KR20140031996A - 조기 종양의 치료 및 아주반트 및 네오아주반트 요법을 위한 ｖｅｇｆ－특이적 길항제 - Google Patents

Abstract

본원에는 항-VEGF-특이적 길항제를 사용하여 양성, 전암성 또는 비-전이성 종양을 치료하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 항-VEGF-특이적 길항제를 사용하여 양성, 전암성 또는 비-전이성 종양이 발생할 위험에 놓인 대상체를 치료하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 항-VEGF-특이적 길항제를 사용하여 종양의 재발을 치료 또는 방지하는 방법 뿐만 아니라 네오아주반트 및 아주반트 암 요법에 있어서의 VEGF-특이적 길항제의 용도가 개시되어 있다.

Description

조기 종양의 치료 및 아주반트 및 네오아주반트 요법을 위한 ＶＥＧＦ－특이적 길항제 {VEGF-SPECIFIC ANTAGONISTS FOR ADJUVANT AND NEOADJUVANT THERAPY AND THE TREATMENT OF EARLY STAGE TUMORS}

암은 인간 건강에 가장 치명적인 위협 중의 하나이다. 미국에서만 매년 1백 3십만명 정도의 새로운 암 환자가 발생하고, 이는 심혈관계 질환 다음으로 두 번째로 높은 사망 원인이며, 사망자 4명 중의 대략 1명이 암 환자인 것으로 추정된다. 이러한 사망의 대부분은 고형 암으로 인한 것이다. 특정 암의 의학적 치료에는 상당한 진보가 있어 왔지만, 모든 암에 대한 전반적인 5년 생존율은 과거 20년간 약 10％ 정도만 개선되었다. 암, 또는 악성 종양은 제어되지 않는 방식으로 신속하게 전이 및 성장하기 때문에, 제시간에 이를 검출하고 치료하는 것이 극도로 어렵다.

현재의 암 치료법은 비교적 비-선택적이고 일반적으로 암이 보다 악성기로 진행된 후의 종양을 표적으로 한다. 수술은 병든 조직을 제거하고; 방사선요법은 고형 종양을 축소시키며; 화학요법은 분열 세포를 신속하게 사멸시켜 준다. 특히 화학요법은 수 많은 부작용을 야기시키는데, 몇몇 경우에는 투여될 수 있는 투여량을 제한할 정도로 심각한 부작용을 유발시키므로, 잠재적으로 유효한 약물의 사용을 배제시킨다. 더우기, 암에서 종종 화학요법 약물에 대한 내성이 생긴다. 조기 또는 양성 종양의 치료는 악성 또는 전이 상태로 진행되는 것을 방지함으로써, 암과 연관된 발병률과 사망률을 저하시키는 것이 바람직할 것이다.

수술가능한 암이 있는 것으로 새로이 진단된 대부분의 환자의 경우에는, 표준 치료가 결정적 외과수술 (definitive surgery)에 이은 화학요법이다. 이러한 치료는 재발을 방지하고 생존율을 개선시키기 위하여 가능한 한 많은 원발성 및 전이성 질병을 제거하는 것을 목표로 한다. 실제로, 이들 환자 대부분은 수술 후 육안으로는 잔류성 종양이 존재한다는 명백한 증거를 갖고 있지 않다. 그러나, 이들 중 많은 수가 나중에 재발되어 결국에는 사망할 수 있다. 이는 소수의 생육 가능한 종양 세포가 수술 이전에 전이되었고, 수술을 피하여 현재의 검출 기술 상의 한계로 인해 수술 후 검출되지 않았기 때문에 발생한다.

따라서, 이들 암 세포가 재증식하여 치료하기 곤란해지기 전에 이들 잔류성 미세전이성 암 세포를 제거하기 위하여 수술에 대한 보조 수단으로서의 수술후 아주반트 (adjuvant) 치료법이 중요해진다. 과거 수 십년 동안, 아주반트 요법 상의 진보는 일반적으로 증가 추세였는데, 각종 화학요법제의 사용에 집중되어 왔다. 많은 화학요법 처방이 조기 주요 암 적응증, 예를 들어 폐암, 유방암 및 결장직장암 환자를 보조적으로 치료하는 데에 있어서 임상적 이득을 나타내었다 [참고: Strauss et al. J Clin Oncol 22:7019 (2004); International Adjuvant Lung Cancer Trial Collaboration Group N Engl J Med 350:351-60 (2004); Moertel et al. Ann Intern Med 122:321-6 (1995); IMPACT Lancet 345:939-44 (1995); Citron et al. J Clin Oncol 21:1431-9 (2003)].

화학물질에 의거한 아주반트 요법의 확립된 이득에도 불구하고, 모든 종류의 화학요법과 연관된 한 가지 주요 단점은 독성이 상당히 높다는 것이다. 일반적으로, 화학요법 약물은 종양 부위를 표적으로 하지 않고, 정상 세포와 종양 세포를 식별할 수 없다. 독성에 관한 쟁점은 오랜 치료와 환자의 삶의 질에 미치는 영향력 때문에 아주반트 요법에서 특히 도전 과제로 대두된다. 더우기, 재발 위험이 낮은 환자에서 아주반트 화학요법의 이득은 여전히 명확치 않기 때문에, 이들이 화학요법 부작용을 참는 것이 가치있는 일인지의 여부는 의심스럽다.

주요 결정적 외과수술 전에 제공되는 보조 요법인 네오아주반트 (neoadjuvant) 요법이 암 요법의 또 다른 중요한 부분으로서 대두되었다. 결정적 외과수술에 앞서 네오아주반트 요법을 제공하는 것은 몇 가지 이점을 제공한다. 첫째, 이는 종양 용적, 복수 및 흉막 삼출의 감소로 인해, 수술에 앞서 환자의 일반 상태 (암의 상태를 나타내는 지수)를 개선시키는 데에 도움을 줄 수 있다. 둘째, 종양 용적 감소로 인해 수술이 덜 광범위해질 수 있으므로, 환자의 장기와 그의 기능을 보존해줄 수 있다. 이는, 예를 들어 유방암 환자의 경우에 특히 유용하다. 또한, 종양 용적 감소는 그 밖의 수술 불가능한 암의 수술을 가능하게 할 수 있다. 마지막으로, 네오아주반트 요법은 수술에 의한 종양의 완전 제거 기회를 개선시킴으로써, 생존율을 개선시킬 수 있다. 지난 10여년 동안, 유방암, 두경부암, 직장암, 담낭암, 비소세포 폐암, 자궁경부암, 식도암 및 위암 및 전립선암 등의 암 환자를 치료하기 위한 각종 화학요법제 및/또는 방사선을 이용하는 네오아주반트 요법에 대한 많은 임상 시도가 있었다 [참고: Tanvetyanon et al., Southern Med . J. 98:338-344 (2005)].

상기 설명한 바와 같이, 모든 종류의 화학요법과 연관된 한 가지 주요 단점은 상당한 독성이다. 많은 네오아주반트 화학요법 처방은 장기간에 걸쳐 빈번한 치료를 요구하기 때문에 번거롭다. 더우기, 재발 위험이 낮은 환자에서 네오아주반트 화학요법의 이득, 특히 생존율 이득은 여전히 명확치 않기 때문에, 이들이 즉각적인 수술 대신 기다리는 것이 가치있는 일인지는 의심스럽다.

혈관형성 (Angiogenesis)은 혈관 내피 세포가 증식하고, 불필요한 부분을 잘라내며 재구성하여 기존의 혈관망으로부터 새로운 혈관을 형성하는 중요한 세포내 사건이다. 혈관의 공급 발생이 정상적 및 병리학적 증식성 과정에 필수적이라는 설득력있는 명백한 증거가 있다. 이화 대사산물의 제거 뿐만 아니라 산소와 영양분의 전달이 다세포 유기체에서 발생하는 대다수의 성장 과정에 있어서 속도-제한 단계를 나타낸다.

새로운 혈관의 유도가 종양 혈관형성의 우세한 방식인 것으로 간주되기는 하지만, 최근의 데이터는 몇몇 종양이 존재하는 숙주 혈관을 공동-선택함으로써 성장할 수도 있음을 나타내었다. 이때, 이와 같이 공동-선택된 혈관계는 퇴행하여, 종양 퇴행을 유발시키고, 이는 결국에는 종양 주변에서의 저산소증-유도된 혈관형성에 의해 역전된다.

정상적 혈관형성과 비정상적 혈관형성 둘 다의 중요한 양성 조절인자 중의 하나가 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)-A이다. VEGF-A는 VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F, 및 PlGF를 포함한 유전자 계열의 일부이다. VEGF-A는 주로 2개의 고 친화성 수용체 티로신 키나제인 VEGFR-1 (Flt-1) 및 VEGFR-2 (Flk-1/KDR)과 결합하는데, 후자는 VEGF-A의 혈관 내피 세포 분열촉진 신호의 주요 전달물질이다. 부가적으로, 뉴로필린 (neuropilin)-1이 헤파린-결합 VEGF-A 이소형에 대한 수용체로서 확인되었고, 이는 혈관 발생에 있어 소정의 역할을 할 수 있다.

VEGF는 혈관형성 인자 이외에도 다형질성 성장 인자로서, 기타 생리학적 과정, 예를 들어 내피 세포 생존 및 증식, 혈관 침투성 및 혈관확장, 단구 화학주성 및 칼슘 유입에 있어서 다수의 생물학적 효과를 나타낸다. 더우기, 기타 연구는 여러 개의 비-내피 세포 유형, 예를 들어 망막 색소 상피 세포, 췌장관 세포 및 슈반 (Schwann) 세포에 대한 VEGF의 분열촉진 효과를 보고하였다.

VEGF를 병리 상태에 있어서의 혈관형성의 주요 조절인자로 인식함으로써, 병리학적 혈관형성과 관련된 질환에서 VEGF 활성을 차단시키고자 하는 수 많은 시도가 있어 왔다.

VEGF 발현은 대다수의 악성 종양에서 상향 조절되고, VEGF의 과발현은 많은 고형 종양에서 보다 진행된 병기 또는 보다 불량한 예후와 상관이 있다. 따라서, VEGF 신호 전달 경로를 억제하는 분자가, 병리학적 혈관형성이 인지되는 비교적 진행된 고형 종양을 치료하기 위해 사용되었다.

말기 및 전이성 또는 침습성 종양을 포함한, 병리학적 혈관형성과 관련이 있는 질환 또는 질병의 발생에 있어서 VEGF의 역할이 밀접한 영향을 미친다는 명백한 증거에도 불구하고, 조기 또는 양성 암, 잠복기 이후의 종양 재발, 또는 잠복기 종양, 악성 종양 또는 미세전이로부터의 이차 부위 종양의 발생에 있어서의 VEGF의 역할에 관해서는 공지된 바가 적다. 본 발명은 이들 및 기타 필요성에 역점을 두었는데, 이는 다음의 설명을 고찰함으로써 명백해질 것이다.

발명의 요약

VEGF-특이적 길항제를 화학요법과 병용해서 사용하는 것이 특히 전이성 결장직장암 및 비소세포 폐암 환자에게 유리한 것으로 밝혀졌지만, 양성 또는 조기 종양; 잠복기, 외과적 개입 또는 기타 개입 이후의 종양 재발; 잠복기 종양, 악성 종양 또는 미세전이로부터의 이차 부위 종양의 발생에 대한, 또는 아주반트 또는 네오아주반트 요법에 있어서의 VEGF-특이적 길항제 요법의 강한 영향력에 관해서는 거의 공지되어 있지 않다. 본 발명자들은 VEGF-특이적 길항제가 조기 종양, 예를 들어 양성, 전암성, 비-전이성 및 수술가능한 종양을 치료하는 데에 사용될 수 있다는 것을 입증해주는 결과를 본원에 제공한다. 이 결과는 VEGF-특이적 길항제가 아주반트 요법의 방법을 포함한, 암 (예: 양성 또는 악성 암)의 네오아주반트 요법에 사용될 수 있거나 또는 암 (예: 양성 또는 악성 암) 재발 가능성을 방지 및/또는 저하시키기 위하여 사용될 수 있다는 것을 추가로 입증해준다. 본 발명은 양성, 조기 및 수술가능한 암을 포함한 암 환자에게 보다 유효하고 덜 독성인 치료를 제공해주는 (수술 이전 및 수술 후 둘 다) 상당한 의학적 발전을 이루어내었다.

따라서, 본 발명은 유효량의 VEGF-특이적 길항제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이러한 대상체에서 양성, 전암성 또는 비-전이성 암을 치료하는 방법을 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 상기 VEGF-특이적 길항제의 투여가 양성, 전암성 또는 비-전이성 암이 침습성 또는 전이성 암으로 되지 못한다. 예를 들어, 양성, 전암성 또는 비-전이성 암은 0기, I기 또는 II기 암일 수 있고, 특정 실시양태에서는 상기 VEGF-특이적 길항제의 투여가 양성, 전암성 또는 비-전이성 암이 그 다음 병기(들), 예를 들어 I기, II기, III기 또는 IV기 암으로 진행되지 못하게 한다. 특정 실시양태에서, VEGF-특이적 길항제는 대상체에서 양성, 전암성 또는 비-전이성 종양을 치료하거나 또는 양성, 전암성 또는 비-전이성 종양이 침습성 또는 전이성 암이 되지 못하게 하기에 충분한 양 및 시간 동안 투여한다. 특정 실시양태에서, 상기 VEGF-특이적 길항제의 투여가 양성, 전암성 또는 비-전이성 종양의 종양 크기, 종양 존재량 또는 종양 수를 감소시킨다. VEGF-특이적 길항제는 또한, 양성, 전암성 또는 비-전이성 종양에서 혈관 밀도를 감소시키기 위한 양 및 시간 동안 투여할 수 있다.

본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은, 예를 들어 0기 (예: 계내 암종), I기 또는 II기 암을 치료하기 위해 사용할 수 있다. 네오아주반트 및 아주반트 요법의 방법을 사용하여 모든 유형의 암, 예를 들어 양성 또는 악성 암을 치료할 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 암은 상피 세포 고형 종양, 예를 들어 위장암, 결장암, 유방암, 전립선암, 신암, 폐암 (예: 비소세포 폐암), 흑색종, 난소암, 췌장암, 두경부암, 간암 및 연질 조직암 (예: B 세포 림프종, 예를 들어 NHL 및 다발성 골수종 및 백혈병, 예를 들어 만성 림프구성 백혈병) 등이다. 또 다른 실시양태에서, 양성, 전암성 또는 비-전이성 종양은 폴립, 선종, 섬유종, 지방종, 가스트린종, 인슐린종, 연골종, 골종, 혈관종, 림프관종, 수막종, 평활근종, 횡문근종, 편평 세포 유두종, 청신경초종, 신경섬유종, 담관 낭선종, 평활근종, 중피종, 기형종, 점액종, 트라코마, 육아종, 과오종, 이행 세포 유두종, 타액선의 다형성 선종, 인대양 (desmoid) 종양, 유피 (dermoid) 낭선유두종, 낭선종, 초점성 결절성 과증식, 또는 결절성 재생 과증식이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 선종을 치료하기 위해 사용하는 것이 바람직하다. 선종의 비제한적 예에는 간 세포 선종, 신 선종, 후신 (metanephric) 선종, 기관지 선종, 폐포 선종, 부신 선종, 뇌하수체 선종, 부갑상선 선종, 췌장 선종, 타액선 선종, 간세포 선종, 위장 선종, 세뇨관 선종 및 담관 선종이 포함된다.

본 발명은 또한, 대상체에서 양성, 전암성 또는 비-전이성 암의 발생 또는 재발을 방지하는 데에 유효한 양의 VEGF-특이적 길항제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 특징으로 한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 대상체는 암, 폴립 또는 암 증후군에 대한 위험에 노출되어 있다. 한 가지 예에서, 대상체는 암, 폴립, 또는 유전성 암 증후군 [예: 다발성 내분비 신생물 유형 1 (MEN1)]의 가족력을 갖고 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 대상체는 양성, 전암성 또는 비-전이성 위장 종양, 인대양 종양, 또는 선종 (예: 위장 선종, 뇌하수체 선종, 또는 췌장 선종)이 발생할 위험에 노출되어 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 종양에 걸린 적이 없었던 대상체, 임상적으로 검출가능한 암에 걸린 적이 없었던 대상체, 또는 단지 양성 종양 만을 갖고 있는 대상체에서 양성, 전암성 또는 비-전이성 암의 발생 또는 재발을 방지하여 준다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 0기, I기 또는 II기 위장 종양을 치료하는 데에 충분한 양 및 시간 동안 VEGF-특이적 길항제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 0기, I기 또는 II기 위장 종양을 치료하는 방법을 특징으로 한다. 위장 종양은 항문암, 결장직장암, 직장암, 식도암, 담낭암, 위암, 간암, 췌장암 및 소장암을 포함한 위장계의 모든 0기, I기 또는 II기 암일 수 있다. 한 실시양태에서, 위장 종양은 0기 (예: 고 악성도 선종) 또는 I기 종양이다. 한 실시양태에서, 대상체는 이전에 위장 종양을 치료하기 위한 절제술을 받은 적이 없다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 위장 종양의 발생 또는 재발을 방지하는 데에 충분한 양 및 시간 동안 VEGF-특이적 길항제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 위장 종양 발생 위험에 노출된 대상체를 치료하는 방법을 특징으로 한다. 위장 종양은 선종, 하나 이상의 폴립, 또는 0기, I기 또는 II기 암을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 모든 위장 종양일 수 있다.

상기 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 50세 이상 인간이거나, 유전성 암 증후군을 나타내거나, 또는 결장암 또는 폴립 가족력을 갖고 있다. 유전성 위장 암 증후군의 비제한적 예에는 가족성 선종성 폴립증 (FAP), 가드너 (Gardner) 증후군, 췌장암 및 유전성 비-폴립증 결장직장암 (HNPCC)이 포함된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 기존에 대장내시경 검사를 수행한 적이 있거나 수행한 적이 없을 수 있다. 한 실시양태에서, VEGF-특이적 길항제는 FAP를 갖는 대상체에서 선종성 결장직장 폴립 수를 감소시키기 위한 양 및 시간 동안 투여한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 암 재발 가능성을 방지하거나 저하시키는 데에 충분한 양 및 시간 동안 VEGF-특이적 길항제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암 재발 가능성을 방지하거나 저하시키는 방법을 특징으로 한다. 본 발명은 종양을 제거하는 단계 (예를 들어, 결정적 외과수술을 이용함), 및 그 후에 대상체에게 VEGF-특이적 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 종양이 있는 대상체에서 암의 재발을 방지하는 방법을 포함한다. 본 발명은 종양을 제거하는 단계 (예를 들어, 결정적 외과수술을 이용함), 및 그 후에 대상체에게 VEGF-특이적 길항제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양의 재증식을 방지하는 방법을 포함한다. 관련 측면에서, 본 발명은 수술 이전에 대상체에게 유효량의 VEGF-특이적 길항제를 투여하고, 결정적 외과수술을 수행하며, 수술 후에 유효량의 VEGF-특이적 길항제를 투여하는 것을 임의로 포함하는 (여기서, 수술 후에 상기 VEGF-특이적 길항제의 투여가 암의 재발을 방지하거나 암 재발 가능성을 저하시킨다), 대상체에서 암의 재발을 방지하거나 대상체에서 암 재발 가능성을 저하시키는 방법을 포함한다. 또 다른 관련 측면에서, 본 발명은 모든 부가적 항암 치료제의 부재 하에서 유효량의 VEGF-특이적 길항제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 (상기 투여가 대상체에서 암의 재발을 방지하거나 대상체에서 암 재발 가능성을 저하시킨다), 대상체에서 암의 재발을 방지하거나 대상체에서 암 재발 가능성을 저하시키는 방법을 포함한다.

상기 측면 각각에 대해, 종양은 고형 종양, 및 특히 본원에 기재된 종양 및 선종을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 모든 유형의 종양일 수 있다. 대상체는 임상적으로 검출될 수 있거나 검출되지 않을 수 있는 잠복기 종양 또는 미세전이를 가질 수 있다. 이러한 측면의 한 실시양태에서, VEGF-특이적 길항제는 잠복기 종양 또는 미세전이의 신생혈관증식을 저하시키기에 충분한 양 및 시간 동안 투여한다. 또 다른 실시양태에서, VEGF-특이적 길항제는 임상적으로 검출가능한 종양 또는 그의 미세전이의 발생을 방지하거나 또는 대상체의 생존 기간을 증가시키기에 충분한 양 및 시간 동안 투여한다.

한 실시양태에서, VEGF-특이적 길항제는 단일요법이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는, 예를 들어 항암 요법을 이용하여 기존에 종양에 대해 치료받은 적이 없다. 한 예에서, 항암 요법은 수술이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 VEGF-특이적 길항제의 투여 전, 투여 동안 (예: 동시에) 또는 투여 후에 부가의 항암 요법과 함께 추가로 치료할 수 있다. 항암 요법의 예에는 수술, 방사선 요법, 생물학적 요법, 면역요법, 화학요법, 또는 이들 요법의 병용이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.

대상체에서 결정적 외과수술을 진행한 실시양태에서는, VEGF-특이적 길항제를 일반적으로, 이러한 대상체가 수술로부터 회복한 소정의 기간 후에 투여한다. 이러한 기간에는 상처 치유 또는 외과적 절개 치유에 요구되는 기간, 상처 열개 위험을 저하시키는 데에 요구되는 기간, 또는 대상체가 수술 이전의 건강 수준과 본질적으로 유사하거나 이 보다 더 우수한 건강 수준으로 회복되는 데에 요구되는 기간이 포함될 수 있다. 결정적 외과수술을 완료하고 VEGF-특이적 길항제를 처음 투여하기까지의 기간에는 또한, 약물 면제를 위해 필요한 기간이 포함될 수 있는데, 대상체는 치료 처방 사이에 소정의 기간을 요구하거나 요청한다. 일반적으로, 결정적 외과수술을 완료하고 VEGF-특이적 길항제 요법을 개시하기까지의 기간에는 1주 미만, 1주, 2주, 3주, 4주 (28일), 5주, 6주, 7주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 2년, 3년 이상이 포함될 수 있다. 한 실시양태에서, 결정적 외과수술을 완료하고 VEGF-특이적 길항제를 투여하기까지의 기간은 2주 초과 1년 미만이다.

상기 측면 각각은 암의 재발을 알아보기 위하여 대상체를 모니터링하는 것을 더 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 종양 또는 암이 있는 것으로 진단된 환자에게 유효량의 VEGF-특이적 길항제, 예를 들어 베바시주맵 (bevacizumab)을 투여하는 것을 포함하는, 대상체, 예를 들어 인간 환자에서 수술가능한 암을 외과적으로 제거하기에 앞서 네오아주반트 요법의 방법을 제공한다. VEGF-특이적 길항제는 단독으로 투여하거나 또는 한 가지 이상의 화학요법제와 병용해서 투여할 수 있다.

본 발명은 또한, 수술가능한 암이 있는 대상체에게, 수술에 앞서 유효량의 VEGF-특이적 길항제를 투여한 후, 수술을 수행함으로써 암을 절제하는 것을 포함하는, 수술가능한 암이 있는 대상체를 치료하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 암의 재발을 방지하기 위하여 수술 후에 유효량의 VEGF-특이적 길항제를 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 수술가능한 암이 있는 대상체에게, 결정적 외과수술 이전에 유효량의 VEGF-특이적 길항제 (예: 베바시주맵)와 한 가지 이상의 화학요법제를 투여하는 것을 포함하는, 네오아주반트 요법의 방법에 관한 것이다. 이러한 방법을 사용하여 대상체에서 질병이 없는 생존율 (DFS) 또는 전반적인 생존율 (OS)을 연장시킬 수 있다. 한 실시양태에서, DFS 또는 OS는 치료 개시 후 약 2 내지 5년째에 평가한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 절제할 수 없는 종양이 있는 대상체에게 유효량의 VEGF-특이적 길항제를 투여하는 것을 포함하는 (상기 투여가 종양 크기를 감소시키고, 이로써 종양을 완전히 절제할 수 있게 된다), 절제할 수 없는 종양이 있는 대상체에서 종양 크기를 감소시키는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 종양을 완전히 절제한 후에 유효량의 VEGF-특이적 길항제를 대상체에게 투여하는 것을 더 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 a) 각 주기가 대상체에게 유효량의 VEGF-특이적 길항제 (예: 베바시주맵)를 한 가지 이상의 화학요법제와 예정된 간격으로 투여하는 것을 포함하는, 복수 개의 치료 주기를 포함하는 제1 단계; b) 결정적 외과수술을 수행함으로써 암을 제거시키는 단계; 및 c) 각 주기가 대상체에게 유효량의 VEGF-특이적 길항제 (예: 베바시주맵)를 예정된 간격으로 어떠한 화학요법제도 수반하지 않으면서 투여하는 것을 포함하는, 복수 개의 유지 주기를 포함하는 제2 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 제1 단계는 VEGF-특이적 길항제 (예: 베바시주맵)를 제1 화학요법 처방과 투여하는 제1 복수 개의 치료 주기에 이어, VEGF-특이적 길항제 (예: 베바시주맵)를 제2 화학요법 처방과 투여하는 제2 복수 개의 치료 주기를 포함한다. 한 실시양태에서, 치료하고자 하는 암이 유방암인 경우, 제1 화학요법 처방은 독소루비신 및 시클로포스파미드를 포함하고, 제2 화학요법 처방은 파클리탁셀을 포함한다.

본 발명은 전이성 또는 비-전이성 암이 있는 대상체에게 결정적 외과수술을 수행한 후, 유효량의 VEGF-특이적 길항제 (예: 베바시주맵)를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 이러한 방법은 한 가지 이상의 화학요법제를 사용하는 것을 더 포함한다. 이 방법을 사용하여 대상체에서 DFS 또는 OS를 연장시킬 수 있다. 한 실시양태에서, DFS 또는 OS는 치료 개시 후 약 2 내지 5년째에 평가한다. 한 실시양태에서, 대상체는 치료 후 1 내지 5년 이상 동안 질병이 없다.

한 측면에서, 본 발명의 방법은 a) 각 주기가 대상체에게 유효량의 VEGF-특이적 길항제 (예: 베바시주맵)를 한 가지 이상의 화학요법제와 예정된 간격으로 투여하는 것을 포함하는, 복수 개의 치료 주기를 포함하는 제1 단계; 및 b) 각 주기가 대상체에게 유효량의 VEGF-특이적 길항제 (예: 베바시주맵)를 예정된 간격으로 어떠한 화학요법제도 수반하지 않으면서 투여하는 것을 포함하는, 복수 개의 유지 주기를 포함하는 제2 단계를 포함하는데, 제1 단계와 제2 단계를 합하면 초기 수술후 치료 후 1년 이상 동안 지속된다. 한 실시양태에서, 제1 단계는 VEGF-특이적 길항제 (예: 베바시주맵)를 제1 화학요법 처방과 투여하는 제1 복수 개의 치료 주기에 이어, VEGF-특이적 길항제 (예: 베바시주맵)를 제2 화학요법 처방과 투여하는 제2 복수 개의 치료 주기를 포함한다. 치료하고자 하는 암이 유방암인 경우, 예를 들어 제1 화학요법 처방은 독소루비신 및 시클로포스파미드를 포함하고, 제2 화학요법 처방은 파클리탁셀을 포함한다.

상기 측면 각각의 특정 실시양태에서, VEGF-특이적 길항제는 VEGF와 결합하거나 또는 VEGF 발현 또는 생물학적 활성을 저하시키는 화합물이다. VEGF-특이적 길항제는 다음의 예시되는 화합물 중의 어느 하나일 수 있다: VEGF에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드, VEGF-특이적 리보자임, VEGF-특이적 펩티바디 (peptibody), VEGF 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자의 적어도 일부와 상보적인 안티센스 뉴클레오염기 올리고머, VEGF 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자의 적어도 일부와 상보적인 RNA 소분자, 또는 아프타머 (aptamer). VEGF에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드는 가용성 VEGF 수용체 단백질, 또는 그의 VEGF-결합 단편, 또는 키메라 VEGF 수용체 단백질, 예를 들어 Flt-1/Fc, KDR/Fc, 또는 Flt/KDR/Fc일 수 있다. VEGF에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드는 또한, 항-VEGF 항체 또는 그의 항원-결합 단편일 수 있다. 항-VEGF 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 모노클로날 항체, 키메라 항체, 완전한 인간 항체, 또는 인간화 항체일 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 예시되는 항체에는 베바시주맵 (AVASTIN^®), G6-31, B20-4.1, 및 그의 단편이 포함된다. 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 또한, Fc 부분, F(ab')₂, Fab, 또는 Fv 구조가 결여된 항체일 수 있다.

질병의 유형 및 중증도에 따라서, VEGF-특이적 길항제 (예: 베바시주맵)에 대한 바람직한 투여량은 본원에 기재되어 있고, 약 1 ㎍/kg 내지 약 50 mg/kg, 가장 바람직하게 약 5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg, 예를 들어 7.5 mg/kg 또는 10 mg/kg 등의 범위일 수 있다. 투여 횟수는 질병의 유형 및 중증도에 따라서 다양할 것이다. 질환에 따라서 수 일 이상에 걸쳐 반복 투여하는 경우에는, 본원에 기재되어 있거나 당해 분야에 공지된 방법에 의해 측정된 바와 같이 암이 치료되거나 목적하는 치료 효과가 달성될 때까지 치료를 지속한다. 한 예에서, 본 발명의 VEGF-특이적 길항제 (예: 베바시주맵)는 약 5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg, 예를 들어 7.5 mg/kg 또는 10 mg/kg 등의 용량으로 매주, 2주마다 또는 3주마다 1회씩 투여한다. 그러나, 기타 투여량 처방도 유용할 수 있다. 본 발명의 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링한다.

상기 측면 각각의 부가의 실시양태에서, VEGF-특이적 길항제는 국소 또는 전신 (예: 경구 또는 정맥내) 투여한다. 한 실시양태에서, VEGF-특이적 길항제를 이용한 치료는 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 11년, 및 12년으로 이루어진 군 중에서 선택된 기간 동안 환자에게 암이 없을 때까지 연장한다.

VEGF-특이적 길항제를 투여하기 이전, 투여하는 동안, 또는 투여 후에 대상체를 수 많은 방식으로 치료할 수 있긴 하지만, 본 발명의 측면 각각의 한 실시양태에서는, 대상체를 수술이나 화학요법 없이 치료한다. 기타 실시양태에서, VEGF-특이적 길항제를 이용한 치료는 단일요법이거나, 또는 임상의에 의해 평가되거나 본원에 기재된 바와 같이 VEGF-특이적 길항제 치료 기간 동안 단일요법이다.

기타 실시양태에서, VEGF-특이적 길항제를 이용한 치료는 수술, 방사선 요법, 화학요법, 분화유도 요법, 생물학적 요법, 면역 요법, 혈관형성 억제제 및 항증식성 화합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 부가의 항암 요법과 병용한다. VEGF-특이적 길항제를 이용한 치료에는 또한, 상기 유형의 치료 처방의 모든 조합이 포함될 수 있다. 또한, 세포독성제, 항혈관형성제 및 항증식제를 VEGF-특이적 길항제와 병용해서 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 항암 요법은 화학요법이다. 예를 들어, 화학요법제는, 예를 들어 알킬화제, 항대사제, 엽산 유사체, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체 및 관련 억제제, 빈카 알카로이드, 에피포도필로톡신, 항생제, L-아스파라기나제, 토포이소머라제 억제제, 인터페론, 백금 배위 착물, 안트라센디온 치환된 우레아, 메틸 히드라진 유도체, 부신피질 억제제, 부신피질 스테로이드, 프로게스틴, 에스트로겐, 항에스트로겐, 안드로겐, 항안드로겐, 성선자극 호르몬-방출 호르몬 유사체 등 중에서 선택된다. 몇몇 측면에서, 화학요법제 및 VEGF-특이적 길항제는 동시에 투여한다.

부가의 항암 요법을 포함하는 실시양태에서는, 대상체를 VEGF-특이적 길항제를 투여하기 전, 투여하는 동안 (예를 들어, 동시에) 또는 투여 후에 부가의 항암 요법으로 추가로 치료할 수 있다. 한 실시양태에서, 항암 요법은 이리노테칸, 플루오로우라실, 류코보린, 젬시타빈 또는 그의 조합물의 투여를 포함하는 화학요법이다. 한 실시양태에서, 단독으로 투여되거나 항암 요법과 함께 투여되는 VEGF-특이적 길항제는 유지 요법으로서 투여할 수 있다. 한 측면에서, 전립선암, 난소암 및 유방암에 대한 항암 요법은 호르몬 요법일 수 있다. 한 가지 예시 실시양태에서, VEGF-특이적 길항제는 항-Her2 항체, 또는 그의 단편 또는 유도체 [예: 헤르셉틴 (Herceptin^®) 항체]를 포함하지 않는 항암 요법과 병용해서 투여한다.

본 발명의 방법은 조기 종양을 치료 및 예방하는 데에 특히 유리하므로, 보다 진행된 병기로의 진행을 방지하여 진행성 암과 연관된 발병률과 사망률을 저하시켜 준다. 본 발명의 방법은 또한, 원발성 종양의 제거 후 영속되는 잠복기 종양 등의 종양의 재증식 또는 종양의 재발을 방지하거나, 또는 미세전이의 발생 또는 증식을 저하 또는 방지하는 데에 유리하다.

본 발명의 방법의 경우, 암은 고형 종양, 예를 들어 유방암, 결장직장암, 직장암, 폐암, 신 세포암, 신경아교종 (예: 역형성 성상세포종, 역형성 희소돌기성상세포종, 역형성 희소돌기아교세포종, 다형성 교모세포종), 신장암, 전립선암, 간암, 췌장암, 연질 조직 육종, 카르시노이드 암종, 두경부암, 흑색종 및 난소암일 수 있다. 한 실시양태에서, 암은 위장암이다.

본 발명의 상기 측면 각각의 부가 실시양태에서, VEGF-특이적 길항제는 양성, 전암성 또는 비-전이성 암을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 암 또는 종양 중의 암 세포의 수를 감소시키고/시키거나 (예를 들어, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 100％ 이상 감소시킴); 종양, 폴립 또는 선종의 크기를 감소시키고/시키거나; 종양 존재량을 감소시키고/시키거나; 암 세포가 말초 기관 내로 침윤되는 것을 억제하고/하거나 (즉, 어느 정도 감소시키고/시키거나 중지시킨다); 호르몬 분비를 저하시키고/시키거나; 폴립의 수를 감소시키고/시키거나; 양성, 전암성 또는 비-전이성 암을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 암 또는 종양 중의 혈관 밀도를 감소시키고/시키거나; 종양 전이를 억제하고/하거나; 종양 성장 또는 종양 세포 증식을 저하 또는 억제하고/하거나; 잠복기 종양의 성장을 저하 또는 방지하고/하거나; 미세전이의 성장 또는 증식을 저하 또는 방지하고/하거나; 치료 또는 제거 후 종양의 재증식을 저하 또는 방지하고/하거나; 양성, 전암성 또는 비-전이성 종양에 대해 감수성이거나 이로 진단된 대상체의 DFS 또는 OS를 증가 또는 연장시키고/시키거나; 암과 연관된 한 가지 이상의 증상을 어느 정도 경감시키기 위한 양 또는 시간 동안 (예를 들어, 시간 경과에 따른 특정한 치료 처방 동안) 투여한다. 한 예에서는, 생존율을 대상체에서 DFS 또는 OS로서 측정하는데, 이러한 DFS 또는 OS는 치료 개시 후 약 2 내지 5년째에 평가한다. 몇몇 부가의 실시양태에서, VEGF-특이적 길항제는 대상체에서 암의 발생 또는 재발을 방지하기 위해 사용된다. 한 예에서, 암 재발 방지는 약 4년 후에 대상체 집단에서 평가하여, 질병 재발이 집단의 약 80％ 이상에서 발생하지 않았다는 것을 확인한다. 또 다른 예에서는, VEGF-특이적 길항제를 사용하여 대상체에서 종양 또는 암의 재발 가능성을 저하시킨다. 한 예에서, 암 재발은 약 3년째에 평가하는데, 암 재발은 화학요법 만으로 치료된 대상체와 비교해서 약 50％ 이상 감소된다.

본 발명의 방법은 암 또는 종양의 재발을 알아보기 위하여 대상체를 모니터링하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 기타 특징 및 이점은 다음 상세한 설명, 도면 및 청구의 범위로부터 명백할 것이다.

