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KR20200089337A - 세포 면역요법을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

세포 면역요법을 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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KR20200089337A
KR20200089337A KR1020207020177A KR20207020177A KR20200089337A KR 20200089337 A KR20200089337 A KR 20200089337A KR 1020207020177 A KR1020207020177 A KR 1020207020177A KR 20207020177 A KR20207020177 A KR 20207020177A KR 20200089337 A KR20200089337 A KR 20200089337A
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KR
South Korea
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chimeric receptor
cell
tumor
ror1
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KR1020207020177A
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KR102264290B1 (ko
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마이클 젠슨
스탠니 알. 리들
미하엘 후덱크
Original Assignee
프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터
시애틀 칠드런즈 호스피탈 디/비/에이 시애틀 칠드런즈 리서치 인스티튜트
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Publication date
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Application filed by 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터, 시애틀 칠드런즈 호스피탈 디/비/에이 시애틀 칠드런즈 리서치 인스티튜트 filed Critical 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터
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Abstract

본 발명은 CD8+ 중추 기억 T 세포 또는 키메릭 리셉터를 발현하기 위해 유전적으로 변성된 CD4+ T 세포와 중추 기억 T 세포의 조합을 양자 전달하는 등으로 세포 면역요법으로 매개된 면역 반응을 제공 및/또는 증가하는 핵산, 벡터, 숙주 세포, 방법 및 조성물을 제공한다. 구체예에서, 유전적으로 변성된 숙주 세포는 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 사용자 지정 스페이서 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 막통관 도메인을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 포함한다. 놀라웁게도, 스페이서 영역의 길이가 시험관 내에서 표적 세포를 인식하고 키메릭 리셉터 변성 T 세포의 생체내 효능에 영향을 미치는 키메릭 리셉터 변성 T 세포의 능력에 영향을 줄 수 있는 것을 발견하였다. 본 방법으로 제조된 약학 제제 및 그의 사용방법 또한 기술하였다.

Description

세포 면역요법을 위한 방법 및 조성물{METHOD AND COMPOSITIONS FOR CELLULAR IMMUNOTHERAPY}
본 원은 2013년 8월 20일자로 PCT 국제특허출원되었고, 2012년 8월 20일자로 출원된 미국 특허출원 제61/691,117호를 우선권으로 주장하며, 그 내용은 본 원에서 전부 참고로 인용되었다.
본 발명의 분야
본 발명은 생체의약품(biomedicine) 및 구체적으로는 암 치료에 유용한 방법의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 구체예는 종양 표적 리셉터(receptor)로 변성된 T 세포를 포함하는 세포 면역요법을 수행하는 방법 및 이를 위한 조성물에 관한 것이다.
연방 후원 연구에 관한 진술
본 발명은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)이 수여한 승인 CA136551 및 CA114536 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에서 특정한 권리를 갖는다.
종양세포 상에서 발현된 표면 분자에 특이적인 키메릭 항원 리셉터(키메릭 리셉터)를 발현하기 위해 유전자 전달로 조작된 사람 T 림프구의 입양 전달(양자 transfer)은 진행된 악성종양을 효과적으로 치료하는 잠재력을 갖는다. 키메릭 리셉터는 세포외 리간드 결합 도메인, 가장 통상적으로 세포외 시그널링 성분에 결합된 모노클로날 항체(scFv)의 단일사슬 가변 단편, 가장 통상적으로 CD3ζ 단독 또는 하나 이상의 공동자극 도메인과 조합된 CD3ζ를 포함하는 합성 리셉터이다. 키메릭 리셉터의 디자인에서 대부분의 연구는 scFv와, 필수적인 정상 조직에 심각한 독성을 유발하지 않고 악성 세포를 표적으로 하는 다른 리간드 결합요소를 정의하고 T 세포 이팩터(effector) 작용을 활성화하는 세포내 시그널링 모듈의 최적 조성물을 정의하는데 집중하고 있다. 그러나, 우수한 시험관내 작용을 매개하는 키메릭 리셉터 디자인의 변형이 키메릭 리셉터 변성 T 세포의 임상적 적용에서 개선된 생체내 치료 활성으로 재현가능하게 번역될지 여부는 불확실하다.
치료 활성에 중요한 키메릭 리셉터 디자인의 요소와 증강된 생존과 생체 내 효능을 제공하는 유전적으로 변성하고 입양 전달하기 위한 세포군을 결정하는 방법을 찾는 것이 필요하다.
발명의 요약
일 측면에서, 본 발명은 세포 면역요법, 예컨대 CD8+ 또는 CD4+ T 세포 단독 또는 조합의 종양 특이적인, 유전적으로 변성된 서브세트를 입양전달하여 매개된 면역반응을 제공하거나/하고 증가하는 방법과 조성물에 관한 것이다. 본 원은 키메릭 리셉터 핵산, 및 이 핵산을 포함하는 벡터와 숙주세포를 제공한다. 키메릭 리셉터를 코딩하는 핵산 서열은 특이적 표적 분자 또는 표적 분자 상의 에피토프의 효율적인 T 세포 활성화 및 인지를 위한 키메릭 리셉터를 지정하기 위해 다른 성분으로 삭제 및 대체될 수 있는 수많은 모듈 성분들과 결합한다.
구체예에서, 키메릭 리셉터 핵산은 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(여기서 리간드는 악성 또는 감염 세포에서 발현된 분자이다), 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(여기서 폴리펩티드 스페이서는 약 200 이하의 아미노산이다); 막관통 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 세포내 시그널링 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 스페이서는 다른 아미노산 서열, 예를 들어 비제한적으로 Ig Fc의 CH2 및 CH3 또는 단지 CH3 서열에 결합할 수 있는 아미노산 서열 X1PPX2P를 함유하는 변성된 IgG4 힌지영역을 포함한다. 놀라웁게도, 시그널링 능력을 갖지 않는 것으로 추정되는 스페이서 영역의 길이가 키메릭 리셉터를 발현하기 위해 변성된 T 세포의 생체 내 효능에 영향을 미치고 최적 종양 또는 표적 세포 인지를 위한 개별 표적 분자에 맞추어져야 하는 것을 발견하였다.
본 원의 다른 측면은, 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (여기서 리간드는 종양 특이적 항원, 바이러스 항원 또는 림프구에 의한 인지 및 제거를 매개하는데 적합한 표적 세포군에서 발현된 다른 분자이다); 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(여기서 폴리펩티드 스페이서는 각각의 표적 리간드에 특이적인 지정된 길이를 갖고, 스페이서는 참조 키메릭 리셉터와 비교하여 증강된 T 세포 증식 및/또는 사이토킨 생산을 제공한다); 막통관 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 하나 이상의 세포내 시그널링 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 키메릭 리셉터 핵산을 제공한다. 일 구체예에서, 표적 리간드 상의 에피토프가 막 근접 위치에 있으면 긴 스페이서가 사용되고, 표적 리간드 상의 에피토프가 막 원거리(distal) 위치에 있으면 짧은 스페이서가 사용된다. 본 발명은 본 원에서 기술된 단리된 키메릭 리셉터를 포함하는 발현벡터 및 숙주세포를 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 리간드 결합 도메인(여기서 리간드는 종양 특이적 항원, 바이러스 항원 또는 표적 세포군에서 발현되며 림프구에 의한 인지 및 제거를 매개하도록 표적화될 수 있는 다른 분자이다); 폴리펩티드 스페이서(여기서 폴리펩티드 스페이서는 약 10-229 아미노산이다); 막통관 도메인; 및 하나 이상의 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 키메릭 리셉터 폴리펩티드를 제공한다. 구체예에서, 폴리펩티드 스페이서는 아미노산 서열 X1PPX2P를 함유하는 변성 IgG 힌지영역을 포함한다.
다른 측면에서, 본 원은 세포 면역요법, 예컨대 종양 특이적, 서브세트 특이적인 유전적으로 변성된 CD4+ T 세포를 양자 전달하여 매개된 면역반응을 제공하거나/하고 증가하는 조성물을 제공한다(여기서 CD4+ T 세포는 항종양 반응성을 유지하고 종양 특이적 증식을 증가하거나/하고 최대화하는 CD8+ T 세포의 능력을 제공하거나/하고 증가한다). 구체예에서, CD4+ 세포는 유전적으로 변성되어 본 원에서 기술된 바와 같이 키메릭 리셉터 핵산 및/또는 키메릭 리셉터 폴리펩티드를 발현한다.
다른 측면에서, 본 원은 세포 면역요법, 예컨대 종양 특이적, 서브세트 특이적인 유전적으로 변성된 CD8+ T 세포를 양자 전달하여 매개된 면역반응을 제공하거나/하고 증가하는 조성물을 제공한다. 구체예에서, CD8+ 세포는 본 원에 기술된 키메릭 리셉터 핵산 및/또는 키메릭 리셉터 폴리펩티드를 발현한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 면역반응을 제공하거나/하고 증가하는 유전적으로 변성된 CD8+ 세포독성 T 림프구 세포 조제물(여기서 세포독성 T 림프구 세포 조제물은 질환 또는 장애와 연관된 리간드에 대한 리간드 결합 도메인, 사용자 정의 스페이서 영역, 막통관 도메인; 및 T 세포 또는 다른 리셉터의 세포내 시그널링 도메인, 예컨대 공동자극 도메인을 포함하는 키메릭 리셉터를 발현하는 CD8+ T 세포를 발현한다), 및/또는 유전적으로 변성된 헬퍼 T 림프구 세포 조제물(여기서 헬퍼 T 림프구 세포 조제물은 질환 또는 장애와 연관된 리간드에 특이적인 항체 가변 도메인, 사용자 정의 스페이서 영역, 막통관 도메인; 및 하나 이상의 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 키메릭 리셉터를 발현하는 CD4+ T 세포를 갖는다)을 갖는 양자 세포 면역요법 조성물을 제공한다.
일 구체예에서, 본 발명은 대상에게 세포 면역반응을 제공하는 유전적으로 변성된 세포독성 T 림프구 세포 조제물을 투여하여 질환 또는 장애가 있는 대상에서 세포 면역요법을 수행하는 방법을 제공하며, 여기서 세포독성 T 림프구 세포 조제물은 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(여기서 리간드는 종양 특이적 항원, 바이러스 항원 또는 표적 세포군에서 발현되며 림프구에 의한 인지 및 제거를 매개하도록 표적화될 수 있는 다른 분자이다); 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(여기서 폴리펩티드 스페이서는 각각의 표적 리간드에 특이적인 사용자 지정된 길이를 갖고, 스페이서는 참조 키메릭 리셉터와 비교하여 증강된 T 세포 증식 및/또는 사이토킨 제조를 제공한다); 막통관 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 하나 이상의 세포내 시그널링 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메릭 리셉터를 갖는 CD8+ T 세포를 포함한다. 구체예에서, 리간드 결합 도메인은 질환 또는 장애와 연관된 리간드에 특이적인 세포외 항체 가변 도메인이다. 구체예는 유전적으로 변성된 헬퍼 T 림프구 세포 조제물을 포함하고, 여기서 헬퍼 T 림프구 세포 조제물은 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(여기서 리간드는 종양 특이적 항원, 바이러스 항원 또는 표적 세포군에서 발현되며 림프구에 의한 인지 및 제거를 매개하도록 표적화될 수 있는 다른 분자이다); 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(여기서 폴리펩티드 스페이서는 각각의 표적 리간드에 특이적인 사용자 지정된 길이를 갖고, 스페이서는 참조 키메릭 리셉터와 비교하여 증강된 T 세포 증식 및/또는 사이토킨 제조를 제공한다); 막통관 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 하나 이상의 세포내 시그널링 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메릭 리셉터를 갖는 CD4+ T 세포를 포함한다. 구체예에서, 유전적으로 변성된 CD8+ 및 유전적으로 변성된 CD4+ 세포군은 동시투여된다. 구체예에서, T 세포는 자가 또는 동종이계(allogeneic) T 세포이다.
상기한 방법의 다양한 변형이 가능하다. 예를 들어, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포로 발현된 키메릭 리셉터는 같거나 다를 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 세포 면역반응을 유도하고 항원 반응성 키메릭 리셉터를 발현하는 키메릭 리셉터 변성 종양 특이적 CD8+ 세포독성 T 림프구 세포 조제물을 얻거나/얻고[여기서 변성된 세포독성 T 림프구 세포 조제물은 리간드 결합 도메인(여기서 리간드는 종양 특이적 항원, 바이러스 항원 또는 림프구에 의한 인지 및 제거를 매개하는데 적합한 표적 세포군에서 발현된 다른 분자이다); 폴리펩티드 스페이서(여기서 폴리펩티드 스페이서는 각각의 표적 리간드에 특이적인 사용자 지정된 길이를 갖고, 스페이서는 참조 키메릭 리셉터와 비교하여 증강된 T 세포 증식 및/또는 사이토킨 제조를 제공한다); 막통관 도메인; 및 하나 이상의 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 키메릭 리셉터를 갖는 CD8+ T 세포를 포함한다]; 변성된 순수(naive) 또는 기억 CD4+ T 헬퍼 세포[여기서 변성된 헬퍼 T 림프구 세포 조제물은 리간드 결합 도메인(여기서 리간드는 종양 특이적 항원, 바이러스 항원 또는 림프구에 의한 인지 및 제거를 매개하는데 적합한 표적 세포군에서 발현된 다른 분자이다); 폴리펩티드 스페이서(여기서 폴리펩티드 스페이서는 각각의 표적 리간드에 특이적인 사용자 지정된 길이를 갖고, 스페이서는 참조 키메릭 리셉터와 비교하여 증강된 T 세포 증식 및/또는 사이토킨 제조를 제공한다); 막통관 도메인; 및 하나 이상의 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 키메릭 리셉터를 갖는 CD4+ T 세포를 포함한다]을 얻어서 양자 면역요법 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 이러한 구체예와 다른 구체예를 첨부한 명세서, 도면 및 특허청구범위에서 상세히 설명하였다.
도 1: 스페이서 서열 라이브러리. IgG4 힌지 단독, CH2 및 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지, 또는 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지를 포함하는 세포외 성분들을 코딩하는 코돈 최적화된 DNA 서열을 함유하는 플라스미드 라이브러리를 제조하였다. scFV 서열(VH 및 VL)은 이러한 다양한 스페이서 도메인 라이브러리를 코딩하는 서열에 대해 5' 클론할 수 있다. 스페이서 도메인은 결국 CD28 막통관 및 세포내 시그널링 도메인과 CD3 제타에 결합한다. 벡터 내의 T2A 서열은 둔단된(truncated) 인간 상피성장인자 리셉터(tEGFR)를 코딩하는 선택성 마커로부터 키메릭 리셉터를 분리한다.
도 2: 변성된 스페이서 길이를 갖는 2A2 ROR1 키메릭 리셉터를 발현하기 위해 변성된 T 세포의 시험관내 세포독성, 사이토킨 제조 및 증식. (A) 긴 스페이서 도메인, 중간 스페이서 도메인 및 짧은 스페이서 도메인을 갖는 2A2 ROR1 키메릭 리셉터 각각으로 변성된 정제된 CD8+ TCM~유도성 세포주의 표현형. 2A2 scFV의 에피토프에 결합한 항-F(ab) 항체로 염색하여 전체 길이 또는 둔단된 스페이서를 갖는 ROR1 키메릭 리셉터의 표면 발현을 표시하였다. (B) 긴 스페이서(●), 중간 스페이서(▲) 및 짧은 스페이서(◆)를 갖는 다양한 2A2 ROR1 키메릭 리셉터, 또는 ROR1+(x) 및 대조 표적 세포에 대한 tEGFR 대조 렌티바이러스 벡터를 발현하는 T 세포의 세포용해활성. 막대 다이아그램은 2A2 ROR1 키메릭 리셉터 'long' = 1에 의한 세포용해활성에 대해 정규화되고 Student's t-test로 분석된 3개의 개별실험(E:T = 30:1)의 세포독성 데이터를 요약한 것이다. (C) CFSE 염료 희석을 사용하여 2A2 ROR1 키메릭 리셉터와 tEGFR 대조 T 세포의 증식을 외인성 사이토킨의 추가 없이 Raji/ROR1(왼쪽 패널) 및 프라이머리 CLL 세포(오른쪽 패널)로 자극한 72시간 후에 측정하였다. 분석 동안, 3번 웰을 모으고 살아있는(PI-), CDS+ T 세포의 증식을 분석하였다. 각 히스토그램 위의 숫자는 증식하는 서브세트가 수행한 세포분열의 수를 나타내고, ≥4/3/2/1 세포분열을 수행한 각 게이트에서 T 세포 분획은 각 플로트 다음에 제공하였다. (D) Raji/ROR1 및 프라이머리 CLL 세포를 갖는 다양한 2A2 ROR1 키메릭 리셉터를 발현하는 5x104 T 세포의 3중 동시배양 24시간 후에 얻어진 상징액의 멀티플렉스(Multiplex) 사이토킨 어세이. 3개 개별 실험의 멀티플렉스 사이토킨 데이터를 정규화(2A2 ROR1 키메릭 리셉터 'long' = 1에 의한 사이토킨 방출)하고 Student's t-test로 분석하였다(오른쪽 막대 다이아그램).
도 3: R11 키메릭 리셉터는 ROR1+ 종양 세포 인지에 긴 스페이서를 필요로 한다. 오펀(orphan) 티로신 키나제 리셉터 ROR1의 막 근접 Kringle 도메인 내 에피토프에 특이적인 R11 모노클로날 항체 유래의 scFV를 코딩하는 서열을 4-1BB 공동자극 도메인을 함유하는 본 원의 키메릭 리셉터 라이브러리 내의 (짧은)IgG4 힌지 단독, IgG4 힌지/CH3 (중간), 및 IgG4 힌지/CH2/CH3 서열의 상부에 클론하여 렌티바이러스 벡터로 제조하였다. A) 인간 CD8+ T 세포를 형질도입하였고, 짧은 길이, 중간 길이 및 긴 길이의 키메릭 리셉터 각각을 사용한 형질도입 효능을 tEGFR 마커에 대한 염색으로 측정하였다. B) 짧은 길이(상부), 중간 길이(중앙) 및 긴 길이(하부)를 발현하는 형질도입된 T 세포를 K562 백혈병 세포만의 용균에 대해 어세이하거나 형질감염하여 ROR1을 발현하였다. 긴 스페이서 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포만이 ROR1+ K562 세포를 효과적으로 사멸하였다. C) 짧은 것(상부), 중간 것(중앙), 및 긴 것(하부)을 발현하는 형질도입된 T 세포를 CFSE로 표지하고, ROR1 또는 CD19 (대조용)를 발현하는 K562 세포로 자극하여 72시간 동안 세포 증식을 어세이하였다. 긴 스페이서 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포가 ROR1 + K562 세포에 특이적으로 증식하였다. D) 짧은 것(상부), 중간 것(중앙), 및 긴 것(하부)을 발현하는 형질도입된 T 세포를 Raji 림프종 세포 및 ROR1 또는 CD19 (대조용)를 발현하는 K562 세포로 자극하여 24시간 동안 인터페론 감마의 상징액 내로의 분비를 어세이하였다. 긴 스페이서 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포가 증식하였고 ROR1 양성 표적 세포에 대한 반응에서 고농도의 인터페론 감마를 생산하였다.
도 4: 상이한 친화도를 갖는 2A2 및 R12 scFV에서 유도되고 변성된 스페이서 길이를 갖는 ROR1 키메릭 리셉터의 디자인. (A) 2A2 scFV, 즉 '힌지-CH2-CH3'(긴 스페이서, 229 AA), '힌지-CT13'(중간, 119 AA), 또는 '힌지' 단독(짧은 스페이서, 12 AA)의 IgG4-Fc 유도성 스페이서, 및 CD3ζ 및 CD28을 갖는 시그널링 모듈을 함유하는 ROR1 키메릭 리셉터의 패널을 코딩하는 렌티바이러스 전이유전자 삽입물의 설계. 각각의 키메릭 리셉터 카세트는 T2A 요소의 하부에 코딩된 둔단된 EGFR 마커를 함유한다. (B) 각각 짧은 IgG4-Fc '힌지' 스페이서(12 AA)를 갖는 R12 및 2A2 scFV로부터 유도된 ROR1-특이적 키메릭 리셉터를 코딩하는 렌티바이러스 전이유전자 삽입물과, CD28 또는 4-1BB 및 CD3ζ를 함유하는 시그널링 모듈(총 4개 구조물).
도 5: 2A2보다 높은 친화도를 갖는 mAb R12에서 유도된 ROR1 키메릭 리셉터로 변성된 T 세포의 항종양 반응성. (A) 짧은 IgG4-Fc '힌지' 스페이서를 갖는 R12 및 2A2 ROR1 키메릭 리셉터, 및 CD28 또는 4-1BB 공동자극 도메인 각각으로 변성된 정제된 폴리클로날 CD8+ TCM-유도성 T 세포주에서 tEGFR 발현. (B) R12(28-▲; 4-1BB-Δ) 및 2A2 ROR1 키메릭 리셉터 (28-●; 4-1BBo) 또는 tEGFR 대조 벡터(x)를 발현하는 T 세포에 의한 대조용 표적 세포 및 ROR1+에 대한 세포독성. (C) Raji/ROR1 종양 세포를 갖는 다양한 ROR1 키메릭 리셉터를 발현하는 5x104 T 세포의 동시배양 24시간 후에 얻어진 상징액의 멀티플렉스 사이토킨 어세이. 중앙/오른쪽 막대 다이아그램은 Student's t-test로 분석된, 3개의 개별 실험으로부터의 정규화된 멀티플렉스 데이터를 나타낸다(ROR1 키메릭 리셉터 2A2 = 1에 의한 사이토킨 방출). (D) Raji/ROR1 세포로 자극한 72시간 후에 외인성 사이토킨의 첨가 없이 ROR1 키메릭 리셉터와 tEGFR 대조 T 세포의 증식을 CFSE 염료 희석으로 평가하였다. 각 히스토그램 위의 숫자는 증식하는 서브세트가 수행한 세포분열의 수를 나타내고, ≥4/3/2/1 세포분열을 수행한 각 게이트에서 T 세포 분획은 각 플로트 위에 제공하였다.
도 6: 2A2보다 더 높은 친화도를 갖는 mAb R12로부터 유도된 ROR1 키메릭 리셉터로 변성된 CD4 + T 세포주의 사이토킨 제조 및 증식의 분석. (A-B) 2A2 및 R12 ROR1 키메릭 리셉터는 짧은 스페이서와 CD28 공동자극 도메인을 갖는다. (A) Raji/ROR1 종양 세포를 갖는 2A2 및 R12 ROR1 키메릭 리셉터를 발현하는 5x104 CD4+ T 세포의 자극 24시간 후에 얻어진 상징액의 멀티플렉스 사이토킨 분석. (B) Raji/ROR1 세포로 자극한 72시간 후에 외인성 사이토킨의 첨가 없이 CD4+ R12 및 2A2 ROR1 키메릭 리셉터 T 세포 및 tEGFR 대조 T 세포의 증식을 CFSE 염료 희석으로 평가하였다. 각 히스토그램 위의 숫자는 증식하는 서브세트가 수행한 세포분열의 수를 나타내고, ≥5/4/3/2/1 세포분열을 수행한 각 게이트에서 T 세포 분획은 각 히스토그램 위에 제공하였다.
도 7: 최적의 짧은 스페이서 및 4-1BB 공동자극 도메인을 갖는 2A2 및 R12 ROR1 키메릭 리셉터, 또는 CD19-특이적 키메릭 리셉터로 변성된 T 세포에 의한 프라이머리 CLL의 인지. (A) 프라이머리 CLL 상에서 ROR1/CD19, 및 키메릭 리셉터 T 세포(흰색 히스토그램)에서 CD28을 결합할 수 있는 프라이머리 CLL 및 Raji ROR1 종양 세포(검은점 플로트) 상에서 CD80/86의 발현. (B) 2A2(●) 및 R12 ROR1 키메릭 리셉터 (■)를 발현하는 T 세포, CD19-특이적 키메릭 리셉터(▲) 및 프라이머리 CLL(왼쪽 다이아그램) 및 정상 B 세포(오른쪽 다이아그램)에 대한 tEGFR 대조용 벡터 (x)의 크롬 방출 어세이로 분석된 세포용해 활성. 4개의 별도 실험으로부터 프라이머리 CLL에 대한 세포독성 데이터(E:T = 30:1)를 정규화하고(ROR1 키메릭 리셉터 2A2 = 1에 의한 세포용해 활성) Student's t-test로 분석하였다(막대 다이아그램). (C) 프라이머리 CLL 세포를 갖는 5x104 키메릭 리셉터 T 세포의 자극 24시간 후의 멀티플렉스 사이토킨 분석. 자극되지 않은 키메릭 리셉터 T 세포의 사이토킨 방출은 3.6 pg/ml(검출 한계) 미만이었다(왼쪽 막대 다이아그램). 프라이머리 CLL과의 24시간 동시배양한 후 5x104 2A2 및 R12 ROR1 키메릭 리셉터 T 세포에 의한 IFN-γ 제조의 ELISA. O.D. 1은 약 250 pg/ml에 해당한다(오른쪽 막대 다이아그램). (D) 프라이머리 CLL 세포로 자극한 72시간 후에 2A2 ROR1, R12 ROR1 및 CD19 키메릭 리셉터로 변성된 CD8+ T 세포의 증식. 각 히스토그램 위의 숫자는 세포분열의 수를 나타내고, ≥3/2/1 세포분열을 수행한 각 게이트에서 T 세포 분획은 각 플로트 다음에 제공하였다.
도 8: 프라이머리 CLL에 대한 ROR1-키메릭 리셉터와 CD19-키메릭 리셉터 변성 CD8 + T 세포의 작용을 키메릭 리셉터-변성 CD4 + 헬퍼 T 세포로 증가시켰다. (A) 프라이머리 CLL과 24시간 동안 인큐베이션된, R12 ROR1 및 CD19-키메릭 리셉터 각각을 발현하는 5xl04 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 3번 동시배양에서 IL-2 제조에 대한 ELISA. O.D. 1은 대략 800 pg/ml에 해당한다. (B) 프라이머리 CLL에 대한 반응에서 키메릭 리셉터-변성 CD8+ T 세포의 증식을 키메릭 리셉터-변성 CD4+ T 세포의 첨가로 증강하였다. 2A2 ROR1, R12 ROR1 및 CD19-키메릭 리셉터 각각을 발현하는 CFSE-표지된 CD8+ T 세포를 종양 세포 및 2A2 ROR1, R12 ROR1 및 형질도입된 CD19-키메릭 리셉터 또는 대조용의 형질도입되지 않은 CD4+ T 세포와 동시배양하였다(CD8+:CD4+=1:1). CD8+ 서브세트의 증식은 자극한 72시간 후에 분석하였다. 각 히스토그램 위의 숫자는 세포분열의 수를 나타내고, ≥3/2/1 세포분열을 수행한 각 게이트에서 T 세포 분획은 각 플로트 위에 제공하였다.
도 9: 2A2 ROR1, R12 ROR1 및 CD19 키메릭 리셉터 T 세포의 생체내 항종양 효능. 마우스 무리를 꼬리정맥 주사를 통해 0.5x106 JeKo-1/ffluc MCL을 접종하고, 5x106 2A2 ROR1, R12 ROR1 또는 CD19 키메릭 리셉터 T 세포, 또는 tEGFR 대조용 벡터를 발현하는 T 세포를 종양 접종 7일 후에 투여하였다. 키메릭 리셉터 구조물은 모두 짧은 IgG4 '힌지-단독'의 스페이서와 4-1BB 공동자극 도메인을 가졌다. (A, B) 2A2 ROR1 키메릭 리셉터 (▼), 고친화도 R12 ROR1 키메릭 리셉터 (■), CD19-특이적 키메릭 리셉터 (▲)를 발현하는 T 세포, tEGFR만(●)으로 형질도입된 T 세포로 처리된 마우스와 미처리 마우스 무리에서 종양의 연속적 생체발광 이미징. 생체발광 이미지는 골수와 흉곽에서 종양 징후를 나타내었고, 따라서 시그널 강도를 개별 마우스 각각의 전신과 흉곽을 포함한 목적하는 영역에서 측정하였다. (C) 개별 처리군과 대조군에서 생존에 대한 Kaplan-Meier 분석. 통계적 분석은 로그순위시험을 사용하여 수행하였다. A-C에 나타낸 데이터는 2개의 개별 실험에서 얻어진 대표적인 결과이다. (D) 생체 내에서 2A2 ROR1, R12 ROR1 및 CD19 키메릭 리셉터 T 세포의 증식. 종양이 있는 NSG/JeKo-1 마우스에게 5xl06 CFSE-표지된 2A2 ROR1, R12 ROR1 또는 CD19 키메릭 리셉터 T 세포를 종양을 접종한 후 7일째에 단일 투여하였고, 72 h 후에 말초혈액, 골수 및 비장을 각 개별 마우스로부터 수집하였다. 살아있는(PI-), CD45+ CD8+ tEGFR4+ T 세포의 빈도 및 증식을 분석하였다. 2A2 ROR1, R12 ROR1 및 CD19 키메릭 리셉터 T 세포 각각의 빈도를 살아있는 세포의 백분율로 각 히스토그램의 왼쪽에 제공하였고, ≥4/3/2/1 세포분열을 수행한 T 세포 분획은 각 플로트 위에 제공하였다.
도 10: 상피암 세포주에서 ROR1 및 NKG2D 리간드의 발현. (A) 삼중음성유방암 세포주 MDA-MB-231 및 468, 및 신장세포암계 FARP, TREP 및 RWL에서 ROR1의 발현(검은색 히스토그램). 부합되는 이소형(isotype) 대조 항체로의 염색은 회색 히스토그램으로 나타내었다. (B) MDA-MB-231 및 Raji/ROR1 종양 세포에서 CD80/86과 NKG2D 리간드 MICA/B, 및 2A2 및 R12 ROR1-키메릭 리셉터 T 세포에서 NKG2D (CD314)의 발현. 부합되는 이소형 대조 mAb로의 염색은 회색 점도표 히스토그램으로 나타내었다.
