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CN109071633B - 基于使用表达增强性基因座来制备抗体的组合物和方法 - Google Patents

基于使用表达增强性基因座来制备抗体的组合物和方法 Download PDF

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CN109071633B CN201780024560.2A CN201780024560A CN109071633B CN 109071633 B CN109071633 B CN 109071633B CN 201780024560 A CN201780024560 A CN 201780024560A CN 109071633 B CN109071633 B CN 109071633B
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Abstract

本发明涉及重组蛋白在真核细胞中的位点特异性整合和表达。具体地讲，本发明包括通过采用表达增强性基因座来改善真核细胞尤其是中国仓鼠细胞系中的抗体的表达的组合物和方法，所述抗体包括双特异性抗体。

Description

基于使用表达增强性基因座来制备抗体的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年4月20日提交的美国临时申请No.62/325,385的优先权权益，其全部内容以引用方式并入本文。
技术领域
本公开涉及重组蛋白在真核细胞中的位点特异性整合和表达。具体地讲，本公开涉及通过采用表达增强性基因座来改善真核细胞(尤其是中国仓鼠(Cricetulus griseus)细胞系)中的抗原结合蛋白(诸如双特异性抗体)表达的组合物和方法。
背景技术
细胞表达系统旨在提供用于制备给定蛋白(不论用于研究或治疗用途)的可靠且高效的来源。由于例如哺乳动物表达系统对重组蛋白进行适当的翻译后修饰的能力，哺乳动物细胞中的重组蛋白表达是用于制备治疗性蛋白的优选方法。
尽管可获得许多系统，但是仍存在用于表达重组蛋白的整合基因的高效基因转移和稳定性的挑战。对于目标转基因的长期表达，一个考虑因素是对细胞基因的破坏程度最小以避免细胞系表型的变化。
对稳定细胞系进行工程化以容纳用于表达的多个基因(例如多特异性抗体中的多条抗体链)是特别具有挑战性的。可能存在整合基因表达水平的大幅变化。整合额外基因可能由于局部遗传环境(即，位置效应)而引起表达的较大变化和不稳定性。用于产生多特异性抗原结合蛋白的表达系统通常需要旨在作为特异性多聚体形式配对的两个或更多个不同免疫球蛋白链的表达，并且可通常倾向于同型二聚体的产生，而非所需的异型二聚体或多聚体组合。因此，本领域中需要经改善的哺乳动物表达系统。
发明内容
在一个方面，提供了含有在增强表达基因座内的特异性位点整合的外源核酸序列的细胞，其中所述外源核酸序列编码双特异性抗原结合蛋白。
在一些实施方案中，外源核酸序列包括含有编码第一轻链片段(LCF)的核苷酸序列的第一外源核酸、含有编码第一重链片段(HCF)的核苷酸序列的第二外源核酸和含有编码第二HCF(或表示为HCF*，其中第二HCF与第一HCF不同)的核苷酸序列的第三外源核酸，其中第一HCF和第二HCF以及第一LCF形成双特异性抗原结合蛋白。在某些实施方案中，第一HCF和第二HCF以及第一LCF含有双特异性抗原结合蛋白的至少两个可变区和两个CH3恒定域。在一些实施方案中，两个可变区是不同的。在一些实施方案中，两个CH3区是不同的。在一些实施方案中，每个外源核酸序列同时整合到增强表达基因座内的特异性位点。
在一些实施方案中，编码第一HCF的核苷酸序列编码第一恒定区的氨基酸(例如，编码CH1、CH2、铰链或CH3结构域中的一者或多者)，并且编码第二HCF的核苷酸序列编码第二恒定区的氨基酸。第一恒定区的氨基酸可以与第二恒定区的氨基酸相同或不同。在特定实施方案中，编码第一HCF的核苷酸序列编码第一CH3结构域，并且编码第二HCF的核苷酸序列编码第二CH3结构域，其中第一CH3结构域和第二CH3结构域可以是相同的或不同的。在一些实施方案中，第一CH3结构域和第二CH3结构域在至少一个氨基酸位置不同；例如，两个CH3结构域中的一个是人IgG CH3结构域，另一个是修饰的人IgG CH3结构域，并且两个CH3结构域具有不同的蛋白A结合特征。在其他实施方案中，编码第一CH3结构域和第二CH3结构域的核苷酸序列彼此不同之处在于所述核苷酸序列中的一者是经密码子修饰的。
在其他特定实施方案中，编码第一HCF的核苷酸序列编码第一重链可变(VH)区，并且编码第二HCF的核苷酸序列编码第二VH区，其中所述第一重链和第二重链可以具有相同的或不同的VH区。在另一个实施方案中，第一VH和第二VH可以连接至相同的或不同的恒定区。
在一些实施方案中，编码第一LCF的核苷酸序列编码第一轻链可变(VL)区。
在一些实施方案中，外源核酸序列含有包括编码第二LCF的核苷酸序列的另外的外源核酸，诸如第二轻链可变(VL)区。在一些实施方案中，编码第二VL区的核苷酸序列还编码第二轻链恒定区。
基因座处的多个外源核酸的相对部分可以变化。在一些实施方案中，编码LCF的核酸相对于两种编码HCF的核酸位于上游或下游。
在一些实施方案中，编码HCF的序列或编码LCF的序列中的每一个独立地连接至转录调控序列。在特定实施方案中，第一外源核酸还包括可操作地连接至编码第一LCF的核苷酸序列的第一启动子，第二外源核酸还包括可操作地连接至编码第一HCF的核苷酸序列的第二启动子，并且第三外源核酸包括可操作地连接至编码第二HCF的核苷酸序列的第三启动子，其中第一启动子、第二启动子和第三启动子是相同的或不同的，和/或所述启动子与第四外源核酸可操作地连接到的第四启动子相同或不同。在一些实施方案中，第一启动子、第二启动子和第三启动子是相同的。
在一些实施方案中，整合位点处的外源核酸序列还包括重组酶识别位点，例如，相对于第一外源核酸位于5’的第一重组酶识别位点(RRS)，和相对于第二外源核酸和第三外源核酸位于3'的第二重组酶识别位点(RRS)，其中第一RRS和第二RRS是不同的。在一些实施方案中，第三RRS也包括在内并且相对于第一外源核酸位于3'，且相对于第二外源核酸和第三外源核酸中的一者或两者位于5’，其中第三RRS与第一RRS和第二RRS不同。
在一些实施方案中，外源核酸序列可包括含有选择性标记基因的第四外源核酸。在特定实施方案中，第四外源核酸相对于第一外源核酸位于3’。在某些实施方案中，第四外源核酸作为断裂基因而整合。在其他实施方案中，第四外源核酸或选择性标记位于第三RRS的3′，即可操作地连接至第四外源核酸的第四启动子的3′。在一些实施方案中，选择性标记基因包含第三RRS，所述第三RRS已经插入，任选地插入选择性标记基因的内含子内，其中第三RRS与第一RRS和第二RRS不同。
在某些实施方案中，基因座处的外源核酸的顺序从5'至3'可以为：第一外源核酸(编码LCF)、第四外源核酸(编码选择性标记)、第二外源核酸(编码第一HCF)和第三外源核酸(编码第二HCF)；并且在一些具体实施方案中，第二外源核酸含有编码人IgG的经修饰的CH3结构域的核苷酸序列，第三外源核酸包含编码人IgG的天然CH3结构域的核苷酸序列。
在某些实施方案中，基因座处的外源核酸的顺序从5'至3'为：第一外源核酸(编码LCF)、第二外源核酸(编码第一HCF)、第四外源核酸(编码选择性标记)和第三外源核酸(编码第二HCF)，其中第二外源核酸包含编码人IgG的天然CH3结构域的核苷酸序列，第三外源核酸包含编码人IgG的经修饰的CH3结构域。
在一些实施方案中，连接至编码HCF的序列或编码LCF的序列的启动子是相同的，并且与选择性标记基因可操作地连接到的启动子不同。
在一些实施方案中，双特异性抗原结合蛋白特异性结合T细胞抗原和肿瘤细胞抗原。还提供了其他合适的双抗原特异性。
在一些实施方案中，增强表达基因座选自：包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的核苷酸序列的基因座，或包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的核苷酸序列的基因座。
在多个实施方案中，细胞是CHO细胞。
在另一个方面，提供了设计用于多个外源核酸的位点特异性整合的载体。
在一些实施方案中，本公开提供一组载体，该组包括第一载体，该载体从5'至3’含有：第一RRS、含有编码第一LCF的核苷酸序列的第一核酸和第三RRS；以及第二载体，该载体从5'至3'含有第三RRS、含有编码第一VH区的核苷酸序列的第二核酸、第二RRS；其中第一核酸或第二核酸还包含编码第二HCF的核苷酸序列；并且其中第一HCF和第二HCF以及第一LCF形成双特异性抗原结合蛋白。
在一些实施方案中，编码第二HCF的核苷酸序列被包括在第一核酸内，任选地位于编码第一LCF的核苷酸序列下游。在其他实施方案中，编码第二HCF的核苷酸序列被包括在第二核酸内。
在一些实施方案中，编码第一HCF的核苷酸序列编码第一嵌合恒定区(例如，编码来自任何同种型的CH1、铰链CH2或CH3结构域或它们的片段中的一者或多者)，并且编码第二HCF的核苷酸序列编码第二嵌合恒定区。嵌合恒定区的实例在2014年8月7日公布的PCT国际公开No.WO 2014/121087 A1中有所描述，该公开以引用的方式并入本文。第一恒定区的氨基酸可以与第二嵌合恒定区相同或不同。在特定实施方案中，编码第一HCF的核苷酸序列编码第一CH3结构域，并且编码第二HCF的核苷酸序列编码第二CH3结构域，其中第一CH3结构域和第二CH3结构域可以是相同的或不同的。在一些实施方案中，第一CH3结构域和第二CH3结构域在至少一个氨基酸位置不同；例如，两个CH3结构域中的一个是人IgG CH3结构域，另一个是修饰的人IgG CH3结构域，并且两个CH3结构域具有不同的蛋白A结合特征。在其他实施方案中，编码第一CH3结构域和第二CH3结构域的核苷酸序列彼此不同之处在于所述核苷酸序列中的一者是经密码子修饰的。
在其他特定实施方案中，编码第一VH区的核苷酸序列编码第一重链，并且编码第二VH区的核苷酸序列编码第二重链，其中第一重链和第二重链可以具有相同的或不同的恒定区。
在一些实施方案中，编码第一LCF的核苷酸序列编码第一轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，编码LCF的序列或编码HCF的序列中的每一个独立地连接至转录调控序列，诸如启动子。在特定实施方案中，连接至编码第一HCF的序列的启动子和连接至编码第二HCF的序列的启动子是相同的。在特定实施方案中，连接至一个或多个LCF和一个或多个HCF的启动子都是相同的。
在一些实施方案中，第一载体中的第一核酸还含有位于第一载体中的第三RRS的5’的选择性标记基因的5'部分；并且第二核酸还含有位于第二载体中的第三RRS的3’的选择性标记基因的其余3'部分，即选择性标记基因断裂到两个载体中。在其他实施方案中，选择性标记及其可操作地连接到的启动子分到两个载体中，换句话讲，启动子和选择性标记基因位于不同的载体上。在某些实施方案中，可操作地连接至标记基因的启动子位于第一载体中第三RRS的5’，标记基因位于第二载体中第三RRS的3′，以及可操作地连接至第二核酸的第二启动子和可操作地连接至第三核酸的第三启动子的5′。在一些实施方案中，第一载体中的第三RRS存在于选择性标记基因的内含子的5'部分内；并且第二载体中的第三RRS存在于选择性标记基因的内含子的3'部分内。
在特定实施方案中，第一载体从5'至3’包括第一RRS、第一核酸和第三RRS；第二载体从5'至3’包括第三RRS、第二核酸(其中第二核酸含有编码第一HCF的核苷酸序列和编码第二HCF的核苷酸序列)以及第二RRS。在其他特定实施方案中，第一载体从5'至3’包括第一RRS、第一核酸，其中第一核酸包含编码第一HCF的核苷酸序列和编码第二HCF区的核苷酸序列，以及第三RRS；第二载体从5'至3’包括第三RRS、第二核酸(其中第二核酸包含编码第一HCF区的核苷酸序列)以及第二RRS。在任何这些特定实施方案中，第一核酸还可以包括位于第一载体中的第三RRS的5’的选择性标记基因的5'部分；并且第二核酸还包含位于第二载体中的第三RRS的3’的选择性标记基因的其余3'部分；其中任选地第一载体中的第三RRS存在于选择性标记基因的内含子的5'部分内，并且第二载体中的第三RRS存在于选择性标记基因的内含子的3'部分内。
在一些实施方案中，该组载体可以包括另外的一个或多个载体；例如，含有一个或多个RRS和编码第二LCF的核苷酸序列的载体，或编码识别RRS的一个或多个重组酶的载体。
在其他实施方案中，本公开提供设计为通过基于同源臂的同源重组实现多个外源核酸的位点特异性整合的载体。在一些实施方案中，载体含有编码双特异性抗原结合蛋白的外源核酸序列，所述外源核酸序列被5'同源臂和3’同源臂侧接以整合到细胞的表达增强性基因座中。
在另一个方面，本公开提供这样的系统：其包括细胞和一个或多个载体的组合，并且可用于制备外源核酸整合到表达增强性基因座内，共同编码双特异性抗原结合蛋白的细胞。
在某些实施方案中，提供了包括细胞和一组载体的系统，其中所述细胞含有整合到其基因组的增强表达基因座内的一组RRS，所述一组RRS是彼此不同的，并且分割在一个或多个外源核酸(诸如选择性标记)之间，用于与一组载体中的所关注的基因重组交换；并且其中一组载体中的RRS包含与细胞中的RRS相同的排列。
在一些实施方案中，提供了包括细胞和一组载体的系统，其中所述细胞从5'至3'含有整合到其基因组的增强表达基因座内的：第一RRS、第一外源核酸、第二RRS、第二外源核酸和第三RRS，其中三个RRS是彼此不同的；其中所述一组载体包括第一载体，所述第一载体从5'至3'含有第一RRS、含有编码第一免疫球蛋白链或其片段的核苷酸序列的第一核酸以及第二RRS；第二载体，所述第二载体含有第二RRS、含有编码第二免疫球蛋白链或其片段的核苷酸序列的第二核酸以及第三RRS；并且其中第一核酸或第二核酸还包括编码第三免疫球蛋白链或其片段的核苷酸序列。在将载体引入细胞时，载体中的第一核酸和第二核酸通过第一RRS、第二RRS和第三RRS介导的重组而整合到增强表达基因座中。
在一些实施方案中，细胞中的第一外源核酸含有第一选择性标记基因，并且细胞中的第二外源核酸含有第二选择性标记基因，其中第一选择性标记基因和第二选择性标记基因是不同的。选择性标记与细胞中的整合外源核酸交换。
在一些实施方案中，第一载体从5'至3’包括第一RRS、含有编码第一LCF的核苷酸序列的第一核酸以及第三RRS；并且第二载体从5'至3’含有第三RRS、第二核酸(其中第二核酸含有编码第一HCF的核苷酸序列和编码第二HC的核苷酸序列)以及第二RRS。在其他实施方案中，第一载体从5'至3’含有第一RRS、含有编码第一LCF的核苷酸序列和编码第二HCF的核苷酸序列的第一核酸以及第三RRS；并且第二载体从5'至3’含有第三RRS、含有编码第一HCF的核苷酸序列的第二核酸以及第二RRS。
在一些实施方案中，第一载体从5'至3’包括第一RRS、含有编码第一HCF的核苷酸序列的第一核酸以及第三RRS；并且第二载体从5'至3’含有第三RRS、第二核酸(其中第二核酸含有编码第一LCF的核苷酸序列和编码第二HCF的核苷酸序列)以及第二RRS。在其他实施方案中，第一载体从5'至3’含有第一RRS、含有编码第一HCF的核苷酸序列和编码第二HCF的核苷酸序列的第一核酸以及第三RRS；并且第二载体从5'至3’含有第三RRS、含有编码第一LCF的核苷酸序列的第二核酸以及第二RRS。在任何这些实施方案中，第一载体中的第一核酸还可包括位于第三RRS的5’的启动子，并且第二载体中的第二核酸还包括位于第三RRS的3'的启动子可操作地连接到的选择性标记基因。在其他实施方案中，第一载体中的第一核酸还可包括位于第三RRS的5’的选择性标记基因的5'部分，并且第二载体中的第二核酸还包括位于第三RRS的3’的选择性标记基因的其余3'部分；其中任选地第一载体中的第三RRS存在于选择性标记基因的内含子的5'部分内；并且第二载体中的第三RRS存在于选择性标记基因的内含子的3'部分内。
在一些实施方案中，编码LCF的核苷酸序列可操作地连接至第一启动子，编码第一HCF的核苷酸序列可操作地连接至第二启动子，并且编码第二HCF的核苷酸序列可操作地连接至第三启动子，其中第一启动子、第二启动子和第三启动子是相同的，并且与选择性标记基因(如果存在于一种载体中的话)可操作地连接到的启动子不同。
在一些实施方案中，编码第一HCF的核苷酸序列编码第一CH3结构域，并且编码第二HCF的核苷酸序列编码第二CH3结构域，其中第一CH3结构域和第二CH3结构域可以是相同的或不同的。在一些实施方案中，两个CH3结构域中的一个是人IgG的天然CH3结构域，另一个CH3结构域是人IgG的经修饰的CH3结构域。在特定实施方案中，编码经修饰的CH3结构域的核苷酸序列在第一载体(即，编码第一LCF的载体)中，任选地编码第一LCF的核苷酸序列下游。在其他特定实施方案中，编码经修饰的CH3结构域的核苷酸序列在第二载体中，编码未修饰的CH3结构域的核苷酸序列上游。
在另一个方面，本公开提供制备双特异性抗原结合蛋白的方法。
在一些实施方案中，所述方法包括提供本文所述的系统，所述系统含有具有RRS的细胞和一组含有多个外源核酸的载体，这些核酸共同编码双特异性抗原结合蛋白和与细胞中的RRS匹配的RRS；通过转染将载体引入细胞；选择转染细胞，其中载体中的外源核酸通过RRS介导的重组而整合到细胞的增强表达基因座中；表达转化细胞中的核酸编码的多肽；以及从转染细胞获得双特异性抗原结合蛋白。
在一些实施方案中，所述方法可包括含有外源核酸序列的细胞，所述外源核酸序列编码整合到表达增强性基因座内的双特异性抗原结合蛋白，从外源核酸序列表达双特异性抗原结合蛋白；以及从细胞获得双特异性抗原结合蛋白。
附图说明
图1用于整合到表达增强性基因座内的示例性双特异性克隆策略。轻链(“LC”)载体(例如共同轻链)和双重链(“HC”)载体(其中“*”表示两个HC是不同的，例如HC*含有CH3结构域的修饰和/或为密码子修饰的)通过将所关注的抗体的可变区克隆到适当的载体中来制备。LC载体的3′RRS位点和双HC载体的5′RRS位点是相同的，并且包括在潮霉素抗性基因的断裂内含子中，被工程化改造为组合和切除内含子，以允许潮霉素抗性基因编码的蛋白质表达，从而用于有效选择重组子。箭头代表启动子。
图2用于整合到表达增强性基因座内的示例性双特异性克隆策略。利用具有5′RRS(RRS1)的通用轻链(参见例如来自如WO 2013022782所述的人源化通用轻链(ULC)
Figure BDA0001834224260000081
