JP2019193676A

JP2019193676A - 細胞免疫療法のための方法および組成物

Info

Publication number: JP2019193676A
Application number: JP2019149318A
Authority: JP
Inventors: ジェンセンマイケル; Jensen Michael; アール．リデルスタンリー; R Riddell Stanley; フデチェクミヒャエル; Hudecek Michael
Original assignee: Fred Hutchinson Cancer Research Center; Seattle Childrens Hospital
Current assignee: Seattle Childrens Hospital; Fred Hutchinson Cancer Center
Priority date: 2012-08-20
Filing date: 2019-08-16
Publication date: 2019-11-07
Anticipated expiration: 2033-08-20
Also published as: IL293944A; SG10201701339RA; AU2018204209A1; SG11201501259QA; US20210052649A1; KR102362240B1; US20180200298A1; MX2020012742A; MX2015002101A; AU2013305838A1; KR102135239B1; NZ745372A; JP6997744B2; PH12015500325A1; JP2022033775A; EP2884999A1; US10780118B2; BR122020002988A8; SI2884999T1; AU2021200249A1

Abstract

【課題】キメラ受容体を発現させるように遺伝子改変された、ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞またはセントラルメモリーＴ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞の組合せを養子移入することなどにより、細胞免疫療法により媒介される免疫応答を付与し、そして／またはこれを増進させる核酸、ベクター、宿主細胞、方法、および組成物を提供すること。【解決手段】実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、カスタマイズされたスペーサー領域を含むポリヌクレオチド、膜貫通ドメインを含むポリヌクレオチド、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリヌクレオチドを含む核酸を含む。驚くべきことに、スペーサー領域の長さが、ｉｎｖｉｔｒｏで標的細胞を認識するキメラ受容体改変Ｔ細胞の能力に影響を及ぼし、キメラ受容体改変Ｔ細胞のｉｎｖｉｖｏにおける有効性に影響を及ぼしうることが見出された。【選択図】なし

Description

本出願は、国際特許出願として２０１３年８月２０日に出願されており、２０１２年８月２０日に出願された米国特許出願第６１／６９１，１１７号の優先権の利益を請求し、本開示は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

本発明は、生物医学の分野および具体的にはがん治療に有用な方法に関する。特に、本発明の実施形態は、腫瘍ターゲティング受容体により改変されたＴ細胞を含む細胞免疫療法を実施するための方法および組成物に関する。

連邦政府による支援研究に関する言明
本発明は、米国保健福祉省およびＬｅｕｋｅｍｉａａｎｄＬｙｍｐｈｏｍａＳｏｃｉｅｔｙからの助成金の形態の政府援助により行った。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。

遺伝子導入により、腫瘍細胞上の発現する表面分子に特異的なキメラ抗原受容体（キメラ受容体）を発現させるように操作されたヒトＴリンパ球の養子移入は、進行した悪性腫瘍を有効に処置する潜在的可能性を有する。キメラ受容体とは、細胞外リガンド結合ドメインを含む合成受容体、最も一般には、細胞内シグナル伝達構成成分へと連結されたモノクローナル抗体の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、最も一般には、単独であるかまたは１つもしくは複数の共刺激ドメインと組み合わせたＣＤ３ζである。キメラ受容体のデザインにおける研究の大半は、不可欠な正常組織に対する重篤な毒性を引き起こさずに、悪性細胞をターゲティングするｓｃＦｖおよび他のリガンド結合エレメントを規定すること、ならびにＴ細胞エフェクター機能を活性化させる細胞内シグナル伝達モジュールの最適な組成を規定することに焦点を当てている。しかし、優れたｉｎｖｉｔｒｏ機能を媒介するキメラ受容体のデザインの変異が、キメラ受容体により改変されたＴ細胞の臨床適用におけるｉｎｖｉｖｏの治療活性の改善へと再現可能に転換されるのかどうかは不確実である。

治療活性に重要なキメラ受容体のデザインのエレメント、ならびに遺伝子改変し、養子移入するための細胞集団であって、ｉｎｖｉｖｏにおける生存の増強および有効性をもたらす細胞集団を決定するための方法を同定することが必要とされている。

一態様では、本開示は、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞の腫瘍特異的な遺伝子改変サブセットを、単独または組合せで養子移入することなどにより、細胞免疫療法により媒介される免疫応答を付与し、かつ／またはこれを増進させる方法および組成物に関する。本開示は、キメラ受容体核酸、ならびにこのような核酸を含むベクターおよび宿主細胞を提示する。キメラ受容体をコードする核酸配列は、Ｔ細胞を効率的に活性化させ、特異的標的分子または標的分子上のエピトープを認識するためのキメラ受容体をカスタマイズするために、切り出し、他の構成成分で置きかえうる多数のモジュラー構成成分を一体に連結する。

実施形態では、キメラ受容体核酸は、リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドであって、リガンドが、悪性細胞上または感染細胞上で発現する分子であるポリヌクレオチドと、約２００アミノ酸以下であるポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチドと、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドと、細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドとを含む。実施形態では、ポリペプチドスペーサーは、ＩｇＦｃのＣＨ２およびＣＨ３の配列またはＣＨ３だけの配列を含むがこれらに限定されない他のアミノ酸配列へと連結されうるアミノ酸配列Ｘ_１ＰＰＸ_２Ｐを含有する改変ＩｇＧ４ヒンジ領域を含む。驚くべきことに、シグナル伝達能を有さないと仮定されているスペーサー領域の長さは、キメラ受容体を発現させるように改変されたＴ細胞のｉｎｖｉｖｏにおける有効性に影響を及ぼし、最適な腫瘍細胞または標的細胞の認識のために、個別の標的分子に応じてカスタマイズする必要があることが見出された。

本開示の別の態様は、リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドであって、リガンドが、腫瘍特異的抗原、ウイルス抗原、またはリンパ球による認識および除去を媒介するのに適する、標的細胞集団上で発現する任意の他の分子であるポリヌクレオチドと、各ターゲティングされるリガンドに特異的な、カスタマイズされた長さのポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチドであって、スペーサーが、基準キメラ受容体と比較したＴ細胞増殖および／またはサイトカイン産生の増強をもたらすポリヌクレオチドと、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドと、１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドとを含む単離キメラ受容体核酸を提示する。実施形態では、標的リガンド上のエピトープが、膜近位にある場合は、長鎖スペーサーを援用し、標的リガンド上のエピトープが、膜遠位にある場合は、短鎖スペーサーを援用する。本開示は、本明細書で記載される単離キメラ受容体を含む発現ベクターおよび宿主細胞を含む。

本開示の別の態様は、リガンドが、腫瘍特異的抗原、ウイルス抗原、または標的細胞集団上で発現し、リンパ球による認識および除去を媒介するようにターゲティングされうる任意の他の分子である、リガンド結合ドメインと、約１０〜２２９アミノ酸であるポリペプチドスペーサーと、膜貫通ドメインと、１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ受容体ポリペプチドを提示する。実施形態では、ポリペプチドスペーサーは、アミノ酸配列Ｘ_１ＰＰＸ_２Ｐを含有する改変ＩｇＧヒンジ領域を含む。

別の態様では、本開示は、腫瘍特異的でサブセット特異的な遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を養子移入することなどにより、細胞免疫療法により媒介される免疫応答を付与し、かつ／またはこれを増進させる組成物であって、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、抗腫瘍反応性を維持し、腫瘍特異的増殖を増大させ、かつ／または最大化するＣＤ８＋Ｔ細胞の能力を付与し、かつ／またはこれを増進させる組成物を提示する。実施形態では、ＣＤ４＋細胞は、本明細書で記載されるキメラ受容体核酸および／またはキメラ受容体ポリペプチドを発現させるように遺伝子改変されている。

別の態様では、本開示は、腫瘍特異的でサブセット特異的な遺伝子改変ＣＤ８＋Ｔ細胞を養子移入することなどにより、細胞免疫療法により媒介される免疫応答を付与し、かつ／またはこれを増進させる組成物を提示する。実施形態では、ＣＤ８＋細胞は、本明細書で記載されるキメラ受容体核酸および／またはキメラ受容体ポリペプチドを発現させる。

別の実施形態では、本発明は、免疫応答を付与し、かつ／もしくはこれを増進させる遺伝子改変ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物であって、疾患もしくは障害と関連するリガンドに対するリガンド結合ドメイン、カスタマイズされたスペーサー領域、膜貫通ドメイン、および共刺激ドメインなど、Ｔ細胞もしくは他の受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体を発現させるＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物、ならびに／または遺伝子改変ヘルパーＴリンパ球細胞調製物であって、疾患もしくは障害と関連するリガンドに特異的な抗体可変ドメイン、カスタマイズされたスペーサー領域、膜貫通ドメイン、および１つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体を発現させるＣＤ４＋Ｔ細胞を有するヘルパーＴリンパ球細胞調製物を有する養子細胞免疫療法組成物を提供する。

一実施形態では、本発明は、細胞性免疫応答をもたらす遺伝子改変細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物を被験体へと投与することにより、疾患または障害を有する被験体において、細胞免疫療法を実施する方法であって、細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物が、リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドであって、リガンドが、腫瘍特異的抗原、ウイルス抗原、またはリンパ球による認識および除去を媒介するのに適する標的細胞集団上で発現する任意の他の分子であるポリヌクレオチドと、各ターゲティングされるリガンドに特異的な、カスタマイズされた長さのポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチドであって、スペーサーが、基準キメラ受容体と比較したＴ細胞増殖および／またはサイトカイン産生の増強をもたらすポリヌクレオチドと、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドと、１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドとを含むキメラ受容体を有するＣＤ８＋Ｔ細胞を含む方法を提供する。実施形態では、リガンド結合ドメインは、疾患または障害と関連するリガンドに特異的な細胞外抗体可変ドメインである。実施形態は、遺伝子改変ヘルパーＴリンパ球細胞調製物を含み、ヘルパーＴリンパ球細胞調製物が、リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドであって、リガンドが、腫瘍特異的抗原、ウイルス抗原、またはリンパ球による認識および除去を媒介するのに適する、標的細胞集団上で発現する任意の他の分子であるポリヌクレオチドと、各ターゲティングされるリガンドに特異的な、カスタマイズされた長さのポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチドであって、スペーサーが、基準キメラ受容体と比較したＴ細胞増殖および／またはサイトカイン産生の増強をもたらすポリヌクレオチドと、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドと、１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドとを含むキメラ受容体を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。実施形態では、遺伝子改変ＣＤ８＋細胞集団および遺伝子改変ＣＤ４＋細胞集団を、共投与する。実施形態では、Ｔ細胞は、自家Ｔ細胞または同種Ｔ細胞である。

上記の方法の多様な改変が可能である。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞が発現させるキメラ受容体は、同じ場合もあり、異なる場合もある。

別の態様では、本発明は、細胞性免疫応答を誘発し、抗原反応性キメラ受容体を発現させる、キメラ受容体により改変された腫瘍特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物であって、リガンドが、腫瘍特異的抗原、ウイルス抗原、もしくはリンパ球による認識および除去を媒介するのに適する、標的細胞集団上で発現する任意の他の分子であるリガンド結合ドメインと、各ターゲティングされるリガンドに特異的な、カスタマイズされた長さのポリペプチドスペーサーであって、基準キメラ受容体と比較したＴ細胞増殖および／もしくはサイトカイン産生の増強をもたらすスペーサーと、膜貫通ドメインと、１つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ受容体を有するＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、改変された細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物を得；かつ／または改変されたナイーブＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞もしくはメモリーＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞であって、リガンドが、腫瘍特異的抗原、ウイルス抗原、もしくはリンパ球による認識および除去を媒介するのに適する、標的細胞集団上で発現する任意の他の分子であるリガンド結合ドメインと、各ターゲティングされるリガンドに特異的な、カスタマイズされた長さのポリペプチドスペーサーであって、基準キメラ受容体と比較したＴ細胞増殖および／もしくはサイトカイン産生の増強をもたらすスペーサーと、膜貫通ドメインと、１つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ受容体を有するＣＤ４＋細胞を含む、改変されたヘルパーＴリンパ球細胞調製物を得ることにより、養子免疫療法組成物を製造する方法を提供する。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
ａ）リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドであって、該リガンド結合ドメインがリガンドに結合し、該リガンドが、腫瘍特異的分子、ウイルス分子、またはリンパ球による認識および除去を媒介するのに適する、標的細胞集団上で発現する任意の他の分子である、ポリヌクレオチドと、
ｂ）該リガンドに特異的な長さのポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチドであって、該スペーサーが、該リガンドに応答して、基準キメラ受容体と比較したＴ細胞増殖および／またはサイトカイン産生の増大をもたらす、ポリヌクレオチドと、
ｃ）膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドと、
ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドと
を含む、キメラ受容体核酸。
（項目２）
前記リガンド結合ドメインが、抗体断片である、項目１に記載のキメラ受容体核酸。
（項目３）
前記リガンド結合ドメインが、単鎖可変断片である、項目２に記載のキメラ受容体核酸。
（項目４）
前記腫瘍特異的分子が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ１２３、ＣＳ−１、ＲＯＲ１、メソテリン、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２、ＧＤ−２、ＭＡＧＥＡ３ＴＣＲ、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目１から３のいずれか一項に記載のキメラ受容体核酸。
（項目５）
前記スペーサーが、Ｘ_１ＰＰＸ_２Ｐのアミノ酸配列を含む、項目１から４のいずれか一項に記載のキメラ受容体核酸。
（項目６）
前記スペーサー領域が、ヒト抗体のヒンジ領域の一部分を含む、項目５に記載のキメラ受容体核酸。
（項目７）
前記スペーサー領域が、ヒンジ領域ならびにＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組合せからなる群から選択されるヒト抗体のＦｃドメインのうちの少なくとも１つの他の部分を含む、項目５に記載のキメラ受容体核酸。
（項目８）
前記スペーサー領域が、１２アミノ酸以下、１１９アミノ酸以下、および２２９アミノ酸以下からなる群から選択される長さである、項目１から７のいずれか一項に記載のキメラ受容体核酸。
（項目９）
前記リガンド結合ドメインが、ＲＯＲ１上でリガンドに結合し、前記スペーサー領域が、配列番号４および配列番号４９（ヒンジ−ＣＨ３）からなる群から選択される、項目５に記載のキメラ受容体核酸。
（項目１０）
前記リンパ球活性化ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ−４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、およびこれらの組合せからなる群から選択される共刺激ドメインと組み合わせたＣＤ３ゼータの全部または一部分を含む、項目１から９のいずれか一項に記載のキメラ受容体核酸。
（項目１１）
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータの一部分および４−１ＢＢの一部分、ＣＤ２８の一部分、または両方を含む、項目１０に記載のキメラ受容体核酸。
（項目１２）
前記リガンド結合ドメインが、ＲＯＲ１に結合し、前記スペーサー領域が、１２アミノ酸以下であり、配列番号４の配列を有する、項目４から１１のいずれか一項に記載のキメラ受容体核酸。
（項目１３）
前記リガンド結合ドメインが、ＲＯＲ１に結合し、前記スペーサー領域が、配列番号５０の配列を有する、項目４から１１のいずれか一項に記載のキメラ受容体核酸。
（項目１４）
前記リガンド結合ドメインが、ＣＤ１９に結合し、前記スペーサー領域が、１２アミノ酸以下であり、配列番号４の配列を有する、項目４から１１のいずれか一項に記載のキメラ受容体核酸。
（項目１５）
前記リガンド結合ドメインが、Ｈｅｒ２に結合し、前記スペーサー領域が、配列番号５０の配列を有する、項目４から１１のいずれか一項に記載のキメラ受容体核酸。
（項目１６）
マーカー配列をコードする核酸をさらに含む、項目１から１５のいずれか一項に記載のキメラ受容体核酸。
（項目１７）
項目１から１６のいずれか一項に記載のキメラ受容体核酸によりコードされるキメラ受容体ポリペプチド。
（項目１８）
項目１から１６のいずれか一項に記載の単離キメラ受容体核酸を含む発現ベクター。
（項目１９）
項目１から１６のいずれか一項に記載の核酸または項目１８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目２０）
ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、およびバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞である、項目１９に記載の宿主細胞。
（項目２１）
前記ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞が、セントラルメモリーＴ細胞であり、前記セントラルメモリーＴ細胞が、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、およびＣＤ８＋について陽性である、項目２０に記載の宿主細胞。
（項目２２）
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、およびバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択されるＣＤ４＋ヘルパーＴリンパ球細胞である、項目１９に記載の宿主細胞。
（項目２３）
前記ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球細胞が、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞であり、前記ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、およびＣＤ４＋について陽性であり、ＣＤ４５ＲＯについて陰性である、項目２２に記載の宿主細胞。
（項目２４）
薬学的に許容される賦形剤中に項目１９から２３のいずれか一項に記載の宿主細胞を含む組成物。
（項目２５）
項目２０または２１に記載の宿主細胞および項目２３または３４に記載の宿主細胞を含む、項目２４に記載の組成物。
（項目２６）
項目１９から２３のいずれか一項に記載の宿主細胞を調製するためのｉｎｖｉｔｒｏの方法であって、
ａ）項目１から１６または１８のいずれか一項に記載のキメラ受容体をコードする核酸のライブラリーを提供するステップであって、該複数の核酸の各々が、長さが異なるキメラ受容体をコードする、ステップと、
ｂ）該複数の核酸の各々を、別々の単離Ｔリンパ球集団へと導入し、各Ｔリンパ球集団をｉｎｖｉｔｒｏで増やすステップと、
ｃ）各遺伝子改変Ｔリンパ球集団を、腫瘍を保有する動物モデルへと投与し、遺伝子改変Ｔリンパ球集団が、抗腫瘍有効性を有するのかどうかを決定するステップと、
ｄ）ｉｎｖｉｔｒｏおよび／または動物モデルにおいて抗腫瘍有効性をもたらす該キメラ受容体をコードする核酸を選択するステップと
を含む方法。
（項目２７）
前記キメラ受容体をコードする選択された核酸を、宿主細胞へと導入するステップをさらに含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
項目１９から２３のいずれか一項に記載の宿主細胞を調製するためのｉｎｖｉｔｒｏの方法であって、
ａ）項目１から１６のいずれか一項に記載の核酸または項目１８に記載の発現ベクターを、ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ４５ＲＯ＋、およびＣＤ６２Ｌ＋の表現型を有するリンパ球集団へと導入するステップと、
ｂ）抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８、ならびに少なくとも１つのホメオスタシスサイトカインの存在下で、該細胞が、細胞注入としての使用のために十分に増えるまで、該細胞を培養するステップと
を含む方法。
（項目２９）
前記リンパ球が、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋である、項目２６から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
がんまたはウイルス感染の処置における、項目１９から２３のいずれか一項に記載の宿主細胞または項目２４から２５に記載の組成物の使用。
（項目３１）
前記がんが、固形腫瘍または血液悪性腫瘍である、項目３０に記載の使用。
（項目３２）
前記固形腫瘍が、乳がん、肺がん、結腸がん、腎臓がん、膵臓がん、前立腺がん、および卵巣がんからなる群から選択される、項目３１に記載の使用。
（項目３３）
がんまたはウイルス感染を有する被験体において細胞免疫療法を実施する方法であって、項目２４から２５のいずれか一項に記載の組成物または項目１９から２３に記載の宿主細胞を前記被験体へと投与するステップを含む方法。
（項目３４）
前記がんが、固形腫瘍または血液悪性腫瘍から選択される、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記固形腫瘍が、乳がん、肺がん、結腸がん、腎臓がん、膵臓がん、前立腺がん、および卵巣がんからなる群から選択される、項目３４に記載の方法。

本発明のこれらの実施形態および他の実施形態については、付属の明細書、図面、および特許請求の範囲においてさらに記載する。

図１は、スペーサー配列のライブラリーを示す図である。本発明者らは、ＩｇＧ４ヒンジ単独、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインへと連結されたＩｇＧ４ヒンジ、またはＣＨ３ドメインへと連結されたＩｇＧ４ヒンジを含む細胞外の構成成分をコードする、コドンを最適化したＤＮＡ配列を含有するプラスミドライブラリーを構築した。任意のｓｃＦＶ配列（ＶＨおよびＶＬ）を、可変スペーサードメインのこのライブラリーをコードする配列に対して５’側にクローニングすることができる。スペーサードメインは、結果としてＣＤ２８膜貫通ドメインおよびＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインならびにＣＤ３ゼータへと連結される。ベクター内のＴ２Ａ配列は、キメラ受容体を、切断型ヒト上皮成長因子受容体（ｔＥＧＦＲ）をコードする選択マーカーから隔てる。

図２は、スペーサー長を改変した２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体を発現させるように改変されたＴ細胞のｉｎｖｉｔｒｏにおける細胞傷害作用、これらによるサイトカイン産生、およびこれらの増殖を示す図である。（Ａ）精製ＣＤ８^＋Ｔ_ＣＭに由来する細胞系であって、長鎖スペーサードメインを伴う２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体、中間鎖スペーサードメインを伴う２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体、および短鎖スペーサードメインを伴う２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体の各々により改変された細胞系の表現型を示す図である。２Ａ２ｓｃＦＶ内のエピトープに結合する抗Ｆ（ａｂ）抗体による染色は、全長スペーサーを伴うＲＯＲ１キメラ受容体または切断型スペーサーを伴うＲＯＲ１キメラ受容体の表面における発現を示す。（Ｂ）長鎖スペーサー（黒丸）、中間鎖スペーサー（黒上三角）、および短鎖スペーサー（黒菱形）を伴う多様な２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体、またはｔＥＧＦＲ対照レンチウイルスベクターを発現させるＴ細胞の、ＲＯＲ１^＋（×）標的細胞および対照標的細胞に対する細胞溶解活性を示す図である。棒グラフは、２Ａ２ＲＯＲ１「長鎖」キメラ受容体による細胞溶解活性＝１に照らして標準化され、スチューデントのｔ検定により解析された、３回にわたる個別の実験に由来する細胞傷害作用データ（Ｅ：Ｔ＝３０：１）についてまとめる。（Ｃ）ＣＦＳＥ色素の希釈を使用して、外因性サイトカインの添加を伴わない、Ｒａｊｉ／ＲＯＲ１細胞（左パネル）および初代ＣＬＬ細胞（右パネル）による刺激の７２時間後における、２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞およびｔＥＧＦＲ対照Ｔ細胞の増殖を測定したことを示す図である。解析のために３連のウェルをプールし、ＣＤ８^＋生（ＰＩ⁻）Ｔ細胞の増殖を解析した。各ヒストグラムの上方の数は、増殖するサブセットが経た細胞分裂の回数を指し示し、≧４／３／２／１回の細胞分裂を経た各ゲート内のＴ細胞画分は、各プロットの隣に提示する。（Ｄ）多様な２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体を発現させる５×１０^４個のＴ細胞の、Ｒａｊｉ／ＲＯＲ１細胞および初代ＣＬＬ細胞を伴う３連の共培養から２４時間後に得られる上清についての、マルチプレックスサイトカインアッセイを示す図である。３回にわたる個別の実験に由来するマルチプレックスサイトカインデータは、標準化し（２Ａ２ＲＯＲ１「長鎖」キメラ受容体によるサイトカインの放出＝１として）、スチューデントのｔ検定により解析した（右棒グラフ）。

図３は、Ｒ１１キメラ受容体が、ＲＯＲ１^＋腫瘍細胞を認識するために長鎖スペーサーを要求することを示す図である。チロシンキナーゼＲＯＲ１のオーファン受容体の膜近位クリングルドメイン内のエピトープに特異的なＲ１１モノクローナル抗体に由来するｓｃＦＶをコードする配列を、４−１ＢＢ共刺激ドメインを含有する本発明者らのキメラ受容体ライブラリー内の、ＩｇＧ４ヒンジだけの配列（短鎖）、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ３配列（中間鎖）、およびＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３配列の上流にクローニングし、レンチウイルスベクターとして調製した。Ａ）ヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞に形質導入し、短鎖キメラ受容体、中間鎖キメラ受容体、および長鎖キメラ受容体の各々による形質導入効率を、ｔＥＧＦＲマーカーについての染色により決定したことを示す図である。Ｂ）短鎖を発現させる形質導入Ｔ細胞（上）、中間鎖を発現させる形質導入Ｔ細胞（中）、および長鎖を発現させる形質導入Ｔ細胞（下）を、Ｋ５６２白血病細胞単独またはＲＯＲ１を発現させるようにトランスフェクトされたＫ５６２白血病細胞の溶解についてアッセイしたことを示す図である。長鎖スペーサーキメラ受容体を発現させるＴ細胞だけが、ＲＯＲ１＋Ｋ５６２細胞を効率的に死滅させた。Ｃ）短鎖を発現させる形質導入Ｔ細胞（上）、中間鎖を発現させる形質導入Ｔ細胞（中）、および長鎖を発現させる形質導入Ｔ細胞（下）を、ＣＦＳＥで標識し、ＲＯＲ１またはＣＤ１９（対照）を発現させるＫ５６２細胞で刺激し、細胞増殖について、７２時間にわたりアッセイしたことを示す図である。長鎖スペーサーキメラ受容体を発現させるＴ細胞は、ＲＯＲ１＋Ｋ５６２細胞に対して特異的に増殖した。Ｄ）短鎖を発現させる形質導入Ｔ細胞（上）、中間鎖を発現させる形質導入Ｔ細胞（中央）、および長鎖を発現させる形質導入Ｔ細胞（下）を、ＲＯＲ１またはＣＤ１９（対照）を発現させるＲａｊｉリンパ腫細胞およびＫ５６２細胞で刺激し、インターフェロンガンマの上清への分泌について、２４時間にわたりアッセイしたことを示す図である。長鎖スペーサーキメラ受容体を発現させるＴ細胞は、増殖し、ＲＯＲ１陽性標的細胞に応答して、最高レベルのインターフェロンガンマを産生した。

図４は、スペーサー長が改変され、アフィニティーが異なる２Ａ２ｓｃＦＶおよびＲ１２ｓｃＦＶに由来する、ＲＯＲ１キメラ受容体のデザインを示す図である。（Ａ）２Ａ２ｓｃＦＶ、「ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３」（長鎖スペーサー；２２９アミノ酸）、「ヒンジ−ＣＨ３」（中間鎖；１１９アミノ酸）、または「ヒンジ」だけ（短鎖；１２アミノ酸）のＩｇＧ４−Ｆｃに由来するスペーサー、ならびにＣＤ３ζおよびＣＤ２８を伴うシグナル伝達モジュールを含有するＲＯＲ１キメラ受容体のパネルをコードするレンチウイルストランス遺伝子インサートのデザインを示す図である。各キメラ受容体カセットは、Ｔ２Ａエレメントの下流においてコードされる切断型ＥＧＦＲマーカーを含有する。（Ｂ）Ｒ１２ｓｃＦＶおよび２Ａ２ｓｃＦＶに由来するＲＯＲ１特異的キメラ受容体であって、それぞれ、短鎖ＩｇＧ４−Ｆｃ「ヒンジ」スペーサー（１２アミノ酸）と、ＣＤ２８または４−１ＢＢおよびＣＤ３ζを含有するシグナル伝達モジュールとを伴うＲＯＲ１特異的キメラ受容体をコードするレンチウイルストランス遺伝子インサート（合計：４つの構築物）を示す図である。

図５は、２Ａ２よりアフィニティーが大きなｍＡｂであるＲ１２に由来するＲＯＲ１キメラ受容体により改変されたＴ細胞の抗腫瘍反応性を示す図である。（Ａ）短鎖ＩｇＧ４−Ｆｃ「ヒンジ」スペーサー、およびＣＤ２８共刺激ドメインまたは４−１ＢＢ共刺激ドメインを伴うＲ１２ＲＯＲ１キメラ受容体および２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体の各々により改変された、ＣＤ８^＋Ｔ_ＣＭに由来する精製されたポリクローナルＴ細胞系上におけるｔＥＧＦＲ発現を示す図である。（Ｂ）Ｒ１２ＲＯＲ１キメラ受容体を発現させるＴ細胞（２８−黒上三角；４−１ＢＢ−白上三角）および２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体を発現させるＴ細胞（２８−黒丸；４−１ＢＢ−白丸）、またはｔＥＧＦＲ対照ベクターを発現させるＴ細胞（×）による、ＲＯＲ１^＋標的細胞および対照標的細胞に対する細胞傷害作用を示す図である。（Ｃ）多様なＲＯＲ１キメラ受容体を発現させる５×１０^４個のＴ細胞の、Ｒａｊｉ／ＲＯＲ１腫瘍細胞との共培養から２４時間後に得られる上清についてのマルチプレックスサイトカインアッセイを示す図である。中央／右の棒グラフは、３回にわたる個別の実験に由来する、標準化（ＲＯＲ１キメラ受容体２Ａ２によるサイトカインの放出＝１とする）マルチプレックスデータであって、スチューデントのｔ検定により解析されたマルチプレックスデータを示す。（Ｄ）Ｒａｊｉ／ＲＯＲ１細胞を伴うが、外因性サイトカインの添加を伴わない刺激の７２時間後における、ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞およびｔＥＧＦＲ対照Ｔ細胞の増殖を、ＣＦＳＥ色素の希釈により評価したことを示す図である。各ヒストグラムの上方の数は、増殖するサブセットが経た細胞分裂の回数を指し示し、≧４／３／２／１回の細胞分裂を経た各ゲート内のＴ細胞画分は、各プロットの上方に提示する。

