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KR102628872B1 - 세포의 증식을 제어하기 위해 세포 분열 좌위를 사용하기 위한 도구 및 방법 - Google Patents

세포의 증식을 제어하기 위해 세포 분열 좌위를 사용하기 위한 도구 및 방법 Download PDF

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KR102628872B1
KR102628872B1 KR1020177028536A KR20177028536A KR102628872B1 KR 102628872 B1 KR102628872 B1 KR 102628872B1 KR 1020177028536 A KR1020177028536 A KR 1020177028536A KR 20177028536 A KR20177028536 A KR 20177028536A KR 102628872 B1 KR102628872 B1 KR 102628872B1
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안드라스 나지
클라우디오 모네티
친 리앙
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시나이 헬스 시스템
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Abstract

본 개시는 동물 세포에서 세포 증식을 제어하기 위해 세포 분열 좌위(CDL)를 사용하기 위한 분자 도구, 방법 및 키트를 제공한다. 본 명세서에서 제공되는 바와 같이, CDL은, 그 전사 산물(들)이 세포 분열 동안 발현되는 좌위들이다. CDL은 음성 선택 마커 및/또는 유도성 활성인자 기반 유전자 발현 시스템을 포함하도록, 본 명세서에 기재된 바와 같이 유전적으로 변형될 수 있으며, 이는 사용자로 하여금 적절한 유도인자의 부가 또는 제거에 의해, 상기 유전적으로 변형된 세포(들)의 증식을 허용하고, 어블레이션하고/하거나, 억제할 수 있도록 한다.

Description

세포의 증식을 제어하기 위해 세포 분열 좌위를 사용하기 위한 도구 및 방법
이전 출원과의 상호 참조
본 출원은, 각각이 본 명세서에서 그 전문이 제공되는 바와 같이 참고로 포함되는 것으로, 2015년 3월 9일자로 출원된 미국 가출원 제 62/130,258호 및 2015년 3월 9일자로 출원된 미국 가출원 제 62/130,270호에 대한 파리 협약하의 우선권을 주장한다.
본 명세서는 일반적으로 세포 및 분자 생물학 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 명세서는 동물 세포의 분열을 제어하기 위한 분자 도구, 방법 및 키트 및 이와 관련된 유전적으로 변형된 세포에 관한 것이다.
인간 만능성 줄기(hPS) 세포는 정상적인 세포 발생, 질병 발생을 이해하고, 현재의 난치성 장애, 예를 들어 유전적 장애, 퇴행성 질병 및/또는 다양한 손상을 치료하기 위한 세포 치료법에 사용하기 위한 도구로서 사용될 수 있다. 이들 세포의 만능성 특성은 줄기세포 상태에서 자가 재생 기간 후에 이들을 임의의 세포 유형으로 분화할 수 있도록 한다(문헌[Rossant and Nagy, 1999]). hPS 세포의 절대 표준은, 1998년에 보고된 인간 배아 줄기(hES) 세포이다(문헌[Thomson et al., 1998]). 2006년과 2007년에, 피부 섬유아세포와 같은 분화된 체세포를 ES 세포와 유사한 "유도된 만능성 줄기"(iPS) 세포로 재프로그래밍하는 방법이 보고되었고, 만능성 세포의 유형이 확장되었다(문헌[Takahashi and Yamanaka, 2006; Takahashi et al., 2007]). iPS 세포를 생성하는 방법 및 질병과 생리적 이상 질환을 치료하기 위한 세포 기반 치료법을 포함한 다방면으로의 응용이 이후 수년 동안 더욱 발전되어 왔다.
만능성 세포 기반 치료법에 관한 한 가지 우려 사항은 안전성이다. 예를 들어, 세포 이식으로부터 기인한 악성 성장이 우려된다. 재프로그래밍 방법이, iPS 세포 유래 세포의 악성 형질전환 위험이 있을 수 있는 게놈 손상 및 비정상적인 후성 변화를 야기할 수 있다고 보고된 바와 같이, 분화된 세포를 iPS 세포로 재프로그래밍하는 과정은 안전성과 관련된다(문헌[Hussein et al., 2011; Laurent et al., 2011; Lister et al., 2011]).
시험관내에서 확장된 만능성 세포를 포함하는 세포 기반 치료법의 한 가지 과제는 세포 자체의 만능성 특성이다. 예를 들어, 만능성 세포가 분화된 치료 세포 사이에 남아 있는 경우, 만능성 세포는 기형종으로 진행될 수 있다(문헌[Yoshida and Yamanaka, 2010]). 만능성 세포 유래 제품 및 치료법의 안전성을 높이기 위한 시도에는 시험관내 분화 후에 세포 배양물로부터 만능성 세포를 제거하려는 노력이 포함된다. 예를 들어: 만능성 특이적 항원을 갖는 세포를 제거하기 위해, 세포독성 항체를 사용하였고(문헌[Choo et al., 2008; Tan et al., 2009]); 세포를 만능성 세포 표면 마커를 기반으로 분류하였으며(문헌[Ben-David et al., 2013a; Fong et al., 2009; Tang et al., 2011]); 종양 진행 유전자를 세포에서 유전적으로 변형시켰고(문헌[Blum et al., 2009; Menendez et al., 2012]); 분화된 세포의 분리를 돕기 위한 전이유전자를 세포 내로 도입하였으며(문헌[Chung et al., 2006; Eiges et al., 2001; Huber et al., 2007]); 자살 유전자를 세포로 도입시켜, 분화 후 잔존하는 만능성 줄기세포를 제거하는데 사용하였고(문헌[Rong et al., 2012; Schuldiner et al., 2003]); 원치 않는 만능성 세포를, 화학 물질을 사용함으로써 어블레이션(ablation)하였다(문헌[Ben-David et al., 2013b; Dabir et al., 2013; Tohyama et al., 2013]). 잔존하는 만능성 세포가 분화된 배양물로부터 제거되더라도, 만능성 세포의 분화 유도체는 발암 성질을 가질 수 있다(문헌[Ghosh et al., 2011]). 관련 발암 현상은 i) 시험관내에서 세포를 제조하는 동안; 또는 ii) 세포를 숙주로 이식한 후, 치료 세포에서 발생될 수 있다.
원치 않는 세포 성장 및/또는 분화를 제거 또는 방지하기 위한 가장 최근의 전략은, 악성종양이 생성된 경우, 이식편을 완전히 제거하거나(문헌[Schuldiner et al., 2003]), 또는 의도된 분화 유도체를 '오염시키는' 만능성 세포만을 제거하는데(문헌[Ben-David and Benvenisty, 2014; Lim et al., 2013]) 사용될 수 있는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제(herpes simplex virus-thymidine kinase)(HSV-TK)/간사이클로비르(ganciclovir)(GCV) 음성 선택 시스템을 기반으로 한다. GCV 유도 세포 사멸 및 아폽토시스(apoptosis)의 메커니즘은 잘 알려져 있다. 이는 DNA 이중 가닥 파열의 복제 의존적 유발을 야기하며(문헌[Halloran and Fenton, 1998]), 이는 아폽토시스로 이어진다(문헌[Tomicic et al., 2002]). 그러나, 많은 HSV-TK/GCV 기반 시스템은, 최소한, HSV-TK의 무작위적 혼입 또는 일과성 발현에 의존하므로, 신뢰할 수 없는 수준으로 발현된다. 예를 들어, 카스파제 9(문헌[Di Stasi et al., 2011])와 같은 상이한 사멸 메커니즘을 갖는 음성 선택 마커를 포함하는 전략이 시험되었으나, 음성 선택 마커의 신뢰할 만한 발현은 나타나지 않았다. 세포 기반 치료법은 수백만 또는 수십억 개의 세포를 필요로 할 수 있으며, 이는 원치 않는 세포 성장 및/또는 분화에 의해 야기되는 모든 문제를 증폭시킬 수 있다.
본 발명의 목적은 상기 결점 중 하나 이상을 완화 및/또는 방지하는 것이다.
일 양태에서, 동물 세포의 증식을 제어하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 동물 세포를 제공하는 단계; 상기 동물 세포에서 세포 분열 좌위(CDL)를 유전적으로 변형시키는 단계로서, CDL은, 그 전사 산물(들)이 분열 세포에 의해 발현되는 하나 이상의 좌위들이며, CDL의 유전적 변형은: a) 상기 CDL을 인코딩하는 DNA 서열에 전사적으로 연결된 음성 선택 마커를 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 어블레이션 연결(ablation link)(ALINK) 시스템; 및 b) 상기 CDL에 작동 가능하게 연결된 유도성 활성인자 기반 유전자 발현 시스템을 포함하는 CDL의 유도성 외인성 활성인자 조절(EARC) 시스템 중 하나 이상을 포함하는 것인 단계; 상기 음성 선택 마커의 유도인자에 의해, ALINK 시스템을 포함하는 유전적으로 변형된 동물 세포의 증식을 제어하는 단계; 및/또는 상기 유도성 활성인자 기반 유전자 발현 시스템의 유도인자에 의해, EARC 시스템을 포함하는 유전적으로 변형된 동물 세포의 증식을 제어하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 제공되는 동물 세포의 증식을 제어하는 방법의 구현예에서, ALINK 변형된 동물 세포의 제어는: ALINK 시스템을 포함하는 유전적으로 변형된 동물 세포를 상기 음성 선택 마커의 유도인자의 부재하에 유지시킴으로써, ALINK 시스템을 포함하는 유전적으로 변형된 동물 세포의 증식을 허용하는 단계; 및 ALINK 시스템을 포함하는 동물 세포를 상기 음성 선택 마커의 유도인자에 노출시킴으로써, ALINK 시스템을 포함하는 유전적으로 변형된 동물 세포의 증식을 어블레이션 또는 억제하는 단계 중 하나 이상을 포함한다.
본 명세서에서 제공되는 동물 세포의 증식을 제어하는 방법의 일 구현예에서, EARC 변형된 동물 세포의 제어는 EARC 시스템을 포함하는 유전적으로 변형된 동물 세포를 상기 유도성 활성인자 기반 유전자 발현 시스템의 유도인자에 노출시킴으로써, EARC 시스템을 포함하는 유전적으로 변형된 동물 세포의 증식을 허용하는 단계; 및 EARC 시스템을 포함하는 동물 세포를 상기 유도성 활성인자 기반 유전자 발현 시스템의 유도인자의 부재하에 유지시킴으로써, EARC 시스템을 포함하는 유전적으로 변형된 동물 세포의 증식을 방지 또는 억제하는 단계 중 하나 이상을 포함한다.
본 명세서에서 제공되는 동물 세포의 증식을 제어하는 방법의 다양한 구현예에서, CDL의 유전적 변형은 다음 중 하나 이상에 의한 CDL의 표적화된 대체를 수행하는 단계를 포함한다: a) ALINK 시스템을 포함하는 DNA 벡터; b) EARC 시스템을 포함하는 DNA 벡터; 및 c) ALINK 시스템 및 EARC 시스템을 포함하는 DNA 벡터.
본 명세서에서 제공되는 동물 세포의 증식을 제어하는 방법의 다양한 구현예에서, CDL의 ALINK 유전적 변형은 동형접합성, 이형접합성, 반접합성 또는 복합 이형접합성이고/이거나, EARC 유전적 변형은, 기능적 CDL 변형이 EARC 변형된 대립유전자를 통해서만 생성될 수 있도록 보장한다.
본 명세서에서 제공되는 동물 세포의 증식을 제어하는 방법의 다양한 구현예에서, CDL은 표 2에 나열된 하나 이상의 좌위들이다. 다양한 구현예에서, 상기 CDL은 세포 주기, DNA 복제, RNA 전사, 단백질 번역 및 대사작용 중 하나 이상에 관여하는 기능을 갖는 유전자 산물을 인코딩한다. 다양한 구현예에서, 상기 CDL은 Cdk1/CDK1, Top2A/TOP2A, Cenpa/CENPA, Birc5/BIRC5, 및 Eef2/EEF2 중 하나 이상이며, 바람직하게는 상기 CDL은 Cdk1 또는 CDK1이다.
본 명세서에서 제공되는 동물 세포의 증식을 제어하는 방법의 다양한 구현예에서, ALINK 시스템은 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제/간사이클로비르 시스템, 시토신 데아미나제(cytosine deaminase)/5-플루오로시토신(5-fluorocytosine) 시스템, 카르복실 에스테라제(carboxyl esterase)/이리노테칸(irinotecan) 시스템 또는 iCasp9/AP1903 시스템을 포함하며, 바람직하게는 ALINK 시스템은 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제/간사이클로비르 시스템이다.
본 명세서에서 제공되는 동물 세포의 증식을 제어하는 방법의 다양한 구현예에서, EARC 시스템은 dox 가교 시스템(dox-bridge system), 큐메이트 스위치 유도성 시스템(cumate switch inducible system), 엑디손 유도성 시스템(ecdysone inducible system), 전파 유도성 시스템(radio wave inducible system) 또는 리간드 가역성 이량체화 시스템이며, 바람직하게는 EARC 시스템은 dox 가교 시스템이다.
본 명세서에서 제공되는 동물 세포의 증식을 제어하는 방법의 다양한 구현예에서, 상기 동물 세포는 포유류 세포 또는 조류 세포이다. 다양한 구현예에서, 상기 포유류 세포는 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그, 고양이, 개, 암소(cow), 말, 사슴, 엘크, 들소, 소(oxen), 낙타, 라마, 토끼, 돼지, 염소, 양 또는 비인간 영장류 세포이며, 바람직하게는 상기 포유류 세포는 인간 세포이다.
본 명세서에서 제공되는 동물 세포의 증식을 제어하는 방법의 다양한 구현예에서, 상기 동물 세포는 만능성 줄기세포, 다능성 세포, 단능성 전구세포 또는 최종 분화된 세포이다.
본 명세서에서 제공되는 동물 세포의 증식을 제어하는 방법의 다양한 구현예에서, 상기 동물 세포는 만능성 줄기세포, 다능성 세포, 단능성 전구세포 또는 최종 분화된 세포로부터 유래된다.
일 양태에서, 세포 증식을 제어하기 위한 적어도 하나의 메커니즘을 포함하도록 유전적으로 변형된 동물 세포가 제공된다. 상기 유전적으로 변형된 동물 세포는 하나 이상의 세포 분열 좌위(CDL)의 유전적 변형을 포함하며, 상기 CDL은, 그 전사 산물(들)이 분열 세포에 의해 발현되는 하나 이상의 좌위들이다. 상기 유전적 변형은: a) 상기 CDL을 인코딩하는 DNA 서열에 전사적으로 연결된 음성 선택 마커를 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 어블레이션 연결(ALINK) 시스템; 및 b) 상기 CDL에 작동 가능하게 연결된 유도성 활성인자 기반 유전자 발현 시스템을 포함하는 CEDL의 외인성 활성인자 조절(EARC) 시스템 중 하나 이상이다.
본 명세서에서 제공되는 세포 증식을 제어하기 위한 적어도 하나의 메커니즘을 포함하도록 유전적으로 변형된 동물 세포의 구현예에서, CDL의 유전적 변형은 다음 중 하나 이상에 의한 CDL의 표적화된 대체를 수행하는 단계를 포함한다: a) ALINK 시스템을 포함하는 DNA 벡터; b) EARC 시스템을 포함하는 DNA 벡터; 및 c) ALINK 시스템 및 EARC 시스템을 포함하는 DNA 벡터.
본 명세서에서 제공되는 세포 증식을 제어하기 위한 적어도 하나의 메커니즘을 포함하도록 유전적으로 변형된 동물 세포의 다양한 구현예에서, CDL의 ALINK 유전적 변형은 동형접합성, 이형접합성, 반접합성 또는 복합 이형접합성이고/이거나, EARC 유전적 변형은, 기능적 CDL 변형이 EARC 변형된 대립유전자를 통해서만 생성될 수 있도록 보장한다.
본 명세서에서 제공되는 세포 증식을 제어하기 위한 적어도 하나의 메커니즘을 포함하도록 유전적으로 변형된 동물 세포의 다양한 구현예에서, CDL은 표 2에 나열된 하나 이상의 좌위들이다. 다양한 구현예에서, CDL은 세포 주기, DNA 복제, RNA 전사, 단백질 번역 및 대사작용 중 하나 이상에 관여하는 기능을 갖는 유전자 산물을 인코딩한다. 다양한 구현예에서, CDL은 Cdk1/CDK1, Top2A/TOP2A, Cenpa/CENPA, Birc5/BIRC5, 및 Eef2/EEF2 중 하나 이상이며, 바람직하게는 상기 CDL은 Cdk1 또는 CDK1이다.
본 명세서에서 제공되는 세포 증식을 제어하기 위한 적어도 하나의 메커니즘을 포함하도록 유전적으로 변형된 동물 세포의 다양한 구현예에서, ALINK 시스템은 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제/간사이클로비르 시스템, 시토신 데아미나제/5-플루오로시토신 시스템, 카르복실 에스테라제/이리노테칸 시스템 또는 iCasp9/AP1903 시스템을 포함하며, 바람직하게는 ALINK 시스템은 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제/간사이클로비르 시스템이다.
본 명세서에서 제공되는 세포 증식을 제어하기 위한 적어도 하나의 메커니즘을 포함하도록 유전적으로 변형된 동물 세포의 다양한 구현예에서, EARC 시스템은 dox 가교 시스템, 큐메이트 스위치 유도성 시스템, 엑디손 유도성 시스템, 전파 유도성 시스템 또는 리간드 가역성 이량체화 시스템이며, 바람직하게는 EARC 시스템은 dox 가교 시스템이다.
본 명세서에서 제공되는 세포 증식을 제어하기 위한 적어도 하나의 메커니즘을 포함하도록 유전적으로 변형된 동물 세포의 다양한 구현예에서, 상기 동물 세포는 포유류 세포 또는 조류 세포이다. 다양한 구현예에서, 상기 포유류 세포는 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그, 고양이, 개, 암소, 말, 사슴, 엘크, 들소, 소, 낙타, 라마, 토끼, 돼지, 염소, 양 또는 비인간 영장류 세포이며, 바람직하게는 상기 포유류 세포는 인간 세포이다.
본 명세서에서 제공되는 세포 증식을 제어하기 위한 적어도 하나의 메커니즘을 포함하도록 유전적으로 변형된 동물 세포의 다양한 구현예에서, 상기 동물 세포는 만능성 줄기세포, 다능성 세포, 단능성 전구세포 또는 최종 분화된 세포이다.
본 명세서에서 제공되는 세포 증식을 제어하기 위한 적어도 하나의 메커니즘을 포함하도록 유전적으로 변형된 동물 세포의 다양한 구현예에서, 상기 동물 세포는 만능성 줄기세포, 다능성 세포, 단능성 전구세포 또는 최종 분화된 세포로부터 유래된다.
일 양태에서, 세포 분열 좌위(CDL)의 발현을 변형시키기 위한 DNA 벡터가 제공되며, 상기 CDL은, 그 전사 산물(들)이 분열 세포에 의해 발현되는 하나 이상의 좌위들이다. 상기 DNA 벡터는 상기 CDL에 전사적으로 연결된 음성 선택 마커를 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 어블레이션 연결(ALINK) 시스템을 포함하며, 상기 DNA 벡터가 하나 이상의 숙주 세포 내로 삽입된다면, 상기 DNA 벡터를 포함하는 증식 숙주 세포가 상기 음성 선택 마커의 유도인자에 노출되는 경우, 상기 DNA 벡터를 포함하는 증식 숙주 세포는 사멸될 것이다.
일 양태에서, 세포 분열 필수 좌위(CDL)의 발현을 변형시키기 위한 DNA 벡터가 제공되며, 상기 CDL은, 그 전사 산물(들)이 분열 세포에 의해 발현되는 하나 이상의 좌위들이다. 상기 DNA 벡터는 상기 CDL에 작동 가능하게 연결된 유도성 활성인자 기반 유전자 발현 시스템을 포함하는 CDL의 외인성 활성인자 조절(EARC) 시스템을 포함하며, 상기 DNA 벡터가 하나 이상의 숙주 세포 내로 삽입된다면, 상기 DNA 벡터를 포함하는 증식 숙주 세포가 상기 유도성 활성인자 상기 기반 유전자 발현 시스템의 유도인자에 노출되지 않는 경우, 상기 DNA 벡터를 포함하는 증식 숙주 세포는 사멸될 것이다.
일 양태에서, 세포 분열 필수 좌위(CDL)의 발현을 변형시키기 위한 DNA 벡터가 제공되며, 상기 CDL은, 그 전사 산물(들)이 분열 세포에 의해 발현되는 하나 이상의 좌위들이다. 상기 DNA 벡터는 상기 CDL에 전사적으로 연결된 음성 선택 마커를 인코딩하는 DNA 서열인 어블레이션 연결(ALINK) 시스템; 및 상기 CDL에 작동 가능하게 연결된 유도성 활성인자 기반 유전자 발현 시스템을 포함하는 CDL의 외인성 활성인자 조절(EARC) 시스템을 포함하며, 상기 DNA 벡터가 하나 이상의 숙주 세포 내로 삽입된다면, 상기 DNA 벡터를 포함하는 증식 숙주 세포가 상기 음성 선택 마커의 유도인자에 노출되는 경우, 및 상기 DNA 벡터를 포함하는 증식 숙주 세포가 상기 유도성 활성인자 기반 유전자 발현 시스템의 유도인자에 노출되지 않는 경우, 상기 DNA 벡터를 포함하는 증식 숙주 세포는 사멸될 것이다.
본 명세서에서 제공되는 DNA 벡터의 다양한 구현예에서, CDL은 표 2에 나열된 하나 이상의 좌위들이다. 다양한 구현예에서, CDL은 세포 주기, DNA 복제, RNA 전사, 단백질 번역 및 대사작용 중 하나 이상에 관여하는 기능을 갖는 유전자 산물을 인코딩한다. 다양한 구현예에서, CDL은 Cdk1/CDK1, Top2A/TOP2A, Cenpa/CENPA, Birc5/BIRC5, 및 Eef2/EEF2 중 하나 이상이며, 바람직하게는 상기 CDL은 Cdk1 또는 CDK1이다.
본 명세서에서 제공되는 DNA 벡터의 다양한 구현예에서, ALINK 시스템은 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제/간사이클로비르 시스템, 시토신 데아미나제/5-플루오로시토신 시스템, 카르복실 에스테라제/이리노테칸 시스템 또는 iCasp9/AP1903 시스템을 포함하며, 바람직하게는 ALINK 시스템은 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제/간사이클로비르 시스템이다.
본 명세서에서 제공되는 DNA 벡터의 다양한 구현예에서, EARC 시스템은 dox 가교 시스템, 큐메이트 스위치 유도성 시스템, 엑디손 유도성 시스템, 전파 유도성 시스템 또는 리간드 가역성 이량체화 시스템이며, 바람직하게는 EARC 시스템은 dox 가교 시스템이다.
일 양태에서, 하나 이상의 세포 분열 필수 좌위/좌위들(CDL)의 유전적 변형에 의해, 동물 세포의 증식을 제어하기 위한 키트가 제공되며, 상기 CDL은, 그 전사 산물(들)이 분열 세포에 의해 발현되는 하나 이상의 좌위들이다. 상기 키트는 상기 CDL을 인코딩하는 DNA 서열에 전사적으로 연결된 음성 선택 마커를 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 어블레이션 연결(ALINK) 시스템을 포함하는 DNA 벡터; 및/또는 상기 CDL에 작동 가능하게 연결된 유도성 활성인자 기반 유전자 발현 시스템을 포함하는 CDL의 외인성 활성인자 조절(EARC) 시스템을 포함하는 DNA 벡터; 및/또는 각각 CDL에 작동 가능하게 연결된 ALINK 시스템 및 EARC 시스템을 포함하는 DNA 벡터; 및 하나 이상의 DNA 벡터를 사용하는 동물 세포에서 CDL의 표적화된 대체를 위한 지침서를 포함한다.
본 명세서에서 제공되는 키트의 일 구현예에서, CDL은 표 2에 나열된 하나 이상의 좌위들이다. 다양한 구현예에서, CDL은 세포 주기, DNA 복제, RNA 전사, 단백질 번역 및 대사작용 중 하나 이상에 관여하는 기능을 갖는 유전자 산물을 인코딩한다. 다양한 구현예에서, CDL은 Cdk1/CDK1, Top2A/TOP2A, Cenpa/CENPA, Birc5/BIRC5, 및 Eef2/EEF2 중 하나 이상이며, 바람직하게는 상기 CDL은 Cdk1 또는 CDK1이다.
본 명세서에서 제공되는 키트의 다양한 구현예에서, ALINK 시스템은 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제/간사이클로비르 시스템, 시토신 데아미나제/5-플루오로시토신 시스템, 카르복실 에스테라제/이리노테칸 시스템 또는 iCasp9/AP1903 시스템을 포함하며, 바람직하게는 ALINK 시스템은 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제/간사이클로비르 시스템이다.
