JP4294382B2 - （２ｓ，３ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素 - Google Patents
（２ｓ，３ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4294382B2 JP4294382B2 JP2003162872A JP2003162872A JP4294382B2 JP 4294382 B2 JP4294382 B2 JP 4294382B2 JP 2003162872 A JP2003162872 A JP 2003162872A JP 2003162872 A JP2003162872 A JP 2003162872A JP 4294382 B2 JP4294382 B2 JP 4294382B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- butanediol
- dehydrogenase
- protein
- enzyme
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/16—Butanols
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド依存性の新規な（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素に関する。また本発明は、該酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド、該酵素の製造方法、該酵素を用いた光学活性アルコール、特に（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール、（Ｓ）−２−ブタノールを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、微生物によるグルコースを原料とした（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールの発酵生産において、また、微生物における２，３−ブタンジオール代謝において重要な役割を有する酵素である。またこの酵素反応によって生成する（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールは、液晶、医薬品などの合成原料として有用な化合物である。また、酵素反応によって生成する（Ｓ）−２−ブタノールは、香料、医薬品などの合成原料として有用な化合物である。
【０００３】
なお、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素とは、２，３−ブタンジオールの３種類の異性体のうち（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールを優先的に酸化する活性を有する脱水素酵素である。
【０００４】
従来、２，３−ブタンジオール脱水素活性を有する酵素に関しては、２，３−ブタンジオールの生合成、代謝に関する研究によって、たとえば以下のような微生物において（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールに対する脱水素酵素活性が報告されている(文献１／Arch. Microbiol. 116, 197-203 ,1978、J. Ferment. Technol. 61, 467-471 ,1983)。しかし、いずれも無細胞抽出液を用いた活性測定のみであり、様々な酵素が混在しているために、２，３−ブタンジオール脱水素酵素の立体選択性、比活性などの諸性質は明らかにされていない。
【０００５】
セラチア・マルセッセンス （Serratia marcescens）、
スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、
エンテロバクター・アエロゲネス （Enterobacter aerogenes）、
エルビニア・キャロトボラ （Erwinia carotovora）、
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum C-1012）、
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス （Brevibacterium ammoniagenes IAM 1641）
【０００６】
高度に精製され、諸性質が明らかにされた酵素としては、以下に示すような酵素が２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性を有することが示されている。しかし、ＤＬ体に対する活性のみでその立体選択性は報告されていない。また、ピキア・オフナエンシスを除き、２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性は、グリセロール脱水素酵素活性と同レベルかそれ以下の活性しか有せず、その比活性は一般に低い。
【０００７】
アクロモバクター・リキダム（Achromobacter liquidum KY 3047）由来のグリセロール脱水素酵素（特許文献１／特公昭 58-40467）、
バチルス・エスピー（Bacillus sp. G-1）由来のグリセロール脱水素酵素（特許文献２／特公平 03-72272）、
バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のグリセロール脱水素酵素（文献２／Biochim. Biophys. Acta 994, 270-279 (1989)）、
シトロバクター・フロインディー（Citrobacter freundii DSM 30040）由来のグリセロール脱水素酵素（文献３／J. Bacteriol. 177, 4392-4401 (1995)）、
エルビニア・アロイデア（Erwinia aroideae IFO 3830）由来のグリセロール脱水素酵素（文献４／Chem. Pharm. Bull. 26, 716-721 (1978)）、
ジオトリカム・キャンディダム（Geotrichum candidum IFO 4597）由来のグリセロール脱水素酵素（特許文献３／特公平 01-27715）、
ピキア・オフナエンシス（Pichia ofunaensis AKU 4328）由来のジヒドロキシアセトン還元酵素（文献５／J. Biosci. Bioeng. 88, 148-152 (1999)）、
シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のグリセロール脱水素酵素（文献６／J. Gen. Microbiol. 131, 1581-1588 (1985)）
【０００８】
高度に精製され、かつ、２，３−ブタンジオールの（２Ｓ，３Ｓ）体に対する高い選択性が明らかにされている酵素としては、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum C-1012）の生産するL-2,3-ブタンジオール脱水素酵素（文献７／Biosci. Biotechnol. Biochem., 65, 1876-1878, (2001)）が公知であるが、２−ブタノールに関して活性が無く、光学活性２級アルコールの選択性についての報告がなされていない（文献７／Biosci. Biotechnol. Biochem., 65 (8), 1876-1878, 2001）。
