JP2003230398A - 光学活性アルコールの製造方法 - Google Patents
光学活性アルコールの製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】本発明は、光学活性アルコールの製造方法の提
供を課題とする。光学活性アルコールは、医薬品などの
中間体として有用である。 【構成】本発明の光学活性アルコールの製造方法は、ト
ロピノン還元酵素−Ｉによってキヌクリジノンを不斉還
元することにより、光学活性アルコールを生成する。た
とえばDatura stramonium、あるいはHyoscyamus niger
などの植物に由来するトロピノン還元酵素−Ｉによっ
て、光学純度に優れる（Ｒ）−３−キヌクリジノールを
生産することができる。 【化２】式（１） 【効果】高い光学純度の光学活性アルコールを、簡便な
操作で効率的に製造することができる。
供を課題とする。光学活性アルコールは、医薬品などの
中間体として有用である。 【構成】本発明の光学活性アルコールの製造方法は、ト
ロピノン還元酵素−Ｉによってキヌクリジノンを不斉還
元することにより、光学活性アルコールを生成する。た
とえばDatura stramonium、あるいはHyoscyamus niger
などの植物に由来するトロピノン還元酵素−Ｉによっ
て、光学純度に優れる（Ｒ）−３−キヌクリジノールを
生産することができる。 【化２】式（１） 【効果】高い光学純度の光学活性アルコールを、簡便な
操作で効率的に製造することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、トロピノン還元酵
素−Ｉを利用した光学活性アルコールの製造方法に関す
る。
素−Ｉを利用した光学活性アルコールの製造方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】光学活性アルコールは、さまざまな光学
活性物質を合成するための不斉源として有用である。一
般にラセミ体を光学分割したり、あるいは不斉合成によ
って光学活性アルコールは製造されている。特に不斉合
成による光学活性アルコールの製造は、多量の光学活性
アルコールの製造には、不可欠の技術と考えられてい
る。
活性物質を合成するための不斉源として有用である。一
般にラセミ体を光学分割したり、あるいは不斉合成によ
って光学活性アルコールは製造されている。特に不斉合
成による光学活性アルコールの製造は、多量の光学活性
アルコールの製造には、不可欠の技術と考えられてい
る。
【０００３】（Ｒ）−３−キヌクリジノールは、産業上
有用な光学活性アルコールの一つである。光学活性
（Ｒ）−３−キヌクリジノールは、例えばスクアレンシ
ンターゼ阻害作用を有する動脈硬化の治療剤、ムスカリ
ン受容体拮抗作用を有する気管支拡張剤、および胃腸運
動抑制剤など（特開平8-134067号、EP-404737A2、EP-42
4021A1、WO92/04346、およびWO93/06098）、多様な生理
活性又は薬理活性成分の重要な中間体として使用され
る。
有用な光学活性アルコールの一つである。光学活性
（Ｒ）−３−キヌクリジノールは、例えばスクアレンシ
ンターゼ阻害作用を有する動脈硬化の治療剤、ムスカリ
ン受容体拮抗作用を有する気管支拡張剤、および胃腸運
動抑制剤など（特開平8-134067号、EP-404737A2、EP-42
4021A1、WO92/04346、およびWO93/06098）、多様な生理
活性又は薬理活性成分の重要な中間体として使用され
る。
【０００４】光学活性３−キヌクリジノールの製造方法
としては、これまでに、例えば、ラセミ体３−キヌクリ
ジノールのアセチル体を酒石酸で分割した後、加水分解
して製造する方法(Acta Pharm. Suec. 16(4), 281-3 (1
979))などが知られている。
としては、これまでに、例えば、ラセミ体３−キヌクリ
ジノールのアセチル体を酒石酸で分割した後、加水分解
して製造する方法(Acta Pharm. Suec. 16(4), 281-3 (1
979))などが知られている。
【０００５】また、微生物や酵素を利用する方法とし
て、例えばラセミ体３−キヌクリジノールエステルを原
料とし、以下のような微生物や酵素を作用させて（Ｓ）
−３−キヌクリジノールエステルを選択的に不斉加水分
解し、残存した（Ｒ）−３−キヌクリジノールエステル
を加水分解して製造する方法が知られている。ズブチリ
シン プロテアーゼ (米国特許5215918号)、Aspergillus
属またはPseudomonas 属由来エステル分解酵素（特開
平10-210997）、あるいはAspergillus属、Rhizopus属、
Candida属、またはPseudomonas属に属する微生物菌体や
酵素など（特開平10-136995）
て、例えばラセミ体３−キヌクリジノールエステルを原
料とし、以下のような微生物や酵素を作用させて（Ｓ）
−３−キヌクリジノールエステルを選択的に不斉加水分
解し、残存した（Ｒ）−３−キヌクリジノールエステル
を加水分解して製造する方法が知られている。ズブチリ
シン プロテアーゼ (米国特許5215918号)、Aspergillus
属またはPseudomonas 属由来エステル分解酵素（特開
平10-210997）、あるいはAspergillus属、Rhizopus属、
Candida属、またはPseudomonas属に属する微生物菌体や
酵素など（特開平10-136995）
【０００６】またラセミ体３−キヌクリジノールエステ
ルを原料とし、馬血清のエステラーゼで（Ｒ）−３−キ
ヌクリジノールエステルを選択的に不斉加水分解して製
造する方法(Life Sci. 21(9), 1593-302 (1977))も報告
されている。更に、ラセミ体３−キヌクリジノールを原
料とし、ズブチリシン プロテアーゼを用いてＳ体のみ
を（Ｓ）−３−キヌクリジニル酪酸に変換させてＲ体を
製造する方法（独国特許19715465）などが知られてい
る。
ルを原料とし、馬血清のエステラーゼで（Ｒ）−３−キ
ヌクリジノールエステルを選択的に不斉加水分解して製
造する方法(Life Sci. 21(9), 1593-302 (1977))も報告
されている。更に、ラセミ体３−キヌクリジノールを原
料とし、ズブチリシン プロテアーゼを用いてＳ体のみ
を（Ｓ）−３−キヌクリジニル酪酸に変換させてＲ体を
製造する方法（独国特許19715465）などが知られてい
る。
【０００７】しかし、これらの製造方法によって得るこ
とができる生成物は、光学純度が低い。またこれらの製
造方法は合成工程が煩雑である。したがっていずれの方
法も（Ｒ）−３−キヌクリジノールを簡便にかつ経済的
に有利に製造できる方法とは言い難い。
とができる生成物は、光学純度が低い。またこれらの製
造方法は合成工程が煩雑である。したがっていずれの方
法も（Ｒ）−３−キヌクリジノールを簡便にかつ経済的
に有利に製造できる方法とは言い難い。
【０００８】その他、微生物や酵素による不斉還元反応
を利用して３−キヌクリジノンから光学活性３−キヌク
リジノールを製造する方法（特開平10-243795, 特開平1
1-196890, 特開2000-245495, 2001年度農芸化学会要旨
集 p.371 3Y7a9）が知られている。これらの反応は、野
生型の微生物を基質化合物に作用させ、光学活性な化合
物を直接的に生成する反応である。反応工程は１段階反
応となり、反応工程の簡略化においては、大きく改善さ
れたといえる。しかし依然として、生成物の光学純度が
低い点、また生成物の蓄積濃度が低いなどの問題があ
る。
を利用して３−キヌクリジノンから光学活性３−キヌク
リジノールを製造する方法（特開平10-243795, 特開平1
1-196890, 特開2000-245495, 2001年度農芸化学会要旨
集 p.371 3Y7a9）が知られている。これらの反応は、野
生型の微生物を基質化合物に作用させ、光学活性な化合
物を直接的に生成する反応である。反応工程は１段階反
応となり、反応工程の簡略化においては、大きく改善さ
れたといえる。しかし依然として、生成物の光学純度が
低い点、また生成物の蓄積濃度が低いなどの問題があ
る。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、トロピノン
還元酵素−Ｉを利用して、高い光学純度を有する光学活
性アルコールを効率的に製造することができる方法の提
供を課題とする。
還元酵素−Ｉを利用して、高い光学純度を有する光学活
性アルコールを効率的に製造することができる方法の提
供を課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、経済的
に、しかも簡便な方法で光学活性アルコールを得るた
め、ケトン還元酵素の還元作用に着目した。そしてケト
ン還元酵素であるトロピノン還元酵素−Ｉの還元作用に
よって、光学純度の高い光学活性アルコールを効率的に
製造しうることを見出し本発明を完成した。
に、しかも簡便な方法で光学活性アルコールを得るた
め、ケトン還元酵素の還元作用に着目した。そしてケト
ン還元酵素であるトロピノン還元酵素−Ｉの還元作用に
よって、光学純度の高い光学活性アルコールを効率的に
製造しうることを見出し本発明を完成した。
【００１１】さらに本発明者らは、トロピノン還元酵素
−Ｉによる光学活性アルコールの生成効率を高めるた
め、不斉還元にともなって生成する酸化型補酵素の再生
用酵素の共発現について検討した。その結果、再生用酵
素の共発現によって、より効率的に光学活性アルコール
が生成されることを見出した。特に、特定のグルコース
脱水素酵素を共発現させた場合に、きわめて高い合成効
率を達成できることを確認した。すなわち本発明は、以
下の光学活性アルコールの製造方法、その製造方法に有
用な酸化型補酵素再生酵素の共発現ベクター、ベクター
による形質転換体に関する。あるいは本発明は、前記製
造方法によって得ることができる光学活性アルコールを
結晶として得るための方法に関する。
−Ｉによる光学活性アルコールの生成効率を高めるた
め、不斉還元にともなって生成する酸化型補酵素の再生
用酵素の共発現について検討した。その結果、再生用酵
素の共発現によって、より効率的に光学活性アルコール
が生成されることを見出した。特に、特定のグルコース
脱水素酵素を共発現させた場合に、きわめて高い合成効
率を達成できることを確認した。すなわち本発明は、以
下の光学活性アルコールの製造方法、その製造方法に有
用な酸化型補酵素再生酵素の共発現ベクター、ベクター
による形質転換体に関する。あるいは本発明は、前記製
造方法によって得ることができる光学活性アルコールを
結晶として得るための方法に関する。
【００１２】〔１〕還元型補酵素の存在下、ケトンにト
ロピノン還元酵素−Ｉ活性を有する酵素活性物質を作用
させ、不斉還元によって生成する光学活性アルコールを
回収する工程を含む、光学活性アルコールの製造方法。 〔２〕ケトンが３−キヌクリジノンであり、光学活性ア
ルコールが（Ｒ）−３−キヌクリジノールである〔１〕
に記載の方法。 〔３〕酵素活性物質が、８０%ee以上の光学純度の光学
活性アルコールを生成するトロピノン還元酵素−Ｉ活性
を有する〔１〕に記載の方法。 〔４〕酵素活性物質が、Datura属、またはHyoscyamus属
に属する植物に由来する〔１〕に記載の方法。 〔５〕Datura属に属する植物が、Datura stramoniumで
ある〔４〕に記載の方法。 〔６〕Hyoscyamus属に属する植物が、Hyoscyamus niger
である〔４〕に記載の方法。 〔７〕酵素活性物質が、下記（ａ）から（ｄ）のいずれ
かに記載の蛋白質である〔１〕に記載の方法。 （ａ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミ
ノ酸配列を有する蛋白質、 （ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミ
ノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠
失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からな
り、３−キヌクリジノンを不斉還元し（Ｒ）−３−キヌ
クリジノールを生成する活性を有する蛋白質、 （ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミ
ノ酸配列と85％以上の相同性を有するアミノ酸配列から
なり、３−キヌクリジノンを不斉還元し（Ｒ）−３−キ
ヌクリジノールを生成する活性を有する蛋白質、 （ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基
配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコ
ードされ、３−キヌクリジノンを不斉還元し（Ｒ）−３
−キヌクリジノールを生成する活性を有する蛋白質 〔８〕酵素活性物質が、トロピノン還元酵素−Ｉをコー
ドするＤＮＡを含むベクターにより形質転換された形質
転換体、またはその処理物である〔１〕に記載の方法。
ロピノン還元酵素−Ｉ活性を有する酵素活性物質を作用
させ、不斉還元によって生成する光学活性アルコールを
回収する工程を含む、光学活性アルコールの製造方法。 〔２〕ケトンが３−キヌクリジノンであり、光学活性ア
ルコールが（Ｒ）−３−キヌクリジノールである〔１〕
に記載の方法。 〔３〕酵素活性物質が、８０%ee以上の光学純度の光学
活性アルコールを生成するトロピノン還元酵素−Ｉ活性
を有する〔１〕に記載の方法。 〔４〕酵素活性物質が、Datura属、またはHyoscyamus属
に属する植物に由来する〔１〕に記載の方法。 〔５〕Datura属に属する植物が、Datura stramoniumで
ある〔４〕に記載の方法。 〔６〕Hyoscyamus属に属する植物が、Hyoscyamus niger
である〔４〕に記載の方法。 〔７〕酵素活性物質が、下記（ａ）から（ｄ）のいずれ
かに記載の蛋白質である〔１〕に記載の方法。 （ａ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミ
ノ酸配列を有する蛋白質、 （ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミ
ノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠
失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からな
り、３−キヌクリジノンを不斉還元し（Ｒ）−３−キヌ
クリジノールを生成する活性を有する蛋白質、 （ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミ
ノ酸配列と85％以上の相同性を有するアミノ酸配列から
なり、３−キヌクリジノンを不斉還元し（Ｒ）−３−キ
ヌクリジノールを生成する活性を有する蛋白質、 （ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基
配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコ
ードされ、３−キヌクリジノンを不斉還元し（Ｒ）−３
−キヌクリジノールを生成する活性を有する蛋白質 〔８〕酵素活性物質が、トロピノン還元酵素−Ｉをコー
ドするＤＮＡを含むベクターにより形質転換された形質
転換体、またはその処理物である〔１〕に記載の方法。
〔９〕形質転換体が、下記（ａ）から（ｄ）のいずれか
に記載のＤＮＡを含むベクターにより形質転換された形
質転換体である〔８〕に記載の方法。 （ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基
酸配列を有するＤＮＡ、（ｂ）配列番号：２、または配
列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複
数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加
したアミノ酸配列からなり、３−キヌクリジノンを不斉
還元し（Ｒ）−３−キヌクリジノールを生成する活性を
有する蛋白質をコードするＤＮＡ、 （ｃ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基
配列と85％以上の相同性を有する塩基配列からなり、３
−キヌクリジノンを不斉還元し（Ｒ）−３−キヌクリジ
ノールを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮ
Ａ、 （ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基
配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズし、３−キヌクリジノンを不斉還
元し（Ｒ）−３−キヌクリジノールを生成する活性を有
する蛋白質をコードするＤＮＡ 〔１０〕ベクターが、更に酸化型補酵素を還元型補酵素
に再生する酵素をコードするＤＮＡを共に含む〔８〕に
記載の方法。 〔１１〕酸化型補酵素を還元型補酵素に再生する酵素
が、グルコース脱水素酵素である〔１０〕に記載の方
法。 〔１２〕グルコース脱水素酵素がBacillus subtilisま
たはThermoplasma acidophilum由来である〔１１〕に記
載の方法。 〔１３〕不斉還元反応をpH６．５−８．５の範囲内で行
う、〔１〕に記載の方法。 〔１４〕次の工程を含む、（Ｒ）−３−キヌクリジノー
ル塩酸塩の製造方法。 （ａ）（Ｒ）−３−キヌクリジノールを含む溶液のpHを
アルカリ性としてフリー体（Ｒ）−３−キヌクリジノー
ルとする工程、（ｂ）フリー体（Ｒ）−３−キヌクリジ
ノールをｎ−ブタノールで抽出する工程、（ｃ）抽出液
に塩酸を添加する工程、（ｄ）抽出液中の水分を除去す
る工程、および（ｅ）ｎ−ブタノールより（Ｒ）−３−
キヌクリジノール塩酸塩を結晶化する工程 〔１５〕 次の工程を含む、（Ｒ）−３−キヌクリジノ
ールの製造方法。 （ａ）（Ｒ）−３−キヌクリジノール塩酸塩を溶媒Ａに
溶解する工程、ここで溶媒Ａは（Ｒ）−３−キヌクリジ
ノール塩酸塩を１％以上の濃度で溶解する溶媒である
（ｂ）（ａ）の溶液のpHをアルカリ性としてフリー体
（Ｒ）−３−キヌクリジノールとする工程、（ｃ）溶媒
Ｂを添加し、溶媒Ａを留去後、溶媒Ｂより（Ｒ）−３−
キヌクリジノールを結晶化する工程、ここで溶媒Ｂは溶
媒Ａとの混合物から溶媒Ａを蒸留により置換することが
できる溶媒であって、かつ溶媒Ａよりもフリー体（Ｒ）
−３−キヌクリジノールの溶解度が低く、そして溶媒Ｂ
からフリー体（Ｒ）−３−キヌクリジノールを結晶化す
ることが可能な溶媒である 〔１６〕溶媒Ｂが、トルエン、４−メチル−２−ペンタ
ノン、および酢酸ブチルで構成される群から選択された
いずれかの溶媒である〔１５〕に記載の方法。 〔１７〕溶媒Ａが水であり、溶媒Ｂがトルエンである、
〔１５〕に記載の方法 〔１８〕 次の工程を含む、（Ｒ）−３−キヌクリジ
ノールの製造方法。 （ａ）（Ｒ）−３−キヌクリジノールを含む溶液のpHを
アルカリ性としてフリー体（Ｒ）−３−キヌクリジノー
ルとする工程、（ｂ）フリー体（Ｒ）−３−キヌクリジ
ノールをｎ−ブタノールで抽出する工程、および（ｃ）
抽出液に溶媒Ｂを添加し、ｎ−ブタノールを留去後、溶
媒Ｂより（Ｒ）−３−キヌクリジノールを結晶化する工
程 〔１９〕トロピノン還元酵素−ＩをコードするＤＮＡ、
および酸化型補酵素を還元型補酵素に再生する酵素をコ
ードするＤＮＡを発現可能に保持したベクター。 〔２０〕トロピノン還元酵素−ＩをコードするＤＮＡ
が、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡで
ある〔１９〕に記載のベクター。 （ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基
酸配列を有するＤＮＡ、 （ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミ
ノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠
失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からな
り、３−キヌクリジノンを不斉還元し（Ｒ）−３−キヌ
クリジノールを生成する活性を有する蛋白質をコードす
るＤＮＡ、 （ｃ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基
配列と85％以上の相同性を有する塩基配列からなり、３
−キヌクリジノンを不斉還元し（Ｒ）−３−キヌクリジ
ノールを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮ
Ａ、 （ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基
配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズし、３−キヌクリジノンを不斉還
元し（Ｒ）−３−キヌクリジノールを生成する活性を有
する蛋白質をコードするＤＮＡ 〔２１〕酸化型補酵素を還元型補酵素に再生する酵素
が、グルコース脱水素酵素である〔１９〕に記載のベク
ター。 〔２２〕グルコース脱水素酵素が、Bacillus subtilis
またはThermoplasma acidophilum由来である〔２１〕に
記載のベクター 〔２３〕〔１９〕に記載のベクターを発現可能に保持し
た形質転換体。 〔２４〕宿主が大腸菌である〔２３〕に記載の形質転換
体。
に記載のＤＮＡを含むベクターにより形質転換された形
質転換体である〔８〕に記載の方法。 （ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基
酸配列を有するＤＮＡ、（ｂ）配列番号：２、または配
列番号：４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複
数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加
したアミノ酸配列からなり、３−キヌクリジノンを不斉
還元し（Ｒ）−３−キヌクリジノールを生成する活性を
有する蛋白質をコードするＤＮＡ、 （ｃ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基
配列と85％以上の相同性を有する塩基配列からなり、３
−キヌクリジノンを不斉還元し（Ｒ）−３−キヌクリジ
ノールを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮ
Ａ、 （ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基
配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズし、３−キヌクリジノンを不斉還
元し（Ｒ）−３−キヌクリジノールを生成する活性を有
する蛋白質をコードするＤＮＡ 〔１０〕ベクターが、更に酸化型補酵素を還元型補酵素
に再生する酵素をコードするＤＮＡを共に含む〔８〕に
記載の方法。 〔１１〕酸化型補酵素を還元型補酵素に再生する酵素
が、グルコース脱水素酵素である〔１０〕に記載の方
法。 〔１２〕グルコース脱水素酵素がBacillus subtilisま
たはThermoplasma acidophilum由来である〔１１〕に記
載の方法。 〔１３〕不斉還元反応をpH６．５−８．５の範囲内で行
う、〔１〕に記載の方法。 〔１４〕次の工程を含む、（Ｒ）−３−キヌクリジノー
ル塩酸塩の製造方法。 （ａ）（Ｒ）−３−キヌクリジノールを含む溶液のpHを
アルカリ性としてフリー体（Ｒ）−３−キヌクリジノー
ルとする工程、（ｂ）フリー体（Ｒ）−３−キヌクリジ
ノールをｎ−ブタノールで抽出する工程、（ｃ）抽出液
に塩酸を添加する工程、（ｄ）抽出液中の水分を除去す
る工程、および（ｅ）ｎ−ブタノールより（Ｒ）−３−
キヌクリジノール塩酸塩を結晶化する工程 〔１５〕 次の工程を含む、（Ｒ）−３−キヌクリジノ
ールの製造方法。 （ａ）（Ｒ）−３−キヌクリジノール塩酸塩を溶媒Ａに
溶解する工程、ここで溶媒Ａは（Ｒ）−３−キヌクリジ
ノール塩酸塩を１％以上の濃度で溶解する溶媒である
（ｂ）（ａ）の溶液のpHをアルカリ性としてフリー体
（Ｒ）−３−キヌクリジノールとする工程、（ｃ）溶媒
Ｂを添加し、溶媒Ａを留去後、溶媒Ｂより（Ｒ）−３−
キヌクリジノールを結晶化する工程、ここで溶媒Ｂは溶
媒Ａとの混合物から溶媒Ａを蒸留により置換することが
できる溶媒であって、かつ溶媒Ａよりもフリー体（Ｒ）
−３−キヌクリジノールの溶解度が低く、そして溶媒Ｂ
からフリー体（Ｒ）−３−キヌクリジノールを結晶化す
ることが可能な溶媒である 〔１６〕溶媒Ｂが、トルエン、４−メチル−２−ペンタ
ノン、および酢酸ブチルで構成される群から選択された
いずれかの溶媒である〔１５〕に記載の方法。 〔１７〕溶媒Ａが水であり、溶媒Ｂがトルエンである、
〔１５〕に記載の方法 〔１８〕 次の工程を含む、（Ｒ）−３−キヌクリジ
ノールの製造方法。 （ａ）（Ｒ）−３−キヌクリジノールを含む溶液のpHを
アルカリ性としてフリー体（Ｒ）−３−キヌクリジノー
ルとする工程、（ｂ）フリー体（Ｒ）−３−キヌクリジ
ノールをｎ−ブタノールで抽出する工程、および（ｃ）
抽出液に溶媒Ｂを添加し、ｎ−ブタノールを留去後、溶
媒Ｂより（Ｒ）−３−キヌクリジノールを結晶化する工
程 〔１９〕トロピノン還元酵素−ＩをコードするＤＮＡ、
および酸化型補酵素を還元型補酵素に再生する酵素をコ
ードするＤＮＡを発現可能に保持したベクター。 〔２０〕トロピノン還元酵素−ＩをコードするＤＮＡ
が、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡで
ある〔１９〕に記載のベクター。 （ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基
酸配列を有するＤＮＡ、 （ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミ
ノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠
失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からな
り、３−キヌクリジノンを不斉還元し（Ｒ）−３−キヌ
クリジノールを生成する活性を有する蛋白質をコードす