도 1A-1F는 Apc^{min /+} 선종 및 정상 융모 (villus)에서의 VEGF-A 발현을 도시한 일련의 현미경사진이다. 14주령 Apc^{min /+} 마우스의 정상 융모 (도 1C, 1F) 뿐만 아니라 소장 (도 1A, 1D) 및 대장 (도 1B, 1E)으로부터의 내장 선종 상에서의 VEGF-A 프로브와의 계내 혼성화는 상피 세포 (화살표) 및 간질 세포 (화살촉)에서의 VEGF-A 발현을 입증해준다. 명시야: 도 1A-1C, 암시야: 도 1D-1F.
도 2a-2f는 VEGF-A의 억제가 종양 존재량을 저하시키고 생존율을 연장시킨다는 것을 도시한 일련의 그래프이다. 도 2a는 군 내의 개별 마우스의 종양 존재량을 도시한 그래프이다. 종양 존재량은 종양 존재량의 가장 큰 값에서부터 가장 작은 값까지 막대로 표시하였다. 화이트 크로스는 군 평균을 표시한다. *P<0.008, **p<5.3 x 10^-5. N은 동물의 수를 의미한다. 도 2b는 직경으로써 및 종양 총 수의 ％로서 종양 분포도를 나타낸 일련의 그래프이다. N은 군 내의 종양 수를 의미한다. 도 2c는 처리한지 3주 후 (상부) 및 처리한지 6주 후 (중간) 종양 크기 빈도의 중복을 도시한 일련의 그래프이다. 바닥 그래프는 0일째 (바닥)와 비교한 종양 크기 빈도의 중복을 도시한 것이다. 수직 막대는 종양 빈도가 mAb G6-31 처리된 동물에서 보다 더 큰 것과 동일하거나 더 작은 크기를 예시하는데; 3주 처리 군에서는 1 mm이고, 6주 처리 군에서는 1.2 mm이다. 도 2d는 내장 위치에 대해 플롯팅된 평균 종양 직경을 도시한 그래프이다. N은 제1, 제2, 제3 및 제4 내장 쿼터 각각에서의 군당 종양 수를 의미한다. 0일 군은 12마리 동물을 함유하였고, 기타 군은 10마리 동물을 함유하였다. S; 위, C; 맹장, R; 직장. 막대는 SEM을 나타낸다. mAb G6-31 3주 또는 6주와 비교한 *P<1.0 x 10^-10, **p<0.002. 도 2e는 14마리 Apc^min/+;빌린 (Villin)-Cre (검은색 칼럼) 및 Apc^{min /+};VEGF^lox;빌린-Cre (회색 칼럼) 마우스의 평균 종양 직경을 하행 순서로 제시하여 도시한 그래프이다. 막대는 표준 편차`(SD)를 나타낸다. 도 2f는 mAb G6-31 (회색 라인) 또는 대조군 IgG (검은색 라인) 처리된 마우스의 카플란-마이어 (Kaplan-Meier)를 도시한 그래프이다. 흰색 화살표는 처리 기간을 지칭한다. 평균 생존율은 회색 화살표로 표시된다. *P<2.4 x 10^-3. N은 군 내의 마우스 수를 의미한다.
도 3A-3L은 증식 지수가 아니라 종양 형태를 변경시키는 데에 있어서의 항-VEGF-A 처리 효과를 도시한 것이다. 도 3A-3B는 메틸렌 블루-염색된 소장의 공장 절편의 현미경사진이다. 도 3C-3D는 공장으로부터의 H&E 염색된 박편의 저배율 영상을 도시한 현미경사진이다. 도 3E-3F는 공장으로부터의 H&E 염색된 종양 박편의 고배율 영상을 도시한 현미경사진이다. 도 3G-3J는 종양 조직 및 정상 점막의 Ki-67 항체를 이용한 면역조직화학적 염색을 도시한 현미경사진이다. H&E으로의 대조염색. 도 3K는 핵 총수와 비교한 Ki-67에 대한 양성 핵의 비율로서 표현된 증식 지수를 도시한 그래프이다. 막대는 SEM을 나타낸다. 도 3L은 대조군 IgG (N1-N4) 또는 mAb G6-31 (N5-N8)로 처리된 동물로부터의 정상적인 점막 용해물의 웨스턴 블롯 (western blot) 분석이다. 대조군 IgG (T1-T4) 또는 mAb G6-31 (T5-T8)로 처리된 동물로부터의 종양 용해물.
도 4A-4C는 mAb G6-31 처리시 감소된 종양 혈관 면적 밀도를 도시한 것이다. 도 4A-4B는 공장으로부터의 종양의 면역조직화학적 염색으로부터의 80 ㎛ 박편의 공초점 영상이다. 그린 - CD31, 혈관 내피 세포; 블루 - E-카드헤린 (cadherin), 상피 세포; 레드 - 평활근 액틴 (actin). 도 4C는 분석된 총 종양 면적과 비교한 CD31에 대해 양성인 면적 비율로서 표현된 혈관 밀도를 도시한 그래프이다. 막대는 SEM을 나타내고; n은 분석된 종양의 수를 의미한다.
도 5A-5D는 항-VEGF-A 처리가 뇌하수체 종양 성장을 억제한다는 것을 도시한 일련의 그래프이다. 도 5A는 처리한지 9일, 25일, 39일, 53일, 및 67일째에 대조군 IgG (검은색 라인) 및 mAb G6-31 (회색 라인) 처리된 군의 평균 종양 용적을 도시한 그래프이다. 막대는 SEM을 나타낸다. N은 군 내의 마우스 수를 의미한다. 도 5B는 대조군 IgG (실선) 또는 mAb G6-31 (파선)으로 처리된 개개 마우스의 종양 용적을 도시한 그래프이다. 건강치 못하기 때문에 연구의 종말점 전에 7마리 동물을 안락사시켰다 (67일 시점 전에 종결되는 라인). 도 5C는 치료 개시 후 9, 25, 39, 53, 및 67일째에 평가된 대조군 IgG (검은색 라인) 및 mAb G6-31 (회색 라인) 처리된 군의 종양 증가가 없는 생존율을 도시한 그래프이다. 도 5D는 처리 1, 7, 14, 21, 28, 및 35일째에 대조군 IgG (검은색 라인) 및 mAb G6-31 (회색 라인) 처리된 피하 뇌하수체 종양 이식체의 종양 용적 측정치를 도시한 그래프이다. 막대는 SEM을 나타낸다. N은 군 내의 마우스 수를 의미한다.
도 6은 뇌하수체 및 Men1^+/- 뇌하수체 선종이 VEGF-A, VEGFR-1 및 VEGFR-2를 발현한다는 것을 도시한 그래프이다. VEGF-A, VEGFR-1 및 VEGFR-2의 상대적 발현이 야생형 뇌하수체 (검은색 칼럼), Men1^+/- 마우스로부터의 비-종양성 뇌하수체 조직 (회색), 작은 비-처리된 뇌하수체 선종, Men1^+/- 마우스로부터의 대조군 IgG-처리된 (레드) 및 mAb G6-31 처리된 (블루) 뇌하수체 종양에 대해 제시되었다. 막대는 SEM을 나타낸다. Ns; 유의적이지 않음.
도 7은 Men1^+/- 마우스로부터의 대표적인 뇌하수체 종양의 일련의 MRI 영상이다. 처리 9, 39 및 67일째에 대조군 IgG 및 mAb G6-31 처리된 마우스의 뇌하수체 선종을 수반한 관상 박편이 도시된다. 9일째에, 뇌하수체 선종의 가장자리를 황색 별표로 강조하였다. 치료 개시 후 9, 39 및 67일째에 대조군 IgG 처리된 종양의 용적은 각각 23.2, 55.9, 및 142.0 ㎣이고, mAb G6-31 처리된 종양의 용적은 각각 18.9, 27.2, 및 35.3 ㎣였다.
도 8A-8H는 Men1^+/- 마우스의 뇌하수체 및 췌장 종양의 조직학적 검사를 도시한 일련의 영상이다. 도 8A-8B는 H&E 염색된 뇌하수체 종양을 도시한 것이고, 도 8E-8F는 H&E 염색된 췌장 종양을 도시한 것이다. 도 8C-8D는 범-내피 마커 MECA-32를 이용한 계내 뇌하수체 종양의 면역조직화학 염색을 도시한 것이고, 도 8G-8H는 범-내피 마커 MECA-32를 이용한 계내 췌장 종양의 면역조직화학 염색을 도시한 것이다. 도 8I는 뇌하수체 종양 중의 혈관 밀도를 검정한 결과를 도시한 그래프이고, 도 8J는 대조군 IgG 및 항-VEGF-처리된 동물에서 췌장 종양 중의 혈관 밀도를 검정한 결과를 도시한 그래프이다. 막대는 SD를 나타낸다. Ns=유의적이지 않음.
도 9A-9D는 Men1^+/- 마우스로부터의 뇌하수체 종양 및 프롤락틴에 대해 양성인 뇌하수체 종양 이식체 염색을 도시한 일련의 영상이다. 항-프롤락틴 항체를 이용한 계내 뇌하수체 종양 (도 9A-9B) 및 피하 뇌하수체 종양 이식체 (도 9C-9D)에 대한 면역조직화학 염색이 도시되었다. 도 9E 및 9F는 유선에 인접한 이식된 뇌하수체 종양이 프롤락틴-유도된 분비성 변화를 나타낸다는 것을 도시한 영상이다 (영상의 좌측).
도 10A-10D는 혈청 프롤락틴 및 성장 호르몬 수준이 뇌하수체 종양 및 뇌하수체 종양 이식체를 수반한 마우스에서 상승된다는 것을 보여준다. 도 10A는 19마리의 처리되지 않은 종양-보유 Men1^+/- 마우스로부터의 뇌하수체 종양 용적 (㎣)에 대해 플롯팅된 혈청 PRL (ng/ml) 수준을 도시한 그래프인데, 이는 양성적 상관관계를 예시한다. 도 10B는 연구 종말점에서 대조군 IgG (검은색 삼각형) 및 mAb G6-31 (회색 구) 처리된 Men1^+/- 마우스의 뇌하수체 종양 용적에 대해 플롯팅된 혈청 PRL 수준을 도시한 그래프이다. 도 10C-10D는 치료 1일 및 35일째에 뇌하수체 선종 이식체를 수반한 마우스로부터의 혈청 프롤락틴 (C) 및 성장 호르몬 (D) 수준을 도시한 그래프이다.
도 11은 췌장 섬 종양 발생의 마우스 Rip-TβAg 모델에서 조기 종양 진행 동안 항-VEGF 처리 ("개입")의 효과를 도시한 그래프이다. 이 그래프는 이소형 매칭된 대조군 모노클로날 항체를 이용한 처리와 비교해서 9 내지 11주째에 항-VEGF 항체를 이용한 처리 후에 혈관형성 섬의 평균 수로써 측정된 바와 같은 종양 혈관형성의 저하를 도시한 것이다.
도 12a 및 12b는 퇴행 시험 결과를 도시한 것인데, 여기서는 췌장 섬 종양 발생의 마우스 Rip-TβAg 모델에서 항-VEGF 항체를 이용한 처리와 이소형 매칭된 대조군 모노클로날 항체를 이용한 처리 간에는 종양 존재량 또는 생존율에 있어서의 상당한 차이가 검출되지 않았다. 도 12a는 이소형 매칭된 대조군 모노클로날 항체로 처리된 것과 비교해서 항-VEGF 항체로 처리된 마우스에서의 종양 존재량을 도시한 그래프이다. 도 12b는 이소형 매칭된 대조군 모노클로날 항체로 처리된 것과 비교해서 항-VEGF 항체로 처리된 마우스의 시간 경과에 따른 생존율을 도시한 그래프이다.
도 13은 탁산 또는 젬시타빈을 이용한 세포감소 후 종양의 재증식을 억제시키기 위한 연장된 항-VEGF 요법의 유효성을 도시한 그래프이다.
도 14A-14D는 원발성의 처리되지 않은 뇌하수체 선종 (도 14A, 점선 위)이 인접한 정상적인 전방 뇌하수체 (점선 아래)와 비교해서 성장 호르몬에 대해 가변적이고도 약한 수준으로 양성이란 사실을 도시한 일련의 영상이다. 이식된 4개의 뇌하수체 종양 중의 1개 (대조군 IgG-처리됨)가 성장 호르몬에 대해 약하게 양성이었다 (도 14B). mab G6-31 (도 14C) 또는 대조군 IgG (도 14D)로 처리된 마우스로부터의 원발성 뇌하수체 종양은 성장 호르몬에 대해 병소적으로 양성이다.

I. 정의

용어 "VEGF" 또는 "VEGF-A"는, 예를 들어 문헌 [참고: Leung et al. Science, 246:1306 (1989), and Houck et al. Mol . Endocrin., 5:1806 (1991)]에 기재된 바와 같이, 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자 및 관련 121-, 145-, 189-, 및 206-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자를 그의 천연 발생적 대립유전자성 및 프로세싱된 형태와 함께 지칭하기 위해 사용된다. VEGF-A는 VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F, 및 PlGF를 포함한 유전자 계열의 일부이다. VEGF-A는 주로 2개의 고 친화성 수용체 티로신 키나제인 VEGFR-1 (Flt-1) 및 VEGFR-2 (Flk-1/KDR)과 결합하는데, 후자는 VEGF-A의 혈관 내피 세포 분열촉진 신호의 주요 전달물질이다. 부가적으로, 뉴로필린-1이 헤파린-결합 VEGF-A 이소형에 대한 수용체로서 확인되었고, 이는 혈관 발생에 있어 소정의 역할을 할 수 있다. 용어 "VEGF" 또는 "VEGF-A"는 또한, 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 래트 또는 영장류로부터의 VEGF를 지칭한다. 종종, 특이적 종으로부터의 VEGF는 인간 VEGF에 대한 hVEGF 또는 뮤린 VEGF에 대한 mVEGF 등의 용어로써 표시된다. 용어 "VEGF"는 또한, 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자의 아미노산 8 내지 109 또는 1 내지 109를 포함하는 폴리펩티드의 절단된 형태 또는 단편을 지칭하기 위해 사용된다. 이러한 모든 형태의 VEGF에 대한 참고는 본원에서, 예를 들어 "VEGF (8-109)", "VEGF (1-109)" 또는 "VEGF₁₆₅"로써 확인될 수 있다. "절단된" 천연 VEGF에 대한 아미노산 위치는 천연 VEGF 서열에 표시된 바와 같이 넘버링된다. 예를 들어, 절단된 천연 VEGF 중의 아미노산 위치 17 (메티오닌)은 또한, 천연 VEGF 중의 위치 17 (메티오닌)이다. 절단된 천연 VEGF는 천연 VEGF와 거의 동등한 수준으로 KDR 및 Flt-1 수용체에 대한 결합 친화성을 갖는다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "VEGF 변이체"는 천연 VEGF 서열 중에 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 VEGF 폴리펩티드를 지칭한다. 임의로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이에는 아미노산 치환(들)이 포함된다. 본원에 기재된 VEGF 변이체의 약칭의 목적상, 숫자는 추정상의 천연 VEGF [문헌 (Leung et al., 상기 참고 및 Houck et al., 상기 참고)에 제공됨]의 아미노산 서열을 따라 아미노산 잔기 위치를 지칭한다.

"천연 서열" 폴리펩티드는 천연으로부터 유래된 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 천연 서열 폴리펩티드는 모든 포유류로부터의 천연 발생적 폴리펩티드의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 천연 서열 폴리펩티드는 천연으로부터 단리할 수 있거나, 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생성될 수 있다. 용어 "천연 서열" 폴리펩티드에는 구체적으로, 해당 폴리펩티드의 천연 발생적 절단 또는 분비된 형태 (예: 세포외 도메인 서열), 상기 폴리펩티드의 천연 발생적 변이체 형태 (예: 대체 스플라이싱된 형태) 및 천연 발생적 대립유전자성 변이체가 포괄된다.

폴리펩티드 "변이체"는 천연 서열 폴리펩티드와의 아미노산 서열 동일률이 약 80％ 이상인 생물학적 활성 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 변이체에는, 예를 들어 하나 이상의 아미노산 잔기가 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에 부가 또는 결실되는 폴리펩티드가 포함된다. 통상적으로, 변이체는 천연 서열 폴리펩티드와의 아미노산 서열 동일률이 약 80％ 이상, 보다 바람직하게 약 90％ 이상, 보다 더 바람직하게 약 95％ 이상일 것이다.

"VEGF 생물학적 활성"에는 모든 VEGF 수용체에 대한 결합성 또는 모든 VEGF 신호 전달 활성, 예를 들어 정상적 및 비정상적 혈관형성 및 혈관생성 둘 다의 조절 [참고: Ferrara and Davis-Smyth (1997) Endocrine Rev. 18:4-25; Ferrara (1999) J Mol . Med. 77:527-543]; 배아 혈관신생 및 혈관형성을 증진시키는 활성 [참고: Carmeliet et al. (1996) Nature 380:435-439; Ferrara et al. (1996) Nature 380:439-442]; 및 여성 생식기에서의 순환적 혈관 증식 및 골 성장과 연골 형성을 위한 순환적 혈관 증식을 조정하는 활성이 포함된다 [참고: Ferrara et al. (1998) Nature Med. 4:336-340; Gerber et al. (1999) Nature Med. 5:623-628]. VEGF는 혈관형성 및 혈관생성에 있어서의 혈관형성 인자 이외에도 다형질성 성장 인자로서, 기타 생리학적 과정, 예를 들어 내피 세포 생존, 혈관 침투성 및 혈관확장, 단구 화학주성 및 칼슘 유입에 있어서 다수의 생물학적 효과를 나타낸다 [참고: Ferrara and Davis-Smyth (1997), supra an Cebe-Suarez et al. Cell . Mol . Life Sci . 63:601-615 (2006)]. 더우기, 최근의 연구는 수 개의 비-내피 세포 유형, 예를 들어 망막 색소 상피 세포, 췌장관 세포 및 신경집 세포에 대한 VEGF의 분열촉진 효과를 보고하였다 [참고: Guerrin et al. (1995) J. Cell Physiol . 164:385-394; Oberg-Welsh et al. (1997) Mol Cell Endocrinol. 126:125-132; Sondell et al. (1999) J Neurosci. 19:5731-5740].

"VEGF-특이적 길항제"는 본원에서 섹션 III에 기재되어 있다.

"항-VEGF 항체"는 충분한 친화성 및 특이성으로 VEGF와 결합하는 항체이다. 선택된 항체는 정상적으로, VEGF에 대한 충분히 강력한 결합 친화도를 가질 것이고, 예를 들어 이러한 항체는 100 nM 내지 1 pM의 K_d 값으로 hVEGF와 결합할 수 있다. 항체 친화도는, 예를 들어 표면 플라스몬 공명에 의거한 검정 [예를 들어, PCT 공개공보 WO2005/012359에 기재된 바와 같은 BIAcore 검정]; 효소 결합 면역 흡착 검정 (ELISA); 및 경쟁 검정 (예: RIA)에 의해 결정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-VEGF 항체는 VEGF 활성이 관계되는 질병이나 질환을 표적화하고 이를 방해하는 데에 있어서 치료제로서 사용될 수 있다. 또한, 상기 항체를 대상으로 하여 기타 생물학적 활성 검정을 수행하여, 예를 들어 그의 치료제로서의 유효성을 평가할 수 있다. 이러한 검정은 당해 분야에 공지되어 있고, 표적 항원 및 의도한 항체 용도에 좌우된다. 그 예에는 HUVEC 억제 검정 (다음 실시예에 기재된 바와 같음); 종양 세포 성장 억제 검정 (예를 들어, WO 89/06692에 기재된 바와 같음); 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 및 보체 매개된 세포독성 (CDC) 검정 [참고: 미국 특허 제5,500,362호]; 및 작동성 활성 또는 조혈 검정 [참고: WO 95/27062]이 포함된다. 항-VEGF 항체는 통상적으로, 기타 VEGF 상동체, 예를 들어 VEGF-B 또는 VEGF-C와 결합하지 않거나 또는 기타 성장 인자, 예를 들어 PlGF, PDGF 또는 bFGF와도 결합하지 않을 것이다. 항-VEGF 항체에 관한 부가의 정보는 섹션 III, A 하에 기재되어 있다.

본 명세서와 청구의 범위 전반에 걸쳐, 면역글로불린 중쇄 내의 잔기에 관한 넘버링은 문헌 [참고: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] (본원에 참고로 도입된다)에서와 같은 EU 인덱스에 따른 것이다. "카바트 문헌에서와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다.

용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로는 모노클로날 항체 (완전한 길이의 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중-특이적 항체 (예: 이중-특이적 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편이 포함된다.

본 발명에 따르는 "Kd" 또는 "Kd 값"은 한 실시양태에서, Fab를 표지되지 않은 VEGF의 적정 시리즈의 존재 하에 최소 농도의 (¹²⁵I)-표지된 VEGF (109)로 평형시킨 다음, 결합된 VEGF를 항-Fab 항체-피복된 판으로 포획함으로써 VEGF에 대한 Fab의 용액 결합 친화도를 측정하는 검정에 의해 기재된 바와 같이 VEGF 분자 및 항체의 Fab 버전을 이용하여 수행된 방사성 표지된 VEGF 결합 검정 (RIA)에 의해 측정된다 [참고: Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881]. 이러한 검정에 대한 조건을 확립시키기 위해, 미소역가판 (공급처: Dynex)을 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중의 5 ㎍/ml의 포획성 항-Fab 항체 (공급처: Cappel Labs)로 밤새 피복시킨 후, 실온 (대략 23℃) 하에 2 내지 5시간 동안 PBS 중의 2％ (w/v) 소 혈청 알부민으로 차단시킨다. 비-흡착성 판 (Nunc #269620)에서는, 100 pM 또는 26 pM [¹²⁵I]VEGF(109)를 관심있는 Fab, 예를 들어 Fab-12의 일련의 희석물과 혼합한다 [참고: Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]. 이어서, 관심있는 Fab를 밤새 항온 배양하지만, 이러한 항온 배양은 평형에 도달시키기 위해 65시간 동안 지속할 수 있다. 그 후, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 항온 배양하기 위해 포획 판에 옮겼다. 그 다음, 용액을 제거하고 판을 PBS 중의 0.1％ 트윈 (Tween)-20으로 8회 세척한다. 판이 건조되면, 150 ㎕/웰의 신틸런트 (scintillant) (MicroScint-20; Packard)를 가하고, 판을 10분 동안 탑카운트 (Topcount) 감마 계수기 (Packard) 상에서 계수한다. 최대 결합의 20％ 이하를 제공해주는 각 Fab의 농도를 경쟁적 결합 검정에 사용하기 위해 선택한다. 또 다른 실시양태에 따르면, Kd 또는 Kd 값은 약 10 반응 단위 (RU)에서 고정화 hVEGF (8-109) CM5 칩을 수반하여 25℃ 하에 BIAcore™-2000 또는 BlAcore™-3000 (공급처: BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)를 이용하여 표면 플라스몬 공명 검정을 사용함으로써 측정한다. 간략하게 설명하면, 카복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (공급처: CM5, BIAcore Inc.)을 공급자의 지시에 따라서 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시석신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 인간 VEGF를 1O mM 나트륨 아세테이트, pH 4.8로 희석시켜 5 ㎍/ml (약 0.2 μM)로 만든 후, 대략 10 반응 단위 (RU)의 커플링된 단백질을 달성하기 위해 5 ㎕/min의 유속으로 주사한다. 인간 VEGF를 주사한 후, 1 M 에탄올아민을 주사하여 반응되지 않은 기를 차단시킨다. 역학 측정을 위해, Fab의 2배 일련 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)을 대략 25 ㎕/min의 유속으로 25℃ 하에 PBS 중에 0.05％ 트윈 20 (PBST)과 함께 주사한다. 연합 속도 (k_on) 및 해리 속도 (k_off)는 연합 및 해리 센서그램을 동시에 고정시킴으로서 간단한 일-대-일 랑뮈르 (Langmuir) 결합성 모델 (BIAcore Evaluation Software version 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 k_off/k_on 비로서 계산하였다 [참고: 예를 들어, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881]. 작동 속도가 상기 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 10⁶ M^-1S^-1를 초과하는 경우에는, 분광계, 예를 들어 스톱-플로우 장착된 분광광도계 (공급처: Aviv Instruments) 또는 교반된 큐베트가 장착된 8000-시리즈 SLM-아민코 (Aminco) 분광광도계 (공급처: ThermoSpectronic)에서 측정된 바와 같은 인간 VEGF 단쇄 형태 (8-109) 또는 마우스 VEGF의 증가 농도의 존재 하에, 25℃에서 PBS, pH 7.2 중의 2O nM 항-VEGF 항체 (Fab 형태)의 형광 발광 세기 (여기 = 295 nm; 발광 = 340 nm, 16 nm 밴드-패스) 상의 증가 또는 감소를 측정하는 형광성 켄칭 기술을 사용함으로써 작동 속도를 결정할 수 있다.

"차단성" 항체 또는 항체 "길항제"는 이와 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제 또는 저하시키는 것이다. 예를 들어, VEGF-특이적 길항제 항체는 VEGF와 결합하고, 혈관 내피 세포 증식을 유도시킬 수 있는 VEGF의 능력을 억제시킨다. 바람직한 차단성 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 완전히 억제시킨다.

달리 표시하지 않는 한, "다가 항원"이란 표현은 본 명세서 전반에 걸쳐 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 항체를 의미하기 위해 사용된다. 예를 들어, 다가 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖도록 공학 처리되고, 이는 일반적으로 천연 서열 IgM 또는 IgA 항체가 아니다.

"Fv" 단편은 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인이 단단하게 연합되어 있는 이량체로 구성되는데, 이는 예를 들어, scFv에서 천연상 공유적일 수 있다. 이러한 형상에서는, 각 가변 도메인의 3개의 CDR이 상호 작용하여 V_H-V_L 이량체의 표면 상의 항원 결합 부위를 규정한다. 집합적으로, 6개의 CDR 또는 그의 일부가 항체에 항원 결합 특이성을 부여해준다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 대한 특이적인 3개의 CDR 만을 포함하는 Fv의 절반)은 항원을 인식하고 결합할 수 있는 능력을 지니고 있지만, 통상적으로 전체 결합 부위 보다 더 낮은 친화도를 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같은 "항체 가변 도메인"은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3), 및 골격 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄의 일부를 지칭한다. V_H는 중쇄의 가변 도메인을 지칭한다. V_L은 경쇄의 가변 도메인을 지칭한다. 본 발명에 사용된 방법에 따르면, CDR 및 FR에 대해 지정된 아미노산 위치는 카바트 [참고: Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991)]에 따라서 규정될 수 있다. 항체 또는 항원-결합 단편의 아미노산 넘버링은 또한 카바트에 따른다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "상보성 결정 영역" (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 그의 존재가 항원 결합에 필수적인 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 도메인은 전형적으로, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다. 각 상보성 결정 영역은 카바트에 의해 규정된 바와 같은 "상보성 결정 영역"으로부터의 아미노산 잔기 [즉, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 24-34 (Ll), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3); 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); 참고: Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 및/또는 "초가변 루프"로부터의 아미노산 잔기 [즉, 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3); 및 중쇄 가변 도메인 내의 잔기 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); 참고: Chothia and Lesk, J. Mol . Biol., 196: 901-917 (1987)]를 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 상보성 결정 영역은 카바트에 따라서 규정된 CDR 영역과 초가변 루프 둘 다로부터의 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 4D5의 중쇄의 CDRH1은 아미노산 26 내지 35를 포함한다.

"골격 영역" (FR로 후술됨)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 확인된 4개의 FR을 갖는다. CDR이 카바트에 따라서 규정되는 경우, 경쇄 FR 잔기는 잔기 약 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3), 및 98-107 (LCFR4)에 위치하고, 중쇄 FR 잔기는 중쇄 잔기 중의 잔기 약 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3), 및 103-113 (HCFR4)에 위치한다. CDR이 초가변 루프로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 경우, 경쇄 FR 잔기는 경쇄 중의 잔기 약 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3), 및 97-107 (LCFR4)에 위치하고, 중쇄 FR 잔기는 중쇄 잔기 중의 잔기 약 1-25 (HCFR1), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3), 및 102-113 (HCFR4)에 위치한다. 몇몇 경우에, CDR이 카바트에 의해 규정된 바와 같은 CDR과 초가변 루프의 CDR 둘 다로부터의 아미노산을 포함하는 경우, FR 잔기는 이에 따라서 조정될 것이다. 예를 들어, CDRH1이 아미노산 H26-H35을 포함하는 경우, 중쇄 FR1 잔기는 위치 1-25에 존재하고, FR2 잔기는 위치 36-49에 존재한다.

"Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과 중쇄의 가변 도메인 및 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. F(ab')₂ 항체 단편은 그들 사이에 힌지 (hinge) 시스테인에 의해 그들의 카복시 말단 근처에 일반적으로 공유적으로 연결되는 한 쌍의 Fab 단편을 포함한다. 항체 단편의 기타 화학적 커플링물이 당해 분야에 또한 공지되어 있다.

"단일 쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 V_H 및 V_L 도메인을 포함하는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있게 해주는, V_H 도메인과 V_L 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 더 포함한다. scFv에 관한 고찰은 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269- 315 (1994)].

용어 "디아바디 (diabody)"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하는데, 이들 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄 내에 경쇄 가변 도메인 (V_L)과 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함한다 (V_H 및 V_L). 동일한 쇄 상에서 두 도메인 간에 짝짓기를 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 이들 도메인을 또 다른 쇄의 상보적 도메인와 짝짓기하여, 2개의 항원-결합 부위를 창출시킨다. 디아바디는, 예를 들어 문헌 [참고: EP 404,097; WO 93/11161; and Hollinger et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세히 기재되어 있다.

"선형 항체"는 문헌 [참고: Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995)]에 기재된 항체를 지칭한다. 간략하게 설명하면, 이들 항체는 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원-결합 영역을 형성하는 한 쌍의 직렬식 Fd 절편 (V_H-C_H1-V_H-C_H1)을 포함한다. 선형 항체는 이중-특이적 또는 단일-특이적일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질적 항체 집단, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가, 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이물을 제외하고는 동일한 집단으로부터 수득한 항체를 지칭한다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이고, 단일 항원성 부위에 대항하여 유도된다. 더우기, 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대항하여 유도된 상이한 항체를 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대항하여 유도된다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득되는 바와 같은 항체의 형질을 표시하고, 특정한 방법에 의한 항체의 생성을 요구하는 것으로 추론되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라서 사용하고자 하는 모노클로날 항체는 문헌 [참고: Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 만들 수 있거나 또는 재조합 DNA 방법에 의해 만들 수 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호]. "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들어 문헌 [참고: Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) and Marks et al. J. Mol . Biol. 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파지 (phage) 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.

본원에서의 모노클로날 항체에는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 종으로부터 유래되거나 특정한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성이고, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린) 뿐만 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다 [참고: 미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81:6851 (1984)].

"인간화" 형태의 비-인간 (예: 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 몇몇 경우에는, 인간 면역글로불린의 Fv 골격 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체시킨다. 더우기, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 정련시키기 위해 만들어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 임의로, 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로는 인간 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 상세 내역에 관해서는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr . Op . Struct . Biol. 2:593-596 (1992)].

"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 상응하고/하거나 본원에 기재된 바와 같은 인간 항체를 제조하기 위한 모든 기술을 이용하여 만든 아미노산 서열을 보유하고 있는 항체이다. 인간 항체의 정의에는 구체적으로, 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체가 배제된다. 인간 항체는 당해 분야에 공지된 각종 기술을 사용하여 생성시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 항체는 파지 라이브러리로부터 선택되는데, 이러한 파지 라이브러리는 인간 항체를 발현한다 [참고: Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheets et al. Proc . Natl . Acad . Scc . 95:6157-6162 (1998); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol . Biol, 222:581 (1991)]. 인간 항체는 인간 면역글로불린 유전자 자리를 트랜스제닉 (transgenic) 동물, 예를 들어 내인성 면역글로불린 유전자를 부분적으로 또는 완전히 불활성화시킨 마우스 내로 도입함으로써 만들 수도 있다. 시험감염시, 인간 항체 생성이 관찰되는데, 이는 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 레퍼토리를 포함한 모든 측면에서 인간에게 관찰된 것과 밀접하게 유사하다. 이러한 접근 방식은, 예를 들어 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호, 및 다음 과학 공보지에 기재되어 있다 [참고: Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern . Rev . Immunol . 13:65-93 (1995)]. 또 다른 한편, 인간 항체는 표적 항원에 대항하여 유도된 항체를 생산하는 인간 B 림프구의 불멸화를 통하여 제조될 수 있다 (이러한 림프구는 개체로부터 회수할 수 있거나 또는 시험관 내에서 면역시킬 수 있다) [참고: 예를 들어, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J Immunol ., 147 (l):86-95 (1991); 및 미국 특허 제5,750,373호].

"친화성 성숙된" 항체는 변경(들)을 나타내지 않는 모 항체와 비교해서 항원에 대한 항체의 친화성을 개선시켜 주는, 그의 하나 이상의 CDR 내에서의 한 가지 이상의 변경을 수반한 항체이다. 바람직한 친화성 성숙된 항체는 표적 항원에 대한 나노몰 또는 심지어 피코몰 친화도를 지닐 것이다. 친화성 성숙된 항체는 당해 분야에 공지된 과정에 의해 생성된다. 문헌 [참고: Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에는 VH 및 VL 도메인 셔플링 (shuffling)에 의한 친화성 성숙이 기재되어 있다. CDR 및/또는 골격 잔기의 무작위 돌연변이 유발이 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Barbas et al., Proc . Nat . Acad . Sci . USA, 91:3809-3813 (1994); Schier et al., Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol . 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol . 154(7):3310-9 (1995); and Hawkins et al., J. Mol . Biol . 226:889-896 (1992)].

항체의 "기능적 항원 결합 부위"는 표적 항원과 결합할 수 있는 것이다. 항원 결합 부위의 항원 결합 친화성은 이러한 항원 결합 부위가 유도되는 모 항체 만큼 반드시 강력하지 않아도 되지만, 항원과 결합할 수 있는 능력은 항원과 결합하는 항체를 평가하는 것으로 공지된 각종 방법 중의 어느 하나를 사용하여 측정 가능해야만 한다. 더우기, 본원에서 다가 항체의 항원 결합 부위 각각의 항원 결합 친화성은 정량적으로 동일할 필요는 없다. 본원에서 다량체성 항체의 경우, 기능적 항원 결합 부위의 수는 미국 공개특허공보 제20050186208호의 실시예 2에 기재된 바와 같은 한외여과 분석을 이용하여 평가할 수 있다. 이러한 분석 방법에 따르면, 다량체성 항체에 대한 표적 항원의 상이한 비를 합하고, 상이한 수의 기능적 결합 부위 수를 추정하여 복합체의 평균 분자량을 계산한다. 이들 이론적 값을 기능적 결합 부위 수를 평가하기 위하여 수득된 실제적 실험 값과 비교한다.

지정된 항체의 "생물학적 특징"을 지닌 항체는 이러한 항체를 동일한 항원과 결합하는 기타 항체와 구별시켜 주는 항체의 한 가지 이상의 생물학적 특징을 보유하고 있는 것이다.

관심있는 항체에 의해 결합된 항원 상의 에피토프와 결합하는 항체에 관하여 스크리닝하기 위하여, 예를 들어 문헌 [참고: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 바와 같은 통상적인 교차-차단성 검정을 수행할 수 있다.

"종-의존성 항체"는 제2 포유류 종으로부터의 항원의 상동체에 대한 결합 친화도 보다 제1 포유류 종으로부터의 항원에 대한 결합 친화도가 더 강력한 것이다. 통상적으로, 종-의존성 항체는 인간 항체와 "특이적으로 결합"하지만 [즉, 결합 친화도 (K_d) 값은 약 1 x 10^-7 M 이하, 바람직하게 약 1 x 10^-8 M 이하, 가장 바람직하게 약 1 x 10^-9 M 이하이다], 제2 비-인간 포유류 종으로부터의 항원의 상동체에 대한 결합 친화도는 인간 항원에 대한 그의 결합 친화도 보다 약 50배 이상, 또는 약 500배 이상, 또는 약 1000배 이상 더 약하다. 종-의존성 항체는 상기 정의된 바와 같은 각종 유형의 항체 중의 어느 것일 수 있지만, 전형적으로 인간화 또는 인간 항체이다.

본원에 사용된 바와 같은 "항체 돌연변이체" 또는 "항체 변이체"는 종-의존성 항체의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변형시킨 종-의존성 항체의 아미노산 서열 변이체를 지칭한다. 이러한 돌연변이체는 종-의존성 항체와 반드시 100％ 서열 동일률 또는 유사율을 가질 필요는 없다. 한 실시양태에서, 항체 돌연변이체는 종-의존성 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일률 또는 유사율이 75％ 이상, 보다 바람직하게 80％ 이상, 보다 바람직하게 85％ 이상, 보다 바람직하게 90％ 이상, 가장 바람직하게 95％ 이상일 것이다. 이러한 서열과 관련한 동일률 또는 유사율은 필요한 경우 서열 최대 동일률을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후, 종-의존성 항체 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기 (즉, 동일한 잔기) 또는 유사한 후보 서열 내의 아미노산 잔기 (즉, 공통의 측쇄 특성에 기초한 동일한 군으로부터의 아미노산 잔기, 하기 참고)의 비율 (％)로서 본원에 규정된다. 가변 도메인의 항체 서열 외부로의 어떠한 N-말단, C-말단 또는 내부 연장물, 결실물, 또는 삽입물도 서열 동일률 또는 유사율을 영향을 미치는 것으로 간주되지 않아야 한다.

본 발명의 아미노산 서열을 함유하는 항체 또는 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어 미국 특허 제5,739,277호에 기재된 바와 같이, 재이용 (salvage) 수용체 결합성 에피토프를 항체 (특히, 항체 단편)에 부착시킬 수 있다. 예를 들어, 이러한 재이용 수용체 결합성 에피토프를 암호화하는 핵산 분자를 동일 프레임 내에서 본 발명의 폴리펩티드 서열을 암호화하는 핵산과 연결시켜, 공학 처리시킨 핵산 분자에 의해 발현된 융합 단백질이 재이용 수용체 결합성 에피토프와 본 발명의 폴리펩티드 서열을 포함하도록 한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "재이용 수용체 결합성 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 데에 책임이 있는 IgG 분자 (예: IgG_l, IgG₂, IgG₃, 또는 IgG₄)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다 [참고: 예를 들어, Ghetie et al, Ann . Rev . Immunol. 18:739-766 (2000), Table 1]. 그의 Fc 영역에서의 치환을 수반하고 혈청 반감기가 증가된 항체는 또한, 문헌 [참고: WO 00/42072, WO 02/060919; Shields et al., J. Biol . Chem. 276:6591-6604 (2001); Hinton, J. Biol . Chem. 279:6213-6216 (2004))]에 기재되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 혈청 반감기는 또한, 예를 들어 기타 폴리펩티드 서열을 부착시킴으로써 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 유용한 항체 또는 기타 폴리펩티드는 FcRn 수용체와 결합하는 혈청 알부민 또는 혈청 알부민의 일부, 또는 혈청 알부민 결합성 펩티드에 부착시켜 혈청 알부민이 이러한 항체 또는 폴리펩티드와 결합되도록 할 수 있는데, 예를 들어 이러한 폴리펩티드 서열은 WO01/45746에 기재되어 있다. 한 실시양태에서, 부착될 혈청 알부민 펩티드는 DICLPRWGCLW의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, Fab의 반감기는 이들 방법에 의해 증가된다. 혈청 알부민 결합성 펩티드 서열에 관해서는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Dennis et al. J Biol . Chem. 277:35035-35043 (2002)].

"키메라 VEGF 수용체 단백질"은 2가지 이상의 상이한 단백질로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 VEGF 수용체 분자인데, 이중의 적어도 하나는 VEGF 수용체 단백질로서 존재한다. 특정 실시양태에서, 키메라 VEGF 수용체 단백질은 VEGF과 결합하여 그의 생물학적 활성을 억제시킬 수 있다.

"단리된" 폴리펩티드 또는 "단리된" 항체는 그의 천연 환경의 구성분으로 확인되어 이러한 천연 환경으로부터 분리 및/또는 회수시킨 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 폴리펩티드 또는 항체에 대한 진단적 또는 치료적 용도를 방해할 수도 있는 물질인데, 이에는 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질이 포함될 수 있다. 특정 실시양태에서는, 폴리펩티드 또는 항체를 (1) 로리 (Lowry) 방법에 의해 결정된 바와 같이 폴리펩티드 또는 항체의 95 중량％ 초과, 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과로 정제시키거나, (2) 스피닝 컵 시퀘네이터 (spinning cup sequenator)의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상 잔기를 수득하기에 충분한 정도로 정제시키거나, 또는 (3) 쿠마시 블루, 또는 은 염색 (silver stain)을 이용하여 환원성 또는 비환원성 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질하도록 정제할 것이다. 단리된 폴리펩티드 또는 항체에는 재조합 세포 내의 계내 폴리펩티드 또는 항체가 포함되는데, 이는 폴리펩티드의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로 단리된 폴리펩티드 또는 항체는 한 가지 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

"단편"이란 바람직하게 기준 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 전체 길이의 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 이상을 함유하는 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 일부를 의미한다. 단편은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100, 200, 300, 400, 500, 600개 이상의 뉴클레오티드, 또는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 190, 200개 이상의 아미노산을 함유할 수 있다.

"항혈관형성제" 또는 "혈관형성 억제제"는 혈관형성, 혈관생성, 또는 바람직하지 못한 혈관 침투성을 직접 또는 간접적으로 억제시키는 저분자량 물질, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 단리된 단백질, 재조합 단백질, 항체, 또는 그의 접합체 또는 융합 단백질을 지칭한다. 항혈관형성제에는 혈관형성 인자 또는 그의 수용체와 결합하여 그의 혈관형성 활성을 차단시키는 작용제가 포함된다는 것을 인지해야 한다. 예를 들어, 항혈관형성제는 상기 정의된 바와 같은 혈관형성제에 대한 항체 또는 기타 길항제, 예를 들어 VEGF-A 또는 VEGF-A 수용체 (예: KDR 수용체 또는 Flt-1 수용체)에 대한 항체, 항-PDGFR 억제제 [예: Gleevec™ (이마티니브 메실레이트: Imatinib Mesylate)]이다. 항혈관형성제에는 또한, 천연 혈관형성 억제제, 예를 들어 안지오스타틴 (angiostatin), 엔도스타틴 (endostatin) 등이 포함된다 [참고: 예를 들어, Klagsbrun and D'Amore, Annu . Rev . Physiol, 53:217-39 (1991); Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003) (예를 들어, 표 3에는 악성 흑색종에서의 항혈관형성 요법이 열거되어 있다); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5:1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (예를 들어, 표 2에는 공지된 항-혈관형성 인자가 열거되어 있다) and Sato. Int . J. Clin. Oncol, 8:200-206 (2003) (예를 들어, 표 1에는 임상 시험에 사용된 항혈관형성제가 열거되어 있다)].

"치료 (처치)"는 치료적 처치와 예방적 조치 둘 다를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 대상체에는 이미 양성, 전암성 또는 비-전이성 종양이 있는 대상체 뿐만 아니라 암의 발생 또는 재발을 방지시키고자 하는 대상체가 포함된다.

용어 "치료적 유효량"은 포유류에게서 특정 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 VEGF-특이적 길항제의 양을 지칭한다. 전암성, 양성 또는 조기 종양의 경우, VEGF-특이적 길항제의 치료적 유효량은 암 세포 수를 감소시키고/시키거나; 원발성 종양 크기를 감소시키고/시키거나; 암 세포가 말초 기관 내로 침윤되는 것을 억제 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 중지시킨다)시키고/시키거나; 종양 전이를 억제 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 중지시킨다)시키고/시키거나; 종양 성장을 어느 정도 억제하고/하거나; 상기 장애와 연관된 한 가지 이상의 증상을 어느 정도 경감시킬 수 있다. 종양 잠복기 또는 미세전이를 치료하기 위한 VEGF-특이적 길항제의 치료적 유효량은 미세전이의 수 또는 증식을 감소시킬 수 있거나; 잠복기 종양의 성장을 저하 또는 방지시킬 수 있거나; 또는 치료 또는 제거 후에 (예를 들어, 항암 요법, 예를 들면 수술, 방사선 요법 또는 화학요법을 이용함) 종양의 재발을 저하 또는 방지시킬 수 있다. 약물이 기존의 암 세포의 성장을 방지하고/하거나 암 세포를 사멸시킬 수 있는 정도까지는 이러한 약물이 세포증식 억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 암 요법의 경우, 생체내 효능은, 예를 들어 생존 기간, 병세 진행까지의 시간 (TTP), 반응 속도 (RR), 반응 기간, 차도 시간, 및/또는 삶의 질을 평가함으로써 측정할 수 있다. 유효량은 질병이 없는 생존율 (DFS)을 개선시키고, 전반적인 생존율 (OS)을 개선시키며, 재발 가능성을 저하시키고, 재발되기까지의 시간을 연장시키며, 원격 재발 (즉, 원발성 부위로부터 벗어난 재발)되기까지의 시간을 연장시키고, 암을 치유하며, 암 증상을 개선시키며 (예를 들어, 암 특이적 검사를 이용하여 판단된 바와 같음), 제2 원발성 암의 발현을 저하시킬 수 있다.

"수술가능한" 암은 원발성 기관으로 한정되고 수술하기에 적합한 암이다.

"생존율"은 환자가 살아있는 상태를 지칭하며, 이에는 질병이 없는 생존율 (DFS), 진행이 없는 생존율 (PFS) 및 전반적인 생존율 (OS)이 포함된다. 생존율은 카플란-마이어 방법에 의해 평가할 수 있고, 생존율 상의 차이는 층상 로그 (log)-랭크 시험을 이용하여 연산처리한다.