본 명세서에서 제공되는 키트의 다양한 구현예에서, EARC 시스템은 dox 가교 시스템, 큐메이트 스위치 유도성 시스템, 엑디손 유도성 시스템, 전파 유도성 시스템 또는 리간드 가역성 이량체화 시스템이며, 바람직하게는 EARC 시스템은 dox 가교 시스템이다.
본 특허 또는 출원 파일은 적어도 하나의 컬러 도면을 포함한다. 컬러 도면이 첨부된 본 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요청 및 필요한 수수료의 지불 시에 국제사무국에 의해 제공될 것이다.
본 개시 내용의 이러한 특징 및 다른 특징은 첨부된 도면을 참고로 하는 다음의 상세한 설명에서 더욱 명백해질 것이다:
도 1a 내지 도 1g는 본 명세서에서 제공되는 방법 및 도구에서 사용하기 위해 고려되는 증식의 유도된 음성 효과기(iNEP)의 개념 및 iNEP 시스템의 예를 설명하는 개략도를 도시한다. 도 1a는 CDL1에서의 동형접합성 변형, CDL1 및 CDL2에서의 동형접합성 삽입, 세포 분열에 함께 필수적인 2개의 별도의 좌위를 포함하는 CDL(CDL3)을 포함하는 iNEP 변형된 CDL의 상이한 예를 나타내는 개략도를 도시한다. 도 1b는 상이한 구성으로 어블레이션 연결(ALINK) 및 CDL의 외인성 활성인자 조절(EARC)을 포함하는 iNEP의 예를 나타내는 개략도를 도시한다. 도 1c는 이량체화제 조절된 발현 유도와 조합된 전사 활성인자 유사 효과기(TALE) 기법을 설명하는 개략도를 도시한다. 도 1d는 역 큐메이트 트랜스활성인자(reverse-cumate-Trans-Activator)(rcTA) 시스템을 설명하는 개략도를 도시한다. 도 1e는 레티노이드 X 수용체(RXR) 및 Vp16(VpEcR)의 활성화 도메인에 융합된 엑디손 수용체(EcR)의 N-말단 절두(N-terminal truncation)을 설명하는 개략도를 도시한다. 도 1f는 본 명세서에 제시된 바와 같은 iNEP 시스템의 일례인 일과성 수용체 전위 바닐로이드-1(transient receptor potential vanilloid-1)(TRPV1)을 페리틴(ferritin)과 함께 설명하는 개략도를 도시한다. 도 1g는 IRES 및 이량체화제가 iNEP로서 어떻게 사용될 수 있는지를 설명하는 개략도를 도시한다.
도 2의 A 내지 도 2의 F는 분열 중인 변형된 CDK1 발현 세포의 제거를 가능하게 하는 ALINK를 생성하기 위해, Cdk1 좌위의 3'UTR 내로 HSV-TK를 표적화하는 것을 설명하는 개략도를 도시한다. 도 2의 A는 마우스 Cdk1 좌위의 개략도를 도시한다. 도 2의 B는 마우스 표적 벡터 I의 개략도를 도시한다. 도 2의 C는 Cdk1TC 대립유전자의 개략도를 도시한다. 도 2의 D는 마우스 표적 벡터 II의 개략도를 도시한다. 도 2의 E는 Cdk1TClox 대립유전자의 개략도를 도시한다. 도 2의 F는 CRISPR 안내 RNA의 위치를 도시하며; 황색 박스의 서열은 Cdk1의 8번째 엑손이다.
도 3ab 내지 도 3g는 ALINK 예로서, 마우스 ES 세포주에서 ALINK를 생성하기 위해 CDK1 좌위의 3'UTR로의 HSV-TK-mCherry의 생성을 도시한다. 도 3ab의 A는 마우스 C2 ES 세포에서 ALINK를 생성하는 전체 단계를 도시한다. 도 3ab의 B는 Cdk1(TK/+), Cdk1(TK, loxP-TK) 및 Cdk1(TK/TK)의 올바른 유전자형 분석의 서던 블롯팅(southern blotting) 결과를 도시한다. 도 3c는 마우스 세포에서 ALINK 유전자형 분석에 사용된 프라이머의 위치를 도시한다. 도 3d는 표적화 벡터 I의 CDK1 좌위의 3'UTR로의 표적화를 설명하는 PCR 결과를 포함한다. 도 3e는 HSV-TK-mCherry의 발현을 활성화하기 위해, 표적화 벡터 I로 이미 올바르게하게 표적화된 마우스 ES 세포주에서 선택 마커의 절개 상황(excision event)을 설명하는 PCR 결과를 도시한다. 도 3f는 표적화 벡터 II의 Cdk1(TK/+) 세포 내로의 표적화를 설명하는 PCR 결과를 도시한다. 도 3g는 HSV-TK-mCherry의 제2 대립유전자 발현을 활성화시킴으로써, Cdk1(TK/TK)를 생성하는 Cdk1(TK, loxP-TK)에서의 선택 마커의 절개 상황을 설명하는 PCR 결과를 도시한다.
도 4a 내지 도 4jk는 ALINK 변형으로서, 인간 ES 세포주에서 CDK1 좌위의 3'UTR로의 HSV-TK-mCherry의 생성을 도시한다. 도 4a는 인간 CA1 ES 세포에서 ALINK를 생성하는 전체 단계를 도시한다. 도 4b는 인간 CA1 세포에서 ALINK 유전자형 분석에 사용된 프라이머의 위치를 도시한다. 도 4c는 표적화 벡터 I의 CDK1 좌위의 3'UTR로의 표적화를 설명하는 PCR 결과를 도시한다. 도 4d는 HSV-TK-mCherry의 발현을 활성화시키기 위한 인간 Cdk1(PB-TK/+) ES 세포주에서의 선택 마커의 절개 상황을 설명하는 유동 세포계측법을 도시하며; Y 축은 mCherry 발현 수준을 나타내고, X 축은 자가 형광 채널이다. 도 4e는 표적화 벡터 II(puro-버전)의 Cdk1(TK/+) 세포 내로의 표적화를 설명하는 PCR 결과를 도시하며; 상단 패널은 5' 상동성 아암(arm)에 플랭킹된 프라이머를 사용하는 PCR이고; 하단 패널은 5' 및 3' 상동성 아암 내부의 프라이머를 사용하는 PCR이며, 0.7kb 밴드가 부재하고, 클론이 ALINK에서 동형접합성임을 의미하는 2.8kb 밴드가 존재하며, 클론이 ALINK에서 이형접합성이거나, 집단이 클론이 아니라는 것을 의미하는 0.7kb 밴드가 존재한다. 도 4f는 HSV-TK-mCherry의 제2 대립유전자 발현을 활성화하기 위한 Cdk1(TK, loxP-TK)에서의 선택 마커의 절개 상황을 설명하는 유동 세포계측 분석을 도시하며; Y 축은 mCherry 발현 수준을 나타내고, X 축은 자가 형광 채널이다. 도 4g는 인간 H1 ES 세포에서 ALINK를 생성하는 전체 단계를 도시한다. 도 4h는 인간 H1 세포에서 ALINK 유전자형 분석에 사용된 프라이머의 위치를 도시한다. 도 4i는 표적화 벡터 II의 CDK1 좌위의 3'UTR로의 표적화를 설명하는 PCR 결과를 도시한다. 도 4jk의 J는 HSV-TK-mCherry의 발현을 활성화시키기 위한 인간 H1 Cdk1(loxP-TK/+)에서의 선택 마커의 절개 상황을 설명하는 PCR 결과를 도시하며; Y 축은 mCherry 발현 수준을 나타내고, X 축은 자가 형광 채널이다. 도 4jk의 K는 Cdk1(TK/+) 세포 내로의 표적화 벡터 Ⅲ(GFP-버전)의 표적화의 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 도시한다. FACS 분류 후, 밀집도가 낮은 플레이트에서 채취한 클론을 mCherry 대립유전자 특이적 프라이머, eGFP 대립유전자 특이적 프라이머 및 5' 및 3' 상동성 아암의 프라이머로 유전자형을 분석하였으며; 주황색 별표로 표시된 클론은 mCherry의 하나의 대립유전자 및 eGFP의 하나의 대립유전자를 갖는 동형접합성 ALINK이고; 녹색 별표로 표시된 하나의 클론은 eGFP의 2개의 대립유전자를 갖는 동형접합성 ALINK이다.
도 5a 내지 도 5c는 기형종 조직학(기형종의 내배엽, 중배엽 및 외배엽 부분이 각각 좌측에서 우측으로 도시됨)을 도시한다. 도 5a는 마우스 ES Cdk1+/+, alink/alink 세포로부터 유래된 기형종의 현미경 사진을 도시한다. 도 5b는 마우스 ES Cdk1earc/earc, alink / alink 세포로부터 유래된 기형종의 현미경 사진을 도시한다. 도 5c는 인간 ES Cdk1+/+, alink/alink 세포로부터 유래된 기형종의 현미경 사진을 도시한다.
도 6a 내지 도 6b는 CDK1 좌위의 3'UTR로의 HSV-TK mCherry 녹인(knock-in)을 갖는 마우스 ES 세포의 시험관내 기능 분석을 도시한다. 도 6a는 세포를 상이한 농도의 GCV에 3일 동안 노출시킨 후, TK.007 유전자에 의해 제공되는 사멸 효율을 도시한다. 콜로니 크기 및 수는 GCV 농도에 정비례한다. 두 번째 저농도인 0.01 μM은 콜로니 수에 영향을 미치지 않았으나, 세포 성장을 둔화시켰으며, 이는 감소된 콜로니 크기(n=5)에 의해 입증된 바와 같다. 도 6b는 네오-카세트의 PB 매개된 제거 전(Cdk1ㆍHSV-TKㆍNeoIN)과 후(Cdk1ㆍHSV-TK), mCherry의 발현을 설명한다.
도 7a 내지 도 7def는 ALINK 변형된 세포를 사용한 세포 실험의 결과를 도시한다. 도 7a는 ALINK 변형된 마우스 C2 세포를 포함하는 피하 기형종의 GCV 처리 결과를 그래프로 도시한다. 도 7b는 ALINK 변형된 H1 ES 세포를 포함하는 피하 기형종의 GCV 처리 결과를 그래프로 도시한다. 도 7c는 ALINK 변형된 세포를 포함하는 유선 종양의 GCV 처리 결과를 그래프로 도시한다. 도 7def의 D는 신경 분석의 실험적 설계를 개략적으로 도시한다. 도 7def의 E는 Cdk1+/+, alink 인간 CA1 ES 세포로부터 유래된 신경 상피 전구세포(NEP) 세포의 현미경 이미지이다. 도 7def의 F는 분열 중인 ALINK 변형된 NEP의 GCV 유도된 사멸 및 비분열 뉴런의 비사멸을 설명하는 현미경 이미지를 도시한다.
도 8은 집단이 이형접합성(청색선) 및 동형접합성(적색선) ALINK 세포로부터 확장됨에 따라, HSV-TK 유전자에서 자연발생 돌연변이를 포함하는 추정 세포 수를 나타내는 그래프를 도시한다.
도 9a 내지 도 9b는, EARC를 생성하기 위한 마우스 Cdk1 좌위의 5'UTR로의 dox 가교의 표적화 및 Cdk1 내로의 삽입 후 가교의 거동을 도시한다. 도 9a는 마우스 Cdk1 좌위의 구조, 표적 벡터 및 상동성 재조합 상황에 대한 유전자형 분석에 사용되는 프라이머의 위치를 설명하는 개략도이다. 도 9b는 dox 가교가 Cdk1 5'UTR에 혼입된 것들을 확인하기 위해, 퓨로마이신 저항성 콜로니의 유전자형 분석을 나타내는 PCR 결과를 도시한다.
도 10은, 동형접합성 dox 가교 녹인을 갖는 ES 세포가 독시사이클린(또는, 독시사이클린 중복 기능을 갖는 약물)의 존재하에서만 생존하고, 분열하는 것을 설명하는 흐름도를 도시한다.
도 11은, 동형접합성 dox 가교 녹인 ES 세포가 독시사이클린 농도 의존적 생존 및 성장을 나타내는 것을 설명하는 대표적인 현미경 사진을 도시한다.
도 12는, ES 세포의 독시사이클린 의존적 생존을 복구하는 Cre 재조합효소 매개된 절개에 의한 dox 가교 제거를 도시한다.
도 13a 및 도 13b는 dox 가교 ES 세포의 성장에 대한 독시사이클린 회수의 효과를 도시한다. 도 13a는 독시사이클린의 존재하에 세포가 기하급수적으로 성장하며(원형이 포함된 적색 선), 이는 그의 정상적인 성장을 나타내는 것임을 나타내는 그래프를 도시한다. 1일째에 독시사이클린 회수 시에, 세포는 2일 동안만 성장하였으며, 그 후, 플레이트들로부터 세포들이 사라지기 시작하여, 9일째에는 세포가 존재하지 않았다(사각형이 포함된 어두운 청색 선). 처음 3일의 성장 후에 20배 더 낮은 독시사이클린 농도(50ng/ml)는 플레이트 상에 적어도 5일 동안 일정한 수의 세포를 유지시켰다(도 13, 삼각형이 포함된 밝은 청색 선). 정상 농도의 독시사이클린을 10일째에 플레이트에 다시 부가하였으며, 세포는 정상 ES 세포와 같이 다시 성장하기 시작하였다. 도 13b는 Dox 제거 0일, 1일 및 2일 후, Cdk1 mRNA의 수준(정량적 PCR에 의해 측정된 바와 같음)을 나타내는 막대 그래프를 도시한다. 발현 수준은 베타 액틴으로 정상화한다.
도 14는 dox 가교 ES 세포의 성장 과정을 도시하며, 독시사이클린이 배지로부터 제거된 경우, 100,000,000개의 dox 가교된 ES 세포 중에서 회피 세포가 존재하지 않는 것으로 나타났으나, 센티넬(sentinel)(야생형, GFP 양성) 세포는 고효율로 생존한 것을 설명한다.
도 15는 dox 가교 ES 세포에 대한 독시사이클린 고농도(10 μg/ml)의 효과를 나타내는 그래프를 도시하며: 고 독시사이클린의 존재하에, 세포는 저 독시사이클린에서와 유사한 그의 성장 속도로 둔화되며(고 dox는 10 μg/ml이고, 정상 dox는 1 μg/ml이며, 저 dox는 0.05 μg/ml임), 이는 세포 증식을 위한 CDK1 발현의 최적 수준을 정의하는 Dox 농도에 대한 창(window)이 존재한다는 것을 나타낸다.
도 16a 및 도 16b는 ALINK 변형을 포함하는 마우스 세포(즉, Cdk1(TK/TK) 세포; 도 3ab 내지 도 3g에 기재된 세포 산물)의 Cdk1 좌위의 5'UTR로의 dox 가교의 표적화를 도시한다. 도 16a는 Cdk1(TK/TK) 세포에서의 Cdk1 좌위의 구조, 가교 표적 벡터 및 유전자형 분석 프라이머의 위치를 설명하는 개략도이다. 도 16b는 마우스 Cdk1(TK/TK) 세포에서 Cdk1 5'UTR에 dox 가교가 혼입됨으로써, 마우스 세포 산물 Cdk1earc/earc, alink / alink이 생성된 것을 확인하기 위해, 퓨로마이신 저항성 콜로니의 유전자형 분석을 나타내는 PCR 결과를 도시한다.
도 17a 내지 도 17b는 ALINK 변형을 포함하는 인간 세포(즉, Cdk1(TK/TK) 세포; 도 4a 내지 도 4f에 기재된 세포 산물)의 Cdk1 좌위의 5'UTR로의 dox 가교의 표적화를 도시한다. 도 17a는 Cdk1(TK/TK) 세포에서의 Cdk1 좌위의 구조, 가교 표적 벡터 및 유전자형 분석 프라이머의 위치를 설명하는 개략도이다. 도 17b는 인간 Cdk1(TK/TK) 세포에서 Cdk1 5'UTR에 dox 가교가 혼입됨으로써, 인간 세포 산물 Cdk1earc/earc, alink / alink이 생성된 것을 확인하기 위해, 퓨로마이신 저항성 콜로니의 유전자형 분석을 나타내는 PCR 결과를 도시한다.
도 18a 및 도 18b는 Top2a로의 EARC 삽입을 생성하기 위한 Top2 좌위의 5'UTR로의 dox 가교의 표적화를 도시한다. 도 18a는 Top2a 좌위 및 표적 벡터의 구조를 설명하는 개략도이다. TOP2a_5scrF, rttaRev, CMVforw 및 TOP2a_3scrR은 상동성 재조합 상황에 대한 유전자형 분석에 사용되는 프라이머의 위치를 나타낸다. 도 18b는, Top2a 5'UTR로 dox 가교가 혼입된 것을 확인하기 위한 puro 저항성 콜로니의 유전자형 분석을 나타내는 PCR 결과를 도시한다. 이들 세포주 중 9개는 상동성 재조합에 의해 Top2a의 대립유전자 둘 모두의 5'UTR에 삽입된 dox 가교를 포함하는 동형접합성 표적화된 것으로 밝혀졌다.
도 19a 및 도 19b는 Top2a-EARC ES 세포의 성장에 대한 독시사이클린 회수의 효과를 도시한다. 도 19a는, 독시사이클린의 회수가 4일 이내에 유사분열 활성 ES 세포의 완전한 제거를 야기한 것을 나타낸다. 도 19b는 4일 동안 세포 성장을 측정함으로써, 상이한 농도의 독시사이클린이 dox 가교 ES 세포의 증식에 어떻게 영향을 주었는지를 도시한다. 독시사이클린의 존재하의 ES 세포는 기하급수적으로 성장하였으며, 이는 그의 정상적인 성장을 나타낸다. 반대로, 독시사이클린 제거 2일 후에는, 세포 성장이 완전히 저지되었다.
도 20a 및 도 20b는 Cenpa로의 EARC 삽입을 생성하기 위한 Cenpa 좌위의 5'UTR로의 dox 가교의 표적화를 도시한다. 도 20a는 Cenpa 좌위 및 표적 벡터의 구조를 설명하는 개략도이다. Cenpa_5scrF, rttaRev, CMVforw 및 Cenpa_3scrR은 상동성 재조합 상황에 대한 유전자형 분석에 사용된 프라이머의 위치를 나타낸다. 도 20b는, Cenpa 5'UTR에 dox 가교가 혼입된 것을 확인하기 위한 puro 저항성 콜로니의 유전자형 분석을 나타내는 PCR 결과를 도시한다. 이들 세포들 중 6개는 5' 및 3'에 올바른 삽입을 갖는 것으로 밝혀졌으며, 적어도 하나의 클론(Cenpa # 4)은 상동성 재조합에 의해 Cenpa의 대립유전자 둘 모두의 5'UTR에 삽입된 dox 가교를 포함하는 동형접합성 표적화된 것으로 밝혀졌다.
도 21a 및 도 21b는 Cenpa-EARC ES 세포의 성장에 대한 독시사이클린 회수의 효과를 도시한다. 도 21a는 독시사이클린의 회수가 4일 이내에 유사분열 활성 ES 세포의 완전한 제거를 야기한 것을 도시한다. 도 21b는 Dox를 갖는 Cenpa-EARC 세포 및 Dox 제거 2일 후의 Cenpa 유전자 발현 수준(q-PCR에 의해 결정됨)이며, 야생형 마우스 ES 세포(C2)의 발현 수준과 비교한 것이다. 추정된 바와 같이, Cenpa 발현 수준은 Dox의 부재하에 Cenpa-EARC 세포에서 2일 동안 크게 감소한다.
도 22는 4일 동안 세포 성장을 측정함으로써, 상이한 농도의 독시사이클린이 Cenpa-EARC ES 세포의 증식에 어떻게 영향을 주었는지를 도시한다. 독시사이클린의 존재하의 ES 세포는 기하급수적으로 성장하였으며, 이는 그의 정상적인 성장을 나타낸다. 반대로, 독시사이클린 제거 80시간 후에는, 세포 성장이 완전히 저지되었다.
도 23a 및 도 23b는 Birc5로의 EARC 삽입을 생성하기 위한 Birc5 좌위의 5'UTR로의 dox 가교의 표적화를 도시한다. 도 23a는 Birc5 좌위 및 표적 벡터의 구조를 설명하는 개략도이다. Birc_5scrF 및 rttaRev는 상동성 재조합 상황에 대한 유전자형 분석에 사용된 프라이머의 위치를 나타낸다. 도 23b는, Birc5 5'UTR에 dox 가교가 혼입된 것을 확인하기 위한 puro 저항성 콜로니의 유전자형 분석을 나타내는 PCR 결과를 도시한다. 5개의 클론은 재조합에 의해 Birc5의 대립유전자 둘 모두의 5'UTR에 삽입된 dox 가교를 포함하는 올바르게 표적화된 것으로 밝혀졌다. 이들 클론 중 하나는 Birc#3이었으며, Dox의 부재하에 성장이 중지되거나 사멸된 것으로 밝혀졌다.
도 24a 및 도 24b는 Birc5-EARC ES 세포의 성장에 대한 독시사이클린 회수의 효과를 도시한다. 도 24a는 독시사이클린의 회수가 4일 이내에 유사분열 활성 ES 세포의 완전한 제거를 야기한 것을 도시한다. 도 24b는 Dox를 갖는 Birc5-EARC 세포에서 Dox 제거 2일 후의 Birc5 유전자 발현 수준(q-PCR에 의해 결정됨)이며, 야생형 마우스 ES 세포(C2)의 발현 수준과 비교한 것이다. 추정된 바와 같이, Birc5 발현 수준은 Dox의 부재하에 Birc5-EARC 세포에서 2일 동안 크게 감소한다.
도 25는 4일 동안 세포 성장을 측정함으로써, 상이한 농도의 독시사이클린이 Birc5-EARC ES 세포의 증식에 어떻게 영향을 주었는지를 도시한다. 독시사이클린의 존재하의 ES 세포는 기하급수적으로 성장하였으며, 이는 그의 정상적인 성장을 나타낸다. 반대로, 독시사이클린 제거 50시간 후에는, 세포 성장이 완전히 저지되었다. 흥미롭게도, 더 저농도 Dox(0.5 및 0.05 μg/ml)가 더 고농도(1 μg/ml)보다 더 양호한 세포 성장을 촉진하는 것으로 나타난다.
도 26a 및 도 26b는 Eef2로의 EARC 삽입을 생성하기 위한 Eef2 좌위의 5'UTR로의 dox 가교의 표적화를 도시한다. 도 26a는 Eef2 좌위 및 표적 벡터의 구조를 설명하는 개략도이다. Eef2_5scrF 및 rttaRev는 상동성 재조합 상황에 대한 유전자형 분석에 사용된 프라이머의 위치를 나타낸다. 도 26b는, Eef2 5'UTR에 dox 가교가 혼입된 것을 확인하기 위한 puro 저항성 콜로니의 유전자형 분석을 나타내는 PCR 결과를 도시한다. 이들 세포주 중 9개가 올바르게 표적화된 것으로 밝혀졌으며, 적어도 하나의 클론은 Dox-배지에서만 성장하였다.
도 27은 Eef2-EARC ES 세포의 성장에 대한 독시사이클린 회수의 효과를 도시한다. 독시사이클린의 회수는 4일 이내에 유사분열 활성 ES 세포의 완전한 제거를 야기한다.