도 11: ROR1-키메릭 리셉터 변성 T 세포는 시험관 내에서 ROR1 + 상피 종양 세포를 인지한다. (A) ROR1+ 유방암 및 신장세포암 계통에 대한 R12 ROR1-키메릭 리셉터 변성 T 세포(짧은 스페이서/4-1BB 공동자극 도메인, 닫힌 기호)와 tEGFR 대조용 T 세포(열린 기호)의 세포용해 활성을 평가하기 위한 크롬 방출 어세이. (A-D) 2A2 및 R12 ROR1-키메릭 리셉터는 짧은 최적 스페이서와 4-1BB 공동자극 도메인을 갖는다. (B) 2A2 및 R12 ROR1-키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포의 MDA-MB-231과 Raji/ROR1 종양 세포로의 자극 후 멀티플렉스 사이토킨 분석. (C) MDA-MB-231 종양 세포로 자극한 72시간 후에 2A2 및 R12 ROR1-키메릭 리셉터로 변성된 CDS+ T 세포의 증식. 분석 동안, 3번 웰을 모으고 살아있는(PI-), CDS+ T 세포의 증식을 분석하였다. 각 히스토그램 위의 숫자는 증식하는 서브세트가 수행한 세포분열의 수를 나타내고, ≥4/3/2/1 세포분열을 수행한 각 게이트에서 T 세포 분획은 각 히스토그램 다음에 제공하였다. (D) 플레인 배지에서 MDA-MB-231과 24시간 동시배양하고, NKG2D 경로 [항-NKG2D (클론 1D11), 항-MICA/B (클론 6D4) 및 항-ULBP] 또는 부합된 이소형 대조용 mAb의 항체 칵테일 블로킹 첨가 후 R12 ROR1-키메릭 리셉터 T 세포에 의한 IL-2 생산에 대한 ELISA. O.D. 0.6은 대략 1900 pg/ml에 해당한다.
도 12: HER2-특이적 키메릭 리셉터를 발현하는 CD8+ 인간 T 세포에 의한 종양 세포 용균의 인지 및 촉발에 대한 세포외 스페이서 길이의 효과. A) 인간 HER2 상의 종양 세포 막 근접 에피토프에서 Herceptin Fab 에피토프 위치의 표시. B) 카복실 EGFRt 마커 막통관 단백질을 갖는 T2A 결합 폴리펩티드로서 Herceptin scFv CAR 스페이서 길이 변이체의 구조적 포맷. C) 인간 CD8+ CTL에서 단 길이, 중간 길이 및 장 길이 스페이서 Herceptin-CAR 변이체 발현의 웨스턴 블롯 검출. D) Herceptin CAR 변이체로 형질도입된 다음, Herceptin-비오틴, 항-비오틴 미소구(microbead)로 면역자성학적으로 정제된 형질도입 인간 CD8+ CTL에 의한 EGFRt의 유동세포계수적 검출. E) HER2+ Med411FH 및 D283 인간 메듈로블라스토마(medulloblastoma) 세포주에 대한 Herceptin CAR 변이체 (단 길이 - S; 중간 길이 - M; 및 장 길이 - L)를 발현하기 위해 형질도입된 T 세포에 의한 분명한 세포용해 작용(D341은 HER2- 대조용 메듈로블라스토마 세포주이고, 삽입한 유동 플롯은 항-HER2 특이적 mAb로 염색된 종양 표적 라인이다). 녹색=전장 IgG4 (긴 스페이서, ▼), 청색=IgG4힌지:CH3(중간 스페이서; ▲), 적색=IgG4힌지 (짧은 스페이서;■).
도 13: CD19-키메릭 리셉터 벡터와 CD19-키메릭 리셉터 T 세포의 생성. (A) 세포외 스페이서 길이와 세포내 공동자극에서 차이가 있는 CD19-특이적 키메릭 리셉터의 패널을 코딩하는 렌티바이러스 전이유전자 삽입물의 설계. 각각의 키메릭 리셉터는 VL-VH 배향 내의 FMC63 mAb로부터 유도된 CD19-특이적 단일사슬 가변 단편, Hinge-CH2-CH3 (긴 스페이서, 229 AA) 또는 힌지만(짧은 스페이서, 12 AA)의 IgG4-유도 스페이서 도메인, 및 CD28 또는 4-IBB를 단독으로 또는 동시에 갖는 CD3ζ를 함유하는 시그널링 모듈을 코딩한다. 각각의 키메릭 리셉터 카세트는 분해가능한 2A 요소의 하부에 코딩된 둔단된 EGFR 마커를 함유한다. (B, C) CD19-키메릭 리셉터 구조물 각각으로 변성된 폴리클로날 T 세포주를 정상 공여체의 정제된 CD8+ CD45RO+ CD62L+ 중추 기억 T 세포(TCM)로부터 제조하였다. 렌티바이러스 형질도입 후에, 각 세포주 내의 전이유전자 양성 T 세포를 tEGFR 마커를 사용하여 정제하고 시험관내 및 생체내 실험에서 증폭하였다. (D) tEGFR 마커에 대해 염색한 후의 MFI는 CD19-키메릭 리셉터 각각으로 변성된 T 세포 내에서 등가의 전이유전자 발현을 나타낸다.
도 14: 고유(distinct) CD19-키메릭 리셉터로 변성된 T 세포의 시험관내 세포독성, 사이토킨 생성 및 증식. (A) CD19+ 및 대조용 표적 T 세포에 대한 다양한 CD19-키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포의 세포용해 활성. (B) 다양한 CD19-키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포와 CD19로 형질감염된 K562 세포, 및 CD19+ Raji 세포의 트리플리케이트 동시배양 24시간 후에 얻어진 상징액의 멀티플렉스 사이토킨 어세이. (C) 다양한 CD19-키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포에 의한 사이토킨 제조 비교. 6개의 개별 실험의 멀티플렉스 사이토킨 데이터를 정규화하고(CD19-키메릭 리셉터 'short/CD28'에 의한 사이토킨 방출 CTL = 1), Student's t-test로 분석하였다. (D) CFSE 염료 희석을 사용하여 K562/CD19 (상부 패널) 및 CD19+ Raji 종양 세포(하부 패널)로 자극한 72시간 후에 외인성 사이토킨의 첨가 없이 CD19-키메릭 리셉터 T 세포의 증식을 측정하였다. 분석 동안, 3번 웰을 모으고, 살아있는(PI-), CD8+ T 세포를 분석하였다. 각 히스토그램 위의 숫자는 증식하는 서브세트가 수행한 세포분열의 수를 나타내고, ≥4/3/2/1 세포분열을 수행한 각 게이트에서 T 세포 분획은 각 플로트의 왼쪽 상부에 제공하였다. (E) Raji 종양 세포를 갖는 다양한 CD19-키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포의 72시간 동시배양의 말에 PI 염색을 수행하였다. 키메릭 리셉터 T 세포주(CD3+) 내에서 PI+ 세포의 백분율은 각 히스토그램에 제공하였다.
도 15: 짧은 세포외 스페이서 도메인을 갖는 CD19-키메릭 리셉터 T 세포는 NOD/SCID 마우스에서 Raji 종양을 근절한다. (A) 마우스 무리를 꼬리정맥 주사를 통해 Raji-ffluc를 접종하고, 긴 스페이서 도메인과 짧은 스페이서 도메인을 함유하는 CD19-키메릭 리셉터 또는 tEGFR 단독으로 형질도입된 T 세포를 꼬리정맥 주사에 의한 종양 접종 2일과 9일 후에 투여하였다. 종양 진행과 분포를 루시페린(luciferin) 기질을 주사한 후에 연속 생체발광 이미지에 의해 평가하였다. (B) 짧은 스페이서 ('short/CD28'과 'short/4-1BB') 및 긴 스페이서('long/CD28'과 'long/4-1BB') 도메인을 갖는 CD19-키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포, tEGFR 대조용 벡터로 형질도입된 T 세포로 처리되거나 미처리된 마우스 무리에서 종양의 연속 생체발광 이미지. CD19-키메릭 리셉터 또는 tEGFR 형질도입 T 세포로 처리된 마우스 무리를 나타내는 각 다이아그램은 또한 비교를 위한 미처리 마우스의 종양 진행(적색 삼각형)의 중간을 나타내었다. (C) 미처리된 마우스와 짧은 스페이서 ('short/CD28'과 'short/4-1BB') 및 긴 스페이서('long/CD28'과 'long/4-1BB') 도메인을 갖는 CD19-키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포 및 대조용 tEGFR로 처리된 마우스의 생존에 대한 Kaplan-Meier 분석. 통계적 분석은 로그순위시험을 사용하여 수행하였다. B와 C에 나타낸 데이터는 3개의 개별 실험에서 얻어진 결과의 대표값이다.
도 16: 짧은 스페이서(short/4-1BB)를 갖는 CD19-키메릭 리셉터 T 세포는 설정된 Raji 종양을 NSG 마우스에서 용량의존적 방식으로 근절한다. (A) 마우스를 꼬리정맥 주사에 의해 Raji-ffluc를 접종하고 종양 생착(engraftment)을 생체발광 이미지에 의해 6일째에 확인하였다. 7일째에 다양한 용량의 T 세포를 일회 i.v. 주사한 마우스를 CD19-키메릭 리셉터 'short/4-1BB' 또는 tEGFR-대조용 렌티바이러스로 형질도입하였다. (B, C) CD19-키메릭 리셉터 'short/4-1BB'를 발현하는 T 세포의 용량의존적 항-종양 효능. 대조용 마우스 무리에게 일tEGFR만으로 변성된 고용량 T 세포를 일회 투여하였다. (D) NSG/Raji 마우스에 양자전달한 후 CD19-키메릭 리셉터 T 세포의 지속성(Persistence). 2.5x106 CD19-키메릭 리셉터 'short/4-1BB' T 세포로 처리된 마우스 무리에서 말초혈액(안구 출혈)의 유동세포계수 분석. CD8+ tEGFR+ T 세포의 빈도를 살아있는 말초혈액 세포의 백분율로 나타내었다.
도 17: 짧은 스페이서 및, CD28 또는 4-1BB를 갖는 CD19-키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포는 긴 스페이서를 갖는 CD19-키메릭 리셉터를 발현하는 것들보다 설정된 림프종에 대해 보다 효과적이다. (A) NSG 마우스를 Raji-ffluc로 0일째에 접종하고, 7일째에 짧은 또는 긴 스페이서 및 CD28 또는 4-1BB 공동자극 도메인을 발현하는 CD19 키메릭 리셉터 T 세포 2.5x106의 일회 투여로 처리하였다. (B) 처리 그룹 각각에서 마우스 생존에 대한 Kaplan-Meier 분석. 통계적 분석은 로그순위시험을 사용하여 수행하였다. (C) 짧은 스페이서('short/CD28'과 'short/4-IBB'), 및 긴 스페이서('long/CD28'과 'long/4-1BB')를 갖는 CD19-키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포로 처리된 마우스 무리의 생체발광 이미징. 각각의 시점에서 미처리된 마우스에서 관찰된 평균종양부담을 비교를 위해 각 다이아그램에 나타내었다(삼각형). (D) 짧은 스페이서 도메인을 갖는 CD19-키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포의 생체내 지속성은 긴 스페이서 도메인을 갖는 CD19-키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포와 비교하여 증강된다. 전달 후 3일째와 10일 째에 얻어진 말초혈액 중 CD8+ tEGFR+ T 세포의 빈도를 유동세포계수법으로 측정하고 살아있는(PI-) 말초혈액 세포의 백분율로 나타내었다. 통계적 분석은 Student's t-test으로 수행하였다. B-D에 나타낸 데이터는 3개의 개별 실험에서 얻어진 결과의 대표값이다.
도 18: 키메릭 리셉터 T 세포 용량을 증가하거나 공동자극 시그널링을 증강하는 것은 설정된 림프종에 대한 긴 스페이서 도메인을 갖는 CD19-키메릭 리셉터의 항-종양 효능을 개선하지 않는다. (A) CD19+ 및 대조용 표적 세포에 대한 'long/CD28', 'long/4-1BB' 및 'long/CD28_4-1BB' CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포의 세포용해 활성. (B) 다양한 CD19-키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포와 K562/CD19 및 Raji 종양 세포의 트리플리케이트 동시배양으로 24시간 후에 얻어진 상징액의 멀티플렉스 사이토킨 어세이. (C) CD19+ 종양 세포 (K562/CD19 - 왼쪽 패널; Raji - 오른쪽 패널)로 자극한 72시간 후에 CFSE 염료 희석에 의한 CD19-키메릭 리셉터 T 세포 증식의 평가. 분석 동안, 트리플리케이트 웰을 모으고 살아있는(PI-) CD8+ T 세포의 증식을 분석하였다. 각 히스토그램 위의 숫자는 증식하는 서브세트가 수행한 세포분열의 수를 나타내고, ≥4/3/2/1 세포분열을 수행한 각 게이트에서 T 세포 분획은 각 플로트의 왼쪽 상부에 제공하였다. (D) 짧은 스페이서 도메인('short/CD28')과 긴 스페이서 도메인 ('long/CD28'과 'long/CD28_4-1BB')을 갖는 CD19-키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포, 또는 tEGFR-코딩 대조용 렌티바이러스 벡터로 변성된 T 세포로 처리된 마우스 생존에 대한 Kaplan-Meier 분석. 통계적 분석은 로그순위시험을 사용하여 수행하였다. (E) 짧은 스페이서('short/CD28'), 및 긴 스페이서 ('long/CD28'과 'long/CD28_4-1BB')를 갖는 CD19-키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포로 처리된 마우스 무리의 생체발광 이미징. 다이아그램은 비교를 위한 미처리 마우스에서 평균종양진행을 나타내고 있다(적색 삼각형). (F) 다양한 CD19-키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포의 생체내 지속성. 전달 후 3일과 10일에 얻어진 말초혈액 내 CD8+ tEGFR+ T 세포의 빈도는 유동세포계수법으로 측정되었고 살아있는(PI-) 말초혈액 세포의 백분율로 나타내었다. 통계적 분석은 Student's t-test로 수행하였다.
도 19: 긴 스페이서 도메인을 갖는 CD19-키메릭 리셉터 T 세포는 생체내 종양으로 활성화되지만 세포수를 증가하지 못하였다. (A) NSG/Raji 마우스로 전달하기 전에 각 CD19-키메릭 리셉터로 변성된 T 세포에서 CD69 및 CD25의 발현. (B) 마우스 무리를 Raji-ffluc 종양 세포로 접종하고, 7일 후에 CFSE-표지 CD19-키메릭 리셉터 형질도입된, 또는 대조용 T 세포를 투여하였다. 골수와 비장을 T 세포를 투여한 24시간과 72시간 후에 마우스의 서브그룹에서 수집하였다. (C, D) T 세포를 전달한 24시간 (C)과 72시간 (D) 후에 얻어진 골수 단핵세포의 다중매개변수 유동세포계수 분석. 점도표는 살아있는 사람 T 세포를 검출하기 위해 PI- 세포에서 게이팅(gating)한 후 염색한 항CD3 및 항CD45를 나타낸다. CD3- CD45+ 게이트는 Raji 종양 세포를 함유한다. 살아있는(PI-) CD3+ CD45+ T 세포 상에서 CD25와 CD69의 발현을 히스토그램에 나타내었다. (E) T 세포 전달 24시간과 72시간 후에 얻어진 비장에서 CD3+ CD45+ T 세포의 빈도. 점도표는 살아있는 PI- 비장세포에 게이트되었고 CD3+ CD45+ T 세포의 백분율은 각 플로트에 나타내었다. (F) NSG Raji 마우스에 T 세포를 전달한 여러 시간 후에 골수 및 비장세포의 PI 염색. 히스토그램 내의 숫자는 CD3+ 개체군 내에서 PI+ 세포의 백분율을 나타낸다. (G) 짧은 스페이서('short/CD28'과 'short/4-IBB'), 및 긴 스페이서('long/CD28과 'long/4-1BB')를 갖는 CD19-키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포, 또는 대조용 T 세포로 처리된 마우스 무리의 생체발광 이미징.
도 20: 4-1BB와 CD3제타 및 변성 IgG4-Fc 힌지를 갖는 CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포는 4-1BB와 CD3제타 및 CD8 알파 힌지를 갖는 CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포보다 시험관내와 생체내 작용이 우수하다. (A) IgG4 Fc 힌지, CD8 알파 힌지를 갖는 CD19 키메릭 리셉터 변성 T 세포와 CD19로 형질감염된 Cr51-표지 K562 세포에 대한 대조용 T 세포, CD19를 발현하는 Raji 림프종 세포, 및 K562 대조용 T 세포의 세포용해 활성. 용균은 4 시간 Cr51 방출 어세이에서 상이한 E/T 비율에서 나타났다. (B) Raji 종양 세포와 24시간의 공동배양 후 IgG4 Fc 힌지 또는 CD8 알파 힌지를 갖는 CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 5xl04 T 세포에 의한 인터페론 감마 제조. O.D. 1은 ~500 pg/ml의 인터페론 감마에 해당한다. (C) IgG4 Fc 힌지 또는 CD8 알파 힌지를 갖는 CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포와 tEGFR만을 발현하는 T 세포(대조용)의 CD19 양성 Raji 림프종 세포와 동시배양한 72시간 후 증식을 측정하기 위한 CFSE 염료 희석 어세이. 각 히스토그램 위의 숫자는 증식하는 서브세트가 수행한 세포분열의 수를 나타낸다. ≥3/2/1 세포분열을 수행한 각 게이트에서 T 세포 분획은 플로트 다음에 제공하였다. (D) 반딧불이 루시퍼라제(ffluc)를 발현하는 Raji 종양 세포가 접종된 NSG 마우스에서 IgG4 Fc 힌지(그룹 1) 또는 CD8 알파 힌지(그룹 2)를 갖는 CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포와 tEGFR만(그룹 3)을 발현하는 T 세포의 생체내 항종양 활성. 마우스는 종양 접종 17일 후와 T 세포 접종 10일 후에 이미지되었다. 데이터는 CD19 키메릭 리셉터 IgG4 Fc 힌지 T 세포로 처리된 마우스(그룹 1)보다 대조용 tEGFR T 세포(그룹 3) 또는 CD19 키메릭 리셉터 CD8 알파 힌지 T 세포로 처리된 마우스에서 거대한 종양부담을 나타내고 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본 원에서 사용된 모든 기계적 및 과학적 용어는 본 발명이 관련된 분야의 기술자들이 통상적으로 이해하는 것과 같은 의미를 가진다.
측정가능한 값을 지칭할 때 본원에서 사용된 "약"은 특정된 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, 더욱 바람직하게 ±5%, 보다 더 바람직하게 ±1%, 더욱 더 바람직하게 ±0.1 %의 변동을 포함하는 것을 의미한다.
본 원에서 사용된 "활성화"란 검출가능한 세포 증식, CD69와 CD25 같은 세포 표면 마커의 사이토킨 생성 또는 발현, 또는 검출가능한 이팩터 작용을 유발하도록 충분히 자극된 T 세포의 상태를 지칭한다.
본 원에서 사용된 "활성화 유도된 세포 사멸(cell death)"이란 활성화되었지만 2세대를 초과하여 증식할 수 없고 아폽토시스(apoptosis) 마커를 나타내는 T 세포 상태를 지칭한다.
본 원에서 사용된 "항원" 또는 "Ag"는 면역반응을 유발하는 분자를 지칭한다. 이러한 면역반응은 항체 생산 또는 특이적 면역학적 수용 세포(competent cell)의 활성화 또는 이들 모두를 포함할 수 있다. 항원이 생성 합성, 재조합 생산되거나 생물학적 샘플로부터 유도될 수 있는 것이 분명하다. 이러한 생물학적 샘플은, 예를 들어 조직 샘플, 종양 샘플, 또는 세포 또는 생물학적 유동액일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 원에서 사용된 "항-종양 효과"란 종양부피의 감소, 종양 세포수의 감소, 전이수 감소, 기대수명 증가, 또는 암 상태와 연관된 다양한 생리증상의 감소를 나타낼 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "항-종양 효과"란 또한 재발의 감소 또는 재발전 시간 감소로 나타낼 수 있다.
본 원에서 사용된 "키메릭 리셉터"란 항체의 리간드 결합 도메인 또는, 질환 또는 장애와 연관된 분자와 결합하고 스페이서 도메인에 의해 T 세포의 하나 이상의 세포내 시그널링 도메인 또는 다른 리셉터, 예컨대 공동자극 도메인에 결합된 다른 단백질 서열을 포함하는 합성적으로 설계된 리셉터를 지칭한다.
본 원에서 사용된 용어로서 "공동자극(Co-stimulatory) 도메인"이란 T 세포에 시그널을 제공하는 시그널링 잔기를 지칭하는 것으로, 이것은 예를 들어 TCR/CD3 복합체의 CD3 제타 사슬에 의해 제공된 프라이머리 시그널 이외에 T 세포 반응, 예컨대 비제한적으로 활성화, 증식, 분화, 사이토킨 분비 등을 매개한다. 공동자극 도메인은, 비제한적으로 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, 1COS, 림프구 작용 연관성 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드의 전체 또는 일부를 포함할 수 있다. 구체예에서, 공동자극 도메인은 세포반응, 예컨대 활성화, 증식, 분화 및 사이토킨 분비 등을 매개하는 다른 세포내 매개체와 반응하는 세포내 시그널링 도메인이다.
본 원에서 사용된 "코딩하는(coding for)"이란 다른 거대분자, 예컨대 아미노산의 정해진 서열의 합성을 위한 템플레이트로서 작용하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 유전자, cDNA, 또는 mRNA에서 뉴클레오티드의 특이적 서열의 특성(property)을 지칭한다. 따라서, 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생산하는 경우, 유전자는 단백질을 코팅한다. "폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열"은 서로의 축퇴 버젼이고 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 원에서 사용된 "세포독성 T 림프구"(CTL)는 그의 표면 상에서 CD8을 발현하는 T 림프구를 지칭한다(즉, CD8+ T 세포). 일부 구체예에서, 이러한 세포는 바람직하게 항원-경험을 한 "기억" T 세포(TM 세포)이다.
본 원에서 사용된 "중추 기억" T 세포(또는 "TCM")는 그의 표면 상에서 CD62L 또는 CCR-7 및 CD45RO을 발현하고 천연(naive) 세포와 비교하여 CD45RA를 발현하지 않거나 발현 감소를 갖는 항원 경험 CTL을 지칭한다. 구체예에서, 중추 기억세포는 CD62L, CCR7, CD28, CD127, CD45RO 및 CD95의 발현에 양성이고, 천연 세포와 비교하여 CD54RA의 발현을 감소한다.
본 원에서 사용된 "이팩터(Effector) 기억" T 세포(또는 "TEM")는 중추 기억 세포와 비교하여 그의 표면 상에서 CD62L을 발현하지 않거나 발현 감소를 갖고 천연 세포와 비교하여 CD45RA를 발현하지 않거나 발현 감소를 갖는 항원 경험 T 세포를 지칭한다. 구체예에서, 이팩터 기억 세포는 천연 세포 또는 중추 기억 세포와 비교하여 CD62L 및 CCR7의 발현에 음성이고, CD28과 CD45RA의 다양한 발현을 갖는다.
본 원에서 사용된 "천연(naive)" T 세포는 CD62L 및 CD45RA를 발현하고 중추 또는 이팩터 기억 세포와 비교하여 CD45RO-를 발현하지 않는 항원 비경험 T 림프구를 지칭한다. 일부 구체예에서, 천연 CD8+ T 림프구는 CD62L, CCR7, CD28, CD127 및 CD45RA를 포함하는 천연 T 세포의 표현형 마커의 발현을 특징으로 한다.
본 원에서 사용된 "이팩터", "TE" T 세포는 CD62L, CCR7, CD28을 발현하지 않거나 발현 감소를 갖고, 중추 기억 또는 천연 T 세포와 비교하여 그랜자임(granzyme) B 및 퍼포린에 양성인 항원 경험 세포독성 T 림프구 세포를 지칭한다.
혼합물에서 세포 종류의 양을 기술하기 위해 본 원에서 사용된 "농축된" 및 "고갈된"은 "농후한" 종류 수의 증가 및 "고갈된" 세포 수의 감소를 제공하는 공정 또는 단계로 세포 혼합물을 처리하는 것을 지칭한다. 따라서, 농후화 공정으로 처리된 세포의 본래 모집단의 공급원에 따라, 혼합물 또는 조성물은 약 60, 70, 80, 90, 95 또는 99% 이상(수 또는 계수)의 "농후한" 세포 및 약 40, 30, 20, 10, 5 또는 1% 이하(수 또는 계수)의 "고갈된" 세포를 함유할 수 있다.
본 원에서 사용된 "에피토프"란 항체, T 세포, 및/또는 B 세포를 포함한 면역 시스템에 의해 인지된 분자 또는 항원의 일부를 지칭한다. 에피토프는 일반적으로 적어도 7개의 아미노산을 가지며 선형이거나 입체형태일 수 있다.
본 원에 기술된 다양한 폴리펩티드를 기술하기 위해 사용된 "단리된"이란 그의 자연적 환경의 성분에서 동정 및 분리 및/또는 회수된 폴리펩티드 또는 핵산을 의미한다. 바람직하게, 단리된 폴리펩티드 또는 핵산은 자연적으로 결합된 모든 성분들과의 관련성이 없다. 그의 자연환경 중의 오염성분들은 폴리펩티드 또는 핵산의 진단 또는 치료 용도를 전형적으로 방해하는 물질들이고, 효소, 호르몬, 및 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다.
본 원에서 사용된 "세포내 시그널링 도메인"이란 림프구의 활성화를 제공하는 분자(여기서는 키메릭 리셉터 분자)의 하나 이상의 도메인 전체 또는 일부를 지칭한다. 이러한 분자들의 세포내 도메인은 세포 매개체와 상호작용하여 시그널을 매개하여 증식, 분화, 활성화 및 다른 이팩터 작용을 유발한다. 구체예에서, 이러한 분자들은 CD28, CD3, 4-1BB 전부 또는 일부, 및 그의 조합을 포함한다.
본 원에서 사용된 "리간드"란 다른 물질과 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 물질을 지칭한다. 리간드의 예는 항원 상의 에피토프, 리셉터에 결합하는 분자, 기질, 저해제, 호르몬, 및 활성제를 포함한다. 본 원에서 사용된 "리간드 결합 도메인"은 리간드에 결합하는 물질 또는 그의 일부를 지칭한다. 리간드 결합 도메인의 예는 항체의 항원 결합 부위, 리셉터의 세포외 도메인, 및 효소의 활성부위를 포함한다.
본 원에서 사용된 "작동가능하게 연결된"이란 조절서열과 이종 핵산 서열 사이의 작용적 연결을 지칭하며, 후자의 발현을 유발한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작용적 연관성 내에 위치했을 때 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결된다. 일예로, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치면 프로모터가 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 인접하고, 필요한 경우에 두 개의 단백질 코딩 영역을 동일한 리딩 프레임에서 결합한다.
본 원에서 동정된 키메릭 리셉터 폴리펩티드 서열과 관련한 "아미노산 서열 동일성 백분율(%)"은 서열을 정렬하고, 필요하다면 최대 비율의 서열 동일성을 얻기 위해 갭을 삽입한 후에 서열 동일성의 일부로서 보존적 치환을 고려하지 않으면서 리간드 결합 도메인, 스페이서, 막통관 도메인, 및/또는 림프구 활성 도메인 각각에 대한 참조 서열에서 아미노산 잔류물과 동일한 후보 서열 내 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 측정하기 위한 정렬은 당분야에서 알려진 다양한 방법으로 이루어질 수 있으며, 예를 들어 공개 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign (DNA STAR) 소프트웨어를 사용한다. 당업자라면 비교되는 서열의 전장에 대해 최대 정렬을 얻는데 필요한 알고리즘을 포함한 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 예를 들어, WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램[Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)]을 사용하여 생성된 아미노산 서열 동일성값(%)은 여러가지 검색 매개변수를 사용하며, 그 대부분은 기본값에 대해 설정된다. 기본값에 대해 설정되지 않는 것들(즉, 조정가능한 매개변수들)은 다음 값으로 설정된다: 오버랩 스팬(overlap span)=l, 오버랩 분획=0.125, 단어 역치(threshold)(T)=11 및 점수화 매트릭스=BLOSUM62. 아미노산 서열 동일성 값(%)은 (a) 표 2에 제공된 참조 키메릭 리셉터 서열의 폴리펩티드 아미노산 서열 각각 또는 전체와 WU-BLAST-2로 측정된 관심있는 비교 아미노산 서열 사이의 매칭되는 동일한 아미노산 잔기의 수를 (b) 관심있는 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 총수로 나누어 측정된다.
본 원에서 사용된 "키메릭 리셉터 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "키메릭 리셉터 변이체 핵산 서열"은 표 1에 나타낸 폴리뉴클레오티드 산 서열 또는 특이적으로 유도된 그의 단편, 예컨대 항원 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 스페이서 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 막통관 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 림프구 자극 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 80%의 핵산 서열 동일성을 갖는 이하에 정의된 폴리펩티드 코딩 핵산 분자를 지칭한다. 통상적으로, 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편의 키메릭 리셉터 변이체는 표에 나타낸 핵산 서열 또는 그의 유도된 단편과, 적어도 약 80% 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 약 81 % 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 약 82% 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 약 83% 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 약 84% 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 약 85% 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 약 86% 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 약 87% 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 약 88% 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 약 89% 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 약 90% 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 약 91% 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 약 92% 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 약 93% 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 약 94% 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 약 95% 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 약 96% 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 약 97% 핵산 서열 동일성, 더욱 바람직하게 적어도 약 98% 핵산 서열 동일성 및 보다 더 바람직하게 적어도 약 99% 핵산 서열 동일성을 갖는다. 변이체는 천연 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다. 이와 관련하여, 유전자 코드의 축퇴 때문에 당업자라면 표 1의 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80%의 핵산 서열 동일성을 갖는 키메릭 리셉터 변이체 폴리뉴클레오티드의 대부분이 표 2의 아미노산 서열과 일치하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것을 바로 알 것이다.
"실질적으로 정제된"이란 본질적으로 다른 분자 종류가 없는 분자 또는 본질적으로 다른 세포 종류가 없는 세포를 지칭한다. 실질적으로 정제된 세포는 또한 자연적으로 발생한 상태에서 정상적으로 결합된 다른 세포 종류에서 분리된 세포를 지칭한다. 일부 예에서, 실질적으로 정제된 세포의 개체군은 세포의 동종 개체군을 지칭한다.
정상 세포에서 다른 분자 또는 종양 항원의 존재를 참조로 사용된 "실질적으로 발견되지 않는"이란 항원 또는 분자를 갖는 정상 세포 종류의 비율, 및/또는 세포에서 항원의 밀도를 지칭한다. 구체예에서, 실질적으로 발견되지 않는이란 항원 또는 분자가 50% 미만의 정상 세포 종류에서, 및/또는 종양 세포 또는 다른 질환 세포에서 발견된 세포 또는 항원의 양과 비교하여 50% 미만의 밀도로 발견된 것을 의미한다.
