CN113453660A

CN113453660A - 包含鼠李糖乳杆菌提取物的组合物

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Publication number: CN113453660A
Application number: CN201980092564.3A
Authority: CN
Inventors: M·迪马; C·厄塞勒; V·戈尔泽兰茨克; O·让纳东
Original assignee: LVMH Recherche GIE
Current assignee: LVMH Recherche GIE
Priority date: 2018-12-21
Filing date: 2019-12-18
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2039-12-18
Also published as: US20220054401A1; FR3090383A1; FR3090383B1; US12011501B2; WO2020127581A1; EP3897569A1; JP2022514669A; KR20210116494A; CN113453660B

Abstract

本发明涉及一种用于局部应用至角质材料，特别是皮肤和/或嘴唇的组合物，其在生理学上可接受的介质中包含至少一种鼠李糖乳杆菌(CNCM I‑5313)提取物，其级分之一和/或其代谢物之一和至少一种赋形剂，所述赋形剂选自水以外的溶剂、UV过滤剂、表面活性剂、胶凝剂、增稠剂、填充剂、染料、成膜聚合物、香料及其混合物；及其用途，特别是用于促进和/或改善皮肤屏障功能的用途。

Description

包含鼠李糖乳杆菌提取物的组合物

技术领域

本发明涉及一种组合物及其对角质材料特别是皮肤的有益作用，所述组合物包含鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的新型提取物，特别是鼠李糖乳杆菌(CNCM I-5313)裂解物。

背景技术

皮肤是人体的主要屏障。其保护器官免受温湿度差异和外界环境的损害，如UV辐射、压力、污染、病原微生物等。然而，过度的化学和物理刺激损伤皮肤的正常功能，诱发或加速其老化，导致皱纹的出现以及紧致度、柔韧度和弹性的损失。

寻找可用于化妆品的新分子或活性成分是开发有效产品的必要条件，以给予皮肤更年轻的外观，更均匀的肤色，没有色素沉着或微循环导致的不规则着色，容光焕发的肤色。

申请人已正确地证明鼠李糖乳杆菌提取物，特别是鼠李糖乳杆菌(CNCM I-5313)裂解物在体外对皮肤培养物具有有益作用。申请人证明该裂解物对多种基因的表达具有刺激作用，所述基因尤其涉及：

-解毒(MRP1＝ABCC1、LONP1、GPX1)，

-涉及细胞能量产生的线粒体呼吸链的功能(MT＝NADH脱氢酶/泛醌)，

-透明质酸的分泌(MRP5)，

-细胞结构如细胞核(SYNE2、LMNA)的完整性的维持，和

-多种胶原蛋白和弹性蛋白(COL1A1、COL5A1、COL13A1、ELN)的形成。

因此，根据本发明的鼠李糖乳杆菌提取物，特别是鼠李糖乳杆菌(CNCM I-5313)裂解物的优势在于，其表现出解毒和抗氧化作用，旨在减少皱纹及紧致度和密度(胶原蛋白和弹性蛋白以及细胞和这些蛋白质结构之间的锚定点)的损失的抗老化作用，皮肤强化作用(细胞结构，如细胞核)，使皮肤适应缺氧压力的作用，对皮肤斑点的脱色作用(黑色素生成抑制)和/或经由增强先天免疫和皮肤屏障使皮肤微生物群正常化的作用。

发明内容

本发明的第一主题涉及一种用于局部应用至角质材料，特别是皮肤和/或嘴唇的组合物，所述组合物在生理学上可接受的介质中包含至少一种鼠李糖乳杆菌(CNCM I-5313)提取物，其级分之一和/或其代谢物之一和至少一种赋形剂，所述赋形剂选自水以外的溶剂、UV过滤剂、表面活性剂、胶凝剂、增稠剂、填充剂、染料、成膜聚合物、香料及其混合物，特别是水以外的溶剂、表面活性剂、胶凝剂、增稠剂、填充剂、染料、成膜聚合物、香料及其混合物。

本发明还涉及一种非治疗性美容方法，包括向角质材料应用至少一种根据本发明的鼠李糖乳杆菌(CNCM I-5313)提取物或含有其的组合物，其旨在预防和/或减少皮肤老化的标志和/或促进和/或改善屏障功能。术语鼠李糖乳杆菌(CNCM I-5313)或鼠李糖乳杆菌CNCM I-5313可互换使用，其对应于根据布达佩斯条约，在2018年4月11日，以BIOVITIS,LeBourg,15400SAINT-ETIENNE-DE-CHOMEIL为名称，以CNCM I-5313为指定编号，向巴斯德研究所(28rue du Docteur Roux,F-75024 Paris cedex 15)的国家微生物培养物保藏中心(CNCM)提交的鼠李糖乳杆菌菌株。