도 28은 4일 동안 세포 성장을 측정함으로써, 상이한 농도의 독시사이클린이 Eef2-EARC ES 세포의 증식에 어떻게 영향을 주었는지를 도시한다. 독시사이클린의 존재하의 ES 세포는 기하급수적으로 성장하였으며, 이는 그의 정상적인 성장을 나타낸다. 반대로, 독시사이클린 부재 시에 세포는 성장에 완전히 실패한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는, 본 개시 내용이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
정의
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "세포 분열 좌위", "세포 분열 좌위들", 및 "CDL"은, 그 전사 산물(들)이 분열 세포에 의해 발현되는 게놈 좌위(또는, 좌위들)를 지칭한다. CDL이 단일 좌위를 포함하는 경우, CDL 발현의 부재 시에 세포(들)가 어블레이션되거나, CDL 발현의 부재 시에 세포(들)의 증식이 차단 또는 훼손될 것이므로, 세포(또는, 그의 유도체)에서 CDL 발현의 부재는 종양 개시 및/또는 형성이 금지된다는 것을 의미한다. CDL이 다수 좌위들을 포함하는 경우, CDL 발현의 부재 시에 세포(들)가 어블레이션되거나, CDL 발현의 부재 시에 세포(들)의 증식이 차단 또는 훼손될 것이므로, 세포(또는, 그의 유도체)에서 상기 좌위들의 전부 또는 그의 하위세트에 의한 발현의 부재는 종양 개시 및/또는 형성이 금지된다는 것을 의미한다. CDL은 비분열성 및/또는 비증식성 세포에서 발현될 수 있거나, 발현되지 않을 수 있다. CDL은 숙주 세포에 대해 내인성이거나, 전이유전자일 수 있다. CDL이 전이유전자인 경우, 숙주 세포와 동일하거나 상이한 종으로부터 유래될 수 있거나, 합성 유래의 것일 수 있다. 일 구현예에서, CDL은 세포 분열 동안 전사되는 단일 좌위이다. 예를 들어, 일 구현예에서, 단일 좌위 CDL은 CDK1이다. 일 구현예에서, CDL은 세포 분열 동안 전사되는 2개 이상의 좌위들을 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 다좌위 CDL은 2개의 MYC 유전자(c-Myc 및 N-myc)를 포함한다(문헌[Scognamiglio et al., 2016]). 일 구현예에서, 다좌위 CDL은 중복 기능을 가질 수 있는 AURORA B 및 C 키나제를 포함한다(문헌[Fernandez-Miranda et al., 2011]). 세포 분열 및 세포 증식은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있는 용어이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "세포 분열의 정상 속도", "정상 세포 분열 속도", "세포 증식의 정상 속도" 및 "정상 세포 증식 속도"는 비암성의 건강한 세포의 전형적인 세포 분열 및/또는 증식의 속도를 지칭한다. 세포 분열 및/또는 증식의 정상 속도는 세포 유형에 특이적일 수 있다. 예를 들어, 표피, 장, 폐, 혈액, 골수, 흉선, 고환, 자궁 및 유선의 세포 수가 고속 세포 분열 및 고속 사멸에 의해 유지된다는 것이 광범위하게 인정되고 있다. 반대로, 췌장, 신장, 각막, 전립선, 골, 심장 및 뇌의 세포 수는 저속 세포 분열 및 저속 세포 사멸에 의해 유지된다(문헌[Pellettieri and Saenchez Alvarado, 2007]).
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "증식의 유도성 음성 효과기" 및 "iNEP"는: i) CDL 발현을 유도적으로 중지시키거나 차단함으로써, 세포 분열 및 증식을 금지하거나; ii) CDL 발현 세포의 적어도 일부를 유도적으로 어블레이션하거나(즉, 증식 세포의 적어도 일부를 사멸시킴); 또는 iii) 세포 분열 속도가 종양 형성에 기여할 만큼 충분히 빠르지 않도록, 세포 분열 속도를 세포의 정상 세포 분열 속도에 비해 유도적으로 둔화시킴으로써, 세포 분열 및/또는 증식을 제어하기 위한 CDL 발현의 사용을 용이하게 하는 유전적 변형을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "어블레이션 연결" 및 "ALINK"은 CDL과 음성 선택 마커를 인코딩하는 서열 사이의 전사 연결을 포함하는 iNEP의 예를 지칭한다. ALINK 변형은 사용자로 하여금, 음성 선택 마커의 유도인자에 ALINK 변형된 세포를 노출시킴으로써, 증식 세포의 적어도 일부를 사멸시킴으로써, ALINK를 포함하는 증식 숙주 세포를 유도적으로 사멸시키거나, 상기 숙주 세포의 증식을 억제할 수 있도록 한다. 예를 들어, CDL에 ALINK를 포함하도록 변형된 세포는, 증식 세포의 적어도 일부를 사멸시킴으로써, 증식 세포를 어블레이션하거나, 세포 증식을 억제하기 위해, 음성 선택 마커의 유도인자(예를 들어, 전구약물)에 의해 치료될 수 있다(도 1b).
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CDL의 외인성 활성인자 조절" 및 "EARC"는, 활성인자를 통한 비코딩 또는 코딩 DNA 전사 또는 상응하는 번역의 외인성 변경을 용이하게 하는 메커니즘 또는 시스템을 포함하는 iNEP의 예를 지칭한다. EARC 변형은 사용자로 하여금, EARC 변형된 CDL의 전사 및/또는 번역을 허용하는 유도인자를 EARC 변형된 세포로부터 제거함으로써, EARC를 포함하는 세포의 분열을 유도적으로 중지 또는 억제할 수 있도록 한다. 예를 들어, 유도성 활성인자 기반 유전자 발현 시스템은 CDL에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 약물 유도성 활성인자 및 상응하는 유도인자 약물의 존재가 CDL 전사 및/또는 번역을 위해 요구되도록, CDL의 발현 또는 CDL 번역을 외인적으로 제어하는데 사용될 수 있다. 유도인자 약물의 부재하에, 세포 분열 및/또는 증식은 중지 또는 억제될 것이다(예를 들어, 정상 세포 분열 속도로 둔화됨). 예를 들어, Cdk1/CDK1의 발현, 그리고 세포 분열 및 증식이 유도인자(예를 들어, 독시사이클린)의 존재하에서만 가능할 수 있도록, CDL Cdk1/CDK1은 dox 가교를 포함하도록 변형될 수 있다(도 1b).
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "증식 길항제 시스템"는, 그의 존재가 세포의 증식을 (완전히 또는 부분적으로) 억제하는 천연 또는 조작된 화합물(들)을 지칭한다.
도구 및 방법에 대한 일반적인 설명
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명자들은, 사용자에 의해 세포 분열 및/또는 증식이 하나 이상의 iNEP를 통해 제어될 수 있는 유전적으로 변형된 세포를 생성하기 위해, 동물 세포에서 하나 이상의 세포 분열 좌위들(CDL)을 사용하기 위한 분자 도구, 방법 및 키트를 제공하였다(도 1a). 예를 들어, 본 명세서에서 제공되는 하나 이상의 도구 및/또는 방법을 사용함으로써 생성된 세포의 분열은, 세포 분열 속도가 종양 형성에 기여할 만큼 충분히 빠르지 않도록, 사용자에 의해 중지, 차단 또는 억제될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 제공되는 하나 이상의 도구 및/또는 방법을 사용함으로써 생성된 세포의 증식은, 세포의 증식 속도 또는 체적이 각각 사용자가 원하는 속도 또는 크기로 유지될 수 있도록, 증식 세포의 적어도 일부를 사멸 또는 중지시킴으로써, 사용자에 의해 중지, 차단 또는 억제될 수 있다.
세포 분열 및/또는 증식을 제어하기 위한 도구 및 방법은, 예를 들어 (정상 세포 분열 속도에 비해) 더 빠른 세포 분열 속도가 바람직하지 않은 경우에, 바람직하다. 예를 들어, 정상 속도보다 더 빠르게 분열하는 세포는 그 위치에서 종양을 형성할 수 있으며, 이는 숙주에 유해할 수 있다. 일 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 유전적으로 변형된 동물 세포는, 바람직하지 않은 세포 분열 및/또는 증식이 사용자에 의해 제어될 수 있도록, 정상 세포 분열 및/또는 증식을 허용하고, 세포 분열 및/또는 증식을 중지, 어블레이션, 차단 및/또는 둔화시키기 위한 하나 이상의 메커니즘을 포함한다(도 1b). 도 1b와 관련하여, 실시예(I)에서, EARC는 CDL의 5'UTR에 삽입되고, ALINK는 3'UTR에 삽입되며, 그 전사 산물은, 2개의 단백질로 가공되는 이중 시스트론(bi-cistronic) mRNA이다. 실시예(II)에서, EARC 및 ALINK 둘 모두는 CDL의 5'UTR에 삽입되며, 그 전사 산물은, 2개의 단백질로 가공되는 이중 시스트론 mRNA이다. 실시예(Ⅲ)에서, EARC는 CDL의 5'UTR에 삽입되고, ALINK는 CDL 코딩 서열 내에 삽입되며, 그 전사 산물은, 특이적으로 설계된 절단 서열의 절단 시에 2개의 개별 단백질을 생성할 것인 전구체 단백질로 가공되는 mRNA이다. 실시예(IV)에서, EARC 및 ALINK 둘 모두는 CDL의 5'UTR에 삽입되며, 그 전사 산물은 CDL 및 ALINK 기능 둘 모두를 유지하는 융합 단백질로 가공되는 mRNA이다. 실시예(V)에서, EARC는 CDL의 5'UTR에 삽입되고, ALINK는 3'UTR에 삽입되며, 그 전사 산물은 CDL 및 ALINK 기능 둘 모두를 유지하는 융합 단백질로 가공되는 mRNA이다.
예를 들어, 본 명세서에서 제공되는 유전적으로 변형된 동물 세포는 대상체에게 적용되는 세포 치료적 처리에 사용될 수 있다. 대상체에 제공되는 하나 이상의 유전적으로 변형된 동물 세포가 바람직하지 않은 속도(예를 들어, 정상보다 더 빠름)로 분열하기 시작하는 경우, 그 후, 사용자는, i) 바람직하지 않은 속도로 분열하는 세포에 상기 세포의 유전적 변형에 상응하는 유도인자를 적용하거나; ii) 바람직하지 않은 속도로 분열하는 세포의 상기 세포의 유전적 변형에 상응하는 유도인자에 대한 접근을 제한함으로써, 바람직하지 않은 속도로 분열하는 세포의 분열을 중지 또는 둔화시킬 수 있거나, 바람직하지 않은 속도로 증식하는 세포를 차단, 둔화 또는 중지시킬 수 있으며, i) 또는 ii)는 유전적으로 변형된 동물 세포에 제공되는 iNEP(들)의 유형을 기반으로 하여 결정된다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 유전적으로 변형된 동물 세포는 "페일 세이프 세포"(fail-safe cell)로서 지칭될 수 있다. 페일 세이프 세포는 하나 이상의 CDL에 하나 이상의 동형접합성, 이형접합성, 반접합성 또는 복합 이형접합성 ALINK를 포함한다. 일 구현예에서, 페일 세이프 세포는 하나 이상의 CDL에 하나 이상의 EARC를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 페일 세이프 세포는 ALINK 및 EARC 변형 둘 모두를 포함하는 CDL을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "페일 세이프"는, 세포 수를 정의하는 확률(pFS로서 지정됨)을 지칭한다. 예를 들어, 모든 ALINK를 상실한 세포를 포함하는 클론을 얻을 확률인, 단일 페일 세이프 세포로부터 성장할 수 있는 세포의 수(클론 용적)는 임의의 값(pFS)보다 작다. 예를 들어, pFS=0.01은, 클론이 ALINK 변형된 CDL을 포함하는 단일 세포로부터 100배 성장한 경우, 하나의 클론만이 ALINK 기능(음성 선택 마커의 발현)을 상실하여, 여전히 세포 분열할 수 있는 세포를 가질 것으로 예상되는 시나리오를 지칭한다. 페일 세이프 용적은 ALINK 수 및 ALINK 표적 CDL의 수에 의존적일 것이다. 페일 세이프 성질은 표 1에 추가로 기재되어 있다.
페일 세이프 세포 용적과 인체의 관계는 수학적 모델링을 사용함으로써 계산하였다. 상기 모델은, CDL 발현이 음성 선택 마커 활성의 상실과 함께 공동 상실되어, 세포 증식이 훼손된 상황은 계수하지 않았다. 따라서, 상기 값은 과소 평가되며, 음성 선택 마커의 경우, 10 내지 6의 전향 돌연변이율(forward mutation rate)을 가정하여 계산하였다. 인체에서의 추정 세포 수는 3.72x1013으로서 산정되었다(문헌[Bianconi et al., 2013]).
CDL # ALINK # CDL의 유전자형 페일 세이프 용적(#세포) 인체에 대한 상대값 (x)=3.72x1013 세포 클론의 추정 중량
1 1 het 512 0.0000000000137 1 μg
1 2 hom 16777216 0.000000451 31 mg
2 3 het, hom 1.374E+11 0.004 0.26 kg
2 4 hom, hom 1.13E+15 30 2100 kg
본 명세서에서, 페일 세이프 세포는, 세포를 숙주 내로 이식하기 전 또는 후에 이러한 세포의 생성 여부에 관계없이, 바람직하지 않은 성장 속도를 나타내는 세포를 제거하는 것이 바람직할 수 있는 세포 기반 치료법에 유용할 수 있는 것으로 고려될 수 있다.
세포 분열 좌위들(CDL )
본 명세서에서 제공되는 시스템, 방법 및 조성물은, 예를 들어 표 2에 제시된 CDL과 같은 하나 이상의 CDL의 확인을 기반으로 한다. 본 명세서에서 제공되는 방법을 사용함으로써, 다양한 CDL이 표적화될 수 있다는 것이 본 명세서에서 고려된다.
다양한 구현예에서, CDL은, 본 명세서에서 그 전문이 제시된 것과 같이, 참조로서 포함되는 문헌[Wang et al., 2015]에 제시된 바와 같이, "필수 유전자"로서 확인된 좌위이다. 문헌[Wang et al., 2015]에서의 필수 유전자는, 상기 유전자의 불활성화에 의해 부여되는 적합도 값(fitness cost)을 반영하는 각 유전자에 대한 점수(즉, CRISPR 점수)를 계산함으로써, 확인하였다. 일 구현예에서, CDL은 약 -1.0 미만의 CRISPR 점수를 갖는다(표 2, 5열).
다양한 구현예에서, CDL은, 세포 분열 및/또는 복제에 관련되는 유전자 산물을 인코딩하는 좌위/좌위들이다(표 2, 6열). 예를 들어, 다양한 구현예에서, CDL은: i) 세포 주기; ii) DNA 복제; iii) RNA 전사 및/또는 단백질 번역; 및 iv) 대사작용 중 하나 이상에 관련되는 유전자 산물을 인코딩하는 좌위/좌위들이다(표 2, 7열).
일 구현예에서, CDL은, 세포 주기 진행의 조절(예를 들어, G1/S G2/M 및 중기로부터 후기로의 전이의 제어)과 관련된 하나 이상의 사이클린 의존성 키나제, 예를 들어 CDK1, CDK2, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7, CDK8, CDK9 및/또는 CDK11이다(문헌[Morgan, 2007]). 일 구현예에서, CDL은, 하나 이상의 CDK를 활성화시킴으로써, 세포 주기의 진행을 제어하는 것과 관련된 하나 이상의 사이클린, 예를 들어, 사이클린B, 사이클린E, 사이클린A, 사이클린C, 사이클린D, 사이클린H, 사이클린C, 사이클린T, 사이클린L 및/또는 사이클린F이다(문헌[FUNG and POON, 2005]). 일 구현예에서, CDL은, 세포 주기의 M기에서 중기로부터 후기로의 전이의 진행을 제어하는 후기 촉진 복합체에 포함되는 하나 이상의 좌위들이다(문헌[Peters, 2002]). 일 구현예에서, CDL은, 세포 주기의 M기에서 중기로부터 후기로의 전이의 진행을 제어하는 방추사부착점 구성요소와 관련된 하나 이상의 좌위들이다(문헌[Fukagawa, 2007]). 일 구현예에서, CDL은, 세포 주기에 요구되는 미소관 역학을 제어하는 미소관 구성요소와 관련된 하나 이상의 좌위들이다(문헌[Cassimeris, 1999]).
다양한 구현예에서, CDL은 세포유지(housekeeping)와 관련된 좌위/좌위들이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "세포유지 유전자" 또는 "세포유지 좌위"는 기본 세포 기능의 유지에 요구되는 하나 이상의 유전자를 지칭한다. 세포유지 유전자는 정상 조건 및 병리학적 조건하에서 유기체의 모든 세포에서 발현된다.
다양한 구현예에서, CDL은, 세포 분열 및/또는 증식에 관련되는 유전자 산물을 인코딩하고, 약 -1.0 미만의 CRISPR 점수를 갖는 좌위/좌위들이다. 예를 들어, 일 구현예에서, CDL은, i) 세포 주기; ii) DNA 복제; iii) RNA 전사 및/또는 단백질 번역; 및 iv) 대사작용 중 하나 이상에 관련되는 유전자 산물을 인코딩하고, 약 -1.0 미만의 CRISPR 점수를 갖는 좌위/좌위들이다. 일 구현예에서, CDL은 또한 세포유지 유전자일 수 있다.
일 구현예에서, 잠재적인 CDL을 확인하기 위해, 본 발명자들은, 유전자 녹아웃(KO; 표 2, 8열)의 초기 마우스 배아 치사 표현형(embryonic lethal phenotype)을 시험하였다. 예를 들어, 본 발명자들은 Cdk1(사이클린 의존성 키나제 1, 세포 분열 주기 단백질 2 상동체(CDC2)로도 지칭됨) 눌 돌연변이에 대해 동형접합성 눌인 마우스 배아가 2 세포기(E1.5)에 사멸한다는 것을 발견하였다(문헌[Santamariea et al., 2007]). Cdk1(인간에서 CDK1으로도 지칭됨)은 세포 주기를 조절하는 데 중요한 기능을 하는 고도로 보존된 세린/트레오닌 키나제이다. Cdk1의 단백질 복합체는 많은 수의 표적 기질을 인산화시킴으로써, 세포 주기의 진행을 야기한다. Cdk1 발현의 부재 시에, 세포는 세포 주기의 G2기에서 M기로 전이할 수 없다.
Cdk1/CDK1은 단일 좌위 CDL의 일례이다. 상기 좌위의 전사가 ALINK 변형의 삽입에 의해 어블레이션되고/되거나, EARC 변형의 삽입에 의해 외인적으로 제어되는 Cdk1/CDK1의 유전적 변형이 실시예 1, 2 및 3에 제시된 바와 같이 본 명세서에서 시험된다. Top2A/TOP2A는 CDL의 일례이다. Cenpa/CEPNA는 CDL의 일례이다. Birc5/BIRC5는 CDL의 일례이다. Eef2/EEF2는 CDL의 일례이다. 상기 좌위의 전사가 EARC 변형의 삽입에 의해 외인적으로 제어될 수 있는 Top2a, Cenpa, Birc5 및 Eef2의 유전적 변형은 각각 실시예 4 내지 7에 제시된 바와 같이 본 명세서에서 시험된다.
대안적 및/또는 추가적 좌위들이 본 명세서에서 제공되는 방법을 사용함으로써 표적화될 수 있는 CDL인 구현예가 본 명세서에서 고려된다.
예를 들어, 인간 세포주의 RNAi 스크리닝에서 세포 증식에 필수적인 다수의 유전자가 확인되었다(문헌[Harborth et al., 2001; Kittler et al., 2004]). 본 발명자들은, 오르소로그(orthologue)가 결핍된 마우스의 상기 좌위들의 초기 배아 치사 표현형을 확인하고/하거나, 상기 좌위들의 GO 기간 및/또는 진카드(genecard)를 확인한 후에, 이들 좌위들의 하위세트가 CDL이었음을 추정하였다(표 2, 8열).
어블레이션 연결( ALINK ) 유전적 변형에 의한 CDL의 표적화
일 양태에서, 본 개시는, 음성 선택 마커를 인코딩하는 DNA 서열의 발현과 CDL의 발현을 연결시킴으로써, 결과적으로 CDL 및 음성 선택 마커를 발현하는 유사분열 활성 세포의 약물 유도된 어블레이션을 허용하도록 CDL을 변형시키기 위한 분자 도구, 방법 및 키트를 제공한다. 예를 들어, 세포 증식이 세포의 정상 분열 속도에 비해 비제어 및/또는 가속화되는 경우(예를 들어, 암종 세포에 의해 나타나는 비제어 세포 분열), 증식 세포의 어블레이션이 바람직할 수 있다. 증식 세포의 어블레이션은, 음성 선택 마커를 인코딩하는 DNA 서열의 발현을 CDL의 발현과 연결시킴으로써, 결과적으로 CDL 좌위를 발현하는 ALINK 변형된 증식 세포의 제거 또는 충분한 억제(충분한 억제란, 너무 저속이어서, 종양 형성에 기여할 수 없는 속도로 세포 확장 속도가 억제되는 것임)를 허용하는, 본 명세서에서 "어블레이션 연결"(ALINK)로 지칭되는 세포에 대한 유전적 변형을 통해 달성될 수 있다. 음성 선택 시스템의 전구약물 또는 다른 유도인자의 존재하에, 음성 마커를 발현하는 세포는 선택 마커의 작용 메커니즘에 따라 증식을 중지하거나, 사멸할 것이다. 세포는 동형접합성, 이형접합성, 반접합성 또는 복합 이형접합성 ALINK를 포함하도록 변형될 수 있다. 일 구현예에서, 어블레이션의 정확도를 향상시키기 위해, 음성 선택 마커는 CDL의 모든 기능적 대립유전자에 도입될 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 음성 선택 마커는 CDL의 모든 기능적 대립유전자에 도입될 수 있다.
ALINK는, CDL 및 음성 선택 마커의 공동 발현을 허용하는 CDL의 임의의 위치에 삽입될 수 있다.
하기 실시예 1에서 추가로 논의되는 바와 같이, 음성 선택 마커(예를 들어, HSV-TK)를 인코딩하는 DNA를 숙주 세포의 CDL(예를 들어, CDK1) 내로 삽입함으로써, 음성 선택 마커의 발현이, 음성 선택 마커 및 필연적으로 CDL을 발현하는 숙주 세포를 음성 선택 마커(예를 들어, 간사이클로비르(GCV))의 유도인자(예를 들어, 전구약물)의 존재하에 사멸될 수 있도록 할 수 있다. 이 실시예에서, ALINK에 의해 변형된 숙주 세포는 티미딘 키나제(TK)를 생성할 것이고, TK 단백질은 GCV를 GCV 일인산염으로 전환시키며, 이어서, 세포 키나제에 의해 GCV 삼인산염으로 전환된다. GCV 삼인산염은 S기 동안 복제 DNA 내로 혼입됨으로써, DNA 연장의 종결 및 세포 아폽토시스를 야기한다(문헌[Halloran and Fenton, 1998]).
바람직하지 않은 세포 분열 속도를 포함하는 세포를 선택적으로 어블레이션하기 위해, ALINK 유전적 변형에 사용될 수 있는 음성 선택 마커를 인코딩하는 DNA의 일례로서 변형된 HSV-TK 유전자(문헌[Preuß et al., 2010])가 본 명세서에 개시되어 있다.
대안적 및/또는 추가적 음성 선택 시스템이 본 명세서에서 제공되는 도구 및/또는 방법에 사용될 수 있음이 본 명세서에서 고려된다. 다양한 음성 선택 마커 시스템이 당 업계에 공지되어 있다(예를 들어, dCK.DM(문헌[Neschadim et al., 2012])).
예를 들어, 부작용 없이 또는 최소화하여, 기존의 암 치료법의 치료적 효능을 향상시키는 것을 목표로 하는, 임상적 관련성을 갖는 다양한 음성 선택 시스템이 "유전자 직접 효소/전구약물 치료법"(GEPT) 분야에서 활발히 개발되어 왔다(문헌[Hedley et al., 2007; Nawa et al., 2008]). 종종, GEPT는, 포유류 세포에서 발견되지 않고, 상대적으로 무독성인 전구약물을 독성 제제로 전환시킬 수 있는 효소를 생성하는 암세포의 영역에서 암세포 또는 암세포의 근처에 유전자를 전달하기 위해, 바이러스 벡터의 사용을 포함한다.
HSV-TK/GCV, 시토신 데아미나제/5-플루오로시토신(CD/5-FC) 및 카르복시 에스테라제/이리노테칸(CE/CPT-11)이 GEPT 전임상 시험 및 임상 시험에서 평가되는 음성 선택 마커 시스템의 예이다(문헌[Danks et al., 2007; Shah, 2012]).
단순 포진 바이러스 1형 티미딘 키나제/간사이클로비르(TK/GCV) 시스템의 잠재적인 면역원성 문제를 극복하기 위해, 인간 데옥시시티딘 키나제 효소를 티미딘 활성이 되도록 하고, 비독성 전구약물에 의한 음성 선택(자살) 시스템으로서 작용하도록 조작함으로써, "인간화된" 자살 시스템이 개발되어 왔다: 브로모비닐-데옥시우리딘(BVdU), L-데옥시티미딘(LdT) 또는 L-데옥시우리딘(LdU)(문헌[Neschadim et al., 2012]).
CD/5-FC 음성 선택 마커 시스템은 광범위하게 사용되는 "자살 유전자" 시스템이다. 시토신 데아미나제(CD)는 박테리아 또는 효모(예를 들어, 각각 에세리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)로부터 얻을 수 있는 비포유류 효소이다(문헌[Ramnaraine et al., 2003]). CD는 시토신의 우라실로의 전환을 촉매하고, 원핵생물 및 진균류에서 피리미딘 회수 경로의 중요한 구성원이나, 포유류 세포에는 존재하지 않는다. 5-플루오로시토신(5-FC)은 인간에게 저수준의 세포독성을 야기하는 항진균성 전구약물이다(문헌[Denny, 2003]). CD는 5-FC의 인간에서 고수준의 독성을 갖는 유전자 독성 물질 5-FU로의 전환을 촉매한다(문헌[Ireton et al., 2002]).