"질병이 없는 생존율 (DFS)"은 환자가 치료 개시 또는 초기 진단으로부터 규정된 기간 동안, 예를 들어 약 1년, 약 2년, 약 3년, 약 4년, 약 5년, 약 10년 동안 암 재발없이 살아있는 것을 지칭한다. 본 발명의 한 측면에서, DFS는 포괄 해석 (intent-to-treat) 원칙에 따라서 분석하는데, 즉 환자는 그들의 지정된 요법에 근거하여 평가한다. DFS의 분석에 사용된 증상은 암의 국소, 부위 및 원격 재발, 이차 암의 발생, 및 선행 증상 (예를 들어, 유방암 재발 또는 제2 원발성 암) 없이 환자에서의 어떠한 원인으로 인한 사망이 포함될 수 있다.

"전반적인 생존율"은 환자가 치료 개시 또는 초기 진단으로부터 규정된 기간 동안, 예를 들어 약 1년, 약 2년, 약 3년, 약 4년, 약 5년, 약 10년 동안 살아있는 것을 지칭한다. 본 발명의 기초가 되는 연구에서 생존율 분석을 위해 사용된 증상은 어떠한 원인으로 인한 사망이었다.

"생존율을 연장시키는 것"은 치료받지 않은 환자 (즉, VEGF-특이적 길항제, 예를 들어 VEGF 항체를 이용하여 치료받지 않은 환자), 또는 대조군 치료 프로토콜, 예를 들어 화학요법제 (예: 파클리탁셀) 만을 이용한 치료와 비교해서 치료받은 환자에서 DFS 및/또는 OS가 증가하는 것을 의미한다. 생존율은 치료 개시 후 또는 초기 진단 후 약 6개월 이상, 또는 약 1년 이상, 또는 약 2년 이상, 또는 약 3년 이상, 또는 약 4년 이상, 또는 약 5년 이상, 또는 약 10년 이상 동안 모니터링한다.

생존율 분석에 있어서의 "위험 비"는 후속 기간 전반에 걸쳐 대조군과 비교한 치료 시의 사망 위험의 감소를 나타내는 2개의 생존율 곡선 간의 차이에 관한 요약이다. 위험 비는 증상 발생율에 대한 통계적 정의이다. 본 발명의 목적상, 위험 비는 실험적 지류 내의 증상 발생 확률을 구체적 시점에서의 대조군 지류 내의 증상 발생 확률로 나눈 것으로서 정의된다.

용어 "동시에"는 2가지 이상의 치료제를 투여하는데, 이러한 투여의 적어도 일부가 시간상 중복되는 것을 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 따라서, 동시 투여에는 하나 이상의 작용제(들)를 불연속적으로 투여한 후에 하나 이상의 다른 작용제(들)의 투여가 연속되는 투약 처방이 포함된다.

"단일요법"은 치료 과정 동안 암 또는 종양을 치료하기 위해 단지 단일 치료제 만을 포함하는 치료 처방을 의미한다. VEGF-특이적 길항제을 사용한 단일요법은 VEGF-특이적 길항제가 치료 과정 동안 부가의 항암 요법의 부재 하에서 투여되는 것을 의미한다.

"유지 요법"은 질병 재발 또는 진행 가능성을 저하시키기 위해 제공되는 치료 처방을 의미한다. 유지 요법은 대상체의 수명까지 연장된 시간을 포함한 소정의 시간 동안 제공될 수 있다. 유지 요법은 초기 요법 후에 제공되거나 또는 초기 또는 부가 요법과 연계해서 제공될 수 있다. 유지 요법에 사용된 투여량은 다양할 수 있고, 이에는 기타 유형의 요법에 사용된 투여량과 비교해서 감소된 투여량이 포함될 수 있다.

본원에서 "네오아주반트 요법" 또는 "수술전 요법"은 수술에 앞서 제공되는 요법을 지칭한다. 네오아주반트 요법의 목표는 표준 수술 순서에 이어 전신 요법이 수행된 경우에 증식할 수도 있는 미세전이를 잠재적으로 박멸시켜 주는 긴급 전신 치료를 제공하기 위한 것이다. 네오아주반트 요법은 또한, 종양 크기를 감소시키는 데에 도움을 줌으로써, 초기에 절제 가능하지 않은 종양의 완전한 절제를 허용해주거나 또는 기관의 일부 및 그의 기능을 보존시킬 수 있다. 더우기, 네오아주반트 요법은 약물 효능의 생체내 평가를 허용해주므로, 후속 치료를 선택하는 데에 지침이 될 수 있다.

본원에서의 "아주반트 요법"은 질병 재발 위험을 감소시키기 위해 잔류 질병에 관한 어떠한 명백한 증거도 검출될 수 없도록 한, 수술 후에 제공되는 요법을 지칭한다. 아주반트 요법의 목표는 암의 재발을 방지함으로써, 암 관련 사망 기회를 저하시키기 위한 것이다.

본원에서 "주의의 기준" 화학요법은 특정한 암을 치료하기 위해 통상적으로 사용되어 온 화학요법제를 지칭한다.

"결정적 외과수술"은 의학계 내에서 사용되는 용어이다. 결정적 외과수술에는, 예를 들어 종양의 제거 또는 절제를 가져다 주는 외과적 시술 등이 포함되는데, 이에는 총체적으로 가시적인 모든 종양의 제거 또는 절제를 가져다 주는 외과적 시술이 포함된다. 결정적 외과수술에는, 예를 들어 종양을 완전히 또는 치유적으로 절제하거나 종양을 완전히 총체적으로 절제하는 것이 포함된다. 결정적 외과수술에는 하나 이상의 병기에서 일어나는 시술이 포함되고, 예를 들어 종양을 절제하기에 앞서 한 가지 이상의 외과적 또는 기타 시술을 수행하는 다중-병기 외과적 시술이 포함된다. 결정적 외과수술에는 관련된 기관, 기간의 일부 및 조직 뿐만 아니라 이를 둘러싸고 있는 기관, 예를 들어 림프절, 기관의 일부 또는 조직을 포함한 종양을 제거 또는 절제하기 위한 시술이 포함된다.

용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징적으로 나타내는 포유류의 생리적 상태를 지칭하거나 이를 서술한다. 이러한 정의에는 양성 및 악성 암 뿐만 아니라 잠복기 종양 또는 미세전이도 포함된다. "조기 암" 또는 "조기 종양"이란 침습성 또는 전이성이 아닌 암, 또는 0기, I 또는 II 암으로서 분류되는 암을 의미한다.

용어 "전암성"은 전형적으로 암으로 진행되거나 암을 발생시키기는 상태 또는 성장을 지칭한다. "전암성" 성장은 비정상적인 세포 주기 조절, 증식 또는 분화를 특징으로 하는 세포를 가질 것인데, 이는 세포 주기 조절, 세포 증식 또는 분화의 마커에 의해 결정될 수 있다.

"형성이상"은 조직, 기관 또는 세포의 모든 비정상적인 성장 또는 발생을 의미한다. 바람직하게, 형성이상은 고 악성도 또는 전암성이다.

"전이"는 암이 그의 원발성 부위로부터 체내의 다른 부위로 확산되는 것을 의미한다. 암 세포는 원발성 종양으로부터 이탈되어, 림프관 및 혈관 내로 침투하고, 혈류를 통하여 순환하여 체내의 그 밖의 정상 조직에서 원격 중심에서 성장한다 (전이된다). 전이는 국소 또는 원격일 수 있다. 전이는 원발성 종양으로부터 갈라진 종양 세포 상에 우발적으로 발생하고, 혈류를 통하여 순환한 다음, 원격 부위에서 중단하는 순차적 과정이다. 이러한 새로운 부위에서 상기 세포는 혈류 공급을 확립시키고 성장하여 생명에 치명적인 덩어리를 형성할 수 있다. 종양 세포 내에서의 자극적 분자 경로와 억제성 분자 경로 둘 다가 이러한 거동을 조정하므로, 원격 부위 내의 숙주 세포와 종양 세포 간의 상호 작용이 또한 중요하다.

"미세전이"는 소수의 세포가 원발성 종양으로부터 기타 신체 부위로 확산되는 것을 의미한다. 미세전이는 스크리닝 또는 진단 시험에서 검출될 수 있거나 그렇치 않을 수 있다.

"비-전이성"이란 양성인 암, 또는 여전히 원발성 부위 내에 있으면서 림프계 또는 혈관계 내로 침투되지 않았거나 원발성 부위 이외의 조직 내로 침투되지 않은 암을 의미한다. 일반적으로, 비-전이성 암은 0기, I 또는 II 암인 모든 암이고, 종종 III기 암이다.

종양 또는 암을 "0기 ", "I기", "II기", "III기" 또는 "IV"기로서 언급하는 것은 당해 분야에서 공지된 전반적인 병기 분류 또는 로마 숫자 병기분류 방법을 이용한 종양 또는 암의 분류를 나타낸다. 암의 실제적 병기가 암의 유형에 좌우되기는 하지만, 일반적으로 0기 암은 계내 병변이고, I기 암은 작은 국소 종양이며, II기 및 III기 암은 국소 림프절의 연루를 나타내는 국소 진행성 종양이며, IV기는 전이성 암을 나타낸다. 각 유형의 종양에 대한 구체적 병기는 숙련된 임상의에게 공지되어 있다.

본원에 사용된 바와 같은 "종양"은 악성 또는 양성이든지 간에 모든 신생물성 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다.

"원발성 종양" 또는 "원발성 암"은 본래의 암이고 대상체 체 내의 또 다른 조직, 기관 또는 위치에 국재된 전이성 병변이 아닌 것을 의미한다.

"양성 종양" 또는 "양성 암"은 본래의 부위에 국재된 채로 있고, 원격 부위로 침윤, 침습 또는 전이될 수 있는 능력이 갖고 있지 않은 종양을 의미한다.

본원에서의 "암 재발"은 치료 후 암이 재발되는 것을 지칭하고, 이에는 원발성 기관에서의 암 재발 뿐만 아니라 암이 원발성 기관을 벗어나서 재발되는 원격 재발이 포함된다.

"종양 잠복기"는 종양 세포가 존재하긴 하지만, 종양 진행이 임상적으로 현성되지 않은 장기간의 휴지 상태를 의미한다. 잠복기 종양은 스크리닝 또는 진단 시험에서 검출될 수 있거나 그렇치 않을 수 있다.

"종양 존재량"은 체내의 암 세포 수, 종양 크기 또는 암의 양을 의미한다. 종양 존재량은 또한, 종양 부하량으로서 지칭된다.

"종양 수"는 종양의 수를 의미한다.

"대상체"는 인간 또는 비-인간 포유류, 예를 들어 소, 말, 개, 양 또는 고양이를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 포유류를 의미한다. 바람직하게, 대상체는 인간이다.

대상체의 "집단"은 임상 시험에서와 같은, 또는 암 네오아주반트 요법 등의 특정한 적응증에 대한 FDA 승인 후에 종양학자가 관찰한 바와 같은, 암이 있는 대상체 군을 지칭한다. 한 실시양태에서, 집단은 3000명 이상의 대상체를 포함한다.

용어 "항암 요법"은 암을 치료하는 데에 유용한 요법을 지칭한다. 항암 치료제의 예에는, 예를 들어 수술, 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 방사선 요법에 사용된 작용제, 항혈관형성제, 세포소멸제, 항투불린제, 및 암을 치료하기 위한 기타 작용제, 예를 들어 항-HER-2 항체, 항-CD20 항체, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 길항제 [예: 티로신 키나제 억제제 HER1/EGFR 억제제 (예: 에를로티니브 (erlotinib) (Tarceva™)], 혈소판 유래 성장 인자 억제제 [예: Gleevec™ (이마티니브 메실레이트)], COX-2 억제제 [예: 셀레콕시브 (celecoxib)], 인터페론, 사이토킨, 표적 ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-베타, BlyS, APRIL, BCMA 또는 VEGF 수용체(들), TRAIL/ Apo2, 및 기타 생활성 및 유기 화학제 등 중의 하나 이상과 결합하는 길항제 (예: 중화 항체)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 그의 조합물 역시 본 발명에 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포의 파괴를 유발시키는 물질을 지칭한다. 이 용어에는 방사성 동위원소 (예: I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰ 및 Re¹⁸⁶), 화학요법제, 및 독소, 예를 들어 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 그의 단편이 포함된다.

"화학요법제"는 암을 치료하는 데에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예에는 암을 치료하는 데에 유용한 화학적 화합물이 포함된다. 화학요법제의 예에는 알킬화제, 예를 들어 티오테파 및 CYTOXAN^® 시클로포스파미드; 알킬 설포네이트, 예를 들어 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 예를 들어, 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸롤로멜라민; 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신 [합성 유사체 토포테칸 포함]; 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체 KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님무스틴; 항생제, 예를 들어 엔디인 (enediyne) 항생제 [예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (참고: Agnew, Chem Intl . Ed . Engl. 33: 183-186 (1994)); 디네미신 (디네미신 A 포함); 비스포스포네이트, 예를 들어 클로드로네이트; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색단백질 엔디인 항생제 발색단], 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르루이신, ADRIAMYCIN^® 독소루비신 [모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함], 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 (예: 미토마이신 C), 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사제, 예를 들어 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예를 들어 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물, 예를 들어 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄시노이드, 예를 들어 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK^® 다당류 복합체 (공급처: JHS Natural Products, Eugene, OR); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 TAXOL^® 파클리탁셀 (공급처: Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™ 크레모포르-무함유, 파클리탁셀의 알부민-공학 처리시킨 나노입자 제형 (공급처; American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), 및 TAXOTERE^® 독세탁젤 (공급처: Rhone-Poulenc Rore Antony, France); 클로란부실; GEMZAR^® 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; NAVELBINE^® 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 크셀로다; 이반드로네이트; 이리노테칸 (Camptosar, CPT-11) (이리노테칸과 5-FU 및 류코보린과의 치료 처방 포함); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드 (예: 레티노산); 카페시타빈; 콤브레타스타틴; 류코보린 (LV); 옥살리플라틴 [옥살리플라틴 치료 처방 (FOLFOX) 포함]; PKC-알파, Raf, H-Ras, EGFR [예: 에를로티니브 (Tarceva™)] 및 세포 증식을 저하시키는 VEGF-A의 억제제; 및 상기 언급된 제제의 제약상 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다.

상기 정의에는 또한, 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제시키는 작용을 하는 항호르몬제, 예를 들어 항에스트로겐제 및 선택적 에스트로겐 수용제 조정제 (SERM)가 포함되는데, 예를 들어 타목시펜 (NOLVADEX^® 타목시펜 포함), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 FARESTON·토레미펜; 부신에서의 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, MEGASE^® 메게스트롤 아세테이트, AROMASIN^® 엑세메스탄, 포르메스타니에, 파드로졸, RIVISOR^® 보로졸, FEMARA^® 레트로졸 및 ARIMIDEX^® 아나스트로졸; 및 항안드로겐제, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상한 세포 증식에 밀접한 영향을 미치는 신호 전달 경로에 있어 유전자, 예를 들어 PKC-알파, Raf 및 H-Ras의 발현을 억제시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드; 리보자임, 예를 들어 VEGF 발현 억제제 (예: ANGIOZYME^® 리보자임) 및 HER 발현 억제제; 백신, 예를 들어 유전자 요법 백신, 예를 들면, ALLOVECTIN^® 백신, LEUVECTIN^® 백신 및 VAXID^® 백신; PROLEUKIN^® rIL-2; LURTOTECAN^® 토포이소머라제 1 억제제; ABARELIX^® rmRH; 비노렐빈 및 에스페라미신 [참고: 미국 특허 제4,675,187호], 및 이들의 제약상 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다.

본원에 사용된 경우의 "성장 억제제"는 시험관내 및/또는 생체 내에서 세포의 성장을 억제시키는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 따라서, 성장 억제제는 S 상의 세포 비율을 상당히 저하시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예에는 (S 상 이외의 위치에서) 세포 주기 진행을 차단시키는 작용제, 예를 들어 GI 정지와 M-상 정지를 유도시키는 작용제가 포함된다. 전통적인 M-상 차단제에는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), TAXOL^® 및 토포 II 억제제, 예를 들어 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신이 포함된다. GI를 정지시키는 작용제가 또한 S-상 정지로까지 영향을 미치는데, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예를 들면, 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로르에타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C가 있다. 추가의 정보는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakaini et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especially p. 13].

용어 "사이토킨"은 또 다른 세포 상에서 세포간 매개인자로서 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출된 단백질에 대한 일반적 용어이다. 이러한 사이토킨의 예는 림포카인, 모노카인, 및 전통적 폴리펩티드 호르몬이다. 이러한 사이토킨에 포함되는 것은 특히, 성장 호르몬, 예를 들어 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소의 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예를 들어 난포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 및 황체형성 호르몬 (LH); 표피 성장 인자; 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프롤락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 물레리안 (mullerian)-억제성 물질; 마우스 성선자극호르몬 관련 펩티드; 인히빈; 악티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장 인자, 예를 들어 NGF-알파; 혈소판 성장 인자; 전환 성장 인자 (TGF), 예를 들어 TGF-알파 및 TGF-베타; 인슐린 유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도성 인자; 인터페론, 예를 들어 인터페론-알파, -베타 및 -감마 집락 자극 인자 (CSF), 예를 들어 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터루킨 (IL), 예를 들어 IL-1, IL-1알파, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; 종양 괴사 인자, 예를 들어 TNF-알파 또는 TNF-베타; 및 기타 폴리펩티드 인자 [이에는 LIF 및 kit 리간드 (KL)가 포함된다]이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 사이토킨에는 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질, 및 천연 서열 사이토킨의 생물학적 활성 등가물이 포함된다.

본 출원에 사용된 바와 같은 용어 "프로드럭 (prodrug)"은 모 약물과 비교해서 종양 세포에 대해 덜 세포독성이고 효소적으로 활성화되거나 보다 더 활성인 모 형태로 전환될 수 있는, 제약상 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 지칭한다 [참고: 예를 들어 Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) and Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)]. 본 발명의 프로드럭에는 보다 활성인 세포독성 무함유 약물로 전환될 수 있는, 포스페이트 함유 프로드럭, 티오포스페이트 함유 프로드럭, 설페이트 함유 프로드럭, 펩티드 함유 프로드럭, D-아미노산 변형된 프로드럭, 글리코실화 프로드럭, β-락탐 함유 프로드럭, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드 함유 프로드럭 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드 함유 프로드럭, 5-플루오로시토신, 및 기타 5-플루오로우리딘 프로드럭이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 사용하기 위한 프로드럭 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예에는 상기 언급된 화학요법제가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

"방사선 요법"이란 정상적으로 기능할 수 있거나 함께 세포를 파괴시킬 수 있는 그의 능력을 제한시키도록 세포에 대한 충분한 손상을 유도시키기 위해 지정된 감마선 또는 베타선을 사용하는 것을 의미한다. 투여량과 치료 기간을 결정하는 것으로 당해 분야에 공지된 수 많은 방식이 있을 것이란 사실을 인지해야 할 것이다. 전형적인 치료는 1회 치료로서 제공되며, 전형적인 투여량은 1일 10 내지 200 단위 [그레이 (Gray)]의 범위이다.

"저하 또는 억제시키는" 것은 바람직하게 20％ 이상, 보다 바람직하게 50％ 이상, 가장 바람직하게 75％, 85％, 90％, 95％ 이상의 전반적인 감소를 유발시킬 수 있는 능력을 의미한다. 저하 또는 억제는 치료하고자 하는 장애의 증상, 전이 또는 미세전이의 존재 또는 크기, 원발성 종양의 크기, 잠복기 종양의 존재 또는 크기, 또는 혈관형성 장애에 있어서의 혈관의 크기 또는 수를 지칭할 수 있다.

"안티센스 뉴클레오염기 올리고머"는 길이에 상관없이, 유전자의 mRNA의 암호화 가닥의 적어도 일부에 대해 상보적인 뉴클레오염기 올리고머를 의미한다.

"뉴클레오염기 올리고머"는 연쇄 군에 의해 함께 연결된, 8개 이상의 뉴클레오염기, 바람직하게 12개 이상, 가장 바람직하게 16개 이상의 염기 쇄를 포함하는 화합물을 의미한다. 이러한 정의에는 변형된 및 변형되지 않은 천연 및 비천연 올리고뉴클레오티드 뿐만 아니라 올리고뉴클레오티드 모방체, 예를 들어 단백질 핵산, 고정 (locked) 핵산 및 아라비노핵산이 포함된다. 수 많은 뉴클레오염기 및 연쇄 군이 본 발명의 뉴클레오염기 올리고머에 이용될 수 있는데, 이에는 미국 공개특허공보 제20030114412호 (예를 들어, 이 공보의 문단 27-45 참고) 및 제20030114407호 (예를 들어, 이 공보의 문단 35-52 참고) (본원에 참고로 도입된다)에 기재된 것이 포함된다. 뉴클레오염기 올리고머는 또한, 해독 출발 및 정지 부위를 표적으로 할 수 있다. 특정 실시양태에서, 안티센스 뉴클레오염기 올리고머는 약 8 내지 30개의 뉴클레오티드를 포함한다. 안티센스 뉴클레오염기 올리고머는 VEGF mRNA 또는 DNA에 대해 상보적인 40, 60, 85, 120개 이상의 연속되는 뉴클레오티드를 함유할 수도 있고, 완전한 길이의 mRNA 또는 유전자 만큼 길 수도 있다.

"소분자 RNA"는 길이가 15개 이상 뉴클레오티드, 바람직하게 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 35개 뉴클레오티드이고 심지어 50 또는 100개 이하의 뉴클레오티드인 (그 사이의 모든 정수를 포함한다) 단일 가닥 또는 이중 가닥의 모든 RNA 분자를 의미한다. 특정 실시양태에서, 소분자 RNA는 RNAi를 매개할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "RNAi를 매개하는" 이란 RNA가 RNAi 기구 또는 과정에 의해 분해되어야 하는 것을 구별할 수 있는 능력을 지칭한다. 용어 소분자 RNA 내에는 "소 간섭 RNA" 및 "마이크로RNA"가 포함된다. 일반적으로, 마이크로RNA (miRNA)는 디세르 (Dicer)에 의해 대략 70개 뉴클레오티드 헤어핀 전구체 RNA로부터 프로세싱되는 저분자 (예: 17 내지 26개 뉴클레오티드) 단일 가닥 비암호화 RNA이다. 소 간섭 RNA (siRNA)는 유사한 크기이고 또한 비암호화이지만, siRNA는 고분자 dsRNA로부터 프로세싱되고 통사적으로 이중 가닥이다. siRNA는 또한 단쇄 헤어핀 RNA를 포함할 수 있는데, 여기서 siRNA 이중체의 양 가닥은 단일 RNA 분자 내에 포함된다. 소분자 RNA를 사용하여 양 유형의 RNA를 기술할 수 있다. 이들 용어에는 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 단리된 RNA (부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합적으로 생성된 RNA) 뿐만 아니라 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 천연 발생적 RNA와 상이한 변경된 RNA가 포함된다. 이러한 변경에는 비-뉴클레오티드 물질을 소분자 RNA의 말단(들)에 부가하거나 내부적으로 부가 (RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에 부가)하는 것이 포함될 수 있다. 본 발명의 RNA 분자 내의 뉴클레오티드는 비-표준 뉴클레오티드를 포함할 수 있는데, 이에는 비-천연 발생적 뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드가 포함된다. 핵산 분자에 대한 부가의 변형에 관해서는 상기 "뉴클레오염기 올리고머"를 참고할 수 있다. 한 실시양태에서, RNA 분자는 3' 히드록실기를 함유한다.

용어 "정맥내 주입"은 약물을 대략 5분 초과, 바람직하게 대략 30분 내지 90분의 기간에 걸쳐 동물 또는 인간 환자의 정맥 내로 도입하는 것을 지칭하지만, 본 발명에 따르면, 정맥내 주입은 10시간 이하 동안 투여하기도 한다.

용어 "정맥내 거환" 또는 "정맥내 푸시 (push)"는 약물을 대략 15분 이하 내에, 바람직하게 5분 이하 내에 체내에 투여하는, 동물 또는 인간의 정맥 내로 약물을 투여하는 것을 지칭한다.

용어 "피하 투여"는 약물을 약물 저장소로부터 비교적 느린 지속적 전달에 의해, 동물 또는 인간 환자의 피부 아래, 바람직하게 피부와 기저 조직 사이의 포켓 내에 도입하는 것을 지칭한다. 이러한 포켓은 기저 조직으로부터 벗어나서 피부 위로 핀칭 또는 드로잉함으로써 창출시킬 수 있다.

용어 "피하 주입"은 약물을 소정의 기간 동안, 예를 들어 30분 이하, 또는 90분 이하 동안 약물 저장소로부터 비교적 느린 지속적 전달에 의해, 동물 또는 인간 환자의 피부 아래, 바람직하게 피부와 기저 조직 사이의 포켓 내에 도입하는 것을 지칭한다. 임의로, 이러한 주입은 동물 또는 인간 환자의 피부 아래로 이식된 약물 전달 펌프의 피하 이식에 의해 이루어질 수 있는데, 이러한 펌프는 예정된 양의 약물을 예정된 기간, 예를 들어 30분, 90분, 또는 치료 처방 기간 전반에 걸친 기간 동안 전달시켜 준다.

용어 "피하 거환"은 약물을 동물 또는 인간 환자의 피부 아래로 투여하는 것을 지칭하는데, 거환 약물 전달은 바람직하게 대략 15분 미만, 보다 바람직하게 5분 미만, 가장 바람직하게 60초 미만 내이다. 투여는 바람직하게, 피부와 기저 조직 사이의 포켓 내에서 이루어지고, 포켓은, 예를 들어 기저 조직으로부터 벗어나서 피부 위로 핀칭 또는 드로잉함으로써 창출된다.

본원에 사용된 경우의 용어 "표지"는 폴리펩티드와 직접 또는 간접적으로 접합되는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 그 자체가 검출 가능하거나 (예: 방사선 동위원소 표지 또는 형광성 표지), 또는 효소적 표지의 경우에는 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다.

II . 조기 종양 치료 및 네오아주반트 및 아주반트 요법을 위해 VEGF -특이적 길항제를 사용함

본 발명은 양성, 전암성 또는 비-전이성 종양을 갖는 대상체를 치료하거나; 잠복기 종양 또는 미세전이를 갖는 대상체를 치료하거나; 또는 암이 있는 대상체를 치료하거나 암 발생 위험에 노출된 대상체를 치료하기 위한 VEGF-특이적 길항제의 용도를 특징으로 한다. 예를 들어, VEGF를 억제시키기 위한 두 가지 독립적인 접근 방식, 즉 VEGF-A를 표적으로 하는 모노클로날 항체 (mAb)를 이용한 단일요법 및 VEGF-A의 유전적 결실을 이용하여, 본 발명자들은 초기 내장 선종 형성의 Apc^{min /+} 마우스 모델을 사용하여, VEGF 신호 전달의 억제가 내장 선종 모델에서 장기간 생존 이득을 부여하고 종양 성장 정지에 충분하다는 사실을 입증하였다. 본 발명자들은 또한, VEGF-A를 표적으로 하는 모노클로날 항체 (mAb)를 사용하여, VEGF-A의 억제가 다발성 내분비 신생물 유형 1 (MENl)의 마우스 모델에서 과도한 호르몬 분비를 저하시키고 뇌하수체 선종 성장을 억제시키는 데에 충분하였다는 사실을 입증하였다. 더우기, 본 발명자들은 마우스 췌장 섬 종양 모델 (RIP-TβAg) 및 VEGF-A를 표적으로 하는 모노클로날 항체 (mAb)를 사용하여, VEGF의 억제가 종양 혈관형성의 현저한 저하를 유발시키고, 수술 또는 화학요법제를 이용한 세포감소 후의 요법으로서 사용되는 경우에는 종양의 재증식을 저해시킨다는 사실을 입증하였다. 본 발명은 또한, 네오아주반트 및 아주반트 요법에 있어서의 VEGF 길항제의 용도를 특징으로 한다.

III . VEGF -특이적 길항제

VEGF-특이적 길항제는 VEGF와 결합할 수 있거나; VEGF 발현 수준을 저하시킬 수 있거나; 또는 하나 이상의 VEGF 수용체에 대한 VEGF 결합 및 VEGF 매개된 혈관형성 및 내피 세포 생존 또는 증식을 포함한 VEGF 생물학적 활성을 중화, 차단, 억제, 폐기, 저하 또는 간섭할 수 있는 분자 (펩티딜 및 비-펩티딜)를 지칭한다. 바람직하게, VEGF-특이적 길항제는 VEGF의 발현 수준 또는 생물학적 활성을 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 이상 저하 또는 억제시킨다. 바람직하게, VEGF-특이적 길항제에 의해 억제된 VEGF는 VEGF 이소형 또는 다중 VEGF 이소형, 예를 들어 VEGF (8-109), VEGF (1-109), VEGF₁₆₅, VEGF₁₂₁, VEGF₁₄₅, VEGF₁₈₉, 또는 VEGF₂₀₆이다.

본 발명의 방법에 유용한 VEGF-특이적 길항제에는 VEGF에 특이적으로 결합하는 펩티딜 또는 비-펩티딜 화합물, 예를 들어 항-VEGF 항체 및 그의 항원-결합 단편, VEGF 폴리펩티드의 길항제 변이체, 또는 VEGF에 특이적으로 결합하는 그의 단편, 및 VEGF에 특이적으로 결합함으로써 하나 이상의 수용체와의 결합을 봉쇄시키는 수용체 분자 및 유도체 (예: 가용성 VEGF 수용체 단백질, 또는 그의 VEGF-결합 단편, 또는 키메라 VEGF 수용체 단백질), 융합 단백질 [예: VEGF-트랩 (Regeneron)], 및 VEGF₁₂₁-겔로닌 (gelonin) (Peregrine)이 포함된다. VEGF-특이적 길항제에는 또한, VEGF 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자의 적어도 단편에 대해 상보적인 안티센스 뉴클레오염기 올리고머; VEGF 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자의 적어도 단편에 대해 상보적인 소분자 RNA; VEGF를 표적으로 하는 리보자임; VEGF에 대한 펩티바디; 및 VEGF 아프타머가 포함된다.

A. 항- VEGF 항체

본 발명의 방법에 유용한 항-VEGF 항체에는 VEGF와 충분한 친화도 및 특이성으로 결합하고 VEGF의 생물학적 활성을 저하 또는 억제시킬 수 있는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 포함된다. 항-VEGF 항체는 통상적으로, 기타 VEGF 상동체, 예를 들어 VEGF-B 또는 VEGF-C와는 결합하지 않거나, 또는 기타 성장 인자, 예를 들어 PlGF, PDGF, 또는 bFGF와도 결합하지 않을 것이다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 항-VEGF 항체에는 하이브리도마 ATCC HB 10709에 의해 생성된 모노클로날 항-VEGF 항체 A4.6.1과 동일한 에피토프와 결합하는 모노클로날 항체; 베바시주맵 (BV; Avastin^®)로서 공지된 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 문헌 [참고: Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]에 따라서 생성된 재조합 인간화 항-VEGF 모노클로날 항체가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 베바시주맵은 인간 VEGF가 그의 수용체와 결합하는 것을 차단시키는 뮤린 항-hVEGF 모노클로날 항체 A.4.6.1로부터의 항원-결합 상보성 결정 영역 및 돌연변이된 인간 IgG1 골격 영역을 포함한다. 대부분의 골격 영역을 포함한, 베바시주맵의 아미노산 서열의 대략 93％는 인간 IgG1로부터 유래되고, 상기 서열의 약 7％는 뮤린 항체 A4.6.1로부터 유래된다. 베바시주맵은 분자량이 약 149,000 달톤이고 글리코실화된다. 베바시주맵 및 기타 인간화 항-VEGF 항체는 미국 특허 제6,884,879호 (2005년 2월 26일자로 허여됨)에 추가로 기재되어 있다. 항체의 부가의 예에는 PCT 공개공보 WO2005/012359에 기재된 바와 같은, G6 또는 B20 시리즈 항체 (예: G6-31 또는 B20-4.1)가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 부가의 항체에 관해서는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: 미국 특허 제7,060,269호, 제6,582,959호, 제6,703,020호; 제6,342,219호; 제6,054,297호; WO98/45332; WO 96/30046; WO94/10202; EP 0666868B1; 미국 공개특허공보 제2006009360호, 제20050186208호, 제20030206899호, 제20030190317호, 제20030203409호, 및 제20050112126호; 및 Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)]. 본 발명에 사용될 수 있는 항체의 기타 예에는 잔기 F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, I91, K1O1, E103, 및 C104를 포함하거나 또다른 한편으론, 잔기 F17, Y21, Q22, Y25, D63, I83 및 Q89를 포함하는 인간 VEGF 상의 기능적 에피토프와 결합하는 것이 포함된다.

본 발명에 따르는 G6 시리즈 항체는 PCT 공개공보 WO2005/012359의 도 7, 24-26, 및 34-35 중의 어느 하나에 따르는 G6 항체 또는 G6-유래 항체의 서열로부터 유래되는 항-VEGF 항체이다. 한 실시양태에서, G6 시리즈 항체는 잔기 F17, Y21, Q22, Y25, D63, I83 및 Q89를 포함하는 인간 VEGF 상의 기능적 에피토프와 결합한다.

본 발명에 따르는 B20 시리즈 항체는 PCT 공개공보 WO2005/012359의 도 27-29 중의 어느 하나에 따르는 B20 항체 또는 B20-유래 항체의 서열로부터 유래되는 항-VEGF 항체이다. 한 실시양태에서, B20 시리즈 항체는 잔기 F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, I91, K101, E103, 및 C104를 포함하는 인간 VEGF 상의 기능적 에피토프와 결합한다.

본 발명에 따르는 "기능적 에피토프"는 항체의 결합성에 강력하게 기여하는 항원의 아미노산 잔기를 지칭한다. 이와 같이 강력하게 기여하는 항원 잔기 중의 어느 하나를 돌여변이시키면 (예를 들어, 알라닌에 의한 야생형 VEGF의 돌연변이 또는 동족체 돌연변이) 항체의 결합성이 붕괴되어 항체의 상대적 친화도 비 (IC50돌연변이체 VEGF/IC50야생형 VEGF)는 5 초과일 것이다 [참고: WO2005/012359의 실시예 2]. 한 실시양태에서, 상대적 친화도 비는 ELISA를 디스플레이하는 용액 결합성 파지에 의해 결정한다. 간략하게 설명하면, 96-웰 막시소르프 (Maxisorp) 면역판 (NUNC)을 4℃ 하에 밤새, PBS 중의 2 ㎍/ml의 농도로 시험하고자 하는 항체의 Fab 형태로 피복시키고, 실온 하에 2시간 동안 PBS, 0.5％ BSA, 및 0.05％ 트윈20 (PBT)로 차단시킨다. PBT 중의 hVEGF 알라닌 점 돌연변이체 (잔기 8-109 형태) 또는 야생형 hVEGF (8-109)를 디스플레이하는 파지의 일련의 희석물을 먼저, 실온에서 15분 동안 Fab-피복된 판 상에서 항온 배양하고, 판을 PBS, 0.05％ 트윈20 (PBST)으로 세척한다. 결합한 파지는 PBT 중에서 1:5000으로 희석된 항-M13 모노클로날 항체 서양고추냉이 퍼옥시다제 (공급처: Amersham Pharmacia) 접합체로 검출하고, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB, Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg, MD) 기질로 대략 5분 동안 전개시키며, 1.0 M H3PO4로 급냉시킨 다음, 450 nm 하에 분광광도계로 판독한다. IC50 값 비 (IC50,ala/IC50,wt)는 결합 친화도에 있어서의 감소 배수 (상대적 결합 친화도)를 나타낸다.

B. VEGF 수용체 분자

두 가지 가장 잘 성상 확인된 VEGF 수용체는 VEGFR1 (Flt-1로서 공지되기도 함) 및 VEGFR2 (뮤린 동족체에 대해 KDR 및 FLK-1로서 공지되기도 함)이다. 각 VEGF 계열 구성원에 대한 각 수용체의 특이성은 다양하지만, VEGF-A는 Flt-1과 KDR 둘 다와 결합한다. 완전한 길이의 Flt-1 수용체는 7개의 Ig 도메인을 갖는 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 티로신 키나제 활성을 지닌 세포내 도메인을 포함한다. 세포외 도메인은 VEGF의 결합에 관여하고, 세포내 도메인은 신호 변환에 관여한다.

VEGF에 특이적으로 결합하는 VEGF 수용체 분자, 또는 그의 단편은 본 발명의 방법에 사용하여 VEGF 단백질과 결합하여 이를 봉쇄시킴으로써, 이것이 신호 전달되지 못하도록 할 수 있다. 특정 실시양태에서, VEGF 수용체 분자, 또는 그의 VEGF-결합 단편은 가용성 형태, 예를 들어 sFlt-1이다. 가용성 형태의 수용체는 VEGF와 결합함으로써 이것이 표적 세포의 표면 상에 존재하는 그의 천연 수용체와 결합되지 못하게 하여 VEGF 단백질의 생물학적 활성에 대해 억제 효과를 발휘한다. 또한, VEGF 수용체 융합 단백질이 포함되는데, 그의 예는 다음에 기재되어 있다.

키메라 VEGF 수용체 단백질은 2가지 이상의 상이한 단백질로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 수용체 분자인데, 이중 적어도 하나는 VEGF와 결합하여 그의 생물학적 활성을 억제시킬 수 있는 VEGF 수용체 단백질 (예: flt-1 또는 KDR 수용체)이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 키메라 VEGF 수용체 단백질은 단지 2가지 상이한 VEGF 수용체 분자로부터 유래된 아미노산 서열로 이루어지지만; flt-1 및/또는 KDR 수용체의 세포외 리간드-결합 영역으로부터의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개 모든 Ig-유사 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 기타 무관한 단백질로부터의 아미노산 서열, 예를 들어 면역글로불린 서열과 연결시킬 수 있다. Ig-유사 도메인과 합해지는 기타 아미노산 서열은 당업자에게 용이하게 명백할 것이다. 키메라 VEGF 수용체 단백질의 예에는, 예를 들어 가용성 Flt-1/Fc, KDR/Fc, 또는 FLt-1/KDR/Fc (VEGF 트랩으로서 공지되기도 함)이 포함된다 [참고: 예를 들어, PCT 공개공보 WO97/44453].

본 발명의 가용성 VEGF 수용체 단백질 또는 키메라 VEGF 수용체 단백질에는 막관통 도메인을 통하여 세포의 표면에 고정되지 않는 VEGF 수용체 단백질이 포함된다. 그 자체로, 가용성 형태의 VEGF 수용체 (키메라 수용체 단백질 포함)는 VEGF와 결합하여 그를 불활성화시키면서도, 막관통 도메인을 포함하지 않으므로, 일반적으로 해당 분자가 발현되는 세포의 세포막과 연합되지 않는다.

C. 리보자임

리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매할 수 있는 효소적 RNA 분자이다. 리보자임은 상보적 표적 RNA와의 서열 특이적 혼성화에 이어 세포내 핵산분해적 절단에 의해 작용한다. 잠재적 RNA 표적 내의 특이적 리보자임 절단 부위는 공지된 기술에 의해 확인할 수 있다. 추가의 상세 내역에 관해서는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: 예를 들어, Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994) 및 PCT 공개공보 WO 97/33551]. VEGF 발현을 표적으로 하는 한 가지 예시되는 리보자임은 안지오자임 (Angiozyme™)이다 [참고: 예를 들어, 미국 공개특허공보 제20060035278호].

D. 아프타머

아프타머는 표적 분자, 예를 들어 VEGF 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 3차 구조를 형성하는 핵산 분자이다. 아프타머의 생성 및 치료적 용도는 당해 분야에 널리 정립되어 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제5,475,096호]. VEGF 아프타머는 세포외 VEGF와 결합할 수 있게 만드는 3차원적 입체 형태를 채택하고 있는, 페길화되고 변형된 올리고뉴클레오티드이다. 연령 관련 황반 변성을 치료하기 위해 VEGF를 표적으로 하는 치료적으로 유효한 아프타머의 한 가지 예는 페갑타니브 (pegaptanib) (Macugen™, Eyetech, New York)이다. 아프타머에 관한 부가의 정보는 미국 공개특허공보 제20060148748호를 참고할 수 있다.

E. 펩티바디

펩티바디는 면역글로불린 분자의 단편 또는 일부를 암호화하는 아미노산 서열과 연결된 펩티드 서열이다. 폴리펩티드는 파지 디스플레이 기술을 포함하지만 그에 제한되지 않는, 특이적 결합을 위한 모든 방법에 의해 선별된 무작위화 서열로부터 유래될 수 있다. 한 실시양태에서, 이와 같이 선별된 폴리펩티드는 면역글로불린의 Fc 부분을 암호화하는 아미노산 서열과 연결될 수 있다. VEGF에 특이적으로 결합하여 이를 길항시키는 펩티바디는 또한, 본 발명의 방법에 유용하다.