図６は、２Ａ２よりアフィニティーが大きなｍＡｂであるＲ１２に由来するＲＯＲ１キメラ受容体により改変されたＣＤ４^＋Ｔ細胞系によるサイトカイン産生およびこれらの増殖についての解析を示す図である。（Ａ〜Ｂ）２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体およびＲ１２ＲＯＲ１キメラ受容体が、短鎖スペーサーおよびＣＤ２８共刺激ドメインを有したことを示す図である。（Ａ）２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体およびＲ１２ＲＯＲ１キメラ受容体を発現させる５×１０^４個のＣＤ４^＋Ｔ細胞を、Ｒａｊｉ／ＲＯＲ１腫瘍細胞で刺激した２４時間後において得られる上清に由来するマルチプレックスサイトカイン解析を示す図である。（Ｂ）Ｒａｊｉ／ＲＯＲ１細胞を伴うが、外因性サイトカインの添加を伴わない刺激の７２時間後における、ＣＤ４^＋Ｒ１２ＲＯＲ１キメラ受容体および２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞およびｔＥＧＦＲ対照Ｔ細胞の増殖を、ＣＦＳＥ色素の希釈により評価したことを示す図である。各ヒストグラムの上方の数は、増殖するサブセットが経た細胞分裂の回数を指し示し、≧５／４／３／２／１回の細胞分裂を経た各ゲート内のＴ細胞画分は、ヒストグラムの上方に提示する。

図７は、最適な短鎖スペーサーおよび４−１ＢＢ共刺激ドメインを伴う２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体およびＲ１２ＲＯＲ１キメラ受容体またはＣＤ１９特異的キメラ受容体で改変されたＴ細胞による初代ＣＬＬの認識を示す図である。（Ａ）キメラ受容体Ｔ細胞上のＣＤ２８（白色のヒストグラム）と関与しうる、初代ＣＬＬ上のＲＯＲ１／ＣＤ１９の発現、ならびに初代ＣＬＬ上およびＲａｊｉ／ＲＯＲ１腫瘍細胞上のＣＤ８０／８６の発現（黒色ドットによるプロット）を示す図である。マッチさせたアイソタイプ対照ｍＡｂによる染色を、グレーのドットによるプロット／ヒストグラムとして示す。（Ｂ）２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体を発現させるＴ細胞（黒丸）およびＲ１２ＲＯＲ１キメラ受容体を発現させるＴ細胞（黒四角）、ＣＤ１９特異的キメラ受容体を発現させるＴ細胞（黒上三角）、ならびにｔＥＧＦＲ対照ベクターにより改変されたＴ細胞（×）の、初代ＣＬＬ細胞に対する細胞溶解活性（左グラフ）および正常Ｂ細胞に対する細胞溶解活性（右グラフ）であって、クロム放出アッセイにより解析された細胞溶解活性を示す図である。４回にわたる個別の実験（Ｅ：Ｔ＝３０：１）に由来する、初代ＣＬＬに対する細胞傷害作用データは、標準化し（ＲＯＲ１キメラ受容体２Ａ２による細胞溶解活性＝１として）、スチューデントのｔ検定により解析した（棒グラフ）。（Ｃ）５×１０^４個のキメラ受容体Ｔ細胞の、初代ＣＬＬ細胞による、２４時間にわたる刺激の後におけるマルチプレックスサイトカイン解析を示す図である。刺激されなかったキメラ受容体Ｔ細胞のサイトカイン放出は、３．６ｐｇ／ｍｌを下回った（検出限界）（左棒グラフ）。初代ＣＬＬとの２４時間にわたる共培養の後における、５×１０^４個の２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞およびＲ１２ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生についてのＥＬＩＳＡである。Ｏ．Ｄ．の１は、約２５０ｐｇ／ｍｌに対応する（右棒グラフ）。（Ｄ）初代ＣＬＬ細胞を伴う刺激の７２時間後における、２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体、Ｒ１２ＲＯＲ１キメラ受容体、およびＣＤ１９キメラ受容体により改変されたＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を示す図である。各ヒストグラムの上方の数は、細胞分裂の回数を指し示し、≧３／２／１回の細胞分裂を経た各ゲート内のＴ細胞画分は、各プロットの隣に提示する。

図８は、ＲＯＲ１キメラ受容体およびＣＤ１９キメラ受容体により改変されたＣＤ８^＋Ｔ細胞の、初代ＣＬＬに対する機能が、キメラ受容体により改変されたＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞を介して増進することを示す図である。（Ａ）初代ＣＬＬと共に２４時間にわたりインキュベートされた、それぞれ、Ｒ１２ＲＯＲ１キメラ受容体およびＣＤ１９キメラ受容体を発現させる、５×１０^４個のＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ４^＋Ｔ細胞の３連の共培養からのＩＬ−２産生についてのＥＬＩＳＡを示す図である。Ｏ．Ｄ．の１は、およそ８００ｐｇ／ｍｌに対応する。（Ｂ）キメラ受容体により改変されたＣＤ８^＋Ｔ細胞の、初代ＣＬＬに応答する増殖が、キメラ受容体により改変されたＣＤ４^＋Ｔ細胞を添加することにより増強されることを示す図である。それぞれ、２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体、Ｒ１２ＲＯＲ１キメラ受容体、およびＣＤ１９キメラ受容体を発現させる、ＣＦＳＥ標識ＣＤ８^＋Ｔ細胞を、腫瘍細胞、ならびに２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体、Ｒ１２ＲＯＲ１キメラ受容体、およびＣＤ１９キメラ受容体を形質導入されたＣＤ４^＋Ｔ細胞、または形質導入されていない対照ＣＤ４^＋Ｔ細胞（ＣＤ８^＋：ＣＤ４^＋＝１：１）と共培養した。ＣＤ８^＋サブセットの増殖は、刺激の７２時間後において解析した。各ヒストグラムの上方の数は、細胞分裂の回数を指し示し、≧３／２／１回の細胞分裂を経た各ゲート内のＴ細胞画分は、各プロットの上方に提示する。

図９は、２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞、Ｒ１２ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞、およびＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞の、ｉｎｖｉｖｏにおける抗腫瘍有効性を示す図である。マウスのコホートに、尾静脈注射を介して、０．５×１０^６個のＪｅＫｏ−１／ｆｆｌｕｃＭＣＬを接種し、腫瘍接種の７日後に、５×１０^６個の２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞、Ｒ１２ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞、もしくはＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞、またはｔＥＧＦＲ対照ベクターを発現させるＴ細胞を投与した。全てのキメラ受容体構築物は、短鎖ＩｇＧ４「ヒンジだけ」のスペーサーおよび４−１ＢＢ共刺激ドメインを有した。（Ａ、Ｂ）２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体を発現させるＴ細胞（黒下三角）、高アフィニティーＲ１２ＲＯＲ１キメラ受容体を発現させるＴ細胞（黒四角）、ＣＤ１９特異的キメラ受容体を発現させるＴ細胞（黒上三角）、ｔＥＧＦＲ単独を形質導入されたＴ細胞（黒丸）で処置されたマウスのコホート、および処置されなかったマウスコホートにおける腫瘍についての連続生物発光造影を示す図である。生物発光造影は、骨髄および胸部における腫瘍症状を示したので、各個別のマウスの全身および胸部を包摂する対象の領域内のシグナル強度を測定した。（Ｃ）個々の処置群および対照群における生存についてのカプラン−マイヤー解析を示す図である。統計学的解析は、ログランク検定を使用して実施した。Ａ〜Ｃにおいて示されるデータは、２回にわたる個別の実験において得られた結果を表す。（Ｄ）２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞、Ｒ１２ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞、およびＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞のｉｎｖｉｖｏにおける増殖を示す図である。腫瘍接種後７日目において、腫瘍を保有するＮＳＧ／ＪｅＫｏ−１マウスに、５×１０^６個のＣＦＳＥ標識２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞、Ｒ１２ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞、またはＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞の単回投与を施し、７２時間後に、末梢血、骨髄、および脾臓を、各個別のマウスから回収した。ＣＤ４５^＋ＣＤ８^＋ｔＥＧＦＲ^＋生（ＰＩ⁻）Ｔ細胞の頻度および増殖を解析した。２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞、Ｒ１２ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞、およびＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞それぞれの頻度は、各ヒストグラムの左方に、生細胞の百分率として提示され、≧４／３／２／１回の細胞分裂を経たＴ細胞画分は、各プロットの上方に提示する。

図１０は、上皮がん細胞系上のＲＯＲ１リガンドおよびＮＫＧ２Ｄリガンドの発現を示す図である。（Ａ）トリプルネガティブ乳がん細胞系であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１上および４６８上、ならびに腎細胞がん細胞系であるＦＡＲＰ上、ＴＲＥＰ上、およびＲＷＬ上（黒色ヒストグラム）のＲＯＲ１の発現を示す図である。マッチさせたアイソタイプ対照抗体による染色を、グレーのヒストグラムとして示す。（Ｂ）ＣＤ８０／８６リガンドおよびＮＫＧ２ＤリガンドであるＭＩＣＡ／Ｂの、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞上およびＲａｊｉ／ＲＯＲ１腫瘍細胞上の発現、ならびにＮＫＧ２Ｄ（ＣＤ３１４）の、２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞上およびＲ１２ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞上の発現を示す図である。マッチさせたアイソタイプ対照ｍＡｂによる染色を、グレーのドットによるプロット／ヒストグラムとして示す。

図１１は、ＲＯＲ１キメラ受容体により改変されたＴ細胞が、ＲＯＲ１^＋上皮腫瘍細胞をｉｎｖｉｔｒｏにおいて認識することを示す図である。（Ａ）Ｒ１２ＲＯＲ１キメラ受容体により改変されたＴ細胞（短鎖スペーサー／４−１ＢＢ共刺激ドメイン；塗りつぶした記号）およびｔＥＧＦＲ対照Ｔ細胞（中抜きの記号）の、ＲＯＲ１^＋乳がん細胞系および腎細胞がん細胞系に対する細胞溶解活性を査定するクロム放出アッセイを示す図である。（Ａ〜Ｄ）２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体およびＲ１２ＲＯＲ１キメラ受容体が、最適な短鎖スペーサーおよび４−１ＢＢ共刺激ドメインを有したことを示す図である。（Ｂ）２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体およびＲ１２ＲＯＲ１キメラ受容体を発現させるＴ細胞を、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞およびＲａｊｉ／ＲＯＲ１腫瘍細胞により刺激した後におけるマルチプレックスサイトカイン解析を示す図である。（Ｃ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞を伴う刺激の７２時間後における、２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体およびＲ１２ＲＯＲ１キメラ受容体により改変されたＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を示す図である。解析のために３連のウェルをプールし、ＣＤ８^＋生（ＰＩ⁻）Ｔ細胞の増殖を解析した。各ヒストグラムの上方の数は、増殖するサブセットが経た細胞分裂の回数を指し示し、≧４／３／２／１回の細胞分裂を経た各ゲート内のＴ細胞画分は、各ヒストグラムの隣に提示する。（Ｄ）プレーン培地中のＭＤＡ−ＭＢ−２３１と共に２４時間にわたり共培養した後で、ＮＫＧ２Ｄ経路を遮断する抗体カクテル［抗ＮＫＧ２Ｄ（クローン１Ｄ１１）、抗ＭＩＣＡ／Ｂ（クローン６Ｄ４）、および抗ＵＬＢＰ］またはマッチさせたアイソタイプ対照ｍＡｂを添加した後における、Ｒ１２ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞によるＩＬ−２産生についてのＥＬＩＳＡを示す図である。Ｏ．Ｄ．の０．６は、およそ１９００ｐｇ／ｍｌに対応する。

図１２は、細胞外スペーサー長の、ＨＥＲ２特異的キメラ受容体を発現させるＣＤ８＋ヒトＴ細胞による、腫瘍細胞の認識および腫瘍細胞の溶解の誘発に対する効果を示す図である。Ａ）ヒトＨＥＲ２上の腫瘍細胞膜近位エピトープ上のＨｅｒｃｅｐｔｉｎＦａｂエピトープの位置を描示する図である。Ｂ）ＨｅｒｃｅｐｔｉｎｓｃＦｖＣＡＲスペーサー長変異体の構造フォーマットをカルボキシル側のＥＧＦＲｔマーカー膜貫通タンパク質を伴うＴ２Ａを連結したポリペプチドとして示す図である。Ｃ）ヒトＣＤ８＋ＣＴＬ内の、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ−ＣＡＲ短鎖スペーサー変異体、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ−ＣＡＲ中鎖スペーサー変異体、およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ−ＣＡＲ長鎖スペーサー変異体の発現の、ウェスタンブロットによる検出を示す図である。Ｄ）ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＣＡＲ変異体を形質導入され、次いで、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ−ビオチンマイクロビーズ、抗ビオチンマイクロビーズにより免疫磁気的に精製された、形質導入ヒトＣＤ８＋ＣＴＬによるＥＧＦＲｔのフローサイトメトリー検出を示す図である。Ｅ）ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＣＡＲ変異体（短鎖：Ｓ；中鎖：Ｍ；および長鎖：Ｌ）を発現させるように形質導入されたＴ細胞による、ＨＥＲ２^＋Ｍｅｄ４１１ＦＨおよびＤ２８３ヒト髄芽腫細胞系（Ｄ３４１は、ＨＥＲ２⁻対照髄芽腫細胞系であり、挿入図のフロープロットは、抗ＨＥＲ２特異的ｍＡｂで染色された腫瘍標的系である）に対する異なる細胞溶解機能を示す図である。緑色＝全長ＩｇＧ４（長鎖スペーサー；黒下三角）、青色＝ＩｇＧ４ヒンジ：ＣＨ３（中鎖スペーサー；黒上三角）、赤色＝ＩｇＧ４ヒンジだけ（短鎖スペーサー；黒四角）。

図１３は、ＣＤ１９キメラ受容体ベクターおよびＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞の作製を示す図である。（Ａ）細胞外スペーサー長および細胞内共刺激が異なるＣＤ１９特異的キメラ受容体のパネルをコードするレンチウイルストランス遺伝子インサートのデザインを示す図である。各キメラ受容体は、ＶＬ−ＶＨ配向のＦＭＣ６３ｍＡｂに由来するＣＤ１９特異的単鎖可変断片、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３（長鎖スペーサー；２２９アミノ酸）またはヒンジだけ（短鎖スペーサー；１２アミノ酸）のＩｇＧ４に由来するスペーサードメイン、およびＣＤ２８または４−１ＢＢを単独またはタンデムで伴うＣＤ３ζを含有するシグナル伝達モジュールをコードした。各キメラ受容体カセットは、切断可能な２Ａエレメントの下流においてコードされる切断型ＥＧＦＲマーカーを含有する。（Ｂ、Ｃ）ＣＤ１９キメラ受容体構築物の各々により改変されたポリクローナルＴ細胞系を、正常ドナーの精製ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＯ^＋ＣＤ６２Ｌ^＋セントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ）から調製したことを示す図である。レンチウイルスにより形質導入した後、ｔＥＧＦＲマーカーを使用して各細胞系内のトランス遺伝子陽性Ｔ細胞を精製し、ｉｎｖｉｔｒｏ実験およびｉｎｖｉｖｏ実験のために増やした。（Ｄ）ｔＥＧＦＲマーカーについて染色した後におけるＭＦＩにより、ＣＤ１９キメラ受容体の各々により改変されたＴ細胞内のトランス遺伝子の同等な発現が示される図である。

図１４は、異なるＣＤ１９キメラ受容体により改変されたＴ細胞のｉｎｖｉｔｒｏにおける細胞傷害作用、これらによるサイトカイン産生、およびこれらの増殖を示す図である。（Ａ）多様なＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞の、ＣＤ１９^＋標的細胞および対照標的細胞に対する細胞溶解活性を示す図である。（Ｂ）多様なＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞と、ＣＤ１９をトランスフェクトされたＫ５６２細胞およびＣＤ１９^＋Ｒａｊｉ細胞との３連の共培養から２４時間後に得られる上清についてのマルチプレックスサイトカインアッセイを示す図である。（Ｃ）多様なＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞によるサイトカイン産生の比較を示す図である。６回にわたる個別の実験に由来するマルチプレックスサイトカインデータを、標準化し（ＣＤ１９キメラ受容体「短鎖／ＣＤ２８」ＣＴＬによるサイトカインの放出＝１として）、スチューデントのｔ検定により解析した。（Ｄ）ＣＦＳＥ色素の希釈を使用して、外因性サイトカインの添加を伴わずに、Ｋ５６２／ＣＤ１９（上パネル）およびＣＤ１９^＋Ｒａｊｉ腫瘍細胞（下パネル）による刺激の７２時間後において、ＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞の増殖を測定したことを示す図である。解析のために３連のウェルをプールし、ＣＤ８^＋生（ＰＩ⁻）Ｔ細胞の増殖を解析した。各ヒストグラムの上方の数は、増殖するサブセットが経た細胞分裂の回数を指し示し、≧４／３／２／１回の細胞分裂を経た各ゲート内のＴ細胞画分は、各プロットの左上に提示する。（Ｅ）多様なＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞の、Ｒａｊｉ腫瘍細胞との７２時間にわたる共培養の終了時において、ＰＩ染色を実施したことを示す図である。キメラ受容体Ｔ細胞系（ＣＤ３^＋）中のＰＩ^＋細胞の百分率を、各ヒストグラムに提示する。

図１５は、短鎖細胞外スペーサードメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞が、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＲａｊｉ腫瘍を根絶することを示す図である。（Ａ）マウスのコホートに、尾静脈注射を介してＲａｊｉ−ｆｆｌｕｃを接種し、長鎖スペーサードメインおよび短鎖スペーサードメインを含有するＣＤ１９キメラ受容体を形質導入されたＴ細胞、またはｔＥＧＦＲ単独を形質導入されたＴ細胞を、腫瘍接種の２および９日後に、尾静脈注射により投与したことを示す図である。ルシフェリン基質を注射した後で、腫瘍の進行および分布を、連続生物発光造影により査定した。（Ｂ）短鎖スペーサー（「短鎖／ＣＤ２８」および「短鎖／４−１ＢＢ」）ドメインおよび長鎖スペーサー（「長鎖／ＣＤ２８」および「長鎖／４−１ＢＢ」）ドメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞により処置されたマウスのコホート、ｔＥＧＦＲ対照ベクターを形質導入されたＴ細胞により処置されたマウスのコホート、または処置されなかったマウスのコホートにおける腫瘍についての連続生物発光造影を示す図である。ＣＤ１９キメラ受容体を形質導入されたＴ細胞で処置されたマウスのコホートまたはｔＥＧＦＲを形質導入されたＴ細胞で処置されたマウスのコホートを表す各グラフはまた、処置されなかったマウスにおける腫瘍の進行についての平均も比較のために示す（赤色の三角）。（Ｃ）処置されなかったマウス、ならびに短鎖スペーサー（「短鎖／ＣＤ２８」および「短鎖／４−１ＢＢ」）ドメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞により処置されたマウス、長鎖スペーサー（「長鎖／ＣＤ２８」および「長鎖／４−１ＢＢ」）ドメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞により処置されたマウス、および対照ｔＥＧＦＲを発現させるＴ細胞により処置されたマウスの生存についてのカプラン−マイヤー解析を示す図である。統計学的解析は、ログランク検定を使用して実施した。ＢおよびＣにおいて示されるデータは、３回にわたる個別の実験において得られた結果を表す。

図１６は、短鎖スペーサー（短鎖／４−１ＢＢ）を伴うＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞が、ＮＳＧマウスにおいて確立されたＲａｊｉ腫瘍を、用量依存的な様式で根絶することを示す図である。（Ａ）マウスに、尾静脈注射を介してＲａｊｉ−ｆｆｌｕｃを接種し、６日目に、腫瘍の生着を、生物発光造影により確認した。７日目において、マウスに、多様な用量の、ＣＤ１９キメラ受容体「短鎖／４−１ＢＢ」を形質導入されたＴ細胞、またはｔＥＧＦＲ対照レンチウイルスを形質導入されたＴ細胞の単回のｉ．ｖ．注射を施した。（Ｂ、Ｃ）ＣＤ１９キメラ受容体「短鎖／４−１ＢＢ」を発現させるＴ細胞の用量依存的な抗腫瘍有効性を示す図である。対照マウスのコホートには、高用量のｔＥＧＦＲ単独により改変されたＴ細胞の単回投与を施した。（Ｄ）ＮＳＧ／Ｒａｊｉマウスへの養子移入後における、ＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞の存続を示す図である。２．５×１０^６個の、ＣＤ１９キメラ受容体「短鎖／４−１ＢＢ」Ｔ細胞で処置されたマウスのコホートにおける、フローサイトメトリーによる末梢血（眼採血）についての解析である。ＣＤ８^＋ｔＥＧＦＲ^＋Ｔ細胞の頻度を、末梢血生細胞の百分率として示す。

図１７は、短鎖スペーサーおよびＣＤ２８または４−１ＢＢを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞が、確立されたリンパ腫に対して、長鎖スペーサーを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞より有効であることを示す図である。（Ａ）０日目において、ＮＳＧマウスに、Ｒａｊｉ−ｆｆｌｕｃを接種し、７日目において、１回投与の、２．５×１０^６個の、短鎖または長鎖スペーサーおよびＣＤ２８共刺激ドメインまたは４−１ＢＢ共刺激ドメインを発現させるＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞で処置したことを示す図である。（Ｂ）処置群の各々におけるマウスの生存についてのカプラン−マイヤー解析を示す図である。統計学的解析は、ログランク検定を使用して実施した。（Ｃ）短鎖スペーサー（「短鎖／ＣＤ２８」および「短鎖／４−１ＢＢ」）を伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞、および長鎖スペーサー（「長鎖／ＣＤ２８」および「長鎖／４−１ＢＢ」）を伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞により処置されたマウスのコホートについての生体発光造影を示す図である。各時点の処置されなかったマウスにおいて観察される平均腫瘍負荷を、比較のために各グラフに示す（三角）。（Ｄ）短鎖スペーサードメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞のｉｎｖｉｖｏにおける存続が、長鎖スペーサードメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞と比較して増強されることを示す図である。移入後の３および１０日目において得られる末梢血中のＣＤ８^＋ｔＥＧＦＲ^＋Ｔ細胞の頻度は、フローサイトメトリーにより決定したが、これを末梢血生（ＰＩ⁻）細胞の百分率として示す。統計学的解析は、スチューデントのｔ検定により実施した。Ｂ〜Ｄにおいて示されるデータは、３回にわたる個別の実験において得られた結果を表す。

図１８は、キメラ受容体Ｔ細胞の用量を増大させても、共刺激シグナル伝達を増進させても、長鎖スペーサードメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体の、確立されたリンパ腫に対する抗腫瘍有効性は改善されないことを示す図である。（Ａ）「長鎖／ＣＤ２８」ＣＤ１９キメラ受容体、「長鎖／４−１ＢＢ」ＣＤ１９キメラ受容体、および「長鎖／ＣＤ２８＿４−１ＢＢ」ＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞の、ＣＤ１９^＋標的細胞および対照標的細胞に対する細胞溶解活性を示す図である。（Ｂ）Ｋ５６２／ＣＤ１９腫瘍細胞およびＲａｊｉ腫瘍細胞の、多様なＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞との３連の共培養から２４時間後に得られる上清についてのマルチプレックスサイトカインアッセイを示す図である。（Ｃ）ＣＤ１９^＋腫瘍細胞（Ｋ５６２／ＣＤ１９：左パネル；Ｒａｊｉ：右パネル）による刺激の７２時間後における、ＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞の増殖の、ＣＦＳＥ色素の希釈による査定を示す図である。解析のために３連のウェルをプールし、ＣＤ８^＋生（ＰＩ⁻）Ｔ細胞の増殖を解析した。各ヒストグラムの上方の数は、増殖するサブセットが経た細胞分裂の回数を指し示し、≧４／３／２／１回の細胞分裂を経た各ゲート内のＴ細胞画分は、各プロットの左上に提示する。（Ｄ）短鎖スペーサードメイン（「短鎖／ＣＤ２８」）を伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞、および長鎖スペーサードメイン（「長鎖／ＣＤ２８」および「長鎖／ＣＤ２８＿４−１ＢＢ」）を伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞、またはｔＥＧＦＲをコードする対照レンチウイルスベクターにより改変されたＴ細胞により処置されたマウスの生存についてのカプラン−マイヤー解析を示す図である。統計学的解析は、ログランク検定を使用して実施した。（Ｅ）短鎖スペーサー（「短鎖／ＣＤ２８」）を伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞、および長鎖スペーサー（「長鎖／ＣＤ２８」および「長鎖／ＣＤ２８＿４−１ＢＢ」）を伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞により処置されたマウスのコホートについての生体発光造影を示す図である。グラフは、処置されなかったマウスにおける腫瘍の平均の進行を比較のために示す（赤色の三角）。（Ｆ）多様なＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞のｉｎｖｉｖｏにおける存続を示す図である。移入後の３および１０日目において得られる末梢血中のＣＤ８^＋ｔＥＧＦＲ^＋Ｔ細胞の頻度は、フローサイトメトリーにより決定したが、これを末梢血生（ＰＩ⁻）細胞の百分率として示す。統計学的解析は、スチューデントのｔ検定により実施した。

図１９は、長鎖スペーサードメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞が、ｉｎｖｉｖｏにおいて腫瘍により活性化するが、細胞数は増大しないことを示す図である。（Ａ）ＮＳＧ／Ｒａｊｉマウスへの移入の前における、各ＣＤ１９キメラ受容体により改変されたＴ細胞上のＣＤ６９およびＣＤ２５の発現を示す図である。（Ｂ）マウスのコホートに、Ｒａｊｉ−ｆｆｌｕｃ腫瘍細胞を接種し、７日後に、ＣＦＳＥ標識ＣＤ１９キメラ受容体を形質導入されたＴ細胞または対照Ｔ細胞を施したことを示す図である。骨髄および脾臓を、マウスの部分群から、Ｔ細胞投与の２４および７２時間後に採取した。（Ｃ、Ｄ）Ｔ細胞移入の２４時間後（Ｃ）および７２時間後（Ｄ）に得られる骨髄単核細胞についての、多重パラメータのフローサイトメトリーによる解析を示す図である。ドットプロットは、ヒト生存Ｔ細胞を検出するＰＩ⁻細胞についてゲートをかけた後における、抗ＣＤ３染色および抗ＣＤ４５染色を示す。ＣＤ３⁻ＣＤ４５^＋ゲートは、Ｒａｊｉ腫瘍細胞を含有する。ＣＤ３^＋ＣＤ４５^＋生（ＰＩ⁻）Ｔ細胞上のＣＤ２５およびＣＤ６９の発現を、ヒストグラムに示す。（Ｅ）Ｔ細胞移入の２４および７２時間後に得られる、脾臓中のＣＤ３^＋ＣＤ４５^＋Ｔ細胞の頻度を示す図である。ドットプロットは、ＰＩ⁻生脾臓細胞についてゲートをかけ、ＣＤ３^＋ＣＤ４５^＋Ｔ細胞の百分率を、各プロットに示す。（Ｆ）骨髄および脾臓細胞の、ＮＳＧ／ＲａｊｉマウスへのＴ細胞の移入の数時間後におけるＰＩ染色を示す図である。ヒストグラム内の数は、ＣＤ３^＋集団内のＰＩ^＋細胞の百分率を指し示す。（Ｇ）短鎖スペーサー（「短鎖／ＣＤ２８」および「短鎖／４−１ＢＢ」）を伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞、長鎖スペーサー（「長鎖／ＣＤ２８」および「長鎖／４−１ＢＢ」）を伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞、または対照Ｔ細胞により処置されたマウスのコホートについての生体発光造影を示す図である。

図２０は、４−１ＢＢおよびＣＤ３ゼータならびに改変されたＩｇＧ４−Ｆｃヒンジを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞が、４−１ＢＢおよびＣＤ３ゼータならびにＣＤ８アルファヒンジを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞と比較して、優れたｉｎｖｉｔｒｏ機能およびｉｎｖｉｖｏ機能を呈示することを示す図である。Ａ：ＩｇＧ４Ｆｃヒンジ、ＣＤ８アルファヒンジを伴うＣＤ１９キメラ受容体により改変されたＴ細胞、および対照Ｔ細胞の、Ｃｒ^５１標識され、ＣＤ１９をトランスフェクトされたＫ５６２細胞、ＣＤ１９を発現させるＲａｊｉリンパ腫細胞、およびＫ５６２対照細胞に対する細胞溶解活性を示す図である。４時間にわたるＣｒ^５１放出アッセイにおける溶解を、異なるＥ／Ｔ比で示す。Ｂ：２４時間にわたるＲａｊｉ腫瘍細胞との共培養の後における、５×１０^４個の、ＩｇＧ４ＦｃヒンジまたはＣＤ８アルファヒンジを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞によるインターフェロンガンマ産生を示す図である。Ｏ．Ｄ．の１は、約５００ｐｇ／ｍｌのインターフェロンガンマに対応する。Ｃ：７２時間にわたるＣＤ１９陽性Ｒａｊｉリンパ腫細胞との共培養の後における、ＩｇＧ４ＦｃヒンジまたはＣＤ８アルファヒンジを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞、およびｔＥＧＦＲを発現させるＴ細胞単独（対照）の増殖を測定するＣＦＳＥ色素希釈アッセイを示す図である。各ヒストグラムの上方の数は、増殖するサブセットが経た細胞分裂の回数を指し示す。≧３／２／１回の細胞分裂を経た各ゲート内のＴ細胞画分は、各プロットの隣に提示する。Ｄ：ＩｇＧ４Ｆｃヒンジを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞（群１）またはＣＤ８アルファヒンジを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞（群２）、およびｔＥＧＦＲ単独を発現させるＴ細胞（群３）の、ホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ）を発現させるＲａｊｉ腫瘍細胞を接種されたＮＳＧマウスにおけるｉｎｖｉｖｏの抗腫瘍活性を示す図である。マウスは、腫瘍接種の１７日後およびＴ細胞接種の１０日後に造影した。データは、対照ｔＥＧＦＲＴ細胞で処置されたマウス（群３）、またはＣＤ８アルファヒンジＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞で処置されたマウス（群２）における腫瘍負荷が、ＩｇＧ４ＦｃヒンジＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞で処置されたマウス（群１）と比較して大きいことを示す。