小鼠)允许通过将第三RRS(RRS3)侧接的一条重链(HC*)插入预先存在的含有通用轻链的表达盒的质粒来有效构建新型双特异性抗体。通过RRS2和RRS3位点将第二重链(HC)克隆第二质粒中。
图3用于整合到表达增强性基因座内的示例性双特异性克隆策略。首先将双特异性抗体的三条不同的抗体链(AbC1、AbC2和AbC3)克隆到单个载体中。AbC1和AbC3载体各自具有侧接抗体表达盒的RRS位点。从AbC2质粒切除AbC2的表达盒，然后亚克隆到AbC3表达质粒中，从而产生从5′至3′含有RRS3位点、AbC2表达盒、AbC3表达盒和RRS2位点的质粒。将该质粒与AbC1质粒和重组酶一起引入宿主细胞，所述宿主细胞的表达增强性基因座中含有RRS1和RRS2。在重组酶介导的盒交换之后分离表达双特异性抗体的细胞系。
图4用于整合到表达增强性基因座内的示例性双特异性克隆策略。首先将双特异性抗体的三条不同的抗体链(AbC1、AbC2和AbC3)克隆到单个载体中。AbC1和AbC3载体各自具有侧接抗体表达盒的RRS位点。从AbC2质粒切除AbC2的表达盒，然后亚克隆到AbC1表达质粒，产生从5′至3′含有RRS1位点、AbC1表达盒、AbC2表达盒和RRS3位点的质粒。将该质粒与AbC3质粒和重组酶一起引入宿主细胞，所述宿主细胞的表达增强性基因座中含有RRS1和RRS2。在重组酶介导的盒交换之后分离表达双特异性抗体的细胞系。
图5从在一个基因组位点
Figure BDA0001834224260000082
整合的表达盒表达双特异性抗体。通过在
Figure BDA0001834224260000083
基因座的重组酶介导的盒交换产生CHO细胞系RSX4189-1、RSX4187-1、RSX4191-1、RSX4188-1。左侧描绘了在
Figure BDA0001834224260000084
基因座的双特异性Ab的三条不同的抗体链(AbC1、AbC2和AbC3)的表达盒排列。通过HPLC测定4天摇瓶培养的废培养基中每个双特异性抗体的滴度，并示于右侧的柱状图中。
具体实施方式
定义
如本文所用，术语“抗体”包括包含通过二硫键相互连接的四条多肽链(两条重链(H)和两条轻链(L))的免疫球蛋白分子。每条重链包含重链可变区(本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH和VL区还可细分成称为互补决定区(CDR)的高变区，其间插有称为构架区(FR)的更保守的区。每个VH和VL由从氨基末端到羧基末端按照下述次序排列的三个CDR和四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(重链CDR可缩写为HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链CDR可缩写为LCDR1、LCDR2和LCDR3)。
短语“抗原结合蛋白”包括具有至少一个CDR并且能够选择性地识别抗原，即能够结合具有至少在微摩尔范围内的KD的抗原的蛋白质。治疗性抗原结合蛋白(例如，治疗性抗体)经常需要在纳摩尔或皮摩尔范围内的KD。通常，抗原结合蛋白包括两个或更多个CDR，例如2、3、4、5、或6个CDR。抗原结合蛋白的实例包括抗体、抗体的抗原结合片段诸如含有抗体的重链和轻链的可变区的多肽(例如，Fab片段、F(ab')2片段)以及含有抗体的重链和轻链的可变区并且含有重链和/或轻链的恒定区(诸如一个或多个恒定域，即CL、CH1、CH2和CH3结构域中的一者或多者)的另外氨基酸的蛋白质。
短语“双特异性抗原结合蛋白”包括能够选择性地结合两个或更多个表位或与所述两个或更多个表位具有不同特异性的抗原结合蛋白-在两个不同分子(例如抗原)上或在同一分子上(例如在同一抗原上)。此类蛋白的抗原结合部分或片段抗原结合(Fab)部分对特定抗原具有特异性，并且通常由免疫球蛋白的重链可变区和轻链可变区构成。在一些情况下，重链可变区和轻链可变区可能不是同源对，换句话说，具有不同的结合特异性。
双特异性抗原结合蛋白的实例是”双特异性抗体”，其包括能够选择性地结合两个或更多个表位的抗体。双特异性抗体一般包含两条不同的重链，其中每条重链特异性结合不同表位-在两个不同分子(例如抗原)上或在同一分子上(例如在同一抗原上)。如果双特异性抗原结合蛋白能够选择性地结合两个不同的表位(第一表位和第二表位)，则第一重链可变区对第一表位的亲和力一般将比第一重链可变区对第二表位的亲和力低至少一个至两个或三个或四个数量级，反之也然。双特异性抗原结合蛋白，例如双特异性抗体可包括识别相同抗原的不同表位的重链可变区。典型的双特异性抗体具有两条重链以及免疫球蛋白轻链，所述两条重链各自具有三个重链CDR，随后为(N-末端至C-末端)CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域，所述免疫球蛋白轻链不赋予抗原结合特异性，但可与每条重链结合，或者可与每条重链结合并且可结合由重链抗原结合区结合的一个或多个表位，或者可与每条重链结合并且使得重链之一或两者能够与一个或两个表位结合。在一个实施方案中，Fc结构域包括至少CH2和CH3。Fc结构域可包括铰链、CH2结构域和CH3结构域。
一种具体化的双特异性形式包括第一重链(HC)、具有修饰的CH3的第二重链(HC*)和共同轻链(LC)(两个拷贝的相同轻链)。另一个实施方案包括第一重链(HC)、共同LC和HC-ScFv融合多肽(其中所述第二HC融合至ScFv的N末端)。另一个实施方案包括第一HC、同源LC、HC-ScFv融合多肽(其中所述第二HC融合至ScFv的N末端)。另一个实施方案包括第一重链(HC)、LC和Fc结构域。另一个实施方案包括第一HC、LC、ScFv-Fc融合多肽(其中所述Fc融合至ScFv的C末端)。另一个实施方案包括第一HC、共同LC、和Fc-ScFv融合多肽(其中所述Fc融合至ScFv的N末端)。另一个实施方案包括第一HC、LC和ScFv-HC(其中所述第二HC融合至ScFv的C末端)。
在某些实施方案中，一条重链(HC)可为天然的或"野生型"序列且第二重链可在Fc结构域中被修饰。在其他实施方案中，一条重链(HC)可为天然的或”野生型”序列且第二重链的密码子可以是经过密码子修饰的。
术语"细胞"包括适于表达重组核酸序列，并且具有允许外源核酸的稳定整合和增强表达的基因座的任何细胞。细胞包括哺乳动物细胞，诸如非人类动物细胞、人类细胞或细胞融合物，例如杂交瘤或四源杂交瘤。在一些实施方案中，细胞为人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施方案中，细胞为选自下列细胞的哺乳动物细胞：CHO(例如CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾(例如HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60、(例如BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮的)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT060562、Sertoli细胞、BRL 3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞和来源于前述细胞的细胞系。在一些实施方案中，细胞包含一个或多个病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如PER.C6TM细胞)。
"细胞密度"是指单位样品体积中细胞的数量，例如总(活的和死的)细胞数/毫升。可以手动或自动(例如用流式细胞仪)对细胞的数量进行计数。已对自动细胞计数仪进行调适来使用例如标准台盼蓝摄取技术对活细胞的数量或死细胞的数量或活/死两种细胞的数量进行计数。短语"活细胞密度"或"活细胞浓度"是指每样品体积中活细胞的数量(也被称为"活细胞计数")。任意数量的众所周知的手册或自动技术可以用于确定细胞密度。可以测量培养物的在线生物质的量，其中电容或光密度与每体积中细胞的数量相关。细胞培养物例如生产培养物中最终细胞密度根据起始细胞系而变化，例如在约1.0至10×106个细胞/mL的范围内。在一些实施方案中，在从生产细胞培养物收获目标蛋白之前，最终细胞密度达到1.0至10×106个细胞/mL。在其他实施方案中，最终细胞密度达到至少5.0×106个细胞/mL、至少6×106个细胞/mL、至少7×106个细胞/mL、至少8×106个细胞/mL、至少9×106个细胞/mL或至少10×106个细胞/mL。
术语"经过密码子修饰"意指编码蛋白的核苷酸序列已在一个或多个核苷酸(即一个或多个密码子)被修饰，而不改变所述密码子所编码的氨基酸，从而产生所述核苷酸序列的经过密码子修饰的形式。核苷酸序列的密码子修饰可为在基于核酸的测定(例如尤其是基于杂交的测定、PCR)中用于区分核苷酸序列与其经过密码子修饰的形式的便利基础。在一些情况下，通过采用本领域熟知的密码子优化技术修饰核苷酸序列的密码子，以提供所编码的蛋白质在宿主细胞在的改善或优化表达(Gustafsson,C.等人,2004,Trends inBiotechnology,22:346–353；Chung,B.K.-S.等人,2013,Journal of Biotechnology,167:326–333；Gustafsson,C.等人,2012,Protein Expr Purif,83(1):37–46)。使用这些技术的序列设计软件工具也是本领域熟知的，包括但不限于Codon optimizer(Fuglsang A.2003,Protein Expr Purif,31:247–249)、Gene Designer(Villalobos A等人,2006,BMCBioinforma,7:285)和OPTIMIZER(PuigbòP等人2007,Nucleic Acids Research,35:W126-W131)等等。
短语“互补决定区”或术语“CDR”包括由生物的免疫球蛋白基因的核酸序列编码的氨基酸序列，其通常(即在野生型动物中)出现在免疫球蛋白分子(例如抗体或T细胞受体)的轻链或重链的可变区中的两个构架区之间。CDR可由例如种系序列或者重排或未重排序列，以及例如天然或成熟的B细胞或T细胞编码。在一些情况下(例如对于CDR3)，CDR可由两个或更多个序列(例如，种系序列)编码，所述两个或更多个序列是不邻接的(例如，未重排的核酸序列中)，但在B细胞核酸序列中是邻接的，例如由于剪接或连接序列(例如，V-D-J重组以形成重链CDR3)。
术语”表达增强性基因座”是指细胞基因组中的基因座，所述基因座含有一序列或多个序列，当合适的基因或构建体是外源性地添加(即整合)至所述一个或多个序列中或接近所述一个或多个序列、或”可操作地连接”至所述一个或多个序列时，所述基因座表现出与所述基因组中的其他区或序列相比更高水平的表达。
术语“增强”在用于描述增强的表达时包括例如与相同表达构建体的单一拷贝的随机整合体池相比，超过通常通过将外源性序列随机整合到基因组中或通过整合在不同基因座所观察到的至少约1.5倍增强到至少约3倍增强的表达。采用本发明的序列所观察到的加倍表达增强是与在基本上相同的条件下、在本发明的序列不存在的情况下所测量的相同基因的表达水平相比，例如与整合到相同物种基因组中的另一基因座相比。增强的重组效率包括基因座重组能力的增强(例如，采用重组酶识别位点("RRS"))。增强是指超过随机重组(例如，不采用重组酶识别位点等)的重组效率，其通常是0.1％。优选增强的重组效率超过随机约10倍，或是约1％。除非规定，否则要求保护的发明不限于特定的重组效率。增强的表达基因座通常由宿主细胞支持目标蛋白的高生产率。因此，增强的表达包括每个细胞的目标蛋白的高产量(以蛋白克数计的升高滴度)，而非简单地通过培养物中的细胞的高拷贝数得到高滴度。比生产率Qp(皮克/细胞/天，即pcd)被视为可持续生产力的量度。表现出大于5pcd、或大于10pcd、或大于15pcd、或大于20pcd、或大于25pcd、或甚至大于30pcd之Qp的重组宿主细胞是合乎需要的。目标基因插入表达增强性基因座、或"热点"的宿主细胞表现出高的比生产率。
在关于目标基因座采用短语“外源性地添加的基因”或“外源性地添加的核酸”或简称为”外源核酸”的情况下，所述短语是指作为自然界中所发现的基因座目标在基因座内不存在的任何DNA序列或基因。例如，CHO基因座(例如包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列的基因座)内“外源核酸”可以是自然界中特定CHO基因座内未发现的仓鼠基因(即，仓鼠基因来自仓鼠基因组的另一基因座)、来自任何其他物种的基因(例如人类基因)、嵌合基因(例如人类/小鼠)或自然界中未发现的任何其他基因存在于目标CHO基因座内。
短语“重链”或“免疫球蛋白重链”包括来自任何生物的免疫球蛋白重链恒定区序列，并且除非另有说明，否则包括重链可变结构域。除非另有说明，否则重链可变结构域包括三个重链CDR和四个FR区。通常的重链在可变结构域之后具有(从N末端到C末端)CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域。术语“重链的片段”或“重链片段”(在本文中也称为“HCF”)包括重链的至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或更多个氨基酸的肽，并且可以包括一个或多个CDR、与一个或多个FR组合的一个或多个CDR、CH1、铰链、CH2或CH3中的一者或多者、可变区、恒定区、恒定区的片段(例如CH1、CH2、CH3)或它们的组合。HCF的实例包括VH，以及Fc区的全部或部分。短语"编码HCF的核苷酸序列"包括编码由HCF组成的多肽的核苷酸序列和编码含有HCF的多肽的核苷酸序列，例如可含有除了指定HCF以外的附加氨基酸的多肽。例如，编码HCF的核苷酸序列包括编码由VH组成、由连接到CH3的VH组成、由完整重链组成的多肽等的核苷酸序列。
在核酸序列的情况下，“同源序列”是指基本上与参考核酸序列同源的序列。在一些实施方案中，如果两个序列的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的相应核苷酸在相关的残基序列段上是相同的，那么这两个序列被认为是基本上同源的。在一些实施方案中，相关序列段是完全序列。
短语“轻链”包括来自任何生物的免疫球蛋白轻链恒定区序列，并且除非另有说明，否则包括人κ和λ轻链。除非另有说明，否则轻链可变(VL)结构域通常包括三个轻链CDR和四个构架(FR)区。一般地，全长轻链从氨基末端到羧基末端包括包含FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的VL结构域和轻链恒定结构域。可用于本发明的轻链包括例如不选择性结合由双特异性抗体选择性结合的第一表位或第二表位的那些。合适的轻链还包括可结合或有助于结合抗体的抗原结合区所结合的表位中的一个或两个。术语"轻链的片段"或"轻链片段"(或"LCF")包括轻链的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个氨基酸的肽，并且可包括一个或多个CDR、结合有一个或多个FR的一个或多个CDR、可变区、恒定区、恒定区的片段、或它们的组合。LCF的实例包括VL和轻链恒定区(“CL”)的全部或部分。短语"编码LCF的核苷酸序列"包括编码由LCF组成的多肽的核苷酸序列和编码含有LCF的多肽的核苷酸序列，例如可含有除了指定LCF以外的附加氨基酸的多肽。例如，编码LCF的核苷酸序列包括编码尤其由VL组成、或由完整轻链组成的多肽的核苷酸序列。
短语"可操作地连接"是指核酸或蛋白以所连接的分子如同预期般发挥作用的方式连接。DNA区当在功能上彼此相关时是可操作地连接的。例如，如果启动子能够参与编码序列的转录，那么所述启动子被可操作地连接到所述序列；如果核糖体结合位点经定位以便允许翻译，那么所述核糖体结合位点被可操作地连接到编码序列。一般来说，可操作地连接可以包括但并不要求邻接。就如分泌性前导序列的序列来说，邻接并且适当放置在阅读框中是典型的特征。在目标基因座的表达增强性序列在功能上与目标基因(GOI)相关的情况下，例如在其存在使得GOI的表达增强的情况下，其被可操作地连接到GOI。
当描述目标基因座，例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或其片段时，“同一性百分比”意味着包括沿着邻接的同源区表现出所列举同一性的同源序列，但在相比较的序列中不具有同源性的间隙、缺失或插入的存在不纳入同一性百分比的计算中。
如本文所用，在例如SEQ ID NO:1或其片段与物种同源物之间的“同一性百分比”测定将不包括在比对中物种同源物无同源序列比较(即，SEQ ID NO:1或其片段在那一点处具有插入，或物种同系物具有间隙或缺失，视具体情况而定)的序列比较。因此，“同一性百分比”不包括间隙、缺失和插入的罚分。
“识别位点”或“识别序列”是由核酸酶或其他酶识别以结合和引导DNA主链的位点特异性切割的特定DNA序列。核酸内切酶在DNA分子内裂解DNA。识别位点在本领域中也被称为识别靶位点。
“重组酶识别位点”(或"RRS")是由重组酶，如Cre重组酶(Cre)或翻转酶(flp)识别的特定DNA序列。位点特异性重组酶在其一个或多个目标识别序列被战略性置于生物体基因组中时，可以进行DNA重排，包括缺失、倒位和易位。在一个实例中，Cre在其DNA目标识别位点loxP处特异性介导重组事件，所述识别位点是由通过8-bp间隔子分隔开的两个13-bp反向重复序列构成。可以采用不止一个重组酶识别位点，例如以有助于重组介导的DNA交换。也可以采用重组酶识别位点(例如lox位点)的变异体或突变体(Araki,N.等人,2002,Nucleic Acids Research,30:19,e103)。
“重组酶介导的盒式交换”或"RMCE”涉及一种用供体盒精确替换基因组目标盒的方法。通常为了进行此方法所提供的分子组合物包括1)5'和3’侧接对特定重组酶具有特异性的识别靶位点的基因组目标盒、2)侧接匹配的识别靶位点的供体盒和3)位点特异性重组酶。重组酶蛋白在本领域中是众所周知的(Turan,S.和Bode J.,2011,FASEB J.,25,第4088-4107页)并且能够精确裂解特定识别靶位点内的DNA(DNA的序列)而不增加或丢失核苷酸。常见重组酶/位点组合包括(但不限于)Cre/lox和Flp/frt。市售的试剂盒也提供含有R4-attP位点的载体和编码phiC31整合酶的载体，以用于RMCE。(另参见，例如美国公开申请No.US20130004946.)