본 원에서 사용된 "T 세포" 또는 "T 림프구"는 포유동물, 바람직하게 영장류, 원숭이, 개 및 사람을 포함하는 종에서 유래할 수 있다. 일부 구체예에서, T 세포는 수용체 대상으로서 동종이계(동일한 종으로부터 유래한 상이한 공여체)이고; 일부 구체예에서 T 세포는 자가(공여체와 수용체가 동일)이고; 일부 구체예에서 T 세포는 동계(공여체와 수용체가 다르지만 동일한 쌍둥이)이다.
기술방법
본 발명은 키메릭 리셉터 핵산, 및 이러한 핵산을 포함하는 벡터와 숙주 세포를 제공한다. 키메릭 리셉터 핵산은 특이적 표적 분자에 대해 키메릭 리셉터를 맞추기 위해 절제되어 다른 성분들로 대체될 수 있는 다수의 모듈 성분들을 포함한다. 본 발명은 모듈 성분들 중 하나가 스페이서 성분인 것을 제공한다. 놀라웁게도, 시그널링 능력이 없는 것으로 추정되는 스페이서 영역의 길이가 키메릭 리셉터를 발현하기 위해 변성된 T 세포의 생체내 효능에 영향을 미치고 개별 표적 분자가 치료활성을 강화하기 위해 맞추어져야 하는 것을 발견하였다.
일 측면에서, 방법과 핵산 구조물은 참조 키메릭 리셉터와 비교하여 리간드에 대한 반응에서 개선된 종양 인지, 증가된 T 세포 증식 및/또는 사이토킨 제조를 갖는 키메릭 리셉터를 설계하도록 제공된다. 구체예에서, 핵산의 라이브러리가 제공되며, 여기에서 각 핵산은 서열과 길이가 다른 것들과 상이한 스페이서 영역을 코딩한다. 이후 각각의 핵산을 사용하여 생체내(동물모델) 및/또는 시험관내에서 시험될 수 있는 키메릭 리셉터 핵산 구조물을 형성하므로써 개선된 종양 인지, 증가된 T 세포 증식 및/또는 리간드에 대한 반응에서 사이토킨 제조를 제공하는 스페이서를 선택할 수 있다.
구체예에서, 키메릭 리셉터 핵산은 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(여기서 리간드는 종양 또는 바이러스 특이적 항원 또는 분자이다), 맞춤된 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(여기서 스페이서는 증강된 T 세포 증식을 제공한다); 막통관 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 하나 이상의 세포내 시그널링 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 구체예에서, 표적 분자의 에피토프가 표적 세포에 근접한 막이면 긴 스페이서가 사용되고 표적 분자의 에피토프가 표적 세포에서 멀리 있는 막이면 짧은 스페이서가 사용된다.
키메릭 리셉터의 디자인은 종양 또는 바이러스 종류, 종양에 존재하는 표적 항원 또는 분자, 표적 분자에 대한 항체의 친화도, 항원 결합 도메인 및/또는 세포내 시그널링 도메인에 필요한 가요성에 따라 맞춤화될 수 있다. 구체예에서, 수많은 키메릭 리셉터 구조물은 시험관내 및 생체내 모델에서 시험하여 면역결핍 마우스에서 종양 세포를 사멸하고 양자 전달 후에 증식 및 지속하는 리셉터로 변성된 T 세포의 능력을 측정한다. 구체예에서, 시험관 내에서 적어도 두 세대 및/또는 생체내 삽입 후 72시간 이내에 증식하는 적어도 30%의 세포의 능력을 제공하는 키메릭 리셉터를 선택한다. 구체예에서, 면역결핍 마우스에서 50% 초과의 세포가 생체내에서 72시간 이내에 활성화유도세포사(AICD)를 일으켜서 종양 세포 근절에 실패하는 키메릭 리셉터를 선택하지 않는다.
표적 분자가 대상의 종양 세포에 존재하는지에 따라, 키메릭 리셉터는 그 표적 분자에 특이적으로 결합하는 리간드 결합 도메인을 포함한다. 구체예에서, 대상의 종양 세포는 세포 표면 종양 분자에 대해 특성화된다. 표적 분자는 특정한 대상의 종양 세포에서 그의 존재의 측정에 기준하여 선택될 수 있다. 구체예에서, 종양 세포에서 지배적으로 발견된 세포 표면 분자 및 실질적인 정도로 정상 조직에서 발견되지 않는 표적 분자를 선택한다. 구체예에서, 표적화된 세포 표면 분자 상의 에피토프와 결합하는 항체를 선택한다. 일부 경우에서, 에피토프는 세포막에 대한 근접성과 관련하여 특성화된다. 에피토프는 표적 세포막에서 먼 거리에 위치하는 구조 분석으로 예측되거나 알려진 대체 에피토프보다 표적 세포막에 더 가까이 있는 구조 분석으로 예측되거나 알려지면 막에 근접한 것으로 특성화된다. 구체예에서, scFV가 구성된 항체의 친화도는 결합 어세이로 비교되며, 상이한 친화도를 갖는 항체들을 친화도가 표적 세포의 우수한 세포독성에 기초한 최적의 종양 인지, 및/또는 T 세포 사이토킨 생산 및 증식을 제공하는 것을 결정하기 위해 T 세포에서 발현된 키메릭 리셉터 포맷으로 시험하였다.
또한, 키메릭 리셉터의 스페이서 영역은 표적 세포 상 리간드의 T 세포 인지를 최적화하기 위해 변화될 수 있다. 구체예에서, 항체가 막에 매우 근접한 표적 세포 상의 에피토프에 결합하는 경우, 스페이서는 약 15 아미노산보다 긴 것이 선택된다. 예를 들어, 구체예에서, 표적 항원 상의 에피토프 또는 그의 일부가 막통관 도메인에 인접한 세포외 도메인의 선형 서열의 최초 100 아미노산 내에 있다면 긴 스페이서 영역이 선택될 수 있다. 구체예에서, 항체가 막과 먼 거리에 있는 표적 세포 상의 에피토프에 결합하는 경우, 스페이서는 약 119 또는 15 아미노산 이하인 것이 선택된다. 예를 들어, 구체예에서, 에피토프 또는 그의 일부가 말단으로부터 세포외 도메인의 선형 서열의 150 아미노산 내에 있다면 짧거나 중간인 스페이서를 사용할 수 있다. 구체예에서, 스페이서는 아미노산 서열 X1PPX2P를 포함한다.
프라이머리 및 공동자극 세포내 시그널링 도메인의 다양한 조합을 키메릭 리셉터의 생체내 효능을 증강하기 위해 사용할 수 있다. 구체예에서, 키메릭 리셉터의 상이한 구조물을 생체내 동물 모델에서 시험하여 종양 사멸에 대한 효능을 결정할 수 있다. 구체예에서, 공동자극 세포내 시그널링 도메인은 CD28 및 그의 변성 버젼, 4-1BB 및 그의 변성 버젼 및 그의 조합으로 구성되는 군에서 선택된다. 다른 공동자극 도메인, 예컨대 OX40을 결합할 수 있다.
CD8+ 중추 기억 T 세포는 투여 후 장기간 동안 이들을 지속하는 고유 프로그래밍을 가지며, 이것이 이들을 면역요법을 위한 CD8+ T 세포의 바람직한 서브세트가 되게 한다. 구체예에서, 분류 정제된 CD8+ 중추 기억 T 세포로부터 제조된 CD19 특이적 키메릭 리셉터 변성 세포독성 T 세포는 CD4+ CD19 특이적 키메릭 리셉터-변성 T 세포의 존재 또는 부재 하에 투여된다. 구체예에서, 종양 특이적 CD4+ T 세포는 항-종양 반응성과 시험관내 및 생체내에서 종양-특이적 CD8+ T 세포를 돕는다. 특정 구체예에서, 종양-특이적 CD4+ T 세포, 또는 천연 또는 중추 기억 기질로부터 선택된 CD4+ T 세포는 단독으로 또는 CD8+ TCM-와 함께 사용된다.
핵산, 벡터 및 폴리펩티드
본 발명은 양자 면역요법에서 사용하기 위한 림프구를 형질전환하거나 형질도입하는데 유용한 키메릭 리셉터 핵산을 제공한다. 구체예에서, 핵산은 핵산 요소들의 용이한 대체를 제공하는 수많은 모듈 성분들을 함유한다. 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니지만, 각각의 종양 항원에 대한 리셉터는 포유동물 세포에서 생체내 효능과 효과적인 발현을 제공하기 위해 구성성분들의 관점에서 바람직하게 조정되는 것으로 생각된다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 막 원위 Ig/Frizzled 도메인에 위치한 ROR1 에피토프와 결합하는 scFV를 포함하는 키메릭 리셉터의 효능을 위해 약 15 아미노산 이하인 스페이서가 사용된다. 다른 특정 구체예에서, 막 원위 Kringle 도메인에 위치한 ROR1 에피토프와 결합하는 scFV를 포함하는 키메릭 리셉터의 효능을 위해 15 아미노산을 초과하는 스페이서가 사용된다. 다른 구체예에서, CD19와 결합하는 scFV를 포함하는 키메릭 리셉터의 효능을 위해 15 아미노산 이하인 스페이서가 사용된다.
구체예에서, 단리된 키메릭 리셉터 핵산은 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(여기서 표적 분자는 종양 특이적 항원이다), 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(여기서 폴리펩티드 스페이서는 약 229 아미노산 이하이다); 막통관 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 세포내 시그널링 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 구체예에서, 발현벡터는 본 원에서 기술된 키메릭 핵산을 포함한다. 또한, 키메릭 리셉터 핵산 전체 또는 일부에 의해 코딩된 폴리펩티드가 본 원에 포함된다.
리간드 결합 도메인
구체예에서, 키메릭 리셉터 핵산은 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 구체예에서, 리간드 결합 도메인은 종양 또는 바이러스 특이적 항원과 특이적으로 결합한다. 구체예에서, 리간드 결합 도메인은 그의 항체 또는 단편이다. 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 핵산 서열은 쉽게 결정할 수 있다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 CD19와 특이적으로 결합하는 단일사슬 Fv를 코딩한다. 다른 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 ROR1과 특이적으로 결합하는 단일사슬 Fv를 코딩한다. 이러한 항체들의 서열은 공지되어 있거나 당업자들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
종양 항원은 면역반응을 유발하는 종양 세포에 의해 생산된 단백질이다. 본 발명의 리간드 결합 도메인의 선택은 치료될 암의 종류에 따르며, 종양 항원 또는 다른 종양 세포표면분자를 표적으로 할 수 있다. 대상의 종양 샘플은 특정 바이오마커 또는 세포표면마커의 존재로 특성화될 수 있다. 예를 들어, 대상의 유방암 세포는 Her2Neu, 에스트로겐 리셉터 및/또는 프로게스테론 리셉터 각각에 양성이거나 음성일 수 있다. 종양 항원 또는 세포표면분자는 개별적인 대상의 종양세포에서 발견된 것이 선택된다. 종양 항원 및 세포표면분자는 당분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 암태아성 항원(CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 리셉터, 프로게스테론 리셉터, ephrinB2, CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, 메조텔린(mesothelin), c-Met, GD-2, 및 MAGE A3 TCR이다. 구체예에서 표적 분자는 종양세포에서 발견되고 정상조직에서는 실질적으로 발견되지 않거나 필수가 아닌(non-vital) 정상조직에 그의 발현이 제한되는 세포표면분자이다.
다른 표적 분자는 감염성 병원체에서 유도된 항원, 예컨대 HIV (인간 면역 결핍 바이러스), HBV(B형 간염 바이러스), HPV(인간 유두종 바이러스) 및 C형 간염 바이러를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일 구체예에서, 종양 상의 표적 분자는 악성종양과 연관된 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 악성종양은 T 세포 리셉터 또는 키메릭 리셉터 매개 인지를 위한 표적 항원으로서 작용할 수 있는 수많은 단백질을 발현한다. 다른 표적 분자들은 발암유전자 HER-2/Neu/ErbB2 같은 세포 형질전환과 연관된 분자의 군에 속한다. 구체예에서, 종양 항원은 동일한 조직 종류의 조절 세포와 비교하여 종양 세포에서 선택적으로 발현되거나 과발현된다. 다른 구체예에서, 종양 항원은 세포 표면 폴리펩티드이다.
키메릭 리셉터로 표적화될 수 있는 종양 세포표면분자가 동정되면, 표적 분자의 에피토프가 선택되어 특성화된다. 구체예에서, 에피토프는 종양 세포 막에 근접한 것을 선택한다. 다른 구체예에서, 에피토프는 종양 세포 막에 원위인 것을 선택한다. 에피토프는 표적 세포막에서 먼 거리에 위치하는 구조 분석으로 예측되거나 알려진 대체 에피토프보다 표적 세포막에 더 가까이 있는 구조 분석으로 예측되거나 알려지면 막에 근접한 것으로 특성화된다.
종양 세포표면분자를 특이적으로 결합하는 항체는 모노클로날 항체를 제조하는 방법, 파지 디스플레이 방법, 인간 또는 인간화된 항체를 생성하는 방법, 또는 인간 항체를 제조하기 위해 조작된 형질전환 동물 또는 식물을 사용한 방법으로 제조할 수 있다. 부분적 또는 전체 합성 항체의 파지 디스플레이 라이브러리가 이용가능하고 표적 분자에 결합할 수 있는 항체 또는 그의 단편에 대해 스크린될 수 있다. 인간 항체의 파지 디스플레이 라이브러리를 또한 이용할 수 있다. 구체예에서, 항체는 종양 세포표면분자에 특이적으로 결합하며, 소혈청알부민 또는 다른 연관되지 않은 항원 같은 비특이적 성분들과 교차 반응하지 않는다. 일단 동정되면, 항체를 코딩하는 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드를 단리 및/또는 결정할 수 있다.
항체 또는 항원 결합 단편은 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 합성 항체, 키메릭 항체, 이중특이성 항체, 미니바디, 및 선형 항체의 전체 또는 일부를 포함한다. 항체 단편은 무손상 항체의 일부, 바람직하게 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함하고, 용이하게 제조될 수 있다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체이다.
구체예에서, 특별한 종양 세포표면분자에 결합하는 수많은 상이한 항체들을 단리하고 특성화할 수 있다. 구체예에서, 항체들은 표적화된 분자의 에피토프 특이성에 기초하여 특성화된다. 또한, 일부 경우에서, 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 그 에피토프에 대한 항체의 친화도에 기초하여 선택할 수 있다. 구체예에서, 항체는 적어도 1 mM, 바람직하게 <50 nM의 친화도를 갖는다. 구체예에서, 항체는 다른 항체와 비교하여 에피토프에 대해 높은 친화도를 갖는 것을 선택한다. 예를 들어, 항체는 동일한 에피토프에 결합하는 참조 항체보다 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 또는 적어도 50배 더 큰 친화도를 갖는 것을 선택한다.
구체예에서, 표적 분자는 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, 메조텔린, Her2, c-Met, PSMA, GD-2, MAGE A3 TCR 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택된다.
특이적 구체예에서, 표적 항원은 CD19이다. CD19에 특이적인 수많은 항체들이 당업자들에게 알려져 있으며, 서열, 에피토프 결합 및 친화도에 대해 용이하게 특성화할 수 있다. 특정 구체예에서, 키메릭 리셉터 구조물은 FMC63 항체로부터의 scFV 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, scFV는 RASQDISKYLN의 CDRL1 서열, SRLHSGV의 CDRL2 서열, 및 GNTLPYTFG의 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 인간 또는 인간화된 ScFv 서열이다. 다른 구체예에서, scFV는 DYGVS의 CDRH1 서열, VIWGSETTYYNSALKS의 CDRH2 서열, 및 YAMDYWG의 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 인간 또는 인간화된 ScFv 서열이다. 본 발명은 또한 FMC63에 대한 scFv의 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%의 아미노산 서열 동일성을 갖고 CD19에 대해 적어도 동일한 친화도를 갖는 가변영역을 고려하였다. 구체예에서, 키메릭 리셉터는 119 아미노산 이하, 또는 12 아미노산 이하의 짧거나 중간의 스페이서를 갖는다. 특정 구체예에서, 스페이서는 12 아미노산 이하이고 서열번호: 4의 서열을 갖는다.
구체예에서, CDR 영역은 Kabat에 의해 다음과 같이 넘버링된 항체 영역 내에서 발견된다: 경쇄에 있어서: CDRL1 아미노산 24-34; CDRL2 아미노산 50-56; CDRL3 아미노산 89-97; 중쇄에 있어서 CDRH1 아미노산 31-35; CDRH2 아미노산 50-65; 및 CDRH3에 대해 아미노산 95-102. 항체 내에서 CDR 영역은 쉽게 결정될 수 있다.
특정 구체예에서, 표적 항원은 ROR1이다. ROR1에 특이적인 수많은 항체들이 당업자들에게 알려져 있으며 서열, 에피토프 결합 및 친화도가 용이하게 특성화될 수 있다. 특정 구체예에서, 키메릭 리셉터 구조물은 R12 항체의 scFV 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, scFV는 ASGFDFSAYYM의 CDRL1 서열, T1YPSSG의 CDRL2 서열, 및 ADRATYFCA의 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 인간 또는 인간화된 ScFv이다. 다른 구체예에서, scFV는 DTIDWY의 CDRH1 서열, VQSDGSYTKRPGVPDR의 CDRH2 서열, 및 YIGGYVFG의 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 인간 또는 인간화된 ScFv이다. 본 발명은 또한 R12에 대한 scFv의 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%의 아미노산 서열 동일성을 갖고 ROR1에 대해 적어도 동일한 친화도를 갖는 가변영역을 고려한다. 구체예에서, 키메릭 리셉터는 119 아미노산 이하, 또는 12 아미노산 이하의 짧거나 중간의 스페이서를 갖는다. 특정 구체예에서, 스페이서는 12 아미노산 이하이고 서열번호: 4의 서열을 갖는다.
특정 구체예에서, 표적 항원은 ROR1이다. ROR1에 특이적인 수많은 항체들이 당업자들에게 알려져 있으며 서열, 에피토프 결합 및 친화도가 용이하게 특성화될 수 있다. 특정 구체예에서, 키메릭 리셉터 구조물은 R11 항체의 scFV 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, scFV는 SGSDINDYPIS의 CDRL1 서열, INSGGST의 CDRL2 서열, 및 YFCARGYS의 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 인간 또는 인간화된 ScFv이다. 다른 구체예에서, scFV는 SNLAW의 CDRH1 서열, RASNLASGVPSRFSGS의 CDRH2 서열, 및 NVSYRTSF의 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 인간 또는 인간화된 ScFv이다. 본 발명은 또한 R11에 대한 scFv의 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%의 아미노산 서열 동일성을 갖고 ROR1에 대해 적어도 동일한 친화도를 갖는 가변영역을 고려한다. 구체예에서, 키메릭 리셉터는 229 아미노산 이하의 긴 스페이서를 갖는다. 특정 구체예에서, 스페이서는 229 아미노산이고 서열번호: 50의 서열을 갖는다.
특정 구체예에서, 표적 항원은 Her2이다. Her2에 특이적인 수많은 항체들이 당업자들에게 알려져 있으며 서열, 에피토프 결합 및 친화도가 용이하게 특성화될 수 있다. 특정 구체예에서, 키메릭 리셉터 구조물은 Herceptin 항체의 scFV 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, scFV는 Herceptin 항체의 CDRL1 서열, CDRL2 서열, 및 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 인간 또는 인간화된 ScFv이다. 다른 구체예에서, scFV는 Herceptin의 CDRH1 서열, CDRH2, 및 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는 인간 또는 인간화된 ScFv이다. CDR 서열은 Herceptin의 아미노산 서열로부터 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명은 또한 Herceptin에 대한 scFv의 아미노산 서열에 대하여 적어도 90%의 아미노산 서열 동일성을 갖고 Her2에 대해 적어도 동일한 친화도를 갖는 가변영역을 고려한다. 구체예에서, 키메릭 리셉터는 229 아미노산 이하의 긴 스페이서를 갖는다. 특정 구체예에서, 스페이서는 229 아미노산이고 서열번호:50의 서열을 갖는다.
구체예에서, 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 스페이서 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 구체예에서, 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한 용이한 절제 및, 폴리뉴클레오티드를 상이한 항원을 코딩하거나 상이한 결합 특성을 갖는 리간드 결합 도메인을 코딩하는 다른 폴리뉴클레오티드로 대체하는 것을 제공하기 위해 코딩 서열의 5' 및/또는 3' 말단에 하나 이상의 제한효소 부위를 가질 수 있다. 예를 들어, 제한부위, NheI은 리더 서열의 상부에 인코딩되고; 힌지영역 내에 위치된 3' RsrII는 키메릭 리셉터 벡터 내로 목적하는 scFv를 서브클로닝할 수 있다. 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 포유동물 세포의 발현에 최적화된 코돈이다.
구체예에서, 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 시그널 펩티드에 작동가능하게 연결된다. 구체예에서, 시그널 펩티드는 과립구 콜로니 자극인자에 대한 시그널 펩티드이다. 다른 시그널 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 CD8 알파가 사용될 수 있다.
구체예에서, 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 프로모터는 포유동물 세포에서 키메릭 항원 리셉터의 발현을 제공하는 것이 선택된다. 특정 구체예에서 프로모터는 신장 성장인자 프로모터(EF-1)이다. 적합한 프로모터의 다른 예는 전초기 거대세포바이러스(CMV) 프로모터 서열이다. 그러나, 다른 구성적 프로모터 서열, 예를 들어 비제한적으로 원숭이 바이러스 40(SV 40) 조기 프로모터 마우스, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV), 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복(LTR) 프로모터, MuMoLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인 바(Epstein-Barr) 바이러스 전초기 프로모터, 라우스(Rous) 육종 바이러스 프로모터뿐만 아니라 인간 유전자 프로모터, 예컨대 비제한적으로 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터를 사용할 수도 있다. 유도성 프로모터도 고려된다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌(metallo-thionine) 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 특정 구체예를 CD19를 특이적으로 결합하는 항체, 예컨대 FMC63로부터의 scFv로서 표 1에 나타내었다. 아미노산 GSTSGSGKPGSGEGSTKG (서열번호: 36)를 포함하는 유연한 링커를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 scFV에서 VH 및 VL 사슬을 분리한다. 링커를 포함하는 scFv의 아미노산 서열을 표 2에 나타내었다.(서열번호: 11) 다른 CD19-표적화 항체, 예컨대 SJ25C1 및 HD37이 알려져 있다. (SJ25C1: Bejcek et al. Cancer Res 2005, PMID 7538901; HD37: Pezutto et al. JI 1987, PMID 2437199).
스페이서
구체예에서, 키메릭 리셉터 핵산은 스페이서 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 놀라웁게도, 시그널링 능력을 갖지 않는 것으로 추정되는 스페이서 영역의 길이가 키메릭 리셉터를 발현하기 위해 변성된 T 세포의 생체내 효능에 영향을 미치고 최적 종양 또는 표적 세포 인지를 위한 개별 표적 분자에 맞추어져야 하는 것을 발견하였다. 구체예에서, 키메릭 리셉터 핵산은 스페이서 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리에서 선택된 맞춤가능한 스페이서 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 구체예에서, 스페이서 길이는 에피토프의 위치, 항체의 에피토프에 대한 친화도, 및/또는 항원 인지에 대응하여 시험관내 및/또는 생체내 증식하는 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포의 능력에 기초하여 선택된다.
전형적으로 스페이서 영역은 리간드 결합 도메인과 키메릭 리셉터의 막통관 도메인 사이에서 발견된다. 구체예에서, 스페이서 영역은 리간드 결합 도메인의 융통성을 제공하고 림프구에서 고도의 발현농도를 가능하게 한다. 약 229 아미노산의 스페이서 도메인을 갖는 CD19-특이적 키메릭 리셉터는 단지 변성된 IgG4 힌지로 구성된 짧은 스페이서 영역을 갖는 CD19-특이적 키메릭 리셉터보다 더 낮은 항종양 활성을 갖는다. 다른 키메릭 리셉터, 예컨대 R12 또는 2A2 scFv로부터 구성된 것들 또한 T 세포 이팩터 작용을 최적 촉발하는 짧은 스페이서를 필요로 하지만, R11 ROR1 scFv로 구성된 키메릭 리셉터는 종양 인지를 위해 약 229 아미노산의 긴 스페이서 도메인을 필요로 한다.
구체예에서, 스페이서 영역은 적어도 약 10 내지 229 아미노산, 약 10 내지 200 아미노산, 약 10 내지 175 아미노산, 약 10 내지 150 아미노산, 약 10 내지 125 아미노산, 약 10 내지 100 아미노산, 약 10 내지 75 아미노산, 약 10 내지 50 아미노산, 약 10 내지 40 아미노산, 약 10 내지 30 아미노산, 약 10 내지 20 아미노산, 또는 약 10 내지 15 아미노산을 가지며, 열거된 범위들의 종말점 사이 정수를 포함한다. 구체예에서, 스페이서 영역은 약 12 아미노산 이하, 약 119 아미노산 이하, 또는 약 229 아미노산 이하이다.
일부 구체예에서, 스페이서 영역은 면역글로불린 유사 분자의 힌지영역에서 유도된다. 구체예에서, 스페이서 영역은 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3, 또는 인간 IgG4 유래의 힌지영역 전체 또는 일부를 포함하고, 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 힌지영역의 예시적인 서열을 표 8에 나타내었다. 구체예에서, 힌지영역의 일부는 가변 경쇄와 코어 사이에서 발견된 상부 힌지 아미노산을 포함하고, 코어 힌지 아미노산은 폴리프롤린 영역을 포함한다. 전형적으로, 상부 힌지영역은 약 3 내지 10 아미노산을 갖는다. 일부 경우에서, 스페이서 영역은 아미노산 서열 X1PPX2P(서열번호: 1)를 포함한다. 구체예에서, X1은 시스테인, 글리신, 또는 아르기닌이고 X2는 시스테인 또는 트레오닌이다.
구체예에서, 힌지영역 서열은 바람직하지 않은 구조적 상호작용, 예컨대 다이머화(dimerization)를 방지하기 위해 하나 이상의 아미노산이 변성될 수 있다. 특정한 구체예에서, 스페이서 영역은, 예를 들어 표 2 또는 표 8(서열번호:21)에 나타낸 바와 같이 IgG4의 변성된 인간 힌지영역 일부를 포함한다. 변성된 IgG4 힌지영역의 일부를 코딩하는 대표적인 폴리뉴클레오티드를 표 1에 나타내었다.(서열번호: 4). 구체예에서, 힌지영역은 표 2 또는 표 8에 나타낸 힌지영역 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 92%, 95%, 또는 100% 서열 동일성을 가질 수 있다. 특정 구체예에서, IgG4의 인간 힌지영역 일부는 CPSP 내지 CPPC의 코어 아미노산에서 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, 힌지영역의 전체 또는 일부는 면역글로불린 정상 영역의 하나 이상의 도메인과 결합된다. 예를 들어, 힌지영역의 일부는 CH2 또는 CH3 도메인 또는 그의 변이체 전체 또는 일부와 결합될 수 있다. 구체예에서, 스페이서 영역은 CD8apha로부터의 47-48 아미노산 힌지영역 서열 또는 CD28 분자의 세포외 일부로 구성되는 스페이서 영역을 포함하지 않는다.
구체예에서, 짧은 스페이서 영역은 약 12 아미노산 이하이고 IgG4 힌지영역 서열 또는 그의 변이체 전체 또는 일부를 포함하며, 중간 스페이서 영역은 약 119 아미노산 이하이고 IgG4 힌지영역 서열 및 CH3 영역 또는 그의 변이체 전체 또는 일부를 포함하고, 긴 스페이서는 약 229 아미노산 이하이고 IgG4 힌지영역 서열, CH2 영역, 및 CH3 영역 또는 그의 변이체 전체 또는 일부를 포함한다.
스페이서 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 아미노산 서열로부터 합성 또는 재조합 방법으로 용이하게 제조할 수 있다. 구체예에서, 스페이서 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 막통관 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 구체예에서, 스페이서 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한 용이한 절제 및, 폴리뉴클레오티드를 상이한 스페이서 영역을 코딩하는 다른 폴리뉴클레오티드로 대체하는 것을 제공하기 위해 코딩 서열의 5' 및/또는 3' 말단에서 하나 이상의 제한효소 부위를 가질 수도 있다. 구체예에서, 스페이서 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 포유동물 세포에서의 발현에 코돈 최적화된다.
구체예에서, 상이한 스페이서 영역을 각각 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리가 제공된다. 구체예에서, 스페이서 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 또는 이들 일부로부터의 힌지영역 서열, CH2 영역 또는 그의 변이체 전체 또는 일부와 결합한 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 힌지영역 서열, CH3 영역 또는 그의 변이체 전체 또는 일부와 결합한 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 힌지영역 서열, 및 CH2 영역 또는 그의 변이체, 및 CH3 영역 또는 그의 변이체 전체 또는 일부와 결합한 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 힌지영역 서열로 구성되는 군에서 선택된다. 구체예에서, 짧은 스페이서 영역은 12 아미노산 이하를 갖는 변성 IgG4 힌지 서열(서열번호: 4)이고, 중간 서열은 119 아미노산 이하의 CH3 서열을 갖는 IgG4 힌지 서열(서열번호: 49); 또는 229 아미노산 이하의 CH2 및 CH3 영역을 갖는 IgG4 힌지 서열(서열번호: 50)이다.
구체예에서, 키메릭 리셉터를 위한 스페이서 영역을 선택하는 방법이 본 원에서 제공된다. 놀라웁게도, 일부 키메릭 리셉터 구조물은 T 세포와 시험관 내에서 종양 세포의 직접적인 그의 사멸을 활성화하는데 효과적이지만 생체내에서는 효과적이지 않다. 또한, 키메릭 리셉터 변성 T 세포의 부작용 특성은 더 많은 세포가 활성화 유도 세포사하거나 생체내 사이토킨의 증가를 유발하는 것 등일 수 있다. 구체예에서, 다수의 키메릭 리셉터 핵산을 제공하고(여기서 키메릭 리셉터 핵산은 스페이서 영역에서만 다르다); 각각의 키메릭 리셉터 핵산을 별도 T 림프구 개체군에 도입하고; 시험관 내 각각의 별도 림프구 개체군을 증폭하여 T 세포가 발현될 때 키메릭 리셉터 각각의 항종양 효능을 결정하기 위해 종양이 있는 동물에 림프구 개체군 각각을 도입하고, 다른 키메릭 리셉터 각각으로 변성된 다른 별도 림프구 개체군 각각과 비교하여 항종양 효능을 제공하는 키메릭 리셉터를 선별하는 방법을 포함한다.
