KR20090033864A

KR20090033864A - 광학 활성 알코올의 제조방법

Info

Publication number: KR20090033864A
Application number: KR1020097000132A
Authority: KR
Inventors: 모토코 하야시; 데루유키 니카이도; 히로아키 야마모토
Original assignee: 다이셀 가가꾸 고교 가부시끼가이샤
Priority date: 2006-06-05
Filing date: 2007-06-05
Publication date: 2009-04-06
Also published as: CN101501202A; EP2034026A4; WO2007142210A1; US20090203096A1; EP2034026A1; JPWO2007142210A1

Abstract

본 발명은 알코올 탈수소 효소(CpSADH), 알코올 탈수소 효소(ReSADH), 카보닐 환원 효소(ScoPAR), (2S,3S)-부탄디올 탈수소 효소(ZraSBDH), 카보닐 환원 효소(ScGCY1), 트로피논 환원 효소(HnTR1), 트로피논 환원 효소(DsTR1), 또는 알코올 탈수소 효소(BstADHT) 중 어느 한 효소, 해당 효소를 기능적으로 발현하는 미생물 또는 형질 전환주, 또는 그들 처리물을 1,1,1-트리플루오로아세톤에 작용시키는 공정을 포함한 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 알코올 탈수소 효소(PfODH), 해당 효소를 기능적으로 발현하는 미생물 또는 형질 전환주, 또는 그들의 처리물을 1,1,1-트리플루오로아세톤에 작용시키는 공정을 포함한 (R)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올의 제조방법을 제공한다.

Description

광학 활성 알코올의 제조방법{Process for production of optically active alcohol}

본 발명은 각종 의약품, 액정 재료 등의 광학 활성 원료로서 유용한 광학 활성 불소 화합물의 제조방법에 관한 것이다.

하기 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올, 및

[화학식 11]

하기 식(3)에 표시된 (R)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올

[화학식 12]

을 제조하는 방법으로서, 이하 <1>∼<4>에 기재된 방법 등이 알려져 있다.

<1>

식(1)

[화학식 13]

에 표시되는 1,1,1-트리플루오로아세톤을 빵 효모에 의해 부제(不齊) 환원하는 방법(비특허문헌 1).

<2>

식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 부제 보란(borane) 환원제인 DIP-C1에 의해 부제 환원하는 방법(비특허문헌 2).

<3>

1,1,1-트리플루오로-3-브로모아세톤을 부제 볼란 환원제인 DIP-C1에 의해 부제 환원한 후 염기에 의해 광학 활성 에폭시드를 생성시키고, 나아가 하이드라이드(hydride)로 개환하여 광학 활성 알코올을 얻는 방법(비특허문헌 3).

<4>

식(2) 및 식(3)에 표시된 알코올의 라세미체 혼합물의 에스테르를 리파아제에 의한 가수분해 반응으로 속도론적 광학 분할을 하여 광학 활성 알코올을 얻는 방법(비특허문헌 4).

그러나 <1>,<2>,<4>에 기재된 방법은 모두 광학 순도가 낮고, <1>에 기재된 방법은 기질 농도가 0.3%로 대단히 낮음에도 불구하고 촉매가 되는 빵 효모를 용매인 물의 18%, 부원료인 글루코오스를 21%로 하여 기질에 비해 대량으로 사용하기 때문에 효율이 매우 나쁘고, <2>,<3>에 기재된 방법은 고가의 환원제가 필요하고, <3>에 기재된 방법은 공정이 복잡하고, <4>에 기재된 방법은 이론 수율이 50%를 채우지 못하는 등 모두 공업적 제조방법으로서는 문제가 있다.

아울러 본 출원의 발명과 관련된 선행기술 문헌정보는 하기와 같다.

비특허문헌 1: Synthesis, 897-899(1983).

비특허문헌 2: Tetrahedron, 49(9), 1725-1738(1993).

비특허문헌 3: J.0rg.Chem., 60(1), 41-46(1995).

비특허문헌 4: Chem.Lett., 855-856(1996).

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

본 발명은 상기 과제를 감안하여 이루어진 것으로서, 본 발명의 과제는, 식(2) 및 식(3)으로 표현되는 광학 활성 알코올의 새로운 제조를 제공하는 것이다. 보다 구체적으로는, 식(2) 및 식(3)으로 표현되는 광학 활성 알코올을 고수율 및 고순도로 제조하는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자들은 이론 수율이 50%를 채우지 못하는 분할 방법이 아니라 원료를 100% 이용 가능한 케톤을, 입체 선택성이 높은 효소를 사용한 부제 환원 반응으로 환원하여 높은 광학 순도의 광학 활성 알코올을 제조하는 방법을 검토했다.

본 발명자들은 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤(이하 TFAC로 약칭)을 기질로 하여 여러가지 카보닐을 부제 환원하는 효소를 사용하여 식(2) 또는 식(3)에 표시된 광학 활성 1,1,1-트리플루오로-2-프로판올(이하 TFIP로 약칭)의 합성 방법을 검토했다. 그 결과 본 발명자들은,

칸디다·파라프실로시스(Candida parapsilosis) 유래의 알코올 탈수소 효소(CpSADH)(서열번호: 9에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질),

로도코커스·에리쓰로폴리스(Rhodococcus erythropolis) 유래의 알코올 탈수소 효소(ReSADH)(서열번호: 10에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질),

스트렙토마이세스·코엘리컬러(Streptomyces coelicolor) 유래의 카보닐 환원 효소(ScoPAR)(서열번호: 11에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질),

주글로에아·라미게라(Zoogloea ramigera) 유래의 (2S,3S)-부탄디올 탈수소 효소(ZraSBDH)(서열번호: 12에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질),

사카로마이세스·세르비지에(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 카보닐 환원 효소(ScGCY1)(서열번호: 13에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질),

사리풀(Hyoscyamus niger) 유래의 트로피논 환원 효소(HnTR1)(서열번호: 14에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질),

독말풀(Datura stramonium) 유래의 트로피논 환원 효소(DsTR1)(서열번호: 15에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질), 및

디오바실루스·스테아로서모필루스(Geobacillus stearothermophilus) 유래의 알코올 탈수소 효소(BstADHT)(서열번호: 16에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질)이 모두 (S)-TFIP를 90% e.e. 이상의 매우 높은 입체 선택성으로 생성하는 것을 찾아내는데 성공했다.

또한, 본 발명자들은,

피치아·핀란디카(Pichia finlandica) 유래의 알코올 탈수소 효소(PfODH)(서열번호: 18에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질)가 (R)-TFIP를 95% e.e.이상의 매우 높은 입체 선택성으로 생성하는 것을 찾아내는 데 성공했다.

CpSADH(특허제3574682호)는 4-히드록시-2-부타논을 부제 환원하여 (S)-1,3-부탄디올을,

ReSADH(Appl.Microbiol.Biotechnol., 62, 380-386(2003).), ScoPAR(일본특개2005-95022)는 2-옥타논을 부제 환원하여 (S)-2-옥탄올을,

ZraSBDH(일본특개2004-357639)는 2,3-부탄디온을 부제 환원하여 (2S,3S)-부탄디올을,

ScGCY1(FEBS Lett., 238, 123-128, (1988).)은 아세트초산에틸을 부제 환원하여 (S)-히드록시부탄산에틸을,

HnTR1, DsTR1(모두 일본특개2003-230398)은 트로피논을 부제 환원하여 트로핀을,

BstADHT(FEBS Lett., 33, 1-3, (1973).)는 아세트알데히드를 환원하여 에탄올을,

PfODH(WO01-061014)는 2-옥타논을 부제 환원하여 (R)-2-옥탄올을

생성하는 것이 알려져 있었다. 그러나 이들 효소가 TFAC에 대해 활성이 있는지 여부, 활성이 있는 경우 어느 정도의 입체 선택성을 가지고 환원하는지, (S)타입, (R)타입 중 어느 입체를 생성하는지는 예측 불가능했다. 따라서 90% e.e.이상의 높은 선택성으로 (S)-TFIP 또는 (R)-TFIP를 생성하는 것을 찾아낸 것은 놀라운 결과였다.

예를 들면, 사카로마이세스·세르비지에(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 알코올 탈수소 효소(ScADH1,ScADH2)(Arch.Biochem.Biophys., 126, 933-944(1968).)나 사카로마이세스·세르비지에(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 카보닐 환원 효소(ScGRE3)(J.Org.Chem., 63, 4996-5000, (1998).)는 여러가지 케톤의 효소를 작용시킨 경우, 얻어진 (S)-TFIP의 광학 순도는 각각 82.3% e.e., 58.0% e.e., 69.6% e.e.였다.

본 발명은 이와 같은 사정을 감안하여 이루어진 것으로서, 이하 〔1〕∼〔6〕을 제공하는 것이다.

〔1〕하기 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질, 해당 단백질을 기능적으로 발현하는 미생물 또는 형질 전환주, 또는 그들의 처리물을 식(1)

[화학식 14]

에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤에 작용시키는 공정을 포함한 식(2)

[화학식 15]

에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올의 제조방법;

(a)서열번호: 1∼8 중 어느 하나에 기재된 염기서열을 포함한 폴리뉴클레오티드,

(b)서열번호: 9∼16 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

(c)서열번호: 9∼16 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에서, 1 또는 여러 개의 아미노산이 치환, 결실(缺失), 삽입 및/또는 부가된 아미노산으로 이루어진 단백질로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

(d)서열번호: 1∼8 중 어느 하나에 기재된 염기서열로 이루어진 DNA와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및,

(e)서열번호: 9∼16 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열을 가지고, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

〔2〕하기 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질, 해당 단백질을 기능적으로 발현하는 미생물 또는 형질 전환주, 또는 그들 처리물을 식(1)

[화학식 16]

에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤에 작용시키는 공정을 포함한 식(3)

[화학식 17]

에 표시된 (R)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올의 제조방법;

(a)서열번호: 17에 기재된 염기서열을 포함한 폴리뉴클레오티드,

(b)서열번호: 18에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

(c)서열번호: 18에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산으로 이루어진 단백질로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(3)에 표시된 (R)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

(d)서열번호: 17에 기재된 염기서열로 이루어진 DNA와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(3)에 표시된 (R)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및,

(e)서열번호: 18에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열을 가지고 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(3)에 표시된 (R)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

〔3〕하기 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질, 해당 단백질에 대응하는 보효소 및 환원형 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드(NADH) 또는 환원형 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드인산(NADPH)을 재생하는 활성을 가진 탈수소 효소를 동시에 발현하는 형질 전환주, 또는 그들의 처리물을 식(1)

[화학식 18]

[화학식 19]

에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올의 제조방법;

(c)서열번호: 9∼16 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산으로 이루어진 단백질로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

〔4〕하기 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질, 해당 단백질에 대응하는 보효소 및 환원형 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드(NADH) 또는 환원형 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드인산(NADPH)을 재생하는 활성을 가진 탈수소 효소를 동시에 발현하는 형질 전환주, 또는 그들의 처리물을 식(1)

[화학식 20]

[화학식 21]

에 표시된 (R)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올의 제조방법;

(e)서열번호: 18에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열을 가지고, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(3)에 표시된 (R)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

〔5〕환원형 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드(NADH) 또는 환원형 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드인산(NADPH)을 재생하는 활성을 가진 탈수소 효소가 글루코오스 탈수소 효소 또는 포름산 탈수소 효소인 〔3〕 또는 〔4〕에 기재된 방법,

〔6〕하기 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질, 해당 단백질을 기능적으로 발현하는 미생물 또는 형질 전환주, 또는 그들의 처리물을 pH5.0∼6.4의 범위에서 식(1)

[화학식 22]

에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤에 작용시켜, 식(2)

[화학식 23]

에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 안정적으로 광학 순도 99.5% e.e.이상으로 제조하는 방법;

(a)서열번호: 1에 기재된 염기서열을 포함한 폴리뉴클레오티드,

(b)서열번호: 9에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

(c)서열번호: 9에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산으로 이루어진 단백질로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

(d)서열번호: 1에 기재된 염기서열로 이루어진 DNA와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및,

(e)서열번호: 9에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열을 가지고, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.

[발명의 실시의 형태]

본 발명은 광학 활성의 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 효소적으로 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은, 본 발명자들이 본 발명의 효소, 해당 효소를 기능적으로 발현하는 미생물 또는 형질 전환주 또는 그들의 처리물을 식(1)

[화학식 24]

에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤에 작용시킴으로써 식(2)

[화학식 25]

에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 효율적으로 제조할 수 있다는 것을 찾아낸 것에 기초로 한다.

상기 식(1)에서 식(2)으로의 반응을 촉매하는 효소로서는,

·알코올 탈수소 효소(CpSADH),

·알코올 탈수소 효소(ReSADH),

·카보닐 환원 효소(ScoPAR),

·(2S,3S)-부탄디올 탈수소 효소(ZraSBDH),

·카보닐 환원 효소(ScGCY1),

·트로피논 환원 효소(HnTR1),

·트로피논 환원 효소(DsTR1), 또는

·알코올 탈수소 효소(BstADHT)가 포함된다.

또한, 본 발명은 광학 활성의 (R)-1,1,1-트리플루오로아세톤을 효소적으로 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은, 본 발명자들이 본 발명의 효소, 해당 효소를 기능적으로 발현하는 미생물 또는 형질 전환주, 또는 그들의 처리물을 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤에 작용시킴으로써, 식(3)

[화학식 26]

에 표시된 (R)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 효율적으로 제조할 수 있는 것을 찾아낸 것에 기초한다.

여기에서, 상기 식(1)로부터 식(3)으로의 반응을 촉매하는 효소로서는, 알코올 탈수소 효소(PfODH)를 들 수 있다. 또한, 본 명세서에서는 식(1)에서 식(2)으로의 반응을 촉매하는 효소 및 식(1)에서 식(3)으로의 반응을 촉매하는 효소를 「카보닐 환원 효소 활성을 가진 효소」라고 칭한다.

효소

이하, 본 발명의 효소(알코올 탈수소 효소(CpSADH), 알코올 탈수소 효소(ReSADH), 카보닐 환원 효소(ScoPAR), (2S,3S)-부탄디올 탈수소 효소(ZraSBDH), 카보닐 환원 효소(ScGCY1), 트로피논 환원 효소(HnTR1), 트로피논 환원 효소(DsTR1), 알코올 탈수소 효소(BstADHT) 또는 알코올 탈수소 효소(PfODH))에 대해서 설명한다.

우선, 본 발명에서의 알코올 탈수소 효소(CpSADH)로서는, 서열번호: 9에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질을 들 수 있다. 또한, 해당 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로서는, 서열번호: 1에 기재된 염기서열을 들 수 있다. 더우기 본 발명의 알코올 탈수소 효소(CpSADH)에는,

(1)서열번호: 9에 기재된 아미노산 서열에서, 1 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산으로 이루어진 단백질로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

(2)서열번호: 1에 기재된 염기서열로 이루어진 DNA와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및,

(3)서열번호: 9에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열을 가지고, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질도 포함된다.

본 발명에 이용되는 카보닐 환원 효소(CpSADH)는, 특허제3574682호에 기재된 방법에 의해 칸디다·파라프실로시스(Candida parapsilosis)로 제조할 수 있다. 또한, 칸디다·파라프실로시스 유래 CpSADH를 코딩하는 서열번호: 1에 기재된 DNA를, 칸디다·파라프실로시스 등에서 PCR 등에 의해 클로닝하고, 대장균 등 이종의 숙주에 발현 가능한 형태로 도입한 재조합체를 사용하여 CpSADH를 발현하고 재조합체로부터 해당 효소를 얻을 수도 있다.

본 발명에 의한 CpSADH의 효소 활성의 측정은 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 다음과 같이 할 수 있다. 즉, 100mM 트리스-염산 완충액(pH 9.0), 2.5 mM NAD⁺, 50mM(S)-1,3-부탄디올 및 효소를 포함한 반응액 중에서 30℃에서 반응시키고 NADH의 생성으로 유래하는 340nm의 흡광도 증가를 측정하는 방법을 들 수 있다. 더우기, 이 경우 1U는 1분 동안에 1㎛ol의 NADH의 생성을 촉매하는 효소량으로 한다.

다음으로, 알코올 탈수소 효소(ReSADH)에 관하여 설명한다. 본 발명에서의 알코올 탈수소 효소(ReSADH)로서는, 서열번호: 10에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질을 들 수 있고, 또 해당 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로서는, 서열번호: 2에 기재된 염기서열을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 알코올 탈수소 효소(ReSADH)에는,

(1)서열번호: 10에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산으로 이루어진 단백질로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

(2)서열번호: 2에 기재된 염기서열로 이루어진 DNA와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및,

(3)서열번호: 10에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열을 가지고, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드

에 의해 코딩되는 단백질도 포함된다.

본 발명에 이용되는 알코올 탈수소 효소(ReSADH)는, Appl.Microbiol.Biotechnol., 62, 380-386(2003)에 기재된 방법에 의해 로도코커스·에리쓰로폴리스(Rhodococcus erythropolis)로 제조할 수 있다. 또한, 로도코커스·에리쓰로폴리스 유래 ReSADH를 코딩하는 서열번호: 2에 기재된 DNA를 로도코커스·에리쓰로폴리스 등으로부터 PCR 등에 의해 클로닝하고, 대장균 등 이종의 숙주에 발현 가능한 형태로 도입한 재조합체를 사용하여 ReSADH를 발현하고, 재조합체에서 해당 효소를 얻을 수도 있다.

본 발명에 의한 ReSADH의 효소 활성의 측정은 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 다음과 같이 확인할 수 있다. 즉, 100mM 트리스-염산 완충액(pH 9.0), 2.5mM NAD⁺, 5mM(S)-2-옥탄올 및 효소를 포함한 반응액 중에서 30℃에서 반응시키고, NADH의 생성으로 유래하는 340nm의 흡광도 증가를 측정한다. 더우기 이 경우, 1U는 1분 동안 1㎛ol의 NADH의 생성을 촉매하는 효소량으로 한다.

다음으로, 카보닐 환원 효소(ScoPAR)에 관하여 설명한다. 본 발명에서 카보닐 환원 효소(ScoPAR)로서는, 서열번호: 11에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질을 들 수 있다. 또 해당 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로서는, 서열번호: 3에 기재된 염기서열을 들 수 있다. 또 본 발명의 카보닐 환원 효소(ScoPAR)에는,

(1)서열번호: 11에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산으로 이루어진 단백질로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

(2)서열번호: 3에 기재된 염기서열로 이루어진 DNA와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및,

(3)서열번호: 11에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열을 가지고, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드

에 의해 코딩되는 단백질도 포함된다.