"位点特异性整合"或"靶向插入"是指用于引导基因或核酸序列插入或整合到基因组中的特定位置，即，引导DNA到相连聚核苷酸链中两个核苷酸之间的特异性位点的基因靶向方法。位点特异性整合或靶向插入也可针对包括多个表达单元或盒的核定特酸，例如多个基因，各自具有其本身的调控元件(例如启动子、增强子和/或转录终止序列)。“插入”和“整合”可互换使用。应理解，基因或核酸序列(例如包含表达盒的核酸序列)的插入可能导致(或可能经工程化以使得)一个或多个核酸的替代或缺失，这取决于所采用的基因编辑技术。
"稳定整合"意指整合到宿主细胞基因组中的外源核酸在细胞培养物中维持整合持续一段时间，例如，至少7天、至少10天、至少15天、至少20天、至少25天、至少30天、至少35天、至少40天、至少45天、至少50天、至少55天、至少60天或更长。应当理解的是，大规模制造和纯化双特异性抗原结合蛋白是一项具有挑战性的任务。稳定性和克隆性对任何生物分子的再现性至关重要，尤其是治疗上使用的生物分子。通过本公开的方法所制备的表达双特异性抗体的稳定克隆提供了产生治疗性生物分子的相同且可再现的方式。
一般说明
本公开提供通过采用宿主细胞中的表达增强性基因座来改善宿主细胞(尤其是中国仓鼠(Cricetulus griseus)细胞系)中多个多肽表达的组合物和方法。更具体地讲，本公开提供被设计为使共同编码双特异性抗原结合蛋白的多个外源核酸整合到宿主细胞(诸如CHO细胞)中表达增强性基因座内的特异性位点的组合物和方法。具体地讲，本公开提供含有整合到表达增强性基因座内的特异性位点的多个外源核酸的细胞，其中所述多个外源核酸共同编码双特异性抗原结合蛋白。本公开还提供被设计为使多个外源核酸位点特异性整合到表达增强性基因座中的核酸载体。本公开另外提供包括宿主细胞的系统，所述宿主细胞含有两个或更多个重组酶识别位点(RRS)和一组含有匹配RR和多个外源核酸的载体，用于将来自载体的多个外源核酸位点特异性整合到表达增强性基因座中。另外，本公开提供使用本文公开的细胞、载体和系统制备双特异性抗原结合蛋白的方法。
多个外源核酸整合到表达增强性基因座内的特异性位点的细胞
在一个方面，本公开提供含有整合到增强表达基因座内的特异性位点的外源核酸序列的细胞，其中所述外源核酸序列编码双特异性抗原结合蛋白。
本文提供的细胞能够产生具有高滴度和/或高比生产率(皮克/细胞/天)的双特异性抗原结合蛋白(例如，双特异性抗体)。在一些实施方案中，细胞以至少5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L、35mg/L、40mg/L、45mg/L、50mg/L或更大的滴度产生双特异性抗原结合蛋白。在一些实施方案中，细胞以至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％或更高的双特异性抗原结合蛋白滴度与总抗原结合蛋白滴度之比来产生双特异性抗原结合蛋白。在一些实施方案中，产生双特异性抗原结合蛋白的细胞具有至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15皮克/细胞/天(pcd)或更高的比生产率，所述比生产率根据每天每个细胞产生的总抗原结合蛋白(单位皮克)来测定。
包含编码整合到增强表达基因座内的特异性位点的双特异性抗原结合蛋白的外源核酸序列的宿主细胞在生产培养物中表现出高细胞密度，例如1至10×106个细胞/mL。在其他实施方案中，编码双特异性抗原结合蛋白的宿主细胞具有至少5×106个细胞/mL、6×106个细胞/mL、7×106个细胞/mL、8×106个细胞/mL、9×106个细胞/mL或10×106个细胞/mL的最终细胞密度。
在一些实施方案中，双特异性抗原结合蛋白含有两个具有不同抗原特异性的HC片段(“HCF”)和两个LCF。在其中使用两个VL区的情况下，它们可以是相同的或不同的。在特定实施方案中，两个VL区是相同的，诸如共同轻链。
在一些实施方案中，两个HCF中的每一个包括来自重链恒定区(诸如CH1、CH2或CH3)的氨基酸。在特定实施方案中，两个HCF中的每一个包括CH3结构域。在具体实施方案中，两个HCF中的每一个包括恒定区，即完全恒定区。
在一些实施方案中，两个HCF中的每一个包括VH，并且两个VH可以是相同的或不同的。
在一些实施方案中，双特异性抗原结合蛋白包括两条重链(即，两条完全重链)。
在一些实施方案中，两个LCF中的每一个包括VL。在特定实施方案中，每个LCF由VL区构成，所述VL区可操作地连接至包括来自轻链恒定区的氨基酸的氨基酸序列。在特定实施方案中，每个VL区可操作地连接至CL区，即双特异性抗原结合蛋白包括轻链(即，完全轻链)。
在一些实施方案中，整合到增强表达基因座内的外源核酸序列包括含有编码第一LCF的核苷酸序列的第一外源核酸、含有编码第一HCF的核苷酸序列的第二外源核酸和含有编码第二HCF的核苷酸序列的第三外源核酸。
在一些实施方案中，编码第一LCF的核苷酸序列可以编码轻链可变(VL)区序列。在特定实施方案中，编码第一VL区的核苷酸序列编码第一轻链。
在一些实施方案中，编码第一HCF的核苷酸序列编码第一重链恒定区的氨基酸，例如CH1、铰链、CH2或CH3中的一者或多者)，并且编码第二HCF的核苷酸序列编码第二重链恒定区的氨基酸。第一重链恒定区的氨基酸可以与第二重链恒定区的氨基酸相同或不同。例如，编码第一HCF的核苷酸序列编码第一CH3结构域，并且编码第二HCF的核苷酸序列编码第二CH3结构域，其中第一CH3结构域和第二CH3结构域可以是相同的或者在一个或多个氨基酸位置上是不同的，如下文对双特异性抗原结合蛋白的描述。
在一些实施方案中，编码第一HCF的核苷酸序列编码第一VH，并且编码第二HCF的核苷酸序列编码第二VH。
在一些实施方案中，编码第一HCF的核苷酸序列编码第一重链，并且编码第二HCF的核苷酸序列编码第二重链。第一重链和第二重链可以具有相同的恒定区，或者具有一个或多个氨基酸的差异。下文进一步描述了具有不同的重链恒定域(诸如不同的CH3结构域)的双特异性抗原结合蛋白的多个实例。与所编码的氨基酸序列无关，编码来自两个重链恒定区的氨基酸的核苷酸序列的差异在于两个编码核苷酸序列之一可以具有密码子修饰，这提供了在基于核酸的检测测定中区分两个核苷酸序列的便利基础。
在一些实施方案中，每个编码HCF的或编码LCF的核苷酸序列独立地并且可操作地连接至含有启动子的转录调控序列。所谓“独立地”意指每个编码序列可操作地连接至单独的转录调控序列，诸如启动子，使得编码序列的转录处于单独的调控和控制下。在一些实施方案中，引导所述两个含HCF多肽的转录的启动子相同。在一些实施方案中，引导两个含有HCF的多肽的转录的启动子，以及引导含有LCF的多肽的转录的启动子均相同，例如CMV启动子。在一些实施方案中，每个编码HCF的或编码LCF的核苷酸序列独立地并且可操作地连接至诱导型或阻抑型启动子。诱导型或阻抑型启动子允许生产，例如，仅在生产期(加料分批培养)而不在生长期(种子培养)期间发生。每个基因产物的产生(表达)的精细控制可通过不同的启动子来实现。
在一个此类实例中，细胞首先被工程化以表达四环素阻遏蛋白(TetR)，并且将每个编码HCF的和编码LCF的核苷酸序列置于活性受TetR调控的启动子的转录控制之下。两个串联的TetR操纵子(TetO)置于紧邻CMV启动子的下游。在一些实施方案中，每个编码HCF的和/或编码LCF的核苷酸序列独立地并且可操作地连接至至少一个TetR操纵子(TetO)或Arc操纵子(ArcO)上游的启动子。在其他实施方案中，每个编码HCF的和/或编码LCF的核苷酸序列独立地并且可操作地连接至CMV/TetO或CMV/ArcO杂合启动子。另外的合适的启动子在下文中描述。
基因座内多个外源核酸的相对部分可以变化。不希望受任何理论的束缚，据信实现两个含有HCF的多肽的平衡(即，可比较的)表达水平是重要的。在一些实施方案中，编码LCF的核酸相对于两种编码HCF的核酸位于上游。在其中引导含有LCF的多肽表达和两个含有HCF的多肽表达的三个启动子相同的情况下，合适的排列从5'至3'可包括编码LCF的核苷酸序列、编码第一HCF的核苷酸序列、可操作地连接至核苷酸序列(诸如选择性标记基因)的另外不同启动子和编码第二HCF的核苷酸序列。其他合适的排列从5'至3'包括编码LCF的核苷酸序列、可操作地连接至核苷酸序列(诸如选择性标记基因)的另外不同启动子、编码第一HCF的核苷酸序列和编码第二HCF的核苷酸序列。在编码HCF的核苷酸序列编码恒定区序列的情况下，位于上游的核苷酸序列可编码恒定区序列的修饰形式(例如，修饰的CH3)，或位于上游的核苷酸序列可编码恒定区序列的修饰形式，而另一个核苷酸序列则编码恒定区序列的未修饰形式。
在一些实施方案中，细胞还含有也整合到基因座内的一个或多个RRS。在一些实施方案中，细胞包括彼此不同和侧接外源核酸序列的第一RRS和第二RRS，其中外源核酸序列又含有编码第一LCF的核酸、编码第一HCF的核酸和编码第二HCF的核酸。在特定实施方案中，编码LCF的核酸相对于两个编码HCF的核酸位于上游，细胞包括相对于编码第一LCF的核酸位于3’并且相对于一个或两个编码HCF外源核酸位于5’的第三RRS，其中第三RRS与第一RRS和第二RRS不同。可以将第三RRS工程化改造为包括在基因的内含子内，所述内含子可以置于任何两个编码HCF的序列或编码LCF的序列之间。
双特异性抗原结合蛋白
适于在本公开中所述的细胞、载体和系统中克隆和生产的双特异性抗原结合蛋白例如双特异性抗体并不限于双特异性抗原结合蛋白的任何特定形式。
在多个实施方案中，双特异性抗原结合蛋白包括两个多肽，每个多肽都含有抗原结合部分(例如，VH区)和CH3结构域，其中两个多肽的抗原结合部分具有不同的抗原特异性，并且其中两个CH3结构域相对于彼此是异源二聚体，因为CH3结构域之一在至少一个氨基酸位置经过修饰，以产生在两个多肽之间具有差异的蛋白A结合特征。参见，例如美国专利8,586,713中所述的双特异性抗体。以此方式，可采用区分性蛋白A分离方案来容易地从异型二聚体中分离异型二聚体的双特异性抗原结合蛋白。
在一些实施方案中，双特异性抗原结合蛋白包括两条重链，所述两条重链具有不同抗原特异性并且在CH3结构域中的至少一个氨基酸位置不同，以产生所述两条重链之间的区分性蛋白A结合特性。
在一些实施方案中，所述两个多肽含有人IgG的CH3结构域，其中所述两个多肽之一含有选自IgG1、IgG2和IgG4的人IgG的CH3结构域，所述两个多肽的另一个含有选自IgG1、IgG2和IgG4的人IgG的经修饰的CH3结构域，其中所述修饰减少或消除了经修饰的CH3区与蛋白A的结合。在特定实施方案中，所述两个多肽之一含有人IgG1的CH3结构域，所述两个多肽的另一个含有人IgG1的经修饰的CH3结构域，其中所述修饰选自IMGT外显子编号系统中的(i)95R以及(ii)95R和96F。在其他特定实施方案中，经修饰的CH3结构域包含选自IMGT外显子编号系统中的16E、18M、44S、52N、57M和82I的一至五个附加修饰。
在其他各种实施方案中，所述两个多肽含有小鼠IgG的CH3结构域，其中所述两个多肽之一含有未修饰小鼠IgG的CH3结构域，并且所述两个多肽的另一个含有小鼠IgG的经修饰的CH3结构域，其中所述修饰减少或消除了经修饰的CH3区与蛋白A的结合。在多个实施方案中，小鼠IgG的CH3区经过修饰，以在特定位置处包含特定氨基酸(EU编号)，这些位置选自：252T、254T、和256T；252T、254T、256T、和258K；247P、252T、254T、256T和258K；435R和436F；252T、254T、256T、435R和436F；252T、254T、256T、258K、435R和436F；24tP、252T、254T、256T、258K、435R和436F；以及435R。在特定实施方案中，进行特定的一组修饰，其选自：M252T、S254T、S256T；M252T、S254T、S256T、I258K；I247P、M252T、S254T、S256T、I258K；H435R、H436F；M252T、S254T、S256T、H435R、H436F；M252T、S254T、S256T、I258K、H435R、H436F；I247P、M252T、S254T、S256T、I258K、H435R、H436F；以及H435R。
在多个实施方案中，双特异性抗原结合蛋白是小鼠和大鼠单克隆抗体或抗原结合蛋白的杂交体，例如小鼠IgG2a和大鼠IgG2b的杂交体。根据这些实施方案，双特异性抗体由两个抗体的异型二聚体构成，其包含各自通过Fc部分结合的一个重/轻链对。所需的异型二聚体可轻易地从两个亲本抗体同型二聚体和双特异性异型二聚体的混合物纯化，因为双特异性抗体和蛋白A的结合特性与亲代抗体和蛋白A的结合特性不同：大鼠IgG2b不会结合至蛋白A，而小鼠IgG2a会。因此，小鼠-大鼠异型二聚体结合至蛋白A，但以比小鼠IgG2a同型二聚体更高pH洗脱，并且这使得双特异性异型二聚体的选择性纯化成为可能。
在其他各式实施方案中，双特异性抗原结合蛋白具有本领域中称为“钮入孔”的形式(参见，例如美国专利No.7,183,076)。在这些实施方案中，两个抗体的Fc部分被工程化，以产生一个突出的“钮”，另一者为互补的“孔”。当在同一细胞中生产时，通过将工程化的“钮”与工程化的“孔”相连，据说重链优先形成异型二聚体，而非同型二聚体。
在另一个实施方案中，第一重链和第二重链包含CH3结构域中的一个或多个氨基酸修饰，以允许两条重链之间发生相互作用。CH3-CH3界面氨基酸残基可用带电荷的氨基酸置换，以提供不利静电的同型二聚体形成。(参见例如PCT公开号WO2009089004；和欧洲专利公开No.EP1870459。)
在其他实施方案中，第一重链包含同种型IgA的CH3结构域，第二重链包含IgG的CH3结构域(或反之亦然)，以促进异源二聚体的优先形成。(参见例如PCT公开号WO2007110205。)
在其他实施方案中，可通过工程化方法将多种形式与免疫球蛋白链整合，以促进异源二聚体的形成，诸如Fab-臂交换(PCT公开No.PCT公开No.WO2008119353；PCT公开No.WO2011131746)、卷曲螺旋域相互作用(PCT公开No.WO2011034605)或亮氨酸拉链肽(Kostelny等人J.Immunol.1992,148(5):1547-1553)。
可以使用本领域已知的任何方法产生可用于产生双特异性抗原结合蛋白的免疫球蛋白重链可变区。例如，第一重链包含由已用第一抗原免疫的第一动物的成熟B细胞的基因组所衍生的核酸编码的可变区，第一重链特异性识别第一抗原；并且第二重链包含由已用第二抗原免疫的第二动物的成熟B细胞的基因组所衍生的核酸编码的可变区，第二重链特异性识别第二抗原。免疫球蛋白重链可变区序列也可通过本领域已知的任何其他方法获得，例如通过噬菌体展示获得。在其他实例中，编码重链可变区的核酸包括这些在本领域已经描述或以其他方式可获得的抗体的核酸。在一些实施方案中，所述两个重链编码序列之一是经密码子修饰的，以提供在基于核酸的测定中区分所述两个编码序列的便利基础。
包含识别两个不同表位(或两个不同抗原)的两条重链的双特异性抗体更易于分离，其中它们可与相同的轻链(即具有相同的可变和恒定结构域的轻链)配对。本领域已知多种方法用于生成可与两条不同特异性的重链配对的轻链，同时不干扰或实质上不干扰重链可变结构域与其靶抗原的选择性和/或亲和力，如描述于例如美国专利8,586,713和其中所述公开的技术。
所述双特异性抗原结合蛋白可具有多种双重抗原特异性和相关的有用应用。
在一些实例中，可制备包含针对肿瘤抗原和T细胞抗原的结合特异性的双特异性抗原结合蛋白，其靶向细胞上的抗原，例如CD20，也靶向T细胞上的抗原细胞，例如T细胞受体，例如CD3。以此方式，双特异性抗原结合蛋白靶向患者的目标细胞(例如，淋巴瘤患者的B细胞，经由CD20结合)以及患者的T细胞。在多个实施方案中，双特异性抗原结合蛋白被设计为在结合T细胞受体(诸如结合CD3)时活化T细胞，从而使T细胞活化与特定的选定肿瘤细胞结合。
就双特异性抗原结合蛋白而言，其中一个部分结合至CD3，另一个部分结合至靶标抗原，靶标抗原可以是肿瘤相关抗原。特定肿瘤相关抗原的非限制实例包括，例如AFP、ALK、BAGE蛋白、BIRC5(存活素)、BIRC7、β-连环蛋白、brc-abl、BRCA1、BCMA、BORIS、CA9、碳酸酐酶IX、半胱天冬酶-8、CALR、CCR5、CD19、CD20(MS4A1)、CD22、CD30、CD40、CDK4、CEA、CLEC-12、CTLA4、cyclin-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRvIII、ErbB2/Her2、ErbB3、ErbB4、ETV6-AML、EpCAM、EphA2、Fra-1、FOLR1、GAGE蛋白(例如，GAGE-1、GAGE-2)、GD2、GD3、GloboH、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、GM3、gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、LMP2、MAGE蛋白(例如，MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6和MAGE-12)、MART-1、间皮素、ML-IAP、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5、Muc16(CA-125)、MUM1、NA17、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、PSMA(FOLH1)、RAGE蛋白、Ras、RGS5、Rho、SART-1、SART-3、Steap-1、Steap-2、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、Thompson-nouvelle抗原(Tn)、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶、和尿路上皮分化特异糖蛋白-3。
在一些实施方案中，双特异性抗原结合蛋白选自抗CD3×抗CD20双特异性抗体(如美国专利申请公开No.US2014/0088295A1和US20150266966A1所述，这些专利申请以引用的方式并入本文)、抗CD3×抗粘蛋白16双特异性抗体(例如，抗CD3×抗Muc16双特异性抗体)和抗CD3×抗前列腺特异性膜抗原双特异性抗体(例如，抗CD3×抗PSMA双特异性抗体)。在其他实施方案中，双特异性抗原结合蛋白包含一个结合CD3的部分。例示的抗-CD3抗体部分描述于美国专利申请公开号US2014/0088295A1和US20150266966A1，以及在2017年3月30日公开的国际专利公开号WO 2017/053856中，所有这些专利均以引用的方式并入本文)。在另外其他实施方案中，双特异性抗原结合蛋白包含一个结合CD3的部分和一个结合BCMA、CD19、CD20、CD28、CLEC-12、Her2、HLA蛋白、MAGE蛋白、Muc16、PSMA或Steap-2部分。