るＤＮＡ、 （ｃ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基
配列と85％以上の相同性を有する塩基配列からなり、３
−キヌクリジノンを不斉還元し（Ｒ）−３−キヌクリジ
ノールを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮ
Ａ、 （ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基
配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズし、３−キヌクリジノンを不斉還
元し（Ｒ）−３−キヌクリジノールを生成する活性を有
する蛋白質をコードするＤＮＡ 〔２１〕酸化型補酵素を還元型補酵素に再生する酵素
が、グルコース脱水素酵素である〔１９〕に記載のベク
ター。 〔２２〕グルコース脱水素酵素が、Bacillus subtilis
またはThermoplasma acidophilum由来である〔２１〕に
記載のベクター 〔２３〕〔１９〕に記載のベクターを発現可能に保持し
た形質転換体。 〔２４〕宿主が大腸菌である〔２３〕に記載の形質転換
体。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明は、還元型補酵素の存在
下、ケトンにトロピノン還元酵素−Ｉ活性を有する酵素
活性物質を作用させ、不斉還元によって生成する光学活
性アルコールを回収する工程を含む、光学活性アルコー
ルの製造方法に関する。
下、ケトンにトロピノン還元酵素−Ｉ活性を有する酵素
活性物質を作用させ、不斉還元によって生成する光学活
性アルコールを回収する工程を含む、光学活性アルコー
ルの製造方法に関する。
【００１４】本発明における酵素活性物質は、トロピノ
ン還元酵素−Ｉ活性を有し、かつケトンを不斉還元して
光学活性アルコールを生成しうるものであれば、任意の
酵素を用いることができる。
ン還元酵素−Ｉ活性を有し、かつケトンを不斉還元して
光学活性アルコールを生成しうるものであれば、任意の
酵素を用いることができる。
【００１５】本発明において、トロピノン還元酵素−Ｉ
活性とは、トロピノンに作用してトロピンを生成する活
性を言う。トロピノン還元酵素には、トロピノンから互
いに逆の立体配置を持つトロピンとシュードトロピンを
生成する二種類の還元酵素が報告されている。これらの
酵素は、それぞれトロピノン還元酵素−Ｉ（EC.1.1.1.2
06）、およびトロピノン還元酵素−ＩＩ(EC1.1.1.236)
と名づけられている。これらの酵素は、ヒヨスチアミン
やスコポラミンなどのトロパンアルカロイド生合成経路
の分岐点に位置する反応を触媒する。トロピノン還元酵
素のうちトロピノン還元酵素−Ｉは、３−キヌクリジノ
ン還元活性を示すことが、以下のような生物に由来する
酵素において報告されている。Hyoscyamus niger (Plant Physiol., 100, 836-845 (19
92))、Datura stramonium (Phytochemistry, 37(2), 39
1-400 (1994))Brugmansia candida x aurea hybrid (Phytochemistry,
52, 871-878 (1999)) なお、Brugmansia candida x aurea hybrid 由来のトロ
ピノン還元酵素−ＩＩはキヌクリジノン還元活性を持つ
ことが報告されているが、本発明に用いる酵素はトロピ
ノン還元酵素−Ｉである。すなわちトロピノンに作用し
てトロピンを生成する活性を有する酵素である。
活性とは、トロピノンに作用してトロピンを生成する活
性を言う。トロピノン還元酵素には、トロピノンから互
いに逆の立体配置を持つトロピンとシュードトロピンを
生成する二種類の還元酵素が報告されている。これらの
酵素は、それぞれトロピノン還元酵素−Ｉ（EC.1.1.1.2
06）、およびトロピノン還元酵素−ＩＩ(EC1.1.1.236)
と名づけられている。これらの酵素は、ヒヨスチアミン
やスコポラミンなどのトロパンアルカロイド生合成経路
の分岐点に位置する反応を触媒する。トロピノン還元酵
素のうちトロピノン還元酵素−Ｉは、３−キヌクリジノ
ン還元活性を示すことが、以下のような生物に由来する
酵素において報告されている。Hyoscyamus niger (Plant Physiol., 100, 836-845 (19
92))、Datura stramonium (Phytochemistry, 37(2), 39
1-400 (1994))Brugmansia candida x aurea hybrid (Phytochemistry,
52, 871-878 (1999)) なお、Brugmansia candida x aurea hybrid 由来のトロ
ピノン還元酵素−ＩＩはキヌクリジノン還元活性を持つ
ことが報告されているが、本発明に用いる酵素はトロピ
ノン還元酵素−Ｉである。すなわちトロピノンに作用し
てトロピンを生成する活性を有する酵素である。
【００１６】トロピノン還元酵素−Ｉの酵素活性は、以
下のような方法によって測定することができる。すなわ
ち、100 mM リン酸カリウム緩衝液(pH 6.5)、0.2 mM NA
DPH、4mM トロピノン および酵素を含む反応液中で、37
℃で反応させ、NADPHの減少による340nmの吸収の減少を
測定することにより、トロピノン還元活性を測定するこ
とができる。また、100 mMリン酸カリウム緩衝液 (pH
6.5)、0.2 mM NADPH、4 mM ３−キヌクリジノン及び酵
素を含む反応液中で、37℃で反応させ、NADPHの減少に
よる340nmの吸収の減少を測定することにより、３−キ
ヌクリジノン還元活性を測定することができる。それぞ
れ、1Uは、1分間に1μmolのNADPHの減少を触媒する酵素
量とした。
下のような方法によって測定することができる。すなわ
ち、100 mM リン酸カリウム緩衝液(pH 6.5)、0.2 mM NA
DPH、4mM トロピノン および酵素を含む反応液中で、37
℃で反応させ、NADPHの減少による340nmの吸収の減少を
測定することにより、トロピノン還元活性を測定するこ
とができる。また、100 mMリン酸カリウム緩衝液 (pH
6.5)、0.2 mM NADPH、4 mM ３−キヌクリジノン及び酵
素を含む反応液中で、37℃で反応させ、NADPHの減少に
よる340nmの吸収の減少を測定することにより、３−キ
ヌクリジノン還元活性を測定することができる。それぞ
れ、1Uは、1分間に1μmolのNADPHの減少を触媒する酵素
量とした。
【００１７】なお本発明における「光学活性アルコー
ル」とは、ある光学異性体が別の光学異性体より多く含
まれるアルコール、もしくはある光学異性体のみからな
るアルコールを意味する。さらに、本発明の「光学異性
体」は、一般的に「光学活性体」および「鏡像異性体」
と呼ばれる場合もある。したがって、ケトンを不斉還元
して光学活性アルコールを生成しうる酵素とは、任意の
ケトン化合物を基質として与えたときに、対応する光学
活性アルコールを生成しうる酵素と定義される。
ル」とは、ある光学異性体が別の光学異性体より多く含
まれるアルコール、もしくはある光学異性体のみからな
るアルコールを意味する。さらに、本発明の「光学異性
体」は、一般的に「光学活性体」および「鏡像異性体」
と呼ばれる場合もある。したがって、ケトンを不斉還元
して光学活性アルコールを生成しうる酵素とは、任意の
ケトン化合物を基質として与えたときに、対応する光学
活性アルコールを生成しうる酵素と定義される。
【００１８】本発明に用いる酵素の由来に特に制限はな
い。本発明における好ましい酵素活性物質は、ラセミ体
のケトンを基質として、少なくとも７０％以上、望まし
くは８０%ee以上の光学純度の光学活性アルコールを生
成することができる酵素活性物質である。生成物の光学
純度は、反応生成物の光学分割カラムなどによる解析に
よって確認できる。
い。本発明における好ましい酵素活性物質は、ラセミ体
のケトンを基質として、少なくとも７０％以上、望まし
くは８０%ee以上の光学純度の光学活性アルコールを生
成することができる酵素活性物質である。生成物の光学
純度は、反応生成物の光学分割カラムなどによる解析に
よって確認できる。
【００１９】本発明における好ましい酵素活性物質は、
たとえばDatura属、あるいはHyoscyamus属に属する植物
から得ることができる。より具体的には、Datura stram
onium由来のトロピノン還元酵素−Ｉ（Proc. Natl. Aca
d. Sci. U. S. A.,90,9591-9595(1993)）、 あるいはHy
oscyamus niger由来のトロピノン還元酵素−Ｉ（Biosc
i. Biotechnol. Biochem.,63(10),1819-1822(1999)）が
公知である。
たとえばDatura属、あるいはHyoscyamus属に属する植物
から得ることができる。より具体的には、Datura stram
onium由来のトロピノン還元酵素−Ｉ（Proc. Natl. Aca
d. Sci. U. S. A.,90,9591-9595(1993)）、 あるいはHy
oscyamus niger由来のトロピノン還元酵素−Ｉ（Biosc
i. Biotechnol. Biochem.,63(10),1819-1822(1999)）が
公知である。
【００２０】その他、種々の生物に由来するトロピノン
還元酵素−Ｉも、ケトンを還元して光学活性アルコール
を生成する活性を有する限り利用することができる。他
の生物由来の酵素としては、例えばBrugmansia candida
x aurea hybrid (Phytochemistry, 52, 871-878 (199
9))、Atropa belladonna (Plant Physiol., 100, 836-8
45 (1992))、Physalis philadelphica (Plant Physio
l., 100, 836-845 (1992))、Solanum tuberosum (DNA D
atabank of JAPAN (DDBJ)) 由来のトロピノン還元酵素
−Ｉなどが挙げられる。
還元酵素−Ｉも、ケトンを還元して光学活性アルコール
を生成する活性を有する限り利用することができる。他
の生物由来の酵素としては、例えばBrugmansia candida
x aurea hybrid (Phytochemistry, 52, 871-878 (199
9))、Atropa belladonna (Plant Physiol., 100, 836-8
45 (1992))、Physalis philadelphica (Plant Physio
l., 100, 836-845 (1992))、Solanum tuberosum (DNA D
atabank of JAPAN (DDBJ)) 由来のトロピノン還元酵素
−Ｉなどが挙げられる。
【００２１】前記のように、トロピノン還元酵素−Ｉの
ケトンに対する還元作用は公知である。たとえば３−キ
ヌクリジノンを還元して３−キヌクリジノールを生成す
ることは知られていた。しかし生成する３−キヌクリジ
ノールの立体構造、並びにその光学純度に関しては不明
であった。また、トロピノンに対する作用に基づいて、
３−キヌクリジノンから生成するキヌクリジノールの立
体構造を推定することは困難である。
ケトンに対する還元作用は公知である。たとえば３−キ
ヌクリジノンを還元して３−キヌクリジノールを生成す
ることは知られていた。しかし生成する３−キヌクリジ
ノールの立体構造、並びにその光学純度に関しては不明
であった。また、トロピノンに対する作用に基づいて、
３−キヌクリジノンから生成するキヌクリジノールの立
体構造を推定することは困難である。
【００２２】本発明者らは、トロピノン還元酵素−Ｉに
よるケトンの還元による光学活性アルコールの生成につ
いて研究を重ねた。その結果、トロピノン還元酵素−Ｉ
による光学活性アルコールの生成を確認した。トロピノ
ン還元酵素−Ｉは、たとえば３−キヌクリジノンの不斉
還元反応により、光学純度の高い（Ｒ）−３−キヌクリ
ジノールを高い効率で生成することを見出した。そして
この酵素反応を利用することによって、光学活性アルコ
ールを製造しうることを明らかにして本発明を完成し
た。
よるケトンの還元による光学活性アルコールの生成につ
いて研究を重ねた。その結果、トロピノン還元酵素−Ｉ
による光学活性アルコールの生成を確認した。トロピノ
ン還元酵素−Ｉは、たとえば３−キヌクリジノンの不斉
還元反応により、光学純度の高い（Ｒ）−３−キヌクリ
ジノールを高い効率で生成することを見出した。そして
この酵素反応を利用することによって、光学活性アルコ
ールを製造しうることを明らかにして本発明を完成し
た。
【００２３】本発明において、酵素活性物質とは、精製
酵素のみならず、トロピノン還元酵素−Ｉを含む微生物
菌体、植物、その培養細胞、形質転換体、または、その
処理物が含まれる。処理物とは、生物細胞に対して、物
理処理、生化学的処理、あるいは化学的処理等を行った
産物を指す。生物細胞は、上記酵素を含む植物細胞に加
え、当該酵素の遺伝子を発現可能に保持する形質転換体
も含まれる。また処理物を得るための物理処理には、凍
結融解処理、超音波処理、加圧処理、浸透圧差処理、あ
るいは磨砕処理等が含まれる。また生化学的処理とは、
具体的にはリゾチームなどの細胞壁溶解酵素処理を示す
ことができる。更に、化学的処理としては、界面活性
剤、トルエン、キシレン、またはアセトンなどの有機溶
媒との接触処理などが挙げられる。このような処理によ
って細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラ
スビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出
液やそれを部分精製したものなどは処理物に含まれる。
酵素のみならず、トロピノン還元酵素−Ｉを含む微生物
菌体、植物、その培養細胞、形質転換体、または、その
処理物が含まれる。処理物とは、生物細胞に対して、物
理処理、生化学的処理、あるいは化学的処理等を行った
産物を指す。生物細胞は、上記酵素を含む植物細胞に加
え、当該酵素の遺伝子を発現可能に保持する形質転換体
も含まれる。また処理物を得るための物理処理には、凍
結融解処理、超音波処理、加圧処理、浸透圧差処理、あ
るいは磨砕処理等が含まれる。また生化学的処理とは、
具体的にはリゾチームなどの細胞壁溶解酵素処理を示す
ことができる。更に、化学的処理としては、界面活性
剤、トルエン、キシレン、またはアセトンなどの有機溶
媒との接触処理などが挙げられる。このような処理によ
って細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラ
スビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出
液やそれを部分精製したものなどは処理物に含まれる。
【００２４】酵素活性物質として利用できる精製酵素
は、例えばDatura stramonium(Phytochemistry, 37(2),
391-400 (1994))や、Hyoscyamus niger(Plant Physio
l., 100, 836-845 (1992))等の植物体から公知の方法に
よって単離することができる。あるいは酵素活性物質と
して形質転換体を利用することもできる。まずトロピノ
ン還元酵素−Ｉをコードする遺伝子を取得し、これを遺
伝子組換え技術を用いて同種もしくは異種の宿主中で発
現可能に保持させた形質転換体を得ることができる。こ
の形質転換体は、そのままで、あるいは処理物として酵
素活性物質とすることができる。更にこの形質転換体を
培養して、トロピノン還元酵素−Ｉを取得することもで
きる。
は、例えばDatura stramonium(Phytochemistry, 37(2),
391-400 (1994))や、Hyoscyamus niger(Plant Physio
l., 100, 836-845 (1992))等の植物体から公知の方法に
よって単離することができる。あるいは酵素活性物質と
して形質転換体を利用することもできる。まずトロピノ
ン還元酵素−Ｉをコードする遺伝子を取得し、これを遺
伝子組換え技術を用いて同種もしくは異種の宿主中で発
現可能に保持させた形質転換体を得ることができる。こ
の形質転換体は、そのままで、あるいは処理物として酵
素活性物質とすることができる。更にこの形質転換体を
培養して、トロピノン還元酵素−Ｉを取得することもで
きる。
【００２５】本発明に用いることができるトロピノン還
元酵素−Ｉをコードする遺伝子としては、例えばDatura
stramoniumやHyoscyamus nigerの遺伝子が公知であ
る。Datura stramonium由来のトロピノン還元酵素−Ｉ
遺伝子の塩基配列を配列番号：１(Proc. Natl. Acad. S
ci. U. S. A. ,90 , 9591-9595 (1993))に示した。また
Hyoscyamus niger由来のトロピノン還元酵素−Ｉ遺伝子
の塩基配列を配列番号：３(Biosci. Biotechnol. Bioch
em.,63(10),1819-1822(1999))に示した。
元酵素−Ｉをコードする遺伝子としては、例えばDatura
stramoniumやHyoscyamus nigerの遺伝子が公知であ
る。Datura stramonium由来のトロピノン還元酵素−Ｉ
遺伝子の塩基配列を配列番号：１(Proc. Natl. Acad. S
ci. U. S. A. ,90 , 9591-9595 (1993))に示した。また
Hyoscyamus niger由来のトロピノン還元酵素−Ｉ遺伝子
の塩基配列を配列番号：３(Biosci. Biotechnol. Bioch
em.,63(10),1819-1822(1999))に示した。
【００２６】これらトロピノン還元酵素−Ｉをコードす
る遺伝子の塩基配列情報は、DNA Databank of JAPAN(DD
BJ)、EMBL、Gene-BankなどのDNAに関するデータベース
に登録されている。これらの塩基配列情報に基いて、目
的とする遺伝子を当該生物から取得することができる。
遺伝子の取得には、PCRやハイブリダイズスクリーニン
グが用いられる。また、DNA合成によって遺伝子の全長
を化学的に合成することもできる。
る遺伝子の塩基配列情報は、DNA Databank of JAPAN(DD
BJ)、EMBL、Gene-BankなどのDNAに関するデータベース
に登録されている。これらの塩基配列情報に基いて、目
的とする遺伝子を当該生物から取得することができる。
遺伝子の取得には、PCRやハイブリダイズスクリーニン
グが用いられる。また、DNA合成によって遺伝子の全長
を化学的に合成することもできる。
【００２７】更に上記塩基配列情報に基づいて、上記以
外の生物に由来するトロピノン還元酵素−Ｉ遺伝子を取
得することもできる。たとえば、上記塩基配列もしくは
その一部の配列をプローブとして他の生物から調製した
ＤＮＡに対しストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ゼーションを行うことにより、種々の生物由来のトロピ
ノン還元酵素−Ｉを単離することができる。ストリンジ
ェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチド
とは、配列番号：１または配列番号：３に記載された塩
基配列から選択された塩基配列を有するＤＮＡをプロー
ブＤＮＡとし、たとえばECL direct nucleic acid labe
ling and detection system (AmershamPharmaica Biote
ch社製)を用いて、マニュアルに記載の条件（wash：４
２℃、0.5x SSCを含むprimary wash buffer）におい
て、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。プロ
ーブDNAを構成する塩基配列は、前記塩基配列から任意
の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、た
とえば４０、６０または１００個の連続した配列を一つ
または複数選択することができる。
外の生物に由来するトロピノン還元酵素−Ｉ遺伝子を取
得することもできる。たとえば、上記塩基配列もしくは
その一部の配列をプローブとして他の生物から調製した
ＤＮＡに対しストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ゼーションを行うことにより、種々の生物由来のトロピ
ノン還元酵素−Ｉを単離することができる。ストリンジ
ェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチド
とは、配列番号：１または配列番号：３に記載された塩
基配列から選択された塩基配列を有するＤＮＡをプロー
ブＤＮＡとし、たとえばECL direct nucleic acid labe
ling and detection system (AmershamPharmaica Biote
ch社製)を用いて、マニュアルに記載の条件（wash：４
２℃、0.5x SSCを含むprimary wash buffer）におい
て、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。プロ
ーブDNAを構成する塩基配列は、前記塩基配列から任意
の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、た
とえば４０、６０または１００個の連続した配列を一つ
または複数選択することができる。
【００２８】また、上記塩基配列情報に基づいて、ホモ
ロジーの高い領域からPCR用のプライマーをデザインす
ることができる。このようなプライマーを用い、染色体
ＤＮＡもしくはｃＤＮＡを鋳型としてPCRを行えば、ト
ロピノン還元酵素−Ｉをコードする遺伝子を種々の生物
から単離することもできる。
ロジーの高い領域からPCR用のプライマーをデザインす
ることができる。このようなプライマーを用い、染色体
ＤＮＡもしくはｃＤＮＡを鋳型としてPCRを行えば、ト
ロピノン還元酵素−Ｉをコードする遺伝子を種々の生物
から単離することもできる。
【００２９】本発明の方法においては、天然型の酵素の
みならず、３−キヌクリジノンを還元して（Ｒ）−３−
キヌクリジノールを生成する活性を有する限り、天然型
酵素のアミノ酸配列に対して１または複数のアミノ酸が
置換、欠失、挿入したアミノ酸配列からなる酵素を用い
ることも可能である。当業者であれば、例えば、部位特
異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (198
2) , Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecul
ar Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory
Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press
pp.200 (1991)）などを用いて、適宜置換、欠失、挿
入、および／または付加変異を導入することにより、蛋
白質の構造を改変することができる。本発明において、
置換、欠失、挿入、および／または付加することができ
るアミノ酸残基は、通常５０未満、たとえば３０未満、
あるいは２０未満、好ましくは１６未満、より好ましく
は５未満、更に好ましくは０〜３アミノ酸残基である。
また、アミノ酸の変異は自然界において生じることもあ
り、人工的にアミノ酸を変異した酵素のみならず、自然
界においてアミノ酸が変異した酵素も本発明の方法にお
いて用いることができる。
みならず、３−キヌクリジノンを還元して（Ｒ）−３−
キヌクリジノールを生成する活性を有する限り、天然型
酵素のアミノ酸配列に対して１または複数のアミノ酸が
置換、欠失、挿入したアミノ酸配列からなる酵素を用い
ることも可能である。当業者であれば、例えば、部位特
異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (198
2) , Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecul
ar Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory
Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press
pp.200 (1991)）などを用いて、適宜置換、欠失、挿
入、および／または付加変異を導入することにより、蛋
白質の構造を改変することができる。本発明において、
置換、欠失、挿入、および／または付加することができ
るアミノ酸残基は、通常５０未満、たとえば３０未満、
あるいは２０未満、好ましくは１６未満、より好ましく
は５未満、更に好ましくは０〜３アミノ酸残基である。
また、アミノ酸の変異は自然界において生じることもあ
り、人工的にアミノ酸を変異した酵素のみならず、自然
界においてアミノ酸が変異した酵素も本発明の方法にお
いて用いることができる。
【００３０】また、本発明の方法においては、トロピノ
ン還元酵素−Ｉのアミノ酸配列にホモロジーを有する蛋
白質をコードする遺伝子も、その産物である酵素が３−
キヌクリジノンを還元して（Ｒ）−３−キヌクリジノー
ルを生成する活性を有する限り、本発明に利用すること
ができる。これら遺伝子は、蛋白質のホモロジー検索を
利用して得ることができる。ホモロジー検索には、たと
えば以下に示すデータベースを用いることができる。SW
ISS-PROT、PIRなどの蛋白質のアミノ酸配列に関するデ
ータベース DNA Databank of JAPAN(DDBJ)、EMBL、Gene-Bankなどの
DNAに関するデータベース DNA配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベ
ース FASTA programやBLAST programなどのホモロジー検索用
のプログラムも公知である。更に、上記データベースを
これらのプログラムを用いて検索するサービスも、イン
ターネット上で提供されている。この種のサービスを利
用して、本発明に用いるトロピノン還元酵素−Ｉを見出
すこともできる。
ン還元酵素−Ｉのアミノ酸配列にホモロジーを有する蛋
白質をコードする遺伝子も、その産物である酵素が３−
キヌクリジノンを還元して（Ｒ）−３−キヌクリジノー
