KR20210116494A - 락토바실러스 람노서스 추출물을 포함하는 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생리학적으로 허용되는 매질에 적어도 하나의 락토바실러스 람노서스 추출물(CNCM I-5313), 이의 분획 중 하나 및/또는 이의 대사산물 중 하나 및 물 이외의 용매, UV 필터, 계면활성제, 겔화제, 증점제, 충전제, 염료, 필름-형성 중합체, 방향제 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 적어도 하나의 부형제를 포함하는, 케라틴 물질, 특히 피부 및/또는 입술에 국소 적용하기 위한 조성물, 및 특히 피부 장벽 기능을 촉진 및/또는 개선시키기 위한 이의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)의 신규 추출물, 특히 락토바실러스 람노서스 용해물(Lactobacillus rhamnosus lysate; CNCM-5313) 및 케라틴 물질(keratinous material), 특히 피부에 대한 이의 유익한 효과를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
피부는 인체의 주요 장벽이다. 이것은 장기를 온도 및 습도 차이, 및 자외선, 스트레스, 오염, 병원성 미생물 등의 외부 환경으로부터의 손상으로부터 보호한다. 그러나, 과도한 화학적 및 물리적 자극은 피부의 정상적인 기능을 저하시키고, 노화를 유도하거나 가속화하여 주름 및 견고성(firmness), 유연성(suppleness) 및 탄성(elasticity) 손실의 출현을 유도한다.
화장품에 사용할 수 있는 새로운 분자 또는 활성 성분(active ingredient)의 탐색은 색소침착 또는 미세순환으로 인한 불규칙한 착색 없이 빛나는 안색(radiant complexion)과 함께 피부에 보다 젊은 외모와 보다 균일한 안색을 제공하는 효과적인 제품의 개발을 필요로 한다.
본 출원인은 락토바실러스 람노서스 추출물, 특히 락토바실러스 람노서스 용해물(CNCM I-5313)이 시험관내 피부 배양물에 유익한 효과를 가졌음을 올바르게 입증했다. 본 출원인은 이 용해물이 특히 다음에 관련된 여러 유전자의 발현에 대한 자극 효과을 가졌음을 입증했다:
- 해독(MRP1 = ABCC1, LONP1, GPX1),
- 세포 에너지 생산에 관여하는 미토콘드리아 호흡 쇄의 기능화(MT = NADH 탈수소효소(dehydrogenase)/유비퀴논),
- 히알루론산(MRP5)의 분비,
- 세포 구조, 예를 들어, 세포 핵(SYNE2, LMNA)의 완전성 유지, 및
- 여러 콜라겐 및 엘라스틴(COL1A1, COL5A1, COL13A1, ELN)의 형성.
따라서, 본 발명에 따른 락토바실러스 람노서스 추출물, 특히 락토바실러스 람노서스 용해물(CNCM I-5313)은 해독 및 항산화 효과, 주름 감소 및 견고성 및 밀도(콜라겐 및 엘라스틴 및 세포와 이러한 단백질 구조 사이의 고정점)의 손실을 표적화하는 노화 방지 효과(anti-aging effect), 피부 강화 효과(세포 핵과 같은 세포 구조), 피부를 저산소 스트레스(hypoxic stress)에 적응시키는 효과, 피부 반점에 대한 탈색소 효과(멜라닌 생성 억제) 및/또는 선천적 면역 및 피부 장벽의 보강을 통한 피부 미생물총(microbiota)의 정상화 효과를 나타낸다는 점에서 유리하다.
본 발명의 제1 목적은 생리학적으로 허용되는 매질에 적어도 하나의 락토바실러스 람노서스 추출물(CNCM I-5313), 이의 분획 중 하나 및/또는 이의 대사산물 중 하나 및 물 이외의 용매, UV 필터, 계면활성제, 겔화제(gelling agent), 증점제(thickener), 충전제, 염료, 필름 형성 중합체, 방향제 및 이들의 혼합물, 특히 물 이외의 용매, 계면활성제, 겔화제, 증점제, 충전제, 필름 형성 중합체, 방향제 및 이들의 혼합물로부터 선택된 적어도 하나의 부형제을 포함하는, 케라틴 물질, 특히 피부 및/또는 입술에 국소 적용(topical application)하기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 피부 노화의 징후를 방지 및/또는 감소시키고/시키거나 장벽 기능(barrier function)을 촉진 및/또는 개선하도록 의도된 본 발명에 따르는 적어도 하나의 락토바실러스 람노서스 추출물(CNCM I-5313) 또는 이를 함유하는 조성물을 케라틴 물질 상에 적용하는 단계를 포함하는 비치료적 향장학적 방법(non-therapeutic cosmetic method)에 관한 것이다. 번호 [원문 그대로] CNCM I-5313으로의 지정하에 2018년 4월 11일에 BIOVITIS, Le Bourg, 15400 SAINT-ETIENNE-DE-CHOMEIL의 이름으로 파스퇴르 연구소(28 rue du Docteur Roux, F-75024 Paris cedex 15)에서 국립 미생물 배양 수집소(CNCM; National Collection of Cultures of Microorganisms)와의 부다페스트 조약에 따라 제출된 락토바실러스 람노서스 균주에 상응하는 용어 락토바실러스 람노서스(CNCM I-5313) 또는 락토바실러스 람노서스 CNCM I-5313이 상호 교환적으로 사용된다.
본 발명은 또한 장벽 기능을 촉진 및/또는 개선하고/하거나 피부 노화의 징후를 감소시키기 위한 락토바실러스 람노서스 추출물(CNCM I-5313)의 비치료적 향장학적 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 특히 생리학적으로 허용되는 매질에 적어도 하나의 락토바실러스 람노서스 추출물(CNCM I-5313), 이의 분획 중 하나 및/또는 이의 대사산물 중 하나 및 물 이외의 용매, 계면활성제, 겔화제, 증점제, 충전제, 염료, 필름 형성 중합체, 방향제 및 이들의 혼합물로부터 선택된 적어도 하나의 부형제를 포함하는, 케라틴 물질, 특히 피부 및/또는 입술에 국소 적용하기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, "케라틴 물질"은 피부, 점막(특히 입술) 및 외피를 의미한다. 특정 구현예에 따르면, 조성물은 피부, 입술 또는 외피, 바람직하게는 피부에 국소 적용하기 위한 것이다.