본 발명에 이용되는 카보닐 환원 효소(ScoPAR)는, 일본특개2005-95022에 기재된 방법에 의해 스트렙토마이세스·코엘리컬러(Streptomyces coelicolor)로부터 제조할 수 있다. 또한, 스트렙토마이세스·코엘리컬러 유래 ScoPAR를 코딩하는 서열번호: 3에 기재된 DNA를 스트렙토마이세스·코엘리컬러 등으로부터 PCR 등에 의해 클로닝하고 대장균 등 이종의 숙주에 발현 가능한 형태로 도입한 재조합체를 사용하여 ScoPAR을 발현하고, 재조합체로부터 해당 효소를 얻을 수도 있다.

본 발명에 의한 ScoPAR의 효소 활성의 측정은 여기에 한정되지는 않지만, 예를 들면 다음과 같이 확인할 수 있다. 즉, 100mM 트리스-염산 완충액(pH 9.0), 2.5mM NAD⁺, 5mM(S)-2-옥탄올 및 효소를 포함한 반응액 중에서 30℃에서 반응시키고, NADH의 생성으로 유래하는 340nm의 흡광도 증가를 측정한다. 1U는, 1분 동안에 1㎛ol의 NADH 생성을 촉매하는 효소량으로 한다.

다음으로, (2S,3S)-부탄디올 탈수소 효소(ZraSBDH)에 관하여 설명한다. 본 발명에서 (2S,3S)-부탄디올 탈수소 효소(ZraSBDH)로서는, 서열번호: 12에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질을 들 수 있고, 또 해당 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로서는, 서열번호: 4에 기재된 염기서열을 들 수 있다. 또 본 발명의 (2S,3S)-부탄디올 탈수소 효소(ZraSBDH)에는, 하기 (1)∼(3)

(1)서열번호: 12에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산으로 이루어진 단백질로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

(2)서열번호: 4에 기재된 염기서열로 이루어진 DNA와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및,

(3)서열번호: 12에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열을 가지고, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드

에 의해 코딩되는 단백질도 포함된다.

본 발명에 이용되는 (2S,3S)-부탄디올 탈수소 효소(ZraSBDH)는, 일본특개2004-357639에 기재된 방법에 의해 주글로에아·라미게라(Zoogloea ramigera)로부터 제조할 수 있다. 또 주글로에아·라미게라 유래의 ZraSBDH를 코딩하는 서열번호: 4에 기재된 DNA를, 주글로에아·라미게라 등으로부터 PCR 등에 의해 클로닝하고, 대장균 등 이종의 숙주에 발현 가능한 형태로 도입한 재조합체를 사용하여 ZraSBDH를 발현하고 재조합체로부터 해당 효소를 얻을 수도 있다.

본 발명에 의한 ZraSBDH의 효소 활성의 측정은 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 다음과 같이 확인할 수 있다. 즉, 100mM 인산 완충액(pH8.0), 2.5mM NAD⁺, 50mM(2S,3S)-부탄디올 및 효소를 포함한 반응액 중에서 30℃에서 반응시켜 NADH의 생성으로 유래하는 340nm의 흡광도 증가를 측정한다. 1U는, 1분 동안에 1㎛ol의 NADH의 생성을 촉매하는 효소량으로 한다.

다음으로, 카보닐 환원 효소(ScGCY1)에 관하여 설명한다. 본 발명에서의 카보닐 환원 효소(ScGCY1)로서는, 서열번호: 13에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질을 들 수 있다. 또한, 해당 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로서는, 서열번호: 5에 기재된 염기서열을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 카보닐 환원 효소(ScGCY1)에는,

(1)서열번호: 13에 기재된 아미노산 서열에서, 1 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산으로 이루어진 단백질로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

(2)서열번호: 5에 기재된 염기서열로 이루어진 DNA와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및,

(3)서열번호: 13에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열을 가지고, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드

에 의해 코딩되는 단백질도 포함된다.

본 발명에 이용되는 카보닐 환원 효소(ScGCY1)는, 사카로마이세스·세르비지에(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 ScGCY1을 코딩하는 서열번호: 5에 기재된 DNA를, 사카로마이세스·세르비지에 등으로부터 PCR 등에 의해 클로닝하고 대장균 등 이종의 숙주로 발현 가능한 형태로 도입한 재조합체를 사용하여 ScGCY1을 발현하고 재조합체로부터 해당 효소를 얻을 수도 있다.

본 발명에 의한 ScGCY1의 효소 활성의 측정은 여기에 한정되지는 않지만, 예를 들면 다음과 같이 확인할 수 있다. 즉, 100mM 인산 완충액(pH6.5), 0.2mM NADPH, 20mM 아세트초산에틸 및 효소를 포함한 반응액 중에서 30℃에서 반응시키고, NADPH의 감소로 유래하는 340nm의 흡광도 감소를 측정한다. 1U는 1분 동안에 1μmol의 NADH의 감소를 촉매하는 효소량으로 한다.

다음으로, 트로피논 환원 효소(HnTR1)에 관하여 설명한다. 본 발명에서의 트로피논 환원 효소(HnTR1)로서는, 서열번호: 14에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질을 들 수 있다. 또한, 해당 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로서는, 서열번호: 6에 기재된 염기서열을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 트로피논 환원 효소(HnTR1)에는,

(1)서열번호: 14에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산으로 이루어진 단백질로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

(2)서열번호: 6에 기재된 염기서열로 이루어진 DNA와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및,

(3)서열번호: 14에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열을 가지고, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드

에 의해 코딩되는 단백질도 포함된다.

본 발명에 이용되는 트로피논 환원 효소(HnTR1)는, 일본특개2003-230398에 기재된 방법에 의해 히오시아무스·니거(Hyoscyamus niger)로 제조할 수 있다. 또 효스치아무스·니거 유래의 HnTR1을 코딩하는 서열번호: 6에 기재된 DNA를 효스치아무스·니거 등에서 PCR 등에 의해 클로닝하고, 대장균 등 이종의 숙주에 발현 가능한 형태로 도입한 재조합체를 사용하여 HnTR1을 발현하여, 재조합체에 의해 해당 효소를 얻을 수도 있다.

본 발명에 의한 HnTR1의 효소 활성의 측정은 이에 한정되지는 않지만, 예를 들면 다음과 같이 확인할 수 있다. 즉, 100mM 인산 완충액(pH6.5), 0.2mM NADPH, 4mM 트로피논 및 효소를 포함한 반응액 중에서 30℃에서 반응시키고, NADPH의 감소로 유래하는 340nm의 흡광도 감소를 측정한다. 1U는, 1분 동안에 1μmol의 NADH의 감소를 촉매하는 효소량으로 한다.

다음으로, 트로피논 환원 효소(DsTR1)에 관하여 설명한다. 본 발명에서의 트로피논 환원 효소(DsTR1)로서는, 서열번호: 15에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질을 들 수 있고, 또 해당 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로서는, 서열번호: 7에 기재된 염기서열을 들 수 있다. 또 본 발명의 트로피논 환원 효소(DsTR1)에는,

(1)서열번호: 15에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산으로 이루어진 단백질로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

(2)서열번호: 7에 기재된 염기서열로 이루어진 DNA와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및,

(3)서열번호: 15에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열을 가지고, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드

에 의해 코딩되는 단백질도 포함된다.

본 발명에 이용되는 트로피논 환원 효소(DsTR1)는, 일본특개2003-230398에 기재된 방법에 의해 다투라·스트라모늄(Datura stramonium)으로 제조할 수 있다. 또한, 다투라·스트라모늄 유래의 DsTR1을 코딩하는 서열번호: 7에 기재된 DNA를, 다투라·스트라모늄 등으로부터 PCR 등에 의해 클로닝하고, 대장균 등 이종의 숙주에 발현 가능한 형태로 도입한 재조합체를 사용하여 DsTR1을 발현하고, 재조합체로부터 해당 효소를 얻을 수도 있다.

본 발명에 의한 DsTR1의 효소 활성의 측정은 여기에 한정되지는 않지만, 예를 들면 다음과 같이 확인할 수 있다. 즉, 100mM 인산 완충액(pH6.5), 0.2mM NADPH, 4mM 트로피논 및 효소를 포함한 반응액 중에서 30℃에서 반응시켜 NADPH의 감소로 유래하는 340nm의 흡광도 감소를 측정한다. 1U는, 1분 동안에 1μmol의 NADH의 감소를 촉매하는 효소량으로 한다.

다음으로, 알코올 탈수소 효소(BstADHT)에 관하여 설명한다. 본 발명에서의 알코올 탈수소 효소(BstADHT)로서는, 서열번호: 16에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질을 들 수 있다. 또 해당 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로서는, 서열번호: 8에 기재된 염기서열을 들 수 있다. 또 본 발명의 알코올 탈수소 효소(BstADHT)에는,

(1)서열번호: 16에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산으로 이루어진 단백질로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

(2)서열번호: 8에 기재된 염기서열로 이루어진 DNA와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및,

(3)서열번호: 16에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열을 가지고, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드

에 의해 코딩되는 단백질도 포함된다.

본 발명에 이용되는 알코올 탈수소 효소(BstADHT)는, 디오바실루스·스테아로서모필루스(Geobacillus stearothermophilus) 유래의 BstADHT를 코딩하는 서열번호: 8에 기재된 DNA를 디오바실루스·스테아로서모필루스 등에서 PCR 등에 의해 클로닝하고, 대장균 등 이종의 숙주에 발현 가능한 형태로 도입한 재조합체를 사용하여 BstADHT를 발현하고, 재조합체로부터 해당 효소를 얻을 수도 있다.

본 발명에 의한 BstADHT의 효소 활성의 측정은 여기에 한정되지는 않지만, 예를 들면 다음과 같이 확인할 수 있다. 즉, 100mM 인산 완충액(pH8.0), 2.5mM NAD⁺, 100mM 에탄올 및 효소를 포함한 반응액 중에서 30℃에서 반응시켜 NADH의 생성으로 유래하는 340nm의 흡광도 증가를 측정한다. 1U는,1분 동안에 1μmol의 NADH의 생성을 촉매하는 효소량으로 한다.

마지막으로 알코올 탈수소 효소(PfODH)에 관하여 설명한다. 본 발명에서의 알코올 탈수소 효소(PfODH)로서는, 서열번호: 18에 기재된 아미노산 서열을 포함한 단백질을 들 수 있다. 또한, 해당 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로서는, 서열번호: 17에 기재된 염기서열을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 알코올 탈수소 효소(PfODH)에는,

(1)서열번호: 18에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산으로 이루어진 단백질로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

(2)서열번호: 17에 기재된 염기서열로 이루어진 DNA와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및,

(3)서열번호: 18에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열을 가지고, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드

에 의해 코딩되는 단백질도 포함된다.

본 발명에 이용되는 알코올 탈수소 효소(PfODH)는, WO01/061014에 기재된 방법에 의해 피치아·핀란디카(Pichia finlandica)로부터 제조할 수 있다. 또한, 피치아·핀란디카 유래의 PfODH를 코딩하는 서열번호: 17에 기재된 DNA를 피치아·핀란디카 등으로부터 PCR 등에 의해 클로닝하고, 대장균 등 이종의 숙주에 발현 가능한 형태로 도입한 재조합체를 사용하여 PDDH를 발현하여, 재조합체로부터 해당 효소를 얻을 수도 있다.

본 발명에 의한 PfODH의 효소 활성의 측정은 이에 한정되지는 않지만, 예를 들면 다음과 같이 확인할 수 있다. 즉, 100mM 트리스-염산 완충액(pH 9.0), 2.5mM NAD⁺, 5mM(R)-2-옥탄올 및 효소를 포함한 반응액 중에서 30℃에서 반응시키고, NADH의 생성으로 유래하는 340nm의 흡광도 증가를 측정한다. 1U는, 1분 동안에 1μmol의 NADH의 생성을 촉매하는 효소량으로 하였다.

상기 본 발명의 효소(서열번호: 9-16 <A 및 18 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질)에서, 1 또는 복수 개(예를 들면, 2∼100개, 바람직하게는 2∼50개, 더욱 바람직하게는 2,3,4,5,6,7,8,9, 또는 10개)의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열은, 서열번호: 9-16 및 18중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드에 부위 특이적 변이 도입법(Nucleic Acid Res.10, pp.6487(1982); Methods in Enzymol.100, pp.448(1983), Molecular Cloning 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); PCR A Practical Approach IRL Press pp.200(1991).)을 이용하여 적절히 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가 변이를 도입함으로써 얻을 수 있다.

본 발명에서의 서열번호: 1-8 및 17 중 어느 하나에 표시된 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건으로 혼성화 가능한 폴리뉴클레오티드란, 서열번호: 1-8 및 17 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드의 임의의 적어도 20개, 바람직하게는 적어도 30개, 예를 들면 40, 60 또는 100개의 연속하는 서열을 하나 또는 복수 개 선택한 DNA를 프로브 DNA로 하고, 예를 들면 ECL direct nucleic acid labeling and detection system(Amersham Pharmaica Biotech사제)을 사용하여 매뉴얼에 기재된 조건(예를 들면, wash:42℃, 0.5xSSC를 포함한 primary wash buffer)에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 가리킨다. 보다 구체적인 「엄격한 조건」이란, 예를 들면, 통상 42℃, 2×SSC, 0.1% SDS의 조건으로서, 바람직하게는 50℃, 2×SSC, 0.1% SDS의 조건이고, 더욱 바람직하게는 65℃, 0.1×SSC 및 0.1% SDS의 조건이지만, 이들 조건에 특별히 제한되지는 않는다. 혼성화의 엄격함에 영향을 주는 요소로서는 온도나 염농도 등 여러 요소를 생각할 수 있는데, 당업자라면 이들 요소를 적절히 선택함으로써 최적의 엄격함(stringency)을 실현할 수 있다.

본 발명에서의 폴리뉴클레오티드의 호모로그(homolog)란, 서열번호: 9-16,18 중 어느 하나에 표시된 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 더욱 바람직하게는 95% 이상(예를 들면, 96%, 97%, 98%, 99%)의 호모로지(homology)를 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 단백질의 호모로지 검색은, 예를 들면 SWISS-PROT, PIR, DAD 등 단백질의 아미노산 서열에 관한 데이터베이스나 DDBJ, EMBL 혹은 Gene-Bank 등의 DNA 서열에 관한 데이터베이스, DNA 서열을 기초로 한 예상 아미노산 서열에 관한 데이터베이스 등을 대상으로 BLAST, FASTA 등의 프로그램을 이용하고, 예를 들면 인터넷을 통해 실행할 수 있다.

더우기, 상기 본 발명의 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 본 발명의 효소를 코딩할 수 있는 것이라면 그 형태에 특별히 제한은 없으며, cDNA 외에 게놈DNA, 화학 합성DNA 등도 포함된다.

효소를 기능적으로 발현하는 미생물 또는 형질 전환체와 그들의 처리물

본 발명의 제조방법에서는, 상기 효소 대신에 상기 효소를 기능적에 발현하는 미생물 또는 그 처리물을 사용할 수도 있다. 본 발명의 미생물로서는, 상기 효소 중 적어도 하나를 발현하는 분리된 미생물을 들 수 있다. 이와 같은 미생물로서는 이에 한정되지는 않지만, 예를 들면 칸디다·파라프실로시스(Candida parapsilosis), 로도코커스·에리쓰로폴리스(Rhodococcus erythropolis), 스트렙토마이세스·코엘리컬러(Streptomyces coelicolor), 주글로에아·라미게라(Zoogloea ramigera), 사카로마이세스·세르비지에(Saccharomyces cerevisiae), 효스치아무스·니거(Hyoscyamus niger), 다투라·스트라모늄(Datura stramonium), 디오바실루스·스테아로서모필루스(Geobacillus stearothermophilus), 피치아·핀란디카(Pichia finlandica) 등의 미생물을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 미생물에는, 상기 효소 중 적어도 하나를 코딩하는 DNA를 포함한 벡터에 의해 형질 전환된 미생물도 포함된다. 이와 같은 미생물은 아래에 기재된 형질 전환체와 동일한 방법으로 작성할 수 있다.

또한, 「기능적으로 발현한다」란, 효소가 그 기능을 유지한 상태로 발현하는 것을 의미한다. 본 발명에서는, 효소가 그 기능을 유지하고 있는 한, 효소를 발현시키는 방법은 제한되지 않는다. 또한, 본 발명에서는, 미생물의 상기 효소의 발현량도 제한되지 않는다. 따라서, 조금이라도 상기 효소를 발현하고 있다면 본 발명의 미생물에 포함된다.

본 발명의 제조방법에서는, 상기 효소 대신에 상기 효소를 코딩하는 DNA를 포함한 벡터에 의해 형질 전환된 형질 전환체, 또는 그 처리물을 사용해도 좋다.

상기 효소 대신에 상기 효소를 코딩하는 DNA를 포함한 벡터에 의해 형질 전환된 형질 전환체를 사용하는 경우의 적절한 벡터로서는, 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지 등 여러가지 벡터를 들 수 있다(Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2^nd ed., Cold Spring Harbor Press(1989); Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons(1987) 참조). 본 발명에 사용하는 바람직한 벡터로서는, 이에 한정되지는 않지만, 예를 들면, 대장균에서의 발현 벡터(pSE420D)에 상기 본 발명의 효소를 코딩하는 유전자를 발현 가능하게 삽입한 pK4EC 등을 들 수 있다.

상기 벡터는, 바람직하게는 삽입된 DNA의 발현에 필요한 제어 서열의 모든 구성 성분을 포함한 것이다. 또한 해당 벡터는, 벡터가 도입된 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커(marker)를 포함할 수 있다.

본 발명에서는, DNA에 시그널 펩타이드를 코딩하는 서열을 부가할 수도 있다. 시그널 펩타이드의 부가에 의해 숙주 세포 내에서 발현된 단백질을 소포체 내강으로 이행시킬 수 있다. 혹은 그램 음성균을 숙주로 할 경우에는, 시그널 펩타이드에 의해 숙주 세포 내에서 발현된 단백질을 페리플라즘 안, 또는 세포 밖으로 이행시킬 수 있다. 이용하는 숙주 세포에서 기능할 수 있는 임의의 시그널 펩타이드를 이용할 수 있다. 따라서, 숙주로서 이종 유래의 시그널 펩타이드를 이용할 수도 있다. 또한 필요에 따라 DNA를 벡터에 도입할 때 링커, 개시 코돈(ATG), 종지 코돈(TAA, TAG 또는 TGA) 등을 부가할 수도 있다.

본 발명에서 각 효소를 발현시키기 위해 형질 전환 대상이 되는 미생물은, 각각의 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 재조합 벡터에 의해 형질 전환되어 각각의 효소 활성을 발현할 수 있는 생물이라면 특별히 제한은 없다. 이용 가능한 미생물로서는, 예를 들면 하기와 같은 미생물을 나타낼 수 있다.

