KR20120028383A

KR20120028383A - 이중 특이성 항원 결합 단백질

Info

Publication number: KR20120028383A
Application number: KR1020127001029A
Authority: KR
Inventors: 사빈 임호프-융; 크리스티안 클라인; 외르그 토마스 레굴라; 볼프강 샤에퍼; 우에르겐 미카엘 샨쩌
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2009-06-16
Filing date: 2010-06-14
Publication date: 2012-03-22
Also published as: SG176886A1; ZA201108536B; US11673945B2; JP5689463B2; US9676845B2; JP2012530088A; CA2764392A1; TW201102087A; DK2443154T3; CL2011003148A1; US20180079805A1; PL2443154T3; BRPI1008145B1; WO2010145792A8; IL216266A0; KR101431345B1; RU2573914C2; EP2443154A1; WO2010145792A1; CA2764392C

Abstract

본 발명은 이중 특이성 항원 결합 단백질, 이의 제조 방법, 상기 항체를 함유하는 약학 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

이중 특이성 항원 결합 단백질{BISPECIFIC ANTIGEN BINDING PROTEINS}

본 발명은 이중 특이성 항원 결합 단백질, 그의 제조 방법, 상기 항체를 함유하는 약학 조성물, 및 그의 용도에 관한 것이다.

2 개 이상의 항원과 결합할 수 있는 조작된(engineered) 단백질, 예를 들이 이중- 또는 다중 특이성 항체들이 당해 분야에 공지되어 있다. 상기와 같은 다중 특이성 결합 단백질은 세포 융합, 화학적 접합, 또는 재조합 DNA 기법을 사용하여 생성시킬 수 있다.

광범위하게 다양한 재조합 다중 특이성 항체 포맷들, 예를 들어 IgG 항체 포맷 및 단일 쇄 도메인의 융합에 의한 4가 이중 특이성 항체가 근래에 개발되었다(Coloma, M.J., et. al., Nature Biotech. 15 (1997) 159-163; WO　2001/077342; Morrison, S.L., Nature Biotech. 25 (2007) 1233-1234).

또한 항체 코어 구조(IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM)가 더 이상 유지되지 않는 여러 개의 다른 신규 포맷들, 예를 들어 다이아-, 트라이아- 또는 테트라바디, 미니바디, 몇몇 단일 쇄 포맷(scFv, Bis-scFv)(2 개 이상의 항원에 결합할 수 있다)이 개발되었다(Holliger, P., et. al., Nature Biotech 23 (2005) 1126-1136; Fischer, N., and Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14; Shen, J., et. al., J. Immunol. Methods 318 (2007) 65-74; Wu, C., et al., Nature Biotech 25 (2007) 1290-1297).

모든 상기와 같은 포맷들은 항체 코어(IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM)를 추가의 결합 단백질(예를 들어 scFv)에 융합시키거나 또는 예를 들어 2 개의 Fab 단편 또는 scFv를 융합시키기 위해 링커를 사용한다(Fischer, N., and Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14). 링커가 이중 특이성 항체의 조작에 유리한 것은 명백하지만, 상기 링커는 또한 치료 상황에 문제를 야기할 수도 있다. 실제로, 이들 외래 펩타이드는 상기 링커 자체에 대한 면역 반응 또는 상기 단백질과 링커 간의 접착을 유도할 수도 있다. 더욱 또한, 이들 펩타이드의 가요성 성질은 상기 펩타이드를 더 쉽게 단백질 분해 절단되게 하여, 잠재적으로는 불량한 항체 안정성, 응집 및 증가된 면역원성에 이르게 한다. 또한, 천연 항체에 대한 고도의 유사성을 유지시킴으로써 Fc 부분을 통해 매개되는 효과기 작용들, 예를 들어 보체-의존성 세포독성(CDC) 또는 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC)을 유지하기를 원할 수도 있다.

따라서, 이상적으로는, 인간 서열로부터 최소로 벗어나면서 천연 항체(IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM과 같은)와 일반적으로 구조가 매우 유사한 이중 특이성 항체를 개발하는 것이 목적일 것이다.

하나의 접근법에서 천연 항체와 매우 유사한 이중 특이성 항체가, 상기 이중 특이성 항체의 목적하는 특이성을 갖는 쥐 단클론 항체를 발현하는 2 개의 상이한 하이브리도마 세포 주의 체 세포 융합에 근거한 콰드로마(quadroma) 기술(Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540)을 사용하여 생산되었다. 상기 생산된 하이브리드-하이브리도마(또는 콰드로마) 세포 주 내에서 2 개의 상이한 항체 중쇄 및 경쇄의 무작위 짝짓기(pairing)로 인해, 10 개까지 상이한 항체 종들이 생성되며 이 중 오직 하나만이 목적하는 작용성의 이중 특이성 항체이다. 잘못 짝지어진(mispaired) 부산물의 존재, 및 현저하게 감소된 생산 수율로 인해, 복잡한 정제 과정들이 요구된다(Morrison, S.L., Nature Biotech. 25 (2007) 1233-1234). 일반적으로 잘못 짝지어진 부산물과 동일한 문제가, 재조합 발현 기법이 사용되는 경우 여전히 남아 있는다.

잘못 짝지어진 부산물의 문제를 우회하기 위한 접근법('혹을 구멍 안으로(konbs-into-holes)'로서 공지됨)은 CH3 도메인에 돌연변이를 도입시켜 접촉 계면을 변형시킴으로써 2 개의 상이한 항체 중쇄들을 강제로 짝짓는 것을 목적으로 한다. 하나의 쇄 상에서 벌키 아미노산을 짧은 측쇄를 갖는 아미노산에 의해 치환시켜 '구멍'을 생성시켰다. 환원하면, 큰 측쇄를 갖는 아미노산을 다른 CH3 도메인 내로 도입시켜 '혹'을 생성시켰다. 이들 2 개의 중쇄(및 2 개의 동일한 경쇄, 이들은 2 개의 중쇄 모두에 적합해야 한다)의 과발현에 의해, 높은 수율의 이종 이량체 형성('혹-구멍') 대 동종 이량체 형성('구멍-구멍' 또는 '혹-혹')이 관찰되었다(Ridgway, J.B., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; WO　96/027011). 상기 이종 이량체의 백분율을, 파지 디스플레이 접근법 및 상기 이종 이량체를 안정화시키기 위한 다이설파이드 가교의 도입을 사용하여 상기 2 개의 CH3 도메인의 상호작용 표면을 리모델링함으로써 더욱 증가시킬 수 있다(Merchant A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35). 상기 혹을 구멍 안으로 기술에 대한 신규의 접근법이 예를 들어 EP 1870459A1에 개시되어 있다. 상기 포맷은 매우 매력적으로 보이지만, 현재 임상적으로 진보된 데이터를 입수할 수 없다. 상기 전략의 한 가지 중요한 제약은 상기 두 모 항체의 경쇄들이, 잘못 짝짓기 및 불활성 분자의 형성을 방지하기 위해서 동일해야 한다는 것이다. 따라서 상기 기법은, 2 개 항체의 중쇄 및/또는 동일한 경쇄 중 어느 쪽이든 최적화되어야 하므로, 제 1 및 제 2 항원에 대한 2 개의 항체로부터 출발하여 상기 두 항원에 대한 이중 특이성 재조합 항체를 쉽게 개발하기에 적합하지 않다.

이중 특이성 항체의 제조에서 잘못 짝지워진 부산물 문제를 우회하기 위한 또 다른 접근법은 예를 들어 WO 2001/077342에 개시된 바와 같이, 제 1 항원에 특이적으로 결합하고, 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 2 개의 융합된 Fab 단편이 중쇄의 N-말단에 융합된 전장 항체를 사용함으로써 이종 이량체를 동종 이량체로 전환시키는 것이다. 상기 전략의 한 가지 중요한 단점은 상기 전장 항체의 경쇄와 상기 Fab 단편의 CH1-VH 도메인과의 잘못 짝짓기 및 상기 Fab 단편 경쇄와 상기 전장 항체의 CH1-VH 도메인과의 잘못 짝짓기에 의한 바람직하지 못한 불활성 부산물의 형성이다.

WO 2006/093794는 이종 이량체성 단백질 결합 조성물에 관한 것이다. WO 99/37791은 다목적 항체 유도체를 개시한다. 문헌[Morrison, S., L., et al the J. Immunolog, 160(1998) 2802-2808]은 IgG의 작용성 성질에 대한 가변 영역 도메인 교환의 영향에 관한 것이다.

본 발명은

a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하고 2 개의 Fab 단편을 포함하는 항체의 2 개의 경쇄 및 2 개의 중쇄;

b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 2 개의 추가적인 Fab 단편으로서, 상기 추가적인 Fab 단편이 둘 다 상기 a)의 중쇄 또는 경쇄의 C- 또는 N-말단에서 펩타이드 연결자(connector)를 통해 융합된 단편

을 포함하고, 상기 Fab 단편에서 하기의 변형이 수행된 이중 특이성 항원 결합 단백질을 포함한다:

i) 상기 a)의 2 개의 Fab 단편 모두 또는 상기 b)의 2 개의 Fab 단편 모두에서

가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 치환되고/되거나

불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환되거나,

ii) 상기 a)의 2 개의 Fab 단편 모두에서

가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 치환되고,

불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환되고,

상기 b)의 2 개의 Fab 단편 모두에서

가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 치환되거나, 또는

불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환되거나,

iii) 상기 a)의 2 개의 Fab 단편 모두에서

가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 치환되거나,

불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환되고,

상기 b)의 2 개의 Fab 단편 모두에서

가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 치환되고,

불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환되거나,

iv) 상기 a)의 2 개의 Fab 단편 모두에서

가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 치환되고,

상기 b)의 2 개의 Fab 단편 모두에서

불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환되거나, 또는

v) 상기 a)의 2 개의 Fab 단편 모두에서

불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환되고,

상기 b)의 2 개의 Fab 단편 모두에서

가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 치환된다.

본 발명의 추가의 실시태양은

a) 숙주 세포를

본 발명에 따른 이중 특이성 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환시키는 단계;

b) 상기 숙주 세포를 상기 항체 분자의 합성을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계; 및

c) 상기 배양물로부터 상기 항체 분자를 회수하는 단계

를 포함하는, 본 발명에 따른 항원 결합 단백질의 제조 방법이다.

본 발명의 추가의 실시태양은 본 발명에 따른 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.

본 발명의 추가의 실시태양은 본 발명에 따른 항원 결합 단백질 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물이다.

본 발명의 추가의 실시태양은 치료가 필요한 환자에게 치료 효과량의 본 발명에 따른 항원 결합 단백질을 투여함을 특징으로 하는, 상기 환자의 치료 방법이다.

본 발명에 따라, 바람직하지 못한 부산물에 대한 목적하는 이중 특이성 항원 결합 단백질의 비를, a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 Fab 단편에서 및/또는 b) 2 개의 추가적인 융합된 Fab 단편에서 일부 도메인들의 치환에 의해 개선시킬 수 있다. 이렇게 하여 상기 경쇄와 틀린 CH1-VH 도메인과의 바람직하지 못한 잘못된 짝짓기를 감소시킬 수 있다.

도 1은 가변 및 불변 도메인들을 전형적인 순서로 포함하는 두 쌍의 중쇄 및 경쇄를 갖는, 제 1 항원(1)에 특이적으로 결합하는 CH4 도메인이 없는 전장 항체의 도식적인 구조이다.
도 2a 및 2b는 CH1-VH 쇄의 C-말단(도 2a) 또는 N-말단(도 2b)에 펩타이드 연결자를 갖는, 제 2 항원(2)에 특이적으로 결합하는 전형적인 변형되지 않은 Fab 단편의 도식적인 구조이다.
도 3은 제 2 항원(2)(도 3a) 및 잘못 짝짓기로 인한 바람직하지 못한 부산물(도 3b, 및 도 3c)에 특이적으로 결합하는 2 개의 변형되지 않은 Fab 단편이 중쇄의 N-말단에 융합된, 제 1 항원(1)에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 도식적인 구조이다.
도 4a, 4b 및 4c는 a) 제 1 항원(1)에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 Fab 단편에서 및/또는 b) 제 2 항원(2)에 특이적으로 결합하는 2 개의 추가적인 융합된 Fab 단편 항체에서 몇몇 도메인들의 치환에 의해 잘못 짝짓기가 감소된 본 발명에 따른 이중 특이성 항원 결합 단백질의 도식적인 구조이다. 도 4a는 이중 특이성 항원 결합 단백질을 도시한다. 도 4b 및 4c는 감소된 잘못 짝짓기를 갖는 본 발명에 따른 이중 특이성 항원 결합 단백질에 이르는 전장 Fab 단편 및 추가적인 Fab 단편 내의 VH/VL 및/또는 CH1/CL 도메인 교환의 모든 조합을 도시한다.
도 5는 Ang-2 및 VEGF를 인식하는 본 발명에 따른 이중 특이성 항원 결합 단백질의 도식적인 구조이다(실시예 1).
도 6은 Ang-2 및 VEGF를 인식하는 본 발명에 따른 이중 특이성 항원 결합 단백질의 도식적인 구조이다(실시예 2).
도 7은 Ang-2 및 VEGF를 인식하는 본 발명에 따른 이중 특이성 항원 결합 단백질의 도식적인 구조이다(실시예 3).