본 발명에 따르는 "케라틴 물질"은 일반적으로 건강한 케라틴 물질(healthy keratinous material)이다, 즉 병리학적 상태(병리를 앓고 있는 "건강하지 않은" 대상체)로부터 초래될 상태 또는 장애를 나타내지 않는다. 건강한 피부 및/또는 입술 또는 피부 및/또는 입술이라는 표현은 나머지 설명에서 상호 교환적으로 사용된다.
"생리학적으로 허용되는 매질"은 케라틴 물질, 특히 피부 및/또는 입술과 상용성인 매질을 의미한다.
본 발명에 따르면, "부형제"는 그 자체로 향장학적 효과가 결여되어 있지만, 락토바실러스 람노서스 추출물을 본 발명의 조성물 또는 이의 제형에 혼입하는 데 유용한 물질을 의미한다.
락토바실러스 람노서스 추출물
프로바이오틱스(probiotics) 및 프리바이오틱스(prebiotics)에 대해 국제 과학 협회에서 사용하는 정의에 따르면. "프로바이오틱"은 적절한 양으로 투여될 때 숙주의 건강에 유익한 영향을 미치는 살아 있는 미생물을 의미한다. "프리바이오틱스"는 장내 미생물총의 조성 및/또는 활성에서 특정한 변화를 유도하여 숙주에 유익한 효과를 생성하는 소화에 내성이 있는 식품 성분을 의미한다. "공생제(Symbiotics)"는 프로바이오틱스와 프리바이오틱스를 모두 함유하는 제품을 의미한다.
본 발명에 따르는 락토바실러스 람노서스 추출물(프로바이오틱 미생물)은 살아있는, 반-활성 또는 불활성화된, 죽은 형태로 본 발명에 따르는 조성물에 포함될 수 있다. 이것은 세포 성분의 분획 형태로 또는 대사산물의 형태로 포함될 수 있다. 미생물, 대사산물(들) 또는 분획(들)은 또한 동결건조된 분말, 배양 상청액의 형태 및/또는 적용 가능한 경우 농축된 형태로 도입될 수 있다.
특정 구현예에 따르면, 락토바실러스 람노서스 미생물은 불활성화된 또는 죽은 형태, 보다 특히 용해물의 형태로 구현된다.
따라서, 특별하고 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따르는 락토바실러스 람노서스 추출물은 락토바실러스 람노서스 용해물(CNCM I-5313)(비생물), 이의 분획 중 하나 및/또는 이의 대사산물 중 하나이다.
용어 "프로바이오틱 추출물" 또는 "락토바실러스 람노서스 추출물" 또는 "프로바이오틱 용해물" 또는 "락토바실러스 람노서스 용해물"은 상호 교환적으로 사용될 것이다.
용해물은 특히 고려되는 미생물의 세포의 세포 용해에 의해 수득된 물질을 의미하며, 따라서 상기 세포에 자연적으로 함유된 세포내 생물학적 성분의 방출을 유도한다. 구현된 용해물은 세포내 생물학적 성분의 전부 또는 일부와 세포벽 및 막의 성분으로 형성된다. 따라서, 본 발명은 프로바이오틱 용해물 및/또는 이의 분획 중 하나 및/또는 이의 대사산물 중 하나에 관한 것이다.
본 발명의 의미 내에서, 용어 "분획"은 보다 특히 상기 전체 미생물에 의한 유추에 의해 적어도 부분적으로 피부에 동일한 유익한 효과가 부여된 상기 미생물의 단편을 지정한다.
특히, 본 발명에 따르는 용해물은 효소(예: 탈수소효소, 포스파타제 등) 및/또는 세포벽 성분(예: 펩티도글리칸 등) 및/또는 세포막 성분(예: 글리세로인지질 등)을 함유하는 세포 세포질 분획을 함유한다.
세포는, 예를 들어, 삼투압 충격, 열 충격, 초음파에 의해, 또는 심지어 기계적 스트레스(예: 원심분리)하에 당업자에게 익히 공지된 상이한 기술에 의해 용해될 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 용해물은 원심분리 및 삼투압 충격(예: 수산화나트륨의 첨가)에 의해 수득된다.
특정 구현예에 따르면, 미생물은 적절한 배양 배지에서 혐기성으로 배양된다. 성장의 정지 단계에 도달하면, 배양 배지는, 예를 들어, 60 내지 65℃의 온도에서 30분 동안 저온 살균에 의해 비활성화될 수 있다. 이어서, 미생물은 통상적인 분리 기술, 예를 들어, 막 여과, 원심분리 및 생리학적으로 멸균 NaCl 용액에의 재현탁에 의해 수확된다. 용해물은 세포질 분획, 세포벽의 단편 및 대사로부터 유도된 생성물을 방출하기 위해 이러한 배지의 초음파 분해에 의해 수득될 수 있다. 이어서, 이들의 자연적 분포의 모든 성분은 약산성 용액에서 안정화된다.
이렇게 수득된 용해물은 일반적으로 총 중량에 대해 약 0.1 내지 10중량%, 특히 0.5 내지 5중량%, 특히 1 내지 2중량%의 활성 건조 물질(active dry matter)의 농도를 갖는다.
용해물은 다양한 형태로, 용액 형태로 또는 분말 형태로 구현될 수 있다.
특정 구현예에 따르면, 용해물은 이의 총 중량에 대해 0.1 내지 10중량%, 특히 0.5 내지 5중량%, 특히 1 내지 2중량%의 활성 건조 물질을 포함하는 용액, 바람직하게는 수용액 형태로 존재한다.