別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が関する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。

測定可能な値に言及する場合に本明細書で使用される「約」とは、指定された値からの±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、なおより好ましくは±１％の変異を包摂し、さらにより好ましくは±０．１％の変異を包摂することを意図する。

本明細書で使用される「活性化」とは、検出可能な細胞性増殖、サイトカイン産生、もしくはＣＤ６９およびＣＤ２５などの細胞表面マーカーの発現、または検出可能なエフェクター機能を誘導するために十分に刺激したＴ細胞の状態を指す。

本明細書で使用される「活性化誘導型細胞死」とは、活性化するが、２世代超にわたり増殖することは可能でなく、アポトーシスのマーカーを呈示するＴ細胞の状態を指す。

本明細書で使用される「抗原」または「Ａｇ」とは、免疫応答を引き起こす分子を指す。この免疫応答は、抗体産生もしくは特異的な免疫学的コンピテント細胞の活性化または両方を伴いうる。抗原は、合成により生成する場合もあり、組換えにより作製する場合もあり、生物学的試料に由来する場合もあることは容易に明らかである。このような生物学的試料は、組織試料、腫瘍試料、細胞、または生物学的流体を含みうるがこれらに限定されない。

本明細書で使用される「抗腫瘍効果」とは、腫瘍容量の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の延長、またはがん性状態と関連する多様な生理学的症状の減少により顕示されうる生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」はまた、再発の減少または再発前時間の延長によっても顕示されうる。

本明細書で使用される「キメラ受容体」とは、合成によりデザインされた受容体であって、抗体のリガンド結合ドメイン、または疾患もしくは障害と関連する分子に結合し、スペーサードメインを介して、共刺激ドメインなど、Ｔ細胞受容体もしくは他の受容体の、１つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメインへと連結された、他のタンパク質配列を含む受容体を指す。

本明細書で使用される場合の「共刺激ドメイン」という用語は、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体のＣＤ３ゼータ鎖によりもたらされる一次シグナルに加えて、活性化、増殖、分化、サイトカイン分泌などを含むがこれらに限定されないＴ細胞応答を媒介するシグナルをＴ細胞へともたらすシグナル伝達部分を指す。共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドの全部または一部分を含みうるがこれらに限定されない。実施形態では、共刺激ドメインとは、活性化、増殖、分化、およびサイトカイン分泌などを含む細胞応答を媒介する他の細胞内メディエーターと相互作用する細胞内シグナル伝達ドメインである。

本明細書で使用される「〜をコードする」とは、アミノ酸の規定された配列など、他の高分子を合成するための鋳型として用いられる遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド内のヌクレオチドの特異的配列の特性を指す。したがって、細胞または他の生物学的系において、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳により、タンパク質が産生される場合、遺伝子は、タンパク質をコードする。「ポリペプチドをコードする核酸配列」は、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。

本明細書で使用される「細胞傷害性Ｔリンパ球」（ＣＴＬ）とは、その表面上にＣＤ８を発現させるＴリンパ球（すなわち、ＣＤ８^＋Ｔ細胞）を指す。いくつかの実施形態では、このような細胞は、抗原経験細胞である「メモリー」Ｔ細胞（Ｔ_Ｍ細胞）であることが好ましい。

本明細書で使用される「セントラルメモリー」Ｔ細胞（または「Ｔ_ＣＭ」）とは、その表面上にＣＤ６２ＬまたはＣＣＲ−７およびＣＤ４５ＲＯを発現するが、ＣＤ４５ＲＡを発現しないか、またはその発現がナイーブ細胞と比較して減少した抗原経験ＣＴＬを指す。実施形態では、セントラルメモリー細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、およびＣＤ９５の発現について陽性であり、ＣＤ５４ＲＡの発現がナイーブ細胞と比較して減少している。

本明細書で使用される「エフェクターメモリー」Ｔ細胞（または「Ｔ_ＥＭ」）とは、ＣＤ６２Ｌをその表面上に発現しないか、またはその発現がセントラルメモリー細胞と比較して減少しており、ＣＤ４５ＲＡを発現しないか、またはその発現がナイーブ細胞と比較して減少した抗原経験Ｔ細胞を指す。実施形態では、エフェクターメモリー細胞は、ナイーブ細胞またはセントラルメモリー細胞と比較して、ＣＤ６２ＬおよびＣＣＲ７の発現について陰性であり、ＣＤ２８およびＣＤ４５ＲＡの発現が可変的である。

本明細書で使用される「ナイーブ」Ｔ細胞とは、セントラルメモリー細胞またはエフェクターメモリー細胞と比較して、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡを発現するが、ＣＤ４５ＲＯを発現しない非抗原経験Ｔリンパ球を指す。いくつかの実施形態では、ナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、およびＣＤ４５ＲＡを含むナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられる。

本明細書で使用される「エフェクター」「Ｔ_Ｅ」Ｔ細胞とは、セントラルメモリーＴ細胞またはナイーブＴ細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８を発現しないか、またはその発現が減少しており、グランザイムＢおよびパーフォリンについて陽性である抗原経験細胞傷害性Ｔリンパ球細胞を指す。

混合物中の細胞型の量について記載するのに本明細書で使用される「濃縮した」および「枯渇させた」とは、細胞の混合物を、「濃縮した」型の数の増大および「枯渇させた」細胞数の減少を結果としてもたらす工程またはステップにかけることを指す。したがって、濃縮工程にかけられる元の細胞集団の供給源に応じて、混合物または組成物は、「濃縮した」細胞のうちの約６０、７０、８０、９０、９５、または９９パーセント以上（数またはカウントで）、および「枯渇させた」細胞のうちの約４０、３０、２０、１０、５、または１パーセント以下（数またはカウントで）を含有しうる。

本明細書で使用される「エピトープ」とは、抗体、Ｔ細胞、および／またはＢ細胞を含む免疫系により認識される抗原または分子の一部を指す。エピトープは通常、少なくとも７アミノ酸を有し、直鎖状の場合もあり、コンフォメーショナルな場合もある。

本明細書で開示される多様なポリペプチドについて記載するのに使用される場合の「単離」とは、同定され、その自然環境の構成成分から分離および／または回収されたポリペプチドまたは核酸を意味する。好ましくは、単離ポリペプチドまたは単離核酸は、それが天然で会合している全ての構成成分との会合を含まない。その自然環境の夾雑的構成成分は、ポリペプチドまたは核酸についての診断的使用および治療的使用に干渉することが典型的な素材であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性溶質または非タンパク質性溶質を含みうる。

本明細書で使用される「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、リンパ球の活性化をもたらす分子（本明細書では、キメラ受容体分子）の１つまたは複数のドメインの全部または一部分を指す。このような分子の細胞内ドメインは、細胞性メディエーターと相互作用して、増殖、分化、活性化、および他のエフェクター機能を結果としてもたらすことにより、シグナルを媒介する。実施形態では、このような分子は、ＣＤ２８、ＣＤ３、４−１ＢＢ、およびこれらの組合せの全部または部分を含む。

本明細書で使用される「リガンド」とは、別の物質に特異的に結合して、複合体を形成する物質を指す。リガンドの例は、受容体、基質、阻害剤、ホルモン、および活性化剤に結合する分子である、抗原上のエピトープを含む。本明細書で使用される「リガンド結合ドメイン」とは、リガンドに結合する物質または物質の部分を指す。リガンド結合ドメインの例は、抗体の抗原結合部分、受容体の細胞外ドメイン、および酵素の活性部位を含む。

本明細書で使用される「作動可能に連結した」とは、調節的配列と異種核酸配列との機能的な連結であって、後者の発現を結果としてもたらす連結を指す。例えば、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と機能的な関係に置かれているとき、第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターは、コード配列の転写または発現に影響を及ぼすとき、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結したＤＮＡ配列は隣接し、２つのタンパク質コード領域を接合することが必要な場合、同じリーディングフレーム内にある。

本明細書で同定されるキメラ受容体ポリペプチド配列に照らした「アミノ酸配列の同一性パーセント（％）」は、配列を配列決定し、ギャップを導入して、必要な場合、最大の配列同一性パーセントを達成した後の、リガンド結合ドメイン、スペーサー、膜貫通ドメイン、および／またはリンパ球活性化ドメインの各々について、基準配列内のアミノ酸残基と同一な候補配列内のアミノ酸残基の百分率として規定され、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない。アミノ酸配列の同一性パーセントを決定することを目的とするアライメントは、当技術分野の技術の範囲内にある多様な方途により、例えば、ＢＬＡＳＴソフトウェア、ＢＬＡＳＴ−２ソフトウェア、ＡＬＩＧＮソフトウェア、ＡＬＩＧＮ−２ソフトウェア、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなど、一般に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、アライメントを測定するのに適切なパラメータであって、比較される配列の全長にわたり最大のアライメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含むパラメータを決定することができる。例えば、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２コンピュータプログラム［Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２６６巻：４６０〜４８０頁（１９９６年）］を使用して求められるアミノ酸配列の同一性％の値では、それらの大半がデフォルト値に設定された、いくつかの検索パラメータを使用する。デフォルト値に設定されていない検索パラメータ（すなわち、調整可能なパラメータ）は、以下の値：重複区間＝１、重複率＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１および、スコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２により設定される。アミノ酸配列の同一性％の値は、（ａ）表２に提示される基準キメラ受容体配列のポリペプチドアミノ酸配列の各々または全てと、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２により決定される対象の比較アミノ酸配列との間で同一なアミノ酸残基のマッチング数を、（ｂ）対象のポリペプチドのアミノ酸残基の合計数で除することにより決定する。

本明細書で使用される「キメラ受容体変異体ポリヌクレオチド」または「キメラ受容体変異体核酸配列」とは、下記で規定される、ポリペプチドをコードする核酸分子であって、抗原結合ドメインをコードするポリヌクレオチド、スペーサードメインをコードするポリヌクレオチド、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド、および／またはリンパ球刺激ドメインをコードするポリヌクレオチドなど、表１において示されるポリヌクレオチド配列またはそれに具体的に由来する断片との少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する核酸分子を指す。通常、ポリヌクレオチドまたはその断片のキメラ受容体変異体は、表１に示される核酸配列またはそれに由来する断片との、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％の核酸配列同一性を有し、なおより好ましくは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するであろう。変異体は、天然のヌクレオチド配列を包摂しない。この点で、遺伝子コードの縮重性に起因して、当業者は、表１のヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する多数のキメラ受容体変異体ポリヌクレオチドは、表２のアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることを即座に認識するであろう。

「実質的に精製された」とは、他の分子種類を本質的に含まない分子、または他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。実質的に精製された細胞はまた、その自然発生の状態において通常会合している他の細胞型から分離された細胞も指す。いくつかの場合において、実質的に精製された細胞集団とは、均質な細胞集団を指す。

正常細胞上の腫瘍抗原または他の分子の存在について使用される場合の「実質的に見出されない」とは、抗原もしくは分子を有する正常細胞型の百分率、および／または細胞上の抗原の密度を指す。実施形態では、実質的に見出されないとは、抗原または分子が、正常細胞型のうちの５０％未満の上で見出され、かつ／あるいは細胞の量または腫瘍細胞もしくは他の疾患細胞上で見出される抗原の量と比較して５０％小さな密度であることを意味する。

本明細書で使用される「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、任意の哺乳動物、好ましくは霊長動物、サル、イヌ、およびヒトを含む種に由来しうる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、レシピエント被験体と同種であり（同じ種であるが異なるドナーに由来し）、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、自家であり（ドナーとレシピエントとが同じであり）、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、同系である（ドナーとレシピエントとが異なるが、一卵性双生児である）。

本開示の様態
本開示は、キメラ受容体核酸、ならびにこのような核酸を含むベクターおよび宿主細胞を提示する。キメラ受容体核酸は、特異的標的分子に対するキメラ受容体をカスタマイズするために、切り出し、他の構成成分で置きかえうる多数のモジュラー構成成分を含む。本開示は、モジュラー構成成分のうちの１つを、スペーサー構成成分とすることを提示する。驚くべきことに、シグナル伝達能を有さないと仮定されているスペーサー領域の長さは、キメラ受容体を発現させるように改変されたＴ細胞のｉｎｖｉｖｏにおける有効性に影響を及ぼし、治療活性を増強するために、個別の標的分子に応じてカスタマイズする必要があることが見出された。

一態様では、基準キメラ受容体と比較して腫瘍認識が改善し、リガンドに応答したＴ細胞増殖および／またはサイトカイン産生が増大したキメラ受容体をデザインするための方法および核酸構築物が提供される。実施形態では、各核酸が、配列および長さが他の核酸とは異なるスペーサー領域をコードする核酸ライブラリーが提供される。次いで、腫瘍認識の改善、リガンドに応答したＴ細胞増殖および／またはサイトカイン産生の増大をもたらすスペーサーを選択しうるように、核酸の各々を使用して、ｉｎｖｉｖｏにおいて（動物モデルにおいて）、かつ／またはｉｎｖｉｔｒｏにおいて調べうるキメラ受容体核酸構築物を形成することができる。

実施形態では、キメラ受容体核酸は、リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドであって、リガンドが、腫瘍特異的抗原もしくは腫瘍特異的分子またはウイルス特異的抗原もしくはウイルス特異的分子であるポリヌクレオチドと、カスタマイズされたポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチドであって、スペーサーが、Ｔ細胞増殖の増強をもたらすポリヌクレオチドと、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドと、１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドとを含む。実施形態では、標的分子のエピトープが標的細胞上の膜近位にある場合は、長鎖スペーサーを援用し、標的分子のエピトープが標的細胞上の膜遠位にある場合は、短鎖スペーサーを援用する。

キメラ受容体のデザインは、腫瘍またはウイルスの種類、腫瘍上に存在する標的抗原または標的分子、抗体の標的分子に対するアフィニティー、抗原結合ドメインおよび／または細胞内シグナル伝達ドメインに必要とされる可撓性に応じてカスタマイズすることができる。実施形態では、多数のキメラ受容体構築物を、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、かつ、ｉｎｖｉｖｏモデルにおいて調べて、養子移入後において、受容体により改変されたＴ細胞が、免疫不全マウスにおいて腫瘍細胞を死滅させ、増殖および存続する能力を決定する。実施形態では、細胞のうちの少なくとも３０％が、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて少なくとも２世代にわたり、かつ／またはｉｎｖｉｖｏにおける導入後の７２時間以内において増殖する能力をもたらすキメラ受容体を選択する。実施形態では、ｉｎｖｉｖｏの免疫不全マウスにおいて、細胞のうちの５０％超が、７２時間以内に活性化誘導型細胞死（ＡＩＣＤ）を受け、腫瘍細胞の根絶に失敗することを結果としてもたらすキメラ受容体は選択しない。

標的分子が、被験体の腫瘍細胞上に存在するのかどうかに応じて、キメラ受容体は、その標的分子に特異的に結合するリガンド結合ドメインを含む。実施形態では、被験体の腫瘍細胞を、細胞表面の腫瘍分子について特徴付ける。標的分子は、特定の被験体の腫瘍細胞上のその存在の決定に基づき選択することができる。実施形態では、主に腫瘍細胞上では見出されるが、正常組織上では実質的な程度では見出されない細胞表面分子である標的分子を選択する。実施形態では、ターゲティングされた細胞表面分子上のエピトープに結合する抗体を選択する。場合によっては、エピトープを、細胞膜に対するその近接性に照らして特徴付ける。エピトープが、構造解析により標的細胞膜から離れて存在することが予測されるかまたは公知である代替的エピトープより、構造解析により標的細胞膜の近傍に存在することが予測されるかまたは公知である場合は、膜に対して近位にあると特徴付ける。実施形態では、ｓｃＦＶがそれに由来して構築される抗体のアフィニティーを結合アッセイにより比較し、アフィニティーが異なる抗体を、Ｔ細胞内で発現するキメラ受容体フォーマットで検討して、標的細胞に対する優れた細胞傷害作用、ならびに／またはＴ細胞によるサイトカイン産生およびＴ細胞の増殖に基づき、どれほどのアフィニティーにより最適な腫瘍認識が付与されるのかを決定する。

加えて、キメラ受容体のスペーサー領域を変化させて、Ｔ細胞による標的細胞上のリガンドの認識を最適化することもできる。実施形態では、抗体が、膜に対して極めて近位にある、標的細胞上のエピトープに結合する場合は、約１５アミノ酸より長いスペーサーを選択する。例えば、実施形態では、標的抗原上のエピトープまたはその一部分が、膜貫通ドメインと隣接する細胞外ドメインの直鎖状配列の最初の１００アミノ酸内にある場合は、長鎖スペーサー領域を選択することができる。実施形態では、抗体が、膜に対して遠位にある、標的細胞上のエピトープに結合する場合は、約１１９または１５アミノ酸以下のスペーサーを選択する。例えば、実施形態では、エピトープまたはその一部分が、末端から１５０アミノ酸の直鎖状の細胞外ドメインの配列内に見出される場合は、短鎖または中間鎖スペーサーを活用することができる。実施形態では、スペーサーは、アミノ酸配列Ｘ_１ＰＰＸ_２Ｐを含む。

主要ドメインと共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインとの様々な組合せを援用して、ｉｎｖｉｖｏにおけるキメラ受容体の有効性を増強することができる。実施形態では、キメラ受容体の異なる構築物を、ｉｎｖｉｖｏの動物モデルにおいて調べて、腫瘍を死滅させるための有効性を決定することができる。実施形態では、共刺激性細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８およびその改変バージョン、４−１ＢＢおよびその改変バージョン、ならびにこれらの組合せからなる群から選択される。ＯＸ４０など、他の共刺激ドメインも組み込むことができる。

ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞は、それらが投与後長時間にわたり存続することを可能とする内因性プログラミングを有し、それにより、この細胞が免疫療法に好ましいＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセットとなる。実施形態では、分取精製ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞から調製されるＣＤ１９特異的キメラ受容体により改変された細胞傷害性Ｔ細胞を、ＣＤ４＋ＣＤ１９特異的キメラ受容体により改変されたＴ細胞の存在下または非存在下で投与する。実施形態では、腫瘍特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏにおいて抗腫瘍反応性を及ぼし、腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を支援する。具体的な実施形態では、ナイーブサブセットまたはセントラルメモリーサブセットから選択した腫瘍特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞を、単独で、またはＣＤ８^＋Ｔ_ＣＭと組み合わせて活用する。

核酸、ベクター、およびポリペプチド本開示は、リンパ球を形質転換するかまたはリンパ球に形質導入するのに有用なキメラ受容体核酸であって、養子免疫療法における使用のためのキメラ受容体核酸を提示する。実施形態では、核酸は、核酸のエレメントの容易な置換をもたらす多数のモジュラー構成成分を含有する。本開示の範囲を限定する意図はないが、ｉｎｖｉｖｏにおける有効性および哺乳動物細胞内の効率的な発現をもたらすために、各腫瘍抗原に対するキメラ受容体は、構成成分との関係でカスタマイズすることが所望であると考えられている。例えば、具体的な実施形態では、膜遠位のＩｇ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメインに位置するＲＯＲ１エピトープに結合するｓｃＦＶを含むキメラ受容体が有効であるためには、約１５アミノ酸以下のスペーサーを援用する。別の具体的な実施形態では、膜近位のクリングルドメインに位置するＲＯＲ１エピトープに結合するｓｃＦＶを含むキメラ受容体が有効であるためには、１５アミノ酸より長いスペーサーを援用する。別の実施形態では、ＣＤ１９に結合するｓｃＦＶを含むキメラ受容体が有効であるためには、１５アミノ酸以下のスペーサーを援用する。

実施形態では、単離キメラ受容体核酸は、リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドであって、標的分子が腫瘍特異的抗原であるポリヌクレオチドと、ポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチドであって、ポリペプチドスペーサーが約２２９アミノ酸以下であるポリペプチドと、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドと、細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドとを含む。実施形態では、発現ベクターは、本明細書で記載されるキメラ核酸を含む。また、キメラ受容体核酸の全部または一部分によりコードされるポリペプチドも、本明細書に含まれる。

リガンド結合ドメイン
実施形態では、キメラ受容体核酸は、リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。実施形態では、リガンド結合ドメインは、腫瘍特異的抗原またはウイルス特異的抗原に特異的に結合する。実施形態では、リガンド結合ドメインは、抗体またはその断片である。抗体または抗体断片をコードする核酸配列は、容易に決定することができる。具体的な実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＤ１９に特異的に結合する単鎖Ｆｖをコードする。他の具体的な実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＯＲ１に特異的に結合する単鎖Ｆｖをコードする。これらの抗体の配列は、当業者により容易に決定されることが公知であるか、または当業者が容易に決定することができる。

腫瘍抗原とは、免疫応答を誘発する腫瘍細胞により産生されるタンパク質である。本発明のリガンド結合ドメインの選択は、処置されるがんの種類に依存し、これにより、腫瘍抗原または他の腫瘍細胞表面分子をターゲティングすることができる。被験体に由来する腫瘍試料は、ある種のバイオマーカーまたは細胞表面マーカーの存在について特徴付けることができる。例えば、被験体に由来する乳がん細胞は、Ｈｅｒ２Ｎｅｕ、エストロゲン受容体、および／またはプロゲステロン受容体の各々について陽性の場合もあり、陰性の場合もある。個別の被験体の腫瘍細胞上に見出される腫瘍抗原または細胞表面分子を選択する。当技術分野では、腫瘍抗原および細胞表面分子が周知であり、例えば、がん胎児性抗原（ＣＥＡ：ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｔｉｇｅｎ）、前立腺特異的抗原、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンＢ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ１２３、ＣＳ−１、ＲＯＲ１、メソテリン、ｃ−Ｍｅｔ、ＧＤ−２、およびＭＡＧＥＡ３ＴＣＲを含む。実施形態では、標的分子は、腫瘍細胞上では見出されるが、正常組織では実質的に見出されないか、またはその発現が正常生組織以外に限定される細胞表面分子である。

他の標的分子は、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）、ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）およびＣ型肝炎ウイルスなどの感染性病原体に由来する抗原を含むがこれらに限定されない。

一実施形態では、腫瘍上の標的分子は、悪性腫瘍と関連する１つまたは複数のエピトープを含む。悪性腫瘍は、Ｔ細胞受容体またはキメラ受容体を媒介する認識のための標的抗原として用いられうる多数のタンパク質を発現させる。他の標的分子は、がん遺伝子であるＨＥＲ−２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２など、細胞の形質転換に関連する分子の群に属する。実施形態では、腫瘍抗原を、腫瘍細胞上の、同じ組織型の対照細胞と比較して選択的に発現させるか、または過剰発現させる。他の実施形態では、腫瘍抗原は、細胞表面ポリペプチドである。

キメラ受容体によりターゲティングされうる腫瘍細胞表面分子を同定したら、標的分子のエピトープを選択し、特徴付ける。実施形態では、腫瘍細胞膜に対して近位のエピトープを選択する。他の実施形態では、腫瘍細胞膜に対して遠位のエピトープを選択する。エピトープが、構造解析により標的細胞膜から離れて存在することが予測されるかまたは公知である代替的エピトープより、構造解析により標的細胞膜の近傍に存在することが予測されるかまたは公知である場合は、膜に対して近位にあると特徴付ける。

腫瘍細胞表面分子に特異的に結合する抗体は、モノクローナル抗体を得る方法、ファージディスプレイ法、ヒト抗体もしくはヒト化抗体を生成する方法、またはヒト抗体を産生するように操作されたトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物を使用する方法を使用して調製することができる。部分的または完全に合成された抗体のファージディスプレイライブラリーが利用可能であり、標的分子に結合しうる抗体またはその断片についてスクリーニングすることができる。また、ヒト抗体のファージディスプレイライブラリーも利用可能である。実施形態では、抗体は、腫瘍細胞表面分子に特異的に結合し、ウシ血清アルブミンまたは他の非類縁抗原などの非特異的構成成分とは交差反応しない。同定されると、抗体をコードするアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列は、単離および／または決定することができる。

抗体または抗原結合断片は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、二特異性抗体、ミニボディー、および直鎖状抗体の全部または一部分を含む。抗体断片は、無傷抗体の一部分、好ましくは無傷抗体の抗原結合領域または可変領域を含み、容易に調製することができる。抗体断片の例は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、およびＦｖ断片；ダイアボディー；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成される多特異性抗体を含む。

実施形態では、特定の腫瘍細胞表面分子に結合する多数の異なる抗体を単離し、特徴付けることができる。実施形態では、ターゲティングされる分子のエピトープ特異性に基づき抗体を特徴付ける。加えて、場合によっては、同じエピトープに結合する抗体を、そのエピトープに対する抗体のアフィニティーに基づき選択することもできる。実施形態では、抗体は、少なくとも１ｍＭのアフィニティーを有し、好ましくは＜５０ｎＭのアフィニティーを有する。実施形態では、エピトープに対するアフィニティーが他の抗体と比較して大きな抗体を選択する。例えば、アフィニティーが、同じエピトープに結合する基準抗体の少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍である抗体を選択する。

実施形態では、標的分子は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ１２３、ＣＳ−１、ＲＯＲ１、メソテリン、Ｈｅｒ２、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、ＧＤ−２、ＭＡＧＥＡ３ＴＣＲ、およびこれらの組合せからなる群から選択される。

具体的な実施形態では、標的抗原は、ＣＤ１９である。当業者には、ＣＤ１９に特異的な多数の抗体が公知であり、配列、エピトープへの結合、およびアフィニティーについて容易に特徴付けることができる。具体的な実施形態では、キメラ受容体構築物は、ＦＭＣ６３抗体に由来するｓｃＦＶ配列を含む。他の実施形態では、ｓｃＦＶは、ＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮのＣＤＲＬ１配列、ＳＲＬＨＳＧＶのＣＤＲＬ２配列、およびＧＮＴＬＰＹＴＦＧのＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含むヒトｓｃＦｖまたはヒト化ｓｃＦｖである。他の実施形態では、ｓｃＦＶは、ＤＹＧＶＳのＣＤＲＨ１配列、ＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳのＣＤＲＨ２配列、およびＹＡＭＤＹＷＧのＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含むヒトｓｃＦｖまたはヒト化ｓｃＦｖである。本開示はまた、ＦＭＣ６３のｓｃＦｖのアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有し、ＣＤ１９に対して少なくとも同じアフィニティーを有する可変領域も想定する。実施形態では、キメラ受容体は、１１９アミノ酸以下または１２アミノ酸以下の短鎖スペーサーまたは中間鎖スペーサーを有する。具体的な実施形態では、スペーサーは、１２アミノ酸以下であり、配列番号４の配列を有する。

実施形態では、ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔにより以下：軽鎖では、アミノ酸２４〜３４におけるＣＤＲＬ１；アミノ酸５０〜５６におけるＣＤＲＬ２；アミノ酸８９〜９７におけるＣＤＲＬ３；重鎖では、アミノ酸３１〜３５におけるＣＤＲＨ１；アミノ酸５０〜６５におけるＣＤＲＨ２；およびアミノ酸９５〜１０２におけるＣＤＲＨ３の通りに番号付けされる抗体領域内に見出される。抗体内のＣＤＲ領域は、容易に決定することができる。

具体的な実施形態では、標的抗原は、ＲＯＲ１である。当業者には、ＲＯＲ１に特異的な多数の抗体が公知であり、配列、エピトープへの結合、およびアフィニティーについて容易に特徴付けることができる。具体的な実施形態では、キメラ受容体構築物は、Ｒ１２抗体に由来するｓｃＦＶ配列を含む。他の実施形態では、ｓｃＦＶは、ＡＳＧＦＤＦＳＡＹＹＭのＣＤＲＬ１配列、ＴＩＹＰＳＳＧのＣＤＲＬ２配列、およびＡＤＲＡＴＹＦＣＡのＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含むヒトｓｃＦｖまたはヒト化ｓｃＦｖである。他の実施形態では、ｓｃＦＶは、ＤＴＩＤＷＹのＣＤＲＨ１配列、ＶＱＳＤＧＳＹＴＫＲＰＧＶＰＤＲのＣＤＲＨ２配列、およびＹＩＧＧＹＶＦＧのＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含むヒトｓｃＦｖまたはヒト化ｓｃＦｖである。本開示はまた、Ｒ１２のｓｃＦｖのアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有し、ＲＯＲ１に対して少なくとも同じアフィニティーを有する可変領域も想定する。実施形態では、キメラ受容体は、１１９アミノ酸以下または１２アミノ酸以下の短鎖スペーサーまたは中間鎖スペーサーを有する。具体的な実施形態では、スペーサーは、１２アミノ酸以下であり、配列番号４の配列を有する。