CE/CPT-11 시스템은 포유류 종의 상이한 조직들에서 발견되는 세린 에스테라아제인 카르복시 에스테라제 효소를 기반으로 한다(문헌[Humerickhouse et al., 2000]). 항암제 CPT-11은, CE에 의해 활성화됨으로써, 강력한 포유류 토포아이소머라제 I 억제제인 7-에틸-10-하이드록시캄토테신(SN-38)으로 불리는 활성을 생성하는 전구약물이다(문헌[Wierdl et al., 2001]). SN-38은 분열 세포에서 이중 가닥 DNA 파열의 축적을 유도한다(문헌[Kojima et al., 1998]).
음성 선택 마커 시스템의 또 다른 예는 iCasp9/AP1903 자살 시스템이며, 이는 인간 FK506 결합 단백질(FKBP)에 융합된 변형된 인간 카스파제 9를 기반으로 하고, 소분자 AP1903을 사용한 화학적 이량체화를 허용하며, 인간에서 안전하게 시험되었다. 이량체화 약물의 투여는 조작된 카스파제 9 구성요소를 발현하는 세포의 아폽토시스를 유도한다. 이 시스템은, 예를 들어, 인간 유전자 산물로 구성되어 있으며, 이 이량체화 약물이, 조작된 카스파제 9 구성요소를 발현하는 세포에만 영향을 미침으로 인한 잠재적 저면역원성을 포함하는 몇 가지 이점을 가진다(문헌[Straathof et al., 2005]). iCasp/AP1903 자살 시스템은 임상 환경에서 시험되고 있다(문헌[Di Stasi et al., 2011]).
본 명세서에서, ALINK 시스템의 음성 선택 마커 시스템이 증식 길항제 시스템으로 대체될 수 있음이 고려된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "증식 길항제"는, 그 존재가 세포 분열을 (완전히 또는 부분적으로) 억제하는 천연 또는 조작된 화합물(들)을 지칭한다. 예를 들어, OmomycER는 돌연변이 쥣과동물 에스트로겐 수용체(ER) 도메인을 갖는 MYC 우성 음성 Omomyc의 융합 단백질이다. 타목시펜(tamoxifen)(TAM)으로 유도되는 경우, 융합 단백질 OmomycER는 핵에 국소화되며, 여기서, 우성 음성 Omomyc는 C-Myc, L-Myc 및 N-Myc와 이량체함으로써, Myc DNA 결합 공통 서열과 결합할 수 없는 복합체 내로 이들을 격리시킨다(문헌[Soucek et al., 2002]). Myc 활성의 결여의 결과로서, 세포는 분열할 수 없다(문헌[Oricchio et al., 2014]). 증식 길항제의 또 다른 예는, 등몰농도 경쟁에서 DNA 결합을 억제하는 활성화 단백질-1(AP1)에 대해 우성 음성인 A-Fos(종양 유전자 Fos와 Jun의 이종이량체)이다(문헌[Olive et al., 1997]). A-Fos는 또한 ER 도메인에 융합됨으로써, TAM에 의해 핵 국소화가 유도되도록 할 수 있다. OmomycER/타목시펜 또는 A-FosER/타목시펜은 TK/GCV를 ALINK로 대체할 수 있다.
EARC 유전적 변형에 의한 CDL의 표적화
일 양태에서, 본 개시는, EARC, 예를 들어 유도성 활성인자 기반 유전자 발현 시스템과 CDL을 작동 가능하게 연결시킴으로써, CDL을 외인적으로 제어하기 위한 분자 도구, 방법 및 키트를 제공한다. 이러한 조건하에서, CDL은 유도성 활성인자 기반 유전자 발현 시스템의 유도인자의 존재하에서만 발현될 것이다(그리고, 세포는 분열할 수 있음). 이러한 조건하에서, EARC 변형된 세포는, 유도성 활성인자 기반 유전자 발현 시스템 및 CDL 기능의 작용 메커니즘에 따라, 유도인자의 부재 시에, 분열을 중지하거나, 유의하게 둔화되거나, 사멸된다. 세포는 동형접합성 또는 복합 이형접합성 EARC를 포함하도록 변형되거나, EARC 변형된 대립유전자만이 기능적 CDL을 생성할 수 있도록 변경될 수 있다. 일 구현예에서, EARC 변형은 CDL의 모든 대립유전자에 도입되어, 예를 들어, 세포 분열 제어를 위한 메커니즘을 제공할 수 있다.
EARC는, 유도인자의 존재하에 CDL 및 유도성 시스템의 활성인자 구성요소의 공동 발현을 허용하는 CDL의 임의의 위치에 삽입될 수 있다.
일 구현예에서, "활성인자" 기반 유전자 발현 시스템은 "리프레서"(repressor) 기반 유전자 발현 시스템보다 바람직하다. 예를 들어, 리프레서가 CDL을 억제하는데 사용되는 경우, 리프레서의 기능 돌연변이의 상실은 CDL 발현을 해제함으로써, 세포 증식을 허용할 수 있다. 활성화에 기반한 세포 분열 억제의 경우, 활성인자 기능(돌연변이)의 상실은 CDL 발현을 폐쇄시킴으로써, 세포 증식을 불허할 수 있다.
하기 실시예 2 내지 6에서 추가로 논의되는 바와 같이, dox 가교를 숙주 세포의 CDL(예를 들어, CDK1) 내로 삽입하여, 유도인자(예를 들어, 독시사이클린 또는 "DOX")의 존재하에, dox 가교가 CDL 발현을 허용함으로써, 세포 분열 및 증식이 허용될 수 있도록 할 수 있다. dox 가교 EARC에 의해 변형된 숙주 세포는, 분열 세포(예를 들어, CDL)에서 활성인 프로모터의 전사적 제어 하의 역 테트라사이클린 트랜스활성인자(rtTA) 유전자(문헌[Urlinger et al., 2000])를 포함할 수 있다. 이러한 표적 삽입은 CDL 프로모터가 CDL 전사에 더 이상 사용될 수 없도록 한다. CDL 전사를 재획득하기 위해, 테트라사이클린 반응자 요소 프로모터(예를 들어, TRE(문헌[Agha-Mohammadi et al., 2004]))를 CDL 전사체 앞에 삽입하면, rtTA가 발현되고, 독시사이클린이 존재하는 경우에만, CDL 유전자가 발현될 것이다. CDL 발현의 유일한 원천이 dox 가교 대립유전자인 경우, 독시사이클린의 부재 시에, CDL 유전자 발현은 존재하지 않는다. CDL 발현의 결여는, 사멸되거나, 세포 분열이 중지되거나, EARC 변형된 세포가 종양 형성에 기여할 수 없도록 세포 유사분열 속도가 둔화되도록 함으로써, EARC 변형된 세포에서 그의 증식이 훼손되도록 야기한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "dox 가교"는, 내인성 또는 외인성 프로모터에 의해 rtTA(문헌[Gossen et al., 1995])를 발현시키고, TRE의 제어하에 표적 영역이 전사되도록 함으로써, 표적 전사 영역으로부터 프로모터의 활성을 분리시키는 메커니즘을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "rtTA"는 테트라사이클린 유도성 시스템의 역 테트라사이클린 트랜스활성인자 요소(문헌[Gossen et al., 1995])를 지칭하고, "TRE"는 최소 프로모터의 상류에 TetO 오퍼레이터 서열로 이루어진 프로모터를 지칭한다. 독시사이클린의 존재하에 rtTA가 TRE 프로모터와 결합하는 경우, TRE 프로모터 하류의 좌위들의 전사가 증가한다. rtTA 서열은, 표적 영역의 전사 발현의 허용 또는 불허 상태가 독시사이클에 의해 제어되는 한, CDL과 동일한 전사 단위 또는 게놈의 다른 위치에 삽입될 수 있다. dox 가교는 EARC의 일례이다.
EARC 시스템을 CDL의 5' 조절 영역에 도입하는 것이 또한 본 명세서에서 고려된다.
대안적 및/또는 추가적 유도성 활성인자 기반 유전자 발현 시스템이 EARC 변형을 생성하기 위해, 본 명세서에서 제공되는 도구 및/또는 방법에 사용될 수 있음이 본 명세서에서 고려된다. 다양한 유도성 활성인자 기반 유전자 발현 시스템이 당 업계에 공지되어 있다.
예를 들어, 코딩 CDL의 작용 단백질 산물과 융합된 불안정화 단백질 도메인(문헌[Banaszynski et al., 2006])은, 세포 분열 및/또는 증식이 바람직한 경우, CDL 융합 단백질을 안정화시키기 위해, 소분자 합성 리간드와 함께 사용될 수 있다. 안정화제의 부재 시에, 불안정화된 CDL 단백질은 세포에 의해 분해됨으로써, 이어서 증식이 중지될 것이다. 안정화제 화합물이 부가되는 경우, 이는 불안정화된 CDL 단백질과 결합하고, 분해되지 않음으로써, 세포의 증식이 허용될 것이다.
예를 들어, 전사 활성인자 유사 효과기(TALE) 기법(문헌[Maeder et al., 2013])은 이량체화제 조절된 발현 유도(문헌[Pollock and Clackson, 2002])와 조합될 수 있다. TALE 기법은 CDL의 프로모터를 대체하는 최소 프로모터와 함께 배치된 서열 특이적으로 설계된 DNA 결합 도메인을 생성하는데 사용될 수 있다. TALE DNA 결합 도메인은 또한 약물 이량체화 도메인으로 확장되었다. 후자는 상응하는 이량체화 도메인 및 전사 활성화 도메인을 갖는 또 다른 조작 단백질과 결합할 수 있다(도 1c).
예를 들어, 도 1d를 참조하면, 역 큐메이트 트랜스활성인자(rcTA)는 CDL의 5' 비번역 영역에 삽입됨으로써, 이는 내인성 CDL 프로모터에 의해 발현될 수 있다. 큐메이트 오퍼레이터(6xCuO)의 6회 반복체가 CDL의 번역 시작(ATG) 직전에 삽입될 수 있다. 상기 시스템에 큐메이트가 부재하는 경우, rcTA는 6xCuO와 결합할 수 없고, 따라서, 6xCuO가 활성화되지 않으므로, CDL이 전사되지 않을 것이다. 큐메이트가 부가되는 경우, rcTA와 복합체를 형성함으로써, 6xCuO와의 결합을 가능하게 하고, CDL 전사를 가능하게 한다(문헌[Mullick et al., 2006]).
예를 들어, 도 1e를 참조하면, Vp16(VpEcR)의 활성화 도메인에 융합된 레티노이드 X 수용체(RXR) 및 엑디손 수용체(EcR)의 N-말단 절두가 CDL의 5' 비번역 영역에 삽입됨으로써, 이들이 내인성 CDL 프로모터에 의해 공동 발현될 수 있다. 하류의 최소 프로모터를 갖는 엑디손 반응성 요소(EcRE)는 또한 개시 코돈 바로 상류의 CDL에 삽입될 수 있다. 공동 발현된 RXR 및 VpEcR은 서로 이종이량체화될 수 있다. 엑디손 또는 합성 약물 유사체 무리스테론 A가 부재하는 경우, 이량체화된 RXR/VpEcR은 EcRE와 결합할 수 없으므로, CDL은 전사되지 않는다. 엑디손 또는 무리스테론 A가 존재하는 경우, 이량체화된 RXR/VpEcR은 EcRE에 결합할 수 있음으로써, CDL이 전사된다(문헌[No et al., 1996]).
예를 들어, 도 1f를 참조하면, 일과성 수용체 전위 바닐로이드-1(TRPV1)은 페리틴과 함께 CDL의 5' 비번역 영역에 삽입되어, 내인성 CDL 프로모터에 의해 공동 발현될 수 있다. NFAT에 의한 유도성 프로모터(NFATre)는 개시 코돈의 바로 상류의 CDL에 삽입될 수 있다. 정상 환경에서는, NFAT 프로모터는 활성이 아니다. 그러나, TRPV1 및 페리틴이 저주파 전파에 노출되는 경우, 세포로 유입되는 Ca++ 파(wave)가 생성되고, 이어서, 세포질-NFAT(NFATc)가 핵-NFAT(NFATn)로 전환되며, 궁극적으로는 NFATre이 활성화되고, CDL이 전사될 것이다(문헌[Stanley et al., 2015]).
예를 들어, 도 1g를 참조하면, CDL은 일부분/도메인: 5' CDL 및 3' CDL로 기능적으로 분열될 수 있으며, FKBP 펩티드 서열은 각각의 도메인에 삽입될 수 있다. IRES(내부 리보솜 유입 부위) 서열은 2개의 도메인 사이에 배치됨으로써, CDL 프로모터에 의해 동시에 전사되나, 2개의 별도의 단백질을 생성할 수 있다. 유도인자의 부재 하에, 2개의 별도의 CDL 도메인은 기능적으로 비활성이다. 이량체화제, 예를 들어 라파마이신 또는 AP20187이 도입되는 경우, FKBP 펩티드는 이량체화되고, 5' 및 3' CDL 일부분을 함께 취합하여, 활성 단백질을 재구성한다(문헌[Rollins et al., 2000]).
동물 세포의 분열을 제어하는 방법
일 양태에서, 동물 세포의 분열을 제어하는 방법이 본 명세서에서 제공된다.
상기 방법은 동물 세포를 제공하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 동물 세포는 조류 또는 포유류 세포일 수 있다. 예를 들어, 포유류 세포는, 만능성(예를 들어, 배아 줄기세포 또는 iPS 세포), 다능성, 단능성 전구세포, 또는 최종 분화된 단리된 인간 또는 비인간 세포일 수 있다. 상기 포유류 세포는 만능성, 다능성, 단능성 전구세포 또는 최종 분화된 세포로부터 유래될 수 있다. 상기 포유류 세포는 체세포 줄기세포, 다능성 또는 단능성 전구세포, 다능성 체세포 또는 체세포 줄기세포, 다능성 전구세포 또는 체세포로부터 유래된 세포일 수 있다. 바람직하게는, 상기 동물 세포는 유전적으로 변형되도록 처리될 수 있다. 바람직하게는, 상기 동물 세포는 사용자에 의해 치료적 가치를 갖는 것으로 고려되며, 이는 상기 세포가 질병, 장애, 결함 또는 손상을 치료할 필요가 있는 대상체에서 이를 치료하는데 사용될 수 있음을 의미한다. 다양한 구현예에서, 상기 비인간 포유류 세포는 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그, 고양이, 개, 암소, 말, 사슴, 엘크, 들소, 소, 낙타, 라마, 토끼, 돼지, 염소, 양 또는 비인간 영장류 세포일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 동물 세포는 인간 세포이다.
상기 방법은 동물 세포에서 CDL을 유전적으로 변형시키는 단계를 추가로 포함한다. CDL을 유전적으로 변형시키는 단계는 iNEP, 예를 들어 하나 이상의 ALINK 시스템 또는 ALINK 시스템 및 EARC 시스템 중 하나 이상을 숙주 동물 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 다양한 유전적 변형, 예를 들어 음성 선택 마커 시스템 및 유도성 활성인자 기반 유전자 발현 시스템을 동물 세포에 도입하기 위한 기법은 그의 표적화(즉, 비무작위), 복합 이형접합성 및 동형접합성 도입 기법을 포함하여, 당 업계에 공지되어 있다. EARC 변형의 사용을 포함하는 경우, 상기 변형은, 기능적 CDL 발현이 EARC 변형된 대립유전자를 통해서만 생성될 수 있도록 보장해야 한다. 예를 들어, 하나 이상의 ALINK를 단독으로 또는 하나 이상의 EARC 시스템과 함께 포함하는 DNA 벡터에 의한 CDL 또는 CDL의 표적화된 대체를 숙주 동물 세포의 유전적 변형을 위해, 수행할 수 있다.
상기 방법은 iNEP 시스템을 포함하는 유전적으로 변형된 동물 세포(들)의 분열을 허용하는 단계를 추가로 포함한다.
예를 들어, ALINK 시스템을 포함하는 유전적으로 변형된 동물 세포를 상응하는 ALINK 음성 선택 마커의 유도인자의 부재 하에 유지시킴으로써, ALINK 변형된 세포의 분열을 허용한다. 세포 분열 및 증식은 시험관내 및/또는 생체내에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 유전적으로 변형된 세포는, 치료용으로 충분히 큰 세포 집단이 생성될 때까지, 시험관내에서 증식 및 확장이 허용될 수 있다. 예를 들어, 증식 및 확장된 하나 이상의 유전적으로 변형된 동물 세포(들)는 (예를 들어, 이식에 의해) 숙주 내로 도입될 수 있고, 생체내에서 추가로 증식하도록 허용될 수 있다. 다양한 구현예에서, ALINK 시스템을 포함하는 유전적으로 변형된 동물 세포(들)의 분열의 어블레이션 및/또는 억제는, ALINK 시스템을 포함하는 유전적으로 변형된 동물 세포(들)을 상응하는 음성 선택 마커의 유도인자에 노출시킴으로써, 시험관내 및/또는 생체내에서 수행될 수 있다. 이러한 노출은 증식 세포를 어블레이션하고/하거나, 증식 세포의 적어도 일부를 사멸시킴으로써, 유전적으로 변형된 동물 세포의 증식 속도를 억제할 것이다. 예를 들어, 세포가 시험관내 또는 생체내에서 정상보다 더 빠른 속도로 분열되기 시작함으로써, 종양 형성 및/또는 바람직하지 않은 세포 성장을 유도할 수 있는 경우, 유전적으로 변형된 세포의 어블레이션 및/또는 유전적으로 변형된 동물 세포의 세포 증식의 억제가 바람직할 수 있다.
예를 들어, EARC 시스템을 포함하는 유전적으로 변형된 동물 세포를 유도성 활성인자 기반 유전자 발현 시스템의 유도인자의 존재하에 유지시킴으로써, EARC 변형된 세포의 분열을 허용한다. 세포 분열 및 증식은 시험관내 및/또는 생체내에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 유전적으로 변형된 세포는, 치료용으로 충분히 큰 세포 집단이 생성될 때까지, 시험관내에서 증식 및 확장이 허용될 수 있다. 예를 들어, 증식 및 확장된 하나 이상의 유전적으로 변형된 동물 세포(들)는 (예를 들어, 이식에 의해) 숙주 내로 도입될 수 있고, 생체내에서 추가로 증식하도록 허용될 수 있다. 다양한 구현예에서, EARC 시스템을 포함하는 유전적으로 변형된 동물 세포(들)의 분열의 어블레이션 및/또는 억제는, EARC 시스템을 포함하는 유전적으로 변형된 동물 세포(들)의 유도성 활성인자 기반 유전자 발현 시스템의 유도인자에 대한 노출을 방지 또는 억제함으로써, 시험관내 및/또는 생체내에서 수행될 수 있다. 상기 유도인자의 부재는 증식 세포를 어블레이션하고/하거나, 너무 느려서, 종양 형성에 기여할 수 없도록, 상기 유전적으로 변형된 동물 세포의 증식에 의한 확장을 억제할 것이다. 예를 들어, 세포가 시험관내 또는 생체내에서 정상보다 더 빠른 속도로 분열되기 시작함으로써, 종양 형성 및/또는 바람직하지 않은 세포 성장을 유도할 수 있는 경우, 상기 유전적으로 변형된 동물 세포의 세포 분열의 어블레이션 및/또는 억제가 바람직할 수 있다.
예를 들어, 하기 다양한 실시예에 제시된 본 명세서에서 제공되는 방법의 다양한 구현예에서, 상기 유도인자는 독시사이클린 및 간사이클로비르이다.
일 구현예에서, 독시사이클린은, 예를 들어, 약 1 mg/ml의 Dox를 물에 용해시키고, 성장 배지의 최종 농도가 약 1 μg/ml가 되도록 한 상기 유도인자의 농축액을 세포 성장 배지에 부가함으로써, 시험관내에서 세포로 전달될 수 있다. 생체내에서, 독시사이클린은, 예를 들어, 주사(예를 들어, 약 50 mg/kg의 투여량으로 IV 또는 IP) 또는 정제(약 1 내지 4 mg/kg의 투여량)에 의해, 음용수(예를 들어, 약 5 내지 10 mg/kg의 투여량) 또는 먹는 음식(예를 들어, 약 100 mg/kg의 투여량)을 통해 대상체에 경구 투여될 수 있다.
일 양태에서, 간사이클로비르는, 예를 들어, 약 10 mg/ml의 GCV를 물에 용해시키고, 성장 배지의 최종 농도가 약 0.25 내지 25 μg/ml가 되도록 한 상기 유도인자의 농축액을 세포 성장 배지에 부가함으로써, 시험관내에서 세포로 전달될 수 있다. 생체내에서, GCV는, 예를 들어, 주사(예를 들어, 약 IV 또는 IP 50 mg/kg의 투여량) 또는 정제(약 4 내지 20 mg/kg의 투여량)에 의해, 음용수(예를 들어, 약 4 내지 20 mg/kg의 투여량) 또는 먹는 음식(예를 들어, 약 4 내지 20 mg/kg의 투여량)을 통해 대상체에 경구 투여될 수 있다.
일 구현예에서, 시험관내에서 상기 유도인자가 작용하는지를 평가하기 위해, 예를 들어, 처리 개시 후, 24시간마다 (예를 들어, 세포 계수 및 생존율 검정에 의해) 세포 성장 및 세포 사멸을 측정할 수 있다. 생체내에서 상기 유도인자가 작용하는지를 평가하기 위해, 예를 들어, 처리 개시 후, 1 내지 2일마다, 유전적 변형된 만능성 세포로부터 생성된 기형종의 크기를 측정할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 방법의 특히 바람직한 구현예에서, 상기 동물 세포는 ALINK 및 EARC 시스템 둘 모두를 포함하도록 유전적으로 변형될 수 있다. ALINK 및 EARC 시스템은 동일하거나 상이한 CDL을 표적화할 수 있다. 이러한 세포는, 예를 들어, 세포 분열의 어블레이션 및/또는 억제, 및/또는 증식 세포의 적어도 일부의 사멸에 의한 증식의 어블레이션 및/또는 억제를 위한 적어도 2개의 메커니즘을 사용자에 제공하므로, 특정 용도를 위해 바람직할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 방법이 조류 세포, 예를 들어 닭 세포의 분열 및/또는 증식을 제어하는데 사용될 수 있다는 것이 본 명세서에서 고려된다.
세포 분열을 제어하기 위한 적어도 하나의 메커니즘을 포함하도록 조작된 세포
일 양태에서, 세포 분열 및/또는 증식을 제어하기 위한 적어도 하나의 메커니즘 및 이의 집단을 포함하도록 유전적으로 변형된 동물 세포가 본 명세서에서 제공된다. 예를 들어, 포유류 세포는, 만능성(예를 들어, 배아 줄기세포 또는 iPS 세포), 다능성, 단능성 전구세포, 또는 최종 분화된 단리된 인간 또는 비인간 세포일 수 있다. 상기 포유류 세포는 만능성, 다능성, 단능성 전구세포 또는 최종 분화된 세포로부터 유래될 수 있다. 상기 포유류 세포는 체세포 줄기세포, 다능성, 단능성 전구세포, 전구세포 또는 체세포 또는, 체세포 줄기세포, 다능성 또는 단능성 전구세포 또는 체세포로부터 유래된 세포일 수 있다. 바람직하게는, 상기 동물 세포는 유전적으로 변형되도록 처리될 수 있다. 바람직하게는, 상기 동물 세포는 사용자에 의해 치료적 가치를 갖는 것으로 고려되며, 이는 상기 세포가 질병, 장애, 결함 또는 손상을 치료할 필요가 있는 대상체에서 이를 치료하는데 사용될 수 있음을 의미한다. 일부 구현예에서, 상기 비인간 포유류 세포는 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그, 고양이, 개, 암소, 말, 사슴, 엘크, 들소, 소, 낙타, 라마, 토끼, 돼지, 염소, 양 또는 비인간 영장류 세포일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 유전적으로 변형된 세포는 하나 이상의 CDL의 하나 이상의 유전적 변형을 포함한다. ALINK 시스템인 하나의 CDL의 유전적 변형 및 복수의 CDL의 경우, ALINK 시스템 및 EARC 시스템 중 하나 이상, 예를 들어 ALINK 및/또는 EARC 시스템 중 하나 이상인 복수의 CDL의 유전적 변형이 본 명세서에 기재된다. 예를 들어, 본 명세서에서 제공되는 유전적으로 변형된 동물 세포는: 하나 이상의 CDL의 ALINK 시스템; 하나 이상의 CDL의 EARC 시스템; 또는 하나 이상의 CDL의 ALINK 및 EARC 시스템을 포함할 수 있으며, ALINK 및 EARC 시스템은 동일하거나 상이한 CDL에 상응한다. 상기 유전적으로 변형된 세포는 동형접합성, 이형접합성, 반접합성 또는 복합 이형접합성 ALINK 유전적 변형을 포함할 수 있다. EARC 변형의 경우, 상기 변형은, 기능적 CDL 발현이 EARC 변형된 대립유전자를 통해서만 생성될 수 있도록 보장해야 한다.