ルを生成する活性を有する限り、本発明に利用すること
ができる。これら遺伝子は、蛋白質のホモロジー検索を
利用して得ることができる。ホモロジー検索には、たと
えば以下に示すデータベースを用いることができる。SW
ISS-PROT、PIRなどの蛋白質のアミノ酸配列に関するデ
ータベース DNA Databank of JAPAN(DDBJ)、EMBL、Gene-Bankなどの
DNAに関するデータベース DNA配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベ
ース FASTA programやBLAST programなどのホモロジー検索用
のプログラムも公知である。更に、上記データベースを
これらのプログラムを用いて検索するサービスも、イン
ターネット上で提供されている。この種のサービスを利
用して、本発明に用いるトロピノン還元酵素−Ｉを見出
すこともできる。
【００３１】配列番号：２(Datura stramonium)や、配
列番号：４(Hyoscyamus niger)に記載のアミノ酸配列
と、少なくとも８５%、好ましくは９０%以上、より好ま
しくは９５％以上のホモロジーを有する蛋白質は、本発
明の本発明に用いるトロピノン還元酵素−Ｉとして好ま
しい。配列番号：２および配列番号：４に示すアミノ酸
からなる蛋白質は、いずれも本発明に利用することがで
きる酵素活性を有していた。両者のホモロジーは９４%
である。ここでいうホモロジーとは、たとえば、BLAST
programを用いたPositiveの相同性の値を示す。
列番号：４(Hyoscyamus niger)に記載のアミノ酸配列
と、少なくとも８５%、好ましくは９０%以上、より好ま
しくは９５％以上のホモロジーを有する蛋白質は、本発
明の本発明に用いるトロピノン還元酵素−Ｉとして好ま
しい。配列番号：２および配列番号：４に示すアミノ酸
からなる蛋白質は、いずれも本発明に利用することがで
きる酵素活性を有していた。両者のホモロジーは９４%
である。ここでいうホモロジーとは、たとえば、BLAST
programを用いたPositiveの相同性の値を示す。
【００３２】本発明における好ましい酵素活性物質とし
て、トロピノン還元酵素−Ｉをコードする遺伝子を遺伝
子組換え技術を用いて同種もしくは異種の宿主中で発現
させた形質転換体、もしくはその処理物を示すことがで
きる。
て、トロピノン還元酵素−Ｉをコードする遺伝子を遺伝
子組換え技術を用いて同種もしくは異種の宿主中で発現
させた形質転換体、もしくはその処理物を示すことがで
きる。
【００３３】本発明においてトロピノン還元酵素−Ｉ遺
伝子を発現させるために、形質転換の対象となる生物
は、トロピノン還元酵素−Ｉ活性を有するポリペプチド
をコードするＤＮＡを含む組換えベクターにより形質転
換され、トロピノン還元酵素−Ｉ活性を発現することが
できる生物であれば特に制限はない。利用可能な微生物
としては、たとえば以下のような微生物を示すことがで
きる。 エシェリヒア(Escherichia)属 バチルス(Bacillus)属 シュードモナス(Pseudomonas)属 セラチア(Serratia)属 ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属 コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属 ストレプトコッカス(Streptococcus)属 ラクトバチルス(Lactobacillus)属など宿主ベクター系
の開発されている細菌 ロドコッカス(Rhodococcus)属 ストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクター
系の開発されている放線菌 サッカロマイセス(Saccharomyces)属 クライベロマイセス(Kluyveromyces)属 シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属 チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属 ヤロウイア(Yarrowia)属 トリコスポロン(Trichosporon)属 ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属 ピキア(Pichia)属 キャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発
されている酵母 ノイロスポラ(Neurospora)属 アスペルギルス(Aspergillus)属 セファロスポリウム(Cephalosporium)属 トリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の
開発されているカビ
伝子を発現させるために、形質転換の対象となる生物
は、トロピノン還元酵素−Ｉ活性を有するポリペプチド
をコードするＤＮＡを含む組換えベクターにより形質転
換され、トロピノン還元酵素−Ｉ活性を発現することが
できる生物であれば特に制限はない。利用可能な微生物
としては、たとえば以下のような微生物を示すことがで
きる。 エシェリヒア(Escherichia)属 バチルス(Bacillus)属 シュードモナス(Pseudomonas)属 セラチア(Serratia)属 ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属 コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属 ストレプトコッカス(Streptococcus)属 ラクトバチルス(Lactobacillus)属など宿主ベクター系
の開発されている細菌 ロドコッカス(Rhodococcus)属 ストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクター
系の開発されている放線菌 サッカロマイセス(Saccharomyces)属 クライベロマイセス(Kluyveromyces)属 シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属 チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属 ヤロウイア(Yarrowia)属 トリコスポロン(Trichosporon)属 ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属 ピキア(Pichia)属 キャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発
されている酵母 ノイロスポラ(Neurospora)属 アスペルギルス(Aspergillus)属 セファロスポリウム(Cephalosporium)属 トリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の
開発されているカビ
【００３４】形質転換体の作製のための手順および宿主
に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生
物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術
に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレ
キュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laborat
ories）。微生物中などにおいて、本発明のNADP+を補酵
素とするトロピノン還元酵素−Ｉ遺伝子を発現させるた
めには、まず微生物中において安定に存在するプラスミ
ドベクターやファージベクター中にこのDNAを導入し、
その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。そのため
には、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモー
ターを本発明のDNA鎖の5'-側上流に、より好ましくはタ
ーミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込めばよ
い。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主
として利用する微生物中において機能することが知られ
ているプロモーター、ターミネーターを用いる必要があ
る。これら各種微生物において利用可能なベクター、プ
ロモーター、ターミネータ−などに関して「微生物学基
礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関して
は、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8,
423-488 (1992)、などに詳細に記述されている。
に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生
物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術
に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレ
キュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laborat
ories）。微生物中などにおいて、本発明のNADP+を補酵
素とするトロピノン還元酵素−Ｉ遺伝子を発現させるた
めには、まず微生物中において安定に存在するプラスミ
ドベクターやファージベクター中にこのDNAを導入し、
その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。そのため
には、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモー
ターを本発明のDNA鎖の5'-側上流に、より好ましくはタ
ーミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込めばよ
い。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主
として利用する微生物中において機能することが知られ
ているプロモーター、ターミネーターを用いる必要があ
る。これら各種微生物において利用可能なベクター、プ
ロモーター、ターミネータ−などに関して「微生物学基
礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関して
は、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8,
423-488 (1992)、などに詳細に記述されている。
【００３５】例えばエシェリヒア属、特に大腸菌エシェ
リヒア・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミ
ドベクターとして、pBR、pUC系プラスミドを利用でき、
lac(β−ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペ
ロン)、tac、trc (lac、trpの融合)、λファージ PL、P
Rなどに由来するプロモーターなどが利用できる。ま
た、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由
来、rrnBリボソーマルRNA由来のターミネーターなどを
用いることができる。これらの中で、市販のpSE420（In
vitrogen製）のマルチクローニングサイトを一部改変し
たベクターpSE420D（特開2000-189170に記載）が好適に
利用できる。
リヒア・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミ
ドベクターとして、pBR、pUC系プラスミドを利用でき、
lac(β−ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペ
ロン)、tac、trc (lac、trpの融合)、λファージ PL、P
Rなどに由来するプロモーターなどが利用できる。ま
た、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由
来、rrnBリボソーマルRNA由来のターミネーターなどを
用いることができる。これらの中で、市販のpSE420（In
vitrogen製）のマルチクローニングサイトを一部改変し
たベクターpSE420D（特開2000-189170に記載）が好適に
利用できる。
【００３６】バチルス属においては、ベクターとしてpU
B110系プラスミド、pC194系プラスミドなどが利用可能
であり、染色体にインテグレートすることもできる。ま
た、プロモーター、ターミネーターとしてapr(アルカリ
プロテアーゼ)、npr(中性プロテアーゼ)、amy(α−アミ
ラーゼ)などが利用できる。
B110系プラスミド、pC194系プラスミドなどが利用可能
であり、染色体にインテグレートすることもできる。ま
た、プロモーター、ターミネーターとしてapr(アルカリ
プロテアーゼ)、npr(中性プロテアーゼ)、amy(α−アミ
ラーゼ)などが利用できる。
【００３７】シュードモナス属においては、シュードモ
ナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・
セパシア(Pseudomonas cepacia)などで宿主ベクター系
が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプ
ラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター
(RSF1010などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含
む)pKT240などが利用可能であり、プロモーター、ター
ミネーターとして、リパーゼ（特開平5-284973）遺伝子
などが利用できる。
ナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・
セパシア(Pseudomonas cepacia)などで宿主ベクター系
が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプ
ラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター
(RSF1010などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含
む)pKT240などが利用可能であり、プロモーター、ター
ミネーターとして、リパーゼ（特開平5-284973）遺伝子
などが利用できる。
【００３８】ブレビバクテリウム属特に、ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactof
ermentum)においては、pAJ43(Gene 39, 281 (1985))な
どのプラスミドベクターが利用可能である。プロモータ
ー、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されている
プロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能であ
る。
リウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactof
ermentum)においては、pAJ43(Gene 39, 281 (1985))な
どのプラスミドベクターが利用可能である。プロモータ
ー、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されている
プロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能であ
る。
【００３９】コリネバクテリウム属、特にコリネバクテ
リウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)に
おいては、pCS11(特開昭57-183799)、pCB101(Mol. Gen.
Genet. 196, 175 (1984)などのプラスミドベクターが
利用可能である。ストレプトコッカス(Streptococcus)
属においては、pHV1301(FEMS Microbiol.Lett. 26, 239
(1985)、pGK1（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (1
985)）などがプラスミドベクターとして利用可能であ
る。
リウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)に
おいては、pCS11(特開昭57-183799)、pCB101(Mol. Gen.
Genet. 196, 175 (1984)などのプラスミドベクターが
利用可能である。ストレプトコッカス(Streptococcus)
属においては、pHV1301(FEMS Microbiol.Lett. 26, 239
(1985)、pGK1（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (1
985)）などがプラスミドベクターとして利用可能であ
る。
【００４０】ラクトバチルス(Lactobacillus)属におい
ては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1（J.
Bacteriol. 137, 614 (1979)）などが利用可能であ
り、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが
利用可能である。ロドコッカス(Rhodococcus)属におい
ては、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodo
chrous)から単離されたプラスミドベクターが使用可能
である (J.Gen. Microbiol. 138,1003 (1992) )。
ては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1（J.
Bacteriol. 137, 614 (1979)）などが利用可能であ
り、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが
利用可能である。ロドコッカス(Rhodococcus)属におい
ては、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodo
chrous)から単離されたプラスミドベクターが使用可能
である (J.Gen. Microbiol. 138,1003 (1992) )。
【００４１】ストレプトマイセス(Streptomyces)属にお
いては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Strepto
myces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Labo
ratories (1985)に記載の方法に従って、プラスミドを
構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リ
ビダンス(Streptomyces lividans)においては、pIJ486
(Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986)、pKC1064(Gen
e 103,97-99 (1991) )、pUWL-KS (Gene 165,149-150 (1
995) )が使用できる。また、ストレプトマイセス・バー
ジニア(Streptomyces virginiae)においても、同様のプ
ラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11,
46-53 (1997)）。
いては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Strepto
myces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Labo
ratories (1985)に記載の方法に従って、プラスミドを
構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リ
ビダンス(Streptomyces lividans)においては、pIJ486
(Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986)、pKC1064(Gen
e 103,97-99 (1991) )、pUWL-KS (Gene 165,149-150 (1
995) )が使用できる。また、ストレプトマイセス・バー
ジニア(Streptomyces virginiae)においても、同様のプ
ラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11,
46-53 (1997)）。
【００４２】サッカロマイセス(Saccharomyces)属、特
にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cer
evisiae) においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プ
ラスミドが利用可能であり、染色体内に多コピー存在す
るリボソームDNAとの相同組み換えを利用したインテグ
レーションベクター（EP 537456など）は、多コピーで
遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため
極めて有用である。また、ADH(アルコール脱水素酵
素)、GAPDH(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵
素)、PHO(酸性フォスファターゼ)、GAL(β−ガラクトシ
ダーゼ)、PGK(ホスホグリセレートキナーゼ)、ENO(エノ
ラーゼ)などのプロモーター、ターミネーターが利用可
能である。
にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cer
evisiae) においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プ
ラスミドが利用可能であり、染色体内に多コピー存在す
るリボソームDNAとの相同組み換えを利用したインテグ
レーションベクター（EP 537456など）は、多コピーで
遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため
極めて有用である。また、ADH(アルコール脱水素酵
素)、GAPDH(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵
素)、PHO(酸性フォスファターゼ)、GAL(β−ガラクトシ
ダーゼ)、PGK(ホスホグリセレートキナーゼ)、ENO(エノ
ラーゼ)などのプロモーター、ターミネーターが利用可
能である。
【００４３】クライベロマイセス属、特にクライベロマ
イセス・ラクティス(Kluyveromyceslactis)において
は、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラス
ミド、pKD1系プラスミド（J. Bacteriol. 145, 382-390
(1981)）、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミ
ド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS
系プラスミド、リボソームDNAなどとの相同組み換えに
より染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミ
ド（EP 537456など）などが利用可能である。また、AD
H、PGKなどに由来するプロモーター、ターミネーターが
利用可能である。
イセス・ラクティス(Kluyveromyceslactis)において
は、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラス
ミド、pKD1系プラスミド（J. Bacteriol. 145, 382-390
(1981)）、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミ
ド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS
系プラスミド、リボソームDNAなどとの相同組み換えに
より染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミ
ド（EP 537456など）などが利用可能である。また、AD
H、PGKなどに由来するプロモーター、ターミネーターが
利用可能である。
【００４４】シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyc
es)属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来
のARS (自律複製に関与する遺伝子)及びサッカロマイセ
ス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マー
カーを含むプラスミドベクターが利用可能である（Mol.
Cell. Biol. 6, 80 (1986)）。また、シゾサッカロマ
イセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用でき
る（EMBO J. 6, 729 (1987)）。特に、pAUR224は、宝酒
造から市販されており容易に利用できる。
es)属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来
のARS (自律複製に関与する遺伝子)及びサッカロマイセ
ス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マー
カーを含むプラスミドベクターが利用可能である（Mol.