就双特异性抗原结合蛋白而言，其中所述一个部分结合至T细胞受体，例如结合至CD3，并且另一部分结合至靶抗原，靶抗原可为传染病相关抗原。传染病相关抗原的非限制实例包括，例如在病毒颗粒的表面上表达或优先在已感染病毒的细胞上表达的抗原，其中所述病毒选自：HIV、肝炎(A、B或C)、疱疹病毒(例如HSV-1、HSV-2、CMV、HAV-6、VZV、EB病毒)、腺病毒、流感病毒、黄热病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道融合病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、HTLV、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和芳香病毒性脑炎病毒。或者，靶抗原可为在细菌表面上表达或优先在已感染细菌的细胞上表达的抗原，其中所述细菌选自：衣原体、立克次体(rickettsia)、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌、淋球菌、克雷伯氏菌、变形杆菌、沙雷氏菌、假单胞菌、军团杆菌、白喉病菌、沙门氏菌、杆菌、霍乱杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、炭疽杆菌、鼠疫杆菌、钩端螺旋体和莱姆病菌。在某些实施方案中，靶抗原是在真菌表面上表达或优先在已感染真菌的细胞上表达的抗原，其中所述真菌选自：念珠菌(白色念珠菌、克鲁斯氏(krusei)念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌等等)、新生隐球菌(Crytococcus neoformans)、曲霉(烟曲霉、黑曲霉等等)、毛霉菌目(毛霉属、犁头霉属、根霉属等等)、丝状芽孢杆菌(Sporothrix schenkii)、皮肤癣菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西隐孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、球孢子虫(Coccidioides immitis)和组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。在某些实施方案中，靶抗原是在寄生虫的表面上表达或优先在已感染寄生虫的细胞上表达的抗原，其中所述寄生虫选自：痢疾阿米巴原虫(Entamoeba histolytica)、大肠纤毛虫(Balantidiumcoli)、福氏耐格里变形虫(Naegleriafowleri)、棘阿米巴属(Acanthamoeba sp.)、梨形鞭毛虫(Giardia lambia)、隐胞子虫属(Cryptosporidium sp.)、肺囊虫(Pneumocystiscarinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、巴贝西虫(Babesia microti)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmaniadonovani)、弓形虫(Toxoplasma gondii)、巴西日圆线虫(Nippostrongylusbrasiliensis)、肥头带绦虫(Taenia crassiceps)和马来丝虫(Brugia malayi)。特异性病原体相关抗原的非限制实例包括例如HIV gp120、HIV CD4、乙型肝炎肝糖蛋白L、乙型肝炎糖蛋白M、乙型肝炎肝糖蛋白S、丙型肝炎E1、丙型肝炎E2、肝细胞特异性蛋白、单纯疱疹病毒gB、巨细胞病毒gB、和HTLV包膜蛋白。
也可制备包含两个结合部分的双特异性结合蛋白，这些结合部分各自指向同一细胞表面上的结合伴侣(即各自指向不同靶)。这种设计尤其适用于靶向在同一细胞表面上表达两种靶的特定细胞或细胞类型。尽管靶可能单独出现在其他细胞上，但是这些结合蛋白的结合部分被选择成使得每个结合部分以相对低的亲和力结合至其靶(例如，低的微摩尔或高的纳摩尔-例如超过一百纳摩尔KD，例如500、600、700、800纳摩尔)。以此方式，在两个靶在同一细胞上邻近的情况下，长期的靶结合是有利的。
可制备包含结合至相同靶的两个结合部分的双特异性结合蛋白，这些结合部分各自在同一靶的不同表位。这种设计尤其适用于将结合蛋白成功阻断靶的机率最大化。多个细胞外循环，例如跨膜通道或细胞表面受体可被同一双特异性结合分子靶向。
可制备包含两个结合部分的双特异性结合蛋白，这些结合部分簇集并激活免疫信号传导的负调控物，以产生免疫阻抑。当靶在同一细胞上时，可实现顺向阻抑；当靶在不同的细胞上时，可实现反向阻抑。顺向阻抑可用具有抗-IgGRIIb结合部分和抗-FelD1结合部分的双特异性结合蛋白来实现，使得IgGRIIb仅在FelD1的存在下簇集，以向下调控对FelD1的免疫反应。反向阻抑，例如可通过具有抗-BTLA结合部分和特异性结合目标组织特异性抗原的结合部分的双特异性结合蛋白来实现，使得抑制性BTLA分子的簇集仅发生在选定的靶组织中，这有可能解决自身免疫疾病。
可制备活化多组分受体的双特异性结合蛋白。在这种设计中，指向受体两个组分的两个结合部分结合、交联所述受体并活化所述受体的信号传导。这可例如使用具有结合IFNAR1的结合部分和结合IFNAR2的结合部分的双特异性结合蛋白来实现，其中所述结合使所述受体交联。此类双特异性结合蛋白可提供干扰素治疗的替代方案。
可制备跨越半渗透屏障，例如血脑屏障运送结合部分的双特异性结合蛋白。在这种设计中，一个结合部分结合能够运送特定选择性屏障的靶；另一个结合部分靶向具有治疗活性的分子，其中所述具有治疗活性的靶分子无法正常穿过屏障。这种双特异性结合蛋白可用于将治疗剂引入所述治疗剂不能到达的组织。一些实例包括靶向pIGR受体以将治疗剂运送到肠或肺中，或靶向转铁蛋白受体以跨越血脑屏障运送治疗剂。
可制备将结合部分运送到特定细胞或细胞类型的双特异性结合蛋白。在这种设计中，一个结合部分靶向容易内化到细胞中的细胞表面蛋白(例如受体)。另一个结合部分靶向细胞内蛋白，其中所述细胞内蛋白的结合产生治疗效果。
结合吞噬免疫细胞的表面受体和传染性病原体(例如酵母或细菌)的表面分子的双特异性结合蛋白将传染性病原体带往吞噬免疫细胞附近，从而促进病原体被吞噬。此类设计的实例是靶向CD64或CD89分子以及病原体的双特异性抗体。
双特异性结合蛋白具有作为一个结合部分的抗体可变区和作为第二结合部分的非Ig部分。抗体可变区实现了靶向，而非Ig部分是连接至Fc的效应子或毒素。以此方式，配体(例如效应子或毒素)被递送至由抗体可变区结合的靶。
双特异性结合蛋白具有各自结合至Ig区的两个部分(例如，含有CH2和CH3区的Ig序列)，使得任何两个蛋白部分可相对于Fc邻近彼此。这种设计的实例包括圈套(trap)，例如同-或异型二聚体圈套分子。
表达增强性基因座
适用于本发明的表达增强性基因座包括例如美国专利8,389,239所述的包含与SEQ ID NO:1实质上同源的核苷酸序列的基因座(本文也称为“
Figure BDA0001834224260000231
基因座”)、美国专利申请序列号14/919,300所述的包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3实质上同源的核苷酸序列的基因座(本文也称为“YARS基因座”)以及本领域中记载的其他表达增强性基因座和序列(例如，US 20150167020A1和美国专利6,800,457)。
在一些实施方案中，用于本发明的表达增强性基因座选自：包含与SEQ ID NO:1实质上同源的核苷酸序列的基因座，或包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3实质上同源的核苷酸序列的基因座。这些基因座含有不仅提供可操作地连接至序列(即在所述序列内或紧邻所述序列)所整合的基因的增强表达的序列，相较于基因组中的其他序列，也表现出更高的重组效率和改善的整合稳定性。
已经从CHO细胞鉴定了SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。发现其他哺乳动物物种(如人类或小鼠)对所鉴别的表达增强区具有有限的同源性，然而可以在来源于灰仓鼠的其他组织类型或其他同源物种的细胞系中发现同源序列，并且可以通过本领域中众所周知的技术分离出来。例如，有人可以通过交叉物种杂交或基于PCR的技术鉴别其他同源序列。此外，可以通过本领域熟知的定点或随机诱变技术在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列中进行改变。随后可测试所得序列变体的表达增强活性。具有表达增强活性的、与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少约90％核酸同一性的DNA可通过常规实验分离，并且预期表现出表达增强活性。
整合位点、一个或多个外源核酸插入的位点或核苷酸位置可以在任何表达增强序列(诸如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3)之内或相邻的任何位置。在目标基因座中或相邻的特定染色体位置是否支持整合外源基因的稳定整合和有效转录可根据本领域熟知的标准程序来确定，例如如美国专利8,389,239和美国申请序列号14,919,300中所述。
本文所考虑的整合位点位于表达增强序列内、或紧邻所述序列，例如小于约1kb、500个碱基对(bp)、250bp、100bp、50bp、25bp、10bbp、或小于约5bp，其在相对于染色体DNA上的表达增强序列位置的上游(5')或下游(3')。在又一些其他实施方案中，所采用的整合位点位在相对于染色体DNA上的表达增强序列位置的上游(5')或下游(3')的约1000、2500、5000或更多个碱基对处。
在本领域中应理解，为了高效复制和转录染色体DNA，采用大基因组区，如支架/基质附着区。支架/基质附着区(S/MAR)，也称为支架附着区(SAR)或基质相关或基质附着区(MAR)，是核基质附着的真核基因组DNA区。在不受任何一个理论束缚的情况下，S/MAR通常定位到非编码区，使给定转录区(例如染色质结构域)与其相邻者分开，并且还提供用于机器加工和/或结合实现转录的因子(如DNA酶或聚合酶的识别位点)的平台。一些S/MAR已表征为约14-20kb长(Klar等人,2005,Gene 364:79-89)。因此，预期在表达增强性基因座处(例如，在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之内或附近)的基因整合赋予增强表达。在一些实施方案中，包含外源核酸序列的宿主细胞表现出高的比生产率，所述外源核酸序列编码整合在表达增强的基因座中的特异性位点处的双特异性抗原结合蛋白。在其他实施方案中，编码双特异性抗原结合蛋白的宿主细胞具有至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、或30皮克/细胞/天(pcd)的比生产率。
在一些实施方案中，整合位点在包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的基因座内。在特定实施方案中，所述整合位点在SEQ ID NO:1的核苷酸序列内或紧邻SEQ ID NO:1的核苷酸序列。在具体实施方案中，所述整合位点在SEQ ID NO:1内的位置，其选自跨越以下编号的位置的核苷酸：10-13,515；20-12,020；1,020-11,020；2,020-10,020；3,020-9,020；4,020-8,020；5,020-7,020；6,020-6,920；6,120-6,820；6,220-6,720；6,320-6,620；6,420-6,520；6,460-6,500；6,470-6,490；和6,475-6,485。在其他实施方案中，所述整合位点位于选自以下的序列中：SEQ ID NO:1的核苷酸5,000-7,400、5,000-6,500、6,400-7,400；和SEQID NO:1的核苷酸6,400-6,500。在特定实施方案中，所述整合位点在SEQ ID NO:1的核苷酸6471至6473的"act"三联体之前、之后或内部。
在一些实施方案中，整合位点在包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核苷酸序列的基因座内。在特定实施方案中，所述整合位点在SEQ ID NO:2的核苷酸序列内或紧邻SEQ IDNO:2的核苷酸序列。在具体实施方案中，所述整合位点在SEQ ID NO:3的核苷酸序列内或紧邻SEQ ID NO:3的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述整合位点在SEQ ID NO:3的核苷酸1990-1991、1991-1992、1992-1993、1993-1994、1995-1996、1996-1997、1997-1998、1999-2000、2001-2002、2002-2003、2003-2004、2004-2005、2005-2006、2006-2007、2007-2008、2008-2009、2009-2010、2010-2011、2011-2012、2012-2013、2013-2014、2014-2015、2015-2016、2016-2017、2017-2018、2018-2019、2019-2020、2020-2021或2021-2022内。在特定实施方案中，所述整合在SEQ ID NO:3的核苷酸2001-2022处或在SEQ ID NO:3的核苷酸2001-2022内。在一些实施方案中，外源核酸插入在SEQ ID NO:3的核苷酸2001-2002或核苷酸2021-2022处或所述核苷酸内，并且SEQ ID NO:3的核苷酸2002-2021由于插入而缺失。
位点特异性整合到表达增强性基因座中
多个外源核酸以位点特异性方式整合到表达增强性基因座中，即本文公开的表达增强性基因座内的一个特异性位点中可以以多种方式实现，包括例如通过本领域所述的同源重组和重组酶介导的盒交换(参见例如美国专利8,389,239和本文公开的领域)。
在一些实施方案中，提供了在表达增强性基因座内含有至少两个(即，两个或更多个)不同的重组酶识别序列(RRS)，以便于整合含有所关注的多个外源核酸或基因的核酸序列的细胞。此类细胞可通过各种方式，包括同源重组，例如下文和本领域所述，例如美国专利8,389,239和其中所述公开的技术，将含有两个或更多个RRS的外源核酸序列引入所需的基因座而获得。
在特定实施方案中，提供了在表达增强性基因座中含有超过两个不同重组酶识别序列(RRS)的细胞，所述重组酶识别序列便于整合多个外源核酸。在具体实施方案中，提供了在表达增强性基因座内含有三个不同重组酶识别序列(RRS)的细胞，所述重组酶识别序列可介导两个单独外源核酸的整合，例如，其中所述基因组中的5'RRS和中间RRS匹配侧接待整合的第一外源核酸的5'RRS和3'RRS，并且基因组中的中间RRS和3'RRS匹配侧接待整合的第二外源核酸的5'RRS和3'RRS。
合适的RRS可选自：LoxP、Lox511、Lox5171、Lox2272、Lox2372、Loxm2、Lox-FAS、Lox71、Lox66及其突变体，其中所述位点特异性重组酶是Cre重组酶或其衍生物用于实现重组酶介导的盒式交换(RMCE)。在其他实例中，合适的RRS可选自：FRT、F3、F5、FRT突变体-10、FRT突变体+10及其突变体，在此情形下，位点特异性重组酶Flp重组酶或其衍生物用于实现RMCE。在另一个实例中，RRS可选自：attB、attP及其突变体，在此情况下，位点特异性重组酶phiC31整合酶或其衍生物用于实现RMCE。
在其他实施方案中，通过同源重组技术修饰天然细胞，以将含有多个外源核酸的核酸序列整合到表达增强性基因座内的特异性位点。
对于同源重组，同源聚核苷酸分子(即，同源臂)排列并交换它们的一段序列。如果转基因侧接同源基因组序列，那么可以在此交换期间引入转基因。在一个实例中，重组酶识别位点可经由同源重组引入宿主细胞基因组的整合位点处。在其他实例中，将含有多个外源核酸，例如共同编码双特异性抗原结合蛋白的多个核酸的核酸序列插入宿主基因组，其中所述核酸序列被靶标基因座处的序列同源的序列(“同源臂”)侧接。
可以通过在染色体DNA中的整合位点处引入断裂来促进真核细胞中的同源重组。这可以通过将某些核酸酶靶向特定整合位点而实现。在目标基因座识别DNA序列的DNA结合蛋白是本领域中已知的。基因靶向载体也用于促进同源重组。
用以实现同源重组的基因靶向载体构建和核酸酶选择在本发明所属领域的技术人员的技术范围内。在一些实例中，具有模块化结构并含有单独锌指结构域的锌指核酸酶(ZFN)识别目标序列中的特定3-核苷酸序列(例如靶向整合的位点)。一些实施方案可利用具有靶向多个靶序列的单独锌指结构域的组合的ZFN。转录活化因子样(TAL)效应子核酸酶(TALEN)也可以用于位点特异性基因组编辑。TAL效应子蛋白DNA结合域通常与限制性核酸酶诸如FokI的非特异性裂解域组合使用。在一些实施方案中，将包含TAL效应子蛋白DNA结合域和限制性核酸酶裂解域的融合蛋白用于识别和裂解本发明基因座内的靶序列处的DNA(Boch J等人,2009Science 326:1509-1512)。RNA指导的核酸内切酶(RGEN)是从细菌适应性免疫机制开发的可编程的基因组工程化工具。在该系统(成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关性(Cas)免疫反应)中，蛋白Cas9当与两个RNA(其中一个引导靶选择)复合时形成序列特异性核酸内切酶。RGEN由组分(Cas9和tracrRNA)以及靶特异性CRISPRRNA(crRNA)组成。DNA靶裂解的效率以及裂解位点的位置均基于前间区序列邻近基序(PAM)的位置而变化，所述基序是针对靶识别的额外要求(Chen,H.等人,J.Biol.Chem.2014年3月14作为手稿M113.539726在线发表)。可通过将很多这些序列与CHO基因组对齐来鉴定特异性靶向基因座的独特序列(诸如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3)，所述对齐可以揭示具有16-17个碱基对配对的潜在脱靶位点。
在一些实施方案中，将携带所关注的核酸(例如，含有任选地侧接一个或多个选择性标记基因的一个或多个RRS的核酸，或含有共同编码双特异性抗原结合蛋白的多个外源核酸的核酸)(所述核酸被5'和3'同源臂侧接)的靶向载体引入具有一个或多个另外的载体或mRNA的细胞。在一个实施方案中，所述一个或多个额外载体或mRNA含有编码位点特异性核酸酶的核苷酸序列，所述位点特异性核酸酶包括(但不限于)锌指核酸酶(ZFN)、ZFN二聚体、转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)、TAL效应子结构域融合蛋白和RNA指导的DNA核酸内切酶。在某些实施方案中，所述一个或多个载体或mRNA含有包括指导RNA、tracrRNA和编码Cas酶的核苷酸序列的第一载体，以及包含供体(外源)核苷酸序列的第二载体。此类供体序列含有编码目标基因的核苷酸序列，或识别序列，或包含旨在用于靶向插入的这些外源元件中的任一个的基因盒。在使用mRNA的情况下，mRNA可以借助于本领域的技术人员已知的常见转染方法转染到细胞中并且可以编码酶，例如转座酶或核酸内切酶。虽然引入到细胞中的mRNA可以是瞬时的并且未整合到基因组中，但是所述mRNA可以携载对于进行整合来说所必需或有益的外源性核酸。在一些情况下，如果仅需要短期表达来实现核酸的所需整合，那么选择mRNA是为了消除辅助性聚核苷酸副作用持久的任何风险。
用于位点特异性整合的载体
本文提供通过位点特异性整合将外源核酸引入表达增强性基因座的核酸载体。合适的载体包括：被设计成含有外源核酸序列的载体，所述外源核酸序列侧接RRS以经由RMCE进行整合；以及被设计成含有目标外源核酸序列的载体，所述目标外源核酸序列侧接同源臂以经由同源重组进行整合。
在多个实施方案中，提供了经由RMCE实现位点特异性整合的载体。在一些实施方案中，载体被设计为实现多个核酸同时整合到靶标基因座。与连续整合相比，同时整合允许高效和快速分离产生双特异性抗原结合蛋白的所需克隆。
在一些实施方案中，提供了一组载体，其包括两个或更多个载体，每个载体含有侧接一个或多个核酸的至少两个RRS，其中该组的载体中的核酸共同编码双特异性抗原结合蛋白。
在一个实施方案中，一组载体包括第一载体，所述第一载体从5'至3'包含：第一RRS、包含编码第一LCF的核苷酸序列的第一核酸和第三RRS；第二载体，所述第二载体从5'至3'包含第三RRS、包含编码第一HCF的核苷酸序列的第二核酸、第二RRS；其中第一核酸或第二核酸还包含编码第二HCF的核苷酸序列；并且其中第一HCF和第二HCF以及第一LCF编码双特异性抗原结合蛋白的区(例如，可变区)。在一些实施方案中，编码第二HCF的核苷酸序列包括在第一载体上的第一核酸中(即，一个载体上的第一LCF和第二HCF)，任选地置于例如编码第一LCF的核苷酸序列的下游；在其他实施方案中，编码第二HCF的核苷酸序列包括在第二载体上的第二核酸中(一个载体上的第一HCF和第二HCF)。