본 명세서에서 제공되는 유전적으로 변형된 세포는 질병, 장애 또는 손상의 치료와 관련된 세포 치료법 및/또는, 화합물 및/또는 조성물(예를 들어, 천연 또는 조작된 생물학적 제제)의 제어된 세포 전달을 포함하는 세포 치료법에 유용할 수 있다는 것이 고려된다. 전술된 바와 같이, 환자 안전성은 특히 치료용 세포 이식편에서 발생하는 악성 성장 가능성과 관련된, 세포 치료법에서의 관심사이다. 치료용 세포 이식편의 집중적인 증식이 요구되지 않는 세포 기반 치료법에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 iNEP 변형을 포함하는 유전적으로 변형된 세포는 치료 및 안전성 요구를 처리하기에 적합할 것으로 고려된다. 치료용 세포 이식편의 집중적인 증식이 요구되는 세포 기반 치료법에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 2개 이상의 iNEP 변형을 포함하는 유전적 변형된 세포가 치료 및 안전성 요구를 처리하기에 적합할 것으로 고려된다.
본 명세서에서는 조류 세포, 예를 들어 닭 세포가 제공될 수 있으며, 상기 조류 세포는 상기 유전적 변형을 포함하는 것으로 고려된다.
CDL을 표적화하기 위한 분자 도구
일 양태에서, CDL의 발현을 변형시키기 위한 다양한 DNA 벡터가 본 명세서에서 제공된다.
일 구현예에서, 상기 DNA 벡터는 ALINK 시스템을 포함하고, ALINK 시스템은 음성 선택 마커를 인코딩하는 DNA 서열을 포함한다. 상기 음성 선택 마커의 발현은 CDL의 발현과 연결된다.
일 구현예에서, 상기 DNA 벡터는 EARC 시스템을 포함하고, EARC 시스템은 CDL에 작동 가능하게 연결된 유도성 활성인자 기반 유전자 발현 시스템을 포함하며, CDL의 발현은 상기 유도성 활성인자 기반 유전자 발현 시스템의 유도인자에 의해 유도될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 DNA 벡터는 본 명세서에 기재된 바와 같은 ALINK 시스템 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 EARC 시스템을 포함한다. 이러한 카세트가 숙주 세포 내로 삽입되는 경우, CDL 전사 산물의 발현은 ALINK 시스템의 음성 선택 마커의 유도인자에 의해 방지 및/또는 억제될 수 있고, CDL의 발현은 EARC 시스템의 유도성 활성인자 기반 유전자 발현 시스템의 유도인자에 의해 유도될 수 있다.
다양한 구현예에서, DNA 벡터 내의 CDL은 표 2에 나열된 CDL이다.
다양한 구현예에서, DNA 벡터 내의 ALINK 시스템은 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제/간사이클로비르 시스템, 시토신 데아미나제/5-플루오로시토신 시스템, 카르복실 에스테라제/이리노테칸 시스템 또는 iCasp9/AP1903 시스템이다.
다양한 구현예에서, DNA 벡터 내의 EARC 시스템은 dox 가교 시스템, 큐메이트 스위치 유도성 시스템, 엑디손 유도성 시스템, 전파 유도성 시스템 또는 리간드 가역성 이량체화 시스템이다.
키트
본 개시는 본 명세서에 개시된 방법을 수행하기 위한 키트를 고려한다. 이러한 키트는 전형적으로 세포 증식을 제어하기 위해 CDL들 및/또는 CDL들을 사용하기 위해 요구되는 2개 이상의 구성요소를 포함한다. 키트의 구성요소에는 화합물, 시약, 용기, 장비 및 키트 사용 지침서 중 하나 이상이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법은 본 명세서에서 제공되는 사전 포장된 키트를 사용함으로써, 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 키트는 하나 이상의 DNA 벡터 및 지침서를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 지침서는 하나 이상의 DNA 벡터를 숙주 세포로 도입하기 위한 하나 이상의 프로토콜을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 하나 이상의 제어를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같이, CDL의 발현을 변형시키기 위한 하나 이상의 DNA 벡터를 포함한다. 예로서, 상기 키트는 ALINK 시스템을 포함하는 DNA 벡터; 및/또는 EARC 시스템을 포함하는 DNA 벡터; 및/또는 ALINK 시스템 및 EARC 시스템을 포함하는 DNA 벡터; 및 하나 이상의 DNA 벡터를 사용함으로써, 동물 세포에서 하나의 CDL 및/또는 CDL의 표적화된 대체를 위한 지침서를 함유할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 키트는 상기 키트의 DNA 벡터(들)에 제공되는 ALINK 및/또는 EARC 시스템에 상응하는 하나 이상의 유도인자(예를 들어, 약물 유도인자)를 추가로 포함할 수 있다.
본 개시의 실례가 되는 하기의 비제한 실시예가 제공된다.
실시예 1: ALINK 변형된 세포(마우스 및 인간)의 생성
실시예 1에서, Cdk1/CDK1을 표적화하는 ALINK(HSV-TK) 벡터의 작제 및 증식 세포의 적어도 일부를 사멸시키는 방식에 의해, 마우스 및 인간 ES 세포에서 세포 증식을 제어하기 위한 그의 용도가 기재된다. 이 실시예에서, CDL은 Cdk1/CDK1이고, 음성 선택 마커는 HSV-TK이다.
Cdk1/CDK1은 모든 유사분열 활성(즉, 분열) 세포에서 발현된다. CDK1 좌위와 HSV-TK 사이에 동형접합성 ALINK를 포함하도록 변형된 세포에서, 모든 유사분열 활성 세포는 CDK1 및 HSV-TK를 발현한다. 따라서, ALINK 변형된 유사분열 활성 세포는 GCV(HSV-TK의 전구약물)의 처리에 의해 제거될 수 있다. 모든 기능적 CDK1 발현 대립유전자가 ALINK 변형되고, 세포에서 HSV-TK 발현이 사일런싱(silencing)된 경우, 이어서, CDK1 발현 가능성이 또한 사일런싱되고, 세포는 더 이상 분열할 수 없게 된다. 휴지기(quiescence)(즉, 비분열) 세포는 Cdk1/CDK1을 발현하지 않는다. 따라서, ALINK 변형된 휴지기 세포는 Cdk1/CDK1-HSV-TK 연결을 발현하지 않을 것이다.
실시예 1에서, Cdk1/CDK1과 HSV-TK 사이의 전사 연결은 상동성 재조합 기반 녹인에 의해 달성하였다.
방법
표적 벡터의 생성
마우스 표적 벡터 I: 마우스 Cdk1 게놈 좌위가 도 2의 A에 도시되어 있다. 도 2의 B를 참조하면, 2개의 DNA 단편: 5TK(SEQ ID NO: 1) 및 3TK(SEQ ID NO: 2)(SalI-F2A-5'TK.007-PB 5'LTR-NotI-SacII 및 SalI-SacII-3'TK.007-PB 3'LTR-3'TK.007-T2A-XhoI-mCherry-NheI)를 pUC57 벡터(GenScript)에서 유전자 합성에 의해 획득하였다. 단편 5TK를 SalI+SacII에 의해 분해하고, 동일한 분해에 의해 3TK로 클로닝함으로써, pUC57-5TK-3TK를 생성시켰다. NotI+HindⅢ에 의해 플라스미드 pBluescript-M214(SEQ ID NO: 3)를 절단함으로써, PGK-네오마이신 카세트를 획득하고, pUC57-5TK-3TK의 NotI+SacII 부위에 결찰시킴으로써, Cdk1(즉, CDL)의 3' 말단에 삽입되는 ALINK 카세트를 생성시켰다.
CDL의 3' 말단에서의 삽입 ALINK를 위한 상동성 아암: Cdk1 DNA 코딩 서열을: The Center for Applied Genomics(TCAG)에서 구입한 Cdk1의 게놈 서열(SEQ ID NO: 4)과 박테리아 인공 염색체(BAC)를 함유하는 DH10B E. 콜라이(E. coli) 세포 균주를 재조합조작(recombineering)함으로써 클로닝하였다. 재조합조작 과정은 플라스미드 pSC101-BAD-γβα Red/ET(pRET)(GeneBridges, Heidelberg Germany)에 의해 매개되었다. pRET는 1.8 kV, 25 μF, 400Ohms(BioRad GenePulserI/II 시스템, BioRad, ON, CA)에서 BAC- 함유 DH10B E. 콜라이에 우선 전기천공한 다음, 콜로람페니콜 및 테트라사이클린 저항성에 대해 선택하였다. ALINK 삽입 지점(Cdk1 종결 코돈의 5' 및 3')에 걸쳐있는 짧은 상동성 아암(50bp)(각각 SEQ ID NO: 5 및 6)을 PCR에 의해 카세트 F2A-5'TK-PB-PGKneo-PB-3'TK-T2A-cherry에 부가하였다. 이어서, 이 PCR 산물을 상기 기재된 조건하에 Bac+pRET DH10B E. 콜라이에 전기천공한 후, 카나마이신 저항성에 대해 선택하였다. 755bp 및 842 염기 쌍(bp) 상동성 아암(각각 SEQ ID NO: 7 및 8)으로 이루어진 최종 표적화 카세트를 프라이머(각각 SEQ ID NO: 9 및 10)에 의한 PCR에 의해 회수하고, pGemT-Easy 벡터에 클로닝함으로써, 마우스 표적 벡터 I를 생성시켰다. 상기 벡터의 주요 접합 영역을 TCAG에서 서열분석하고, 확인하였다.
마우스 표적 벡터 II: 도 2의 D를 참조하면, F2A-loxP-PGK-neo-pA-loxP-AscI(SEQ ID NO: 11)를 pLoxPNeo1 벡터로부터 PCR 증폭시키고, TA를 pDrive 벡터(Qiagen)에 클로닝하였다. AscI-TK-T2A-mCherry-EcoRI(SEQ ID NO: 12)를 절개된 TC 대립유전자 I로부터 PCR 증폭시키고, TA를 pDrive 벡터에 클로닝하였다. 이어서, 후자의 단편을 BamHI+AscI 제한 부위에 의해 전자의 벡터에 클로닝하였다. 이 F2A-loxP-PGK-neo-pA-loxP-TK-T2A-mCherry 카세트를 GeneArt® Seamless Cloning and Assembly Kit(Life Technologies)에 의해 마우스 Cdk1 상동성 아암 사이에 삽입하였다. 퓨로마이신(puro) 버전 벡터를 생성하기 위해, PGN-puro-pA 단편(SEQ ID NO: 13)을 BamHI+NotI에 의해 pNewDockZ로부터 절단하고, T4로 평활화하였다. neo 버전 벡터를 AscI+ClaI에 의해 절단하고, T4로 평활화하였으며, PGK-puro-pA에 의해 결찰시켰다.
인간 표적 벡터 I: 마우스 표적 벡터 I과 유사하게, 인간 CDK1 종결 코돈(SEQ ID NO: 14)의 상류의 847 bp + F2A-5'TK-PB-PGKneo-PB-3'TK-T2A-cherry(SEQ ID NO: 15) + 인간 CDK1 종결 코돈(SEQ ID NO: 16)의 하류의 831 bp를 재조합조작 기법에 의해 생성시켰다. 동종접합성 표적화의 원샷(one-shot) 생성을 용이하게 하기 위해, 선택을 위해 퓨로마이신 저항성 카세트를 함유하는 상이한 버전의 벡터를 생성하고: AgeI-PGK-puro-pA-FseI(SEQ ID NO: 17)를 pNewDockZ 벡터로부터 증폭시키고, 분해하여, AgeI+FseI에 의해 절단된 neo 버전 벡터로 클로닝하였다.
인간 표적화 벡터 II: BamHI-F2A-loxP-PGK-neo-pA-loxP-TK-T2A-mCherry(SEQ ID NO: 18) 및 BamHI-F2A-loxP-PGK-puro-pA-loxP-TK-T2A-mCherry(SEQ ID NO: 19)를 상응하는 마우스 표적 벡터 II로부터 증폭시키고, BamHI+SgrAI에 의해 분해하였다. mCherry(3' 30bp)-hCDK13'HA-pGemEasy-hCDK15'HA-BamHI(SEQ ID NO: 20)를 PCR 증폭시키고, 또한 BamHI+SgrAI로 분해하였다. 인간 표적 벡터 II의 neo 및 퓨로마이신 버전을 상기 상동성 아암 골격 및 neo 또는 퓨로마이신 버전 ALINK 카세트의 결찰에 의해 생성시켰다.
인간 표적 벡터 Ⅲ: FACS에 의한 형광 표지(mCherry 또는 eGFP)로 표적화하고, 선택 카세트의 절개 단계를 피하기 위해, 선택 카세트가 없는 표적 벡터를 제조하였다. BamHI-F2A-TK-T2A-mCherry-SgrAI(SEQ ID NO: 58)를 절개된 TC 대립유전자 I로부터 PCR 증폭시키고, BamHI+SgrAI에 의해 분해하고, 분해된 mCherry(3' 30bp)-hCDK13'HA-pGemEasy-hCDK15'HA-BamHI(SEQ ID NO: 20)에 의해 결찰시켰다. 표적 벡터의 CRISPR PAM 부위를 부위 유도 PCR 기반 돌연변이유발 프로토콜을 사용함으로써, 프라이머 PAM_fwd(SEQ ID NO: 59) 및 PAM_rev(SEQ ID NO: 60)에 의해, 돌연변이유발시켰다. NEBuiler HiFi DNA 어셈블리 클로닝 키트(New England Biolabs Inc.)에 의해, GFP 버전 벡터를 PCR 증폭된 XhoI-GFP(SEQ ID NO: 61) 및 pGemT-hCdk1-TK-PAMmut(SEQ ID NO: 62)의 융합에 의해 생성시켰다.
CRISPR / Cas9 플라스미드의 생성
고효율 표적화를 달성하기 위해, CRISPR/Cas9-지원 유전자 표적화를 사용 하였다(문헌[Cong et al., 2013]). CRISPR/Cas9의 안내 서열을 온라인 CRISPR 설계 도구(http://crispr.mit.edu)를 사용함으로써, 분석하였다(문헌[Hsu et al., 2013]).
SEQ ID NO: 23의 마우스 Cdk1을 표적화하기 위해, CRISPR/Cas9 플라스미드 pX335-mCdkTK-A(SEQ ID NO: 21) 및 pX335-mCdkTK-B(SEQ ID NO: 22)를 설계하였다.
SEQ ID NO: 26의 인간 Cdk1을 표적화하기 위해, CRISPR/Cas9 플라스미드 pX330-hCdkTK-A(SEQ ID NO: 24) 및 pX459-hCdkTK-A(SEQ ID NO: 25)를 설계하였다.
제안된 프로토콜에 따라 Addgene으로부터 구입한 골격 플라스미드에 의해 CRISPR을 생성시켰다(문헌[Ran et al., 2013]).
ALINK 변형된 마우스 ES 세포의 생성
마우스 ES 세포 배양: 마우스 ES 세포를 15% 소 태아 혈청(Invitrogen), 1 mM 피루브산나트륨(Invitrogen), 0.1 mM MEM 비필수 아미노산(Invitrogen), 2 mM GlutaMAX(Invitrogen), 0.1 mM 2-mEARCaptoethanol(Sigma), 50 U/ml 각 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen) 및 1000 U/ml 백혈병 억제 인자(LIF)(Chemicon)로 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)(고 글루코오스, 4500 mg/l)(Invitrogen)에서 배양하였다. 마우스 ES 세포를 0.25% 트립신 및 0.1% EDTA에 의해 통과시킨다.
표적화: 5x105 마우스 C57BL/6 C2 ES 세포(문헌[Gertsenstein et al., 2010])를 JetPrime 형질감염(Polyplus)에 의해 2 ug DNA(표적 벡터:0.5 μg, CRISPR 벡터: 1.5 μg)로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, 세포를 G418 또는/및 퓨로마이신 저항성에 대해 선택하였다. 저항성 클론을 독립적으로 채취하여, 96-웰 플레이트로 이동시켰다. 96-웰 플레이트를 동결 및 유전자형 분석(SEQ ID NO: 27, 28, 29 및 30)을 위해 복제하였다. PCR 양성 클론을 확장시키고, 다수의 바이알에 동결시키고, 서던 블롯팅에 의해 유전자형을 분석하였다.
선택 카세트의 절개: 올바르게 표적화된 ES 클론을 Episomal-hyPBase(표적 벡터 I)(SEQ ID NO: 34) 또는 pCAGGs-NLS-Cre-Ires-퓨로마이신(표적 벡터 II)(SEQ ID NO: 35)에 의해 형질감염시켰다. 형질감염 2 내지 3일 후에, 세포를 트립신 처리하고, 클론(10 cm 플레이트당 1000 내지 2000개의 세포)으로 플레이팅하였다. mCherry 양성 클론을 채취하여, 96-웰 플레이트에 독립적으로 운반하고, PCR(SEQ ID NO: 31 및 36) 및 서던 블롯에 의해 유전자형을 분석함으로써, 절개 상황을 확인하였다. 제거 영역의 접합부를 PCR 증폭시키고, 서열분석하고, 구조 이동(frame shift) 없이, 온전하고 이음부(seam)가 없는지를 확인하였다.
동형접합성 표적화: 이미 neo 버전 표적 벡터로 올바르게 표적화되고, 선택 카세트로 절개된 ES 클론을 표적 벡터의 퓨로마이신 저항성 버전으로 다시 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, 퓨로마이신의 선택을 부가한 후, 상기에 기재된 바와 같이 콜로니를 채취하여, 분석하였다(SEQ ID NO: 31 및 32). 독립적인 puro 저항성 클론을 젤라틴 상에서 성장시킨 후, PCR을 위해 DNA를 추출하여, 야생형 대립유전자 밴드가 없음을 확인하였다(SEQ ID NO: 31, 33).
ALINK 변형된 인간 ES 세포의 생성
인간 ES 세포 배양: 인간 CA1 또는 H1(문헌[Adewumi et al., 2007]) ES 세포를 Geltrex(Life Technologies) 배양보조세포 무함유(feeder-free) 조건하에서, mTeSR1 배지(STEMCELL Technologies) + 페니실린-스트렙토마이신(Life Technologies의 Gibco)으로 배양하였다. 세포를 TryplE Express(Life Technologies) 또는 Accutase(STEMCELL Technologies)에 의해 통과시키고, 처음 24시간 동안 mTeSR 배지 + ROCK 억제제(STEMCELL Technologies)에 플레이팅한 후, mTeSR 배지로 교체하였다. 완전한 컨플루언스(confluence)의 6-웰 플레이트의 절반의 세포를 1ml 90% FBS(Life Technologies) + 10% DMSO(Sigma)에서 동결시켰다.
표적화: 6x106 CA1 hES 세포를 24 ug DNA(표적 벡터: pX330-hCdkTK-A=18 ug:6 ug)으로 Neon 프로토콜 14에 의해 형질감염시켰다. 형질감염 후, 세포를 4개의 10 cm 플레이트에 플레이팅하였다. G418 및/또는 퓨로마이신 선택을 형질감염 48시간 후에 시작하였다. 독립적인 콜로니를 채취하여, 96-웰 플레이트로 옮겼다. 각 플레이트를 추가의 성장 및 유전자형 분석(SEQ ID NO: 37, 38, 39 및 40)을 위해 복제하였다. PCR 양성 클론을 확장시키고, 다수의 바이알에 동결시키고, 서던 블롯팅에 의해 유전자형을 분석하였다.
선택 카세트의 절개: ALINK 표적화된 ES 클론을 hyPBase 또는 pCAGGs-NLS-Cre-IRES-퓨로마이신으로 형질감염시키고, 6-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 세포가 6-웰 플레이트에서 컨플루언스에 도달한 경우, 세포를 항크스 평형 염류 용액(Hanks Balanced Salt Solution)(HBSS)(Ca2+/ Mg2+ 무함유)(25 mM HEPES pH7.0, 1% 소 태아 혈청)에 현탁시키고, mCherry 양성 세포를 ASTRIOS EQ 세포 분류기(Beckman Coulter)를 사용하여, 96-웰 플레이트에 분류하였다.
동형접합성 표적화: 마우스 시스템에서와 동일한 방식에 의해, 또는 mCherry 및 eGFP 인간 표적 벡터 Ⅲ + pX330-hCdkTK-A 또는 pX459-hCdkTK-A를 형질감염시킨 후, mCherry 및 eGFP 이중 양성 세포에 대한 FACS 분류에 의해, 동형접합성 표적화를 달성할 수 있다.
기형종 검정
Matrigel Matrix High Concentration(Corning)을 얼음 상에서 저온의 DMEM 배지에 의해 1:3으로 희석하였다. 5x106 내지 10x106 세포를 100 ul의 66% DMEM + 33% Matrigel 배지에 현탁시키고, B6N 마우스(마우스 C2 ES 세포) 및 NOD-SCID 마우스(인간 ES 세포) 중 어느 하나 또는 둘 모두의 등쪽 측복부에 피하 주사하였다. 주사 후 2 내지 4주 후에 기형종이 형성되었다. 기형종 크기를 캘리퍼(caliper)로 측정하고, 기형종 체적을 V=(LxWxH)π/6을 사용하여 계산하였다. 상이한 처리 기간으로 50 mg/kg을 복강 내로 매일 주사하여, GCV/PBS 처리를 수행하였다. 처리 종료시, 마우스를 희생시키고, 조직학 분석을 위해 종양을 해부하고, 4% 파라포름알데하이드로 고정시켰다.
유선 종양 검정
Cdk1+/+, +/ loxp - alink 마우스 C2 ES 및 CD-1 배경의 키메라를 배수체 응집을 통해 생성한 후, B6N WT 마우스와 교배시켜, 생식선 전달(germline transmission)을 통해 Cdk1+/+, +/ loxp - alink 마우스를 생성시켰다. Cdk1+/+, +/ loxp - alink 마우스를 EIIa-Cre 마우스와 교배시켜, Cdk1+/+, +/ alink 마우스를 생성시켰다. 이어서, Cdk1+/+, +/ alink 마우스를 MMTV-PyMT 마우스(문헌[Guy et al., 1992])와 교배시켜, 유선 종양 및 ALINK 변형을 가진 이중 양성 자손을 획득하였다. 페일 세이프 변형을 가진 유선 종양을 분리하고, 1 mm3 조각으로 절단하고, 야생형 B6N 암컷의 제4 유선에 이식하였다. GCV/PBS 치료를 상이한 처리 기간으로 50 mg/kg의 투여량에서 복강 내로 격일로 주사하였다. 유선 종양 크기를 캘리퍼로 측정하고, 식 V=길이*너비*높이*π/6으로 계산하였다.
신경 전구세포 대 뉴런 사멸 검정
Cdk1+/+, +/ alink 인간 CA1 ES 세포를 신경 상피 전구세포(NEP)로 분화시켰다. 후속하여, NEP를 뉴런으로의 분화를 위한 조건하에서 배양함으로써, DAPI, Ki67 및 Sox2의 면역염색을 특징으로 하는 비분열 뉴런과 분열 NEP의 혼합 배양물을 생성시켰다. GCV(10uM)를 20일 동안 격일로 상기 혼합 배양물에 제공하였다. 그런 다음, GCV를 4일 동안 배양물로부터 회수한 후, 세포를 4% PFA로 고정시켰다. 모든 잔여 세포의 세포 주기 이탈 여부를 조사하기 위해, 고정된 세포를 증식 마커 Ki67로 면역염색하고, 성숙 뉴런 마커 베타-튜블린Ⅲ로 면역염색하였다.
결과
마우스 Cdk1 게놈 좌위가 도 2의 A에 도시되어 있다. T2A(문헌[Szymczak et al., 2004]) 서열을 갖는 mCherry 리포터와 연결된 증대된 HSV -TK(TK.007(Preuß et al., 2010)) 유전자에 선행하는 F2A(문헌[Szymczak et al., 2004]) 서열에 의해 마지막 엑손의 종결 코돈을 대체함으로써, 각각 Cdk1 유전자(도 2의 A)의 3'UTR이 변형되도록 구성된 쥣과동물 Cdk1을 표적화하는 2개의 벡터를 생성시켰다(도 2의 B 및 도 2의 D).