F. VEGF -특이적 길항 핵산 분자

본 발명의 방법은 또한, 안티센스 뉴클레오염기 올리고머 및 소분자 RNA를 포함한 VEGF-특이적 길항 핵산 분자의 사용을 특징으로 한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 VEGF RNA에 대해 유도된 안티센스 뉴클레오염기 올리고머의 사용을 특징으로 한다. 상보적 핵산 서열 (센스 또는 암호화 가닥)과 결합함으로써, 안티센스 뉴클레오염기 올리고머는 추정상 RNAse H에 의한 RNA 가닥의 효소적 절단을 통해서 단백질 발현을 억제할 수 있다.

본 발명의 방법 및 조성물에 특히 유용한 안티센스 뉴클레오염기 올리고머의 한 예는 모르폴리노 올리고머이다. 모르폴리노를 사용하여 핵산 분자 내의 특이적 서열로의 기타 분자의 접근을 차단시킨다. 이는 리보핵산 (RNA)의 작은 (약 25개 염기) 영역으로의 기타 분자의 접근을 차단시킬 수 있다. 모르폴리노는 종종, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고에 대한 두문자어인 PMO로서 지칭된다.

모르폴리노를 사용하여, 세포가 표적화 단백질을 만들지 못하도록 하거나 프리-mRNA의 스플라이싱을 변형시킴으로써 유전자 기능을 녹다운시킨다. 모르폴리노는 표준 핵산 염기쌍 형성에 의해 RNA의 상보적 서열과 결합하는 합성 분자이다. 모르폴리노가 표준 핵산 염기를 갖고 있긴 하지만, 이들 염기는 데옥시리보스 환 대신 모르폴리노 환과 결합되고, 포스페이트 대신 포스포로디아미데이트 기를 통하여 연결된다. 음이온성 포스페이트를 전하를 띠지 않은 포스포로디아미데이트 기로 대체시키면 통상의 생리적 pH 범위 내에서의 이온화가 제거되므로, 유기체 또는 세포 중의 모르폴리노는 전하를 띠지 않은 분자이다.

모르폴리노는 RNA 내의 표적 서열을 "입체 차단"시키거나 이러한 서열과 결합하여 RNA와 상호 작용할 수도 있는 분자를 차단시킴으로써 작용한다. 모르폴리노는 완전한 비천연 주쇄로 인해 세포성 단백질에 의해 인식되지 못한다. 뉴클레아제는 모르폴리노를 분해하지 않고 모르폴리노는 톨 (toll)-유사 수용체를 활성화시키지 않으므로, 이들은 인터페론 시스템 또는 NF-κB 매개된 염증 반응과 같은 선천 면역 반응을 활성화시키지 못한다. 모르폴리노는 또한, DNA의 메틸화를 변형시키는 것으로 공지되어 있지 않다. 따라서, VEGF의 발현 수준 또는 생물학적 활성을 저하 또는 억제시킬 수 있는 VEGF의 모든 부분에 대해 유도된 모르폴리노가 본 발명의 방법 및 조성물에 특히 유용하다.

본 발명은 또한, VEGF의 발현을 억제시키기 위한 RNA 간섭 (RNAi)의 용도를 특징으로 한다. RNAi는 이중 가닥 RNA (dsRNA)를 도입함으로써 개시된 전사 후 유전자 억제의 특정 형태이다. 일반적으로 "siRNA," "소분자 RNA," 또는 "마이크로RNA"로서 공지된 짧은 15 내지 32개 뉴클레오티드 이중 가닥 RNA는 선충류에서의 유전자 발현 [참고: Zamor et al., Cell 101:25-33] 및 포유류 조직 배양 세포주에서의 유전자 발현 [참고: Elbashir et al., Nature 411:494-498, 2001; 본원에 참고로 도입된다]을 하향 조절하는 데에 유효하다. 포유류에서의 이러한 접근 방식의 추가의 치료적 유효성은 생체내 입증되었다 [참고: McCaffrey e1 al., Nature 418:38-39, 2002]. 소분자 RNA는 길이가 15개 이상 뉴클레오티드, 바람직하게 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개 뉴클레오티드 내지 심지어 50 또는 100개 이하 뉴클레오티드이다 (그 사이의 모든 정수를 포함한다). VEGF의 어떠한 영역과도 실질적으로 동일하거나 이에 상보적인 상기 소분자 RNA가 본 발명의 VEGF-특이적 길항제로서 포함된다.

소분자 RNA의 구체적 요구 사항 및 변형은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 PCT 공개공보 WO01/75164 및 미국 공개특허공보 제20060134787호, 제20050153918호, 제20050058982호, 제20050037988호, 및 제20040203145호 (그의 관련 부분이 본원에 참고로 도입된다)에 기재되어 있다. 특정한 실시양태에서, siRNA는 보다 긴 이중 가닥 RNA를, 예를 들어 dsRNA가 약 17개 내지 약 26개 뉴클레오티드의 RNA 분자로 프로세싱되는 조건 하에 효소 디세르의 존재 하에 프로세싱함으로써 합성 또는 생성시킬 수 있다. siRNA는 또한, 상응하는 DNA 단편 (예: 헤어핀 DNA 구조물)을 발현시킴으로써 생성시킬 수 있다. 일반적으로, siRNA는 특징적인 2- 내지 3-뉴클레오티드 3' 오버행잉 (overhanging) 말단을 갖는데, 바람직하게 이들은 (2'-데옥시) 티미딘 또는 우라실이다. siRNA는 전형적으로, 3' 히드록실기를 포함한다. 몇몇 실시양태에서는, 단일 가닥 siRNA 또는 평활 말단 dsRNA를 사용한다. RNA의 안정성을 추가로 증강시키기 위하여, 3' 오버행을 분해에 대항하여 안정화시킨다. 한 실시양태에서는, 퓨린 뉴클레오티드, 예를 들어 아데노신 또는 구아노신을 포함시킴으로써 RNA를 안정화시킨다. 또 다른 한편, 피리미딘 뉴클레오티드를 변형된 유사체로 치환시키는 것, 예를 들어 우리딘 2-뉴클레오티드 오버행을 (2'-데옥시)티미드로 치환시키는 것이 관용되고 이는 RNAi의 효율에 영향을 미치지 않는다. 2' 히드록실기의 부재는 조직 배양 배지 중의 상기 오버행의 뉴클레아제 저항성을 상당히 증강시켜 준다.

siRNA 분자는 드로소필라 (Drosophila) 시험관내 시스템을 이용하는 재조합 생성 또는 화학적 합성을 포함한 각종 프로토콜을 통하여 수득할 수 있다. 이들은 다음 회사 [예를 들어, Dharmacon Research Inc. 또는 Xeragon Inc.]로부터 시판될 수 있거나 또는 시판용 키트, 예를 들어 Silencer(TM) siRNA 구축 키트 (공급처: Ambion) (카탈로그 번호 1620) 또는 HiScribe™ RNAi 전사 키트 (공급처: New England BioLabs) (카탈로그 번호 E2000S)를 이용하여 합성할 수 있다.

또 다른 한편, siRNA는 RNA의 시험관내 전사를 위한 표준 과정 및 dsRNA 어닐링 과정, 예를 들어 문헌 [참고: Elbashir et al., Genes & Dev. 15:188-200, 2001; Girard et al., Nature 442:199-202 (2006); Aravin et al., Nature 442:203-207 (2006); Grivna et al., Genes Dev . 20:1709-1714 (2006); and Lau et al., Science 313:363-367 (2006)]에 기재된 과정을 이용하여 제조할 수 있다.

문헌 [참고: Yu et al., Proc . Natl . Acad . Sci USA, 99:6047-6052, 2002; or Paddison et al., Genes & Dev, 16:948-958, 2002]에 기재된 바와 같은 작은 헤어핀 RNA (shRNA)를 본 발명의 방법에 사용할 수도 있다. shRNA는 센스 가닥과 안티센스 가닥 둘 다가 단일 RNA 분자 내에 포함되고 뉴클레오티드의 루프에 의해 연결되도록 (3개 이상) 설계한다. shRNA는 상기 및 문헌 [Yu et al., 상기 참고]에 기재된 바와 같은 표준 시험관내 T7 전사 합성을 이용하여 합성 및 정제할 수 있다. shRNA는 또한, 마우스 U6 프로모터 서열을 갖는 발현 벡터 내로 서브클로닝한 다음, 세포 내로 형질감염시키고 shRNA의 생체내 발현을 위해 사용할 수 있다.

dsRNA를 포유류 세포 내로 형질감염 또는 도입하기 위한 각종 방법이 이용 가능하다. 예를 들어, 지질에 의거한 siRNA의 형질감염에 유용한 몇 가지 시판용 형질감염 시약이 있는데, 이에는 TransIT-TKO™ (Mirus, Cat. # MIR 2150), 트랜스메신저 (Transmessenger™) (Qiagen, Cat. # 301525), 올리고펙타민 (Oligofectamine™) 및 리포펙타민 (Lipofectamine™) (Invitrogen, Cat. # MIR 12252-011 및 Cat. #13778-075), siPORT™ (Ambion, Cat. #1631), DharmaFECT™ (Fisher Scientific, Cat. # T-2001-01)이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. siRNA를 형질감염시키기 위한 전기천공에 의거한 방법에 대한 작용제도 또한 시판되고 있는데, 예를 들어 siPORTer™ (Ambion Inc. Cat. # 1629)이다. 미소주사 기술을 사용할 수도 있다. 소분자 RNA는 또한, 세포 내로 도입된 발현 구조물로부터 전사될 수 있는데, 이러한 발현 구조물은 하나 이상의 전사 조절성 서열과 작동적으로 연결된 소분자 RNA를 전사하기 위한 암호화 서열을 포함한다. 경우에 따라, dsRNA 또는 siRNA의 전달을 위해 플라스미드, 벡터 또는 바이러스 벡터를 사용할 수도 있고, 이러한 벡터는 당해 분야에 공지되어 있다. 각 형질감염제에 대한 프로토콜은 제조업자로부터 입수 가능하다.

IV . 치료적 용도

혈관형성에 있어서의 VEGF의 역할에 관한 광범위한 정보에도 불구하고, 양성, 전암성 또는 비-전이성 암에 있어서의 VEGF의 역할, 또는 아주반트 또는 네오아주반트 요법에 있어서의 VEGF의 역할에 관해서는 비교적 공지된 바가 없다. 본 발명자들은 VEGF-특이적 길항제를 양성, 전암성 또는 비-전이성 암을 치료하거나; 잠복기 종양 또는 미세전이를 치료하거나; 종양 재발 또는 재증식을 방지하거나; 또는 암 발생 위험에 노출된 대상체에서 암을 치료 또는 예방하기 위하여 사용할 수 있다는 사실을 밝혀내었다. VEGF-특이적 길항제는 또한, 결정적 외과수술 후 비-전이성 암이 있는 대상체를 치료하기 위한 아주반트 요법; 또는 수술가능한 암이 있는 대상체를 치료하기 위한 네오아주반트 요법에 사용할 수 있는데, 이러한 요법은 대상체에서 수술가능한 암을 외과적으로 제거하기에 앞서 제공된다. 치료적 적용이 요법, 예방, 네오아주반트 요법, 및 아주반트 요법으로 분리되기는 하지만, 당업자는 이들 범주가 반드시 상호 배타적이지 않다는 것을 인지할 것이다.

A. 종양의 분류

용어 암은 증식성 장애를 집합적으로 포괄하는데, 이에는 전암성 성장, 양성 종양, 악성 종양 및 잠복기 종양이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 양성 종양은 여전히 본래의 부위에 국재되고, 원격 부위로 침윤, 침습 또는 전이될 수 있는 능력이 없다. 악성 종양은 이러한 종양 주변의 기타 조직을 침습하여 이를 손상시킬 것이다. 이는 본래의 부위로부터 갈라져서 신체의 다른 부위로 확산될 수 있는 능력 (전이)을 갖고 있을 수 있는데, 통상적으로 혈류를 통해서이거나 림프절이 위치한 림프계를 통하여 이루어진다. 잠복기 종양은 종양 세포가 존재하긴 하지만 임상적으로 종양 진행이 나타나지 않고 있는 휴지기 종양이다.

원발성 종양은 종양이 발생한 조직의 유형에 의해 분류되고; 전이성 종양은 암 세포가 유래되는 조직 유형에 의해 분류된다. 시간이 경과함에 따라, 악성 종양 세포는 보다 비정상적으로 되고 정상 세포의 외형과 다르게 된다. 이러한 암 세포의 외형 상의 변화는 종양 악성도로 지칭되고, 암 세포는 잘 분화된 것 (저 악성도), 중간 수준으로 분화된 것, 불량한 수준으로 분화된 것, 또는 분화되지 않은 것 (고 악성도)으로서 서술된다. 잘 분화된 세포는 이들이 유래된 정상 세포의 외형과 다소 유사하다. 분화되지 않은 세포는 더 이상 세포 기원을 결정하는 것이 불가능할 정도로 비정상적으로 된 세포이다.

암 병기 분류 시스템은 암이 해부학적으로 얼마나 멀리 확산되었고 동일한 병기 군에서 유사한 예후와 치료를 나타내는 환자를 수용하고자 하였다. 암 병기 분류를 도와주기 위한 몇 가지 시험을 수행할 수 있는데, 이에는 생검 및 특정 영상화 시험, 예를 들어 흉부 x-선, 유방 촬영상, 골 스캔, CT 스캔, 및 MRI 스캔이 포함된다. 혈액 시험 및 임상 평가를 또한 사용하여 환자의 전반적인 건강 상태를 평가하고 암이 특정 기관으로 확산되었는지를 검출할 수 있다.

암의 병기를 설정하기 위하여, 암에 관한 미국 합동 위원회는 TNM 분류 시스템을 이용하여 암, 특히 고형 종양을 문자 범주에 제일 먼저 놓아두고 있다. 암은 문자 T (종양 크기), N (촉진할 수 있는 결절) 및/또는 M (전이)으로 지정된다. T1, T2, T3, 및 T4는 원발성 병변의 증가 크기를 기술한다. NO, N1, N2, N3은 점진적으로 진행되는 결절 발병을 표시하고; MO 및 M1은 원격 전이의 부재 또는 존재를 반영한다.

전반적인 병기 분류 또는 로마 숫자 병기로서 공지되기도 한 제2 병기 분류 방법에서는 암을 0기 내지 IV기로 나누었는데, 원발성 병변의 크기 뿐만 아니라 결절 확산 및 원격 전이의 존재 여부를 도입하였다. 이러한 시스템에서는, 증례를 로마 숫자 I 내지 IV로 나타낸 4가지 병기로 분류하거나 "재발"로서 분류한다. 몇몇 암의 경우, 0기 은 "계내" 또는 "Tis"로서 지칭하는데, 예를 들어 유방암의 경우 계내 소엽 암종 또는 계내 관상 암종이다. 고 악성도 선종이 0기 으로서 분류될 수도 있다. 일반적으로, I기 암은 통상적으로 치유 가능한 작은 국한성 암인 반면, IV기 암은 통상적으로 수술 불가능하거나 전이성 암을 나타낸다. II기 및 III 암은 통상적으로, 국소적으로 진행되고/되거나 국소 림프절의 연루를 나타낸다. 일반적으로, 보다 높은 병기 숫자는 보다 광범위한 질병을 표시하는데, 이에는 보다 큰 종양 크기 및/또는 림프절 근처 및/또는 원발성 종양에 인접한 기관까지의 암 확산이 포함된다. 이들 병기는 정확하게 규정되지만, 그 정의는 각 종류의 암에 대해 상이하고 숙련인에게 공지되어 있다.

많은 암 등기소 [예를 들어, NCI's Surveillance, Epidemiology, and End Results Program (SEER)]는 요약 병기 분류를 이용한다. 이 시스템은 모든 유형의 암에 사용된다. 이는 암 증례를 5가지 주요 범주로 분류한다:

계내 암은 암이 시작되는 세포 층에서만 존재하는 초기 암이다.

국한성 암은 확산의 명백한 증거없이, 암이 시작되는 기관으로 제한되는 암이다.

지역 암은 본래의 (원발성) 부위를 벗어나서 림프절 또는 기관 및 조직 근처로까지 확산된 암이다.

원격 암은 원발성 부위로부터 원격 기관 또는 원격 림프절로 확산된 암이다.

공지되지 않은 암은 병기를 표시하기에 충분한 정보가 없는 증례를 서술하기 위해 사용된다.

또한, 원발성 종양이 제거된지 수 개월 또는 수 년 후에 암이 재발되는 것은 흔한 일이다. 가시적인 모든 종양을 박멸시킨 후 재발되는 암은 재발성 질병으로 불리운다. 원발성 종양 부위에서 재발되는 질병은 국소적으로 재발성이고, 전이로서 재발되는 질병은 원격 재발로서 지칭된다. 잠복기 종양은 종양 세포가 존재하긴 하지만 임상적으로 종양 진행이 나타나지 않고 있는 휴지기 상태로 존재하는 종양이다. 미세전이는 전이가 작거나 원발성 종양으로부터 기타 신체 부위로 확산되는 세포 수가 작다. 미세전이는 스크리닝 또는 진단 시험에서 검출될 수 있거나 그렇치 않을 수 있다. 본 발명의 방법은, 예를 들어 잠복기 종양 또는 미세전이가 존재하긴 하지만 임상적으로 검출될 수 있거나 그렇치 않을 수 있는 환경에서 종양의 재발 또는 잠복기 종양 또는 미세전이의 발생을 방지하는 데에 유용하다.

본 발명의 방법은 또한, 양성, 전암성 또는 비-전이성 종양을 포함하지만, 그에 제한되지 않는 조기 암을 치료하는 데에 유용하다. 이에는 모든 0기, I 또는 II 종양; 모든 비-전이성 II기 종양; 전형적으로 암으로 진행 또는 발생되는 모든 질환 (이에는 형성이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다); 및 여전히 본래의 부위에 국한되고 원격 부위로 침윤, 침습 또는 전이되지 않은 모든 종양이 포함된다. 양성, 전암성 또는 비-전이성 종양의 예에는 폴립, 선종, 섬유종, 지방종, 가스트린종, 인슐린종, 연골종, 골종, 혈관종, 림프관종, 수막종, 평활근종, 횡문근종, 편평 세포 유두종, 청신경초종, 신경섬유종, 담관 낭선종, 평활근종, 중피종, 기형종, 점액종, 트라코마, 육아종, 과오종, 이행 세포 유두종, 타액선의 다형성 선종, 인대양 종양, 유피 낭선유두종, 낭선종, 초점성 결절성 과증식, 또는 결절성 재생 과증식이 포함된다.

혈관형성은 원발성 종양 성장과 전이 둘 다에 관여하기 때문에, 본 발명에 의해 제공된 항-혈관형성 치료는 원발성 부위에서의 종양의 신생물 성장을 억제할 수 있을 뿐만 아니라 이차 부위에서의 종양의 전이를 방지하므로, 기타 치료제에 의한 종양의 공격을 허용해준다. 본원에서 치료하고자 하는 암의 예에는 고형 종양과 비-고형 또는 연질 조직 종양 둘 다가 포함된다. 암의 예에는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예에는 편평 세포 암; 폐암 (소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 암종 포함); 복막암, 간세포암, 위암 (위장암 포함); 췌장암; 교모세포종; 자궁경부암; 난소암; 간암; 담낭암; 간세포암; 유방암; 결장암; 결장직장암; 자궁내막 또는 자궁 암종; 타액선 암종; 신장암 또는 신암; 간암; 전립선암; 외음부암; 갑상선암; 간 암종; 및 각종 유형의 두경부암 뿐만 아니라; B-세포 림프종 [저 악성도/소포 비호지킨 림프종 (NHL); 소 림프구성 (SL) NHL; 중간 악성도/소포 NHL; 중간 악성도 확산성 NHL; 고 악성도 면역모세포성 NHL; 고 악성도 림프아구성 NHL; 고 악성도 소 비-절단 세포 NHL; 거대 질환 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련 림프종 및 발덴스트롬 (Waldenstrom) 마크로글로불린혈증 포함]; 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 급성 림프아구성 백혈병 (ALL); 모발 세포 백혈병; 만성 골수아구성 백혈병; 및 이식 후 림프증식성 장애 (PTLD) 뿐만 아니라 모반증 (phakomatoses)과 연관된 비정상적인 혈관 증식, 부종 (예를 들어, 뇌 종양과 연관된 부종), 및 메이그스 (Meigs) 증후군이 포함된다. 보다 특히, 본 발명의 VEGF-특이적 길항제에 의해 치료할 수 있는 암에는 유방암, 결장직장암, 직장암, 비소세포 폐암, 비호지킨 림프종 (NHL), 신 세포암, 전립선암, 간암, 췌장암, 연질 조직 육종, 카포시 육종, 카르시노이드 암종, 두경부암, 뇌 종양, 신경아교종 (예: 역형성 성상세포종, 역형성 희소돌기성상세포종, 역형성 희소돌기아교세포종, 다형성 교모세포종), 흑색종, 난소암, 중피종, 및 다발성 골수종이 포함된다. 보다 바람직하게, 본 발명의 방법은 인간 환자에서 결장직장암을 치료하기 위해 사용된다.

B. 선종

한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 선종으로서 공지된 양성 상피 세포 종양을 치료하는 데에 사용한다. 선종은 선상 기원을 갖는 양성 종양이다. 선종은 전형적으로, 분비를 위해 사용된 상피 세포로부터 유래된다. 상피 세포는 신체 전반에 걸쳐 국재되어 있지만, 이 세포의 일부 만이 분비를 위해 사용된다. 분비를 위해 사용되는 상피 세포는 선 (gland)으로서 지칭된 신체의 특이적 부분을 구성하고 있다. 선은 체내의 수 많은 물질, 예를 들어 땀, 타액, 유즙, 점액 및 호르몬 등을 형성하는 역할을 한다. 선종은 체내의 대부분의 선상 세포로부터 형성될 수 있다.

선종은 악성 또는 암성 종양과 유사한 방식으로 형성될 수 있다. 선종은 양성이므로, 다른 기관이나 조직으로 전이 또는 확산되지 않는다. 대부분의 선종이 양성이긴 하지만, 몇몇 선종은 악성 종양으로 발전할 수 있는데, 이러한 것이 발생하게 되면, 새로운 악성 선종은 선암종으로 지칭된다. 예를 들어, 결장 및 직장암은 선종 또는 폴립으로서 양성이지만, 나중에 선암종으로 발전할 수 있고; 기관지 선종은 폐암으로 발전할 수 있다.

빈번히, 선종은 이것이 발생하는 기관 또는 선 조직에 대한 현저한 효과를 나타낸다. 종종, 선종은 과도한 수준의 호르몬을 분비한다. 이러한 것이 일어나는 경우, 그 효과는 병에 걸린 개체에 대해 다소 불괘할 수 있다. 특정의 상황에서는, 그 효과가 생명에 위협이 될 수 있다. 그러나, 몇몇 선종은 어떠한 입증 가능한 효과없이 발생한다.

여성에게 보다 흔한 특정 유형의 선종이 있는데, 예를 들면 간의 선종이다. 결장 선종과 같은 기타 선종은 연령이 늘어난, 예를 들어 50세 이상 성인에게서 가장 흔하다. 또한, 선종 발생 환자를 예측하는 몇 가지 요인이 있다. 예를 들어, 경구 피임약을 복용하고 있는 여성은 간 선종 발생 위험이 증가할 수 있다. 특정 유형의 선종, 예를 들어 결장 선종은 유전성일 수 있다.

선종과 관련된 증상은 광범위하게 다양하다. 예를 들어, 섬유선종으로 지칭되는 유방 선종은 전형적으로 증상이 없고, 병에 걸린 개체가 그것을 검출할 수 없을 정도로 작을 수 있다. 그러나, 기타 유방 선종은 촉감에 의해서도 인지할 정도로 충분히 클 수 있다. 이와는 달리, 폐 선종은 발열, 오한, 숨참 및 피가 섞인 기침을 유발시킬 수 있다.

선종은 혈액 및 뇨 샘플 수집, 초음파 영상화, 컴퓨터 단층촬영술 (CT) 스캐닝 및 자기 공명 영상화 (MRI)를 포함한 각종 기술을 사용하여 진단한다. 종양이 양성인지 아니면 악성인지를 결정하기 위해 전형적으로 생검을 이용한다. 본 발명의 방법은 선종을 치료하거나, 예를 들어 잠복기 종양 또는 미세전이가 있는 대상체에서 선종 재발을 치료 또는 방지하거나, 또는 선종과 연관된 위험 요인 중의 어느 것을 갖는 대상체에서 선종을 예방하는 데에 특히 유용하다.

C. 위장 종양

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 양성, 전암성, 비-전이성 또는 잠복기 위장 종양, 또는 위장 종양으로부터의 미세전이를 치료하기 위하여 사용된다. 이에는 모든 0기, I 또는 II 종양; 전형적으로 위장암으로 진행 또는 발생되는 모든 종양 또는 질환; 및 여전히 본래의 부위에 국한되고 원격 부위로 침윤, 침습 또는 전이되지 않은 모든 위장 종양이 포함된다. 위장 종양에는 폴립, 선종, 종양, 또는 소화기계, 구체적으로는 식도, 위, 간, 담도 [담낭, 담관, 바터 팽대부 (ampulla of vater)], 내장, 췌장, 결장, 직장 및 항문의 암이다. 이들은 다음에 상세히 기재된다.

(i) 항문암

항문암은 항문관 또는 항문 피부선의 악성 종양이다. 항문암은 종종, 항문 형성이상으로서 시작한다. 항문 형성이상은 비정상적인 변화를 갖긴 하지만, 주변 조직으로 침습되었다는 명백한 증거를 나타내지 않는 항문 세포로 구성된다. 가장 중증 형태의 항문 형성이상은 계내 암종으로 지칭되는데, 여기서 세포는 암 세포와 유사한 외형을 나타내지만, 정상 세포가 놓여있는 곳을 벗어나서 침습되지는 않는다. 시간이 지남에 따라, 항문 형성이상은 결국에는, 세포가 침습성이 되고 신체의 다른 부위로 전이되거나 이탈될 수 있는 능력을 획득하는 수준으로 변하게 된다. 항문 형성이상은 종종 항문 상피내 신생물 (AIN)로서 지칭된다. 항문암이 확산되는 경우에는, 이는 통상적으로 주변 조직으로의 직접적인 침습이나 림프계를 통해서이다. 혈관을 통한 항문암의 확산은 덜 흔하긴 하지만, 일어날 수는 있다.

몇 가지 요인이 항문암과 연관이 있다. 가장 중요하게는, 인간 유두종 바이러스 (HPV) 감염이 항문암과 관계가 있는 것으로 밝혀졌고, 이는 자궁경부암 및 두경부암을 포함한 몇 가지 기타 암과 연관이 있어 왔다. 또 다른 성행위 전염 바이러스인 인간 면역결핍증 바이러스 (HIV)가 항문암과 연관이 있어 왔고, HIV에 감염된 개체는 HPV에 감염될 위험이 높다. 항문암은 항문암으로 진행되기 전에 먼저 항문 형성이상으로서 시작하는 것으로 여겨지기 때문에, AIN 병력이 있는 환자는 항문암 발생 위험이 증가한다. 또한, 양성 항문 질환, 예를 들어 항문 누공, 항문 열창, 항문주위 농양 또는 출혈이 있는 환자에서 항문암 발생 위험이 증가하는 것으로 여겨진다.

본 발명의 방법은 조기 항문암을 치료하거나, 예를 들어 잠복기 종양 또는 미세전이가 있는 대상체에서 항문암 재발을 치료 또는 방지하거나, 또는 항문암과 연관된 위험 요인 중의 어느 것을 갖는 대상체에서 항문암을 예방하는 데에 특히 유용하다.

( ii ) 결장직장 암 및 직장암

결장은 대장으로서 공지되기도 한 대장의 가장 긴 부분이다. 결장암은 서방 세계의 여성과 남성 둘 다에게서 세 번째로 가장 흔한 유형의 암이다. 아프리카계 미국인에게서 가장 많이 발병하는데, 이들은 이 질병으로 인한 사망률도 보다 높다. 결장암 위험은 실질적으로 50세 이후에게서 발생하지만, 매년 젊은 사람에게도 수많은 증례가 보고되고 있다. 일반적으로, 결장암과 직장암은 함께 분류되고 이들과 연관된 동일한 위험 요인을 갖고 있다. 결장암, 폴립, 또는 유전성 결장암 증후군 (예: FAP 및 HNPCC)을 나타내는 개개인 또는 가족력이 있는 개개인 뿐만 아니라 궤양성 결장염 또는 크론병 (Crohn's disease)에 걸린 환자는 모두 위험율이 높고 일반적 집단 보다는 조기 연령에 스크리닝할 필요가 있다. 결장암에 걸린 일촌 친척 (부모, 형제 또는 자식)이 있는 사람은 병에 걸린 친척이 없는 사람과 비교해서 암 발생 가능성이 2 내지 3배 더 높다.

결장암은 임상의에게 공지된 각종 기술을 이용하여 진단할 수 있다. 스크리닝 시험은 조기 결장암 (예: 폴립 또는 선종)을 진단하는 데에 가장 유효한 방법인데, 이는 이들 병기가 종종 어떠한 증상과도 연관이 없기 때문이다. 이는 일반적으로, 폴립이 종양으로 성장함에 따라 출혈이 있거나 결장 유발성 증상이 폐쇄될 수 있다. 이들 증상으로는 직장으로부터 출혈이 있고, 장 운동 후 대변이나 세정액에서 혈액이 보이며, 대변의 외형 변화 (즉, 가늘어짐)와 복부에서의 경련 통증이 나타나고, 장 운동이 필요하지 않은 시점에 장 운동을 해야할 필요성을 느끼는 것이 있다. 간헐적으로 출혈이 있을 수 있는 종양 및 폴립의 경우에는, 대변 잠수 피검사 (FOBT)로 불리우는 검사에 의해 대변 샘플에서 혈액을 검출할 수 있다. FOBT 단독으로는 암의 약 24％ 만을 발견한다. 가요성 S자결장 거울 검사 또는 대장내시경 검사를 사용하여 결장직장암을 진단할 수도 있다.

일반적으로, 결장직장암은 다음과 같이 병기 분류한다:

0기 (계내 암종으로서 지칭되기도 함) - 암은 결장 벽의 최외 부분으로 한정된다.

I기 - 암이 결장 벽의 제2 및 제3 층으로 확산되었지만, 외부 결장 벽이나 그 너머까지는 확산되지 않았다. 이는 듀크스 (Dukes') A 결장암으로 지칭되기도 한다.

II기 - 암이 결장 벽을 통하여 확산되었지만, 림프절 (이는 감염 및 질병과 싸우는 데에 도움을 주는 작은 구조물이다)에는 침습되지 않았다. 이는 듀크스 B 결장암으로 지칭되기도 한다.

III기 - 암이 결장 벽을 통하여 림프절 내로 확산되었지만, 신체의 다른 부위로는 확산되지 않았다. 이는 듀크스 C 결장암으로 지칭되기도 한다.

IV기 - 암이 신체의 다른 부위 (즉, 간 및 폐)로 확산되었다. 이는 듀크스 D 결장암으로 지칭되기도 한다.

본 발명의 방법은 조기 결장직장암을 치료하거나, 예를 들어 잠복기 종양 또는 미세전이가 있는 대상체에서 결장직장암 재발을 치료 또는 방지하거나, 또는 결장직장암과 연관된 위험 요인, 예를 들어 상기 언급된 바와 같은 요인 중의 어느 것을 갖는 대상체에서 결장직장암을 예방하는 데에 특히 유용하다.

( iii ) 식도암

식도는 목구멍과 위를 연결하는 근육관이다. 대다수의 식도암은 식도의 내부 내막 (점막)으로부터 발생하고, 식도의 나머지를 구성하고 있는 근육 또는 연골 세포로부터는 발생하지 않는다. 식도의 내막은 이것이 목구멍으로부터 위로 감에 따라 변화한다는 점에서 다소 독특하다. 상부 (근위) 식도에서는, 식도 내막이 편평 세포로 구성된 목구멍 내막과 유사하다. 따라서, 암이 이 영역에서 발생하게 되면, 이는 통상적으로 편평 세포 암종이다. 하부 (원위) 식도에서는, 보다 통상적인 유형의 암이 선암종으로 지칭된다.

침습성 암 이외에도, 환자는 종종 계내 암종으로 지칭되는 전암성 병변이 있는 것으로 진단된다. 이들 전암성 병변은 편평 세포 암종 또는 선암종이 발생하기에 앞서 관찰될 수 있다. 계내 암종은 식도 내막이 보다 심부 조직 내로의 어떠한 침습도 없이 암성 변화와 유사한 변화를 진행하는 경우에 발생한다. 따라서, 세포 자체는 암과 유사한 성질을 지니고 있긴 하지만, 확산 위험은 없는데, 이는 침습이 전혀 일어나지 않았기 때문이다. 암 자체에 대한 전구체인 것으로 간주되는 또 다른 유형의 병변은 바레트 (Barrett) 식도로 지칭되는데, 이는 다음에 상세히 설명된다.

식도암은 매년 대략 13,500명 미국인에게서 발생하여, 약 12,500명이 사망한다. 진단된 대부분의 환자는 50대 또는 60대이고, 여성 보다는 남성에게서 대략 4배 정도 더 많이 발병한다. 과거에는, 진단된 식도암의 대다수 (약 85％)가 상부 식도에서 발생한 편평 세포암이었다. 이러한 유형의 암에 대한 위험 요인으로는 흡연과 음주가 있다. 둘 다 독립적인 위험 요인인 것으로 여겨지긴 하지만 (흡연이 좀 더 위험하다), 식도암 발생에 대해서는 이들 둘 다가 상승 작용을 일으키는 것으로 보인다. 식도의 편평 세포 암종을 발생시키는 기타 잠재적 발암 물질은 니트로사민, 석면 섬유 및 석유 제품이다.

이는 통상적으로 하부 식도의 선암종에 대한 위험에 노출된 환자군과 대비된다. 선암종은 기존에 편평 세포 암종과 비교해서 덜 흔한 질병이었다. 그러나, 최근에는 편평 세포 암종 보다 훨씬 더 널리 퍼져있다. 선암종은 일반적으로, 식도의 정상적인 내막이 위와 유사한 내막으로 대체되는 상태인 바레트 식도 환경에서 유발되는 것으로 여겨진다. 바레트 식도는 내시경에 의해 진단되는데, 광섬유 카메라를 사용하여 식도 내부를 내려다보고 의심스러운 모든 부위를 생검한다. 바레트 식도는 하부 식도가 위산에 만성적으로 노출됨으로써 유발되는 것으로 여겨진다. 이러한 노출은 환자에게 가슴쓰림, 부어오름, 식욕 상실, 또는 음식물 섭취시 또는 취침 중의 위 통증을 유발시키는 위식도 역류병 (GERD) 환자에서 일어난다. 만성 GERD 환자는 바레트 식도 발생 위험에 노출되므로, 식도 선암종 발생 위험이 더 높다.

바레트 식도가 규정에 의해 식도 내막이 비정상적인 경우에 발생하긴 하지만, 비정상적인 수준은 다양할 수 있다. 이는 형성이상 측면에서 등급화되는데, 이는 바레트 식도가 어떻게 암으로 진행되는지를 결정하기 위해 사용되고 있다. 고 악성도 형성이상을 나타내는 바레트 식도 환자는 3개월마다 내시경으로 검사하거나 실제적으로 치료를 진행해야 하는데, 이는 암으로 진행될 가능성이 높은 전악성 변화인 것으로 간주되기 때문이다. 국소 식도암 또는 형성이상의 증거 자료를 제공하기 위한 가장 민감한 시험은 내시경이다. 내시경을 이용하는 경우에는, 광섬유 카메라를 사용하여 식도 내의 우려되는 부분을 직접 관찰할 수 있고, 비정상 위치, 출혈의 존재 또는 부재, 및 폐쇄 양을 가시화할 수 있다. 식도암의 위치와 정도에 따라서, 후두경 검사 (목구멍에서 바라본다)를 수행해야 하는지 아니면 기관지경술 (기관지와 기도에서 바라본다)을 수행해야 하는지를 결정할 수 있다. 오늘날 주의 기준에는 또한, 내시경 초음파 검사 (EUS)로 지칭되는, 내시경 동안에 초음파를 수행하는 것이 포함된다. CT 스캔, 바륨을 삼키는 검사, x-선 및 기타 보다 통상적인 시험 (혈액 스크리닝 시험 포함)을 전형적으로 수행하여, 암을 적절하게 진단하고 그의 병기를 분류한다.

본 발명의 방법은 조기 식도암을 치료하거나, 예를 들어 잠복기 종양 또는 미세전이가 있는 대상체에서 식도암 재발을 치료 또는 방지하거나, 또는 식도암과 연관된 위험 요인, 예를 들어 상기 언급된 바와 같은 요인 중의 어느 것을 갖는 대상체에서 식도암을 예방하는 데에 특히 유용하다.

( iv ) 담낭암

담낭은 담즙을 저장하고 농축시키는 작은 배 모양의 기관이다. 담낭과 간은 간관에 의해 연결된다. 원발성 담낭암은 미국에서 매년 약 6000명의 성인에게서 발병한다. 이들 암의 대다수가 선암종인데, 이는 현미경으로 보면 종양 세포의 외형에 따라서 유두상, 결절성 및 관상 등의 아유형을 수반한다. 덜 흔한 아유형에는 편평 세포, 반지 세포 (signet ring cell), 및 선편평 (선극세포종)이 포함된다.

담낭암은 노인 환자에서 가장 자주 관찰되는데, 진단되는 평균 연령은 62 내지 66세이다. 이는 여성에게서 보다 자주 발생하는데, 여성 대 남성 비가 약 3:1이다.

담낭암의 원인은 공지되어 있지 않지만, 담석, 고 에스트르겐 수준, 흡연, 알코올, 비만 및 여성이란 점과 연관이 있어 왔다. 또한, 염증성 장 질병 [궤양성 결장염 및 크론병] 환자에서는 간외 담도암 발생 확률이 10배 정도 더 높다.

일반적으로, 담낭암은 일반적인 간담즙성 질환을 시사하는 혈액 중의 각종 물질의 비정상적인 수준을 알아보기 위하여 간 기능 패널 및 대사 화학을 포함하는 실험실 연구 및 병력과 신체 검사를 통하여 진단한다. 이들 몇몇 물질의 뇨 수준을 평가하기 위해 또한 뇨검사를 통상적으로 수행한다. 부가의 기술, 예를 들어 초음파, MRI, 담관조영술, 및 CT 스캔을 사용할 수도 있다.

본 발명의 방법은 조기 담낭암을 치료하거나, 예를 들어 잠복기 종양 또는 미세전이가 있는 대상체에서 담낭암 재발을 치료 또는 방지하거나, 또는 담낭암과 연관된 위험 요인, 예를 들어 상기 언급된 바와 같은 요인 중의 어느 것을 갖는 대상체에서 담낭암을 예방하는 데에 특히 유용하다.

(v) 위암

위암의 위의 암이다. 미국에서는, 위암이 현재 14번째로 가장 흔한 암으로서 분류된다. 40세 이전 연령층에서는 위암을 발견하는 것이 드물고, 그 이후의 연령층에서 위암 발생률이 증가한다.

위암의 90％ 이상이 위의 내막으로부터 유발된다. 이러한 내막은 선을 갖고 있기 때문에, 이로부터 유래되는 암은 선종으로 지칭되거나, 또는 보다 진행된 형태에 대해서는 선암종으로 지칭된다. 위에서 유발될 수 있는 기타 암 (림프 조직으로부터의 림프종, 근육 조직으로부터의 평활근육종, 선을 수반하지 않는 내막으로부터의 편평 세포 암종)이 있긴 하지만, 대다수가 선암종이다.

위암을 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori) 감염증과 연계하여 연구를 수행하기도 하였다. 에이치. 필로리 (H. pylori)는 위궤양 및 만성 위축성 위염과 연관이 있는데, 이는 에이치. 필로리에 감염된 환자에서 위암 발병률이 높은 사실을 설명해줄 수 있다. 그러나. 위암 발생에 있어서의 에이치. 필로리의 정확한 역할은 여전히 명확치 않다.

각종 시험을 이용하여 위암을 정확하게 확인하는데, 이에는 이중-대비 바륨 방사선촬영 (소위 "상부 GI" 또는 "바륨 삼키기") 및 상부 내시경이 포함된다. CT 스캔, PET 스캔, 및 복강경을 포함한 기타 시술을 위암 진단에 사용한다.

본 발명의 방법은 조기 위암을 치료하거나, 예를 들어 잠복기 종양 또는 미세전이가 있는 대상체에서 위암 재발을 치료 또는 방지하거나, 또는 위암과 연관된 위험 요인, 예를 들어 상기 언급된 바와 같은 요인 중의 어느 것을 갖는 대상체에서 위암을 예방하는 데에 특히 유용하다.

( vi ) 간암

수 많은 양성 간 종양이 있다. 혈관종은 간의 가장 흔한 양성 종양이고, 양성의 혈액 충만 종양이 간 내에서 형성되는 경우에 발생한다. 기타 양성 종양에는 선종 및 초점성 결절성 과증식이 포함된다. 이들 종양이 주변 조직으로 침습 또는 전이되지 않지만, 방사선촬영 영상화시 양성 종양과 악성 종양 간의 차이를 언급하기가 곤란한 경우가 종종 있다.