본 발명에 따르는 프로바이오틱 미생물은 락토바실러스 람노서스 종(ATCC 7469, CCM 1825, NCDO 243, NCIB 6375 또는 WDCM 00101, 이것이 제출된 수집소에 따름), 바람직하게는 CNCM I-5313 지정하에 2018년 4월 11일에 BIOVITIS, Le Bourg, 15400 SAINT-ETIENNE-DE-CHOMEIL의 이름으로 파스퇴르 연구소(28 rue du Docteur Roux, F-75024 Paris cedex 15)에서 국립 미생물 배양 수집소(CNCM)와의 부다페스트 조약에 따라 제출된 락토바실러스 람노서스 CNCM 균주 및/또는 이의 분획중 하나 및/또는 이의 대사산물 중 하나에 속한다.
이러한 엘. 람노서스 균주의 용해물은 공급업체인 Greentech의 다음 프로토콜에 따라 수득된다:
1. 적절한 배양 배지에서 엘. 람노서스 균주의 배양;
2. 원심분리에 의한 바이오매스의 회수;
3. 세포 용해(수산화나트륨의 첨가);
4. 상기 용해물의 총 중량에 대해 0.1 내지 10중량%의 건조 물질(활성 물질) 범위의 활성 물질 함량을 수득하기 위한 pH(시트르산의 첨가) 및 건조 물질(멸균수의 첨가)의 조정;
5. 방부제(페녹시에탄올)의 첨가.
이러한 엘. 람노서스 용해물은 공급업체인 Greentech에 의해 Probiophyte LB라고 지칭되며, 이의 INCI 이름에 의해 물 및 락토바실러스 발효 용해물 및 페녹시에탄올 및 수산화나트륨 및 시트르산으로 정의되고; 페녹시에탄올은 또 다른 방부제에 의해 대체될 수 있다.
이 용해물은 상기 용해물의 총 중량에 대해 0.1 내지 10중량%, 특히 0.5 내지 5중량%, 특히 1 내지 2중량%의 건조 물질(활성 물질) 범위의 락토바실러스 람노서스 함량을 포함한다.
본 발명의 엘. 람노서스 용해물은 조성물의 총 중량에 대해 적어도 0.0001중량%(활성 물질의 건조 중량 또는 중량으로 표현됨)의 양, 특히 0.0001 내지 10중량%의 양, 보다 특히 0.0001 내지 5중량%, 특히 0.0001 내지 2중량%, 특히 0.0001 내지 1중량%, 또는 심지어 0.0001 내지 0.05중량%의 양으로 조성물에 제형화될 수 있다.
하나의 특정 구현예에 따르면, 락토바실러스 람노서스 추출물(CNCM I-5313)은 상기 조성물의 총 중량에 대해 활성 물질의 0.0001 내지 0.05중량% 범위의 함량으로 존재한다.
본 발명에 따르는 엘. 람노서스 용해물은 단독으로 또는 다른 프로바이오틱 미생물, 프리바이오틱 성분, 공생 성분(symbiotic ingredient) 또는 이들의 혼합물과 함께 사용될 수 있다.
특정 구현예에 따르면, 조성물은 비타민 또는 이들을 함유하는 추출물 이외의, 특히 필수 지방산이 풍부한 오일 또는 그렇지 않으면 프리바이오틱 추출물(이는 바람직하지 않은 종에 해를 끼치는 피부 미생물총(microflora)의 특정의 유익한 박테리아 종의 성장을 촉진한다), 프로바이오틱 미생물의 다른 균주 또는 심지어 공생 성분의 다른 추출물(프로바이오틱 추출물 + 프리바이오틱 추출물), 피지 조절제(식물군의 생물다양성을 촉진하기 위해) 및 고화제(firming agent)(모공 확대를 제한하기 위해), 진정제, 보호 활성 성분, 특히 피부의 항산화 및 해독 방어의 자극제(달리 항산화제 또는 간단히 항산화제로 공지됨), 탈색제, 각질 제거제, 노화 방지 활성 성분, 보습 성분, 면역 조절 활성 성분, 및 이들의 혼합물로부터 선택된 적어도 하나의 향장학적 활성제를 또한 포함한다.
본 발명에 따르는 "조성물"은 향장학적 또는 피부과용 조성물을 의미한다.
하나의 특정 구현예에 따르면, 이는 향장학적 조성물일 것이다.
또 다른 특정 구현예에 따르면, 이는 피부과용 조성물일 것이다.
본 발명에 따르는 조성물은, 예를 들어, 얼굴 및/또는 신체를 위한 케어 및/또는 메이크업(makeup) 제품으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따르는 조성물은 더욱 특히 케라틴 물질, 특히 피부에 국소 적용을 위한 것이다.
본 발명의 조성물은 생리학적으로 허용되는 매질, 즉 피부 및 외피와 상용성인 매질을 포함한다. 조성물은 모든 향장학적 형태를 가질 수 있고, 특히 수중유(oil-in-water) 또는 유중수 에멀젼 또는 다중 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 로션, 젤, 크림, 우유, 세럼(serum), 미스트(mist)(분무 유체 용액), 스틱 또는 심지어 분말 형태로 존재하며, 피부, 입술 및/또는 외피에 적용하기에 적합하다.
특정 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 피부 및/또는 입술에 국소 적용하기 위한 것이고, 피부 및/또는 입술을 위한 향장학적 케어 조성물 및/또는 메이크업 조성물의 형태로 존재한다.
본 발명의 향장학적 조성물은 유리하게는 에멀젼, 세럼 또는 미스트 형태로 존재한다.
조성물은 일반적으로 적어도 하나의 수성 상 및 적어도 하나의 오일 상을 포함한다.
수성 상은 일반적으로 상기 조성물의 총 중량에 대해 1 내지 99중량%를 나타낸다.
본 발명에 따르는 오일 상은 탄화수소 오일, 실리콘 오일, 불소화 또는 비불소화, 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 이러한 오일은 휘발성 또는 비휘발성, 식물성, 광물성 또는 합성일 수 있다.
유리하게는, 특히 식물 기원의 탄화수소 오일이 사용될 것이다.
휘발성 탄화수소 오일은 C8-C16 분지형 알칸, C8-C16 분지형 에스테르 및 이들의 혼합물을 포함한다.