도 2의 B 및 마우스 표적 벡터 I를 참조하면, PGK-neo-pA 선택 마커(표적화에 필요함)를 piggyBac 전이인자(transposon)에 의해 TK.007 개방형 판독 프레임 내로 삽입함으로써, TK 발현을 저지시켰다. piggyBac 전이인자 삽입은 전이인자 제거가 TK.007의 정상 ORF를 복원함으로써, 기능적 티미딘 키나제의 발현이 유도되도록 설계하였다(도 2의 C).
도 2의 D 및 마우스 표적 벡터 II를 참조하면, neo 카세트는 loxP-플랭킹되며, F2A와 TK.007 사이에 삽입하였다.
표적 벡터 I 및 II는 짧은(약 800 bp) 상동성 아암을 가졌으며, 이는, CRISPR이 상동성 재조합 표적화를 지원하고, 표적화 상황을 확인하기 위한 PCR 유전자형 분석을 쉽고 신뢰할 수 있도록 하기에 충분한 것이었다. CRISPR은 약물 저항성 클론의 40% PCR 양성으로 고빈도 표적화를 용이하게 하였다(도 3d).
piggyBac-삽입된 neo 카세트 및 loxP-플랭킹된 neo 카세트 둘 모두를 각각 piggyBac 전이효소 및 Cre 재조합효소의 일과성 발현에 의해 제거함으로써, 각각 도 2의 C 및 도 2의 E에 도시된 대립유전자를 포함하는 세포주를 생성시켰다. 도 2의 E를 참조하면, 나머지 loxP 부위는 TK와 프레임 내에 존재하고, TK의 N-말단에 13개의 아미노산이 부가되어 있다. TK 기능성 시험(GCV 사멸)은, 이 N-말단 삽입이 TK 기능을 방해하지 않는다는 것을 증명하였다.
도 4를 참조하면, CRISPR-Cas9 기법의 지원하에, 동형접합성 ALINK는 또한 2개의 상이한 인간 ES 세포주인 CA1 및 H1(문헌[Adewumi et al., 2007])에서 효율적으로 생성될 수 있다.
도 5a 및 도 5c를 참조하면, 데이터는 다음을 나타낸다: i) Cdk1의 3'UTR로의 TK.007 삽입은 Cdk1 발현을 방해하지 않으며; ii) ALINK 변형된 동형접합성 마우스 C2 ES 세포는 ES 세포 조건하에서 적절하게 자체 재생되고, 생체내에서 분화되고, 복합 기형종을 형성하고; iii) ALINK 변형된 동형접합성 인간 CA1 ES 세포는 ES 세포 조건하에서 적절하게 자체 재생되고, 생체내에서 분화되고, 복합 기형종을 형성한다.
도 6을 참조하면, 데이터는 다음을 나타낸다: i) TK.007이 적절하게 발현되며; 미분화된 ES 세포의 GCV 처리는 동형접합성 및 이형접합성 변형된 세포 둘 모두를 어블레이션하고(도 6a); 그리고, ii) T2A-연결된 mCherry는 ES 세포에서 지속적으로 발현된다(도 6b).
도 7a를 참조하면, 데이터는, ALINK 변형된 세포 이식편을 포함하는 숙주에서, ALINK 변형된 ES 세포를 포함하는 피하 기형종의 GCV 처리는 분열 세포를 어블레이션함으로써, 기형종의 성장을 중지시킨다는 것을 나타낸다. GCV 처리는 기형종의 휴지기 세포에는 영향을 주지 않았다. 수용체의 단기간(3주)의 GCV 처리 기간은 기형종을 휴면기(dormant)가 되도록 하는데 충분하였다. 도 7b를 참조하면, ALINK 변형된 인간 세포 이식편을 포함하는 NOD scid 감마 마우스 숙주에서, 2회의 GCV 처리(제1 회 15일 + 제2 회 40일)는 기형종을 휴면기가 되도록 하였다.
도 7c를 참조하면, ALINK 변형된 MMTV-PyMT-형질전환된 유방 상피 종양 형성 세포 이식편을 포함하는 B6N 숙주에서, GCV 처리는 유선 종양을 휴면기가 되도록 할 수 있다.
도 7def의 D 내지 도 7def의 F를 참조하면, 모든 세포가 Cdk1+/+, +/ alink 인간 CA1 ES 세포로부터 유래된, 비분열 뉴런과 분열 NEP의 혼합 배양물에서, GCV는 분열 NEP를 사멸시켰으나, 비분열 뉴런은 사멸시키지 않았다.
일 구현예에서, 불활성화 돌연변이가 CDL-HSV-TK 전사 연결의 HSV-TK 구성요소에서 발생된 경우, 하나 이상의 분열 세포가 GCV 매개된 어블레이션을 회피할 수 있다고 고려된다. 세포 회피의 가능성을 처리하기 위해, 본 발명자는 세포 분열당 대체적인 돌연변이율(즉, 10-6)을 고려하여, 1개의 돌연변이 세포를 생성하는데 필요한 것으로 추정되는 세포 분열 횟수는 이형접합성 Cdk1 HSV-TK 전사 연결을 포함하는 세포의 경우, 16회, 동형접합성 Cdk1 HSV-TK 전사 연결을 포함하는 세포의 경우, 30회의 세포 분열인 것으로 결정하였다. 이는, 하나의 이형접합성 ALINK 변형된 세포가 216개(즉, 65,000개의 세포)로 확장되고, 단일 동형접합성 ALINK 변형된 세포가 230개(즉, 10억 개의 세포)로 확장되는 경우, 그 후, 이형접합성 및 동형접합성 세포 집단당 상실된 HSV-TK 활성을 포함하는 평균 하나의 돌연변이 세포가 생성될 것이라는 것을 의미한다(도 8). 따라서, 본 발명자들은, 동형접합성 ALINK 변형된 세포가 세포 기반 치료법용으로 매우 안전할 것이라고 결정하였다. 세포 치료법의 안전성 수준을 계산하는 또 다른 방법은 상기에 제시되어 있다.
실시예 2: Cdk1 좌위에서의 EARC 변형된 마우스 ES 세포의 생성
실시예 2에, Cdk1을 표적화하는 EARC(dox 가교) 벡터의 작제 및 마우스 ES 세포에서 세포 분열을 제어하기 위한 그의 용도가 기재되어 있다. 이 실시예에서, dox 가교가 삽입되고, 독시사이클린이 CDL의 발현을 유도하는 유도성 유전자 발현 시스템으로 표적화되는 CDL은 Cdk1/CDK1이다.
상기에 기재된 바와 같이, Cdk1/CDK1은 모든 유사분열 활성(즉, 분열) 세포에서 발현된다. Cdk1 좌위에 EARC(dox 가교) 삽입을 포함하도록 변형된 세포에서, 세포 분열은, Cdk1의 발현을 허용하는 유도인자(독시사이클린)의 존재하에서만 가능하다. 따라서, EARC 변형된 유사분열 활성 세포의 세포 분열은 독시사이클린의 부재 시에 제거될 수 있다.
실시예 2에서, Cdk1 유전자의 5'UTR로의 dox 가교 삽입은 상동성 재조합 녹인 기법에 의해 달성하였다.
방법
dox 가교를 포함하는 EARC 표적화 벡터의 작제
3x SV40 pA 신호에 선행하는 rTTA 코딩 서열(SEQ ID NO: 41)을 함유하는 단편을 rTTA의 5'에 부가된 lox71 부위를 함유하는 프라이머(rtta3xpaFrw1(SEQ ID NO: 63), rtta3xpaRev1(SEQ ID NO: 64))를 사용하여, PCR에 의해 pPB-CAGG-rtta 플라스미드로부터 증폭시켰다. 이 단편을 pGemT 플라스미드에 서브클로닝함으로써, pGem-가교-단계1을 생성시켰다. 후속하여, TetO 프로모터(SEQ ID NO: 42)(pPB-TetO-IRES-mCherry로부터 유래됨)를 함유하는 SacII 단편을 pGem-가교-단계1의 SacII 부위에 클로닝함으로써, pGem-가교-단계2를 생성시켰다. 상기 가교의 최종 요소를 pGem-가교-단계2의 BamHI 부위에 BamHI IRES-퓨로마이신 단편(SEQ ID NO: 43)을 삽입하여 클로닝함으로써, pGem-가교-단계3을 생성시켰다. C57/B6 게놈 DNA로부터 900 bp 단편(SEQ ID NO: 44)을 PCR 증폭시키고(프라이머 cdk5FrwPst(SEQ ID NO: 45) 및 cdk5RevSpe(SEQ ID NO: 46)), 이를 pGem-가교-단계3의 SbfI 및 SpeI에 클로닝함으로써, 5' 상동성 아암을 클로닝하였다. 유사하게, 프라이머 dkex3_5'FSpe(SEQ ID NO: 48), cdkex3_3lox(SEQ ID NO: 49)를 사용하여, PCR에 의해 3' 상동성 아암(900bp)(SEQ ID NO: 47)을 증폭시키고, SphI 및 NcoI에 클로닝함으로써, pBridge(SEQ ID NO: 148)로 지칭되는 최종 표적화 벡터를 생성시켰다.
CRISPR / Cas9 플라스미드의 작제
표적외 돌연변이의 가능성을 최소화하기 위해, 이중 닉카아제(nickase) 전략을 선택하였다. 안내 RNA 서열(SEQ ID NO: 50, 51, 52 및 53)을 pX335(제안된 프로토콜에 따라 Addgene으로부터 획득됨)에 클로닝하였다(문헌[Ran et al., 2013]).
EARC 변형된 마우스 ES 세포의 생성
마우스 ES 세포 배양: 모든 유전적 조작은 종래에 특성화된 C57BL/6N 마우스 ES 세포주(C2)(문헌[Gertsenstein et al., 2010])에서 수행하였다. 마우스 ES 세포를, 15% ES 세포 등급 FBS(Gibco), 0.1 mM 2-mEARCaptophenol, 2 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산나트륨, 0.1 mM 비필수 아미노산 및 2,000 단위/ml 백혈병 억제 인자(LIF)가 보충된 고 글루코스 DMEM(Invitrogen)을 기반으로 한 배지에서 성장시켰다. 세포를, 미토마이신 C 처리된 마우스 배아 섬유아세포(MEF)에서 5% CO2로 37℃에서 유지시켰다.
표적화: CRISPR/Cas9 구성요소를 함유하는 플라스미드(pX335-cdk-ex3A(SEQ ID NO: 151) 및 px335-cdk-ex3B(SEQ ID NO: 152)) 및 표적화 플라스미드(pBridge; SEQ ID NO: 148)를 제조사의 지침에 따라, FuGENE HD(Clontech)를 사용하고, 8:2의 FuGENE:DNA 비(2 μg 총 DNA: 각 pX330의 경우 250 ng 및 pBridge의 경우 1500 ng)를 사용하여, 마우스 ES 세포에 공동 형질감염시켰다. 전형적인 형질감염을 3x105개의 세포에서 수행하고, 35 mm 플레이트에 플레이팅하였다. 형질감염 시에, 독시사이클린을 배지에 부가하여, 최종 농도가 1 μg/ml가 되도록 하였다. 형질감염 2일 후에, 세포를 100 mm 플레이트에 플레이팅하고, 선택을 1 μg/ml의 퓨로마이신에 의해 적용하였다. 퓨로마이신 저항성 콜로니를 선택 시작 후 8 내지 10일 후에 채취하고, PCR 스크리닝시까지 96 웰 플레이트에 유지하였다.
유전자형 분석: 문헌[Nagy et al., 2003]에 따라 96 웰 플레이트에서 ES 세포로부터 DNA를 직접 추출하였다. Cdk1 유전자의 5'에서 pBridge의 상동성 재조합에 의한 올바른 삽입에 대해 양성인 클론을 5' 및 3' 상동성 아암에 걸친 프라이머(5' 아암의 경우, 프라이머 rttaRev(SEQ ID NO: 54), ex3_5scr(SEQ ID NO: 55), 3' 아암의 경우, 프라이머 CMVforw(SEQ ID NO: 56), ex3_3scr(SEQ ID NO: 57))를 사용하여, PCR에 의해 스크리닝하였다.
표적화된 세포 성장: F3-가교 표적화된 세포를 트립신 처리하고, 젤라틴화된 24 웰 플레이트에 웰당 5x104개의 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 플레이팅 1일 후에 개시하여, 각 조건에 대해 3개의 웰을 트립신 처리하고, Countess 자동 세포 계수기(Life Technologies)를 사용하여, 생존 세포를 계수함으로써, 세포 계수를 수행하였다. 플레이팅 2일 후에, 독시사이클린을 제거하거나, 0.05 ng/ml로 감소시켰으며, 생존 세포를 상이한 조건에서 매일 최대 18일 동안 계수하였다.
Cre-절개: F3-가교 세포(Dox+ 배지에서 성장함)를 트립신 처리하고, Cre(pCAGG-NLS-Cre)를 발현하는 2 μg의 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염은 JetPrime(Polyplus)을 사용하여, 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 형질감염 후, 독시사이클린을 제거하고, 콜로니를 트립신 처리하고, 풀(pool)로 확장시켰다.
정량적 PCR: 제조사의 프로토콜에 따라 GeneElute 총 RNA 미니프렙 키트(Sigma)를 사용하여, 1 μg/ml 및 0 μg/ml의 Dox로 2일 동안 처리한 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 QuantiTect 역전사 키트(Qiagen)를 사용하여, 1 μg의 RNA의 역전사에 의해 cDNA를 생성시켰다. 실시간 qPCR을 SensiFast-SYBR qPCR 믹스(Bioline)를 사용하여, BioRad CFX 유전자증폭기(thermocycler)에서 설정하였다. 사용된 프라이머는: qpcrcdk1_F(SEQ ID NO: 65), qpcrcdk1_R(SEQ ID NO:66) 및 actBf(SEQ ID NO: 67), actBr(SEQ ID NO: 68)이었다. 결과를 ΔΔCT 방법으로 분석하고, 베타 액틴에 대하여 정상화(normalization)하였다.
결과
도 9를 참조하면, 도 9a에 도시된 dox 가교 표적 벡터를 사용함으로써, 3개의 표적화된 C2 마우스 ES 세포주를 생성시켰다(도 9b). 이들 세포주 중 하나는, 상동성 재조합에 의해 Cdk1의 대립유전자 둘 모두의 5'UTR에 삽입된 dox 가교를 포함하는 동형접합성 표적화된 세포주(도 9b의 3F)인 것으로 밝혀졌다.
추정된 바와 같이, 이 ES 세포주는 독시사이클린의 존재하에서만 성장한다. 독시사이클린의 존재하에서, Cdk1 프로모터 활성 생성된 rtTA는 TRE와 결합하고, Cdk1의 전사를 개시시킨다. 3' 변형과 유사하게, CDL 발현이 EARC를 통해서만 발생될 수 있도록 보장하기 위해, dox 가교가 Cdk1의 대립유전자 둘 모두에 5'UTR로 삽입될 수 있다. 대안적 방법은 CDL의 모든 나머지 EARC 비변형된 대립유전자에 눌 돌연변이를 생성시키는 것이다.
독시사이클린의 회수는 5일 이내에 유사분열 활성 ES 세포의 완전한 제거를 야기하였다(도 10). doc 가교 세포주의 유도 및 유지에 사용된 농도에 비해, 독시사이클린 농도를 20배(50 ng/ml) 감소시킨 경우, 일부 세포/콜로니의 5일의 기간의 생존이 허용되었다(도 11).
도 12를 참조하면, dox 가교는, 2개의 lox71 부위 사이의 절편의 Cre 재조합효소 매개된 절개에 의해 제거될 수 있으며, 이는, 상기 대립유전자의 본래의 내인성 발현 조절을 복원시키고, 독시사이클린의 결여로부터 세포 치사율을 복구시킨다. 이러한 데이터는 dox 가교가 추정된 바와 같이, 세포에 작용하고 있음을 나타낸다.
도 13을 참조하면, 본 발명자들은, 독시사이클린의 존재 및 부재하에서 세포 성장을 측정함으로써, 독시사이클린 회수가 dox 가교 ES 세포의 제거에 어떻게 영향을 주는지를 결정하였다. 독시사이클린의 존재하의 ES 세포는 기하급수적으로 성장하였으며, 이는 그의 정상적인 성장을 나타낸다. 반대로, 독시사이클린의 회수 시(1일째)에, 세포는 2일 동안만 성장하였으며, 그 후, 세포 사멸이 시작되어, 9일째에는 생존 세포가 존재하지 않았다. 처음 3일의 세포 성장 후에 제공된 20배 더 저농도 독시사이클린(50ng/ml)은 플레이트 상에 적어도 5일 동안 일정한 수의 세포를 유지하기에 충분하였다(도 13, 밝은 청색 선). 정상 농도의 독시사이클린을 10일째에 플레이트에 다시 부가하는 경우, 세포는 정상 ES 세포와 같이 다시 성장하기 시작하였다.
독시사이클린이 결여된 배지에서 성장한 경우, 분열 세포는 Cdk1의 EARC(dox 가교) 변형을 회피할 수 있을 것으로 고려된다. 세포 회피 가능성을 처리하기 위해, EARC(dox 가교) 변형된 마우스 ES 세포를 독시사이클린을 함유하는 배지에서 10개의 플레이트에 100,000,000 세포/플레이트까지 성장시켰다. 이어서, 변형된 ES 세포의 10개의 플레이트 각각에 300개의 GFP 양성 야생형 ES 세포(센티넬)를 혼합하고, 독시사이클린을 배양 배지로부터 회수하였다. GFP 양성 콜로니만이 회복되었고(도 14), 이는, 배양 중의 100,000,000개의 세포 중에 회피된 dox 가교 ES 세포가 존재하지 않음을 나타낸다. 따라서, 본 발명자들은, 돌연변이에 의해, dox 가교의 상실이 발생할 개연성이 낮고, CDL 발현의 차단으로 인해, 유도인자(독시사이클린)의 부재하에 세포 분열이 가능하지 않기 때문에, EARC(dox 가교) 변형된 ES 세포는 특정 세포 치료 적용을 위해 ALINK 변형에 추가적 수준의 안전성을 부가할 것으로 결정하였다.
도 15를 참조하면, dox 가교 ES 세포의 성장에 대한 고농도 독시사이클린(10 μg/ml)의 영향을 조사하였다. 고농도 독시사이클린의 존재하에, dox 가교 ES 세포의 성장 속도는 저농도 독시사이클린에서 성장한 세포와 유사한 속도로 둔화되었다. 이러한 데이터는 야생형 세포 유사 증식을 위한 최적의 Cdk1 발현을 허용할 수 있는 독시사이클린 농도의 범위가 존재함을 나타낸다.
실시예 3: CDK1 좌위에서 EARC - ALINK 변형된 세포의 생성(마우스 및 인간)
실시예 3에서, CDK1을 표적화하는 EARC(dox 가교) 벡터의 작제 및 마우스 및 인간 ALINK 변형된 ES 세포 둘 모두에서 세포 분열을 제어하기 위한 그의 용도가 기재되어 있다. 이 실시예에서, CDL은 Cdk1/CDK1이고, EARC는 dox 가교이며, ALINK는 HSV-TK이다. CDL Cdk1은 동형접합성 형태로 EARC 및 ALINK 시스템 둘 모두에 의해 변형되고, 여기서, CDL의 발현을 유도하기 위해 독시사이클린이 요구되며, 독시사이클린 및 GCV는 함께, 변형된 증식 세포를 사멸시키는 방법을 제공한다.
실시예 3에서, CDK1 유전자의 5'UTR로의 dox 가교 삽입은 상동성 재조합 녹인 기법에 의해 달성하였다.
방법
마우스 표적화를 위한 마우스 EARC 표적화 벡터, CRISPR/Cas9 플라스미드의 작제는 실시예 2에서와 동일하다. 표적화 및 유전자형 분석 방법은 또한, C2 WT 세포 대신에, 실시예 1(도 3ab 내지 도 3g)에서 생성된 Cdk1(TK/TK) 세포를 형질감염을 위해 사용하였다는 것을 제외하고, 실시예 2에 기재된 바와 동일하다.
인간 CDK1에 대한 dox 가교를 포함하는 EARC 표적화 벡터의 작제
CA1 게놈 DNA로부터의 981 bp 단편을 PCR 증폭시키고(프라이머 hcdk5'F(SEQ ID NO: 70) 및 hcdk5'R(SEQ ID NO: 71)), 이를 pGem-가교-단계3의 SbfI에 클로닝함으로써, 5' 상동성 아암(SEQ ID NO: 69)을 클로닝하였다. 유사하게, 프라이머 hcdk3'F(SEQ ID NO: 73) 및 hcdk3'R(SEQ ID NO: 74)를 사용하여, PCR에 의해 3' 상동성 아암(943 bp; SEQ ID NO: 72)을 증폭시키고, SphI 및 NcoI에 클로닝함으로써, pBridge-hCdk1(SEQ ID NO: 75)로 지칭되는 최종 표적화 벡터를 생성시켰다.
인간 표적화를 위한 CRISPR / Cas9 플라스미드의 작제
안내 RNA(hCdk1A_up(SEQ ID NO: 76), hCdk1A_low(SEQ ID NO: 77), hCdk1B_up(SEQ ID NO: 78), hCdk1B_low(SEQ ID NO: 79))를 pX335(SEQ ID NO: 149) 및 pX330(SEQ ID NO: 150)에 클로닝하여, pX335-1A(SEQ ID NO: 80), pX335-1B(SEQ ID NO: 81) 및 pX330-1B(SEQ ID NO: 82)를 생성시켰다.
EARC 변형된 인간 ES 세포의 생성
표적화: 2x106 CA1 Cdk1(TK/TK)(즉, 도 4a 내지 도 4f에 기재된 세포 산물) hES 세포를 Neon 프로토콜 14에 의해 8 ug의 DNA(표적 벡터: pX330-hCdkTK-A=6 ug: 2 ug)로 형질감염시켰다. 형질감염 후, 세포를 4개의 10 cm 플레이트에 플레이팅하였다. 형질감염 시, 독시사이클린을 배지에 부가하여, 최종 농도가 1 μg/ml이 되도록 하였다. 형질감염 2일 후에, 0.75 μg/ml의 퓨로마이신에 의한 선택을 적용하였다. 퓨로마이신 저항성 콜로니를 96-웰 플레이트에 채취하고, 추가적 성장 및 프라이머(hCdk1Br-5HAgen_F1(SEQ ID NO: 83), rtTA_rev_1(SEQ ID NO: 84), mCMV_F(SEQ ID NO:85), hCdk1Br-3HAgen_R1(SEQ ID NO: 86))에 의한 유전자형 분석을 위해 복제하였다.
결과
도 16a를 참조하면, 실시예 1에서 생성된 마우스 세포 산물, Cdk1(TK/TK)를 표적화하기 위해, 마우스 dox 가교 표적 벡터, pBridge를 사용함으로써, 마우스 Cdk1earc/earc,alink/alink 세포를 생성시켰다. 9개의 Cdk1earc / earc,alink / alink 클론이 원샷 형질감염에 의해 생성되었다(도 16b).
도 5b를 참조하면, 데이터는, EARC-및-ALINK-변형된 동형접합성 마우스 C2 ES Cdk1 earc / earc,alink / alink 세포가 ES 세포 조건하에서 적절하게 자가 재생되고, 생체내에서 분화되고, 복합 기형종을 형성하였다는 것을 나타낸다.
도 17a를 참조하면, 인간 dox 가교 표적 벡터인 pBridge-hCdk1을 사용하여, 실시예 1에서 생성된 인간 CA1 세포 산물, Cdk1(TK/TK)를 표적화함으로써, 인간 Cdk1 earc / earc,alink / alink 세포를 생성시켰다. 원샷 형질감염에 의해 적어도 Cdk1 earc/earc,alink/alink CA1 클론이 생성되었다(도 17b).
실시예 4: Top2a 좌위에서 EARC 변형된 마우스 ES 세포의 생성
실시예 4에서, Top2a를 표적화하는 EARC(dox 가교) 벡터의 작제 및 마우스 ES 세포에서 세포 분열을 제어하기 위한 그의 용도가 기재되어 있다. 이 실시예에서, dox 가교가 삽입되고, 독시사이클린이 CDL의 발현을 유도하는 유도성 유전자 발현 시스템에 의해 표적화되는 CDL은 Top2a/TOP2A이다.
상기에서 기재된 바와 같이, Top2a/TOP2A는 모든 유사분열 활성(즉, 분열) 세포에서 발현된다. Top2a 좌위에 EARC(dox 가교) 삽입을 포함하도록 변형된 세포에서, 세포 분열은, Top2a의 발현을 허용하는 유도인자(독시사이클린)의 존재하에서만 가능하다. 따라서, EARC 변형된 유사분열 활성 세포의 세포 분열은 독시사이클린의 부재하에 제거될 수 있다.