·대장균(Escherichia)속

·바실러스(Bacillus)속

·슈도모나스(Pseudomonas)속

·세라티아(Serratia)속

·브레비박테리움(Brevibacterium)속

·코리네박테리움(Corynebacterium)속

·스트렙토코커스(Streptococcus)속

·락토바실루스(Lactobacillus)속

등 숙주 벡터계가 개발되어 있는 세균

·로도코커스(Rhodococcus)속

·스트렙토마이세스(Streptomyces)속

등 숙주 벡터계가 개발되어 있는 방선균

·사카로마이세스(Saccharomyces)속

·클루이베로마이세스(Kluyveromyces)속

·스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)속

·자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces)속

·야로이야(Yarrowia)속

·트리코스포론(Trichosporon)속

·로도스포리듐(Rhodosporidium)속

·피치아(Pichia)속

·칸디다(Candida)속

등 숙주 벡터계가 개발되어 있는 효모

·뉴로스포라(Neurospora)속

·아스퍼질러스(Aspergillus)속

·세팔로스포륨(Cephalosporium)속

·트리코델마(Trichoderma)속

등 숙주 벡터계가 개발되어 있는 곰팡이.

형질 전환체의 제작을 위한 순서 및 숙주에 적합한 재조합 벡터의 구축은, 분자 생물학, 생물 공학, 유전자 공학의 분야에서 관용되고 있는 기술에 준하여 실행할 수 있었다(예를 들면, Sambrook 등, 분자·클로닝, Cold Spring Harbor Laboratories). 미생물 중에서, 본 발명의 NADPH를 전자 공여체로 하는 카보닐 환원 효소 유전자를 발현시키기 위해서는, 우선 미생물 중에서 안정적으로 존재하는 플라스미드 벡터나 파지 벡터 중에 이 DNA를 도입하고, 그 유전 정보를 전사·번역시킬 필요가 있다. 그러기 위해서는 전사·번역을 제어하는 유닛에 해당하는 프로모터를 본 발명의 DNA쇄의 5'-측 상류에, 보다 바람직하게는 터미네이터를 3'-측 하류에 각각 삽입하면 된다. 이 프로모터, 터미네이터로서는, 숙주로서 이용하는 미생물 중에서 기능하는 것으로 알려져 있는 프로모터, 터미네이터를 사용할 필요가 있다. 이들 각종 미생물에서 이용 가능한 벡터, 프로모터, 터미네이터 등에 관하여 「미생물학 기초 강좌8 유전자공학·공립출판」, 특히 효모에 관해서는 Adv.Biochem.Eng., 43, 75-102(1990), Yeast, 8, 423-488(1992) 등에 상세히 기술되어 있다.

또한, 미생물 이외에도 식물, 동물에서 여러가지 숙주·벡터계가 개발되어 있으며, 특히 누에를 사용한 곤충(Nature, 315, 592-594(1985))이나 야채씨, 옥수수, 감자 등 식물 중에 대량으로 이종 단백질을 발현시키는 계가 개발되어 있어 적절하게 이용할 수 있다.

벡터에 DNA를 도입하는 것은, 제한 효소 사이트를 이용한 리가아제 반응에 의해 수행할 수 있다(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons(1987) Section 11.4-11.11; Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Press(1989)Section 5.61-5.63). 또한, 사용하는 숙주의코돈 사용 빈도를 고려하여 필요에 따라 폴리뉴클레오티드 서열의 개변을 수행하여 발현 효율이 높은 벡터를 설계하도록 해도 좋다(Grantham et al., Nucleic Acids Res(1981)9:r43-74).

상술한 바와 같이, 여러가지 세포가 숙주 세포주로서 확립되어 있다. 그리고 각 세포주에 적합한 발현 벡터의 도입법도 공지된 것으로서, 당업자라면 각 선택한 숙주 세포에 적절한 도입법을 선택할 수 있다. 예를 들면, 원핵 세포에 대해서는 칼슘 처리, 일렉트로포레이숀에 의한 형질 전환 등이 알려져 있다. 또한, 식물 세포에 대해서는 아그로박테리움을 사용한 방법이 공지되어 있고, 포유동물 세포에 대해서는 인산 칼슘 침강법을 예시할 수 있다. 본 발명은 특별히 이들 방법으로 한정되지는 않으며 선택한 숙주에 따라 기타 공지의 핵마이크로인젝션, 프로토프라스트 융합, DEAE-덱스트란법, 세포 융합, 전기 펄스 천공법, 리포펙타민법(GIBCOBRL), FuGENE6 시약(Boehringer-Mannheim)을 사용한 방법을 비롯한 여러가지 공지의 방법에 의해 발현 벡터를 도입할 수 있다.

이상과 같이 하여 DNA를 포함한 재조합 벡터에 의해 형질 전환된 형질 전환체를 배양함으로써 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 광학 활성1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 제조할 수 있다.

형질 전환체의 배양 방법은 특별히 한정되지 않으며 선택한 각 숙주 세포의 생육에 적합하고, 또한 본 발명의 효소 생산에 가장 적합한 배지, 온도, 시간 등의 조건을 선택하는 것이 바람직하다. 형질 전환체로부터의 효소의 정제는, 당업자가 공지의 방법에 의해 수행할 수 있다. 예를 들면, 형질 전환체는 숙주의 생육에 적합한 배지에서 배양하여 충분히 증식시킨 후에 균체를 회수하고, 2―머캅토에탄올이나 페닐메탄술포닐불화물 등의 환원제나 프로테아제 저해제를 추가한 완충액 중에서 파쇄하여 무세포 추출액으로 한다. 무세포 추출액으로부터 단백질의 용해도에 의한 분획(유기 용매에 의한 침전이나 황산암모늄 등에 의한 염석(鹽析) 등)이나, 양이온 교환, 음이온 교환, 겔 여과, 소수성 크로마토그래피나 킬레이트, 색소, 항체 등을 사용한 어피니티 크로마토그래피 등을 적절히 조합함으로써 효소를 정제할 수 있다.

본 발명에 기재된 식(2) 및 식(3)에 표시되는 광학 활성 알코올 제조의 바람직한 태양에서는, 효소 분자, 그 처리물, 효소 분자를 포함한 배양물 혹은 효소를 생성하는(발현하는) 미생물 또는 형질 전환체 또는 그들의 처리물을 반응 용액과 접촉시킴으로써 목적으로 하는 효소 반응을 실행시킴으로써 광학 활성 알코올을 제조할 수 있다. 더욱이 효소와 반응 용액의 접촉 형태는 이러한 구체적인 사례에 한정되지 않는다.

본 발명에서 사용하는 처리물은, 생물 세포에 대해 물리적 처리, 생화학적 처리 혹은 화학적 처리 등을 수행한 산물을 가리킨다. 생물 세포는, 상기 효소를 포함한 식물 세포에 추가하여 해당 효소의 유전자를 발현 가능하게 유지하는 형질 전환체도 포함된다. 또한, 처리물을 얻기 위한 물리 처리에는 동결 융해 처리, 초음파 처리, 가압 처리, 삼투압 차이 처리 혹은 마쇄 처리 등이 포함된다. 또한, 생화학적 처리란, 구체적으로는 리소짐 등의 세포벽 용해 효소 처리를 나타낼 수 있다. 또한 화학적 처리로서는, 계면활성제, 톨루엔, 자일렌 또는 아세톤 등의 유기 용매와의 접촉 처리 등을 들 수 있다. 이와 같은 처리에 의해 세포막의 투과성을 변화시킨 미생물 혹은 유리 비즈나 효소 처리에 의해 균체를 파쇄한 무세포 추출액이나 그것을 부분 정제한 것 등은 처리물에 포함된다.

또한, 본 발명에 사용하는 생물 세포 혹은 처리물은, 예를 들면 폴리아크릴아미드법, 함유다당겔법(κ―카라기난 겔법 등), 알긴산 겔법, 한천 겔법, 이온 교환 수지법 등 주지의 방법에 의해 고정화하여 사용할 수도 있다.

보효소

본 발명의 바람직한 태양에서는, CpSADH, ReSADH, ScoPAR, ZraSBDH, ScGCY1, HnTR1, DsTR1 또는 BstADHT에서 선택된 카보닐 환원 효소 활성을 가진 단백질, 해당 효소 또는 단백질을 생산하는(발현하는) 미생물 또는 형질 전환체, 또는 그들의 처리물을 1,1,1-트리플루오로아세톤(이하 TFAC로 약칭)에 작용시켜 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올(이하 (S)-TFIP로 약칭)을 제조하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은, 카보닐 환원 효소 활성을 가진 단백질(PfODH), 해당 효소 또는 단백질을 생산하는(발현하는) 미생물 또는 형질 전환체, 또는 그들의 처리물을 TFAC에 작용시켜 (R)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올(이하 (R)-TFIP로 약칭)을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 제조방법에서는, 카보닐 환원 효소 활성을 가진 단백질(효소)에 추가하여 해당 효소에 대응하는 보효소 및 환원형 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드(NADH) 또는 환원형 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드인산(NADPH)을 재생하는 활성을 가진 탈수소 효소를 동시에 사용하는 것도 가능하다.

상기 환원 반응에 부수적으로 NAD(P)H로부터 생성되는 NAD(P)⁺의 NAD(P)H로의 재생은, 미생물이 가진 NAD(P)⁺ 환원 능력(해당계(解糖系), 메틸영양세균(methylotroph)의 C1화합물 자화 경로 등)을 사용하여 수행할 수 있다. 이들 NAD(P)⁺ 환원 능력은, 반응계에 글루코오스나 에탄올 등을 첨가함으로써 증강시킬 수 있다. 또한, NAD(P)⁺로부터 NAD(P)H를 생성하는 능력을 가진 미생물이나 그 처리물, 효소를 반응계에 첨가함으로써도 수행할 수 있다. 예를 들면, 글루코오스 탈수소 효소, 알코올 탈수소 효소, 포름산 탈수소 효소, 아미노산 탈수소 효소, 유기산 탈수소 효소(사과산 탈수소 효소 등), 아인산 탈수소 효소, 하이드로게나아제 등을 포함한 미생물, 그 처리물 및 부분 정제 또는 정제 효소를 사용하여 NAD(P)H의 재생을 수행할 수 있다. 이러한 NAD(P)H의 재생에 필요한 반응을 구성하는 성분은, 본 발명에 의한 광학 활성 알코올의 제조를 위한 반응계에 첨가하는, 고정화된 것을 첨가하거나 혹은 NAD(P)H의 교환이 가능한 막을 사이에 두고 접촉시킬 수 있다.

여기에서, 본 발명에서 사용되는 환원형 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드건ADH) 또는 환원형 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드인산(NADPH)을 재생하는 활성을 가진 탈수소 효소 및 카보닐 환원 효소 활성을 가진 효소의 조합은 전혀 제한되지 않지만 바람직한 조합으로서는, 하기 (1)에 기재된 탈수소 효소에서 선택되는 탈수소 효소와, 하기 (2)에 기재된 카보닐 환원 효소 활성을 가진 효소에서 선택되는 카보닐 환원 효소 활성을 가진 효소의 조합을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 예를 들면 카보닐 환원 효소 활성을 가진 효소로서 CpSADH를 선택한 경우, 이것과 조합하여 사용되는 탈수소 효소로서는, 글루코오스 탈수소 효소, 알코올 탈수소 효소, 포름산 탈수소 효소, 아미노산 탈수소 효소, 유기산 탈수소 효소(사과산 탈수소 효소 등), 아인산 탈수소 효소 또는 하이드로게나아제의 임의의 탈수소 효소에서 선택되는 탈수소 효소를 사용할 수 있다. 이것은, 카보닐 환원 효소 활성을 가진 효소로서 CpSADH 이외의 효소를 선택한 경우도 마찬가지이다. 이와 같이 본 발명의 광학 활성 알코올의 제조방법에서는, 카보닐 환원 효소 활성을 가진 효소와 탈수소 효소의 조합은 실시예에 기재된 것에 한정되지 않는다.

(1)탈수소 효소

글루코오스 탈수소 효소, 알코올 탈수소 효소, 포름산 탈수소 효소, 아미노산 탈수소 효소, 유기산 탈수소 효소(사과산 탈수소 효소 등), 아인산 탈수소 효소, 하이드로게나아제

(2)카보닐 환원 효소 활성을 가진 효소

알코올 탈수소 효소(CpSADH), 알코올 탈수소 효소(ReSADH), 카보닐 환원 효소(ScoPAR), (2S,3S)-부탄디올 탈수소 효소(ZraSBDH), 카보닐 환원 효소(ScGCY1), 트로피논 환원 효소(HnTR1), 트로피논 환원 효소(DsTR1), 알코올 탈수소 효소(BstADHT), 알코올 탈수소 효소(PfODH)

또한, 본 발명의 방법에서는, 본 발명에 이용 가능한 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 재조합 벡터에 의해 형질 전환된 형질 전환체를 배양하는 공정을 포함할 수도 있다. 본 발명의 방법에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한 재조합 벡터로 형질 전환된 미생물의 생균체를 이용할 경우에는, NAD(P)H 재생을 위한 부가적인 반응계를 불필요하게 하는 경우가 있다. 즉, NAD(P)H 재생 활성이 높은 미생물을 숙주로서 사용함으로써, 형질 전환체를 사용한 환원 반응에서, NAD(P)H 재생용 효소를 첨가하지 않고 효율적인 반응을 할 수 있다. 또한 NAD(P)H 재생에 이용 가능한 글루코오스 탈수소 효소, 알코올 탈수소 효소, 포름산 탈수소 효소, 아미노산 탈수소 효소, 유기산 탈수소 효소(사과산 탈수소 효소 등), 아인산 탈수소 효소, 하이드로게나아제 등의 유전자를, 본 발명의 NAD(P)H 의존성 효소를 코딩하는 DNA와 동시에 숙주에 도입함으로써 보다 효율적인 NAD(P)H 의존성 카보닐 환원 효소의 발현, 환원 반응을 수행할 수도 있다. 이들 2개 또는 그 이상의 유전자를 숙주에 도입하려면 불화합성(不和合性)을 피하기 위해 복제 기원이 다른 복수 개의 벡터에 따로따로 유전자를 도입한 재조합 벡터에 의해 숙주를 형질 전환하는 방법이나, 단일 벡터에 양유전자를 도입하는 방법 둘 다 또는 한쪽의 유전자를 염색체 중에 도입하는 방법 등을 이용할 수 있다.

단일 벡터 중에 복수 개의 유전자를 도입할 경우에는 프로모터, 터미네이터 등 발현 제어에 관한 영역을 각각의 유전자에 연결하는 방법이나 락토오스 오페론과 같은 복수 개의 시스트론를 포함한 오페론으로서 발현시킬 수도 있다.

예를 들면, NADPH 재생용 효소로서, 바실루스·섭틸리스(Bacillus subtilis)나 서모플라즈마·아시도필럼(Thermoplasma acidophilum)에 유래한 글루코오스 탈수소 효소를 이용할 수 있다. 또한, NADH 재생용 효소로서, 마이코박테리움·바카에(Mycobacterium vaccae)에서 유래한 포름산 탈수소 효소를 이용할 수 있다.

구체적으로는, 광학 활성 TFIP 합성에는 CpSADH, ReSADH, ScoPAR, ZraSBDH, PfODH 중 어느 한 카보닐 환원 능력을 가진 효소의 유전자와 마이코박테리움·바카에 유래의 포름산 탈수소 효소 유전자를 함께 도입한 공(共)발현 플라스미드(각각, pSF-CPA4(본 발명의 실시예에 기재), pSF-RED1(본 발명의 실시예에 기재), pSF-SCP7(본 발명의 실시예에 기재), pSF-ZRD1(일본특개2004-357639), pSF-PFO2(WO01-061014))를 들 수 있다. 또한, ScGCY1, HnTR1, DsTR1 중 어느 한 카보닐 환원 능력을 가진 효소의 유전자와 바실루스·서브틸러스 유래 글루코오스 탈수소 효소 유전자를 함께 도입한 공발현 플라스미드(각각, pSG-GCY1(본 발명의 실시예에 기재), pSG-HNR1(일본특개2003-230398), pSG-DSR1(일본특개2003-230398))을 들 수 있다.

본 발명의 효소를 사용한 환원 반응은, 수중 또는 물에 용해되지 않는 유기 용매, 예를 들면 초산에틸, 초산부틸, 톨루엔, 클로로포름, 헥산, 메틸이소부틸케톤, 메틸 tert-부틸에스테르 등의 유기 용매 중, 또는 수성 매체와의 2상계, 또는 물에 용해되는 유기 용매(예: 메탄올, 에탄올, 이소프로필알코올, 아세토니트릴, 아세톤, 디메틸술폭시드)와의 혼합계에 의해 수행할 수 있다. 본 발명의 반응은 고정화 효소, 막(膜)리액터 등을 이용하여 수행할 수도 있다.

또한, 본 반응의 원료인 식(1)에 표시되는 TFAC의 농도는 제한되지 않는다. 통상, 기질 농도 0.01-50%, 바람직하게는 0.1-20%, 더욱 바람직하게는 1-10%에서 수행할 수 있다. 기질은 반응 개시 시에 일괄적으로 첨가할 수도 있지만, 반응액 중의 기질 농도가 지나치게 높아지지 않도록 연속적 또는 간헐적으로 첨가해도 좋다. 기질은 식(1)에 표시되는 TFAC의 상태에서 반응계에 투입해도 되지만, 식(4)로 표시된 수화물 혹은 식(1) 또는 식(4)에 표시되는 화합물의 수용액 혹은 기타 용매의 용액 상태로 첨가해도 된다.

[화학식 27]

또한 본 발명에서의 농도%는 모두 「원료 또는 생성물의 중량/반응액의 중량(w/w)%」을 의미하는 것으로 하고, 변환율은 「생성물 농도/([잔존 원료 농도]+[생성물 농도])%」를 의미하는 것으로 한다. 또한, % e.e.는 (S)-TFIP의 경우, 「([(S)-TFIP농도]-[(R)-TFIP농도])/([(S)-TFIP농도]+[(R)-TFIP농도])×100」을 의미하는 것으로 한다. 마찬가지로 (R)-TFIP의 경우, %e.e.는 「([(R)-TFIP농도]-[(S)-TFIP농도])/([(R)-TFIP농도]+[(S)-TFIP농도])×100」을 의미하는 것으로 한다.