상이한 종양의 동물 모델이 알려져 있다. 항종양 효능은 종양 크기의 감소 확인, 동물 사멸, 생체 내에서 유전적으로 변성된 T 세포의 지속성, (예를 들어, CD25 및/CD69 발현 증가의 검출에 의한)유전적으로 변성된 T 세포의 활성화, 및/또는 생체 내에서 유전적으로 변성된 T 세포의 증식을 결정하여 측정할 수 있다. 구체예에서, 키메릭 리셉터는 이러한 매개변수들 중 하나 이상으로 측정된 생체 내 최고의 항종양 효능을 제공하는 것을 선택한다. 항종양 효능의 결핍은 유전적으로 변성된 림프구의 생체 내 지속성의 결핍, 동물 사멸, 카스파제(caspase)-3 유도 증가로 측정된 아폽토시스의 증가 및/또는 유전적으로 변성된 림프구 증식의 감소로 측정할 수 있다.
다른 구체예에서, 스페이서를 선별하는 방법은 표적 분자의 에피토프를 선별하고 세포막에 대하여 에피토프의 위치를 특성화하고, 세포막에 대하여 에피토프 위치에 따라 길거나 짧은 스페이서 영역을 선별하고, 대조 항체보다 높거나 낮은 에피토프에 대한 친화도를 갖는 항체 또는 그의 단편을 선별하고, 키메릭 리셉터 구조물이 시험관 내 및/또는 생체 내에서 증가된 T 세포 증식 및/또는 사이토킨 생성을 제공하는지를 결정하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 표적 에피토프 또는 그의 일부가 막에 근접하여 위치하면 이것은 막통관 도메인에 인접한 세포외 도메인의 선형 서열의 최초 100 아미노산 내에 위치한다. 에피토프가 막에 근접하여 위치하면 긴 스페이서(예를 들어, 229 아미노산 이하 및 119 아미노산 초과)가 선택된다. 일부 구체예에서, 표적 에피토프가 막에 대해 멀리 위치하면, 이것은 세포외 도메인 말단의 선형 서열의 최초 150 아미노산 내에 위치한다. 에피토프가 막에 대해 멀리 있으면 중간 또는 짧은 스페이서가 선택된다(예를 들어, 119 아미노산 이하 또는 12-15 아미노산 이하). 경우에 따라, 에피토프가 막에 근접하는지 또는 원위인지는 3차원 구조의 모델링으로 결정하거나 결정 구조의 분석에 기초할 수 있다.
일부 구체예에서, 키메릭 리셉터는 시험관 내 및/또는 생체 내에서 2세대에 결쳐 증식하는 세포 적어도 30%를 제공하는 것을 선택한다. 다른 구체예에서, 키메릭 리셉터가 72시간 내에 활성화유도세포사을 일으키는 세포 적어도 50%를 유발한다면 이를 선택하지 않는다. 구체예에서, 에피토프가 막에서 멀리 있는 경우 짧은 스페이서(예를 들어, 15 아미노산 이하)가 선택된다. 구체예에서, 에피토프가 막에 근접하면 긴 스페이서(예를 들어, 229 아미노산 이하이거나 119 아미노산 초과)가 선택된다.
구체예에서, 키메릭 리셉터 핵산이 스페이서 영역에서만 다른 다수의 키메릭 리셉터 핵산을 제공하는 것은 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(여기서 리간드는 종양 특이적 항원, 바이러스 항원, 또는 림프구에 의한 인지 및 제거를 매개하는데 적합한 표적 세포군에서 발현된 다른 분자이다); 제1 폴리펩티드 스페이서 코딩 서열의 5' 및 3' 말단에 정의된 제한부위를 갖는 제1 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막통관 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 하나 이상의 세포내 시그널링 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메릭 리셉터 구조물을 제공하는 것을 포함한다.
구체예에서, 방법은 각각 상이한 스페이서 영역을 코딩하는, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 포함한다. 구체예에서, 상이한 스페이서 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 또는 그의 변이체 또는 그의 일부의 힌지영역 서열, CH2 영역 또는 그의 변이체 전체 또는 일부와 결합한 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터의 힌지영역 서열, CH3 영역 또는 그의 변이체 전체 또는 일부와 결합한 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터의 힌지영역 서열, 및 CH2 영역 또는 그의 변이체 및 CH3 영역 또는 그의 변이체 전체 또는 일부와 결합한 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터의 힌지영역 서열로 구성되는 군에서 선택된다. 구체예에서, CH2 또는 CH3 영역은 림프구 내 발현을 제공하거나/하고 다른 분자와의 상호작용을 최소화하기 위해 하나 이상의 결실 또는 아미노산 치환에 의해 변성될 수 있다. 구체예에서, 힌지영역의 일부는 적어도 상부 아미노산과 코어 서열을 포함한다. 구체예에서, 힌지영역은 서열 X1PPX2P를 포함한다.
구체예에서, 방법은 스페이서 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 상이한 스페이서 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 대체하여 상이한 스페이서 영역을 갖는 키메릭 리셉터 핵산을 형성하는 것을 추가로 포함한다. 본 방법은 각각 스페이서 영역이 상이한, 임의 수의 키메릭 리셉터 핵산을 형성하기 위해 반복할 수 있다. 구체예에서, 키메릭 리셉터 핵산은 스페이서 영역에서만 서로 다르다.
막통관 도메인
구체예에서, 키메릭 리셉터 핵산은 막통관 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 막통관 도메인은 막 내에서 키메릭 리셉터의 고정을 제공한다.
구체예에서, 키메릭 리셉터 내 도메인들 중 하나와 자연적으로 결합된 막통관 도메인이 사용된다. 일부 경우에, 막통관 도메인은 선택하거나, 같거나 다른 표면막 단백질의 막통관 도메인에 이러한 도메인들이 결합하는 것을 방지하기 위해 아미노산 치환으로 변성하여 리셉터 컴플렉스의 다른 성분들과의 상호작용을 최소화할 수 있다.
막통관 도메인은 자연 또는 합성 공급원으로부터 유도될 수 있다. 자연적 공급원이면 도메인은 막-결합 또는 막통관 단백질로부터 유도될 수 있다. 막통관 영역은 적어도 T 세포 리셉터의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3, CD45, CD4, CD8, CD9, CD16, CD22; CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154의 막통관 영역(들)을 포함한다. 특정 구체예에서, 막통관 도메인은 표 2에 나타낸 CD28 막통관 도메인의 아미노산 서열을 포함한다. CD28 막통관 도메인을 코딩하는 대표적인 폴리뉴클레오티드 서열을 표 1에 나타내었다(서열번호: 5).
막통관 도메인은 합성이거나 자연적으로 발생한 막통관 도메인의 변이체일 수 있다. 구체예에서, 합성 또는 변이체 막통관 도메인은 루신과 발린 같은 우세하게 소수성인 잔기를 포함한다. 구체예에서, 막통관 도메인은 표 2 또는 표 6에 나타낸 막통관 도메인과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 변이체 막통관 도메인은 바람직하게 Kyte Doolittle로 계산된 적어도 50의 소수성 점수를 갖는다.
막통관 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 합성 또는 재조합 방법으로 용이하게 제조할 수 있다. 구체예에서, 막통관 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포내 시그널링 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 구체예에서, 막통관 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한 용이한 절제 및, 상이한 막통관 도메인을 코딩하는 다른 폴리뉴클레오티드로 막통관 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 대체를 제공하기 위해 코딩 서열의 5' 및/또는 3' 말단에 하나 이상의 제한효소 부위를 가질 수 있다. 구체예에서, 막통관 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는는 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다.
세포내 시그널링 도메인
구체예에서, 키메릭 리셉터 핵산은 세포내 시그널링 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 세포내 시그널링 도메인은 종양세포에서 발현된 리간드에 결합할 때 키메릭 리셉터를 발현하는 형질도입된 세포 작용의 활성화를 제공한다. 구체예에서, 세포내 시그널링 도메인은 하나 이상의 세포내 시그널링 도메인을 함유한다. 구체예에서, 세포내 시그널링 도메인은 적어도 하나의 형질도입된 세포 작용을 제공하는 세포내 시그널링 도메인의 일부 및/또는 변이체이다.
본 발명의 키메릭 리셉터에서 사용하기 위한 세포내 시그널링 도메인의 예는 CD3 제타 사슬의 세포질 서열, 및/또는 키메릭 리셉터 결합 후에 시그널 형질도입을 개시하는데 함께 작용하는 공동 리셉터뿐만 아니라 이러한 서열의 유도체 또는 변이체 및 동일한 작용 능력을 갖는 합성 서열을 포함한다. T 세포 활성화는 세포질 시그널링 서열: 항원 의존성 1차 활성화를 개시하는 것들의 2개의 별도 부류로 매개되고 T 세포 유사 시그널(프라이머리 세포질 시그널링 서열) 및 제2 또는 공동자극 시그널을 제공하기 위해 항원 독립적 방법으로 작용하는 것들(2차 세포질 시그널링 서열)을 제공한다고 말할 수 있다. 자극 방식으로 작용하는 프라이머리 세포질 시그널링 서열은 리셉터 티로신계 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 시그널링 모티프를 함유할 수 있다. 프라이머리 세포질 시그널링 서열을 함유하는 ITAM의 예는 CD3 제타, FcR 감마, CD3 감마, CD3 델타, CD3 입실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d에서 유도된 것들을 포함한다. 구체예에서, 프라이머리 시그널링 세포내 도메인은 표 2에 제공된 서열을 갖는 CD3제타에 대하여 적어도 약 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 구체예에서, CD3 제타의 변이체는 표 7에 나타낸 ITAM 영역 적어도 1, 2, 3 또는 전부를 함유한다.
바람직한 구체예에서, 키메릭 리셉터의 세포내 시그널링 도메인은 단독으로 또는 다른 목적하는 세포질 도메인(들)과 조합된 CD3-제타 시그널링 도메인을 포함하도록 설계할 수 있다. 예를 들어, 키메릭 리셉터의 세포내 시그널링 도메인은 CD3제타 사슬 및 공동자극 시그널링 영역을 포함할 수 있다.
공동자극 시그널링 영역은 공동자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 키메릭 리셉터의 일부를 지칭한다. 공동자극 분자는 항원 리셉터 또는, 림프구의 항원에 대한 반응에 필요한 그의 리간드 이외의 세포표면분자이다. 이러한 분자들의 예는 CD27, CD28, 4-1BB(CD 137), OX40, CD30, CD40, 림프구 작용-연관 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드이다. 구체예에서, 공동자극 시그널링 도메인은 표 5에 나타낸 CD28의 세포내 도메인 또는 표 2에 제공된 서열을 갖는 4-1BB에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 구체예에서, CD28 세포내 도메인의 변이체는 위치 186-187에 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 LL은 GG로 치환된다.
키메릭 리셉터의 세포내 시그널링 서열을 서로 무작위로 또는 특정 순서로 연결할 수 있다. 임의로, 짧은, 바람직하게 2 내지 10 아미노산 길이의 올리고- 또는 폴리펩티드 링커가 결합을 형성할 수 있다. 일 구체예에서, 세포내 시그널링 도메인은 CD3-제타 또는 그의 변이체의 시그널링 도메인 전체 또는 일부 및 CD28 또는 그의 변이체의 시그널링 도메인 전체 또는 일부를 포함한다. 다른 구체예에서, 세포내 시그널링 도메인은 CD3-제타 또는 그의 변이체의 시그널링 도메인 전체 또는 일부 및 4-1BB 또는 그의 변이체의 시그널링 도메인 전체 또는 일부를 포함한다. 또다른 구체예에서, 세포내 시그널링 도메인은 CD3-제타 또는 그의 변이체의 시그널링 도메인 전체 또는 일부, CD28 또는 그의 변이체의 시그널링 도메인 전체 또는 일부, 및 4-1BB 또는 그의 변이체의 시그널링 도메인 전체 또는 일부를 포함한다. 특정 구체예에서, CD3제타 변이체를 포함하는 세포내 시그널링 도메인과 4-1BB 세포내 시그널링 도메인 일부의 아미노산 서열을 표 2에 나타내었다. 대표적인 핵산 서열을 표 1에 기재하였다(서열번호: 6; 서열번호: 7).
구체예에서, 세포내 시그널링 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CD3제타 도메인의 일부에 연결된 4-1BB 세포내 도메인을 포함한다. 다른 구체예에서, 4-1BB 세포내 도메인과 CD28 세포내 도메인은 CD3 제타 도메인의 일부에 연결된다.
세포내 시그널링 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 합성 또는 재조합 방법에 의해 아미노산 서열로부터 용이하게 제조할 수 있다. 구체예에서, 세포내 시그널링 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 또한 용이한 절제 및, 세포내 시그널링 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 상이한 세포내 시그널링 도메인을 코딩하는 또다른 폴리뉴클레오티드로 대체하는 것을 제공하기 위해 코딩 서열의 5' 및/또는 3' 말단에 하나 이상의 제한효소 부위를 가질 수 있다. 구체예에서, 세포내 시그널링 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다.
마커 서열
구체예에서, 키메릭 리셉터 핵산은 임의로 마커 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 마커 서열은 형질도입된 세포, 및 형질전환된 세포의 확인을 제공할 수 있다. 구체예에서, 마커 서열은 링커 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된다. 구체예에서, 링커 서열은 분해가능한 링커 서열이다.
수많은 상이한 마커 서열들이 사용될 수 있다. 전형적으로 마커 서열은 형질도입된 세포의 선택 및/또는 형질도입된 세포의 검출을 가능하게 하는 작용특성을 갖는다. 구체예에서, 마커 서열은 인간 림프구의 형질도입과 양립할 수 있다.
양성 선택가능 마커는 유전자일 수 있고, 숙주세포에 도입될 때 유전자를 수반하는 세포의 양성 선택을 허용하는 우성 표현형을 발현한다. 이러한 종류의 유전자들이 당분야에 알려져 있으며, 특히 하이그로마이신(hygromycin) B에 대한 내성을 제공하는 하이그로마이신-B 포스포트랜스퍼라제 유전자(hph), 항생물질 G418에 대한 내성을 코딩하는 Tn5로부터의 아미노 글리코시드 포스포트랜스퍼라제 유전자(neo 또는 aph), 디하이드로폴레이트(dihydrofolate) 리덕타제(DHFR) 유전자, 아데노신 데아미나제 유전자(ADA), 및 다중약물 내성(MDR) 유전자를 포함한다.
구체예에서, 키메릭 리셉터 핵산은 또한 마커 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 구체예에서, 마커 서열은 표 2에 나타낸 둔단된 상피성장인자 리셉터이다. 둔단된 상피성장인자 리셉터의 예시적인 폴리뉴클레오티드를 표 1에 나타내었다(서열번호: 9). 구체예에서, 마커 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 링커 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 특정 구체예에서, 링커 서열은 표 2에 나타낸 분해가능한 링커 서열 T2A이다. T2A 링커를 코딩하는 예시적인 폴리뉴클레오티드 서열을 표 1에 나타내었다(서열번호: 8).
마커 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 합성 또는 재조합 방법에 의해 아미노산 서열로부터 용이하게 제조할 수 있다. 구체예에서 마커 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 세포내 시그널링 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 구체예에서, 마커 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 용이한 절제 및, 마커 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상이한 마커 서열을 코딩하는 다른 폴리뉴클레오티드로의 대체를 제공하기 위해 코딩 서열의 5' 및/또는 3' 말단에 하나 이상의 제한효소 부위를 가질 수 있다. 구체예에서, 마커 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 포유동물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다.
벡터, 세포 및 세포의 형질도입 방법
T 림프구 개체군의 선택 및 분류(Sorting)
본 원에 기술된 조성물은 CD4+ 및/또는 CD8+ T 림프구를 제공한다. T 림프구는 공지된 방법으로 수집하여 공지된 기술, 예컨대 유동세포계수법 같은 항체에 대한 친화성 결합 및/또는 면역자성 선택으로 농축 또는 고갈될 수 있다. 농축 및/또는 고갈 단계 후에 목적하는 T 림프구의 시험관내 증폭을 공지된 기술(예를 들어, 비제한적으로 미국 특허 제6,040,177호(Riddell 등)에 기술된 방법), 또는 당업자들에게 자명한 그의 변형방법으로 수행할 수 있다. 구체예에서, T 세포는 환자에게서 얻어진 자가(autologous) T 세포이다.
예를 들어, 목적하는 T 세포군 또는 서브 개체군은 초기 T 림프구 개체군을 시험관 내 배양배지에 첨가한 다음, 배양배지 공급체(feeder) 세포, 예컨대 미분열 말초혈액 단핵 세포(PBMC)에 첨가하고(예를 들어, 얻어진 세포 개체군이 증폭될 초기 개체군 내 각 T 림프구에 대해 적어도 약 5, 10, 20, 또는 40 이상의 PBMC 공급체 세포를 함유하도록), 배양물을 (예를 들어, T 세포의 수를 증폭하는데 충분한 시간 동안)인큐베이션하여 증폭할 수 있다. 미분열 공급체 세포는 감마선 조사된 PBMC 공급체 세포를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, PBMC는 세포 분열을 방지하기 위해 약 3000 내지 3600 rad 범위의 감마선으로 조사된다. T 세포와 공급체 세포를 배양배지에 첨가하는 순서는 필요에 따라 반전될 수 있다. 배양물은 전형적으로 T 림프구의 성장에 적합한 온도 등의 조건 하에서 인큐베이션할 수 있다. 인간 T 림프구의 성장에 있어서, 예를 들어 온도는 일반적으로 적어도 약 25 ℃, 바람직하게 적어도 약 30 ℃, 더욱 바람직하게 약 37 ℃이다.
증폭된 T 림프구는 인간 종양 또는 병원체 상에 존재하는 항원에 특이적일 수 있는 CD4+ 헬퍼 T 림프구 및 CD8+ 세포독성 T 림프구(CTL)를 포함한다.
임의로, 증폭 방법은 미분열 EBV-형질전환된 림프아구성(lymphoblastoid) 세포 (LCL)를 공급체 세포로서 첨가하는 단계를 포함한다. LCL은 감마선으로 약 6000 내지 10,000 rad의 범위로 조사할 수 있다. LCL 공급체 세포는 적합한 양, 예컨대 적어도 약 10:1의 LCL 공급체 세포 대 초기 T 림프구 비율로 제공할 수 있다.
임의로, 증폭 방법은 또한 항-CD3 및/또는 항 CD28 항체를 배양배지에 (예를 들어 적어도 약 0.5 ng/ml의 농도로)첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 임의로, 증폭 방법은 또한 1L-2 및/또는 항 1L-15를 배양배지에 첨가하는 단계를 포함할 수 있다(예를 들어, 여기서 1L-2의 농도는 적어도 약 10 units/ml이다).
T 림프구를 단리한 후, 세포독성 및 헬퍼 T 림프구 둘다를 천연, 기억 및 이팩터 T 세포 서브개체군으로 증폭 전 또는 후에 분류할 수 있다.
CD8+ 세포는 표준방법을 사용하여 얻을 수 있다. 일부 구체예에서, CD8+ 세포는 또한 천연, 중추 기억, 및 이팩터 기억 세포로 이러한 종류의 CD8+ 세포와 연관된 세포표면항원을 동정하여 분류된다. 구체예에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초혈액 림프구의 CD62L+ 및 CD62L- 서브세트에 존재한다. PBMC는 항-CD8 및 항-CD62L 항체로 염색한 후 CD62L-CD8+ 및 CD62L+CD8+ 분획으로 분류된다. 일부 구체예에서, 중추 기억 TCM의 표현형 마커의 발현은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, 및 CD127을 포함하고 그랜자임(granzyme) B에 대해 음성이거나 낮다. 일부 구체예에서, 중추 기억 T 세포는 CD45RO+, CD62L+, CD8+ T 세포이다. 일부 구체예에서, 이팩터 TE는 CD62L, CCR7, CD28, 및 CD127에 음성이고 그랜자임 B와 퍼포린(perforin)에 대해 양성이다. 일부 구체예에서, 천연 CD8+ T 림프구는 CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD127, 및 CD45RA를 포함하는 천연 T 세포의 표현형 마커의 발현을 특징으로 한다.
세포 또는 세포군이 특정 세포표면마커에 대해 양성인지는 표면 마커에 대한 특이적 항체와 이소형(isotype) 매칭 대조 항체로의 염색을 사용하는 유동세포계수법으로 결정할 수 있다. 마커에 대해 음성인 세포군은 이소형 대조군 상에서 특이적 항체로의 상당한 세포군 염색 부재를 나타내고, 양성은 이소형 대조군 상에서 세포군의 균일한 염색을 나타낸다. 일부 구체예에서, 하나 또는 마커들의 발현 감소는 1 loglO의 평균형광강도 손실 및/또는, 참조 세포군과 비교하여 적어도 약 20%의 세포, 25%의 세포, 30%의 세포, 35%의 세포, 40%의 세포, 45%의 세포, 50%의 세포, 55%의 세포, 60%의 세포, 65%의 세포, 70%의 세포, 75%의 세포, 80%의 세포, 85%의 세포, 90%의 세포, 95%의 세포, 및 100%의 세포 및 20 내지 100% 사이의 임의 백분율의 마커를 나타내는 세포 비율의 감소를 나타낸다. 일부 구체예에서, 하나 또는 마커들에 양성인 세포군은 참조 세포군과 비교하여 적어도 약 50%의 세포, 55%의 세포, 60%의 세포, 65%의 세포, 70%의 세포, 75%의 세포, 80%의 세포, 85%의 세포, 90%의 세포, 95%의 세포, 및 100%의 세포 및 50 내지 100% 사이의 임의 백분율의 마커를 나타내는 세포 비율을 지칭한다.
CD4+ T 헬퍼 세포는 세포표면항원을 갖는 세포군을 동정하여 천연, 중추 기억 및 이팩터 세포로 분류된다. CD4+ 림프구는 표준 방법으로 얻을 수 있다. 일부 구체예에서, 천연 CD4+ 림프구는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+ T 세포이다. 일부 구체예에서, 중추 기억 CD4+ 세포는 CD62L+ 및 CD45RO+이다. 일부 구체예에서, 이팩터 CD4+ 세포는 CD62L- 및 CD45RO-이다.
구체예에서, 항원 특이적인 CD4+와 CD8+의 개체군은 천연 또는 항원 특이적 T 림프구를 항원으로 자극하여 얻을 수 있다. 예를 들어, 항원-특이적 T 세포주 또는 클론들은 사이토메갈로바이러스 항원에 대해 T 세포를 감염된 대상에서 단리하고 시험관 내 세포를 동일한 항원으로 자극하여 생성할 수 있다. 천연 T 세포를 사용할 수도 있다. 임의 수의 종양세포 항원을 표적으로 사용하여 T 세포 반응을 유도할 수 있다. 일부 구체예에서, 양자 세포 면역요법 조성물은 고형 종양, 혈액학적 악성종양, 유방암 또는 흑색종 등의 질환 또는 장애의 치료에 유용하다.
T 림프구 개체군의 변성
일부 구체예에서, 본 발명에 따른 면역요법에서 사용될 T 세포에 작용성 유전자를 삽입하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 삽입 유전자 또는 유전자들은 전달된 T 세포의 생존력 및/또는 작용을 촉진하여 요법의 효능을 개선하거나; 생체내 생존 또는 이동의 선택 및/또는 평가를 허용하는 유전적 마커를 제공하거나; 예를 들어 문헌[Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); 및 Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)]에 기술된 바와 같이 세포가 생체내 음성 선택에 민감하게 하는 등으로 면역요법의 안정성을 개선하는 작용을 결합할 수 있다; 우성 양성 선택 마커와 음성 선택 마커를 융합하여 유도된 2작용성 선택가능한 융합 유전자의 사용을 기술한 Lupton 등의 PCT/US91/08442 및 PCT/US94/05601 참조. 이것은 공지된 방법(예를 들어, Riddell 등의 미국 특허 제6,040,177호 14-17 컬럼 참조) 또는 본 발명에 기초하여 당업자들에게 자명한 그의 변형으로 수행될 수 있다.
구체예에서, T 세포는 본 원에 기술된 바와 같이 키메릭 리셉터로 변성된다. 일부 구체예에서, T 세포는 치료 대상에서 얻어지며, 다른 구체예에서, 림프구는 동종이계 인간 공여자, 바람직하게 건강한 인간 공여자로부터 얻어진다.
일부 구체예에서, 키메릭 리셉터는 종양세포표면분자에 특이적으로 결합하는 리간드 결합 도메인, 폴리펩티드 스페이서 영역, 막통관 도메인 및 본 원에 기술된 세포내 시그널링 도메인을 포함한다. 구체예에서, 리간드 결합 도메인은 모노클로날 항체(mAb)의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)로부터 유도된 단일사슬 항체 단편(scFv)이다. 공동자극 시그널은 또한 키메릭 리셉터를 통해서 CD28 및/또는 4-1BB의 공동자극 도메인을 CD3ζ 사슬에 융합하여 제공할 수 있다. 키메릭 리셉터는 HLA와 별개인 세포표면분자에 특이적이고, 따라서 종양 세포 상에서 HLA-제한 및 낮은 수준의 HLA-발현을 포함한 TCR-인지의 제한을 극복한다.
키메릭 리셉터는, 예를 들어 항체 분자의 항원결합단편 또는 항체 가변 도메인을 사용하여 세포표면마커에 대한 특이성으로 구성될 수 있다. 항원결합분자는 하나 이상의 세포 시그널링 모듈에 연결될 수 있다. 구체예에서, 세포 시그널링 모듈은 CD3 막통관 도메인, CD3 세포내 시그널링 도메인, 및 CD28 막통관 도메인을 포함한다. 구체예에서, 세포내 시그널링 도메인은 CD3 제타 세포내 도메인에 연결된 CD28 막통관 및 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 키메릭 리셉터는 또한 tEGFR 같은 형질도입 마커를 포함할 수 있다.
구체예에서, 같거나 다른 키메릭 리셉터를 CD4+ 및 CD8+ T 림프구의 개체군 각각에 삽입할 수 있다. 구체예에서, 각각의 이러한 개체군 내 키메릭 리셉터는 종양 또는 감염 세포 상의 동일 리간드에 특이적으로 결합하는 리간드 결합 도메인을 갖는다. 세포 시그널링 모듈은 다를 수 있다. 구체예에서, CD8+ 세포독성 T 세포의 세포내 시그널링 도메인은 CD4+ 헬퍼 T 세포의 세포내 시그널링 도메인과 같다. 다른 구체예에서, CD8+ 세포독성 T 세포의 세포내 시그널링 도메인은 CD4+ 헬퍼 T 세포의 세포내 시그널링 도메인과 다르다.
구체예에서 CD4 또는 CD8 T 림프구 각각은 본 원에 기술된 형질도입 전에 천연, 중추 기억, 이팩터 기억 또는 이팩터 세포로 분류될 수 있다. 대안적인 구체예에서, CD4 또는 CD8 T 림프구 각각은 형질도입 후에 천연, 중추 기억, 이팩터 기억 또는 이팩터 세포로 분류될 수 있다.
유전자 전달에 재조합 감염성 바이러스 입자를 사용하는 다양한 형질도입 방법이 개발되고 있다. 이것은 본 발명의 T 림프구의 형질도입에 대한 현재 바람직한 방법이다. 이 방법에서 사용된 바이러스 벡터는 원숭이(simian) 바이러스 40, 아데노바이러스, 아데노-결합 바이러스(AAV), 렌티바이러스 벡터, 및 레트로바이러스를 포함한다. 따라서, 유전자 전달 및 발현 방법은 다양하지만, 본질적으로 포유동물 세포에서 유전자 물질을 삽입하고 발현하도록 작용한다. 상기한 기술들 중 몇 가지는 조혈 또는 림프 세포를 형질도입하기 위해 사용되며, 예를 들어 칼슘 포스페이트 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 및 재조합 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스 및 레트로바이러스 벡터로의 감염이다. 프라이머리 T 림프구는 성공적으로 전기천공 및 레트로바이러스성 또는 렌티바이러스성 감염으로 형질도입된다.
레트로바이러스와 렌티바이러스 벡터는 원핵세포에 유전자 전달을 위한 매우 효과적인 방법을 제공한다. 또한, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 통합은 제어된 형태로 일어나며 세포 당 하나 또는 적은 수의 새로운 유전자 정보 카피의 안정한 통합을 생성한다.
자극인자(예를 들어, 림포카인(lymphokine) 또는 사이토킨)의 과발현은 치료된 개체에 독성이 될 수도 있다. 그러므로, 본 발명의 T 세포가 생체내 음성 선택에 영향받도록 하는 유전자 세그먼트를 포함하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다. "음성 선택"이란 주입된 세포가 개체의 생체내 조건의 변화로 인하여 제거될 수 있는 것을 의미한다. 음성 선택가능 표현형은 투여된 제제, 예를 들어 화합물에 대한 민감성을 제공하는 유전자의 삽입에서 기인할 수 있다. 음성 선택가능 유전자는 당분야에 공지되어 있으며, 특히 다음을 포함한다: 간사이클로비르(ganciclovir) 민감성을 제공하는 단순 헤르페스 바이러스 타입 I 티미딘 키나제(HSV-I TK) 유전자; 세포 하이포잔틴 포스포리보실트랜스퍼라제(HPRT) 유전자, 세포 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(APRT) 유전자, 및 박테리아 사이토신 데아미나제(deaminase).
일부 구체예에서 시험관 내에서 음성 선택가능 표현형의 세포 선택을 가능하게 하는 양성 마커를 T 세포 내에 포함하는 것이 유용할 수 있다. 양성 선택가능 마커는 숙주세포 내에 도입되었을 때 유전자를 갖는 세포의 양성 선택을 허용하는 우성 표현형을 발현하는 유전자일 수 있다. 이러한 종류의 유전자가 당업계에 알려져 있으며, 특히 하이그로마이신 B에 대한 내성을 제공하는 하이그로마이신-B 포스포트랜스퍼라제 유전자(hph), 항생물질 G418에 대한 내성을 코딩하는 Tn5 유래의 아미노 글리코시드 포스포트랜스퍼라제 유전자(neo 또는 aph), 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자, 아데노신 데아미나제 유전자(ADA), 및 다중약물 내성(MDR) 유전자를 포함한다.
당분야에 알려진 바와 같이 T 림프구를 형질도입하기 위해 다양한 방법들을 사용할 수 있다. 구체예에서, 형질도입은 렌티바이러스 벡터를 사용하여 수행한다.