具体的な実施形態では、標的抗原は、ＲＯＲ１である。当業者には、ＲＯＲ１に特異的な多数の抗体が公知であり、配列、エピトープへの結合、およびアフィニティーについて容易に特徴付けることができる。具体的な実施形態では、キメラ受容体構築物は、Ｒ１１抗体に由来するｓｃＦＶ配列を含む。他の実施形態では、ｓｃＦＶは、ＳＧＳＤＩＮＤＹＰＩＳのＣＤＲＬ１配列、ＩＮＳＧＧＳＴのＣＤＲＬ２配列、およびＹＦＣＡＲＧＹＳのＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含むヒトｓｃＦｖまたはヒト化ｓｃＦｖである。他の実施形態では、ｓｃＦＶは、ＳＮＬＡＷのＣＤＲＨ１配列、ＲＡＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳのＣＤＲＨ２配列、およびＮＶＳＹＲＴＳＦのＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含むヒトｓｃＦｖまたはヒト化ｓｃＦｖである。本開示はまた、Ｒ１１のｓｃＦｖのアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有し、ＲＯＲ１に対して少なくとも同じアフィニティーを有する可変領域も想定する。実施形態では、キメラ受容体は、２２９アミノ酸以下の長鎖スペーサーを有する。具体的な実施形態では、スペーサーは、２２９アミノ酸であり、配列番号５０の配列を有する。

具体的な実施形態では、標的抗原は、Ｈｅｒ２である。当業者には、Ｈｅｒ２に特異的な多数の抗体が公知であり、配列、エピトープへの結合、およびアフィニティーについて容易に特徴付けることができる。具体的な実施形態では、キメラ受容体構築物は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ抗体に由来するｓｃＦＶ配列を含む。他の実施形態では、ｓｃＦＶは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ抗体のＣＤＲＬ１配列、ＣＤＲＬ２配列およびＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖を含むヒトｓｃＦｖまたはヒト化ｓｃＦｖである。他の実施形態では、ｓｃＦＶは、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎのＣＤＲＨ１配列、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖を含むヒトｓｃＦｖまたはヒト化ｓｃＦｖである。ＣＤＲ配列は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎのアミノ酸配列から容易に決定することができる。本開示はまた、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎのｓｃＦｖのアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有し、Ｈｅｒ２に対して少なくとも同じアフィニティーを有する可変領域も想定する。実施形態では、キメラ受容体は、２２９アミノ酸以下の長鎖スペーサーを有する。具体的な実施形態では、スペーサーは、２２９アミノ酸であり、配列番号５０の配列を有する。

実施形態では、リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを、スペーサー領域をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結する。実施形態では、リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドはまた、ポリヌクレオチドの、異なる抗原をコードするかまたは異なる結合特徴を有するリガンド結合ドメインをコードする別のポリヌクレオチドによる容易な切出しおよび置きかえをもたらすために、コード配列の５’末端および／または３’末端において、１つまたは複数の制限酵素部位も有しうる。例えば、制限部位であるＮｈｅＩは、リーダー配列の上流にコードされ、３’側ＲｓｒＩＩは、任意の所望のｓｃＦｖの、キメラ受容体ベクターへのサブクローニングを可能とするヒンジ領域内に配置される。実施形態では、ポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞内の発現のためにコドンを最適化する。

実施形態では、リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを、シグナルペプチドに作動可能に連結する。実施形態では、シグナルペプチドは、顆粒球コロニー刺激因子のシグナルペプチドである。ＣＤ８アルファなど、他のシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドも活用することができる。

実施形態では、リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを、プロモーターに作動可能に連結する。哺乳動物細胞内のキメラ抗原受容体の発現をもたらすプロモーターを選択する。具体的な実施形態では、プロモーターは、伸長因子（ＥＦ−１）プロモーターである。適切なプロモーターの別の例は、サイトメガロウイルス即初期（ＣＭＶ）プロモーター配列である。しかし、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルスウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｕＭｏＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン−バーウイルス即初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターのほか、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターなどであるがこれらに限定されない、ヒト遺伝子プロモーターを含むがこれらに限定されない他の構成的プロモーター配列もまた使用することができる。また、誘導的プロモーターも想定される。誘導的プロモーターの例は、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターを含むがこれらに限定されない。

リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドの具体的実施形態を、ＦＭＣ６３など、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体に由来するｓｃＦｖとして、表１に示す。アミノ酸ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号３６）を含む可撓性のリンカーをコードするポリヌクレオチドは、ｓｃＦＶ内のＶＨ鎖とＶＬ鎖とを隔てる。リンカーを含むｓｃＦｖのアミノ酸配列を、表２（配列番号１１）に示す。ＳＪ２５Ｃ１およびＨＤ３７など、他のＣＤ１９ターゲティング抗体も公知である（ＳＪ２５Ｃ１：Ｂｅｊｃｅｋら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、２００５年、ＰＭＩＤ７５３８９０１；ＨＤ３７：Ｐｅｚｕｔｔｏら、ＪＩ、１９８７年、ＰＭＩＤ２４３７１９９）。

スペーサー
実施形態では、キメラ受容体核酸は、スペーサー領域をコードするポリヌクレオチドを含む。驚くべきことに、シグナル伝達能を有さないと仮定されているスペーサー領域の長さは、キメラ受容体を発現させるように改変されたＴ細胞のｉｎｖｉｖｏにおける有効性に影響を及ぼし、最適な腫瘍細胞または標的細胞の認識のために、個別の標的分子に応じてカスタマイズする必要があることが見出された。実施形態では、キメラ受容体核酸は、スペーサー領域をコードするポリヌクレオチドのライブラリーから選択したカスタマイズ可能なスペーサー領域をコードするポリヌクレオチドを含む。実施形態では、エピトープの位置、エピトープに対する抗体のアフィニティー、ならびに／またはキメラ受容体を発現させるＴ細胞が、抗原認識に応答してｉｎｖｉｔｒｏおよび／もしくはｉｎｖｉｖｏにおいて増殖する能力に基づき、スペーサー長を選択する。

典型的に、スペーサー領域は、キメラ受容体のリガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間で見出される。実施形態では、スペーサー領域は、リンパ球内の高い発現レベルを可能とするリガンド結合ドメインの可撓性をもたらす。約２２９アミノ酸のスペーサードメインを有するＣＤ１９特異的キメラ受容体の抗腫瘍活性は、改変ＩｇＧ４ヒンジだけを含む短鎖スペーサー領域を伴うＣＤ１９特異的キメラ受容体より小さかった。また、Ｒ１２ｓｃＦｖまたは２Ａ２ｓｃＦｖから構築されるキメラ受容体など、他のキメラ受容体も、Ｔ細胞エフェクター機能の最適な誘発のために、短鎖スペーサーを要求するが、Ｒ１１ＲＯＲ１ｓｃＦｖにより構築されるキメラ受容体は、腫瘍認識のために約２２９アミノ酸の長鎖スペーサードメインを要求する。

実施形態では、スペーサー領域は、少なくとも約１０〜２２９アミノ酸、約１０〜２００アミノ酸、約１０〜１７５アミノ酸、約１０〜１５０アミノ酸、約１０〜１２５アミノ酸、約１０〜１００アミノ酸、約１０〜７５アミノ酸、約１０〜５０アミノ酸、約１０〜４０アミノ酸、約１０〜３０アミノ酸、約１０〜２０アミノ酸、または約１０〜１５アミノ酸を有し、列挙された範囲のうちのいずれかの端点間の任意の整数を含む。実施形態では、スペーサー領域は、約１２アミノ酸以下、約１１９アミノ酸以下、または約２２９アミノ酸以下を有する。

いくつかの実施形態では、スペーサー領域は、免疫グロブリン様分子のヒンジ領域に由来する。実施形態では、スペーサー領域は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、またはヒトＩｇＧ４に由来するヒンジ領域の全部または一部分を含み、１カ所または複数カ所のアミノ酸置換を含有しうる。ヒンジ領域の例示的な配列を表８に提示する。実施形態では、ヒンジ領域の一部分は、可変重鎖とコアとの間で見出される上側ヒンジアミノ酸と、ポリプロリン領域を含むコアヒンジアミノ酸とを含む。典型的に、上側ヒンジ領域は、約３〜１０アミノ酸を有する。場合によっては、スペーサー領域は、Ｘ_１ＰＰＸ_２Ｐのアミノ酸配列（配列番号１）を含む。実施形態では、Ｘ_１は、システイン、グリシン、またはアルギニンであり、Ｘ２は、システインまたはトレオニンである。

実施形態では、二量体化など、所望されない構造的相互作用を回避するために、ヒンジ領域の配列を、１つまたは複数のアミノ酸において改変することができる。具体的な実施形態では、スペーサー領域は、例えば、表２または表８（配列番号２１）に示される、ＩｇＧ４に由来する改変ヒトヒンジ領域の一部分を含む。改変ＩｇＧ４ヒンジ領域の一部分をコードするポリヌクレオチドの代表例を、表１（配列番号４）に提示する。実施形態では、ヒンジ領域は、表２または表８で同定されるヒンジ領域のアミノ酸配列との、少なくとも約９０％、９２％、９５％、または１００％の配列同一性を有しうる。具体的な実施形態では、ＩｇＧ４に由来するヒトヒンジ領域の一部分は、コアアミノ酸内の、ＣＰＳＰからＣＰＰＣへのアミノ酸置換を有する。

いくつかの実施形態では、ヒンジ領域の全部または一部分を、免疫グロブリンの定常領域の１つまたは複数のドメインと組み合わせる。例えば、ヒンジ領域の一部分は、ＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメインまたはこれらの変異体の全部または一部分と組み合わせることができる。実施形態では、スペーサー領域は、ＣＤ８アルファに由来する４７〜４８アミノ酸のヒンジ領域の配列またはＣＤ２８分子の細胞外部分からなるスペーサー領域を含まない。

実施形態では、短鎖スペーサー領域は、約１２アミノ酸以下を有し、ＩｇＧ４ヒンジ領域配列またはこれらの変異体の全部または一部分を含み、中間鎖スペーサー領域は、約１１９アミノ酸以下を有し、ＩｇＧ４ヒンジ領域配列およびＣＨ３領域またはこれらの変異体の全部または一部分を含み、長鎖スペーサーは、約２２９アミノ酸以下を有し、ＩｇＧ４ヒンジ領域配列、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域またはこれらの変異体の全部または一部分を含む。

スペーサー領域をコードするポリヌクレオチドは、合成法または組換え法により、アミノ酸配列から容易に調製することができる。実施形態では、スペーサー領域をコードするポリヌクレオチドは、膜貫通領域をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。実施形態では、スペーサー領域をコードするポリヌクレオチドはまた、ポリヌクレオチドの、異なるスペーサー領域をコードする別のポリヌクレオチドによる容易な切出しおよび置きかえをもたらすために、コード配列の５’末端および／または３’末端において、１つまたは複数の制限酵素部位も有しうる。実施形態では、スペーサー領域をコードするポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞内の発現のためにコドンを最適化する。

実施形態では、各々が異なるスペーサー領域をコードするポリヌクレオチドのライブラリーが提供される。実施形態では、スペーサー領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４、またはその部分に由来するヒンジ領域配列、ＣＨ２領域またはその変異体の全部または一部分と組み合わせた、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来するヒンジ領域配列、ＣＨ３領域またはその変異体の全部または一部分と組み合わせた、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来するヒンジ領域配列、ＣＨ２領域またはその変異体およびＣＨ３領域またはその変異体の全部または一部分と組み合わせた、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来するヒンジ領域配列からなる群から選択される。実施形態では、短鎖スペーサー領域は、１２アミノ酸以下を有する、改変ＩｇＧ４ヒンジ配列（配列番号４）であり、中間鎖配列は、ＣＨ３配列を伴い、１１９アミノ酸以下を有する、ＩｇＧ４ヒンジ配列（配列番号４９）、またはＣＨ２領域およびＣＨ３領域を伴い、２２９アミノ酸以下を有する、ＩｇＧ４ヒンジ配列（配列番号５０）である。

本明細書において、実施形態では、キメラ受容体のためのスペーサー領域を選択する方法が提示される。驚くべきことに、いくつかのキメラ受容体構築物は、ｉｎｖｉｔｒｏでは、Ｔ細胞を活性化させ、それらによる腫瘍細胞の殺滅を方向付けるのに有効であったが、ｉｎｖｉｖｏでは有効でなかった。加えて、キメラ受容体改変Ｔ細胞の副作用プロファイルは、多くの細胞が活性化誘導型細胞死を受けるか、またはｉｎｖｉｖｏにおけるサイトカインの増大を引き起こすことを結果としてもたらすような副作用プロファイルでありうる。実施形態では、方法は、複数のキメラ受容体核酸を提供するステップであって、キメラ受容体核酸がスペーサー領域内でだけ異なるステップと、キメラ受容体核酸の各々を、別々のＴリンパ球集団へと導入するステップと、各別々のリンパ球集団をｉｎｖｉｔｒｏにおいて増やすステップと、各リンパ球集団を、腫瘍を保有する動物へと導入して、キメラ受容体の各々の、Ｔ細胞内で発現させる場合の抗腫瘍有効性を決定するステップと、他のキメラ受容体の各々により改変された他の別々のリンパ球集団の各々と比較して抗腫瘍有効性をもたらすキメラ受容体を選択するステップとを含む。

異なる腫瘍の動物モデルが公知である。抗腫瘍有効性は、腫瘍容量の減少を同定することにより測定することもでき、動物の死、ｉｎｖｉｖｏにおける遺伝子改変Ｔ細胞の存続、遺伝子改変Ｔ細胞の活性化（例えば、ＣＤ２５および／ＣＤ６９の発現の増大を検出することによる）、および／またはｉｎｖｉｖｏにおける遺伝子改変Ｔ細胞の増殖を決定することにより測定することもできる。実施形態では、これらのパラメータのうちの１つまたは複数により決定される、ｉｎｖｉｖｏにおける最良の抗腫瘍有効性をもたらすキメラ受容体を選択する。抗腫瘍有効性の欠如は、ｉｎｖｉｖｏにおける遺伝子改変リンパ球の存続の欠如、動物の死、カスパーゼ３の誘導の増大により測定されるアポトーシスの増大、および／または遺伝子改変リンパ球の増殖の低下により決定することができる。

他の実施形態では、スペーサーを選択するための方法は、標的分子のエピトープを選択するステップと、エピトープの位置を、細胞膜に照らして特徴付けるステップと、細胞膜に照らしたエピトープの位置に応じて長鎖または短鎖であるスペーサー領域を選択するステップと、エピトープに対するアフィニティーが基準抗体と比較して大きいかまたは小さい抗体またはその断片を選択するステップと、キメラ受容体構築物が、ｉｎｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎｖｉｖｏにおいて、Ｔ細胞増殖またはサイトカイン産生の増強をもたらすのかどうかを決定するステップとを含む。

いくつかの実施形態では、標的エピトープまたはその一部分は、それが膜に対して近位に位置する場合、膜貫通ドメインと隣接する細胞外ドメインの直鎖状配列の最初の１００アミノ酸に位置する。エピトープが膜に対して近位に位置する場合は、長鎖スペーサー（例えば、２２９アミノ酸以下であり、かつ、１１９アミノ酸を超える）を選択する。いくつかの実施形態では、標的エピトープは、それが膜に対して遠位に位置する場合、細胞外ドメイン末端の直鎖状配列の最初の１５０アミノ酸に位置する。エピトープが膜に対して遠位に位置する場合は、中間鎖スペーサーまたは短鎖スペーサー（例えば、１１９アミノ酸以下、または１２〜１５アミノ酸以下）を選択する。代替的に、エピトープが膜に対して近位であるのか遠位であるのかは、三次元構造をモデル化することにより決定することもでき、結晶構造解析に基づき決定することもできる。

いくつかの実施形態では、細胞のうちの少なくとも３０％が、ｉｎｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎｖｉｖｏにおいて２世代にわたり増殖しているキメラ受容体を選択する。他の実施形態では、細胞のうちの少なくとも５０％が、７２時間以内に活性化誘導型細胞死を受ける結果をもたらす場合は、キメラ受容体を選択しない。実施形態では、エピトープが、膜に対して遠位に位置する場合、短鎖スペーサー（例えば、１５アミノ酸以下）を選択する。実施形態では、エピトープが、膜に対して近位に位置する場合、長鎖スペーサー（例えば、２２９アミノ酸以下であり、かつ、１１９アミノ酸を超える）を選択する。

実施形態では、複数のキメラ受容体核酸を提供するステップであって、キメラ受容体核酸がスペーサー領域内でだけ異なるステップは、リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドであって、リガンドが、腫瘍特異的抗原、ウイルス抗原、またはリンパ球による認識および除去を媒介するのに適する、標的細胞集団上で発現する任意の他の分子であるポリヌクレオチドと、第１のポリペプチドスペーサーのコード配列の５’末端および３’末端において、規定された制限部位を有する第１のポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチドと、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドと、１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドとを含むキメラ受容体構築物を提供することを含む。

実施形態では、方法は、各々が異なるスペーサー領域をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを提供するステップをさらに含む。実施形態では、異なるスペーサー領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４、またはこれらの変異体もしくはその部分に由来するヒンジ領域配列、ＣＨ２領域またはその変異体の全部または一部分と組み合わせた、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来するヒンジ領域配列、ＣＨ３領域またはその変異体の全部または一部分と組み合わせた、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来するヒンジ領域配列、ＣＨ２領域またはその変異体およびＣＨ３領域またはその変異体の全部または一部分と組み合わせた、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４に由来するヒンジ領域配列からなる群から選択される。実施形態では、リンパ球内の発現をもたらすために、かつ／または他の分子との相互作用を最小化するために、ＣＨ２領域またはＣＨ３領域を、１カ所または複数カ所の欠失またはアミノ酸置換により改変することができる。実施形態では、ヒンジ領域の一部分は、少なくとも上方のアミノ酸配列およびコア配列を含む。実施形態では、ヒンジ領域は、配列Ｘ_１ＰＰＸ_２Ｐを含む。

実施形態では、方法は、スペーサー領域をコードするポリヌクレオチドを、異なるスペーサー領域をコードするポリヌクレオチドで置きかえて、異なるスペーサー領域を伴うキメラ受容体核酸を形成するステップをさらに含む。方法を繰り返して、各々のスペーサー領域が異なる任意の数のキメラ受容体核酸を形成することができる。実施形態では、キメラ受容体核酸は、スペーサー領域だけにおいて互いと異なる。

膜貫通ドメイン
実施形態では、キメラ受容体核酸は、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。膜貫通ドメインは、キメラ受容体の膜内のアンカリングをもたらす。

実施形態では、キメラ受容体内のドメインのうちの１つと天然で会合する膜貫通ドメインを使用する。場合によっては、このようなドメインの、同じ表面膜タンパク質または異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに対する結合を回避するアミノ酸置換により、膜貫通ドメインを選択または改変して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化することもできる。

膜貫通ドメインは、天然の供給源に由来する場合もあり、合成の供給源に由来する場合もある。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来しうる。膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２；ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ１５４の少なくとも膜貫通領域（複数可）を含む。具体的な実施形態では、膜貫通ドメインは、表２に示されるＣＤ２８の膜貫通ドメインのアミノ酸配列を含む。ＣＤ２８の膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチド配列の代表例を、表１（配列番号５）に示す。

膜貫通ドメインは、合成の場合もあり、自然発生の膜貫通ドメインの変異体の場合もある。実施形態では、合成または変異体の膜貫通ドメインは主に、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含む。実施形態では、膜貫通ドメインは、表２または表６に示される膜貫通ドメインとの、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のアミノ酸配列の同一性を有しうる。変異体の膜貫通ドメインは、ＫｙｔｅＤｏｏｌｉｔｔｌｅにより計算される疎水性スコアが、少なくとも５０であることが好ましい。

膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドは、合成法または組換え法により容易に調製することができる。実施形態では、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドは、細胞内シグナル伝達領域をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。実施形態では、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドはまた、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドの、異なる膜貫通ドメインをコードする別のポリヌクレオチドによる容易な切出しおよび置きかえをもたらすために、コード配列の５’末端および／または３’末端において、１つまたは複数の制限酵素部位も有しうる。実施形態では、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞内の発現のためにコドンを最適化する。

細胞内シグナル伝達ドメイン
実施形態では、キメラ受容体核酸は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、腫瘍細胞上の発現するリガンドに結合すると、キメラ受容体を発現させる形質導入細胞の１つの機能の活性化をもたらす。実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、形質導入細胞の少なくとも１つの機能の活性化をもたらす、細胞内シグナル伝達ドメインの一部分および／または変異体である。

本開示のキメラ受容体における使用のための細胞内シグナル伝達ドメインの例は、ＣＤ３ゼータ鎖の細胞質配列および／またはキメラ受容体との係合の後でシグナル伝達を誘発するように協同的に作用する共受容体のほか、これらの配列の任意の誘導体または変異体、および同じ機能的能力を有する任意の合成配列も含む。Ｔ細胞の活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列：抗原依存的な一次活性化を誘発し、Ｔ細胞受容体様シグナル（一次細胞質シグナル伝達配列）をもたらす細胞質シグナル伝達配列、および抗原非依存的な様式で作用して、二次シグナルまたは共刺激シグナル（二次細胞質シグナル伝達配列）をもたらす細胞質シグナル伝達配列により媒介されるということができる。刺激性の様式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして公知のシグナル伝達モチーフを含有しうる。ＩＴＡＭを含有する一次細胞質シグナル伝達配列の例は、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来する一次細胞質シグナル伝達配列を含む。実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、表２に提示される配列を有するＣＤ３ゼータに対する、少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％の配列同一性を有しうる。実施形態では、ＣＤ３ゼータの変異体は、表７に示される、少なくとも１つ、２つ、３つ、または全てのＩＴＡＭ領域を保持する。

好ましい実施形態では、キメラ受容体の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメイン自体または任意の他の所望の細胞質ドメイン（複数可）と組み合わせたＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインを含むようにデザインすることができる。例えば、キメラ受容体の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖および共刺激シグナル伝達領域を含みうる。

共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激性分子の細胞内ドメインを含むキメラ受容体の一部分を指す。共刺激性分子とは、リンパ球の抗原に対する応答に要求される、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。このような分子の例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンドを含む。実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、表５に示されるＣＤ２８の細胞内ドメインまたは表２に提示される配列を有する４−１ＢＢに対する、少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％のアミノ酸配列の同一性を有しうる。実施形態では、ＣＤ２８細胞内ドメインの変異体は、ＬＬをＧＧで置換する、１８６〜１８７位におけるアミノ酸置換を含む。

キメラ受容体の細胞内シグナル伝達配列は、ランダムな順序で互いと連結することもでき、指定された順序で互いと連結することもできる。任意選択で、短鎖のオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー、好ましくは長さが２〜１０アミノ酸の間のオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーは、連結を形成しうる。一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ゼータまたはその変異体のシグナル伝達ドメインの全部または一部分、およびＣＤ２８またはその変異体のシグナル伝達ドメインの全部または一部分を含む。別の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ゼータまたはその変異体のシグナル伝達ドメインの全部または一部分、および４−１ＢＢまたはその変異体のシグナル伝達ドメインの全部または一部分を含む。さらに別の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ゼータまたはその変異体のシグナル伝達ドメインの全部または一部分、ＣＤ２８またはその変異体のシグナル伝達ドメインの全部または一部分、および４−１ＢＢまたはその変異体のシグナル伝達ドメインの全部または一部分を含む。具体的な実施形態では、ＣＤ３ゼータの変異体を含む細胞内シグナル伝達ドメイン、および４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインの一部分のアミノ酸配列を、表２に提示する。核酸配列の代表例を、表１（配列番号６；配列番号７）に提示する。

実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドは、ＣＤ３ゼータドメインの一部分へと連結された４−１ＢＢ細胞内ドメインを含む。他の実施形態では、４−１ＢＢ細胞内ドメインおよびＣＤ２８細胞内ドメインを、ＣＤ３ゼータドメインの一部分へと連結する。

細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドは、合成法または組換え法により、アミノ酸配列から容易に調製することができる。実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドはまた、細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドの、異なる細胞内シグナル伝達ドメインをコードする別のポリヌクレオチドによる容易な切出しおよび置きかえをもたらすために、コード配列の５’末端および／または３’末端において、１つまたは複数の制限酵素部位も有しうる。実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞内の発現のためにコドンを最適化する。

マーカー配列
実施形態では、キメラ受容体核酸は、マーカー配列をコードするポリヌクレオチド配列を任意選択でさらに含む。マーカー配列は、形質導入細胞の選択および形質導入細胞の同定をもたらしうる。実施形態では、マーカー配列を、リンカー配列をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結する。実施形態では、リンカー配列は、切断可能なリンカー配列である。

多数の異なるマーカー配列を援用することができる。典型的に、マーカー配列は、形質導入細胞の選択および／または形質導入細胞の検出を可能とする機能的な特徴を有する。実施形態では、マーカー配列は、ヒトリンパ球の形質導入と適合的である。

陽性選択マーカーは、宿主細胞へと導入されると、遺伝子を保有する細胞の陽性選択を可能とする優性表現型を発現させる遺伝子でありうる。当技術分野では、この種類の遺伝子が公知であり、とりわけ、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）、抗生剤であるＧ４１８に対する耐性をコードするＴｎ５に由来するアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏまたはａｐｈ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ＡＤＡ）、および多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子を含む。

実施形態では、キメラ受容体核酸は、マーカー配列をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。実施形態では、マーカー配列は、表２に示される切断型上皮成長因子受容体である。切断型上皮成長因子受容体の例示的なポリヌクレオチドを、表１（配列番号９）に示す。実施形態では、マーカー配列をコードするポリヌクレオチドを、リンカー配列をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結する。具体的な実施形態では、リンカー配列は、表２に示される切断可能なリンカー配列であるＴ２Ａである。Ｔ２Ａリンカーをコードする例示的なポリヌクレオチド配列を、表１（配列番号８）に提示する。

マーカー配列をコードするポリヌクレオチドは、合成法または組換え法により、アミノ酸配列から容易に調製することができる。実施形態では、マーカー配列をコードするポリヌクレオチドを、細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結する。実施形態では、マーカー配列をコードするポリヌクレオチドはまた、マーカー配列をコードするポリヌクレオチドの、異なるマーカー配列をコードする別のポリヌクレオチドによる容易な切出しおよび置きかえをもたらすために、コード配列の５’末端および／または３’末端において、１つまたは複数の制限酵素部位も有しうる。実施形態では、マーカー配列をコードするポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞内の発現のためにコドンを最適化する。

ベクター、細胞、および細胞に形質導入する方法
Ｔリンパ球集団の選択および分取
本明細書で記載される組成物は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球および／またはＣＤ８＋Ｔリンパ球をもたらす。Ｔリンパ球は、公知の技法に従い回収し、フローサイトメトリー選択および／または免疫磁気選択など、抗体へのアフィニティー結合など、公知の技法により濃縮するかまたは枯渇させることができる。濃縮ステップおよび／または枯渇ステップの後、公知の技法（Ｒｉｄｄｅｌｌらによる米国特許第６，０４０，１７７号において記載されている技法を含むがこれらに限定されない）または当業者に明らかなその変法に従い、所望のＴリンパ球を、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて増やすことができる。実施形態では、Ｔ細胞は、患者から得られる自家Ｔ細胞である。

例えば、所望のＴ細胞集団または部分集団は、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、初期Ｔリンパ球集団を培養培地へと添加し、次いで、非分裂末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、（例えば、結果として得られる細胞集団が、増やされる初期集団内の各Ｔリンパ球につき、少なくとも約５、１０、２０、または４０以上のＰＢＭＣフィーダー細胞を含有するように）などの培養培地フィーダー細胞へと添加し、培養物をインキュベートする（例えば、Ｔ細胞の数を増やすのに十分な時間にわたり）ことにより増やすことができる。非分裂フィーダー細胞は、ガンマ線照射ＰＢＭＣフィーダー細胞を含みうる。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣを、約３０００〜３６００ラドの範囲のガンマ線で照射して、細胞分裂を防止する。所望の場合、Ｔ細胞およびフィーダー細胞の培養培地への添加の順序は、逆転することができる。培養物は、Ｔリンパ球を成長させるのに適する温度などの条件下でインキュベートしうることが典型的である。ヒトＴリンパ球を成長させるには、例えば、温度は一般に、少なくとも摂氏約２５度、好ましくは少なくとも約３０度、より好ましくは約３７度となろう。

増やされたＴリンパ球は、ヒト腫瘍または病原体上に存在する抗原に特異的でありうるＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびＣＤ４^＋ヘルパーＴリンパ球を含む。

任意選択で、増殖法は、非分裂ＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）を、フィーダー細胞として添加するステップをさらに含みうる。ＬＣＬは、約６０００〜１０，０００ラドの範囲のガンマ線で照射することができる。ＬＣＬフィーダー細胞は、ＬＣＬフィーダー細胞の初期Ｔリンパ球に対する比を少なくとも約１０：１とするなど、任意の適切な量で提供することができる。

任意選択で、増殖法は、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体を、培養培地へと添加する（例えば、少なくとも約０．５ｎｇ／ｍｌの濃度で）ステップをさらに含みうる。任意選択で、増殖法は、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５を、培養培地へと添加する（例えば、ここで、ＩＬ−２の濃度は、１ｍｌ当たり少なくとも約１０単位である）ステップをさらに含みうる。

Ｔリンパ球を単離した後で、細胞傷害性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ球のいずれも、増やす前に、または増やした後で、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、およびエフェクターＴ細胞の部分集団へと分取することができる。