실시예 4에서, Top2a 유전자의 5'UTR로의 dox 가교 삽입은 상동성 재조합 녹인 기법에 의해 달성하였다.
방법
Top2a에 대한 dox 가교를 포함하는 EARC 표적화 벡터의 작제
C57/B6 게놈 DNA로부터의 870 bp 단편을 PCR 증폭시키고(프라이머 Top5F(SEQ ID NO: 88) 및 Top5R(SEQ ID NO: 89)), pGem-가교-단계3의 SbfI 및 SpeI로 클로닝함으로써, 5' 상동성 아암(SEQ ID NO: 87)을 클로닝하였다. 유사하게, 프라이머 Top3F(SEQ ID NO: 91), Top3R(SEQ ID NO: 92)를 사용하여, PCR에 의해 3' 상동성 아암(818 bp; SEQ ID NO: 90)을 증폭시키고, SphI 및 NcoI에 클로닝함으로써, pBridge-Top2a(SEQ ID NO: 93)로 지칭되는 최종 표적화 벡터를 생성시켰다.
CRISPR / Cas9 플라스미드의 작제
표적외 돌연변이의 가능성을 최소화하기 위해 이중 닉카아제 전략을 선택하였다. 안내 RNA 서열을, 제안된 프로토콜에 따라 올리고(oligos): TOP2A1BF(SEQ ID NO: 94), TOP2A1BR(SEQ ID NO: 95), TOP2A1AF(SEQ ID NO: 96), TOP2A1AR(SEQ ID NO: 97)를 사용하여, pX335(Addgene)에 클로닝함으로써(문헌[Ran et al., 2013]), CRISPR 벡터 pX335-Top2aA(SEQ ID NO: 98) 및 px335-Top2aB(SEQ ID NO: 99)를 생성시켰다.
EARC 변형된 마우스 ES 세포의 생성
마우스 ES 세포 배양: 모든 유전적 조작은 종래에 특성화된 C57/B6 마우스 ES 세포주(C2)(문헌[Gertsenstein et al., 2010])에서 수행하였다. 마우스 ES 세포를, 15% ES 세포 등급 FBS(Gibco), 0.1 mM 2-mEARCaptophenol, 2 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산나트륨, 0.1 mM 비필수 아미노산 및 2,000 단위/ml 백혈병 억제 인자(LIF)가 보충된 고 글루코스 DMEM(Invitrogen)을 기반으로 한 배지에서 성장시켰다. 세포를, 미토마이신 C 처리된 마우스 배아 섬유아세포(MEF)에서 5% CO2로 37℃에서 유지시켰다.
표적화: CRISPR/Cas9 구성요소를 함유하는 플라스미드(pX335-Top2aA(SEQ ID NO: 98) 및 px335-Top2aB(SEQ ID NO: 99)) 및 표적화 플라스미드(pBridge-Top2a(SEQ ID NO: 93)를 제조사의 지침에 따라, FuGENE HD(Clontech)를 사용하고, 8:2의 FuGENE:DNA 비(2 μg 총 DNA: 각 pX335의 경우 250 ng 및 pBridge-Top2a의 경우 1500 ng)를 사용하여, 마우스 ES 세포에 공동 형질감염시켰다. 전형적인 형질감염을 3x105개의 세포에서 수행하고, 35 mm 플레이트에 플레이팅하였다. 형질감염 시에, 독시사이클린을 배지에 부가하여, 최종 농도가 1 μg/ml가 되도록 하였다. 형질감염 2일 후에, 세포를 100 mm 플레이트에 플레이팅하고, 선택을 1 μg/ml의 퓨로마이신에 의해 적용하였다. 퓨로마이신 저항성 콜로니를 선택 시작 후 8 내지 10일째에 채취하고, PCR 스크리닝시까지 96 웰 플레이트에 유지하였다.
유전자형 분석: 문헌[Nagy et al., 2003]에 따라 96 웰 플레이트에서 ES 세포로부터 DNA를 직접 추출하였다. Top2a 유전자의 5'에서 pBridge-Top2a의 상동성 재조합에 의한 올바른 삽입에 대해 양성인 클론을 5' 및 3' 상동성 아암에 걸친 프라이머(5' 아암의 경우, 프라이머 rttaRev(SEQ ID NO: 54), top2a_5scrF(SEQ ID NO: 55), 3' 아암의 경우, 프라이머 CMVforw(SEQ ID NO: 56), top2a_3scrR(SEQ ID NO: 57)를 사용하여, PCR에 의해 스크리닝하였다.
표적화된 세포 성장: Top2a 동형접합성 표적화된 세포를 트립신 처리하고, 젤라틴화된 24 웰 플레이트에 웰당 5x104개의 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 플레이팅 1일 후에 개시하여, 세포를 상이한 Dox 농도(1 μg/ml, 0.5 μg/ml, 0.05 μg/ml 및 0 μg/ml)에 노출시키고, 상기 플레이트를 IncucyteZoom 시스템(Essen Bioscience)에서 3 내지 4일 동안 2시간마다 사진을 촬영하고, 컨플루언스를 측정함으로써, 분석하였다.
결과
도 18을 참조하면, 도 18a에 도시된 dox 가교 표적 벡터를 사용함으로써, 여러 개의 표적화된 C2 마우스 ES 세포주를 생성시켰다(도 18b). 이들 세포주 중 9개는, 상동성 재조합에 의해 Top2a의 대립유전자 둘 모두의 5'UTR에 삽입된 dox 가교를 포함하는 동형접합성 표적화된 것(도 18b)으로 밝혀졌다.
추정된 바와 같이, 이 ES 세포주는 독시사이클린의 존재하에서만 성장한다. 독시사이클린의 존재하에서, Top2a 프로모터에 의해 생성된 rtTA는 TRE와 결합하고, Top2a 코딩 서열의 전사를 개시시킨다. CDL 발현이 EARC를 통해서만 발생될 수 있도록 보장하기 위해, dox 가교가 Top2a의 대립유전자 둘 모두에 5'UTR로 삽입될 수 있다. 대안적 방법은 CDL의 모든 나머지 EARC 비변형된 대립유전자에 눌 돌연변이를 생성시키는 것이다.
독시사이클린의 회수는 4일 이내에 유사분열 활성 ES 세포의 완전한 제거를 야기하였다(도 19a).
도 19b를 참조하면, 본 발명자들은, 4일 동안 세포 성장을 측정함으로써, 상이한 농도의 독시사이클린이 dox 가교 ES 세포의 증식에 어떻게 영향을 주는지를 결정하였다. 독시사이클린의 존재하의 ES 세포는 기하급수적으로 성장하였으며, 이는 그의 정상적인 성장을 나타낸다. 반대로, 독시사이클린 제거 2일 후에는, EARC 변형된 세포의 세포 성장이 완전히 저지되었다.
실시예 5: Cenpa 좌위에서 EARC 변형된 마우스 ES 세포의 생성
실시예 5에서, Cenpa를 표적화하는 EARC(dox 가교) 벡터의 작제 및 마우스 ES 세포에서 세포 분열을 제어하기 위한 그의 용도가 기재되어 있다. 이 실시예에서, dox 가교가 삽입되고, 독시사이클린이 CDL의 발현을 유도하는 유도성 유전자 발현 시스템으로 표적화되는 CDL은 Cenpa/CENPA이다.
상기에서 기재된 바와 같이, Cenpa/CENPA는 모든 유사분열 활성(즉, 분열) 세포에서 발현된다. Cenpa 좌위에서 EARC(dox 가교) 삽입을 포함하도록 변형된 세포에서, 세포 분열은, Cenpa의 발현을 허용하는 유도인자(독시사이클린)의 존재하에서만 가능하다. 따라서, EARC 변형된 유사분열 활성 세포의 세포 분열은 독시사이클린의 부재하에서 제거될 수 있다.
실시예 5에서, Cenpa 유전자의 5'UTR로의 dox 가교 삽입은 상동성 재조합 녹인 기법에 의해 달성하였다.
방법
dox 가교를 포함하는 EARC 표적화 벡터의 작제
C57/B6 게놈 DNA로부터의 874 bp 단편을 PCR 증폭시키고(프라이머 Cenpa5F(SEQ ID NO: 101) 및 Cenpa5R(SEQ ID NO: 102)), pGem-가교-단계3의 SbfI 및 SpeI로 클로닝함으로써, 5' 상동성 아암(SEQ ID NO: 100)을 클로닝하였다. 유사하게, 프라이머 Cenpa3F(SEQ ID NO: 104), Cenpa3R(SEQ ID NO: 105)를 사용하여, PCR에 의해 3' 상동성 아암(825 bp; SEQ ID NO: 103)을 증폭시키고, SphI 및 NcoI에 클로닝함으로써, pBridge-Cenpa(SEQ ID NO: 106)로 지칭되는 최종 표적화 벡터를 생성시켰다.
CRISPR / Cas9 플라스미드의 작제
표적외 돌연변이의 가능성을 최소화하기 위해 이중 닉카아제 전략을 선택하였다. 안내 RNA 서열을, 제안된 프로토콜에 따라 올리고 CenpaAF(SEQ ID NO: 107), CenpaAR(SEQ ID NO: 108), CenpaBF(SEQ ID NO: 109), CenpaBR(SEQ ID NO: 110)를 사용하여, pX335(Addgene)에 클로닝함으로써(문헌[Ran et al., 2013]), CRISPR 벡터 pX335-CenpaA(SEQ ID NO: 111) 및 px335-CenpaB(SEQ ID NO: 112)를 생성시켰다.
EARC 변형된 마우스 ES 세포의 생성
마우스 ES 세포 배양: 실시예 4에서와 같음.
표적화: CRISPR/Cas9 구성요소를 함유하는 플라스미드(pX335-CenpaA; SEQ ID NO: 111, 및 px335-CenpaB; SEQ ID NO: 112) 및 표적화 플라스미드(pBridge-Cenpa; SEQ ID NO: 106)를 실시예 4에서와 같이, FuGENE HD(Clontech)를 사용하여, 마우스 ES 세포에 공동 형질감염시켰다.
유전자형 분석: 실시예 4에서와 같이 DNA를 추출하였다. Cenpa 유전자의 5'에서 pBridge-Cenpa의 상동성 재조합에 의한 올바른 삽입에 대해 양성인 클론을 5' 및 3' 상동성 아암에 걸친 프라이머(5' 아암의 경우, 프라이머 rttaRev(SEQ ID NO: 54), Cenpa_5scr(SEQ ID NO: 113), 3' 아암의 경우, 프라이머 CMVforw(SEQ ID NO: 114), Cenpa_3scr(SEQ ID NO: 115))를 사용하여, PCR에 의해 스크리닝하였다.
표적화된 세포 성장: Cenpa 동형접합성 표적화된 세포를 트립신 처리하고, 젤라틴화된 24 웰 플레이트에 웰당 5x104개의 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 플레이팅 1일 후에 개시하여, 세포를 상이한 Dox 농도(1 μg/ml, 0.5 μg/ml, 0.05 μg/ml 및 0 μg/ml)에 노출시키고, 상기 플레이트를 IncucyteZoom 시스템(Essen Bioscience)에서 3 내지 4일 동안 2시간마다 사진을 촬영하고, 컨플루언스를 측정함으로써, 분석하였다.
정량적 PCR: 제조사의 프로토콜에 따라 GeneElute 총 RNA 미니프렙 키트(Sigma)를 사용하여, 1 μg/ml 및 0 μg/ml의 Dox로 2일 동안 처리한 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 QuantiTect 역전사 키트(Qiagen)를 사용하여, 1 μg의 RNA의 역전사에 의해 cDNA를 생성시켰다. 실시간 qPCR을 SensiFast-SYBR qPCR 믹스(Bioline)를 사용하여, BioRad CFX 유전자증폭기에서 설정하였다. 사용된 프라이머는: qpcrcenpa_F(SEQ ID NO: 116), qpcrcenpa_R(SEQ ID NO: 117) 및 actBf(SEQ ID NO: 67), actBr(SEQ ID NO: 68)이었다. 결과를 ΔΔCT 방법으로 분석하고, 베타 액틴에 대하여 정상화하였다.
결과
도 20을 참조하면, 도 20a에 도시된 dox 가교 표적 벡터를 사용함으로써, 여러 개의 표적화된 C2 마우스 ES 세포주를 생성시켰다(도 20b). 이들 세포주 중 6개는 5' 및 3'에 올바른 삽입을 갖는 것으로 밝혀졌으며, 적어도 하나의 클론(Cenpa#4)은, 상동성 재조합에 의해 Cenpa의 대립유전자 둘 모두의 5'UTR에 삽입된 dox 가교를 포함하는 동형접합성 표적화(도 20b)를 갖는 것으로 밝혀졌다.
추정된 바와 같이, 이 ES 세포주는 독시사이클린의 존재하에서만 성장한다. 독시사이클린의 존재하에서, Cenpa 프로모터에 의해 생성된 rtTA는 TRE와 결합하고, Cenpa 코딩 서열의 전사를 개시시킨다. CDL 발현이 EARC를 통해서만 발생될 수 있도록 보장하기 위해, dox 가교가 Cenpa의 대립유전자 둘 모두에 5'UTR로 삽입될 수 있다. 대안적 방법은 CDL의 모든 나머지 EARC 비변형된 대립유전자에 눌 돌연변이를 생성시키는 것이다.
독시사이클린의 회수는 4일 이내에 유사분열 활성 ES 세포의 완전한 제거를 야기하였다(도 21a).
도 21b를 참조하면, 본 발명자들은 qPCR에 의해 Dox를 갖는 Cenpa-EARC 세포에서 Dox 제거 2일 후에, Cenpa 유전자 발현 수준을 결정하고, 야생형 마우스 ES 세포(C2)에서의 발현 수준과 비교하였다. 추정된 바와 같이, Cenpa 발현 수준은 Dox의 부재하에 Cenpa-EARC 세포에서 2일 동안 크게 감소한다.
도 22를 참조하면, 본 발명자들은, 4일 동안 세포 성장을 측정함으로써, 상이한 농도의 독시사이클린이 dox 가교 ES 세포의 증식에 어떻게 영향을 주는지를 결정하였다. 독시사이클린의 존재하의 ES 세포는 기하급수적으로 성장하였으며, 이는 그의 정상적인 성장을 나타낸다. 반대로, 독시사이클린 제거 80시간 후에는, 세포 성장이 완전히 저지되었다.
실시예 6: Birc5 좌위에서 EARC 변형된 마우스 ES 세포의 생성
실시예 6에서, Birc5를 표적화하는 EARC(dox 가교) 벡터의 작제 및 마우스 ES 세포에서 세포 분열을 제어하기 위한 그의 용도가 기재되어 있다. 이 실시예에서, dox 가교가 삽입되고, 독시사이클린이 CDL의 발현을 유도하는 유도성 유전자 발현 시스템으로 표적화되는 CDL은 Birc5/BIRC5이다.
상기에서 기재된 바와 같이, Birc5/BIRC5는 모든 유사분열 활성(즉, 분열) 세포에서 발현된다. Birc5 좌위에서 EARC(dox 가교) 삽입을 포함하도록 변형된 세포에서, 세포 분열은, Birc5의 발현을 허용하는 유도인자(독시사이클린)의 존재하에서만 가능하다. 따라서, EARC 변형된 유사분열 활성 세포의 세포 분열은 독시사이클린의 부재하에서 제거될 수 있다.
실시예 6에서, Birc5 유전자의 5'UTR로의 dox 가교 삽입은 상동성 재조합 녹인 기법에 의해 달성하였다.
방법
dox 가교를 포함하는 EARC 표적화 벡터의 작제
C57/B6 게놈 DNA로부터의 775 bp 단편을 PCR 증폭시키고(프라이머 Birc3F(SEQ ID NO: 119), Birc3R(SEQ ID NO: 120)), pGem-가교-단계3의 SbfI 및 NcoI로 클로닝함으로써, 3' 상동성 아암(SEQ ID NO: 118)을 클로닝하였다. 유사하게, 프라이머 Birc5F(SEQ ID NO: 122) 및 Birc5R PstI(SEQ ID NO: 123)를 사용하여, PCR에 의해 5' 상동성 아암(617 bp; SEQ ID NO: 121)을 증폭시키고, SpeI에 클로닝함으로써, pBridge-Birc5(SEQ ID NO: 124)로 지칭되는 최종 표적화 벡터를 생성시켰다.
CRISPR/Cas9 플라스미드의 작제
표적외 돌연변이의 가능성을 최소화하기 위해 이중 닉카아제 전략을 선택하였다. 안내 RNA 서열을, 제안된 프로토콜에 따라 올리고 Birc5AF(SEQ ID NO: 125), Birc5AR(SEQ ID NO: 126), Birc5BF(SEQ ID NO: 127), Birc5BR(SEQ ID NO: 128)를 사용하여, pX335(Addgene)에 클로닝함으로써(문헌[Ran et al., 2013]), CRISPR 벡터 pX335-Birc5A(SEQ ID NO: 129) 및 px335-Birc5B(SEQ ID NO: 130)를 생성시켰다.
EARC 변형된 마우스 ES 세포의 생성
마우스 ES 세포 배양: 실시예 4에서와 같음.
표적화: CRISPR/Cas9 구성요소를 함유하는 플라스미드(pX335-Birc5A 및 px335-Birc5B) 및 표적화 플라스미드(pBridge-Birc5)를 실시예 4에서와 같이, FuGENE HD(Clontech)를 사용하여, 마우스 ES 세포에 공동 형질감염시켰다.
유전자형 분석: 실시예 4에서와 같이 DNA를 추출하였다. Birc5 유전자의 5'에서 pBridge-Birc5의 상동성 재조합에 의한 올바른 삽입에 대해 양성인 클론을 5' 상동성 아암에 걸친 프라이머(프라이머 rttaRev(SEQ ID NO: 54), Birc_5scrF(SEQ ID NO: 131))를 사용하여, PCR에 의해 스크리닝하였다.
표적화된 세포 성장: Birc5 동형접합성 표적화된 세포를 트립신 처리하고, 젤라틴화된 24 웰 플레이트에 웰당 5x104개의 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 플레이팅 1일 후에 개시하여, 세포를 상이한 Dox 농도(1 μg/ml, 0.5 μg/ml, 0.05 μg/ml 및 0 μg/ml)에 노출시키고, 상기 플레이트를 IncucyteZoom 시스템(Essen Bioscience)에서 3 내지 4일 동안 2시간마다 사진을 촬영하고, 컨플루언스를 측정함으로써, 분석하였다.
정량적 PCR: 제조사의 프로토콜에 따라 GeneElute 총 RNA 미니프렙 키트(Sigma)를 사용하여, 1 μg/ml 및 0 μg/ml의 Dox로 2일 동안 처리한 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 QuantiTect 역전사 키트(Qiagen)를 사용하여, 1 μg의 RNA의 역전사에 의해 cDNA를 생성시켰다. 실시간 qPCR을 SensiFast-SYBR qPCR 믹스(Bioline)를 사용하여, BioRad CFX 유전자증폭기에서 설정하였다. 사용된 프라이머는: qpcrbirc_F(SEQ ID NO: 132), qpcrbirc_R(SEQ ID NO: 133) 및 actBf(SEQ ID NO: 67), actBr(SEQ ID NO: 68)이었다. 결과를 ΔΔCT 방법으로 분석하고, 베타 액틴에 대하여 정상화하였다.
결과
도 23을 참조하면, 도 23a에 도시된 dox 가교 표적 벡터를 사용함으로써, 표적화된 C2 마우스 ES 세포주를 생성시켰다(도 23b). 5개의 클론은, 재조합에 의해 Birc5의 대립유전자 둘 모두의 5'UTR에 삽입된 dox 가교를 포함하는 올바르게 표적화된 것(도 23b)으로 밝혀졌다. 이들 클론 중 하나는 Birc#3이었으며, Dox의 부재하에 성장이 중지되거나 사멸되는 것으로 밝혀졌다.
추정된 바와 같이, 이 ES 세포주는 독시사이클린의 존재하에서만 성장한다. 독시사이클린의 존재하에서, Birc5 프로모터에 의해 생성된 rtTA는 TRE와 결합하고, Birc5 코딩 서열의 전사를 개시시킨다. CDL 발현이 EARC를 통해서만 발생될 수 있도록 보장하기 위해, dox 가교가 Birc5의 대립유전자 둘 모두에 5'UTR로 삽입될 수 있다. 대안적 방법은 CDL의 모든 나머지 EARC 비변형된 대립유전자에 눌 돌연변이를 생성시키는 것이다.
독시사이클린의 회수는 4일 이내에 유사분열 활성 ES 세포의 완전한 제거를 야기하였다(도 24a).
도 24b를 참조하면, 본 발명자들은 qPCR에 의해 Dox를 갖는 Birc5-EARC 세포에서 Dox 제거 2일 후에, Birc5 유전자 발현 수준을 결정하고, 야생형 마우스 ES 세포(C2)에서의 발현 수준과 비교하였다. 추정된 바와 같이, Birc5 발현 수준은 Dox의 부재하에 Birc5-EARC 세포에서 2일 동안 크게 감소한다.
도 25를 참조하면, 본 발명자들은, 4일 동안 세포 성장을 측정함으로써, 상이한 농도의 독시사이클린이 dox 가교 ES 세포의 증식에 어떻게 영향을 주는지를 결정하였다. 독시사이클린의 존재하의 ES 세포는 기하급수적으로 성장하였으며, 이는 그의 정상적인 성장을 나타낸다. 반대로, 독시사이클린 제거 50시간 후에는, 세포 성장이 완전히 저지되었다. 흥미롭게도, 더 저농도 Dox(0.5 및 0.05 μg/ml)가 더 고농도(1 μg/ml)보다 더 양호한 세포 성장을 촉진하는 것으로 나타난다.
실시예 7: Eef2 좌위에서 EARC 변형된 마우스 ES 세포의 생성
실시예 7에서, Eef2를 표적화하는 EARC(dox 가교) 벡터의 작제 및 마우스 ES 세포에서 세포 분열을 제어하기 위한 그의 용도가 기재되어 있다. 이 실시예에서, dox 가교가 삽입되고, 독시사이클린이 CDL의 발현을 유도하는 유도성 유전자 발현 시스템으로 표적화되는 CDL은 Eef2/EEF2이다.
상기에서 기재된 바와 같이, Eef2/EEF2는 모든 유사분열 활성(즉, 분열) 세포에서 발현된다. Eef2 좌위에서 EARC(dox 가교) 삽입을 포함하도록 변형된 세포에서, 세포 분열은, Eef2의 발현을 허용하는 유도인자(독시사이클린)의 존재하에서만 가능하다. 따라서, EARC 변형된 유사분열 활성 세포의 세포 분열은 독시사이클린의 부재하에서 제거될 수 있다.
실시예 7에서, Eef2 유전자의 5'UTR로의 dox 가교 삽입은 상동성 재조합 녹인 기법에 의해 달성하였다.
방법
dox 가교를 포함하는 EARC 표적화 벡터의 작제
C57/B6 게놈 DNA로부터의 817 bp 단편(SEQ ID NO: 134)을 PCR 증폭시키고(프라이머 Eef2_5F(SEQ ID NO: 135) 및 Eef2_5R(SEQ ID NO: 136)), pGem-가교-단계3의 SbfI 및 SpeI로 클로닝함으로써, 5' 상동성 아암을 클로닝하였다. 유사하게, 프라이머 Eef2_3F(SEQ ID NO: 138), Eef2_3R(SEQ ID NO: 139)를 사용하여, PCR에 의해 3' 상동성 아암(826 bp; SEQ ID NO: 137)을 증폭시키고, SphI to에 클로닝함으로써, pBridge-Eef2(SEQ ID NO: 140)로 지칭되는 최종 표적화 벡터를 생성시켰다.
CRISPR/Cas9 플라스미드의 작제
표적외 돌연변이의 가능성을 최소화하기 위해 이중 닉카아제 전략을 선택하였다. 안내 RNA 서열을, 제안된 프로토콜에 따라 올리고 Eef2aFWD(SEQ ID NO: 141), Eef2aREV(SEQ ID NO: 142), Eef2bFWD(SEQ ID NO: 143), Eef2bREV(SEQ ID NO: 144)를 사용하여, pX335(Addgene)에 클로닝함으로써(문헌[Ran et al., 2013]), CRISPR 벡터 pX335-Eef2A(SEQ ID NO: 145) 및 px335-Eef2B(SEQ ID NO: 146)를 생성시켰다.
EARC 변형된 마우스 ES 세포의 생성
마우스 ES 세포 배양: 실시예 4에서와 같음.