编码HCF的核苷酸序列可以编码氨基酸，例如恒定区的氨基酸或一个或多个结构域，或编码整个恒定区。在特定实施方案中，编码HCF或LCF的核苷酸序列可以编码一个或多个恒定域，诸如CL、CH1、铰链、CH2、CH3或它们的组合。在某些实施方案中，编码HCF的核苷酸序列可以编码CH3结构域。例如，编码第一HCF的核苷酸序列可编码第一CH3结构域，并且编码第二HCF的核苷酸序列可编码第二CH3结构域。第一CH3结构域和第二CH3结构域可相同，或在至少一个氨基酸中不同。CH3结构域或恒定区的差异可以采用本文所述的双特异性抗原结合蛋白的任何形式，例如产生不同蛋白A结合特征、静电导向或产生“钮入孔”形式的差异。与任何氨基酸序列差异无关，所述两个编码HCF的核苷酸序列的差异也可在于所述两个核苷酸序列之一是经密码子修饰的。
在一些实施方案中，每个编码HCF核苷酸序列独立地和可操作地连接至转录调控序列，包括例如启动子。在一些实施方案中，引导所述两个含HCF多肽的转录的启动子相同。在一些实施方案中，引导两个含有HCF的多肽的转录的启动子，以及引导含有LCF的多肽的转录的启动子均相同(例如，CMV启动子)。在一些实施方案中，每个编码HCF的或编码LCF的核苷酸序列独立地并且可操作地连接至诱导型或阻抑型启动子。诱导型或阻抑型启动子允许生产，例如，仅在生产期(加料分批培养)而不在生长期(种子培养)期间发生。诱导型或阻抑型启动子也允许一个或多个目标基因的差异化表达。在一些实施方案中，每个编码HCF的和/或编码LCF的核苷酸序列独立地并且可操作地连接至至少一个TetR操纵子(TetO)或Arc操纵子(ArcO)上游的启动子。在另外其他实施方案中，每个编码HCF的和/或编码LCF的核苷酸序列独立地并且可操作地连接至CMV/TetO或CMV/ArcO杂合启动子。杂合启动子(也称为调控融合蛋白)的实例可在2003年12月11日公开的国际专利公开号WO03101189A1中找到(以引用方式并入本文)。
在一些实施方案中，第一载体中的第一核酸还包含位于第一载体中的第三RRS的5’的选择性标记基因的5'部分；并且第二核酸还包含位于第二载体中的第三RRS的3'的选择性标记基因的其余3'部分。在这些实施方案中，第一RRS、第二RRS和第三RRS介导第一核酸和第二核酸的位点特异性整合，使选择性标记基因的5'部分和3'部分在便于选择的适当和同时整合的克隆中进行连接。在某些实施方案中，第一载体中的第三RRS被设计在选择性标记基因的内含子的5'部分内；并且第二载体中的第三RRS被设计在选择性标记基因的内含子的3'部分内。在其他实施方案中，第一载体中的第三RRS被设计成位于启动子和其可操作地连接到的选择性标记基因之间(但在另一个载体上是分离的)；第一载体中的第三RRS被设计在启动子的3’；并且第二载体中的第三RRS被设计在选择性标记基因的5’。
上述一组载体可包括多于两个载体。例如，除上述两个载体之外，该组还可包括包含侧接编码第二LCF的核苷酸序列的至少两个RRS的第三载体。该组还可包括编码一个或多个识别RRS的重组酶的载体。
在其他实施方案中，提供了通过同源重组实现位点特异性整合的载体。在一些实例中，整合到宿主基因组的多核苷酸序列可以是DNA序列，诸如RRS或侧接一个或多个选择性标记基因的多个RRS，以产生一个或多个RRS整合到所需基因座中，用于编码双特异性抗原结合蛋白的核酸的后续整合的细胞。在其他实例中，待整合到宿主基因组的多核苷酸序列包括共同编码双特异性抗原结合蛋白的多个核酸。例如，多核苷酸序列包括编码双特异性抗体的两个不同重链和共同轻链的核酸。在一些实施方案中，共同编码双特异性抗原结合蛋白的多个核酸各自独立地(即，分别)可操作地连接至调控序列(诸如启动子、增强子、转录终止序列或它们的组合)，也就是说，多个核酸中的每一个的调控序列(诸如启动子)是分开的，这些核酸可以是相同的或不同的(即，含有相同的或不同的核苷酸序列)。在多个核酸中的一个核酸包括多个编码序列的情况下，每个编码序列或编码多肽的N-末端部分的每个核苷酸序列独立地和可操作地连接至其自身的调控序列(诸如启动子)。
选择与表达增强性基因座内的序列同源的序列并且包括选定的序列作为靶向载体中的同源臂完全在技术人员的技术范围内。在一些实施方案中，载体或构建体包含第一同源臂和第二同源臂，其中所述合并的第一同源臂和第二同源臂包含置换所述基因座内的内源性序列的靶向序列。在其他实施方案中，第一同源臂和第二同源臂包含整合或插入在所述基因座内的内源性序列内的靶向序列。在一些实施方案中，所述同源臂含有与存在于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中的核苷酸序列同源的核苷酸序列在特定实施方案中，所述载体含有：5'同源臂，其具有对应于SEQ ID NO:3的核苷酸1001-2001的核苷酸序列；和3'同源臂，其具有对应于SEQ ID NO:3的核苷酸2022-3022的核苷酸序列。同源臂，例如第一同源臂(也称为5'同源臂)和第二同源臂(也称为3’同源臂)，与基因座内的靶向序列同源。5'到3’的同源臂可以扩增基因座内包含至少1kb、或至少约2kb、或至少约3kb、或至少约4kb、或至少5kb、或至少约10kb的区或靶向序列。在其他实施方案中，选择用于第一和第二同源臂的靶向序列的核苷酸总数包含至少1kb、或至少约2kb、或至少约3kb、或至少约4kb、或至少5kb、或至少约10kb。在一些情况下，5'同源臂与3’同源臂(与靶向序列同源)之间的距离包含至少5bp、10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、或至少1kb、或至少约2kb、或至少约3kb、或至少约4kb、或至少5kb、或至少约10kb。在SEQ ID NO:3的核苷酸1001-2001和2022-3022被选择作为5'和3'同源臂的情况下，所述两同源臂之间的距离可为20个核苷酸(对应于SEQID NO:3的核苷酸2002-2021)；此类同源臂可介导外源核酸序列整合到包含SEQ ID NO:3的基因座中，例如在SEQ ID NO:3的核苷酸1990-2021或2002-2021内，并同时缺失SEQ ID NO:3的核苷酸2002-2021。
本文公开的用于以位点特异性地整合到表达增强性基因座中来引入外源核酸的载体可包括附加的基因和序列，以用于引导目标外源核酸和所编码多肽的表达，并且用于选择和鉴定目标外源核酸已成功整合进入的细胞。下文还描述了此类另外的序列包括例如转录和翻译调控序列、选择性标记基因等等。
调控序列
本文所公开的用于将外源核酸以位点特异性方式引入表达增强性基因座中的载体，和由于位点特异性整合而获得的细胞，可包括用于引导目标外源核酸和经编码的多肽的表达的调控序列。调控元件包括转录启动子、增强子、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译终止的序列。转录和翻译的控制序列可通过病毒来源提供。例如，常用的启动子和增强子来源于病毒，诸如多瘤病毒、腺病毒2、猿猴病毒40(SV40)、小鼠或人类巨细胞病毒(CMV)、CMV立即早期(CMV-IE)或CMV主要IE(CMV-MIE)启动子，以及RSV、SV40晚期启动子、SL3-3、MMTV、泛素(Ubi)、泛素C(UbC)和HIV LTR启动子。病毒基因组启动子、控制和/或信号序列可用于驱动表达，所提供的这类控制序列与所选择的宿主细胞相容。还可以使用非病毒细胞启动子(例如β-球蛋白和EF-1α启动子)，取决于其中将表达目标蛋白的细胞类型。来源于SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40起点、早期和晚期启动子、增强子、剪接和聚腺苷酸化位点可用于提供对外源DNA序列的表达有用的其他基因元件。早期和晚期启动子是特别有用的，因为它们两者易于从SV40病毒作为还包含SV40病毒复制起点的片段活动(Fiers等人,Nature 273:113,1978)。也可使用较小或较大的SV40片段。通常，包括从位于SV40复制起点中的Hind III位点向BglI位点延伸的大约250bp序列。诱导型启动子(例如，由化合物、辅因子、调控蛋白诱导)是可以使用的，并且尤其可用于允许仅在生产期(分批加料培养)而不是生长期(种菌培养)出现的抗原结合蛋白产生。诱导型或抑制型启动子的实例包括醇脱氢酶I基因启动子、四环素响应启动子系统、糖皮质激素受体启动子、雌激素受体启动子、蜕皮激素受体启动子、基于金属硫蛋白的启动子和基于T7聚合酶的启动子。先前已经说明了适用于通过双顺反子载体表达多个转录体的序列(Kim S.K.和WoldB.J.,Cell 42:129,1985)，并可用于本发明。用于以多顺反子表达蛋白的合适的策略的实例包括使用2A肽(Szymczak等人,Expert Opin Biol Ther 5:627–638(2005))和使用内核糖体进入位点("IRES")，两者都是本领域熟知的。其他类型的表达载体也将是有用的，例如描述于美国专利第4,634,665号(Axel等人)和美国专利第4,656,134号(Ringold等人)中的那些。
选择性标记
本文所公开的用于将外源核酸以位点特异性方式引入表达增强性基因座中的载体，和由于位点特异性整合而获得的细胞，可包括一个或多个可选标志基因。
在一些实施方案中，可选标志基因赋予抗药性，例如描述于Kaufman,R.J.(1988)Meth.Enzymology185:537的表1中的那些，并且包括DHFR-MTX抗性、P-糖蛋白和多重抗药性(MDR)-各种亲脂性细胞毒性剂(例如阿霉素(adriamycin)、秋水仙碱、长春新碱)、和腺苷脱氨酶(ADA)-Xyl-A或腺苷和2'-脱氧柯福霉素(2'-deoxycoformycin)。其他显性选择性标记包括来源于微生物的抗生素抗性基因，例如新霉素、卡那霉素或潮霉素抗性。哺乳动物宿主存在数种合适的选择系统(Sambrook同上,第16.9-16.15页)。也已描述采用两个显性选择性标记的共转染方案(Okayama和Berg,Mol.Cell Biol 5:1136,1985)。
在其他实施方案中，可选标志基因编码提供或能够生成用于识别已经或尚未成功插入和/或置换的基因盒的可检测信号的多肽，视情况而定。合适的实例包括荧光标志物或蛋白、催化生成可检测信号的化学反应的酶等等。荧光标记的实例是本领域中众所周知的，包括(但不限于)Discosoma珊瑚(DsRed)、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、蓝绿色荧光蛋白(CFP)、增强型蓝绿色荧光蛋白(eCFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(eYFP)和远红外荧光蛋白(例如mKate、mKate2、mPlum、mRaspberry或E2-crimson。还参见例如Nagai,T.等人,2002Nature Biotechnology 20:87-90；Heim,R.等人1995年2月23日Nature 373:663-664；和Strack,R.L.等人2009Biochemistry 48:8279-81。
用于制备双特异性抗原结合蛋白的系统
在另一个方面，本公开提供这样的系统：其包括细胞和一个或多个载体的组合，并且可用于制备外源核酸整合到表达增强性基因座内，共同编码双特异性抗原结合蛋白的细胞。例如，所述系统可以试剂盒的形式提供。
在一些实施方案中，系统被设计为允许有效载体构建和多个外源核酸通过RMCE同时整合到增强表达基因座内的特异性位点。同时整合允许快速分离所需克隆，并且使用一个增强表达基因座对于产生稳定细胞系也是重要的。
在一些实施方案中，提供了这样的系统，其包括上文所述的被设计为通过RMCE整合多个外源核酸的一组载体中的任一者和含有RRS的细胞，所述RRS整合到增强表达基因座内的特异性位点，并且与所述一组载体中的RRS匹配。例如，系统包括细胞和一组载体，其中细胞从5'至3’含有整合到其基因组的增强表达基因座内的：第一RRS、第一外源核酸、第二RRS、第二外源核酸和第三RRS，其中三个RRS是彼此不同的；其中所述一组载体包括第一载体，所述第一载体从5'至3'包含第一RRS、包含编码第一LCF(例如，第一VL)的核苷酸序列的第一核酸和第二RRS；第二载体，所述第二载体包含第二RRS、包含编码第一HCF(例如，第一VH)的核苷酸序列的第二核酸和第三RRS；并且其中第一核酸或第二核酸还包含编码第二HCF(例如，第二VH)的核苷酸序列。在将载体引入细胞时，载体中的第一核酸和第二核酸通过第一RRS、第二RRS和第三RRS介导的重组而整合到增强表达基因座中。为了便于筛选核酸从载体适当整合到基因座的转染子，系统的细胞中的第一外源核酸可包括第一选择性标记基因，并且细胞中的第二外源核酸可包括第二选择性标记基因，其中第一选择性标记基因和第二选择性标记基因是彼此不同的，并且也与载体提供的任何选择性标记基因不同；在特定实施方案中，第一选择性标记基因和第二选择性标记基因编码荧光蛋白(它可提供阴性选择)，并且载体上的第一核酸和第二核酸提供断裂形式的另外选择性标记基因，以提供阳性选择。阴性选择单独可提供快速克隆分离，但通过预期重组分离克隆的效率可为有限的(约1％)。阴性选择与阳性选择(新荧光或对药物或抗生素的抗性)结合可显著提高阳性克隆的分离效率(达约80％)。
所述系统可包括附加的组分、试剂或信息，例如，通过转染将系统中的(多个)载体引入系统中的细胞的方案。非限制性转染方法包括基于化学的转染方法，包括使用脂质体；纳米颗粒；磷酸钙(Graham等人(1973).Virology 52(2):456-67,Bacchetti等人(1977)Proc Natl Acad Sci USA 74(4):1590-4和Kriegler,M(1991).Transfer andExpression:A Laboratory Manual.New York:W.H.Freeman and Company.第96-97页)；树枝状聚合物；或阳离子聚合物，如DEAE-葡聚糖或聚乙烯亚胺。非化学法包括电穿孔；声穿孔；和光学转染。基于粒子的转染包括使用基因枪、磁体辅助转染(Bertram,J.(2006)Current Pharmaceutical Biotechnology 7,277-28)。还可以使用病毒方法进行转染。mRNA递送包括使用TransMessengerTM和
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的方法(Bire等人BMC Biotechnology2013,13:75)。将异源DNA引入到细胞中的一种常用方法是磷酸钙沉淀，如Wigler等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:3567,1980)所述。聚乙烯诱导的细菌原生质体与哺乳动物细胞的融合(Schaffner等人,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:2163)是另一种适用于引入异源DNA的方法。还可以使用电穿孔将DNA直接引入到宿主细胞的细胞质中，如Potter等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:7161,1988)或Shigekawa等人(BioTechniques 6:742,1988)所述。已描述适用于将异源DNA引入到哺乳动物细胞中的其他试剂，如LipofectinTM试剂和LipofectamineTM试剂(Gibco BRL,Gaithersburg,Md.)。这两种可商购的试剂均用于形成脂质-核酸复合物(或脂质体)，当应用于培养的细胞时，有利于核酸摄入细胞中。
用于制备双特异性抗原结合蛋白的方法
本公开还提供了制备双特异性抗原结合蛋白的方法。通过利用本发明的方法，双特异性抗原结合蛋白(例如，双特异性抗体)可以以高滴度和/或高比生产率(皮克/细胞/天)产生。在一些实施方案中，双特异性抗原结合蛋白以至少5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L、35mg/L、40mg/L、45mg/L、50mg/L或更大的滴度产生。在一些实施方案中，双特异性抗原结合蛋白以至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％或更高的双特异性抗原结合蛋白滴度与总抗原结合蛋白滴度之比来产生。在一些实施方案中，双特异性抗原结合蛋白以至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15皮克/细胞/天或更高的比生产率产生，所述比生产率根据每天每个细胞产生的总抗原结合蛋白(单位皮克)来测定。
在一个实施方案中，所述方法利用本文公开的系统并通过转染将系统中的载体引入系统中的细胞。可以筛选和鉴定其中外源核酸已通过RMCE适当整合到细胞的靶标增强表达基因座的转染细胞。两个含有HCF的多肽和至少一个含有LCF的多肽可以从整合核酸表达，并且含有全部三个多肽的双特异性抗原结合蛋白可以从所鉴定的转染细胞获得，并且使用已知的方法纯化。
在一些实施方案中，方法包括(i)提供包括细胞和一组载体的系统，其中所述细胞从5'至3'含有整合到其基因组的增强表达基因座内的：第一RRS、第一外源核酸、第二RRS、第二外源核酸和第三RRS，其中三个RRS是彼此不同的；其中所述一组载体包括第一载体，所述第一载体从5'至3'包含第一RRS、包含编码第一LCF(例如，第一VL)的核苷酸序列的第一核酸和第二RRS；第二载体，所述第二载体包含第二RRS、包含编码第一HCF(例如，第一VH)的核苷酸序列的第二核酸和第三RRS；并且其中第一核酸或第二核酸还包含编码第二HCF(例如，第二VH)的核苷酸序列；(ii)将载体同时引入细胞；并且(iii)筛选其中载体中的第一核酸和第二核酸通过第一RRS、第二RRS和第三RRS介导的重组同时整合到增强表达基因座的转化细胞。
在方法的特定实施方案中，为了便于筛选核酸从载体适当整合到基因座的转化子，系统的细胞中的第一外源核酸可包括第一选择性标记基因，并且细胞中的第二外源核酸可包括第二选择性标记基因，其中第一选择性标记基因和第二选择性标记基因是彼此不同的；并且载体上的第一核酸和第二核酸共同编码断裂形式的另外选择性标记，其中在同时整合后提供了编码另外的选择性标记基因的完整序列。可进行转化子的筛选以针对第一选择性标记和第二选择性标记(阴性选择)和针对另外的选择性标记(阳性选择)进行选择。
在另一个实施方案中，方法仅使用外源核酸序列整合到细胞的增强表达基因座内的特异性位点的细胞，其中外源核酸序列编码双特异性抗原结合蛋白，并且从细胞表达双特异性抗原结合蛋白。特异性整合位点内的克隆表达盒是连续的。
通过以下实施例进一步说明本说明书，所述实施例不应解释为以任何方式具有限制性。所有引用文献(包括贯穿本申请所引用的参考文献、发布的专利和公布的专利申请)的内容特此以引用的方式明确并入。
实施例
实施例1：双特异性抗体表达质粒的克隆：
可以使用本领域已知的方法从杂交瘤细胞、B细胞、浆细胞或重组抗体基因文库克隆双特异性抗体的重链和轻链组分。例如，可以通过五次初级RACE PCR或使用前导肽、框架1序列、框架4序列或恒定区序列的引物进行的PCR从杂交瘤或B细胞克隆抗体。或者，抗体表达细胞中的抗体基因或mRNA可以通过新一代测序技术进行测序，随后通过生物信息学鉴定。对抗体蛋白进行测序并通过合成DNA技术克隆对应的抗体基因也是可行的。重组抗体文库(诸如酵母或噬菌体文库)也是抗体基因的来源。
CHO表达细胞系RSX4189-1,RSX4187-1,RSX4191-1和RSX4188-1各自产生由三个不同多肽：AbC1、AbC2和AbC3组成的双特异性抗体(图5)。为了产生用于构建RSX4189-1的质粒，AbC1质粒通过Mfe I消化来线性化，Mfe I位于AbC1基因的3’。将通过Mfe I消化从AbC2质粒切除的AbC2表达盒连接至线性化AbC1质粒的Mfe I位点。将连接产物转化至DH10B大肠杆菌(E.coli.)。在转化和在含有氨苄青霉素的LB培养基中生长之后，分析具有含AbC1和AbC2基因的所需质粒的单个大肠杆菌克隆。通过Sanger测序确认AbC3质粒和AbC1-AbC2双表达质粒的大量制备DNA的序列。使用lipofectamine将这两个质粒与Cre表达质粒pRG858一起转染至具有
Figure BDA0001834224260000351
基因座处的RRS1和RRS3位点的
Figure BDA0001834224260000352
宿主细胞。用抗生素选择转染细胞12天，然后将重组细胞合并为RSX4189-1。