本发明还涉及鼠李糖乳杆菌(CNCM I-5313)提取物促进和/或改善屏障功能和/或减少皮肤老化标志的非治疗性美容用途。

具体实施方式

因此，本发明尤其涉及一种用于局部应用至角质材料，特别是皮肤和/或嘴唇的组合物，所述组合物在生理学上可接受的介质中包含至少一种鼠李糖乳杆菌(CNCM I-5313)提取物，其级分之一和/或其代谢物之一和至少一种赋形剂，所述赋形剂选自水以外的溶剂、表面活性剂、胶凝剂、增稠剂、填充剂、染料、成膜聚合物、香料及其混合物。

根据本发明，“角质材料”是指皮肤、粘膜(特别是嘴唇)和外皮(phanères)。根据一个特别的实施方案，组合物旨在用于局部应用至皮肤、嘴唇或外皮，优选皮肤。

根据本发明的“角质材料”通常为健康的角质材料，即不呈现由病理状态导致的病症或疾病(患有病状的“不健康”受试者)。在说明书的其余部分，表述健康皮肤和/或嘴唇或皮肤和/或嘴唇可互换使用。

“生理学上可接受的介质”是指与角质材料，特别是皮肤和/或嘴唇相容的介质。

根据本发明，“赋形剂”是指本身缺乏美容作用，但可用于将鼠李糖乳杆菌提取物掺入本发明的组合物或其制剂中的物质。

鼠李糖乳杆菌提取物

根据国际科学协会对益生菌和益生元的定义，“益生菌”是指活的微生物，当其以适当的量施用时，对宿主的健康具有有益作用。“益生元”是指耐受消化的食物成分，其诱导肠道微生物群的组成和/或活性发生特定变化，从而对宿主产生有益作用。“共生素(symbiotiques)”是指同时含有益生菌和益生元的产品。

根据本发明的鼠李糖乳杆菌提取物(益生菌微生物)可以以活的、半活性的或灭活的、死的形式包含在根据本发明的组合物中。其可以以细胞组分的级分的形式或以代谢物的形式包含在内。微生物、代谢物或级分也可以以冻干粉末、培养物上清液和/或浓缩形式(如适用)引入。

根据一个特别的实施方案，鼠李糖乳杆菌微生物以灭活的或死的形式，更特别地以裂解物的形式使用。

因此，根据一个特别且优选的实施方案，根据本发明的鼠李糖乳杆菌提取物为鼠李糖乳杆菌(CNCM I-5313)(非存活的)裂解物、其级分之一和/或其代谢物之一。

术语“益生菌提取物”或“鼠李糖乳杆菌提取物”或“益生菌裂解物”或“鼠李糖乳杆菌裂解物”可互换使用。

裂解物尤其是指一种材料，其通过所考虑的微生物细胞的细胞裂解而获得，从而诱导所述细胞中天然包含的细胞内生物组分的释放。所使用的裂解物由全部或部分细胞内生物组分以及细胞壁和细胞膜的组分形成。因此，本发明涉及益生菌裂解物和/或其级分之一和/或其代谢物之一。

在本发明的含义内，术语“级分”更特别地表示所述微生物的片段，与所述完整微生物相比，其至少部分地具有相同的对皮肤的有益作用。

特别地，根据本发明的裂解物含有具有酶(例如脱氢酶、磷酸酶等)的细胞质级分和/或细胞壁组分(例如肽聚糖等)和/或细胞膜组分(例如甘油磷脂等)。

可以通过技术人员熟知的不同技术，例如渗透休克、热休克、超声或甚至在机械应力(例如离心)下使细胞裂解。

根据一个优选的实施方案，通过离心和渗透休克(例如，加入氢氧化钠)获得裂解物。

根据一个特别的实施方案，在合适的培养介质中厌氧培养微生物。当达到生长的稳定期时，可以通过巴氏杀菌使培养介质灭活，例如在60至65℃的温度持续30分钟。然后，通过常规分离技术收集微生物，例如膜过滤、离心和在生理学上无菌的NaCl溶液中再混悬。可以通过该介质的超声分解来获得裂解物，以释放细胞质级分、细胞壁片段和代谢产物。然后，将自然分布的所有组分稳定在弱酸性溶液中。