비휘발성 탄화수소 오일은 특히 탄화수소 오일, 식물성 탄화수소 오일, C10-C40 합성 에테르, C10-C40 합성 에스테르, C12-C26 지방 알코올, C12-C22 고급 지방산, 및 이들의 혼합물을 포함한다.
오일은 조성물의 총 중량에 대해 1 내지 95중량% 범위의 함량으로 본 발명의 조성물에 존재할 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 화장품에 일반적으로 사용되는 임의의 첨가제, 예를 들어, UV 필터, 항산화제, 계면활성제, 겔화제, 충전제, 염료(예: 안료), 방부제, 필름 형성 중합체, 방향제, 향장학적 활성 성분, 예를 들어, 연화제, 보습제, 비타민, 노화 방지제, 미백제 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
향장학적 방법 및 다른 용도
본 발명은 또한 적어도 하나의 락토바실러스 람노서스 추출물(CNCM I-5313), 특히 락토바실러스 람노서스 용해물(CNCM I-5313), 이의 분획 중 하나 및/또는 이의 대사산물 중 하나, 또는 앞서 정의된 바와 같은 본 발명에 따른 조성물을 케라틴 물질에 적용하는 단계를 포함하는, 피부 노화의 징후를 예방 및/또는 감소시키고/시키거나 장벽 기능을 촉진 및/또는 개선하기 위한 비치료적 향장학적 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명에 따르는 케라틴 물질은 건강한 케라틴 물질이다.
락토바실러스 람노서스 추출물은 일반적으로 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 0.0001 내지 10중량%의 건조 물질, 특히 0.0001 내지 5중량%, 바람직하게는 0.0001 내지 2중량%, 특히 0.0001% 내지 1중량%, 또는 심지어 0.0001 내지 0.05중량% 범위의 함량으로 존재한다.
향장학적 방법에서 구현되는 조성물은 케어 및/또는 메이크업 조성물, 특히 얼굴 및/또는 신체용 스킨케어 조성물일 수 있다.
특히, 상기 방법은 피부 견고성 및 밀도의 손실을 방지 및/또는 감소시키고, 주름 및/또는 잔주름 및/또는 피부 반점의 출현을 예방 및/또는 감소시키고, 피부 광채 및/또는 균일성을 개선하고, 피부 수화를 촉진 및/또는 개선하고, 피부를 해독하고, 이의 항산화 방어(antioxidant defense)를 촉진 및/또는 자극하고/하거나 저산소증에 대한 피부 내성(resistance)을 개선하고/하거나 피부 미생물총을 제어하고/하거나 피부 면역 및 피부 장벽의 형성을 자극하기 위한 것이다.
"케라틴 물질의 항산화 방어를 촉진 및/또는 자극하다"는 특히 피부 산소화를 촉진하여 피부 저산소증의 영향을 감소시키고 세포 수준에서 세포 호흡 및 에너지 생성을 촉진함을 의미한다.
"피부 면역을 촉진 및/또는 자극하다"는 피부 미생물총의 균형을 유지하고 외부 인자로부터 더 잘 보호되는 더 건강한 피부를 위한 피부 항상성을 촉진함을 의미한다.
특정 구체예에 따르면, 상기 방법은 피부 견고성 및 밀도의 손실을 방지 및/또는 감소시키고, 주름 및/또는 잔주름 및/또는 피부 반점의 출현을 방지 및/또는 감소시키고, 피부 광채 및/또는 균일성을 개선하고, 피부 수화를 촉진 및/또는 개선하고/하거나 저산소증에 대한 피부의 내성을 개선하고/하거나 피부 미생물총을 제어하기 위한 것이다.
특정 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 노화되고, 윤기가 없고, 피곤한 피부 또는 바람직하지 않거나 불균형한 식이(diet), 정서적 스트레스 또는 수면 부족에 의해 영향을 받은 피부에 적용된다.
본 발명은 또한 장벽 기능을 촉진 및/또는 개선하고/하거나 피부 노화의 징후를 감소시키기 위한, 특히 피부 견고성 및 밀도의 손실을 방지 및/또는 감소시키고, 주름 및/또는 잔주름 및/또는 피부 반점의 출현의 방지 및/또는 감소시키고, 피부 광채 및/또는 균일성을 개선하고, 피부 수화를 촉진 및/또는 개선하고, 피부를 해독하고, 이의 항산화 방어를 자극하고/하거나 저산소증에 대한 피부의 내성을 개선하고/하거나 피부 미생물총을 제어하고/하거나 피부 면역 및 피부 장벽의 형성을 자극하기 위한 락토바실러스 람노서스 추출물(CNCM I-5313)의 비치료적 향장학적 용도에 관한 것이다.
특정 구현예에 따르면, 본 발명에 따르는 추출물은 장벽 기능을 촉진 및/또는 개선하고/하거나 피부 노화의 징후를 감소시키는 데, 특히 피부 견고성 및 밀도의 손실을 방지 및/또는 감소시키고, 주름 및/또는 잔주름 및/또는 피부 반점의 출현을 방지 및/또는 감소시키고, 피부 광채 및/또는 균일성을 개선하고, 피부 수화를 촉진 및/또는 개선하고, 피부를 해독하고/하거나 저산소증에 대한 피부의 내성을 개선하고/하거나 피부 미생물총을 제어하는 데 사용된다.
본 발명은 또한 피부 면역을 촉진 및/또는 자극하기 위한 본 발명에 따르는 락토바실러스 람노서스 추출물 CNCM I-5313에 관한 것이다.
본 발명은 이제 다음의 비제한적인 실시예에서 설명될 것이다.
달리 명시되지 않는 한, 백분율은 조성물의 총 중량에 대한 중량 백분율로 표시된다.
실시예
본 출원인은 이것이 제출된 수집소에 따라 프로바이오틱 박테리아 균주 엘. 람노서스의 용해물: ATCC 7469, CCM 1825, NCDO 243, NCIB 6375 또는 WDCM 00101의 효과를 평가했다.
특히, 사용된 프로바이오틱 박테리아 균주는 CNCM I-5313 지정하에 2018년 4월 11일에 BIOVITIS, Le Bourg, 15400 SAINT-ETIENNE-DE-CHOMEIL의 이름으로 파스퇴르 연구소(28 rue du Docteur Roux, F-75024 Paris cedex 15)에서 국립 미생물 배양 수집소(CNCM)와의 부다페스트 조약에 따라 제출되었다.