본 발명은

b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 2 개의 추가적인 Fab 단편으로서, 상기 추가적인 Fab 단편이 둘 다 상기 a)의 중쇄의 C- 또는 N-말단에서 펩타이드 연결자를 통해 융합된 단편

가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 치환되고/되거나

불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환되거나,

ii) 상기 a)의 2 개의 Fab 단편 모두에서

가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 치환되고,

불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환되고,

상기 b)의 2 개의 Fab 단편 모두에서

가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 치환되거나, 또는

불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환되거나,

iii) 상기 a)의 2 개의 Fab 단편 모두에서

가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 치환되거나,

불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환되고,

상기 b)의 2 개의 Fab 단편 모두에서

가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 치환되고,

불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환되거나,

iv) 상기 a)의 2 개의 Fab 단편 모두에서

가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 치환되고,

상기 b)의 2 개의 Fab 단편 모두에서

불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환되거나, 또는

v) 상기 a)의 2 개의 Fab 단편 모두에서

불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환되고,

상기 b)의 2 개의 Fab 단편 모두에서

가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 치환된다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 이중 특이성 항원 결합 단백질은, 상기 추가적인 Fab 단편들이 둘 다 펩타이드 연결자를 통해 a)의 중쇄의 C-말단 또는 a)의 중쇄의 N-말단에 융합됨을 특징으로 한다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 이중 특이성 항원 결합 단백질은, 상기 추가적인 Fab 단편들이 둘 다 펩타이드 연결자를 통해 a)의 중쇄의 C-말단에 융합됨을 특징으로 한다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 이중 특이성 항원 결합 단백질은 상기 추가적인 Fab 단편들이 둘 다 펩타이드 연결자를 통해 a)의 중쇄의 N-말단에 융합됨을 특징으로 한다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 이중 특이성 항원 결합 단백질은, 상기 Fab 단편에서 하기의 변형이 수행됨을 특징으로 한다:

가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 치환되고/되거나

불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환된다.

i) 상기 a)의 2 개의 Fab 단편 모두에서

가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 치환되고/되거나

불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환된다.

i) 상기 a)의 2 개의 Fab 단편 모두에서

불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환된다.

i) 상기 b)의 2 개의 Fab 단편 모두에서

가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 치환되고/되거나

불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환된다.

i) 상기 b)의 2 개의 Fab 단편 모두에서

불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환된다.

본 발명에 따라, 바람직하지 못한 부산물(경쇄와 틀린 CH1-VH 도메인과의 잘못 짝짓기로 인한)에 대한 목적하는 이중 특이성 항원 결합 단백질의 비를 a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 Fab 단편에서 및/또는 b) 상기 2 개의 추가적인 융합된 Fab 단편에서 몇몇 도메인들의 치환에 의해 감소시킬 수 있다. 이와 관련하여 잘못 짝짓기는 i) a) 하의 전장 항체의 경쇄와 b) 하의 Fab 단편의 CH1-VH 도메인과의 회합; 또는 ii) b) 하의 Fab 단편의 경쇄와 a) 하의 전장 항체의 CH1-VH 도메인과의 회합(바람직하지 못한 불활성 또는 충분히 작용적이지 않은 부산물이 된다)을 의미한다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "항체"는 2 개의 항체 중쇄 및 2 개의 항체 경쇄로 이루어진 전장 항체를 나타낸다(도 1 참조). 전장 항체의 중쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 불변 중쇄 도메인 1(CH1), 항체 힌지 영역(HR), 항체 중쇄 불변 도메인 2(CH2), 및 항체 중쇄 불변 도메인 3(CH3)(VH-CH1-HR-CH2-CH3으로서 약기함); 및 하위 부류 IgE 항체의 경우 임의로 항체 중쇄 불변 도메인 4(CH4)로 이루어진 폴리펩타이드이다. 바람직하게는 상기 전장 항체의 중쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 VH, CH1, HR, CH2 및 CH3으로 이루어진 폴리펩타이드이다. 전장 항체의 경쇄는 N-말단에서 C-말단 방향으로 항체 경쇄 가변 도메인(VL), 및 항체 경쇄 불변 도메인(CL)(VL-CL로서 약기함)으로 이루어진 폴리펩타이드이다. 상기 항체 경쇄 불변 도메인(CL)은 κ(카파) 또는 λ(람다)일 수 있다. 상기 항체 쇄들은 CL 도메인과 CH1 도메인 사이(즉 경쇄와 중쇄 사이) 및 상기 전장 항체 중쇄들의 힌지 영역들 사이에서 폴리펩타이드 간 다이설파이드 결합을 통해 함께 연결된다. 전형적인 전장 항체의 예는 IgG(예를 들어 IgG1 및 IgG2), IgM, IgA, IgD 및 IgE와 같은 천연 항체이다. 본 발명에 따른 항체는 단일 종, 예를 들어 인간으로부터 나오거나, 또는 키메라화된 또는 인간화된 항체일 수 있다. 본 발명에 따른 전장 항체는, 각각이 한 쌍의 VH 및 VL(이들은 모두 동일한(제 1) 항원에 특이적으로 결합한다)에 의해 형성된 2 개의 항원 결합 부위를 포함한다. 상기 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단은 상기 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 있는 최종 아미노산을 나타낸다. 상기 항체는 중쇄의 VH 및 CH1 도메인 및 경쇄의 VL 및 CL 도메인으로 이루어진 2 개의 동일한 Fab 단편을 포함한다(도 1 및 2 참조).

제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 "추가적인 Fab 단편"(도 2 참조)은 상기 제 2 항체의 중쇄의 VH 및 CH1 도메인 및 경쇄의 VL 및 CL 도메인으로 이루어진 추가의 Fab 단편을 지칭한다. 상기 추가적인 Fab 단편은 중쇄 부분(CH1 또는 VH 도메인)을 통해, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C- 또는 N-말단에 변형되지 않은 형태(도 3 참조)로 융합된다.

본 발명 내에서 사용되는 바와 같은 "펩타이드 연결자"란 용어는, 바람직하게는 합성 기원의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 나타낸다. 본 발명에 따른 상기 펩타이드 연결자를 사용하여 상기 항원 결합 펩타이드를 상기 전장 및/또는 변형된 전장 항체 쇄의 C- 또는 N-말단에 융합시켜 본 발명에 따른 이중 특이성 항원 결합 단백질을 형성시킨다. 바람직하게는 상기 c) 하의 펩타이드 연결자는 5 아미노산 이상의 길이, 바람직하게는 5 내지 100, 보다 바람직하게는 10 내지 50 아미노산 길이의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드이다. 하나의 실시태양에서 상기 펩타이드 연결자는 (GxS)n 또는 (GxS)nGm 이고, 이때 G = 글리신, S = 세린, 및 (x = 3, n= 3, 4, 5 또는 6, 및 m = 0, 1, 2 or 3) 또는 (x = 4, n = 2, 3, 4 또는 5 및 m = 0, 1, 2 or 3), 바람직하게는 x = 4 및 n = 2 또는 3, 보다 바람직하게는 x = 4, n = 2이다. 하나의 실시태양에서 상기 펩타이드 연결자는 (G₄S)₂이다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "결합 부위" 또는 "항원-결합 부위"란 용어는 리간드(예를 들어 항원 또는 항원 단편)가 실제로 결합하고 항체 분자 또는 그의 단편(예를 들어 Fab 단편)으로부터 유도되는 본 발명에 따른 항원 결합 단백질의 영역(들)을 나타낸다. 본 발명에 따른 항원 결합 부위는 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다.

목적하는 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위(즉 VH/VL의 쌍)는 a) 상기 항원에 대해 공지된 항체로부터 또는 b) 특히 항원 단백질 또는 핵산 또는 그의 단편을 사용하는 드 노보 면역화 방법에 의해 또는 파지 디스플레이에 의해 수득된 신규의 항체 또는 항체 단편으로부터 유래할 수 있다.

본 발명의 항원 결합 단백질의 항원-결합 부위는, 항원에 대한 결합 부위의 친화성에 대해 다양한 정도로 기여하는 6 개의 상보성 결정 영역(CDR)을 함유한다. 3 개의 중쇄 가변 도메인 CDR(CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 및 3 개의 경쇄 가변 도메인 CDR(CDRL1, CDRL2 및 CDRL3)이 존재한다. CDR 및 프레임워크 영역(FR)의 범위는, 상기 영역들이 서열들 간의 변화성에 따라 한정된 아미노산 서열의 편집된 데이터베이스에 대한 비교에 의해 결정된다.

항체 특이성은 항원의 특정 에피토프에 대한 항체 또는 항원 결합 단백질의 선택적인 인식을 지칭한다. 예를 들어 천연 항체는 단일 특이성이다. 이중 특이성 항체는 2 개의 상이한 항원-결합 특이성을 갖는 항체이다. 항체가 하나보다 많은 특이성을 갖는 경우, 상기 인식된 에피토프는 단일 항원 또는 하나보다 많은 항원과 회합될 수 있다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "단일 특이성" 항체 또는 항원 결합 단백질이란 용어는 하나 이상의 결합 부위(이들은 각각 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합한다)를 갖는 항체 또는 항원 결합 단백질을 나타낸다.

본 출원 내에 사용된 "가(valent)"란 용어는 항체 분자 중의 특정한 수의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 예를 들어 천연 항체 또는 본 발명에 따른 전장 항체는 2 개의 결합 부위를 가지며 2가이다. "4가"란 용어는 항원 결합 단백질 중에 4 개의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "4 가, 이중 특이성"이란 용어는 4 개의 항원 결합 부위를 가지며 이중 2 개가 또 다른 항원(또는 상기 항원의 또 다른 에피토프)에 결합하는 본 발명에 따른 항원 결합 단백질을 나타낸다. 본 발명의 항원 결합 단백질은 4 개의 결합 부위를 가지며 4가이다.

본 발명의 전장 항체는 하나 이상의 면역글로불린 부류의 면역글로불린 불변 영역들을 포함한다. 면역글로불린 부류는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 아이소타입, 및 IgG 및 IgA의 경우, 이들의 하위유형들을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 전장 항체는 IgG 유형 항체의 불변 도메인 구조를 갖는다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "단클론 항체" 또는 "단클론 항체 조성물"이란 용어는 항체 또는 단일 아미노산 조성의 항체 또는 항원 결합 단백질의 제제를 지칭한다.

"키메릭 항체"란 용어는, 대개 재조합 DNA 기법에 의해 제조된, 하나의 출처 또는 종들로부터의 가변 영역, 즉 결합 영역 및 상이한 출처 또는 종들로부터 유도된 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 항체를 지칭한다. 쥐 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메릭 항체가 바람직하다. 본 발명에 의해 포함되는 "키메릭 항체"의 다른 바람직한 형태는 상기 불변 영역이 원래 항체의 것으로부터 변형되거나 변화되어, 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합에 관하여 본 발명에 따른 성질을 생성시키는 것들이다. 상기와 같은 키메릭 항체를 또한 "부류-전환된 항체"로서 지칭한다. 키메릭 항체는 면역글로불린 가변 영역을 암호화하는 DNA 분절 및 면역글로불린 불변 영역을 암호화하는 DNA 분절을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 산물이다. 키메릭 항체의 제조 방법은 통상적인 재조합 DNA 및 유전자 형질감염 기법들을 포함하며 이들은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Morrison, S., L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855]; US　5,202,238 및 US　5,204,244를 참조하시오.