ＣＤ８＋細胞は、標準的な方法を使用することにより得ることができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋細胞を、これらのＣＤ８＋細胞型の各々と関連する細胞表面抗原を同定することにより、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、およびエフェクターメモリー細胞へとさらに分取する。実施形態では、メモリーＴ細胞は、ＣＤ８＋末梢血リンパ球のＣＤ６２Ｌ＋サブセットおよびＣＤ６２Ｌ−サブセットのいずれにおいても存在する。ＰＢＭＣは、抗ＣＤ８抗体および抗ＣＤ６２Ｌ抗体による染色の後で、ＣＤ６２Ｌ− ＣＤ８＋画分およびＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８＋画分へと分取する。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーＴ_ＣＭの表現型マーカーの発現は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、およびＣＤ１２７を含み、グランザイムＢについては陰性または低度である。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、エフェクターＴ_Ｅは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、およびＣＤ１２７について陰性であり、グランザイムＢおよびパーフォリンについて陽性である。いくつかの実施形態では、ナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ１２７、およびＣＤ４５ＲＡを含むナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられる。

細胞または細胞集団が、特定の細胞表面マーカーについて陽性であるのかどうかは、表面マーカーおよびアイソタイプをマッチさせた対照抗体について特異的な抗体による染色を使用して、フローサイトメトリーにより決定することができる。マーカーについて陰性の細胞集団とは、特異的な抗体による細胞集団の、アイソタイプ対照を上回る著明な染色の非存在を指し、陽性とは、細胞集団の、アイソタイプ対照を上回る均一な染色を指す。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のマーカーの発現の低下とは、平均蛍光強度の１ｌｏｇ１０の減少および／またはマーカーを呈示する細胞の百分率の低下であって、基準細胞集団と比較した場合の、細胞のうちの少なくとも約２０％、細胞のうちの２５％、細胞のうちの３０％、細胞のうちの３５％、細胞のうちの４０％、細胞のうちの４５％、細胞のうちの５０％、細胞のうちの５５％、細胞のうちの６０％、細胞のうちの６５％、細胞のうちの７０％、細胞のうちの７５％、細胞のうちの８０％、細胞のうちの８５％、細胞のうちの９０％、細胞のうちの９５％、細胞のうちの１００％、および２０〜１００％の間の任意の％の低下を指す。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のマーカーについて陽性の細胞集団とは、マーカーを呈示する細胞の百分率であって、基準細胞集団と比較した場合の、細胞のうちの少なくとも約５０％、細胞のうちの５５％、細胞のうちの６０％、細胞のうちの６５％、細胞のうちの７０％、細胞のうちの７５％、細胞のうちの８０％、細胞のうちの８５％、細胞のうちの９０％、細胞のうちの９５％、細胞のうちの１００％、および５０〜１００％の間の任意の％である百分率を指す。

ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することにより、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、およびエフェクター細胞へと分取する。ＣＤ４＋リンパ球は、標準的な方法により得ることができる。いくつかの実施形態では、ナイーブＣＤ４＋Ｔリンパ球は、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ４５ＲＯ＋である。いくつかの実施形態では、エフェクターＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ−およびＣＤ４５ＲＯ−である。

実施形態では、抗原特異的なＣＤ４＋およびＣＤ８＋の集団は、ナイーブＴリンパ球または抗原特異的Ｔリンパ球を抗原で刺激することにより得ることができる。例えば、Ｔ細胞を感染被験体から単離し、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、細胞を同じ抗原で刺激することにより、サイトメガロウイルス抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞系またはクローンを生成することができる。ナイーブＴ細胞もまた使用することができる。腫瘍細胞に由来する任意の数の抗原を標的として活用して、Ｔ細胞応答を誘発することができる。いくつかの実施形態では、養子細胞免疫療法組成物は、固形腫瘍、血液悪性腫瘍、乳がん、または黒色腫を含む疾患または障害の処置において有用である。

Ｔリンパ球集団の改変
いくつかの実施形態では、機能的な遺伝子を、本開示に従う免疫療法において使用されるＴ細胞へと導入することが所望でありうる。例えば、導入される１つまたは複数の遺伝子は、移入Ｔ細胞の生存可能性および／または機能を促進することにより、治療の有効性を改善する場合もあり、ｉｎｖｉｖｏにおける生存または遊走の選択および／または査定を可能とする遺伝子マーカーを提供する場合もあり、例えば、ＬｕｐｔｏｎＳ．Ｄ．ら、Ｍｏｌ．ａｎｄＣｅｌｌＢｉｏｌ．、１１巻：６頁（１９９１年）；およびＲｉｄｄｅｌｌら、ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、３巻：３１９〜３３８頁（１９９２年）（また、優性の陽性選択マーカーを、陰性選択マーカーと融合させることから導出される二官能性選択用の融合遺伝子の使用について記載する、ＬｕｐｔｏｎらによるＰＣＴ／ＵＳ９１／０８４４２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０５６０１の公報も参照されたい）により記載されている通り、ｉｎｖｉｖｏにおける陰性選択に対して感受性の細胞を作製することにより、免疫療法の安全性を改善する機能を組み込む場合もある。これは、公知の技法（例えば、Ｒｉｄｄｅｌｌらによる米国特許第６，０４０，１７７号の第１４〜１７欄を参照されたい）、または本開示に基づく、当業者に明らかなその変法に従い実行することができる。

実施形態では、Ｔ細胞を、本明細書で記載されるキメラ受容体により改変する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、処置される被験体から得、他の実施形態では、リンパ球は、同種ヒトドナー、好ましくは健常ヒトドナーから得る。

いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、本明細書で記載される、腫瘍細胞表面分子に特異的に結合するリガンド結合ドメイン、ポリペプチドスペーサー領域、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。実施形態では、リガンド結合ドメインは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）に由来する単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）である。また、共刺激シグナルも、ＣＤ２８および／または４−１ＢＢの共刺激ドメインをＣＤ３ζ鎖へと融合させることを介するキメラ受容体により提供することができる。キメラ受容体は、ＨＬＡから独立している細胞表面分子に特異的であり、これにより、腫瘍細胞上のＨＬＡ拘束および低レベルのＨＬＡ発現を含む、ＴＣＲ認識の限界を克服する。

例えば、抗体分子の抗原結合断片または抗体可変ドメインを活用することにより、任意の細胞表面マーカーに特異的なキメラ受容体を構築することができる。抗原結合分子は、１つまたは複数の細胞シグナル伝達モジュールへと連結することができる。実施形態では、細胞シグナル伝達モジュールは、ＣＤ３膜貫通ドメイン、ＣＤ３細胞内シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインへと連結されたＣＤ２８膜貫通およびシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体はまた、ｔＥＧＦＲなどの形質導入マーカーも含みうる。

実施形態では、ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球の集団の各々へと、同じキメラ受容体を導入することもでき、異なるキメラ受容体を導入することもできる。実施形態では、これらの集団の各々におけるキメラ受容体は、腫瘍または感染細胞上の同じリガンドに特異的に結合するリガンド結合ドメインを有する。細胞性シグナル伝達モジュールは異なりうる。実施形態では、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の細胞内シグナル伝達ドメインと同じである。他の実施形態では、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の細胞内シグナル伝達ドメインと異なる。

実施形態では、ＣＤ４Ｔリンパ球またはＣＤ８Ｔリンパ球の各々は、本明細書で記載される形質導入の前に、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、エフェクターメモリー細胞、またはエフェクター細胞へと分取することができる。代替的な実施形態では、ＣＤ４Ｔリンパ球またはＣＤ８Ｔリンパ球の各々は、形質導入の後で、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、エフェクターメモリー細胞、またはエフェクター細胞へと分取することもできる。

遺伝子送達のために組換え感染性ウイルス粒子を活用する、多様な形質導入法が開発されている。これは現在のところ、本発明のＴリンパ球の形質導入のための好ましい手法を表す。このようにして使用されているウイルスベクターは、サルウイルス４０、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、およびレトロウイルスに由来するウイルスベクターを含む。したがって、遺伝子導入法および遺伝子発現法は数多いが、本質的に、遺伝子素材を哺乳動物細胞内に導入し、発現させるように機能する。リン酸カルシウムトランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔、ならびに組換えアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレトロウイルスベクターの感染を含む、上記の技法のうちのいくつかは、造血細胞またはリンパ球様細胞を形質導入するのに使用されている。初代Ｔリンパ球は、電気穿孔およびレトロウイルス感染またはレンチウイルス感染により形質導入することに成功している。

レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターは、遺伝子を真核細胞へと導入するための極めて効率的な方法を提供する。さらに、レトロウイルスまたはレンチウイルスの組込みは、制御された様式で行い、細胞１個当たり１つまたは数コピーの新たな遺伝子情報の安定的な組込みを結果としてもたらす。

刺激因子（例えば、リンホカインまたはサイトカイン）の過剰発現は、処置する個体に毒性でありうることが想定されている。したがって、本発明のＴ細胞をｉｎｖｉｖｏにおける陰性選択に対して感受性とする遺伝子セグメントを含むことは、本発明の範囲内にある。「陰性選択」とは、注入された細胞が、ｉｎｖｉｖｏにおける個体の状態の変化の結果として除去されうることを意味する。陰性選択用の表現型は、投与される薬剤、例えば、化合物に対する感受性を付与する遺伝子の挿入から生じうる。当技術分野では、陰性選択用の遺伝子が公知であり、とりわけ、以下：ガンシクロビル感受性を付与するＩ型単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＩＴＫ）遺伝子；細胞内ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、細胞内アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）遺伝子、および細菌性シトシンデアミナーゼを含む。

いくつかの実施形態では、ｉｎｖｉｔｒｏにおける、陰性選択用の表現型を有する細胞の選択を可能とする陽性マーカーをＴ細胞内に含むことは有用でありうる。陽性選択マーカーは、宿主細胞へと導入されると、遺伝子を保有する細胞の陽性選択を可能とする優性表現型を発現させる遺伝子でありうる。当技術分野では、この種類の遺伝子が公知であり、とりわけ、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）、抗生剤であるＧ４１８に対する耐性をコードするＴｎ５に由来するアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏまたはａｐｈ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ＡＤＡ）、および多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子を含む。

当技術分野で周知の通り、Ｔリンパ球に形質導入するために、様々な方法を援用することができる。実施形態では、形質導入は、レンチウイルスベクターを使用して実行する。

実施形態では、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞は各々、規定された集団を形成するキメラ受容体をコードする発現ベクターにより個別に改変することができる。実施形態では、次いで、これらの細胞を、これらの細胞集団の各々に固有な細胞表面抗原について分取することにより、上記で記載したナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、およびエフェクター細胞の部分集団へとさらに分取する。加えて、ＣＤ４＋細胞集団またはＣＤ８＋細胞集団は、それらのサイトカインプロファイルまたは増殖活性により選択することもできる。例えば、抗原で刺激したときに、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、およびＩＦＮγなどのサイトカインの産生の、偽形質導入細胞または形質導入ＣＤ８＋細胞と比較した増強を示すＣＤ４＋Ｔリンパ球を選択することができる。他の実施形態では、ＩＬ−２および／またはＴＮＦαの産生の増強を示す、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞またはセントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞を選択する。同様に、ＩＦＮγ産生の増強を示すＣＤ８＋細胞も、偽形質導入ＣＤ８＋細胞と比較して選択する。

実施形態では、抗原または腫瘍標的に応答して増殖するＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞を選択する。例えば、抗原または腫瘍標的で刺激したときに、偽形質導入細胞またはＣＤ８＋形質導入細胞と比較して活発に増殖するＣＤ４＋細胞を選択する。いくつかの実施形態では、抗原保有細胞に対して細胞傷害性であるＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞を選択する。実施形態では、ＣＤ４＋は、ＣＤ８＋細胞と比較して細胞傷害性が弱いことが予測されている。

好ましい実施形態では、特定の種類のがんについて確立された動物モデルを使用して、ｉｎｖｉｖｏにおいて腫瘍細胞の殺滅をもたらすＣＤ８＋セントラルメモリー細胞などの形質導入リンパ球を選択する。当業者には、このような動物モデルが公知であり、ヒトを除外する。本明細書で記載される通り、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて活性化し、腫瘍細胞を死滅させる能力にもかかわらず、リンパ球へと形質導入された全てのキメラ受容体構築物が、ｉｎｖｉｖｏにおいて腫瘍細胞を死滅させる能力を付与するわけではない。特に、ある標的分子では、長鎖スペーサー領域を伴うキメラ受容体構築物を有するＴ細胞は、ｉｎｖｉｖｏにおける腫瘍細胞の殺滅が、短鎖スペーサー領域を伴うキメラ受容体を有するＴ細胞と比較してそれほど有効でなかった。他の標的分子では、短鎖スペーサー領域を伴うキメラ受容体構築物を有するＴ細胞は、ｉｎｖｉｖｏにおける腫瘍細胞の殺滅が、長鎖スペーサー領域を伴うキメラ受容体を有するＴ細胞と比較してそれほど有効でなかった。

さらに他の実施形態では、特定の種類のがんについて確立された動物モデルを使用して、形質導入されたキメラ受容体を発現させるＴ細胞であって、ｉｎｖｉｖｏにおいて存続しうるＴ細胞を選択する。実施形態では、短鎖スペーサー領域を伴う、キメラ受容体を形質導入されたＣＤ８＋セントラルメモリー細胞は、動物へと導入した後、ｉｎｖｉｖｏにおいて、約３日間以上、１０日間以上、２０日間以上、３０日間以上、４０日間以上、または５０日間以上にわたり存続することが示されている。

本開示は、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との組合せを、組成物中で活用することを想定する。一実施形態では、キメラ受容体を形質導入されたＣＤ４＋細胞は、同じリガンド特異性を有するキメラ受容体を形質導入されたＣＤ８＋細胞と組み合わせることもでき、異なる腫瘍リガンドに特異的なＣＤ８^＋Ｔ細胞と組み合わせることもできる。他の実施形態では、キメラ受容体を形質導入されたＣＤ８＋細胞を、腫瘍上で発現する異なるリガンドに特異的なキメラ受容体を形質導入されたＣＤ４＋細胞と組み合わせる。さらに別の実施形態では、キメラ受容体により改変されたＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞とを組み合わせる。実施形態では、ＣＤ８＋細胞とＣＤ４＋細胞とは、異なる比、例えば、ＣＤ８＋細胞とＣＤ４＋細胞との１：１の比、ＣＤ８＋細胞のＣＤ４＋細胞に対する１０：１の比、またはＣＤ８＋細胞のＣＤ４＋細胞に対する１００：１の比で組み合わせることができる。実施形態では、組み合わされた集団を、ｉｎｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎｖｉｖｏにおける細胞増殖について調べ、細胞の増殖をもたらす細胞の比を選択する。

本明細書で記載される通り、本開示は、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞は、ナイーブ細胞集団、セントラルメモリー細胞集団、およびエフェクターメモリー細胞集団などの部分集団へとさらに分離しうることを想定する。本明細書で記載される通り、いくつかの実施形態では、ナイーブＣＤ４＋細胞は、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋陽性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ陽性およびＣＤ４５ＲＯ陽性である。いくつかの実施形態では、エフェクターＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ陰性およびＣＤ４５ＲＯ陽性である。これらの集団の各々は、キメラ受容体により独立に改変することができる。

本明細書で記載される通り、実施形態では、メモリーＴ細胞は、ＣＤ８＋末梢血リンパ球のＣＤ６２Ｌ＋サブセットおよびＣＤ６２Ｌ−サブセットのいずれにおいても存在する。ＰＢＭＣは、抗ＣＤ８抗体および抗ＣＤ６２Ｌ抗体による染色の後で、ＣＤ６２Ｌ− ＣＤ８＋画分およびＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８＋画分へと分取する。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）の表現型マーカーの発現は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、およびＣＤ１２７を含み、グランザイムＢについては陰性または低度である。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、エフェクターＴ細胞（Ｔ_Ｅ）は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、およびＣＤ１２７について陰性であり、グランザイムＢおよびパーフォリンについて陽性である。いくつかの実施形態では、ナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ１２７＋、およびＣＤ４５ＲＯ＋によって特徴付けられる。これらの集団の各々は、キメラ受容体により独立に改変することができる。

キメラ受容体を保有する細胞の形質導入および／または選択の後で、ヒト被験体への少なくとも１回の注入を行うのに十分な数、典型的に、１ｋｇ当たりの細胞１０^４個〜１ｋｇ当たりの細胞１０^９個程度の細胞が得られるまで、ｉｎｖｉｔｒｏで細胞集団を増やすことが好ましい。実施形態では、形質導入細胞を、抗原保有細胞、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、およびＩＬ２、ＩＬ−７、ＩＬ１５、ＩＬ−２１、ならびにこれらの組合せの存在下で培養する。

ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の部分集団の各々は、互いと組み合わせることができる。具体的な実施形態では、改変されたナイーブＣＤ４＋細胞またはセントラルメモリーＣＤ４＋細胞を、改変されたセントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞と組み合わせて、腫瘍細胞など、抗原を保有する細胞上の相乗作用的な細胞傷害性効果をもたらす。

組成物
本開示は、本明細書で記載される遺伝子改変Ｔリンパ球細胞調製物を含む養子細胞免疫療法組成物を提示する。

実施形態では、Ｔリンパ球細胞調製物は、疾患または障害と関連するリガンドに特異的な細胞外抗体可変ドメイン、カスタマイズ可能なスペーサー領域、膜貫通ドメイン、および本明細書で記載されるＴ細胞受容体または他の受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。他の実施形態では、養子細胞免疫療法組成物は、細胞性免疫応答をもたらす、キメラ受容体により改変された腫瘍特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物であって、疾患または障害と関連するリガンドに特異的な細胞外単鎖抗体、カスタマイズ可能なスペーサー領域、膜貫通ドメイン、および本明細書で記載されるＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体を有するＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物をさらに含む。実施形態では、本開示のキメラ受容体改変Ｔ細胞集団は、ｉｎｖｉｖｏにおいて少なくとも約３日間以上にわたり存続しうる。

いくつかの実施形態では、養子細胞免疫療法組成物は、細胞性免疫応答をもたらす、キメラ受容体により改変された腫瘍特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物を含み、細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物は、ＣＤ４５ＲＯ− ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞に由来する、抗原反応性キメラ受容体により改変されたナイーブＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞と組み合わせた、疾患または障害と関連するリガンドに特異的な細胞外単鎖抗体、カスタマイズ可能なスペーサー領域、膜貫通ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体を有するＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびに薬学的に許容される担体を含む。

他の実施形態では、養子細胞免疫療法組成物は、ＣＤ８＋免疫応答を増進させる、抗原反応性キメラ受容体により改変されたナイーブＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞と組み合わせた、患者に由来する、細胞性免疫応答をもたらす抗原特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物を含み、ヘルパーＴリンパ球細胞調製物は、疾患または障害と関連する抗原に特異的な細胞外抗体可変ドメイン、カスタマイズ可能なスペーサー領域、膜貫通ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体を有するＣＤ４＋
Ｔ細胞を含む。

さらなる実施形態では、養子細胞免疫療法組成物は、ＣＤ８＋免疫応答を増進させる、抗原反応性キメラ受容体により改変されたナイーブＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を含み、ヘルパーＴリンパ球細胞調製物は、疾患または障害と関連するリガンドに特異的な細胞外抗体可変ドメイン、カスタマイズ可能なスペーサー領域、膜貫通ドメイン、およびＴ細胞受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。

実施形態では、ＣＤ４＋ヘルパーＴリンパ球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、またはバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球細胞は、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞である。実施形態では、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、またはバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、セントラルメモリーＴ細胞である。さらに他の実施形態では、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞は、セントラルメモリーＴ細胞であり、ＣＤ４＋ヘルパーＴリンパ球細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞またはセントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞である。

方法
本開示は、疾患または障害を有する被験体において、細胞免疫療法を実施するための、養子免疫療法組成物を作製する方法、またはこれらの組成物を使用する方法を提示する。実施形態では、本明細書で記載されるキメラ受容体改変Ｔ細胞は、ｉｎｖｉｖｏで少なくとも３日間、または少なくとも１０日間にわたり存続することが可能である。実施形態では、本明細書で記載されるキメラ受容体改変Ｔ細胞は、ＣＦＳＥ色素の希釈により決定される通り、ｉｎｖｉｖｏで少なくとも２世代、または少なくとも３世代にわたり増殖しうる。キメラ受容体改変Ｔ細胞の増殖および存続は、疾患または障害の動物モデルを使用し、細胞を投与し、移入される細胞の存続能および／または増殖能を決定することにより決定することができる。他の実施形態では、抗原を保有する細胞による複数サイクルにわたる活性化を経ることにより、ｉｎｖｉｔｒｏにおける増殖および活性化を調べることができる。

実施形態では、組成物を製造する方法は、改変ナイーブＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を得るステップであって、改変ヘルパーＴリンパ球細胞調製物が、本明細書で記載される、腫瘍細胞表面分子に特異的なリガンド結合ドメイン、カスタマイズされたスペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を含むステップを含む。

別の実施形態では、方法は、改変ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を得るステップであって、改変細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物が、本明細書で記載される、腫瘍細胞表面分子に特異的なリガンド結合ドメイン、カスタマイズされたスペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体を有するＣＤ８＋細胞を含むステップをさらに含む。

別の実施形態では、方法は、改変ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を得るステップであって、改変細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物が、本明細書で記載される、腫瘍細胞表面分子に特異的なリガンド結合ドメイン、カスタマイズされたスペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体を有するＣＤ８＋Ｔ細胞を含むステップを含み、改変ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を、ＣＤ４＋ヘルパー細胞リンパ球細胞調製物と組み合わせるステップをさらに含む。

キメラ受容体により改変されたＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の調製については、上記でも記載しており、実施例でも記載する。抗原特異的Ｔリンパ球は、疾患または障害を有する患者から得ることもでき、抗原存在下のｉｎｖｉｔｒｏでＴリンパ球を刺激することにより調製することもできる。また、抗原特異性について選択されていないＣＤ４＋
Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球の部分集団も、本明細書で記載される通りに単離し、製造法において組み合わせることができる。実施形態では、細胞集団の組合せを、細胞表面マーカーの均一性、少なくとも２世代にわたり増殖する能力、均一な細胞分化状態を有する能力について査定することができる。標的リガンドを発現させる細胞系を、キメラ受容体改変Ｔ細胞と共に共培養することにより、品質管理を実施して、当分野で公知の細胞傷害作用アッセイ、増殖アッセイ、またはサイトカイン産生アッセイを使用して、キメラ受容体改変Ｔ細胞が細胞系を認識するのかどうかを決定することができる。細胞分化状態およびキメラ受容体改変Ｔ細胞上の細胞表面マーカーは、フローサイトメトリーにより決定することができる。実施形態では、ＣＤ８＋細胞上のマーカーおよび細胞分化状態は、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４５ＲＯ、およびＣＤ４５ＲＡを含む。実施形態では、ＣＤ４＋細胞上のマーカーおよび細胞分化状態は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ４５ＲＯ、およびＣＤ４５ＲＡを含む。

本明細書において、実施形態では、キメラ受容体のためのスペーサー領域を選択する方法が提示される。驚くべきことに、いくつかのキメラ受容体構築物は、ｉｎｖｉｔｒｏでは、Ｔ細胞を活性化させるのに有効であったが、ｉｎｖｉｖｏでは有効でなかった。実施形態では、方法は、複数のキメラ受容体核酸を提供するステップであって、キメラ受容体核酸がスペーサー領域内でだけ異なるステップと、キメラ受容体核酸の各々を、別々のＴリンパ球集団へと導入するステップと、各別々のリンパ球集団をｉｎｖｉｔｒｏにおいて増やすステップと、各リンパ球集団を、腫瘍を保有する動物へと導入して、キメラ受容体改変Ｔ細胞の各々の抗腫瘍有効性を決定するステップと、他のキメラ受容体改変Ｔ細胞の各々により改変された他の別々のリンパ球集団の各々と比較して抗腫瘍有効性をもたらすキメラ受容体を選択するステップとを含む。

実施形態では、複数のキメラ受容体核酸を提供するステップであって、キメラ受容体核酸がスペーサー領域内でだけ異なるステップは、リガンド結合ドメインをコードするポリヌクレオチドであって、リガンドが、腫瘍特異的抗原、ウイルス抗原、またはリンパ球による認識および除去を媒介するのに適する、標的細胞集団上で発現する任意の他の分子であるポリヌクレオチドと、第１のポリペプチドスペーサーのコード配列の５’末端および３’末端において、規定された制限部位を有する第１のポリペプチドスペーサーをコードするポリヌクレオチドと、膜貫通ドメインをコードするポリヌクレオチドと、細胞内シグナル伝達ドメインをコードするポリヌクレオチドとを含むキメラ受容体構築物を提供することを含む。

本開示はまた、疾患または障害を有する被験体において、細胞免疫療法を実施する方法であって、本明細書で記載されるキメラ受容体を発現させるリンパ球の組成物を投与するステップを含む方法も提示する。他の実施形態では、方法は、細胞性免疫応答をもたらす遺伝子改変細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物であって、本明細書で記載される、腫瘍細胞表面分子に特異的なリガンド結合ドメイン、カスタマイズされたスペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体を有するＣＤ８＋
Ｔ細胞を含む細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物と、直接的な腫瘍認識を誘発し、細胞性免疫応答を媒介する遺伝子改変細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物の能力を増進させる遺伝子改変ヘルパーＴリンパ球細胞調製物であって、本明細書で記載される、腫瘍細胞表面分子に特異的なリガンド結合ドメイン、カスタマイズされたスペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を含むヘルパーＴリンパ球細胞調製物とを被験体へと投与するステップを含む。

本開示の範囲を限定するわけではないが、投与の前に、ｉｎｖｉｖｏにおいて存続および増殖しうるキメラ受容体改変Ｔ細胞集団を選択することにより、低用量のＴ細胞を使用し、より均一な治療活性をもたらす能力を結果としてもたらしうると考えられる。実施形態では、Ｔ細胞の用量は、少なくとも１０％、２０％、または３０％以上低減することができる。Ｔ細胞の用量の低減は、腫瘍溶解症候群およびサイトカインストームの危険性を低減するのに有益でありうる。

別の実施形態では、疾患または障害を有する被験体において、細胞免疫療法を実施する方法は、遺伝子改変ヘルパーＴリンパ球細胞調製物であって、本明細書で記載される、腫瘍細胞表面分子に特異的なリガンド結合ドメイン、カスタマイズされたスペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体を有するＣＤ４＋Ｔ細胞を含む改変ヘルパーＴリンパ球細胞調製物を被験体へと投与するステップを含む。実施形態では、方法は、遺伝子改変細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物であって、本明細書で記載される、腫瘍細胞表面分子に特異的なリガンド結合ドメイン、カスタマイズされたスペーサードメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体を有するＣＤ８＋細胞を含む改変細胞傷害性Ｔリンパ球細胞調製物を被験体へと投与するステップをさらに含む。

別の実施形態は、疾患または障害を有する被験体において、細胞免疫療法を実施する方法であって、被験体の生物学的試料を、疾患または障害と関連する標的分子の存在について解析するステップと、本明細書で記載される養子免疫療法組成物を投与するステップであって、キメラ受容体が、標的分子に特異的に結合するステップとを含む方法について記載する。

いくつかの実施形態では、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、またはバルクＣＤ４＋Ｔ細胞からなる群に由来するキメラ受容体を導入する前に、ＣＤ４＋ヘルパーＴリンパ球細胞を選択する。具体的な実施形態では、ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球細胞は、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞である。さらに他の実施形態では、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、セントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、またはバルクＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群に由来するキメラ受容体を導入する前に、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞を選択する。具体的な実施形態では、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、セントラルメモリーＴ細胞である。具体的な実施形態では、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球細胞は、セントラルメモリーＴ細胞であり、ＣＤ４＋ヘルパーＴリンパ球細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞である。

実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞はいずれも、腫瘍特異的細胞表面分子に特異的に結合する抗体重鎖ドメインを含むキメラ受容体により遺伝子改変されている。他の実施形態では、ＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ４ヘルパーＴ細胞の細胞内シグナル伝達ドメインと同じである。さらに他の実施形態では、ＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ４ヘルパーＴ細胞の細胞内シグナル伝達ドメインと異なる。

本発明により処置されうる被験体は一般に、ヒト被験体、ならびに獣医学的医療を目的とする、サルおよび類人猿など、他の霊長動物被験体である。被験体は、雄の場合もあり、雌の場合もあり、幼児被験体、小児被験体、青年被験体、成人被験体、および高齢者被験体を含む任意の適切な年齢でありうる。

方法は、例えば、血液悪性腫瘍、黒色腫、乳がん、および他の上皮悪性腫瘍、または固形腫瘍の処置において有用である。いくつかの実施形態では、疾患または障害と関連する分子は、チロシンキナーゼオーファン受容体であるＲＯＲ１、Ｈｅｒ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＣＥＡ、およびＢ型肝炎表面抗原からなる群から選択される。

処置されうる被験体は、結腸がん、肺がん、肝臓がん、乳がん、腎臓がん、前立腺がん、卵巣がん、皮膚がん（黒色腫を含む）、骨がん、および脳腫瘍などを含むがこれらに限定されないがんに罹患する被験体を含む。いくつかの実施形態では、黒色腫、乳がん、扁平細胞癌、結腸がん、白血病、骨髄腫、および前立腺がんなど、腫瘍関連抗原または腫瘍関連分子が公知である。他の実施形態では、腫瘍関連分子を、操作されたキメラ受容体を発現させる遺伝子改変Ｔ細胞によりターゲティングすることができる。例は、Ｂ細胞リンパ腫、乳がん、前立腺がん、および白血病を含むがこれらに限定されない。

上記で記載した通りに調製される細胞は、公知の技法に従う養子免疫療法のための方法および組成物、または本開示に基づく、当業者に明らかなその変法において活用することができる。