구체예에서, CD4+ 및 CD8+ 세포 각각은 키메릭 리셉터를 코딩하는 발현벡터로 개별적으로 변성하여 정의된 개체군을 형성한다. 구체예에서, 세포들은 이후에 이 세포군들 각각에 대해 고유한 세포표면항원으로 분류하여 상기한 바와 같은 천연, 중추 기억 및 이팩터 세포의 서브개체군으로 다시 분류된다. 또한, CD4+ 또는 CD8+ 세포군은 그의 사이토킨 특성 또는 증식 활성에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 항원으로 자극되었을 때 가장(sham) 형질도입 세포 또는 형질도입 CD8+ 세포와 비교하여 IL-2, IL-4, IL-10, TNFα, 및 IFNγ 같은 사이토킨의 생산을 증강하는 CD4+ T 림프구를 선택할 수 있다. 다른 구체예에서, IL-2 및/또는 TNFα의 생산을 증강하는 천연 또는 중추 기억 CD4+ T 세포가 선택된다. 마찬가지로, IFNγ 생산을 증강하는 CD8+ 세포가 가장 형질도입 CD 8+ 세포와의 비교로 선택된다.
구체예에서, 항원 또는 종양 표적에 대한 반응으로 증식하는 CD4+ 및 CD8+ 세포가 선택된다. 예를 들어, 항원 또는 종양 표적으로 자극될 때 가장 형질도입 세포, 또는 CD8+ 형질도입 세포보다 활발하게 증식하는 CD4+ 세포가 선택된다. 일부 구체예에서, 항원을 갖는 세포에 대해 세포독성인 CD4+ 및 CD8+ 세포가 선택된다. 구체예에서, CD4+가 CD8+ 세포보다 약한 세포독성인 것으로 예상된다.
바람직한 구체예에서, 형질도입된 림프구, 예컨대 CD8+ 중추 기억 세포는 특정한 암 종류에 대해 구축된 동물 모델을 사용한 생체내 종양세포 사멸을 제공하는 것이 선택된다. 이러한 동물 모델은 당업자들에게 알려져 있으며, 사람은 제외한다. 본 원에 기술된 바와 같이, 림프구에 형질도입된 모든 키메릭 리셉터 구조물 전부가 시험관 내에서 종양 세포를 활성이 되게 하고 사멸시키는 능력에도 불구하고 시험관 내에서 종양 세포를 사멸하는 능력을 제공하는 것은 아니다. 구체적으로, 일부 표적 분자의 경우 긴 스페이서 영역의 키메릭 리셉터 구조물을 갖는 T 세포는 짧은 스페이서 영역의 키메릭 리셉터를 갖는 T 세포와 비교하여 생체내 종양 세포의 사멸에 있어서 덜 효과적이었다. 다른 표적 분자의 경우에 짧은 스페이서 영역의 키메릭 리셉터 구조물을 갖는 T 세포는 긴 스페이서 영역의 키메릭 리셉터를 갖는 T 세포와 비교하여 생체내 종양 세포의 사멸에 있어서 덜 효과적이었다.
또다른 구체예에서, T 세포를 발현하는 형질도입된 키메릭 리셉터는 특정한 암 종류에 대해 구축된 동물 모델을 사용하여 생체 내에서 지속가능한 것을 선택하였다. 구체예에서, 짧은 스페이서 영역을 갖는 형질도입된 키메릭 리셉터 CD8+ 중추 기억 세포는 동물에 삽입한 후에 약 3일 이상, 10일 이상, 20일 이상, 30일 이상, 40일 이상, 또는 50일 이상 동안 생체 내에서 지속하는 것으로 나타났다.
본 원에서는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 조합을 조성물에 이용하는 것을 고려하였다. 일 구체예에서, 키메릭 리셉터 형질도입 CD4+ 세포의 조합은 동일한 리간드 특이성의 키메릭 리셉터 형질도입 CD8+ 세포와 조합하거나 별개의 종양 리간드에 특이적인 CD8+ T 세포와 조합할 수 있다. 다른 구체예에서, 키메릭 리셉터 형질도입 CD8+ 세포는 종양에서 발현된 상이한 리간드에 특이적인 키메릭 리셉터 형질도입 CD4+ 세포와 조합된다. 또다른 구체예에서, 키메릭 리셉터 변성 CD4+ 및 CD8+ 세포가 조합된다. 구체예에서, CD8+ 및 CD84+ 세포는 상이한 비율, 예를 들어 CD8+ 대 CD4+가 1:1 비율, 10:1 비율, 또는 100:1 비율로 조합될 수 있다. 구체예에서, 조합된 개체군은 시험관내 및/또는 생체내 세포 증식을 시험하고, 세포 증식을 제공하는 세포의 비율이 선택된다.
본 원에 기술된 바와 같이, 본 발명에서는 CD4+ 및 CD8+ 세포를 서브개체군, 예컨대 천연, 중추 기억 및 이팩터 기억 세포군으로 추가 분리할 수 있는 것을 고려하였다. 본 원에 기술된 바와 같이, 일부 구체예에서, 천연 CD4+ 세포는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+ 양성 T 세포이다. 일부 구체예에서, 중추 기억 CD4+ 세포는 CD62L 양성 및 CD45RO 양성이다. 일부 구체예에서, 이팩터 CD4+ 세포는 CD62L 음성 및 CD45RO 양성이다. 이러한 개체군 각각은 키메릭 리셉터로 독립적으로 변성될 수 있다.
본 원에 기술된 바와 같이, 구체예에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초혈액 림프구의 CD62L+ 및 CD62L- 서브세트에 존재한다. PBMC는 항-CD8 및 항-CD62L 항체로 염색한 후 CD62L-CD8+ 및 CD62L+CD8+ 분획으로 분류된다. 일부 구체예에서, 중추 기억 T 세포(TCM)의 표현형 마커의 발현은 CD62L, CCR7, CD28, CD3, 및 CD127을 포함하고 그랜자임 B에 대해 음성이거나 낮다. 일부 구체예에서, 중추 기억 T 세포는 CD45RO+, CD62L+, CD8+ T 세포이다. 일부 구체예에서, 이팩터 T 세포(TE)는 CD62L, CCR7, CD28, 및 CD127에 대해 음성이고, 그랜자임 B와 퍼포린에 대해 양성이다. 일부 구체예에서, 천연 CD8+ T 림프구는 CD8+, CD62L+, CD45RO+, CCR7+, CD28+ CDI 27+, 및 CD45RO+를 특징으로 한다. 이러한 개체군들 각각은 키메릭 리셉터로 독립적으로 변성될 수 있다.
키메릭 리셉터를 갖는 세포에 대한 형질도입 및/또는 선별 후에 세포군은 바람직하게 충분한 수의 세포가 얻어질 때까지 시험관 내에서 증폭하여 인간 대상 내로의 적어도 일 주입(infusion), 전형적으로 약 104 세포/kg 내지 109 세포/kg을 제공한다. 구체예에서, 형질도입된 세포는 항원을 갖는 세포, 항 CD3, 항 CD28, 및 IL 2, IL-7, IL 15, IL-21 및 이들의 조합의 존재 하에 배양된다.
CD4+ 및 CD8+ 세포의 서브개체군 각각을 서로 조합할 수 있다. 특정 구체예에서, 변성된 천연 또는 중추 기억 CD4+ 세포는 변성된 중추 기억 CD8+ T 세포와 조합되어 항원을 갖는 세포, 예컨대 종양 세포에서 상승적인 세포독성 효과를 제공한다.
조성물
본 원은 여기에 기술된 유전적으로 변성된 T 림프구 세포 조제물을 포함하는 양자 세포 면역요법 조성물을 제공한다.
구체예에서, T 림프구 세포 조제물은 질환 또는 장애와 연관된 리간드에 특이적인 세포외 항체 가변성 도메인, 사용자 정의 스페이서 영역, 막통관 도메인; 및 본 원에 기술된 T 세포 리셉터 또는 다른 리셉터의 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 키메릭 리셉터를 갖는 CD4+ T 세포를 포함한다. 다른 구체예에서, 양자 세포 면역요법 조성물은 또한 세포 면역반응을 제공하는 키메릭 리셉터 변성 종양-특이적 CD8+ 세포독성 T 림프구 세포 조제물을 포함하며, 여기서 세포독성 T 림프구 세포 조제물은 질환 또는 장애와 연관된 리간드에 특이적인 세포외 단일사슬 항체, 사용자 정의 스페이서 영역, 막통관 도메인; 및 본 원에 기술된 T 세포 리셉터의 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 키메릭 리셉터를 갖는 CD8+ T 세포를 포함한다. 구체예에서, 본 원의 키메릭 리셉터 변성 T 세포군은 생체 내에서 적어도 약 3일 이상 지속할 수 있다.
일부 구체예에서, 양자 세포 면역요법 조성물은 세포 면역반응을 제공하는 키메릭 리셉터 변성 종양-특이적 CD8+ 세포독성 T 림프구 세포 조제물을 포함하며, 여기서 세포독성 T 림프구 세포 조제물은 CD45RO- CD62L+ CD4+ T 세포로부터 유도된 항원 반응성 키메릭 리셉터 변성 천연 CD4+ T 헬퍼 세포와 조합하여, 질환 또는 장애와 연관된 리간드에 특이적인 세포외 단일사슬 항체, 사용자 정의 스페이서 영역, 막통관 도메인; 및 T 세포 리셉터의 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 키메릭 리셉터를 갖는 CD8+ T 세포, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
다른 구체예에서, 양자 세포 면역요법 조성물은 CD8+ 면역반응을 증강하는 항원 반응성 키메릭 리셉터 변성 천연 CD4+ T 헬퍼 세포와 조합된 환자에서 유도된 세포 면역반응을 제공하는 항원 특이적 CD8+ 세포독성 T 림프구 세포 조제물을 포함하며, 여기서 헬퍼 T 림프구 세포 조제물은 질환 또는 장애와 연관된 항원에 특이적인 세포외 항체 가변 도메인, 사용자 정의 스페이서 영역, 막통관 도메인; 및 T 세포 리셉터의 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 키메릭 리셉터를 갖는 CD4 + T 세포를 포함한다.
다른 구체예에서, 양자 세포 면역요법 조성물은 CD8+ 면역반응을 증강하는 항원 반응성 키메릭 리셉터 변성 천연 CD4+ T 헬퍼 세포를 포함하며, 여기서 헬퍼 T 림프구 세포 조제물은 질환 또는 장애와 연관된 리간드에 특이적인 세포외 항체 가변 도메인, 사용자 정의 스페이서 영역, 막통관 도메인; 및 T 세포 리셉터의 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 키메릭 리셉터를 갖는 CD4 + T 세포를 포함한다.
구체예에서, CD4+ T 헬퍼 림프구 세포는 천연 CD4+ T 세포, 중추 기억 CD4+ T 세포, 이팩터 기억 CD4+ T 세포, 또는 벌크 CD4+ T 세포로 구성되는 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, CD4+ 헬퍼 림프구 세포는 천연 CD4+ T 세포이고, 여기서 천연 CD4+ T 세포는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ CD4+ T 세포를 포함한다. 구체예에서, CD8+ T 세포독성 림프구 세포는 천연 CD8+ T 세포, 중추 기억 CD8+ T 세포, 이팩터 기억 CD8+ T 세포 또는 벌크 CD8+ T 세포로 구성되는 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, CD8+ 세포독성 T 림프구 세포는 중추 기억 T 세포이고, 여기서 중추 기억 T 세포는 CD45RO+, CD62L+, CD8+ T 세포를 포함한다. 또다른 구체예에서, CD8+ 세포독성 T 림프구 세포는 중추 기억 T 세포이고, CD4+ 헬퍼 T 림프구 세포는 천연 또는 중추 기억 CD4+ T 세포이다.
방법
본 원에서는 양자 면역요법 조성물의 제조방법과 질환 또는 장애를 갖는 대상에서 세포 면역요법을 수행하는 조성물의 용도 또는 그의 사용방법을 제공한다. 구체예에서, 본 원에 기술된 키메릭 리셉터 변성 T 세포는 생체 내에서 적어도 3일, 또는 적어도 10일 동안 지속할 수 있다. 구체예에서, 본 원에 기술된 키메릭 리셉터 변성 T 세포는 CFSE 염료 희석으로 측정했을 때 적어도 2, 또는 적어도 3세대 동안 생체 내에서 증식할 수 있다. 키메릭 리셉터 변성 T 세포의 증식과 지속성은 질환 또는 장애가 있는 동물 모델을 사용하여 세포를 투여하고 전달된 세포의 지속성 및/또는 증식 능력을 측정하여 결정할 수 있다. 다른 구체예에서, 증식과 활성화는 항원을 갖는 세포로 여러 번의 활성화 사이클을 통과하여 시험관 내에서 시험할 수 있다.
구체예에서, 조성물을 제조하는 방법은 변성된 천연 CD4+ T 헬퍼 세포를 얻는 것을 포함하며, 변성 헬퍼 T 림프구 세포 조제물은 종양세포표면분자에 특이적인 리간드 결합 도메인, 사용자 지정 스페이서 도메인, 막통관 도메인, 및 본 원에 기술된 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 키메릭 리셉터를 갖는 CD4+ T 세포를 포함한다.
다른 구체예에서, 방법은 변성 CD8+ 세포독성 T 세포를 얻는 것을 추가로 포함하며, 여기서 변성 세포독성 T 림프구 세포 조제물은 종양세포표면분자에 특이적인 리간드 결합 도메인, 사용자 지정 스페이서 도메인, 막통관 도메인, 및 본 원에 기술된 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 키메릭 리셉터를 갖는 CD8+ 세포를 포함한다.
다른 구체예에서, 방법은 변성 CD8+ 세포독성 T 세포를 얻는 것을 포함하고, 추가로 변성된 CD8+ 세포독성 T 세포를 CD4+ 헬퍼 세포 림프구 세포 조제물과 조합하는 것을 포함한다(여기서 변성 세포독성 T 림프구 세포 조제물은 종양세포표면분자에 특이적인 리간드 결합 도메인, 사용자 지정 스페이서 도메인, 막통관 도메인, 및 본 원에 기술된 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 키메릭 리셉터를 갖는 CD8+ 세포를 포함한다).
키메릭 리셉터로 변성된 CD4+ 및 CD8+ 세포의 조제물을 실시예뿐만 아니라 위에 기술하였다. 항원 특이적 T 림프구는 질환 또는 장애를 갖는 환자로부터 얻거나, 항원 존재 하에서 T 림프구의 시험관내 자극으로 제조할 수 있다. 항원 특이성으로 선택되지 않은 CD4+ 및 CD8+ T 림프구의 서브개체군도 본 원에서 단리할 수 있으며 제조방법에 조합될 수 있다. 구체예에서, 세포군의 조합을 세포표면마커의 균일성에 대해 적어도 2세대에 걸쳐 증식하고 균일한 세포 분화 상태를 갖는 능력을 평가할 수 있다. 키메릭 리셉터 변성 T 세포가 당분야에서 알려진 세포독성, 증식, 또는 사이토킨 제조 어세이를 사용하여 세포주를 인식하는지를 결정하기 위해서 키메릭 리셉터 변성 T 세포와 표적 리간드를 발현하는 세포주를 동시배양하여 품질을 관리할 수 있다. 키메릭 리셉터 변성 T 세포 상에서 세포 분화 상태 및 세포표면마커는 유동세포계수법으로 측정할 수 있다. 구체예에서, CD8+ 세포 상의 마커 및 세포 분화 상태는 CD3, CD8, CD62L, CD28, CD27, CD69, CD25, PD-1, CTLA-4, CD45RO, 및 CD45RA를 포함한다. 구체예에서, CD4+ 세포 상의 마커 및 세포 분화 상태는 CD3, CD4, CD62L, CD28, CD27, CD69, CD25, PD-1, CTLA-4 CD45RO, 및 CD45RA를 포함한다.
구체예에서, 키메릭 리셉터에 대한 스페이서 영역을 선택하는 방법이 본 원에서 제공된다. 놀라웁게도, 일부 키메릭 리셉터 구조물은 시험관 내에서 T 세포를 활성화하는데는 효과적이지만 생체 내에서는 효과적이지 않았다. 구체예에서, 방법은 다수의 키메릭 리셉터 핵산을 제공하고(여기서 키메릭 리셉터 핵산은 스페이서 영역에서만 다르다); 키메릭 리셉터 핵산을 별도의 T 림프구 개체군에 삽입하고; 각각의 별도 림프구 개체군을 시험관 내에서 증폭하고, 종양이 있는 동물에 각각의 림프구 개체군을 삽입하여 키메릭 리셉터 변성 T 세포 각각의 항종양 효능을 측정하고; 다른 키메릭 리셉터 변성 T 세포 각각으로 변성된 다른 별도 림프구 개체군 각각과 비교하여 항종양 효능을 제공하는 키메릭 리셉터를 선택하는 것을 포함한다.
상이한 종양에 대한 동물 모델들이 알려져 있다. 항종양 효능은 종양 크기의 감소 확인, 동물 사멸, 생체 내에서 유전적으로 변성된 T 세포의 지속성, (예를 들어, CD25 및/CD69 발현 증가의 검출에 의한)유전적으로 변성된 T 세포의 활성화, 및/또는 생체 내에서 유전적으로 변성된 T 세포의 증식을 결정하여 측정할 수 있다. 구체예에서, 키메릭 리셉터는 이러한 매개변수들 중 하나 이상으로 측정된 생체 내 최고의 항종양 효능을 제공하는 것을 선택한다. 항종양 효능의 결핍은 유전적으로 변성된 림프구의 생체 내 지속성의 결핍, 동물 사멸, 카스파제(caspase)-3 유도 증가로 측정된 아폽토시스의 증가 및/또는 유전적으로 변성된 림프구 증식의 감소로 측정할 수 있다.
구체예에서, 스페이서 영역에서만 상이한 다수의 키메릭 리셉터 핵산을 제공하는 것은 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(여기서 리간드는 종양 특이적 항원, 바이러스 항원 또는 림프구에 의한 인지 및 제거를 매개하는데 적합한 표적 세포군 상에서 발현된 임의의 다른 분자이다); 제1 폴리펩티드 스페이서의 코딩 서열의 5' 및 3' 말단에 정해진 제한부위를 갖는 제1 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 막통관 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 세포내 시그널링 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키메릭 리셉터 구조물을 제공하는 것을 포함한다.
본 원은 또한 본 원에 기술된 키메릭 리셉터를 발현하는 림프구의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 질환 또는 장애가 있는 대상에서 세포 면역요법을 수행하는 방법을 제공한다. 다른 구체예에서, 방법은 대상에게 세포 면역반응을 제공하는 유전적으로 변성된 세포독성 T 림프구 세포 조제물(여기서, 세포독성 T 림프구 세포 조제물은 종양세포표면분자에 특이적인 리간드 결합 도메인, 사용자 지정 스페이서 도메인, 막통관 도메인, 및 본 원에 기술된 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 키메릭 리셉터를 갖는 CD8+ T 세포를 포함한다), 및 직접적인 종양 인지를 유도하고 세포 면역반응을 매개하는 유전적으로 변성된 세포독성 T 림프구 세포 조제물 능력을 증강하는 유전적으로 변성된 헬퍼 T 림프구 세포 조제물(여기서, 헬퍼 T 림프구 세포 조제물은 종양세포표면분자에 특이적인 리간드 결합 도메인, 사용자 지정 스페이서 도메인, 막통관 도메인, 및 본 원에 기술된 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 키메릭 리셉터를 갖는 CD4+ T 세포를 포함한다)을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니지만, 이것은 투여 전에 생체 내에서 지속 및 증식할 수 있는 키메릭 리셉터 변성 T 세포군을 선택하므로써 저용량의 T 세포를 사용하고 더 균일한 치료활성을 제공하는 능력을 얻는 것으로 판단된다. 일 구체예에서, T 세포의 용량은 적어도 10%, 20%, 또는 30% 이상 감소될 수 있다. T 세포 용량의 감소는 위험 또는 종양 용균 증상 및 사이토킨 발작을 줄이는데 유리할 수 있다.
다른 구체예에서, 질환 또는 장애가 있는 대상에서 세포 면역요법을 수행하는 방법은: 대상에게 유전적으로 변성된 헬퍼 T 림프구 세포 조제물을 투여하는 것을 포함한다(여기서, 변성 헬퍼 T 림프구 세포 조제물은 종양세포표면분자에 특이적인 리간드 결합 도메인, 사용자 지정 스페이서 도메인, 막통관 도메인, 및 본 원에 기술된 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 키메릭 리셉터를 갖는 CD4+ T 세포를 포함한다). 구체예에서, 방법은 대상에게 유전적으로 변성된 세포독성 T 림프구 세포 조제물을 투여하는 것을 추가로 포함한다(여기서, 변성 세포독성 T 림프구 세포 조제물은 종양세포표면분자에 특이적인 리간드 결합 도메인, 사용자 지정 스페이서 도메인, 막통관 도메인, 및 본 원에 기술된 세포내 시그널링 도메인을 포함하는 키메릭 리셉터를 갖는 CD8+ 세포를 포함한다).
다른 구체예에서는 질환 또는 장애와 연관된 표적 분자의 존재에 대해 대상의 생물학적 샘플을 분석하고 본 원에 기술된 양자 면역요법 조성물을 투여하는 것을 포함하는: 질환 또는 장애가 있는 대상에서 세포 면역요법을 수행하는 방법을 기술하였고, 여기서 키메릭 리셉터는 특이적으로 표적 분자에 결합한다.
일부 구체예에서, CD4+ T 헬퍼 림프구 세포는 키메릭 리셉터의 삽입 전에 천연 CD4+ T 세포, 중추 기억 CD4+ T 세포, 이팩터 기억 CD4+ T 세포 또는 벌크 CD4+ T 세포로 구성되는 군에서 선택된다. 특정 구체예에서, CD4+ 헬퍼 림프구 세포는 천연 CD4+ T 세포이고, 여기서 천연 CD4+ T 세포는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ CD4+ T 세포를 포함한다. 또다른 구체예에서, CD8+ T 세포독성 림프구 세포는 키메릭 리셉터의 삽입 전에 천연 CD8+ T 세포, 중추 기억 CD8+ T 세포, 이팩터 기억 CD8+ T 세포 또는 벌크 CD8+ T 세포로 구성되는 군에서 선택된다. 특정 구체예에서, CD8+ 세포독성 T 림프구 세포는 중추 기억 T 세포이고, 여기서 중추 기억 T 세포는 CD45RO+, CD62L+, CD8+ T 세포를 포함한다. 특정 구체예에서, CD8+ 세포독성 T 림프구 세포는 중추 기억 T 세포이고, CD4+ 헬퍼 T 림프구 세포는 천연 CD4+ T 세포이다.
구체예에서, CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포는 둘다 종양 특이적 세포표면 분자를 특이적으로 결합하는 항체 중쇄 도메인을 포함하는 키메릭 리셉터로 유전적으로 변성된다. 다른 구체예에서, CD8 세포독성 T 세포의 세포내 시그널링 도메인은 CD4 헬퍼 T 세포의 세포내 시그널링 도메인과 같다. 또다른 구체예에서, CD8 세포독성 T 세포의 세포내 시그널링 도메인은 CD4 헬퍼 T 세포의 세포내 시그널링 도메인과 다르다.
본 발명으로 치료될 수 있는 대상은, 일반적으로 인간 및 다른 영장류 대상, 예컨대 수의학 목적을 위한 원숭이 및 유인원이다. 대상은 남성 또는 여성이 될 수 있으며, 유아, 소아, 청소년, 성인 및 노인 대상자를 포함하는 임의의 적절한 나이가 될 수 있다.
방법은 예를 들어, 혈액학적 악성종양, 흑색종, 유방암 및 다른 상피 악성종양 또는 고형 종양의 치료에 유용하다. 일부 구체예에서, 질환 또는 장애와 연관된 분자는 오르판(orphan) 티로신 키나제 리셉터 ROR1, Her2, CD19, CD20, CD22, 메조텔린, CEA, 및 B형 간염 표면항원으로 구성되는 군에서 선택된다.
치료가능한 대상은 암, 예를 들어 제한적인 것은 아니나 결장암, 폐암, 간암, 유방암, 신장암, 전립선암, 난소암, 피부암(흑색종 포함), 뼈암 및 뇌암 등을 가진 대상을 포함한다. 일부 구체예에서, 종양 관련 항원 또는 분자, 예컨대 흑색종, 유방암, 편평세포암종, 결장암, 백혈병, 골수종, 및 전립선암이 알려져 있다. 다른 구체예에서, 종양관련분자는 조작된 키메릭 리셉터를 발현하는 유전적으로 변성된 T 세포로 표적이 될 수 있다. 예를 들어, B 세포 림프종, 유방암, 전립선암 및 백혈병을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
상기한 바와 같이 제조된 세포는 공지된 기술에 따른 양자 면역요법, 또는 본 발명에 기초하여 당업자들에게 자명한 그의 변형을 위한 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 세포는 먼저 그의 배양배지에서 수확된 다음 세척하고 치료에 효과적인 양으로 투여하는데 적합한 매질 및 컨테이너 시스템("약학적으로 허용가능한" 담체)에 세포를 농축하여 제제화된다. 적합한 주입(infusion) 매질은 등장성 매질 제제, 전형적으로 생리식염수, Normosol R (Abbott) 또는 Plasma-Lyte A (Baxter)일 수 있으나, 5% 덱스트로스 수용액 또는 링거 락테이트를 사용할 수도 있다. 주입 매질은 인간 혈청 알부민, 소태아혈청 또는 다른 인간 혈청 성분들이 보충될 수 있다.
조성물 중 세포의 치료적 유효량은 적어도 2 세포 서브세트(예를 들어, 1 CD8+ 중추 기억 T 세포 서브세트 및 1 CD4+ 헬퍼 T 세포 서브세트)이거나, 전형적으로 102 세포 초과, 최대 106, 108 또는 109 세포 이하이고 1010 세포 초과일 수 있다. 세포의 수는 세포 종류가 그 안에 포함되도록 의도된 조성물의 최종 용도에 따른다. 예를 들어, 특정 항원에 특이적인 세포가 필요하다면, 개체군은 70% 초과, 일반적으로 80%, 85% 초과 및 90-95%의 이러한 세포를 함유하게 된다. 본 원에서 제공된 용도에서, 세포는 일반적으로 1 리터 이하의 부피로 존재하며, 500 ml 이하, 250 ml 또는 100 ml 이하일 수 있다. 그러므로, 바람직한 세포의 밀도는 전형적으로 104 세포/ml 초과이고, 일반적으로 107 세포/ml 초과, 일반적으로 108 세포/ml 이상이다. 임상적 연관 면역 세포수는 누적으로 동일하거나 106, 107, 108, 108, 109, 1010 또는 1011 세포를 초과하는 다중 주입으로 배분될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 림프구를 사용하여 개체에 면역성을 제공할 수 있다. "면역성"이란 림프구 반응이 관련된, 병원체에 의한 감염 또는 종양에 대한 반응과 연관된 하나 이상의 신체 증상의 경감을 의미한다. 투여된 세포량은 일반적으로 병원체에 대한 면역성을 갖는 정상 개체 내에 존재하는 범위 내이다. 따라서, 세포는 일반적으로 주입에 의해 투여되고, 주입마다 2 세포에서, 최대 적어도 106 내지 3xl010 세포, 바람직하게 적어도 107 내지 109 세포의 범위이다. T 세포는 단일 주입으로, 또는 시간 범위에 따라 다중 주입으로 투여될 수 있다. 그러나, 상이한 개체들은 대응이 다양할 것으로 예상되므로, 주입된 세포의 종류와 양, 및 주입수와 다수 주입이 제공되는 시간 범위는 참여한 임상의가 결정하며 일반적 실험으로 결정할 수 있다. 충분한 농도의 T 림프구(예를 들어, 세포독성 T 림프구 및/또는 헬퍼 T 림프구) 생성은 본 원에서 예시한 바와 같이 본 발명의 급속 증폭방법을 사용하여 얻어질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,040,177호(Riddell 등), 컬럼 17 참조.
구체예에서, 본 원에 기술된 조성물은 골수, 림프절 및/또는 뇌척수액 내로 정맥 내, 복강 내, 종양 내 투여된다. 구체예에서, 키메릭 리셉터 조작 조성물은 종양 부위에 전달된다. 경우에 따라, 본 원에 기술된 조성물은 종양 또는 면역 체계 구획에 대해 세포를 표적으로 하고, 폐 등의 부위를 피하는 화합물과 결합 할 수 있다.
구체예에서, 본 원에 기술된 조성물은 화학치료제 및/또는 면역억제제와 함께 투여된다. 구체예에서, 환자는 먼저 다른 면역 세포를 저해하거나 파괴하는 화학치료제로 치료된 다음, 본 원에 기술된 조성물로 치료된다. 일부 경우에서, 화학요법은 완전히 회피될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하였다.
실험
실시예 1 - 스페이서 도메인 길이의 지정 및 키메릭 리셉터 변성 T 세포를 갖는 ROR1의 최적 인지에 대한 scFv 친화도
다양한 인간 악성종양, 예를 들어 만성 림프성 백혈병, 맨틀 세포 림프종, 급성 림프구성 백혈병, 및 유방암, 폐암, 전립선암, 췌장암 및 난소암에서 발현된 ROR1 분자에 특이적인 키메릭 리셉터를 구성하였다. ROR1 키메릭 리셉터를 상이한 친화도를 갖고 상이한 길이의 세포외 IgG4-Fc 스페이서 도메인을 함유하는 ROR1 특이적 scFV로부터 설계하였다. 시험관 내에서 ROR1+ 조혈 및 상피 종양을 인식하고 면역결핍 마우스에 이식된 인간 맨틀 세포 림프종을 제거하는 각각의 ROR-1 특이적 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포의 능력을 분석하였다.
재료 및 방법
인간 대상체
말초혈액 단핵세포(PBMC)를 건강한 공여자와 환자로부터 Institutional Review Board of the Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC)에 의해 인증된 연구 계획에 대한 서면 정보 동의 후에 얻었다.
세포주
K562, Raji, JeKo-1, MDA-MB-231, MDA-MB-468, 및 293T 세포주를 American Type Culture Collection으로부터 입수하였다. Edns H. Warren (FHCRC) 박사로부터 신장세포암계 FARP, TREP 및 RWL을 제공받았다. K562/ROR1과 Raji/ROR1를 전장 ROR1-유전자를 사용한 렌티바이러스 형질도입으로 생성하였다. JeKo-l/ffluc를 유도하기 위해, 천연 JeKo-1 세포를 T2A 서열과 eGFP 상부에서 반딧불이 루시퍼라제(ffluc)-유전자를 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입하였다. 형질도입된 JeKo-1 세포를 eGFP 발현에서 분류하여 생체내 실험 동안 증식하였다.