由此获得的裂解物通常具有相对于其总重量以活性干物质的重量计约0.1至10％，特别是0.5至5％，尤其是1至2％的浓度。

然后，可以以不同的形式、溶液的形式或粉末的形式使用裂解物。

根据一个特别的实施方案，裂解物为溶液的形式，优选水溶液的形式，其包含相对于其总重量以重量计0.1至10％，特别是0.5至5％，尤其是1至2％的活性干物质。

根据本发明的益生菌微生物属于物种鼠李糖乳杆菌(ATCC 7469、CCM 1825、NCDO243、NCIB 6375或WDCM 00101，取决于其所提交的保藏)，优选根据布达佩斯条约，在2018年4月11日，以BIOVITIS,Le Bourg,15400SAINT-ETIENNE-DE-CHOMEIL为名称，以CNCM I-5313为指定名称，向巴斯德研究所(28rue du Docteur Roux,F-75024 Paris cedex 15)的国家微生物培养物保藏中心(CNCM)提交的鼠李糖乳杆菌CNCM I-5313菌株，和/或其级分之一和/或其代谢物之一。

该鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)菌株的裂解物根据以下方案从供应商Greentech获得：

1、在合适的培养介质中培养鼠李糖乳杆菌菌株；

2、通过离心回收生物质；

3、细胞裂解(加入氢氧化钠)；

4、调节pH(加入柠檬酸)和干物质(加入无菌水)，以获得相对于所述裂解物的总重量以干物质(活性物质)的重量计0.1至10％的活性物质含量；

5、加入防腐剂(苯氧乙醇)。

这种鼠李糖乳杆菌裂解物被供应商Greentech称为Probiophyte LB，并由其INCI名称水和发酵乳杆菌和苯氧乙醇和氢氧化钠和柠檬酸(WATER and LACTOBACILLUSFERMENT LYSATE and PHENOXYETHANOL and SODIUM HYDROXIDE and CITRIC ACID)所定义；苯氧乙醇可以用另一种防腐剂代替。

该裂解物包含相对于所述裂解物的总重量以干物质(活性材料)的重量计0.1至10％，特别是0.5至5％，尤其是1至2％的鼠李糖乳杆菌含量。

可以将本发明的鼠李糖乳杆菌裂解物以相对于组合物的总重量以重量计至少0.0001％(以干重或活性材料的重量表示)的量，特别是0.0001至10％的量，更特别是0.0001至5％的量，特别是0.0001至2％的量，尤其是0.0001％至1％的量，或甚至是0.0001至0.05％的量配制在组合物中。

根据一个特别的实施方案，鼠李糖乳杆菌(CNCM I-5313)提取物以相对于所述组合物的总重量以活性材料的重量计0.0001至0.05％的含量存在。

根据本发明的鼠李糖乳杆菌裂解物可以单独使用，或与其他益生菌微生物、益生元成分、共生素成分或其混合物联合使用。

根据一个特别的实施方案，组合物还包含至少一种除维生素或含有它们的提取物以外的化妆品活性剂，所述化妆品活性剂特别地选自富含必需脂肪酸或其他物质的油、益生元提取物(其促进皮肤微生物群中某些有益细菌物种的生长，从而减少不期望的物种)、其他益生菌微生物菌株的其他提取物或甚至共生素成分(益生菌提取物+益生元提取物)、皮脂调节剂(促进生物群的生物多样性)和紧致剂(限制毛孔扩大)、舒缓剂、保护性活性成分(特别是皮肤的抗氧化和解毒防御的刺激剂(也称为抗氧化剂或简称抗氧剂))、脱色剂、去角质剂、抗老化活性成分、保湿成分、免疫调节活性成分及其混合物。

根据本发明的“组合物”是指化妆品或皮肤病学组合物。

根据一个特别的实施方案，其将为化妆品组合物。

根据另一个特别的实施方案，其将为皮肤病学组合物。

根据本发明的组合物可以例如用于面部和/或身体的护理和/或化妆产品。

根据本发明的组合物更特别地旨在用于局部应用至角质材料，特别是皮肤。

本发明的组合物包含生理学上可接受的介质，即与皮肤和外皮相容的介质。组合物可以具有所有化妆品形式，尤其为水包油或油包水乳剂或多重乳剂、微乳、溶液、混悬剂、洗剂、凝胶、霜剂、乳液、精华、喷雾(喷雾的流体溶液)、棒剂或甚至粉末的形式，并且适合应用至皮肤、嘴唇和/或外皮。