"인간화된 항체"란 용어는 프레임워크 또는 "상보성 결정 영역"(CDR)이 모 면역글로불린의 경우에 비해 상이한 특이성의 면역글로불린의 CDR을 포함하도록 변형된 항체를 지칭한다. 바람직한 실시태양에서, 쥐 CDR을 인간 항체의 프레임워크 영역에 그래프트화시켜 "인간화된 항체"를 제조한다. 예를 들어 문헌[Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327]; 및 [Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270]을 참조하시오. 특히 바람직한 CDR은 키메릭 항체에 대해 상기 나타낸 항원을 인식하는 서열을 나타내는 것들에 상응한다. 본 발명에 의해 포함되는 "인간화된 항체"의 다른 형태는 상기 불변 영역이 원래 항체의 상기 영역으로부터 추가로 변형되거나 변화되어, 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합에 관하여 본 발명에 따른 성질을 생성시키는 것들이다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "인간 항체"란 용어는 인간 생식 계열 면역글로불린 서열로부터 유래한 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함함을 의미한다. 인간 항체는 현재의 발달 수준으로 널리 공지되어 있다(van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). 인간 항체를 또한, 면역화 시, 내생적인 면역글로불린 생산의 부재 하에서 전체 레퍼토리 또는 인간 항체의 선택을 생성시킬 수 있는 트랜스제닉 동물(예를 들어 마우스)에서 생성시킬 수 있다. 상기와 같은 생식 계열 돌연변이 마우스에서의 인간 생식 계열 면역글로불린 유전자 배열의 운반은 항원 투여 시 인간 항체를 생성시킬 것이다(Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Brueggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40)). 인간 항체를 또한 파지 디스플레이 라이브러리 중에 생성시킬 수 있다(Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). 콜(Cole) 등 및 베르너(Boerner) 등의 기법을 또한 인간 단클론 항체의 제조에 이용할 수 있다(Cole, S., P., C., et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss (1985) 77-96; Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). 본 발명에 따른 키메릭 및 인간화된 항체에 대해 이미 언급한 바와 같이, 본 발명에 사용된 "인간 항체"란 용어는 또한, 예를 들어 "부류 전환", 즉 Fc 부분의 변화 또는 돌연변이(예를 들어 IgG1에서 IgG4로 및/또는 IgG1/IgG4 돌연변이)에 의해 불변 영역에서 변형되어, 특히 C1q 결합 및/또는 FcR 결합에 관하여 본 발명에 따른 성질을 생성시키는 상기와 같은 항체를 포함한다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "재조합 인간 항체"란 용어는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 모든 인간 항체, 예를 들어 NS0 또는 CHO 세포와 같은 숙주 세포로부터 또는 인간 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉한 동물(예를 들어 마우스)로부터 단리된 항체 또는 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체를 포함함을 의미한다. 상기와 같은 재조합 인간 항체는 가변 및 불변 영역들을 재배열된 형태로 갖는다. 본 발명에 따른 재조합 인간 항체를 생체 내에서 체 세포 초 돌연변이시켰다. 따라서 상기 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식 계열 VH 및 VL 서열로부터 유래하고 이와 관련되었지만, 생체 내에서 인간 항체 생식 계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수도 있는 서열이다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "가변 도메인"(경쇄의 가변 도메인(VL), 중쇄의 가변 영역(VH))은 항체의 항원에 대한 결합에 직접 관련된 각각의 경쇄 및 중쇄 쌍을 나타낸다. 가변 인간 경쇄 및 중쇄의 도메인들은 동일한 일반적인 구조를 가지며 각각의 도메인은, 광범위하게 보존되고 3 개의 "초 가변 영역"(또는 상보성 결정 영역, CDR)에 의해 연결된 서열들을 갖는 4 개의 프레임워크(FR) 영역을 포함한다. 상기 프레임워크 영역은 β-시트 형태를 채용하며 상기 CDR은 상기 β-시트 구조를 연결하는 고리를 형성할 수도 있다. 각 쇄 중의 CDR은 상기 프레임워크 영역에 의해 그의 3 차원 구조로 유지되며 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 상기 항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역은 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화성에 특히 중요한 역할을 하며 따라서 본 발명의 추가의 목적을 제공한다.

"초 가변 영역" 또는 "항체의 항원 결합 부분"이란 용어는 본 발명에서 사용 시 항원 결합을 맡고 있는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 상기 초 가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 영역은 본 발명에서 정의된 바와 같은 초 가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 영역들이다. 따라서, 항체의 경쇄 및 중쇄는 N-말단에서부터 C-말단으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4를 포함한다. 각 쇄 상의 CDR들은 상기와 같은 프레임워크 아미노산에 의해 분리된다. 특히, 중쇄의 CDR3은 항원 결합에 가장 기여하는 영역이다. CDR 및 FR 영역은 문헌[Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]의 표준 정의에 따라 결정된다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "결합하는" 또는 "특이적으로 결합하는"이란 용어는 정제된 야생형 항원을 사용하는 시험관 분석에서, 바람직하게는 플라스몬 공명 분석(BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Sweden)에서 항원의 에피토프에 대한 항체의 결합을 지칭한다. 상기 결합의 친화성은 ka(항체/항원 복합체로부터 항체(또는 항체 또는 항원 결합 단백질)의 회합에 대한 속도 상수), k_D(해리 상수), 및 K_D(k_D/ka)의 용어들에 의해 정의된다. 결합하는 또는 특이적으로 결합하는은 10^-8 mol/l 이하, 바람직하게는 10^-9 M 내지 10^-13 mol/l의 결합 친화성(K_D)을 의미한다. 따라서, 본 발명에 따른 이중 특이성 항원 결합 단백질은 10^-8 mol/l 이하, 바람직하게는 10^-9 M 내지 10^-13 mol/l의 결합 친화성(K_D)의 특이성으로, 각 항원에 특이적으로 결합한다.

FcγRIII에 대한 항체의 결합을 바이아코어(BIAcore) 분석(GE-Healthcare Uppsala, Sweden)에 의해 조사할 수 있다. 상기 결합의 친화성은 ka(항체/항원 복합체로부터 항체의 회합에 대한 속도 상수), k_D(해리 상수), 및 K_D(k_D/ka)의 용어들에 의해 정의된다.

"에피토프"란 용어는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩타이드 결정인자를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 에피토프 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐과 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹들을 포함하며, 몇몇 실시태양에서, 특정한 3차원 구조 특성 및/또는 특정한 전하 특성을 가질 수도 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 영역이다.

몇몇 실시태양에서, 항체는 단백질 및/또는 거대 분자의 복잡한 혼합물 중에서 그의 표적 항원을 우선적으로 인식할 때 항원과 특이적으로 결합한다라고 한다.

추가의 실시태양에서 본 발명에 따른 이중 특이성 항원 결합 단백질은 상기 전장 항체가 인간 IgG1 하위 부류, 또는 돌연변이 L234A 및 L235A를 갖는 인간 IgG1 하위 부류의 것임을 특징으로 한다.

추가의 실시태양에서 본 발명에 따른 이중 특이성 항원 결합 단백질은 상기 전장 항체가 인간 IgG2 하위 부류의 것임을 특징으로 한다.

추가의 실시태양에서 본 발명에 따른 이중 특이성 항원 결합 단백질은 상기 전장 항체가 인간 IgG3 하위 부류의 것임을 특징으로 한다.

추가의 실시태양에서 본 발명에 따른 이중 특이성 항원 결합 단백질은 상기 전장 항체가 인간 IgG4 하위 부류, 또는 추가의 돌연변이 S228P를 갖는 인간 IgG4 하위 부류의 것임을 특징으로 한다.

바람직하게는 본 발명에 따른 이중 특이성 항원 결합 단백질은 상기 전장 항체가 인간 IgG1 하위 부류, 추가의 돌연변이 S228P를 갖는 인간 IgG4 하위 부류의 것임을 특징으로 한다.

본 발명에 이르러, 본 발명에 따른 이중 특이성 항원 결합 단백질이 개선된 특성, 예를 들어 생물학적 또는 약물학적 활성, 약동학적 성질 또는 독성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이들을 예를 들어 암과 같은 질병의 치료에 사용할 수 있다.

본 출원 내에서 사용된 "불변 영역"이란 용어는 상기 가변 영역 이외의 항체의 도메인들의 합을 나타낸다. 상기 불변 영역은 항원의 결합에 직접 관여하지는 않지만, 다양한 효과기 작용들을 나타낸다. 항체는 그의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 부류로 나뉘며, 이들 중 몇몇을 하위 부류, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가 분류할 수도 있다. 상기 항체의 상이한 부류들에 상응하는 중쇄 불변 영역을 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 칭한다. 상기 5 개 항체 부류 모두에서 발견될 수 있는 경쇄 불변 영역(CL)을 κ(카파) 및 λ(람다)라 칭한다.

본 출원에 사용된 바와 같은 "인간 기원으로부터 유래된 불변 영역"이란 용어는 하위 부류 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 인간 항체의 불변 중쇄 영역 및/또는 불변 경쇄 카파 또는 람다 영역을 나타낸다. 상기와 같은 불변 영역은 현재 발달 수준으로 널리 공지되어 있으며 예를 들어 문헌[Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218]; [Kabat, E.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788]에 개시되어 있다.

IgG4 하위 부류의 항체는 감소된 Fc 수용체(FcγRIIIa) 결합을 나타내지만, 다른 IgG 하위 부류의 항체들은 강한 결합을 나타낸다. 그러나, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (Fc 탄수화물의 상실), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 및 His435 는, 변경되는 경우, 또한 감소된 Fc 수용체 결합을 제공하는 잔기들이다(Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; EP　0　307　434).

하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 항원 결합 단백질은 IgG1 항체에 비해 감소된 FcR 결합을 가지며 전장 모 항체는 IgG4 하위 부류 또는 S228, L234, L235 및/또는 D265의 돌연변이를 갖는 IgG1 또는 IgG2 하위 부류의 FcR 결합에 대해서 그렇고/그렇거나 PVA236 돌연변이를 함유한다. 하나의 실시태양에서, 상기 전장 모 항체의 돌연변이는 S228P, L234A, L235A, L235E 및/또는 PVA236이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 전장 모 항체의 돌연변이는 IgG4 S228P 및 IgG1 L234 및 L235A에 있다.

항체의 불변 영역은 ADCC(항체-의존성 세포 매개된 세포독성) 및 CDC(보체 의존성 세포독성)에 직접 관련된다. 보체 활성화(CDC)는 대부분의 IgG 항체 하위 부류의 불변 영역에 대한 보체 인자 C1q의 결합에 의해 개시된다. 항체에 대한 C1q의 결합은 소위 결합 부위에서의 한정된 단백질-단백질 상호작용에 의해 유발된다. 상기와 같은 불변 영역 결합 부위들은 현재의 발달 수준으로 공지되어 있으며 예를 들어 하기의 문헌들에 개시되어 있다: Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R. and Cebra, J., J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J., E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E., E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; 및 EP　0　307　434. 상기와 같은 불변 영역 결합 부위들은 예를 들어 아미노산 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331, 및 P329(Kabat의 EU 색인에 따른 넘버링)를 특징으로 한다.

"항체 의존성 세포 세포독성(ADCC)"이란 용어는 효과기 세포의 존재 하에서 본 발명에 따른 항원 결합 단백질에 의한 인간 표적 세포의 용해를 지칭한다. ADCC는 바람직하게는 효과기 세포, 예를 들어 새로 단리된 PBMC 또는 버피 코트(buffy coat)로부터 정제된 효과기 세포, 예를 들어 단핵구 또는 천연 살해(NK) 세포 또는 영구적으로 증식하는 NK 세포 주의 존재 하에서 본 발명에 따른 항원 결합 단백질에 의한 항원 발현 세포 제제의 처리에 의해 측정된다.

"보체 의존성 세포독성(CDC)"이란 용어는 대부분의 IgG 항체 하위 부류의 Fc 부분에 대한 보체 인자 C1q의 결합에 의해 개시되는 과정을 나타낸다. 항체에 대한 C1q의 결합은 소위 결합 부위에서의 한정된 단백질-단백질 상호작용에 의해 유발된다. 상기와 같은 Fc 부분 결합 부위들은 현재의 발달 수준으로 공지되어 있다(상기 참조). 상기와 같은 Fc 부분 결합 부위들은 예를 들어 아미노산 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331, 및 P329(Kabat의 EU 색인에 따른 넘버링)를 특징으로 한다. 하위 부류 IgG1, IgG2 및 IgG3의 항체들은 대개 C1q 및 C3 결합을 포함하는 보체 활성화를 나타내는 반면, IgG4는 보체 시스템을 활성화하지 않으며 C1q 및/또는 C3과 결합하지 않는다.

단클론 항체의 세포-매개된 효과기 작용을 문헌[Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180], 및 US　6,602,684에 개시된 바와 같이 그의 올리고사카라이드 성분을 조작함으로써 향상시킬 수 있다. 가장 통상적으로 사용되는 치료 항체인 IgG1 유형 항체는 각각의 CH2 도메인 중의 Asn297에 보존된 N-결합된 글리코실화 부위를 갖는 당단백질이다. Asn297에 결합된 2 개의 복잡한 이중 촉각(biantennary) 올리고사카라이드가 CH2 도메인들 사이에 묻혀있어, 상기 폴리펩타이드 주 쇄와 광범위한 접촉을 형성하며, 이의 존재는 항체가 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC)과 같은 효과기 작용을 매개하는데 필수적이다(Lifely, M., R., et al., Glycobiology 5(1995) 813-822; Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A., and Morrison, S., L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32). 문헌[Umana, P., et al. Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180] 및 WO　99/54342는 이등분된 올리고사카라이드의 형성을 촉매화하는 글리코실트랜스퍼라제인 β(1,4)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III("GnTIII")의 중국 햄스터 난소(CHO) 세포의 과발현이 항체의 시험관 내 ADCC 활성을 현저하게 증가시킴을 보였다. 상기 Asn297 탄수화물의 조성 변경 또는 그의 제거가 또한 FcγR 및 C1q에 대한 결합에 영향을 미친다(Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999)

176-180; Davies, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294; Mimura, Y., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 45539-45547; Radaev, S., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478-16483; Shields, R., L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Shields, R., L., et al., J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740; Simmons, L., C., et al., J. Immunol. Methods 263 (2002) 133-147).

단클론 항체의 세포 매개된 효과기 작용을 향상시키는 방법들이 예를 들어 WO　2005/018572, WO　2006/116260, WO　2006/114700, WO　2004/065540, WO　2005/011735, WO　2005/027966, WO　1997/028267, US　2006/0134709, US　2005/0054048, US　2005/0152894, WO　2003/035835, WO　2000/061739에 보고되어 있다.