면역표현형검사(Immunophenotyping)
PBMC와 세포주들을 다음 컨쥬게이트 mAb로 염색하였다: CD3, CD4, CD5, CD8, CD19, CD28, CD45RO, CD62L, CD314 (NKG2D), MICA/B 및 매칭된 이소형 대조군(BD Biosciences). 프로피디움 요오드화물(PI) 염색을 생/사 세포 식별을 위해 수행하였다. ROR1의 세포 표면 발현을 폴리클로날 염소 항-인간-ROR1 항체(R&D Systems)를 사용하여 분석하였다.
2A2 ROR1 키메릭 리셉터의 표면 발현을 폴리클로날 염소 항-마우스-IgG 항체 (Fab-특이적) (Jackson ImmunoResearch)를 사용하여 분석하였다. 유동 분석을 FACSCanto®에서, FACSAriall® (Becton Dickinson)에서 분류-정제를 수행하였고, Flow Jo® 소프트웨어 (Treestar)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
벡터 구성 및 키메릭 리셉터 인코딩 렌티바이러스의 제조
ROR1-특이적이고 CD19-특이적인 키메릭 리셉터를 2A2, R12, 및 R11 mAbs (ROR1) 및 FMC63 mAb (CD19)의 VL 및 VH 사슬 세그먼트를 사용하여 구성하였다. (R11과 R12의 가변영역 서열은 Yang 등의 문헌[Plos One 6(6):e21018, June 15, 2011]에서 제공되었다). 각각의 scFV는 (G4S)3(서열번호: 12) 펩티드에 의해 '힌지-CH2-CH3' (229 AA, 서열번호:), '힌지-CH3'(119 AA, 서열번호:) 또는 '힌지'단독(12 AA, 서열번호: 4) 서열을 포함하는 IgG4-Fc (Uniprot 데이터베이스: P01861, 서열번호: 13)로부터 유도된 스페이서 도메인에 연결되었다(도 1). 모든 스페이서가 천연 IgG4-Fc 단백질의 108 위치에 있는 '힌지' 도메인 내에 S->P 치환을 함유하였고, 인간 CD28의 27 AA 막통관 도메인(Uniprot: PI 0747, 서열번호: 14) 및, (i) 천연 CD28 단백질의 186-187 위치에 위치한 LL->GG 치환을 갖는 인간 CD28의 41 AA 세포질 도메인(서열번호: 14) 또는 (ii) 인간 4-1BB의 42 AA 세포질 도메인(Uniprot: Q07011, 서열번호: 15)을 포함하는 시그널링 모듈에 연결되었고, 각각은 인간 CD3ζ의 이소형태 3의 112 AA 세포질 도메인(Uniprot: P20963, 서열번호; 16)에 연결되었다. 구조물은 키메릭 리셉터의 하부에서 T2A 리보솜 스킵(skip) 요소(서열번호: 8) 및 tEGFR 서열(서열번호:9)을 코딩하였다. 각각의 전이유전자를 코딩하는 코돈 최적화 뉴클레오티드 서열을 합성하였고(Life Technologies), epHIV7 렌티바이러스 벡터를 클론하였다.
ROR1-키메릭 리셉터, CD19-키메릭 리셉터 또는 tEGFR-코딩 렌티바이러스를 293T 세포에서 패키징 벡터 pCHGP-2, pCMV-Rev2 및 pCMV-G, 및 Calphos® 형질감염제(Clontech)를 사용하여 제조하였다.
ROR1과 CD19-키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포주의 생성
CD8+ CD45RO+ CD62L+ 중추 기억 T 세포(TCM) 또는 벌크 CD4+ T 세포를 정상 공여체의 PBMC로부터 분류하여, 항-CD3/CD28 비즈(Life Technologies)로 활성화하고, 800 g으로 45분 동안 32 ℃에서 1 μg/mL 폴리브렌(polybrene)(Millipore)이 보충된 렌티바이러스 상징액(MOI = 3)과 함께 원심분리하여 활성화한 후 3일째에 형질도입되었다. T 세포를 RPMI에서 재조합 인간 IL-2로 50 U/mL의 최종 농도로 보충된, 10% 인간 혈청, 2 mM L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (CTL 배지)으로 증폭하였다. T 세포주 각각의 tEGFR+ 서브세트를 면역자성 선택에 의해 비오틴-컨쥬게이트 항-EGFR mAb (ImClone Systems) 및 스트렙타비딘-비즈 (Miltenyi)로 농축하였다. ROR1-키메릭 리셉터와 tEGFR 대조용 T 세포를 급속증폭 프로토콜(Riddell SR, Greenberg PD, The use of anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies to clone and expand human antigen-specific T cells J Immunol Methods. 1990; 128(2): 189-201. Epub 1990/04/17.)을 사용하여 증폭하고, CD19-키메릭 리셉터 변성 T 세포를 1:7의 T 세포:LCL 비율에서 조사(8,000 rad)된 B-LCL을 사용한 자극에 의해 증폭하였다. T 세포를 50 U/mL IL-2를 갖는 CTL 배지에서 배양하였다.
세포독성, 사이토킨 분비 및 증식 어세이
표적 세포를 51Cr(PerkinElmer)로 표지하고 세척하여 3회 1-2x103 세포/well로 이팩터 키메릭 리셉터 변성 T 세포를 사용하여 다양한 이팩터 대 표적(E:T) 비율에서 인큐베이션하였다. 4시간 인큐베이션한 후 γ-카운팅에서 상징액을 수집하고 특이적 용균을 표준식을 사용하여 계산하였다. 사이토킨 분비 분석에서는 5x104 T 세포를 3회 표적세포를 사용하여 1:1 (프라이머리 CLL), 2:1 (Raji/ROR1; JeKo-1), 4:1 (K562/ROR1, K562/CD19 및 K562) 또는 10:1 (MDA-MB-231)의 E:T 비율로 도포하고, 상징액에서 ELISA 또는 멀티플렉스 사이토킨 면역어세이 (Luminex)로 측정된 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2를 24-h 인큐베이션 후에 제거하였다. 실험에서 NKG2D 시그널링, 항-NKG2D (클론 1D11), 항-MICA/B (클론 6D4, 모두 BD로부터 유래) 및 항-ULBP (Dr. Veronika Groh(FHCRC) 제공)의 블로킹은 포화 농도에서 사용되었다. 증식의 분석을 위해 T 세포를 0.2 μM 카복시플루오레신 숙신이미딜 에스테르(CFSE, Invitrogen)로 표지하고 세척하여 자극인자 세포로 외인성 사이토킨이 없는 배지에 3회 도포하였다. 72시간 인큐베이션한 후, 세포를 항-CD8 mAb와 PI로 표지하고 유동세포계수법으로 분석하여 살아있는 CD8+ T 세포의 세포분열을 평가하였다.
NOD/SCID/ γc -/- (NSG) 마우스 실험
동물실험윤리위원회(Institutional Animal Chimeric receptor and Use Committee)가 모든 마우스 실험을 승인하였다. 6- 내지 8-주령의 암컷 NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtmlWjl/SzJ(NSG) 마우스를 Jackson Laboratory 또는 인하우스 사육으로 입수하였다. 마우스의 꼬리 정맥을 통해 0.5x106 JeKo-l/ffluc 종양 세포를 주사하고 키메릭 리셉터-변성 또는 대조용 T 세포의 후속 꼬리 정맥 주사를 수행하였다.
종양 성장의 생체발광 이미지화를 위해 PBS로 재현탁된 루시페린 기질(Caliper Life Sciences)을 마우스에 복강내 투여하였다(15 μg/g 체중). 마우스를 이소플루란으로 마취하고 Xenogen IVIS Imaging System (Caliper)을 사용하여 스몰 비닝 모드(small binning mode)로 루시페린을 주사한 10, 12 및 14분 후 불포화 이미지를 얻기 위한 1 s 내지 1 min의 취득 시간에 이미지화하였다. 루시퍼라제 활성은 Living Image Software (Caliper)와 개별 마우스 각각의 전신 또는 흉부를 포함하는 관심 영역에서 분석된 광자속(photon flux)을 사용하여 분석하였다.
통계적 분석
Prism Software (GraphPad®)를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 스튜던트 t 시험을 95%의 신뢰성 간격으로 양측 대 시험으로 수행하였고, p<0.05의 p값을 갖는 결과를 유의한 것으로 간주하였다. 생존율의 통계적 분석은 로그순위 시험으로 수행하였고 p<0.05의 p값을 갖는 결과를 유의한 것으로 간주하였다.
결과
2A2 ROR1-키메릭 리셉터의 스페이서 도메인을 트렁케이트하여 ROR1 + 종양의 우수한 인지를 제공한다.
본 발명자들은 이전에 ROR1-1의 NH2-터미널, 막 원위 Ig-유사/프리즐드(Frizzled) 포션의 에피토프에 결합하는 2A2 scFV를 사용하는 ROR1-특이적 키메릭 리셉터 디자인을 보고하였다. 초기 2A2 ROR1-키메릭 리셉터는 IgG4-Fc의 '힌지-CH2-CH3' 영역을 포함하고 CD28 공동자극 및 CD3ζ 시그널링 도메인과 결합된 긴 229 AA 스페이서를 갖는다(Hudecek M et al. Blood, 2010). 이 키메릭 리셉터가 ROR1+ 종양의 특이적 인지를 제공하지만, ROR1+ 에피토프의 막 원위 위치 때문에 스페이서 도메인을 트렁케이트하여 종양 인지와 T 세포 시그널링을 증강할 수 있는 것으로 추론하였다. 따라서, IgG4-Fc 스페이서 도메인이 순차적으로 결실되어 '힌지-CH3'(119 AA, 중간), 및 '힌지 단독'(12 AA, 짧음) 변이체를 유도하는 2 추가 키메릭 리셉터를 구성하였다. 새로운 리셉터 각각은 동일한 2A2 scFV, 및 CD28과 CD3ζ 시그널링 모듈을 함유하였다. 전이유전자 카세트는 키메릭 리셉터-변성 T 세포에 대한 형질도입, 선택 및 생체내 트래킹 마커로서 작용하는 둔단된 EGFR (tEGFR)을 포함하였다.
전장 또는 둔단된 IgG4-Fc 스페이서를 함유하는 2A2 ROR1-키메릭 리셉터와 tEGFR 대조용 벡터를 갖는 정제된 CD8+ TCM을 형질도입하였다. 평균 형질도입 효능은 15%였고(9-22% 범위), 전이유전자 양성 T 세포는 tEGFR 발현을 위한 선택에 의해 10일째에 균일한 순도(>90%)로 농축되었고 증폭되었다(도 2A). 키메릭 리셉터 각각의 표면 발현을 F(ab)-특이적 항체로 염색하여 확인하였다(도 2A).
2A2 ROR1-키메릭 리셉터 각각을 발현하기 위해 변성된 CD8+ T 세포의 시험관내 작용을 분석한 결과, 자연적으로 ROR1을 발현하는 JeKo-1 MCL과 프라이머리 CLL 세포 및, ROR1으로 형질도입된 K562 세포의 특이적 용균을 제공하지만 대조용 ROR1- 표적의 인지를 제공하지는 않는 것으로 나타났다(도 2B). 짧은 '힌지 단독' 2A2 ROR1-키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포는 최대 세포독성 활성을 가지며, 종양 용균의 계층구조(짧은 것>중간 것>>긴 것)는 모든 ROR1+ 종양 표적에 대해 분명하게 나타나서(도 2B), ROR1+ 종양 세포의 인지에 대한 스페이서 도메인 길이의 중요성을 시사하였다.
양자 T 세포 요법의 항-종양 효능은 전달된 T 세포의 증식 및 생존과 연관되어 있고, 이것은 키메릭 리셉터를 통한 시그널링에 의해 변경될 수 있다. 본 발명자들은 CFSE 희석 어세이를 사용하여 Raji ROR1 또는 CLL을 연결한 후에 2A2 ROR1-키메릭 리셉터 각각으로 변성된 T 세포의 증식을 분석하였고, 짧은 스페이서 구조물이 자극 후 가장 많은 T 세포 증식을 자극하는 것을 발견하였다(도 2 C). 농축된 증식이 더 많은 활성화유도세포사(AICD)와 연관되지 않는 것을 확실히 하기 위하여, Raji/ROR1 및 JeKo-1 종양 세포로 자극한 후 프로피디움 요오드화물(PI)로 염색된 2A2 ROR1 키메릭 리셉터 변성 T 세포의 비율도 분석하였다. 중간(41.6%/42.4%) 및 긴(44.5%/48.5%) 스페이서와 비교하여 짧은 것(Raji/ROR1: 17.2%/JeKo-l: 20.2%)으로 변성된 T 세포주에서 더 적은 빈도의 PI+ CD8+ T 세포가 검출되었다.
Raji/ROR1과 프라이머리 CLL 세포로의 자극에 대한 반응에서 사이토킨 생산의 정량적 분석에서는 2A2 ROR1 키메릭 리셉터 각각을 발현하는 T 세포에 의한 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2의 생산이 나타났다. 세포독성 어세이에서 관찰된 바와 같이, 짧은 스페이서 구조물은 종양 인지 후 사이토킨 분비를 매개하는데 탁월하였다(도 2D). 따라서, 이 분석은 2A2 ROR1-키메릭 리셉터의 세포외 IgG4-Fc 스페이서 도메인의 트렁케이팅이 종양 자극 후에 세포독성, 증식 및 시험관 내 이팩터 작용의 유의한 증가를 유발하는 것을 나타내고 있다.
ROR1 Kringle 도메인에서 막 근접 에피토프에 특이적인 Rll scFv는 긴 세포외 스페이서 도메인을 필요로 한다.
ROR1의 Kringle 도메인에 특이적인 R11 scFv와 전장 또는 둔단된 IgG4-Fc 스페이서(CH3 및 힌지 단독)를 함유하는 ROR1-키메릭 리셉터를 갖는 정제된 CD8+ T 세포를 형질도입하였다. 짧은(IgG4 힌지 단독), 중간(IgG4 힌지/CH3)5 및 긴(IgG4 힌지/CH2/CH3) 벡터 각각을 사용한 형질도입 효능은 EGFR 발현으로 측정했을 때와 같았다(45-51 %)(도 3A). 각각의 벡터로 형질도입된 T 세포를 ROR1을 발현하거나 하지 않는 백혈병 또는 림프종 세포에 대한 반응에서 세포용해(도 3B), 증식(도 3C), 및 사이토킨 생산(도 3D)을 어세이하였다. 보이는 바와 같이 긴 스페이서 서열을 함유하는 R11 키메릭 리셉터로 형질도입된 T 세포만이 ROR1+ 종양을 효과적으로 인지하고 이팩터 작용을 매개할 수 있었다.
2A2보다 더 높은 친화도를 갖는 mAb R12로부터 유도된 ROR1 키메릭 리셉터는 우수한 항종양 활성을 매개한다.
다음으로, ROR1 키메릭 리셉터를 구성하는데 사용된 scFV의 친화도를 증가하여 종양 인지와 T 세포 작용에 영향을 미칠 수 있는지를 시험하였다. 본 발명자들은 2A2와 같이 ROR1의 NH2-터미널 Ig/Frizzled 도메인 내 에피토프에 결합하지만 >50배의 고도의 일가 결합 친화도를 갖는 mAb R12로부터 ROR1-특이적 키메릭 리셉터를 생성하였다.
이러한 높은 친화도 scFV를 위한 최적 스페이서 디자인이 저 친화도 scFV에 대한 것과 다른지를 측정하기 위해 R12 ROR1 키메릭 리셉터를 TgG4-Fc 스페이서 긴 것과 짧은 것으로 제조하였다. 본 발명자들은 2A2와 유사하게 짧은 스페이서 R12 ROR1 키메릭 리셉터가 개선된 세포용해 활성, 사이토킨 분비 및 증식을 제공(데이터 미도시)하는 것을 발견하였으며, 이는 더 짧은 스페이서 길이가 T 세포 활성화를 위한 T 세포와 ROR1+ 표적 세포의 우수한 공간적 결합을 제공하는 것을 나타낸다.
본 발명자들은 최적의 (짧은)세포외 스페이서와, 비교를 위한 CD3ζ (4 구조물)와 나란히 CD28 또는 4-1BB 공동자극 도메인을 함유하는 R12 및 2A2 ROR1 키메릭 리셉터를 디자인하였다(도 4A.B). ROR1-키메릭 리셉터 구조물을 건강한 공여체의 정제된 CD8+ TCM에서 발현하였고, fEGFR 염색으로 등가의 전이유전자 발현을 확인하였다(도 5A). 2A2 및 R12 ROR1-키메릭 리셉터 각각으로 변성된 T 세포는 특이적으로 K562/ROR1 및 Raji/ROR1 종양 세포를 대략적으로 등가의 효율로 용균하였다(도 5B). 그러나, 사이토킨 생산 분석에서는 CD28 또는 4-1BB를 함유하는 고 친화성 R12 RORl 키메릭 리셉터가 상응하는 2A2 구조물과 비교하여 상당히 높은 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2 생산을 제공하는 것으로 나타났다(도 5C). 본 발명자들은 CD28 공동자극 도메인을 갖는 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포가 4-1BB를 갖는 것들보다 더 많은 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2를 제조하는 것을 확인하였다.
ROR1 키메릭 리셉터 T 세포의 증식을 분석한 실험에서는 각각의 2A2 대응물을 발현하는 T 세포와 비교하여 CD28과 4-1BB 도메인을 갖는 고 친화성 R12 ROR1 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포에서 T 세포 증식의 높은 비율과 더 많은 수의 세포분열을 나타냈다(도 4D). 이러한 리셉터들에 의해 유발된 고도의 IL-2 생산과 일치하여, CD28 도메인을 갖는 키메릭 리셉터를 발현한 T 세포에서 더 활발한 증식이 있었다. Raji/ROR1 및 JeKo-1 종양 세포(R12: 5.6%/6.9% vs. 2A2: 10%/9.65%) 각각으로 자극한 후 2A2 ROR1-키메릭 리셉터와 비교하여 R12로 변성된 T 세포주에서 PI 염색으로 측정하였을 때 AICD의 빈도가 더 낮았다. CD28 도메인을 갖는 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포주는 또한 Raji/ROR1 및 JeKo-1 종양 세포(R12: 16.4%/18.4% vs. 2A2: 38.1%/39.6%) 각각에 대한 반응에서 4-1BB와 비교하여 AICD가 더 낮았다.
CD8+ T 세포에서 R12 ROR1 키메릭 리셉터로 관찰된 강화 작용이 CD4+ T 세포까지 연장되는지를 측정하기 위해, 벌크 CD4+ T 세포를 짧은 스페이서와 CD28 공동자극 도메인을 함유하는 2A2 및 R12 ROR1 키메릭 리셉터로 형질도입하였다. Raji/ROR1+ 종양 세포에 대한 반응에서, 고 친화성 R12 scFV를 발현하는 CD4+ T 세포는 높은 농도의 IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-4, 및 IL-10을 생산하였고, 2A2를 발현하는 CD4+ T 세포보다 더 많은 증식이 일어났다(도 5 A,B). 사이토킨 생산과 증식 모두 동일한 ROR1 키메릭 리셉터로 변성된 CD8+ T 세포와 비교하여 CD4+에서 훨씬 우수하였다. 요약하면, 이러한 데이터들은 비시그널링 세포외 키메릭 리셉터 스페이서 도메인의 길이와 scFV 친화성 모두를 조절하는 것은 ROR1-키메릭 리셉터 T 세포의 작용에 영향을 미치는 독립적인 매개변수라는 것을 증명한다.
고 친화성 ROR1 키메릭 리셉터로 변성된 D8 + T 세포는 시험관내 프라이머리 CLL에 대해 CD19 키메릭 리셉터에 필적하는 활성을 갖는다.
ROR1과 CD1은 모든 프라이머리 CLL에 대해 둘 다 균일하게 발현되지만(도 6A), 종양 세포 당 ROR1-분자의 절대수는 임상시험에서 CD19 키메릭 리셉터 T 세포로 성공적으로 표적화되는 CD19보다 10배 더 낮은 것으로 추정된다. 본 발명자들은 최적화된 R12 및 2A2 ROR1 키메릭 리셉터, 및 FMC63 scFV로부터 유도된 CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 CD8+ T 세포에 의한 프라이머리 CLL의 인지를 비교하였다. 키메릭 리셉터 변성을 위해 정제된 CD8+ TCM를 사용하여 균일한 세포 생성물과 짧은 IgG4-Fc '힌지 단독' 스페이서 및 4-1BB 공동자극 도메인이 함유된 각각의 키메릭 리셉터를 제공하였다. 본 발명의 CD19 키메릭 리셉터 (IgG4 힌지)가 진행중인 임상시험에서 사용되고 있는 CD8a 힌지 스페이서와 4-1BB 공동자극 도메인을 갖는 CD19 키메릭 리셉터보다 CD19+ 종양을 인지하는데 적어도 같으며 더 효과적인 것을 확인하였다(도 20). 4-1BB와 CD3제타 및 변성 IgG4-Fc 힌지를 갖는 CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포는 4-1BB와 CD3제타 및 CD8 알파 힌지를 갖는 CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포와 비교하여 우수한 시험관내 및 생체내 작용을 나타낸다. 도 20D에서, IgG4 Fc 힌지(그룹 1) 또는 CD8 알파 힌지 (그룹 2)를 갖는 CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포와 반딧불이 루시퍼라제(ffluc)를 발현하는 Raji 종양 세포가 접종된 NSG 마우스에서 tEGFR만(그룹 3)을 발현하는 T 세포의 생체내 항종양 활성을 비교하였다. 마우스를 종양 접종 17일 후와 T 세포 접종 10일 후에 이미지화하였다. 데이터는 CD19 키메릭 리셉터 IgG4 Fc 힌지 T 세포로 처리된 마우스(그룹 1)와 비교하여 대조용 tEGFR T 세포(그룹 3) 또는 CD19 키메릭 리셉터 CD8 알파 힌지 T 세포 (그룹 2)로 처리된 마우스에서 더 커다란 종양 부담을 나타내고 있다.
다중 CLL 환자(n=4)의 프라이머리 종양 세포에 대한 R12 ROR1 키메릭 리셉터 T 세포의 세포용해 활성은 저 친화성 2A2 ROR1 키메릭 리셉터로 변성된 T 세포보다 더 높았고, CD19 키메릭 리셉터 T 세포로 관찰된 용균과 동등하였다(도 6B). 멀티플렉스 사이토킨 분석은 IFN-γ와 TNF-α의 거의 동등한 생산을 나타내었지만, 프라이머리 CLL과 동시배양한 후 CD19-키메릭 리셉터를 발현하는 것들과 비교하여 R12 ROR1을 발현하는 CD8+ T 세포에 의한 IL-2 생산은 더 적었다(도 6C). 2A2 ROR1 키메릭 리셉터 T 세포는 앞서 기재한 바와 같이 R12 ROR1 키메릭 리셉터 T 세포보다 더 적은 양의 모든 사이토킨을 생산하였다. CLL로 자극한 후 키메릭 리셉터로 형질도입된 T 세포 전부에 의한 사이토킨 생산은 Raji/ROR1를 갖는 것보다 실질적으로 더 적었고, CLL과 달리 키메릭 리셉터 T 세포에서 발현된 CD28을 결합할 수 있는 CD86과 CD80 둘다를 발현한다(도 6A,C).
CLL로 자극한 후에 CD19 키메릭 리셉터와 비교하여 R12 및 2A2 ROR1 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포의 증식이 더 적은 것이 관찰되었다(CD19>R12>2A2) (도 6D). CLL에 대한 반응에서 CD8+ ROR1 키메릭 리셉터 T 세포의 증식은 CD8+ TCM과 비교하여 이들의 더 높은 IL-2 분비로 인하여 키메릭 리셉터-변성 CD4+ T 세포의 존재 하에 증가될 수 있는 것으로 추정된다(도 4A; 도 8A). 이러한 가능성을 시험하기 위하여, CD4+와 CD8 TCM을 R12 ROR1, 2A2 ROR1 및 CD19 키메릭 리셉터 각각으로 별도로 변성하고, 키메릭 리셉터 발현에서 농축하여 1:1 비율로 조합하여 각각의 벡터로 변성된 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 동등한 비율을 얻는 시험관내 동시배양 실험을 수행하였다. 이 세포들을 CFSE 표지하고 프라이머리 CLL로 자극하였다. 비형질도입 CD4+ T 세포가 아니지만, 키메릭 리셉터-형질도입물의 첨가 후 CD8+ R12 ROR1 키메릭 리셉터 T 세포의 증식에서 극적인 증가가 관찰되었다(도 8B). 특히, CD4 도움이 제공되었을 때 CLL에 대한 반응에서 R12 ROR1 및 CD19 키메릭 리셉터 CD8+ T 세포의 동등한 증식이 관찰된 반면, 저 친화성 2A2 ROR1 키메릭 리셉터를 발현하는 CD8+ T 세포의 증식은 여전히 더 적었다. 총괄적으로, 데이터는 고 친화성 R12 ROR1 키메릭 리셉터가 시험관 내에서 프라이머리 CLL 세포에 대한 2A2와 비교하여 월등한 반응성을 제공하는 것을 나타내고 있다.
ROR1-키메릭 리셉터 T 세포는 전신적 맨틀 세포 림프종의 마우스 모델에서 생체내 항종양 활성을 매개한다.
고 친화성 R12 키메릭 리셉터로 변성된 T-세포의 우수한 시험관내 활성이 생체 내에서 개선된 항종양 활성으로 번역되는지와, CD19를 표적화하는 것과 비교하여 어떻게 ROR1을 표적으로 하는지는 불명확하다. 이러한 의문을 해결하기 위하여 면역결핍 NSG 마우스 집단을 꼬리정맥 주사에 의해 인간 MCL계 JeKo-l/ffluc로 접종하고, 종양이 번진 7일 후에 마우스를 R12 ROR1, 2A2 ROR1 또는 CD19 키메릭 리셉터 CD8+ T 세포의 정맥내 단일 치료로 처리하였다. 대조용 마우스는 tEGFR T 세포로 처리하거나 미처리하였다. 모든 키메릭 리셉터는 최적의 짧은 스페이서와 4-1BB 공동자극 도메인을 가졌다. 미처리 NSG/JeKo-1 마우스는 급성 진행성 전신 림프종이 발명하여 종양을 접종한 대략 4주 후에 안락사가 필요하였다(도 9A-C).
종양 퇴행과 R12 ROR1, 2A2 ROR1 및 CD19 키메릭 리셉터 T 세포로 처리된 모든 마우스에서 생존율 개선이 관찰되었다. R12 ROR1 키메릭 리셉터 T 세포로 처리된 마우스는 2A2 ROR1 키메릭 리셉터 T 세포로 처리된 마우스(p<0.01)와 비교하여 우수한 항종양 반응과 생존율, 및 CD19 키메릭 리셉터 T-세포로 처리된 마우스에 필적하는 항종양 활성을 가졌다(도 9A-C).
양자 전달 후 말초혈액 내 키메릭 리셉터 T-세포의 빈도를 분석하고 2A2 ROR1 키메릭 리셉터와 비교하여 R12 ROR1 키메릭 리셉터로 처리된 마우스에서 다량의 tEGFR-/- T 세포를 검출하여, 생체내 개선된 종양 제어에서 더 활발한 증식을 시사하였다. 이를 확인하기 위하여 CFSE-표지 CD19 키메릭 리셉터, R12 및 2A2 ROR1 키메릭 리셉터 T 세포를 JeKo-l/ffluc를 갖는 NSG 마우스 집단에 투여하고 전달한 72시간 후에 말초 혈액, 골수 및 비장에서 T-세포 증식을 분석하였다. 높은 비율의 R12 및 CD19 키메릭 리셉터 T 세포가 증식하였고 2A2 ROR1 키메릭 리셉터 T 세포와 비교하여 더 많은 세포분열이 일어났다(도 9D). JeKo-1 종양은 결국 ROR1 또는 CD19 키메릭 리셉터 T 세포로 처리된 모든 마우스에서 재발하였다(도 9A-C). 종양 재발은 ROR1 또는 CD19 결실 변이체의 선택 결과가 아니며, 그 이유는 재발 종양이 양 분자에 양성이기 때문이다.
비교를 위하여, Raji 종양이 이식된 NSG 마우스에서 CD19 키메릭 리셉터 T 세포의 항종양 효능을 분석하였고 완전한 종양 제거가 관찰되어 JeKo-1의 재발은 이러한 종양을 치료하는 어려움을 반영하였다(데이터 미기재). 요약하면, 이러한 데이터는 ROR1 키메릭 리셉터 T 세포가 생체 내에서 항종양 효능을 가지는 것을 나타내고, B-세포 악성종양의 경우 R12 같은 최적화된 ROR1 키메릭 리셉터가 효과적이며 ROR1 발현이 없는 정상 CD19+ B-세포를 절약할 수 있는 것을 시사하는 최초이다.
R12 ROR1 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포는 ROR1 + 상피 종양 세포에 대한 2A2보다 우수한 반응성을 갖는다.
ROR1 발현이 ROR1 키메릭 리셉터 T 세포에 의한 인지에 충분한지는 알려져 있지 않지만 ROR1은 다양한 상피 종양에서 검출된다. 유동세포계수법을 사용하여 유방암 세포주 MDA-MB-231 및 468과, 신장세포암종 FARP, TREP, 및 RWL에서 ROR1 발현을 확인하였다(도 10A). 이후, 최적의 짧은 스페이서 및 4-1BB 도메인을 갖는 R12 ROR1 키메릭 리셉터로 형질도입된 CD8+ T 세포에 의한 종양 인지를 분석하여 MDA-MB-231, MDA-MB-468, FARP, TREP 및 RWL에 대한 효과적인 인지를 관찰하였다(도 11A). MDA-MB-231과 공동배양한 후 R12 및 2A2 ROR1-키메릭 리셉터로 변성된 T 세포의 사이토킨 분비와 증식을 분석하였고 R12 ROR1 키메릭 리셉터를 사용한 더 많은 사이토킨 생산과 증식을 관찰하였다(도 11B,C). ROR1+B 세포 악성종양으로 관찰된 것과 유사하게, MDA-MB-231로의 자극 후 R12 ROR1 키메릭 리셉터 T 세포의 우수한 활성화는 증가된 AICD와 연관되지 않았다(R12: 9.8% vs. 2A2: 10.9%).