이러한 엘. 람노서스 균주의 용해물은 공급업체인 Greentech의 다음 프로토콜에 따라 수득된다:
1. 적절한 배양 배지에서 엘. 람노서스 균주의 배양;
2. 원심분리에 의한 바이오매스의 회수;
3. 세포 용해(수산화나트륨의 첨가);
4. 상기 용해물의 총 중량에 대해 0.01 내지 10중량%의 건조 물질(활성 물질) 범위의 활성 물질 함량을 수득하기 위한 pH(시트르산의 첨가) 및 건조 물질(멸균수의 첨가)의 조정;
5. 방부제(페녹시에탄올)의 첨가.
이러한 엘. 람노서스 용해물은 공급업체인 Greentech에 의해 Probiophyte LB라고 지칭되며, INCI 이름에 의해 물 및 락토바실러스 발효 용해물 및 페녹시에탄올 및 수산화나트륨 및 시트르산으로서 정의되고; 페녹시에탄올은 또 다른 방부제에 의해 대체될 수 있다.
이 용해물은 상기 용해물의 총 중량에 대해 0.1 내지 10중량%, 특히 0.5 내지 5중량%, 특히 1 내지 2중량%, 심지어 1.75중량%의 건조 물질(활성 물질) 범위의 락토바실러스 람노서스 함량을 포함한다.
이러한 용해물(그러나, 페녹시에탄올 보존제를 함유하지 않음)은 피부 세포 배양물 대한 시험에서 0.05, 0.1 및 0.2%의 함량으로 시험되고, 원료의 1 내지 2중량% 범위의 함량으로 하기 예시된 국소 적용용 향장학적 조성물에 사용된다.
용어 Probiophyte LB 또는 락토바실러스 람노서스 용해물이 다음 실시예에서 상호 교환적으로 사용된다.
실시예 1: 각질 세포 배양에 대한 엘 람노서스 추출물의 효과
여기에서 구현된 시험은 피부 세포를 자극하는 가장 효과적인 추출물을 선택하기 위해 두 개의 프로바이오틱 박테리아 균주 추출물을 비교할 수 있도록 한다. RT-qPCR 방법이 사용되었고, 이는 주요 스킨케어 과정, 특히 표피의 우세한 세포인 각질 세포에 관여하는 유전자의 자극 또는 억제 또는 심지어 자극의 부재를 관찰할 수 있도록 한다.
정상 인간 각질 세포(NHK)를 배양한 다음, 싱기 기재된 엘. 람노서스 프로바이오틱 추출물 또는 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) 추출물로 처리한다.
NHK를 처리한 후, 추출된 전체 RNA의 역전사 후 수득된 cDNA로부터 연구된 유전자에 대해 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 연구를 수행한다.
사용된 세포 및 배양 조건:
세포: 3차 계대 정상 인간 각질 세포(NHEK)
배양 배지: 37℃ 및 5% CO2에서 0.25ng/ml EGF, 25μg/ml 뇌하수체 추출물(pituitary extract) 및 25μg/ml 젠타마이신(gentamycin)으로 보충된 각질 세포-SFM
시험 배지: 25μg/ml 젠타마이신이 보충된 각질 세포-SFM
시험된 화합물:
- 방부제가 없는 Probiophyte LB: 본 발명에 따르는 락토바실러스 람노서스 추출물 CNCM I-5313
- 락토코쿠스 락티스 추출물: Greentech(2012년 3월의 제품 ref. 001119, 배치 번호 LYCC1204E1-BY)에 의해 제공되고 락토코쿠스 락티스 용해물, 시트르산 및 수산화나트륨을 포함하는 락토코쿠스 락티스 추출물. 엘. 락티스의 건조 물질(활성) 함량은 원료 물질의 5 내지 6중량%이다.
시험된 용량: 0.05, 0.1 및 0.2%
치료 시간: 24시간
실험 조건당 N = 3 배양물
수행된 분석:
처리되지 않은 세포 층(대조군)과 다양한 농도의 프로바이오틱 추출물로 처리된 것들로부터 메신저 RNA 추출물에 대한 RT-qPCR에 의한 유전자 발현의 측정. 여러 유전자가 평가되었다. 유전자 및 상응하는 결과는 하기 표에 제시되며, 이 차별적 결과는 본 발명에 따르는 추출물(Probiophyte LB: 락토바실러스 람노서스) 추출물과 비교 추출물(락토코쿠스 락티스 추출물) 사이에서 관찰되었다.
RT-qPCR(RT-정량적 PCR) 기술
· 전체 RNA의 수득
각 샘플의 총 RNA는 공급업체에 의해 권장된 프로토콜에 따라 TriPure 단리 Reagent®를 사용하여 단리시켰다. RNA의 양과 품질은 모세관 전기영동(Bioanalyzer 2100, Agilent)으로 평가되었다.
오염 DNA의 잠재적인 흔적은 DNA 비함유 시스템(Ambion)에 의한 치료로 제거했다.
· 상보성 DNA의 합성
상보성 DNA(cDNA)는 올리고(dT) 및 "전사기 제1 가닥 cDNA 합성" 효소(Roche Diagnostics)의 존재하에 전체 RNA의 역전사에 의해 합성했다. 수득된 cDNA는 분광광도법(Nanovue; GE Healthcare)으로 정량화한 후, cDNA의 양을 5ng/μl로 조정하였다.
· 정량적 PCR
중합효소 연쇄 반응(PCR)은 정량적 PCR(라이트 사이클러(Light Cycler); Roche Molecular Systems Inc.)에 의해 공급업체에 의해 권장된 절차에 따라 수행되었다.
각 샘플에 대한 반응 혼합물(최종 10μl)은 다음을 함유했다:
- 5ng/μl에서 2.5μl의 cDNA,
- 사용된 다양한 마커에 대한 프라이머,
- taq DNA 중합효소 효소, SYBR Green I 마커 및 MgCl2를 함유하는 반응 매질.