根据一个特别的实施方案，本发明的组合物旨在用于局部应用至皮肤和/或嘴唇，并且以用于皮肤和/或嘴唇的美容护理组合物和/或化妆组合物的形式存在。

本发明的化妆品组合物有利地为乳剂、精华或喷雾的形式。

组合物通常包含至少一个水相和至少一个油相。

水相通常以重量计占所述组合物总重量的1至99％。

根据本发明的油相可以包含氟化的或非氟化的烃油、硅酮油，及其混合物。这些油可以是挥发性的或非挥发性的，植物的、矿物的或合成的。

有利地，将使用烃油，尤其是植物来源的烃油。

挥发性烃油包括C8-C16支链烷烃、C8-C16支链酯及其混合物。

非挥发性烃油特别包括烃油、植物烃油、C10-C40合成醚、C10-C40合成酯、C12-C26脂肪醇、C12-C22高级脂肪酸及其混合物。

油可以以相对于组合物的总重量以重量计1至95％的含量存在于本发明的组合物中。

本发明的组合物还可以包含通常用于化妆品中的任何添加剂，如UV过滤剂、抗氧化剂、表面活性剂、胶凝剂、填充剂、染料(例如颜料)、防腐剂、成膜聚合物、香料、化妆品活性成分，例如润肤剂、保湿剂、维生素、抗老化剂、美白剂及其混合物。

美容方法及其他用途

本发明还涉及一种旨在预防和/或减少皮肤老化的标志和/或促进和/或改善屏障功能的非治疗性美容方法，其包括向角质材料应用至少一种鼠李糖乳杆菌(CNCM I-5313)提取物，特别是鼠李糖乳杆菌(CNCM I-5313)裂解物，其级分之一和/或其代谢物之一，或根据本发明的组合物，如前面所定义的组合物。

优选地，根据本发明的角质材料为健康的角质材料。

鼠李糖乳杆菌提取物通常以相对于组合物的总重量以干物质的重量计0.0001至10％，特别是0.0001至5％，优选0.0001至2％，尤其是0.0001％至1％，或甚至0.0001至0.05％的含量存在。

在美容方法中使用的组合物可以是护理和/或化妆组合物，特别是用于面部和/或身体的皮肤护理组合物。

特别地，所述方法旨在防止和/或减少皮肤紧致度和密度的损失，防止和/或减少皱纹和/或细纹和/或皮肤斑点的出现，改善皮肤光泽和/或均匀度，促进和/或改善皮肤水合作用，使皮肤解毒，促进和/或刺激其抗氧化防御和/或提高皮肤对缺氧的抵抗力，和/或控制皮肤微生物群，和/或刺激皮肤免疫力和皮肤屏障的形成。

“促进和/或刺激角质材料的抗氧化防御”尤其是指促进皮肤氧合作用，从而减少皮肤缺氧的影响，并在细胞水平上促进细胞呼吸和能量产生。

“促进和/或刺激皮肤免疫力”是指保持皮肤微生物群的平衡，并促进皮肤内稳态，从而使皮肤更健康，更好地免受外部因素的影响。

根据一个特别的实施方案，所述方法旨在防止和/或减少皮肤紧致度和密度的损失，防止和/或减少皱纹和/或细纹和/或皮肤斑点的出现，改善皮肤光泽和/或均匀度，促进和/或改善皮肤水合作用和/或提高皮肤对缺氧的抵抗力，和/或控制皮肤微生物群。

根据一个特别的实施方案，将本发明的组合物应用至老化、无光泽、疲倦的皮肤或受不利或不平衡饮食、情绪压力或睡眠不足影响的皮肤。

本发明还涉及鼠李糖乳杆菌(CNCM I-5313)提取物促进和/或改善其屏障功能和/或减少皮肤老化的标志，特别是防止和/或减少皮肤紧致度和密度的损失，防止和/或减少皱纹和/或细纹和/或皮肤斑点的出现，改善皮肤光泽和/或均匀度，促进和/或改善皮肤水合作用，使皮肤解毒，刺激其抗氧化防御和/或提高皮肤对缺氧的抵抗力，和/或控制皮肤微生物群，和/或刺激皮肤免疫力和皮肤屏障的形成的非治疗性美容用途。

根据一个特别的实施方案，根据本发明的提取物用于促进和/或改善屏障功能和/或减少皮肤老化的标志，特别是防止和/或减少皮肤紧致度和密度的损失，防止和/或减少皱纹和/或细纹和/或皮肤斑点的出现，改善皮肤光泽和/或均匀度，促进和/或改善皮肤水合作用，使皮肤解毒和/或提高皮肤对缺氧的抵抗力，和/或控制皮肤微生物群。

本发明还涉及促进和/或刺激皮肤免疫力的根据本发明的鼠李糖乳杆菌CNCM I-5313提取物。

现在将通过以下非限制性实施例阐明本发明。

除非另有说明，百分比表示为相对于组合物的总重量以重量计的百分比。

实施例

申请人已经评估了益生菌菌株鼠李糖乳杆菌(ATCC 7469、CCM 1825、NCDO 243、NCIB 6375或WDCM 00101，具体取决于其提交的保藏)的裂解物的作用。