간세포로부터 유발되는 암인 간세포 암종 (HCC)는 가장 흔한 유형의 원발성 간암이고 모든 간암의 약 70％를 차지한다. 간 내의 담관으로부터 유발되는 암은 담관암종으로서 공지되어 있고 모든 간암의 10 내지 20％를 나타낸다. 이들 암은 간 내의 담관으로부터 유발되거나 (간내 담관암종으로서 공지된다) 또는 이들이 간으로부터 누출됨에 따라 담관 내에서 유래된다 (간외 담관암종으로서 공지된다). 기타 유형의 희귀암이 간 내에서 발생할 수 있다. 이에는 혈관육종 (악성의 혈관 충만 종양) 및 간모세포종 (극히 어린 아이에게서 발생하는 희귀암)이 포함된다.

간암과 연관되는 수 많은 위험 요인이 있다. 미국에서, 간암에 대한 가장 흔한 위험 요인은 간경변이다. C형 간염 바이러스 (HCV)에 의한 만성 감염증이 또한 미국에서 간암의 흔한 원인이다. 전세계적으로, B형 간염 바이러스 (HBV)에 의한 만성 감염증 및 아플라톡신 (aflatoxin) B1 식품 오염 등의 기타 위험 요인이 보다 흔하다.

간암을 검출하기 위해 사용되고 있는 몇 가지 스크리닝 시험이 있다. 한 가지 가능한 스크리닝 시험은 알파-태아단백질 (AFP)의 혈액 수준을 검출하는 것을 포함한다. AFP는 태아 혈액에서 높은 수준으로 발견되지만, 정상적으로는 출생 후에 소멸되는 단백질이다. AFP 수준은 HCC의 존재 하에 증가하고 간암 발생의 마커일 수 있다. 간암 발생 위험이 높은 몇몇 환자는 통상적으로 AFP 수준에 관하여 시험하긴 하지만, 모든 간암이 혈액 중에 높은 수준의 AFP를 생성시키지 않으며, 대부분의 환자가 높은 수준의 AFP를 갖는 것으로 밝혀진 시점에서는 종양이 이미 상당히 진행되었다. 기타 혈액 단백질을 간암에 대한 스크리닝 도구로서 잠재적으로 사용할 수 있다. 몇 가지 연구 결과, 데스-감마-카복시 프로트롬빈 (DCP) 및 렌스 쿨리나리스 (Lens culinaris) 응집소-반응성 분획 (AFP-L3) 등의 단백질이 간암 형성 마커로서 사용될 수도 있다는 사실을 밝혀내었지만, 실제적으로 이들은 드물게 사용된다.

또한, 간암이 의심되는 경우에는, 초음파, CT 스캔, MRI, 혈관조영술, 플루오로데옥시글루코스-양전자 방출 단층 촬영술 (FDG-PET), 생검 및 예비적 개복술을 수행하여 간암을 추가로 진단하고 병기를 분류할 수 있다.

본 발명의 방법은 조기 간암을 치료하거나, 예를 들어 잠복기 종양 또는 미세전이가 있는 대상체에서 간암 재발을 치료 또는 방지하거나, 또는 간암과 연관된 위험 요인, 예를 들어 상기 언급된 바와 같은 요인 중의 어느 것을 갖는 대상체에서 간암을 예방하는 데에 특히 유용하다.

( vii ) 췌장암

췌장은 위와 척추 사이 복부 내에 깊이 위치한, 길이가 대략 6 인치인 배 모양의 선이다. 이는 3가지 부분으로 지칭된다: 가장 넓은 부분은 두부로 지칭되고, 중간 부분은 몸체이며 얇은 말단은 미부로 지칭된다. 췌장은 혈당치 조절에 도움을 주는 인슐린을 포함한 호르몬과, 음식물 소화를 위해 장에 의해 사용되는 효소를 만드는 데에 책임이 있다. 이들 효소는 총담관 내로 비워진, 췌장 내의 관을 통하여 수송되는데, 이는 효소를 장 내로 운반시켜 준다. 췌장암 발병률은 60세에서 80세 연령층에서 가장 높고, 40세 이하에서는 거의 드물다. 여성과 남성에게서 동등한 수준으로 관찰되지만, 여성 발병률이 최근 수 년간 상승하였는데, 이는 여성의 흡연율이 높아지기 때문일 수 있다. 흡연자는 췌장암 발생률이 2 내지 3배 더 높은 것으로 예상된다. 부모 또는 형제가 췌장암에 걸렸으면, 그 위험율은 세배가 된다. 유방암 또는 결장암 가족력도 그 위험을 증가시킨다. 이와 같은 위험율 증가는 암을 유발시키는 유전자 상의 유전된 돌연변이 때문이다. 췌장암의 실제 원인은 공지되어 있지 않지만, 유전적인 유전자 변화와 환경상 노출에 의해 유발된 변화의 조합에 따른 결과인 것으로 여겨진다.

의사가 환자에게 췌장암이 발생할 수도 있다고 추정하면, 초음파, CT 스캔 및 내시경을 이용하여 암을 진단하고 병기를 분류할 수 있다. 몇몇 췌장암 환자는 탄수화물 항원 19-9 (CA 19-9) 수치가 상승할 수 있다. 수치가 상승된 환자에게는, 기타 시험과 연계해서 진단을 확증하고 치료 동안 상기 질병을 모니터링하는 것이 유용하다. 암이 안정적인지 아니면 악화되는지를 알아보기 위하여, 치료 동안에 상기 수치를 주기적으로 검사할 수 있다.

본 발명의 방법은 조기 췌장암을 치료하거나, 예를 들어 잠복기 종양 또는 미세전이가 있는 대상체에서 췌장암 재발을 치료 또는 방지하거나, 또는 췌장암과 연관된 위험 요인, 예를 들어 상기 언급된 바와 같은 요인 중의 어느 것을 갖는 대상체에서 췌장암을 예방하는 데에 특히 유용하다.

( viii ) 소장암

소장으로서 공지되기도 한 작은 장은 결장으로 지칭되는 대장과 위를 연결시켜 주는 소화관의 일부이다. 소장에는 세 가지 별개의 부분이 있다: 1) 십이지장, 2) 공장 및 3) 회장. 놀랍게도, 소장은 나머지 소화관과 비교해서 그 길이가 굉장히 김에도 불구하고, 소장암은 극히 드물다. 이에는 장에서 시작하는 암 또는 또 다른 신체 부위로부터 장으로 확산되는 암이 포함된다. 구체적으로 언급하면, 소장암은 모든 장 암의 5％ 미만이고, 미국에서 진단된 모든 암의 약 0.5％를 차지한다.

대부분의 소장암의 원인은 공지되어 있지 않다. 그러나, 몇몇 가능한 위험 요인은 소장암 발생 기회를 증가시킬 수 있다. 그의 몇몇 예에는 크론병, 비열대 스프루병 (celiac sprue disease), 포이츠-예거 (Peutz-Jegher) 증후군 및 내장 폴립증이 포함된다.

현미경으로 관찰한 외형과 기원 세포에 따라서 4가지 주요 유형의 소장암이 있다. 선암종은 가장 흔한 유형이다. 이는 전형적으로, 장의 내막 또는 내층에서 시작하고, 통상적으로 십이지장에서 발생한다. 또 다른 유형은 육종이고, 그의 전형적인 아유형은 평활근육종인데, 이는 소장의 근육 벽에서 시작하여 통상적으로 회장에서 발생한다. 세 번째 유형은 카르시노이드인데, 이는 소장의 특수 호르몬-제조 세포에서 시작하고, 통상적으로 회장에서 발생하는데, 종종 부속기 (대장의 제1 부분이다)에서 발생한다. 네 번째 유형은 림프종인데, 이는 소장의 림프 조직에서 시작하여 통상적으로 공장에서 발생한다. 림프종의 가장 전형적인 아유형은 비호지킨 (non-Hodgkin) 림프종이다. 소장암의 특이한 아유형은 위장 간질 종양인데, 이는 소장의 세 가지 부분 모두에서 발생할 수 있다.

소장암은 통상적으로, 완전한 병력, 신체 검사 및 대변 샘플, 내시경 또는 대장내시경 검사, 바륨 C-선, CT 스캔, 초음파 또는 기타 x-선을 사용하여 진단한다.

본 발명의 방법은 조기 소장암을 치료하거나, 예를 들어 잠복기 종양 또는 미세전이가 있는 대상체에서 소장암 재발을 치료 또는 방지하거나, 또는 소장암과 연관된 위험 요인, 예를 들어 상기 언급된 바와 같은 요인 중의 어느 것을 갖는 대상체에서 소장암을 예방하는 데에 특히 유용하다.

V. 예방

본 발명의 추가 측면에서, 본 발명자들은 VEGF-특이적 길항제가 양성, 전암성 또는 조기암을 치료하거나, 또는 종양 재발을 치료 또는 방지하기 위해 사용될 수 있다는 사실을 밝혀내었다. 본 발명의 방법을 사용하여 암 자체를 치료할 수 있거나, 또는 암이 전이성 또는 침습성 단계 또는 고 악성도 또는 병기로 진행되는 것을 방지할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법을 사용하여 0기 암 또는 폴립을 수반한 대상체를 치료하여 I기 또는 보다 높은 병기 종양으로 진행되는 것을 방지할 수 있다. 유사하게, II기 암 환자에서는, 본 발명의 방법을 사용하여 암이 III기 또는 IV기 암으로 진행되는 것을 방지할 수 있다.

VEGF-특이적 길항제를 사용하여 종양의 재발을 방지할 수도 있다. 예를 들어, 종양을 확인하고 치료한 경우 (예를 들어, 화학요법을 이용하거나 외과적으로 제거함), VEGF-특이적 길항제를 사용하여 결장직장 종양의 재발을 국소적으로 방지하거나 결장직장 종양의 전이를 방지할 수 있다. 종양의 재발 방지를 위해, VEGF-특이적 길항제를 사용하여, 예를 들어 잠복기 종양 또는 미세전이를 치료하거나 또는 잠복기 종양 또는 미세전이의 성장 또는 재증식을 방지할 수 있는데, 이는 임상적으로 검출할 수 있거나 그렇지 않을 수 있다.

본 발명자들은 또한, VEGF-특이적 길항제를 암에 걸린 적이 없는 대상체 또는 암 발생 위험에 노출된 대상체에서 암을 예방하기 위해 사용할 수 있다는 사실을 밝혀내었다. 암과 연관된 것으로 공지된 각종 위험 요인이 있고, 이들 중의 많은 것이 상기 언급되어 있다. 예시되는 위험 요인에는 연령 증가 (즉, 50세 이상), 암 가족력, HPV, HIV, HBV 및 HCV에 의한 바이러스 감염증, 경구 피임약 복용, 경화증, 궤양성 결장염, 바레트 식도, 에이치. 필로리 감염증, 및 폴립 또는 형성이상의 존재가 포함된다. 또한, 유전적 암 증후군을 나타내는 것으로 공지된 대상체가 암 발생 위험에 노출된 것으로 간주된다. 이러한 증후군의 비제한적 예에는 APC, HNPCC, 가드너 증후군, 및 MEN1이 포함된다. 암 발생에 대한 부가의 위험 요인은 임상 평가시 결정할 수 있고, 이에는 호르몬 또는 혈액 단백질, 예를 들어 PSA (전립선암), CA-125 (난소암), AFP (간암), DCP (간암), 및 CA 19-9 (췌장암)의 수준 상승이 포함된다.

VI . 네오아주반트 요법

본 발명은 환자에게 (예를 들어, 이러한 환자가 종양 및/또는 암이 있는 것으로 진단된 경우에) 유효량의 VEGF-특이적 길항제, 예를 들어 VEGF 항체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체, 예를 들어 인간 환자에서 수술가능한 암을 외과적으로 제거하기에 앞서 네오아주반트 요법을 수행하는 방법을 제공한다. 임의로, VEGF-특이적 길항제는 한 가지 이상의 화학요법제와 병용해서 투여한다. 암 재발을 방지하기 위하여 수술 후 유효량의 VEGF-특이적 길항제를 대상체에게 투여하는 부가의 단계를 또한, 본원에 기재된 네오아주반트 요법과 함께 이용할 수 있다. 수술 후 유효량의 VEGF-특이적 길항제를 대상체에게 투여하는 부가의 단계를 포함하는 방법의 경우에는, 본원에 기재된 어떠한 아주반트 방법도 사용할 수 있다.

예를 들어, 한 가지 방법에는 a) 각 주기가 대상체에게 유효량의 VEGF-특이적 길항제 (예: 베바시주맵)를, 임의로 한 가지 이상의 화학요법제와 예정된 간격으로 투여하는 것을 포함하는, 복수 개의 치료 주기를 포함하는 제1 단계; b) 결정적 외과수술을 수행함으로써 암을 제거시키는 단계; 및 임의로, c) 각 주기가 대상체에게 유효량의 VEGF-특이적 길항제 (예: 베바시주맵)를 예정된 간격으로 화학요법제를 수반하거나 수반하지 않으면서 투여하는 것을 포함하는, 복수 개의 유지 주기를 포함하는 제2 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 것을 포함한다.

네오아주반트 요법의 경우, VEGF-특이적 길항제는 종양 중의 암 세포의 수를 감소시키고/시키거나 (예를 들어, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 100％ 이상 감소시킴); 종양의 크기를 감소시키고/시키거나 (예를 들어, 절제를 허용하기 위함); 종양 존재량을 감소시키고/시키거나; 암 세포가 말초 기관 내로 침윤되는 것을 억제하고/하거나 (즉, 어느 정도 감소시키고/시키거나 중지시킨다); 종양 중의 혈관 밀도를 감소시키고/시키거나; 종양 전이를 억제하고/하거나; 종양 성장 또는 종양 세포 증식을 저하 또는 억제하고/하거나; 잠복기 종양의 성장을 저하 또는 방지하고/하거나; 미세전이의 성장 또는 증식을 저하 또는 방지하고/하거나; 양성, 전암성 또는 비-전이성 종양에 대해 감수성이거나 이로 진단된 대상체의 DFS 또는 OS를 증가 또는 연장시키고/시키거나; 암과 연관된 한 가지 이상의 증상을 어느 정도 경감시키기 위한 양 또는 시간 동안 (예를 들어, 시간 경과에 따른 특정한 치료 처방 동안) 투여할 수 있다.

한 예에서, 네오아주반트 요법은 DFS 또는 OS를 연장시키기 위해 투여하는데, 이러한 DFS 또는 OS는 항체의 초기 투여 후 약 2 내지 5년째에 평가한다. 특정 실시양태에서, 대상체의 DFS 또는 OS는 치료 개시 후 또는 초기 진단 후 약 3 내지 5년, 약 4 내지 5년, 또는 약 4년 이상, 또는 약 5년 이상째에 평가한다. 전형적으로, VEGF-특이적 길항제는 VEGF 항체 (예: 베바시주맵)이다.

또 다른 예에서, 항체 및/또는 화학요법의 투여는 화학요법 (예: 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀) 만으로 치료된 대상체와 비교해서, 대상체 집단에게서 질병 재발 (원발성 기관에서의 암 재발 및/또는 원격 재발)을 3년차에 약 50％ (여기서, "약 50％"는 약 45％ 내지 약 70％의 범위를 포함한다) 저하시킬 수 있는데, 예를 들어 원발성 기관에서의 재발을 3년차에 약 52％ 저하시키고/시키거나 원격 재발을 3년차에 약 53％ 저하시킬 수 있다.

VEGF-특이적 길항제, 예를 들어 VEGF 항체는 공지된 방법에 따라서, 예를 들어 정맥내 투여, 예를 들면 거환으로서 또는 소정의 시간에 걸친 연속적 주입, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 수막강내, 경구, 국부 또는 흡입 경로에 의해 대상체, 예를 들어 인간 환자에게 투여한다. 항체를 정맥내 투여하는 것이 바람직하다.

VEGF-특이적 길항제, 예를 들어 VEGF 항체를 단일 작용제로서 투여할 수 있지만, 환자는 임의로, VEGF 항체를 한 가지 이상의 화학요법제(들)과 병용해서 치료한다. 한 실시양태에서, 화학요법제 중의 적어도 하나는 탁소이드이다. 병용 투여에는 별개의 제형 또는 단일 제약 제형을 사용하여 공동-투여 또는 동시에 투여하는 것과, 어느 한 순서로 연속적으로 투여하는 것이 포함되는데, 바람직하게는 양 (또는 모든) 활성제가 그들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 기간이 있다. 따라서, 화학요법제는 VEGF-특이적 길항제, 예를 들어 VEGF 항체를 투여하기에 앞서, 또는 투여 후에 투여할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 화학요법제를 1회 이상 투여하는 것과 VEGF-특이적 길항제, 예를 들어 VEGF 항체를 1회 이상 투여하는 것 사이의 시한은 바람직하게 대략 1개월 이하, 가장 바람직하게 대략 2주 이하이다. 또 다른 한편, 화학요법제와 VEGF-특이적 길항제, 예를 들어 VEGF 항체는 환자에게 단일 제형 또는 별개의 제형으로 동시에 투여한다. 화학요법제 (예: 탁소이드)를 VEGF 항체 (예: 베바시주맵)와 병용해서 치료하면 환자에게 상승적, 또는 부가적 이상의 치료 이득을 가져다줄 수 있다.

화학요법제는 투여할 경우, 이에 대해 공지된 투여량으로 통상 투여하거나, 또는 임의로는 약물의 복합 작용 또는 항대사제 화학요법제의 투여에 기인한 음성 부작용 때문에 투여량을 감소시켜 투여한다. 이러한 화학요법제에 대한 투여 스케줄 및 제조는 제조업자의 지시에 따라서 사용할 수 있거나 또는 전문 실시자에 의해 임상적으로 결정된 바와 같이 사용할 수 있다. 화학요법제가 파클리탁셀인 경우, 바람직하게 이는 매주 투여하거나 (예: 80 mg/㎡) 3주마다 투여한다 (예: 175 mg/㎡ 또는 135 mg/㎡). 적합한 도세탁셀 투여량에는 60 mg/㎡, 70 mg/㎡, 75 mg/㎡, 100 mg/㎡ (3주마다); 또는 35 mg/㎡ 또는 40 mg/㎡ (매주)이 포함된다.

병용될 수 있는 각종 화학요법제가 상기 언급되어 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, VEGF-특이적 길항제, 예를 들어 VEGF 항체와 병용될 화학요법제에는, 예를 들어 탁소이드 (도세탁셀 및 파클리탁셀 포함), 빈카 (예를 들어, 비노렐빈 또는 빈블라스틴), 백금 화합물 (예를 들어, 카보플라틴 또는 시스플라틴), 아로마타제 억제제 (예를 들어, 레트로졸, 아나스트라졸 또는 엑세메스탄), 항에스트로겐제 (예: 풀베스트란트 또는 타목시펜), 에토포시드, 티오테파, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 리포솜성 독소루비신, 페길화 리포솜성 독소루비신, 카페시타빈, 젬시타빈, COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕시브), 또는 프로테오솜 억제제 (예: PS342)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

안트라사이클린 (예: 독소루비신 또는 에피루비신)을 대상체에게 투여하는 경우, 바람직하게 이는 VEGF-특이적 길항제 (예: 베바시주맵)의 투여에 앞서 및/또는 투여 후에 제공한다. 그러나, 심장 독성이 저하된 변형된 안트라사이클린, 예를 들어 리포솜성 독소루비신 [TLC D-99 (MYOCET^®)], 페길화 리포솜성 독소루비신 (CAELYX^®), 또는 에피루비신 (epirubicin)을 VEGF-특이적 길항제 (예: 베바시주맵)와 병용할 수 있다.

투여 스케줄의 한 실시양태에서, 본 발명의 네오아주반트 요법은 VEGF-특이적 길항제 (예: 베바시주맵)와 한 가지 이상의 화학요법제를 복수 개의 네오아주반트 주기로 환자에게 투여한 다음, 종양을 결정적으로 제거하기 위한 수술을 수행하는 제1 단계를 포함한다. 각 네오아주반트 주기는 특정한 치료 계획에 따라서 1 내지 3주로 이루어진다. 예를 들어, 치료 주기는 3주일 수 있는데, 이는 환자에게 1회분의 화학요법과 1회분의 베바시주맵을 3주마다 투여하는 것을 의미한다. 치료 주기는 2주일 수도 있는데, 이는 환자에게 1회분의 화학요법과 1회분의 베바시주맵을 격주로 투여하는 것을 의미한다. 네오아주반트 치료의 전체 제1 단계는 약 4 내지 8주기 동안 지속될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 네오아주반트 요법은 수술에 앞서 1년 미만 동안 지속되고, 한 실시양태에서는 수술에 앞서 6개월 미만 동안 지속된다. 질병의 유형과 중증도에 따라서, VEGF-특이적 길항제 (예: 베바시주맵)에 대한 바람직한 투여량은 약 1 ㎍/kg 내지 약 50 mg/kg, 가장 바람직하게 약 5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg, 예를 들어 7.5 mg/kg 또는 10 mg/kg 등이다. 몇몇 측면에서, 화학요법 처방은 전통적인 고 용량 간헐적 투여를 포함한다. 몇몇 기타 측면에서, 화학요법제는 예정된 중단없이 보다 적은 용량을 보다 자주 투여한다 ["메트로노믹 (metronomic) 화학요법"]. 본 발명의 요법의 진행 과정은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링한다.

VEGF 항체 및 화학요법제 이외에도, 기타 치료 처방을 그와 병용할 수 있다. 예를 들어, 제2 (제3, 제4 등) 화학요법제(들)를 투여할 수 있는데, 이러한 제2 화학요법제는 또 다른 상이한 탁소이드 화학요법제이거나, 또는 탁소이드가 아닌 화학요법제이다. 예를 들어, 제2 화학요법제는 탁소이드 (예: 파클리탁셀 또는 도세탁셀), 빈카 (예: 비노렐빈), 백금 화합물 (예: 시스플라틴 또는 카보플라틴), 항호르몬제 (예: 아로마타제 억제제 또는 항에스트로겐제), 젬시타빈, 카페시타빈 등일 수 있다. 예시되는 병용물에는 탁소이드/백금 화합물, 젬시타빈/탁소이드, 젬시타빈/비노렐빈, 비노렐빈/탁소이드, 카페시타빈/탁소이드 등이 포함된다. 상이한 화학요법제의 "칵테일"을 투여할 수 있다.

VEGF 항체와 병용될 수 있는 기타 치료제에는 다음 중의 하나 이상이 포함된다: 또 다른 VEGF 길항제 또는 VEGF 수용체 길항제, 예를 들어 제2의 항-VEGF 항체, VEGF 변이체, 가용성 VEGF 수용체 단편, VEGF 또는 VEGFR을 차단시킬 수 있는 아프타머, 중화 항-VEGFR 항체, VEGFR 티로신 키나제의 억제제 및 그의 모든 조합물. 본 발명의 항체와의 병용 종양 요법에 유용한 기타 치료제에는 종양 성장에 관여하는 기타 인자, 예를 들어 EGFR, ErbB2 (Her2로서 공지되기도 함), ErbB3, ErbB4, 또는 TNF의 길항제가 포함된다. 한 가지 예시 실시양태에서, VEGF-특이적 길항제에 대한 조성물은 항-ErbB2 항체, 또는 그의 단편 또는 유도체 (예: Herceptin^® 항체)를 포함하지 않는다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 하나 이상의 티로신 키나제 수용체, 예를 들어 VEGF 수용체, FGF 수용체, EGF 수용체 및 PDGF 수용체를 표적으로 하는 소분자 수용체 티로신 키나제 억제제 (RTKI)와 병용해서 사용할 수 있다. 수 많은 치료적 소분자 RTKI가 당해 분야에 공지되어 있는데, 이에는 바탈라니브 (vatalanib) (PTK787), 에를로티니브 (erlotinib) (TARCEVA^®), OSI-7904, ZD6474 (ZACTIMA^®), ZD6126 (ANG453), ZD1839, 수니티니브 (sunitinib) (SUTENT^®), 세막사니브 (semaxanib) (SU5416), AMG706, AGO13736, 이마티니브 (Imatinib) (GLEEVEC^®), MLN-518, CEP-701, PKC-412, 라파티니브 (Lapatinib) (GSK572016), VELCADE^®, AZD2171, 소라페니브 (sorafenib) (NEXAVAR^®), XL880, 및 CHIR-265가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.

상기 공동-투여 작용제 모두에 대한 적합한 투여량은 현재 사용되고 있는 투여량이고, 상기 작용제와 VEGF 항체의 복합 작용 (상승 작용) 때문에 낮출 수 있다.

상기 치료 처방 이외에도, 환자에게 방사선 요법을 수행할 수 있다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 투여된 VEGF 항체는 본래의 노출된 항체이다. 그러나, VEGF 항체는 세포독성제와 접합시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 접합된 항체 및/또는 이와 결합되는 항원은 세포에 의해 내재화되어, 이와 결합되는 암 세포를 사멸시키는 데에 있어서 접합체의 치료 효능을 증가시켜 준다. 한 실시양태에서, 세포독성제는 암 세포 중의 핵산을 표적으로 하거나 이를 방해한다. 이러한 세포독성제의 예에는 마이탄시노이드, 칼리케아미신, 리보뉴클레아제 및 DNA 엔도뉴클레아제가 포함된다.

VII . 아주반트 요법

본 발명은 결정적 외과수술 후, 비-전이성 암이 있는 대상체에게 VEGF-특이적 길항제, 예를 들어 VEGF 항체를 투여하는 것을 포함하는 아주반트 요법의 방법을 제공한다.

예를 들어, 방법은 다음 단계: a) 각 주기가 대상체에게 유효량의 VEGF-특이적 길항제 (예: 베바시주맵)를, 임의로 한 가지 이상의 화학요법제와 예정된 간격으로 투여하는 것을 포함하는, 복수 개의 치료 주기를 포함하는 제1 단계; 및 b) 각 주기가 대상체에게 유효량의 VEGF-특이적 길항제 (예: 베바시주맵)를 예정된 간격으로 어떠한 화학요법제도 수반하지 않으면서 투여하는 것을 포함하는, 복수 개의 유지 주기를 포함하는 제2 단계를 포함할 수 있는데, 합한 제1 단계와 제2 단계는 초기 수술후 치료 후 1년 이상 동안 지속된다. 한 실시양태에서, 제1 단계는 VEGF-특이적 길항제 (예: 베바시주맵)와 제1 화학요법 처방을 투여하는 제1 복수 개의 치료 주기에 이어 VEGF-특이적 길항제 (예: 베바시주맵)와 제2 화학요법 처방을 투여하는 제2 복수 개의 치료 주기를 포함한다.

아주반트 요법의 경우, VEGF-특이적 길항제는 종양 중의 암 세포의 수를 감소시키고/시키거나 (예를 들어, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 100％ 이상 감소시킴); 종양의 크기를 감소시키고/시키거나; 종양 존재량을 감소시키고/시키거나; 암 세포가 말초 기관 내로 침윤되는 것을 억제하고/하거나 (즉, 어느 정도 감소시키고/시키거나 중지시킨다); 종양 중의 혈관 밀도를 감소시키고/시키거나; 종양 전이를 억제하고/하거나; 종양 성장 또는 종양 세포 증식을 저하 또는 억제하고/하거나; 잠복기 종양의 성장을 저하 또는 방지하고/하거나; 미세전이의 성장 또는 증식을 저하 또는 방지하고/하거나; 치료 또는 제거 후에 종양의 재증식을 저하 또는 방지하고/하거나; 암과 연관된 한 가지 이상의 증상을 어느 정도 경감시키기 위한 양 또는 시간 동안 (예를 들어, 시간 경과에 따른 특정한 치료 처방 동안) 투여할 수 있다. 몇몇 부가의 실시양태에서, VEGF-특이적 길항제는 대상체에서 암의 발생 또는 재발을 방지하기 위해 사용할 수 있다. 한 예에서, 암 재발 방지는 약 4년 후에 대상체 집단에서 평가하여, 집단의 약 80％ 이상에게서 질병 재발이 발생하지 않았다는 것을 확인한다. 또 다른 예에서는, 질병 재발 방지를 약 3년째에 평가하는데, 여기서는 질병 재발이 화학요법 만으로 치료된 대상체와 비교해서 약 50％ 이상 정도 감소된다.

VEGF-특이적 길항제는 일반적으로, 대상체가 수술로부터 회복된 기간 후에 투여한다. 이러한 기간에는 상처 치유 또는 외과적 절개를 치유하는 데에 요구되는 기간, 상처 열개 위험을 저하시키는 데에 요구되는 기간, 또는 대상체가 수술 이전의 건강한 수준과 본질적으로 유사하거나 이 보다 우수한 건강 수준으로 회복하는 데에 요구되는 기간이 포함된다. 결정적 외과수술의 완료와 VEGF-특이적 길항제의 제1 투여 사이의 기간에는 또한, 약물 면제에 필요한 기간이 포함될 수 있는데, 대상체는 치료 처방 사이에 소정의 기간을 요구하거나 요청한다. 일반적으로, 결정적 외과수술의 완료와 VEGF-특이적 길항제 요법의 개시 사이의 기간에는 1주 미만, 1주, 2주, 3주, 4주 (28일), 5주, 6주, 7주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 2년, 3년 이상이 포함될 수 있다. 한 실시양태에서, 결정적 외과수술과 VEGF-특이적 길항제 투여 사이의 기간은 2주 초과 1년 미만이다.

한 예에서, VEGF-특이적 길항제, 예를 들어 VEGF 항체는 질병이 없는 생존율 (DFS) 또는 전반적인 생존율 (OS)을 연장시키는 데에 유효한 양으로 투여하는데, 이러한 DFS 또는 OS는 항체의 초기 투여 후 약 2 내지 5년째에 평가한다. 특정 실시양태에서, 대상체의 DFS 또는 OS는 치료 개시 후 또는 초기 진단 후 약 3 내지 5년, 약 4 내지 5년, 또는 약 4년 이상, 또는 약 5년 이상째에 평가한다.

VEGF-특이적 길항제, 예를 들어 VEGF 항체는 공지된 방법에 따라서, 예를 들어 정맥내 투여, 예를 들면 거환으로서 또는 소정의 시간에 걸친 연속적 주입, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 수막강내, 경구, 국부 또는 흡입 경로에 의해 대상체, 예를 들어 인간 환자에게 투여한다. 항체를 정맥내 투여하는 것이 바람직하다.

VEGF-특이적 길항제를 단일 작용제로서 투여할 수 있다. 기타 실시양태에서는, 환자를 VEGF-특이적 길항제와 한 가지 이상의 화학요법제(들)의 병용물로 치료한다. 몇몇 실시양태에서, 화학요법제 중의 적어도 하나는 탁소이드이다. 병용 투여에는 별개의 제형 또는 단일 제약 제형을 사용하여 공동-투여 또는 동시에 투여하는 것과, 어느 한 순서로 연속적으로 투여하는 것이 포함되는데, 임의로 양 (또는 모든) 활성제가 그들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 기간이 있다. 따라서, 화학요법제는 VEGF-특이적 길항제, 예를 들어 VEGF 항체를 투여하기에 앞서, 또는 투여 후에 투여할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 화학요법제를 1회 이상 투여하는 것과 VEGF-특이적 길항제, 예를 들어 VEGF 항체를 1회 이상 투여하는 것 사이의 시한은 바람직하게 대략 1개월 이하, 가장 바람직하게 대략 2주 이하이다. 또 다른 한편, 화학요법제와 VEGF 항체는 환자에게 단일 제형 또는 별개의 제형으로 동시에 투여한다. 화학요법제 (예: 탁소이드)를 VEGF 항체 (예: 베바시주맵)와 병용해서 치료하면 환자에게 상승적, 또는 부가적 이상의 치료 이득을 가져다줄 수 있다.

화학요법제는 투여할 경우, 이에 대해 공지된 투여량으로 통상 투여하거나, 또는 임의로는 약물의 복합 작용 또는 항대사제 화학요법제의 투여에 기인한 음성 부작용 때문에 투여량을 감소시켜 투여한다. 이러한 화학요법제에 대한 투여 스케줄 및 제조는 제조업자의 지시에 따라서 사용할 수 있거나 또는 전문 실시자에 의해 실험적으로 결정된 바와 같이 사용할 수 있다. 화학요법제가 파클리탁셀인 경우, 바람직하게 이는 매주 투여하거나 (예: 80 mg/㎡) 3주마다 투여한다 (예: 175 mg/㎡ 또는 135 mg/㎡). 적합한 도세탁셀 투여량에는 60 mg/㎡, 70 mg/㎡, 75 mg/㎡, 100 mg/㎡ (3주마다); 또는 35 mg/㎡ 또는 40 mg/㎡ (매주)이 포함된다.

병용될 수 있는 각종 화학요법제가 상기 언급되어 있다. VEGF 항체와 병용될 화학요법제의 예에는, 예를 들어 탁소이드 (도세탁셀 및 파클리탁셀 포함), 빈카 (예를 들어, 비노렐빈 또는 빈블라스틴), 백금 화합물 (예를 들어, 카보플라틴 또는 시스플라틴), 아로마타제 억제제 (예를 들어, 레트로졸, 아나스트라졸 또는 엑세메스탄), 항에스트로겐제 (예: 풀베스트란트 또는 타목시펜), 에토포시드, 티오테파, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 리포솜성 독소루비신, 페길화 리포솜성 독소루비신, 카페시타빈, 젬시타빈, COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕시브), 또는 프로테오솜 억제제 (예: PS342)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

안트라사이클린 (예: 독소루비신 또는 에피루비신)을 대상체에게 투여하는 경우, 바람직하게 이는 VEGF-항체의 투여에 앞서 및/또는 투여 후에 제공하는데, 예를 들어 다음 실시예에 기재되는 프로토콜에서는 안트라사이클린/시클로포스파미드 병용물을 대상체에게 수술 후에 투여하지만, VEGF 항체와 탁소이드의 투여 이전에 투여한다. 그러나, 심장 독성이 저하된 변형된 안트라사이클린, 예를 들어 리포솜성 독소루비신 [TLC D-99 (MYOCET^®)], 페길화 리포솜성 독소루비신 (CAELYX^®), 또는 에피루비신을 VEGF 항체와 병용할 수 있다.

한 가지 투여 스케줄에서, 본 발명의 아주반트 요법은 VEGF-특이적 길항제, 예를 들어 VEGF 항체와 한 가지 이상의 화학요법제를 복수 개의 치료 주기로 환자에게 투여하는 제1 단계; 및 VEGF-특이적 길항제, 예를 들어 VEGF 항체를 복수 개의 유지 주기에서 단일 작용제로서 사용하는 제2 단계를 포함한다. 각 치료 주기는 특정한 치료 계획에 따라서 1 내지 3주로 이루어진다. 예를 들어, 치료 주기에는 VEGF-특이적 길항제로서의 베바시주맵이 포함될 수 있고 3주일 수 있는데, 이는 환자에게 1회분의 화학요법과 1회분의 베바시주맵을 3주마다 투여하는 것을 의미한다. 치료 주기는 2주일 수도 있는데, 이는 환자에게 1회분의 화학요법과 1회분의 베바시주맵을 격주로 투여하는 것을 의미한다. 치료의 전체 제1 단계는 약 4 내지 8주기 동안 지속될 수 있다. 제2의 유지 단계 동안에는, 특정한 주기 길이에 따라서 총 약 30 내지 50주기 동안 베바시주맵을 2주 또는 3주마다 투여한다. 특정 실시양태에서, 아주반트 요법은 치료 개시로부터 1년 이상 동안 지속되고, 이 기간 후에 대상체의 진행 상태를 추적할 것이다. 질병의 유형과 중증도에 따라서, VEGF 항체에 대한 바람직한 투여량은 약 1 ㎍/kg 내지 약 50 mg/kg, 가장 바람직하게 약 5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg, 예를 들어 7.5 mg/kg 또는 10 mg/kg 등이다. 몇몇 측면에서, 화학요법 처방은 전통적인 고 용량 간헐적 투여를 포함한다. 몇몇 기타 측면에서, 화학요법제는 예정된 중단없이 보다 적은 용량을 보다 자주 투여한다 ["메트로노믹 화학요법"]. 본 발명의 요법의 진행 과정은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링한다.

항체와 화학요법의 투여는 화학요법 (예: 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀) 만으로 치료된 대상체와 비교해서, 대상체 집단에게서 질병 재발 (원발성 기관에서의 암 재발 및/또는 원격 재발) 가능성을 3년차에 약 50％ (여기서, "약 50％"는 약 45％ 내지 약 70％의 범위를 포함한다) 저하시킬 수 있는데, 예를 들어 원발성 기관에서의 재발을 3년차에 약 52％ 저하시키고/시키거나 원격 재발을 3년차에 약 53％ 저하시킬 수 있다.

본 발명은 결정적 외과수술 후, 유효량의 VEGF-특이적 길항제, 예를 들어 VEGF 항체와 한 가지 이상의 화학요법제를 비-전이성 암이 있는 인간 대상체에게 투여하는 단계; 및 이러한 대상체를 4년 이상 후에 평가하여 대상체의 약 80％ 이상 (바람직하게 약 85％ 이상)에게서 약 4년 후에 질병 재발이 발생하지 않았다는 것을 확인하는 단계를 포함하는, 상기 비-전이성 암이 있는 인간 대상체 집단에게서 비-전이성 암을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 집단은 3000명 이상의 인간 대상체를 포함할 수 있다.

본 발명은 추가로, 결정적 외과수술 후, 유효량의 베바시주맵과 한 가지 이상의 화학요법제를 비-전이성 암이 있는 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 비-전이성 암이 있는 인간 대상체 집단에게서 질병 재발 가능성을 저하시키는 방법에 관한 것인데, 이러한 질병 재발 가능성은 탁소이드 단독으로 치료한 대상체와 비교해서 3년차에 약 50％ 이상 저하된다.

VEGF 항체 및 화학요법제 이외에도, 기타 치료 처방을 그와 병용할 수 있다. 예를 들어, 제2 (제3, 제4 등) 화학요법제(들)를 투여할 수 있는데, 이러한 제2 화학요법제는 또 다른 상이한 탁소이드 화학요법제이거나, 또는 탁소이드가 아닌 화학요법제이다. 예를 들어, 제2 화학요법제는 탁소이드 (예: 파클리탁셀 또는 도세탁셀), 빈카 (예: 비노렐빈), 백금 화합물 (예: 시스플라틴 또는 카보플라틴), 항호르몬제 (예: 아로마타제 억제제 또는 항에스트로겐제), 젬시타빈, 카페시타빈 등일 수 있다. 예시되는 병용물에는 탁소이드/백금 화합물, 젬시타빈/탁소이드, 젬시타빈/비노렐빈, 비노렐빈/탁소이드, 카페시타빈/탁소이드 등이 포함된다. 상이한 화학요법제의 "칵테일"을 투여할 수 있다.

VEGF 항체와 병용될 수 있는 기타 치료제에는 다음 중의 하나 이상이 포함된다: 또 다른 VEGF 길항제 또는 VEGF 수용체 길항제, 예를 들어 제2의 항-VEGF 항체, VEGF 변이체, 가용성 VEGF 수용체 단편, VEGF 또는 VEGFR을 차단시킬 수 있는 아프타머, 중화 항-VEGFR 항체, VEGFR 티로신 키나제의 억제제 및 그의 모든 조합물. 본 발명의 항체와의 병용 종양 요법에 유용한 기타 치료제에는 종양 성장에 관여하는 기타 인자, 예를 들어 EGFR, ErbB2 (Her2로서 공지되기도 함), ErbB3, ErbB4, 또는 TNF의 길항제가 포함된다. 한 가지 예시 실시양태에서, VEGF-특이적 길항제에 대한 조성물은 항-ErbB2 항체, 또는 그의 단편 또는 유도체 (예: Herceptin^® 항체)를 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 하나 이상의 티로신 키나제 수용체, 예를 들어 VEGF 수용체, FGF 수용체, EGF 수용체 및 PDGF 수용체를 표적으로 하는 소분자 수용체 티로신 키나제 억제제 (RTKI)와 병용해서 사용할 수 있다. 수 많은 치료적 소분자 RTKI가 당해 분야에 공지되어 있는데, 이에는 바탈라니브 (PTK787), 에를로티니브 (TARCEVA^®), OSI-7904, ZD6474 (ZACTIMA^®), ZD6126 (ANG453), ZD1839, 수니티니브 (SUTENT^®), 세막사니브 (SU5416), AMG706, AGO13736, 이마티니브 (GLEEVEC^®), MLN-518, CEP-701, PKC-412, 라파티니브 (GSK572016), VELCADE^®, AZD2171, 소라페니브 (NEXAVAR^®), XL880, 및 CHIR-265가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.

상기 공동-투여 작용제 모두에 대한 적합한 투여량은 현재 사용되고 있는 투여량이고, 상기 작용제와 VEGF 항체의 복합 작용 (상승 작용) 때문에 낮출 수 있다.

상기 치료 처방 이외에도, 환자에게 방사선 요법을 수행할 수 있다.

