CN112587432A

CN112587432A - 一种含噻唑烷抗菌环肽的凝胶型精华油及其制备方法

Info

Publication number: CN112587432A
Application number: CN202011558124.3A
Authority: CN
Inventors: 马文君; 石莲莲; 王培培; 孙亚萍; 郑春阳
Original assignee: Robustnique Corp ltd
Current assignee: Robustnique Corp ltd
Priority date: 2020-12-25
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2021-04-02

Abstract

一种含噻唑抗菌环肽的凝胶型精华油，包括噻唑烷环肽、提高皮肤自身免疫力活性物质、油相凝胶剂、植物油脂、抗氧化剂等组分，其特征在于所添加的噻唑烷环肽和提高皮肤自身免疫力活性物质具有修复皮肤屏障损伤、提高皮肤自身免疫能力的功效。通过添加油相凝胶成分，使得精华油体验感舒适不粘腻。

Description

一种含噻唑烷抗菌环肽的凝胶型精华油及其制备方法

技术领域

本发明属于化妆品配方技术领域，尤其涉及一种含有新型的噻唑烷抗菌环肽和修复皮肤屏障损伤的凝胶型精华油。

背景技术

皮肤被一个包括细菌、病毒、真菌和螨虫在内的多种复杂的共生和致病微生物群落所占据。皮肤通过多种免疫防御系统来管理与不同微生物群落的相互作用。皮肤产生一系列抗菌蛋白，通过靶向细菌的细胞壁或细胞膜结构来杀死细菌。皮肤表达的抗菌蛋白具有多样性，目前在皮肤中发现了几种不同的抗菌蛋白家族，包括Cathelidins、S100蛋白质和β-防御素。在稳定状态下，抗菌蛋白的存在允许与共生微生物定殖，同时可以有效地防止致病微生物如金黄色葡萄球菌持续存在。但是当皮肤屏障损伤出现皮损给金黄色葡萄球菌提供生长繁殖的机会，金黄色葡萄球菌表达大量的毒力因子，是造成浅表性和侵袭性感染发病的主要原因，一些毒力因子通过作用于角质形成细胞和免疫细胞的机制，促进皮炎病原体的形成或疾病的恶化。

近年来，添加抗菌肽以修复皮肤屏障成为研究热点。虽然市场上存在一些添加抗菌肽的护肤品，但是这些护肤品中添加的主要是线性肽（CN110183528A，CN111494603A）。与线性肽相比，环肽具有较高的蛋白水解稳定性，生物活性高、半衰期长、受体选择性强，并且这种环状分子具有明确的分子构象，能够与受体很好地契合。加上分子内不存在游离的活性末端，使其对水解酶的敏感性大大降低。因此，环肽的代谢稳定性和生物利用度远远高于直链肽，在化妆品中能够保持更好的稳定性。根据文献报道，在环肽的基础上接枝噻唑烷基使其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）具有微摩尔抗菌活性。

目前市面上已有的精华油产品，产品配方主要以动物油脂和植物油脂为主，主要依靠油脂在皮肤表面形成一层防御来实现皮肤水润状态，缓解皮肤敏感，功能相对单一。由于皮肤亲脂性的原因，通过在油脂中添加活性成分来修复受损屏障，其效果非常有限。另外，精华油由于产品自身特性，在使用过程中会给体验者带来油腻、粘腻感。因此有必要开发一款兼具功能性和舒适体验的精华油。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明首次提出了一种含有噻唑抗菌环肽凝胶型精华油配方，其不但具有屏障修复的功能，同时具有舒适不粘腻的体验感。