본 발명의 반응은, 효소가 그 촉매 작용을 나타낼 수 있는 온도를 선택할 수 있다. 구체적으로는, 반응 온도4-50℃, 바람직하게는 10-40℃, 보다 바람직하게는 10-30℃에서 실시할 수 있다. 본 발명의 반응의 기질인 식(1)에 표시되는 TFAC, 생성물인 식(2) 및 식(3)에 표시된 광학 활성 TFIP는 모두 비점이 낮기 때문에 반응은 낮은 온도에서 실시하는 것이 바람직하다. 반응의 pH는 효소가 그 촉매 작용을 나타낼 수 있는 범위를 선택할 수 있다. 구체적으로는 pH 3-9, pH 4-8, 보다 바람직하게는 pH 5-7에서 수행할 수 있다. 또한, 반응계에는 필요에 따라 보효소NAD⁺, NADH, NADP⁺ 또는 NADPH가 0.001-100mM, 바람직하게는 0.01-10 mM의 농도로 첨가할 수 있다.

NADH, NADPH의 재생을 위해서, 예를 들면 글루코오스 탈수소 효소를 이용할 경우에는 글루코오스, 알코올 탈수소 효소를 이용할 경우에는 에탄올 또는 이소프로판올이, 포름산 탈수소 효소를 이용할 경우에는 포름산이, 아미노산 탈수소 효소를 이용할 경우에는 아미노산이, 사과산 탈수소 효소를 이용할 경우에는 사과산이, 글리세롤탈수소 효소를 이용할 경우에는 글리세롤이, 아인산 탈수소 효소를 이용할 경우에는 아인산이, 하이드로게나아제를 이용할 경우에는 수소 등이 반응계에 첨가된다. 이러한 화합물은 기질 케톤에 대해 몰비로 0.1-20, 바람직하게는 1-5배 과잉으로 첨가할 수 있다. 한편, 글루코오스 탈수소 효소, 알코올 탈수소 효소, 포름산 탈수소 효소, 아미노산 탈수소 효소, 사과산 탈수소 효소, 글리세롤 탈수소 효소, 아인산 탈수소 효소, 하이드로게나아제 등의 NAD(P)H 재생용 효소는 본 발명의 NAD(P)H 의존성 효소와 비교하여 효소 활성으로 0.01-100배, 바람직하게는 0.1-20배 정도 첨가할 수 있다.

또한, 본 발명의 제조방법에서는 (S)-TFIP 또는 (R)-TFIP를 회수하는 공정을 더 포함해도 좋다. (S)-TFIP 또는 (R)-TFIP의 회수는, 예를 들면 실시예에 기재된 방법으로 수행할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 TFAC의 환원에 의해 생성하는 광학 활성 TFIP의 정제는, 균체, 단백질의 원심분리, 막처리 등에 의한 분리, 용매 추출, 증류, 건제조에 의한 건조, 칼럼 크로마토그래피 등을 적절하게 조합함으로써 수행할 수 있다.

예를 들면, 광학 활성 TFIP 합성에서는 미생물 균체를 포함한 반응액을 증류하여 광학 활성 TFIP로서 채취할 수 있다. 바람직하게는, 증류 조작 전에는 균체를 제거하는 조작, 예를 들면 원심분리, 막처리 등을 실시할 수 있다. 반응 생성물 순도를 더욱 높이고 특히 수분 함량을 낮추려면 각종 건제조로 건조를 수행하고 필요에 따라 재증류함으로써 더욱 고정밀도로 정제할 수 있다. 건제조는 일반적으로 건조 용도에 사용되는 것을 사용할 수 있다.

또한, 광학 활성 TFIP란, 한쪽 광학이성질체(對掌體)의 농도가 다른 쪽 광학이성질체의 농도보다도 높은 상태에 있는 TFIP를 의미하는데, 공업적으로 실용성 있는 높은 광학 순도로서는 90% e.e. 이상, 바람직하게는 93% e.e. 이상을 들 수 있다.

또한, 본 명세서에서 인용된 모든 선행기술 문헌은 참조로서 본 명세서에 추가된다.

도 1은 실시예 1에서 구축한 플라스미드pSF-CPA4의 제한 효소 지도를 표시한 도면이다. 도면 중, CpSADH는 칸디다·파라프실로시스 유래 알코올 탈수소 효소 유전자를, McFDH는 마이코박테리움·바카에 유래 포름산 탈수소 효소 유전자를, lac I^q는 lac 리프레서(repressor)를, P(trc)는 trc 프로모터를, mc는 멀티클로닝사이트 를, T(rrnB)는 rrnB 터미네이터를, amp는 암피실린 내성 유전을, ori는 복제 기점을, rop는 rop protein 유전자를 의미한다.

도 2는 실시예 4에서 구축한 플라스미드 pSE-RED1의 제한 효소 지도를 표시한 도면이다. ReSADH는 로도코커스·에리쓰로폴리스 유래의 알코올 탈수소 효소 유전자를 의미한다.

도 3은 실시예 5에서 구축한 플라스미드 pSF-RED1의 제한 효소 지도를 표시한 도면이다.

도 4는 실시예 6에서 구축한 플라스미드 pSE-SCP7의 제한 효소 지도를 표시한 도면이다. ScoPAR은 스트렙토마이세스·세리컬러 유래 카보닐 환원 효소 유전자를 의미한다.

도 5는 실시예 8에서 구축한 플라스미드 pSF-SCP7의 제한 효소 지도를 표시한 도면이다.

도 6은 실시예 11에서 구축한 플라스미드 pSE-GCY1의 제한 효소 지도를 표시한 도면이다. ScGCY는 사카로마이세스·세르비지에 유래 카보닐 환원 효소 유전자를 의미한다.

도 7은 실시예 12에서 구축한 플라스미드 pSG-GCY1의 제한 효소 지도를 표시한 도면이다. BsGDH는 바실루스·서브틸러스 유래의 글루코오스 탈수소 효소 유전자를 의미한다.

도 8은 실시예 14에서 구축한 플라스미드 pSE-BSA1의 제한 효소 지도를 표시한 도면이다. BstADHT는 디오바실루스·서모카테뉴러스 유래 알코올 탈수소 효소 유전자를 의미한다.

도 9는 실시예 16에서 구축한 플라스미드 pSU-SCA1의 제한 효소 지도를 표시한 도면이다. ScADH1은 사카로마이세스·세르비지에 유래 알코올 탈수소 효소I유전자를 의미한다.

도 10은 실시예 18에서 구축한 플라스미드 pSU-SCA2의 제한 효소 지도를 표시한 도면이다. ScADH2는 사카로마이세스·세르비지에 유래 알코올 탈수소 효소II유전자를 의미한다.

도 11은 실시예 20에서 구축한 플라스미드 pSE-GRE3의 제한 효소 지도를 표시한 도면이다. ScGRE3은 사카로마이세스·세르비지에 유래 카보닐 환원 효소 유전자를 의미한다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세히 설명하기로 하는데, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 LB 배지란, 1% 박토트립톤(bacto tryptone), 0.5% 박토 효모 추출물, 1% 염화나트륨, pH 7.2의 구성 배지를 가리키고, 암피실린을 포함한 LB 배지란, 상기 구성의 LB 배지에 암피실린을 50mg/mL 농도로 첨가한 배지를 가리킨다.

효소 활성의 측정

대장균 HB101주 또는 JM109주를, 이하에 나타내는 본 실시예에서 제조한 플라스미드 및 문헌에 기재된 플라스미드로 형질 전환했다. 얻어진 형질 전환주를, 암피실린을 포함한 LB 배지 중에서 밤새 배양했다. 0.1mM 이소프로필―1-티오-β― D-갈락토피라노시드(이하 IPTG로 약칭)를 첨가하여 유전자의 발현을 유도하여 4시간 더 배양했다. 얻어진 균체를 집균 후 0.02% 머캅토에탄올을 포함한 트리스-염산 완충액 또는 인산 완충액에 현탁하여 밀폐식 초음파 파쇄 장치 UCD-200TM(코스모바이오제)로 파쇄했다. 이것을 원심분리하여 얻어진 상청액을 무세포 추출액으로 하였다. 이 무세포 추출액을 사용하여 각각 하기의 방법으로 효소 활성을 측정했다.

(CpSADH, ReSADH, ScoPAR 및 PfODH 활성의 측정)

무세포 추출액, 100mM 트리스-염산 완충액(pH 9.0), 기질, 2.5mM NAD⁺를 포함한 반응액을 30℃에서 반응시켜 NADH의 생성으로 유래하는 340nm의 흡광도 증가를 측정했다. 1U는, 1분 동안에 1μmol의 NADH 생성을 촉매하는 효소량으로 하였다. 기질로서는, CpSADH 활성의 측정에는 50mM(S)-1,3-부탄디올, ReSADH 활성과 ScoPAR 활성의 측정에는 5mM(S)-2-옥탄올, PfODH 활성의 측정에는 5mM(R)-2-옥탄올을 사용했다.

(ZraSBDH, BstADHT, ScADH1 및 ScADH2 활성의 측정)

무세포 추출액, 100mM 인산 완충액(pH 8.0), 기질, 2.5mM NAD⁺를 포함한 반응액을 30℃에서 반응시켜 NADH의 생성으로 유래하는 340nm의 흡광도 증가를 측정했다. 1U는, 1분 동안에 1μmol의 NADH 생성을 촉매하는 효소량으로 하였다. 기질로서는, ZraSBDH 활성의 측정에는 50mM(2S,3S)-부탄디올, BstADHT, ScADH1, ScADH2 활성의 측정에는 100mM 에탄올을 사용했다.

(ScGCY1, HnTR1, DsTR1 및 ScGRE3 활성의 측정)

무세포 추출액, 100mM 인산 완충액(pH 6.5), 기질, 0.2mM NADPH를 포함한 반응액을 30℃에서 반응시켜 NADPH의 감소로 유래하는 340nm의 흡광도 감소를 측정했다. 1U는, 1분 동안에 1μmol의 NADPH 감소를 촉매하는 효소량으로 하였다. 기질로서, ScGCY1 활성의 측정에는 20mM 아세트초산에틸, HnTR1 활성과 DsTR1 활성의 측정에는 4mM 트로피논, ScGRE3 활성의 측정에는 100mM 크실로오스를 사용했다.

(포름산 탈수소 효소 활성의 측정)

무세포 추출액, 100mM 인산 완충액(pH 7.0), 100mM 포름산나트륨, 2.5mM NAD⁺를 포함한 반응액을 30℃에서 반응시키고, NADH의 생성으로 유래하는 340nm의 흡광도 증가를 측정했다. 1U는,1분 동안에 1μmol의 NADH의 생성을 촉매하는 효소량으로 하였다.(글루코오스 탈수소 효소 활성의 측정)

무세포 추출액, 100mM 인산 완충액(pH7.0), 100mM D-글루코오스, 2.5mM NAD⁺를 포함한 반응액을 30℃에서 반응시켜 NADH의 생성으로 유래하는 340nm의 흡광도 증가를 측정했다. 1U는, 1분 동안에 1μmol의 NADPH 생성을 촉매하는 효소량으로 하였다.

분석 조건

(분석 조건 1) TFAC 및 TFIP의 정량 분석

반응액을 같은 용적의 디클로로메탄으로 추출한 유기층, 또는 TFIP 10mg을 아세트니트릴 1mL에 용해한 샘플을 이하의 조건으로 분석했다.

칼럼: 스펠코 왁스 10(스펠코제)(30m×0.25mm×0.25㎛)

칼럼 온도: 60℃∼120℃(4℃/분)

주입부 및 검출부 온도: 250℃

검출 방법: 수소염 이온화 검출법

캐리어 가스: 헬륨(1OO kPa)

이상의 조건으로 분석을 했을 때 TFAC는 유지시간 2.2분에 TFIP는 5.6분에 검출되었다.

(분석 조건 2) TFIP의 광학 순도 분석

반응액을 같은 용적의 디클로로메탄으로 추출한 유기층 또는 TFIP 5mg를 디클로로메탄 1mL에 용해한 샘플을 이하의 조건으로 분석했다.

칼럼: BGB-174(BGB 애널리틱제)(30m×0.25㎜×0.25㎛)

칼럼 온도: 60℃∼85℃(1℃/분)∼110℃(5℃/분)

주입부 온도: 180℃

검출부 온도: 200℃

검출 방법: 수소염 이온화 검출법

캐리어 가스: 헬륨(1OOkPa)

이상의 조건으로 분석했을 때 (R)-TFAC는 유지 시간 21.8분에, (S)-TFIP는 23.5분에 검출되었다.

[실시예 1] 칸디다·파라프실로시스 유래의 알코올 탈수소 효소(CpSADH) 유전자와 마이코박테리움·바카에 유래 포름산 탈수소 효소(McFDH) 유전자를 공(共)발현하는 플라스미드(pSF-CPA4)의 구축

특허공보(특허제3574682호)에 기재된 염기서열(Accession No.E09871)을 기초로 클로닝용 센스 프라이머(CPA-ATG5)(서열번호: 19), 안티센스 프라이머(CPA-TAA5)(서열번호: 20)를 합성했다.

서열번호: 19 GTGGAATTCTATAATGTCAATTCCATCAAGCCAG

서열번호: 20 CTGAAGCTTATTATGGATTAAAAACAACACGACCTTCATAAGC

프라이머 CPA-ATG5, CPA-TAA5를 각 10pmol, dNTP 10pmol, Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 481-483(2002)에 기재된 플라스미드 pSE-CPA1 10pmol, Pfu Turbo DNA polymerase 1.25 U(STRATAGENE제)를 포함한 50μL을 사용하고, 변성(95℃, 30초), 어닐(50℃, 1분), 신장(72℃, 2분 30초)을 30싸이클, GeneAmp PCR System 2400을 사용하여 PCR을 수행한 결과, 특이적인 증폭 산물을 얻을 수 있었다.

증폭 산물을 제한 효소(NcoI,XbaI)로 이중 소화하여 아가로스겔 전기 영동 후, 목적으로 하는 밴드를 잘라서 GFX PCR DNA and Gel Band Purifucation Kit(파마시아製)로 정제했다.

얻어진 제한 효소 소화가 완료된 PCR 증폭 DNA 단편을 제한 효소(NcoI,XbaI)로 이중 소화한 벡터(pSE-MF26)(일본특개2003-199595)와 TAKARA Ligation Kit에 의해 라이게이션했다. 라이게이션한 DNA에 의해 대장균 JM109주를 형질 전환하여 암피실린을 포함한 LB 배지에서 생육하고, 얻어진 형질 전환주로부터 플라스미드를 FlexiPrep Kit(파마시아제)에 의해 정제했다. 얻어진 플라스미드의 삽입 DNA부분의 염기서열을 해석하여 얻어진 염기서열을 서열번호: 1에, 그 아미노산 서열을 서열 번호: 9에 나타내었다. 또한, 얻어진 플라스미드를 pSF-CPA4(도 1)로 하였다.

[실시예 2] 칸디다·파라프실로시스 유래의 알코올 탈수소 효소(CpSADH)와 마이코박테리움·바카에 유래 포름산 탈수소 효소(McFDH) 공발현 플라스미드에 의한 형질 변환체의 효소 활성

실시예 1에서 얻어진 pSF-CPA4로 형질 전환한 대장균HB101주로부터 상기 방법에 의해 무세포 추출액을 제조했다. 상기 방법에 따라 그 효소 활성을 측정했을 때 CpSADH의 비활성은 5.96 U/mg-단백질, McFDH의 비활성은 0.474 U/mg-단백질이었다.

[실시예 3] 로도코커스·에리쓰로폴리스로부터의 염색체 DNA의 제조

로도코커스·에리쓰로폴리스(Rhodococcus erythropolis)DSM 743주를 영양 배지(bouillon medium)에서 배양하여 균체를 제조했다. 균체로부터의 염색체 DNA의 제조는 Nucleic Acids Res., 8,4321(1980)에 기재된 방법에 의해 수행하였다.

[실시예 4] 로도코커스·에리쓰로폴리스 유래 알코올 탈수소 효소(ReSADH)의 클로닝

Appl.Microbiol.Biotechnol.,62,380-386(2003)에 기재된 염기서열(Accession No.AY161280)을 기초로 클로닝용 센스 프라이머(RE-ATG1)(서열번호: 21), 안티센스 프라이머(RE-TAA1)(서열번호: 22)를 합성했다.

서열번호: 21 CACGAATTCTATCATGAAAGCAATCCAGTACACG

서열번호: 22 TCGAAGCTTCTAGATTAAAGACCAGGGACCACAAC

프라이머 RE-ATG1, RE-TAA1을 각 10pmol, dNTP 10nmol, 실시예 3에서 제조한 로도코커스·에리쓰로폴리스 유래 염색체 50ng, Pfu Turbo DNA polymerase 1.25U(STRATAGENE제)를 포함한 50μL을 사용하고, 변성(95℃, 30초), 어닐링(50℃, 1분), 신장(72℃, 2분 30초)을 30싸이클, GeneAmp PCR System 2400을 사용하여 PCR을 수행한 결과, 특이적인 증폭 산물을 얻을 수 있었다.

증폭 산물을 제한 효소(EcoRI, HindIII)로 이중 소화하여 아가로스겔 전기 영동 후, 목적으로 하는 밴드를 잘라서 GFX PCR DNA and Gel Band Purifucation Kit(파마시아제)로 정제했다.

얻어진 제한 효소 소화가 완료된 PCR 증폭 DNA 단편을 제한 효소(EcoRI, HindIII)로 이중 소화한 벡터(pSE420D)(일본특개2000-189170)와 TAKARA Ligation Kit에 의해 라이게이션했다. 라이게이션한 DNA에 의해 대장균 JM109주를 형질 전환하고 암피실린을 포함한 LB 배지에서 생육하여 얻어진 형질 전환주로부터 플라스미드를 FlexiPrep Kit(파마시아제)에 의해 정제했다. 얻어진 플라스미드의 삽입 DNA 부분의 염기서열을 해석한 결과, 프라이머 부분을 제외하고 문헌에 기재되어 있는 염기서열과 비교하여 4염기의 치환과 1아미노산의 치환이 인정되었다. 얻어진 염기서열을 서열번호: 2에, 그 아미노산 서열을 서열번호: 10에 나타내었다. 또한, 얻어진 플라스미드를 pSE-RED1(도 2)으로 하였다.