본 발명의 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 이중 특이성 항원 결합 단백질은 Asn297에서 당 쇄에 의해 글리코실화되며(상기 단백질이 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위 부류, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG3 하위 부류의 Fc 부분을 포함하는 경우), 이때 상기 당 쇄 내의 퓨코스의 양은 65% 이하이다(Kabat에 따른 넘버링). 또 다른 실시태양에서, 상기 당 쇄 내 퓨코스의 양은 5% 내지 65%, 바람직하게는 20% 내지 40%이다. 본 발명에 따른 "Asn297"은 Fc 영역 중의 대략 297 번 위치에 위치한 아미노산 아스파라진을 의미한다. 항체들의 작은 서열 변화를 근거로, Asn297은 또한 297 번 위치의 상부 또는 하부, 즉 294 번 내지 300 번 위치의 일부 아미노산(대개는 ±3 이하의 아미노산)에 위치할 수 있다. 본 발명에 따른 글리코실화된 항원 결합 단백질의 하나의 실시태양에서 IgG 하위 부류는 인간 IgG1 하위 부류, L234A 및 L235A 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 하위 부류 또는 IgG3 하위 부류의 것이다. 추가의 실시태양에서 N-글리콜릴뉴라민산(NGNA)의 양은 1% 이하이고/이거나 N-말단 알파-1,3-갈락토스의 양은 상기 당 쇄 내에서 1% 이하이다. 상기 당 쇄는 바람직하게는 CHO 세포에서 재조합 발현된 항체의 Asn297에 결합된 N-결합된 글리칸의 특징을 나타낸다.

"상기 당 쇄는 CHO 세포에서 재조합 발현된 항체의 Asn297에 결합된 N-결합된 글리칸의 특징을 나타낸다"란 어구는 상기 퓨코스 잔기를 제외하고 본 발명에 따른 전장 모 항체의 Asn297에서의 당 쇄가, 변형되지 않은 CHO 세포에서 발현된 동일한 항체의 경우, 예를 들어 WO 2006/103100에 보고된 경우와 동일한 구조 및 당 잔기 서열을 가짐을 나타낸다.

본 출원 내에서 사용된 바와 같은 "NGNA"란 용어는 당 잔기 N-글리콜릴뉴라민산을 나타낸다.

인간 IgG1 또는 IgG3의 글리코실화는 2 개 이하의 Gal 잔기로 종결된 코어 퓨코실화된 이중 촉각 복합체 올리고사카라이드 글리코실화로서 Asn297에서 발생한다. 상기 IgG1 또는 IgG3 하위 부류의 인간 불변 중쇄 영역들은 문헌[Kabat, E., A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)], 및 [Brueggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361]; [Love, T., W., et al., Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527]에 상세히 보고되어 있다. 이들 구조를 말단 Gal 잔기의 양에 따라, G0, G1(α-1,6- 또는 α-1,3-), 또는 G2 글리칸 잔기로서 표시한다(Raju, T., S., Bioprocess Int. 1 (2003) 44-53). 항체 Fc 부분의 CHO 유형 글리코실화는 예를 들어 문헌[Routier, F., H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207]에 개시되어 있다. 비-글리코변형된 CHO 숙주 세포에서 재조합 발현되는 항체들은 대개 Asn297에서 85% 이상의 양으로 퓨코실화된다. 상기 전장 모 항체의 변형된 올리고사카라이드는 하이브리드 또는 복합체일 수 있다. 바람직하게는 상기 이등분된, 환원된/퓨코실화되지 않은 올리고사카라이드는 하이브리드이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 이등분된, 환원된/퓨코실화되지 않은 올리고사카라이드는 복합체이다.

본 발명에 따른 "퓨코스의 양"은 MALDI-TOF 질량 분광측정법에 의해 측정되고 평균값으로서 계산된, Asn297에 결합된 모든 당구조(예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고 만노스 구조)의 합에 관한, Asn297에서의 당 쇄 내의 상기 당의 양을 의미한다. 퓨코스의 상대적인 양은 MALDI-TOF에 의해 N-글리코시다제 F 처리된 샘플 중에서 확인된 모든 당구조(예를 들어 각각 복합체, 하이브리드 및 올리고- 및 고-만노스 구조)에 관한 퓨코스-함유 구조의 백분율이다.

본 발명에 따른 항원 결합 단백질은 재조합 수단에 의해 생산된다. 따라서, 본 발명의 하나의 태양은 본 발명에 따른 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산이며 추가의 태양은 본 발명에 따른 항원 결합 단백질을 암호화하는 상기 핵산을 포함하는 세포이다. 재조합 생산 방법은 현재의 발달 수준으로 널리 공지되어 있으며 원핵생물 및 진핵생물 세포에서의 단백질 발현을 포함하며 후속적인 항원 결합 단백질의 단리 및 대개는 약학적으로 허용 가능한 순도로의 정제를 포함한다. 숙주 세포에서 상기 언급한 바와 같은 항체의 발현을 위해서, 각각의 변형된 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 핵산을 표준 방법에 의해 발현 벡터에 삽입한다. 발현을 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, PER.C6 세포, 효모 또는 에스케리키아 콜라이 세포와 같은 적합한 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 수행하며, 상기 항원 결합 단백질을 상기 세포(용해 후 상등액 또는 세포)로부터 회수한다. 항체의 일반적인 재조합 생산 방법은 현재의 발달 수준으로 널리 공지되어 있으며 예를 들어 하기의 고찰 문헌들에 개시되어 있다: Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880.

본 발명에 따른 이중 특이성 항원 결합 단백질을 통상적인 면역글로불린 정제 과정, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지로부터 적합하게 분리시킨다. 상기 단클론 항체를 암호화하는 DNA 또는 RNA를 쉽게 단리하고 통상적인 과정을 사용하여 서열화한다. 상기 하이브리도마 세포는 상기와 같은 DNA 및 RNA의 출처로서 작용할 수 있다. 상기 DNA를, 일단 단리되면, 발현 벡터에 삽입시키고, 이어서 달리 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예를 들어 HEK 293 세포, CHO 세포, 또는 골수종 세포에 형질감염시켜 상기 숙주 세포에서 재조합 단클론 항체의 합성을 획득한다.

상기 이중 특이성 항원 결합 단백질의 아미노산 서열 변체(또는 돌연변이체)를, 항원 결합 단백질 DNA 내로 적합한 뉴클레오타이드 변화를 도입시키거나 또는 뉴클레오타이드 합성에 의해 제조한다. 그러나, 상기와 같은 변화를, 단지 매우 제한된 범위로만, 예를 들어 상술한 바와 같이 수행할 수 있다. 예를 들어, 상기 변형은 IgG 아이소타입 및 항원 결합과 같은 상기 언급한 항체 특성을 변경시키지 않지만, 재조합체 생산 수율, 단백질 안정성을 개선시키거나, 또는 정제를 촉진시킬 수도 있다.

본 출원에 사용된 바와 같은 "숙주 세포"란 용어는 본 발명에 따른 항체를 생산하도록 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템을 나타낸다. 하나의 실시태양에서 HEK293 세포 및 CHO 세포를 숙주 세포로서 사용한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "세포", "세포 주", 및 "세포 배양물"이란 표현은 호환적으로 사용되며 모든 상기와 같은 명칭들은 자손을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"란 단어는 1차 주인 세포, 및 전이 수에 간계 없이 상기로부터 유래한 배양물을 포함한다. 모든 자손이, 계획적이거나 우연한 돌연변이로 인해, DNA 함량이 정확하게 동일할 수는 없는 것으로 또한 생각된다. 원래 형질전환된 세포에 대해 선별된 바와 동일한 작용 또는 생물 활성을 갖는 변체 자손들이 포함된다.

NS0 세포에서의 발현이 예를 들어 문헌[Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123]; [Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270]에 개시되어 있다. 일시적인 발현은 예를 들어 문헌[Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9]에 개시되어 있다. 가변 도메인의 클로닝은 예를 들어 문헌[Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837]; [Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289]; 및 [Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87]에 개시되어 있다. 바람직한 일시적인 발현 시스템(HEK293)은 문헌[Schlaeger, E.-J., Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83] 및 [Schlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199]에 개시되어 있다.

원핵생물에 적합한 조절 서열은 예를 들어 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵생물 세포는 프로모터, 인핸서 및 폴리아데닐화 신호를 사용하는 것으로 공지되어 있다.

핵산은 또 다른 핵산 서열과 작용성 관계에 놓일 때 "작동적으로 연결된다". 예를 들어, 예비-서열 또는 분비 리더용 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 예비 단백질로서 발현되는 경우 상기 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동적으로 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 암호화 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 상기 서열에 작동적으로 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하기 위해서 위치되는 경우 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 일반적으로, "작동적으로 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 연속적이고, 분비 리더의 경우에, 연속적이고 판독 프레임 중에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 연속적일 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 연결에 의해 수행된다. 상기와 같은 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 연결자 또는 링커가 통상적인 실시에 따라 사용된다.

항체의 정제를 표준 기법, 예를 들어 알칼리/SDS 처리, CsCl 분염법(banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 젤 전기영동, 및 당해 분야에 널리 공지된 다른 기법들에 의해, 세포 성분 또는 다른 오염물질, 예를 들어 다른 세포 핵산 또는 단백질을 제거하기 위해 수행한다. 문헌[Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)]을 참조하시오. 단백질 정제를 위한 상이한 방법들, 예를 들어 미생물 단백질과의 친화성 크로마토그래피(예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어 양이온 교환(카복시메틸 수지), 음이온 교환(아미노 에틸 수지) 및 혼합 방식 교환), 호황성 흡착(예를 들어 베타-머캅토에탄올 및 다른 SH 리간드와의), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피(예를 들어 페닐-세파로스, 아자-아레노필릭(aza-arenophilic) 수지, 또는 m-아미노페닐보론산에 의한), 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피(예를 들어 Ni(II)- 및 Cu(II)-친화성 물질과의), 크기 배제 크로마토그래피, 및 전기영동 방법(예를 들어 젤 전기영동, 모세관 전기영동)이 잘 확립되어 있고 널리 사용된다(Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).

본 발명의 하나의 태양은 본 발명에 따른 항원 결합 단백질을 포함하는 약학 조성물이다. 본 발명의 또 다른 태양은 약학 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 항원 결합 단백질의 용도이다. 본 발명의 추가의 태양은 본 발명에 따른 항원 결합 단백질을 포함하는 약학 조성물의 제조 방법이다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 약학 담체와 함께 제형화된, 본 발명에 따른 항원 결합 단백질을 함유하는 조성물, 예를 들어 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 태양은 암의 치료를 위한 상기 약학 조성물이다.

본 발명의 또 다른 태양은 암의 치료를 위한 본 발명에 따른 이중 특이성 항원 결합 단백질이다.

본 발명의 또 다른 태양은 암 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 항원 결합 단백질의 용도이다.

본 발명의 또 다른 태양은 암 치료가 필요한 환자에게 본 발명에 따른 항원 결합 단백질을 투여함으로써 상기 암을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법이다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "약학 담체"는 생리학적으로 적합한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 상기 담체는 정맥 내, 근육 내, 피하, 비 경구, 척추 또는 상피 투여(예를 들어 주사 또는 주입에 의해)에 적합하다.

본 발명의 조성물을 당해 분야에 공지된 다양한 방법들에 의해 투여할 수 있다. 숙련가에 의해 인식되는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 다양할 것이다. 몇몇 투여 경로에 의해 본 발명의 화합물을 투여하기 위해서, 상기 화합물을 그의 불활성화를 방지하기 위한 물질로 코팅하거나 상기 물질과 함께 투여하는 것이 필요할 수도 있다. 예를 들어, 상기 화합물을 피실험자에게, 적합한 담체, 예를 들어 리포솜 또는 희석제 중에서 투여할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 희석제는 염수 및 수성 완충제 용액을 포함한다. 약학 담체는 멸균 수성 용액 또는 분산액, 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 약학적으로 활성인 물질에 대한 상기와 같은 매질 및 작용제의 용도는 당해 분야에 공지되어 있다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "비 경구 투여" 및 "비 경구적으로 투여된"이란 어구는 경구 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 대개는 주사에 의한 투여 방식을 의미하며, 비 제한적으로 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 척추 강 내, 관절 내, 안와 내, 심장 내, 피 내, 복강 내, 경 기관지, 피 하, 각피 하, 관절 강 내, 피막 하, 지주막 하, 척수 내, 경막 외 및 흉골 내 주사 및 주입을 포함한다.

본 발명에 사용된 바와 같은 암이란 용어는 증식성 질병, 예를 들어 림프종, 림프구성 백혈병, 폐암, 비 소세포 폐(NSCL) 암, 기관지 폐포성 세포 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안 내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부 암, 위암, 결장암, 유방암, 자궁암, 난관암, 자궁내막 암종, 경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨 병, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선 암, 부갑상선 암, 부신 암, 연 조직 육종, 요도 암, 고환 암, 전립선암, 방광 암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장 세포 암종, 신우 암종, 중피종, 간세포암, 담즙 암, 중추 신경계(CNS) 종양, 척추 종양, 뇌간 신경교종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 신경초종, 상의세포종, 수모세포종, 뇌수막종, 편평세포 암종, 뇌하수체 선종 및 유잉 육종, 상기 암들 중 임의의 암의 난치성 버전, 또는 상기 암들 중 하나 이상의 조합을 지칭한다.