【０００９】
更に、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）より２，３−ブタンジオール代謝に関与する２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードする遺伝子がクローニングされ、大腸菌で発現されている（文献８／FEMS Microbiol. Lett. 124 (2), 141-150 (1994)）が、その立体選択性は報告されていない。また、シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）のゲノム解析の結果、シュードモナス・プチダ由来の２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子に高いホモロジーを有する遺伝子が同定されているが、実際に、この遺伝子を発現させ、その酵素活性、立体選択性などは確認されていない。
【００１０】
（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール、（Ｓ）−２−ブタノールなどの光学活性アルコールの生産に有用な、立体選択性が高く、比活性の高い（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の探索、特に、該酵素を容易に大量生産を可能にするため、該酵素をコードする遺伝子の単離、該酵素を発現可能な形質転換体の調製は、産業上重要な課題となっている。
【００１１】
【文献１】
Arch. Microbiol. 116, 197-203 ,1978、J. Ferment. Technol. 61, 467-471 ,1983)
【文献２】
Biochim. Biophys. Acta 994, 270-279 (1989)
【文献３】
J. Bacteriol. 177, 4392-4401 (1995)
【文献４】
Chem. Pharm. Bull. 26, 716-721 (1978)
【文献５】
J. Biosci. Bioeng. 88, 148-152 (1999)
【文献６】
J. Gen. Microbiol. 131, 1581-1588 (1985)
【文献７】
Biosci. Biotechnol. Biochem., 65, 1876-1878, (2001)
【文献８】
FEMS Microbiol. Lett. 124 (2), 141-150 (1994)
【特許文献１】
特公昭 58-40467
【特許文献２】
特公平 03-72272
【特許文献３】
特公平 01-27715
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＮＡＤ＋を補酵素として利用しうる（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の提供を課題とする。また本発明は、２，３−ブタンジオンを基質とする光学活性（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールの酵素的な製造工程に利用した場合に、光学的純度の高い生成物を収率良く与えることができる（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を提供することも課題としている。また、２−ブタノンを基質とする光学活性（Ｓ）−２−ブタノールの酵素的な製造工程に利用した場合に、光学的純度の高い生成物を収率良く与えることができる（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を提供することも課題としている。
【００１３】
更に本発明は、目的とする性状を備えた（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするＤＮＡを単離し、組換え体として得ることを課題とする。加えて、新規な（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素による光学活性（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール、（Ｓ）−２−ブタノールの酵素的な製造方法の提供をも課題とするものである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ツーグレア・ラミゲラに関する研究を進めてきた。２，３−ブタンジオールの（Ｓ）配置の水酸基に対して高い活性と高い選択性を併せ持つ、新規な（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を見出した。
更に、本酵素をコードするＤＮＡを単離し、本酵素を高発現する組換え菌を造成し、本発明を完成した。
【００１５】
すなわち本発明は、以下の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素、この酵素をコードするＤＮＡ、この酵素の製造方法、および用途に関する。
〔１〕次の（１）から（３）に示す理化学的性質を有する（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素。
（１）作用
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールに作用し、（Ｓ）−アセトインを生成する。還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、２，３−ブタンジオンを還元し、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールを生成する。
（２）基質特異性
酸化反応の補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを利用する。還元反応の補酵素として還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを利用する。また、２，３−ブタンジオールの３種類の異性体のうち（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールを優先的に酸化する。
（３）２価イオンによる活性化
Ｍｇ２＋イオン、Ｃａ２＋イオン、Ｂａ２＋イオン、Ｃｏ２＋イオン、Ｍｎ２＋イオンによって実質的に活性化されない。
〔２〕更に付加的に、次の（４）に示す理化学的性質を有する〔１〕に記載の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素。
（４）基質特異性
i) ２-ブタノールの（Ｓ）配置の水酸基を優先的に酸化する。
ii) １，２−プロパンジオールの（Ｓ）配置の水酸基を優先的に酸化する。
〔３〕ツーグレア（Ｚｏｏｇｌｏｅａ）属に属する微生物によって産生される〔１〕に記載の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素。
〔４〕ツーグレア属に属する微生物が、ツーグレア・ラミゲラ (Zoogloea ramigera)である〔３〕に記載の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素。