[실시예 5] 로도코커스·에리쓰로폴리스 유래 알코올 탈수소 효소(ReSADH)유전자와 마이코박테리움·바카에 유래 포름산 탈수소 효소(McFDH) 유전자를 공발현하는 플라스미드(pSF-RED1)의 구축

실시예 4에서 얻어진 pSE-RED1을 제한 효소(EcoRI, HindIII)로 이중 소화하 여 DNA 단편을 정제했다. 나아가 마이코박테리움·바카에(Mycobacterium vaccae) 유래의 포름산 탈수소 효소 유전자를 포함한 플라스미드pSE-MF26(일본특개2003-199595)을 제한 효소(EcoRI, HindIII)로 이중 소화하고 pSL-RED1로부터 잘라낸 DNA 단편과 TAKARA Ligation Kit를 사용하여 라이게이션했다. 라이게이션한 DNA에 의해 대장균 JM109주를 형질 전환하고 암피실린을 포함한 LB 배지에서 생육하여 얻어진 형질 전환주로부터 플라스미드를 FlexiPrep Kit(파마시아제)로 정제하고, ReSADH와 포름산 탈수소 효소(McFDH)를 동시에 발현할 수 있는 플라스미드인 pSF-RED1(도 3)을 얻었다.

[실시예 6] 로도코커스·에리쓰로폴리스 유래 알코올 탈수소 효소(ReSADH)와 마이코박테리움·바카에 유래 포름산 탈수소 효소(McFDH) 공발현 플라스미드에 의한 형질 전환체의 효소 활성

실시예 5에서 얻어진 pSF-RED1으로 형질전환된 대장균HB101주로부터 상기 방법에 의해 무세포 추출액을 제조했다. 상기 방법에 따라 그 효소 활성을 측정했을 때 ReSADH의 비활성은 8.49U/mg-단백질, McFDH의 비활성은 1.52U/mg-단백질이었다.

[실시예 7] 스트렙토마이세스·코엘리컬러 유래의 카보닐 환원 효소(ScoPAR)의 클로닝

서열번호: 11에 기재된 아미노산 서열에 기초하여 DNA를 합성했다. 합성한 DNA의 서열을 서열번호: 3에 나타내었다. 얻어진 서열을 제한 효소(EcoRI, HindIII)로 이중 소화하여 정제했다.

얻어진 제한 효소 소화 완료된 합성DNA 단편을, 제한 효소(EcoRI, HindIII) 로 이중 소화한 벡터 pSE420D(일본특개2000-189170)와 TAKARA Ligation Kit에 의해 라이게이션했다. 라이게이션한 DNA에 의해 대장균 JM109주를 형질 전환하고 암피실린을 포함한 LB 배지에서 생육하여 얻어진 형질 전환주로부터 플라스미드를 FlexiPrep Kit(파마시아제)에 의해 정제했다. 얻어진 플라스미드의 삽입DNA 부분의 염기서열을 해석한 결과, 서열번호: 11에 기재된 염기서열과 일치했다. 얻어진 플라스미드를 pSE-SCP7(도 4)로 하였다.

[실시예 8] 스트렙토마이세스·코엘리컬러 유래의 카보닐 환원 효소(ScoPAR)와 마이코박테리움·바카에 유래 포름산 탈수소 효소(McFDH) 유전자를 공발현하는 플라스미드(pSF-SCP7)의 구축

실시예 7에서 얻어진 pSE-SCP7을 제한 효소(EcoRI, HindIII)로 이중 소화하여 DNA 단편을 정제했다. 나아가 마이코박테리움·바카에(Mycobacterium vaccae) 유래의 포름산 탈수소 효소(McFDH) 유전자를 포함한 플라스미드(pSU-MF26)(일본특원2005-169919)를 제한 효소(EcoRI, HindIII)로 이중 소화하고 pSL-SCP7로부터 잘라낸 DNA 단편과 라이게이션했다. 라이게이션한 DNA에 의해 대장균 JM109주를 형질 전환하고 암피실린을 포함한 LB 배지에서 생육하여 얻어진 형질 전환주로부터 플라스미드를 FlexiPrep Kit(파마시아제)에 의해 정제하여 ScoPAR와 McFDH를 동시에 발현할 수 있는 플라스미드인 pSF-SCP7(도 5)를 얻었다.

[실시예 9] 스트렙토마이세스·코엘리컬러 유래의 카보닐 환원 효소(ScoPAR)와 마이코박테리움·바카에 유래 포름산 탈수소 효소(McFDH) 공발현 플라스미드에 의한 형질 전환체의 효소 활성

실시예 8에서 얻어진 pSF-SCP7으로 형질 전환된 대장균HB101주로부터 상기 방법에 의해 무세포 추출액을 제조했다. 상기 방법에 따라 그 효소 활성을 측정했을 때 ScoPAR의 비활성은 0.67mU/mg-단백질, McFDH의 비활성은 0.25U/mg-단백질이었다.

[실시예 10] 사카로마이세스·세르비지에로부터의 염색체DNA의 제조

사카로마이세스·세르비지에(Saccharomyces cerevisiae)를 YEPD 배지에서 배양하여 균체를 제조했다. 균체부터의 염색체DNA의 제조는 Meth.Cell Biol.,29,39(1975)에 기재된 방법에 의해 수행하였다.

[실시예 11] 사카로마이세스·세르비지에 유래의 카보닐 환원 효소(ScGCY1)의 클로닝

FEBS Lett.,238,123-128(1988)에 기재된 사카로마이세스·세르비지에(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 카보닐 환원 효소 유전자의 염기서열(Accession No.X13228)을 기초로 클로닝용 센스 프라이머(GCY1-ATG1)(서열번호: 23), 안티센스 프라이머(GCY1-TAA1)(서열번호: 24)를 합성했다.

서열번호: 23 GAGCCATGGCACCTGCTACTTTACATGATTCTACGAA

서열번호: 24 GAGCTTAAGTCTAGATTATTTGAATACTTCGAAAGGAGACCA

실시예 10에서 얻어진 사카로마이세스·세르비지에로부터 정제한 염색체DNA를 주형으로 하고, 프라이머GCY1-ATG1과 GCY1-TAA1을 사용하여 실시예 4와 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다.

증폭 산물을 제한 효소(NcoI,XbaI)로 이중 소화하여 아가로스겔 전기 영동 후, 목적으로 하는 밴드를 잘라서 GFX PCR DNA and Gel Band Purihcation Kit(파마시아제)에서 정제했다.

얻어진 제한 효소 소화가 완료된 PCR 증폭 DNA 단편을, 제한 효소(NcoI,XbaI)로 이중 소화된 벡터(pSE420D)(일본특개2000-189170)와 라이게이션했다. 라이게이션한 DNA에 의해 대장균 JM109주를 형질 전환하고 암피실린을 포함한 LB 배지에서 생육하여 얻어진 형질 전환주로부터 플라스미드를 FlexiPrep Kit(파마시아제)에 의해 정제했다. 얻어진 플라스미드의 삽입DNA 부분의 염기서열을 해석한 결과, 프라이머 부분을 제외하고 문헌에 기재되어 있는 염기서열과 일치하는 것을 확인했다. 얻어진 염기서열을 서열번호: 5에, 그 아미노산 서열을 서열번호: 13에 나타내었다. 또한, 얻어진 플라스미드를 pSE-GCY1(도 6)으로 하였다.

[실시예 12] 사카로마이세스·세르비지에 유래의 카보닐 환원 효소(ScGCY1)와 바실루스·서브틸러스 유래의 글루코오스 탈수소 효소(BsGDH) 유전자를 공발현하는 플라스미드(pSG-GCY1)의 구축

실시예 11에서 얻어진 pSE-GCY1을 제한 효소(NcoI,XbaI)로 이중 소화하여 DNA 단편을 정제했다. 또한 바실루스·서브틸러스(Bacillus subtilis) 유래의 글루코오스 탈수소 BsGDH효소 유전자를 포함한 플라스미드pSE-BSG1(일본특개2000-189170)을 제한 효소(NcoI,XbaI)로 이중 소화하여 pSL-GCY1에서 잘라낸 DNA 단편과 라이게이션했다. 라이게이션한 DNA에 의해 대장균 JM109주를 형질 전환하고 암피실린을 포함한 LB 배지에서 생육하여 얻어진 형질 전환주로부터 플라스미드를 FlexiPrep Kit(파마시아제)에 의해 정제하여 ScGCY1과 BsGDH를 동시에 발현할 수 있는 플라스미드인 pSG-GCY1(도 7)을 얻었다.

[실시예 13] 사카로마이세스·세르비지에 유래의 카보닐 환원 효소(ScGCY1)와 바실루스·서브틸러스 유래의 글루코오스 탈수소 효소(BsGDH) 공발현 플라스미드에 의한 형질 전환체의 효소 활성

실시예 12에서 얻어진 pSF-GCY1으로 형질 전환된 대장균 HB101주로부터 상기 방법에 의해 무세포 추출액을 제조했다. 상기 방법에 따라 그 효소 활성을 측정했을 때 ScGCY1의 비활성은 0.27U/mg-단백질, BsGDH의 비활성은 3.72U/mg-단백질이었다.

[실시예 14] 디오바실루스·스테아로서모필루스 유래의 알코올 탈수소 효소(BstADHT)의 클로닝

J.Bacteriol., 174, 1397-1402(1992)에 기재된 디오바실루스·스테아로서모필루스(Geobacillus stearothermophilus) 유래의 알코올 탈수소 효소 유전자의 염기서열(Accession No.D90421)을 기초로 클로닝용 센스 프라이머BSAT-AT1(서열번호: 25), 안티센스 프라이머 BSAT-TA1(서열번호: 26)을 합성했다.

서열번호: 25 GAGGAATTCAATCATGAAAGCTGCAGTTGTG

서열번호: 26 GTCAAGCTTCTAGATTAATCTACTTTTAACACGACGC

플라스미드 pTBAD40을 주형으로 하고 프라이머BSAT-AT1과 BSAT-TA1을 사용하여 실시예 4와 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다.

증폭 산물을 제한 효소(BspHI,XbaI)로 이중 소화하고 아가로스겔 전기 영동 후, 목적으로 하는 밴드를 잘라서 GFX PCR DNA and Gel Band Purihcation Kit(파마 시아제)로 정제했다.

얻어진 제한 효소 소화가 완료된 PCR 증폭 DNA 단편을, 제한 효소(NcoI,XbaI)로 이중 소화한 벡터 pSE420D(일본특개2000-189170)와 라이게이션했다. 라이게이션한 DNA에 의해 대장균 JM109주를 형질 전환하고 암피실린을 포함한 LB 배지에서 생육하여 얻어진 형질 전환주로부터 플라스미드를 FlexiPrep Kit(파마시아제)에 의해 정제했다. 얻어진 플라스미드의 삽입 DNA 부분의 염기서열을 해석한 결과, 프라이머 부분을 제외하고 문헌에 기재되어 있는 염기서열과 일치하는 것을 확인했다. 얻어진 염기서열을 서열번호: 8에, 그 아미노산 서열을 서열번호: 16에 나타내었다. 또한, 얻어진 플라스미드를 pSE-BSA1(도 8)으로 하였다.

[실시예 15] 디오바실루스·스테아로서모필루스 유래의 알코올 탈수소 효소(BstADHT) 발현 플라스미드에 의한 형질 변환체의 효소 활성

실시예 14에서 얻어진 pSE-BSA1으로 형질 전환된 대장균HB101주로부터 상기 방법에 의해 무세포 추출액을 제조했다. 상기 방법에 따라 그 효소 활성을 측정했을 때 BstADHT의 비활성은 1.08U/mg-단백질이었다.

[참고예 1] 사카로마이세스·세르비지에 유래의 알코올 탈수소 효소-I, ScADH1d의 클로닝

Basic Life Sci., 19, 335-361(1982)에 기재된 사카로마이세스·세르비지에(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 알코올 탈수소 효소-I유전자의 염기서열(Accession No.M38456)을 기초로 클로닝용 센스 프라이머 ScADH1-A1(서열번호: 27), 안티센스 프라이머ScADH1-T1(서열번호: 28)을 합성했다.

서열번호: 27 GTCGAATTCATACATGTCTATCCCAGAAACTCAAAAAGG

서열번호: 28 CTGCTTAAGTCTAGATTATTTAGAAGTGTCAACAACGTAACGACCAA

CCAA

실시예 10에서 얻어진 사카로마이세스·세르비지에로부터 정제한 염색체DNA를 주형으로 하고 프라이머 ScADH1-A1과 ScADH1-T1을 사용하여 실시예 4와 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다.

증폭 산물을 제한 효소(EcoRI,AflⅡ)로 이중 소화하여 아가로스겔 전기 영동 후, 목적으로 하는 밴드를 잘라서 GFX PCR DNA and Gel Band Purihcation Kit(파마시아제)fh 정제했다.

얻어진 제한 효소 소화가 완료된 PCR 증폭 DNA 단편을, 제한 효소(EcoRI,AflⅡ)로 이중 소화된 벡터 pSE420U(일본특원 2005-169919)와 라이게이션했다. 라이게이션한 DNA에 의해 대장균 JM109주를 형질 전환하고 암피실린을 포함한 LB 배지에서 생육하여 얻어진 형질 전환주로부터 플라스미드를 FlexiPrep Kit(파마시아제)에 의해 정제했다. 얻어진 플라스미드의 삽입DNA 부분의 염기서열을 해석한 결과, 프라이머 부분을 제외하고 문헌에 기재되어 있는 염기서열과 비교하여 10염기의 치환, 1아미노산의 치환이 확인되었다. 얻어진 염기서열을 서열번호: 29에, 그 아미노산 서열을 서열번호: 30에 나타내었다. 또한, 얻어진 플라스미드를 pSU-SCA1(도 9)로 하였다.

[참고예 2] 사카로마이세스·세르비지에 유래의 알코올 탈수소 효소-I, ScADH1d 발현 플라스미드에 의한 형질 변환체의 효소 활성

참고예 1에서 얻어진 pSU-SCA1으로 형질 전환한 대장균 JM109주로부터 상기 방법에 의해 무세포 추출액을 제조했다. 상기 방법에 따라 그 효소 활성을 측정했을 때 ScADH1의 비활성(比活性)은 4.92U/mg-단백질이었다.

[참고예 3] 사카로마이세스·세르비지에 유래의 알코올 탈수소 효소-Ⅱ, ScADH12의 클로닝

J.Biol.Chem., 258, 2674-2682(1983)에 기재된 사카로마이세스·세르비지에(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 알코올 탈수소 효소-Ⅱ 유전자의 염기서열(Accession No.J01314, M13475)을 기초로 클로닝용 센스 프라이머 ScADH2-A1(서열번호: 31), 안티센스 프라이머 ScADH2-T1(서열번호: 32)를 합성했다.

서열번호: 31 GTCGAATTCATACATGTCTATTCCAGAAACTCAAAAAGC

서열번호: 32 GCACTTAAGTCTAGATTATTTAGAAGTGTCAACAACGTAACGACCAG

실시예 10에서 얻어진 사카로마이세스·세르비지에로부터 정제한 염색체 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 ScADH2-A1과 ScADH2-T1을 사용하여 실시예 4와 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다.

증폭 산물을 제한 효소(EcoRI,AflⅡ)로 이중 소화하여 아가로스겔 전기 영동 후, 목적으로 하는 밴드를 잘라서 GFX PCR DNA and Gel Band Purifucation Kit(파마시아제)로 정제했다.

얻어진 제한 효소 소화가 완료된 PCR 증폭 DNA 단편을, 제한 효소(EcoRI,AflⅡ)로 이중 소화된 벡터 pSE420U(일본특원2005-169919)와 라이게이션했다. 라이게이션한 DNA에 의해 대장균 JM109주를 형질 전환하고 암피실린을 포함한 LB 배지에 서 생육하여 얻어진 형질 전환주로부터 플라스미드를 FlexiPrep Kit(파마시아제)에 의해 정제했다. 얻어진 플라스미드의 삽입 DNA 부분의 염기서열을 해석한 결과, 프라이머 부분을 제외하고 문헌에 기재되어 있는 염기서열과 비교하여 1염기의 치환이 확인되었다. 얻어진 염기서열을 서열번호: 33에, 그 아미노산 서열을 서열번호: 34에 나타내었다. 또한, 얻어진 플라스미드를 pSU-SCA2(도 10)로 하였다.

[참고예 4] 사카로마이세스·세르비지에 유래의 알코올 탈수소 효소-Ⅱ, ScADH12 발현 플라스미드에 의한 형질 전환체의 효소 활성

참고예 3에서 얻어진 pSU-SCA2에서 형질 전환된 대장균 JM109주로부터 상기 방법에 의해 무세포 추출액을 제조했다. 상기 방법에 따라 그 효소 활성을 측정했을 때 ScADH2의 비활성은 32.3mU/mg-단백질이었다.

[참고예 5] 사카로마이세스·세르비지에 유래의 카보닐 환원 효소(ScGRE3)의 클로닝

Appl.Environ.Microbiol.,61,1580-1585(1995)에 기재된 사카로마이세스·세르비지에(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 카보닐 환원 효소 유전자의 염기서열(Accession No.U00059)을 기초로 클로닝용 센스 프라이머 GRE3-ATG1(서열번호: 35), 안티센스 프라이머 GRE3-TAA1(서열번호: 36)을 합성했다.

서열번호: 35 GAGTCATGAGTTCACTGGTTACTCTTAATAACGGTC

서열번호: 36 GACGAATTCCTCTAGATTATGCAAAAGTGGGGAATTTACCATC

실시예 10에서 얻어진 사카로마이세스·세르비지에로부터 정제된 염색체 DNA를 주형으로 하고 프라이머 GRE3-ATG1과 GRE3-TAA1을 사용하여 실시예 4와 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다.

증폭 산물을 제한 효소(BspHI,EcoRI)로 이중 소화하여 아가로스겔 전기 영동 후, 목적으로 하는 밴드를 잘라서 GFX PCR DNA and Gel Band Purifucation Kit(파마시아제)로 정제했다.

얻어진 제한 효소 소화가 완료된 PCR 증폭 DNA 단편을 제한 효소(NcoI,EcoRI)로 이중 소화한 벡터 pSE420D(일본특개2000-189170)와 라이게이션했다. 라이게이션한 DNA에 의해 대장균 JM109주를 형질 전환하고 암피실린을 포함한 LB 배지에서 생육하여 얻어진 형질 전환주로부터 플라스미드를 FlexiPrep Kit(파마시아제)에 의해 정제했다. 얻어진 플라스미드의 삽입 DNA 부분의 염기서열을 해석한 결과, 프라이머 부분을 제외하고 문헌에 기재되어 있는 염기서열과 일치하는 것을 확인했다. 얻어진 염기서열을 서열번호: 37에, 그 아미노산 서열을 서열번호: 38에 나타내었다. 또한, 얻어진 플라스미드를 pSE-GRE3(도 11)로 하였다.