상기 조성물은 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제들을 또한 함유할 수도 있다. 미생물 존재의 방지는 상기 멸균 과정에 의해서 및 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산 등의 포함에 의해 보장될 수 있다. 또한 등장성 작용제, 예를 들어 당, 염화 나트륨 등을 상기 조성물에 포함시키는 것도 바람직할 수 있다. 또한, 상기 주사 가능한 약제 형태의 연장된 흡수를, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같이 흡수를 지연시키는 작용제의 포함에 의해 일으킬 수 있다.

선택된 투여 경로와 관계없이, 본 발명의 화합물(적합한 수화된 형태로 사용될 수 있다) 및/또는 본 발명의 약학 조성물을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 통상적인 방법에 의해 약학적으로 허용 가능한 투여형으로 제형화한다.

본 발명의 약학 조성물 중의 활성 성분의 실제 투여량 수준을, 특정 환자에 대해 독성이지 않으면서, 상기 환자에 대해 바람직한 치료 반응, 조성물 및 투여 방식을 성취하는데 유효한 양의 활성 성분을 수득하기 위해 변화시킬 수 있다. 상기 선택된 투여량 수준은 다양한 약동학적 인자들, 예를 들어 사용되는 본 발명의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료 지속 기간, 상기 사용되는 특정 조성물과 함께 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 조건, 일반적인 건강 및 선행 병력, 및 의료 분야에 널리 공지된 유사한 인자들에 따라 변할 것이다.

상기 조성물은 멸균성이고 상기 조성물을 주사기에 의해 전달할 수 있을 정도로 유동성이어야 한다. 상기 담체는 물 이외에, 바람직하게는 등장성의 완충된 염수 용액이다.

적합한 유동성을, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지시킬 수 있다. 다수의 경우에, 등장성 작용제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예를 들어 만니톨 또는 솔비톨, 및 염화 나트륨을 상기 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "세포", "세포 주" 및 "세포 배양물"이란 표현은 호환적으로 사용되며, 모든 상기와 같은 명칭들은 자손을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"란 단어는 1차 주인 세포, 및 전이 수에 간계 없이 상기로부터 유래한 배양물을 포함한다. 모든 자손이, 계획적이거나 우연한 돌연변이로 인해, DNA 함량이 정확하게 동일할 수는 없는 것으로 또한 생각된다. 원래 형질전환된 세포에 대해 선별되는 바와 동일한 작용 또는 생물 활성을 갖는 변체 자손들이 포함된다. 별도의 표시가 의도된 경우, 이는 문맥상 명백할 것이다.

본 발명에 사용된 바와 같은 "형질전환"이란 용어는 벡터/핵산을 숙주 세포 내로 운반하는 과정을 지칭한다. 굉장한 세포벽 차단층이 없는 세포가 숙주 세포로서 사용되는 경우, 형질감염을 예를 들어 문헌[Graham, F., L., and Van der Eb, A., J., Virology 52 (1973) 456-467]에 개시된 바와 같은 칼슘 포스페이트 침전 방법에 의해 수행한다. 그러나, DNA를 세포에 도입시키기 위한 다른 방법들, 예를 들어 핵 주사에 의한 방법 또는 원형질체 융합에 의한 방법을 또한 사용할 수도 있다. 원핵생물 세포 또는 상당한 세포벽 구조물을 함유하는 세포가 사용되는 경우, 예를 들어 한 가지 형질감염 방법은 문헌[Cohen, S., N., et al, PNAS. 69 (1972) 2110-2114]에 개시된 바와 같은 염화 칼슘을 사용하는 칼슘 처리이다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "발현"은 핵산을 mRNA 내로 전사하는 방법 및/또는 상기 전사된 mRNA(또한 전사물이라 지칭된다)를 후속적으로 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질로 번역하는 방법을 지칭한다. 상기 전사물 및 암호화된 폴리펩타이드를 집합적으로 유전자 산물이라 칭한다. 상기 폴리뉴클레오타이드가 게놈 DNA로부터 유래하는 경우, 진핵생물 세포에서의 발현은 상기 mRNA의 스플라이싱(splicing)을 포함할 수도 있다.

"벡터"는 삽입된 핵산 분자를 숙주 세포 내로 및/또는 숙주 세포 사이로 운반하는 핵산 분자, 특히 자기 복제 분자이다. 상기 용어는 주로 DNA 또는 RNA의 세포 내로의 삽입(예를 들어 염색체 통합)을 위해 작용하는 벡터, 주로 DNA 또는 RNA의 복제를 위해 작용하는 벡터들의 복제, 및 상기 DNA 또는 RNA의 전사 및/또는 번역을 위해 작용하는 발현 벡터를 포함한다. 또한 개시된 바와 같은 작용들 중 하나보다 많은 작용을 제공하는 벡터를 포함한다.

"발현 벡터"는 적합한 숙주 세포 내로 도입 시, 폴리펩타이드로 전사 및 번역될 수 있는 폴리뉴클레오타이드이다. "발현 시스템"은 대개 목적하는 발현 산물을 제공하는 작용을 할 수 있는 발현 벡터를 포함하는 적합한 숙주 세포를 지칭한다.

하기의 실시예, 서열 목록 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 이들의 진정한 범위는 첨부된 청구의 범위에 나열된다. 본 발명의 진의로부터 이탈됨 없이, 나열된 과정에서 변형을 수행할 수 있을 것으로 생각된다.

서열 목록의 설명

서열식별번호: 1

변형된 Fab 단편(CH1-CL 교환)의 C-말단 융합된 <VEGF> VH-CL 도메인을 갖는 변형되지 않은 중쇄 <Ang-2>

서열식별번호: 2

변형된 Fab 단편(CH1-CL 교환)의 <VEGF> VL-CH1 도메인

서열식별번호: 3

변형되지 않은 경쇄 <Ang-2>

서열식별번호: 4

변형된 Fab 단편(CH1-CL 교환)의 N-말단 융합된 <VEGF> VH-CL 도메인을 갖는 변형되지 않은 중쇄 <Ang-2>

서열식별번호: 5

변형되지 않은 Fab 단편의 C-말단 융합된 <Ang-2> VH-CH1 도메인을 갖는 변형된 중쇄 <VEGF>(CH1-CL 교환)

실시예

물질 및 일반적인 방법

인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오타이드 서열에 관한 일반적인 정보는 문헌[Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 제공되어 있다. 항체 쇄의 아미노산들은 EU 넘버링에 따라 번호를 매기고 이에 따라 지칭된다(Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)).

재조합 DNA 기법

문헌[Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 개시된 바와 같은 표준 방법들을 사용하여 DNA를 조작한다. 분자 생물학적 시약들을 제조자의 설명에 따라 사용한다.

유전자 합성

목적하는 유전자 분절들을 화학 합성에 의해 제조된 올리고뉴클레오타이드로부터 제조한다. 상기 유전자 분절(개개의 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위가 측면에 인접해 있다)을 PCR 증폭을 포함하여 올리고뉴클레오타이드들의 어닐링 및 연결에 의해 조립하고 후속적으로 지시된 제한 부위, 예를 들어 KpnI/SacI 또는 AscI/PacI를 통해 pPCRScript(Stratagene) 기재 pGA4 클로닝 벡터 내로 클로닝시킨다. 상기 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열화에 의해 확인한다. 유전자 합성 단편들을 진아트(Geneart)(Regensburg, Germany)에서 제공된 명세서에 따라 정렬시킨다.

DNA 서열 측정

DNA 서열들을 메디게노믹스 게엠베하(MediGenomix GmbH) (Martinsried, Germany) 또는 세퀴서브 게엠베하(Sequiserve GmbH )(Vaterstetten, Germany)에서 수행된 이중 가닥 서열화에 의해 측정한다.

DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 관리

GCG(Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) 소프트웨어 패키지 버전 10.2 및 인포맥스의 벡터 NT1 어드밴스 스위트 버전(Infomax's Vector NT1 Advance suite version) 8.0을 서열 생성, 지도화, 분석, 주해 및 예시를 위해 사용한다.

발현 벡터

상기 개시된 이중 특이성 4가 항체의 발현을 위해서 CMV-인트론 A 프로모터가 있거나 없는 cDNA 기구 또는 CMV 프로모터를 갖는 게놈 기구를 기본으로 하는 일시적인 발현(예를 들어 HEK293 EBNA 또는 HEK293-F에서) 세포에 대한 발현 플라스미드의 변체들을 적용한다.

상기 항체 발현 카세트 이외에, 상기 벡터는

-에스케리키아 콜라이에서 상기 플라스미드의 복제를 허용하는 복제 기원, 및

-에스케리키아 콜라이에서 암피실린 내성을 부여하는 β-락타마제 유전자

를 함유한다.

상기 항체 유전자의 전사 단위는 하기의 요소들로 구성된다:

-5' 단부의 독특한 제한 부위(들),

-인간 거대세포바이러스로부터의 급속 초기 인핸서 및 프로모터,

-이어서 상기 cDNA 기구의 경우에 인트론 A 서열,

-인간 항체 유전자의 5'-번역되지 않은 영역,

-면역글로불린 중쇄 신호 서열,

-cDNA로서 또는 게놈 기구로서 면역글로불린 엑손-인트론 기구를 갖는 인간 이중 특이성 4 가 항체 쇄(야생형 또는 도메인 교환된),

-폴리아데닐화 신호 서열을 갖는 3' 번역되지 않은 영역, 및

-3' 단부의 독특한 제한 부위(들).

하기 개시하는 개시된 항체 쇄를 포함하는 융합 유전자를 PCR 및/또는 유전자 합성에 의해 생성시키고 예를 들어 각 벡터 중의 독특한 제한 부위들을 사용하는 상응하는 핵산 분절들의 연결에 의한 공지된 재조합 방법 및 기법으로 조립한다. 상기 서브클로닝된 핵산 서열을 DNA 서열화에 의해 확인한다. 일시적인 형질감염을 위해서 보다 많은 양의 플라스미드를, 형질전환된 에스케리키아 콜라이 배양물로부터의 플라스미드 제제에 의해 제조한다(Nucleobond AX, Macherey-Nagel).

세포 배양 기법

표준 세포 배양 기법을 문헌[Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc]에 개시된 바와 같이 사용한다.

이중 특이성 4가 항체를 하기 개시하는 바와 같이 착생 증식하는 HEK293-EBNA에서 또는 현탁액 중에서 증식하는 HEK29-F 세포에서 각각 3 개의 발현 플라스미드의 일시적인 동시-형질감염에 의해 발현시킨다.

HEK293 - EBNA 시스템에서의 일시적인 형질감염

이중 특이성 4가 항체를, 10% 초 저 IgG FCS(송아지 태아 혈청, Gibco), 2 mM L-글루타민(Gibco), 및 250 ㎍/㎖ 제네티신(Gibco)이 보충된 DMEM(둘베코의 변형된 이글 배지, Gibco)에서 배양한 착생 증식하는 HEK293-EBNA 세포(엡스타인-바-바이러스 핵 항원을 발현하는 인간 배아 신장 세포 주 293; 아메리칸 타입 걸쳐 콜렉션 기탁 번호 ATCC # CRL-10852, Lot. 959 218)에서 각각 3 개의 발현 플라스미드(변형된 중쇄뿐만 아니라 상응하는 경쇄 및 변형된 경쇄를 암호화함)의 일시적인 동시 형질감염에 의해 발현시킨다. 형질감염을 위해서 FuGENE^TM 6 형질감염 시약(Roche Molecular Biochemicals)을 4:1(3:1 내지 6:1의 범위)의 FuGENE^TM 시약(㎕) 대 DNA(㎍)의 비로 사용한다. 단백질을 각각 1:1:2 내지 2:2:1 범위의 1:1:1(동 몰)의 (변형된 및 야생형) 경쇄 및 변형된 중쇄 암호화 플라스미드의 몰 비를 사용하여 상기 각각의 플라스미드로부터 발현시킨다. 세포를 3일째에 L-글루타메이트 ad 4 mM, 글루코스[Sigma], 및 NAA[Gibco]와 함께 공급한다. 이중 특이성 4 가 항체 함유 세포 배양 상등액을 원심분리에 의해 형질감염 후 5 내지 11일째에 수확하고 -20 ℃에서 보관한다. 예를 들어 HEK293 세포에서의 인간 면역글로불린의 재조합 발현에 관한 일반적인 정보는 문헌[Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203]에 제공되어 있다.