데이터 처리 및 통계 분석
미정제 데이터는 Microsoft Excel®로 전송하여 처리되었다.
증폭된 DNA로의 형광의 통합은 PCR 주기 동안 지속적으로 측정된다. 이러한 측정은 PCR 주기의 함수로 형광 강도 곡선을 수득할 수 있도록 하고, 따라서 각 마커에 대한 상대적 발현(RE) 값을 평가할 수 있다.
주기의 수는 형광 곡선의 "출력" 지점으로부터 결정된다. 분석된 동일한 마커의 경우, 샘플이 나중일 수록(주기의 수가 많을수록) 초기 mRNA 카피의 수가 더 낮아진다.
상대적 발현(RE) 값은 다음 식에 따라 임의의 단위(AU)로 표시된다:
(1/2주기의 수) x 106
[표 1]
[표 2]
결과는 락토코커스 락티스 추출물과 비교하여 여러 각질 세포 유전자에 대한 본 발명에 따르는 Probiophyte LB의 자극제 효과를 나타낸다.
상기 표는 몇 가지 중요한 피부 과정에 대한 Probiophyte LB의 자극제 효과를 보여준다:
- 피부 표면의 기계적 및 화학적 내성 및 소수성뿐만 아니라 피부 표면 상의 지질의 조직을 보장하는 각질 세포의 각질화된 외피의 형성을 가능하게 하는 트랜스글루타미나제(TGM1) 유전자의 자극에 의한 피부 장벽의 형성;
- 피부 미생물총: DEFB4A, S100A7, PI3, RNASE7의 발달을 제어할 수 있도록 하는 항균 펩티드를 위한 다수의 유전자의 자극에 의한 선천적 면역, 및
- 진피와 표피 접합부 사이의 부착을 위한 콜라겐인 7형 콜라겐 유전자(COL7A1)의 자극으로 진피-표피 접합부의 강화. 이 콜라겐은 노화 동안 감소된다.
실시예 2: 각질 세포, 멜라닌 세포 및 섬유아세포 배양물에 대한 엘 람노서스 추출물의 효과
이 제2 실험은 더 큰 유전자 레퍼토리와 피부의 세 가지 주요 세포 유형인 각질 세포, 멜라닌 세포 및 섬유아세포에 대한 Probiophyte LB, TaqMan 저밀도 어레이(TLDA) 방법론의 생물학적 효과에 대한 심층 연구를 가능하게 한다.
사용된 세포:
5차 계대 정상 인간 각질 세포(NHK), 6차 계대 정상 인간 섬유아세포 및 7차 계대 정상 인간 멜라닌 세포(NHM)
시험된 화합물:
방부제 없는 Probiophyte LB: 락토바실러스 람노서스 CNCM I-5313 추출물
시험된 용량: 0.1 및 0.2μg/ml
치료 시간: 24시간
실험 조건당 N=3 배양물
수행된 분석:
처리되지 않은 세포층(대조군)과 다양한 농도의 Probiophyte LB로 처리된 것들로부터 메신저 RNA 추출물로부터 RT-qPCR에 의한 유전자 발현의 측정.
TaqMan 저밀도 어레이(TLDA) 기술
· 총 RNA 획득
세포 배양 배지를 제거하고, 250μL의 RLT 용해 완충제(Nucleospin RNA 추적 키트, Macherey-Nagel에 제공됨)를 첨가한다. 세포를 세포 스크레이퍼로 긁어낸 다음, 세포 용해물을 1.2mL 딥 웰(NucleoSpin RNA 키트에 제공됨)에서 회수한다. 정의된 프로토콜에 따라 총 RNA가 추출된다.
수득된 총 RNA 용액을 검정하고, 이들의 품질은 Microlab STAR와 쌍을 이루는 마이크로플레이트 판독기, SPECTROstar Nano(BMG Labtech)를 사용하여 검증한다. 이 장치는 로봇 플랫폼을 제어하는 컴퓨터에 연결되며, 결과 분석(MARS)을 위한 특정 소프트웨어를 갖는다. 이 기술은 로봇에 의해 수행된 피펫팅과 SPECTROstar Nano 판독기에 의해 생성된 값을 검증하기 위해 384-웰 마이크로플레이트(LoBase)와 양성 대조군(RNA 250, AM7155, ThermoFisher)을 필요로 한다.
· 상보성 DNA의 합성
사용된 역전사(RT) 키트는 고용량 역전사 키트(ThermoFisher)이다. 이것은 제공된 프로토콜에 따라 사용되었다. 500ng의 총 RNA를 최종 용적 25μL가 되도록 물로 희석시킨다. 이어서, 이하 표시된 바와 같이 미리 제조된 고용량 역전사 키트 2X 반응 혼합물 25μL의 존재하에 25℃에서 10분 동안, 이어서 37℃에서 2시간 동안 배양한다. 상이한 배양이 TRobot(Biometra)에서 수행된다.
[표 3]
· PCR-TaqMan 저밀도 어레이
15μL의 각 RT를 60μl의 물과 혼합한 다음, DNA 중합효소를 함유하는 TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스(ThermoFisher) 75μL를 첨가한다. 균질화 후, 시험된 유전자에 상응하는 프로브를 함유하는 미세유체 카드(microfluidic card)에 100μL를 증착시키고; 이들을 원심분리한 다음 밀봉시킨다. 플레이트에 증착된 유전자의 프로필에 상응하는 CD ROM은 SDS 2.3 소프트웨어에 적재하여 카드 상 각 유전자의 위치를 구체화한다. 결과의 정상화용으로 사용할 대조군 유전자(또는 "내인성 유전자")는 PCR 시작 전에 표시된다. 이것은 ABI Prism 7900HT 서열 검출 시스템에서 Applied Biosystems에 의해 제공된 프로토콜에 따라 수행된다. qPCR 단계는 40주기 동안 50℃에서 2분, 94.5℃에서 10분, 이어서 97℃에서 30초, 59.7℃에서 1분이다.