[참고예 6] 사카로마이세스·세르비지에 유래의 카보닐 환원 효소, ScGRE3 발현 플라스미드에 의한 형질 변환체의 효소 활성

실시예 20에서 얻어진 pSE-GRE3로 형질 전환된 대장균 JM109주로부터 상기 방법에 의해 무세포 추출액을 제조했다. 상기 방법에 따라 그 효소 활성을 측정했을 때 ScGRE3의 비활성은 206mU/mg-단백질이었다.

[실시예 16] TFAC 수화물의 제조

100mL 매스 플라스크에 100mM 인산 완충액(pH 7.4) 40mL를 넣고 빙욕상에서 냉각시켰다. 거기에 1,1,1-트리플루오로아세톤(TFAC)를 조금씩 넣어서 용해시켜 100mL로 하여 TFAC 농도 944g/L의 TFAC 수화물을 얻었다.

[실시예 17] TFAC를 기질로 한 광학 활성 TFIP의 제조

플라스미드 pSF-CPA4(본 명세서의 실시예 1에 기재), pSF-RED1(본 명세서의 실시예 5에 기재), pSF-SCP7(본 명세서의 실시예 8에 기재), pSF-ZRD1(일본특개2004-357639), pSF-PFO2(WO01-061014)로 각각 대장균 HB101주를 형질 전환하고, 얻어진 형질 전환체를 2×YT배지(2% 박토트립톤, 1% 박토 효모 추출물, 1% 염화나트륨, pH 7.2)를 사용하여 33℃에서 밤새 배양했다. 배지에 0.1mM IPTG를 첨가하여 각 효소 유전자의 발현을 유도한 후, 균체를 집균하여 각 효소 유전자를 발현하는 대장균을 얻었다.

반응 용기에 기질인 TFAC의 최종 농도가 2%(178mM)가 되도록 하는 실시예 16에서 얻은 TFAC 수화물, 100mM 인산 완충액(pH6.5), TFAC에 대해 2당량의 포름산나트륨, 배양액 10g 분량으로부터 얻은 집균 균체를 추가하여 총 중량 10g의 반응액을 제조하고 20℃에서 밤새 회전 진탕(振蕩)시켰다. 반응액으로부터 0.8mL씩을 샘플링하여 디클로로메탄 0.8mL으로 추출하고, 유기층을 후술하는 분석 조건 1,2에 의해 분석하여 TFIP의 정량과 광학 순도 분석을 각각 수행하였다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.

[표 1]

실시예,비교예	플라스미드	효소	수율 %	광학순도 % e.e.	절대배치
실시예17	pSF-CPA4	CpSADH -McFDH	67.8	99.1	S
실시예17	pSF-RED1	ReSADH -McFDH	63.0	98.7	S
실시예17	pSF-SCP7	ScoPAR -McFDH	49.4	98.5	S
실시예17	pSF-ZRD1	ZraSBDH -McFDH	64.3	97.8	S
실시예18	pSG-GCY1	ScGCY1 -BsGDH	7.0	93.0	S
실시예18	pSG-HNR1	HnTR1 -BsGDH	11.4	94.6	S
실시예18	pSG-DSR1	DsTR1 -BsGDH	20.6	93.5	S
실시예19	pSE-BSA1	BstADHT -Amano2	8.7	93.9	S
실시예17	pSF-PFO2	PfODH -McFDH	73.4	100.0	R
비교예1	pUC-SCA1	ScADH1 -Amano2	5.2	82.3	S
비교예1	pUC-SCA2	ScADH2 -Amano2	8.9	58.0	S
비교예1	pSE-GRE3	ScGRE3 -Amano2	8.3	69.6	S

[실시예 18] TFAC를 기질로 한 광학 활성 TFIP의 제조

플라스미드 pSG-GCY1(본 명세서 실시예 12에 기재), pSG-HNR1(일본특개2003-230398), pSG-DSR1(일본특개2003-230398)으로 각각 대장균HB101주를 형질 전환하고, 얻어진 형질 전환체를 2×YT배지(2% 박토트립톤, 1% 박토효모 추출물, 1% 염화나트륨, pH 7.2)를 사용하여 33℃에서 밤새 배양했다. 배지에 0.1mM IPTG를 첨가하여 각 효소 유전자의 발현을 유도한 후, 균체를 집균하여 각 효소 유전자를 발현하는 대장균을 얻었다.

반응 용기에 기질인 TFAC의 최종 농도가 각각 2%(178mM)가 되도록 하는 실시예 16에서 얻은 TFAC 수화물, 100mM 인산 완충액(pH6.5), TFAC에 대해 2당량의 D- 글루코오스, 배양액 1Og분량으로 얻은 집균 균체를 더하여 총 중량 1Og의 반응액을 제조하고 20℃에서 밤새 회전 진탕하였다. 반응액으로부터 0.8mL씩 샘플링하여 디클로로메탄 0.8mL로 추출하고, 유기층을 후술하는 분석 조건 1,2에 의해 분석하여 TFIP의 정량과 광학 순도 분석을 각각 수행하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

[실시예 19] TFAC를 기질로 한 광학 활성 TFIP의 제조

플라스미드 pSE-BSA1(본 명세서 실시예 14에 기재)로 대장균HB101주를 형질 전환하고, 얻어진 형질 전환체를 2×YT배지(2% 박토트립톤, 1% 박토효모 추출물, 1% 염화나트륨, pH 7.2)를 사용하여 33℃에서 밤새 배양했다. 배지에 0.1mM IPTG를 첨가하여 각 효소 유전자의 발현을 유도한 후, 균체를 집균하여 각 효소 유전자를 발현하는 대장균을 얻었다.

반응 용기에 기질인 TFAC의 최종농도가 2%(178mM)가 되도록 실시예 16에서 얻은 TFAC수화물, 100mM 인산 완충액(pH 6.5), TFAC에 대해 2당량의 D-글루코오스, 배양액 10g 분량으로부터 얻은 집균 균체, 5U 글루코오스 탈수소 효소(Amano-2, 아마노엔자임제)를 더하여 총 중량 10g의 반응액을 제조하고 20℃에서 밤새 회전 진탕했다. 반응액으로부터 0.8mL씩을 샘플링하여 디클로로메탄 0.8mL로 추출하고, 유기층을 후술하는 분석 조건 1,2에 의해 분석하여 TFIP의 정량과 광학 순도 분석을 각각 실행하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

[실시예 20] TFAC를 기질로 한 (S)-TFIP의 제조

플라스미드pSF-CPA4(본 명세서 실시예 1에 기재)로 대장균HB101주를 형질 전환하고, 얻어진 형질 전환체를 2×YT배지(2% 박토트립톤, 1% 박토효모 추출물, 1% 염화나트륨, pH7.2)를 사용하여 33℃에서 밤새 배양했다. 배지에 0.1mM IPTG를 첨가하여 각 효소 유전자의 발현을 유도한 후 균체를 집균하여 CpSADH와 McFDH를 공발현하는 대장균을 얻었다.

반응 용기에 기질인 TFAC의 최종농도가 6%(535mM)가 되도록 실시예 20에서 얻은 TFAC수화물, 100 mM 인산 완충액(pH 6.0), 803mM 포름산나트륨, 배양액 267g분량에서 얻은 집균 균체를 더하여 총 중량 400g의 반응액을 제조하고, 40% 황산으로 pH 6.0로 조절하면서 20℃에서 교반함으로써 반응시켰다. 26시간 후, 반응액으로부터 0.8mL씩을 샘플링하여 디클로로메탄 0.8mL로 추출하고 유기층을 후술하는 분석 조건 1,2에 의해 분석하여 TFIP의 정량과 광학 순도 분석을 각각 실행한 결과, 변환율은 99%, 광학 순도는 99.8% e.e.(S)였다.

[실시예 21] (S)-TFIP의 제조

실시예 20에서 얻은 반응액 1230g를 원심분리함으로써 제균했다. 얻어진 상청액을 증류하고 증기 온도 77-79℃의 부분을 주요부로 하여 60.17g 얻었다. 얻어진 주요부의 59.02g에 대해 포화 염화칼슘 수용액을 11.8mL 더하여 1 시간 실온에서 교반한 후, 정치시켜 유기층을 분리했다. 이 유기층을 다시 증류하고 증기 온도 72-74℃의 부분을 주요부로 하여 48.63g 얻었다. 또한, 주요부 부분을 분석 조건 1,2에 의해 분석했을 때 TFIP 순도는 97.3%, 광학 순도는 99.7% e.e.(S)였다.

[비교예 1] TFAC를 기질로 한 (S)-TFIP의 제조

플라스미드 pSU-SCA1(본 명세서 참고예 1에 기재), pSU-SCA2(본 명세서 참고예 3에 기재), pSE-GRE3(본 명세서 참고예 5에 기재)로 대장균 HB101주를 형질 전 환하여 얻어진 형질 전환체를 2×YT배지(2% 박토트립톤, 1% 박토효모 추출물, 1% 염화나트륨, pH 7.2)를 사용하여 33℃에서 밤새 배양했다. 배지에 0.1 mM IPTG를 첨가하여 각 효소 유전자의 발현을 유도한 후, 균체를 집균하여 각 효소 유전자를 발현하는 대장균을 얻었다.

반응 용기에 기질인 TFAC의 최종농도가 2%(178mM)가 되도록 실시예 20에서 얻은 TFAC수화물, 100mM 인산 완충액(pH 6.5), TFAC에 대해 2당량의 D-글루코오스, 배양액 10 g분량으로부터 얻은 집균 균체, 5U 글루코오스 탈수소 효소(Amano-2, 아마노엔자임제)를 더하여 총 중량 10g의 반응액을 제조하고 20℃에서 밤새 회전 진탕했이다. 반응액으로부터 0.8mL씩을 샘플링하여 디클로로메탄 0.8mL로 추출하고, 유기층을 후술하는 분석 조건 1,2에 의해 분석하여 TFIP의 정량과 광학 순도 분석을 각각 실행하였다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.

[비교예 2] 반응pH의 광학 순도에 미치는 영향

반응액에 첨가하는 기질의 종농도를 5%(446mM)로 하고, 인산 완충액의 pH를 각각 pH 6.5로 하고, 반응 중의 pH 조절을 각각 pH 6.5로 한 것 외에는 실시예 20과 동일하게 하여 반응을 수행하였다. 그 결과, 광학 순도는 99.1-99.2% e.e.(S)였다.

본 발명에 의해 광학 활성의 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올 및 (R)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 효소적으로 제조하는 방법이 제공되었다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올 및 (R)-1,1,1-트리플 루오로-2-프로판올은 모두 높은 광학 순도를 부여한다. 즉, 광학 분할제를 이용한 종래의 방법에 비해 높은 수준의 광학 순도를 저렴하고 용이하게 달성할 수 있다.

또한, 본 발명에 의하면, 다량의 원료를 사용하여 목적으로 하는 화합물을 효율적으로 얻을 수 있다. 보다 구체적으로는, 본 발명에 기초하여 예를 들면 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올 및 (R)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 간편하면서 경제적으로 공업적으로 제조할 수 있게 되었다. 즉, 본 발명의 효소 활성 물질은 다량의 기질 및 기질로부터 생성되는 반응 생성물에 의한 저해 작용을 받지 않는다. 따라서 보다 많은 원료를 사용하여 목적으로 하는 화합물을 효율적으로 얻을 수 있게 되었다.

본 발명의 방법에 의해 제조된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올 및 (R)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올은 각종 의약품, 액정 재료 등의 광학 활성 원료로서 유용하다.