特别地，所使用的益生菌菌株根据布达佩斯条约，在2018年4月11日，以BIOVITIS,Le Bourg,15400SAINT-ETIENNE-DE-CHOMEIL为名称，以CNCM I-5313为指定名称，向巴斯德研究所(28rue du Docteur Roux,F-75024Paris cedex 15)的国家微生物培养物保藏中心(CNCM)提交。

该鼠李糖乳杆菌菌株的裂解物根据以下方案从供应商Greentech获得：

1、在合适的培养介质中培养鼠李糖乳杆菌菌株；

2、通过离心回收生物质；

3、细胞裂解(加入氢氧化钠)；

4、调节pH(加入柠檬酸)和干物质(加入无菌水)，以获得相对于所述裂解物的总重量以干物质(活性物质)的重量计0.01至10％的活性物质含量；

5、任选地加入防腐剂(例如苯氧乙醇)。

这种鼠李糖乳杆菌裂解物被供应商Greentech称为Probiophyte LB，并由INCI名称水和发酵乳杆菌和苯氧乙醇和氢氧化钠和柠檬酸(WATER and LACTOBACILLUS FERMENTLYSATE and PHENOXYETHANOL and SODIUM HYDROXIDE and CITRIC ACID)所定义；苯氧乙醇可以用另一种防腐剂代替。

该裂解物包含相对于所述裂解物的总重量以干物质(活性材料)的重量计0.1至10％，特别是0.5至5％，尤其是1至2％，甚至1.75％的鼠李糖乳杆菌含量。

在对皮肤细胞培养物的测试中，测试了0.05、0.1和0.2％含量的这种裂解物(但不含苯氧乙醇防腐剂)，并且其以以原料的重量计1至2％的含量用于如下所示的局部应用的化妆品组合物中。

术语Probiophyte LB或鼠李糖乳杆菌裂解物在以下实施例中可互换使用。

实施例1：鼠李糖乳杆菌提取物对角质形成细胞培养物的作用

本文实施的测试能够比较两种益生菌菌株提取物，以选择刺激皮肤细胞的最有效的提取物。使用RT-qPCR方法，其能够观察关键皮肤护理过程(特别是表皮的主要细胞角质形成细胞)中涉及的基因的刺激或抑制，甚至刺激的缺失。

培养正常人角质形成细胞(NHK)，然后用上面描述的鼠李糖乳杆菌益生菌提取物或乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)提取物处理。

处理NHK后，对提取的总RNA逆转录后获得的cDNA研究的基因进行聚合酶链式反应(qPCR)研究。

所使用的细胞和培养条件：

细胞：第三代正常人角质形成细胞(NHEK)。

培养介质：角质形成细胞-SFM，补充有0.25ng/ml EGF、25μg/ml垂体提取物和25μg/ml庆大霉素，在37℃和5％CO2。

测试介质：角质形成细胞-SFM，补充有25μg/ml庆大霉素。

所测试的化合物：

-不含防腐剂的Probiophyte LB：根据本发明的鼠李糖乳杆菌CNCM I-5313提取物

-乳酸乳球菌提取物：由Greentech提供的乳酸乳球菌提取物(产品编号001119，批号LYCC1204E1-BY，2012年3月)，其包含乳酸乳球菌裂解物、柠檬酸和氢氧化钠。乳酸乳球菌的干物质(活性)含量为以原料的重量计5％至6％。

所测试的剂量：0.05、0.1和0.2％

处理时间：24小时

每个实验条件N＝3个培养物

进行的分析：

通过对来自未处理细胞层(对照)和用不同浓度益生菌提取物处理的细胞层的信使RNA提取物进行RT-qPCR来测量基因表达。评估了多个基因。基因和相应的结果列于下表中，在根据本发明的提取物(Probiophyte LB：鼠李糖乳杆菌提取物)和对比提取物(乳酸乳球菌提取物)之间观察到不同的结果。

RT-qPCR(RT-定量PCR)技术

·获得总RNA

根据供应商推荐的方案，使用TriPure Isolation

分离每个样品的总RNA。通过毛细管电泳(Bioanalyzer 2100，Agilent)评价RNA的数量和质量。

用DNA-free系统(Ambion)处理来消除污染物DNA的潜在痕迹。

·互补DNA的合成

在oligo(dT)和“Transcriptor First strand cDNA synthesis”酶(RocheDiagnostics)的存在下，通过总RNA的逆转录来合成互补DNA(cDNA)。通过分光光度法(Nanovue；GE Healthcare)对所得的cDNA进行定量，然后将cDNA的量调整为5ng/μl。