〔５〕下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｅ）配列番号：１に記載の塩基配列と７０%以上の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド。
〔６〕〔５〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。
〔７〕〔５〕に記載されたポリヌクレオチドを含むベクター。
〔８〕〔５〕に記載されたポリヌクレオチド、または〔７〕に記載のベクターを保持する形質転換体。
〔９〕ツーグレア属に属し、〔１〕に記載の酵素、または〔６〕に記載のタンパク質を産生する微生物を培養する工程を含む、〔１〕に記載の酵素、または〔６〕に記載のタンパク質の製造方法。
〔１０〕ツーグレア属に属する微生物が、ツーグレア・ラミゲラ(Zoogloea ramigera)である〔９〕に記載の製造方法。
〔１１〕〔８〕に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、〔１〕もしくは〔６〕に記載の蛋白質の製造方法。
〔１２〕〔１〕に記載の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素、〔６〕に記載のタンパク質、それらを産生する微生物、およびそれらの処理物からなる群から選択されるいずれかの酵素活性物質を、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下でケトンに作用させ、生成するアルコールを回収する工程を含むアルコールの製造方法。
〔１３〕ケトンが、２，３−ブタンジオンであり、アルコールが（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールである〔１２〕に記載のアルコールの製造方法。
〔１４〕〔１〕に記載の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素、〔６〕に記載のタンパク質、それらを産生する微生物、およびそれらの処理物からなる群から選択されるいずれかの酵素活性物質を、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下で、ラセミ体アルコールに作用させ、光学異性体の一方を優先的に酸化し、残存する光学活性アルコールを取得することを特徴とする、光学活性アルコールの製造方法。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明による（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、補酵素としてＮＡＤ＋を利用しうること、２，３−ブタンジオールの（Ｓ）配置の水酸基を優先的に酸化すること、また、ＮＡＤＨを補酵素として２，３−ブタンジオンを還元し、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールを生成することによって特徴付けられる。
【００１７】
本発明において、酵素の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールに対する酸化活性、および、２，３−ブタンジオンに対する還元活性は、次のようにして確認することができる。
【００１８】
（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールに対する酸化活性測定法:
５０mM グリシン-水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１．０）、２．５mM ＮＡＤ＋、５０mM （２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール及び酵素を合む反応液中30℃で反応させ、ＮＡＤＨの増加にともなう３４０nmの吸光度の増加を測定する。１Uは、１分間に１μmolのＮＡＤＨの増加を触媒する酵素量とする。
【００１９】
２，３−ブタンジオンに対する還元活性測定法:
５０mM リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５）、０．２mM ＮＡＤＨ、２０mM ２，３−ブタンジオン及び酵素を合む反応液中30℃で反応させ、ＮＡＤＨの減少にともなう３４０nmの吸光度の減少を測定する。１Uは、１分間に１μmolのＮＡＤＨの減少を触媒する酵素量とする。タンパク質の定量は、バイオラッド製タンパク質アッセイキットを用いた色素結合法により行うことができる。
２価のイオンによる活性化効果は、上記の反応液中に１mMの金属イオンを添加し、上記の方法で活性を測定する。ここで、酵素活性が実質的に活性化されないとは、金属イオンを添加しない時の活性を１００とした時、金属イオンを加えた際の相対活性が１２０を超えない場合をいう。
【００２０】
また、本発明において（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素が２，３−ブタンジオールの（２Ｓ，３Ｓ）配置の水酸基を「優先的」に酸化するとは、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の、（２Ｓ，３Ｓ）配置の２，３−ブタンジオールに対する酵素活性を１００としたとき、（２R、３Ｒ）配置の２，３−ブタンジオールとメソ配置の２，３−ブタンジオールに対する酵素活性が２０以下、好ましくは１０以下、更に好ましくは５以下である場合を言う。
また、本発明において（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素が２−ブタノールの（Ｓ）配置の水酸基を「優先的」に酸化するとは、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の、（Ｓ）配置の２−ブタノールに対する酵素活性を１００としたとき、（R）配置の２−ブタノールに対する酵素活性が２０以下、好ましくは１０以下、更に好ましくは５以下である場合を言う。また、本発明において（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素が１，２−ブタンジオールの（Ｓ）配置の水酸基を「優先的」に酸化するとは、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の、（Ｓ）配置の１，２−ブタンジオールに対する酵素活性を１００としたとき、（R）配置の１，２−ブタンジオールに対する酵素活性が２０以下、好ましくは１０以下、更に好ましくは５以下である場合を言う。
【００２１】
上記のような理化学的性状を持つ（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、たとえばツーグレア属細菌の培養物より精製することができる。ツーグレア属細菌としては、ツーグレア・ラミゲラ(Zoogloea ramigera)が特に本発明による（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の産生能に優れる。本発明の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を得るために利用することができるツーグレア・ラミゲラは、たとえば、DSM 287としてDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHより入手することができる。