SEQUENCE LISTING <110> DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES, LTD. <120> PROCESS FOR PRODUCTION OF OPTICALLY ACTIVE ALCOHOL <130> D1-A0601P <150> JP 2006-156059 <151> 2006-06-05 <160> 38 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1011 <212> DNA <213> Candida parapsilosis <400> 1 atgtcaattc catcaagcca gtacggattc gtattcaata agcaatcagg acttaatttg 60 cgcaatgatt tgcctgtcca caagcccaaa gcgggtcaat tgttgttgaa agttgatgct 120 gttggattgt gtcattctga tttacatgtc atttacgaag ggttggattg tggtgataat 180 tatgtaatgg gacatgaaat tgctggaact gttgctgctg tgggtgatga tgtcattaac 240 tacaaggttg gtgatcgtgt tgcctgtgtc ggacccaatg gatgtggtgg gtgcaagtat 300 tgtcgtggtg ccattgacaa tgtatgtaaa aacgcatttg gtgattggtt cggattgggg 360 tacgatggtg ggtatcaaca gtacttgttg gttactcgcc cacgtaactt gtctcgtatc 420 ccagataacg tatctgcaga cgtggctgcg gcttcaactg atgctgtatt gacaccatat 480 cacgcaatca agatggctca agtgtcacca acttcgaata tcttgcttat tggtgctggt 540 ggattgggtg gaaatgcaat tcaagttgcc aaggcatttg gtgcgaaagt tactgttttg 600 gacaaaaaaa aggaggctcg tgaccaagca aagaagttgg gtgctgatgc agtttatgaa 660 acattgccag aatccatttc tcctggctct ttttcagcat gttttgattt tgtttcagtg 720 caagctacat ttgatgtatg tcaaaagtat gttgaaccaa agggtgtaat tatgcccgtg 780 ggactcggtg ctcctaattt atcgtttaat ttgggagatt tggcattgcg cgaaattcga 840 atcttgggta gtttttgggg aactactaat gatttggatg atgttttgaa attggttagt 900 gaaggtaaag ttaaacccgt tgtgcgcagt gccaaattga aggaattgcc agagtatatt 960 gaaaaattgc gcaacaatgc ttatgaaggt cgtgttgttt ttaatccata a 1011 <210> 2 <211> 1047 <212> DNA <213> Rhodococcus erythropolis <400> 2 atgaaagcaa tccagtacac gagaatcggc gcggaacccg aactcacgga gattcccaag 60 cccgagcccg gtccaggtga agtgctcctg gaagtcaccg ctgccggcgt ctgccactcg 120 gacgacttca tcatgagcct gcccgaagag cagtacacct acggccttcc gctcacgctc 180 ggccacgaag gcgcaggcaa ggtcgccgcc gtcggcgagg gtgtcgaagg tctcgacatc 240 ggaaccaatg tcgtcgtcta cgggccttgg ggttgcggca actgttggca ctgctcacaa 300 ggactcgaga actattgctc tcgcgcccaa gaactcggaa tcaatcctcc cggtctcggt 360 gcacccggcg cgttggccga gttcatgatc gtcgattctc ctcgccacct tgtcccgatc 420 ggtgacctcg acccggtcaa gacggtgccg ctgaccgacg ccggtctgac gccgtatcac 480 gcgatcaagc gttctctgcc gaaacttcgc ggaggctcgt tcgcggttgt cattggtacc 540 ggcggtctcg gccacgtcgc tattcagctc ctccgtcacc tctcggcggc aacggtcatc 600 gctttggacg tgagcgcgga caagctcgaa ctggcaacca aggtaggcgc tcacgaagtg 660 gttctgtccg acaaggacgc ggccgagaac gtccgcaaga tcactggaag tcaaggcgcc 720 gcactggttc tcgacttcgt cggctaccag cccaccatcg acaccgcgat ggctgtcgcc 780 ggcgtcggat cagacgtcac gatcgtcggg atcggggacg gccaggccca cgccaaagtc 840 gggttcttcc aaagtcctta cgaggcttcg gtgacagttc cgtattgggg tgcccgcaac 900 gagttgatcg aattgatcga cctcgcccac gccggcatct tcgacatcgc ggtggagacc 960 ttcagtctcg acaacggtgc cgaagcgtat cgacgactgg ctgccggaac gctaagcggc 1020 cgtgcggttg tggtccctgg tctttaa 1047 <210> 3 <211> 1041 <212> DNA <213> Streptomyces coelicolor <400> 3 atgaaagcac tgcagtatcg tactattggt gcaccacctg aagttgtaac ggtaccagat 60 ccagaacctg gtccaggtca agttttactt aaagttactg cggccggtgt gtgccatagc 120 gatatcgctg ttatgtcttg gcctgccgaa ggcttcccgt atgaactgcc gctgaccctg 180 ggtcacgagg gcgtaggtac tgtggcagcg ctgggcgccg gcgttaccgg cctggcagaa 240 ggcgacgcgg tcgctgtgta tggtccgtgg ggctgtggta cgtgcgccaa atgtgcagaa 300 ggcaaagaaa attattgcct gcgtgcggat gagctgggga tccgccctcc gggtcttggc 360 cgtccgggtt ctatggctga atacctgctc atcgacgatc cgcgccatct cgtgccgctg 420 gatggcttag atccggtagc agcggtgccg ctgaccgacg ctggtttgac tccgtaccac 480 gccattaaac gttcactgcc taagctggtt ccggggtcga ccgcagtcgt gatcgggact 540 ggtggccttg gtcatgttgc gatccaattg ctccgcgctc tgacgtcagc gcgtgtagtg 600 gcgctggatg tcagcgaaga aaagttacgc ctggcacgtg ccgtcggcgc acacgaggcg 660 gtgttgtctg acgctaaagc agcggatgct gttcgcgaaa ttaccggtgg cctgggggcc 720 gaagcagtat tcgattttgt gggtgttgcg ccaaccgtcc agaccgcggg cgcagtggcg 780 gctgttgaag gtgacgtaac cctggtgggc atcggtggcg ggtccttgcc ggttggtttt 840 ggcatgctgc cgttcgaagt ctcagtgaac gccccgtatt ggggttcgcg tagtgaactc 900 actgaagttc tgaacctggc acgcagcggc gcggtatctg tacataccga aacgtactcc 960 ttagatgacg ctccgctggc gtacgagcgc ttgcacgaag gtcgcgttaa tggtcgtgct 1020 gttattttac cacatggtta a 1041 <210> 4 <211> 780 <212> DNA <213> Zoogloea ramigera <400> 4 atgtcgttga atggcaaagt cattttggta accggcgctg gccaggggat cggacgcggt 60 attgcgctgc ggcttgcaaa ggaaggcgct gatctcgcgc tggccgacgt caaggccgat 120 aagctcgact ccgttcgcaa ggaagtcgaa gcgctcggac gcaaggccac caccgtcgtc 180 gccgatgtca gcaagcgcga cgaagtctac gccgccatcg accatgcaga gaagcaactc 240 ggcgggttcg acgtcatggt caacaatgcc ggcatcgccc aggtcaagcc gatcgccgac 300 gtcacgcccg aggacatgga cctgatcttc cggatcaatg tcgacggcgt gctctggggc 360 atccaggcgg cttcgcagaa attcaaggat cgaggtcaga agggcaagat catcaatgcc 420 tgctcgattg ccggacatga cggcttcgcc atgctcggcg tctattcggc aaccaagttc 480 gccgtgcgtg cgctgacgca agccgccgcc aaggaatatg ccagcgcggg catcacggtg 540 aacgcctact gccccggcat cgtcggcacc gacatgtggg tggagatcga cgagcgcttt 600 tccgagatca ccggaacgcc gaagggcgaa acctacaaga aatacgtcga gggcatcgct 660 ttgggccgcg cgcagacacc ggaggacgtg gcagcgttgg tcgccttcct cgcgggcgcc 720 gattccgact acatcacggg acagtcgatc ctgaccgatg gcggtatcgt ctatcgataa 780 <210> 5 <211> 939 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 5 atgcctgcta ctttacatga ttctacgaaa atcctttctc taaatactgg agcccaaatc 60 cctcaaatag gtttaggtac gtggcagtcg aaagagaacg atgcttataa ggctgtttta 120 accgctttga aagatggcta ccgacacatt gatactgctg ctatttaccg taatgaagac 180 caagtcggtc aagccatcaa ggattcaggt gttcctcggg aagaaatctt tgttactaca 240 aagttatggt gtacacaaca ccacgaacct gaagtagcgc tggatcaatc actaaagagg 300 ttaggattgg actacgtaga cttatatttg atgcattggc ctgccagatt agatccagcc 360 tacatcaaaa atgaagacat cttgagtgtg ccaacaaaga aggatggttc tcgtgcagtg 420 gatatcacca attggaattt catcaaaacc tgggaattaa tgcaggaact accaaagact 480 ggtaaaacta aggccgttgg agtctccaac ttttctataa ataacctgaa agatctatta 540 gcatctcaag gtaataagct tacgccagct gctaaccaag tcgaaataca tccattacta 600 cctcaagacg aattgattaa tttttgtaaa agtaaaggca ttgtggttga agcttattct 660 ccgttaggta gtaccgatgc tccactattg aaggaaccgg ttatccttga aattgcgaag 720 aaaaataacg ttcaacccgg acacgttgtt attagctggc acgtccaaag aggttatgtt 780 gtcttgccaa aatctgtgaa tcccgatcga atcaaaacga acaggaaaat atttactttg 840 tctactgagg actttgaagc tatcaataac atatcgaagg aaaagggcga aaaaagggtt 900 gtacatccaa attggtctcc tttcgaagta ttcaagtaa 939 <210> 6 <211> 825 <212> DNA <213> Hyoscyamus niger <400> 6 atggccggag aatcagaagt ttacattaat ggcaacaatg gaggaattag atggagtctc 60 aaaggcacaa ctgcccttgt tactggtggc tctaaaggca ttgggtatgc agtagtggaa 120 gaactagcag gtcttggtgc aagagtatat acatgttcac gtaatgaaaa ggaactccaa 180 caatgccttg atatttggag aaatgaagga cttcaagttg aaggttctgt ttgtgattta 240 ttactgcgct ctgaacgtga caaacttatg cagactgttg cagatttatt taatggaaag 300 ctcaatattt tggtaaataa tgcaggtgtg gtgatacata aagaagctaa agatttcaca 360 aaagaagatt acgacatcgt attgggcact aattttgaag cagcttatca cttatgtcaa 420 cttgcttatc cctttttgaa ggcatctcaa aatggcaatg ttatttttct ttcttctata 480 gctggatttt cagcactgcc ttctgtttct ctttattctg cttccaaagc tgcaataaat 540 caaataacga agaacttggc atgtgaatgg gccaaggaca acattcgggt caattcagtt 600 gctccaggag tcattttaac cccactcatt gaaactgcaa ttaagaaaaa tcctcatcaa 660 aaagaagaaa tagacaattt tattgtcaag actccaatgg gccgggctgg aaagcccaat 720 gaagtgtctg cactaatagc ctttctttgc ttccctgctg cttcttatat tactggccaa 780 attatatggg ctgatggtgg attcacagct aatggtgggt tttaa 825 <210> 7 <211> 822 <212> DNA <213> Datura stramonium <400> 7 atggaagaat caaaagtgtc catgatgaat tgcaacaatg aaggaagatg gagtctcaaa 60 ggcaccacag cccttgttac tggtggctct aaaggcattg ggtatgcaat agtggaagaa 120 ttggcaggtc ttggagcaag agtatataca tgttcacgta atgaaaaaga actggacgaa 180 tgccttgaaa tttggagaga aaaaggactt aatgttgaag gttctgtttg tgacttatta 240 tcacgtactg aacgtgataa gcttatgcag actgttgcac atgtatttga tggaaagctc 300 aatattttgg tgaataatgc cggggtggtg atacataagg aagctaaaga tttcacagaa 360 aaagattaca acataattat gggaactaat tttgaagcag cttatcattt atctcaaatt 420 gcttatccat tattgaaggc ttctcaaaat gggaatgtta tttttctctc ttctattgct 480 ggattttcag cactgccttc tgtttctctt tactcagctt ccaaaggtgc aataaatcaa 540 atgacaaaga gtttggcttg tgaatgggct aaagacaaca ttcgggtcaa ttcagttgct 600 ccgggagtca ttttaacccc actggttgaa actgcaatta agaaaaatcc tcatcaaaaa 660 gaagaaatag acaattttat tgtcaagact cctatgggcc gggccggaaa gccccaagaa 720 gtttctgcac taatagcttt tctttgcttc cctgctgctt catatattac gggccagatc 780 atatgggctg acggtggatt cacagctaat ggtgggtttt aa 822 <210> 8 <211> 1014 <212> DNA <213> Geobacillus stearothermophilus <400> 8 atgaaagctg cagttgtgga acaatttaaa aagccgttac aagtgaaaga agtggaaaaa 60 cctaagatct catacgggga agtattagtg cgcatcaaag cgtgtggggt atgccataca 120 gacttgcatg ccgcacatgg cgactggcct gtaaagccta aactgcctct cattcctggc 180 catgaaggcg tcggtgtaat tgaagaagta ggtcctgggg taacacattt aaaagttgga 240 gatcgcgtag gtatcccttg gctttattcg gcgtgcggtc attgtgacta ttgcttaagc 300 ggacaagaaa cattatgcga acgtcaacaa aacgctggct attccgtcga tggtggttat 360 gctgaatatt gccgtgctgc agccgattat gtcgtaaaaa ttcctgataa cttatcgttt 420 gaagaagccg ctccaatctt ttgcgctggt gtaacaacat ataaagcgct caaagtaaca 480 ggcgcaaaac caggtgaatg ggtagccatt tacggtatcg gcgggcttgg acatgtcgca 540 gtccaatacg caaaggcgat ggggttaaac gtcgttgctg tcgatttagg tgatgaaaaa 600 cttgagcttg ctaaacaact tggtgcagat cttgtcgtca atccgaaaca tgatgatgca 660 gcacaatgga taaaagaaaa agtgggcggt gtgcatgcga ctgtcgtcac agctgtttca 720 aaagccgcgt tcgaatcagc ctacaaatcc attcgtcgcg gtggtgcttg cgtactcgtc 780 ggattaccgc cggaagaaat acctattcca attttcgata cagtattaaa tggagtaaaa 840 attattggtt ctatcgttgg tacgcgcaaa gacttacaag aggcacttca atttgcagca 900 gaaggaaaag taaaaacaat tgtcgaagtg caaccgcttg aaaacattaa cgacgtattc 960 gatcgtatgt taaaagggca aattaacggc cgcgtcgtgt taaaagtaga ttaa 1014 <210> 9 <211> 336 <212> PRT <213> Candida parapsilosis <400> 9 Met Ser Ile Pro Ser Ser Gln Tyr Gly Phe Val Phe Asn Lys Gln Ser 1 5 10 15 Gly Leu Asn Leu Arg Asn Asp Leu Pro Val His Lys Pro Lys Ala Gly 20 25 30 Gln Leu Leu Leu Lys Val Asp Ala Val Gly Leu Cys His Ser Asp Leu 35 40 45 His Val Ile Tyr Glu Gly Leu Asp Cys Gly Asp Asn Tyr Val Met Gly 50 55 60 His Glu Ile Ala Gly Thr Val Ala Ala Val Gly Asp Asp Val Ile Asn 65 70 75 80 Tyr Lys Val Gly Asp Arg Val Ala Cys Val Gly Pro Asn Gly Cys Gly 85 90 95 Gly Cys 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Leu Leu Lys Glu Pro Val Ile Leu Glu Ile Ala Lys 225 230 235 240 Lys Asn Asn Val Gln Pro Gly His Val Val Ile Ser Trp His Val Gln 245 250 255 Arg Gly Tyr Val Val Leu Pro Lys Ser Val Asn Pro Asp Arg Ile Lys 260 265 270 Thr Asn Arg Lys Ile Phe Thr Leu Ser Thr Glu Asp Phe Glu Ala Ile 275 280 285 Asn Asn Ile Ser Lys Glu Lys Gly Glu Lys Arg Val Val His Pro Asn 290 295 300 Trp Ser Pro Phe Glu Val Phe Lys 305 310 <210> 14 <211> 274 <212> PRT <213> Hyoscyamus niger <400> 14 Met Ala Gly Glu Ser Glu Val Tyr Ile Asn Gly Asn Asn Gly Gly Ile 1 5 10 15 Arg Trp Ser Leu Lys Gly Thr Thr Ala Leu Val Thr Gly Gly Ser Lys 20 25 30 Gly Ile Gly Tyr Ala Val Val Glu Glu Leu Ala Gly Leu Gly Ala Arg 35 40 45 Val Tyr Thr Cys Ser Arg Asn Glu Lys Glu Leu Gln Gln Cys Leu Asp 50 55 60 Ile Trp Arg Asn Glu Gly Leu Gln Val Glu Gly Ser Val Cys Asp Leu 65 70 75 80 Leu Leu Arg Ser Glu Arg Asp Lys Leu Met Gln Thr Val Ala Asp Leu 85 90 95 Phe Asn Gly Lys Leu Asn Ile Leu Val Asn Asn Ala Gly Val Val Ile 100 105 110 His Lys Glu Ala Lys Asp Phe Thr Lys Glu Asp Tyr Asp Ile Val Leu 115 120 125 Gly Thr Asn Phe Glu Ala Ala Tyr His Leu Cys Gln Leu Ala Tyr Pro 130 135 140 Phe Leu Lys Ala Ser Gln Asn Gly Asn Val Ile Phe Leu Ser Ser Ile 145 150 155 160 Ala Gly Phe Ser Ala Leu Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ser Ala Ser Lys 165 170 175 Ala Ala Ile Asn Gln Ile Thr Lys Asn Leu Ala Cys Glu Trp Ala Lys 180 185 190 Asp Asn Ile Arg Val Asn Ser Val Ala Pro Gly Val Ile Leu Thr Pro 195 200 205 Leu Ile Glu Thr Ala Ile Lys Lys Asn Pro His Gln Lys Glu Glu Ile 210 215 220 Asp Asn Phe Ile Val Lys Thr Pro Met Gly Arg Ala Gly Lys Pro Asn 225 230 235 240 Glu Val Ser Ala Leu Ile Ala Phe Leu Cys Phe Pro Ala Ala Ser Tyr 245 250 255 Ile Thr Gly Gln Ile Ile Trp Ala Asp Gly Gly Phe Thr Ala Asn Gly 260 265 270 Gly Phe <210> 15 <211> 273 <212> PRT <213> Datura stramonium <400> 15 Met Glu Glu Ser Lys Val Ser Met Met Asn Cys Asn Asn Glu Gly Arg 1 5 10 15 Trp Ser Leu Lys Gly Thr Thr Ala Leu Val Thr Gly Gly Ser Lys Gly 20 25 30 Ile Gly Tyr Ala Ile Val Glu Glu Leu Ala Gly Leu Gly Ala Arg Val 35 40 45 Tyr Thr Cys Ser Arg Asn Glu Lys Glu Leu Asp Glu Cys Leu Glu Ile 50 55 60 Trp Arg Glu Lys Gly Leu Asn Val Glu Gly Ser Val Cys Asp Leu Leu 65 70 75 80 Ser Arg Thr Glu Arg Asp Lys Leu Met Gln Thr Val Ala His Val Phe 85 90 95 Asp Gly Lys Leu Asn Ile Leu Val Asn Asn Ala Gly Val Val Ile His 100 105 110 Lys Glu Ala Lys Asp Phe Thr Glu Lys Asp Tyr Asn Ile Ile Met Gly 115 120 125 Thr Asn Phe Glu Ala Ala Tyr His Leu Ser Gln Ile Ala Tyr Pro Leu 130 135 140 Leu Lys Ala Ser Gln Asn Gly Asn Val Ile Phe Leu Ser Ser Ile Ala 145 150 155 160 Gly Phe Ser Ala Leu Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ser Ala Ser Lys Gly 165 170 175 Ala Ile Asn Gln Met Thr Lys Ser Leu Ala Cys Glu Trp Ala Lys Asp 180 185 190 Asn Ile Arg Val Asn Ser Val Ala Pro Gly Val Ile Leu Thr Pro Leu 195 200 205 Val Glu Thr Ala Ile Lys Lys Asn Pro His Gln Lys Glu Glu Ile Asp 210 215 220 Asn Phe Ile Val Lys Thr Pro Met Gly Arg Ala Gly Lys Pro Gln Glu 225 230 235 240 Val Ser Ala Leu Ile Ala Phe Leu Cys Phe Pro Ala Ala Ser Tyr Ile 245 250 255 Thr Gly Gln Ile Ile Trp Ala Asp Gly Gly Phe Thr Ala Asn Gly Gly 260 265 270 Phe <210> 16 <211> 337 <212> PRT <213> Geobacillus stearothermophilus <400> 16 Met Lys Ala Ala Val Val Glu Gln Phe Lys Lys Pro Leu Gln Val Lys 1 5 10 15 Glu Val Glu Lys Pro Lys Ile Ser Tyr Gly Glu Val Leu Val Arg Ile 20 25 30 Lys Ala Cys Gly Val Cys His Thr Asp Leu His Ala Ala His Gly Asp 35 40 45 Trp Pro Val Lys Pro Lys Leu Pro Leu Ile Pro Gly His Glu Gly Val 50 55 60 Gly Val Ile Glu Glu Val Gly Pro Gly Val Thr His Leu Lys Val Gly 65 70 75 80 Asp Arg Val Gly Ile Pro Trp Leu Tyr Ser Ala Cys Gly His Cys Asp 85 90 95 Tyr Cys Leu Ser Gly Gln Glu Thr Leu Cys Glu Arg Gln Gln Asn Ala 100 105 110 Gly Tyr Ser Val Asp Gly Gly Tyr Ala Glu Tyr Cys Arg Ala Ala Ala 115 120 125 Asp Tyr Val Val Lys Ile Pro Asp Asn Leu Ser Phe Glu Glu Ala Ala 130 135 140 Pro Ile Phe Cys Ala Gly Val Thr Thr Tyr Lys Ala Leu Lys Val Thr 145 150 155 160 Gly Ala Lys Pro Gly Glu Trp Val Ala Ile Tyr Gly Ile Gly Gly Leu 165 170 175 Gly His Val Ala Val Gln Tyr Ala Lys Ala Met Gly Leu Asn Val Val 180 185 190 Ala Val Asp Leu Gly Asp Glu Lys Leu Glu Leu Ala Lys Gln Leu Gly 195 200 205 Ala Asp Leu Val Val Asn Pro Lys His Asp Asp Ala Ala Gln Trp Ile 210 215 220 Lys Glu Lys Val Gly Gly Val His Ala Thr Val Val Thr Ala Val Ser 225 230 235 240 Lys Ala Ala Phe Glu Ser Ala Tyr Lys Ser Ile Arg Arg Gly Gly Ala 245 250 255 Cys Val Leu Val Gly Leu Pro Pro Glu Glu Ile Pro Ile Pro Ile Phe 260 265 270 Asp Thr Val Leu Asn Gly Val Lys Ile Ile Gly Ser Ile Val Gly Thr 275 280 285 Arg Lys Asp Leu Gln Glu Ala Leu Gln Phe Ala Ala Glu Gly Lys Val 290 295 300 Lys Thr Ile Val Glu Val Gln Pro Leu Glu Asn Ile Asn Asp Val Phe 305 310 315 320 Asp Arg Met Leu Lys Gly Gln Ile Asn Gly Arg Val Val Leu Lys Val 325 330 335 Asp <210> 17 <211> 765 <212> DNA <213> Pichia finlandica <400> 17 atgtcttata acttccataa caaggttgca gttgttactg gagctctatc aggaatcggc 60 ttaagcgtcg caaaaaagtt ccttcagctc ggcgccaaag taacgatctc tgatgtcagt 120 ggagagaaaa aatatcacga gactgttgtt gctctgaaag cccaaaatct caacactgac 180 aacctccatt atgtacaggc agattccagc aaagaagaag ataacaagaa attgatttcg 240 gaaactctgg caacctttgg gggcctggat attgtttgtg ctaatgcagg aattggaaag 300 ttcgctccca cccatgaaac acccttcgac gtatggaaga aggtgattgc tgtgaatttg 360 aatggagtat tcttactgga taagctagcc atcaattact ggctagagaa aagcaaaccc 420 ggcgtaattg tcaacatggg atcagtccac tcttttgtag cagctcctgg ccttgcgcat 480 tatggagctg caaaaggcgg tgtcaaactg ttaacacaaa cattggctct agagtacgca 540 tctcatggta ttagagtaaa ttctgtcaat ccggggtaca tttcgactcc tttgatagat 600 gaggttccga aagagcggtt ggataaactt gtaagcttgc accctattgg gagactaggt 660 cgtccagagg aagttgctga tgcagtcgca tttctgtgtt cccaggaggc cactttcatc 720 aacggcgttt ctttgccggt tgacgggggg tacacagccc agtaa 765 <210> 18 <211> 254 <212> PRT <213> Pichia finlandica <400> 18 Met Ser Tyr Asn Phe His Asn Lys Val Ala Val Val Thr Gly Ala Leu 1 5 10 15 Ser Gly Ile Gly Leu Ser Val Ala Lys Lys Phe Leu Gln Leu Gly Ala 20 25 30 Lys Val Thr Ile Ser Asp Val Ser Gly Glu Lys Lys Tyr His Glu Thr 35 40 45 Val Val Ala Leu Lys Ala Gln Asn Leu Asn Thr Asp Asn Leu His Tyr 50 55 60 Val Gln Ala Asp Ser Ser Lys Glu Glu Asp Asn Lys Lys Leu Ile Ser 65 70 75 80 Glu Thr Leu Ala Thr Phe Gly Gly Leu Asp Ile Val Cys Ala Asn Ala 85 90 95 Gly Ile Gly Lys Phe Ala Pro Thr His Glu Thr Pro Phe Asp Val Trp 100 105 110 Lys Lys Val Ile Ala Val Asn Leu Asn Gly Val Phe Leu Leu Asp Lys 115 120 125 Leu Ala Ile Asn Tyr Trp Leu Glu Lys Ser Lys Pro Gly Val Ile Val 130 135 140 Asn Met Gly Ser Val His Ser Phe Val Ala Ala Pro Gly Leu Ala His 145 150 155 160 Tyr Gly Ala Ala Lys Gly Gly Val Lys Leu Leu Thr Gln Thr Leu Ala 165 170 175 Leu Glu Tyr Ala Ser His Gly Ile Arg Val Asn Ser Val Asn Pro Gly 180 185 190 Tyr Ile Ser Thr Pro Leu Ile Asp Glu Val Pro Lys Glu Arg Leu Asp 195 200 205 Lys Leu Val Ser Leu His Pro Ile Gly Arg Leu Gly Arg Pro Glu Glu 210 215 220 Val Ala Asp Ala Val Ala Phe Leu Cys Ser Gln Glu Ala Thr Phe Ile 225 230 235 240 Asn Gly Val Ser Leu Pro Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln 245 250 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 19 gtggaattct ataatgtcaa ttccatcaag ccag 34 <210> 20 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 20 ctgaagctta ttatggatta aaaacaacac gaccttcata agc 43 <210> 21 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 21 cacgaattct atcatgaaag caatccagta cacg 34 <210> 22 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 22 tcgaagcttc tagattaaag accagggacc acaac 35 <210> 23 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 23 gagccatggc acctgctact ttacatgatt ctacgaa 37 <210> 24 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 24 gagcttaagt ctagattatt tgaatacttc gaaaggagac ca 42 <210> 25 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 25 gaggaattca atcatgaaag ctgcagttgt g 31 <210> 26 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 26 gtcaagcttc tagattaatc tacttttaac acgacgc 37 <210> 27 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 27 gtcgaattca tacatgtcta tcccagaaac tcaaaaagg 39 <210> 28 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 28 ctgcttaagt ctagattatt tagaagtgtc aacaacgtaa cgaccaa 47 <210> 29 <211> 1047 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 29 atgtctatcc cagaaactca aaaaggtgtt atcttctacg aatcccacgg taaattggaa 60 cacaaggata ttccagttcc aaagccaaag gccaacgaat tgttgatcaa cgttaagtac 120 tctggtgtct gtcacaccga cttgcacgct tggcacggtg actggccatt gccagttaag 180 ctaccattag tcggtggtca cgaaggtgcc ggtgtcgttg tcggcatggg tgaaaacgtt 240 aagggctgga agatcggtga ctacgccggt atcaaatggt tgaacggttc ttgtatggcc 300 tgtgaatact gtgaattggg taacgaatcc aactgtcctc acgctgactt gtctggttac 360 acccacgacg gttctttcca acaatacgct accgctgacg ctgttcaagc cgctcacatt 420 cctcaaggta ccgacttggc ccaagtcgcc cccatcttgt gtgctggtat caccgtctac 480 aaggctttga agtctgctaa cttgatggcc ggtcattggg ttgccatttc cggtgctgcc 540 ggtggtctag gttctttggc tgttcaatac gccaaggcta tgggttacag agtcttgggt 600 attgacggtg gtgaaggtaa ggaagaatta ttcagatcca tcggtggtga agtcttcatt 660 gacttcacta aggaaaagga cattgtcggt gctgttctaa aggccactga cggtggtgct 720 cacggtgtca tcaacgtttc cgtttccgaa gccgctattg aagcttctac cagatacgtt 780 agagctaacg gtaccaccgt tttggtcggt atgccagctg gtgccaagtg ttgttctgat 840 gtcttcaacc aagtcgtcaa gtccatctct attgttggtt cttacgtcgg taacagagcc 900 gacaccagag aagctttgga cttcttcgcc agaggtttgg tcaagtctcc aatcaaggtt 960 gtcggcttgt ctaccttgcc agaaatttac gaaaagatgg aaaagggtca aatcgttggt 1020 agatacgttg ttgacacttc taaataa 1047 <210> 30 <211> 348 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 30 Met Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu Ser His 1 5 10 15 Gly Lys Leu Glu His Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys Ala Asn 20 25 30 Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr Asp Leu 35 40 45 His Ala Trp His Gly Asp Trp Pro Leu Pro Val Lys Leu Pro Leu Val 50 55 60 Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Gly Met Gly Glu Asn Val 65 70 75 80 Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Tyr Ala Gly Ile Lys Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Ser Cys Met Ala Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Gly Asn Glu Ser Asn Cys 100 105 110 Pro His Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe Gln Gln 115 120 125 Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala His Ile Pro Gln Gly Thr 130 135 140 Asp Leu Ala Gln Val Ala Pro Ile Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr 145 150 155 160 Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Met Ala Gly His Trp Val Ala Ile 165 170 175 Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr Ala Lys 180 185 190 Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Gly Gly Glu Gly Lys Glu 195 200 205 Glu Leu Phe Arg Ser Ile Gly Gly Glu Val Phe Ile Asp Phe Thr Lys 210 215 220 Glu Lys Asp Ile Val Gly Ala Val Leu Lys Ala Thr Asp Gly Gly Ala 225 230 235 240 His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Ala Ala Ile Glu Ala Ser 245 250 255 Thr Arg Tyr Val Arg Ala Asn Gly Thr Thr Val Leu Val Gly Met Pro 260 265 270 Ala Gly Ala Lys Cys Cys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val Lys Ser 275 280 285 Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr Arg Glu 290 295 300 Ala Leu Asp Phe Phe Ala Arg Gly Leu Val Lys Ser Pro Ile Lys Val 305 310 315 320 Val Gly Leu Ser Thr Leu Pro Glu Ile Tyr Glu Lys Met Glu Lys Gly 325 330 335 Gln Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys 340 345 <210> 31 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 31 gtcgaattca tacatgtcta ttccagaaac tcaaaaagc 39 <210> 32 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 32 gcacttaagt ctagattatt tagaagtgtc aacaacgtaa cgaccag 47 <210> 33 <211> 1047 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 33 atgtctattc cagaaactca aaaagccatt atcttctacg aatccaacgg caagttggag 60 cataaggata tcccagttcc aaagccaaag cccaacgaat tgttaatcaa cgtcaagtac 120 tctggtgtct gccacaccga tttgcacgct tggcatggtg actggccatt gccaactaag 180 ttaccattag ttggtggtca cgaaggtgcc ggtgtcgttg tcggcatggg tgaaaacgtt 240 aagggctgga agatcggtga ctacgccggt atcaaatggt tgaacggttc ttgtatggcc 300 tgtgaatact gtgaattggg taacgaatcc aactgtcctc acgctgactt gtctggttac 360 acccacgacg gttctttcca agaatacgct accgctgacg ctgttcaagc cgctcacatt 420 cctcaaggta ctgacttggc tgaagtcgcg ccaatcttgt gtgctggtat caccgtatac 480 aaggctttga agtctgccaa cttgagagca ggccactggg cggccatttc tggtgctgct 540 ggtggtctag gttctttggc tgttcaatat gctaaggcga tgggttacag agtcttaggt 600 attgatggtg gtccaggaaa ggaagaattg tttacctcgc tcggtggtga agtattcatc 660 gacttcacca aagagaagga cattgttagc gcagtcgtta aggctaccaa cggcggtgcc 720 cacggtatca tcaatgtttc cgtttccgaa gccgctatcg aagcttctac cagatactgt 780 agggcgaacg gtactgttgt cttggttggt ttgccagccg gtgcaaagtg ctcctctgat 840 gtcttcaacc acgttgtcaa gtctatctcc attgtcggct cttacgtggg gaacagagct 900 gataccagag aagccttaga tttctttgcc agaggtctag tcaagtctcc aataaaggta 960 gttggcttat ccagtttacc agaaatttac gaaaagatgg agaagggcca aattgctggt 1020 cgttacgttg ttgacacttc taaataa 1047 <210> 34 <211> 348 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 34 Met Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Ala Ile Ile Phe Tyr Glu Ser Asn 1 5 10 15 Gly Lys Leu Glu His Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys Pro Asn 20 25 30 Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr Asp Leu 35 40 45 His Ala Trp His Gly Asp Trp Pro Leu Pro Thr Lys Leu Pro Leu Val 50 55 60 Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Gly Met Gly Glu Asn Val 65 70 75 80 Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Tyr Ala Gly Ile Lys Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Ser Cys Met Ala Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Gly Asn Glu Ser Asn Cys 100 105 110 Pro His Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe Gln Glu 115 120 125 Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala His Ile Pro Gln Gly Thr 130 135 140 Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Ile Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr 145 150 155 160 Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Arg Ala Gly His Trp Ala Ala Ile 165 170 175 Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr Ala Lys 180 185 190 Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Gly Gly Pro Gly Lys Glu 195 200 205 Glu Leu Phe Thr Ser Leu Gly Gly Glu Val Phe Ile Asp Phe Thr Lys 210 215 220 Glu Lys Asp Ile Val Ser Ala Val Val Lys Ala Thr Asn Gly Gly Ala 225 230 235 240 His Gly Ile Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Ala Ala Ile Glu Ala Ser 245 250 255 Thr Arg Tyr Cys Arg Ala Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly Leu Pro 260 265 270 Ala Gly Ala Lys Cys Ser Ser Asp Val Phe Asn His Val Val Lys Ser 275 280 285 Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr Arg Glu 290 295 300 Ala Leu Asp Phe Phe Ala Arg Gly Leu Val Lys Ser Pro Ile Lys Val 305 310 315 320 Val Gly Leu Ser Ser Leu Pro Glu Ile Tyr Glu Lys Met Glu Lys Gly 325 330 335 Gln Ile Ala Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys 340 345 <210> 35 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 35 gagtcatgag ttcactggtt actcttaata acggtc 36 <210> 36 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 36 gacgaattcc tctagattat gcaaaagtgg ggaatttacc atc 43 <210> 37 <211> 984 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 37 atgagttcac tggttactct taataacggt ctgaaaatgc ccctagtcgg cttagggtgc 60 tggaaaattg acaaaaaagt ctgtgcgaat caaatttatg aagctatcaa attaggctac 120 cgtttattcg atggtgcttg cgactacggc aacgaaaagg aagttggtga aggtatcagg 180 aaagccatct ccgaaggtct tgtttctaga aaggatatat ttgttgtttc aaagttatgg 240 aacaattttc accatcctga tcatgtaaaa ttagctttaa agaagacctt aagcgatatg 300 ggacttgatt atttagacct gtattatatt cacttcccaa tcgccttcaa atatgttcca 360 tttgaagaga aataccctcc aggattctat acgggcgcag atgacgagaa gaaaggtcac 420 atcaccgaag cacatgtacc aatcatagat acgtaccggg ctctggaaga atgtgttgat 480 gaaggcttga ttaagtctat tggtgtttcc aactttcagg gaagcttgat tcaagattta 540 ttacgtggtt gtagaatcaa gcccgtggct ttgcaaattg aacaccatcc ttatttgact 600 caagaacacc tagttgagtt ttgtaaatta cacgatatcc aagtagttgc ttactcctcc 660 ttcggtcctc aatcattcat tgagatggac ttacagttgg caaaaaccac gccaactctg 720 ttcgagaatg atgtaatcaa gaaggtctca caaaaccatc caggcagtac cacttcccaa 780 gtattgctta gatgggcaac tcagagaggc attgccgtca ttccaaaatc ttccaagaag 840 gaaaggttac ttggcaacct agaaatcgaa aaaaagttca ctttaacgga gcaagaattg 900 aaggatattt ctgcactaaa tgccaacatc agatttaatg atccatggac ctggttggat 960 ggtaaattcc ccacttttgc ataa 984 <210> 38 <211> 327 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 38 Met Ser Ser Leu Val Thr Leu Asn Asn Gly Leu Lys Met Pro Leu Val 1 5 10 15 Gly Leu Gly Cys Trp Lys Ile Asp Lys Lys Val Cys Ala Asn Gln Ile 20 25 30 Tyr Glu Ala Ile Lys Leu Gly Tyr Arg Leu Phe Asp Gly Ala Cys Asp 35 40 45 Tyr Gly Asn Glu Lys Glu Val Gly Glu Gly Ile Arg Lys Ala Ile Ser 50 55 60 Glu Gly Leu Val Ser Arg Lys Asp Ile Phe Val Val Ser Lys Leu Trp 65 70 75 80 Asn Asn Phe His His Pro Asp His Val Lys Leu Ala Leu Lys Lys Thr 85 90 95 Leu Ser Asp Met Gly Leu Asp Tyr Leu Asp Leu Tyr Tyr Ile His Phe 100 105 110 Pro Ile Ala Phe Lys Tyr Val Pro Phe Glu Glu Lys Tyr Pro Pro Gly 115 120 125 Phe Tyr Thr Gly Ala Asp Asp Glu Lys Lys Gly His Ile Thr Glu Ala 130 135 140 His Val Pro Ile Ile Asp Thr Tyr Arg Ala Leu Glu Glu Cys Val Asp 145 150 155 160 Glu Gly Leu Ile Lys Ser Ile Gly Val Ser Asn Phe Gln Gly Ser Leu 165 170 175 Ile Gln Asp Leu Leu Arg Gly Cys Arg Ile Lys Pro Val Ala Leu Gln 180 185 190 Ile Glu His His Pro Tyr Leu Thr Gln Glu His Leu Val Glu Phe Cys 195 200 205 Lys Leu His Asp Ile Gln Val Val Ala Tyr Ser Ser Phe Gly Pro Gln 210 215 220 Ser Phe Ile Glu Met Asp Leu Gln Leu Ala Lys Thr Thr Pro Thr Leu 225 230 235 240 Phe Glu Asn Asp Val Ile Lys Lys Val Ser Gln Asn His Pro Gly Ser 245 250 255 Thr Thr Ser Gln Val Leu Leu Arg Trp Ala Thr Gln Arg Gly Ile Ala 260 265 270 Val Ile Pro Lys Ser Ser Lys Lys Glu Arg Leu Leu Gly Asn Leu Glu 275 280 285 Ile Glu Lys Lys Phe Thr Leu Thr Glu Gln Glu Leu Lys Asp Ile Ser 290 295 300 Ala Leu Asn Ala Asn Ile Arg Phe Asn Asp Pro Trp Thr Trp Leu Asp 305 310 315 320 Gly Lys Phe Pro Thr Phe Ala 325