いくつかの実施形態では、細胞は、まずそれらの培養培地からそれらを採取し、次いで、細胞を洗浄し、投与に適する培地中および容器系内（「薬学的に許容される」担体中）に処置有効量で濃縮することにより製剤化する。適切な注入培地は、任意の等張性培地製剤、典型的に、生理食塩液、ＮｏｒｍｏｓｏｌＲ（Ａｂｂｏｔｔ）またはＰｌａｓｍａ−ＬｙｔｅＡ（Ｂａｘｔｅｒ）でありうるが、また、水中または乳酸加リンゲル液中に５％のデキストロースも活用することができる。注入培地には、ヒト血清アルブミン、ウシ胎仔血清または、他のヒト血清成分を補充することができる。

組成物中の処置有効量の細胞は、少なくとも２つの細胞サブセット（例えば、１つのＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞サブセットおよび１つのＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞サブセット）であり、またはより典型的に、細胞１０^２個を超え、最大で１０^６個、最大で細胞１０^８または１０^９個であり、かつ、これを含み、細胞１０^１０個を超える場合もある。細胞の数は、その中に含まれる細胞の種類に依存するように、組成物が意図される最終的な使用にも依存するであろう。例えば、特定の抗原に特異的な細胞が所望される場合、集団は、このような細胞のうちの７０％超、一般に、８０％超、８５％、および９０〜９５％を含有するであろう。本明細書で提示される使用では、細胞は一般に、１リットル以下の容量であり、５００ｍｌ以下、なおまた２５０ｍｌまたは１００ｍｌ以下でありうる。よって、所望の細胞の密度は典型的に、１ｍｌ当たりの細胞１０^４個を超え、一般に１ｍｌ当たりの細胞１０^７個を超え、一般に１ｍｌ当たりの細胞１０^８個以上である。臨床的に関与性の免疫細胞の数は、のべの細胞個数を１０^６、１０^７、１０^８、１０^８、１０^９、１０^１０、または１０^１１個以上とする、複数回の注入へと分配することができる。

いくつかの実施形態では、本発明のリンパ球を使用して、個体に免疫を付与することができる。「免疫」とは、リンパ球応答が方向付けられる、病原体による感染または腫瘍に対する応答と関連する１つまたは複数の身体症状の軽減を意味する。投与される細胞の量は通常、病原体に対する免疫を伴う正常個体において存在する範囲内にある。したがって、細胞は通常、各注入が、細胞２個〜最大で少なくとも細胞１０^６〜３×１０^１０個の範囲内、好ましくは少なくとも細胞１０^７〜１０^９個の範囲内にある注入により投与する。Ｔ細胞は、ある期間にわたり、単回の注入により投与することもでき、複数回の注入により投与することもできる。しかし、異なる個体は、応答性においてばらつくことが予測されているので、注入された細胞の種類および量のほか、注入の回数および複数回の注入が施される時間の範囲は、主治医により決定され、日常的な検査により決定することができる。十分なレベルのＴリンパ球（細胞傷害性Ｔリンパ球および／またはヘルパーＴリンパ球を含む）の作製は、本明細書で例示される、本発明の急速増殖法を使用して容易に達成可能である。例えば、Ｒｉｄｄｅｌｌらによる米国特許第６，０４０，１７７号の第１７欄を参照されたい。

実施形態では、本明細書で記載される組成物を、静脈内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、骨髄内投与、リンパ節内投与、および／または脳脊髄液内投与する。実施形態では、キメラ受容体操作組成物を、腫瘍部位へと送達する。代替的に、本明細書で記載される組成物は、細胞を腫瘍または免疫系区画へとターゲティングする化合物と組み合わせ、肺などの部位を回避することができる。

実施形態では、本明細書で記載される組成物を、化学療法剤および／または免疫抑制剤と共に投与する。実施形態ではまず、患者を、他の免疫細胞を阻害または破壊する化学療法剤により処置した後で、本明細書で記載される組成物により処置する。場合によっては、化学療法を完全に回避することができる。

下記で示される実施例において、本発明をさらに例示する。

（実施例１）
スペーサードメインの長さおよびｓｃＦｖのアフィニティーの、キメラ受容体により改変されたＴ細胞によるＲＯＲ１の最適な認識のためのカスタマイズ
本発明者らは、慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、ならびに乳がん、肺がん、前立腺がん、膵臓がん、および卵巣がんを含む多数のヒト悪性腫瘍上で発現するＲＯＲ１分子に特異的なキメラ受容体を構築した。ＲＯＲ１キメラ受容体は、アフィニティーが異なり、異なる長さの細胞外ＩｇＧ４−Ｆｃスペーサードメインを含有する、ＲＯＲ１特異的ｓｃＦｖからデザインした。ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、ＲＯＲ１^＋造血系腫瘍およびＲＯＲ１^＋上皮腫瘍を認識し、免疫不全マウスへと生着させたヒトマントル細胞リンパ腫を除去する、各ＲＯＲ−１特異的キメラ受容体を発現させるＴ細胞の能力を解析した。

材料および方法
ヒト被験体
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ＦｒｅｄＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ（ＦＨＣＲＣ）の治験審査委員会により承認された研究プロトコールについての書面による説明同意の後で、健常ドナーおよび患者から得た。

細胞系
Ｋ５６２Ｔ細胞系、ＲａｊｉＴ細胞系、ＪｅＫｏ−１Ｔ細胞系、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｔ細胞系、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８Ｔ細胞系、および２９３Ｔ細胞系は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た。腎細胞がん系であるＦＡＲＰ、ＴＲＥＰ、およびＲＷＬは、ＥｄｕｓＨ．Ｗａｒｒｅｎ博士（ＦＨＣＲＣ）から恵与された。Ｋ５６２／ＲＯＲ１およびＲａｊｉ／ＲＯＲ１は、レンチウイルスによる全長ＲＯＲ１遺伝子の形質導入を介して生成した。ＪｅＫｏ−１／ｆｆｌｕｃを導出するため、天然のＪｅＫｏ−１細胞に、Ｔ２Ａ配列およびｅＧＦＰの上流でホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ）遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを形質導入した。形質導入ＪｅＫｏ−１細胞を、ｅＧＦＰ発現について分取し、ｉｎｖｉｖｏ実験のために増やした。

免疫表現型解析
ＰＢＭＣおよび細胞系を、以下のコンジュゲートｍＡｂ：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ３１４（ＮＫＧ２Ｄ）、ＭＩＣＡ／Ｂ、およびマッチさせたアイソタイプ対照（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。生細胞／死細胞を弁別するために、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を実施した。細胞の表面におけるＲＯＲ１の発現は、ポリクローナルヤギ抗ヒトＲＯＲ１抗体（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を使用して解析した。

２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体の表面における発現は、ポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｆａｂ特異的）（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して解析した。フロー解析は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）上で行い、分取精製は、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ（登録商標）（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で行い、データは、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を使用して解析した。

ベクターの構築およびキメラ受容体をコードするレンチウイルスの調製
２Ａ２ｍＡｂ、Ｒ１２ｍＡｂ、およびＲ１１ｍＡｂ（ＲＯＲ１）、ならびにＦＭＣ６３ｍＡｂ（ＣＤ１９）のＶＬ鎖セグメントおよびＶＨ鎖セグメントを使用してＲＯＲ１特異的およびＣＤ１９特異的キメラ受容体を構築した（Ｒ１１およびＲ１２の可変領域配列は、Ｙａｎｇら、ＰｌｏｓＯｎｅ、６巻（６号）：ｅ２１０１８頁、２０１１年６月１５日において提示されている）。各ｓｃＦｖは、（Ｇ_４Ｓ）_３（配列番号１２）ペプチドにより、「ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３」配列（２２９アミノ酸；配列番号）、「ヒンジ−ＣＨ３」配列（１１９アミノ酸；配列番号）、または「ヒンジ」だけの配列（１２アミノ酸；配列番号４）（図１）を含む、ＩｇＧ４−Ｆｃに由来するスペーサードメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース：Ｐ０１８６１、配列番号１３）へと連結した。全てのスペーサーは、天然のＩｇＧ４−Ｆｃタンパク質の１０８位に位置する「ヒンジ」ドメイン内のＳ→Ｐ置換を含有したが、これらを、ヒトＣＤ２８の２７アミノ酸の膜貫通ドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１０７４７、配列番号１４）；およびそれらの各々が、ヒトＣＤ３ζのアイソフォーム３の１１２アミノ酸の細胞質ドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ２０９６３、配列番号１６）へと連結された、（ｉ）天然のＣＤ２８タンパク質の１８６〜１８７位に位置するＬＬ→ＧＧ置換を伴う、ヒトＣＤ２８の４１アミノ酸の細胞質ドメイン（配列番号１４）；または（ｉｉ）ヒト４−１ＢＢの４２アミノ酸の細胞質ドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ０７０１１、配列番号１５）を含むシグナル伝達モジュールへと連結した。構築物は、キメラ受容体の下流において、Ｔ２Ａリボソームスキップエレメント（配列番号８）およびｔＥＧＦＲ配列（配列番号９）をコードした。各トランス遺伝子をコードする、コドンを最適化したヌクレオチド配列を合成し（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターへとクローニングした。

パッケージングベクターであるｐＣＨＧＰ−２、ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ２、およびｐＣＭＶ−Ｇ、ならびにＣａｌｐｈｏｓ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、ＲＯＲ１キメラ受容体、ＣＤ１９キメラ受容体、またはｔＥＧＦＲをコードするレンチウイルスを、２９３Ｔ細胞内で産生させた。

ＲＯＲ１キメラ受容体およびＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞系の作製
ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＯ^＋ＣＤ６２Ｌ^＋セントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ）またはバルクＣＤ４^＋Ｔ細胞を、正常ドナーのＰＢＭＣから分取し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で活性化し、活性化後の３日目において、１μｇ／ｍＬのポリブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を補充したレンチウイルス上清（ＭＯＩ＝３）を伴う８００ｇ、３２℃で４５分間にわたる遠心分離により形質導入した。Ｔ細胞は、組換えヒトＩＬ−２を５０Ｕ／ｍＬの最終濃度まで補充した、１０％のヒト血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、および１％のペニシリン−ストレプトマイシンを伴うＲＰＭＩ（ＣＴＬ培地）中で増やした。各Ｔ細胞系のｔＥＧＦＲ^＋サブセットは、ビオチンとコンジュゲートさせた抗ＥＧＦＲｍＡｂ（ＩｍＣｌｏｎｅＳｙｓｔｅｍｓ）およびストレプトアビジンビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を伴う免疫磁気選択により濃縮した。ＲＯＲ１キメラ受容体およびｔＥＧＦＲ対照Ｔ細胞は、急速増殖プロトコール（ＲｉｄｄｅｌｌＳＲ、ＧｒｅｅｎｂｅｒｇＰＤ、Ｔｈｅｕｓｅｏｆａｎｔｉ−ＣＤ３ａｎｄａｎｔｉ−ＣＤ２８ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏｃｌｏｎｅａｎｄ
ｅｘｐａｎｄｈｕｍａｎａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃＴｃｅｌｌｓ、Ｊ
ＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ．、１９９０年、１２８巻（２号）：１８９〜２０１頁、Ｅｐｕｂ１９９０／０４／１７）を使用して増やした。ＣＤ１９キメラ受容体により改変されたＴ細胞は、Ｔ細胞：ＬＣＬ比を１：７とする、照射された（８，０００ラド）Ｂ−ＬＣＬによる刺激を介して増やした。Ｔ細胞は、５０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を伴うＣＴＬ培地中で培養した。

細胞傷害作用アッセイ、サイトカイン分泌アッセイ、および増殖アッセイ
標的細胞を、^５１Ｃｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で標識し、洗浄し、３連、ウェル１つ当たりの細胞１〜２×１０^３個で、エフェクターキメラ受容体により改変された多様なエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比のＴ細胞と共にインキュベートした。４時間にわたるインキュベーションの後、γカウンティングのために上清を採取し、標準的な式を使用して、特異的溶解を計算した。サイトカイン分泌についての解析のため、５×１０^４個のＴ細胞を、標的細胞と共に、３連、１：１（初代ＣＬＬ）、２：１（Ｒａｊｉ／ＲＯＲ１；ＪｅＫｏ−１）、４：１（Ｋ５６２／ＲＯＲ１、Ｋ５６２／ＣＤ１９およびＫ５６２）、または１０：１（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）のＥ：Ｔ比で播種し、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２を、２４時間にわたるインキュベーションの後で除去される上清中のＥＬＩＳＡまたはマルチプレックスサイトカインイムノアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）により測定した。ＮＫＧ２Ｄシグナル伝達を遮断する実験では、抗ＮＫＧ２Ｄ（クローン１Ｄ１１）、抗ＭＩＣＡ／Ｂ（クローン６Ｄ４；全てＢＤより）、および抗ＵＬＢＰ（ＦＨＣＲＣのＶｅｒｏｎｉｋａＧｒｏｈ博士による恵与）を、飽和濃度で使用した。増殖についての解析では、Ｔ細胞を、０．２μＭのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、洗浄し、外因性サイトカインを伴わずに、培地中の刺激細胞と共に３連で播種した。７２時間にわたるインキュベーションの後、細胞を抗ＣＤ８ｍＡｂおよびＰＩで標識し、フローサイトメトリーにより解析して、ＣＤ８^＋生Ｔ細胞の細胞分裂を評価した。

ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ^−／−（ＮＳＧ）マウスにおける実験
全てのマウス実験は、ＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄ
ＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。６〜８週齢の雌ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスは、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙから得るか、施設内で飼育した。マウスに、尾静脈を介して、０．５×１０^６個のＪｅＫｏ−１／ｆｆｌｕｃ腫瘍細胞を注射し、その後もキメラ受容体により改変されたＴ細胞または対照Ｔ細胞の尾静脈注射を施した。

腫瘍成長についての生物発光造影のため、マウスに、ＰＢＳ中に再懸濁させたルシフェリン基質（ＣａｌｉｐｅｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）の腹腔内注射（体重１ｇ当たり１５μｇ）を施した。マウスにイソフルランで麻酔をかけ、ルシフェリンを注射した１０、１２、および１４分後に、ＸｅｎｏｇｅｎＩＶＩＳＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を使用して、収集時間を１秒間〜１分間とする小ビニングモードで造影して、不飽和画像を得た。ルシフェラーゼ活性は、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅＳｏｆｔｗａｒｅ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を使用して解析し、各個別のマウスの全身または胸部を包摂する対象の領域内で光子束解析した。

統計学的解析
統計学的解析は、ＰｒｉｓｍＳｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ（登録商標））を使用して実施した。スチューデントのｔ検定を、信頼区間を９５％とする、対応のある両側検定として実施し、ｐ値をｐ＜０．０５とする結果を有意と考えた。生存についての統計学的解析は、ログランク検定により行い、ｐ値をｐ＜０．０５とする結果を有意と考えた。

結果
２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体のスペーサードメインを切断することにより、ＲＯＲ１^＋腫瘍の優れた認識が付与される
本発明者らは、ＲＯＲ１−１のＮＨ２末端の膜遠位Ｉｇ様／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ部分におけるエピトープに結合する、２Ａ２ｓｃＦｖを使用するＲＯＲ１特異的キメラ受容体のデザインについてかつて報告した。初期２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体は、ＩｇＧ４−Ｆｃの「ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３」領域を含む２２９アミノ酸の長鎖スペーサーを有し、これには、ＣＤ２８共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインが組み込まれた（ＨｕｄｅｃｅｋＭら、Ｂｌｏｏｄ、２０１０年）。このキメラ受容体は、ＲＯＲ１^＋腫瘍の特異的認識を付与したが、本発明者らは、ＲＯＲ１エピトープが膜遠位の位置にあるために、スペーサードメインを切断すれば、腫瘍認識およびＴ細胞シグナル伝達を増強しうるであろうと仮定した。したがって、本発明者らは、２つのさらなるキメラ受容体であって、ＩｇＧ４−Ｆｃスペーサードメインを逐次欠失させて、「ヒンジ−ＣＨ３」変異体（１１９アミノ酸、中間鎖）および「ヒンジだけ」の変異体（１２アミノ酸、短鎖）を導出するキメラ受容体を構築した。新たな受容体の各々は、同一な２Ａ２ｓｃＦｖならびにＣＤ２８シグナル伝達モジュールおよびＣＤ３ζシグナル伝達モジュールを含有した。トランス遺伝子カセットは、キメラ受容体により改変されたＴ細胞のための形質導入マーカー、選択マーカー、およびｉｎｖｉｖｏにおけるトラッキングマーカーとして用いられる切断型ＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）を含んだ。

本発明者らは、精製ＣＤ８^＋Ｔ_ＣＭに、全長ＩｇＧ４−Ｆｃスペーサーまたは切断型ＩｇＧ４−Ｆｃスペーサーを含有する２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体およびｔＥＧＦＲ対照ベクターを形質導入した。平均形質導入効率は、１５％（範囲：９〜２２％）であり、１０日目において、ｔＥＧＦＲ発現について選択することにより、トランス遺伝子陽性Ｔ細胞を、均一な純度（＞９０％）まで濃縮し、増やした（図２Ａ）。キメラ受容体の各々の表面における発現は、Ｆ（ａｂ）特異的抗体による染色を介して確認した（図２Ａ）。

２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体の各々を発現させるように改変されたＣＤ８^＋Ｔ細胞のｉｎｖｉｔｒｏ機能について解析することにより、各受容体は、ＲＯＲ１を天然で発現させるＪｅＫｏ−１ＭＣＬおよび初代ＣＬＬ細胞、ならびにＲＯＲ１を形質導入されたＫ５６２細胞の特異的溶解を付与するが、対照ＲＯＲ１⁻標的の認識は付与しないことが裏付けられた（図２Ｂ）。「ヒンジだけ」の短鎖２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体を発現させるＴ細胞は、最大の細胞溶解活性を有し、腫瘍溶解についての階層（短鎖＞中間鎖＞＞長鎖）は、全てのＲＯＲ１^＋腫瘍標的に対して明確であった（図２Ｂ）ことから、スペーサードメインの長さが、ＲＯＲ１^＋腫瘍細胞の認識において重要であることが例示される。

養子Ｔ細胞療法の抗腫瘍有効性は、キメラ受容体を介するシグナル伝達により変化させうる移入Ｔ細胞の増殖および生存と相関する。本発明者らは、ＣＦＳＥ希釈アッセイを使用して、２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体の各々により改変されたＴ細胞の、Ｒａｊｉ／ＲＯＲ１またはＣＬＬが係合した後における増殖について解析し、短鎖スペーサー構築物が、刺激後における最大のＴ細胞増殖を促進することを見出した（図２Ｃ）。増殖の増強が、活性化誘導型細胞死（ＡＩＣＤ）の増大と関連しなかったことを確認するために、本発明者らはまた、Ｒａｊｉ／ＲＯＲ１腫瘍細胞およびＪｅＫｏ−１腫瘍細胞による刺激の後において、２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体により改変されたＴ細胞であって、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色されたＴ細胞の比率についても解析した。本発明者らは、短鎖（Ｒａｊｉ／ＲＯＲ１：１７．２％／ＪｅＫｏ−１：２０．２％）スペーサーにより改変されたＴ細胞系におけるＰＩ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度が、中間鎖（４１．６％／４２．４％）および長鎖（４４．５％／４８．５％）スペーサーにより改変されたＴ細胞系におけるＰＩ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度と比較して、はるかに低いことを検出した。

Ｒａｊｉ／ＲＯＲ１細胞および初代ＣＬＬ細胞による刺激に応答したサイトカイン産生についての定量的解析は、２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体の各々を発現させるＴ細胞による、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２の産生を示した。細胞傷害作用アッセイにおいて観察される通り、短鎖スペーサー構築物は、腫瘍認識の後におけるサイトカイン分泌の媒介において優れていた（図２Ｄ）。したがって、この解析は、２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体の細胞外ＩｇＧ４−Ｆｃスペーサードメインを切断することにより、腫瘍認識の後における細胞傷害作用、増殖、およびｉｎｖｉｔｒｏエフェクター機能の著明な増大がもたらされることを示す。

ＲＯＲ１クリングルドメイン内の膜近位エピトープに特異的なＲ１１ｓｃＦｖは、長鎖細胞外スペーサードメインを要求する
本発明者らは、精製ＣＤ８^＋Ｔ細胞に、ＲＯＲ１のクリングルドメインに特異的なＲ１１ｓｃＦｖを含有し、全長ＩｇＧ４−Ｆｃスペーサーまたは切断型ＩｇＧ４−Ｆｃスペーサーを含有するＲＯＲ１キメラ受容体（ＣＨ３およびヒンジだけ）を形質導入した。ＥＧＦＲ発現により測定される通り、短鎖（ＩｇＧ４ヒンジだけ）ベクター、中間鎖（ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ３）ベクター、および長鎖（ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３）ベクターの各々による形質導入効率は、同等（４５〜５１％）であった（図３Ａ）。ベクターの各々を形質導入されたＴ細胞を、ＲＯＲ１を発現させるかまたは発現させない白血病細胞またはリンパ腫細胞に応答する、細胞溶解（図３Ｂ）、増殖（図３Ｃ）、およびサイトカイン産生（図３Ｄ）についてアッセイした。示される通り、長鎖スペーサー配列を含有するＲ１１キメラ受容体を形質導入されたＴ細胞だけが、ＲＯＲ１＋腫瘍を効率的に認識し、エフェクター機能を媒介することが可能であった。

２Ａ２よりアフィニティーが大きなｍＡｂであるＲ１２に由来するＲＯＲ１キメラ受容体は、優れた抗腫瘍反応性を媒介する
本発明者らは次に、ＲＯＲ１キメラ受容体を構築するのに使用されるｓｃＦｖのアフィニティーを増大させることにより、腫瘍認識およびＴ細胞機能に影響を及ぼしうるのかどうかについて検討した。本発明者らは、ＲＯＲ１特異的キメラ受容体を、２Ａ２と同様に、ＲＯＲ１のＮＨ２末端のＩｇ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄドメインにおいてエピトープに結合するが、＞５０倍の一価結合アフィニティーで結合するｍＡｂであるＲ１２から生成した。

Ｒ１２ＲＯＲ１キメラ受容体を、長鎖ＩｇＧ４−Ｆｃスペーサーおよび短鎖ＩｇＧ４−Ｆｃスペーサーの両方により構築して、この高アフィニティーのｓｃＦｖに最適なスペーサーデザインが、低アフィニティーのｓｃＦｖのためのスペーサーデザインと異なるのかどうかを決定した。本発明者らは、２Ａ２と同様に、短鎖スペーサーのＲ１２ＲＯＲ１キメラ受容体により、細胞溶解活性、サイトカイン分泌、および増殖の改善（データは示さない）が付与されることから、短いスペーサー長により、Ｔ細胞とＲＯＲ１^＋標的細胞との、Ｔ細胞の活性化に優れた空間的係合がもたらされると示唆されることを見出した。

本発明者らは、次いで、比較のために、最適の（短鎖）細胞外スペーサー、およびＣＤ３ζを伴うタンデムのＣＤ２８共刺激ドメインまたは４−１ＢＢ共刺激ドメインを含有するＲ１２ＲＯＲ１キメラ受容体および２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体（４つの構築物）をデザインした（図４Ａ、Ｂ）。これらのＲＯＲ１キメラ受容体構築物を、健常ドナーの精製ＣＤ８^＋Ｔ_ＣＭ内で発現させ、本発明者らは、ｔＥＧＦＲ染色により、同等なトランス遺伝子の発現を確認した（図５Ａ）。２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体およびＲ１２ＲＯＲ１キメラ受容体の各々により改変されたＴ細胞は、Ｋ５６２／ＲＯＲ１腫瘍細胞およびＲａｊｉ／ＲＯＲ１腫瘍細胞を、大体同等な効率で特異的に溶解させた（図５Ｂ）。しかし、サイトカイン産生についての解析は、ＣＤ２８または４−１ＢＢを含有する高アフィニティーＲ１２ＲＯＲ１キメラ受容体により、対応する２Ａ２構築物と比較して著明に高度なＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２の産生が付与されることを示した（図５Ｃ）。本発明者らは、ＣＤ２８共刺激ドメインを伴うキメラ受容体を発現させるＴ細胞が、４−１ＢＢ共刺激ドメインを伴うキメラ受容体を発現させるＴ細胞と比較して多くのＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２を産生することを見出した。

ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞の増殖について解析するための実験は、ＣＤ２８ドメインおよび４−１ＢＢドメインを伴う高アフィニティーＲ１２ＲＯＲ１キメラ受容体を発現させるＴ細胞における、増殖Ｔ細胞の百分率および細胞分裂回数の、それぞれの２Ａ２対応物を発現させるＴ細胞と比較した増大を示した（図４Ｄ）。ＣＤ２８ドメインを伴うキメラ受容体を発現させるＴ細胞内では、より活発な増殖が見られたことは、これらの受容体により誘導される高度なＩＬ−２産生と符合した。Ｒａｊｉ／ＲＯＲ１腫瘍細胞およびＪｅＫｏ−１腫瘍細胞のそれぞれによる刺激の後におけるＰＩ染色により測定される通り、Ｒ１２により改変されたＴ細胞系では、ＡＩＣＤの頻度が、２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体により改変されたＴ細胞系と比較して低下した（Ｒ１２：５．６％／６．９％対２Ａ２：１０％／９．６５％）。また、ＣＤ２８ドメインを伴うキメラ受容体を発現させるＴ細胞系は、Ｒａｊｉ／ＲＯＲ１腫瘍細胞およびＪｅＫｏ−１腫瘍細胞それぞれに応答する４−１ＢＢと比較しても、ＡＩＣＤを低下させた（Ｒ１２：１６．４％／１８．４％対２Ａ２：３８．１％／３９．６％）。

ＣＤ８^＋Ｔ細胞内のＲ１２ＲＯＲ１キメラ受容体について観察される機能の増強が、ＣＤ４^＋Ｔ細胞へも拡張されるのかどうかを決定するため、本発明者らは、バルクＣＤ４^＋Ｔ細胞に、短鎖スペーサーおよびＣＤ２８共刺激ドメインを含有する２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体およびＲ１２ＲＯＲ１キメラ受容体を形質導入した。Ｒａｊｉ／ＲＯＲ１^＋腫瘍細胞に応答して、高アフィニティーＲ１２ｓｃＦｖを発現させたＣＤ４^＋Ｔ細胞は、高レベルのＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＬ−１０を産生し、２Ａ２を発現させたＣＤ４^＋Ｔ細胞を超える増殖の増大を示した（図５Ａ、Ｂ）。ＣＤ４^＋Ｔ細胞では、サイトカイン産生および増殖のいずれも、同じＲＯＲ１キメラ受容体により改変されたＣＤ８^＋Ｔ細胞と比較して優れていた。まとめると、本発明者らのデータは、非シグナル伝達細胞外キメラ受容体スペーサードメインの長さおよびｓｃＦｖのアフィニティーのいずれの調整も、ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞の機能に影響を及ぼす独立のパラメータであることを裏付ける。

ｉｎｖｉｔｒｏにおける高アフィニティーＲＯＲ１キメラ受容体により改変されたＣＤ８^＋Ｔ細胞の初代ＣＬＬに対する活性は、ＣＤ１９キメラ受容体と同等である
ＲＯＲ１およびＣＤ１９はいずれも、全ての初代ＣＬＬ上で均一に発現するが（図６Ａ）、腫瘍細胞１個当たりのＲＯＲ１分子の絶対数は、ＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞を伴う臨床試験においてターゲティングに成功しているＣＤ１９の１０分の１であると推定されている。本発明者らは、最適化されたＲ１２ＲＯＲ１キメラ受容体を発現させるＣＤ８^＋Ｔ細胞および最適化された２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体を発現させるＣＤ８^＋Ｔ細胞による初代ＣＬＬの認識と、ＦＭＣ６３ｓｃＦｖに由来するＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＣＤ８^＋Ｔ細胞による初代ＣＬＬの認識とを比較した。

本発明者らは、キメラ受容体改変のために精製ＣＤ８^＋Ｔ_ＣＭを使用して、均一な細胞生成物をもたらし、各キメラ受容体は、ＩｇＧ４−Ｆｃ「ヒンジだけ」の短鎖スペーサーおよび４−１ＢＢ共刺激ドメインを含有した。本発明者らは、本発明者らのＣＤ１９キメラ受容体（ＩｇＧ４ヒンジ）が、ＣＤ１９^＋腫瘍の認識において、進行中の臨床試験において使用されている、ＣＤ８ａヒンジスペーサーおよび４−１ＢＢ共刺激ドメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体と少なくとも同等以上に有効であることを確認した（図２０）。４−１ＢＢおよびＣＤ３ゼータならびに改変されたＩｇＧ４−Ｆｃヒンジを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞は、４−１ＢＢおよびＣＤ３ゼータならびにＣＤ８アルファヒンジを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞と比較して、優れたｉｎｖｉｔｒｏ機能およびｉｎｖｉｖｏ機能を呈示する。図２０Ｄでは、ＩｇＧ４Ｆｃヒンジを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞（群１）またはＣＤ８アルファヒンジを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞（群２）、およびｔＥＧＦＲ単独を発現させるＴ細胞（群３）の、ホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ）を発現させるＲａｊｉ腫瘍細胞を接種されたＮＳＧマウスにおけるｉｎｖｉｖｏの抗腫瘍活性を比較した。マウスは、腫瘍接種の１７日後およびＴ細胞接種の１０日後に造影した。データは、対照ｔＥＧＦＲＴ細胞で処置されたマウス（群３）、またはＣＤ８アルファヒンジＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞で処置されたマウス（群２）における腫瘍負荷が、ＩｇＧ４ＦｃヒンジＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞で処置されたマウス（群１）と比較して大きいことを示す。