【００２２】
上記微生物は、ＹＰＤ（１％酵母エキス、１％ペプトン、２％グルコースを含むｐＨ６．０の培地）培地等の真菌の培養に用いられる一般的な培地で培養することができる。本発明の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を生産するには、ＹＰＤ培地のグルコースをメタノールもしくはグリセロールに変えた培地でも培養可能である。
【００２３】
得られた菌体を、2-メルカプトエタノール(2-mercaptoethanol)等の還元剤や、フェニルメタンスルホニルフルオリド(phenylmethansulfonyl fluoride;PMFS)やエチレンジアミン４酢酸（以下、ＥＤＴＡと略す）、プロテアーゼ阻害剤を加えた緩衝液中でガラスビーズとの物理的な衝撃やミニラボ、フレンチプレスなどの高圧を利用するなどして破砕し、無細胞抽出液を得る。無細胞抽出液から、蛋白質の溶解度による分画（アセトンやジメチルスルホキシドなどの有機溶媒による沈澱や硫安などによる塩析など）や、陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィーや、キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより本発明の酵素を精製する事ができる。例えば、無細胞抽出液をブルー−セファロース、フェニル−セファロース、Mono-Q（いずれもファルマシア製）、ヒドロキシアパタイト（株式会社高研製）などのカラムクロマトグラフィーを組み合わせることにより、電気泳動的にほぼ単一バンドにまで精製することができる。
【００２４】
ツーグレア・ラミゲラに由来する本発明の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は以下の（１）−（３）の理化学的性質を有する蛋白質である。
（１）作用
ＮＡＤ＋を補酵素として、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールに作用し、（Ｓ）−アセトインを生成する。ＮＡＤＨを補酵素として、２，３−ブタンジオンを還元し、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールを生成する。
（２）基質特異性
酸化反応の補酵素としてＮＡＤ＋を、また還元反応の補酵素としてＮＡＤＨを利用する。また、２，３−ブタンジオールの３種類の異性体のうち、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３ブタンジオールを優先的に優先的に酸化する。
（３）２価イオンによる活性化
Ｍｇ２＋イオン、Ｃａ２＋イオン、Ｂａ２＋イオン、Ｃｏ２＋イオン、Ｍｎ２ ＋イオンによって実質的に活性化されない。
（４）基質特異性
２−ブタノールの（Ｓ）配置の水酸基を優先的に酸化する。
（５）基質特異性
１，２−プロパンジオールの（Ｓ）配置の水酸基を優先的に酸化する。
更に本発明の酵素は、以下の性状（６）−（８）によって特徴付けることができる。
（６）至適ｐＨ
（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール酸化反応の至適ｐＨが１１．０。
（７）分子量
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（以下SDS-PAGEと省略する）によるサブユニットの分子量が２７，０００。
（８）作用適温
至適温度は４５℃である。
【００２５】
ツーグレア・ラミゲラに由来する（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、補酵素として酸化反応におけるＮＡＤＰ＋、あるいは還元反応におけるＮＡＤＰＨを実質的に利用することができない。しかし、ＮＡＤＰ＋やＮＡＤＰの利用性に関わらず、前記物理学化学的性状（１）−（３）、望ましくは（１）−（５）、あるいは更に望ましくは（１）−（８）を備えた酵素は、本発明に含まれる。
【００２６】
本発明は、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドおよびそのホモログに関する。本発明において、ポリヌクレオチドは、DNAやRNA等の天然のポリヌクレオチドに加え、人工的なヌクレオチド誘導体を含む人工的な分子であることもできる。また本発明のポリヌクレオチドは、DNA-RNAのキメラ分子であることもできる。本発明の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドは、たとえば配列番号：１に示す塩基配列を含む。配列番号：１に示す塩基配列は、配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしており、このアミノ酸配列を含むタンパク質は、本発明による（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の好ましい態様を構成する。
【００２７】
本発明の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドのホモログとは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、前記理化学的性質（１）−（３）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。当業者であれば、配列番号：１記載のポリヌクレオチドに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982) , Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991) などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することによりポリヌクレオチドのホモログを得ることが可能である。
変異
【００２８】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、たとえば１００以下、通常５０以下、好ましくは３０以下、より好ましくは１５以下、更に好ましくは１０以下、あるいは５以下のアミノ酸残基の変異は許容される。本発明のホモログにおけるアミノ酸残基の変異は、保存的置換であることが望ましい。一般に蛋白質の機能の維持のためには、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸であることが好ましい。このようなアミノ酸残基の置換は、保存的置換と呼ばれている。
【００２９】
例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trpは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性としては、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glnが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、AspおよびGluが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Lys、Arg、Hisが挙げられる。