Claims

하기 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질, 해당 단백질을 기능적으로 발현하는 미생물 또는 형질 전환주, 또는 그들의 처리물을 식(1)

[화학식 1]

에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤에 작용시키는 공정을 포함한 식(2)

[화학식 2]

에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올의 제조방법;

(a)서열번호: 1∼8 중 어느 하나에 기재된 염기서열을 포함한 폴리뉴클레오티드,

(b)서열번호: 9∼16 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

(c)서열번호: 9∼16 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에서, 1 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실(缺失), 삽입 및/또는 부가된 아미노산으로 이루어진 단백질로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

(d)서열번호: 1∼8 중 어느 하나에 기재된 염기서열로 이루어진 DNA와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및,

(e)서열번호: 9∼16 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열을 가지고, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
하기 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질, 해당 단백질을 기능적으로 발현하는 미생물 또는 형질 전환주, 또는 그들 처리물을 식(1)

[화학식 3]

에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤에 작용시키는 공정을 포함한 식(3)

[화학식 4]

에 표시된 (R)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올의 제조방법;

(a)서열번호: 17에 기재된 염기서열을 포함한 폴리뉴클레오티드,

(b)서열번호: 18에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

(c)서열번호: 18에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산으로 이루어진 단백질로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(3)에 표시된 (R)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

(d)서열번호: 17에 기재된 염기서열로 이루어진 DNA와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(3)에 표시된 (R)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및,

(e)서열번호: 18에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열을 가지고, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(3)에 표시된 (R)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
하기 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질, 해당 단백질에 대응하는 보효소 및 환원형 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드(NADH) 또는 환원형 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드인산(NADPH)을 재생하는 활성을 가진 탈수소 효소를 동시에 발현하는 형질 전환주, 또는 그들의 처리물을 식(1)

[화학식 5]

에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤에 작용시키는 공정을 포함한 식(2)

[화학식 6]

에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올의 제조방법;

(a)서열번호: 1∼8 중 어느 하나에 기재된 염기서열을 포함한 폴리뉴클레오티드,

(b)서열번호: 9∼16 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

(c)서열번호: 9∼16 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산으로 이루어진 단백질 로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

(d)서열번호: 1∼8 중 어느 하나에 기재된 염기서열로 이루어진 DNA와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및,

(e)서열번호: 9∼16 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열을 가지고, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
하기 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질, 해당 단백질에 대응하는 보효소 및 환원형 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드(NADH) 또는 환원형 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드인산(NADPH)을 재생하는 활성을 가진 탈수소 효소를 동시에 발현하는 형질 전환주, 또는 그들의 처리물을 식(1)

[화학식 7]

에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤에 작용시키는 공정을 포함한 식(3)

[화학식 8]

에 표시된 (R)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올의 제조방법;

(a)서열번호: 17에 기재된 염기서열을 포함한 폴리뉴클레오티드,

(b)서열번호: 18에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

(c)서열번호: 18에 기재된 아미노산 서열에서, 1 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산으로 이루어진 단백질로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(3)에 표시된 (R)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

(d)서열번호: 17에 기재된 염기서열로 이루어진 DNA와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(3)에 표시된 (R)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및,

(e)서열번호: 18에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열을 가지고, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(3)에 표시된 (R)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제3항 또는 제4항에 있어서, 환원형 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드(NADH) 또는 환원형 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드인산(NADPH)을 재생하는 활성을 가진 탈수소 효소가 글루코오스 탈수소 효소 또는 포름산 탈수소 효소인 방법.
하기 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질, 해당 단백질을 기능적으로 발현하는 미생물 또는 형질 전환주, 또는 그들의 처리물을 pH 5.0∼6.4의 범위에서 식(1)

[화학식 9]

에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤에 작용시키고, 식(2)

[화학식 10]

에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 안정적으로 광학 순도 99.5% e.e.이상으로 제조하는 방법;

(a)서열번호: 1에 기재된 염기서열을 포함한 폴리뉴클레오티드,

(b)서열번호: 9에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

(c)서열번호: 9에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산으로 이루어진 단백질로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드,

(d)서열번호: 1에 기재된 염기서열로 이루어진 DNA와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로서, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및,

(e)서열번호: 9에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가진 아미노산 서열을 가지고, 식(1)에 표시된 1,1,1-트리플루오로아세톤을 환원하여 식(2)에 표시된 (S)-1,1,1-트리플루오로-2-프로판올을 생성하는 활성을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.