Ｒ１２ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞の、複数のＣＬＬ患者（ｎ＝４）に由来する初代腫瘍細胞に対する細胞溶解活性は、低アフィニティー２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体により改変されたＴ細胞と比較して大きく、ＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞について観察される溶解と同等であった（図６Ｂ）。マルチプレックスサイトカイン解析は、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αのほぼ同等な産生を示したが、初代ＣＬＬとの共培養後における、Ｒ１２ＲＯＲ１を発現させるＣＤ８^＋Ｔ細胞によるＩＬ−２産生は、ＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＣＤ８^＋Ｔ細胞によるＩＬ−２産生と比較して少なかった（図６Ｃ）。かつて注目した通り、２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞によるいずれのサイトカインの産生も、Ｒ１２ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞より低量であった。ＣＬＬにより刺激した後における、いずれのキメラ受容体を形質導入されたＴ細胞によるサイトカイン産生も、ＣＬＬと異なり、キメラ受容体Ｔ細胞上に発現したＣＤ２８と係合しうるＣＤ８０およびＣＤ８６の両方を発現させるＲａｊｉ／ＲＯＲ１により刺激した後より実質的に少なかった（図６Ａ、Ｃ）。

本発明者らは、ＣＬＬにより刺激した後における、Ｒ１２ＲＯＲ１キメラ受容体を発現させるＴ細胞および２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体を発現させるＴ細胞の増殖が、ＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞と比較して少ないことを観察した（ＣＤ１９＞Ｒ１２＞２Ａ２）（図６Ｄ）。本発明者らは、キメラ受容体により改変されたＣＤ４^＋Ｔ細胞の存在下では、それらによるＩＬ−２の分泌がＣＤ８^＋Ｔ_ＣＭと比較して高度であるために、ＣＬＬに応答するＲＯＲ１キメラ受容体ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖が増進されうると仮定した（図４Ａ；図８Ａ）。この可能性について調べるため、本発明者らは、ｉｎｖｉｔｒｏ共培養実験を実施し、そこで、ＣＤ４^＋およびＣＤ８Ｔ_ＣＭを、Ｒ１２ＲＯＲ１キメラ受容体、２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体、およびＣＤ１９キメラ受容体のそれぞれにより個別に改変し、キメラ受容体の発現を強化し、１：１の比で組み合わせて、同等な比率のＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ４^＋Ｔ細胞が、ベクターの各々により改変されたことを確認した。これらの細胞をＣＦＳＥ標識し、初代ＣＬＬで刺激した。本発明者らは、Ｒ１２
ＲＯＲ１キメラ受容体ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖が、キメラ受容体を形質導入されたＣＤ４^＋Ｔ細胞を添加した後では劇的に増大するが、形質導入されていないＣＤ４^＋Ｔ細胞を添加した後では劇的に増大しないことを観察した（図８Ｂ）。とりわけ、ＣＤ４の支援を施された場合、本発明者らは、ＣＬＬに応答する、Ｒ１２ＲＯＲ１キメラ受容体ＣＤ８^＋Ｔ細胞とＣＤ１９キメラ受容体ＣＤ８^＋Ｔ細胞との同等な増殖を観察したのに対し、低アフィニティー２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体を発現させるＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖は低度にとどまった。まとめると、本発明者らのデータは、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、高アフィニティーＲ１２ＲＯＲ１キメラ受容体が、初代ＣＬＬ細胞に対する、２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体と比較して優れた反応性を付与することを示す。

ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞は、全身性マントル細胞リンパ腫のマウスモデルにおいて、ｉｎｖｉｖｏの抗腫瘍活性を媒介する
高アフィニティーＲ１２キメラ受容体により改変されたＴ細胞の優れたｉｎｖｉｔｒｏ活性が、ｉｎｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性の改善へと転換されるのかどうか、そして、ＲＯＲ１のターゲティングは、ＣＤ１９のターゲティングといかにして比較されるのかは、依然として不確定であった。これらの問題に取り組むため、本発明者らは、免疫不全ＮＳＧマウスのコホートに、ヒトＭＣＬ細胞系であるＪｅＫｏ−１／ｆｆｌｕｃを、尾静脈注射により接種し、腫瘍が播種された７日後に、マウスを、Ｒ１２ＲＯＲ１キメラ受容体ＣＤ８^＋Ｔ細胞、２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体ＣＤ８^＋Ｔ細胞、またはＣＤ１９キメラ受容体ＣＤ８^＋Ｔ細胞の単回の静脈内投与で処置した。対照マウスは、ｔＥＧＦＲＴ細胞で処置するかまたは処置しなかった。全てのキメラ受容体は、最適な短鎖スペーサーおよび４−１ＢＢ共刺激ドメインを有した。処置されなかったＮＳＧ／ＪｅＫｏ−１マウスは、進行性全身性リンパ腫を急速に発症し、腫瘍接種のおよそ４週間後における安楽死を必要とした（図９Ａ〜Ｃ）。

本発明者らは、Ｒ１２ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞、２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞、およびＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞で処置された全てのマウスにおける腫瘍の退縮および生存の改善を観察した。Ｒ１２ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞で処置されたマウスは、２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞で処置されたマウスと比較して優れた抗腫瘍応答および生存（ｐ＜０．０１）を示し、ＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞で処置されたマウスと同等の抗腫瘍活性を示した（図９Ａ〜Ｃ）。

本発明者らは、養子移入後における末梢血中のキメラ受容体Ｔ細胞の頻度について解析し、Ｒ１２ＲＯＲ１キメラ受容体で処置されたマウスにおけるｔＥＧＦＲ^＋Ｔ細胞の数が、２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体で処置されたマウスにおけるｔＥＧＦＲ^＋Ｔ細胞の数と比較して大きいことを検出したが、これは、ｉｎｖｉｖｏにおけるより活発な増殖により、腫瘍管理が改善されることを示唆する。これを確認するため、本発明者らは、ＣＦＳＥ標識されたＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞、Ｒ１２ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞、および２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞を、ＪｅＫｏ−１／ｆｆｌｕｃを保有するＮＳＧマウスのコホートへと投与し、移入の７２時間後における、末梢血中の、骨髄中、および脾臓内のＴ細胞増殖について解析した。高い百分率のＲ１２およびＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞が、２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞と比較して増殖し、細胞分裂の回数の増大を示した（図９Ｄ）。最終的に、ＪｅＫｏ−１腫瘍は、ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞またはＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞で処置された全てのマウスにおいて再発した（図９Ａ〜Ｃ）。再発した腫瘍は、いずれの分子についても陽性であったので、腫瘍の再発は、ＲＯＲ１またはＣＤ１９を喪失させた変異体を選択した結果ではなかった。

比較のために、本発明者らは、Ｒａｊｉ腫瘍を生着させたＮＳＧマウスにおいて、ＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞の抗腫瘍有効性について解析し、完全な腫瘍の根絶を観察したことから、ＪｅＫｏ−１の再発は、この腫瘍を根絶することの困難を反映することが指し示される（データは示さない）。まとめると、このデータはまず、ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞が、ｉｎｖｉｖｏにおける抗腫瘍有効性を有することを示し、Ｂ細胞悪性腫瘍では、Ｒ１２などの最適化されたＲＯＲ１キメラ受容体が有効であり、ＲＯＲ１の発現を欠く正常ＣＤ１９^＋Ｂ細胞を死滅させないことを示唆するものである。

Ｒ１２ＲＯＲ１キメラ受容体を発現させるＴ細胞は、ＲＯＲ１^＋上皮腫瘍細胞に対する、２Ａ２と比較して優れた反応性を示す
ＲＯＲ１は、多くの上皮腫瘍上で検出されているが、ＲＯＲ１の発現が、ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞による認識に十分であるのかどうかは未知である。フローサイトメトリーを使用して、本発明者らは、乳がん系であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１上およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８上のＲＯＲ１、ならびに腎細胞癌細胞系であるＦＡＲＰ上、ＴＲＥＰ上、およびＲＷＬ上の発現を確認した（図１０Ａ）。次いで、本発明者らは、最適な短鎖スペーサーおよび４−１ＢＢドメインを伴うＲ１２ＲＯＲ１キメラ受容体を形質導入されたＣＤ８^＋Ｔ細胞による腫瘍認識について解析し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＦＡＲＰ、ＴＲＥＰ、およびＲＷＬの効率的な認識について観察した（図１１Ａ）。本発明者らは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１との共培養の後における、Ｒ１２ＲＯＲ１キメラ受容体により改変されたＴ細胞および２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体により改変されたＴ細胞によるサイトカイン分泌およびこれらの増殖について解析し、Ｒ１２ＲＯＲ１キメラ受容体によるサイトカイン産生および増殖の増大について観察した（図１１Ｂ、Ｃ）。本発明者らが、ＲＯＲ１^＋Ｂ細胞悪性腫瘍について観察したことと同様に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１による刺激の後におけるＲ１２ＲＯＲ１キメラ受容体Ｔ細胞の優れた活性化は、ＡＩＣＤの増大と関連しなかった（Ｒ１２：９．８％対２Ａ２：１０．９％）。

考察
ＲＯＲ１は、多くのＢリンパ球様がんならびに肺がん、結腸直腸がん、および腎細胞がんのサブセットを含む上皮がんの表面におけるその発現に起因して、がん免疫療法の潜在的標的としての関心を惹きつけてきた。本発明者らはかつて、ＣＬＬおよびＭＣＬが、ＲＯＲ１特異的キメラ受容体を発現させるように改変されたＴ細胞により特異的に認識されることを示した（ＨｕｄｅｃｅｋＭら、Ｂｌｏｏｄ、２０１０年、１１６巻（２２号）：４５３２〜４１頁、Ｅｐｕｂ２０１０／０８／１３）。ＲＯＲ１キメラ受容体のデザインおよび機能は、細胞外スペーサードメインを改変し、キメラ受容体を高アフィニティーのｓｃＦｖから導出することにより改善されており、デザインされたＲＯＲ１キメラ受容体により改変されたＴ細胞は、ＲＯＲ１^＋Ｂ細胞リンパ腫に対するｉｎｖｉｖｏ活性、および広範囲にわたる上皮腫瘍に対するｉｎｖｉｔｒｏ活性を有することを裏付けている。

本発明者らは、本発明者らが高レベルの細胞表面発現を可能とすることを示した、元のＩｇＧ４−Ｆｃ「ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３」長鎖スペーサーを含有する２Ａ２ｍＡｂに由来するＲＯＲ１キメラ受容体、または「ヒンジ−ＣＨ３」切断型中間鎖スペーサー変異体を含有する２Ａ２ｍＡｂに由来するＲＯＲ１キメラ受容体、および「ヒンジだけ」の短鎖スペーサー変異体を含有する２Ａ２ｍＡｂに由来するＲＯＲ１キメラ受容体により改変されたＴ細胞の機能を比較した。本発明者らは、可撓性のスペーサーが、ｓｃＦｖをＴ細胞膜から隔て、腫瘍細胞上の抗原認識を可能とするのに要求されるというかつてのデータに基づき、本発明者らの短鎖スペーサー構築物内の１２アミノ酸のヒンジドメインを保存した（Ｆｉｔｚｅｒ−ＡｔｔａｓＣＪら、ＨａｒｎｅｓｓｉｎｇＳｙｋｆａｍｉｌｙｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅｓａｓｓｉｇｎａｌｉｎｇｄｏｍａｉｎｓｆｏｒｃｈｉｍｅｒｉｃｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎｏｆｔｈｅｖａｒｉａｂｌｅｄｏｍａｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｏｐｔｉｍａｌｄｅｓｉｇｎｆｏｒ
Ｔｃｅｌｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、ＪＩｍｍｕｎｏｌ．、１９９８年、１６０巻（１号）：１４５〜５４頁、Ｅｐｕｂ１９９８／０４／２９）。

本発明者らの２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体による研究は、腫瘍細胞を認識した後におけるＴ細胞によるサイトカイン分泌およびＴ細胞の増殖が、中間鎖スペーサー構築物および短鎖スペーサー構築物では、長鎖スペーサー構築物と比較して優れていることを示す。抗Ｆ（ａｂ）Ａｂによる染色は、キメラ受容体による３つの受容体全ての同等な発現を示したことから、短鎖スペーサーキメラ受容体によるＴ細胞機能の改善は、キメラ受容体内の密度の差違に起因しないことが裏付けられる。このデータは、細胞外スペーサーのデザインは、各標的分子およびエピトープについて調整すべきであるという原理を裏付ける。

キメラ受容体をデザインするために選択されるｓｃＦｖのアフィニティーは、Ｔ細胞の認識に影響を及ぼしうるさらなるパラメータである。本発明者らは、アフィニティーの異なるＲＯＲ１特異的ｍＡｂのパネルを生成し、特徴付け、２Ａ２と同様にＩｇ様／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ領域内のエピトープを認識するＲ１２ｍＡｂを選択した。Ｒ１２は、解離がはるかに緩徐であることに起因して、ＲＯＲ１タンパク質に対するアフィニティーが大きい。Ｒ１２キメラ受容体は、２Ａ２キメラ受容体と同様、短鎖細胞外スペーサーと共にデザインされる場合、最適なＴ細胞の認識および機能を付与した。２Ａ２キメラ受容体により改変されたＴ細胞およびＲ１２キメラ受容体により改変されたＴ細胞が腫瘍に係合した後における、増殖およびサイトカイン産生の直接的な比較により、高アフィニティーのｍＡｂに由来するＲ１２キメラ受容体が優れていることが裏付けられた。本発明者らは、Ｒ１２のＲＯＲ１からの解離が緩徐であれば、Ｔ細胞の活性化が延長され、ＡＩＣＤに対する感受性の増大が付与されうることを憂慮した。しかし、本発明者らは、Ｒ１２ＲＯＲ１キメラ受容体により改変されたＴ細胞では、２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体により改変されたＴ細胞と比較してＡＩＣＤ率が低いことを検出したことから、Ｒ１２のアフィニティーの増大は、本発明者らの前臨床モデルにおけるＴ細胞の生存に対して有害作用を及ぼさないことを裏付ける。

ＲＯＲ１は、正常成熟ナイーブＢ細胞上および正常成熟メモリーＢ細胞上で発現しないので、ＣＬＬおよびＭＣＬに対する標的として、ＣＤ１９を凌ぐ潜在的利点を有する。しかし、Ｂ細胞腫瘍上のＲＯＲ１分子の数は、ＣＤ１９と比較して少数であり、最適化されたＲＯＲ１キメラ受容体が、デザインが類似するＣＤ１９キメラ受容体と同様に、臨床において使用するのに有効であるのかどうかは不確実である。残念ながら、かつてＮＳＧマウスにおいてＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞の機能を査定するのに使用されたＢ細胞腫瘍異種移植モデルであって、Ｒａｊｉ、Ｄａｕｄｉ、およびＮａｌｍ−６を含むＢ細胞腫瘍異種移植モデルは、ＣＬＬまたはＭＣＬに由来せず、ＲＯＲ１を構成的に発現させない。したがって、ｉｎｖｉｖｏにおけるＣＤ１９のターゲティングとＲＯＲ１のターゲティングとを比較するため、本発明者らは、天然でＣＤ１９およびＲＯＲ１の両方を発現させ、ＮＳＧマウスに生着するＪｅＫｏ−１ＭＣＬ細胞系を使用した。本発明者らのモデルを臨床的に関与性とするため、本発明者らは、ＪｅＫｏ−１リンパ腫細胞を静脈内接種して、全身性腫瘍を生成し、腫瘍が確立されたら、マウスを、稠度が均一なＴ細胞生成物で処置した。本発明者らは、高アフィニティーＲ１２キメラ受容体を発現させるＴ細胞が、ｉｎｖｉｖｏにおいて、ＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞と同等な抗腫瘍活性を付与することを見出した。Ｒ１２ＲＯＲ１キメラ受容体はまた、ｉｎｖｉｖｏにおいても、最適な２Ａ２ＲＯＲ１キメラ受容体と比較して優れた活性を媒介することは、本発明者らのｉｎｖｉｔｒｏ解析と符合する。これらの結果は、マウス腫瘍モデルは、臨床状況における養子療法の有効性を予測しない可能性があるので、慎重に解釈すべきである。しかし、結果は、ＲＯＲ１が、ＣＤ１９に対する代替物としての検討を正当化するか、またはＣＤ１９を喪失させた変異体が出現する潜在的可能性を最小化するさらなる標的をもたらすことを示唆する。

ＲＯＲ１は、いくつかの上皮腫瘍の生存において決定的な役割を果たすと考えられる。したがって、ＲＯＲ１をターゲティングする利点は、単一のキメラ受容体が、多数の造血系腫瘍および非造血系腫瘍を伴う患者を処置するのに有用でありうることである。

本発明者らのデータは初めて、デザインされたＲＯＲ１キメラ受容体を発現させるＴ細胞が、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、上皮がんを効率的に認識することを示す。ＣＤ８０／８６共刺激性リガンドの非存在にもかかわらず、ＲＯＲ１^＋乳がん細胞により誘導されるサイトカイン分泌およびＴ細胞増殖は、白血病細胞により誘導されるサイトカイン分泌およびＴ細胞増殖より高度であった。本明細書で報告した研究は、細胞外スペーサードメインのデザインおよびキメラ受容体のアフィニティーが、ＲＯＲ１キメラ受容体により改変されたＴ細胞による、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏにおける、ＲＯＲ１^＋造血系腫瘍およびＲＯＲ１^＋上皮腫瘍の認識を増強するようにモジュレートしうるパラメータであることを裏付けている。腫瘍反応性を増強したＲＯＲ１キメラ受容体を開発することにより、様々なヒトがんにおける臨床適用のための機会がもたらされる。

（実施例２）
細胞外スペーサードメインの長さの、腫瘍細胞膜に対して近位に位置するエピトープを認識するＨｅｒ２特異的キメラ受容体による腫瘍細胞の溶解の誘発に対する効果

ＲＯＲ１について上記で記載した方法と同様の方法を使用して、ＣＡＲスペーサー長の、ＨＥＲ２特異的キメラ受容体を発現させるＣＤ８＋ヒトＴリンパ球による腫瘍細胞の認識および腫瘍細胞の認識の誘発に対する効果を検討した。ＨＥＲ２上の膜近位エピトープを認識するＨＥＲ２特異的ｍＡｂのＶＬ鎖セグメントおよびＶＨ鎖セグメントを使用して、ＨＥＲ２特異的キメラ受容体を構築し（図１２Ａ）、ｓｃＦｖを、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３細胞外スペーサードメイン、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ３細胞外スペーサードメイン、およびＩｇＧ４ヒンジだけの細胞外スペーサードメイン、ならびにＣＤ２８膜貫通ドメイン、４−１ＢＢシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインへと連結した（図１２Ｂ）。初代ＣＤ８＋Ｔ細胞に、ＨＥＲ２キメラ受容体の各々を形質導入し、ＥＧＦＲ形質導入マーカーの発現について選択した（図１２Ｄ）。ＨＥＲ２キメラ受容体の発現および各受容体のサイズは、ウェスタンブロットにより確認した（図１２Ｃ）。次いで、Ｔ細胞を、抗ＣＤ３ｍＡｂおよびフィーダー細胞と共に増やし、ＨＥＲ２＋腫瘍細胞を認識するそれらの能力について検討した。Ｒ１１ＲＯＲ１特異的キメラ受容体について観察される通り、長鎖細胞外スペーサードメインを含有するＨＥＲ２キメラ受容体は、Ｔ細胞によるＨＥＲ２＋腫瘍細胞の優れた認識を付与した（図１２Ｅ）。

考察
細胞外スペーサー長の、キメラ受容体改変Ｔ細胞による腫瘍細胞の認識に対する効果についての本実施例では、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎキメラｍＡｂのＶ_Ｈ＋Ｌ配列から構築されたｓｃＦｖを含むキメラ受容体を使用した。Ｃｈｏら（Ｎａｔｕｒｅ、４２１巻：７５６頁、２００３年）による研究により、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎのエピトープの位置が、ＨＥＲ２（ＥＲＲＢ２）細胞外ドメイン上の膜近位位置へと位置特定された（図１２Ａ）。ヒトＩｇＧ４ヒンジ：Ｆｃ変異体の構造（図１２Ｂ）についての本発明者らの理解に基づき、本発明者らは、細胞外腫瘍細胞抗原上のターゲティングエピトープの膜近位位置であれば、長鎖スペーサーをコードするキメラ受容体を発現させるエフェクターＴ細胞により最もよく認識されることを仮定する。本発明者らのデータは、短鎖スペーサーＨｅｒｃｅｐｔｉｎキメラ受容体を発現させるＴ細胞によるバックグラウンドに近い活性から、中位の長さのスペーサーキメラ受容体を発現させるＴ細胞による中間の活性、および長鎖スペーサーキメラ受容体を発現させるＴ細胞による最大の溶解に至る細胞溶解活性の勾配を裏付ける。したがって、細胞外スペーサーは、Ｔ細胞による腫瘍の認識に対して決定的な効果を及ぼし、このデータは、標的分子を発現させた腫瘍のエピトープの位置に基づき、キメラ受容体のデザインを調整する必要についてのさらなる裏付けをもたらす。

（実施例３）
キメラ受容体により改変されたＴ細胞によるＣＤ１９の最適な認識およびＣＤ１９に対するｉｎｖｉｖｏ有効性のためのスペーサー長および配列のカスタマイズ

材料および方法
ヒト被験体
血液試料は、ＦｒｅｄＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ（ＦＨＣＲＣ）の治験審査委員会により承認された研究プロトコールに参加する説明同意文書を提出した健常ドナーから得た。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）上の遠心分離により単離し、ＲＰＭＩ、２０％のヒト血清、および１０％のジメチルスルホキシド中で極低温保存した。

細胞系
Ｋ５６２、Ｒａｊｉ、ＪｅＫｏ−１、および２９３Ｔ細胞系は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得、指示の通りに培養した。Ｔ２Ａ配列およびｅＧＦＰの上流でｆｆｌｕｃ遺伝子をコードするレンチウイルスを２９３Ｔ細胞内で産生させ、Ｒａｊｉ腫瘍細胞およびＪｅＫｏ−１腫瘍細胞に形質導入するのに使用した。Ｒａｊｉ細胞およびＪｅＫｏ−１細胞は、レンチウイルスによる形質導入の後で増やし、ｅＧＦＰ陽性サブセットを分取精製した。

免疫表現型解析
ＰＢＭＣおよびＴ細胞系を、以下のコンジュゲートモノクローナル抗体：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、およびマッチさせたアイソタイプ対照（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のうちの１つまたは複数で染色した。生細胞／死細胞を弁別するために、製造元により指示される通りに、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による染色を実施した。フロー解析は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ上で行い、分取精製は、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で行い、データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を使用して解析した。

ＣＤ１９キメラ受容体をコードするレンチウイルスによるベクターの構築および調製
ＣＤ１９特異的キメラ受容体は、以下を使用して構築した：（１）（Ｇ_４Ｓ）_３リンカー（配列番号１２）ペプチド（ＶＬ−リンカー−ＶＨ）により連結された、ＣＤ１９特異的ｍＡｂであるＦＭＣ６３（配列番号３）のＶＬ鎖セグメントおよびＶＨ鎖セグメント；（２）ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３部分（２２９アミノ酸（配列番号））またはヒンジだけ（１２アミノ酸（配列番号４））を含むＩｇＧ４−Ｆｃ（Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース：Ｐ０１８６１（配列番号１３））に由来するスペーサードメイン。スペーサーのいずれも、天然のＩｇＧ４−Ｆｃタンパク質の１０８位に位置するヒンジドメイン内のＳ→Ｐ置換を含有した；ヒトＣＤ２８の２７アミノ酸の膜貫通ドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース：Ｐ１０７４７（配列番号１４））；（４）（ｉｉｉ）ヒトＣＤ３ζのアイソフォーム３の１１２アミノ酸の細胞質ドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース：Ｐ２０９６３（配列番号１６））へと連結された、（ｉ）天然のＣＤ２８タンパク質（配列番号１４）の１８６〜１８７位に位置するＬＬ→ＧＧ置換を伴う、ヒトＣＤ２８の４１アミノ酸の細胞質ドメイン；および／または（ｉｉ）ヒト４−１ＢＢの４２アミノ酸の細胞質ドメイン（Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース：Ｑ０７０１１（配列番号１５））を含むシグナル伝達モジュール；自己切断型Ｔ２Ａ配列（配列番号８）；ならびに（６）切断型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）配列（配列番号９）。

ＮｈｅＩ制限部位およびＮｏｔＩ制限部位を使用して、各トランス遺伝子をコードする、コドンを最適化したヌクレオチド配列を合成し（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターへとクローニングした。ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターは、ｐＨＩＶ７のサイトメガロウイルスプロモーターを、ＥＦ−１プロモーターで置きかえることにより、ｐＨＩＶ７ベクターから導出した。

ＣＤ１９キメラ受容体またはｔＥＧＦＲをコードするレンチウイルスは、Ｃａｌｐｈｏｓトランスフェクション試薬（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、レンチウイルスベクターならびにパッケージングベクターであるｐＣＨＧＰ−２、ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ２、およびｐＣＭＶ−Ｇを共トランスフェクトされた、２９３Ｔ細胞内で産生させた。トランスフェクションの１６時間後において培地を交換し、２４、４８、および７２時間後にレンチウイルスを回収した。

ＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞系の作製
正常ドナーの分取精製ＣＤ８^＋ＣＤ４５ＲＡ⁻ＣＤ４５ＲＯ^＋ＣＤ６２Ｌ^＋セントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ）を、製造元の指示書に従い抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で活性化し、活性化後の３日目において、２，１００ｒｐｍ、３２℃で４５分間にわたる遠心分離により、これに、１μｇ／ｍＬのポリブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を補充したレンチウイルス上清（ＭＯＩ＝３）を形質導入した。Ｔ細胞は、組換えヒト（ｒｈ）ＩＬ−２を５０Ｕ／ｍＬの最終濃度まで補充した、ＲＰＭＩ、１０％のヒト血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、および１％のペニシリン−ストレプトマイシン（ＣＴＬ培地）中で、４８時間ごとに増やした。増殖の後、各形質導入されたＴ細胞系のアリコートを、ビオチンとコンジュゲートした抗ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）抗体およびストレプトアビジンビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で染色し、免疫磁気選択によりｔＥＧＦＲ＋Ｔ細胞を単離した。

次いで、ｔＥＧＦＲ＋Ｔ細胞サブセットを、Ｔ細胞：ＬＣＬ比を１：７とする、照射された（８，０００ラド）ＴＭＥＢＶ−ＬＣＬで刺激し、５０Ｕ／ｍＬのｒｈＩＬ−２を添加したＣＴＬ培地中で、４８時間ごとに８日間にわたり増やした。

クロム放出アッセイ、サイトカイン分泌アッセイ、およびＣＦＳＥ増殖アッセイ
標的細胞を、^５１Ｃｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で一晩にわたり標識し、洗浄し、３連、ウェル１つ当たりの細胞１〜２×１０^３個で、多様なエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比のエフェクターＴ細胞と共にインキュベートした。４時間にわたるインキュベーションの後、γカウンティングのために上清を採取し、標準的な式を使用して、特異的溶解を計算した。サイトカイン分泌についての解析のため、標的細胞およびエフェクター細胞を、３連のウェル内、２：１（Ｒａｊｉ）または４：１（Ｋ５６２／ＣＤ１９およびＫ５６２）のＥ：Ｔ比で播種し、ＩＮＦ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０を、２４時間にわたるインキュベーションの後で除去される上清中のマルチプレックスサイトカインイムノアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）により測定した。

増殖についての解析では、Ｔ細胞を、０．２μＭのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、洗浄し、３連のウェル内、外因性サイトカインを伴わずに、ＣＴＬ培地中の比を２：１（Ｒａｊｉ）または４：１（Ｋ５６２／ＣＤ１９およびＫ５６２）とする刺激細胞と共に播種した。７２時間のインキュベーションの後、細胞を抗ＣＤ３ｍＡｂおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で標識して、死細胞を解析から除外した。試料は、フローサイトメトリーにより解析し、ＣＦＳＥ希釈によりＣＤ３＋生Ｔ細胞の細胞分裂を評価した。

ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスおよびＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ^−／−（ＮＳＧ）マウスによる実験
全てのマウス実験は、ＦＲＣＲＣＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。６〜８週齢の雌ＮＯＤ．ＣＢＩ７−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄ／Ｊ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）およびＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍｌＷｊｌ}／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスは、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙから得るか、施設（ＦＲＣＲＣ）内で飼育した。マウスに、尾静脈注射を介して、０．５×１０^６個のＲａｊｉ−ｆｆｌｕｃ腫瘍細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）注射し、かつ、尾静脈注射を介して、指し示される通り、キメラ受容体により改変されたＴ細胞、対照Ｔ細胞、またはＰＢＳを注射した。

生物発光造影のため、マウスに、ＰＢＳ中に再懸濁させた、調製したてのルシフェリン基質（ＣａｌｉｐｅｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、ＭＡ）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射（体重１ｇ当たり１５μｇ）を施し、次いで、誘導チャンバー内でイソフルランにより麻酔をかけた。深麻酔の誘導後、ルシフェリンをｉ．ｐ．注射した１０、１２、および１４分後に、ＸｅｎｏｇｅｎＩＶＩＳＩｎＶｉｖｏＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（ＣａｌｉｐｅｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、ＭＡ）を使用して、収集時間を１秒間〜１分間とする小ビニングモードでマウスを造影して、不飽和画像を得た。ルシフェラーゼ活性は、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅＳｏｆｔｗａｒｅ（ＣａｌｉｐｅｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、ＭＡ）を使用して解析し、各個別のマウスの全身を包摂する対象の領域内で光子束解析した。