【００３０】
また、本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは、配列番号：１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドであって、かつ、前記理化学的性質（１）−（３）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含む。ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号：１に記載中の任意の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、たとえば４０、６０または１００個の連続した配列を一つまたは複数選択したＤＮＡをプローブＤＮＡとし、たとえばECL direct nucleic acid labeling and detection system (Amersham Pharmaica Biotech社製)を用いて、マニュアルに記載の条件（wash：42℃、0.5x SSCを含むprimary wash buffer）において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。
ハイブリダイゼーションは、ニトロセルロース膜またはナイロン膜などを用いて慣用の方法にて実施することができる（Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories; Ausubel, F.M. et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishe Associates/ John Wiley and Sons, New York. NY）。
【００３１】
上記のストリンジェントな条件を更に具体的に例示すれば、例えば6×SSC、0.5%(W/V) SDS、100μg/ml 変性サケ精子DNA、5×デンハルト溶液（１×デンハルト溶液は0.2%ポリビニールピロリドン、0.2%牛血清アルブミン、および0.2%フィコールを含む）を含む溶液中、45℃、好ましくは55℃、より好ましくは60℃、さらに好ましくは65℃で一晩ハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて、4×SSC、0.5% SDS、20分を３回の洗浄を行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 4×SSC、0.5% SDS、20分を2回、2×SSC、0.5% SDS、20分を1回の洗浄を行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 4×SSC、0.5% SDS、20分を2回、続いて 1×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 2×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 1×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 0.5×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 2×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 1×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 0.5×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 0.1×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。
【００３２】
さらに、本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%または９０%、より好ましくは９５%以上のホモロジーを有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。タンパク質のホモロジー検索は、たとえばDAD, SWISS-PROT, PIRなどの蛋白質のアミノ酸配列に関するデータベースや DDBJ、EMBL、あるいはGene-BankなどのＤＮＡ配列に関するデータベース、ＤＮＡ配列を元にした予想酸配列に関するデータベースなどを対象に、BLAST, FASTAなどのプログラムを利用して、例えば、インターネット通じて行うことができる。
【００３３】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列を用いてDADを対象にBLASTプログラムを用いてホモロジー検索を行った結果、既知のタンパク質の中でもっとも高いホモロジーを示したのは、クレブジラ・ニューモニアエ（Klebsiella pneumoniae）のアセトイン還元酵素であった。このアセトイン還元酵素はmeso-ブタンジオールのみに特異的に作用し、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３-ブタンジオールには作用しないことが知られている(J. Ferment. Technol. 83, 32-37 ,1997)。このアセトイン還元酵素に対するホモロジーはIdentityで５６％、Positiveで６７％であった。本発明の７０％以上のホモロジーとは、例えば、BLASTプログラムを用いたIdentityの相同性の値を表す。
【００３４】
本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質に関する。本発明はまた、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質のホモログを含む。
【００３５】
本発明の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のホモログとは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を意味する。本発明において、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等とは、当該タンパク質が前記（１）−（３）に示した物理化学的性状を有することを意味する。当業者であれば、配列番号：１記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982) , Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991) ）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。その（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドを宿主に導入して発現させることにより、配列番号：２に記載の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のホモログを得ることが可能である。
【００３６】