Cell. Biol. 6, 80 (1986)）。また、シゾサッカロマ
イセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用でき
る（EMBO J. 6, 729 (1987)）。特に、pAUR224は、宝酒
造から市販されており容易に利用できる。
【００４５】チゴサッカロマイセス属(Zygosaccharomyc
es)においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ (Zyg
osaccharomyces rouxii)由来の pSB3（Nucleic Acids R
es.13, 4267 (1985)）などに由来するプラスミドベクタ
ーが利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ
由来 PHO5 プロモーターや、チゴサッカロマイセス・ロ
ウキシ由来 GAP-Zr(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱
水素酵素)のプロモーター（Agri. Biol. Chem. 54, 252
1 (1990)）などが利用可能である。
es)においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ (Zyg
osaccharomyces rouxii)由来の pSB3（Nucleic Acids R
es.13, 4267 (1985)）などに由来するプラスミドベクタ
ーが利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ
由来 PHO5 プロモーターや、チゴサッカロマイセス・ロ
ウキシ由来 GAP-Zr(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱
水素酵素)のプロモーター（Agri. Biol. Chem. 54, 252
1 (1990)）などが利用可能である。
【００４６】ピキア(Pichia)属においては、ピキア・パ
ストリス(Pichia pastoris)などにピキア由来自律複製
に関与する遺伝子 (PARS1、PARS2)などを利用した宿主
ベクター系が開発されており（Mol. Cell. Biol. 5, 33
76 (1985)）、高濃度培養とメタノールで誘導可能な AO
X など強いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids
Res. 15, 3859 (1987)）。また、ピキア・アンガスタ(P
ichia angusta、旧名ハンゼヌラ・ポリモルファ Hansen
ula polymorpha)において宿主ベクター系が開発されて
いる。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律
複製に関与する遺伝子（HARS1、HARS2）も利用可能であ
るが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーイ
ンテグレーションが有効である（Yeast 7, 431-443 (19
91)）。また、メタノールなどで誘導される AOX（アル
コールオキシダーゼ）、FDH(ギ酸脱水素酵素)のプロモ
ーターなどが利用可能である。
ストリス(Pichia pastoris)などにピキア由来自律複製
に関与する遺伝子 (PARS1、PARS2)などを利用した宿主
ベクター系が開発されており（Mol. Cell. Biol. 5, 33
76 (1985)）、高濃度培養とメタノールで誘導可能な AO
X など強いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids
Res. 15, 3859 (1987)）。また、ピキア・アンガスタ(P
ichia angusta、旧名ハンゼヌラ・ポリモルファ Hansen
ula polymorpha)において宿主ベクター系が開発されて
いる。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律
複製に関与する遺伝子（HARS1、HARS2）も利用可能であ
るが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーイ
ンテグレーションが有効である（Yeast 7, 431-443 (19
91)）。また、メタノールなどで誘導される AOX（アル
コールオキシダーゼ）、FDH(ギ酸脱水素酵素)のプロモ
ーターなどが利用可能である。
【００４７】キャンディダ(Candida)属においては、キ
ャンディダ・マルトーサ(Candida maltosa)、キャンデ
ィダ・アルビカンス(Candida albicans)、キャンディダ
・トロピカリス(Candida tropicalis)、キャンディダ・
ウチルス (Candida utilis) などにおいて宿主ベクター
系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおい
てはキャンディダ・マルトーサ由来ARSがクローニング
され（Agri. Biol. Chem.51, 51, 1587 (1987)）、これ
を利用したベクターが開発されている。また、キャンデ
ィダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイ
プのベクターは強力なプロモーターが開発されている
（特開平 08-173170）。
ャンディダ・マルトーサ(Candida maltosa)、キャンデ
ィダ・アルビカンス(Candida albicans)、キャンディダ
・トロピカリス(Candida tropicalis)、キャンディダ・
ウチルス (Candida utilis) などにおいて宿主ベクター
系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおい
てはキャンディダ・マルトーサ由来ARSがクローニング
され（Agri. Biol. Chem.51, 51, 1587 (1987)）、これ
を利用したベクターが開発されている。また、キャンデ
ィダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイ
プのベクターは強力なプロモーターが開発されている
（特開平 08-173170）。
【００４８】アスペルギルス(Aspergillus)属において
は、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger)、ア
スペルギルス・オリジー (Aspergillus oryzae) などが
カビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色
体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プ
ロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能
である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (198
9)）。
は、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger)、ア
スペルギルス・オリジー (Aspergillus oryzae) などが
カビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色
体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プ
ロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能
である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (198
9)）。
【００４９】トリコデルマ(Trichoderma)属において
は、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)を利
用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ
遺伝子由来プロモーターなどが利用できる（Biotechnol
ogy 7, 596-603 (1989)）。
は、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)を利
用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ
遺伝子由来プロモーターなどが利用できる（Biotechnol
ogy 7, 596-603 (1989)）。
【００５０】また、微生物以外でも、植物、動物におい
て様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を
用いた昆虫（Nature 315, 592-594 (1985)）や菜種、ト
ウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種蛋白
質を発現させる系が開発されており、好適に利用でき
る。形質転換体の培養、および形質転換体からのトロピ
ノン還元酵素−Ｉの精製は、当業者に公知の方法により
行うことができる。
て様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を
用いた昆虫（Nature 315, 592-594 (1985)）や菜種、ト
ウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種蛋白
質を発現させる系が開発されており、好適に利用でき
る。形質転換体の培養、および形質転換体からのトロピ
ノン還元酵素−Ｉの精製は、当業者に公知の方法により
行うことができる。
【００５１】本発明による光学活性アルコールの製造方
法においては、補酵素の再生系を組み合わせることがで
きる。ケトンを還元してアルコールを生成する過程で、
トロピノン還元酵素−Ｉは還元型補酵素を要求する。還
元型補酵素としては、NADPHやNADHを利用することがで
きる。たとえばNADPHを還元型補酵素に用いた場合、ト
ロピノン還元酵素−Ｉによる還元反応に付随して、NADP
HからNADP+が生成する。NADP+は、適当な基質の酸化反
応を利用することによって、再び還元型であるNADPHに
再生することができる。NADP+からNADPHへの再生は、植
物、微生物、形質転換体の含有するNADP+からNADPHを再
生する酵素によって行うことができる。NADPHの再生反
応を触媒する酵素は、単一であっても良いし、複数の酵
素で構成される多段階反応であってもよい。複数の酵素
によって目的とする酵素反応が支えられているとき、一
連の酵素反応を構成する酵素の集合を酵素系と呼ぶ。こ
れらNADP+還元能は、反応系にグルコース、スクロース
などの糖、有機酸、またはエタノール、イソプロパノー
ルなどのアルコールを添加することにより、増強するこ
とができる。また、NADP+からNADPHを生成する能力を有
する酵素を用いてNADPHの再生を行うことができる。NAD
PHの生成に有用な酵素を以下に示す。これらの酵素は、
精製酵素のみならず、当該酵素を有する微生物、その処
理物、あるいは部分精製酵素として用いることができ
る。たとえばグルコース脱水素酵素の場合には、グルコ
ースからδ−グルコノラクトンへの酸化に伴ってNADP+
からNADPHへの再生が行われる。
法においては、補酵素の再生系を組み合わせることがで
きる。ケトンを還元してアルコールを生成する過程で、
トロピノン還元酵素−Ｉは還元型補酵素を要求する。還
元型補酵素としては、NADPHやNADHを利用することがで
きる。たとえばNADPHを還元型補酵素に用いた場合、ト
ロピノン還元酵素−Ｉによる還元反応に付随して、NADP
HからNADP+が生成する。NADP+は、適当な基質の酸化反
応を利用することによって、再び還元型であるNADPHに
再生することができる。NADP+からNADPHへの再生は、植
物、微生物、形質転換体の含有するNADP+からNADPHを再
生する酵素によって行うことができる。NADPHの再生反
応を触媒する酵素は、単一であっても良いし、複数の酵
素で構成される多段階反応であってもよい。複数の酵素
によって目的とする酵素反応が支えられているとき、一
連の酵素反応を構成する酵素の集合を酵素系と呼ぶ。こ
れらNADP+還元能は、反応系にグルコース、スクロース
などの糖、有機酸、またはエタノール、イソプロパノー
ルなどのアルコールを添加することにより、増強するこ
とができる。また、NADP+からNADPHを生成する能力を有
する酵素を用いてNADPHの再生を行うことができる。NAD
PHの生成に有用な酵素を以下に示す。これらの酵素は、
精製酵素のみならず、当該酵素を有する微生物、その処
理物、あるいは部分精製酵素として用いることができ
る。たとえばグルコース脱水素酵素の場合には、グルコ
ースからδ−グルコノラクトンへの酸化に伴ってNADP+
からNADPHへの再生が行われる。
【００５２】グルコース脱水素酵素
グルタミン酸脱水素酵素
ギ酸脱水素酵素
リンゴ酸脱水素酵素
グルコース−６−リン酸脱水素酵素
ホスホグルコン酸脱水素酵素
アルコール脱水素酵素
グリセロール脱水素酵素
【００５３】これらのNADPH再生に必要な反応を構成す
る成分は、本発明を構成する還元酵素反応系に添加、も
しくは固定化したものを添加することができる。あるい
はNADPHの交換が可能な膜を介して前記反応系に接触さ
せることができる。
る成分は、本発明を構成する還元酵素反応系に添加、も
しくは固定化したものを添加することができる。あるい
はNADPHの交換が可能な膜を介して前記反応系に接触さ
せることができる。
【００５４】また、トロピノン還元酵素−Ｉをコードす
るDNAを含む組換えベクターで形質転換した形質転換体
を、本発明の光学活性アルコールの製造方法に利用する
場合には、NADPH再生のための付加的な反応系を不要と
できる場合がある。すなわち、NADPH再生活性の高い生
物を宿主として用いることにより、形質転換体を用いた
還元反応において、NADPH再生用の酵素を添加すること
なく効率的な反応を行える。あるいは前記NADPH再生に
利用可能な酵素の遺伝子を、トロピノン還元酵素−Ｉを
コードするDNAと同時に導入した宿主を利用することも
できる。このような形質転換体の利用によって、NADPH
再生酵素とトロピノン還元酵素−Ｉの発現、並びに基質
の還元反応を、より効率的に行うこともできる。これら
の２つ、もしくは、それ以上の遺伝子の宿主への導入に
は、不和合性をさけるために複製起源の異なる複数のベ
クターに別々に遺伝子を導入した組み換えベクターによ
り宿主を形質転換する方法や、単一のベクターに両遺伝
子を導入する方法、片方、もしくは、両方の遺伝子を染
色体中に導入する方法などを利用することができる。
るDNAを含む組換えベクターで形質転換した形質転換体
を、本発明の光学活性アルコールの製造方法に利用する
場合には、NADPH再生のための付加的な反応系を不要と
できる場合がある。すなわち、NADPH再生活性の高い生
物を宿主として用いることにより、形質転換体を用いた
還元反応において、NADPH再生用の酵素を添加すること
なく効率的な反応を行える。あるいは前記NADPH再生に
利用可能な酵素の遺伝子を、トロピノン還元酵素−Ｉを
コードするDNAと同時に導入した宿主を利用することも
できる。このような形質転換体の利用によって、NADPH
再生酵素とトロピノン還元酵素−Ｉの発現、並びに基質
の還元反応を、より効率的に行うこともできる。これら
の２つ、もしくは、それ以上の遺伝子の宿主への導入に
は、不和合性をさけるために複製起源の異なる複数のベ
クターに別々に遺伝子を導入した組み換えベクターによ
り宿主を形質転換する方法や、単一のベクターに両遺伝
子を導入する方法、片方、もしくは、両方の遺伝子を染
色体中に導入する方法などを利用することができる。
【００５５】本発明におけるNADPH再生に利用可能なグ
ルコース脱水素酵素として、バシラス・サブチルス（Ba
cillus subtilis）に由来するグルコース脱水素酵素
や、サーモプラズマ・アシドフィラム (Thermoplasma a
cidophilum) に由来するグルコース脱水素酵素を示すこ
とができる。これら酵素をコードする遺伝子は既に単離
されている(Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.,80,785-789
(1983); Eur. J. Biochem.,211,549-554(1993))。ある
いは既に明らかにされているその塩基配列に基づいて、
PCRやハイブリダイズスクリーニングによって、当該微
生物から取得することもできる。
ルコース脱水素酵素として、バシラス・サブチルス（Ba
cillus subtilis）に由来するグルコース脱水素酵素
や、サーモプラズマ・アシドフィラム (Thermoplasma a
cidophilum) に由来するグルコース脱水素酵素を示すこ
とができる。これら酵素をコードする遺伝子は既に単離
されている(Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.,80,785-789
(1983); Eur. J. Biochem.,211,549-554(1993))。ある
いは既に明らかにされているその塩基配列に基づいて、
PCRやハイブリダイズスクリーニングによって、当該微
生物から取得することもできる。
【００５６】単一のベクター中に複数の遺伝子を導入す
る場合には、プロモーター、ターミネーターなど発現制
御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラ
クトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペ
ロンとして発現させることも可能である。
る場合には、プロモーター、ターミネーターなど発現制
御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラ
クトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペ
ロンとして発現させることも可能である。
【００５７】単一のベクターにトロピノン還元酵素−Ｉ
とグルコース脱水素酵素を導入したプラスミドは、例え
ばpSE420D(特開2000-189170)に各遺伝子をタンデムに連
結して取得することができる。Datura stramonium 由来
のトロピノン還元酵素−ＩとBacillus subtilis由来の
グルコース脱水素酵素を導入されたプラスミドpSG-DSR1
(FERM P-18395)、Hyoscyamus niger 由来のトロピノン
還元酵素−ＩとBacillussubtilis由来のグルコース脱水
素酵素を導入されたプラスミドpSG-HNR1(FERM P-18396)
は、それぞれ以下のとおり特許生物寄託センターに寄託
されている。
とグルコース脱水素酵素を導入したプラスミドは、例え
ばpSE420D(特開2000-189170)に各遺伝子をタンデムに連
結して取得することができる。Datura stramonium 由来
のトロピノン還元酵素−ＩとBacillus subtilis由来の
グルコース脱水素酵素を導入されたプラスミドpSG-DSR1
(FERM P-18395)、Hyoscyamus niger 由来のトロピノン
還元酵素−ＩとBacillussubtilis由来のグルコース脱水
素酵素を導入されたプラスミドpSG-HNR1(FERM P-18396)
は、それぞれ以下のとおり特許生物寄託センターに寄託
されている。
【００５８】プラスミドpSG-DSR1、またはpSG-HNR1の寄
託： (a)寄託機関の名称・あて名 名称：独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託
センター （旧名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究
所） あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号中央第
６（郵便番号305-8566） (b)寄託日 平成１３年６月２２日 (c)受託番号 FERM P-18395 (pSG-DSR1) 受託番号 FERM P-18396 (pSG-HNR1)
託： (a)寄託機関の名称・あて名 名称：独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託
センター （旧名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究
所） あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号中央第
６（郵便番号305-8566） (b)寄託日 平成１３年６月２２日 (c)受託番号 FERM P-18395 (pSG-DSR1) 受託番号 FERM P-18396 (pSG-HNR1)
【００５９】由来の異なる酵素遺伝子の共発現には、し
ばしば困難が伴う。たとえばピキア・フィンランディカ
由来の(Ｒ)−２−オクタノール脱水素酵素と枯草菌由来
グルコース脱水素酵素を共発現するpSG-PFO1、あるいは
pSG-PFO2 (WO01/61014)においてみられるように、両酵
素が高発現しない場合がある。更に、一般に、植物由来
の酵素と植物以外に由来する酵素とが共発現することは
期待しにくいとされている。したがって、トロピノン還
元酵素−Ｉとグルコース脱水素酵素とを共発現させるこ
とによって、上記本発明の製造方法に有用な形質転換体
を得られるとは考えにくかった。
ばしば困難が伴う。たとえばピキア・フィンランディカ
由来の(Ｒ)−２−オクタノール脱水素酵素と枯草菌由来
グルコース脱水素酵素を共発現するpSG-PFO1、あるいは
pSG-PFO2 (WO01/61014)においてみられるように、両酵