특정의 실시양태에서, 투여된 VEGF 항체는 본래의 노출된 항체이다. 그러나, VEGF 항체는 세포독성제와 접합시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 접합된 항체 및/또는 이와 결합되는 항원은 세포에 의해 내재화되어, 이와 결합되는 암 세포를 사멸시키는 데에 있어서 접합체의 치료 효능을 증가시켜 준다. 한 실시양태에서, 세포독성제는 암 세포 중의 핵산을 표적으로 하거나 이를 방해한다. 이러한 세포독성제의 예에는 마이탄시노이드, 칼리케아미신, 리보뉴클레아제 및 DNA 엔도뉴클레아제가 포함된다.

VIII . 투여량, 제형 및 기간

VEGF-특이적 길항제 조성물은 우수한 의료 행위에 부합되는 방식으로 제형화, 투약 및 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려해야 하는 요인에는 치료하고자 하는 특정한 장애, 치료하고자 하는 특정한 대상체, 개개 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의사에게 공지된 기타 요인들이 포함된다. 투여하고자 하는 VEGF-특이적 길항제의 "치료적 유효량"은 이러한 고려 사항에 의해 좌우될 것이며, 이는 예를 들어, 네오아주반트 또는 아주반트 요법에서, 양성, 전암성 또는 조기 암을 예방, 개선, 치료 또는 안정화시키거나; 또는 종양, 잠복기 종양 또는 미세전이의 발생 또는 재발을 치료 또는 방지하는 데에 필요한 최소량이다. VEGF-특이적 길항제를, 암을 예방 또는 치료거나 또는 암 발생 위험을 예방하기 위해 현재 사용되고 있는 한 가지 이상의 작용제와 함께 반드시 제형화할 필요는 없지만, 임의로 제형화한다. 이러한 기타 작용제의 유효량은 제형 내에 존재하는 VEGF-특이적 길항제의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 기타 요인들에 의해 좌우된다. 이들은 일반적으로, 지금까지 사용된 바와 동일한 투여량과 투여 경로로 사용되거나, 또는 지금까지 이용된 투여량의 약 1 내지 99％이다.

질병의 유형과 중증도에 따라서, 1회 이상의 별도 투여이든지 아니면 연속적인 주입이든지 간에, VEGF-특이적 길항제 약 1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg (예: 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg)이 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 요인들에 따라서 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 특히 바람직한 투여량에는, 예를 들어 7.5 mg/kg, 10 mg/kg 및 15 mg/kg이 포함된다. 수 일에 걸쳐 반복 투여하는 경우에는 질환에 따라서, 상기 언급되거나 당해 분야에 공지되어 있는 방법에 의해 결정된 바와 같이, 암이 치료될 때까지 치료를 지속한다. 그러나, 기타 투여량 처방도 유용할 수 있다. 한 예에서, VEGF-특이적 길항제가 항체인 경우, 본 발명의 항체는 매주, 2주 마다, 또는 3주 마다 1회씩 약 5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg의 용량 범위, 예를 들어 7.5 mg/kg 또는 10 mg/kg 등의 용량으로 투여한다. 본 발명의 요법의 진행 과정은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링한다.

한 예에서, 베바시주맵은 VEGF-특이적 길항제이다. 베바시주맵은 4 ml 또는 16 ml의 베바시주맵 (25 mg/ml)를 전달하기 위해 100 mg 및 400 mg 방부제 무함유 1회용 바이알에서 치료적으로 사용하기 위해 공급된다. 100 mg 생성물은 240 mg α,α-트레할로스 수화물, 23.2 mg 인산나트륨 (1가, 일수화물), 4.8 mg 인산나트륨 (2가, 무수), 1.6 mg 폴리솔베이트 20, 및 주사용수, USP에서 제형화한다. 400 mg 생성물은 960 mg α,α-트레할로스 수화물, 92.8 mg 인산나트륨 (1가, 일수화물), 19.2 mg 인산나트륨 (2가, 무수), 6.4 mg 폴리솔베이트 20, 및 주사용수, USP에서 제형화한다.

요법 기간은 의학적으로 적응되는 한 장기간 지속하거나 목적하는 치료 효과 (예를 들어, 본원에 기재된 치료 효과)가 달성될 때까지 지속한다. 특정 실시양태에서, VEGF-특이적 길항제 요법은 2개월, 4개월, 6개월, 8개월, 10개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 또는 대상체의 수명까지 수 년 동안 지속한다.

일반적으로, 양성, 전암성 또는 조기 암의 경감 또는 치료, 또는 암 (양성 또는 악성)의 아주반트 또는 네오아주반트 요법은 암과 연관된 한 가지 이상의 증상 또는 의학적 문제를 경감시키는 것을 포함한다. 치료적 유효량의 약물은 다음 중의 한 가지 또는 조합해서 달성할 수 있다: 종양 중의 암 세포의 수를 감소시키고/시키거나 (예를 들어, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 100％ 이상 감소시킴); 종양의 크기를 감소시키고/시키거나; 종양 존재량을 감소시키고/시키거나; 암 세포가 말초 기관 내로 침윤되는 것을 억제하고/하거나 (즉, 어느 정도 감소시키고/시키거나 중지시킨다); 종양 중의 혈관 밀도를 감소시키고/시키거나; 종양 전이를 억제하고/하거나; 종양 성장 또는 종양 세포 증식을 저하 또는 억제하고/하거나; 잠복기 종양의 성장을 저하 또는 방지하고/하거나; 미세전이의 성장 또는 증식을 저하 또는 방지하고/하거나; (예를 들어, 아주반트 요법에서) 치료 또는 제거 후 종양의 재증식을 저하 또는 방지하고/하거나; 양성, 전암성 또는 비-전이성 종양, 또는 악성 종양에 대해 감수성이거나 이로 진단된 대상체의 DFS 또는 OS를 증가 또는 연장시키고/시키거나; (예를 들어, 네오아주반트 요법에서) 수술을 허용하기 위해 종양의 크기를 감소시키고/시키거나; 암과 연관된 한 가지 이상의 증상을 어느 정도 경감시킨다. 몇몇 부가의 실시양태에서, VEGF-특이적 길항제는 대상체에서 암의 발생 또는 재발을 방지하기 위해 사용될 수 있다. 한 예에서, 암 재발 방지는 약 4년 후에 대상체 집단에서 평가하여, 질병 재발이 집단의 약 80％ 이상에서 발생하지 않았다는 것을 확인한다. 또 다른 예에서, 질병 재발 방지는 약 3년째에 평가하는데, 질병 재발은 화학요법 만으로 치료된 대상체와 비교해서 약 50％ 이상 감소된다.

한 예에서, VEGF-특이적 길항제, 예를 들어 VEGF 항체는 DFS 또는 OS를 연장시키는 데에 유효한 양으로 투여하는데, 이러한 DFS 또는 OS는 항체의 초기 투여 후 약 2 내지 5년째에 평가한다. 특정 실시양태에서, 대상체의 DFS 또는 OS는 치료 개시 후 또는 초기 진단 후 약 3 내지 5년, 약 4 내지 5년, 또는 약 4년 이상, 또는 약 5년 이상째에 평가한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 양성, 전암성 또는 비-전이성 종양에 대해 감수성이거나 이로 진단된 대상체의 생존 기간을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 생존 기간은 약물의 처음 투여로부터 사망까지의 시간으로서 정의된다. 생존 기간은 또한, 치료군 대 대조군의 층상 위험 비 (HR)에 의해 측정될 수 있는데, 이는 치료 기간 동안 환자에 대한 사망 위험을 나타낸다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 치료법은 각종 항암 요법을 이용하여 치료받고 있는, 암에 대해 감수성이거나 이로 진단된 대상체, 예를 들어 인간 환자군에게서 반응 속도를 상당히 증가시켜 준다. 반응 속도는 해당 치료에 반응하는 치료받은 환자의 비율로서 정의된다. 한 측면에서, VEGF-특이적 길항제와 수술, 방사선 요법, 또는 한 가지 이상의 화학요법제를 사용하는 본 발명의 병용 치료는 수술, 방사선 요법 또는 화학요법 만으로 치료한 군과 비교해서, 병용 치료받은 환자군에서 반응 속도를 상당히 증가시켜 주는데, 이러한 증가는 0.005 미만의 카이 제곱 p-값을 갖는다.

종양, 잠복기 종양 또는 미세전이의 발생 또는 재발을 치료 또는 방지하는 것은 일반적으로 초기 치료 또는 종양을 제거한 후 (예를 들어, 수술, 화학요법 또는 방사선 요법 등의 항암 요법을 사용한다), 종양 또는 전이 형성을 방지하는 것을 포함한다. 수술은 "혈관형성 프로그램"을 재활성화시키고 보다 지수적 종양 성장을 촉진시킬 수 있는 잠재력을 지닌 잔류성 종양 세포 또는 잠복기 미세전이성 결절을 남겨둘 수 있다. 잠복기 종양 또는 미세전이의 존재가 임상적 측정이나 스크린을 이용하여 반드시 검출 가능하지 않더라도, 치료적 유효량은 임상의에게 공지된 기술을 사용하여 잠복기 종양, 미세전이, 전이 또는 종양 재발의 검출를 방지하거나 저하시키기에 충분한 양이다. 한 예에서, 종양을 외과적으로 제거함으로써 종양을 치료하고자 하는 대상체는 VEGF-특이적 길항제로 처리하고, 시간 경과에 따라 잠복기 종양, 미세전이 또는 종양 재발의 검출를 위해 모니터링한다. VEGF-특이적 길항제는 또 다른 항암 요법과 병용해서 (예를 들어, VEGF-특이적 길항제에 앞서, 동시에 또는 후에) 투여할 수 있고, 한 가지 요법 또는 둘 다의 요법을 유지 요법으로서 지속할 수 있다.

암을 치료하는 데에 있어서의 치료적 효능에 관한 부가의 측정은 미국 공개특허공보 제20050186208호에 기재되어 있다.

치료적 제형은 목적하는 순도를 지닌 활성 성분을 임의의 생리상 허용 가능한 담체, 부형 또는 안정화제와 혼합함으로써 당해 분야에 공지된 표준 방법을 이용하여 제조한다 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences (20^th edition), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA]. 허용 가능한 담체에는 식염수, 또는 완충제, 예를 들어 인산염, 시트레이트 및 기타 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산; 저분자량 (약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 당 알코올, 예를 들어 만니톨 또는 솔비톨; 염 형성 반대-이온, 예를 들어 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 PEG가 포함된다.

임의로, 그러나 바람직하게, 제형은 제약상 허용 가능한 염, 전형적으로 예를 들어, 바람직하게 약 생리적 농도 하의 염화나트륨을 함유한다. 임의로, 본 발명의 제형은 제약상 허용 가능한 방부제를 함유할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 방부제 농도는 0.1 내지 2.0 v/v％의 범위이다. 적합한 방부제에는 제약 분야에 공지된 것이 포함된다. 벤질 알코올, 페놀, m-크레솔, 메틸파라벤 및 프로필파라벤이 방부제의 예이다. 임의로, 본 발명의 제형은 제약상 허용 가능한 계면 활성제를 0.005 내지 0.02％의 농도로 포함할 수 있다.

본원의 제형은 치료하고자 하는 특정한 적응증에 대해 필요한 만큼의 한 가지 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에게 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 지닌 한 가지 이상의 활성 화합물을 함유할 수도 있다. 이러한 분자는 의도한 목적에 유효한 양으로 병용해서 존재하는 것이 적합하다.

활성 성분을, 예를 들어 액적형성 (coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 미소캡슐, 예를 들면, 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 미소캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미소캡슐; 콜로이드상 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구, 마이크로에멀션, 나노-입자 및 나노-캡슐); 또는 매크로에멀션 내에 포착시킬 수도 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기 참고]에 기재되어 있다.

지속 방출 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예에는 본 발명의 항체를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되는데, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 미소캡슐 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 [예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)], 폴리락티드 [참고: 미국 특허 제3,773,919호], L-글루탐산과 γ에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산 등의 중합체가 분자를 100일에 걸쳐 방출시킬 수 있긴 하지만, 특정 히드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출시킨다. 피막화 항체가 체내에 장기간 동안 잔존하는 경우, 이들은 37℃하 수분에 대한 노출에 따른 결과로서 변성되거나 응집되어 생물학적 활성을 상실하고 면역원성이 변할 수 있다. 관련된 기전에 따라서 안정화시키기 위한 합리적 전략을 설계할 수 있다. 예를 들어, 응집 기전이 티오-디설피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진 경우에는, 설프히드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키며, 적당한 첨가제를 사용하여 수분 함량을 제어하며 특이적 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 안정화를 달성시킬 수 있다.

본 발명의 VEGF-특이적 길항제는 공지된 방법에 따라서, 예를 들어 정맥내 투여, 예를 들면 거환으로서 또는 소정의 시간에 걸친 연속적 주입, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 수막강내, 경구, 국부 또는 흡입 경로에 의해 대상체, 예를 들어 인간 환자에게 투여한다. 광범위한 부작용 또는 독성이 VEGF 길항 작용과 연관되는 경우에는 국소 투여가 특히 요망된다. 생체외 전략을 치료적 적용에 사용할 수도 있다. 생체외 전략은 대상체로부터 수득된 세포를 VEGF 길항제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염 또는 형질도입시키는 것을 포함한다. 이어서, 이와 같이 형질감염 또는 형질도입된 세포를 대상체에게 다시 주입한다. 세포는 광범위한 어떠한 유형일 수 있는데, 이에는 조혈 세포 (예: 골수 세포, 대식 세포, 단구, 수지상 세포, T 세포 또는 B 세포), 섬유아세포, 상피 세포, 내피 세포, 각질 세포 또는 근육 세포가 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.

예를 들어, VEGF-특이적 길항제가 항체인 경우, 이러한 항체는 적합한 모든 수단, 예를 들어 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비내에 의해 투여하고, 경우에 따라 국소 면역억제 치료를 위해 병변내 투여한다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여가 포함된다. 또한, 항체는 특히 항체의 용량을 감소시키면서 펄스 주입에 의해 투여하는 것이 적합하다. 바람직하게, 투약은 부분적으로 투여가 단발성인지 아니면 만성적인지에 따라서 주입, 가장 바람직하게 정맥내 또는 피하 주사에 의해 이루어진다.

또 다른 예에서, VEGF-특이적 길항제 화합물은 종양의 위치 또는 장애가 허용하는 경우, 예를 들어 직접 주사함으로써 국소적으로 투여하고, 이러한 주사는 주기적으로 반복할 수 있다. VEGF-특이적 길항제는 또한, 대상체에게 전신 전달될 수 있거나 또는 종양 세포에 직접적으로 전달할 수 있는데, 예를 들어 종양을 외과적으로 절제한 후 종양 또는 종양 상에 직접 전달하여, 예를 들어 잠복기 종양 또는 미세전이의 국소 재발 또는 전이를 방지 또는 저하시킬 수 있다.

또 다른 한편, VEGF-특이적 길항제를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 억제성 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드를 대상체 중의 적당한 세포에 전달할 수 있다. 특정 실시양태에서는, 상기 핵산이 종양 자체를 향할 수 있다.

핵산은 이용된 벡터에 대해 적당한 모든 수단에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 많은 방법이 당해 분야에 널리 공지되어 있다 [참고: Sambrook et al 상기 참고, and Watson et al., Recombinant DNA, Chapter 12, 2d edition, Scientific American Books, 1992]. 유전자 전달 방법의 예에는 리포솜 매개된 형질감염, 전기천공, 인산칼슘/DEAE 덱스트란 방법, 유전자 총, 및 미소주사가 포함된다.

IX . 병용 요법

본 발명은 또한, 본 발명의 둘 이상의 VEGF-특이적 길항제를 병용해서 사용하거나 또는 하나 이상의 VEGF-특이적 길항제와 한 가지 이상의 부가의 항암 요법을 병용해서 사용하는 것을 특징으로 한다. 항암 요법의 예에는 수술, 방사선 요법 (방사성요법), 생물학적 요법, 면역요법, 화학요법, 또는 이들 요법의 병용이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다. 또한, 세포독성제, 항혈관형성제 및 항증식제를 VEGF-특이적 길항제와 병용해서 사용할 수 있다.

한 예에서, VEGF-특이적 길항제는 결정적 외과수술 후 비-전이성 암을 치료하기 위한 아주반트 요법으로서 사용한다. 이러한 예에서, VEGF-특이적 길항제는 한 가지 이상의 부가의 화학요법제를 수반하거나 수반하지 않으면서 제공될 수 있다.

또 다른 예에서, VEGF-특이적 길항제는 수술에 앞서 수술가능한 암을 치료하기 위한 네오아주반트 요법으로서 사용한다. 이러한 예에서, VEGF-특이적 길항제는 수술에 앞서 한 가지 이상의 부가의 화학요법제를 수반하거나 수반하지 않으면서 제공될 수 있다.

한 예에서, 본 발명은 VEGF-특이적 길항제를 한 가지 이상의 화학요법제와 함께 (예: 칵테일) 사용하는 것을 특징으로 한다. 화학요법제의 비제한적 예에는 이리노테칸, 플루오로우라실, 류코보린, 또는 그의 모든 조합물이 포함된다. 병용 투여에는 별개의 제형 또는 단일 제약 제형을 사용하여 동시에 투여하는 것과, 어느 한 순서로 연속적으로 투여하는 것이 포함되는데, 바람직하게는 양 (또는 모든) 활성제가 그들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 기간이 있다. 이러한 화학요법제에 대한 투여 스케줄 및 제조는 제조업자의 지시에 따라서 사용할 수 있거나 또는 전문 실시자에 의해 실험적으로 결정된 바와 같이 사용할 수 있다. 화학요법에 대한 투여 스케줄 및 제조는 또한, 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md. (1992)]. 화학요법제는 VEGF-특이적 길항제의 투여에 앞서거나 투여 후에 투여할 수 있거나 또는 VEGF-특이적 길항제와 동시에 투여할 수 있다.

본원의 제형은 치료하고자 하는 특정한 적응증에 대해 필요한 만큼의 한 가지 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에게 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 지닌 한 가지 이상의 활성 화합물을 함유할 수도 있다. 예를 들어, 하나의 제형 중에 EGFR, VEGF (예: VEGF 상의 상이한 에피토프와 결합하는 항체), VEGFR, 또는 ErbB2 (예: Herceptin^®)와 결합하는 항체를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 한 가지 예시 실시양태에서, VEGF-특이적 길항제에 대한 조성물은 항-ErbB2 항체, 또는 그의 단편 또는 유도체 (예: Herceptin^® 항체)를 포함하지 않는다. 또 다른 한편, 또는 또한, 상기 조성물은 세포독성제, 사이토킨, 성장 억제제 및/또는 소분자 VEGFR 길항제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 의도한 목적에 유효한 양으로 병용해서 존재하는 것이 적합하다.

질병을 예방 또는 치료하는 데에 적당한 VEGF-특이적 길항제의 투여량은 상기 규정된 바와 같은 치료하고자 하는 질병의 유형, 질병의 중증도 및 과정, VEGF-특이적 길항제가 예방적 용도로 투여되는지 아니면 치료적 용도로 투여되는지의 여부, 기존의 요법, 환자의 임상 병력 및 VEGF-특이적 길항제에 대한 반응, 및 담당 의사의 판단에 좌우될 것이다. VEGF-특이적 길항제는 환자에게 1회 투여하거나 일련의 치료 기간 내내 투여하는 것이 적합하다. 병용 요법 처방에서는, 본 발명의 VEGF-특이적 길항제와 한 가지 이상의 항암 치료제를 치료적 유효량 또는 상승적 양으로 투여한다. 본원에 사용된 바와 같이, 치료적 유효량은 VEGF-특이적 길항제와 한 가지 이상의 기타 치료제를 공동-투여하거나 또는 본 발명의 조성물을 투여하면 상기 언급된 바와 같은 암이 저하 또는 억제되도록 하는 양이다. 치료적 상승량은 특정한 질병과 연관된 증상 또는 상태를 상승적 또는 상당히 저하 또는 제거시키는 데에 필요한 VEGF-특이적 길항제와 한 가지 이상의 기타 치료제의 양이다.

VEGF-특이적 길항제와 한 가지 이상의 기타 치료제는 종양, 잠복기 종양 또는 미세전이의 발생 또는 재발을 저하 또는 없애기에 충분한 시간 동안 및 충분한 양으로 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다. VEGF-특이적 길항제와 한 가지 이상의 기타 치료제는 종양 재발 가능성을 방지 또는 저하시키기 위한 유지 요법으로서 투여할 수 있다.

VEGF-특이적 길항제는 단독으로 또는 기타 항암 치료 화합물과 병용해서 키트로서 패키징할 수 있다. 이러한 키트는 환자에게 단위 용량을 투여하는 데에 도움을 주는 임의의 성분, 예를 들어 분말 형태를 재구성하기 위한 바이알, 주사용 주사기, 주문설계된 정맥내 전달 시스템, 흡입기 등을 포함할 수 있다. 부가적으로, 단위 용량 키트는 조성물의 제조 및 투여를 위한 지시 사항을 함유할 수 있다. 키트는 1명의 환자에 대한 단일 사용 단위 용량으로서, 특정한 환자에 대해 여러 회 사용 단위 용량으로서 (일정한 용량에서 또는 개개 화합물이 치료가 진행됨에 따라 그 효력이 다양해질 수 있다) 제작할 수 있거나; 또는 키트는 다수의 환자에게 투여하기에 적합한 여러 회분 용량을 함유할 수 있다 ("벌크 패키징"). 키트 성분은 카툰, 블리스터 팩, 병, 튜브 등에 어셈블리할 수 있다.

X. 제조품

본 발명의 또 다른 실시양태에서는, 상기 언급된 장애를 치료하는 데에 유용한 물질을 함유하는 제조품이 제공된다. 본 발명의 제조품은 용기, 표지 및 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등이 포함된다. 용기는 각종 재료, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 형성할 수 있다. 용기는 해당 질환을 치료하는 데에 유효한 조성물을 보유하고 있고 멸균성 유입 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용제 봉지 또는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 한 가지 이상의 활성제는 항-VEGF 항체이다. 용기 상에 있거나 이와 연합된 표지는 해당 조성물이 선택 질환을 치료하는 데에 사용된다는 것을 표시한다. 본 발명의 제조품은 제약상 허용 가능한 완충제, 예를 들어 인산염 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 더 포함할 수 있다. 상업적 및 사용자 측면에서 바람직한 기타 재료, 예를 들어 기타 완충제, 희석제, 충진제, 바늘 및 주사기를 더 포함할 수 있다. 또한, 제조품은, 예를 들어 조성물이 또 다른 조성물과 병용해서 사용되지 않아야 한다는 경고를 포함하거나, 또는 조성물 사용자에게 항-VEGF 항체 조성물을 환자에게 단독으로 투여하거나 이를 항암 조성물과 병용해서 투여하라고 지시하는 사용 설명서를 수반한 패키지 삽입물을 포함한다. 용어 "사용 설명서"는 모든 수단, 예를 들어 패키지 삽입물 형태의 서면 또는 서면으로 작성된 기타 홍보물에 의해 적용 가능한 요법, 의약, 치료, 치료 처방 등에 대한 지시를 제공하는 것을 의미한다.

X. 기탁

다음 하이브리도마 세포주가 부다페스트 조약의 규정 하에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 [American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA]에 기탁되었다:

항체 명칭 ATCC 번호 기탁일

A4.6.1 ATCC HB-10709 1991. 3. 29

실시예

실시예 1. VEGF -A를 억제하면 Apc ^{min /+} 마우스가 장기간 생존하고 내장 선종 성장이 저지된다

가족성 선종성 폴립증 (FAP) 증후군과 대다수의 산발성 결장직장암은 APC 유전자 내의 돌연변이에 의해 유발된다. FAP 환자는 결장외 종양 이외에도 상부 위장 (GI) 관의 종양 및 인대양을 포함하는 그의 하부 GI 관에 수백 내지 수천개의 선종성 폴립이 발생한다. 코돈 850에 이형접합성 절단 대립 유전자를 수반한 Apc^min/+ 마우스는 생식 세포계 APC 돌연변이를 수반한 FAP 환자의 폴립증의 몇몇 특징을 모방한다 [참고: Moser et al., Science 247:322-324 (1990), Su et al., Science 256:668-670 (1992)]. Apc^{min /+} 마우스에서의 종양 형성 개시는 조기 성인기에서 일어나고 동물에게는 전형적으로, C57BL/6 유전적 배경에서 60 내지 150개 내장 폴립이 발생한다. 종양 발생으로 인해, 마우스의 수명이 심각하게 손상되어 대략 5개월째에 통상적으로 빈혈 및/또는 저단백혈증으로 인해 사망하게 된다 [참고: Moser et al., Science 247:322-324 (1990)]. FAP를 나타내는 인간에게서는 전형적으로 결장 선종이 발생하긴 하지만, Apc^{min /+} 마우스는 완전히 밝혀지지 않은 이유로 인해 대부분의 폴립이 그의 소장에서 발생한다. 이들 폴립은 직경이 1 내지 2 mm의 크기에 도달하지만, 보다 큰 폴립 (직경이 4 mm 이하)은 보다 적은 횟수로 유발된다. 우발적인 결장 선종 만이 관찰되는데, 통상적으로 동물당 0 내지 3개 정도이다.

Apc는 증식, 세포소멸, 세포 이동, 세포 부착, 미소관 어셈블리, 신호 변환 및 염색체 분리를 포함한 세포내 과정에 관여하는 것으로 보고되었다 [참고: Nathke, Annu . Rev . Cell Dev . Biol. 20:337-366 (2004)]. Apc의 가장 우수하게 연구된 기능은 Wnt 신호 전달 경로에 대한 베타-카테닌의 조절인자로서의 그의 역할이다 [참고: Nathke, Mol . Pathol . 52:169-173 (1999)]. 간략하게 언급하면, Wnt 신호 전달의 부재하에서는 Apc가 악신 (axin) 및 GSK-3베타 키나제와 결합하여 세포질성 베타-카테닌에 대한 파괴 복합체를 형성함으로써, 그의 핵 전위와 전사 인자의 T-세포 인자/림프계 증강인자 (TCF/LEF) 계열의 후속 활성화를 방지하여 준다. TCF/LEF의 전사 표적에는 상기 언급된 세포내 경로에 관여한 분자가 포함된다.

이종이식편에서의 종양 성장 기전을 연구 조사하는 것은 일부 한계가 있는데, 이는 이들 모델이 천연 환경 하에서 종양 발생을 반복하지 않기 때문이다. 천연 발생적이고 유전적으로 병에 걸리기 쉬운 비-악성 종양 모델에 대한 항혈관형성 요법의 효과를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 내장 선종증의 Apc^{min /+} 모델을 연구하였다. 다음 실시예에서는, 예시되는 VEGF-특이적 길항제인 항-VEGF-A mAb를 이용하여 단기간 및 장기간 처리한 후 뿐만 아니라 내장 상피 세포에서 Cre-LoxP 기술에 의한 VEGF-A의 유전적 결실 후에 Apc^{min /+} 마우스의 종양 표현형을 분석하였다.

다음에 기재된 실험을 위해, Apc^{min /+} 마우스 (스톡 번호 002020,5) 및 12.4KbVilCre 마우스 [스톡 번호 004586; 빌린Cre로 후술됨; 참고: Madison et al., J. Biol . Chem. 277:33275-33283 (2002)]는 공급처 [The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)]로부터 수득하였다. VEGF^{lox / lox} 마우스 (VEGF^lox로 후술됨)는 이미 공개되어 있다 [참고: Gerber et al., Development 126:1149-1159 (1999)]. 마우스를 장벽 설비 내의 미소절연체 우리에서 사육하고 임의로 음식물을 제공하였다. 동물의 유지 및 실험적 프로토콜은 연방 규정에 따라서 수행하였고 시설내 동물 보호 및 사용 위원회에 의해 승인되었다.

Apc ^{min /+} 내장 선종에서의 VEGF -A의 발현

Apc^{min /+} 마우스의 내장 종양에서의 VEGF-A의 발현 패턴을 연구 조사하기 위하여, 본 발명자들은 14주령 마우스로부터의 선종에 대한 계내 혼성화를 수행하였다. 이들 실험을 위해, 계내 혼성화는 기존에 보고된 바와 같이 수행하였다 [참고: Ferrara et al., Am . J. Pathol. 162:1881-1893 (2003)]. 간략하게 설명하면, 중성 완충된 포르말린 고정되고, 탈수되며 파라핀 포매된 내장 조직 박편을 탈파라핀화시키고 수화시킨 후, 37℃ 하에 15분 동안 20 ㎍/ml 프로테이나제 K 중에서 단백질 제거시켰다. [³³P]UTP-표지된 센스 및 안티센스 리보프로브를 55℃ 하에 밤새 혼성화시킨 다음, 0.1 X 표준 식염수 시트레이트 중에서 55℃ 하에 2시간 동안 고 엄격도 세척하였다. 건조 유리 슬라이드를 실온 하에 3일 동안 코닥 바이오맥스 (Kodak BioMax) MR 자가방사선상 필름 (공급처: Eastman Kodak Co.. Rochester, NY)에 노출시킨 다음, NTB2 핵 트랙 에멀션 (공급처: Eastman Kodak Co.)에 침지시키고, 4℃ 하에 28일 동안 건조제를 함유하는 밀봉된 플라스틱 슬라이드 박스에 노출시키며, 현상한 후, H&E (헤마톡실린 에오신)으로 대조염색하였다. VEGF-A 프로브는 기존에 언급된 바와 같이 제조하였다 [참고: Ferrara et al., Am . J. Pathol. 162:1881-1893 (2003)]. VEGF-A 프로브 길이는 NM_031836의 뉴클레오티드 297-645에 상응하는 349개 뉴클레오티드였다. 상부 프라이머 서열은 5'- CAA CGT CAC TAT GCA GAT CAT GCG (서열 1)이고; 하부 프라이머 서열은 5'- GGT CTA GTT CCC GAA ACC CTG AG (서열 2)였다.

이들 계내 혼성화 실험에서는, VEGF-A 발현이 정상적인 내장 융모 상피와 비교해서 다양한 세기를 지닌 상피 세포에서 관찰되었지만, 선종의 간질 세포에서 뿐만 아니라 정상적인 융모의 위에서도 병소적으로 두드러진 신호가 관찰되었다 (도 1A-F).

VEGF -A를 억제하면 Apc ^{min /+} 마우스의 종양 존재량이 저하된다

항-VEGF-A 요법이 마우스 내의 양성 내장 종양의 종양 존재량을 저하시키는 데에 유효한지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 면역 반응을 유발시킬 수 있는 가능성을 줄이기 위하여 Apc^{min /+} 마우스를 마우스-인간 키메라 포맷으로 항-VEGF-A mAb G6-31로 처리하였다. 항-VEGF-A mAb G6-31은 다음 문헌에 기재된 바와 같이 인간 Fab 파지 라이브러리로부터 유래되었다 [참고: Liang et al., J. Biol Chem. 281:951-961 (2006)]. 마우스에서 장기간 투여하는 데에 적합한 항체를 생성시키기 위해, 가변 도메인을 뮤린 IgG2a 불변 도메인 내로 이식하였다. mAb G6-31 [참고: Liang et al., J. Biol . Chem. 281:951-961 (2006)] 또는 이소형 매칭된 대조군 뮤린 IgG2a (항-GP120) (둘 다 5 mg/kg의 용량이다)를 PBS 중의 90 내지 140 ㎕ 용적으로 1주에 1회씩 복강내 투여하였다. 이러한 처리는 3주, 6주, 1년 이하, 또는 마우스가 빈사 상태로 될 때까지 지속하였다. 각 군 당 5 내지 14마리 마우스를 처리하는 것은 91주±3일 연령에 시작하였다.

본 발명자들은 mAb G6-31을 선택하였는데, 이는 이것이 마우스와 인간 VEGF-A 둘 다를 강력하게 차단시킬 수 있는 능력이 있기 때문이다 [참고: Liang et al., J. Biol . Chem . 281:951-961 (2006)]. 이는 인간 VEGF-A는 억제시키지만 마우스 VEGF-A는 그렇치 못하는, 널리 성상 확인된 항-VEGF mAb A.4.6.1과는 다르다 [참고: Gerber et al., Cancer Res. 60:6253-6258 (2000), Liang et al., J. Biol . Chem. 281:951-961 (2006)]. 종양 존재량에 대한 mAb G6-31의 단기간 효과를 평가하기 위하여, 코호트 (cohort) 당 10마리 마우스의 처리를 13주 연령에 시작하여 3주 또는 6주 동안 지속하였다. 처리 개시 연령시의 종양 표현형을 결정하기 위하여, 처리되지 않은 12마리 마우스의 대조군을 13주 연령 (0일째)에서 분석하였다.

3 또는 6주 동안 항-VEGF-A mAb로 처리하면 Apc^{min /+} 마우스에서 전반적인 종양 존재량이 상당히 감소되었다. 0일째에, Apc^{min /+} 마우스의 평균 종양 존재량은 39.3 ㎣였다 (12.3 ㎣ 내지 97.0 ㎣의 범위) (도 2a). 3주 동안 대조군 IgG로 처리된 마우스의 평균 종양 존재량은 96.8 ㎣ (47.1 내지 299.9 ㎣)인 반면, 3주 동안 mAb G6-31로 처리된 마우스의 평균 종양 존재량은 23.5 ㎣ (4.5 내지 58.2 ㎣)였다. 이는 mAb G6-31 처리시 평균 종양 존재량이 75％ 또는 4배로 통계학적으로 유의하게 감소되었다 (p<0.008). 대조군 IgG를 투여한지 6주 후에, 종양 존재량은 평균 198.6 ㎣ (40.5 내지 315.7 ㎣)에 도달하였지만, mAb G6-31로 처리된 마우스에서의 종양 존재량은 여전히 28.4 ㎣ (3.2 내지 75.9 ㎣)로 낮았는데, 이는 평균 종양 존재량이 유의적으로 86％ 또는 7배 감소되었다는 것을 나타낸다 (p<5.3 x 10^-5) (도 2a).

mAb G6-31로 처리한지 3주 및 6주 후에 종양 존재량이 현저하게 감소하는 것은 선종 수 감소와는 반대로 선종 크기 감소에 기인하였다. 대조군 IgG로 처리한지 3주 후, 평균 종양 수는 116±9개 (±SEM)이지만, mAb G6-31 투여 후에는 평균 종양 수가 107±11개 (p<0.28)였다. 대조군 IgG로 처리한지 6주 후, 평균 종양 수는 120±11개이지만, mAb G6-31 투여 후에는 평균 종양 수가 100±10개 (p<0.09)였다. 0일째에는 마우스에게 평균 100±9개의 종양이 있었다.

종양 크기와 수를 분석하기 위하여, 선상 위부터 직장까지의 장관을 세로로 개방하고, 세정한 다음 여과지 상에 편평하게 펼쳤다. 밤새 노톡스 히스토 (Notox Histo) 고정액 (공급처: Scientific Design Laborator Inc., Des Plaines, IL)로 고정시키고 메틸렌 블루 0.1％ 수용액으로 염색시킨 후, 소장 및 대장의 각 내장 선종의 수, 위치 및 직경을, 처리 내용을 모르는 단일 관찰자가 레이카 (Leica) 해부 현미경 상의 20배 배율 하에 접안 눈금자를 통하여 스코어링하였다. 이러한 방법으로, 직경이 0.3 mm 이상인 폴립이 신뢰할 만한 수준으로 기록되었다. 종양 용적은 반구로서 계산하였다. 각 마우스에 대한 종양 존재량은 그의 종양 용적의 합으로서 계산하였다. 양측 스튜던츠 t-시험을 이용하여 P-값을 계산하였다. 처리되지 않은 마우스 군 (0일째)은 항체 처리된 마우스에 대한 대조군으로서 처리 개시 연령 (13주) 시에 분석하였다.

선종 성장이 처리 3 또는 6주 동안의 항-VEGF-A 처리를 잘 피해갔다는 명백한 증거는 없었다: mAb G6-31로 처리된 마우스에서의 종양은 대조군 IgG로 처리된 마우스로부터의 종양의 보다 광범위한 크기 분포도 (도 2b, 상부로부터 2번째 및 4번째 그래프)와 비교해서 보다 조밀한 크기 분포도 (도 2b, 중간 및 바닥 그래프)를 나타내었다. 3주 동안 대조군 IgG가 투여된 마우스에서의 평균 폴립 직경은 1.28 mm이고, mAb G6-31이 투여된 마우스에서의 평균 폴립 직경은 0.85 mm였지만 (p<9.2 x 10^-117), 6주 동안 대조군 IgG가 투여된 마우스에서의 평균 폴립 직경은 1.64 mm이고, mAb G6-31이 투여된 마우스에서의 평균 폴립 직경은 0.86 mm였다 (p<2.7 x 10^-214). 0일째에 평균 종양 직경은 0.97 mm였다.

흥미롭게도, 항-VEGF-A 처리는 모든 크기의 종양의 성장을 억제하는 것으로 여겨졌다. mAb G6-31로 3주간 처리한 후, 직경이 0.3 내지 1.0 mm인 (6주 처리의 경우에는 0.3 내지 1.2 mm) 작은 종양의 빈도는 대조군 처리된 군에서 보다 컸지만, 직경이 1.0 mm 초과인 (6주 처리의 경우에는 >1.2 mm) 종양의 빈도는 감소되었다 (도 2c, 상부 및 중간 그래프). 0일째의 종양 크기 분포도 (도 2c, 바닥 그래프)와 비교하면 선종의 성장이 mAb G6-31 투여 개시시 본질적으로 억제되었다는 것을 제안하였다.

더우기, 항-VEGF-A mAb G6-31은 모든 소장 부위에서 선종 성장을 억제시키는 데에 유효하였다. 3주 요법 및 6주 요법 후 둘 다에서 대조군 IgG 처리와 비교해서 상당히 저하된 평균 종양 직경이 mAb G6-31 처리시 관찰되었다 (도 2d). 더우기, mAb G6-31로 처리된 마우스의 제1 내장 쿼터 내의 평균 선종 직경은 0일째에 마우스에게서 관찰된 것으로부터 상당히 감소되었다 (도 2d에서의 이중 별표). 결장 선종의 평균 종양 직경 상의 감소는 통계학적으로 유의하지 못하였다 (도 2d). 3주 동안 mAb G6-31로 처리된 마우스에서 대장 폴립의 평균 직경은 1.3±0.3 mm (±SEM)지만, 대조군 IgG로 처리된 마우스에서의 평균 직경은 2.5±0.4 mm였다 (p<0.064). 6주 동안 mAb G6-31로 처리한 후 대장 종양의 평균 직경은 2.2±0.3 mm이고, 대조군 IgG를 투여한 후 평균 직경은 2.6±0.3 mm였다 (p<0.37).

내장 상피 세포에서 VEGF -A를 결실시키면 평균 종양 직경이 감소된다

이어서, 본 발명자들은 Apc^{min /+} 모델에서 내장 상피 공급원으로부터 선종 발생까지의 VEGF-A의 기여를 해부하고자 하였다. 이를 위하여, 종양 직경과 수를 상기 언급된 바와 같이, Cre/loxP 기술을 이용하여 VEGF-A를 내장 상피 세포에서 조건부로 결실시킨 마우스 (VEGF^lox;빌린-Cre 마우스)와 교배시킨 13주령 Apc^{min /+} 마우스에서 평가하였다. Apc^{min /+};빌린-Cre 및 Apc^{min /+};VEGF^lox;빌린-Cre 마우스를 13주 연령에서 분석하였다.

액틴 결합성 단백질이고 특수 흡수성 세포의 쇄자연 (brush border)의 주요 구조적 성분인 빌린의 발현은 내장 뒤창자 내배엽에서의 배아발생 동안에 시작하고, 나중에는 소장과 대장 내배엽 전반에 걸쳐 연장된다 [참고: Braunstein et al., Dev . Dyn. 224:90-102 (2002), Ezzell et al., Development 106:407-419 (1989), Maunoury et al., EMBO J. 7:3321-3329 (1988), and Maunoury et al., Development 115:717-728 (1992)]. 성인에게서, 빌린 분포도는 음와 (crypt)의 미성숙 증식성 세포에서 적당한 수준의 선단 분극, 및 소장 융모 내막의 잘 분화된 세포의 쇄자연에서의 강력한 분극을 수반하면서 확산된다 [참고: Robine et al., Proc. Natl . Acad . Sci. 82:8488-8492 (1985)]. 빌린 프로모터에 의해 구동된 Cre 재조합효소 (빌린-Cre)의 발현은 음와로부터 융모 팁 및 결장을 통한 십이지장까지의 내장 상피의 모든 세포에서 빌린 유전자의 발현 패턴이 반복발생하는 것으로 기존에 성상 확인되었다 [참고: Madison et al., J. Biol . Chem. 277:33275-33283 (2002)].

표현형별 분석 결과, 대조군 Apc^{min /+};빌린-Cre 마우스의 평균 종양 직경은 1.02±0.3 mm (±SEM)인 반면, Apc^{min /+};VEGF^lox;빌린-Cre 마우스의 평균 종양 직경은 0.82±0.3 mm인 것으로 밝혀졌는데 (도 2e), 이는 19.8％ 감소를 입증해준다 (p<7.2 x 10^-5). 종양 수는 두 군 간에 상당한 차이가 없었다. Apc^{min /+};빌린-Cre 마우스는 137±11개의 내장 선종을 갖고 있지만, Apc^{min /+};VEGF^lox;빌린-Cre 마우스는 150±17개 선종을 갖고 있었다 (p<0.27).