統計学的解析
統計学的解析は、ＰｒｉｓｍＳｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ、ＣＡ）を使用して実施した。スチューデントのｔ検定を、信頼区間を９５％とする両側検定として実施し、ｐ値をｐ＜０．０５とする結果を有意と考えた。生存についての統計学的解析は、ログランク検定により行い、ｐ値をｐ＜０．０５とする結果を有意と考えた。

結果
長鎖細胞外スペーサーを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるポリクローナルＣＤ８^＋Ｔ_ＣＭおよび短鎖細胞外スペーサーを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるポリクローナルＣＤ８^＋Ｔ_ＣＭに由来する細胞系の調製
本発明者らは、コドンを最適化したＣＤ１９キメラ受容体遺伝子のパネルをコードする個別のレンチウイルスベクターを構築して、細胞外スペーサー長の、ＣＤ１９キメラ受容体により改変されたＴ細胞のｉｎｖｉｔｒｏにおける機能およびｉｎｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性に対する影響を検討した。各キメラ受容体は、ＣＤ１９特異的ｍＡｂであるＦＭＣ６３の配列に対応する単鎖可変断片（ｓｃＦｖ：ＶＬ−ＶＨ）、「ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３」ドメイン（２２９アミノ酸、長鎖スペーサー）または「ヒンジ」ドメインだけ（１２アミノ酸、短鎖スペーサー）を含むＩｇＧ４−Ｆｃに由来するスペーサー、および膜近位ＣＤ２８共刺激ドメインまたは４−１ＢＢ共刺激ドメインを単独またはタンデムで伴う、ＣＤ３ζのシグナル伝達モジュールを含んだ（図１３Ａ）。トランス遺伝子カセットは、キメラ受容体遺伝子から下流において切断型ＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）を含み、切断可能なＴ２Ａエレメントで隔てられて、キメラ受容体により改変されたＴ細胞のための形質導入マーカー、選択マーカー、およびｉｎｖｉｖｏにおけるトラッキングマーカーとして用いられた。

本発明者らは、養子移入後においてもｉｎｖｉｖｏで存続するＴ_ＣＭの優れた能力のために、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋セントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ）細胞集団を、正常ドナーの血液から細胞分取することにより、形質導入および増殖のために単離した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／２８ビーズで刺激し、レンチウイルスベクターの各々を形質導入し、培養物中で１８日間にわたり増やしてから、ｉｎｖｉｔｒｏ実験およびｉｎｖｉｖｏ実験のために使用した（図１３Ｂ）。レンチウイルスベクターの各々について、同様の形質導入効率を達成し（平均：２５％）、ビオチニル化抗ＥＧＦＲｍＡｂおよびストレプトアビジンビーズを使用して、トランス遺伝子陽性Ｔ細胞を、免疫磁気選択により均一な純度へと濃縮した。ｔＥＧＦＲ濃縮の後、ＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞系の各々を、多様なＣＤ１９キメラ受容体構築物を発現させるＴ細胞系の間の、ｉｎｖｉｔｒｏにおける成長動態の明らかな差違を伴わずに、ＣＤ１９＋Ｂ−ＬＣＬによる単回の刺激により増やした。増殖の後、ｔＥＧＦＲマーカーは、ベクターの各々を形質導入されたＴ細胞のうちの＞９０％において、同等なレベルで発現した（図１３Ｃ）。

長鎖細胞外スペーサードメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体および短鎖細胞外スペーサードメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体は、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて、特異的抗腫瘍反応性を付与する
本発明者らは、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達部分および４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達部分、ならびに短鎖（「短鎖／ＣＤ２８」；「短鎖／４−１ＢＢ」）細胞外スペーサードメインまたは長鎖（「長鎖／ＣＤ２８」；「長鎖／４−１ＢＢ」）細胞外スペーサードメインのそれぞれを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるように改変されたＴ_ＣＭに由来するＴ細胞系のエフェクター機能を比較した。４つのＣＤ１９キメラ受容体構築物の各々を発現させるＴ細胞は、ＣＤ１９^＋Ｒａｊｉリンパ腫細胞およびＪｅＫｏ−１リンパ腫細胞、ならびにＣＤ１９を安定的にトランスフェクトされており、天然のＣＤ１９⁻Ｋ５６２細胞ではないＫ５６２細胞に対する特異的細胞溶解活性を付与した（図１４Ａ）。マルチプレックスサイトカインアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）による、Ｋ５６２／ＣＤ１９腫瘍細胞またはＲａｊｉ腫瘍細胞による刺激に応答するサイトカイン産生についての定量的解析は、ＣＤ１９キメラ受容体の各々を発現させるＴ細胞による、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０の産生を示した（図１４Ｂ）。ＣＤ２８共刺激ドメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞は、４−１ＢＢ共刺激ドメインを伴う、対応する構築物と比較して、著明に高度なレベルのＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、およびＩＬ−１０を産生した（図１４Ｂ、Ｃ）。ＣＤ１９「長鎖／ＣＤ２８」キメラ受容体を発現させるＴ細胞により、「短鎖／ＣＤ２８」キメラ受容体を発現させるＴ細胞と比較して、著明に高度なＩＦＮ−γ産生および著明に低度のＩＬ−４産生が認められた。４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達モジュールを伴うＣＤ１９キメラ受容体のうち、本発明者らは、短鎖スペーサードメインを伴う構築物を発現させるＴ細胞内で、著明に高度なレベルのＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＬ−１０の分泌を検出した（図１４Ｂ、Ｃ）。

本発明者らは、ＣＦＳＥ色素の希釈を使用して、ＣＤ１９＋腫瘍細胞が係合した後における、ＣＤ１９キメラ受容体の各々により改変されたＴ細胞の増殖を解析した。ＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞系の各々の特異的で活発な増殖を、Ｋ５６２／ＣＤ１９またはＲａｊｉによる刺激の７２時間後において観察した。ＣＤ２８共刺激ドメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞では、細胞分裂の平均回数が、４−１ＢＢ共刺激ドメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞と比較して多く、ＣＤ２８を含有するキメラ受容体を発現させるＴ細胞によるＩＬ−２産生の増大と符合した（図１４Ｂ〜Ｄ）。本発明者らはまた、７２時間の終わりでのＫ５６２／ＣＤ１９およびＲａｊｉ腫瘍細胞による刺激の後に、培養物をＣＤ３＋およびＰＩで共染色することにより、活性化誘導型細胞死を経るキメラ受容体Ｔ細胞の比率も解析した。本発明者らは、ＣＤ１９キメラ受容体「長鎖／４−１ＢＢ」細胞系内では、高頻度のＣＤ３^＋ＣＤ８＋ＰＩ^＋Ｔ細胞を検出したが、他のＣＤ１９キメラ受容体については、少数のＰＩ＋細胞を観察した（図１４Ｅ）。

ｉｎｖｉｔｒｏにおけるエフェクター機能についてのこの解析は、ＣＤ２８共刺激ドメインと４−１ＢＢ共刺激ドメインとを比較したが、Ｔ細胞機能の差違が明らかにならなかったかつての研究と符合し、このことは、このパネルに由来する特定のＣＤ１９キメラ受容体構築物が、ｉｎｖｉｖｏにおける抗腫瘍有効性を欠くことを示唆する。

短鎖細胞外スペーサードメインを伴うが、長鎖細胞外スペーサードメインを伴わないＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞は、免疫不全マウスモデルにおいて、Ｒａｊｉ腫瘍を根絶する
本発明者らは次に、生物発光造影を使用して、ＣＤ１９キメラ受容体の各々により改変されたＴ細胞のｉｎｖｉｖｏにおける抗腫瘍有効性を、腫瘍の負荷および分布についての逐次的な定量的解析を可能とする、ホタルルシフェラーゼをトランスフェクトされたＲａｊｉ細胞（Ｒａｊｉ−ｆｆｌｕｃ）を移植された免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスにおいて査定した。尾静脈注射を介して、０．５×１０^６個のＲａｊｉ−ｆｆｌｕｃ細胞を接種されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、処置しなければおよそ３．５週間後に後肢の麻痺をもたらす、播種性リンパ腫を発症し、安楽死を必要とした。腫瘍を保有するマウスは、腫瘍接種後の２および９日目に投与される、ＣＤ１９キメラ受容体の各々により改変されたＴ細胞に由来するＣＤ８＋Ｔ_ＣＭの２回にわたる投与、またはｔＥＧＦＲ対照ベクターで処置した（図１５Ａ）。

驚くべきことに、短鎖細胞外スペーサードメイン（「短鎖／ＣＤ２８」および「短鎖／４−１ＢＢ」）を伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるように改変されたＴ細胞だけが、このモデルにおけるＲａｊｉ腫瘍を根絶したのに対し、長鎖スペーサー（「長鎖／ＣＤ２８」および「長鎖／４−１ＢＢ」）を伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞により処置されたマウスは、処置されなかったマウスまたは対照ｔＥＧＦＲ＋Ｔ細胞で処置されたマウスとほぼ同一な動態で、全身性リンパ腫および後肢の麻痺を発症した（図１５Ｂ、Ｃ）。短鎖スペーサードメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体と長鎖スペーサードメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体との間の抗腫瘍活性の顕著な差違は、極めて著明であり、３例の異なる正常ドナーから生成されたキメラ受容体Ｔ細胞系による複数回の実験において再現可能であった。

ＮＯＤ／ＳＣＩＤリンパ腫モデルは、腫瘍接種とＴ細胞投与との短い間隔およびヒト細胞の生着に対する耐性の増大のために、臨床状況における抗腫瘍活性を予測するのには、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ^−／−（ＮＳＧ）など、さらなる免疫不全マウス株と比較して最適未満でありうる。したがって、本発明者らは、養子療法の抗腫瘍活性を、より臨床的に関与性のモデルであって、Ｒａｊｉ−ｆｆｌｕｃリンパ腫をＮＳＧマウスにおいて確立し、生物発光造影により骨髄中で腫瘍が容易に検出可能となる７日後にＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞を投与するモデルにおいて査定した（図１６Ａ）。本発明者らは、初期用量滴定実験を実施して、ＣＤ１９「短鎖／４−１ＢＢ」キメラ受容体を形質導入されたＴ細胞の最低用量であって、確立されたＲａｊｉ腫瘍の根絶に要求される最低用量を決定した。２．５×１０^６個のＣＤ１９キメラ受容体「短鎖／４−１ＢＢ」を発現させるＴ細胞の単回投与は、確立されたＲａｊｉ腫瘍の完全な退縮を促進し、１００％のマウスにおいて、長期にわたる無腫瘍生存を結果としてもたらした（図１６Ｂ、Ｃ）。２．５×１０^６個の用量レベルで、Ｔ細胞は、養子移入および腫瘍の根絶後少なくとも３週間にわたり、ＮＳＧマウスの末梢血中でたやすく検出された。したがって、このモデルは、本発明者らのパネル内のＣＤ１９キメラ受容体の各々により改変されたＴ細胞の抗腫瘍活性および存続の両方についての比較研究を可能とした（図１６Ｄ）。

本発明者らは、次いで、Ｒａｊｉリンパ腫を移植されたＮＳＧマウスのコホートを、ＰＢＳ単独、２．５×１０^６個の、ＣＤ１９キメラ受容体の各々を発現させるＴ細胞の単回投与、またはｔＥＧＦＲをコードする対照ベクターにより改変されたＴ細胞で処置した（図１７Ａ）。確立されたリンパ腫のこのモデルにおいて、短鎖細胞外スペーサードメインおよび４−１ＢＢ共刺激ドメインまたはＣＤ２８共刺激ドメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞（「短鎖／ＣＤ２８」および「短鎖／４−１ＢＢ」）は、７〜１０日間にわたり、完全な腫瘍の退縮を媒介し、全てのマウスは、＞５６日間にわたり無腫瘍で生存した。これに対し、長鎖スペーサードメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるように改変されたＴ細胞（「長鎖／ＣＤ２８」および「長鎖／４−１ＢＢ」）で処置されたマウスは、腫瘍の進行を呈示し、対照ｔＥＧＦＲＴ細胞を施されたマウスと同様の時期に屠殺しなければならなかった（図１７Ｂ、Ｃ）。「長鎖／ＣＤ２８」ＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞の係合の後における、４−１ＢＢ構築物と比較した、これらの構築物を発現させるＴ細胞の、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて腫瘍細胞を溶解させる能力、ＩＬ−２産生の増強、および増殖を踏まえると、長鎖スペーサーを伴うキメラ受容体構築物のｉｎｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性の欠如は、予測されなかった。

有効性の欠如の基盤に対する洞察をもたらすため、本発明者らは、Ｔ細胞注入の後、間隔をおいて、マウスの末梢血試料に対する逐次フローサイトメトリーを実施した。「短鎖／ＣＤ２８」ＣＤ１９キメラ受容体および「短鎖／４−１ＢＢ」ＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞で処置された全てのマウスが、養子移入後の全ての時点において、対応する長鎖細胞外スペーサーを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させたＴ細胞で処置されたマウスと比較して、有意に高度なレベルの移入Ｔ細胞を血液中に有した（ｐ＜０．０１）（図１７Ｄ）。本発明者らは、ＣＤ２８共刺激ドメインまたは４−１ＢＢ共刺激ドメインおよび短鎖スペーサードメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞を施されたマウスの末梢血中のＴ細胞の存続に著明な差違を観察しなかった（図１７Ｄ）。

長鎖スペーサーを伴うＣＤ１９キメラ受容体のｉｎｖｉｖｏにおける抗腫瘍有効性は、Ｔ細胞の用量を増大させるかまたはさらなる共刺激ドメインを施すことによっては改善されない
長鎖スペーサードメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体により改変されたＴ細胞で処置されたマウスでは、ｉｎｖｉｖｏにおける抗腫瘍有効性が欠如し、存続するキメラ受容体Ｔ細胞のレベルも低下することから、有効性は、キメラ受容体Ｔ細胞の用量を増大させるか、またはＣＤ２８ドメインおよび４−１ＢＢドメインの両方を、キメラ受容体へと組み入れて、共刺激シグナル伝達を増進させることにより改善しうることが示唆された。この可能性を査定するために、本発明者らは、ＣＤ８＋Ｔ_ＣＭを、「長鎖／ＣＤ２８」ＣＤ１９キメラ受容体ベクター、「短鎖ＣＤ２８」ＣＤ１９キメラ受容体ベクター、および「長鎖／ＣＤ２８＿４−１ＢＢ」ＣＤ１９キメラ受容体ベクターで改変し、ＣＤ１９＋標的細胞を認識した後で、「長鎖／ＣＤ２８＿４−１ＢＢ」ＣＤ１９キメラ受容体が、ｉｎｖｉｔｒｏにおける特異的溶解およびサイトカイン産生を付与することを確認した（図１８Ａ〜Ｃ）。

「ＣＤ２８＿４−１ＢＢ」ＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞における、ｉｎｖｉｔｒｏのサイトカイン産生および増殖のレベルが、ＣＤ２８単独を伴う同一な構築物と比較して劣り、「長鎖４−１ＢＢ」ＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞に優ることは、ＣＤ１９キメラ受容体についてのかつての研究と符合する（図１８Ｂ、Ｃ）。

次いで、確立されたＲａｊｉ腫瘍を伴うＮＳＧマウスの群を、「長鎖／ＣＤ２８」ＣＤ１９キメラ受容体、「長鎖／ＣＤ２８＿４−１ＢＢ」ＣＤ１９キメラ受容体、「短鎖／ＣＤ２８」ＣＤ１９キメラ受容体、およびｔＥＧＦＲ単独を発現させる、高用量のＴ細胞（１０×１０^６個）で処置した。生物発光造影により腫瘍負荷を測定し、連続フローサイトメトリーによる末梢血試料の解析を実施して、移入Ｔ細胞の頻度を決定した。「短鎖／ＣＤ２８」ＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞で処置されたマウスにおいてＲａｊｉ腫瘍が完全に根絶されたことは、はるかに低用量のＴ細胞を使用した、本発明者らによるかつての実験の結果と符合する。しかし、４倍のＴ細胞の用量を伴ってもなお、「長鎖／ＣＤ２８」ＣＤ１９キメラ受容体または「長鎖／ＣＤ２８＿４−１ＢＢ」ＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞による処置は、識別可能な抗腫瘍効果をもたらさなかった（図１８Ｄ、Ｅ）。

したがって、キメラ受容体Ｔ細胞の用量を増大させ、４−１ＢＢ共刺激ドメインをＣＤ１９キメラ受容体へと添加することは、ｉｎｖｉｖｏにおける長いスペーサードメインの抗腫瘍活性に対する負の影響を克服することに失敗した。したがって、このモデルでは、ＣＤ１９キメラ受容体の抗腫瘍反応性は、大きな程度で、細胞外スペーサードメインの長さにより決定付けられるものであり、細胞内共刺激シグナル伝達モジュールにより決定付けられるものではない。

長鎖細胞外スペーサーを保有するＣＤ１９キメラ受容体により改変されたＴ細胞は、ｉｎ
ｖｉｖｏにおける活性化誘導型細胞死を経る
本発明者らは、長鎖スペーサードメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞のｉｎｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性の低さの根底をなす潜在的機構を決定しようと試みた。血液中に存在する、長鎖スペーサードメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるように改変された移入Ｔ細胞の数は少なかったため、本発明者らは、ｉｎｖｉｖｏにおいて、Ｔ細胞が、腫瘍細胞により効率的に活性化されないか、または逆に、ｉｎｖｉｖｏにおいて、Ｔ細胞が、活性化誘導型のＴ細胞死を受ける可能性について検討した。したがって、本発明者らは、ＣＤ１９キメラ受容体により改変されたＴ細胞および対応する対照Ｔ細胞を、ＣＦＳＥで標識し、これらのＴ細胞を、腫瘍を保有するＮＳＧ／Ｒａｊｉマウスへと投与して、ｉｎｖｉｖｏの腫瘍部位における、ＣＤ１９キメラ受容体構築物の各々により改変されたＴ細胞の活性化、増殖および生存について検討した（図１９Ａ）。それらのｉｎｖｉｔｒｏにおける増殖を終え、ＣＦＳＥによる標識化および確立されたＲａｊｉ腫瘍を保有するＮＳＧマウスへと注入される直前において、ＣＤ１９キメラ受容体の各々を形質導入されたＴ細胞は、低レベルの活性化マーカーであるＣＤ６９およびＣＤ２５を発現させた（図１９Ｂ）。

Ｔ細胞注入の２４および７２時間後に、骨髄をマウスの部分群から得て、移入Ｔ細胞の頻度、活性化、および増殖について検討した。２４時間後の全ての処置群において、腫瘍細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３−）は、骨髄中に存在し、キメラ受容体Ｔ細胞の大部分は、ＣＤ６９およびＣＤ２５を上方調節したが、対照Ｔ細胞は、ＣＤ６９およびＣＤ２５を上方調節しなかった。移入されたキメラ受容体Ｔ細胞において、ＣＦＳＥの測定可能な希釈は認められなかった（図１９Ｃ）。ＣＤ６９およびＣＤ２５のいずれも、「長鎖スペーサー」ＣＤ１９キメラ受容体により改変されたＴ細胞のうちの大部分において発現したことから、これらの細胞は、「短鎖スペーサー」ＣＤ１９キメラ受容体を伴うＴ細胞と比較して、より強力な刺激を受けた可能性があることが示唆される（図１９Ｃ）。２４時間後におけるＴ細胞の活性化の証拠にもかかわらず、ＣＤ２８および４−１ＢＢ「長鎖スペーサー」構築物により改変されたＴ細胞で処置されたマウスの骨髄中のキメラ受容体Ｔ細胞の数は、ＣＤ２８および４−１ＢＢ「短鎖スペーサー」構築物により改変されたＴ細胞、または対照ｔＥＧＦＲベクターで処置されたマウスの骨髄中のキメラ受容体Ｔ細胞の数と比較して著明に少なかった（図１９Ｃ、Ｅ）。

Ｔ細胞移入の７２時間後において、「短鎖／ＣＤ２８」ＣＤ１９キメラ受容体および「短鎖／４−１ＢＢ」ＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞は、骨髄中および脾臓内の頻度が３〜＞１０倍に増大し、数回の細胞分裂を経た（図１９Ｄ、Ｅ）。対照のｔＥＧＦＲ＋Ｔ細胞は、７２時間後において、骨髄中および脾臓に、２４時間後に観察されるレベルと同様のレベルで存在したままであり、ＣＦＳＥ希釈により測定される通り、分裂しなかった。これに対し、「長鎖／ＣＤ２８」ＣＤ１９キメラ受容体および「長鎖／４−１ＢＢ」ＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞の数は、骨髄中および脾臓内で増大しなかった（図１９Ｄ、Ｅ）。ＰＩ−「長鎖／ＣＤ２８」ＣＤ１９キメラ受容体生存Ｔ細胞およびＰＩ−「長鎖／４−１ＢＢ」ＣＤ１９キメラ受容体生存Ｔ細胞におけるＣＦＳＥ染色についての解析により、これらの細胞が、「短鎖／ＣＤ２８」ＣＤ１９キメラ受容体および「短鎖／４−１ＢＢ」ＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞と比較してはるかに少ない回数の細胞分裂を経たと裏付けられたことは、低細胞数と符合する（図１９Ｄ）。ＰＩ＋Ｔ細胞を組み入れるようにフローデータを解析したところ、本発明者らは、はるかに高頻度のＰＩ＋ＣＤ３＋Ｔ細胞を、「長鎖スペーサー」ドメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞を施されたマウスの骨髄中および脾臓内で検出したことから、ｉｎｖｉｖｏにおいて、著明な比率のＴ細胞が、腫瘍により活性化されたにもかかわらず、細胞死を受けたことが裏付けられる（図１９Ｆ）。長鎖スペーサードメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞またはｔＥＧＦＲだけを発現させるＴ細胞により処置されたマウスの骨髄中では、ＣＤ４５＋ＣＤ３− Ｒａｊｉ腫瘍細胞が、短鎖スペーサードメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体で処置されたマウスと比較してより大きな数で存在したことは、生物発光造影と符合する（図１９Ｄ、Ｅ、Ｇ）。

まとめると、データは、長鎖細胞外スペーサードメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体は、ｉｎｖｉｔｒｏにおいて同等であるかまたは優れたエフェクター機能を媒介し、ｉｎ
ｖｉｖｏにおいて腫瘍を認識するにもかかわらず、ｉｎｖｉｖｏにおいて高レベルの活性化誘導型細胞死を誘導し、確立されたリンパ腫を根絶することに失敗することの証拠を提示する。

考察
キメラ受容体とは、細胞外抗原結合ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖの細胞膜からの隔離をもたらすスペーサードメイン、およびＴ細胞の活性化を媒介する細胞内シグナル伝達モジュールを含む人工の受容体である。本明細書で研究したＣＤ１９特異的ＦＭＣ６３ｍＡｂに由来するｓｃＦｖを含有するキメラ受容体は、Ｂ細胞悪性腫瘍を伴う患者での臨床試験における検査へと進んでいる。抗腫瘍活性およびＴ細胞の存続は、異なる試験では、実質的に変化している。これらの臨床試験の各々は、異なる遺伝子導入ベクター、細胞培養法、およびＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞を移入する前の馴致レジメンを含む、潜在的に極めて重要な変数が異なった。

本発明者らは、ＣＤ１９キメラ受容体の細胞外スペーサードメインが、キメラ受容体によりもたらされる共刺激シグナル伝達とは独立の、ｉｎｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性の重要な決定因子でありうる可能性について検討した。本発明者らは、スペーサードメインを、高レベルのキメラ受容体の細胞表面発現を可能とし、生得的免疫細胞による認識を引き起こす可能性が他のＩｇＧアイソタイプと比較して低い、ＩｇＧ４−Ｆｃから導出した。本発明者らは、長鎖（２２９アミノ酸）スペーサー構築物のデザインでは、ＩｇＧ４「ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３」を使用し、本発明者らの短鎖（１２アミノ酸）スペーサーキメラ受容体では、ＩｇＧ４「ヒンジ」ドメインを使用した。個別のキメラ受容体構築物を比較するために、本発明者らは、精製された（＞９０％）キメラ受容体陽性ＣＤ８^＋Ｔ_ＣＭに由来するＴ細胞を使用して、ｉｎｖｉｔｒｏ機能およびｉｎｖｉｖｏ機能についての解析におけるバイアスの潜在的発生源としての、細胞組成の差違および形質導入頻度を除去した。ＣＤ８^＋Ｔ_ＣＭは、血液中でより夥多な他のＴ細胞サブセットであって、存続が低度であり、腫瘍の治療において有効でないサブセットと比較して、養子免疫療法のための優れた形質を有することが示されている。ＣＤ１９キメラ受容体Ｔ細胞を、臨床試験のためのキメラ受容体Ｔ細胞を導出するのに使用されるプロトコールと同様の、標準化された培養プロトコールを使用して生成した。本発明者らのデータは、短鎖ＩｇＧ４「ヒンジ」スペーサーを伴うＣＤ１９キメラ受容体が、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏにおいて強力な抗腫瘍反応性を付与したのに対し、ＩｇＧ４「ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３」による、対応する長鎖スペーサーを伴うＣＤ１９キメラ受容体は、ｉｎｖｉｔｒｏにおける同等であるかまたは優れた反応性にもかかわらず、マウスリンパ腫モデルにおいて著明な抗腫瘍効果を付与するのに失敗したことを示す。驚くべきことに、スペーサードメインの長さが、ｉｎｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性のための決定的なエレメントであることがわかり、「長鎖スペーサー」キメラ受容体の有効性の欠如は、Ｔ細胞の用量を増大させることにより克服することができなかった。

本発明者らはまた、ＣＤ２８共刺激ドメインを含有するＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞と４−１ＢＢ共刺激ドメインを含有するＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞との間の、ｉｎｖｉｔｒｏにおけるサイトカイン分泌および増殖の主要な差違も観察したが、ＣＤ２８は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、およびＴＮＦ−αの分泌を、４−１ＢＢと比較して増進させた。また、タンデムのＣＤ２８＿４−１ＢＢを保有するＣＤ１９キメラ受容体も、これらのサイトカインを、４−１ＢＢだけをコードするキメラ受容体と比較して高レベルで産生した。しかし、ＣＤ２８共刺激ドメインおよび短鎖スペーサーを伴うＣＤ１９キメラ受容体、または４−１ＢＢ共刺激ドメインおよび短鎖スペーサーを伴うＣＤ１９キメラ受容体は、ＮＳＧマウスにおいて確立された進行したＲａｊｉ腫瘍を根絶するのに同様に有効であるので、本発明者らのデータは、これらのｉｎｖｉｔｒｏ機能の差違が、ｉｎｖｉｖｏにおける抗腫瘍有効性を予測しなかったことを示す。これに対し、最適未満のスペーサー長およびＣＤ２８、４−１ＢＢ、または両方の共刺激ドメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体は、短鎖スペーサードメインを伴う同一なキメラ受容体構築物と同様のｉｎｖｉｔｒｏ機能を付与するにもかかわらず、ｉｎｖｉｖｏにおける著明な抗腫瘍活性を欠いたことから、スペーサー長の、キメラ受容体Ｔ細胞のｉｎｖｉｖｏ機能への寄与が裏付けられる。

本発明者らの研究は、長鎖スペーサードメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体のｉｎｖｉｖｏにおける有効性の欠如の一因となる機構への洞察をもたらす。長鎖スペーサードメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞および短鎖スペーサードメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞のいずれも、確立されたＲａｊｉリンパ腫を保有するＮＳＧマウスへの養子移入の後において、骨髄中および脾臓内で検出することができ、ＣＤ２５およびＣＤ６９の上方調節により裏付けられる通り、大半は活性化された。しかし、長鎖スペーサードメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるように改変されたＴ細胞は、短鎖スペーサードメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞のｉｎｖｉｖｏにおける顕著な増殖と対照的に、細胞数の急激な減少を呈示した。Ｔ細胞数の減少は、養子移入後の最初の７２時間における、短鎖スペーサードメインを伴うＴ細胞およびＣＤ１９キメラ受容体を発現しない対照Ｔ細胞と比較した、はるかに高レベルの細胞死の帰結であった。まとめると、これらのデータは、ｉｎｖｉｖｏにおける腫瘍細胞の認識が、長鎖スペーサードメインを伴うＣＤ１９キメラ受容体を発現させるＴ細胞の死を結果としてもたらしたことを指し示す。同様の機構により、長鎖スペーサーＣＤ１９キメラ受容体を援用した臨床試験における、Ｔ細胞存続の持続期間の短さおよびレベルの低さを説明することができる（１４）。

本明細書で報告した研究は、内因性シグナル伝達特性を欠くＣＤ１９キメラ受容体のスペーサードメインが、共刺激シグナル伝達とは独立に、ｉｎｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性に対して劇的な効果を及ぼすことを示し、キメラ受容体のデザインにおけるこの領域の最適な組成を解析することが臨床適用のために重要であることを同定する最初の研究である。

前出は、本発明を例示するものであり、その限定としてみなされないものとする。本発明は、その中に含まれる特許請求の範囲の同等物と共に、以下の特許請求の範囲により規定される。本明細書で参照される全ての参考文献および文献は、参照により本明細書に組み込まれる。