为了产生用于构建RSX4187-1的质粒，将Mlu I和Nhe I位点侧接的AbC3表达盒克隆到AbC2质粒中的Mlu I和Spe I位点AbC2基因的3’。使用lipofectamine将组合AbC2-AbC3质粒、AbC1质粒和Cre质粒pRG858共转染至
Figure BDA0001834224260000353
宿主细胞。将已经历RMCE的细胞合并为RSX4187-1。
为了产生用于构建RSX4191-1的质粒，将AbC3表达盒克隆到AbC1质粒中的Mfe I位点AbC1基因的3’。使用lipofectamine将组合AbC1-AbC3质粒、AbC2质粒和Cre质粒pRG858共转染至
Figure BDA0001834224260000354
宿主细胞。将已经历RMCE的细胞合并为RSX4191-1。
为了产生用于构建RSX4188-1的质粒，将Mlu I和Nhe I位点侧接的AbC2表达盒克隆到AbC3质粒中的Mlu I和Spe I位点AbC3基因的3’。使用lipofectamine将组合AbC3-AbC2质粒、AbC1质粒和Cre质粒pRG858共转染至
Figure BDA0001834224260000355
宿主细胞。将已经历RMCE的细胞合并为RSX4188-1。
实施例2：来自
Figure BDA0001834224260000363
基因座的双特异性抗体的表达
在无血清培养基中悬浮培养双特异性抗体表达细胞系RSX4189-1、RSX4187-1、RSX4191-1和RSX4188-1。为了定量双特异性抗体表达水平，在Guava flow流式细胞仪上对培养物的细胞数计数，并在含有200万个细胞/ml培养基的新鲜摇瓶中开始培养。4天后，在离心移除细胞之后收集废培养基。使用双特异性抗体特异性的蛋白A HPLC分析测定双特异性抗体滴度。从RSX4189-1、RSX4187-1、RSX4191-1和RSX4188-1表达的双特异性抗体蛋白的滴度分别为37.8mg/L、40.5mg/L、48.3mg/L和21.8mg/L。从这些细胞系表达的所有抗体蛋白(包括双特异性抗体蛋白和单特异性抗体蛋白)的总滴度，以及双特异性抗体蛋白滴度与总抗体蛋白滴度之比如下表所示。
Figure BDA0001834224260000361
序列表
SEQ ID NO:1
13515个碱基
DNA
中国仓鼠
Figure BDA0001834224260000362
Figure BDA0001834224260000371
Figure BDA0001834224260000381
Figure BDA0001834224260000391
Figure BDA0001834224260000401
Figure BDA0001834224260000411
Figure BDA0001834224260000421
Figure BDA0001834224260000431
SEQ ID NO:2
14931个碱基
DNA
中国仓鼠
misc_feature(2176)..(2239)
n为a、c、g、t或核苷酸缺失
Figure BDA0001834224260000441
Figure BDA0001834224260000451
Figure BDA0001834224260000461
Figure BDA0001834224260000471
Figure BDA0001834224260000481
Figure BDA0001834224260000491
Figure BDA0001834224260000501
Figure BDA0001834224260000511
SEQ ID NO:3
4001个碱基
DNA
中国仓鼠
Figure BDA0001834224260000521
Figure BDA0001834224260000531
Figure BDA0001834224260000541
序列表
<110> 瑞泽恩制药公司
<120> 基于使用表达增强性基因座来制备抗体
的组合物和方法
<130> 32354PCT (T0047WO01)
<150> 62/325,385
<151> 2016-04-20
<160> 3
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 13515
<212> DNA
<213> 中国仓鼠
<400> 1
tctagaaaca aaaccaaaaa tattaagtca ggcttggctt caggtgctgg ggtggagtgc 60
tgacaaaaat acacaaattc ctggctttct aaggcttttt cggggattca ggtattgggt 120
gatggtagaa taaaaatctg aaacataggt gatgtatctg ccatactgca tgggtgtgta 180
tgtgtgtgta tgtgtgtctg tgtgtgtgcc cagacagaaa taccatgaag gaaaaaaaca 240
cttcaaagac aggagagaag agtgacctgg gaaggactcc ccaatgagat gagaactgag 300
cacatgccag aggaggtgag gactgaacca ttcaacacaa gtggtgaata gtcctgcaga 360
cacagagagg gccagaagca ctcagaactc cagggggtca ggagtggttc tctggaggct 420
tctgcccttg gaggttcctg aggaggaggc ttccatattg aaaatgtagt tagtggccgt 480
ttccattagt acagtgacta gagagagctg agggaccact ggactgaggc ctagatgctc 540
agtcagatgg ccatgaaagc ctagacaagc acttccgggt ggaaaggaaa cagcaggtgt 600
gaggggtcag gggcaagtta gtgggagagg tcttccagat gaagtagcag gaacggagac 660
gcactggatg gccccacttg tcaaccagca aaagcttgga tcttgttcta agaggccagg 720
gacatgacaa gggtgatctc ggtttttaaa aggctttgtg ttacctaatc acttctatta 780
gtcagatact ttgtaacaca aatgagtact tggcctgtat tttagaaact tctgggatcc 840
tgaaaaaaca caatgacatt ctggctgcaa cacctggaga ctcccagcca ggccctggac 900
ccgggtccat tcatgcaaat actcagggac agattcttca ctaggtactg atgagctgtc 960
ttggatgcaa atgtggcctc ttcattttac tacaagtcac catgagtcag gaggtgctgt 1020
ttgcacagtg tgactaagtg atggagtgtt gactgcagcc attcccggcc ccagcttgtg 1080
agagagatcc ttttaaattg aaagtaagct caaagttacc acgaagccac acatgtataa 1140
actgtgtgaa taatctgtgc acatacacaa accatgtgaa taatctgtgt acatgtataa 1200
actgtgtgaa taatctgtgt gcagcctttc cttacctact accttccagt gatcaggttt 1260
ggactgcctg tgtgctactg gaccctgaat gtccccaccg ctgtcccctg tcttttacga 1320
ttctgacatt tttaataaat tcagcggctt cccctctgct ctgtgcctag ctataccttg 1380
gtactctgca ttttggtttc tgtgacattt ctctgtgact ctgctacatt ctcagatgac 1440
atgtgacaca gaaggtgttc cctctggaga catgtgatgt ccctgtcatt agtggaatca 1500
gatgccccca aactgttgtc cagtgtttgg gaaagtgaca cgtgaaggag gatcaggaaa 1560
agaggggtgg aaatcaagat gtgtctgagt atctcatgtc cctgagtggt ccaggctgct 1620
gacttcactc ccccaagtga gggaggccat ggtgagtaca cacacctcac acatactata 1680
tccaacacac acacacacac acacacacac acgcacgcac gcacgcacgc acgcacacat 1740
gcacacacac gaactacatt tcacaaacca catacgcata ttacacccca aacgtatcac 1800
ctatacatac cacacataca cacccctcca cacatcacac acataccaca cccacacaca 1860
gcacacacat acataggcac acattcacac accacacata tacatttgtg tatgcataca 1920
tgcatacaca cacaggcaca cagacaccac acacatgcat tgtgtacgca cacatgcata 1980
cacacacata ggcacacatt gagcacacac atacatttgt gtacgcacac tacatagaca 2040
tatatgcatt tgtatatgca cacatgcatg cacacataca taggcacaca tagagcacac 2100
acatacattt gtgtatgcac acatgcacac accaatcaca tgggaagact caggttcttc 2160
actaaggttc acatgaactt agcagttcct ggttatctcg tgaaacttgg aagattgctg 2220
tggagaagag gaagcgttgg cttgagccct ggcagcaatt aaccccgccc agaagaagta 2280
ggtttaaaaa tgagagggtc tcaatgtgga acccgcaggg cgccagttca gagaagagac 2340
ctacccaagc caactgagag caaaggcaga gggatgaacc tgggatgtag tttgaacctc 2400
tgtaccagct gggcttcatg ctattttgtt atatctttat taaatattct tttagtttta 2460
tgtgcgtgaa taccttgctt gcataaatgt atgggcactg tatgtgttct tggtgccggt 2520
ggaggccagg agagggcatg gatcctccgg agctggcgtt tgagacagtt gtgacccaca 2580
gtgtggggtc tgggaactgg gtcttagtgt tccgcaagtg cagctggggc tcttaacctc 2640
tgagccatcc ctccagcttc aagaaactta ttttcttagg acatggggga agggatccag 2700
ggctttaggc ttgtttgttc agcaaatact cttttcgtgt attttgaatt ttattttatt 2760
ttactttttt gggatagaat cacattctgc agctcaggct gggcctgaac tcatcaaaat 2820
cctcctgtct cagtctacca ggtgataaga ttactgatgt gagcctggct ttgacaagca 2880
ctttagagtc cccagccctt ctggacactt gttccaagta taatatatat atatatatat 2940
atatatatat atatatatat atatattgtg tgtgtgtgtt tgtgtgtgta tgagacactt 3000
gctctaaggg tatcatatat atccttgatt tgcttttaat ttatttttta attaaaaatg 3060
attagctaca tgtcacctgt atgcgtctgt atcatctata tatccttcct tccttctctc 3120
tctttctctc ttcttcttct cacccccaag catctatttt caaatccttg tgccgaggag 3180
atgccaagag tctcgttggg ggagatggtg agggggcgat acaggggaag agcaggagga 3240
aagggggaca gactggtgtg ggtctttgga gagctcagga gaatagcagc gatcttccct 3300
gtccctggtg tcacctctta cagccaacac cattttgtgg cctggcagaa gagttgtcaa 3360
gctggtcgca ggtctgccac acaaccccaa tctggcccca agaaaaggca cctgtgtgtg 3420
actctggggt taaaggcgct gcctggtcgt ctccagctgg acttgaaact cccgtttaat 3480
aaagagttct gcaaaataat acccgcagag tcacagtgcc aggttcccgt gctttcctga 3540
agcgccaggc acgggttccc taggaaatgg ggccttgctt gccaagctcc cacggcttgc 3600
cctgcaaacg gcctgaatga tctggcactc tgcgttgcca ctgggatgaa atggaaaaaa 3660
gaaaaagaag aagtgtctct ggaagcgggc gcgctcacac aaacccgcaa cgattgtgta 3720
aacactctcc attgagaatc tggagtgcgg ttgccctcta ctggggagct gaagacagct 3780
agtgggggcg gggggaggac cgtgctagca tccttccacg gtgctcgctg gctgtggtgc 3840
atgccgggaa ccgaaacgcg gaactaaagt caagtcttgc tttggtggaa ctgacaatca 3900
acgaaatcac ttcgattgtt ttcctctttt tactggaatt cttggatttg atagatgggg 3960
gaggatcaga gggggagggg aggggcgggg agacggaggg aggaggggag gaggggagga 4020
ggggaggagg ggaggagggg aagggatgga ggaaaatact aacttttcta attcaacatg 4080
acaaagattc ggagaaagtg caccgctagt gaccgggagg aggaatgccc tattgggcat 4140
tatattccct gtcgtctaat ggaatcaaac tcttggttcc agcaccaagg attctgagcc 4200
tatcctattc aagacagtaa ctacagccca cacggaagag gctatacaac tgaagaaata 4260
aaattttcac tttatttcat ttctgtgact gcatgttcac atgtagagag ccacctgtgt 4320
ctaggggctg atgtgctggg cagtagagtt ctgagcccgt taactggaac aacccagaac 4380
tcccaccaca gttagagctt gctgagagag ggaggccctt ggtgagattt ctttgtgtat 4440
ttatttagag acagggtctc atactgtagt ccaagctagc ctccagctca cagaaattct 4500
cctgttccgg tttccaaagt actggagtta tgagtgtgtg ttaattgaac gctaagaatt 4560
tgctgattga agaaaacctc aagtgggttt ggctaatccc cacgacccca gaggctgagg 4620
caggaggaat gagagaattc aaggtttgcc agagccacag ggtgagctca atgtggagac 4680
tgtgagggtg agctcaatgt ggagactgtg agggtgagct caatgtggag actgtgaggg 4740
tgagctcaat gtggagactg tgagggtgag ctcaatgtgg agactgtgag ggtgagctca 4800
atgtggagac ctgtatcaag ataataatag tagtagtaac aatgcaggcg agggtgtggt 4860
tgagtggtag agcagttagt tgatttgaca tgcttgaggt ctcccggtcc atctgtggcc 4920
ctgcaacagg aagggaggga ggaagggggg gaacgagaga gaggaaagag agacagaagc 4980
taagataggg aatgagagag gaaggaagaa acgggaagaa attcagactc cttcctgagt 5040
tccgccaacg cctagtgaca tcctgtgcac accctaaggt ggcctttgtg tggcactggc 5100
ttgggtggtc gggaaaggca ttttcagctt gttgcagaac tgccacagta gcatgctggg 5160
tccgtgaaag tttctgcccg ttaacaagaa gtctctacta cttgtgacct caccagtgaa 5220
aatttcttta attgtctcct ggtgttctgg gttttgcatt tttgtttcta aggatacatt 5280
cctgggtgat gtcatgaagt ccccaaagac acagtggggc tgtgttggat tgggaaagat 5340
gatttatctg gggtgtcaaa aggaaaagaa gggaaacagg cacttgggaa aatgtcctcc 5400
cgcccacccg aattttggct tggcaaccgt ggtggaggag caagaaacac gtggacgttt 5460
gaggaggcat ggggtcctag gaggacagga agcagaagga gagagctggg ctgacagcct 5520
gcaggcattg cacagtttca gaaggagatt acagcatgac tgagttttta gggatccaac 5580
agggacctgg gtagagattc tgtgggctct gaggcaactt gacctcagcc agatggtatt 5640
tgaataacct gctcttagag ggaaaacaga catagcaaac agagccacgt ttagtgatga 5700
aactctcact ttgcctgagt catgtgcggc catgcccagg ggtcaggctg acactcaact 5760
caaaaacaag tgagaaattg aagacaatcc gtggtggcag ctactggaag ggccaccaca 5820