素が高発現しない場合がある。更に、一般に、植物由来
の酵素と植物以外に由来する酵素とが共発現することは
期待しにくいとされている。したがって、トロピノン還
元酵素−Ｉとグルコース脱水素酵素とを共発現させるこ
とによって、上記本発明の製造方法に有用な形質転換体
を得られるとは考えにくかった。
【００６０】しかし本発明者らは、トロピノン還元酵素
−Ｉとグルコース脱水素酵素をタンデムに連結したベク
ターを導入することによって、１０％という高濃度の３
−キヌクリジノンを不斉還元しうる形質転換体を得るこ
とに成功した。すなわち本発明は、トロピノン還元酵素
−ＩをコードするＤＮＡ、および酸化型補酵素を還元型
補酵素に再生する酵素をコードするＤＮＡを発現可能に
保持したベクターに関する。
−Ｉとグルコース脱水素酵素をタンデムに連結したベク
ターを導入することによって、１０％という高濃度の３
−キヌクリジノンを不斉還元しうる形質転換体を得るこ
とに成功した。すなわち本発明は、トロピノン還元酵素
−ＩをコードするＤＮＡ、および酸化型補酵素を還元型
補酵素に再生する酵素をコードするＤＮＡを発現可能に
保持したベクターに関する。
【００６１】本発明のベクターにおいて、トロピノン還
元酵素−ＩをコードするＤＮＡとしては、たとえば下記
（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡを用いるこ
とができる。 （ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基
酸配列を有するＤＮＡ、 （ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミ
ノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠
失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からな
り、３−キヌクリジノンを不斉還元し（Ｒ）−３−キヌ
クリジノールを生成する活性を有する蛋白質をコードす
るＤＮＡ、 （ｃ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基
配列と85％以上の相同性を有する塩基配列からなり、３
−キヌクリジノンを不斉還元し（Ｒ）−３−キヌクリジ
ノールを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮ
Ａ、 （ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基
配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズし、３−キヌクリジノンを不斉還
元し（Ｒ）−３−キヌクリジノールを生成する活性を有
する蛋白質をコードするＤＮＡ
元酵素−ＩをコードするＤＮＡとしては、たとえば下記
（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡを用いるこ
とができる。 （ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基
酸配列を有するＤＮＡ、 （ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミ
ノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠
失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からな
り、３−キヌクリジノンを不斉還元し（Ｒ）−３−キヌ
クリジノールを生成する活性を有する蛋白質をコードす
るＤＮＡ、 （ｃ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基
配列と85％以上の相同性を有する塩基配列からなり、３
−キヌクリジノンを不斉還元し（Ｒ）−３−キヌクリジ
ノールを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮ
Ａ、 （ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基
配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズし、３−キヌクリジノンを不斉還
元し（Ｒ）−３−キヌクリジノールを生成する活性を有
する蛋白質をコードするＤＮＡ
【００６２】また本発明のベクターを構成する酸化型補
酵素を還元型補酵素に再生する酵素としては、上記の再
生反応用の酵素を利用することができる。特に、グルコ
ース脱水素酵素は再生用酵素として好ましい。脱水素酵
素としては、Bacillus subtilisまたはThermoplasma ac
idophilumに由来するグルコース脱水素酵素を例示する
ことができる。実施例に示すように、これらのグルコー
ス脱水素酵素は、配列番号：１あるいは配列番号：３に
示す塩基配列からなるトロピノン還元酵素−Ｉをコード
するＤＮＡと組み合せたときに、高濃度の（Ｒ）−３−
キヌクリジノールを生成することができる形質転換体を
与える。
酵素を還元型補酵素に再生する酵素としては、上記の再
生反応用の酵素を利用することができる。特に、グルコ
ース脱水素酵素は再生用酵素として好ましい。脱水素酵
素としては、Bacillus subtilisまたはThermoplasma ac
idophilumに由来するグルコース脱水素酵素を例示する
ことができる。実施例に示すように、これらのグルコー
ス脱水素酵素は、配列番号：１あるいは配列番号：３に
示す塩基配列からなるトロピノン還元酵素−Ｉをコード
するＤＮＡと組み合せたときに、高濃度の（Ｒ）−３−
キヌクリジノールを生成することができる形質転換体を
与える。
【００６３】本発明のベクターにおいて、トロピノン還
元酵素−Ｉと再生反応用の酵素をコードするDNAは、タ
ンデムに連結するのが好ましい。タンデムに連結すると
は、共通の発現制御領域の支配下に、これらの酵素が発
現するように配置することを言う。このような配置とす
ることにより、より効率的な酵素遺伝子の発現、並びに
光学活性アルコールの生成を期待することができる。
元酵素−Ｉと再生反応用の酵素をコードするDNAは、タ
ンデムに連結するのが好ましい。タンデムに連結すると
は、共通の発現制御領域の支配下に、これらの酵素が発
現するように配置することを言う。このような配置とす
ることにより、より効率的な酵素遺伝子の発現、並びに
光学活性アルコールの生成を期待することができる。
【００６４】本発明はまた、本発明のベクターを発現可
能に保持した形質転換体に関する。本発明のベクター
は、ベクターを機能的に保持しうる宿主であれば任意の
宿主に形質転換することができる。本発明において特に
望ましい宿主は、目的とする光学活性アルコールの光学
異性体を生成する能力を実質的に欠いている微生物であ
る。たとえば、光学活性アルコールとして（Ｒ）−３−
キヌクリジノールの生成を目的とする場合には、宿主自
体では３−キヌクリジノールを実質的に生成できない微
生物を利用することができる。もしも宿主が（Ｓ）−３
−キヌクリジノールを合成する作用を有する場合には、
（Ｓ）体を生成する酵素を欠損させた欠損株を利用する
ことが好ましい。欠損株は、自然変異、人工変異、遺伝
子組換え技術などを利用して得ることができる。たとえ
ば実施例において利用している大腸菌 HB101株は、もと
もと３−キヌクリジノールの光学異性体を実質的に生成
しない微生物である。したがって、本発明に基づく
（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造方法のための形質
転換体に有用な宿主微生物である。
能に保持した形質転換体に関する。本発明のベクター
は、ベクターを機能的に保持しうる宿主であれば任意の
宿主に形質転換することができる。本発明において特に
望ましい宿主は、目的とする光学活性アルコールの光学
異性体を生成する能力を実質的に欠いている微生物であ
る。たとえば、光学活性アルコールとして（Ｒ）−３−
キヌクリジノールの生成を目的とする場合には、宿主自
体では３−キヌクリジノールを実質的に生成できない微
生物を利用することができる。もしも宿主が（Ｓ）−３
−キヌクリジノールを合成する作用を有する場合には、
（Ｓ）体を生成する酵素を欠損させた欠損株を利用する
ことが好ましい。欠損株は、自然変異、人工変異、遺伝
子組換え技術などを利用して得ることができる。たとえ
ば実施例において利用している大腸菌 HB101株は、もと
もと３−キヌクリジノールの光学異性体を実質的に生成
しない微生物である。したがって、本発明に基づく
（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造方法のための形質
転換体に有用な宿主微生物である。
【００６５】本発明による光学活性アルコールの製造方
法を構成する酵素反応は、前記酵素活性物質を基質であ
るケトンを含む反応溶液と接触させることにより、実施
することができる。具体的には、水性媒体中、水性媒体
と水可溶性の有機溶媒との混合系、あるいは水不溶性の
溶媒との２相系中において行うことができる。水性媒体
としては、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液などの中
性付近に緩衝能を有する緩衝液が挙げられる。あるいは
酸とアルカリを用いて反応中のpH変化を好ましい範囲に
とどめることが可能であれば、緩衝液を特に使う必要は
ない。水に溶解しにくい有機溶媒としては、例えば、酢
酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、n-ヘ
キサン、イソオクタンなどを用いることができる。ある
いは、エタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド、
アセトニトリル等の有機溶媒と水性媒体との混合系中で
行うこともできる。
法を構成する酵素反応は、前記酵素活性物質を基質であ
るケトンを含む反応溶液と接触させることにより、実施
することができる。具体的には、水性媒体中、水性媒体
と水可溶性の有機溶媒との混合系、あるいは水不溶性の
溶媒との２相系中において行うことができる。水性媒体
としては、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液などの中
性付近に緩衝能を有する緩衝液が挙げられる。あるいは
酸とアルカリを用いて反応中のpH変化を好ましい範囲に
とどめることが可能であれば、緩衝液を特に使う必要は
ない。水に溶解しにくい有機溶媒としては、例えば、酢
酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、n-ヘ
キサン、イソオクタンなどを用いることができる。ある
いは、エタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド、
アセトニトリル等の有機溶媒と水性媒体との混合系中で
行うこともできる。
【００６６】２相系では、酵素活性物質は、そのまま、
あるいは水や緩衝液の溶液として供給される。基質化合
物を水、緩衝液またはエタノール等の水溶性溶媒に溶解
させて反応系に供給することもできる。この場合は、酵
素活性物質とともに単一相の反応系を構成することにな
る。その他、本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクタ
ーなどを利用して行うことも可能である。なお、酵素活
性物質と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定さ
れない。反応溶液とは、基質を酵素活性の発現に望まし
い環境を与える適当な溶媒に溶解したものである。
あるいは水や緩衝液の溶液として供給される。基質化合
物を水、緩衝液またはエタノール等の水溶性溶媒に溶解
させて反応系に供給することもできる。この場合は、酵
素活性物質とともに単一相の反応系を構成することにな
る。その他、本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクタ
ーなどを利用して行うことも可能である。なお、酵素活
性物質と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定さ
れない。反応溶液とは、基質を酵素活性の発現に望まし
い環境を与える適当な溶媒に溶解したものである。
【００６７】本発明における基質化合物であるケトン
は、トロピノン還元酵素−Ｉの作用によって目的とする
光学活性アルコールを生成する化合物であれば特に限定
されない。表１に、基質として利用し得る化合物と、そ
の基質から本発明によって生成されるアルコールを示
す。
は、トロピノン還元酵素−Ｉの作用によって目的とする
光学活性アルコールを生成する化合物であれば特に限定
されない。表１に、基質として利用し得る化合物と、そ
の基質から本発明によって生成されるアルコールを示
す。
【表１】
------------------------------------------------------
基質となりうるもの 生成するアルコール
======================================================
Tropinone Tropine
3-Quinuclidinone 3-Quinuclidinol
6-Hydroxytropinone 6-Hydroxytropine
N-Methyl-4-piperidone N-Methyl-4-piperidinol
4-Piperidone 4-Piperidinol
Tetrahydrothiopyran-4-one Tetrahydrothiopyran-4-ol
4-Methylcyclohexanone 4-Methylcyclohexanol
3-Methylcyclohexanone 3-Methylcyclohexanol
2-Methylcyclohexanone 2-Methylcyclohexanol
4-Ethylcyclohexanone 4-Ethylcyclohexanol
8-Thiabicyclo[3.2.1] 8-Thiabicyclo[3.2.1]
-octan-3-one -octan-3-ol
7-Hydroxytropinone 7-Hydroxytropine
N-Ethylnortropinone N-Ethylnortropine
N-iso-Propylnortropinone N-iso-Propylnortropine
------------------------------------------------------
【００６８】これらの基質の中でも特に望ましい基質と
して、たとえば３−キヌクリジノンを示すことができ
る。３−キヌクリジノンを基質として生成する（Ｒ）−
３−キヌクリジノールは、先に述べたように産業上有用
な光学活性化合物である。３−キヌクリジノンと（Ｒ）
−３−キヌクリジノールの構造を式（１）に示す。
して、たとえば３−キヌクリジノンを示すことができ
る。３−キヌクリジノンを基質として生成する（Ｒ）−
３−キヌクリジノールは、先に述べたように産業上有用
な光学活性化合物である。３−キヌクリジノンと（Ｒ）
−３−キヌクリジノールの構造を式（１）に示す。
【化１】式（１）
【００６９】本発明のトロピノン還元酵素−Ｉによる酵
素反応は、以下の条件で行うことができる。 ・基質濃度：0.01-50%、好ましくは、0.1-30% ・反応温度：4-60℃、好ましくは30-50℃ ・ｐＨ：4-9、好ましくは6.5-8.5
素反応は、以下の条件で行うことができる。 ・基質濃度：0.01-50%、好ましくは、0.1-30% ・反応温度：4-60℃、好ましくは30-50℃ ・ｐＨ：4-9、好ましくは6.5-8.5
【００７０】反応系には必要に応じて補酵素NADP+また
はNADPHを0.001 mM-100 mM、好ましくは、0.01-10 mM添
加することができる。また、基質は反応開始時に一括し
て添加するか、あるいは連続的もしくは非連続的に添加
する。
はNADPHを0.001 mM-100 mM、好ましくは、0.01-10 mM添
加することができる。また、基質は反応開始時に一括し
て添加するか、あるいは連続的もしくは非連続的に添加
する。
【００７１】NADPHの再生反応用の化合物は、基質であ
るケトンに対して、モル比でたとえば０．１−２０倍、
好ましくは０．５−５倍の量を添加することができる。
またNADPH再生反応用の酵素は、トロピノン還元酵素−
Ｉに比較して酵素活性で０．１−１００倍、好ましくは
０．５−２０倍程度添加することができる。以下にNADP
Hの再生反応用の化合物と、当該化合物を利用してNADPH
を再生する酵素の組み合せの例を示した。 グルコース（グルコース脱水素酵素） ギ酸（ギ酸脱水素酵素） エタノールまたは2-プロパノール（アルコール脱水素酵
素） Ｌ−グルタミン酸（グルタミン酸脱水素酵素） Ｌ−リンゴ酸（リンゴ酸脱水素酵素、または有機酸脱水
素酵素）
るケトンに対して、モル比でたとえば０．１−２０倍、
好ましくは０．５−５倍の量を添加することができる。
またNADPH再生反応用の酵素は、トロピノン還元酵素−
Ｉに比較して酵素活性で０．１−１００倍、好ましくは
０．５−２０倍程度添加することができる。以下にNADP
Hの再生反応用の化合物と、当該化合物を利用してNADPH
を再生する酵素の組み合せの例を示した。 グルコース（グルコース脱水素酵素） ギ酸（ギ酸脱水素酵素） エタノールまたは2-プロパノール（アルコール脱水素酵
素） Ｌ−グルタミン酸（グルタミン酸脱水素酵素） Ｌ−リンゴ酸（リンゴ酸脱水素酵素、または有機酸脱水
素酵素）
【００７２】本発明において、生成された光学活性アル
コールは、公知の方法によって採取することができる。
すなわち、例えば反応液からの有機溶媒による抽出、晶
析、再結晶、カラムクロマトグラフィー、濃縮、蒸留な
どの分離精製手段によって、光学活性アルコールを得る
ことができる。分離精製手段は、単独または複数の手段
を組み合わせて利用できる。また、必要により反応液か
ら菌体や蛋白質を分離する工程を付加することもでき
る。菌体や蛋白質の分離には、遠心分離や膜処理等を利
用すれば良い。
コールは、公知の方法によって採取することができる。
すなわち、例えば反応液からの有機溶媒による抽出、晶
析、再結晶、カラムクロマトグラフィー、濃縮、蒸留な
どの分離精製手段によって、光学活性アルコールを得る
ことができる。分離精製手段は、単独または複数の手段
を組み合わせて利用できる。また、必要により反応液か
ら菌体や蛋白質を分離する工程を付加することもでき
る。菌体や蛋白質の分離には、遠心分離や膜処理等を利
用すれば良い。
【００７３】本発明に基づく光学活性アルコールの製造
方法によれば、多量の光学活性アルコールを高い光学純
度で得ることができる。光学純度が高い生成物を用いれ
ば、より容易に結晶を得ることができる。たとえば、光
学活性アルコールである（Ｒ）−３−キヌクリジノール
は、以下のようにして容易に塩酸塩として結晶化でき
る。すなわち本発明は、以下の工程を含む（Ｒ）−３−
キヌクリジノール塩酸塩の取得方法に関する。 （ａ）（Ｒ）−３−キヌクリジノールを含む溶液のpHを
アルカリ性としてフリー体（Ｒ）−３−キヌクリジノー
ルとする工程、（ｂ）フリー体（Ｒ）−３−キヌクリジ
ノールをｎ−ブタノールで抽出する工程、（ｃ）抽出液
に塩酸を添加する工程、（ｄ）抽出液中の水分を除去す
る工程、および（ｅ）ｎ−ブタノールより（Ｒ）−３−
キヌクリジノール塩酸塩を結晶化する工程
方法によれば、多量の光学活性アルコールを高い光学純
度で得ることができる。光学純度が高い生成物を用いれ
ば、より容易に結晶を得ることができる。たとえば、光
学活性アルコールである（Ｒ）−３−キヌクリジノール
は、以下のようにして容易に塩酸塩として結晶化でき
る。すなわち本発明は、以下の工程を含む（Ｒ）−３−
キヌクリジノール塩酸塩の取得方法に関する。 （ａ）（Ｒ）−３−キヌクリジノールを含む溶液のpHを
アルカリ性としてフリー体（Ｒ）−３−キヌクリジノー
ルとする工程、（ｂ）フリー体（Ｒ）−３−キヌクリジ
ノールをｎ−ブタノールで抽出する工程、（ｃ）抽出液
に塩酸を添加する工程、（ｄ）抽出液中の水分を除去す
る工程、および（ｅ）ｎ−ブタノールより（Ｒ）−３−
キヌクリジノール塩酸塩を結晶化する工程
【００７４】上記の結晶化工程において、ｎ−ブタノー
ル抽出液中の（Ｒ）−３−キヌクリジノールを塩酸塩化
する際、抽出液中の水分を除去し、塩酸ガスを吹き込む
ことで、ｎ−ブタノールより（Ｒ）−３−キヌクリジノ
ール塩酸塩を結晶化することもできる。
ル抽出液中の（Ｒ）−３−キヌクリジノールを塩酸塩化
する際、抽出液中の水分を除去し、塩酸ガスを吹き込む
ことで、ｎ−ブタノールより（Ｒ）−３−キヌクリジノ
ール塩酸塩を結晶化することもできる。
【００７５】このようにして得られた（Ｒ）−３−キヌ
クリジノール塩酸塩から、フリー体（Ｒ）−３−キヌク
リジノールの結晶を得ることもできる。すなわち本発明
は、以下の工程を含むフリー体（Ｒ）−３−キヌクリジ
ノールの結晶を得る方法に関する。 （ａ）（Ｒ）−３−キヌクリジノール塩酸塩を溶媒Ａに
溶解する工程、（ｂ）（ａ）の溶液のpHをアルカリ性と
してフリー体（Ｒ）−３−キヌクリジノールとする工
程、および（ｃ）溶媒Ｂを添加し、溶媒Ａを留去後、溶
媒Ｂより（Ｒ）−３−キヌクリジノールを結晶化する工
程 ここで溶媒Ａは、（Ｒ）−３−キヌクリジノール塩酸塩
を１％以上の濃度で溶解する溶媒である。溶媒の（Ｒ）
−３−キヌクリジノール塩酸塩の溶解度（１％以上）
は、実際にその溶媒によって（Ｒ）−３−キヌクリジノ
ール塩酸塩を溶解するときの温度における溶解度を言
う。また溶媒Ｂは、溶媒Ａとの混合物から溶媒Ａを蒸留
により置換することができる溶媒であって、かつ溶媒Ａ
よりもフリー体（Ｒ）−３−キヌクリジノールの溶解度
が低く、そして溶媒Ｂからフリー体（Ｒ）−３−キヌク
リジノールを結晶化することが可能な溶媒である。３−
キヌクリジノールを結晶化することが可能な溶媒とは、
溶媒の温度の低下により３−キヌクリジノールの溶解度
を低下させること、あるいは溶媒を除去すること等によ