표적화: CRISPR/Cas9 구성요소를 함유하는 플라스미드(pX335-Eef2A 및 px335-Eef2B) 및 표적화 플라스미드(pBridge-Eef2)를 실시예 4에서와 같이, FuGENE HD(Clontech)를 사용하여, 마우스 ES 세포에 공동 형질감염시켰다.
유전자형 분석: 실시예 4에서와 같이 DNA를 추출하였다. Eef2 유전자의 5'에서 pBridge-Eef2의 상동성 재조합에 의한 올바른 삽입에 대해 양성인 클론을 5' 상동성 아암에 걸친 프라이머(프라이머 rttaRev(SEQ ID NO: 54), Eef2_5scrF(SEQ ID NO: 147))를 사용하여, PCR에 의해 스크리닝하였다.
표적화된 세포 성장: Eef2 동형접합성 표적화된 세포를 트립신 처리하고, 젤라틴화된 24 웰 플레이트에 웰당 5x104개의 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 플레이팅 1일 후에 개시하여, 세포를 상이한 Dox 농도(1 μg/ml, 0.5 μg/ml, 0.05 μg/ml 및 0 μg/ml)에 노출시키고, 상기 플레이트를 IncucyteZoom 시스템(Essen Bioscience)에서 3 내지 4일 동안 2시간마다 사진을 촬영하고, 컨플루언스를 측정함으로써, 분석하였다.
결과
도 26을 참조하면, 도 26a에 도시된 dox 가교 표적 벡터를 사용함으로써, 여러 개의 표적화된 C2 마우스 ES 세포주를 생성시켰다(도 26b). 이들 세포주 중 9개는 올바르게 표적화된 것(도 26b)으로 밝혀졌으며, 적어도 하나의 클론은 Dox-배지에서만 성장하였다.
추정된 바와 같이, 이 ES 세포주는 독시사이클린의 존재하에서만 성장한다. 독시사이클린의 존재하에서, Eef2 프로모터에 의해 생성된 rtTA는 TRE와 결합하고, Eef2 코딩 서열의 전사를 개시시킨다. CDL 발현이 EARC를 통해서만 발생될 수 있도록 보장하기 위해, dox 가교가 Eef2의 대립유전자 둘 모두에 5'UTR로 삽입될 수 있다. 대안적 방법은 CDL의 모든 나머지 EARC 비변형된 대립유전자에 눌 돌연변이를 생성시키는 것이다.
독시사이클린의 회수는 4일 이내에 유사분열 활성 ES 세포의 완전한 제거를 야기하였다(도 27).
도 28을 참조하면, 본 발명자들은, 4일 동안 세포 성장을 측정함으로써, 상이한 농도의 독시사이클린이 dox 가교 ES 세포의 증식에 어떻게 영향을 주는지를 결정하였다. 독시사이클린의 존재하의 ES 세포는 기하급수적으로 성장하였으며, 이는 그의 정상적인 성장을 나타낸다. 반대로, 독시사이클린의 부재 시에, 세포는 성장에 완전히 실패하였다.
본 개시는 특정의 구체적인 구현예를 참조하여 기재되었으나, 그의 다양한 변형이 당업자에게 명백할 것이다. 본 명세서에서 제공되는 임의의 실시예는 본 개시를 설명하기 위한 목적으로만 포함되며, 어떤 방식으로든 본 개시를 제한하려는 의도가 아니다. 본 명세서에서 제공되는 임의의 도면은 본 개시의 다양한 양태를 설명하기 위한 목적일 뿐이며, 어떤 방식으로든 본 개시의 규모를 도출하거나, 제한하려는 의도가 아니다. 본 명세서에 첨부된 청구범위의 범위는 상기 설명에서 제시된 바람직한 구현예들에 의해 제한되어서는 안되며, 전체적으로 본 명세서와 일치하는 가장 넓은 해석이 주어져야 한다. 본 명세서에 나열된 모든 선행 기술의 개시는 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
표 2: 추정 CDL(ID는 EntrezGene 식별 번호를 지칭하고; CS 점수는 문헌[Wang et al., 2015]에 제공되는 CRISPR 점수 평균을 지칭하며; 기능은 공지되었거나, 추정된 좌위의 기능을 지칭하고, 추정은 GO 기간을 기반으로 하며, Gene Ontology Consortium 웹 사이트 http://geneontology.org/에서 제시된 바와 같고; 기능 범주는 GO 기간 추정된 기능을 기반으로 한 4가지 범주의 세포 기능을 지칭하며; CDL(기준)은, 본 발명자들이 유전자가 CDL이라는 것을 추정하는데 사용했던 정보를 지칭하며, 추정은 CS 점수, 이용 가능한 유전자 녹아웃(KO) 데이터, 유전자 기능 및 본 명세서에서 제공되는 실험 데이터를 기반으로 함).
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tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac 8400 ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgt 8436 <210> 152 <211> 8435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 152 gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60 ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120 aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180 atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240 cgaaacaccc tcgccgcggt aaagctccgt tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa 300 ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt gttttagagc 360 tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgtttttagc gcgtgcgcca attctgcaga 420 caaatggctc tagaggtacc cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg 480 cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 540 caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 600 ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttgtgcccag 660 tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 720 accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca 780 cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg 840 gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg 900 agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg 960 cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagt cgctgcgacg 1020 ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 1080 gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 1140 gctgagcaag aggtaagggt ttaagggatg gttggttggt ggggtattaa tgtttaatta 1200 cctggagcac ctgcctgaaa tcactttttt tcaggttgga ccggtgccac catgtaccca 1260 tacgatgttc cagattacgc ttcgccgaag aaaaagcgca aggtcgaagc gtccgacaag 1320 aagtacagca tcggcctggc catcggcacc aactctgtgg gctgggccgt gatcaccgac 1380 gagtacaagg tgcccagcaa gaaattcaag gtgctgggca acaccgaccg gcacagcatc 1440 aagaagaacc tgatcggagc cctgctgttc gacagcggcg aaacagccga ggccacccgg 1500 ctgaagagaa ccgccagaag aagatacacc 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cagagcaaga acggctacgc cggctacatt 2400 gacggcggag ccagccagga agagttctac aagttcatca agcccatcct ggaaaagatg 2460 gacggcaccg aggaactgct cgtgaagctg aacagagagg acctgctgcg gaagcagcgg 2520 accttcgaca acggcagcat cccccaccag atccacctgg gagagctgca cgccattctg 2580 cggcggcagg aagattttta cccattcctg aaggacaacc gggaaaagat cgagaagatc 2640 ctgaccttcc gcatccccta ctacgtgggc cctctggcca ggggaaacag cagattcgcc 2700 tggatgacca gaaagagcga ggaaaccatc accccctgga acttcgagga agtggtggac 2760 aagggcgctt ccgcccagag cttcatcgag cggatgacca acttcgataa gaacctgccc 2820 aacgagaagg tgctgcccaa gcacagcctg ctgtacgagt acttcaccgt gtataacgag 2880 ctgaccaaag tgaaatacgt gaccgaggga atgagaaagc ccgccttcct gagcggcgag 2940 cagaaaaagg ccatcgtgga cctgctgttc aagaccaacc ggaaagtgac cgtgaagcag 3000 ctgaaagagg actacttcaa gaaaatcgag tgcttcgact ccgtggaaat ctccggcgtg 3060 gaagatcggt tcaacgcctc cctgggcaca taccacgatc tgctgaaaat tatcaaggac 3120 aaggacttcc tggacaatga ggaaaacgag gacattctgg aagatatcgt gctgaccctg 3180 acactgtttg aggacagaga gatgatcgag 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ctgatcatca agctgcctaa gtactccctg 4920 ttcgagctgg aaaacggccg gaagagaatg ctggcctctg ccggcgaact gcagaaggga 4980 aacgaactgg ccctgccctc caaatatgtg aacttcctgt acctggccag ccactatgag 5040 aagctgaagg gctcccccga ggataatgag cagaaacagc tgtttgtgga acagcacaag 5100 cactacctgg acgagatcat cgagcagatc agcgagttct ccaagagagt gatcctggcc 5160 gacgctaatc tggacaaagt gctgtccgcc tacaacaagc accgggataa gcccatcaga 5220 gagcaggccg agaatatcat ccacctgttt accctgacca atctgggagc ccctgccgcc 5280 ttcaagtact ttgacaccac catcgaccgg aagaggtaca ccagcaccaa agaggtgctg 5340 gacgccaccc tgatccacca gagcatcacc ggcctgtacg agacacggat cgacctgtct 5400 cagctgggag gcgacagccc caagaagaag agaaaggtgg aggccagcta agaattccta 5460 gagctcgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct 5520 cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg 5580 aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc 5640 aggacagcaa gggggaggat tgggaagaga atagcaggca tgctggggag cggccgcagg 5700 aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg 5760 ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag 5820 cgcgcagctg cctgcagggg cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta 5880 tttcacaccg catacgtcaa agcaaccata gtacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc 5940 ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc 6000 tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct 6060 aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa 6120 acttgatttg ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc 6180 tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact 6240 caaccctatc tcgggctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg 6300 gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgtt 6360 tacaatttta tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc 6420 ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc 6480 ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc 6540 accgaaacgc gcgagacgaa agggcctcgt 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Claims (42)

  1. CDK1, TOP2A, CENPA, BIRC5 및 EEF2로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 내인성 유전자의 유전적 변형을 포함하는, 단리되고 유전적으로 변형된 동물 세포로서, 상기 유전적 변형은:
    a) 음성 선택 마커 및 적어도 하나의 상기 유전자가 공동 발현되도록, 적어도 하나의 상기 유전자를 인코딩하는 DNA 서열에 전사적으로 연결된 음성 선택 마커를 인코딩하는 DNA 서열; 및
    b) 적어도 하나의 상기 유전자에 작동 가능하게 연결된 외인성 유도성 전사 활성인자
    중 하나 이상을 포함하는, 단리되고 유전적으로 변형된 동물 세포.
  2. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 상기 유전자의 유전적 변형이:
    a) 음성 선택 마커를 포함하는 DNA 벡터;
    b) 외인성 유도성 전사 활성인자를 포함하는 DNA 벡터; 및
    c) 음성 선택 마커 및 외인성 유도성 전사 활성인자를 포함하는 DNA 벡터
    중 하나 이상에 의해 적어도 하나의 상기 유전자의 표적화된 변형을 수행하는 것에 의해 생성된 것인, 단리되고 유전적으로 변형된 동물 세포.
  3. 제1항에 있어서, 음성 선택 마커를 포함하는 적어도 하나의 상기 유전자의 유전적 변형은 동형접합성, 이형접합성, 반접합성 또는 복합 이형접합성 유전적 변형이고/이거나, 외인성 유도성 전사 활성인자를 포함하는 적어도 하나의 상기 유전자의 유전적 변형은 외인성 유도성 전사 활성인자를 포함하는 대립유전자만 적어도 하나의 상기 유전자를 발현할 수 있도록 보장하는 것인, 단리되고 유전적으로 변형된 동물 세포.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 내인성 유전자 중 2개 이상은 유전적 변형을 포함하는 것인, 단리되고 유전적으로 변형된 동물 세포.
  5. 제4항에 있어서, 2개 이상의 내인성 유전자는 CDK1 및 TOP2A 또는 CDK1 및 EEF2인, 단리되고 유전적으로 변형된 동물 세포.
  6. 제1항에 있어서,
    a) 음성 선택 마커는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제, 시토신 데아미나제, 카르복실 에스테라제 또는 iCasp9를 포함하거나; 또는
    b) 외인성 유도성 전사 활성인자는 유도인자와 함께 시스템을 형성하고, 상기 시스템은 독시사이클린 유도성 시스템(doxycycline inducible system), 큐메이트 스위치 유도성 시스템(cumate switch inducible system), 엑디손 유도성 시스템(ecdysone inducible system), 전파 유도성 시스템(radio wave inducible system) 또는 리간드 가역성 이량체화 시스템(ligand reversible dimerization system)인, 단리되고 유전적으로 변형된 동물 세포.
  7. 제6항에 있어서,
    a) 음성 선택 마커는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제를 포함하거나;
    b) 시스템은 독시사이클린 유도성 시스템인, 단리되고 유전적으로 변형된 동물 세포.
  8. 제7항에 있어서, 유전자는 CDK1인, 단리되고 유전적으로 변형된 동물 세포.
  9. 제7항에 있어서, 유전자는 CDK1 및 TOP2A인, 단리되고 유전적으로 변형된 동물 세포.
  10. 제1항에 있어서,
    a) 동물 세포는 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그, 고양이, 개, 암소, 말, 사슴, 엘크, 들소, 소, 낙타, 라마, 토끼, 돼지, 염소, 양 및 비인간 영장류 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 포유류 세포 또는 조류 세포이고/이거나;
    b) 동물 세포는 만능성 줄기세포, 다능성 세포 또는 단능성 전구세포이거나, 이들 세포로부터 유래되거나, 또는 최종 분화된 세포인, 단리되고 유전적으로 변형된 동물 세포.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 유전적으로 변형된 동물 세포를 포함하는 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 조성물.
  13. 제1항의 단리되고 유전적으로 변형된 동물 세포의 증식을 제어하는 방법으로서,
    a) 음성 선택 마커를 포함하는 단리되고 유전적으로 변형된 동물 세포를, 상기 음성 선택 마커의 유도인자와 접촉시켜 세포의 증식을 제어하거나; 또는
    b) 외인성 유도성 전사 활성인자를 포함하는 단리되고 유전적으로 변형된 동물 세포를, 상기 외인성 유도성 전사 활성인자의 유도인자와 접촉시켜 세포의 증식을 제어하는 것
    을 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    a) 음성 선택 마커를 포함하는 단리되고 유전적으로 변형된 동물 세포의 증식을 제어하는 것이
    i) 세포를 상기 음성 선택 마커의 유도인자의 부재 하에 유지시킴으로써, 상기 세포의 증식을 허용하거나; 또는
    ii) 상기 세포를 상기 음성 선택 마커의 유도인자에 노출시킴으로써, 상기 세포의 증식을 어블레이션 또는 억제하는 것
    중 하나 이상을 포함하거나; 또는
    b) 외인성 유도성 전사 활성인자를 포함하는 단리되고 유전적으로 변형된 동물 세포의 증식을 제어하는 것이
    i) 상기 세포를 상기 외인성 유도성 전사 활성인자의 유도인자에 노출시킴으로써, 상기 세포의 증식을 허용하거나; 또는
    ii) 상기 세포를 상기 외인성 유도성 전사 활성인자의 유도인자의 부재 하에 유지시킴으로써, 상기 세포의 증식을 방지 또는 억제하는 것
    중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 적어도 하나의 상기 유전자의 유전적 변형이:
    a) 음성 선택 마커를 포함하는 DNA 벡터;
    b) 외인성 유도성 전사 활성인자를 포함하는 DNA 벡터; 및
    c) 음성 선택 마커 및 외인성 유도성 전사 활성인자를 포함하는 DNA 벡터
    중 하나 이상에 의해 적어도 하나의 상기 유전자의 표적화된 변형을 수행하는 것에 의해 생성된 것인 방법.
  16. 제13항에 있어서, 음성 선택 마커를 포함하는 적어도 하나의 상기 유전자의 유전적 변형은 동형접합성, 이형접합성, 반접합성 또는 복합 이형접합성 유전적 변형이고/이거나, 외인성 유도성 전사 활성인자를 포함하는 적어도 하나의 상기 유전자의 유전적 변형은 외인성 유도성 전사 활성인자를 포함하는 대립유전자만 적어도 하나의 상기 유전자를 발현할 수 있도록 보장하는 것인 방법.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 내인성 유전자 중 2개 이상은 유전적 변형을 포함하는 것인, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 2개 이상의 내인성 유전자는 CDK1 및 TOP2A 또는 CDK1 및 EEF2인, 방법.
  19. 제13항에 있어서,
    a) 음성 선택 마커는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제, 시토신 데아미나제, 카르복실 에스테라제 또는 iCasp9를 포함하거나; 또는
    b) 외인성 유도성 전사 활성인자는 유도인자와 함께 시스템을 형성하고, 상기 시스템은 독시사이클린 유도성 시스템, 큐메이트 스위치 유도성 시스템, 엑디손 유도성 시스템, 전파 유도성 시스템 또는 리간드 가역성 이량체화 시스템인 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    a) 음성 선택 마커는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제를 포함하거나;
    b) 시스템은 독시사이클린 유도성 시스템인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 유전자는 CDK1인 방법.
  22. 제20항에 있어서, 유전자는 CDK1 및 TOP2A인 방법.
  23. 제19항에 있어서,
    i) 음성 선택 마커는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제를 포함하고, 유도인자는 간사이클로비르를 포함하거나;
    ii) 음성 선택 마커는 시토신 데아미나제를 포함하고, 유도인자는 5-플루오로시토신을 포함하거나;
    iii) 음성 선택 마커는 카르복실 에스테라제를 포함하고, 유도인자는 이리노테칸을 포함하거나; 또는
    iv) 음성 선택 마커는 iCasp9를 포함하고, 유도인자는 AP1903을 포함하는 것인 방법.
  24. 제13항에 있어서,
    a) 동물 세포는 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그, 고양이, 개, 암소, 말, 사슴, 엘크, 들소, 소, 낙타, 라마, 토끼, 돼지, 염소, 양 및 비인간 영장류 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 포유류 세포 또는 조류 세포이고/이거나;
    b) 동물 세포는 만능성 줄기세포, 다능성 세포 또는 단능성 전구세포이거나, 이들 세포로부터 유래되거나, 또는 최종 분화된 세포인 방법.
  25. 제13항 내지 제24항 중 어느 한 항의 방법에 따라 동물 세포 집단의 증식을 제어하는 방법.
  26. 유전적으로 변형된 동물 세포를 제조하는 방법으로서,
    a) 동물 세포에서 음성 선택 마커를 인코딩하는 DNA 서열을, CDK1, TOP2A, CENPA, BIRC5 및 EEF2로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 내인성 유전자의 좌위에 삽입함으로써, 음성 선택 마커를 인코딩하는 DNA 서열이 적어도 하나의 상기 내인성 유전자를 인코딩하는 DNA 서열에 전사적으로 연결되도록 함으로써, 음성 선택 마커 및 적어도 하나의 상기 유전자가 공동 발현되도록 하고/하거나;
    b) 동물 세포에서 외인성 유도성 전사 활성인자를 인코딩하는 DNA 서열을, CDK1, TOP2A, CENPA, BIRC5 및 EEF2로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 내인성 유전자의 좌위에 삽입함으로써, 외인성 유도성 전사 활성인자를 인코딩하는 DNA 서열이 적어도 하나의 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되도록 하는 것
    을 포함하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 적어도 하나의 상기 유전자의 유전적 변형이:
    a) 음성 선택 마커를 포함하는 DNA 벡터;
    b) 외인성 유도성 전사 활성인자를 포함하는 DNA 벡터; 및
    c) 음성 선택 마커 및 외인성 유도성 전사 활성인자를 포함하는 DNA 벡터
    중 하나 이상에 의해 적어도 하나의 상기 유전자의 표적화된 변형을 수행하는 것을 포함하는 것인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 음성 선택 마커를 포함하는 적어도 하나의 상기 유전자의 유전적 변형은 동형접합성, 이형접합성, 반접합성 또는 복합 이형접합성 유전적 변형이고/이거나, 외인성 유도성 전사 활성인자를 포함하는 적어도 하나의 상기 유전자의 유전적 변형은 외인성 유도성 전사 활성인자를 포함하는 대립유전자만 적어도 하나의 상기 유전자를 발현할 수 있도록 보장하는 것인 방법.
  29. 제26항에 있어서,
    상기 내인성 유전자 중 2개 이상은 유전적 변형을 포함하는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 2개 이상의 내인성 유전자는 CDK1 및 TOP2A 또는 CDK1 및 EEF2인 방법.
  31. 제26항에 있어서,
    a) 음성 선택 마커는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제, 시토신 데아미나제, 카르복실 에스테라제 또는 iCasp9를 포함하거나; 또는
    b) 외인성 유도성 전사 활성인자는 유도인자와 함께 시스템을 형성하고, 상기 시스템은 독시사이클린 유도성 시스템, 큐메이트 스위치 유도성 시스템, 엑디손 유도성 시스템, 전파 유도성 시스템 또는 리간드 가역성 이량체화 시스템인 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    a) 음성 선택 마커는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제를 포함하거나;
    b) 시스템은 독시사이클린 유도성 시스템인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 유전자는 CDK1인 방법.
  34. 제32항에 있어서, 유전자는 CDK1 및 TOP2A인 방법.
  35. 제26항에 있어서,
    a) 동물 세포는 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그, 고양이, 개, 암소, 말, 사슴, 엘크, 들소, 소, 낙타, 라마, 토끼, 돼지, 염소, 양 및 비인간 영장류 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 포유류 세포 또는 조류 세포이고/이거나;
    b) 동물 세포는 만능성 줄기세포, 다능성 세포 또는 단능성 전구세포이거나, 이들 세포로부터 유래되거나, 또는 최종 분화된 세포인 방법.
  36. 동물 세포에서 CDK1, TOP2A, CENPA, BIRC5 및 EEF2로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 내인성 유전자를 변형시키기 위한 DNA 벡터로서,
    a) 음성 선택 마커를 인코딩하는 DNA 서열의 세포 혼입 시에, 음성 선택 마커를 인코딩하는 DNA 서열이 상기 내인성 유전자를 인코딩하는 DNA 서열에 전사적으로 연결되고, 음성 선택 마커가 내인성 유전자와 공동 발현되도록 하는, 상기 내인성 유전자를 유전적으로 변형시키기 위한 음성 선택 마커를 인코딩하는 DNA 서열;
    b) 외인성 유도성 전사 활성인자를 인코딩하는 DNA 서열의 세포 혼입 시에, 외인성 유도성 전사 활성인자를 인코딩하는 DNA 서열이 상기 내인성 유전자에 작동 가능하게 연결되도록 하는, 상기 내인성 유전자를 유전적으로 변형시키기 위한 외인성 유도성 전사 활성인자를 인코딩하는 DNA 서열; 또는
    c) 음성 선택 마커를 인코딩하는 DNA 서열의 세포 혼입 시에, 음성 선택 마커를 인코딩하는 DNA 서열이 상기 내인성 유전자를 인코딩하는 DNA 서열에 전사적으로 연결되고, 음성 선택 마커가 내인성 유전자와 공동 발현되도록 하는, 상기 내인성 유전자를 유전적으로 변형시키기 위한 음성 선택 마커를 인코딩하는 DNA 서열; 및
    외인성 유도성 전사 활성인자를 인코딩하는 DNA 서열의 세포 혼입 시에, 외인성 유도성 전사 활성인자를 인코딩하는 DNA 서열이 내인성 유전자에 작동 가능하게 연결되도록 하는, 상기 내인성 유전자를 유전적으로 변형시키기 위한 외인성 유도성 전사 활성인자를 인코딩하는 DNA 서열
    을 포함하는 DNA 벡터.
  37. 제36항에 있어서,
    a) 음성 선택 마커는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제, 시토신 데아미나제, 카르복실 에스테라제 또는 iCasp9를 포함하거나; 또는
    b) 외인성 유도성 전사 활성인자는 유도인자와 함께 시스템을 형성하고, 상기 시스템은 독시사이클린 유도성 시스템, 큐메이트 스위치 유도성 시스템, 엑디손 유도성 시스템, 전파 유도성 시스템 또는 리간드 가역성 이량체화 시스템인 DNA 벡터.
  38. 제37항에 있어서,
    a) 음성 선택 마커는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제를 포함하거나;
    b) 시스템은 독시사이클린 유도성 시스템인 DNA 벡터.
  39. 제38항에 있어서, 유전자는 CDK1인 DNA 벡터.
  40. 제36항에 있어서,
    a) 음성 선택 마커를 포함하는 DNA 서열의 하나 이상의 숙주 세포로의 혼입은, 음성 선택 마커의 유도인자에 대한 숙주 세포의 노출 시에 증식하는 숙주 세포의 사멸을 촉진하거나; 또는
    b) 외인성 유도성 전사 활성인자를 포함하는 DNA 서열의 하나 이상의 숙주 세포로의 혼입은, 외인성 유도성 전사 활성인자의 유도인자에 대한 숙주 세포의 노출 시에 숙주 세포의 증식을 촉진 또는 허용하는 것인 DNA 벡터.
  41. 그 발현이 세포 생존력 또는 세포 증식에 필요한 동물 세포의 적어도 하나의 유전자를 유전적으로 변형시켜 유전적으로 변형된 동물 세포의 증식을 제어하기 위한 키트로서,
    제36항 내지 제40항 중 어느 한 항의 DNA 벡터 및
    상기 DNA 벡터 중 하나 이상을 사용한, 동물 세포에서의 상기 내인성 유전자의 표적화된 변형을 위한 지침서
    를 포함하는 키트.
  42. 삭제
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