tccccagaaa gagtggagct gctaaaaagc catttgtgat aggcacagtt atcttgaatg 5880
catggagcag agattacgga aaaatcgaga atgttaatga ggcaacattc gagttgagtc 5940
attcagtgtg ggaaacccag acgcttccat cccctaaaag gaacatcttg ctctcagtca 6000
aaatggaaat aaaaattggg gcttgaattt ggcaaatgat tcagaactct gtgtaggtat 6060
tttcacacgc acagtggata attttcatgt tggagtttat ttgtgctaaa aggcagaaaa 6120
gggtaaaaag cacatcttaa gagttatgag gttctacgaa taaaaataat gttacttaca 6180
gctattcctt aattagtacc cccttccacc tgtggtaatt tcctgagata gtcagtgggg 6240
aaaagatctc tccttctctt ctttctcccc ctcccctcct ctccctccct ccctccctcc 6300
ctccctcctc tccctccctc cccctttcct tctttctttg ctccttctcc tctgcctcct 6360
tctccctttc ttcttcattt attctaagta gcttttaaca gcacaccaat tacctgtgta 6420
taacgggaaa acacaggctc aagcagctta gagaagattg atctgtgttc actagcgtgc 6480
aattcagagg tgggtgaaga taaaaggcaa acatttgagg ccatttcctt atttggcacg 6540
gcacttagga agtggaacat gcctaatcta ctggtttgta ccacctttcc ctataatgga 6600
ctgtttggga agctcctggg caaccgattc tggcatctca ttggtcagag gcctgttaaa 6660
tggtactctt atttgcaaag aaggctgtaa cttgtagctt taaaagcctc tcctcaagaa 6720
agaagggaga aaggatatgg ctagacatat ctaatagact taaccactgt gaaaagcctt 6780
agtatgaatc agatagaacc tatttttaac tcagttttga aaaaaataat ctttatattt 6840
atttgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gaaccacatg 6900
tagcaggtgc tggaggaggc cagaagaggg caccagatct cctggaactg acaccacaca 6960
tggttatgag ctgcctgatg tgggtgctgg gaactgaact ctcgtgttct gcaagagcag 7020
caactgttct cttaactgat gagccatctc tccagccccc cccataattt taattgttca 7080
ttttagtaaa ttttattcat aatcaattat cacagtataa aacaatgatt ttatatatat 7140
catatacata tcaaggatga cagtgagggg gatatgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 7200
tgtgtgtgtg tgtgttattt gtgtgtgtgc tttttaagaa ggtgccatag tcactgcatt 7260
tctctgaagg atttcaaagg aatgagacat gtctgtctgc caggaaccct atcttcctct 7320
ttgggaatct gacccaaatg aggtattctg aggaactgaa tgaagagctc aagtagcagt 7380
gtcttaaacc caaatgtgct gtctagagaa agtcaacgtc atcagtgagc tgaggagaga 7440
tttactgagc ggaagacaag cgctctttga tttaagtggc tcgaacagtc acggctgtgg 7500
agtggagcct gtgctcaggt ctgaggcagt ctttgctagc cagctgtgat gagcagtgaa 7560
gaaagggtgg agatggaggc agggtgggag cagggctatg gttcagacta ggtatcgtga 7620
gcacaccagc tggttgactt gtggtctgtg ggtcaggcgt tgtaaacgcc ctcagggtca 7680
ggcagtcaca ttgcttgaag ctgaatgggt gaggcaacac agagagtgca aagaaggcaa 7740
agtaccacct cttccccgac ccaggtcact tctgggttat agctgagact ccggacagca 7800
tgcaaccagc tggttagagc ttcagggaaa acttgatgtc tgcatgttgc tatgaaatgt 7860
gattcggtac atctggagaa aatttataat gctggctcag tcaagcactg aacaaaggta 7920
ccttggcttt gggagctaca tgacattgac ttgtaggcag actttttttt ttctgcccgc 7980
caattcccag ataaccaata tggaggctca atattaatta taaatgctcg gctgatagct 8040
caggcttgtt actagctaac tcttccaact taaatgaacc catttctatt atctacattc 8100
tgccacgtga ctttaccttg tacttcctgt ttcctctcct tgtctgactc tgcccttctg 8160
cttcccagag tccttagtct ggttctcctg cctaacctta tcctgcccag ctgctgacca 8220
agcatttata attaatatta agtctcccag tgagactctc atccagggag gacttgggtg 8280
ctcccccctc ctcattgcca tccgtgtctt cctcttccct cgcttccccc tcctcttcct 8340
gctcttcctc ctccacccct cctttcatag tattgatggc aagggtgttc tagaatggag 8400
gagtgcccat aggcatgcaa agaaaccagt taggatgctc tgtgaggggt tgtaatcata 8460
agcgatggac acaattcaag ccacagagtg aagacggaag gatgcactgt gctctagagc 8520
aacttctggg gcagaatcac agggtgagtt tctgacttga gggcgaagag gccacgagga 8580
agggagtgag tttgtctgag ctagaagcta cggcccacct cttggtagca gacctgccca 8640
caagcatgct ttgttaatca tgtgggatct gattttcctc taaatctatg ttcaactctt 8700
aagaaaatgt gaattctcac attaaaattt agatatacgt cttttggtgg ggggggtgta 8760
aaaaatcctc aagaatatgg atttctgggg gccggagaga tggctcagag gttaagagaa 8820
ctggttgctc ttctagacat tctgagttca attcccagca accacatggt ggctcacaac 8880
catctgtaat gcgacctggt gccatcttct gacatgcatg gatacatgca ggcagaaagc 8940
tgtatacata gtaaattgat aaatcttttt ttaaaaagag tatggattct gccgggtgtt 9000
ggtggcgcac gcctttaatc ccagcactct ggaggcagag gcaggtggat ctctgtgagt 9060
tcgagaccag cctggtctat aagagctagt tccaggacag cctccaaagc cacagagaaa 9120
ccctgtctcg aaaaaccaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaga gtatggattc 9180
taagaaagcc gtaacagctg gagctgtgta cggagttcag cgtggtacta gaagaacaga 9240
cattcatgat gaaacacccc aggattttta cttagtatct agtttccatt gttgttttga 9300
gaccggctct tatgctctcc aggctggcct caaactgctg atcttcccgc ctctacctct 9360
caagtcctgg gactacttgg ctcataaaac agtttttgtc gggctccctg aagttatggt 9420
tgtacaaacc gtgggggtca atatactcac ttgggcagag agagaaggtc tgaatcccag 9480
acaatgactg catctcagga cagttgggaa gaggacaatg gcagaaggac ttagaaaaga 9540
tagactggag ggtggaaaag cagcaggaac agagaaacaa aacaggaagc ttgctatcca 9600
gggccactct ggagtcctgt ggcaagatgg aagcgggcta ggggaataca tttgtgctac 9660
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgat caatgcctat caatgttgaa 9720
ggggaaatat gtataccaca ttgattctgg gagcaattct cagtatctgg cctagagaaa 9780
ggaatggccc ctgcagaata gacagagtga atggtgccct ttatcatttg ctaaagtgaa 9840
ggagaaataa acatccttcc atagagtttc aggtaaatga accccacagt tcatctgtgc 9900
cgtggtggag gcctggccaa cagttaaaaa gattagacac ggacaaagtc tgaaggaaac 9960
acctcgaata ggaagaggag agccacctca ttctgtaact ttcctcaagg ggaagatgtt 10020
ccaagagtgg gaataaatgg tcaaaggggg gatttttaat taggaaaacg atttcctgta 10080
tcacttgtga aactggaggt tgatttgggg cataggacaa tagatttgat gctttgcaaa 10140
aagctgtttc aaagcagaga aatggaatag agacaattat gtagcgagga gggagggtgg 10200
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atctataatc aattg 13515
<210> 2
<211> 14931
<212> DNA
<213> 中国仓鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (2716)..(2239)
<223> n为a、c、g、t或核苷酸缺失
<400> 2
catgtacact tatgcaagta tgatatggcc caacacagta ttttacacca atttttatct 60
ataaaatata catgtacatc aaaatatatt attaataata acatcattat tctttctttc 120
caagtaataa acacatacac tgaaattttg gttcttgtgg ataattttaa tgaaacagga 180
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnc tgggtgactt tatggaaaga atttgataga tttcatgatg 2280
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agaaattata atttctaatc tttcctataa gtagaatgat gataattaat ataggccatt 3180
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tattatattt tatttcccat tttgtttgca ccactattct atatccctca gcagtttaaa 3300
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aatattaaac aatgttattt ctctaaccac attttaaatt aatttaaaaa tccattaatt 10620
gtgtctataa aatgcagaca gagtgctgag acacaatata agcctgatga tctgaatttg 10680
aaactcacac ccaccacatg gagaatcaac ttccaaaaat tttcctatta cttccacact 10740
tacaccattg tacaaacaca ataataatga acaaaatgaa atgaaataaa aaattaagtc 10800
tctgtaggta atgctactgt gcagcaaaag taaaaatggc agcttaagct tgctttatgg 10860
ttacacttta ccatcttcca ttaattataa ggacttcaat catggcagaa ctatgctgtt 10920
attgtctcag tgtaacctaa ccaggtgttc cagatgttct taatgtggac acctaaacta 10980
tttgatattt gggttaagat ctttccctct ttcagaagaa acctcaggac agagggaatc 11040
ttgtctttta attttgagtc tgtagacttt ttccatttca aatatacatg aaacaagtga 11100
tgaagaaaat taatcaaaag gtgggaattg caatgatatt aggttcaata ttaagcttca 11160
atattatcat ggaatcgcct gttatacact gagtgtttgg caataaggga tttttagaag 11220
aaggagtttt tattctcaac aggttcctta agtttagctc aaataaatct aagcaatcca 11280
ctctagaatt aaatagtttc ctaagggcac agctatgaat agagctcaat ttacatataa 11340
aattttgttc accatttatg tcattccagt tttcattagt acaaggaaaa tacaaaatat 11400
ttagatgtca atatcaagtg aatagttcat ctcctttttt aatatatatc acctaaatca 11460
ccattttctc agaaaaatct ggcctgaagt tctgtctgga acttcaacat gaaaaatatg 11520
cacagcttgc tattataaat cctagttgat ttttaagatt catgtctggt gtctgactca 11580
gaggggccag aggctagaca aatatttttt gaatcttcat tgtgaagatt tttaatgatt 11640
attttaatat aaataacaaa gatgatggat aatgtaactt tgtacagttc atagacgctg 11700
aactactttg tgcttaaaat gttagttccc tatcataaat gataggtgat aagtgtatgt 11760
ttaatacttt ccctctgagc tatattcatg tactagagaa ttattttaaa catgaaaaga 11820
ctgtgtttat agtctcagct cctgagaact ggtccaacct taggcaggtg aatgccagga 11880
gcaacgtttt tcttctacag aggatgcttt gctgccaagc aacctggttg tgtggaaatg 11940
ttcctttttt aatcaagttt aaagggtctt catcatgctg ttgctccaca tattttcagg 12000
ttagagcttg gtccttggag tattatcttt taccagaaaa ttcatagtat tctttcaata 12060
actaacaact aaacttttcg ataaaaaaga attggaattt caattttaaa gcctgagtaa 12120
aattcttgtg aatcaggata ttttatttta agtcttatct tttaaaaagt tattttattt 12180
tttaaaaaat tataatatac tttcataatt tccctccttc acttttcttt acaaacactt 12240
ctatagatca ccatgtgttt ttttttttac atttatggcc tctttctgtt cattgttatt 12300
acatacaaat agtcttgcct atagaagaac accacaattt gttacctgat aacaaattat 12360
caacccttaa aacctacaaa ctattgatat tactgaaaag actatactta tagatgtaaa 12420
gatatatgtg tgtgcacata tatagataca catatatgta ggatttttaa ttttagattt 12480
tagacatcaa aattatttat atgactgaga aactagacac tataaatgag cattcagtat 12540
tcaacaccgt gattttagat attgtcacaa tgacagaaaa ttttcttata gaaaatttta 12600
agttttgtga ttgctctgtg cacttagtga agtctcacag aaaaagaatc atagtatttt 12660
tagtttataa taaaaagtac atataattaa aatggttggc acaaaacaac atttgagcat 12720
ttttcctatt tactatcaag tagtatcatt ttgaaataat aatttgacta gtttcaaaaa 12780
tgaaaacaaa atttaaacta aatgcctaat ctagcctgat aacattttta tgaatgaaat 12840