논의
ROR1은 수많은 B-림프종과 상피암, 예를 들어 폐, 결장 및 신장세포암의 서브세트의 표면에서 발현하기 때문에 ROR1은 암 면역요법의 잠재적 표적으로 관심을 끌고 있다. 본 발명자들은 이미 CLL과 MCL이 ROR1-특이적 키메릭 리셉터를 발현하기 위해 변성된 T 세포에 의해 특이적으로 인식되는 것을 입증하였다(Hudecek M, et al. Blood. 2010;116(22):4532-41. Epub 2010/08/13). ROR1-키메릭 리셉터의 디자인과 작용은 세포외 도메인의 변성과 고 친화성 scFV로부터 키메릭 리셉터를 유도하여 개선되었고, 디자인된 ROR1 키메릭 리셉터로 변성된 T 세포가 ROR1+ B-세포 림프종에 대한 생체내 활성과 다양한 범위의 상피 종양에 대한 시험관내 활성을 가지는 것을 나타내고 있다.
본 발명자들이 제시한 고농도 세포표면 발현이 가능한 원래의 긴 IgG4-Fc '힌지-CH2-CH3'.스페이서, 또는 둔단된 중간 '힌지-CH3' 및 짧은 '힌지 단독' 스페이서 변이체를 함유하는 2A2 mAb에서 유도된 ROR1 키메릭 리셉터로 변성된 T-세포의 작용을 비교하였다. 본 발명에서는 가요성 스페이서가 T 세포 막에서 scFV를 단리하고 종양 세포 상의 항원 인지를 하는데 필요하다는 이전 데이터에 기반하여 본 발명의 짧은 스페이서 구조물에서 12 AA 힌지 도메인을 보존하였다(Fitzer-Attas CJ, et al., Harnessing Syk family tyrosine kinases as signaling domains for chimeric single chain of the variable domain receptors: optimal design for T cell activation. J Immunol. 1998;160(l):145-54. Epub 1998/04/29.)
2A2 ROR1 키메릭 리셉터를 사용한 본 발명자들의 연구에서는 종양 세포 인지 후 T 세포 사이토킨 분비와 증식이 긴 스페이서 구조물과 비교하여 중간 및 짧은 스페이서 구조물보다 더 뛰어난 것으로 나타났다. 항-F(ab) Ab로의 염색은 3종의 리셉터 모두의 동등한 키메릭 리셉터 발현을 나타내어 짧은 스페이서 키메릭 리셉터를 갖는 개선된 T 세포 작용이 키메릭 리셉터 밀도의 차이로 인한 것이 아님을 입증하였다. 이러한 데이터는 세포외 스페이서의 디자인이 각각의 표적 분자와 에피토프에 맞추어져야 하는 원리를 지지한다.
키메릭 리셉터를 디자인하기 위해 선택된 scFV의 친화성은 T 세포 인지에 영향을 줄 수 있는 추가 매개변수이다. 상이한 친화도의 ROR1-특이적 mAb 패널을 생성하여 특성화하고 R12 mAb를 선택하였으며, 이것은 Ig-유사/Frizzled 영역 내 에피토프를 2A2로서 인지한다. R12는 매우 천천히 해리하기 때문에 ROR1-단백질에 대해 높은 친화도를 갖는다. 2A2 키메릭 리셉터 같은 R12 키메릭 리셉터는 짧은 세포외 스페이서로 디자인될 때 최적의 T 세포 인지 및 작용을 제공한다. 2A2 및 R12 키메릭 리셉터로 변성된 T 세포에 의한 종양 참여 후에 증식 및 사이토킨 생산의 직접적 비교는 고 친화성 mAb에서 유도된 R12 키메릭 리셉터가 월등하다는 것을 증명한다. 본 발명자들은 ROR1에서 R12의 저속 해리가 T 세포 활성화를 연장하고 AICD에 대해 증가된 감수성을 제공할 수 있는 것을 우려하였다. 그러나, 2A2와 비교하여 R12 ROR1-키메릭 리셉터로 변성된 T 세포에서 AICD의 더 낮은 비율을 검출하였으며, 이것은 R12의 증가된 친화도가 본 발명의 기본 모델에서 T 세포 생존율에 대해 유해한 효과를 갖지 않는 것을 나타낸다.
ROR1은 정상적인 성숙한 천연 및 기억 B-세포에서 발현되지 않으므로 CLL 및 MCL의 표적으로서 CD19에 대해 잠재적 이점을 가진다. 그러나, CD19와 비교하여 B-세포 종양에서 ROR1 분자의 수가 더 적고, 최적화된 ROR1 키메릭 리셉터가 디자인에서 임상에 사용되는 것들과 유사한 CD19 키메릭 리셉터 만큼 효과적일지는 불확실하다. 불행하게도, Raji, Daudi 및 Nalm-6 같은 CD19-키메릭 리셉터 T 세포의 작용을 평가하기 위해 NSG 마우스에서 이전에 사용된 B-세포 종양 이종이식 모델은 CLL 또는 MCL로부터 유도되지 않으며, 본질적으로 ROR1을 발현하지 않는다. 따라서, 생체 내에서 CD19 및 ROR1을 표적화하는 것을 비교하기 위하여 CD19 및 ROR1 모두를 자연적으로 발현하고 NSG 마우스에 이식하는 JeKo-1 MCL 세포주를 사용하였다. 본 발명의 모델을 임상적으로 연관시키기 위해 JeKo-1 림프종 세포를 정맥 내로 접종하여 전신 종양을 생성하고, 일단 종양이 발생되면 균일한 농도의 T 세포 생성물로 마우스를 처리하였다. 고 친화성 R12 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포가 CD19 키메릭 리셉터 T 세포로서 생체 내에서 동등한 항종양 활성을 제공하는 것을 발견하였다. 본 발명의 시험관내 분석에 부합하여, R12 ROR1 키메릭 리셉터도 최적 2A2 ROR1-키메릭 리셉터와 비교하여 생체 내에서 우수한 활성을 매개하였다. 마우스 종양 모델은 임상 설정에서 양자 치료 효과를 예측할 수 없는 경우가 있으므로 이러한 결과는 신중하게 해석되어야 한다. 그러나, 이 결과는 ROR1이 CD19에 대한 대안으로서의 고려를 보증하거나, CD19 손실 변이체가 발생할 가능성을 최소화하기 위해 추가 표적을 제공하는 것을 시사하고 있다.
ROR1은 일부 상피 종양의 생존에서 결정적인 역할을 하는 것으로 보인다. 따라서, ROR1을 표적으로 하는 이점은 단일 키메릭 리셉터가 다량의 조혈 및 비조혈 종양으로 환자를 치료하는데 유용할 수 있다.
본 데이터는 처음으로 지정된 ROR1 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포가 시험관 내에서 상피암을 효과적으로 인지하는 것을 제시하였다. ROR1+ 유방암 세포로 유발된 사이토킨 분비와 T 세포 증식은 CD80/86 공동자극 리간드의 부재에도 불구하고 백혈병 세포로 유발된 것보다 더 높았다. 보고된 연구는 세포외 스페이서 도메인과 키메릭 리셉터 친화도의 디자인이 ROR1-키메릭 리셉터 변성 T 세포에 의한 시험관내와 생체내 ROR1+ 혈액학적 및 상피 종양의 인지를 증강하기 위해 조절될 수 있는 매개변수인 것을 증명하였다. 증강된 종양 반응성을 갖는 ROR1-키메릭 리셉터의 개발은 다양한 인간 암에서의 임상적 적용 기회를 제공한다.
실시예 2 -
종양 세포막에 근접하여 위치하는 에피토프를 인지하는 Her2-특이적 키메릭 리셉터를 사용한 종양 세포 용균 촉발에 대한 세포외 스페이서 도메인 길이의 효과
인지에 대한 CAR 스페이서 길이의 효과 및 HER2-특이적 키메릭 리셉터를 발현하는 CD8+ 인간 T 림프구에 의한 종양 세포 인지의 촉발을 ROR1에 대해 상기한 것들과 유사한 방법을 사용하여 시험하였다. HER2-특이적 키메릭 리셉터를 HER2 상에서 막 근접 에피토프를 인지하는 HER2-특이적 mAb의 VL 및 VH 사슬 세그먼트를 사용하여 구성하였고(도 12A), scFV를 IgG4 힌지/CH2/CH3, IgG4 힌지/CH3, 및 IgG4 힌지 단독 세포외 스페이서 도메인, 및 CD28 막통관 도메인, 4-1BB 및 CD3 제타 시그널링 도메인에 연결하였다(도 12B). 프라이머리 CD8+ T 세포를 각각의 HER2 키메릭 리셉터로 형질도입하여 EGFR 형질도입 마커의 발현에서 선택하였다(도 12D). HER 2 키메릭 리셉터의 발현과 각 리셉터 크기를 웨스턴 블롯으로 확인하였다(도 12C). 이후 T 세포를 항 CD3 mAb와 공급체 세포로 증폭하였고 HER2+ 종양 세포를 인지하는 그의 능력을 시험하였다. R11 ROR1 특이적 키메릭 리셉터로 관찰된 바와 같이, 세포외 긴 스페이서 도메인을 함유하는 HER2 키메릭 리셉터는 HER2+ 종양 세포의 월등한 T 세포 인지를 제공하였다(도 12E).
논의
종양 세포의 키메릭 리셉터 변성 T 세포 인지에 대한 세포외 스페이서 길이의 효과에 대한 이 실시예에서는 헤르셉틴 키메릭 mAb의 VH+L 서열로부터 구축된 scFv를 포함하는 키메릭 리셉터를 사용하였다. Cho 등(Nature 421 :756, 2003)의 연구는 HER2 (ERRB2) 세포외 도메인에서 막 근접 위치에 헤르셉틴(Herceptin)의 에피토프 위치로 국한되었다(도 12A). 인간 TgG4 힌지:Fc 변이체의 구조(도 12B)에 대한 본 발명의 이해에 기초하여, 세포외 종양 세포 항원 상의 표적 에피토프의 막 근접 위치가 긴 스페이서를 코딩하는 키메릭 리셉터를 발현하는 이팩터 T 세포로 최대 인지될 것으로 추정하였다. 본 데이터는 짧은 스페이서 헤르셉틴 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포에 의한 거의 바닥 활성부터 중간 길이 스페이서 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포에 의한 중간 활성, 및 긴 스페이서 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포에 의한 최대 용균까지의 세포분해 활성의 그래디언트를 나타내고 있다. 따라서, 세포외 스페이서는 T 세포에 의한 종양 인지에서 확실한 효과를 가지며, 이 데이터는 종양 발현 표적 분자의 에피토프 위치에 기초한 키메릭 리셉터 디자인을 제작할 필요에 대한 또다른 지원을 제공한다.
실시예 3 - 스페이서 길이 및 키메릭 리셉터 변성 T 세포를 갖는 CD19의 최적 인지 및 생체내 효능을 위한 서열의 지정
재료 및 방법
인간 대상체
Institutional Review Board of the Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC)에 의해 인증된 연구 계획에 참여하는 서면 정보 동의를 제출한 건강한 공여자로부터 혈액 샘플을 얻었다. 말초혈액단핵세포(PBMC)를 Ficoll-Hypaque(Sigma, St.Louis, MO)에 대해 원심분리로 단리하여 RPMI, 20% 인간 혈청 및 10% 디메틸 설폭사이드 중에서 저온보존하였다.
세포주
K562, Raji, JeKo-1, 및 293T 세포주를 American Type Culture Collection (Manassas, VA)으로부터 입수하여 지시된 대로 배양하였다. T2A 서열과 eGFP의 상부에서 ffluc-유전자를 코딩하는 렌티바이러스를 293T 세포에서 제조하여 Raji 및 JeKo-1 종양 세포를 형질도입하기 위해 사용하였다. Raji, 및 JeKo-1 세포를 렌티바이러스 형질도입 후에 증폭하여 eGFP 양성 서브세트 분류 정제하였다.
면역표현형검사
PBMC와 T 세포주들을 하나 이상의 다음 컨쥬게이트 모노클로날 항체로 염색하였다: CD3, CD4, CD8, CD25, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD69 및 매칭된 이소형 대조군(BD Biosciences). 프로피디움 요오드화물(PI, BD Biosciences) 염색을 생/사 세포 식별을 위해 제조업체의 지시에 따라 수행하였다. 유동 분석을 FACSCanto®에서, FACSAriaII®(Becton Dickinson)에서 분류-정제를 수행하였고, FlowJo 소프트웨어 (Treestar)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
벡터 구성 및 CD19 키메릭 리셉터 인코딩 렌티바이러스의 제조
CD19 특이적 키메릭 리셉터를 다음을 사용하여 구성하였다: (1) CD19-특이적 mAb FMC63의 VL 및 VH 사슬 세그먼트(서열번호:3), (G4S)3 링커(서열번호:12) 펩티드(VL-링커-VH)에 의해 연결; (2) 힌지-CH2-CH3 부분(229 AA, (서열번호:)) 또는 힌지 단독(12 AA; (서열번호:4))를 포함하는 IgG4-Fc (Uniprot Database: P01861, (서열번호: 13))로부터 유도된 스페이서 도메인. 두 스페이서 모두 천연 IgG4-Fc 단백질의 108 위치에 있는 힌지 도메인 내에 S→ P 치환; 인간 CD28의 27 AA 막통관 도메인(Uniprot: PI 0747, 서열번호: 14)을 함유하였다; (4) (i) 천연 CD28 단백질의 186-187 위치에 위치한 LL→ GG 치환을 갖는 인간 CD28의 41 AA 세포질 도메인(서열번호: 14); 및/또는 (ii) 인간 4-1BB의 42 AA 세포질 도메인(Uniprot Database: Q07011, 서열번호: 15)을 포함하는 시그널링 모듈; 이것은 (iii) 인간 CD3ζ의 이소형태 3의 112 AA 세포질 도메인(Uniprot Database: P20963, 서열번호; 16)에 연결되고; 자가분해 T2A 서열(서열번호: 8); 및 (6) 둔단된 상피성장인자 리셉터(EGFR) 서열(서열번호:9).
코돈 최적화 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 각각의 전이유전자를 합성하였고(LifeTechnologies, Carlsbad, CA), NheI와 Notl 제한부위를 사용하는 epHIV7 렌티바이러스 벡터에 클론하였다. epHIV7 렌티바이러스 벡터를 pHIV7 벡터로부터 pHIV7의 사이토메갈로바이러스 프로모터를 EF-1 프로모터로 대체하여 유도하였다.
CD19 키메릭 리셉터 또는 tEGFR-코딩 렌티바이러스를 렌티바이러스 벡터와 패키징 벡터 pCHGP-2, pCMV-Rev2 및 pCMV-G로 동시형질감염된 293T 세포에서 Calphos® 형질감염제(Clontech)를 사용하여 제조하였다. 배지를 형질감염하고 16 h에 교환하고 렌티바이러스를 24, 48 및 72 h 후에 수집하였다.
CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포주의 생성
정상 공여자의 분류 정제된 CD8+ CD45RA- CD45RO+ CD62L+ 중추 기억 T 세포(TCM)를 제조업체의 지시에 따라 항-CD3/CD28 비즈(Life Technologies)로 활성화하고, 2,100 rpm으로 45분 동안 32 ℃에서 원심분리하여 활성화한 후 3일째에 1 μg/mL 폴리브렌(polybrene)(Millipore)이 보충된 렌티바이러스 상징액(MOI = 3)으로 형질도입하였다. T 세포를 재조합 인간(rh) IL-2로 50 U/mL의 최종 농도로 48 h 마다 보충된, RPMI, 10% 인간 혈청, 2 mM L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (CTL 배지)으로 증폭하였다. 증폭한 후, 형질도입된 T 세포주 각각의 분액을 비오틴-컨쥬게이트 항-EGFR(상피성장인자 리셉터) 항체 및 스트렙타비딘-비즈 (Miltenyi)로 염색하고 tEGFR+ T 세포를 면역자성 선택으로 단리하였다.
이후, tEGFR+ T 세포 서브세트를 조사(8,000 rad)된 TM EBV-LCL로 1:7의 T 세포:LCL 비율에서 자극하고, 50 U/mL rh IL-2를 48 h 마다 첨가하여 CTL 배지에서 8일 동안 증폭하였다.
크롬 방출, 사이토킨 분비 및 CFSE 증식 어세이
표적 세포를 51Cr(PerkinElmer)로 밤새 표지하고, 세척하여 3회 1-2x103 세포/well로 이팩터 T 세포와 다양한 이팩터 대 표적(E:T) 비율로 인큐베이션하였다. 4시간 인큐베이션한 후 γ-카운팅에서 상징액을 수집하고 특이적 용균을 표준식을 사용하여 계산하였다. 사이토킨 분비 분석에서는 표적과 이팩터 세포를 3회 웰에 2:1 (Raji), 또는 4:1 (K562/CD19 및 K562)의 E:T 비율로 도포하고, 상징액에서 멀티플렉스 사이토킨 면역어세이(Luminex)로 측정된 IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-6 및 IL-10을 24-h 인큐베이션 후에 제거하였다.
증식의 분석을 위해 T 세포를 0.2 μM 카복시플루오레신 숙신이미딜 에스테르(CFSE, Invitrogen)로 표지하고 세척하여 3회 웰에서 자극인자 세포로 2:1 (Raji), 또는 4:1 (K562/CD19 및 K562)의 비율로 외인성 사이토킨이 없는 CTL 배지에서 도포하였다. 72시간 인큐베이션한 후, 세포를 항-CD8 mAb와 프로피디움 요오드화물(PI)로 표지하여 죽은 세포를 분석에서 제외하였다. 샘플을 유동세포계수법으로 분석하여 살아있는 CD3+ T 세포의 세포분열을 CFSE 희석으로 평가하였다.
NOD/SCID 및 NOD/SCID/ γc -/- (NSG) 마우스 실험
FRCRC 동물실험윤리위원회(FRCRC Institutional Animal Chimeric receptore and Use Committee)가 모든 마우스 실험을 승인하였다. 6- 내지 8-주령의 암컷 NOD.CBI17-Prkdcscid/J(NOD/SCID) 및 NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtmlWjl/SzJ (NSG) 마우스를 Jackson Laboratory 또는 인하우스(FRCRC) 사육으로 입수하였다. 마우스의 꼬리 정맥 주입을 통해 0.5x106 Raji/ffluc 종양 세포를 정맥내 주사(i.v.)하고, 지시된 바와 같이 꼬리 정맥 주사로 키메릭 리셉터-변성 또는 대조용 T 세포, 또는 PBS를 주사하였다.
생체발광 이미지화를 위해 PBS에 재현탁된, 새로 제조된 루시페린 기질(Caliper Life Sciences, MA)을 마우스에 복강내(i,p.) 주사한(15 μg/g 체중) 다음, 흡기 챔버 내에서 이소플루란으로 마취하였다. 깊은 마취를 유도한 후, 마우스를 Xenogen IVIS In Vivo Imaging System (Caliper Life Sciences, MA)을 사용하여 스몰 비닝 모드(small binning mode)로 루시페린을 i.p. 주사한 10, 12 및 14분 후 불포화 이미지를 얻기 위한 1 s 내지 1 min의 취득 시간에 이미지화하였다. 루시퍼라제 활성은 Living Image Software (Caliper)와 개별 마우스 각각의 전신dmf 포함하는 관심 영역에서 분석된 광자속(photon flux)을 사용하여 분석하였다.
통계적 분석
Prism Software(GraphPad, CA)를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 스튜던트 t-시험을 95%의 신뢰성 간격으로 양측 대 시험으로 수행하였고, p<0.05의 p값을 갖는 결과를 유의한 것으로 간주하였다. 생존율의 통계적 분석은 로그순위 시험으로 수행하였고 p<0.05의 p값을 갖는 결과를 유의한 것으로 간주하였다.
결과
세포외 스페이서 긴 것과 짧은 것을 갖는 CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 폴리클로날 CD8 + T CM -유도 세포주의 제조
CD19 키메릭 리셉터-변성 T 세포의 시험관내 작용과 생체내 항종양 활성에 대한 세포외 스페이서 길이의 영향을 시험하기 위하여 코돈 최적화된 CD19 키메릭 리셉터 유전자의 패널을 코딩하는 개별 렌티바이러스 벡터를 구성하였다. 키메릭 리셉터 각각은 CD19-특이적 mAb FMC63의 서열에 상응하는 단일사슬 가변 단편(scFv: VL-VH), '힌지-CH2-CH3' 도메인 (229 AA, 긴 스페이서) 또는 '힌지' 도메인 단독 (12 AA, 짧은 스페이서)을 포함하는 IgG4-Fc에서 유도된 스페이서, 및 막 근접 CD28 또는 4-1BB 공동자극 도메인을 단독으로 또는 동시에 갖는 CD3ζ의 시그널링 모듈로 구성되었다(도 13A). 전이유전자 카세트는 키메릭 리셉터 유전자로부터 하부에 둔단된 EGFR (tEGFR)을 포함하고 분해가능한 T2A 요소에 의해 분리되어 키메릭 리셉터-변성 T 세포를 위한 형질도입, 선택 및 생체내 트래킹 마커로 작용한다.
본 발명자들은 형질도입과 증폭을 위해 정상 공여자의 혈액으로부터 세포 분류에 의해 CD8+ CD45RO+ CD62L+ 중추 기억 T 세포(TCM) 세포군을 단리하였고, 이것은 양자 전달 후에 생체 내에서 지속하는 TCM의 탁월한 능력 때문이다. CD8+ T 세포를 CD3/28 비즈로 자극하여 렌티바이러스 벡터 각각으로 형질도입하고 시험관내와 생체내 실험에서 사용하기 전에 18일 동안 배양으로 증폭하였다.(도 13B) 유사한 형질도입 효능이 렌티바이러스 벡터 각각으로 얻어졌으며(평균 25%), 전이유전자 양성 T 세포를 비오틴화된 항-EGFR mAb 및 스트렙타비딘 비즈를 사용하여 면역자성 선택에 의해 균일한 순도로 농축하였다. tEGFR-농축 후에, CD19 키메릭 리셉터 T 세포주 각각을 다양한 CD19 키메릭 리셉터 구조물을 발현하는 T 세포주들 사이에서 시험관내 성장 키네틱스의 분명한 차이 없이 CD19+B-LCL을 사용한 단일 자극으로 증폭하였다. 증폭 후, tEGFR 마커는 각각의 벡터로 형질도입된 T 세포 >90%에서 동등한 농도로 발현되었다(도 13C).
세포외 스페이서 도메인 긴 것과 짧은 것을 갖는 CD19 키메릭 리셉터는 시험관 내에서 특이적 항종양 반응성을 제공한다.
CD28과 4-1BB 공동자극 시그널링 잔기, 및 짧은('short/CD28';'short/4-1BBr') 또는 긴('long/CD28';'long/4-lBB') 세포외 스페이서 도메인 각각을 갖는 CD19 키메릭 리셉터를 발현하기 위해 변성된 TCM으로 유도된 T 세포의 이팩터 작용을 비교하였다. 4 CD19 키메릭 리셉터 구조물 각각을 발현하는 T 세포는 CD19+ Raji 및 JeKo-1 림프종 세포, 및 천연 CD19- K562 세포가 아니라 CD19로 안정하게 형질감염된 K562 세포에 대해 특이적 세포용해 활성을 제공하였다(도 14A). 멀티플렉스 사이토킨 어세이(Luminex)에 의해 K562/CD19 또는 Raji 종양 세포로의 자극에 대한 반응에서 사이토킨 생산의 정량적 분석은 각각의 CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포에 의한 IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-6, 및 IL-10의 생산을 나타냈다(도 14B). CD28 공동자극 도메인을 갖는 CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포는 4-1BB 공동자극 도메인을 갖는 상응하는 구조물과 비교하여 상당히 고농도의 IFN-γ, TNF-α, IL-2 및 IL-10을 생산하였다(도 14B,C). 'short/CD28' 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포와 비교하여 CD19 'long/CD28' 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포에 의해 IFN-γ의 생산은 상당히 많았고 IL-4 생산은 상당히 적었다. 4-1BB 공동자극 시그널링 분자를 갖는 CD19 키메릭 리셉터 중에서 짧은 스페이서 도메인을 갖는 구조물을 발현하는 T 세포에서 상당히 높은 농도의 IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-4 및 IL-10 분비를 검출하였다(도 14B, C).
CD19+ 종양 세포 참여 후 CD19 키메릭 리셉터 각각으로 변성된 T 세포의 증식을 분석하기 위해 CFSE 염료 희석을 사용하였다. CD19 키메릭 리셉터 T 세포주 각각의 특이적이고 활발한 증식을 K562/CD19 또는 Raji를 사용한 자극 후에 72시간 동안 관찰하였다. 세포분열의 평균적인 수는 4-1BB를 갖는 것들과 비교하여 CD28 공동자극 도메인을 갖는 CD19 키메릭 리셉터 T 세포에서 더 높았고 CD28 함유 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포에 의한 더 많은 IL-2 생산과 일치하였다(도 14B-D). 본 발명자들은 또한 배양물을 CD3+ 및 PI로 염색하여 72시간의 말단에서 K562/CD19 및 Raji 종양 세포로 자극한 후 활성화유도세포사가 일어나는 키메릭 리셉터 T 세포의 비율을 분석하였다. CD19 키메릭 리셉터 세포주 'long/4-1BB'에서 CD3+ CD8+ PI+ T 세포의 높은 빈도를 검출하였으나, 다른 CD19 키메릭 리셉터로는 PI+ 세포가 거의 검출되지 않았다(도 14E).
시험관내 이팩터 작용의 이러한 분석은 CD28과 4-1BB 공동자극 도메인을 비교한 이전 연구와 일치하며, 이 패널의 특정 CD19 키메릭 리셉터 구조물은 생체 내에서 항종양 효능이 결핍하는 것을 시사하는 T 세포 작용의 차이를 나타내지 않았다.
긴 세포외 스페이서 도메인이 아니라 짧은 세포외 스페이서 도메인을 갖는 CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포는 면역결핍 마우스 모델에서 Raji 종양을 제거한다.
본 발명자들은 다음으로 생체발광 이미징을 사용하여 종양 부담과 분포의 연속적 정량분석이 가능한, 반딧불이 루시퍼라제 형질감염 Raji 세포 (Raji-ffluc)가 이식된 면역결핍(NOD/SCTD) 마우스에서 CD19 키메릭 리셉터 각각으로 변성된 T 세포의 생체내 항종양 효능을 평가하였다. 꼬리정맥 주사로 0.5x106 Raji-ffluc 세포가 접종된 NOD/SCID 마우스에서 파종성 림프종을 진행하였고, 이것은 처리하지 않으면 대략 3.5주 후에 뒷다리 마비를 유발하여 안락사가 필요하였다. 종양을 가진 마우스를 각각의 CD19 키메릭 리셉터 또는 tEGFR 대조용 벡터로 변성된 CD8+ TCM-유도 T 세포 2 용량을 종양 접종 후 2일째와 9일째에 투여하여 처리하였다(도 15A).
놀라웁게도, 짧은 세포외 스페이서 도메인('short/CD28' 및 'short/4-1BB')을 갖는 CD19 키메릭 리셉터를 발현하기 위해 변성된 T 세포만이 이 모델에서 Raji 종양을 제거하였지만, 긴 스페이서('Iong/CD28' 및 'long/4-1BB')를 갖는 CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포로 처리된 마우스는 전신 림프종과 뒷다리 마비가 진행되어 미처리된 마우스 또는 대조용 tEGFR+ T 세포로 처리된 마우스처럼 거의 동일한 키네틱스를 가졌다(도 15B, C). 스페이서 도메인 짧은 것과 긴 것을 갖는 CD19 키메릭 리셉터 사이에서 항종양 활성의 현저한 차이는 매우 의미 있고, 상이한 정상 공여체 3에서 생성된 키메릭 리셉터 T 세포주를 사용한 다수의 실험에서 재현할 수 있었다.
종양 접종과 T 세포 투여 사이의 짧은 간격과 NOD/SClD/γc -/-(NSG) 같은 면역결핍성이 큰 마우스 균주와 비교하여 인간 세포의 이식에 대한 강력한 저항성으로 인해 임상적 설정에서 항종양 활성을 예측하는데 NOD/SCID 림프종 모델은 차선일 수 있다. 따라서, 보다 임상적으로 관련된 모델에서 양자 요법의 항종양 활성을 평가하였으며, 여기에서 Raji-ffluc 림프종을 NSG 마우스에서 구축하고, CD19 키메릭 리셉터 T 세포를 종양이 골수에서 생체발광 이미징으로 용이하게 검출가능한 7일 후에 투여하였다(도 16A). 본 발명자들은 구축된 Raji 종양의 제거에 필요한 CD19 'short/4-1BB' 키메릭 리셉터로 형질도입된 T 세포의 최소 용량을 결정하기 위해 초기용량적정 실험을 수행하였다. CD19-키메릭 리셉터 'short/4-lBB'를 발현하는 2.5x106 T 세포의 단일 투여는 구축된 Raji 종양의 완전한 퇴행을 촉진하였고 100%의 마우스에서 장기간 종양 없는 생존을 유발하였다(도 16B,C). 2.5x106 용량 수준에서, T 세포는 양자 전달 및 종양 제거 후 적어도 3주 동안 NSG 마우스의 말초혈액에서 용이하게 검출되었다. 따라서, 이 모델은 본 발명 패널 내에서 CD19-키메릭 리셉터 각각으로 변성된 T 세포의 항종양 활성 및 지속성 모두에 대한 비교가능 시험을 수행할 수 있다(도 16D).
PBS만을 갖는 Raji 림프종, 각각의 CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 단일 용량의 2.5x106 T 세포 또는 tEGFR 코딩 대조용 벡터로 변성된 T 세포가 이식된 NSG 마우스 집단을 처리하였다(도 17A). 이러한 설정된 림프종 모델에서, 짧은 세포외 스페이서 도메인과 4-1BB 또는 CD28 공동자극 도메인('short/CD28'과 'short/4-1BB')을 갖는 CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포는 7-10일 동안 완전한 종양 퇴행을 매개하여 모든 마우스가 >56일 동안 종양 없이 생존하였다. 이에 비하여, 긴 스페이서 도메인('long CD28' 및 'long/4-1BB')을 갖는 CD19 키메릭 리셉터를 발현하기 위해 변성된 T 세포로 처리된 마우스는 종양 진행을 나타내어 대조용 tEGFR T 세포가 제공된 마우스와 비슷한 시간에 치사시켜야 하였다(도 17B,C). 시험관 내에서 종양 세포를 용균하는 이러한 구조물을 발현하는 T 세포의 능력, 및 4-1BB 구조물과 비교하여 'long/CD28' CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포의 결합 후 증강된 IL-2 생산과 증식을 고려할 때 긴 스페이서를 갖는 키메릭 리셉터 구조물의 생체내 항종양 활성 결핍은 의외였다.