·定量PCR

通过定量PCR(Light Cycler；Roche Molecular Systems Inc.)并根据供应商推荐的程序进行PCR(聚合酶链式反应)。

每个样品的反应混合物(最终10μl)包含：

-2.5μl的cDNA(5ng/μl)，

-所使用的各种标记物的引物，

-含有taq DNA聚合酶、SYBR Green I标记物和MgCl2的反应介质。

数据处理和统计分析

通过Microsoft

传输和处理原始数据。

在PCR循环期间，连续测量荧光向扩增的DNA中的掺入。这些测量能够获得以PCR循环作为函数的荧光强度曲线，从而评估每个标记物的相对表达(ER)值。

由荧光曲线的“输出”点确定循环的次数。对于所分析的相同标记物，样本越晚(循环的次数越多)，mRNA拷贝的初始数量越低。

相对表达(ER)值根据以下公式以任意单位(UA)表示：

(1/2^{循环的次数})×10⁶

表1：

所研究的基因

表2：

结果显示了与乳酸乳球菌提取物相比根据本发明的Probiophyte LB对多种角质形成细胞基因的刺激作用。

上表显示了Probiophyte LB对多个重要皮肤过程的刺激作用：

-通过刺激转谷氨酰胺酶(TGM1)基因形成皮肤屏障，从而形成角化细胞的角化包膜，所述角化包膜确保皮肤表面的机械和化学耐受性和疏水性以及皮肤表面脂质的组织；

-通过刺激能够控制皮肤微生物群的发育的抗微生物肽的多个基因：DEFB4A、S100A7、PI3、RNASE7而先天免疫，和

-通过刺激7型胶原基因(COL7A1，一种用于真皮和表皮连接之间的粘附的胶原)加强真皮-表皮连接。这种胶原在衰老过程中减少。

实施例2：鼠李糖乳杆菌提取物对角质形成细胞、黑素细胞和成纤维细胞培养物的作用

第二个实验允许通过TLDA(TaqMan低密度阵列)方法深入研究Probiophyte LB对更大的基因库和皮肤的三种主要细胞类型(角质形成细胞、黑素细胞和成纤维细胞)的生物学作用。

所使用的细胞：

第五代正常人角质形成细胞(NHK)、第六代正常人成纤维细胞和第七代正常人黑素细胞(NHM)

所测试的化合物：

不含防腐剂的Probiophyte LB：鼠李糖乳杆菌CNCM I-5313提取物

所测试的剂量：0.1和0.2μg/ml

处理时间：24小时

每个实验条件N＝3个培养物

进行的分析：

通过对来自未处理细胞层(对照)和用不同浓度Probiophyte LB处理的细胞层的信使RNA提取物进行RT-qPCR来测量基因表达。

TLDA(TaqMan低密度阵列)技术

·获得总RNA

去除细胞培养介质，并加入250μL的RLT裂解缓冲液(在Nucleospin RNA trace试剂盒(Macherey-Nagel)中提供)。用细胞刮刀刮下细胞，然后将细胞裂解物回收在1.2mL深孔(在NucleoSpin RNA试剂盒中提供)中。根据所定义的方案提取总RNA。

使用配备有Microlab STAR的酶标仪spectrostarNANO(BMG Labtech)分析所得的总RNA溶液并验证其质量。该设备连接至控制机器人平台的计算机，并具有用于结果分析的特定软件(MARS)。该技术需要384孔微孔板(LoBase)和阳性对照(RNA 250、AM7155，ThermoFisher)以验证机器人完成的移液和spectrostarNANO酶标仪生成的值。

·互补DNA的合成

所使用的逆转录(RT)试剂盒为High Capacity Reverse Transcription Kit(ThermoFisher)。其是根据所提供的方案使用的。将500ng总RNA在水中稀释，最终体积为25μL。然后将其在25℃孵育10分钟，然后在37℃在如下所示提前制备的25μL High CapacityReverse Transcription Kit 2X反应混合物的存在下孵育2小时。在TRobot(Biométra)中完成不同的孵化。

表3：

试剂

RT缓冲液

dNTP

引物

RNase OUT

RT

H2O

体积

5μl

2μl

5μl

0.5μl

2.5μl

10μl

1次反应的High Capacity Reverse Transcription Kit 2X反应介质

·PCR-TaqMan低密度阵列

将15μL的各RT与60μl水混合，然后加入75μL含有DNA聚合酶的TaqMan GeneExpression master mix(ThermoFisher)。均质化后，将100μL沉积在含有与测试基因相对应的探针的微流体卡上；将它们离心，然后密封。将与沉积在板上的基因谱相对应的CD Rom加载到SDS 2.3软件中，指定每个基因在卡上的位置。在PCR开始前标明用于使结果归一化的对照基因(或“内源基因”)。这是根据Applied Biosystems在ABI Prism 7900HTSequence Detection System中提供的方案来完成的。qPCR步骤为在50℃持续2分钟，在94.5℃持续10分钟，在97℃持续30秒，在59.7℃持续1分钟，40次循环。