tattcaatag tgttatcaat taggggccca aaacttttcc taaaataaaa cttttaattt 12900
ttttccattt ttatttaaat tagaaacaaa attgttttac atgtaaatca gagtttcctc 12960
accctcccct tctccctgtc cctcactaac accctacttg tcccatacca tttctgctcc 13020
ccagggaggg tgaggccttc catggggaaa cttcagagtc tgtctatcct ttcggatagg 13080
gcctaggccc tcacccattt gtctaggcta aggctcacaa agtttactcc tatgctagtg 13140
ataagtactg atctactaca agagacacca tagatttcct aggcttcctc actgacaccc 13200
atgttcatgg ggtctggaac aatcatatgc tagtttccta ggtatcagtc tggggaccat 13260
gagctccccc ttgttcaggt caactgtttc tgtgggtttc accaccctgg tcttgactgc 13320
tttgctcatc actcctccct ttctgtaact gggttccagt acaattccgt gtttagctgt 13380
gggtgtctac ttctactttc atcagcttct gggatggagc ctctaggata gcatacaatt 13440
agtcatcatc tcattatcag ggaagggcat ttaaagtagc ctctccattg ttgcttggat 13500
tgttagttgg tgtcatcttt gtagatctct ggacatttcc ctagtgccag atatctcttt 13560
aaacctacaa gactacctct attatggtat ctcttttctt gctctcgtct attcttccag 13620
acaaaatctt cctgctccct tatattttcc tctcccctcc tcttctcccc ttctcattct 13680
cctagatcca tcttcccttc ccccatgctc ccaagagaga tgttgctcag gagatcttgt 13740
tccttaaccc ttttcttggg gatctgtctc tcttagggtt gtccttgttt cctagcttct 13800
ctggaagtgt ggattgtaag ctggtaatca tttgctccat gtctaaaatc catatatgag 13860
tgatgtttgt ctttttgtga ctgggttacc tcactcaaaa tggtttcttc catatgtctg 13920
tggatttcaa tagcacaaac aacatacagt atcttggggc aacactaacc aaacaagtga 13980
aagaccagta tagcaagaac tttgagttta aagaaagaaa ttaaagaaga taccagaaaa 14040
tggaaagatc tcccatgctc tttgataggc agaatcaaca tagtaaaaat ggcaatcttg 14100
ccaaaatcca tctacagact caatgcaatc cccattaaat accagcacac ttcttcacag 14160
acctgaaaga ataatactta actttatatg gagaaacaaa agacccagga taggccaaac 14220
aaccctgtac aatgaaggca cttccagagg catccccatc cctgacttca agctctatta 14280
tagagtaata atcctgaaaa cagcttggta atggcacaaa aatagacagg tagaccaatg 14340
gaattgagtt gaaaaccctg atattaaccc acatatctat gaacacctga ctttgacaaa 14400
gaagctaagg ttatacaatg taagaaagaa agcatcttca acaaatcgtg ctggcataac 14460
tggatgctgg catgtagaag actgcagata gatccatgtc taatgccatg cacaaaactt 14520
aagtccaaat ggatcaaaaa cctcaacata aatccagcca cactgaacct catagaagag 14580
aaagtgggaa gtatccttga ataaattggt acaggagacc acatcttgaa cttaacacca 14640
gtagcacaga caatcagatc aataatcaat aaatgggacc tcctgaaact gagaagcttc 14700
tgtaaggcaa tggataagtc aacaggacaa aatggcagcc cacggaatgg gaaaagatat 14760
tcaccaatcc tatatctgac agagggctgc tctctatttg caaagaacac aataagctag 14820
tttttaaaac accaattaat ccgattataa agttgggtag agaactaaat aaagaattgt 14880
taacagagca atctaacttg gcagaaagac acataagaaa gtgctcacca t 14931
<210> 3
<211> 4001
<212> DNA
<213> 中国仓鼠
<400> 3
ccaagatgcc catcaactga ttaatagatg ataaaattat tgtacatttc agtgtaatat 60
tattcagttt ttaagaaaaa tgaaattatg taataagcat gtaaatggat atatcttgaa 120
acaaccattc cccattatat tacctaaaca ttgaaagtcc aaaatcatat gatcttttta 180
gtggatctac taatcttttg ctatatgtat tttattgaac tacccatgga tgtgagataa 240
ttggtaacaa cagcacatgg gagagcatgg gatcattcaa ggaagattag agagaatgca 300
ttttttagga gataatggag gagcaataga aaggattaaa tgaggttact gatgaaagtg 360
atggttagag aaggcaatat gaggagggat aactagcact tagggccttt tgaaaaagac 420
atagagaaaa tactattgta gaaacttcct ataattggtg tatagttata tacaccaaag 480
agctcagatg gagttaccct ataatggaaa tattaactac tttttatcac tgtgataaaa 540
catcctgaac agagcaacat agattgggaa gcatttactt tggcttacag ttctaacggg 600
ataaaaattc atgatgaaag aatgaatatg tcagcaaaca gcagtagcaa tggcctgaga 660
agcaggtgag agctcacatc ttgaagtgta agaatgtagc agagagaaca aactgcaaat 720
gaccagaaaa tgcttttgga tcagagccca tacccctctg actgacttct ccagaaattc 780
tgaacaaata aaactcccca aacagagcca taactgaagg tccagtgtct gagactacta 840
ggggtatttc ttattcaaac cactacaatg gggtgggggg agcaatcctc caagtaggca 900
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atatctagtt gttcttcaac tggaaacttc atgctttctg cccagcattc atgttgctgg 1140
aaagagcaat gtacactacc agtgtagaaa ttaaatcatc aatcttatca agatgtggat 1200
cctataagtt acaataaaaa ttagcctgat aagatatccc caccagaaga atattcacat 1260
aaatgctatg ggagcaacaa gctattttct aaattagctt taatcctatt ctacaagaga 1320
gaatccatat ctagaatagt tatagggatc aagaacccat ggcttgattg gtcataggcc 1380
caatgggaga tcctaatatt attgttctac aaaatgaaaa taactcctaa tgacttgttg 1440
ctgcagtaat aagttagtat gttgctcaac tctcacaaga gaagttttgt cttacaataa 1500
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aagcaatagt cgagaggcta ccttaaaagc ctttctctga taatgagatt gatgactacc 1920
ttatatacca tcctagagcc ttcatccagt agctgatgga agcagaagca gacatctaca 1980
gctaaacact gagctagttg cagacaggga ggagtgatga gcaaagtcaa gaccaggctg 2040
gagaaacaca cagaaacagc agacctgaaa aaaatgttgc acatggaccc cagactgata 2100
gctgggagtc cagcatagga cttttctaga aaccctgaat gaggatatca gtttggaggt 2160
ctggttaatc tatggggaca ctggtagtgg atcaatattt atccctagtt catgactgga 2220
atttgggtac ccattccaca tggaggaatt ctctgtcagc ctagacacat gggggaggtt 2280
ctaggtcctg ctccaaataa tgtgttagac tttgaagaac tcccttgaga agactcaccc 2340
tccctgggga gcagaaaggg gatgggatga gggttggtga gggacaggag aggaggggag 2400
ggtgagggaa ctgggattga caagtaaatg atgcttgttt ctaatttaaa tgaataaagg 2460
aaaagtaaaa gaagaaaaga aaacaggcca aaagattata aaagacagag gtggtgggtg 2520
actataaaga aacactatta tctaaataaa aacatgtcag aagcacacat gaacttatag 2580
tgtttatgaa agtatgtata ataactacat aatctcaagc caagaaaaaa atatcatctt 2640
tcagtgatga aggtgatttt atttctccca gaattaaagc caaagaccta atgaaagtaa 2700
ttatcttcaa aaggttgaaa atacatactt tgcaatacac agatctgcct agaaatctca 2760
tgttcacaat acacatgatg ctcaattgaa ttccattcaa tgttacagtt tagataaaca 2820
gtttgtagat aaactcacaa tgtatcattt ctttttattt tttgaccaaa cagcttctca 2880
tctgttattc agaataattc ctcgatggca ggatatccat cccaattggg ggaaggggag 2940
aatttgaaga aaacctagac cacatacata tttgccattg ggaaacaaag tctaaaatga 3000
tgttgttcac atcttctcta ctagtcctct ccccgtccca aagaaccttg gtatatgtgc 3060
ctcattttac agagagagga aagcaggaac tgagcatccc ttacttgcca tcctcaaccc 3120
aaaatttgca tcattgctca gctctgccct tctcatatga cagttacaag tcaaggcttc 3180
caaagtccct ctgtcatgtt tggtgtcaat agtttataca gatgacttca tgtcttcata 3240
tctaatgtct tatatagatt aatattaaac aatgttattt ctctaaccac attttaaatt 3300
aatttaaaaa tccattaatt gtgtctataa aatgcagaca gagtgctgag acacaatata 3360
agcctgatga tctgaatttg aaactcacac ccaccacatg gagaatcaac ttccaaaaat 3420
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agcttaagct tgctttatgg ttacacttta ccatcttcca ttaattataa ggacttcaat 3600
catggcagaa ctatgctgtt attgtctcag tgtaacctaa ccaggtgttc cagatgttct 3660
taatgtggac acctaaacta tttgatattt gggttaagat ctttccctct ttcagaagaa 3720
acctcaggac agagggaatc ttgtctttta attttgagtc tgtagacttt ttccatttca 3780
aatatacatg aaacaagtga tgaagaaaat taatcaaaag gtgggaattg caatgatatt 3840
aggttcaata ttaagcttca atattatcat ggaatcgcct gttatacact gagtgtttgg 3900
caataaggga tttttagaag aaggagtttt tattctcaac aggttcctta agtttagctc 3960
aaataaatct aagcaatcca ctctagaatt aaatagtttc c 4001

Claims (12)

1.一种包含整合到增强表达基因座内的特异性位点的外源核酸序列的细胞，其中所述增强表达基因座包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列，并且其中所述外源核酸序列包括包含编码第一轻链片段(LCF)的核苷酸序列的第一外源核酸、包含编码第一重链片段(HCF)的核苷酸序列的第二外源核酸和包含编码第二HCF的核苷酸序列的第三外源核酸，其中所述第一HCF、所述第二HCF和所述第一LCF是双特异性抗体的片段。
2.根据权利要求1所述的细胞，其中所述细胞是CHO细胞。
3.一种包含细胞和一组载体的组合，
其中所述细胞从5'至3'包含整合到其基因组的增强表达基因座内的：第一重组酶识别位点(RRS)、第一外源核酸、第三RRS、第二外源核酸和第二RRS，其中所述三个RRS是彼此不同的，并且其中所述增强表达基因座包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列；
其中所述一组载体包含
第一载体，其从5'至3'包含：所述第一RRS、包含编码第一轻链片段(LCF)的核苷酸序列的第一核酸、和所述第三RRS；
第二载体，其包含：所述第三RRS、包含编码第一重链片段(HCF)的核苷酸序列的第二核酸、和所述第二RRS；并且
其中所述第一核酸或所述第二核酸还包含编码第二HCF的核苷酸序列；
其中所述第一HCF、所述第二HCF和所述第一LCF是双特异性抗体的片段；并且
其中在将所述载体引入所述细胞时，所述载体中的所述第一核酸和所述第二核酸通过所述第一RRS、所述第二RRS和所述第三RRS介导的重组而整合到所述增强表达基因座。
4.根据权利要求3所述的组合，其中所述第一外源核酸包含第一选择性标记基因，并且所述第二外源核酸包含第二选择性标记基因，其中所述第一选择性标记基因和所述第二选择性标记基因是不同的。
5.根据权利要求3所述的组合，其中
(i)所述第一载体从5'至3'包含：所述第一RRS、包含所述第一LCF的所述第一核酸、和所述第三RRS；并且
所述第二载体从5'至3’包含所述第三RRS、所述第二核酸，其中所述第二核酸包含编码所述第一HCF的所述核苷酸序列和编码所述第二HCF的核苷酸序列两者、以及所述第二RRS；或者
(ii)所述第一载体从5'至3’包含：所述第一RRS、包含编码所述第一LCF的所述核苷酸序列和编码所述第二HCF的所述核苷酸序列的所述第一核酸、以及所述第三RRS；并且
所述第二载体从5'至3'包含：所述第三RRS、包含编码所述第一HCF的所述核苷酸序列的所述第二核酸、和所述第二RRS。
6.根据权利要求5所述的组合，其中编码所述LCF的所述核苷酸序列可操作地连接至第一启动子，编码所述第一HCF的所述核苷酸序列可操作地连接至第二启动子，并且编码所述第二HCF的所述核苷酸序列可操作地连接至第三启动子，其中所述第一启动子、所述第二启动子和所述第三启动子是相同的或不同的。
7.根据权利要求3所述的组合，其中编码所述第一HCF的所述核苷酸序列编码第一CH3结构域，并且编码所述第二HCF的所述核苷酸序列编码第二CH3结构域。
8.根据权利要求7所述的组合，其中所述第一CH3结构域和所述第二CH3结构域中的一个是人IgG的CH3结构域，而另一个是所述人IgG的包含至少一个氨基酸位置的修饰的经修饰的CH3结构域。
9.一种将核酸整合到增强表达基因座中的方法，其包括：
(i)提供根据权利要求3-8中任一项所述的组合；
(ii)通过转染将所述载体同时引入所述细胞；以及
(iii)选择其中所述载体中的所述第一核酸和所述第二核酸已通过所述第一RRS、所述第二RRS和所述第三RRS介导的重组而整合到所述细胞的所述增强表达基因座中的转染细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，还包括：
(iv)在所选的转染细胞中表达所述第一LCF、所述第一HCF和所述第二HCF；以及
(v)从所选的转染细胞获得包含所述第一LCF、所述第一HCF和所述第二HCF的双特异性抗体或其抗原结合片段。
11.一种制备双特异性抗原结合蛋白的方法，其包括：
(i)提供根据权利要求1或2所述的细胞；
(ii)在所述细胞中表达所述第一LCF、所述第一HCF和所述第二HCF；以及
(iii)从所述细胞获得包含所述第一LCF、所述第一HCF和所述第二HCF的双特异性抗体或其抗原结合片段。
12.一种制备双特异性抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：
(i)提供通过权利要求9所述的方法获得的所选的转染细胞；
(ii)在所述细胞中表达所述第一LCF、所述第一HCF和所述第二HCF；以及
(iii)从所述细胞获得包含所述第一LCF、所述第一HCF和所述第二HCF的双特异性抗体或其抗原结合片段。
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