HEK293 -F 시스템에서 일시적인 형질감염

한편으로, 이중 특이성 4가 항체를 제조자의 설명에 따라 HEK293-F 시스템(Invitrogen)을 사용하여 각각의 플라스미드(예를 들어 변형된 중쇄뿐만 아니라 상응하는 경쇄 및 변형된 경쇄를 암호화함)의 일시적인 형질감염에 의해 생성시킨다. 간단히, 진탕 플라스크에서 또는 교반식 발효기에서 무 혈청 프리스타일(FreeStyle) 293 발현 배지(Invitrogen) 중의 현탁액에서 증식하는 HEK293-F 세포(Invitrogen)를 상술한 바와 같은 3 개의 발현 플라스미드와 293 펙틴 또는 펙틴(Invirogen)의 혼합물로 형질감염시킨다. 2L 진탕 플라스크(Corning)의 경우 HEK293-F 세포를 600 ㎖ 중의 1.0E^*6 세포/㎖의 밀도로 시딩하고 120 rpm, 8% CO2에서 배양한다. 그 다음날 상기 세포를 A) 동 몰 비로 상기 변형된 중쇄, 상응하는 경쇄 및 상응하는 변형된 경쇄를 암호화하는 600 ㎍의 전체 플라스미드 DNA(1 ㎍/㎖)를 갖는 20 ㎖ Opti-MEM(Invitrogen) 및 B) 20 ㎖ Opti-MEM + 1.2 ㎖ 293 펙틴 또는 펙틴(2 ㎕/㎖)의 혼합물 약 42 ㎖로 약 1.5E^*6 세포/㎖의 밀도로 형질 감염시킨다. 상기 글루코스 소비에 따라 글루코스 용액을 상기 발효 과정 동안 첨가한다. 상기 분비된 항체를 함유하는 상등액을 5 내지 10일 후에 수확하고 항체들을 상기 상등액으로부터 직접 정제하거나 또는 상기 상등액을 동결시키고 보관한다.

단백질 측정

정제된 이중 특이성 4가 항체 및 유도체의 단백질 농도를 문헌[Pace, C., N., et al., Protein Science 4 (1995) 2411-1423]에 따라 아미노산 서열을 근거로 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 ㎚에서 흡광도(OD)를 측정함으로써 측정한다.

상등액 중의 항체 농도 측정

세포 배양 상등액 중의 이중 특이성 4가 항체의 농도를 단백질 A 아가로스-비드(Roche)에 의한 면역침전에 의해 평가한다. 60 ㎕의 단백질 A 아가로스 비드를 TBS-NP40(50 mM 트리스, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Nonidet-P40) 중에서 3 회 세척한다. 후속적으로, 1 내지 15 ㎖의 세포 배양 상등액을 TBS-NP40 중에서 예비 평형화시킨 단백질 A 아가로스 비드에 적용한다. 실온에서 1 시간 동안 배양 후 상기 비드를 울트라프리(Ultrafree)-MC-필터 컬럼(Amicon) 상에서 TBS-NP40 0.5 ㎖로 1 회, 2x 포스페이트 완충된 염수(2x PBS, Roche) 0.5 ㎖로 2 회, 및 100 mM Na-시트레이트(pH 5.0) 0.5 ㎖로 간단히 4 회 세척한다. 결합된 항체를 35 ㎕의 NuPAGE(등록상표) LDS 샘플 완충제(Invitrogen)의 첨가에 의해 용출시킨다. 상기 샘플의 절반을 각각 NuPAGE(등록상표) 샘플 환원제와 배합하거나 또는 환원시키지 않고 방치하며, 70 ℃에서 10 분간 가열한다. 결과적으로, 5 내지 30 ㎕를 4 내지 12% NuPAGE(등록상표) 비스-트리스 SDS-PAGE(Invitrogen)(환원되지 않은 SDS-PAGE의 경우 MOPS 완충제 및 환원된 SDS-PAGE의 경우 NuPAGE(등록상표) 산화방지제 실행 완충제 첨가제(Invitrogen)를 갖는 MES 완충제 사용)에 적용하고 쿠마씨 블루로 염색한다.

세포 배양 상등액 중의 이중 특이성 4가 항체의 농도를 친화성 HPLC 크로마토그래피에 의해 정량적으로 측정한다. 간단히, 단백질 A에 결합하는 항체 및 유도체를 함유하는 세포 배양 상등액을 200 mM KH2PO4, 100 mM 나트륨 시트레이트, pH 7.4 중의 어플라이드 바이오시스템스 포로스(Applied Biosystems Poros) A/20 컬럼에 적용하고, 에이질런트(Agilent) HPLC 1100 시스템상에서 200 mM NaCl, 100 mM 시트르산, pH 2.5에 의해 상기 기질로부터 용출시킨다. 상기 용출된 단백질을 UV 흡광도 및 피크 면적의 적분에 의해 정량화한다. 정제된 표준 IgG1 항체를 기준으로서 사용하였다.

한편으로, 세포 배양 상등액 중의 이중 특이성 4가 항체의 농도를 샌드위치-IgG-ELISA에 의해 측정한다. 간단히, 스트렙타웰 하이 바인드(StreptaWell High Bind) 스트렙트아비딘 A-96 웰 미세적정 플레이트(Roche)를 실온에서 1 시간 동안 또는 한편으로 4 ℃에서 밤새 100 ㎕/웰의 비오틴화된 항-인간 IgG 포획 분자 F(ab')2<h-Fcγ> BI(Dianova)로 0.1 ㎍/㎖로 코팅하고 후속적으로 200 ㎕/웰의 PBS, 0.05% 트윈(PBST, Sigma)으로 3 회 세척한다. 상기 각 항체 함유 세포 배양 상등액의 PBS(Sigma) 중의 일련의 희석액 100 ㎕/웰을 상기 웰에 가하고 실온에서 미세적정 플레이트 진탕기 상에서 1 내지 2 시간 동안 배양한다. 상기 웰을 200 ㎕/웰의 PBST로 3 회 세척하고 결합된 항체를 실온에서 미세적정 플레이트 진탕기 상에서 1 내지 2 시간 동안 검출 항체로서 100 ㎕의 F(ab')2<hFcγ>POD(Dianova)로 0.1 ㎍/㎖로 검출한다. 결합되지 않은 검출 항체를 200 ㎕/웰의 PBST로 3 회 세척하여 버리고, 결합된 검출 항체를 100 ㎕의 ABTS/웰의 첨가에 의해 검출한다. 흡광도의 측정을 405 ㎚(기준 파장 492 ㎚)의 측정 파장에서 테칸 플루오르(Tecan Fluor) 분광계상에서 수행한다.

단백질 정제

단백질을 표준 프로토콜을 참조하여 여과된 세포 배양 상등액으로부터 정제한다. 간단히, 이중 특이성 4가 항체를 단백질 A 세파로스 컬럼(GE healthcare)에 적용하고 PBS로 세척한다. 이중 특이성 4가 항체의 용출을 pH 2.8에서 성취한 다음 상기 샘플을 바로 중화시킨다. 응집된 단백질을 PBS 또는 20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl pH 6.0 중에서 크기 배제 크로마토그래피(Superdex 200, GE Healthcare)에 의해 단량체성 항체로부터 분리시킨다. 단량체성 분획들을 모으고, 필요한 경우 예를 들어 밀리포어 아미콘 울트라(MILLIPORE Amicon Ultra)(30 MWCO) 원심분리 농축기를 사용하여 농축시키고, -20 ℃ 또는 -80 ℃에서 동결시키고 보관한다. 상기 샘플의 일부를 예를 들어 SDS-PAGE, 크기 배제 크로마토그래피 또는 질량 분광측정에 의해 후속의 단백질 분석 및 분석학적 특성화를 위해 제공한다.

SDS - PAGE

상기 NuPAGE(등록상표) 프리-캐스트(Pre-Cast) 젤 시스템(Invitrogen)을 제조자의 설명에 따라 사용한다. 특히, 10% 또는 4 내지 12% NuPAGE(등록상표) 노벡스(Novex)(등록상표) 비스-트리스 프리-캐스트 젤(pH 6.4) 및 NuPAGE(등록상표) MES(환원된 젤, NuPAGE(등록상표) 산화방지제 실행 완충제 첨가제가 있음) 또는 MOPS(환원되지 않은 젤)실행 완충제를 사용한다.

분석학적 크기 배제 크로마토그래피

상기 이중 특이성 4가 항체의 응집 및 올리고머 상태의 측정을 위한 크기 배제 크로마토그래피를 HPLC 크로마토그래피에 의해 수행한다. 간단히, 단백질 A 정제된 항체를 에이질런트 HPLC 1100 시스템상에서 300 mM NaCl, 50 mM KH2PO4/K2HPO4, pH 7.5 중의 토소(Tosoh) TSK젤 G3000SW 컬럼에, 또는 다이오넥스(Dionex) HPLC-시스템상에서 2 x PBS 중의 수퍼덱스(Superdex) 200 컬럼(GE Healthcare)에 적용시킨다. 상기 용출된 단백질을 UV 흡광도 및 피크 면적들의 적분에 의해 정량화한다. 바이오래드(BioRad) 젤 여과 표준 151-1901을 기준으로서 사용하였다.

질량 분광측정

상기 이중 특이성 4가 항체의 전체 탈글리코실화된 질량을 측정하고 전기분무 이온화 질량 분광측정(ESI-MS)을 통해 확인한다. 간단히, 100 ㎍의 정제된 항체를 37 ℃에서 12 내지 24 시간 동안 2 ㎎/㎖ 이하의 단백질 농도에서 100 mM KH2PO4/K2HPO4, pH 7 중의 50 mU N-글리코시다제 F(PNGaseF, ProZyme)로 탈글리코실화시키고 후속적으로 세파덱스(Sephadex) G25 컬럼(GE Healthcare) 상에서 HPLC를 통해 탈염시킨다. 상기 각각의 변형된 중쇄, 경쇄 및 변형된 경쇄의 질량을 탈글리코실화 및 환원 후에 ESI-MS에 의해 측정한다. 간단히, 115 ㎕ 중의 50 ㎍의 이중 특이성 4 가 항체를 60 ㎕의 1M TCEP 및 50 ㎕의 8M 구아니딘-하이드로클로라이드와 함께 배양하고 후속적으로 탈염시킨다. 상기 전체 질량 및 환원된 중쇄 및 경쇄의 질량을 나노메이트(NanoMate) 소스가 구비된 큐-스타 엘리트(Q-Star Elite) MS 시스템상에서 ESI-MS를 통해 측정한다.

VEGF 결합 ELISA

상기 이중 특이성 4가 항체의 결합 성질을 전장 VEGF165-His 단백질(R&D Systems)을 사용하여 ELISA 분석에 의해 평가한다. 이를 위해서, 팔콘(Falcon) 폴리스타이렌 투명성 향상된 미세적정 플레이트를 실온에서 2 시간 동안 또는 4 ℃에서 밤새 PBS 중의 100 ㎕의 2 ㎍/㎖ 재조합 인간 VEGF165(R&D Systems)로 코팅한다. 상기 웰을 300 ㎕의 PBST(0.2% 트윈 20)로 3 회 세척하고 200 ㎕의 2% BSA 0.1% 트윈 20으로 실온에서 30 분간 차단하고 후속적으로 300 ㎕의 PBST로 3 회 세척한다. PBS(Sigma) 중의 정제된 이중 특이성 4가 항체의 일련의 희석물 100 ㎕/웰을 상기 웰에 가하고 실온에서 미세적정 플레이트 진탕기 상에서 1 시간 동안 배양한다. 상기 웰을 300 ㎕ PBST(0.2% 트윈 20)로 3 회 세척하고 결합된 항체를 실온에서 미세적정 플레이트 진탕기 상에서 1 시간 동안 검출 항체로서 2% BSA 0.1% 트윈 20 중의 0.1 ㎍/㎖ F(ab')<hFc감마>POD(Immuno research) 100 ㎕/웰로 검출한다. 결합되지 않은 검출 항체를 300 ㎕/웰의 PBST로 3 회 세척하여 버리고, 결합된 검출 항체를 100 ㎕의 ABTS/웰의 첨가에 의해 검출한다. 흡광도의 측정을 405 ㎚(기준 파장 492 ㎚)의 측정 파장에서 테칸 플루오르 분광계상에서 수행한다.