이들 데이터는 결장을 통한 십이지장, 및 음와로부터 융모 팁까지의 모든 내장 상피 세포로부터 VEGF-A를 결실시키면 종양 성장이 상당히 억제된다는 것을 나타내는데, 그 정도는 항-VEGF-A 항체를 전신 투여함으로써 비롯되는 것과 비교해서 감소되긴 하였다. 따라서, 이들 데이터는 VEGF-A의 상피외 공급원이 Apc^{min /+} 마우스의 내장 선종의 성장에 기여한다는 것을 제안하고 있다.

VEGF -A를 억제하면 Apc ^{min /+} 마우스의 평균 생존율이 연장된다

종양 성장을 억제하는 데에 있어서 항-VEGF-A 처리가 유효하다고 가정하고, 본 발명자들은 mAb G6-31을 이용한 처리가 Apc^{min /+} 마우스에 대해 장기간 이득을 산출할 수 있었는지를 연구 조사하고자 하였다. 이를 위하여, mAb G6-31 또는 대조군 IgG을 이용한 투여를 52주까지 지속하거나 마우스가 빈사 상태인 것으로 관찰될 때까지 지속하였다. 흥미롭게도, mAb G6-31 처리는 평균 생존율을 대조군 IgG를 이용한 경우의 24.0주에서 mAb G6-31을 이용한 경우의 33.6주로 증가시켰다 (로그-랭크 p<2.4 x 10^-3) (도 2f).

mAb G6-31로 처리한 4마리 마우스의 종양 표현형을 32, 51, 64, 또는 66주 연령에서 (mAb G6-31로 처리한지 19, 38, 51, 또는 53주 후) 안락사시켜 분석하였다. 표 1에 제시된 바와 같이, 평균 종양 직경은 19주령 마우스에서 관찰된 바와 근접한 수준으로 유지되었다 (6주 동안 대조군 IgG로 처리된 마우스에서 1.64 mm). 유사하게, 종양 수는 13주령 마우스와 거의 동등한 수준으로 유지되었다 (0일째 군 마우스는 59 내지 161개 내장 선종을 갖고 있는데, 평균 100개의 선종을 갖고 있다). 조직학적 분석에서 박편 평면에서 잡아낸 15개 결장 선종 (마우스 1 내지 4에서 확인된 총 수) 중의 3개 (표 1의 각 마우스 2, 3 및 4로부터 하나씩)는 악성 형질전환을 전혀 표시하지 않았다.

요약하면, 장기간 항-VEGF-A 처리는 일반적으로 널리 관용되고 있고, Apc^{min /+} 마우스의 생존율을 증가시켰다. 더우기, mAb G6-31로 장기간 처리된 마우스에서의 종양 수와 평균 종양 직경은 마우스 연령 측면에서 현저하게 낮았는데, 이는 새로운 선종 형성과 선종 성장의 억제와 일치한다.

항- VEGF -A로 처리된 Apc ^{min /+} 마우스에서 정상적인 혈청 총 단백질, 알부민 및 트리글리세라이드 수준, 및 감소된 비장 골수외 조혈

일반적인 관찰 결과로서, mAb G6-31로 처리된 Apc^{min /+} 마우스는 대조군 IgG로 처리된 마우스 보다 상당히 더 민감하고 반응성인 것으로 나타났다. 더우기, 문헌 [참고: Moser et al., Science 247:322-324 (1990)]에 초기에 보고된 진행성 빈혈을 시사하는 창백한 발은 대조군 IgG로 처리한 동물에게서는 규칙적으로 관찰되었지만, mAb G6-31로 처리된 동물에게서는 그렇지 않았다. 이러한 관찰과 일관되게, 대조군 IgG를 투여한 Apc^{min /+} 마우스의 평균 총 혈청 단백질 및 혈청 알부민은 감소하였지만, mAb G6-31로 처리된 마우스에서는 총 단백질과 알부민 수준이 정상 범위 내였다 (표 2).

Apc^{min /+} 마우스에 대해 보고된 바와 같고 [참고: Moser et al., Science 247:322-324 (1990)], 저단백혈증과 일치되는 바와 같이, 평균 트리글리세라이드 수준은 대조군 IgG로 처리된 동물에서 상승하였지만, mAb G6-31로의 처리시에는 기준 값에 거의 동등한 수준으로 감소되었다 (표 2).

처리한지 3주 또는 6주 후에 처리와 관계된 체중 상의 차이는 전혀 없었지만, 평균 비장 질량은 대조군 IgG로 처리된 마우스에서 상당히 증가하였다 (p<2.3 x 10^-3). 대조군 IgG를 투여한지 3주 후, 마우스는 평균 비장 질량이 0.26 g이거나 체중의 1.17％이지만, 3주 동안 mAb G6-31로 처리된 마우스에서는 평균 비장 질량이 0.11 g (체중의 0.49％)였다. 대조군 IgG로 처리된 마우스에서의 평균 비장 질량 상의 증가는 골수외 조혈 (본 경우에는 내장 출혈에 부차적인 대상성 적혈구생성, EMH)과 일치하였는데, 이는 비장을 조직학적으로 조사함으로써 확인하였다. 6주 동안 대조군 IgG로 처리된 10마리 마우스 중의 10마리가 현저한 EMH를 나타내었지만, mAb G6-31로 처리된 2마리 마우스는 적당한 수준의 EMH을 나타내었고, 5마리는 경미한 수준의 EMH를 나타내었고, 3마리는 그들의 비장에 있어서의 진단적 변화가 없었다. 18 내지 53주 동안 mAb G6-31로 처리된 5마리 마우스 중의 4마리가 비장에서 경미한 수준 내지 광범위한 EMH가 있는 것으로 진단되었다.

단기간 동안 mAb G6-31로 처리된 마우스의 비장에서 EMH 수준이 보다 낮다는 것은 항-VEGF-A 요법이 내장 출혈을 저하시키는 데에 있어서 유리한 효과를 나타낸다는 것을 제안하고 있다.

mAb G6 -31로 장기간 처리한 후의 신장 변화

고 친화성 항-VEGF-A mAb G6-31을 투여하는 것과 관련된 잠재적 독성을 연구 조사하기 위하여, 단기간 처리 (3 내지 6주) 또는 장기간 처리 (18 내지 53주) 후에 췌장, 간 및 신장을 조직학적으로 분석하였다. 조직학적 분석을 위해, 노톡스 고정된 내장 조직을 탈수시키고, 파라핀에 포매시키며, 박편으로 나눈 다음, 표준 프로토콜에 따라서 조직학적 분석을 위해 H&E로 염색하였다.

3 내지 6주 동안 처리된 동물에게서는 상당한 독성이 인지되지 않았다. mAb G6-31를 이용한 장기간 처리 후, 5마리 마우스 중의 5마리는 가변적 (경미한 상태 내지 중증 상태) 확산성 포괄적 사구체경화증과 적당한 수준의 췌장의 간질 부종 (저단백혈증을 반영함)을 나타내었다. 이들 관찰 결과는 기존에 관찰된 mAb G6-31을 장기간 투여함에 따른 독성과 일치하였다. 중요하게는, 평균 생존율 증가로써 반영된 전반적인 건강 상의 개선이 부작용을 능가하였다.

mAb G6 -31 처리시 변경된 종양 형태는 증식 지수 상의 변화를 동반하지 않았다

항-VEGF-A mAb G6-31를 이용한 처리 후 Apc^{min /+} 마우스에서의 내장 폴립을 추가로 성상 확인하기 위하여, 현미경 및 조직학적 분석을 상기 언급된 바와 같이 수행하였다. mAb G6-31로 처리된 폴립의 전체 형태는 대조군 IgG로 처리된 폴립의 형태와 두드러지게 상이하였다 (도 3A-B). 대조군 IgG를 투여한 마우스로부터의 종양은 전형적으로, 비교적 갈라지지 않은 매끄러운 표면을 갖고 있지만, mAb G6-31로 처리된 동물로부터의 종양은 그의 표면 상에 깊은 함입이 나타났다. 조직학적 분석 결과, mAb G6-31 및 대조군 IgG로 처리된 마우스로부터의 종양은 관상 선종인 것으로 밝혀졌다 (도 3C-F). 대조군 IgG로 처리된 마우스로부터의 선종은 수직 및 측면 확장을 수반한 현저한 융모내 상피 증식을 나타내었고, 전형적으로 그의 기저부로부터 내강 표면까지 2배 이상 확대되었다. 최소한의 섬유성 간질이 있었다. mAb G6-31로 처리된 마우스로부터의 선종은 특징적으로, 보다 적은 수의 융모내 상피 세포를 갖고 있으며, 내강 표면에서 덜 광범위하며, 보다 더 얕고, 보다 적은 수의 인접 융모가 관여한다. 양 처리군에서의 결장 폴립을 조직학적으로 분석한 결과, 풍부한 섬유혈관성 간질과 다양한 양 (100％ 이하)의 형성이상 상피를 수반한 유경성 (pendunculated) 관상 선종인 것으로 밝혀졌다.

종양 조직 및 정상 점막 중에서의 증식 정도를 평가하기 위하여, Ki-67 항체를 이용한 간접 면역조직화학적 염색을 수행하였다 (도 3G-J). 이들 실험을 위해, 노톡스 고정시키고, 탈수시키며 파라핀 포매시킨 내장 조직 박편을 탈파라핀화하고 수화시킨 후, 99℃ 하에 타겟 레트리발 [Target Retrieval (공급처: DAKO, Glostrup, Denmark)]에서 항온 배양한 다음, 내인성 퍼옥시다제 활성을 켄칭하고 아비딘 및 바이오틴 (공급처; Vector, Burlingame, CA)을 차단시켰다. 3％ 소 혈청 알부민을 수반한 PBS 중의 10％ 차단용 혈청을 이용하여 박편을 30분 동안 추가로 차단시켰다. 조직 박편을 60분 동안 차단용 혈청 중에서 희석된 일차 항체와 함께 항온 배양하고, TBST 완충액 (공급처: DAKO)으로 세척하며, 30분 동안 이차 항체와 함께 항온 배양하고, TBST로 세척하며, 30분 동안 ABC 엘리트 (Elite) 시약 (공급처: Vector)에서 항온 배양한 다음, 금속 증강된 DAB (공급처: Pierce, Rockford, IL)에서 항온 배양하고 마이어 (Mayer) 헤마톡실린으로 대조염색하였다. 사용된 일차 항체는 Ki-67에 대항한 토끼 폴리클로날 항체였다 (SP6, 1:200, Lab Vision, Fremont, CA). 사용된 이차 항체는 바이오티닐화 염소 항-토끼 항체 (7.5 ㎍/ml, 공급처: Vector)였다. 모든 단계는 실온 하에 수행하였다.

정량적으로 분석한 결과, 대조군 IgG 또는 mAb G6-31로 처리된 마우스로부터의 종양에서 유사한 양의 Ki-67 양성 세포가 나타났다. 마찬가지로, 정상적인 인접한 점막의 증식 지수는 양 처리군 간에 거의 동등한 수준이었다 (도 3K). 증식 지수는 카이사이트 (Kisight) 검정 [Ariol Review (v2.6)]을 활용하는 아리올 (Ariol) SL50 슬라이드 스캐닝 현미경 시스템 (공급처: Applied Imaging, Inc., San Jose, CA)을 이용하여 획득한 정상 점막 및 종양 조직의 5 ㎛ 파라핀 박편의 영상들로부터 정량화하였다. 종양 조직과 정상 점막의 부위를 수동으로 확인하고, 그 내용을 모르는 조사자에 의해 외접시켰다. 총 핵과 비교한 Ki-67 양성 핵의 비율로서 측정된 증식 지수는 양성 역치의 정의에 따라서 핵 색상을 기준으로 한 반자동화 방식으로 정량화하였다. 증식 지수 측정치는 mAb G6-31 처리군 (n=3)에서의 29개 종양 분석치와 대조군 IgG 처리군 (n=3)에서의 44개 종양 분석치를 포함하였는데, 모두 6주 동안 처리하였다.

mAb G6-31에 의한 성장 억제가 주요 신호 변환 경로의 분자 부분의 발현 수준 상의 변화를 동반하였는지를 시험하기 위하여, 웨스턴 (Western) 블롯 분석을 수행하였다. mAb G6-31 및 대조군 항체 처리된 마우스로부터의 정상적인 인접한 점막 및 공장 선종을 외과용 메스로 수거하고, RIPA 용해 완충액 중에서 OMNI TH115 균질화기로 기계적으로 균질화시켰다. 사용된 일차 항체는 p38 MAPK, 포스포르-p38 MAPK, p42/p44 MAPK, 포스포르-p42/p44 MAPK, PTEN, Akt, 포스포르-Akt, 및 포스포르-GSK3알파/베타에 대항한 토끼 폴리클로날 항체였다 (모두 1:1000, 공급처; Cell Signaling, Danvers, MA). 사용된 이차 항체는 서양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 항-토끼 항체였다 (1:5000, 공급처: Chemicon).

시험된 수 많은 분자의 발현 수준이 mAb G6-31로의 처리시 변화하지 않은 채로 있었지만, 정상 점막에서 발견된 것에 대한 4개 종양 샘플 중의 3개에서 포스포-p38 MAPK 수준이 적당한 수준으로 복원된 것으로 관찰되었다 (도 3L; p-p38, T5-T8을 N5-N8과 비교한다).

mAb G6 -31 처리된 종양에서의 감소된 혈관 밀도

VEGF-A가 VEGFR-2 신호 전달을 통하여 혈관 내피 세포에 대한 분열촉진 물질인 것으로 공지되어 있다고 가정하고, 본 발명자들은 두꺼운 조직 박편을 항-CD31 항체로 면역조직화학적 염색함으로써 Mab G6-31 및 대조군 IgG로 처리된 마우스에서의 종양 혈관망을 조사하였다 (도 4A-B). 공초점 현미경 영상화 목적을 위해, 마우스를 이소플루오란 마취 하에 PBS 중의 1％ 파라포름알데히드 (PFA)로 관류 고정시키고, 장관을 여과지 상에서 편평하게 펼쳐 놓으며, 4％ PFA로 고정시킨 후, 4℃ 하에 밤새 PBS 중의 30％ 수크로스에 함침시킨 다음, O.C.T.에 포매시키고 드라이 아이스 상에서 동결시켰다. 한랭박편을 80 ㎛로 절단하고, 10분 동안 4％ PFA에 고정시키며, PBS 중의 0.2％ 트리톤 (Triton)-X-100으로 투과시킨 다음, 0.2％ 트리톤-X-10을 수반한 PBS 중의 5％ 정상 염소 혈청으로 30분 동안 차단시켰다. 차단용 완충액 중의 일차 항체를 밤새 항온 배양하고, 이차 항체는 5 내지 6시간 동안 항온 배양하며, PBS로 세척하고, 훽스트 (Hoechst) 33342 (0.5 mg/ml; 공급처; Sigma, St. Louis, MO)로 대조염색하였다. 사용된 일차 항체는 CD31에 대항한 햄스터 모노클로날 (1:500, 공급처: Chemicon, Temecula, CA), E-카드헤린 (cadherin)에 대항한 래트 모노클로날 (1:2500, 공급처: Zymed, South San Francisco, CA), 및 평활근 액틴에 대항한 Cy3 접합된 마우스 모노클로날 (1:1000, 공급처: Sigma)였다. 사용된 이차 항체는 Cy5 접합된 항-미국 햄스터 (1:500, 공급처: Jackson Immunoresearch, Cambridgeshire, UK), 및 ALEXA 488 접합된 항-래트 (1:500, 공급처: Molecular Probes, Eugene, OR)였다.

Apc^{min /+} 마우스로부터의 종양 상의 혈관 밀도는 짜이스 악시오플란2 (Zeiss Axioplan2) 형광 현미경 (공급처: Thornwood, NY) 상의 CCD 카메라를 이용하여 포착한 디지털 영상으로부터 정량화하였다. 4가지 군 (대조군 IgG 또는 mAb G6-31로 3주 또는 6주 동안 처리된 마우스) 각각은 2마리 마우스로 이루어졌고, 각 군으로부터 11 내지 22개 종양을 분석하였다. 80 ㎛ 종양 박편 중의 혈관 면적은 이미지J v.1.36을 이용하여 역치에 의거한 CD31 양성 형광의 절편화를 통하여 계산하였다 (http://rsb.info.nih.gov/ij/). 그 다음, 혈관 밀도는 CD31 양성 픽셀 대 총 종양 면적의 비로서 계산하였다. 각 군으로부터의 모든 종양 값의 평균을 구하여 해당 군에 대한 평균 값을 산출하였다.

혈관 밀도를 정량화한 결과, mAb G6-31-처리된 마우스로부터의 종양의 혈관 성분이 대조군 IgG 처리된 마우스에서 관찰된 것과 비교해서 감소된 것으로 나타났다 (도 4C). 대조군 IgG를 투여한지 3주 후에는, 평균 종양 혈관 면적 밀도가 23.2％였지만, mAb G6-31을 투여한 후에는 18.6％로 감소되었다. 6주 동안 대조군 IgG로 처리된 종양의 평균 혈관 면적은 25.5％인 반면, mAb G6-31로 처리된 마우스로부터의 종양의 평균 혈관 면적 밀도는 19.7％였다.

논의

본 발명자들은 양성 내장 종양형성에 있어서의 VEGF-A의 역할을 연구 조사하기 위하여 Apc^{min /+} 마우스를 사용하였다. 제1 부에서는, 원기왕성한 성장을 진행하고 있는 것으로 확립된 내장 선종에 대한 단기간 및 장기간 항-VEGF-A 처리의 효과를 측정하기 위한 실험을 설계하였다. 본 발명자들은 항-VEGF-A mAb G6-31로 처리하면 종양 존재량이 상당히 감소되었고 Apc^{min /+} 마우스의 생존율이 연장되었다는 사실을 밝혀내었다.

Apc^{min /+} 마우스의 종양 존재량에 대한 식이 및 화학방지제 [비스테로이드계 소염제 (NSAID) 포함]의 효과에 관한 몇 가지 연구를 수행하였다 [참고: Corpet et al., Cancer Epidemiol . Biomarkers Prev. 12:391-400 (2003); 이의 업데이트된 목록이 http://corpet.net/nnin에 있다]. 많은 이들 연구는 종양 수의 상당한 감소를 보고하고 있다. COX-1과 COX-2 둘 다를 표적으로 하는 NSAID, 예를 들어 피록시캄 (piroxicam) 및 술린닥 (sulindac)은 선택적 COX-2 억제제, 예를 들어 셀레콕시브 [참고: Jacoby et al., Cancer Res. 60:5040-5044 (2000)] 및 A-285969 [참고: Wagenaar-Miller et al., Br . J. Cancer 88:1445-1452 (2003)]에 덧붙여, Apc^min/+ 마우스에서 종양 형성을 억제하는 데에 있어서 특히 가장 강력한 작용제였다 [참고: Boolbol et al., Cancer Res. 56:2556-2560 (1996), Chiu et al., Cancer Res. 57:4267-4273 (1997), Hansen-Petrik et al., Cancer Lett. 175:157-163 (2002), Ritland et al., Carcinogenesis 20:51-58 (1999)]. 병용 요법이 또한, 종양 수를 감소시키기 위해 성공적으로 사용되어 왔다. 토란세 (Torrance) 등은 특이적 표피 성장 인자 수용체 억제제인 EKI-785를 술린닥과 병용해서 활용하였고, 이로써 종양 수가 거의 제거되었다는 사실을 밝혀내었다 [참고: Torrance et al., Nat . Med . 6:1024-1028 (2000)]. 유사하게, 화학요법제 랄티트렉세드 (raltitrexed) (RTX)와 5-플루오로우라실 (FU)의 병용 효과로 인해 Apc^{min /+} 종양 수가 상당히 (37％) 감소되었다 [참고: Murphy et al., Cancer Biol . Ther. 3:1169-1176 (2004)]. 최근에는, 수용체 티로신 키나제 (RTK) 억제제 AZD2171을 단기간 투여하는 것이 Apc^{min /+} 모델에서 종양 존재량을 감소시킨다는 사실이 입증되었다 [참고: Goodlad et al., Carcinogenesis 27:2133-2139 (2006)]. 이들은 AZD2171을 이용한 조기 치료 개시 (6주째)가 종양 수를 감소시킬 수 있었던 반면, 나중에 개입하면 (10주째) 종양 크기만 감소되었다는 사실을 인지하였다 [Goodlad et al., 상기 참고]. 그러나, 이러한 치료는 혈관 밀도에 대해서는 효과가 없었다 [Goodlad et al., 상기 참고]. AZD2171은 몇 가지 RTK, 예를 들어 VEGFR-1, -2, 및 -3 등을 억제시킨다 [참고: Wedge et al., Cancer Res. 65:4389-4400 (2005)].

본 발명자들은 13주째에 투여된 항-VEGF-A Mab G6-31은 기존의 종양 수를 감소시키지 못하였지만, 종양 크기를 감소시켰고 새로운 선종 형성을 억제시킬 수 있다는 사실을 관찰하였다. 이들 결과는 생존율 상의 증가 관찰과 상관이 있었다. 그러나, 본 발명자들은 항-VEGF-특이적 종양 예방 접근 방식 (보다 조기에 치료를 개시함)이 본 연구에서 사용되었던 종양 개입 접근 방식 (나중에 치료를 개시함) 보다 종양 수를 감소시키는 데에 있어서 잠재적으로 더 유효할 수 있을 것으로 믿고 있다. 그럼에도 불구하고, 항-VEGF 특이적 억제는 종양 성장의 모든 단계에서 유효하였다.

본 발명자들의 연구는 결론적으로, VEGF-A를 표적화하는 것이 Apc^{min /+} 모델에서 심오한 치료 효과를 달성하기에 충분하다는 사실을 나타내었다. Mab G6-31을 이용한 전신 VEGF-A 억제를 Apc^{min /+};VEGF^lox;빌린-Cre 마우스에서 내장 상피 구획 단독에서의 VEGF-A의 유전적 결실과 비교한 결과는 상피 세포 이외에도, VEGF-A의 기타 세포성 공급원이 Apc^{min /+} 선종 성장에 있어서 중요한 역할을 한다는 것을 제안하고 있다. 이들 VEGF-A의 부가의 공급원에는 잠재적으로, 단핵 세포 [참고: Sunayama et al., Carcinogenesis 23:1351-1359 (2002)] 및 간질 섬유아세포 [참고: Seno et al., Cancer Res. 62:506-511 (2002), Williams et al., J Clin . Invest. 105:1589-1594 (2000)]가 포함된다. 본 발명자들의 계내 분석은 선종 및 정상 융모 내에서의 상피외 VEGF-A 발현을 표시하는데, 이는 상기 관찰 결과를 뒷받침해준다.

데이터에 관한 광범위한 본문 내용을 기초로 하여, 관찰된 mAb G6-31의 항종양 효과의 상당 부분이 혈관형성의 억제에 의해 매개된다고 생각할 수 있다 [참고: Wise et al., Proc . Natl . Acad . Sci USA 96:3071-3076 (1999), Zachary et al., Cardiovasc Res. 49:568-581 (2001)]. 실제로, 항-VEGF-A 모노클로날 항체에 반응하여 혈관 공급이 감소하는 것은 종양 이종이식편 모델에서 관찰되었다 [참고; Borgstrom et al., Prostate 35:1-10 (1998)]. 이와 부합되게, 대조군 IgG로 처리된 마우스로부터의 종양과 비교해서, mAb G6-31를 투여한지 3주 및 6주 후에 Apc^min/+ 내장 선종의 혈관 면적 밀도 상의 감소가 관찰되었다.

VEGF-A의 억제시 1 mm 보다 작은 선종이 상당히 축적된다는 관찰 결과는 Apc^min/+ 마우스의 내장 선종에서는 혈관형성 전환이 Apc^delta716 모델에서 관찰된 바와 같이, 종양 발생에 관해 일반적으로 믿고 있는 것 보다 초기에 발생할 수도 있다는 것을 제안하고 있다 [참고: Seno et al., Cancer Res. 62:506-511 (2002)].

본 발명자들의 연구에 관한 중요하고도 예상치 못한 결론은 단일 혈관형성 인자를 표적으로 하는 항-혈관형성 단일요법이 종양 성장을 억제하는 데에 고도로 유효할 수 있고 생존율 이득을 산출할 수 있다는 것이다. 이는 악성 종양의 연구 조사로부터 일차적으로 수집한 관점과는 달리, 이러한 요법의 주요 이득이 종양 혈관을 "표준화"시켜 화학요법의 전달을 촉진시키기 위한 것으로 여겨진다 [참고: Jain et al., Nat . Med. 7:987-989 (2001)]. 양성 종양에게서 돌연변이가 발생할 경향 (이는 잠재적으로 치료 내성을 유발시킨다)이 감소하는 것은 적어도 부분적으로는, 그 차이 때문일 수 있다. 따라서, 본 발명자들의 데이터는 반드시 화학요법제를 사용하지 않고서도 양성 종양을 비-외과적으로 치료할 수 있는 가능성을 제안하고 있다.

실시예 2. 항- VEGF -A 모노클로날 항체는 다발성 내분비 신생물의 마우스 모델에서 뇌하수체 선종의 성장을 억제시키고 혈청 프롤락틴 및 성장 호르몬 수준을 저하시킨다

다발성 내분비 신생물 (MEN)은 둘 이상의 내분비선을 포함한 종양의 발생을 특징으로 한 장애이다. 환자는 부갑상선, 췌장 섬 세포 및 전방 뇌하수체에 종양이 복합적으로 발생한 것이 확인되는 경우에 MEN 유형 1 (MEN1)로 분류된다. MEN1 유전자 상의 돌연변이가 이러한 장애의 기초가 되는 것으로 밝혀졌는데, 이로써 단백질 메닌 (menin)은 흔히 절단되거나 존재하지 않는다 [참고: Pannett et al., Endocr. Relat . Cancer 6:449-473 (1999)]. 종양 내에 남아있는 대립 유전자의 빈번한 상실을 추가로 발견함으로써 [참고: Bystrom et al., Proc . Natl . Acad . Sci USA 87:1968-1972 (1990), Debelenko et al., Cancer Res. 57:2238-2243 (1997), Larsson et al.. Nature 332:85-87 (1988)], MEN1은 종양 억제인자 유전자로서 분류되어 왔다. MEN1은 상염색체 우성 질환으로서 대개 유전되기는 하지만, MEN1 유전자의 드 노보 (de novo) 돌연변이가 MEN1의 산발적 증례의 원인으로서 분류되어 왔다.

메닌의 기능은 여전히 상당 부분 공지되어 있지 않다. 편재해서 발현된, 주로 핵 610개 아미노산 단백질이 전사 조절, DNA 프로세싱 및 복구, 및 상기 언급된 경로의 단백질 부분과의 시험관내 상호 작용을 통한 세포골격 구성에 관여하는 것으로 제안되었다 [참고: Agarwal et al., Horm . Metab . Res. 37:369-374 (2005)]. 그러나 지금까지 확인된 단백질 상호 작용 중의 어느 것도 MEN1에서의 종양원성에 대한 설명을 제공해주지 못하였다.

췌장 종양 (이의 50％ 초과는 가스트린종이고 10 내지 30％는 인슐린종이다)에 대한 현재의 치료 기준은 가스트린종의 증례에서 기저 산의 박출량 감소인 반면, 인슐린종에 대한 최적의 치료는 수술인 것으로 여겨진다. 뇌하수체 종양에 대한 치료는 호르몬 프로파일에 따라서 의학적 요법을 다양하게 하면서 선택적으로 수술하는 것으로 이루어지는 반면, 부갑상선 종양에 대한 결정적 치료는 과반응성 선을 외과적으로 제거하는 것이다. 그러나, 부갑상선절제술의 정도와 시기는 가변적이다 [참고: Brandi et al., J. Clin . Endocrinol Melab. 86:5658-5671 (2001)]. MEN1의 진단 및 치료에 대한 새로운 접근 방식 생성에 관한 가장 늦은 개발이 최근에 고찰되었다 [참고: Viola et al., Curr . Opin . Oncol. 17:24-27 (2005)].

상동 재조합을 통하여, 마우스 유전자 Men1의 엑손 3-8의 결실을 목표로 하였다 [참고: Crabtree et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 98:1118-1123 (2001)]. 9개월 연령까지는, 이형접합성 Men1 마우스에게서 췌장 섬 병변이 발생하였는데, 부갑상선 선종이 부가적으로 빈번히 관찰된 것으로 보고되었다. 16개월 연령까지는 보다 크고 더 많은 수의 종양이 췌장 섬, 부갑상선, 갑상선, 부신 피질 및 뇌하수체에서 관찰되었는데 [참고; Crabtree et al., Proc . Natl . Acad . Sci USA 98:1118-1123 (2001)], 이는 인간 장애와 현저하게 유사한 특징이다.

항-VEGF-A 접근 방식이 인간 악성 암 세포주로부터 유래된 각종 전임상 모델을 치료하는 데에 사용되어 왔기 때문에 [참고: Geber et al., Cancer Res . 60:2178-2189 (2000)], VEGF-A-매개된 혈관형성을 차단시키면 종양이 억제된다는 것을 시사하는 광범위한 명백한 증거가 존재한다 [참고: Gerber et al., Cancer Res. 60:6253-6258 (2000), Holash et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 99:11393-11398 (2002), Millauer et al., Nature 367:576-579 (1994), Prewett et al., Cancer Res. 59:5209-5218 (1999), Wood et al., Cancer Res. 60:2178-2189 (2000)]. 그러나, 종양 이종이식편은 천연 환경 하에서 종양 발생을 불량하게 반복한다. 더우기, 항-VEGF-A 항체 요법은 양성 종양, 또는 내분비 기원의 종양의 성장을 억제하는 데에 있어서 지금까지 시도되지 않았다. 내분비 조직-특이적 선종의 발생에 있어서의 VEGF-A의 역할을 연구 조사하기 위하여, 본 발명자들은 천연 발생적 비-악성 종양 모델인 MEN1의 Men1^+/- 마우스 모델에 대한 항혈관형성 요법의 효과를 조사하였다. 예시되는 VEGF-특이적 길항제인 항-VEGF-A 모노클로날 항체 (mAb)를 이용한 단기간 처리 후에, Men1^+/- 마우스에서의 뇌하수체 선종 뿐만 아니라 Balb/c 누드 (Nude) 마우스에서의 피하 뇌하수체 종양 이식체의 종양 용적을 분석하였다. 또한, 항-VEGF-A mAb를 이용하여 MEN1과 연관된 상승된 호르몬 수준을 저하시킬 수 있는 가능성을 연구 조사하였다.

다음에 기재된 실험을 위해, Men1^+/- 마우스 (스톡 번호 004066)를 공급처 [The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)]로부터 수득하고, Balb/c 누드 마우스는 공급처 [Charles River Laboratories Inc. (Wilmington, MA)]로부터 수득하였다. 혼합 129-FVB 배경의 실험적 Men1^+/- 암컷 마우스는 Men1^+/- 수컷과 암컷을 교배함으로써 수득하였다. 마우스를 장벽 설비 내의 미소절연체 우리에서 사육하고 임의로 음식물을 제공하였다. 동물의 유지 및 실험적 프로토콜은 연방 규정에 따라서 수행하였고 시설내 동물 보호 및 사용 위원회에 의해 승인되었다.

mAb G6 -31을 이용한 처리가 Men1 ^+/- 뇌하수체 선종의 성장을 억제시킨다

항-VEGF-A 요법이 뇌하수체 선종의 성장을 억제하는 데에 있어서 유효한지를 연구 조사하기 위하여, 11개월 내지 13개월 연령 암컷 Men1^+/- 마우스 125마리를 대상으로 하여 MRI를 수행하여 뇌하수체 종양이 있는 마우스를 확인하였다. 종양을 보유하고 있는 마우스를 대상으로 하여 14일 및 28일 후에 다시 영상화하여 선종의 성장율을 확립하였다. 67일 동안 또는 마우스가 빈사 상태로 될 때까지, 1일 평균 종양 성장율이 12.4％이고 연구 개시시 평균 종양 용적이 15.58±4.0 ㎣ (±SEM)인 9마리 마우스의 코호트에게는 대조군 IgG를 투여하였고, 1일 평균 종양 성장율이 10.2％이고 연구 개시시 평균 종양 용적이 16.70±5.7 ㎣인 8마리 마우스의 코호트에게는 항-VEGF-A mAb G6-31을 투여하였다. mAb G6-31 및 대조군 IgG 항체를 이용한 처리를 위해, 5 mg/kg의 항-VEGF mAb G6-31 [참고: Liang et al., J. Biol . Chem . 281:951-961 (2005)] 또는 이소형 매칭된 대조군 IgG (항-GP120)을 매주 1회씩 PBS 중의 100 내지 200 ㎕ 용적으로 복강내 주사하였다. 계내 뇌하수체 선종이 있는 8마리 (mAb G6-31) 또는 9마리 (대조군 IgG) Men1^+/- 마우스의 투여는 13.5 내지 14.5개월 연령에서 시작하였고 67일 동안 또는 마우스가 빈사 상태로 될 때까지 지속하였다. 피하 뇌하수체 선종 이식체가 있는 23마리 (대조군 IgG) 또는 35마리 (mAb G6-31) Balb/c 누드 마우스의 처리는 이식 후 4개월째에 시작하였고, 35일 동안 또는 마우스가 빈사 상태로 될 때까지 또는 종양 용적이 3000 ㎣의 용적에 도달할 때까지 지속하였다.

동물을 MRI로 2주마다 영상화하여 생체내 뇌하수체 선종 성장을 추적하였다. MRI 영상은 9.4T 수평선상의 보어 (bore) 자석 (공급처: Oxford Instruments Ltd., Oxford, UK) 상에서 포착하고, 전파 및 수용을 위한 3 cm 용적 코일 (공급처: Varian, Inc.)을 이용하여 바리안 이노바 콘솔 (Varian Inova console) (공급처: Varian, Inc., Palo Alto, CA)에 의해 제어하였다. 반복 시간 4초, 에코 트레인 길이 8, 에코 스페이싱 12 ms, 유효 에코 시간 48 ms, 및 6개 평균치를 수반한 신속 스핀 에코 영상화 순서를 이용하였다. 영상 매트릭스는 128²였는데, 시야 (20 ㎟) 및 슬라이스 두께 0.5 mm를 갖는다. 마우스는 의학적 공기 중의 2％ 이소플루란을 이용하여 엎드린 자세로 제한하고, 직장 프로브를 이용하여 체온을 모니터링하며, 15분 영상 포착 기간 동안 온기를 수반하면서 37℃ 하에 유지시켰다. 영상화한 후, 동물을 가열된 표면 상에서 회복시켜 둔 다음, 다시 사육 설비 내로 반송하였다. 분석용 소트프웨어 (공급처: (AnalyzeDirect, Inc., Lenexa, KS)에서 발췌된 관심있는 3차원적 영역을 이용하여 원발성 뇌하수체 종양 용적을 MRI 데이터로부터 계산하였다.

처리한지 39일째에, 대조군 IgG 처리된 군과 비교해서 mAb G6-31-처리된 군에서 평균 뇌하수체 종양 용적의 통계학적으로 유의한 감소가 관찰되었다 (도 5A). 연구 종말점에서 (67일), mAb G6-31 처리시 평균 종양 용적이 통계학적으로 유의하게 72％ 또는 3.7배 감소되었다 (p-값 0.016 미만). 대부분의 (9개 중의 6개) 대조군 IgG 처리된 Men1^+/- 종양은 치료 기간 내내 원기왕성하게 성장을 지속하였지만, mAb G6-31 처리된 뇌하수체 선종 8개 중의 7개는 그 성장 속도가 상당히 느려졌다 (도 5B). 4마리의 대조군 IgG 처리된 마우스와 3마리의 mAb G6-31 처리된 마우스는 건강이 나쁘기 때문에 연구 종말점 이전에 안락사시켰는데, 대조군 IgG 처리된 1마리 마우스는 처리 25일째에 영상화하기 전에 안락사시켰다. 종양이 증가되지 않은 생존율은 mAb G6-31 처리된 군에서 상당히 증가하였는데 (로그 랭크 p<0.019) (도 5C), 이는 뇌하수체 종양 성장을 억제시키면 이들 마우스의 건강이 대조군 IgG로 처리된 마우스와 비교해서 개선되었다는 것을 제안하고 있다. mAb G6-31 처리 군에서의 2마리 마우스의 종양 용적은 67일간의 처리에 의해서 증가되지 않았다.

항- VEGF -A 항체는 피하 뇌하수체 선종 이식체의 성장을 억제시킨다

Men1^+/- 뇌하수체 선종 이식체 모델에 대한 항-VEGF-A 항체 처리의 효능을 시험하기 위하여, 다음 과정에 따라서 6 내지 8주령 암컷 Balb/c 누드 마우스의 옆구리에서 피하 종양을 확립시켰다. 이들 실험을 위해, Men1^+/- 마우스로부터의 단일 계내 뇌하수체 선종을 추출하고 대략 1 ㎣ 조각으로 분쇄하며, BD 매트리겔 (Matrigel) 매트릭스 기저막 (공급처: BD, Bedford, MA)과 혼합하고, Balb/c 누드 마우스의 등쪽 옆구리에 200 ㎕ 용적으로 피하 접종하였다. 4개월 후에, 단일 피하 종양 (대략 용적 900 ㎣)을 추출하고, 분쇄하며, 매트리겔과 혼합하며, 상기 언급된 바와 같이 접종하여 뇌하수체 선종 이식체를 갖는 마우스의 코호트를 확립하였다.

피하 뇌하수체 선종 이식체의 종양 크기는 가장 큰 종양 직경과 이에 수직인 직경을 수집함으로써 칼리퍼 도구 (공급처: Fred V. Fowler Co. Inc., Newton, MA)를 이용하여 측정하였다. 종양 용적은 다음 식을 이용하여 계산하였다: V=πab²/6 (a=가장 큰 종양 직경, b=수직 직경).

상기 언급된 방법을 이용하여 35일 동안, 치료 개시시 평균 종양 용적이 515±42 ㎣인 35마리 마우스의 코호트에게는 mAb G6-31을 투여하고, 연구 개시시 평균 종양 용적이 527±64 ㎣인 23마리 마우스의 코호트에게는 대조군 IgG를 투여하였다. 연구 종말점에, 대조군 IgG 처리된 종양은 그의 용적이 거의 4배로 되어 평균 2071±152 ㎣로 되었지만, mAb G6-31로 처리된 마우스에서의 종양 성장은 본질적으로 중지되었는데, 평균 종양 용적은 35일째에 556±89 ㎣였다 (도 5D). mAb G6-31 처리시 평균 종양 용적이 통계학적으로 유의하게 73％ 또는 3.7배 감소되었다 (p<1.9 x 10^-12).

이들 데이터는 Men1의 이종접합성에 의해 유발된, 뇌하수체 선종 및 비슷한 피하 뇌하수체 선종 이식체의 성장을 억제하는 데에 유효한 항-VEGF-A mAb G6-31을 확립시켜 준다.

정상 뇌하수체 및 뇌하수체 종양 조직에서의 VEGF -A, VEGFR -1, 및 VEGFR -2의 발현

뇌하수체 조직에서의 VEGF-A, VEGFR-1, 및 VEGFR-2의 발현 수준을 연구 조사하고 그들의 발현 수준이 mAb G6-31 처리에 의해 영향을 받았는지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 5개의 연령 적합 작은 비-처리된 (9.7±2.9 ㎣) 뇌하수체 선종, Men1^+/- 마우스로부터의 4개의 연령 적합 정상 뇌하수체, 및 8개의 연령 적합 야생형 뇌하수체 샘플과 함께, 5개의 대조군 IgG 처리된 (평균 용적 96.2±8.7 ㎣) 및 5개의 mAb G6-31 처리된 (35.2±4.0 ㎣) 계내 뇌하수체 선종에서의 VEGF-A, VEGFR-1, 및 VEGFR-2의 평균 상대적 발현을 비교하였다. 또한, 5개의 대조군 IgG-처리된 (평균 용적 2063±205 ㎣) 및 5개의 mAb G6-31-처리된 (577±45 ㎣) 뇌하수체 선종 이식체로부터 VEGF-A, VEGFR-1, 및 VEGFR-2의 발현을 연구 조사하였다.

이들 실험을 위해, 제조업자의 프로토콜에 따라서 RNeasy 키트 (공급처: Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 신속 동결시킨 뇌하수체 선종 또는 정상 뇌하수체로부터 총 DNA-무함유 RNA를 제조하였다. 슈퍼스크립트 (Superscript) III 플래티늄 1-단계 qRT-PCR 키트 (공급처: Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 ng의 총 RNA, 45 nM의 각 PCR 프라이머, 및 12.5 nM Taqman 프로브를 이용하여 총 용적 50 ㎕으로 1-단계 정량적 RT-PCR을 수행하였다. 관심있는 유전자의 발현을 검출하기 위하여, 다음 TaqMan 유전자 발현 검정 프라이머 및 프로브 혼합물 (공급처: Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하였다: VEGF -A (Assay ID: Mm00437304_ml), VEGFR -1 (Assay ID: Mm00438980_ml), 및 VEGFR -2 (Assay ID: Mm00440099_ml). 자가 설비 내에서 합성된 프라이머 및 Taqman 프로브를 사용하여 GAPDH 발현을 검출하였다 [정배향 프라이머 서열: ATGTTCCAGT ATGACTCCAC TCACG (서열 3); 역배향 프라이머 서열: GAAGACACCA GTAGACTCCA CGACA (서열 4); Taqman 프로브 서열: AAGCCCATCA CCATCTTCCA GGAGCGAGA (서열 5)].