本发明的第二目的在于提供一种含有噻唑抗菌环肽的凝胶型精华油的制备方法，通过剂型的改变以解决精华油在使用过程中产生油腻感的问题。

本发明的第三目的在于提供一种噻唑抗菌环肽的制备方法。

本发明的第四目的在于提供噻唑抗菌环肽在皮肤屏障损伤预防修复和提高皮肤自身免疫的化妆品中的应用。

本发明的一种含噻唑抗菌环肽的凝胶型精华油的具体技术方案如下：

一种含噻唑抗菌环肽的凝胶型精华油，按照质量百分比计，包括以下组分：

噻唑烷环肽0.05-5%、提高皮肤自身免疫力活性物质2-5%、油相凝胶剂10-25%、植物油脂20-50%、抗氧化剂1-5%、余量为合成油脂。

更优选的，含有新型的噻唑抗菌环肽和修复皮肤屏障损伤的凝胶型精华油，按照质量百分比计，包括以下组分：

噻唑烷环肽0.5-5%、提高皮肤自身免疫力活性物质1.6-3.4%、油相凝胶剂11-22%、植物油脂44-45.8%、抗氧化剂2.8-4.6%、余量为合成油脂。

所述提高皮肤自身免疫力活性物质为卵磷脂、溶血卵磷脂、溶血磷脂酸、白桦脂醇、乙酰基4肽-11中一种或几种。

所述凝胶型精华油中油相凝胶剂为甘油山嵛酸酯、二十酸酯、丙二醇二辛酸酯、二癸酸酯、碳酸丙二醇酯中一种或几种。

本发明还提供了一种新型噻唑抗菌环肽凝胶型精华油的制备方法，步骤如下：

S1分别称取植物油脂、提高皮肤免疫能力活性物质、合成油脂和油相凝胶剂称入烧杯中，持续搅拌30-40 min，加热升温至70-90℃，保温5-10 min，均质5.0-7.0 krpm*2 min，搅拌下降温，搅拌转速为120-170 rpm；

S2待混合体系降温至40-45℃以下，称取环肽和抗氧化剂加入已降温体系混合均匀；

S3待产品降温至室温过滤出料即可。

本发明还提供了一种噻唑抗菌环肽的制备方法，步骤如下：

（1）发酵：路邓葡萄球菌经培养发酵，所述培养发酵条件为添加0.2-0.8%木糖的BM培养基，在36-38 ℃，转速为150-180 rpm，培养24-36 h；

（2）破壁：将发酵液离心后收集菌体，将菌体进行高压均质破壁，所述高压均质条件为压力400-800 bar，均质次数3-5次；

（3）提取：所述提取条件为添加培养物体积5-7倍的1-丁醇提取整个培养物，离心后丢弃水相，并在35-38℃下减压蒸发有机相，最后溶解于甲醇中。

所述减压蒸发条件为甲醇混合物在35-38℃减压下蒸发，得到含噻唑抗菌环肽白色粉末状的物质。

所述缓冲体系为Tris-HCl（pH 5.6-6.0）、EDTA、甘油、氯化钠中的一种或几种。

所述柱层析条件为硅胶柱，洗脱剂为甲醇、乙醇和乙酸乙酯的一种或几种。

本发明还提供了噻唑抗菌环肽在皮肤屏障损伤预防修复和提高皮肤自身免疫的化妆品中的应用。

更优选的，可以将噻唑抗菌环肽和修复皮肤屏障损伤的凝胶型精华油应用于皮肤屏障功能异常的敏感皮肤中，用作抗敏化妆品。

本发明的有益效果：

1本发明首次提供噻唑抗菌环肽在精华油中的应用，该精华油富含高活性抗菌环肽，具有修复皮肤屏障损伤、提高皮肤自身免疫能力的功效；

2本发明首次提出了一种凝胶型精华油，通过添加油相凝胶成分，使得精华油体验感舒适不粘腻；

3本发明首次提出了一种新型的噻唑抗菌环肽的制备方法。

附图说明

图1为本发明的抗菌能力结果图；

图2为本发明的小鼠切片H&E染色结果图。

具体实施方式

为了更好地了解本发明的目的及功能，下面通过实施例的方式进一步说明本发明，并结合表格及附图，对本发明做进一步详细的描述。

对照例和实施例1-4具体成分和添加量如表1所示：

表1含噻唑抗菌环肽凝胶型精华油配方(质量份数)

以上对照例和实施例均按照如下步骤制备：

S3待产品降温至室温过滤出料即可。

将制备得到的含噻唑抗菌环肽凝胶型精华油进行下述功效测试：

（一）抗菌性测试

金黄色葡萄球菌在营养肉汤培养基中生长至对数中期，将菌涂布营养肉汤(NB)固体培养基，分别在平皿上放置牛津杯，用移液枪吸取等量的样液滴至牛津杯中，将平板置于37℃过夜培养，观察结果如图1所示，根据抑菌圈的大小可以看出，实施例2-4的抗金黄色葡萄球菌感染能力明显强于对照例。