VEGF 결합: 표면 플라스몬 공명( Biacore )에 의해 37 ℃에서 VEGF 결합의 동역학적 특성화

상기 ELISA 결과를 추가로 확인하기 위해서 VEGF에 대한 상기 이중 특이성 4가 항체의 결합을 하기의 프로토콜에 따라 바이아코어(Biacore) T100 장치 상에서 표면 플라스몬 공명 기술을 사용하여 정량적으로 분석하고 상기 T100 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석한다. 간단히, 이중 특이성 4가 항체를 염소 항 인간 IgG(JIR 109-005-098)에 대한 결합을 통해 CM5-칩 상에 포획한다. 상기 포획 항체를 하기와 같이 표준 아미노 커플링을 사용하여 아미노 커플링에 의해 고정화한다: HBS-N 완충제를 실행 완충제로서 사용하였으며, 활성화를 700 RU의 리간드 밀도를 목표로 EDC/NHS의 혼합물에 의해 수행한다. 상기 포획-항체를 커플링 완충제 NaAc, pH 5.0, c = 2 ㎍/㎖로 희석하고, 마지막으로 여전히 활성화된 카복실 그룹을 1M 에탄올아민의 주입에 의해 차단한다. 이중 특이성 4가 <VEGF> 항체의 포획을 5 ㎕/분의 흐름 및 c = 10 nM에서 수행하고, 실행 완충제 + 1 ㎎/㎖ BSA로 희석하고; 대략 30 RU의 포획 수준에 도달해야 한다. rhVEGF(rhVEGF, R&D-Systems Cat.-No, 293-VE)를 분석물로서 사용한다. 이중 특이성 4가 <VEGF> 항체에 대한 VEGF 결합의 동역학적 특성화를 실행 완충제로서 PBS + 0.005%(v/v) 트윈20 중에서 25 ℃ 또는 37 ℃에서 수행한다. 상기 샘플을 300 내지 0.29 nM의 일련의 rhVEGF 농도로 50 ㎕/분의 흐름 및 80 초의 회합 시간 및 1200 초의 해리 시간으로 주입한다. 유리 포획 항체 표면의 재생을 각 분석 주기 후에 10 mM 글리신 pH 1.5 및 60 초의 접촉 시간으로 수행한다. 동역학 상수를 통상적인 이중 참조 방법(대조용 기준: 측정하는 유동 세포에 대한 블랭크, 포획 분자 염소 항 인간 IgG에 대한 rhVEGF의 결합, rhVEGF 농도 "0", 모델: 랭뮤어(Langmuir) 결합 1:1, (포획 분자 결합으로 인해 Rmax를 로컬(local)로 설정함))을 사용하여 계산한다.

Ang -2 결합 ELISA

상기 이중 특이성 4가 항체의 결합 성질을 전장 Ang-2-His 단백질(R&D Systems)을 사용하여 ELISA 분석으로 평가한다. 이를 위해서 팔콘 폴리스타이렌 투명성 향상된 미세적정 플레이트를 실온에서 2 시간 동안 또는 4 ℃에서 밤새 PBS 중의 100 ㎕의 1 ㎍/㎖ 재조합 인간 Ang-2(R&D Systems, 담체 없음)로 코팅한다. 상기 웰을 300 ㎕의 PBST(0.2% 트윈 20)로 3 회 세척하고 200 ㎕의 2% BSA 0.1% 트윈 20으로 실온에서 30 분간 차단하고 후속적으로 300 ㎕의 PBST로 3 회 세척한다. PBS(Sigma) 중의 정제된 이중 특이성 4가 항체의 일련의 희석물 100 ㎕/웰을 상기 웰에 가하고 실온에서 미세적정 플레이트 진탕기 상에서 1 시간 동안 배양한다. 상기 웰을 300 ㎕의 PBST(0.2% 트윈 20)로 3 회 세척하고 결합된 항체를 실온에서 미세적정 플레이트 진탕기 상에서 1 시간 동안 검출 항체로서 2% BSA 0.1% 트윈 20 중의 0.1 ㎍/㎖ F(ab')<hk>POD(Biozol Cat.No. 206005) 100 ㎕/웰로 검출한다. 결합되지 않은 검출 항체를 300 ㎕/웰의 PBST로 3 회 세척하여 버리고, 결합된 검출 항체를 100 ㎕의 ABTS/웰의 첨가에 의해 검출한다. 흡광도의 측정을 405 ㎚(기준 파장 492 ㎚)의 측정 파장에서 테칸 플루오르 분광계상에서 수행한다.

Ang -2 결합 BIACORE

인간 Ang-2에 대한 상기 이중 특이성 4가 항체의 결합을 바이아코어 T100 장치(GE Healthcare Bioscience AB, Uppsala, Sweden)상에서 표면 플라스몬 공명에 의해 조사한다. 간단히, 친화성 측정을 위해서 염소<hIgG-Fcγ>다클론 항체를, 인간 Ang-2에 대한 이중 특이성 4가 항체의 제공을 위해서 아민 커플링을 통해 CM5 칩상에 고정화한다. 결합을 25 ℃에서 HBS 완충제(HBS-P)(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005% 트윈 20, ph 7.4) 중에서 측정한다. 정제된 Ang-2-His(R&D systems 또는 사내 정제됨)를 용액 중의 다양한 농도로 첨가한다. 회합을 3 분의 Ang-2-주입에 의해 측정하고; 해리를 3 분간 HBS 완충제에 의한 상기 칩 표면의 세척에 의해 측정하며 KD 값을 1:1 랭뮤어 결합 모델을 사용하여 평가한다. 상기 Ang-2 제제의 불균질성으로 인해, 1:1 결합이 관찰될 수 없으며; 따라서 KD 값은 단지 상대적인 평가이다. 음성 대조군 데이터(예를 들어 완충제 곡선)를 시스템 고유의 기준선 편차의 보정 및 소음 신호 감소를 위해 샘플 곡선으로부터 제한다. 바이아코어 T100 평가 소프트웨어 버전 1.1.1을 센서그램의 분석 및 친화성 데이터의 산출을 위해 사용한다. 한편으로, Ang-2를 아민 커플링(BSA-부재)을 통해 CM5 칩 상에 고정화되는 펜타히스안티바디(PentaHisAntibody)(PentaHis-Ab BSA-free, Qiagen No. 34660)를 통해 2000 내지 1700 RU의 포획 수준으로 포획할 수 있었다(하기 참조).

Ang -2- VEGF 가교 ELISA

상기 이중 특이성 4가 항체의 결합 성질을, 결합된 이중 특이성 항체의 검출을 위해 고정화된 전장 VEGF165-His 단백질(R&D Systems) 및 인간 Ang-2-His 단백질(R&D Systems)을 사용하여 ELISA 분석에서 평가한다. 오직 이중 특이성 4가 <VEGF-Ang-2> 항체만이 VEGF와 Ang-2에 동시에 결합할 수 있고 따라서 상기 두 항원을 가교할 수 있는 반면, 단일 특이성 "기준" IgG1 항체는 VEGF와 Ang-2에 동시에 결합할 수 없다(도 7).

이를 위해서 팔콘 폴리스타이렌 투명성 향상된 미세적정 플레이트를 실온에서 2 시간 동안 또는 4 ℃에서 밤새 100 ㎕의 PBS 중 2 ㎍/㎖ 재조합 인간 VEGF165(R&D Systems)로 코팅한다. 상기 웰을 300 ㎕의 PBST(0.2% 트윈 20)로 3 회 세척하고 200 ㎕의 2% BSA 0.1% 트윈 20으로 실온에서 30 분간 차단하고 후속적으로 300 ㎕의 PBST로 3 회 세척한다. PBS(Sigma) 중의 정제된 이중 특이성 4가 항체의 일련의 희석물 100 ㎕/웰을 상기 웰에 가하고 실온에서 미세적정 플레이트 진탕기 상에서 1 시간 동안 배양한다. 상기 웰을 300 ㎕의 PBST(0.2% 트윈 20)로 3 회 세척하고 결합된 항체를 100 ㎕의 PBS 중 0.5 ㎍/㎖ 인간 Ang-2-His(R&D Systems)의 첨가에 의해 검출한다. 상기 웰을 300 ㎕의 PBST(0.2% 트윈 20)로 3 회 세척하고, 결합된 Ang-2를 실온에서 1 시간 동안 100 ㎕의 0.5 ㎍/㎖ <Ang-2>mIgG1-비오틴 항체(BAM0981, R&D Systems)로 검출한다. 결합되지 않은 검출 항체를 300 ㎕의 PBST(0.2% 트윈 20)로 3 회 세척하여 버리고, 결합된 항체를 실온에서 1 시간 동안 차단 완충제 중에서 1:4 희석된 100 ㎕의 1:2000 스트렙트아비딘-POD 접합체(Roche Diagnostics GmbH, Cat. No. 11089153)의 첨가에 의해 검출한다. 결합되지 않은 스트렙트아비딘-POD 접합체를 300 ㎕의 PBST(0.2% 트윈 20)로 3 내지 6 회 세척하여 버리고 결합된 스트렙트아비딘-POD 접합체는 100 ㎕의 ABTS/웰의 첨가에 의해 검출한다. 흡광도의 측정을 405 ㎚(기준 파장 492 ㎚)의 측정 파장에서 테칸 플루오르 분광계상에서 수행한다.

바이아코어에 의한 VEGF -A 및 Ang -2에 대한 이중 특이성 4가 항체< VEGF - Ang -2>의 동시 결합에 대한 입증

상기 가교 ELISA로부터의 데이터를 추가로 확인하기 위해서 하기의 프로토콜에 따라 바이아코어 T100 장치상에서의 표면 플라스몬 공명 기술을 사용하여 VEGF 및 Ang-2에 대한 동시 결합을 확인하기 위한 추가의 분석을 확립하고 상기 T100 소프트웨어 패키지(T100 조절, 버전 2.01, T100 평가, 버전 2.01, T100 동역학 요약, 버전 1.01)를 사용하여 분석한다: Ang-2를 아민 커플링(BSA-부재)을 통해 CM5 칩 상에 고정화되는 펜타히스안티바디(PentaHis-Ab BSA-free, Qiagen No. 34660)를 통해 2000 내지 1700 RU의 포획 수준으로 포획한다. HBS-N 완충제는 커플링 도중 실행 완충제로서 사용되었으며, 활성화를 EDC/NHS의 혼합물에 의해 수행한다. 상기 펜타히스-Ab BSA-부재 포획-항체를 커플링 완충제 NaAc, pH 4.5, c = 30 ㎍/㎖로 희석하고, 마지막으로 여전히 활성화된 카복실 그룹을 1M 에탄올아민의 주입에 의해 차단하고; 5000 및 17000 RU의 리간드 밀도를 시험한다. 500 nM의 농도를 갖는 Ang-2를, 실행 완충제 + 1 ㎎/㎖ BSA로 희석한, 5 ㎕/분의 흐름의 상기 펜타히스-Ab에 의해 포획한다. 후속적으로, Ang-2 및 VEGF에 대한 <Ang-2, VEGF> 이중 특이성 4 가 항체 결합을 rhVEGF와의 배양 및 샌드위치 복합체의 형성에 의해 입증한다. 이를 위해서 상기 이중 특이성 4가 <VEGF-Ang-2> 항체를 Ang-2에 50 ㎕/분의 흐름 및 100 nM의 농도에서 결합시키고, 실행 완충제 + 1 ㎎/㎖ BSA로 희석하고, 동시적인 결합을, 50 ㎕/분의 흐름 및 150 nM의 VEGF 농도, 120 초의 회합 시간, 1200 초의 해리 시간으로 PBS + 0.005%(v/v) 트윈 20 실행 완충제 중의 VEGF(rhVEGF, R&D-Systems Cat.-No, 293-VE)와 함께 배양하여 검출한다. 재생을 각 주기 후에 2 x 10 mM 글리신 pH 2.0 및 60 초의 접촉 시간으로 50 ㎕/분의 흐름으로 수행한다. 통상적인 이중 참조(대조용 기준: 포획 분자 펜타히스Ab에 대한 이중 특이성 항체 및 rhVEGF의 결합)를 사용하여 센서그램을 보정한다. 각 Ab에 대한 블랭크를 rhVEGF 농도 "0"로 측정한다.

HEK293 - Tie2 세포 주의 생성

Ang-2 자극된 Tie2 인산화 및 세포 상의 Tie2에 대한 Ang-2의 결합에 의한 <Ang-2, VEGF> 이중 특이성 4가 항체의 간섭을 측정하기 위해서, 재조합 HEK293-Tie 세포 주를 생성시켰다. 간단히, CMV 프로모터 및 네오마이신 내성 마커의 조절 하에서 전장 인간 Tie2를 암호화하는 pcDNA3 기재 플라스미드(RB22-pcDNA3 Topo hTie2)를, HEK293 세포(ATCC) 내로의 형질감염 인자로서 퓨젠(Fugene)(Roche Applied Science)을 사용하여 형질감염시키고 내성 세포들을 DMEM 10% FCS, 500 ㎍/㎖ G418 중에서 선택하였다. 개별적인 클론들을 클로닝 실린더를 통해 단리하고, 후속적으로 FACS에 의해 Tie2 발현에 대해 분석하였다. 클론 22를 G418의 부재 하에서조차 높고 안정한 Tie2 발현을 갖는 클론으로서 동정하였다(HEK293-Tie2 클론22). HEK293-Tie2 클론22를 후속적으로 세포 분석: Ang-2 유발된 Tie2 인산화 및 Ang-2 세포 리간드 결합 분석에 사용한다.