って３−キヌクリジノールの結晶を生じさせることので
きる溶媒を言う。
クリジノール塩酸塩から、フリー体（Ｒ）−３−キヌク
リジノールの結晶を得ることもできる。すなわち本発明
は、以下の工程を含むフリー体（Ｒ）−３−キヌクリジ
ノールの結晶を得る方法に関する。 （ａ）（Ｒ）−３−キヌクリジノール塩酸塩を溶媒Ａに
溶解する工程、（ｂ）（ａ）の溶液のpHをアルカリ性と
してフリー体（Ｒ）−３−キヌクリジノールとする工
程、および（ｃ）溶媒Ｂを添加し、溶媒Ａを留去後、溶
媒Ｂより（Ｒ）−３−キヌクリジノールを結晶化する工
程 ここで溶媒Ａは、（Ｒ）−３−キヌクリジノール塩酸塩
を１％以上の濃度で溶解する溶媒である。溶媒の（Ｒ）
−３−キヌクリジノール塩酸塩の溶解度（１％以上）
は、実際にその溶媒によって（Ｒ）−３−キヌクリジノ
ール塩酸塩を溶解するときの温度における溶解度を言
う。また溶媒Ｂは、溶媒Ａとの混合物から溶媒Ａを蒸留
により置換することができる溶媒であって、かつ溶媒Ａ
よりもフリー体（Ｒ）−３−キヌクリジノールの溶解度
が低く、そして溶媒Ｂからフリー体（Ｒ）−３−キヌク
リジノールを結晶化することが可能な溶媒である。３−
キヌクリジノールを結晶化することが可能な溶媒とは、
溶媒の温度の低下により３−キヌクリジノールの溶解度
を低下させること、あるいは溶媒を除去すること等によ
って３−キヌクリジノールの結晶を生じさせることので
きる溶媒を言う。
【００７６】上記の結晶化工程において、溶媒Ｂとして
は、たとえばトルエン、４−メチル−２−ペンタノン、
および酢酸ブチルで構成される群から選択されたいずれ
かの溶媒を単独で、あるいは混合して用いることができ
る。中でも溶媒Ａに水、溶媒Ｂにトルエンを用いるのが
望ましい。
は、たとえばトルエン、４−メチル−２−ペンタノン、
および酢酸ブチルで構成される群から選択されたいずれ
かの溶媒を単独で、あるいは混合して用いることができ
る。中でも溶媒Ａに水、溶媒Ｂにトルエンを用いるのが
望ましい。
【００７７】本発明による（Ｒ）−３−キヌクリジノー
ル塩酸塩の取得方法を、より具体的に述べる。まず３−
キヌクリジノンに上記酵素活性物質を接触させて、
（Ｒ）−３−キヌクリジノールを生成させる。（Ｒ）−
３−キヌクリジノールを生成させるための条件は、先に
述べたとおりである。（Ｒ）−３−キヌクリジノールを
含む反応液からは、必要に応じて菌体、蛋白質を遠心分
離、膜処理等により分離することができる。次いで反応
液にアルカリを加えてpHを調節する。アルカリには、例
えば水酸化ナトリウムや水酸化カリウムを用いることが
できる。このときのpHは、pH10以上、好ましくはpH12以
上とする。反応液のアルカリ化によって、（Ｒ）−３−
キヌクリジノールはフリー体となる。フリー体の（Ｒ）
−３−キヌクリジノールは、ｎ−ブタノールにより反応
液から抽出する。（Ｒ）−３−キヌクリジノールを含む
ｎ−ブタノールに、０．８−５等量、好ましくは１−
１．２等量の塩酸を加えれば、（Ｒ）−３−キヌクリジ
ノールは塩酸塩化される。次に溶液中の水分を共沸脱水
により除去し、冷却することによりｎ−ブタノールから
（Ｒ）−３−キヌクリジノール塩酸塩を結晶化すること
ができる。
ル塩酸塩の取得方法を、より具体的に述べる。まず３−
キヌクリジノンに上記酵素活性物質を接触させて、
（Ｒ）−３−キヌクリジノールを生成させる。（Ｒ）−
３−キヌクリジノールを生成させるための条件は、先に
述べたとおりである。（Ｒ）−３−キヌクリジノールを
含む反応液からは、必要に応じて菌体、蛋白質を遠心分
離、膜処理等により分離することができる。次いで反応
液にアルカリを加えてpHを調節する。アルカリには、例
えば水酸化ナトリウムや水酸化カリウムを用いることが
できる。このときのpHは、pH10以上、好ましくはpH12以
上とする。反応液のアルカリ化によって、（Ｒ）−３−
キヌクリジノールはフリー体となる。フリー体の（Ｒ）
−３−キヌクリジノールは、ｎ−ブタノールにより反応
液から抽出する。（Ｒ）−３−キヌクリジノールを含む
ｎ−ブタノールに、０．８−５等量、好ましくは１−
１．２等量の塩酸を加えれば、（Ｒ）−３−キヌクリジ
ノールは塩酸塩化される。次に溶液中の水分を共沸脱水
により除去し、冷却することによりｎ−ブタノールから
（Ｒ）−３−キヌクリジノール塩酸塩を結晶化すること
ができる。
【００７８】こうして得られた塩酸塩からフリー体の
（Ｒ）−３−キヌクリジノールを結晶化することもでき
る。例えば上記の方法により得られた塩酸塩を０．５倍
量以上、好ましくは０．８−１．５倍量の溶媒Ａに溶解
する。溶媒Ａには、好ましくは水を用いる。得られた
（Ｒ）−３−キヌクリジノール溶液に、アルカリを加え
る。アルカリには、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム
が用いられる。このとき（Ｒ）−３−キヌクリジノール
溶液のpHは、pH10以上、好ましくはpH12以上とする。反
応液のアルカリ化によって、（Ｒ）−３−キヌクリジノ
ールはフリー体となる。フリー体の（Ｒ）−３−キヌク
リジノールは、適当な有機溶媒Ｂを用いて結晶化するこ
とができる。たとえば、トルエンを（Ｒ）−３−キヌク
リジノール溶液の１倍量以上、好ましくは５−５０倍量
添加して溶媒Ａを留去する。このとき生じる無機塩など
を必要に応じて濾過などの方法で分離して、冷却すれ
ば、トルエンから（Ｒ）−３−キヌクリジノールを結晶
化することができる。なお、無機塩との分離に際し、収
率低下を防止するため、熱時濾過を行うことが好まし
い。有機溶媒Ｂとしては、トルエンの他にヘキサン、４
−メチル−２−ペンタノン、酢酸ブチルなどを用いるこ
ともできる。
（Ｒ）−３−キヌクリジノールを結晶化することもでき
る。例えば上記の方法により得られた塩酸塩を０．５倍
量以上、好ましくは０．８−１．５倍量の溶媒Ａに溶解
する。溶媒Ａには、好ましくは水を用いる。得られた
（Ｒ）−３−キヌクリジノール溶液に、アルカリを加え
る。アルカリには、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム
が用いられる。このとき（Ｒ）−３−キヌクリジノール
溶液のpHは、pH10以上、好ましくはpH12以上とする。反
応液のアルカリ化によって、（Ｒ）−３−キヌクリジノ
ールはフリー体となる。フリー体の（Ｒ）−３−キヌク
リジノールは、適当な有機溶媒Ｂを用いて結晶化するこ
とができる。たとえば、トルエンを（Ｒ）−３−キヌク
リジノール溶液の１倍量以上、好ましくは５−５０倍量
添加して溶媒Ａを留去する。このとき生じる無機塩など
を必要に応じて濾過などの方法で分離して、冷却すれ
ば、トルエンから（Ｒ）−３−キヌクリジノールを結晶
化することができる。なお、無機塩との分離に際し、収
率低下を防止するため、熱時濾過を行うことが好まし
い。有機溶媒Ｂとしては、トルエンの他にヘキサン、４
−メチル−２−ペンタノン、酢酸ブチルなどを用いるこ
ともできる。
【００７９】また本発明によって得ることができる
（Ｒ）−３−キヌクリジノールは、塩酸塩のみならずフ
リー体としても結晶化することができる。すなわち本発
明は、以下の工程を含む（Ｒ）−３−キヌクリジノール
の製造方法に関する。 （ａ）（Ｒ）−３−キヌクリジノールを含む溶液のpHを
アルカリ性としてフリー体（Ｒ）−３−キヌクリジノー
ルとする工程、（ｂ）フリー体（Ｒ）−３−キヌクリジ
ノールをｎ−ブタノールで抽出する工程、および（ｃ）
抽出液に溶媒Ｂを添加し、ｎ−ブタノールを留去後、溶
媒Ｂより（Ｒ）−３−キヌクリジノールを結晶化する工
程
（Ｒ）−３−キヌクリジノールは、塩酸塩のみならずフ
リー体としても結晶化することができる。すなわち本発
明は、以下の工程を含む（Ｒ）−３−キヌクリジノール
の製造方法に関する。 （ａ）（Ｒ）−３−キヌクリジノールを含む溶液のpHを
アルカリ性としてフリー体（Ｒ）−３−キヌクリジノー
ルとする工程、（ｂ）フリー体（Ｒ）−３−キヌクリジ
ノールをｎ−ブタノールで抽出する工程、および（ｃ）
抽出液に溶媒Ｂを添加し、ｎ−ブタノールを留去後、溶
媒Ｂより（Ｒ）−３−キヌクリジノールを結晶化する工
程
【００８０】本発明によるフリー体（Ｒ）−３−キヌク
リジノールの取得方法を、より具体的に述べる。まず先
に述べた方法によって、本発明によって生成する（Ｒ）
−３−キヌクリジノールを抽出し、アルカリを加えてフ
リー体とする。フリー体の（Ｒ）−３−キヌクリジノー
ルを、ｎ−ブタノールにより抽出し、溶液中の水分を共
沸脱水により除去する。更に有機溶媒をｎ−ブタノール
に対して３−１００倍量、好ましくは５−１０倍量添加
する。このとき用いる有機溶媒としては、例えばヘキサ
ン、４−メチル−２−ペンタノン、酢酸ブチル等を挙げ
ることができる。特にトルエンは望ましい有機溶媒であ
る。
リジノールの取得方法を、より具体的に述べる。まず先
に述べた方法によって、本発明によって生成する（Ｒ）
−３−キヌクリジノールを抽出し、アルカリを加えてフ
リー体とする。フリー体の（Ｒ）−３−キヌクリジノー
ルを、ｎ−ブタノールにより抽出し、溶液中の水分を共
沸脱水により除去する。更に有機溶媒をｎ−ブタノール
に対して３−１００倍量、好ましくは５−１０倍量添加
する。このとき用いる有機溶媒としては、例えばヘキサ
ン、４−メチル−２−ペンタノン、酢酸ブチル等を挙げ
ることができる。特にトルエンは望ましい有機溶媒であ
る。
【００８１】共沸などにより水とｎ−ブタノールを除去
後、必要により濾過などにより夾雑物を除去した後、冷
却することにより、有機溶媒から（Ｒ）−３−キヌクリ
ジノールを結晶化することができる。なお、夾雑物の除
去に際し、収率低下を防止するため、熱時濾過を行うこ
とが好ましい。
後、必要により濾過などにより夾雑物を除去した後、冷
却することにより、有機溶媒から（Ｒ）−３−キヌクリ
ジノールを結晶化することができる。なお、夾雑物の除
去に際し、収率低下を防止するため、熱時濾過を行うこ
とが好ましい。
【００８２】工業的に製造するにあたり、高純度な結晶
を得ることは必須である。結晶化によって不純物を除く
ことにより、高純度の（Ｒ）−３−キヌクリジノールと
なる。なお本明細書において引用された全ての先行技術
文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
を得ることは必須である。結晶化によって不純物を除く
ことにより、高純度の（Ｒ）−３−キヌクリジノールと
なる。なお本明細書において引用された全ての先行技術
文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【００８３】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳しく説明
するが、本発明はこれに限定されるものではない。 ［実施例１］Datura stramoniumのトロピノン還元酵素
−Ｉ遺伝子の取得 文献 （Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95, 4876-488
1 (1998)） 記載の方法により、Datura stramoniumのト
ロピノン還元酵素−Ｉをコードする遺伝子を保持したpE
TTR1を得た。プラスミドを新たに構築するために、構造
遺伝子の5'-末端、3'-末端の配列を元にプライマーDSR-
ATG1（配列番号：５）、DSR-TAA1（配列番号：６）を合
成した。pETTR1を鋳型として、PCR（95℃, 30秒、50℃,
1分、75℃, 3分15秒）を30サイクル行い、特異的な増
幅DNAを得た。 配列番号：５：DSR-ATG1／ATACCATGGAAGAATCAAAAGTG 配列番号：６：DSR-TAA1／TGGTCTAGATTAAAACCCACCATTAG
CTGTG
するが、本発明はこれに限定されるものではない。 ［実施例１］Datura stramoniumのトロピノン還元酵素
−Ｉ遺伝子の取得 文献 （Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95, 4876-488
1 (1998)） 記載の方法により、Datura stramoniumのト
ロピノン還元酵素−Ｉをコードする遺伝子を保持したpE
TTR1を得た。プラスミドを新たに構築するために、構造
遺伝子の5'-末端、3'-末端の配列を元にプライマーDSR-
ATG1（配列番号：５）、DSR-TAA1（配列番号：６）を合
成した。pETTR1を鋳型として、PCR（95℃, 30秒、50℃,
1分、75℃, 3分15秒）を30サイクル行い、特異的な増
幅DNAを得た。 配列番号：５：DSR-ATG1／ATACCATGGAAGAATCAAAAGTG 配列番号：６：DSR-TAA1／TGGTCTAGATTAAAACCCACCATTAG
CTGTG
【００８４】［実施例２］Datura stramonium由来トロ
ピノン還元酵素−Ｉと枯草菌由来グルコース脱水素酵素
遺伝子を共発現するプラスミドpSG-DSR1の構築 枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を含むプラス
ミドpSE-BSG1（特開 2000-189170）をNco I、およびXba
Iの２つの制限酵素で二重消化し、枯草菌由来のグルコ
ース脱水素酵素遺伝子を含むDNA断片を調製した。このD
NA断片を、実施例１で調製したDNA断片より同酵素で切
り出したDatura stramonium由来のトロピノン還元酵素
−Ｉ遺伝子を含むDNA断片とT4 DNAリガーゼで連結し、
グルコース脱水素酵素とトロピノン還元酵素−Ｉを同時
に発現可能なプラスミドpSG-DSR1(FERM P-18395)を得
た。
ピノン還元酵素−Ｉと枯草菌由来グルコース脱水素酵素
遺伝子を共発現するプラスミドpSG-DSR1の構築 枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を含むプラス
ミドpSE-BSG1（特開 2000-189170）をNco I、およびXba
Iの２つの制限酵素で二重消化し、枯草菌由来のグルコ
ース脱水素酵素遺伝子を含むDNA断片を調製した。このD
NA断片を、実施例１で調製したDNA断片より同酵素で切
り出したDatura stramonium由来のトロピノン還元酵素
−Ｉ遺伝子を含むDNA断片とT4 DNAリガーゼで連結し、
グルコース脱水素酵素とトロピノン還元酵素−Ｉを同時
に発現可能なプラスミドpSG-DSR1(FERM P-18395)を得
た。
【００８５】［実施例３］Datura stramoniumのトロピ
ノン還元酵素−Ｉと枯草菌由来グルコース脱水素酵素の
同時発現 pSG-DSR1で形質転換した大腸菌 HB101株（E.coli HB101
(pSG-DSR1) ） をアンピシリン50 mg/Lを含むLB培地で
終夜培養後、IPTGを0.1 mM添加して遺伝子の発現を誘導
し、更に４時間培養した。得られた菌体を集菌後、密閉
式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバイオ製）で破砕
し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。
ノン還元酵素−Ｉと枯草菌由来グルコース脱水素酵素の
同時発現 pSG-DSR1で形質転換した大腸菌 HB101株（E.coli HB101
(pSG-DSR1) ） をアンピシリン50 mg/Lを含むLB培地で
終夜培養後、IPTGを0.1 mM添加して遺伝子の発現を誘導
し、更に４時間培養した。得られた菌体を集菌後、密閉
式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバイオ製）で破砕
し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。
【００８６】［実施例４］Datura stramonium由来トロ
ピノン還元酵素−Ｉと枯草菌由来グルコース脱水素酵素
の酵素活性 実施例３で得られた無細胞抽出液を用い、酵素活性を測
定した。組換え大腸菌から得た無細胞抽出液では、NADP
H依存的にトロピノン還元活性を示し、その比活性は、
9.49 U/mg-蛋白質であった。また、組換え大腸菌から得
た無細胞抽出液では、NADPH依存的に３−キヌクリジノ
ン還元活性を示し、その比活性は、4.33U/mg-蛋白質で
あった。
ピノン還元酵素−Ｉと枯草菌由来グルコース脱水素酵素
の酵素活性 実施例３で得られた無細胞抽出液を用い、酵素活性を測
定した。組換え大腸菌から得た無細胞抽出液では、NADP
H依存的にトロピノン還元活性を示し、その比活性は、
9.49 U/mg-蛋白質であった。また、組換え大腸菌から得
た無細胞抽出液では、NADPH依存的に３−キヌクリジノ
ン還元活性を示し、その比活性は、4.33U/mg-蛋白質で
あった。
【００８７】グルコース脱水素酵素活性の測定は、100m
Mリン酸カリウム緩衝液（pH6.5）、2.5mM NAD+、100mM
D-グルコース及び酵素を含む反応液中で、37℃で反応さ
せた。1Uは、1分間に1μmolのNADHの生成を触媒する酵
素量とした。組換え大腸菌から得た無細胞抽出液では、
その比活性は、9.02 U/mg-蛋白質であった。
Mリン酸カリウム緩衝液（pH6.5）、2.5mM NAD+、100mM
D-グルコース及び酵素を含む反応液中で、37℃で反応さ
せた。1Uは、1分間に1μmolのNADHの生成を触媒する酵
素量とした。組換え大腸菌から得た無細胞抽出液では、
その比活性は、9.02 U/mg-蛋白質であった。
【００８８】［実施例５］Datura stramonium由来トロ
ピノン還元酵素−Ｉによる（Ｒ）−３−キヌクリジノー
ルの合成 実施例２で調製したpSG-DSR1で形質転換した大腸菌を2
×YT培地(Tryptone 20g、Yeast extract 10 g、 NaCl 1
0 g、 pH 7.2 )400 mLで培養し、0.1 mMのIPTGで発現を
誘導後に集菌した。得られた菌体を、500 mMリン酸カリ
ウム緩衝液 (pH7.5) 、10%（618.7 mM） ３−キヌクリ
ジノン塩酸塩、927.8mM グルコースを含む400 mLの反応
液に加えて、攪拌下37℃で１晩反応させた。
ピノン還元酵素−Ｉによる（Ｒ）−３−キヌクリジノー
ルの合成 実施例２で調製したpSG-DSR1で形質転換した大腸菌を2
×YT培地(Tryptone 20g、Yeast extract 10 g、 NaCl 1
0 g、 pH 7.2 )400 mLで培養し、0.1 mMのIPTGで発現を
誘導後に集菌した。得られた菌体を、500 mMリン酸カリ
ウム緩衝液 (pH7.5) 、10%（618.7 mM） ３−キヌクリ
ジノン塩酸塩、927.8mM グルコースを含む400 mLの反応
液に加えて、攪拌下37℃で１晩反応させた。
【００８９】反応液を除菌後、一部を0.35 N水酸化ナト
リウムで2倍希釈し、生成した３−キヌクリジノールを
ガスクロマトグラフィーにより定量した。ガスクロマト
グラフィー分析には、ユニソール10T＋KOH（10+3％）ユ
ニポートHP 80/100メッシュ(2 m、ジーエルサイエンス
社製) を用いた。カラム温度は150℃、検出温度は250℃
の条件で、デテクターには水素炎イオン化検出器(FID)
を用いた。各化合物の保持時間は、３−キヌクリジノン
で5.4分、３−キヌクリジノールで11.2分であった。更
にシグナル強度に基づいて算出した３−キヌクリジノー
ル塩酸塩の濃度は89.5 g/Lであり、収率は88.4%であっ
た。
リウムで2倍希釈し、生成した３−キヌクリジノールを
ガスクロマトグラフィーにより定量した。ガスクロマト
グラフィー分析には、ユニソール10T＋KOH（10+3％）ユ
ニポートHP 80/100メッシュ(2 m、ジーエルサイエンス
社製) を用いた。カラム温度は150℃、検出温度は250℃
の条件で、デテクターには水素炎イオン化検出器(FID)
を用いた。各化合物の保持時間は、３−キヌクリジノン
で5.4分、３−キヌクリジノールで11.2分であった。更
にシグナル強度に基づいて算出した３−キヌクリジノー
ル塩酸塩の濃度は89.5 g/Lであり、収率は88.4%であっ
た。
【００９０】次に生成物の光学純度を測定した。光学純
度は、以下の操作により測定した。まず反応液を除菌
後、炭酸ナトリウムを飽和濃度に加えて、３−キヌクリ
ジノールを酢酸エチルで抽出した。脱溶媒した後、ベン
ゾイルクロライドによってベンゾイル化し、光学分割カ
ラムを用いた高速液体クロマトグラフィー (カラム, ダ
イセル化学製キラルパックＡＤ; 移動相, ｎ−ヘキサン
／エタノール／ジエチルアミン (９５／５／０．１);
検出波長２５４nm; 流速, １．０ mL/分) により測定し
た。保持時間12分で(Ｓ)体、23分で(Ｒ)体が検出され
た。その結果、生成物における光学純度は 98.6% ee
(R) であった。
度は、以下の操作により測定した。まず反応液を除菌
後、炭酸ナトリウムを飽和濃度に加えて、３−キヌクリ
ジノールを酢酸エチルで抽出した。脱溶媒した後、ベン
ゾイルクロライドによってベンゾイル化し、光学分割カ
ラムを用いた高速液体クロマトグラフィー (カラム, ダ
イセル化学製キラルパックＡＤ; 移動相, ｎ−ヘキサン
／エタノール／ジエチルアミン (９５／５／０．１);
検出波長２５４nm; 流速, １．０ mL/分) により測定し
た。保持時間12分で(Ｓ)体、23分で(Ｒ)体が検出され
た。その結果、生成物における光学純度は 98.6% ee
(R) であった。
【００９１】更に、反応液を除菌後、炭酸ナトリウムを
飽和濃度に加え、３−キヌクリジノールを酢酸エチルで
２回抽出した。抽出液の脱溶媒によって得られた結晶を
１N塩酸に溶解し、旋光度を測定した。その結果、[α]D
=-43.7(c=1, 1N HCl)であり、文献値：[α]D=-43.8(c=
3, 1NHCl) (J.Amer.Chem.Soc., 74, 2215-2218(1952))
との比較から生成物が(Ｒ)体であることを確認した。
飽和濃度に加え、３−キヌクリジノールを酢酸エチルで
２回抽出した。抽出液の脱溶媒によって得られた結晶を
１N塩酸に溶解し、旋光度を測定した。その結果、[α]D
=-43.7(c=1, 1N HCl)であり、文献値：[α]D=-43.8(c=