통계 분석
실시간 정량적 PCR은 이의 효능이 90% 내지 110% 사이로 구성되는 경우 사용될 수 있다. 각 샘플에 대해, 신호가 나타나는 주기의 수는 SDS 2.3 소프트웨어에 의해 결정된다. 동일한 시험의 경우, 수득된 관심 있는 전사체의 발현 수준은 베타-2-마이크로글로불린 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)에 대해 수득된 값에 대해 정규화된다. 발현이 구성적이고 불변인 이 유전자는 실험 동안 유발된 임의의 변이(총 RNA 검정, 피펫팅, 역전사 단계, 장치에서 PCR)를 해결할 수 있게 한다.
RT-PCR TLDA 방법에서, 정량화는 ΔΔCt 비교 방법을 사용하여 수행된다. 수득된 상대적 정량화(RQ) 값은 여기에서 조사되지 않은 본 대조군에 대한 발현의 진폭 수준(대조군보다 x배 많거나 적음)에 상응한다. RQ는 다음 계산에 의해 수득되고, 여기서 대조군은 1이다:
RQ = 2-ΔΔCt = 2-(ΔCt 처리됨 - ΔCt 미처리됨)
ΔCt 처리됨 = Ct 처리된 표적 유전자 - Ct 처리된 하우스키핑 유전자
ΔCt 미처리됨 = Ct 미처리된 표적 유전자 - Ct 미처리된 하우스키핑 유전자
전사 활성의 통계적으로 유의한 변화를 평가하기 위해, 본 발명자들은 스튜던츠 t-테스트(Student's t-test)를 사용할 것이다. 각 조건은 3중으로 수행된다(동일한 조건하에 3개 미처리됨 및 3개 처리됨). 피셔 F 테스트(Fisher's F test)는 먼저 두 데이터 매트릭스(matrix)를 비교하여 적용된다. 값이 α = 0.05보다 크면, 스튜던트 t-테스트의 분산은 2이고, 피셔 F-테스트가 α = 0.05보다 작으면, 분산은 3일 것이다. 사용된 전사 변형은 α = 0.05보다 작은 스튜던트 t-테트스에 상응하는 것들일 것이다.
결과는 n=3에 대한 평균으로 표시된다. 처리된 세포와 미처리된 세포 사이의 효과를 비교하기 위해 스튜던트 t-테스트가 사용되었다.
결과는 p<0.05(*) 또는 p<0.01(**)에 대해 유의한 것으로 간주된다.
아래 결과 표는 이전 연구의 것들에 상보적인 여러 각질 세포(NHK) 유전자와 여러 멜라닌 세포(NHM) 및 섬유아세포(NHF) 유전자에 대한 Probiophyte LB의 효과를 보여준다.
1 미만의 값은 상기 유전자의 발현에 억제제 효과에 상응하고, 1보다 큰 값은 상기 유전자의 발현에 대한 자극제 효과에 상응한다.
[표 4]
[표 5]
[표 6]
이러한 결과는 진피 섬유아세포가 각질 세포(n=2 유전자 조절됨) 및 멜라닌 세포(n=1 유전자 조절됨)보다 Probiophyte LB(n=22 유전자 조절됨)에 의한 유전자 조절에 훨씬 더 민감하다는 것을 보여준다. 따라서, 추출물은 진피 세포에서 매우 큰 활성을 갖는다.
진피 섬유아세포의 경우, 특히 다음과 관련된 유전자의 활성화는 본 발명의 락토바실러스 람노서스 용해물에 의해 관찰된다:
- 섬유아세포가 매트릭스를 견고성(ITGB1)에 대한 본 공정의 긍정적인 효과로 조밀화하고 수축하게 하는 세포-매트릭스 접착 및 응집력;
- 핵과 같은 세포 구조의 완전성 유지, 따라서 피부 세포(SYNE2, LMNA)의 내성의 완전성 유지;
- 진피의 주요 성분이고 그 자극이 노화의 영향을 반대하는 여러 콜라겐 및 엘라스틴(COL1A1, COL5A1, COL13A1, ELN)의 형성;
- 물에서 이의 중량을 최대 1000배까지 보유할 수 있는 히알루론산의 형성(HAS2 및 3), 고정(CD44) 및 분비(ABCC5)와 함께 수분 이동(AQP1) 또는 수분 보유량에 대한 진피의 수분 균형;
- 진피 세포 재생(Ki67)
- 세포 항산화 방어(GPX1) 및 해독제(ABCC1=MRP1).
이 유전자는 세포에 독성이 있을 수 있는 화합물을 세포에서 추방할 수 있도록 하는 단백질을 코딩한다:
- 피부 나이에 따라 증가하고(노화된 피부에서 탄산 탈수효소 9와 같은 저산소증 마커 참조) 나이에 따른 진피 혈관 네트워크의 감소로 설명될 수 있는 저산소증(HIF1a) 상태에 대한 세포의 적응;
- 글루코스의 세포(SLC2A1)로의 진입을 갖는 에너지 및 영양;
- 미토콘드리아에서 에너지의 생산(MT= NADH 탈수소효소 또는 유비퀴논);
- 해독 및 손상된 미토콘드리아 단백질(L0NP1)의 분해 및 재활용에 의한 미토콘드리아의 보호.
각질 세포의 경우, 다음이 관찰된다:
- 선천적 면역(TLR1)에 관여하고 리포펩티드와 같은 박테리아 성분을 위한 면역 감시 수용체인 유전자의 활성화
- 노화에 따라 증가하는 과정인 콜라겐 분해(MMP9)에 관여하는 유전자의 억제.
멜라닌 세포의 경우, 다음이 관찰된다:
- 탈색 효과에 기여하는 이들 세포(PPARG)에서 멜라닌생성 자극 인자의 감소.
모든 결과는 케라틴 물질, 특히 피부에 적용된 본 발명에 따르는 락토바실러스 람노서스 추출물(CNCM I-5313)이 피부의 견고성 및 밀도 손실을 방지 및/또는 감소시키고, 주름 및/또는 잔주름 및/또는 피부 반점의 출현을 방지 및/또는 감소시키고, 피부 광채 및/또는 균일성을 개선하고, 피부 수화를 촉진 및/또는 개선하고, 피부를 해독시키고, 항산화 방어를 자극하고/하거나 저산소증에 대한 피부의 내성을 개선하고/하거나 피부 미생물총을 제어하고/하거나 피부 면역 및 피부 장벽의 형성을 자극하는 것을 가능하도록 한다는 것을 보여준다.