Ang -2 유발된 Tie2 인산화 분석

<Ang-2, VEGF> 이중 특이성 4가 항체에 의한 Ang-2 유발된 Tie2 인산화의 억제를 하기의 분석 원리에 따라 측정한다. HEK293-Tie2 클론22를 Ang-2 항체의 부재 또는 존재 하에서 5 분간 Ang-2로 자극하고 P-Tie2를 샌드위치 ELISA에 의해 정량화한다. 간단히, 웰당 2 x 105 HEK293-Tie2 클론 22 세포를 100 ㎕ DMEM, 10% FCS, 500 ㎍/㎖ 제네티신 중의 폴리-D-리신 코팅된 96 웰-미세적정 플레이트 상에서 밤새 증식시킨다. 그 다음날, <Ang-2, VEGF> 이중 특이성 4가 항체의 적정 열을 미세적정 플레이트 중에 제조하고(4 배 농축됨, 75 ㎕ 최종 부피/웰, 중복) 75 ㎕의 Ang-2(R&D systems # 623-AN) 희석물(4 배 농축된 용액으로서 3.2 ㎍/㎖)과 혼합한다. 항체 및 Ang-2를 실온에서 15 분간 예비 배양한다. 100 ㎕의 상기 혼합물을 상기 HEK293-Tie2 클론 22 세포(1 mM NaV3O4와 5 분간 예비 배양됨, Sigma #S6508)에 가하고 37 ℃에서 5 분간 배양한다. 후속적으로 세포를 웰 당 200 ㎕의 빙냉 PBS + 1 mM NaV3O4로 세척하고 얼음 상에서 웰 당 120 ㎕의 용해 완충제(20 mM 트리스, pH 8.0, 137 mM NaCl, 1% NP-40, 10% 글리세롤, 2 mM EDTA, 1 mM NaV3O4, 1 mM PMSF 및 10 ㎍/㎖ 아프로티닌)의 첨가에 의해 용해시킨다. 세포를 미세적정 플레이트 진탕기 상에서 4 ℃에서 30 분간 용해시키고 100 ㎕ 용해물을 선행 원심분리 및 총 단백질 측정 없이 p-Tie2 ELISA 미세적정 플레이트(R&D Systems, R&D #DY990) 내로 직접 운반한다. P-Tie2 양을 제조자의 설명에 따라 정량화하고 억제에 대한 IC50 값을 엑셀용 XLfit4 분석 플러그-인(용량-반응 한 부위, 모델 205)을 사용하여 측정한다. IC50 값들을 실험 내에서 비교할 수 있지만 실험마다 변할 수도 있다.

VEGF 유발된 HUVEC 증식 분석

VEGF 유발된 HUVEC(인간 제대 정맥 내피 세포, Promocell #C-12200) 증식을 <Ang-2, VEGF> 이중 특이성 4가 항체의 세포 융합을 측정하기 위해서 선택한다. 간단히, 96 웰 당 5000 HUVEC 세포(낮은 계대 배양 수, ≤계대 배양)를 밤새 콜라겐 I-코팅된 BD 바이오코트(Biocoat) 콜라겐 I 96-웰 미세적정 플레이트(BD #354407/35640)에서 100 ㎕의 기아 배지(EBM-2 내피 기본 배지 2, Promocell # C-22211, 0.5% FCS, 페니실린/스트렙토마이신) 중에서 배양한다. 다양한 농도의 <Ang-2, VEGF> 이중 특이성 4가 항체를 rhVEGF(30 ng1/㎖ 최종 농도, BD # 354107)와 혼합하고 실온에서 15 분간 예비 배양한다. 후속적으로, 상기 혼합물을 상기 HUVEC 세포에 가하고 이들을 37 ℃, 5% CO2에서 72 시간 동안 배양한다. 분석일에 상기 플레이트를 실온에서 30 분간 평형화하고 세포 생육력/증식을 설명서(Promega, #G7571/2/3)에 따라 셀티터(CellTiter)-GloTM 발광 세포 생육력 분석 키트를 사용하여 측정한다. 발광을 분광광도계에서 측정한다.

실시예 1

Ang -2 및 VEGF -A를 인식하는 이중 특이성 및 4가 항체의 생산, 발현, 정제 및 특성화

첫 번째 실시예에서 Ang-2 및 VEGF-A를 인식하는 각각의 항체 쇄 사이의 링커 없이 이중 특이성 4가 항체를, (G4S)4-연결자를 통해 VEGF-A에 대한 VH-CL 도메인 융합부를 Ang-2를 인식하는 항체(SEQ1 또는 상응하는 IgG1 알로타입)의 중쇄의 C-말단에 융합시킴으로써 제조하였다. 상기 이중 특이성 4가 항체를 수득하기 위해서 상기 중쇄 구조물을 상기 Ang-2 항체(SEQ3)의 각각의 경쇄 및 VEGF-A(SEQ2)를 인식하는 VL-CH1 도메인 융합부를 암호화하는 플라스미드와 함께 발현시켰다. 상기 각 항체의 도해를 도 5에 제공한다.

상기 이중 특이성 4가 항체를 전통적인 분자 생물학 기법에 의해 일반적인 방법 부분에 개시된 바와 같이 생성시키고 상술한 바와 같이 HEK293F 세포에 일시적으로 발현시킨다. 후속적으로, 이를 단백질 A 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 상등액으로부터 정제하였다. 수득된 생성물을 질량 분광측정에 의한 정체 및 분석 성질, 예를 들어 SDS-PAGE에 의한 순도, 단량체 함량 및 안정성에 대해 특성화하였다.

이들 데이터는 상기 이중 특이성 4가 항체가 양호한 수율로 생산될 수 있고 안정함을 보인다.

후속적으로 Ang-2 및 VEGF-A에 대한 결합뿐만 아니라 동시적인 결합을 상술한 ELISA 및 바이아코어 분석에 의해 연구하고 Tie2 인산화의 억제 및 VEGF 유발된 HUVEC 증식의 억제와 같은 작용성 성질들을 분석하였으며, 이는 상기 생성된 이중 특이성 4가 항체가 Ang-2 및 VEGF-A에 결합할 수 있고 그들의 활성을 동시에 차단할 수 있음을 보인다.

실시예 2

두 번째 실시예에서 Ang-2 및 VEGF-A를 인식하는 각각의 항체 쇄 사이의 링커 없이 이중 특이성 4가 항체를, (G4S)4-연결자를 통해 VEGF-A에 대한 VH-CL 도메인 융합부를 Ang-2를 인식하는 항체(SEQ4 또는 상응하는 IgG1 알로타입)의 중쇄의 N-말단에 융합시킴으로써 제조하였다. 상기 이중 특이성 4가 항체를 수득하기 위해서 상기 중쇄 구조물을 상기 Ang-2 항체(SEQ3)의 각각의 경쇄 및 VEGF-A(SEQ2)를 인식하는 VL-CH1 도메인 융합부를 암호화하는 플라스미드와 함께 발현시켰다. 상기 각 항체의 도해를 도 6에 제공한다.

실시예 3

세 번째 실시예에서 Ang-2 및 VEGF-A를 인식하는 각각의 항체 쇄 사이의 링커 없이 이중 특이성 4가 항체를, (G4S)4-연결자를 통해 Ang-2에 대한 VH-CH1 Fab 도메인을 VEGF를 인식하는 CH1-CL 교환 항체(SEQ5 또는 상응하는 IgG1 알로타입)의 중쇄의 C-말단에 융합시킴으로써 제조하였다. 상기 이중 특이성 4가 항체를 수득하기 위해서 상기 중쇄 구조물을 상기 Ang-2 항체(SEQ3)의 각각의 경쇄 및 VEGF-A(SEQ2)를 인식하는 VL-CH1 도메인 융합부를 암호화하는 플라스미드와 함께 발현시켰다. 상기 각 항체의 도해를 도 7에 제공한다.

SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Bispecific antigen binding proteins <130> 26145 WO <140> PCT/EP2010/003559 <141> 2010-06-14 <150> EP09007857.7 <151> 2009-06-16 <160> 5 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 709 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> unmodified heavy chain <Ang-2> with C-terminal fused <VEGF> VH-CL domains of modified Fab Fragment (CH1-CL exchange) <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr 100 105 110 Pro Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 340 345 350 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 355 360 365 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 370 375 380 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 385 390 395 400 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 405 410 415 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 420 425 430 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 435 440 445 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser 450 455 460 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 465 470 475 480 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 485 490 495 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly 500 505 510 Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 515 520 525 Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys 530 535 540 Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu 545 550 555 560 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 565 570 575 Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp 580 585 590 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro 595 600 605 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 610 615 620 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 625 630 635 640 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 645 650 655 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 660 665 670 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 675 680 685 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 690 695 700 Asn Arg Gly Glu Cys 705 <210> 2 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> <VEGF> VL-CH1 domains of modified Fab Fragment (CH1-CL exchange) <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr 100 105 110 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 115 120 125 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 130 135 140 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 145 150 155 160 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 180 185 190 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 195 200 205 Pro Lys Ser Cys 210 <210> 3 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> unmodified light chain <Ang-2> <400> 3 Gln Pro Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His 85 90 95 Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 4 <211> 709 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> unmodified heavy chain <Ang-2> with N-terminal fused <VEGF> VH-CL domains of modified Fab Fragment (CH1-CL exchange) <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala 115 120 125 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 130 135 140 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 145 150 155 160 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 165 170 175 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 180 185 190 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 195 200 205 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 210 215 220 Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 225 230 235 240 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu 245 250 255 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 260 265 270 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg 275 280 285 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn 290 295 300 Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met 305 310 315 320 Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu 325 330 335 Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Pro Asn Pro 340 345 350 Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Pro Gly Ala Phe Asp Ile 355 360 365 Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 370 375 380 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 385 390 395 400 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 405 410 415 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 420 425 430 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 435 440 445 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 450 455 460 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 465 470 475 480 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 485 490 495 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 500 505 510 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 515 520 525 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 530 535 540 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 545 550 555 560 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 565 570 575 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 580 585 590 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Ser Gln Val Gln 465 470 475 480 Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys 485 490 495 Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His 500 505 510 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile 515 520 525 Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg 530 535 540 Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu 545 550 555 560 Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser 565 570 575 Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Pro Gly Ala 580 585 590 Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 595 600 605 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 610 615 620 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 625 630 635 640 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 645 650 655 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 660 665 670 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 675 680 685 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 690 695 700 Glu Pro Lys Ser Cys 705

Claims

a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하고 2 개의 Fab 단편을 포함하는 항체의 2 개의 경쇄 및 2 개의 중쇄;
b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 2 개의 추가적인 Fab 단편으로서, 상기 추가적인 Fab 단편이 둘 다 상기 a)의 중쇄의 C- 또는 N-말단에서 펩타이드 연결자(connector)를 통해 융합된 단편
을 포함하고, 하기의 변형이 Fab 단편에서 수행된 이중 특이성 항원 결합 단백질:
i) 상기 a)의 2 개의 Fab 단편 모두 또는 상기 b)의 2 개의 Fab 단편 모두에서 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 치환되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환되는 변형,
ii) 상기 a)의 2 개의 Fab 단편 모두에서 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 치환되고 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환되고, 상기 b)의 2 개의 Fab 단편 모두에서 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 치환되거나 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환되는 변형,
iii) 상기 a)의 2 개의 Fab 단편 모두에서 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 치환되거나 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환되고, 상기 b)의 2 개의 Fab 단편 모두에서 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 치환되고 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환되는 변형,
iv) 상기 a)의 2 개의 Fab 단편 모두에서 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 치환되고, 상기 b)의 2 개의 Fab 단편 모두에서 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환되는 변형, 또는
v) 상기 a)의 2 개의 Fab 단편 모두에서 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환되고, 상기 b)의 2 개의 Fab 단편 모두에서 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 치환되는 변형.
제 1 항에 있어서,
추가적인 Fab 단편이 둘 다 펩타이드 연결자를 통해 a)의 중쇄의 C-말단 또는 a)의 중쇄의 N-말단에 융합되는 이중 특이성 항원 결합 단백질.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
i) a)의 2 개의 Fab 단편 모두 또는 b)의 2 개의 Fab 단편 모두에서 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 치환되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환되는 변형이 Fab 단편에서 수행됨을 특징으로 하는 이중 특이성 항원 결합 단백질.
제 3 항에 있어서,
i) a)의 2 개의 Fab 단편 모두에서 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 치환되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환되는 변형이 Fab 단편에서 수행됨을 특징으로 하는 이중 특이성 항원 결합 단백질.
제 4 항에 있어서,
i) a)의 2 개의 Fab 단편 모두에서 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환되는 변형이 Fab 단편에서 수행됨을 특징으로 하는 이중 특이성 항원 결합 단백질.
제 3 항에 있어서,
i) b)의 2 개의 Fab 단편 모두에서 가변 도메인 VL 및 VH가 서로에 의해 치환되고/되거나 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환되는 변형이 Fab 단편에서 수행됨을 특징으로 하는 이중 특이성 항원 결합 단백질.
제 6 항에 있어서,
i) b)의 2 개의 Fab 단편 모두에서 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로에 의해 치환되는 변형이 Fab 단편에서 수행됨을 특징으로 하는 이중 특이성 항원 결합 단백질.
a) 숙주 세포를 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 이중 특이성 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환시키는 단계;
b) 상기 숙주 세포를 항원 결합 단백질 분자의 합성을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계; 및
c) 배양물로부터 항원 결합 단백질 분자를 회수하는 단계
를 포함하는, 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 이중 특이성 항원 결합 단백질의 제조 방법.
제 8 항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 이중 특이성 항원 결합 단백질 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
암의 치료를 위한 이중 특이성 항원 결합 단백질.
암 치료용 약제의 제조를 위한 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 이중 특이성 항원 결합 단백질의 용도.
치료가 필요한 환자에게 치료 효과량의 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 이중 특이성 항원 결합 단백질을 투여함을 특징으로 하는, 상기 환자의 치료 방법.