효능 결핍의 근거에 대한 이해를 제공하기 위하여 T 세포 주입 후 간격으로 마우스의 말초혈액 샘플에 대해 순차적 유동세포계수법을 수행하였다. 'short/CD28' 및 'short/4-1BB' CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포로 처리된 모든 마우스는 긴 세포외 스페이서를 갖는 상응하는 CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포로 처리된 마우스와 비교하여 양자 전달 후 모든 시점의 혈액에서 전달된 T 세포 농도가 상당히 높았다(p<0.01) (도 17D). CD28 또는 4-1BB 공동자극 도메인과 짧은 스페이서 도메인을 갖는 CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포가 제공된 마우스의 말초혈액에서 T 세포 지속성의 유의한 차이는 관찰되지 않았다(도 17D).
긴 스페이서를 갖는 CD19 키메릭 리셉터의 생체내 항종양 효능은 T 세포 용량을 증가하거나 추가적인 동시자극 도메인의 제공으로 향상되지 않는다.
긴 스페이서 도메인을 갖는 CD19 키메릭 리셉터로 변성된 T 세포로 처리된 마우스에서 키메릭 리셉터 T 세포를 지속하는 낮은 농도와 생체내 항종양 효능의 결핍은 키메릭 리셉터 T 세포 용량을 증가하거나 공동자극 시그널링을 증가하기 위해 키메릭 리셉터에 CD28 및 4-1BB 도메인을 포함하여 효능을 개선할 수 없다는 것을 시사하고 있다. 이러한 가능성을 평가하기 위해, CD8+ TCM을 'long/CD28', 'short CD28', 및 'long/CD28_4-1BB' CD19 키메릭 리셉터 벡터로 변성하여 long/CD28_4-1BB' CD19 키메릭 리셉터가 특이적 용균과 CD19+ 표적 세포의 인지 후 시험관내 사이토킨 생산을 제공하는 것을 확인하였다(도 18A-C). CD19 키메릭 리셉터에 대한 이전 연구와 부합하여, CD28_4-1BB' CDI9 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포에서 시험관내 사이토킨 생산과 증식의 농도는 CD28만을 갖는 동일한 구조보다 열등하였고, 'long 4-1BB' CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포보다 우수하였다(도 18B, C).
설정된 Raji 종양을 갖는 NSG 마우스 그룹을 'long/CD28' CD19 키메릭 리셉터, 'long/CD28_4-1BB' CDI9 키메릭 리셉터, 'short/CD28' CD19-키메릭 리셉터, 및 tEGFR만을 발현하는 T 세포를 고용량의 T 세포(10xlO6)로 처리하였다. 종양 부담을 생체발광 이미지로 측정하였고, 말초혈액 샘플의 연속 유동세포계수 분석을 수행하여 전달된 T 세포의 빈도를 측정하였다. 아주 낮은 용량의 T 세포를 사용한 본 발명자들의 이전 실험 결과와 부합하여 Raji 종양은 'short/CD28' CD19-키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포로 처리된 마우스에서 완전히 제거되었다. 그러나, 4배의 고용량 T 세포를 사용하였음에도 불구하고, 'long CD28' CD19 키메릭 리셉터 또는 'long CD28_ 4-1BB' CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포로의 처리는 식별가능한 항종양 효과를 제공하지 않았다(도 18D,E).
따라서, 키메릭 리셉터 T 세포 용량을 증가하고 4-1BB 공동자극 도메인을 CD19 키메릭 리셉터에 첨가하는 것으로는 생체내 항종양 활성에 대한 긴 스페이서 도메인의 부정적 영향을 극복할 수 없다. 그러므로, 이 모델에서 CD19 키메릭 리셉터의 항종양 반응성은 세포내 공동자극 시그널링 모듈이 아니라 세포외 스페이서 도메인의 길이에 의해 크게 좌우된다.
긴 세포외 스페이서를 포함하는 CD19 키메릭 리셉터로 변성된 T 세포는 생체내에서 활성화유도세포사된다.
본 발명자들은 긴 스페이서 도메인을 갖는 CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포의 열등한 생체내 항종양 활성이 놓여 있는 가능한 메카니즘을 측정하고자 노력하였다. 긴 스페이서 도메인을 갖는 CD19 키메릭 리셉터를 발현하기 위해 변성된 전달 T 세포의 적은 수가 혈액 내에 존재하기 때문에 본 발명자들은 T 세포가 생체 내에서 종양 세포에 의해 효과적으로 활성화되지 않는 가능성, 또는 역으로 이들이 생체 내에서 활성화 유도 T 세포 사멸되는 가능성을 고려하였다. 그러므로, 변성된 CD19 키메릭 리셉터와 CFSE를 갖는 상응하는 대조용 T 세포를 표지하고 이 T 세포들을 종양을 갖는 NSG/Raji 마우스에 투여하여 생체내 종양 부위에서 각각의 CD19 키메릭 리셉터 구조물로 변성된 T 세포의 활성화, 증식 및 생존을 시험하였다(도 19A). 이들의 시험관내 증폭 말단과 설정된 Raji 종양을 갖는 NSG 마우스로의 주입 및 CFSE 표지 직전에 각각의 CD19 키메릭 리셉터가 형질도입된 T 세포는 낮은 수준으로 활성화 마커 CD69 및 CD25를 발현하였다(도 19B).
전달된 T 세포의 빈도, 활성화 및 증식을 시험하기 위하여 T 세포를 주입한 24시간과 72시간 후에 마우스 서브그룹으로부터 골수를 채집하였다. 24시간일 때, 종양 세포(CD45+ CD3-)는 모든 처리 그룹 내에 존재하였고, 대조용 T 세포가 아니라 많은 분획의 키메릭 리셉터 T 세포가 CD69과 CD25를 상향 조절하였다. 전달된 키메릭 리셉터 T 세포에서 측정가능한 CFSE 희석은 없었다. (도 19C) CD69와 CD25는 둘다 'long 스페이서' CD19 키메릭 리셉터로 변성된 T 세포의 높은 비율 내에서 발현되어, 이러한 세포들이 '짧은 스페이서' CD19 키메릭 리셉터로 변성된 T 세포보다 더 강한 자극을 받을 수 있는 것을 나타내었다(도 C). 24시간에서 T 세포 활성화에 대한 증거에도 불구하고 CD28과 4-1BB '짧은 스페이서' 구조물 또는 대조용 tEGFR 벡터로 변성된 것들보다 CD28과 4-1BB '긴 스페이서' 구조물로 변성된 T 세포들로 처리된 마우스의 골수에서 키메릭 리셉터 T 세포의 수가 상당히 더 적었다(도 19C,E).
T 세포를 전달한 후 72시간일 때, 'short/CD28' 및 'short/4-1BB' CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포는 골수와 비장에서의 빈도가 3 내지 > 10배 증가하였고, 여러 번 세포분열이 일어났다(도 19D,E). 대조용 tEGFR+ T 세포는 24시간에 관찰된 것과 유사한 농도로 72시간일 때 골수와 비장에 남아있었고, CFSE 희석으로 측정되었을 때 분할되지 않았다. 이에 비하여, 'long/CD28'과 'long/4-IBB' CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포의 수는 골수와 비장에서 증가하지 않았다. (도 19D, E) 더 적은 수의 세포에 부합하여, 살아있는 PI-'long/CD28' 및 'long/4-IBB' CD19 키메릭 리셉터 T 세포의 CFSE 염색 분석에서는 이러한 세포들이 'short/CD28' 및 'short/4-TBB' CD19 키메릭 리셉터 T 세포보다 훨씬 더 적은 수의 세포분열을 일으키는 것으로 나타났다.(도 19D) 유동 데이터를 PI+ T 세포를 포함하도록 분석했을 때, 'long 스페이서' 도메인을 갖는 CD19 키메릭 리셉터 T 세포가 제공된 마우스의 골수와 비장에서 PI+ CD3+ T 세포의 매우 높은 빈도를 검출하였으며, 이것은 생체 내에서 종양에 의한 활성화에도 불구하고 상당한 비율의 T 세포가 세포사된 것을 나타낸다(도 19F). 생체발광 이미지에 부합하여, CD45+ CD3-Raji 종양 세포는 짧은 스페이서 도메인을 갖는 CD19 키메릭 리셉터로 처리된 마우스와 비교하여 긴 스페이서 도메인을 갖는 CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포로 처리된 마우스 골수 중에 더 많은 수가 존재하였다(도 19D,E, G).
종합적으로, 데이터는 긴 세포외 스페이서 도메인을 갖는 CD19 키메릭 리셉터가, 시험관 내에서 동등하거나 우수한 이팩터 작용을 매개하고 생체 내에서 종양을 인지하는 것에도 불구하고 생체 내에서 높은 수준의 활성화유도세포사를 유발하고 설정된 림프종을 제거하지 못한 것을 입증하고 있다.
논의
키메릭 리셉터는 세포외 항원 결합 scFv, 세포막으로부터 scFv의 분리를 제공하는 스페이서 도메인 및 T 세포 활성화를 매개하는 세포내 시그널링 모둘을 포함하는 인공 리셉터이다. 본 원에서 연구된 CD19-특이적 FMC63 mAb에서 유도된 scFv를 함유하는 키메릭 리셉터는 B-세포 악성종양을 가진 환자의 임상 시험에서 시험을 진행하고 있다. 항종양 활성과 T 세포 지속성은 실질적으로 상이한 시험들에서 변화한다. 이러한 임상적 시험들 각각은 잠재적으로 중요한 변수, 예를 들어 상이한 유전자 전달 벡터, 세포 배양 방법 및 CD19 키메릭 리셉터 T 세포 전달 전의 식이요법 조건화 등이 달랐다.
본 발명에서는 키메릭 리셉터로 제공된 공동자극 시그널링과 별개로 CD19 키메릭 리셉터의 세포외 스페이서 도메인이 생체 내 항종양 활성의 중요한 결정인자일 수 있는 가능성을 시험하였다. 본 발명자들은 스페이서 도메인을 IgG4-Fc로부터 유도하였고, 이것은 높은 수준의 키메릭 리셉터 세포 표면 발현이 가능하고 다른 IgG 이소형보다 선천적 면역세포에 의한 인지를 유발한 가능성이 낮다. 본 발명자들은 긴(229 AA) 스페이서 구조물의 디자인에서 IgG4 '힌지-CH2-CH3'를, 그리고 본 원의 짧은 (12 AA) 스페이서 키메릭 리셉터에서 IgG4 '힌지' 도메인을 사용하였다. 개별적인 키메릭 리셉터 구조물을 비교하기 위해 정제된 (>90%) 키메릭 리셉터 양성 CD8+ TCM-유도 T 세포를 사용하여 시험관내와 생체내 작용의 분석에서 편파성의 잠재적 근원으로서 세포 조성물과 형질도입 빈도의 차이를 제거하였다. CD8+ TCM은 불충분하게 지속되고 종양 치료에 비효과적인 혈액 내의 보다 일반적인 다른 T 세포 서브세트와 비교하여 양자 면역요법에 대해 월등한 특성을 갖는 것으로 입증되었다. CD19 키메릭 리셉터 T 세포는 임상시험을 위한 키메릭 리셉터 T 세포를 유도하는데 사용되는 것과 유사한 표준 배양방법을 사용하여 생성하였다. 본 발명의 데이터는 짧은 IgG4 '힌지' 스페이서를 갖는 CD19 키메릭 리셉터가 시험관내 및 생체내에서 강력한 항종양 반응성을 제공하는 반면, IgG4 '힌지-CH2-CH3'의 긴 스페이서를 갖는 상응하는 CD19 키메릭 리셉터는 시험관 내에서 동등하거나 우수한 반응성에도 불구하고 마우스 림프종 모델에서 유의한 항종양 효과를 제공하지 못하는 것을 입증하고 있다. 놀라웁게도, 생체내 항종양 활성에 대한 결정적 인자인 것으로 증명된 스페이서 도메인 길이와, '긴 스페이서' 키메릭 리셉터의 효능 부재는 T 세포 용량을 증가하여 극복될 수 없었다.
본 발명에서는 또한 4-1BB와 비교하여 IFN-γ, IL-2, 및 TNF-α의 분비를 증가하는 CD28과 함께, CD28 및 4-1BB 공동자극 도메인을 함유하는 CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포들 사이에서 사이토큰 분비와 시험관내 증식의 중요한 차이를 관찰하였다. 탠덤형(tandem) CD28_4-1BB를 포함하는 CD19 키메릭 리셉터도 4-1BB만을 코딩하는 키메릭 리셉터와 비교하여 이러한 사이토킨을 고농도로 생산하였다. 그러나, 본 원의 데이터는 시험관내 작용의 이러한 차이가 생체내 항종양 효능을 예측하지 못하는 것을 나타내고 있는데, 왜냐하면 CD28 또는 4-1BB 공동자극 도메인 및 짧은 스페이서를 갖는 CD19 키메릭 리셉터가 NSG 마우스의 진행성의 설정된 Raji 종양을 제거하는데 효과적이었기 때문이다. 대조적으로 차선의 스페이서 길이와 CD28, 4-1BB, 또는 양 공동자극 도메인을 갖는 CD19 키메릭 리셉터는 짧은 스페이서 도메인을 갖는 동일한 키메릭 리셉터 구조물로서 유사한 시험관내 작용을 제공함에도 불구하고 생체 내에서 유의한 항종양 활성이 결여되어 키메릭 리셉터 T 세포의 생체내 작용에 대한 스페이서 길이의 기여를 증명하였다.
본 연구에서는 긴 스페이서 도메인을 갖는 CD19 키메릭 리셉터의 생체내 효능의 결핍에 대한 메카니즘의 이해를 제공하였다. 긴 스페이서 도메인과 짧은 스페이서 도메인을 갖는 CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포는 설정된 Raji 림프종을 갖는 NSG 마우스에 양자 전달한 후 골수와 비장에서 검출될 수 있고, 그 대부분이 CD25와 CD69의 상향조절로 입증된 바와 같이 활성화되었다. 그러나, 긴 스페이서 도메인을 갖는 CD19 키메릭 리셉터를 발현하기 위해 변성된 T 세포는 짧은 스페이서 도메인을 갖는 CD19 키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포의 분명한 생체내 증폭에 비하여 세포수의 급격한 감소를 나타냈다. T 세포수의 감소는 짧은 스페이서 도메인을 갖는 T 세포, 및 CD19 키메릭 리셉터를 발현하지 않는 대조용 T 세포와 비교하여 양자 전달 후 최초 72시간 내의 매우 높은 정도의 세포사 결과이다. 종합적으로, 이러한 결과는 생체 내에서 종양 세포의 인지는 긴 스페이서 도메인을 갖는 CD19-키메릭 리셉터를 발현하는 T 세포의 사멸로 인한 것임을 나타낸다. 유사한 메카니즘으로 긴 스페이서 CD19-키메릭 리셉터를 사용하는 임상시험에서 T 세포 지속성의 짧은 지속기간과 낮은 농도를 설명할 수 있다(14).
본 원에서 보고된 연구는 최초로 고유한 시그널링 특성이 없는 CD19 키메릭 리셉터의 스페이서 도메인이 공동자극 시그널링과 독립적으로 생체내 항종양 활성에 대한 극적 효과를 가지는 것을 나타내고, 임상 적용에서 키메릭 리셉터의 디자인으로 이러한 영역의 최적 조성물을 분석하는 중요성을 확인하였다.
상기한 내용은 본 발명의 예시인 것으로, 본 발명을 제한하지 않는다. 본 발명은 이하의 특허청구범위, 거기에 포함된 청구항들의 등가물에 의해 정의된다. 본 원에서 언급된 모든 참고문헌과 문서들은 참조로 본 원에 포함되었다.
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Hudecek, Michael <120> METHOD AND COMPOSITIONS FOR CELLULAR IMMUNOTHERAPY <130> 15950.0012WOU1 <140> New Filing <141> 2013-08-20 <150> US 61/691,117 <151> 2012-08-20 <160> 56 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is glycine, cysteine or arginine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is cysteine or threonine <400> 1 Xaa Pro Pro Xaa Pro 1 5 <210> 2 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60 atcccc 66 <210> 3 <211> 735 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60 atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120 gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180 cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240 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agccggtggc aggaaggcaa cgtctttagc tgcagcgtga tgcacgaggc 3540 cctgcacaac cactacaccc agaagagcct gagcctgtcc ctgggcaaga tgttctgggt 3600 gctggtggtg gtgggcgggg tgctggcctg ctacagcctg ctggtgacag tggccttcat 3660 catcttttgg gtgaaacggg gcagaaagaa actcctgtat atattcaaac aaccatttat 3720 gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc tgccgatttc cagaagaaga 3780 agaaggagga tgtgaactgc gggtgaagtt cagcagaagc gccgacgccc ctgcctacca 3840 gcagggccag aatcagctgt acaacgagct gaacctgggc agaagggaag agtacgacgt 3900 cctggataag cggagaggcc gggaccctga gatgggcggc aagcctcggc ggaagaaccc 3960 ccaggaaggc ctgtataacg aactgcagaa agacaagatg gccgaggcct acagcgagat 4020 cggcatgaag ggcgagcgga ggcggggcaa gggccacgac ggcctgtatc agggcctgtc 4080 caccgccacc aaggatacct acgacgccct gcacatgcag gccctgcccc caaggctcga 4140 gggcggcgga gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg 4200 ccctaggatg cttctcctgg tgacaagcct tctgctctgt gagttaccac acccagcatt 4260 cctcctgatc ccacgcaaag tgtgtaacgg aataggtatt ggtgaattta aagactcact 4320 ctccataaat gctacgaata ttaaacactt caaaaactgc acctccatca gtggcgatct 4380 ccacatcctg ccggtggcat ttaggggtga ctccttcaca catactcctc ctctggatcc 4440 acaggaactg gatattctga aaaccgtaaa ggaaatcaca gggtttttgc tgattcaggc 4500 ttggcctgaa aacaggacgg acctccatgc ctttgagaac ctagaaatca tacgcggcag 4560 gaccaagcaa catggtcagt tttctcttgc agtcgtcagc ctgaacataa catccttggg 4620 attacgctcc ctcaaggaga taagtgatgg agatgtgata atttcaggaa acaaaaattt 4680 gtgctatgca aatacaataa actggaaaaa actgtttggg acctccggtc agaaaaccaa 4740 aattataagc aacagaggtg aaaacagctg caaggccaca ggccaggtct gccatgcctt 4800 gtgctccccc gagggctgct ggggcccgga gcccagggac tgcgtctctt gccggaatgt 4860 cagccgaggc agggaatgcg tggacaagtg caaccttctg gagggtgagc caagggagtt 4920 tgtggagaac tctgagtgca tacagtgcca cccagagtgc ctgcctcagg ccatgaacat 4980 cacctgcaca ggacggggac cagacaactg tatccagtgt gcccactaca ttgacggccc 5040 ccactgcgtc aagacctgcc cggcaggagt catgggagaa aacaacaccc tggtctggaa 5100 gtacgcagac gccggccatg tgtgccacct gtgccatcca aactgcacct acggatgcac 5160 tgggccaggt 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acgtgagcca ggaagatccc 960 gaggtccagt tcaattggta cgtggacggc gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagccc 1020 agagaggaac agttcaacag cacctaccgg gtggtgtctg tgctgaccgt gctgcaccag 1080 gactggctga acggcaaaga atacaagtgc aaggtgtcca acaagggcct gcccagcagc 1140 atcgaaaaga ccatcagcaa ggccaagggc cagcctcgcg agccccaggt gtacaccctg 1200 cctccctccc aggaagagat gaccaagaac caggtgtccc tgacctgcct ggtgaagggc 1260 ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaacg gccagcctga gaacaactac 1320 aagaccaccc ctcccgtgct ggacagcgac ggcagcttct tcctgtacag ccggctgacc 1380 gtggacaaga gccggtggca ggaaggcaac gtctttagct gcagcgtgat gcacgaggcc 1440 ctgcacaacc actacaccca gaagagcctg agcctgtccc tgggcaagat gttctgggtg 1500 ctggtggtgg tgggcggggt gctggcctgc tacagcctgc tggtgacagt ggccttcatc 1560 atcttttggg tgaaacgggg cagaaagaaa ctcctgtata tattcaaaca accatttatg 1620 agaccagtac aaactactca agaggaagat ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa 1680 gaaggaggat gtgaactgcg ggtgaagttc agcagaagcg ccgacgcccc tgcctaccag 1740 cagggccaga atcagctgta caacgagctg aacctgggca gaagggaaga gtacgacgtc 1800 ctggataagc ggagaggccg ggaccctgag atgggcggca agcctcggcg gaagaacccc 1860 caggaaggcc tgtataacga actgcagaaa gacaagatgg ccgaggccta cagcgagatc 1920 ggcatgaagg gcgagcggag gcggggcaag ggccacgacg gcctgtatca gggcctgtcc 1980 accgccacca aggataccta cgacgccctg cacatgcagg ccctgccccc aaggctcgag 2040 ggcggcggag agggcagagg aagtcttcta acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc 2100 cctaggatgc ttctcctggt gacaagcctt ctgctctgtg agttaccaca cccagcattc 2160 ctcctgatcc cacgcaaagt gtgtaacgga ataggtattg gtgaatttaa agactcactc 2220 tccataaatg ctacgaatat taaacacttc aaaaactgca cctccatcag tggcgatctc 2280 cacatcctgc cggtggcatt taggggtgac tccttcacac atactcctcc tctggatcca 2340 caggaactgg atattctgaa aaccgtaaag gaaatcacag ggtttttgct gattcaggct 2400 tggcctgaaa acaggacgga cctccatgcc tttgagaacc tagaaatcat acgcggcagg 2460 accaagcaac atggtcagtt ttctcttgca gtcgtcagcc tgaacataac atccttggga 2520 ttacgctccc tcaaggagat aagtgatgga gatgtgataa tttcaggaaa caaaaatttg 2580 tgctatgcaa atacaataaa ctggaaaaaa ctgtttggga cctccggtca gaaaaccaaa 2640 attataagca acagaggtga aaacagctgc aaggccacag gccaggtctg ccatgccttg 2700 tgctcccccg agggctgctg gggcccggag cccagggact gcgtctcttg ccggaatgtc 2760 agccgaggca gggaatgcgt ggacaagtgc aaccttctgg agggtgagcc aagggagttt 2820 gtggagaact ctgagtgcat acagtgccac ccagagtgcc tgcctcaggc catgaacatc 2880 acctgcacag gacggggacc agacaactgt atccagtgtg cccactacat tgacggcccc 2940 cactgcgtca agacctgccc ggcaggagtc atgggagaaa acaacaccct ggtctggaag 3000 tacgcagacg ccggccatgt gtgccacctg tgccatccaa actgcaccta cggatgcact 3060 gggccaggtc ttgaaggctg tccaacgaat gggcctaaga tcccgtccat cgccactggg 3120 atggtggggg ccctcctctt gctgctggtg gtggccctgg ggatcggcct cttcatgtga 3180

Claims (35)

  1. a) 리간드에 결합하는 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(여기서, 리간드는 종양 특이적 분자, 바이러스 분자, 또는 림프구에 의한 인지 및 제거를 매개하는데 적합한 표적 세포군에서 발현된 다른 분자이다);
    b) 리간드에 특이적인 길이의 폴리펩티드 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(여기서, 스페이서는 참조 키메릭 리셉터와 비교하여 리간드에 대한 반응에서 증가된 T 세포 증식 및/또는 사이토킨 생산을 제공한다);
    c) 막통관(transmembrane) 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
    d) 세포내 시그널링 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 키메릭 리셉터 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 리간드 결합 도메인이 항체 단편인 키메릭 리셉터 핵산.
  3. 제2항에 있어서, 리간드 결합 도메인이 단일사슬 가변 단편인 키메릭 리셉터 핵산.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 종양 특이적 분자가 CD19, CD20, CD22, CD23, CD123, CS-1, ROR1, 메조텔린(mesothelin), c-Met, PSMA, Her2, GD-2, MAGE A3 TCR 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택된 키메릭 리셉터 핵산.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 스페이서가 아미노산 서열 X1PPX2P를 포함하는 키메릭 리셉터 핵산.
  6. 제5항에 있어서, 스페이서 영역이 인간 항체의 힌지영역 일부를 포함하는 키메릭 리셉터 핵산.
  7. 제5항에 있어서, 스페이서 영역이 힌지영역과, CH1, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택된 인간 항체의 Fc 도메인의 다른 일부 적어도 하나를 포함하는 키메릭 리셉터 핵산.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 스페이서 영역이 12 아미노산 이하, 119 아미노산 이하, 및 229 아미노산 이하로 구성되는 군에서 선택된 길이를 갖는 키메릭 리셉터 핵산.
  9. 제5항에 있어서, 리간드 결합 도메인이 ROR1에서 리간드에 결합하고, 스페이서 영역이 서열번호: 4, 및 서열번호: 49 (Hinge-CH3)로 구성되는 군에서 선택된 키메릭 리셉터 핵산.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 림프구 활성 도메인이 CD27, CD28, 4-1BB, OX-40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1, CD2, CD7, NKG2C, B7-H3 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택된 공동자극 도메인과 함께 CD3 제타(zeta)의 일부 모두를 포함하는 키메릭 리셉터 핵산.
  11. 제10항에 있어서, 세포내 시그널링 도메인이 CD3 제타의 일부 및, 4-1BB의 일부, CD28의 일부 또는 둘다를 포함하는 키메릭 리셉터 핵산.
  12. 제4항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 리간드 결합 도메인이 ROR1에 결합하고 스페이서 영역이 12 아미노산 이하이고 서열번호: 4의 서열을 갖는 키메릭 리셉터 핵산.
  13. 제4항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 리간드 결합 도메인이 ROR1에 결합하고 스페이서 영역이 서열번호: 50의 서열을 갖는 키메릭 리셉터 핵산.
  14. 제4항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 리간드 결합 도메인이 CD19에 결합하고 스페이서 영역이 12 아미노산 이하이고 서열번호: 4의 서열을 갖는 키메릭 리셉터 핵산.
  15. 제4항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 리간드 결합 도메인이 Her2에 결합하고 스페이서 영역이 서열번호: 50의 서열을 갖는 키메릭 리셉터 핵산.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 마커 서열을 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 키메릭 리셉터 핵산.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 키메릭 리셉터 핵산에 의해 코딩된 키메릭 리셉터 폴리펩티드.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 단리된 키메릭 리셉터 핵산을 포함하는 발현벡터.
  19. 제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 핵산 또는 제18항의 발현벡터를 포함하는 숙주 세포.
  20. 제19항에 있어서, 천연(naive) CD8+ T 세포, 중추 기억 CD8+ T 세포, 이팩터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크(bulk) CD8+ T 세포로 구성되는 군에서 선택된 CD8+ T 세포독성 림프구 세포인 숙주 세포.
  21. 제20항에 있어서, CD8+ 세포독성 T 림프구 세포가 CD45RO+, CD62L+, 및 CD8+에 양성인 중추 기억 T 세포인 숙주 세포.
  22. 제19항에 있어서, 천연(naive) CD4+ T 세포, 중추 기억 CD4+ T 세포, 이팩터 기억 CD4+ T 세포 및 벌크(bulk) CD4+ T 세포로 구성되는 군에서 선택된 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포인 숙주 세포.
  23. 제22항에 있어서, CD4+ 헬퍼 림프구 세포가 CD45RA+, CD62L+ 및 CD4+에 양성이고 CD45RO에 음성인 천연 CD4+ T 세포인 숙주 세포.
  24. 약학적으로 허용가능한 첨가제 중에 제19항 내지 제23항 중 어느 하나의 항의 숙주 세포를 포함하는 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 제20항 또는 제21항의 숙주 세포와 제23항 또는 제34항의 숙주 세포를 포함하는 조성물.
  26. a) 제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항 또는 제18항의 키메릭 리셉터를 코딩하는 핵산 라이브러리를 제공하고(여기서, 다수의 핵산 각각은 길이가 다른 키메릭 리셉터를 코딩한다);
    b) 다수의 핵산 각각을 별도의 단리된 T 림프구 개체군에 삽입하고 각각의 T 림프구 개체군을 시험관 내에서 증폭하고;
    c) 종양을 가진 동물 모델에 유전적으로 변성된 T 림프구 개체군 각각을 투여하여 유전적으로 변성된 T 림프구 개체군이 항종양 효능을 갖는지 측정하고;
    d) 시험관 내 및/또는 동물 모델에서 항종양 효능을 제공하는 키메릭 리셉터를 코딩하는 핵산을 선별하는 것을 포함하는 제19항 내지 제23항 중 어느 하나의 항의 숙주 세포를 시험관 내에서 제조하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 키메릭 리셉터를 코딩하는 선별된 핵산을 숙주 세포에 삽입하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  28. a) 제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항의 핵산 또는 제18항의 발현벡터를 CD45RA-, CD45RO+, 및 CD62L+ 표현형을 갖는 림프구 개체군에 삽입하고;
    b) 항-CD3 및/또는 항 CD28, 및 적어도 하나의 항상성(homeostatic) 사이토킨의 존재 하에 세포가 세포 주입물로서 사용하는데 충분하게 증폭할 때까지 세포를 배양하는 것을 포함하는 제19항 내지 제23항 중 어느 하나의 숙주 세포를 시험관 내에서 제조하는 방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 림프구가 CD8+ 또는 CD4+인 방법.
  30. 암 또는 바이러스 감염의 치료에서 제19항 내지 제23항 중 어느 하나의 항의 숙주 세포, 또는 제24항 또는 제25항의 조성물의 용도.
  31. 제30항에 있어서, 암이 고형 종양 또는 혈액학적 악성종양인 용도.
  32. 제31항에 있어서, 고형 종양이 유방암, 폐암, 결장암, 신장암, 췌장암, 전립선암 및 난소암으로 구성되는 군에서 선택된 용도.
  33. 제24항 또는 제25항의 조성물 또는 제19항 내지 제23항 중 어느 하나의 항의 숙주 세포를 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 암 또는 바이러스 감염이 있는 대상에서 세포 면역요법을 수행하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 암이 고형 종양 또는 혈액학적 악성종양에서 선택된 방법.
  35. 제34항에 있어서, 고형 종양이 유방암, 폐암, 결장암, 신장암, 췌장암, 전립선암 및 난소암으로 구성되는 군에서 선택된 방법.
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