统计分析

如果效率在90％至110％之间，则可以使用实时定量PCR。对于每个样品，通过SDS2.3软件确定出现信号的循环次数。对于相同的测试，将所得的目标转录物的表达水平相对于从β-2-微球蛋白管家基因获得的值进行归一化。该基因的表达是组成型的且不变的，该基因能够克服实验期间(总RNA测定、移液、逆转录步骤、装置中的PCR)引起的任何变化。

在RT-PCR TLDA方法中，使用ΔΔCt比较方法进行定量。所得的相对量化(RQ)值对应于相对于我们的对照的表达幅度水平(比对照多或少x倍)，本文未显示。通过以下计算获得RQ，其中对照等于1：

RQ＝2^-ΔΔCt＝2^{-(ΔCt处理的-ΔCt未处理的)}

ΔCt处理的＝Ct处理的目标基因-Ct处理的管家基因

ΔCt未处理的＝Ct未处理的目标基因-Ct未处理的管家基因

为了评估转录活性的统计显著变化，我们将使用学生t检验。每个条件一式三份进行(3个未处理，3个在相同条件下处理)。首先，通过比较两个数据矩阵来应用费舍尔F检验。当值大于α＝0.05时，学生t检验的方差为2，当费舍尔F检验小于α＝0.05时，方差将等于3。所使用的转录变化将为对应于学生t检验小于α＝0.05的那些。

结果以n＝3的平均值表示。使用学生t检验以比较处理的细胞和未处理的细胞之间的效果。

对于p<0.05(*)或p<0.01(**)，结果被认为是显著的。

下面的结果表格显示了Probiophyte LB对与前述研究的那些互补的多种角质形成细胞(NHK)基因以及多种黑素细胞(NHM)和成纤维细胞(NHF)基因的作用。

小于1的值对应于对所述基因的表达的抑制作用，大于1的值对应于对所述基因的表达的刺激作用。

表4：

黑素细胞的基因表达的结果

表5：

角质形成细胞的基因表达的结果

表6

成纤维细胞的基因表达的结果

这些结果表明，与角质形成细胞(n＝2个基因受调节)和黑素细胞(n＝1个基因受调节)相比，真皮成纤维细胞对Probiophyte LB的基因调节更加敏感(n＝22个基因受调节)。因此，提取物在真皮细胞中具有非常显著的活性。

特别地对于真皮成纤维细胞，观察到本发明的鼠李糖乳杆菌裂解物对基因的活化，所述基因涉及：

-细胞-基质粘附和内聚，其使成纤维细胞致密并收缩基质，该过程对紧致度产生积极作用(ITGB1)；

-维持细胞结构(如细胞核)的完整性，从而提高皮肤细胞的抵抗力(SYNE2、LMNA)；

-形成多种胶原和弹性蛋白，其为真皮的主要组成，其刺激可对抗老化的作用(COL1A1、COL5A1、COL13A1、ELN)；

-真皮的水平衡，其涉及水运动(AQP1)或水储备，及透明质酸的形成(HAS2和3)、固定(CD44)和分泌(ABCC5)，所述透明质酸可以容纳其重量1000倍的水；

-真皮细胞再生(Ki67)

-细胞抗氧化防御(GPX1)和解毒剂(ABCC1＝MRP1)。该基因编码蛋白质，所述蛋白质能够将对细胞有毒的化合物从细胞中排出；

-细胞对缺氧条件的适应(HIF1a)，所述缺氧条件随着皮肤年龄而增长(参见缺氧标志物，如老化皮肤中的碳酸酐酶9)，其可以通过皮肤血管网络随着年龄的增长而减少来解释；

-葡萄糖进入细胞的能量和营养(SLC2A1)；

-线粒体中能量的产生(MT＝NADH脱氢酶或泛醌)；

-通过降解和回收受损的线粒体蛋白来解毒并保护线粒体(LONP1)。

对角质形成细胞观察到以下情况：

-先天免疫涉及的基因(TLR1)的活化，所述基因是细菌组成(如脂肽)的免疫监视受体

-胶原降解涉及的基因(MMP9)的抑制，该过程随着衰老而增加。

对黑素细胞观察到以下情况：

-这些细胞中的黑色素生成刺激因子(PPARG)的减少，其有助于脱色作用。

所有结果表明，应用至角质材料特别是皮肤的根据本发明的鼠李糖乳杆菌(CNCMI-5313)提取物能够防止和/或减少皮肤紧致度和密度的损失，防止和/或减少皱纹和/或细纹和/或皮肤斑点的出现，改善皮肤光泽和/或均匀度，促进和/或改善皮肤水合作用，使皮肤解毒，刺激其抗氧化防御和/或提高皮肤对缺氧的抵抗力，和/或控制皮肤微生物群，和/或刺激皮肤免疫力和皮肤屏障的形成。