3, 1NHCl) (J.Amer.Chem.Soc., 74, 2215-2218(1952))
との比較から生成物が(Ｒ)体であることを確認した。
【００９２】［実施例６］反応液からの（Ｒ）−３−キ
ヌクリジノール塩酸塩の回収 実施例５で調製した反応液を遠心分離により除菌後、UF
膜処理により除蛋白し、エバポレータで濃縮した。これ
に25%水酸化ナトリウムを加えてpH12.0に調整し、等量
のｎ−ブタノールで2回抽出した。抽出液に濃塩酸を18m
L加え、110-130℃、常圧での蒸留操作により水を除去
し、冷却することで（Ｒ）−３−キヌクリジノール塩酸
塩の結晶を得た。得られた結晶を濾過により回収し、減
圧乾燥することで、32.4gの結晶を得た。収率は80.0%で
あった。
ヌクリジノール塩酸塩の回収 実施例５で調製した反応液を遠心分離により除菌後、UF
膜処理により除蛋白し、エバポレータで濃縮した。これ
に25%水酸化ナトリウムを加えてpH12.0に調整し、等量
のｎ−ブタノールで2回抽出した。抽出液に濃塩酸を18m
L加え、110-130℃、常圧での蒸留操作により水を除去
し、冷却することで（Ｒ）−３−キヌクリジノール塩酸
塩の結晶を得た。得られた結晶を濾過により回収し、減
圧乾燥することで、32.4gの結晶を得た。収率は80.0%で
あった。
【００９３】［実施例７］（Ｒ）−３−キヌクリジノー
ル塩酸塩からのフリー化 実施例６で調製した（Ｒ）−３−キヌクリジノール塩酸
塩の結晶25.0gを水25.0gに溶解後、25%水酸化ナトリウ
ムを加えてpH13.0に調整した。これにトルエンを500g添
加し、60-70℃、170Torrで共沸脱水した。脱水終了後、
80℃、常圧で（Ｒ）−３−キヌクリジノールをトルエン
に完溶させ、残存した無機塩を80℃で熱時濾過すること
で除去した。トルエン溶液を冷却することで（Ｒ）−３
−キヌクリジノールの結晶を得た。得られた結晶を濾過
により回収し、減圧乾燥することで16gの結晶を得た。
ル塩酸塩からのフリー化 実施例６で調製した（Ｒ）−３−キヌクリジノール塩酸
塩の結晶25.0gを水25.0gに溶解後、25%水酸化ナトリウ
ムを加えてpH13.0に調整した。これにトルエンを500g添
加し、60-70℃、170Torrで共沸脱水した。脱水終了後、
80℃、常圧で（Ｒ）−３−キヌクリジノールをトルエン
に完溶させ、残存した無機塩を80℃で熱時濾過すること
で除去した。トルエン溶液を冷却することで（Ｒ）−３
−キヌクリジノールの結晶を得た。得られた結晶を濾過
により回収し、減圧乾燥することで16gの結晶を得た。
【００９４】［実施例８］反応液からの（Ｒ）−３−キ
ヌクリジノールの単離 pSG-DSR1で形質転換した大腸菌による３−キヌクリジノ
ン還元反応液を遠心分離により除菌後、UF膜処理により
除蛋白した。UF膜処理液91g（３−キヌクリジノール塩
酸塩含有率 12%）に25%の水酸化ナトリウム水溶液を加
え、pH 12に調整した。得られた液を50〜60℃、20Torr
の条件下で減圧濃縮し、48gとした。同量のｎ−ブタノ
ール を加え、2回抽出を行った。得られた有機層を、50
〜60℃、20Torrの条件で濃縮した。トルエン50gを添加
し、濃縮を繰り返すことによって、トルエンに溶媒置換
した。得られたトルエン溶液を冷却し、析出した結晶を
濾過した。得られた湿結晶を減圧乾燥すると、（Ｒ）−
３−キヌクリジノールが結晶として6.5g得られた。
ヌクリジノールの単離 pSG-DSR1で形質転換した大腸菌による３−キヌクリジノ
ン還元反応液を遠心分離により除菌後、UF膜処理により
除蛋白した。UF膜処理液91g（３−キヌクリジノール塩
酸塩含有率 12%）に25%の水酸化ナトリウム水溶液を加
え、pH 12に調整した。得られた液を50〜60℃、20Torr
の条件下で減圧濃縮し、48gとした。同量のｎ−ブタノ
ール を加え、2回抽出を行った。得られた有機層を、50
〜60℃、20Torrの条件で濃縮した。トルエン50gを添加
し、濃縮を繰り返すことによって、トルエンに溶媒置換
した。得られたトルエン溶液を冷却し、析出した結晶を
濾過した。得られた湿結晶を減圧乾燥すると、（Ｒ）−
３−キヌクリジノールが結晶として6.5g得られた。
【００９５】［実施例９］Hyoscyamus niger由来のトロ
ピノン還元酵素−Ｉ遺伝子の取得 文献 （Biosci. Biotechnol. Biochem.,63(10),1819-18
22(1999)） 記載の方法により、Hyoscyamus niger由来
トロピノン還元酵素−Ｉ遺伝子を得た。この構造遺伝子
の5'-末端、3'-末端の配列を元にプライマーHNR-ATG1
（配列番号：７）、HNR-TAA1（配列番号：８）を合成し
た。トロピノン還元酵素−ＩcDNAを鋳型として、PCR（9
5℃, 30秒、50℃, 1分、75℃, 3分15秒）を30サイクル
行い、特異的な増幅DNAを得た。 配列番号：７：HNR-ATG1 ATACCATGGCCGGAGAATCA 配列番号：８：HNR-TAA1 ACCTCTAGATTAAAACCCACCATTAGCTGTG
ピノン還元酵素−Ｉ遺伝子の取得 文献 （Biosci. Biotechnol. Biochem.,63(10),1819-18
22(1999)） 記載の方法により、Hyoscyamus niger由来
トロピノン還元酵素−Ｉ遺伝子を得た。この構造遺伝子
の5'-末端、3'-末端の配列を元にプライマーHNR-ATG1
（配列番号：７）、HNR-TAA1（配列番号：８）を合成し
た。トロピノン還元酵素−ＩcDNAを鋳型として、PCR（9
5℃, 30秒、50℃, 1分、75℃, 3分15秒）を30サイクル
行い、特異的な増幅DNAを得た。 配列番号：７：HNR-ATG1 ATACCATGGCCGGAGAATCA 配列番号：８：HNR-TAA1 ACCTCTAGATTAAAACCCACCATTAGCTGTG
【００９６】［実施例１０］Hyoscyamus niger由来トロ
ピノン還元酵素−Ｉと枯草菌由来グルコース脱水素酵素
遺伝子を共発現するプラスミドpSG-HNR1の構築 枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を含むプラス
ミドpSE-BSG1（特開 2000-189170）をNco IおよびXba I
の２つの制限酵素で二重消化し、枯草菌由来のグルコー
ス脱水素酵素遺伝子を含むDNA断片を調製した。このDNA
断片を実施例６で調製したDNA断片より同酵素で切り出
したHyoscyamus niger由来のトロピノン還元酵素−Ｉ遺
伝子を含むDNA断片とT4 DNAリガーゼで連結し、グルコ
ース脱水素酵素とトロピノン還元酵素−Ｉを同時に発現
可能なプラスミドpSG-HNR1(FERMP-18396)を得た。
ピノン還元酵素−Ｉと枯草菌由来グルコース脱水素酵素
遺伝子を共発現するプラスミドpSG-HNR1の構築 枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を含むプラス
ミドpSE-BSG1（特開 2000-189170）をNco IおよびXba I
の２つの制限酵素で二重消化し、枯草菌由来のグルコー
ス脱水素酵素遺伝子を含むDNA断片を調製した。このDNA
断片を実施例６で調製したDNA断片より同酵素で切り出
したHyoscyamus niger由来のトロピノン還元酵素−Ｉ遺
伝子を含むDNA断片とT4 DNAリガーゼで連結し、グルコ
ース脱水素酵素とトロピノン還元酵素−Ｉを同時に発現
可能なプラスミドpSG-HNR1(FERMP-18396)を得た。
【００９７】［実施例１１］Hyoscyamus nigerのトロピ
ノン還元酵素−Ｉと枯草菌由来グルコース脱水素酵素の
同時発現 pSG-HNR1で形質転換した大腸菌 HB101株（E.coli HB101
(pSG-HNR1) ） をアンピシリン50 mg/Lを含むLB培地で
終夜培養後、IPTGを0.1 mM添加して遺伝子の発現を誘導
し、更に4時間培養した。得られた菌体を集菌後、密閉
式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバイオ製）で破砕
し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。
ノン還元酵素−Ｉと枯草菌由来グルコース脱水素酵素の
同時発現 pSG-HNR1で形質転換した大腸菌 HB101株（E.coli HB101
(pSG-HNR1) ） をアンピシリン50 mg/Lを含むLB培地で
終夜培養後、IPTGを0.1 mM添加して遺伝子の発現を誘導
し、更に4時間培養した。得られた菌体を集菌後、密閉
式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバイオ製）で破砕
し、遠心分離した上清を無細胞抽出液とした。
【００９８】［実施例１２］Hyoscyamus niger由来トロ
ピノン還元酵素−Ｉと枯草菌由来グルコース脱水素酵素
の酵素活性 実施例１１で得られた無細胞抽出液を用い、酵素活性を
測定した。組換え大腸菌から得た無細胞抽出液では、NA
DPH依存的にトロピノン還元活性を示し、その比活性
は、0.35 U/mg-蛋白質であった。
ピノン還元酵素−Ｉと枯草菌由来グルコース脱水素酵素
の酵素活性 実施例１１で得られた無細胞抽出液を用い、酵素活性を
測定した。組換え大腸菌から得た無細胞抽出液では、NA
DPH依存的にトロピノン還元活性を示し、その比活性
は、0.35 U/mg-蛋白質であった。
【００９９】また、組換え大腸菌から得た無細胞抽出液
では、NADPH依存的に３−キヌクリジノン還元活性を示
し、その比活性は、0.26 U/mg-蛋白質であった。グルコ
ース脱水素酵素活性の比活性は、3.96 U/mg-蛋白質であ
った。グルコース脱水素酵素活性は、実施例４に記載の
方法で測定した。
では、NADPH依存的に３−キヌクリジノン還元活性を示
し、その比活性は、0.26 U/mg-蛋白質であった。グルコ
ース脱水素酵素活性の比活性は、3.96 U/mg-蛋白質であ
った。グルコース脱水素酵素活性は、実施例４に記載の
方法で測定した。
【０１００】［実施例１３］Hyoscyamus niger由来トロ
ピノン還元酵素−Ｉによる（Ｒ）−３−キヌクリジノー
ルの合成 実施例９で調製したpSG-HNR1で形質転換した大腸菌を2
×YT培地(Tryptone 20g、Yeast extract 10 g、 NaCl 1
0 g、 pH 7.2 )10 mLで培養し、0.1 mMのIPTGで発現を
誘導後に集菌した。得られた菌体を、500 mMリン酸カリ
ウム緩衝液 (pH6.5)、1%（61.9 mM） ３−キヌクリジノ
ン塩酸塩、278.4mM グルコースを含む10 mLの反応液に
加えて、攪拌下20℃で１晩反応させた。反応液を除菌
後、実施例５に記載の方法で生成した３−キヌクリジノ
ールを定量した。その結果、３−キヌクリジノール塩酸
塩濃度は1.59g/Lであり、収率は15.7%であった。光学純
度は、実施例５に記載の方法で測定した。その結果、光
学純度は 89.0%ee (R) であった。
ピノン還元酵素−Ｉによる（Ｒ）−３−キヌクリジノー
ルの合成 実施例９で調製したpSG-HNR1で形質転換した大腸菌を2
×YT培地(Tryptone 20g、Yeast extract 10 g、 NaCl 1
0 g、 pH 7.2 )10 mLで培養し、0.1 mMのIPTGで発現を
誘導後に集菌した。得られた菌体を、500 mMリン酸カリ
ウム緩衝液 (pH6.5)、1%（61.9 mM） ３−キヌクリジノ
ン塩酸塩、278.4mM グルコースを含む10 mLの反応液に
加えて、攪拌下20℃で１晩反応させた。反応液を除菌
後、実施例５に記載の方法で生成した３−キヌクリジノ
ールを定量した。その結果、３−キヌクリジノール塩酸
塩濃度は1.59g/Lであり、収率は15.7%であった。光学純
度は、実施例５に記載の方法で測定した。その結果、光
学純度は 89.0%ee (R) であった。
【０１０１】［実施例１４］Thermoplasma acidophilum
IFO 15155からの染色体DNAの調製Thermoplasma acidophilum IFO 15155 株を Medium 280
(KH2PO4 3 g/L, MgSO 4・7H2O 0.5 g/L, CaCl2・2H2O
0.25 g/L, yeast extract 1 g/L, glucose 10 g/L, (N
H4) 2SO4 2 g/L, pH 2.0) を 50 mL入れた250 mLフラス
コ4本に植菌し、60℃で2週間培養した。得られた菌を遠
心分離により集菌し、DNeasy Tissue kit (Qiagen) に
より染色体DNAを調製した。
IFO 15155からの染色体DNAの調製Thermoplasma acidophilum IFO 15155 株を Medium 280
(KH2PO4 3 g/L, MgSO 4・7H2O 0.5 g/L, CaCl2・2H2O
0.25 g/L, yeast extract 1 g/L, glucose 10 g/L, (N
H4) 2SO4 2 g/L, pH 2.0) を 50 mL入れた250 mLフラス
コ4本に植菌し、60℃で2週間培養した。得られた菌を遠
心分離により集菌し、DNeasy Tissue kit (Qiagen) に
より染色体DNAを調製した。
【０１０２】［実施例１５］Thermoplasma acidophilum
IFO 15155由来グルコース脱水素酵素遺伝子のクローニ
ングThermoplasma acidophilum IFO 15155由来グルコース脱
水素酵素遺伝子をクローニングするために、プライマー
TAG-ATG1（配列番号：９）、 TAG-TAA3（配列番号：１
０）を合成した。 配列番号：９：TAG-ATG1 CAGGAATTCAATAATGACTGAACAGAAAGCCATTG 配列番号：１０：TAG-TAA3 CTGACTAGTATTACTGCCACTTTATCACCGTC Pfu DNA Polymerase用緩衝液、0.2 mM dNTP, 各25 pmol
のプライマーDNA, PfuDNA polymerase 2.5 Uおよび実施
例１３で調製したThermoplasma acidophilum由来の染色
体DNA 50 ngを含む反応液を用い、変性 95℃, 30秒、ア
ニール50℃,1分、伸張75℃, 4分の条件でPCRを30サイク
ル行い、グルコース脱水素酵素遺伝子を含むDNA断片を
増幅させた。得られたDNA断片をGFX-column (Pharmacia
製) で精製し、EcoRI, SpeIにより2重消化した後、アガ
ロース電気泳動によりDNA断片を精製した。得られたDNA
断片と同制限酵素で消化したpSE420D(特開2000-189170)
をライゲーションし、pSE-TAG3を構築した。
IFO 15155由来グルコース脱水素酵素遺伝子のクローニ
ングThermoplasma acidophilum IFO 15155由来グルコース脱
水素酵素遺伝子をクローニングするために、プライマー
TAG-ATG1（配列番号：９）、 TAG-TAA3（配列番号：１
０）を合成した。 配列番号：９：TAG-ATG1 CAGGAATTCAATAATGACTGAACAGAAAGCCATTG 配列番号：１０：TAG-TAA3 CTGACTAGTATTACTGCCACTTTATCACCGTC Pfu DNA Polymerase用緩衝液、0.2 mM dNTP, 各25 pmol
のプライマーDNA, PfuDNA polymerase 2.5 Uおよび実施
例１３で調製したThermoplasma acidophilum由来の染色
体DNA 50 ngを含む反応液を用い、変性 95℃, 30秒、ア
ニール50℃,1分、伸張75℃, 4分の条件でPCRを30サイク
ル行い、グルコース脱水素酵素遺伝子を含むDNA断片を
増幅させた。得られたDNA断片をGFX-column (Pharmacia
製) で精製し、EcoRI, SpeIにより2重消化した後、アガ
ロース電気泳動によりDNA断片を精製した。得られたDNA
断片と同制限酵素で消化したpSE420D(特開2000-189170)
をライゲーションし、pSE-TAG3を構築した。
【０１０３】［実施例１６］ダツラ由来トロピノン還元
酵素−ＩとThermoplasma acidophilumIFO 15155由来グ
ルコース脱水素酵素遺伝子を共発現するプラスミドpTG-
DSR1の構築 実施例２で調製したプラスミド pSG-DSR1をNcoI及びXba
Iで2重消化し、ダツラ由来のトロピノン還元酵素−Ｉ遺
伝子を含むDNA断片(pSG-DSR1/NcoI-XbaI) 824bp を精製
した。このDNA断片を、実施例１４で調製したプラスミ
ドpSE-TAG3をNcoI及びXbaIで2重消化したベクター部分
と、T4 DNA リガーゼで連結し、グルコース脱水素酵素
とトロピノン還元酵素−Ｉを同時に発現可能なプラスミ
ドpTG-DSR1を得た。
酵素−ＩとThermoplasma acidophilumIFO 15155由来グ
ルコース脱水素酵素遺伝子を共発現するプラスミドpTG-
DSR1の構築 実施例２で調製したプラスミド pSG-DSR1をNcoI及びXba
Iで2重消化し、ダツラ由来のトロピノン還元酵素−Ｉ遺
伝子を含むDNA断片(pSG-DSR1/NcoI-XbaI) 824bp を精製
した。このDNA断片を、実施例１４で調製したプラスミ
ドpSE-TAG3をNcoI及びXbaIで2重消化したベクター部分
と、T4 DNA リガーゼで連結し、グルコース脱水素酵素
とトロピノン還元酵素−Ｉを同時に発現可能なプラスミ
ドpTG-DSR1を得た。
【０１０４】［実施例１７］ダツラ由来トロピノン還元
酵素−ＩとThermoplasma acidophilumIFO 15155由来グ
ルコース脱水素酵素の同時発現 pTG-DSR1で形質転換した大腸菌 HB101株（E.coli HB101
(pTG-DSR1) ）をアンピシリン50 mg/Lを含むLB培地で
終夜培養後、IPTGを0.1 mM添加し、更に4時間培養し
た。得られた菌体を集菌後、密閉式超音波破砕装置UCD-
200TM（コスモバイオ製）で破砕し、遠心分離した上清
を無細胞抽出液とした。
酵素−ＩとThermoplasma acidophilumIFO 15155由来グ
ルコース脱水素酵素の同時発現 pTG-DSR1で形質転換した大腸菌 HB101株（E.coli HB101
(pTG-DSR1) ）をアンピシリン50 mg/Lを含むLB培地で
終夜培養後、IPTGを0.1 mM添加し、更に4時間培養し
た。得られた菌体を集菌後、密閉式超音波破砕装置UCD-
200TM（コスモバイオ製）で破砕し、遠心分離した上清
を無細胞抽出液とした。
【０１０５】［実施例１８］ダツラ由来トロピノン還元
酵素−ＩとThermoplasma acidophilumIFO 15155由来グ
ルコース脱水素酵素の酵素活性 実施例１７で得られた無細胞抽出液を用い、酵素活性を
測定した。組換え大腸菌から得た無細胞抽出液では、Ｎ
ＡＤＰＨ依存的にトロピノン還元活性を示し、その比活
性は、5.13 U/mg-蛋白質であった。また、組換え大腸菌
から得た無細胞抽出液では、ＮＡＤＰＨ依存的に３−キ
ヌクリジノン還元活性を示し、その比活性は、1.91 U/m
g-蛋白質であった。グルコース脱水素酵素活性の測定
は、100 mM リン酸カリウム緩衝液(pH 7.0),2.5 mM NAD
P+, 100 mM D-グルコースおよび酵素を含む反応液で、2
5℃で反応させた。1Uは、1分間に1μmolのNADPHの生成
を触媒する酵素量とした。組換え大腸菌から得た無細胞
抽出液では、その比活性は、1.95 U/mg-蛋白質であっ
た。
酵素−ＩとThermoplasma acidophilumIFO 15155由来グ
ルコース脱水素酵素の酵素活性 実施例１７で得られた無細胞抽出液を用い、酵素活性を
測定した。組換え大腸菌から得た無細胞抽出液では、Ｎ
ＡＤＰＨ依存的にトロピノン還元活性を示し、その比活
性は、5.13 U/mg-蛋白質であった。また、組換え大腸菌
から得た無細胞抽出液では、ＮＡＤＰＨ依存的に３−キ
ヌクリジノン還元活性を示し、その比活性は、1.91 U/m
g-蛋白質であった。グルコース脱水素酵素活性の測定
は、100 mM リン酸カリウム緩衝液(pH 7.0),2.5 mM NAD
P+, 100 mM D-グルコースおよび酵素を含む反応液で、2
5℃で反応させた。1Uは、1分間に1μmolのNADPHの生成
を触媒する酵素量とした。組換え大腸菌から得た無細胞
抽出液では、その比活性は、1.95 U/mg-蛋白質であっ
た。
【０１０６】［実施例１９］ダツラ由来トロピノン還元
酵素−ＩとThermoplasma acidophilumIFO 15155由来グ
ルコース脱水素酵素による（Ｒ）−３−キヌクリジノー
ルの合成 実施例１６で調製したpTG-DSR1で形質転換した大腸菌HB
101株を2×YT培地(Tryptone 20 g、Yeast extract 10
g、 NaCl 10 g、 pH 7.2 )10 mLで培養、誘導後、集菌
し、500 mMリン酸カリウム緩衝液 (pH 7.5) 、5%（309.
3 mM）３−キヌクリジノン塩酸塩、464.0mM グルコース
を含む10 mLの反応液を用い、攪拌下37℃で1晩反応させ
た。反応液を除菌後、実施例５に記載の方法で生成した
３−キヌクリジノールを定量した。その結果、３−キヌ
クリジノール塩酸塩濃度は44.7 g/Lであり、収率は88.3
%であった。光学純度は、実施例５に記載の方法で測定
した。その結果、光学純度は 93.4%ee (R) であった。
酵素−ＩとThermoplasma acidophilumIFO 15155由来グ
ルコース脱水素酵素による（Ｒ）−３−キヌクリジノー
ルの合成 実施例１６で調製したpTG-DSR1で形質転換した大腸菌HB
101株を2×YT培地(Tryptone 20 g、Yeast extract 10
g、 NaCl 10 g、 pH 7.2 )10 mLで培養、誘導後、集菌
し、500 mMリン酸カリウム緩衝液 (pH 7.5) 、5%（309.