실시예 3: 제형
다음 제형은 화장품 분야에서 통상적인 제형화 방법에 따라 제조된다.
노화 방지 재생 세럼
피부에 도포되면, 조성물은 피부 견고성을 개선하고 주름을 감소시킨다.
정제 마스크
피부에 도포되면, 조성물은 피지 수준을 감소시키고, 모공 크기를 감소시키며, 피부 결을 개선한다.
항오염 해독 로션
피부에 도포되면, 조성물은 피부에 건강한 광채와 윤기 있고 균일한 안색을 부여한다.
미백 에센스
피부에 도포되면, 조성물은 안색의 균일성을 향상시킨다.
광택 파운데이션
피부에 도포되면, 조성물은 건강한 광채 및 윤기 있는 균일한 안색을 부여한다.
비타민 세럼
피부에 도포되면, 조성물은 피부 견고성을 개선하고 건강한 광채를 부여한다.
미스트
피부에 도포되면, 조성물은 피부의 영양을 촉진 및/또는 개선하고, 건강한 광채 및 윤기 있고 균일한 안색을 부여한다.
Claims (10)
- 생리학적으로 허용되는 매질에 적어도 하나의 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 추출물(CNCM I-5313), 이의 분획 중 하나 및/또는 이의 대사산물 중 하나 및 물 이외의 용매, 계면활성제, 겔화제(gelling agent), 증점제(thickener), 충전제, 염료, 필름-형성 중합체, 방향제 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 적어도 하나의 부형제를 포함하는, 케라틴 물질(keratinous material), 특히 피부 및/또는 입술에 국소 적용(topical application)하기 위한 조성물로서, 락토바실러스 람노서스 용해물(Lactobacillus rhamnosus lysate) CNCM II-5313, 이의 분획 중 하나 및/또는 이의 대사산물 중 하나임을 특징으로 하는, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 락토바실러스 람노수스 용해물 CNCM I-5313이 이의 총 중량에 대해 0.1 내지 10중량%, 특히 0.5 내지 5중량%, 특히 1 내지 2중량%의 활성 건조 물질(active dry material)을 포함함을 특징으로 하는, 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 락토바실러스 람노서스 추출물 CNCM I-5313이 상기 조성물의 총 중량에 대해 0.0001 내지 10중량%, 특히 0.0001 내지 5중량%, 특히 0.0001 내지 2중량%, 특히 0.0001% 내지 1중량%, 또는 심지어 0.0001 내지 0.05중량%의 활성 물질(건조 물질) 범위의 함량으로 존재함을 특징으로 하는, 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 비타민 또는 이를 함유하는 추출물 이외의, 특히 필수 지방산이 풍부한 오일 또는 그렇지 않으면 프리바이오틱 추출물(prebiotic extracts), 프로바이오틱 미생물 또는 심지어 공생 성분(symbiotic ingredient)의 다른 균주의 다른 추출물, 피지 조절제 및 고화제(firming agent), 진정제, 항산화제, 탈색소제, 각질 제거제, 노화 방지 활성 성분, 보습 성분, 면역조절 활성 성분, 및 이의 혼합물로부터 선택된 적어도 하나의 향장학적 활성 성분(cosmetic active agent)을 또한 포함함을 특징으로 하는, 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 수중유(oil-in-water) 또는 유중수 에멀젼 또는 다중 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 로션, 젤, 크림, 우유, 세럼(serum), 미스트(mist), 스틱 또는 심지어 분말 형태로 존재함을 특징으로 하는, 조성물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 피부 및/또는 입술용 케어 및/또는 메이크업(makeup) 제품임을 특징으로 하는, 조성물.
- 적어도 하나의 락토바실러스 람노서스 추출물 CNCM I-5313, 특히 락토바실러스 람노서스 용해물 CNCM I-5313, 이의 분획 중 하나 및/또는 이의 대사산물 중 하나, 또는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 조성물을 케라틴 물질에 적용하는 단계를 포함하는, 피부 노화의 징후를 예방 및/또는 감소시키고/시키거나 장벽 기능(barrier function)을 촉진 및/또는 개선시키기 위한 비치료적 향장학적 방법(non-therapeutic cosmetic method).
- 제7항에 있어서, 피부 견고성 및/또는 밀도의 손실을 방지 및/또는 감소시키고, 주름 및/또는 잔주름 및/또는 피부 반점의 출현을 예방 및/또는 감소시키고, 피부 광채 및/또는 균일함을 개선하고, 피부 수화를 촉진 및/또는 개선하고, 피부를 해독하고/하거나 저산소증에 대한 피부 내성(resistance)을 개선하고/하거나 피부 미생물총(microflora)을 제어하기 위한 것임을 특징으로 하는, 향장학적 방법.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 조성물이 노화되고, 윤기가 없고, 지친 피부 또는 바람직하지 않거나 불균형한 식이(diet), 정서적 스트레스 또는 수면 부족으로 영향을 받은 피부에 적용됨을 특징으로 하는, 향장학적 방법.
- 장벽 기능을 촉진 및/또는 개선하고/하거나, 피부 노화의 징후를 감소시키기 위한, 특히 피부 견고성 및/또는 밀도의 손실을 방지 및/또는 감소시키고, 주름 및/또는 잔주름 및/또는 피부 반점의 출현을 예방 및/또는 감소시키고, 피부 광채 및/또는 균일함을 개선하고, 피부 수화를 촉진 및/또는 개선하고, 피부를 해독하고/하거나 저산소증에 대한 피부 내성을 개선하고/하거나 피부 미생물총을 제어하기 위한, 락토바실러스 람노서스 추출물 CNCM I-5313, 특히 락토바실러스 람노서스 용해물 CNCM I-5313, 이의 분획 중 하나 및/또는 이의 대사산물 중 하나의 비치료적 용도.
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