（二）DPPH自由基(DPPH·)清除能力的测定

依次向96孔板中加入100 μL不同浓度的样品液，再加入100 μL 浓度为0.2 mmol /L的DPPH 溶液(用无水乙醇溶液溶解)，在室温下，避光反应30 min后，用酶标仪测定517 nm处的吸光度值(OD₅₁₇ )。DPPH·清除率的计算公式为：

清除率 =

式中，A₁为100 μL DPPH工作液+ 100 μL样品液的OD₅₁₇;

A₂ 为100 μL 无水乙醇+ 100 μL样品液的OD₅₁₇ ;

A₀ 为100 μL DPPH工作液+ 100 μL蒸馏水的OD₅₁₇。

表2对照例和实施例的DPPH自由基清除率

抗氧化剂清除DPPH自由基的能力常用IC₅₀来表示，即当DPPH自由基清除率为50%时所对应的抗氧化剂溶液的浓度值。IC₅₀值越大，则说明抗氧化能力越弱。同对照例相比，实施例1-4的IC₅₀均显著高于对照例，说明实施例具有较强的抗氧化能力。

（三）总抗氧化能力检测(FRAP法)

标准曲线测定的准备：称取27.8 mg FeSO₄•7H2O，溶解并定容到1 mL，此时浓度即为100 mM。取适量100 mM FeSO₄溶液稀释至0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5 mM。

总抗氧化能力的测定：往96孔板的每个检测孔中加入180 μLFRAP工作液。空白对照孔中加入5 μL蒸馏水或PBS等适当溶液；标准曲线检测孔内加入5 μL各种浓度的 FeSO₄标准溶液；样品检测孔内加入5 μL各种样品，轻轻混匀。37ºC孵育3-5 min后测定A₅₉₃。根据标准曲线计算出样品的总抗氧化能力。

表3对照例和实施例总抗氧化能力（FRAP法）

FRAP法总抗氧化能力如表3所示，实施例1-4的总抗氧化能力显著高于对照例。

（四）小鼠屏障实验效果评价

将10只小鼠随机分成2组，在颈背部取5 cmx5 cm先用电推推去背部的毛，再用薇婷脱毛膏脱去背部残留的毛，A组为对照例，注射D-乳糖溶液，涂抹对照例精华油；B组为实施例4，注射D-乳糖溶液，涂抹实施例4精华油，7周后处死小鼠，取小鼠颈背部受试皮肤，制作皮肤切片。将小鼠皮肤固定、脱水、包埋、切片、脱腊后进行 H&E 染色，观察表皮、真皮组织结构（如图2所示）。

从图2中可以看出，正常组小鼠皮肤结构完整，表面平整；真皮与表皮界线清晰，表皮规则，真皮层较厚，细胞层数较多，排列致密；皮下脂肪、毛囊、汗腺丰富；皮脂腺结构完整。模型组小鼠皮肤结构可辨，表面粗糙；真皮与表皮界线尚可分清，表皮不规则，真皮层变薄，且厚度不均，细胞层数减少，排列疏松；皮下脂肪、毛囊、汗腺、明显减少；皮脂腺结构可辨。和对照例相比，实施例4小鼠皮肤结构相对于模型组基本恢复，厚度增加红色箭头所示；表皮与真皮界线尚清晰，表皮相对规则，真皮厚度较均匀，细胞层数增多；皮下脂肪、毛囊、皮脂腺丰富；汗腺结构相对完整。

（五）小鼠组织rtPCR分析

将小鼠切除的组织立即在浸泡在RNAlater储存液中，并在-20°C下储存，直到分离出RNA。使用组织匀浆器和商业试剂盒（RiboPure；Applied 分离RNA。所有分离的RNA的A260/A280值均≥1.7。然后，使用商业试剂盒用2μg RNA生成反转录成DNA。使用基于Taqman的扩增技术，在StepOne系统上使用默认标准协议对每个单独的基因表达进行分析。使用的小鼠Taqman探针有I-IFN、CXCL10、Fgf2、Fgf7、Tgfb1、VEGF、Egf和Pdgf。计算各基因表达值。然后以未受伤的小鼠皮肤作为参考，计算相对表达量。