3 mM）３−キヌクリジノン塩酸塩、464.0mM グルコース
を含む10 mLの反応液を用い、攪拌下37℃で1晩反応させ
た。反応液を除菌後、実施例５に記載の方法で生成した
３−キヌクリジノールを定量した。その結果、３−キヌ
クリジノール塩酸塩濃度は44.7 g/Lであり、収率は88.3
%であった。光学純度は、実施例５に記載の方法で測定
した。その結果、光学純度は 93.4%ee (R) であった。
【０１０７】
【発明の効果】本発明により、トロピノン還元酵素−Ｉ
の不斉還元作用を利用する光学活性アルコールの製造方
法が提供された。本発明の方法は、産業上重要な化合物
である（Ｒ）−３−キヌクリジノールを、容易に、かつ
効率的に製造することができる。しかも本発明によって
得ることができる（Ｒ）−３−キヌクリジノールは、高
い光学純度を備える。
の不斉還元作用を利用する光学活性アルコールの製造方
法が提供された。本発明の方法は、産業上重要な化合物
である（Ｒ）−３−キヌクリジノールを、容易に、かつ
効率的に製造することができる。しかも本発明によって
得ることができる（Ｒ）−３−キヌクリジノールは、高
い光学純度を備える。
【０１０８】更に本発明は、遺伝子組み換えの手法を利
用することによって、より効率的に（Ｒ）−３−キヌク
リジノールを製造することができる方法を提供した。す
なわち、トロピノン還元酵素−Ｉを酸化型還元酵素の再
生酵素と共発現させることによって、本発明に基づく光
学活性アルコールの製造方法を更に効率的に実施できる
ことを見出した。中でも、Datura stramonium、あるい
はHyoscyamus nigerといった植物由来のトロピノン還元
酵素−Ｉに対して、枯草菌あるいはThermoplasma acido
philumに由来するグルコース脱水素酵素を再生酵素とし
て組み合わせた場合には、両者の共発現によって、きわ
めて効率的に光学活性アルコールを生成させることがで
きる。植物由来の酵素と微生物由来の酵素の共発現によ
って、光学純度の高い（Ｒ）−３−キヌクリジノールを
高度に効率的に製造しうることはまったく予想されてい
なかった。
用することによって、より効率的に（Ｒ）−３−キヌク
リジノールを製造することができる方法を提供した。す
なわち、トロピノン還元酵素−Ｉを酸化型還元酵素の再
生酵素と共発現させることによって、本発明に基づく光
学活性アルコールの製造方法を更に効率的に実施できる
ことを見出した。中でも、Datura stramonium、あるい
はHyoscyamus nigerといった植物由来のトロピノン還元
酵素−Ｉに対して、枯草菌あるいはThermoplasma acido
philumに由来するグルコース脱水素酵素を再生酵素とし
て組み合わせた場合には、両者の共発現によって、きわ
めて効率的に光学活性アルコールを生成させることがで
きる。植物由来の酵素と微生物由来の酵素の共発現によ
って、光学純度の高い（Ｒ）−３−キヌクリジノールを
高度に効率的に製造しうることはまったく予想されてい
なかった。
【０１０９】また本発明は、本発明によって製造された
光学純度の高い（Ｒ）−３−キヌクリジノールを結晶化
することが可能な製造方法を提供した。本発明によれ
ば、光学純度の高い（Ｒ）−３−キヌクリジノールを高
濃度で得ることができるため、結晶化には有利である。
しかも本発明者らは、水溶性が高いために通常は結晶化
が困難な（Ｒ）−３−キヌクリジノールを、特定の溶媒
の組み合わせによって容易に結晶化しうることを見出し
た。物質を高純度な結晶として得ることは、工業材料と
して用いるために必須である。
光学純度の高い（Ｒ）−３−キヌクリジノールを結晶化
することが可能な製造方法を提供した。本発明によれ
ば、光学純度の高い（Ｒ）−３−キヌクリジノールを高
濃度で得ることができるため、結晶化には有利である。
しかも本発明者らは、水溶性が高いために通常は結晶化
が困難な（Ｒ）−３−キヌクリジノールを、特定の溶媒
の組み合わせによって容易に結晶化しうることを見出し
た。物質を高純度な結晶として得ることは、工業材料と
して用いるために必須である。
【０１１０】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.
<120> Method for producing optically active alcohol.
<130> D1-A0110Y1
<140>
<141>
<150> JP 2001-375041
<151> 2001-12-07
<160> 10
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 822
<212> DNA
<213> Datura stramonium
<400> 1
atggaagaat caaaagtgtc catgatgaat tgcaacaatg aaggaagatg gagtctcaaa 60
ggcaccacag cccttgttac tggtggctct aaaggcattg ggtatgcaat agtggaagaa 120
ttggcaggtc ttggagcaag agtatataca tgttcacgta atgaaaaaga actggacgaa 180
tgccttgaaa tttggagaga aaaaggactt aatgttgaag gttctgtttg tgacttatta 240
tcacgtactg aacgtgataa gcttatgcag actgttgcac atgtatttga tggaaagctc 300
aatattttgg tgaataatgc cggggtggtg atacataagg aagctaaaga tttcacagaa 360
aaagattaca acataattat gggaactaat tttgaagcag cttatcattt atctcaaatt 420
gcttatccat tattgaaggc ttctcaaaat gggaatgtta tttttctctc ttctattgct 480
ggattttcag cactgccttc tgtttctctt tactcagctt ccaaaggtgc aataaatcaa 540
atgacaaaga gtttggcttg tgaatgggct aaagacaaca ttcgggtcaa ttcagttgct 600
ccgggagtca ttttaacccc actggttgaa actgcaatta agaaaaatcc tcatcaaaaa 660
gaagaaatag acaattttat tgtcaagact cctatgggcc gggccggaaa gccccaagaa 720
gtttctgcac taatagcttt tctttgcttc cctgctgctt catatattac gggccagatc 780
atatgggctg acggtggatt cacagctaat ggtgggtttt aa 822
<210> 2
<211> 273
<212> PRT
<213> Datura stramonium
<400> 2
Met Glu Glu Ser Lys Val Ser Met Met Asn Cys Asn Asn Glu Gly Arg
1 5 10 15
Trp Ser Leu Lys Gly Thr Thr Ala Leu Val Thr Gly Gly Ser Lys Gly
20 25 30
Ile Gly Tyr Ala Ile Val Glu Glu Leu Ala Gly Leu Gly Ala Arg Val
35 40 45
Tyr Thr Cys Ser Arg Asn Glu Lys Glu Leu Asp Glu Cys Leu Glu Ile
50 55 60
Trp Arg Glu Lys Gly Leu Asn Val Glu Gly Ser Val Cys Asp Leu Leu
65 70 75 80
Ser Arg Thr Glu Arg Asp Lys Leu Met Gln Thr Val Ala His Val Phe
85 90 95
Asp Gly Lys Leu Asn Ile Leu Val Asn Asn Ala Gly Val Val Ile His
100 105 110
Lys Glu Ala Lys Asp Phe Thr Glu Lys Asp Tyr Asn Ile Ile Met Gly
115 120 125
Thr Asn Phe Glu Ala Ala Tyr His Leu Ser Gln Ile Ala Tyr Pro Leu
130 135 140
Leu Lys Ala Ser Gln Asn Gly Asn Val Ile Phe Leu Ser Ser Ile Ala
145 150 155 160
Gly Phe Ser Ala Leu Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ser Ala Ser Lys Gly
165 170 175
Ala Ile Asn Gln Met Thr Lys Ser Leu Ala Cys Glu Trp Ala Lys Asp
180 185 190
Asn Ile Arg Val Asn Ser Val Ala Pro Gly Val Ile Leu Thr Pro Leu
195 200 205
Val Glu Thr Ala Ile Lys Lys Asn Pro His Gln Lys Glu Glu Ile Asp
210 215 220
Asn Phe Ile Val Lys Thr Pro Met Gly Arg Ala Gly Lys Pro Gln Glu
225 230 235 240
Val Ser Ala Leu Ile Ala Phe Leu Cys Phe Pro Ala Ala Ser Tyr Ile
245 250 255
Thr Gly Gln Ile Ile Trp Ala Asp Gly Gly Phe Thr Ala Asn Gly Gly
260 265 270
Phe
<210> 3
<211> 825
<212> DNA
<213> Hyoscyamus niger
<400> 3
atggccggag aatcagaagt ttacattaat ggcaacaatg gaggaattag atggagtctc 60
aaaggcacaa ctgcccttgt tactggtggc tctaaaggca ttgggtatgc agtagtggaa 120
gaactagcag gtcttggtgc aagagtatat acatgttcac gtaatgaaaa ggaactccaa 180
caatgccttg atatttggag aaatgaagga cttcaagttg aaggttctgt ttgtgattta 240
ttactgcgct ctgaacgtga caaacttatg cagactgttg cagatttatt taatggaaag 300
ctcaatattt tggtaaataa tgcaggtgtg gtgatacata aagaagctaa agatttcaca 360
aaagaagatt acgacatcgt attgggcact aattttgaag cagcttatca cttatgtcaa 420
cttgcttatc cctttttgaa ggcatctcaa aatggcaatg ttatttttct ttcttctata 480
gctggatttt cagcactgcc ttctgtttct ctttattctg cttccaaagc tgcaataaat 540
caaataacga agaacttggc atgtgaatgg gccaaggaca acattcgggt caattcagtt 600
gctccaggag tcattttaac cccactcatt gaaactgcaa ttaagaaaaa tcctcatcaa 660
aaagaagaaa tagacaattt tattgtcaag actccaatgg gccgggctgg aaagcccaat 720
gaagtgtctg cactaatagc ctttctttgc ttccctgctg cttcttatat tactggccaa 780
attatatggg ctgatggtgg attcacagct aatggtgggt tttga 825
<210> 4
<211> 274
<212> PRT
<213> Hyoscyamus niger
<400> 4
Met Ala Gly Glu Ser Glu Val Tyr Ile Asn Gly Asn Asn Gly Gly Ile
1 5 10 15
Arg Trp Ser Leu Lys Gly Thr Thr Ala Leu Val Thr Gly Gly Ser Lys
20 25 30
Gly Ile Gly Tyr Ala Val Val Glu Glu Leu Ala Gly Leu Gly Ala Arg
35 40 45
Val Tyr Thr Cys Ser Arg Asn Glu Lys Glu Leu Gln Gln Cys Leu Asp
50 55 60
Ile Trp Arg Asn Glu Gly Leu Gln Val Glu Gly Ser Val Cys Asp Leu
65 70 75 80
Leu Leu Arg Ser Glu Arg Asp Lys Leu Met Gln Thr Val Ala Asp Leu
85 90 95
Phe Asn Gly Lys Leu Asn Ile Leu Val Asn Asn Ala Gly Val Val Ile
100 105 110
His Lys Glu Ala Lys Asp Phe Thr Lys Glu Asp Tyr Asp Ile Val Leu
115 120 125
Gly Thr Asn Phe Glu Ala Ala Tyr His Leu Cys Gln Leu Ala Tyr Pro
130 135 140
Phe Leu Lys Ala Ser Gln Asn Gly Asn Val Ile Phe Leu Ser Ser Ile
145 150 155 160
Ala Gly Phe Ser Ala Leu Pro Ser Val Ser Leu Tyr Ser Ala Ser Lys
165 170 175
Ala Ala Ile Asn Gln Ile Thr Lys Asn Leu Ala Cys Glu Trp Ala Lys
180 185 190
Asp Asn Ile Arg Val Asn Ser Val Ala Pro Gly Val Ile Leu Thr Pro
195 200 205
Leu Ile Glu Thr Ala Ile Lys Lys Asn Pro His Gln Lys Glu Glu Ile
210 215 220
Asp Asn Phe Ile Val Lys Thr Pro Met Gly Arg Ala Gly Lys Pro Asn
225 230 235 240
Glu Val Ser Ala Leu Ile Ala Phe Leu Cys Phe Pro Ala Ala Ser Tyr
245 250 255
Ile Thr Gly Gln Ile Ile Trp Ala Asp Gly Gly Phe Thr Ala Asn Gly
260 265 270
Gly Phe
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:an artificially
synthesized primer sequence
<400> 5
ataccatgga agaatcaaaa gtg 23
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:an artificially
synthesized primer sequence
<400> 6
tggtctagat taaaacccac cattagctgt g 31
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:an artificially
synthesized primer sequence
<400> 7
ataccatggc cggagaatca 20
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:an artificially
synthesized primer sequence
<400> 8
acctctagat taaaacccac cattagctgt g 31
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:an artificially
synthesized primer sequence
<400> 9
caggaattca ataatgactg aacagaaagc cattg 35
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:an artificially
synthesized primer sequence
<400> 10
ctgactagta ttactgccac tttatcaccg tc 32
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【書類名】 受託番号変更届
【整理番号】 Ｄ１−Ａ０１１０Ｙ１
【提出日】 平成１４年６月２６日
【旧寄託機関の名称】 独立行政法人産業技術総合
研究所 特許生物寄託 センター
研究所 特許生物寄託 センター
【旧受託番号】 生命研菌寄第１８３９５号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１８３９ ５）、生命研菌寄第１８３９６号（ＦＥＲＭ Ｐ−１８
３９６）
（ＦＥＲＭ Ｐ−１８３９ ５）、生命研菌寄第１８３９６号（ＦＥＲＭ Ｐ−１８
３９６）
【新寄託機関の名称】 独立行政法人産業技術総合研
究所 特許生物寄託 センター
究所 特許生物寄託 センター
【新寄託番号】 生命研条寄第８０６１号（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−８０６１ ）、生命研条寄第８０６２号（ＦＥＲＭ ＢＰ−８０６
２）
ＥＲＭ ＢＰ−８０６１ ）、生命研条寄第８０６２号（ＦＥＲＭ ＢＰ−８０６
２）
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:125
(Ｃ１２Ｐ 17/18 1:01
Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
(Ｃ１２Ｐ 17/18
Ｃ１２Ｒ 1:125）
(Ｃ１２Ｐ 17/18
Ｃ１２Ｒ 1:01）
(72)発明者 潘 立瑞
新潟県新井市白山町２−５、３−５
(72)発明者 濱谷 武
新潟県新井市工団町２−７−202
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA08 CA04 DA06 EA04
GA11
4B064 AE56 BH01 CA21 CB18 CC03
CC24 CD12 DA06
4B065 AA26X AB01 BA02 CA18
CA28 CA44
4C064 AA06 CC01 DD01 EE05 FF01
GG01 HH07
Claims (24)
- 【請求項１】還元型補酵素の存在下、ケトンにトロピノ
ン還元酵素−Ｉ活性を有する酵素活性物質を作用させ、
不斉還元によって生成する光学活性アルコールを回収す
る工程を含む、光学活性アルコールの製造方法。 - 【請求項２】ケトンが３−キヌクリジノンであり、光学
活性アルコールが（Ｒ）−３−キヌクリジノールである
請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】酵素活性物質が、８０%ee以上の光学純度
の光学活性アルコールを生成するトロピノン還元酵素−
Ｉ活性を有する請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】酵素活性物質が、Datura属、またはHyoscy
amus属に属する植物に由来する請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】Datura属に属する植物が、Datura stramon
iumである請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】Hyoscyamus属に属する植物が、Hyoscyamus
nigerである請求項４に記載の方法。 - 【請求項７】酵素活性物質が、下記（ａ）から（ｄ）の
いずれかに記載の蛋白質である請求項１に記載の方法。 （ａ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミ
ノ酸配列を有する蛋白質、 （ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミ
ノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠
失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からな
り、３−キヌクリジノンを不斉還元し（Ｒ）−３−キヌ
クリジノールを生成する活性を有する蛋白質、 （ｃ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミ
ノ酸配列と85％以上の相同性を有するアミノ酸配列から
なり、３−キヌクリジノンを不斉還元し（Ｒ）−３−キ
ヌクリジノールを生成する活性を有する蛋白質、 （ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基
配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコ
ードされ、３−キヌクリジノンを不斉還元し（Ｒ）−３
−キヌクリジノールを生成する活性を有する蛋白質 - 【請求項８】酵素活性物質が、トロピノン還元酵素−Ｉ
をコードするＤＮＡを含むベクターにより形質転換され
た形質転換体、またはその処理物である請求項１に記載
の方法。 - 【請求項９】形質転換体が、下記（ａ）から（ｄ）のい
ずれかに記載のＤＮＡを含むベクターにより形質転換さ
れた形質転換体である請求項８に記載の方法。 （ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基
酸配列を有するＤＮＡ、 （ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミ
ノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠
失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からな
り、３−キヌクリジノンを不斉還元し（Ｒ）−３−キヌ
クリジノールを生成する活性を有する蛋白質をコードす
るＤＮＡ、 （ｃ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基
配列と85％以上の相同性を有する塩基配列からなり、３
−キヌクリジノンを不斉還元し（Ｒ）−３−キヌクリジ
ノールを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮ
Ａ、 （ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基
配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズし、３−キヌクリジノンを不斉還
元し（Ｒ）−３−キヌクリジノールを生成する活性を有
する蛋白質をコードするＤＮＡ - 【請求項１０】ベクターが、更に酸化型補酵素を還元型
補酵素に再生する酵素をコードするＤＮＡを共に含む請
求項８に記載の方法。 - 【請求項１１】酸化型補酵素を還元型補酵素に再生する
酵素が、グルコース脱水素酵素である請求項１０に記載
の方法。 - 【請求項１２】グルコース脱水素酵素がBacillus subti
lisまたはThermoplasma acidophilum由来である請求項
１１に記載の方法。 - 【請求項１３】不斉還元反応をpH６．５−８．５の範囲
内で行う、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１４】次の工程を含む、（Ｒ）−３−キヌクリ
ジノール塩酸塩の製造方法。（ａ）（Ｒ）−３−キヌク
リジノールを含む溶液のpHをアルカリ性としてフリー体
（Ｒ）−３−キヌクリジノールとする工程、（ｂ）フリ
ー体（Ｒ）−３−キヌクリジノールをｎ−ブタノールで
抽出する工程、（ｃ）抽出液に塩酸を添加する工程、
（ｄ）抽出液中の水分を除去する工程、および（ｅ）ｎ
−ブタノールより（Ｒ）−３−キヌクリジノール塩酸塩
を結晶化する工程 - 【請求項１５】次の工程を含む、（Ｒ）−３−キヌクリ
ジノールの製造方法。 （ａ）（Ｒ）−３−キヌクリジノール塩酸塩を溶媒Ａに
溶解する工程、ここで溶媒Ａは（Ｒ）−３−キヌクリジ
ノール塩酸塩を１％以上の濃度で溶解する溶媒である
（ｂ）（ａ）の溶液のpHをアルカリ性としてフリー体
（Ｒ）−３−キヌクリジノールとする工程、（ｃ）溶媒
Ｂを添加し、溶媒Ａを留去後、溶媒Ｂより（Ｒ）−３−
キヌクリジノールを結晶化する工程、ここで溶媒Ｂは溶
媒Ａとの混合物から溶媒Ａを蒸留により置換することが
できる溶媒であって、かつ溶媒Ａよりもフリー体（Ｒ）
−３−キヌクリジノールの溶解度が低く、そして溶媒Ｂ
からフリー体（Ｒ）−３−キヌクリジノールを結晶化す
ることが可能な溶媒である - 【請求項１６】溶媒Ｂが、トルエン、４−メチル−２−
ペンタノン、および酢酸ブチルで構成される群から選択
されたいずれかの溶媒である請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１７】溶媒Ａが水であり、溶媒Ｂがトルエンで
ある、請求項１５に記載の方法 - 【請求項１８】次の工程を含む、（Ｒ）−３−キヌクリ
ジノールの製造方法。（ａ）（Ｒ）−３−キヌクリジノ
ールを含む溶液のpHをアルカリ性としてフリー体（Ｒ）
−３−キヌクリジノールとする工程、（ｂ）フリー体
（Ｒ）−３−キヌクリジノールをｎ−ブタノールで抽出
する工程、および（ｃ）抽出液に溶媒Ｂを添加し、ｎ−
ブタノールを留去後、溶媒Ｂより（Ｒ）−３−キヌクリ
ジノールを結晶化する工程 - 【請求項１９】トロピノン還元酵素−ＩをコードするＤ
ＮＡ、および酸化型補酵素を還元型補酵素に再生する酵
素をコードするＤＮＡを発現可能に保持したベクター。 - 【請求項２０】トロピノン還元酵素−ＩをコードするＤ
ＮＡが、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮ
Ａである請求項１９に記載のベクター。 （ａ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基
酸配列を有するＤＮＡ、 （ｂ）配列番号：２、または配列番号：４に記載のアミ
ノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠
失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からな
り、３−キヌクリジノンを不斉還元し（Ｒ）−３−キヌ
クリジノールを生成する活性を有する蛋白質をコードす
るＤＮＡ、 （ｃ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基
配列と85％以上の相同性を有する塩基配列からなり、３
−キヌクリジノンを不斉還元し（Ｒ）−３−キヌクリジ
ノールを生成する活性を有する蛋白質をコードするＤＮ
Ａ、 （ｄ）配列番号：１、または配列番号：３に記載の塩基
配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズし、３−キヌクリジノンを不斉還
元し（Ｒ）−３−キヌクリジノールを生成する活性を有
する蛋白質をコードするＤＮＡ - 【請求項２１】酸化型補酵素を還元型補酵素に再生する
酵素が、グルコース脱水素酵素である請求項１９に記載
のベクター。 - 【請求項２２】グルコース脱水素酵素が、Bacillus sub
tilisまたはThermoplasma acidophilum由来である請求
項２１に記載のベクター - 【請求項２３】請求項１９に記載のベクターを発現可能
に保持した形質転換体。 - 【請求項２４】宿主が大腸菌である請求項２３に記載の
形質転換体。
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