다음 조건을 이용하여, 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems) 7500 실시간 PCR 시스템을 사용하여 반응을 수행하였다: 역전사 단계 (48℃ 하에 15분)에 이어 변성 단계 (95℃ 하에 2분), 및 95℃ 하에 15초 및 60℃ 하에 1분의 40주기. 각 샘플에서의 유전자 발현 수준은 내인성 대조군으로서 GAPDH 유전자를 사용하고 기준으로서 마우스 태반 총 RNA (공급처: Clontech, Mountain View, CA)를 사용하여, 상대적 정량화 방법 (ddCt 방법)으로 결정하였다.

현저하게, VEGF-A의 평균 상대적 발현은 대조군 IgG 처리된 뇌하수체 종양, 작은 비-처리된 종양, 및 야생형 또는 Men1^+/- 마우스로부터의 정상 뇌하수체와 비교해서 mAb G6-31 처리된 계내 선종에서 상당히 상승되었다 (도 6). VEGF-A 발현은 양 피하 종양 이식체 샘플에서 비교적 높았다. mAb G6-31 처리된 종양에서 VEGF-A 전사체가 높은 수준으로 관찰되는 것은 잠재적으로, mAb G6-31에 의한 VEGF-A의 전신 봉쇄에 대한 대상성 기전 결과이다. 그러나, 상승된 VEGF-A는 종양 성장을 구동시키기에 충분치 않은 것으로 여겨졌다.

VEGFR-1의 평균 상대적 발현은 상이한 조직 샘플 내에서 당연히 변하지 않는 것으로 여겨졌지만, VEGFR-2의 평균 상대적 발현은 종양 이식체, 작은 비-처리된 종양, 또는 야생형 및 Men1^+/- 마우스로부터의 정상 뇌하수체에서 발견된 것과 비교해서 대조군 IgG 또는 mAb G6-31로 처리된 계내 종양 샘플에서 더 낮아진 것으로 여겨졌다 (도 6).

MRI 는 종양 성장을 생체내 추적할 수 있게 해준다

MRI는 동물을 대상으로 하여 격주로 영상화함으로써, 치료 기간 내내 계내 뇌하수체 선종의 성장을 추적하기 위해 상기 언급된 바와 같이 사용하였다. 치료 개시 후 9일, 39일 및 67일째에 취한, 1마리의 대조군 IgG 및 1마리의 mAb G6-31 처리된 Men1^+/- 마우스로부터의 대표적 선종을 수반한 뇌의 관상 박편의 그래프가 도 7에 도시되었다.

뇌하수체 및 췌장 종양의 조직학

Men1^+/- 뇌하수체 선종은 mAb G6-31 처리된 마우스와 대조군 IgG 처리된 마우스에서 조직학적으로 유사하였다 (도 8A-B). 이들 실험을 위해, 포르말린 고정시킨 조직을 탈수시키고 파라핀에 포매시키며, 박편으로 나눈 다음, 표준 프로토콜에 따라서 조직학적 분석을 위해 헤마톡실린-에오신 (H&E)으로 염색하였다. 전형적으로, 종양 세포는 작고 (직경이 약 10 마이크론이다), 고 핵/세포질 비를 갖고 있으며, 종종 유사분열적으로 활성이고, 10개 625-마이크론 직경 시야당 40개 이하의 유사분열 형상을 갖는다. 종양은 가변적으로 고형 또는 낭종성인데, 다중 내피 세포-라이닝된 혈관, 끝이 뾰족한 출혈 부위 (비-내피-라이닝된 공간 내의 본래의 적혈구 세포, 피브린 또는 세포성 구성의 부재) 및 산란된 헤모시데린 (hemosiderin)을 충분히 가진 대식 세포 (기존의 출혈과 일치됨)을 수반하였다. 가변 단일 세포 괴사와 최소한의 섬유증이 있었다. 종양 용적은 불규칙적으로 이격되었는데, 전형적으로 직경이 5 내지 10 마이크론이지만, 드물게는 비-종양 혈관주위 간질 세포가 거의 없는 50 마이크론 정도로 크다.

범내피 세포 마커 항체 MECA-32로 간접적으로 면역조직화학적 염색함으로써, 대조군 IgG 처리된 종양과 mAb G6-31 처리된 종양 간의 혈관 패턴을 관찰하였다 (도 8C-D). 이들 실험을 위해, 포르말린 고정시키고, 파라핀 포매시킨 조직 박편을 탈파라핀화시킨 후, 내인성 퍼옥시다제 활성을 켄칭하고 아비딘 및 바이오틴 (공급처; Vector, Burlingame, CA)을 차단시켰다. 3％ BSA를 수반한 PBS 중의 10％ 정상 토끼 혈청을 이용하여 박편을 30분 동안 차단시켰다. 이어서, 조직 박편을 60분 동안 일차 항체와 함께 항온 배양하고, 30분 동안 바이오티닐화 이차 항체와 함께 항온 배양하며, 30분 동안 ABC 시약 (공급처: Vector, Burlingame, CA)에서 항온 배양한 다음, 금속 증강된 DAB (공급처: Pierce, Rockford, IL)에서 5분 동안 항온 배양하였다. 이어서, 박편을 마이어 헤마톡실린으로 대조염색하였다. 사용된 일차 항체는 0.10 ㎍/ml의 염소 항-마우스 프롤락틴 (공급처: R&D systems, Minneapolis, MN) 및 2 ㎍/ml의 래트 항-마우스 범내피 세포 항원, 클론 MECA32 (공급처: BD Biosciences, San Jose, CA)였다. 사용된 이차 항체는 7.5 ㎍/ml의 바이오티닐화 토끼 항-염소 (공급처; Vector, Burlingame, CA) 및 2.5 ㎍/ml의 바이오티닐화 토끼 항-래트 (공급처: Vector, Burlingame, CA)였다. 범내피 세포 항원 염색을 위해서는 99℃ 하에 20분 동안 타겟 레트리발 (공급처: DAKO, Glostrup, Denmark)로 전처리시켜야 한다. 기타 모든 단계는 실온 하에 수행하였다.

혈관 밀도는 mab G6-31 처리에 의해, 대조군 IgG-처리된 종양의 혈관 밀도의 46％로 상당히 감소되었다 (p-값=0.009; 도 8I). 양 처리군에서, 종양 혈관성은 정상적인 인접한 전방 뇌하수체에서 보다 덜하였다. 혈관 밀도를 정량화하기 위하여, MECA-32-염색된 박편을 10배 대물렌즈를 사용하여 아리올 SL-50 슬라이드 스캐닝 플랫폼 (공급처: Applied Imaging; San Jose, CA)으로 분석하였다. 뇌하수체 종양 부위를 확인하고 수동으로 그 윤곽을 나타내었다. MECA-32 염색에 상응하는 픽셀 색상을 규정하고, 이에 따라 혈관 면적을 측정하였다. 종양 세포 핵을 픽셀 색상 및 물체 형상에 의해 확인하였다. 이어서, 혈관 면적을 뇌하수체 종양 세포 수로 표준화시켰다. 췌장 섬을 유사하게 분석하였는데, 단 MECA-32 염색 면적은 섬 종양 면적으로 표준화시켰다.

뇌하수체 종양 이외에도, 췌장 섬 종양을 상기 처리된 Men1^+/- 마우스에서 종종 확인하였고, 이를 연구 종말점에서 조직학적으로 분석하였다. 섬 종양 (박편 평면에서 10⁵ ㎛² 보다 큰 것으로 정의된다)은 전형적으로, 상당한 출혈이나 괴사를 수반하지 않는 고형이다. 항-VEGF-A Mab G6-31로 처리된 6마리 동물로부터의 종양 (n=32 종양)은 평균적으로, 대조군 IgG로 처리된 5마리 동물로부터의 종양 (n=45 종양; p-값 = 0.026) 면적의 39％ 만을 나타내었다. 대조군 IgG로 처리된 췌장 선종 (도 8E-F)은 일반적으로, mAb G6-31 처리된 선종 (박편 평면에서의 종양 직경은 5.0 mm 이하이다) 보다 더 크고 (박편 평면에서 7.0 mm 이하) 보다 더 혈관성인 것으로 여겨졌다. 대조군 IgG로 처리된 7마리 마우스 중의 4마리에게서, 췌장 종양은 확장되고, 혈액 충만되며, 얇은 벽이 형성되고, 내피-라이닝된 300 ㎛ 이하 직경의 공간을 함유하고 있는 반면, mAb G6-31 처리된 마우스 중의 췌장 선종은 종종 현저한 혈관성이 결여되었다 (도 8G-H). mAb G6-31로 처리된 8마리 마우스 중의 1마리로부터의 췌장 종양은 확장된 혈관을 나타내었다. 헤모시데린을 많이 가진 대식 세포는 어느 한 처리를 이용한 경우에 췌장 종양으로부터 간헐적으로 발견되었는데, 이는 섬 출혈을 시사한다.

섬 종양의 혈관 밀도는 G6-31 처리에 의해 대조군 IgG-처리된 섬 종양의 혈관 밀도의 56％로 상당히 감소되었다 (p-값 = 2 x 10^-7). 또한, Mab G6-31-처리된 마우스로부터의 "정상" 섬 (박편 평면에서 10⁵ ㎛² 미만)은 혈관 밀도가 대조군 IgG-처리된 동물의 76％로 보다 적은 정도로 감소되었다 (p-value=4 x 10^-7; 도 8J 참고). 대조군 IgG로 처리된 단일 숫컷 동물은 MEN1 증후군 선에서 인식된 종양 유형인 고립성 12 mm 직경 부신 피질 종양을 갖고 있었다.

피하 뇌하수체 선종 이식체의 조직학은 계내 뇌하수체 종양과 거의 동등한 수준이었는데, 이는 원격 유전자 자리에서 내분비 종양 성장의 성공적인 반복발생을 나타낸다.

Men1 뇌하수체 선종은 프롤락틴 분비 선종 ( Prolactinoma )이다

MEN1 환자에서 뇌하수체 선종의 대략 60％는 프롤락틴 (PRL), 25％ 미만의 성장 호르몬 (GH), 및 5％ 부신피질자극 호르몬 (ACTH)을 분비한다 [참고: Trump et al., QJM 89:653-669 (1996)]. Men1^+/- 마우스의 뇌하수체 선종이 PRL을 분비하는 지를 연구 조사하기 위하여, 항-PRL 항체를 이용한 면역조직화학적 염색을 대조군 IgG 및 mAb G6-31 처리된 계내 뇌하수체 선종 뿐만 아니라 뇌하수체 종양 이식체 상에서 수행하였다. 6개의 대조군 IgG 처리된 뇌하수체 선종 중의 6개와, 5개의 mAb G6-31 처리된 뇌하수체 선종 중의 5개가 세포의 대략 50 내지 95％에서 프롤락틴에 대한 특이적 양성 염색을 나타내었는데, 이로써 이들은 프롤락틴 분비 선종으로서 확립되었다 (도 9A-9B). 이러한 결과와 연계해서, 다음 문헌에는 Men1^TSM/+ 뇌하수체 종양이 면역조직화학적 염색에서 PRL에 대해 양성이었다고 보고되었다 [참고: Crabtree et al., Proc . Natl . Sci USA 98:1118-1123 (2001)]. 프롤락틴 염색은 어느 한 치료를 이용한 뇌하수체 선종 이식체에서 또한 양성이었다 (도 9C-9D). 이들 종양으로부터의 기능적 프롤락틴 분비와 일치하게, 이식된 뇌하수체 선종을 보유하고 있는 암컷 마우스의 유선 조직은 대조군 IgG 처리된 동물과 항-VEGF-A-처리된 동물 둘 다에서 중간 수준 내지 현저한 수준의 수유성 변화를 변함없이 나타내었다 (도 9 E,F).

면역조직화학적 염색에 의해 평가한 바와 같이, 11개의 비-처리된 원발성 뇌하수체 종양 중의 6개는 병소적이고 성장 호르몬에 대해 약하게 양성인 반면 (도 14A), 4개의 이식된 뇌하수체 종양 중의 1개 만이 병소적 약한 염색을 나타내었다 (도 14B). 성장 호르몬 발현은 G6-31 및 대조군 IgG 처리된 계내 뇌하수체 종양 둘 다에 존재하였다 (도 6C,D). 정상적인 전방 뇌하수체는 세포의 약 20 내지 30％에서 강력한 반응성을 나타내었다 (도 14A).

혈청 프롤락틴 수준은 처리되지 않은 마우스 및 대조군 IgG 처리된 마우스에서의 뇌하수체 종양 용적과 상관이 있고 mAb G6-31 처리에 의해 감소된다

Men1^+/- 마우스로부터 조사된 모든 대조군 IgG 및 모든 mAb G6-31 처리된 뇌하수체 선종이 면역조직화학적 분석에 의해 프롤락틴에 대해 양성이었다고 가정하고, 본 발명자들은 혈청 PRL 수준이 Men1^+/- 뇌하수체 선종-보유 마우스에서 상승하였는지를 연구 조사하였다. 이를 위하여, 본 발명자들은 초기에, 46마리의 비-처리된 암컷 Men1^+/- 마우스를 대상으로 하여 그들의 뇌하수체 종양 상태 및 혈청 PRL 수준에 관하여 분석하였고, 5마리 암컷 야생형 한배 새끼 대조군을 대상으로 하여 혈청 PRL 수준에 관하여 분석하였다. 혈청 프롤락틴 양은 다음 기관 [National Hormone & Peptide Program at Harbor UCLA (Torrance, CA)]에 의해 분석하였다.

이들 마우스의 연령 범위는 15.6 내지 10.5개월인데, 평균 연령은 13.3개월이었다. 야생형 마우스의 평균 혈청 PRL 수준은 43.8±25.3 (±SEM) ng/ml였다. 46마리 Men1^+/- 마우스 중의 27마리는 MRI 분석에서 검출가능한 뇌하수체 종양을 갖고 있지 않았다. 이들 마우스의 평균 혈청 PRL 수준은 69.0±24.6 ng/ml였다. 10마리 마우스 군은 평균 용적이 1.7±0.6 ㎣인 작은 뇌하수체 종양을 갖고 있었다. 이들 마우스의 혈청 PRL 수준은 평균 188.7±61.9 ng/ml로 상승되었다. 큰 뇌하수체 종양 (평균 용적 83.1±23.8 ㎣)을 갖는 9마리 마우스는 평균 혈청 PRL 수준이 13239.8±3466.5 ng/ml였다. 이들 데이터는 Men1^+/- 마우스에서 혈청 PRL 수준과 뇌하수체 종양 용적 간에는 양성적 상관 관계가 존재한다는 것을 확립시켜 주는데 (도 10A) [퍼슨 (Pearson) 상관 계수 R=O.94], 이는 혈청 PRL 수준이 뇌하수체 종양 상태의 평가를 확립시키는 데에 있어서 진단 도구로서 유용할 수 있다는 것을 제안하고 있다.

항-VEGF-A 처리가 혈청 PRL 수준에 대해 영향을 미쳤는지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 연구 종말점에서 (67일째) 계내 뇌하수체 선종을 수반한 7마리 대조군 IgG 처리된 Men1^+/- 마우스와 7마리 mAb G6-31 처리된 Men1^+/- 마우스의 혈청을 분석하였다. 대조군 IgG-처리된 마우스에서는, 평균 혈청 PRL 수준이 12566.7±3047.4 ng/ml으로 상승하였고, 일반적으로 종양 용적이 증가함에 따라 (평균 116.2±18.5 ㎣) 증가하였다 [R=0.80 (p<0.03)]. 분석된 mAb G6-31-처리된 Men1^+/- 마우스에서는, 혈청 PRL 수준이 5163.7±1608.9 ng/ml로 여전히 더 낮았지만, 종양 용적과의 통계적 상관 관계는 분명하지 않았다 (평균 종양 용적 35.3±6.5 ㎣) [R=-0.12 p<0.80] (도 10B). 그럼에도 불구하고, 이들 데이터는 mAb G6-31이 뇌하수체 선종 성장을 억제하긴 하지만, 대조군 IgG 처리된 마우스와 비교해서 평균 혈청 PRL의 감소를 유도시키기도 한다는 것을 표시한다 (p<0.053).

항- VEGF -A 처리는 피하 뇌하수체 종양 이식체를 수반한 마우스에서 혈청 PRL 수준을 저하시킨다

상기 데이터는 항-VEGF-A 항체 처리가 종양을 보유하고 있는 Men1^+/- 마우스에서 PRL의 혈청 수준을 저하시킨다고 나타내긴 하지만, 본 발명자들은 Balb/c 누드 마우스에서 피하 뇌하수체 선종 이식체의 맥락에서 이를 추가로 연구 조사하였다. 혈청 PRL을 처리 개시 (1일째) 및 연구 종말점 (35일째)에 수거된, 23마리의 대조군 IgG 처리된 마우스 및 35마리의 mAb G6-31 처리된 마우스로부터 유래되는 샘플로부터 측정하였다. 1일째의 평균 혈청 PRL이 두 처리군 간에 거의 동등한 수준이긴 하였지만, 35일째 mAb G6-31 처리는 혈청 PRL 수준을 상당히 감소시켰다 (각각 도 10 C 및 D).

MEN1 프롤락틴 분비 선종에 대한 현재의 치료법에는 의학 요법 또는 선택적 뇌하수체절제술에 이어 방사선 요법이 포함되기 때문에, mAb Gb-31 처리로 인해 PRL 혈청 수준이 저하되고 종양 성장이 현저하게 억제된다는 것을 나타내는 본 발명자들의 데이터는 MEN1 환자에 대한 잠재적인 새로운 치료적 접근 방식을 제공해준다.

혈청 인슐린 수준은 Men1 ^+/- 마우스에서 상승된다

혈청 인슐린 수준이 Men1^+/- 마우스에서 상승되었는지를 조사하기 위하여, 조직학적 분석에서 췌장 병변이 있는 것으로 모두 확인된, 대조군 IgG로 처리된 6마리의 단식시키지 않은 마우스와, mAb G6-31로 처리된 6마리의 단식시키지 않은 마우스로부터 혈청 샘플을 분석하였다. 혈청 인슐린 수준은 또한, 제조업자의 지시 (Mercodia, Uppsala, Sweden)에 따라서 초민감성 마우스 인슐린 ELISA 키트를 사용하여 5마리의 단식시키지 않은 연령 적합 야생형 마우스로부터 분석하였다. 처리와의 상관 관계는 관찰되지 않았지만, 평균 혈청 인슐린은 야생형 마우스 (1.4±0.7 ng/ml (±SEM))와 비교해서 Men1^+/- 마우스에서 현저하게 상승되었다 (대조군 IgG, 3.8±2.6 ng/ml; mAb G6-31, 3.7±2.4 ng/ml).

논의

본 발명자들의 데이터는 VEGF-A가 MEN1의 마우스 모델에서 양성 뇌하수체 선종의 성장에 요구된다는 것을 표시하는데, 이는 VEGF-A에 대항한 모노클로날 항체를 이용한 요법이 종양 성장 억제에 충분한 것으로 밝혀졌기 때문이다.

입수 가능한 문헌에 기초하여, mAb G6-31의 수 많은 관찰된 항종양 효과는 VEGFR-2-의존성 혈관형성의 억제에 의해 매개되는 것이 가능하다 [참고: Wise et al., Proc . Natl . Acad . Sci . 96:3071-3076 (1999) and Zachary et al., Cardiovasc. Res. 49:568-581 (2001)]. 큰 뇌하수체 선종에서의 VEGFR-2 mRNA의 상대적 평균 발현은 항-VEGF-A 처리에 의해 상당한 영향을 받지 않았기 때문에 (도 6), MECA-32에 대한 면역조직화학적 염색은 Mab G6-31로 처리된 뇌하수체 종양과 췌장 종양 둘 다에서 혈관성 상의 상당한 감소 (대략 50％ 감소)를 나타내었다. 항-VEGF-A-처리된 종양 성장에 있어서의 상응하는 감소가 뇌하수체 선종과 췌장 선종 둘 다에서 인지되었다. 정상 췌장 섬에서의 혈관 밀도 또한, 항-VEGF-A 처리에 의해 상당히 감소되었지만, 변화 크기 (대조군 IgG 처리된 경우의 25％ 감소)는 췌장 선종에서 관찰된 것 보다 덜하였다.

Mab G6-31 처리된 종양에서 관찰된 높은 수준의 VEGF-A 전사체는 잠재적으로, Mab G6-31에 의한 VEGF-A의 전신 봉쇄에 대한 대상성 기전 결과이다. 그러나, 이러한 상승된 VEGF-A는 종양 성장을 구동시키기에 충분치 않은 것으로 여겨졌다.

항-VEGF-A mAb G6-31 처리를 이용한 단일요법이 선종 성장을 효과적으로 억제함으로써 Men1^+/- 마우스의 종양 존재량을 상당히 저하시켰다는 사실을 밝혀낸 것 이외에도, 본 발명자들은 혈청 프롤락틴 수준을 또한 저하시켰다는 사실을 밝혀내었다. 따라서, 본 발명자들의 데이터는 화학요법제를 사용하지 않고서도 질병 진행을 중지시키면서 내분비의 양성 종양에 대한 비-외과적 치료 가능성을 제안하고 있다. 또 다른 한편, 이러한 VEGF-A 차단은 약리학적 작용제와 병용할 수 있다. 예를 들어, 프롤락틴 분비성 선종의 경우에는, VEGF-A 길항제를 도파민 작동제와 병용할 수 있다.

실시예 3. 다중-병기 발암 현상의 RIP -Tβ Ag 모델에서 항- VEGF 개입 효능 및 퇴행/생존 효능

종양 성장의 각종 단계에서 항-VEGF 요법의 역할을 보다 잘 이해하기 위하여, 본 발명자들은 RIP-TβAg를 포함한 수 많은 전임상 종양 모델에 집중하였다. RIP-TβAg (공급처: Exelixis, Inc.)는 SV40 대형 T 항원 (TAg) (췌장성 β-세포를 표적으로 하는데, TAg는 p53 및 Rb 둘 다와 결합함으로써 강력한 종양형성 유전자로서 기능한다)의 트랜스제닉 발현에 의해 구동된 마우스 췌장 섬 종양 모델의 조건부 버전이다. RIP-TβAg는 기존에 보고된 RIP-TAg 모델과 표현형별로 유사하다 [참고: Hanahan, Nature 315:115-122 (1985); Bergers et al., Science 284 (808-811), 1999]. 본 발명자들은 이러한 모델이 대략 5주째에 VEGF 신호 전달 및 "혈관형성 전환"의 활성화 (즉, 새로운 혈관을 형성하는 과정의 개시)를 포함한, 더욱 더 침습성이 강해지는 일련의 단계를 통하여 진행된다는 사실을 밝혀내었다. 작은 종양은 10주까지 형성되는데, 그의 악성 전환 개시가 동시에 일어난다. 큰 침습성 암종은 12주까지 형성된다. 따라서, 10주 연령이 되기 전에, 마우스에서의 세포 성장은 악성 또는 전이로 간주되지 않는다. 10주 내지 12주 연령 사이의 기간에 일반적으로, 침습성 암이 형성된다.

이들 실험을 위해, RIP-TβAg 마우스를 사육하고 표준 IACUC 권장 사항에 따라서 처리하였으며, 마우스에게 당분이 많은 음식과 5％ 수크로스 물을 공급하여 췌장에서 인슐린-분비성 베타-세포 증가에 의해 유발된 고인슐린혈증 증상을 경감시켰다. 9 내지 9.5주 또는 11 내지 12주 연령에서는, 마우스에게 매주 2회씩 멸균성 인산염 완충 식염수 중의 5 mg/kg 항-VEGF 항체 또는 이소형 적합 항-두드러기쑥 (rageweed) 대조군 모노클로날 항체를 복강내 주사함으로써 처리하였다. "개입 시도"에서는, 9 내지 9.5주령 마우스를 14일 동안 처리한 다음, 조사하였다. "퇴행 시도"에서는, 11 내지 12주령 마우스를 처리한지 7일, 14일 및 21일 후에 조사하였다. 생존율을 조사하기 위하여, 마우스가 발병률 또는 사망률이 나타날 때까지 마우스의 또 다른 코호트를 처리하였다. 개입 및 퇴행 시도에서 각각의 규정된 시점에서, 각 마우스의 췌장과 비장을 꺼내어 사진을 찍었다. 췌장 내의 종양 수는 각 구형 종양을 해부하고 계수함으로써 결정하였다. 종양 존재량을 결정하고, 각 종양의 2개의 가장 큰 직경을 측정하고, 회전 타원체 용적 계산치 (y를 2배 곱한다)에 0.52를 곱하여 용적을 계산하였다. 마우스의 췌장 내의 모든 종양의 용적을 합계내어 총 종양 존재량을 결정하였다. 평균 및 표준 편차를 계산하고, 마이크로소프트 엑셀 (Microsoft Excel) v11.3.3 (공급처: Microsoft, Inc.)을 이용하여 데이터를 그래프로 만들었다. 스튜던츠 t 시험을 이용하여 상이한 군으로부터의 종양 수와 존재량 간의 통계학적 비교를 수행하였다. JMP 6.0 (공급처: SAS Institute, Inc.)을 이용하여 생존율 분석을 위한 카플란-마이어 곡선을 생성시키고, 로그-랭크 분석을 이용하여 통계적 비교를 수행하였다.

9주령 동물을 항-VEGF 항체로 처리하면 ("개입" 시도) 종양 혈관형성이 현저하게 감소되었다 (도 11). 11주령 동물을 처리하면 ("퇴행" 시도) 종양 혈관성과 증식이 저하되었다 (도 12a). 그러나, 개입 시도와는 대조적으로, 종양 성장의 일시적 저하만이 검출되었고 생존율에 대한 강한 영향력이 없었다 (도 12b). 이들 연구는 이들 조기 종양이 진행성 종양과 비교해서 항-VEGF 표적화 요법에 대해 더 민감하다는 것을 입증해준다.

실시예 4. 항- VEGF 및 화학요법은 전임상 모델에서 유효하다

수술은 "혈관형성 프로그램"을 재활성화시켜 보다 지수적 종양 성장을 촉진시킬 수 있는 능력을 지닌 잔류성 종양 세포 또는 잠복기 미세전이성 결절을 남겨둘 수 있다.

본 발명자들은 종양을 항-VEGF 요법으로 동시에 또는 순차적으로 "세포감소"시키기 위한 강력한 화학요법 처방에 이어, 항-VEGF 모노클로날 항체를 이용하는 유지 요법을 사용함으로써, 종양 잠복기를 모델로 하기 위해 마우스 유전 종양 및 인간 이종이식편을 사용하였다. 따라서, 본 발명자들은 종양이 몇몇 증례에서 표적화 항-VEGF 요법을 포함한 더 많은 치료에 대해 난치성, 재발성 또는 내성인 종양으로 재형성되거나 종양이 형성된 후에 이를 추적하는 것이 아니라, 종양 재발을 방지하기 위해 마우스를 처치하고 있다. 도 13은 도세탁셀이 종양 존재량을 감소시키는 데에 있어서 다소 유효하긴 하지만, 잠복기 세포는 대략 2개월 후에 재증식한다는 관찰 결과를 도시한 것이다. 그러나, 항-VEGF로 동시 처리하면 종양 재증식이 억제되기는 하지만, 이는 보다 크고 보다 확립된 종양의 성장에 대해서는 강한 영향력을 거의 발휘하지 못하였다. 부가의 데이터는 연장된 항-VEGF 요법이 또한, 탁산 또는 젬시타빈을 이용한 세포감소 후에 종양의 재증식을 억제한다는 것을 입증하고 있다. 이들 결과는 항-VEGF를 사용하여 잠복기 종양 또는 미세전이의 성장 또는 재증식을 효과적으로 차단시킬 수 있다는 것을 입증하고 있다. 이들 발견은 신생혈관증식이 육안으로 보이는 종양의 형성과 연관된 신속한 클로날 확장에 대한 필수 조건이라는 사실과 일치하고; 종양의 초기 치료 후 및 잠복기 종양, 악성 종양 및 미세전이의 재활성화인 새로운 종양의 형성 전에 종양 재증식을 억제하고 종양 잠복기를 유지하는 데에 있어서의 VEGF-특이적 길항제 (예: G6 또는 B20 시리즈 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 항-VEGF 항체)의 용도를 뒷받침해준다.

실시예 5. 베바시주맵을 이용한 네오아주반트 요법

본 실시예는 촉진할 수 있고 수술가능한 유방암 환자의 네오아주반트 요법에 있어서의 베바시주맵의 용도를 예시하고 있다.

네오아주반트 화학요법은 국소적으로 진행되었거나 잠재적으로 수술이 가능한 큰 유방암을 치료하는 데에 광범위하게 사용되어 왔다. 무작위화 시험 결과, 네오아주반트 화학요법은 아주반트 화학요법과 유사한 전반적인 생존율을 나타내면서도 유방절제술에 대한 필요성을 저하시켜 주는 (이로써 유방이 보존된다) 것으로 입증되었다 [참고: Powles et al., J. Clin . Oncol. 13:547-52 (1995); Fisher et al., J. Clin . Oncol. 16:2672-85 (1998)].

본 요법의 주요 목표는 촉진할 수 있고 수술가능한 유방암 환자에서 화학요법에 베바시주맵을 부가함으로써 개선된 임상적 이득을 제공하기 위한 것이다. 구체적으로 언급하면, 네오아주반트 요법의 임상 효능의 일차 측정치 중의 하나는 병리학적 완전 반응율 (pCR)일 수 있다. 기타 측정치에는 전반적인 반응율 (OR), 임상 완전 반응율 (cCR), 질병이 없는 생존율 (DFS) 및 전반적인 생존율 (OS)이 포함된다. 더우기, 이러한 치료의 부작용은, 예를 들어 외과적 합병증 비율, 독성 및 심장 기능에 대한 부작용에 의해 모니터링할 수 있다. 특정의 유전자 발현 또는 기타 생체 마커 활성이 치료에 대한 반응의 마커로서 사용될 수도 있다.

병리학적 완전 반응율 (pCR)은 치료 효능의 예후 마커로서 사용되어 왔다. pCR은 수술시 네오아주반트 요법 후 종양의 잔류 조직학적 증거가 결여된다는 것을 지칭한다. 연구 결과는 pCR을 달성한 환자가 상당히 개선된 생존율을 지녔다고 제안하였다. 그러나, 병리학적 반응을 등급화하기 위한 표준 방법이 없으며, pCR이 효능의 대리 마커로서 사용될 수 있는지의 여부는 여전히 논쟁거리이다.

VEGF-특이적 길항제를 이용한 네오아주반트 요법에 적합한 환자는 치료 중인 특정한 암 유형에 따라서 다양한 예정된 기준과 지침에 기초하여 선별한다. 예를 들어, 환자는 그들의 수명, 연령, 암의 조직학, 혈액학적/간 및 심장 기능, 치료 전력, 생식 상태 및 계획, 및 정신적 또는 습관성 중독 상태에 기초하여 선별할 수 있다. 보다 중요하게, 원발성 종양은 측정 가능해야 하고/하거나 수술 가능해야 한다.

치료 처방에는 화학요법 + VEGF-특이적 길항제 (예: 베바시주맵)가 포함된다. 임의로, 부가의 치료제를 상기 처방에 또한 사용할 수 있다. 전형적으로, 특정한 암 유형에 대해 흔히 사용되고 있는 화학요법 처방 (예: 표준 요법 처방)을 베바시주맵과 병용해서 사용한다. 예를 들어, 네오아주반트로 치료하고 있는 유방암의 경우에는, 도세탁셀, 파클리탁셀 또는 독소루비신/시클로포스파미드 (AC) 처방을 베바시주맵과 병용해서 사용할 수 있다. 또 다른 한편으론, 도세탁셀에 의거한 처방 또는 파클리탁셀에 의거한 처방과 AC 처방은 베바시주맵과 병용된 화학요법으로서 순차적으로 사용할 수 있다. 비소세포 폐암을 치료하는 경우에는, 시스플라틴 (단독으로 또는 기타 화학요법제, 예를 들어 젬시타빈, 도세탁셀 또는 비노렐빈과 병용함)을 베바시주맵과 병용해서 일차 화학요법제로서 사용할 수 있다. 한편, 결장직장암을 치료하는 경우에는, 5-FU에 의거한 처방 (예: FOLFOX)을 베바시주맵과 병용해서 사용할 수 있다.

화학요법제와 VEGF-특이적 길항제 (예: 베바시주맵)는 수 많은 주기 동안 소정의 투여량 및 간격으로 환자에게 투여한다. 예를 들어, 베바시주맵은 4주기 동안 3주마다 15 mg/kg으로 제공되거나 또는 6주기 동안 2주마다 10 mg/kg으로 제공될 수 있다. 또 다른 예에서, VEGF-특이적 길항제 (예: 베바시주맵)는 2주 또는 3주마다 1회씩 7.5 mg/kg으로 투여한다. 치료 동안의 반응을 알아보기 위해 환자를 모니터링한다. 네오아주반트 요법의 완료시, 환자에서 수술을 진행하여 네오아주반트 요법 이전에 수술 가능하였거나 또는 네오아주반트 요법에 반응하여 수술이 가능해진 원발성 종양을 제거하였다. 수술 후, 환자의 특정한 상태에 따라서, 환자에게 화학요법을 수반하거나 수반하지 않으면서 VEGF-특이적 길항제 요법 (예: 베바시주맵)을 지속하였다. 임의로, 환자에게 방사선 요법을 진행시킬 수도 있다. 환자의 진행 과정은 치료 기간 내내 및 치료 후에 모니터링한다.

항-VEGF 치료와 연관된 부작용 (AE)은 면밀히 모니터링하고 관리해야 한다. 기존의 연구로부터 공지된 주요 AE에는 고혈압, 단백뇨, 출혈, 혈전색전증, 위장 천공/누공 및 상처 치유 합병증이 포함된다. 특정의 AE, 예를 들어 고혈압은 약물로 관리할 수 있다. AE가 심각하고 관리할 수 없는 상태인 경우에는, 치료를 중단해야 한다.

실시예 6. 베바시주맵을 이용한 아주반트 요법

본 실시예는 절제된 암이 있는 환자의 아주반트 치료에 있어서 화학요법과 병용된 베바시주맵의 용도를 예시하고 있다.

베바시주맵을 이용한 아주반트 요법에 적합한 환자는 치료 중인 특정한 암 유형에 따라서 다양한 예정된 기준과 지침에 기초하여 선별한다. 예를 들어, 환자는 그들의 수명, 연령, 암의 조직학, 혈액학적/간 및 심장 기능, 생활 방식 전력, 치료 전력, 생식 상태 및 계획, 및 정신적 또는 습관성 중독 상태에 기초하여 선별할 수 있다. 보다 중요하게, 환자는 아주반트 치료 이전에 그의 암을 완전히 절제시켜야만 한다. 허용된 유형의 절제는 특정한 종양 유형에 좌우된다. 또한, 환자의 암을 대표하는 충분한 병리학적 물질도 초기 단계의 분석을 위해 그리고 효능 결정을 위해 입수 가능해야 한다. 치료시, 수술은 꽤 최근이어야 하지만, 환자는 이러한 수술로부터 완전히 회복되어야만 한다. 예를 들어, 환자는 수술 후 3 내지 6주 이상 8 내지 12주 이하에 아주반트 치료를 시작해야만 한다.

치료 처방에는 화학요법 + 베바시주맵이 포함된다. 임의로, 부가의 치료제를 상기 처방에 또한 사용할 수 있다. 전형적으로, 베바시주맵과 병용하는 화학요법제는 치료의 제1 단계 동안에 사용한 다음, 나머지 기 동안에는 베바시주맵을 단일 작용제 유지 치료로서 사용한다. 예를 들어, 환자는 약 4 내지 12주기 동안 화학요법제 및 베바시주맵으로 치료한 다음, 1 내지 2년까지는 베바시주맵 단독으로 치료한다. 화학요법제 + 베바시주맵 치료의 각 주기 기간은 사용된 특이적 작용제와 투여량에 좌우된다. 예를 들어, 베바시주맵은 1주기로서 3주마다 15 mg/kg으로 투여할 수 있거나, 또는 1주기로서 2주마다 5 mg/kg으로 투여할 수 있다. 또 다른 예에서, 베바시주맵은 2주 또는 3주마다 7.5 mg/kg 또는 10 mg/kg으로 투여할 수 있다.

특정한 암 유형에 대해 흔히 사용되고 있는 화학요법 처방 (예: 표준 요법 처방)을 베바시주맵과 병용해서 사용한다. 예를 들어, 유방암의 아주반트 요법의 경우에는, 도세탁셀, 파클리탁셀 또는 독소루비신/시클로포스파미드 (AC) 처방을 베바시주맵과 병용해서 사용할 수 있다. 또 다른 한편으론, 도세탁셀에 의거한 처방 또는 파클리탁셀에 의거한 처방과 AC 처방은 베바시주맵과 병용된 화학요법으로서 순차적으로 사용할 수 있다. 비소세포 폐암을 치료하는 경우에는, 시스플라틴 (단독으로 또는 기타 화학요법제, 예를 들어 젬시타빈, 도세탁셀 또는 비노렐빈과 병용함)을 베바시주맵과 병용해서 일차 화학요법제로서 사용할 수 있다. 한편, 결장직장암을 치료하는 경우에는, 5-FU에 의거한 처방 (예: FOLFOX)을 베바시주맵과 병용해서 사용할 수 있다.

베바시주맵을 이용한 아주반트 치료의 목표는 환자의 생존율, 바람직하게는 질병이 없는 생존율을 개선시키는 것이다. 한편, 베바시주맵과 연관된 모든 부작용은 면밀히 모니터링해야 하는데, 이는 특히 아주반트 치료가 장기간이기 때문이다. 생존율은 카플란-마이어 방법에 의해 평가할 수 있고, 생존율 상의 모든 차이는 층상 로그-랭크 시험을 이용하여 연산처리한다. Cox 비례 위험 모델을 이용한 다가변 분석을 사용하여 생존율에 대한 예후 인자의 동시 효과를 평가한다. Cox 비례 위험 모델을 이용하여 예후 인자와의 상호 작용을 조사한다. 모든 계산을 위해 SAS 통계 소프트웨어 패키지를 사용한다. 데이터는 P 값이 0.05 이하인 경우에 통계학적으로 유의한 것으로 간주된다. 모든 통계적 시험은 양측이다.

항-VEGF 치료와 연관된 부작용 (AE)은 면밀히 모니터링하고 관리해야 한다. 기존의 연구로부터 공지된 주요 AE에는 고혈압, 단백뇨, 출혈, 혈전색전증, 위장 천공/누공 및 상처 치유 합병증이 포함된다. 특정의 AE, 예를 들어 고혈압은 약물로 관리할 수 있다. AE가 심각하고 관리할 수 없는 상태인 경우에는, 치료를 중단해야 한다.

기타 실시양태

전술된 설명으로부터, 본원에 기재된 발명에 대한 변동 및 변형이 이루어질 수 있어 이를 다양한 활용 및 조건에 적응하도록 할 수 있다는 것이 명백할 것이다. 이러한 실시양태 또한, 다음 청구의 범위 내에 포함된다.

본 명세서 내에 언급된 모든 공보, 특허 출원 및 특허, 예를 들어 미국 가특허원 제60/870,741호 (2006년 12월 19일자로 출원됨); 제60/870,745호 (2006년 12월 19일자로 출원됨); 제60/877,267호 (2006년 12월 27일자로 출원됨); 제60/919,638호 (2007년 3월 22일자로 출원됨); 제60/958,384호 (2007년 7월 5일자로 출원됨); 및 제60/989,397호 (2007년 11월 20일자로 출원됨)는 각각의 독립적인 공보, 특허 또는 특허 출원이 참고로 도입된다고 구체적이고도 개별적으로 표시한 경우와 동일한 정도로 본원에 참고로 도입된다.

SEQUENCE LISTING <110> Genentech, Inc. et al. <120> VEGF-Specific Antagonists For Adjuvant and Neoadjuvant Therapy and the Treatment of Early Stage Tumors <130> 50474/014WO6 <150> US 60/989,397 <151> 2007-11-20 <150> US 60/958,384 <151> 2007-07-05 <150> US 60/919,638 <151> 2007-03-22 <150> US 60/877,267 <151> 2006-12-27 <150> US 60/870,745 <151> 2006-12-19 <150> US 60/870,741 <151> 2006-12-19 <160> 5 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 1 caacgtcact atgcagatca tgcg 24 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 2 ggtctagttc ccgaaaccct gag 23 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 3 atgttccagt atgactccac tcacg 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 4 gaagacacca gtagactcca cgaca 25 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 5 aagcccatca ccatcttcca ggagcgaga 29

Claims (1)

1. 유효량의 VEGF-특이적 길항제를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 양성, 전암성 또는 비-전이성 암을 치료하는 방법.

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