实施例3：制剂

根据化妆品领域的常规制剂方法制备以下制剂。

抗老化再生精华(Sérum)

应用至皮肤后，组合物改善皮肤紧致度并减少皱纹。

净化面膜

应用至皮肤后，组合物降低皮脂水平，缩小毛孔并改善皮肤质地。

抗污染解毒乳液

应用至皮肤后，组合物赋予皮肤健康光泽和容光焕发的均匀肤色。

焕亮精华素(Essence)

应用至皮肤后，组合物改善肤色的均匀度。

光彩粉底

应用至皮肤后，组合物带来健康光泽和容光焕发的均匀肤色。

维生素精华(Serum)

应用至皮肤后，组合物改善皮肤紧致度并带来健康光泽。

喷雾

应用至皮肤后，组合物促进和/或改善皮肤的营养，并带来健康光泽和容光焕发的均匀肤色。

(原件电子版)

Claims

1.一种用于局部应用至角质材料，特别是皮肤和/或嘴唇的组合物，其在生理学上可接受的介质中包含至少一种鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus CNCM I-5313提取物，其级分之一和/或其代谢物之一和至少一种赋形剂，所述赋形剂选自水以外的溶剂、表面活性剂、胶凝剂、增稠剂、填充剂、染料、成膜聚合物、香料及其混合物，其特征在于其为鼠李糖乳杆菌CNCM I-5313裂解物，其级分之一和/或其代谢物之一。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于鼠李糖乳杆菌CNCM I-5313裂解物包含相对于其总重量以重量计0.1至10％，特别是0.5至5％，尤其是1至2％的活性干物质。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于鼠李糖乳杆菌CNCM I-5313提取物以相对于所述组合物的总重量以活性材料(干物质)的重量计0.0001至10％，尤其是0.0001至5％，特别是0.0001至2％，尤其是0.0001％至1％，或甚至0.0001至0.05％的含量存在。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其特征在于其还包含至少一种除维生素或含有它们的提取物以外的化妆品活性剂，所述化妆品活性剂特别地选自富含必需脂肪酸或其他物质的油、益生元提取物、其他益生菌微生物菌株的其他提取物或甚至共生素成分、皮脂调节剂和紧致剂、舒缓剂、抗氧化剂、脱色剂、去角质剂、抗老化活性成分、保湿成分、免疫调节活性成分及其混合物。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其特征在于其为水包油或油包水乳剂或多重乳剂、微乳、溶液、混悬剂、洗剂、凝胶、霜剂、乳液、精华、喷雾、棒剂或甚至粉末的形式。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其特征在于其为用于皮肤和/或嘴唇的护理和/或化妆产品。

7.一种旨在预防和/或减少皮肤老化的标志和/或促进和/或改善屏障功能的非治疗性美容方法，其包括向角质材料应用至少一种鼠李糖乳杆菌CNCM I-5313提取物，特别是鼠李糖乳杆菌CNCM I-5313裂解物，其级分之一和/或其代谢物之一，或组合物，如根据权利要求1至6中任一项所述的组合物。

8.根据权利要求7所述的美容方法，其特征在于其旨在防止和/或减少皮肤紧致度和/或密度的损失，防止和/或减少皱纹和/或细纹和/或皮肤斑点的出现，改善皮肤光泽和/或均匀度，促进和/或改善皮肤水合作用，使皮肤解毒和/或提高皮肤对缺氧的抵抗力，和/或控制皮肤微生物群。

9.根据权利要求7或8所述的美容方法，其特征在于将组合物应用至老化、无光泽、疲倦的皮肤或受不利或不平衡饮食、情绪压力或睡眠不足影响的皮肤。

10.鼠李糖乳杆菌CNCM I-5313提取物，特别是鼠李糖乳杆菌CNCM I-5313裂解物，其级分之一和/或其代谢物之一促进和/或改善屏障功能和/或减少皮肤老化的标志，特别是防止和/或减少皮肤紧致度和密度的损失，防止和/或减少皱纹和/或细纹和/或皮肤斑点的出现，改善皮肤光泽和/或均匀度，促进和/或改善皮肤水合作用，使皮肤解毒和/或提高皮肤对缺氧的抵抗力，和/或控制皮肤微生物群的非治疗性用途。