表4小鼠组织rtPCR分析

由表4结果可知，实施例4可以促进I型干扰素（IFN）、趋化因子CXCL10和生长因子表达。表明由I型干扰素（IFN）产生的浆细胞样DC（pDC）的募集和激活所介导的。在皮肤表达趋化因子CXCL10，该因子招募pDC并激活pDC产生I型IFN，通过触发皮肤炎症和早期T细胞来提升皮肤屏障，由巨噬细胞和成纤维细胞介导，产生愈合所需的主要生长因子。这些发现确定了实施例4在驱动皮肤屏障改善反应中的关键作用。

（六）产品感官与理化性质测试

按照QB/T 1857-2013的规定对对照例和实施例进行感官评价和理化指标检验。

表5感官评价和理化指标

由表5结果可知，实施例1-4黏度低于对照例，肤感方面实施例啫喱质地，易推开，吸收快，滋润顺滑不油腻。理化指标均满足QB/T 1857-2013的规定。

（六）产品安全性能测定

安全性评价采用人体手臂皮肤斑贴实验方法，选择20名志愿者，量勺取0.02 g精华油样品放入斑试器内，斑试器标好标记实施例1-4。将斑试器小心平整贴于志愿者的前臂曲侧，再轻压斑试器让样品精华油均匀接触志愿者的手臂皮肤，持续时间为24 h，去除斑试器30 min后，待压痕消失后观察皮肤状态，48 h后再观察一次。

结果评定原则：受试部位无反应为0，皮肤出现微弱红斑为1，皮肤出现红斑、浸润水肿或丘疹为2，皮肤出现水肿性红斑、丘疹、疱疹为3，皮肤出现明显红斑、显著水肿、融合性丘疹为4。20例中出现2级皮肤不良反应的人数多于2例，或出现任何1例3级或3级以上皮肤不良反应时，判定受试物对人体有不良反应。

表6对照例和实施例的安全性评价

由表6结果可知，对照例和实施例均维产生不良反应，结果表明安全无刺激。

综上所述，本发明中的实施例配方在抗菌、清除自由基、抗氧化、屏障保护、感官和理化、安全性方面均优于对照组。

可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。

Claims

1.一种含噻唑抗菌环肽的凝胶型精华油，按照质量百分比计，包括以下组分：

2.根据权利要求1所述的一种含噻唑抗菌环肽的凝胶型精华油，其特征在于，按照质量百分比计，包括以下组分：

3.根据权利要求1或2所述的一种含噻唑抗菌环肽的凝胶型精华油，其特征在于，

所述提高皮肤自身免疫力活性物质为卵磷脂、溶血卵磷脂、溶血磷脂酸、白桦脂醇、乙酰基4肽-11中一种或几种；

4.一种含噻唑抗菌环肽的凝胶型精华油的制备方法，其制备过程如下：

S3待产品降温至室温过滤出料即可。

5.一种噻唑抗菌环肽的制备方法，其制备步骤如下：

1)发酵：路邓葡萄球菌经培养发酵，所述培养发酵条件为添加0.2-0.8%木糖的BM培养基，在36-38℃，转速为150-180 rpm，培养24-36 h；

2)破壁：将发酵液离心后收集菌体，将菌体进行高压均质破壁，所述高压均质条件为压力400-800 bar，均质次数3-5次；

3)提取：所述提取条件为添加培养物体积5-7倍的1-丁醇提取整个培养物，离心后丢弃水相，并在35-38℃下减压蒸发有机相，最后溶解于甲醇中。

6.根据权利要求5所述的一种噻唑抗菌环肽的制备方法，其特征在于：

所述减压蒸发条件为甲醇混合物在35-38℃减压下蒸发，得到含噻唑抗菌环肽白色粉末状的物质；

所述缓冲体系为Tris-HCl（pH 5.6-6.0）、EDTA、甘油、氯化钠中的一种或几种；

7.一种噻唑抗菌环肽在皮肤屏障损伤预防修复和提高皮肤自身免疫的化妆品中的应用。

8.根据权利要求7所述的一种噻唑抗菌环肽的应用，其特征在于，噻唑抗菌环肽在抗敏化妆品中的应用。