さらに、本発明の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のホモログとは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%または９０%、より好ましくは９５%以上のホモロジーを有するタンパク質をいう。タンパク質のホモロジー検索は、たとえばDAD,SWISS-PROT, PIRなどの蛋白質のアミノ酸配列に関するデータベースやDDBJ、EMBL、あるいはGene-BankなどのＤＮＡ配列に関するデータベース、ＤＮＡ配列を元にした予想酸配列に関するデータベースなどを対象に、BLAST、FASTAなどのプログラムを利用して、例えば、インターネット通じて行うことができる。
【００３７】
本発明の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドは、たとえば、以下のような方法によって単離することができる。
【００３８】
配列番号：１に記載の塩基配列を元にＰＣＲ用のプライマーを設計し、酵素生産株の染色体ＤＮＡもしくは、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うことにより本発明のＤＮＡを得ることができる。
【００３９】
さらに、得られたＤＮＡ断片をプローブとして、酵素生産株の染色体ＤＮＡの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを利用して、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどにより、本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。
【００４０】
また、ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、得られた配列から、既知のＤＮＡの外側に伸長させるためのＰＣＲプライマーを設計し、酵素生産株の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、自己環化反応によりＤＮＡを鋳型として逆ＰＣＲを行うことにより（Genetics 120, 621-623 (1988)）、また、ＲＡＣＥ法（Rapid Amplification of cDNA End、「ＰＣＲ実験マニュアル」p25-33, ＨＢＪ出版局）などにより本発明のポリヌクレオチドを得ることも可能である。
【００４１】
なお本発明のポリヌクレオチドには、以上のような方法によってクローニングされたゲノムＤＮＡ、あるいはｃＤＮＡの他、合成によって得られたＤＮＡが含まれる。
【００４２】
このようにして単離された、本発明による（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドを公知の発現ベクターに挿入することにより、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素発現ベクターが提供される。
【００４３】
また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、本発明の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を組み換え体から得ることができる。
【００４４】
本発明においてＮＡＤ＋を電子受容体とする（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、ＮＡＤ＋を電子受容体とする（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換され、ＮＡＤ＋を電子受容体とする（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。利用可能な微生物としては、たとえば以下のような微生物を示すことができる。
エシェリヒア(Escherichia)属
バチルス(Bacillus)属
シュードモナス(Pseudomonas)属
セラチア(Serratia)属
ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属
コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属
ストレプトコッカス(Streptococcus)属
ラクトバチルス(Lactobacillus)属など宿主ベクター系の開発されている細菌
ロドコッカス(Rhodococcus)属
ストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌
サッカロマイセス(Saccharomyces)属
クライベロマイセス(Kluyveromyces)属
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属
チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属
ヤロウイア(Yarrowia)属
トリコスポロン(Trichosporon)属
ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属
ピキア(Pichia)属
キャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母
ノイロスポラ(Neurospora)属
アスペルギルス(Aspergillus)属
セファロスポリウム(Cephalosporium)属
トリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ
【００４５】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories)。微生物中などにおいて、本発明のＮＡＤＨを電子供与体とする（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子を発現させるためには、まず微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中にこのＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。
【００４６】
そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の5'-側上流に、より好ましくはターミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる必要がある。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−などに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8, 423-488 (1992)、などに詳細に記述されている。
【００４７】
例えばエシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミドベクターとして、pBR、pUC系プラスミドを利用でき、lac(β−ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペロン)、tac、 trc (lac、trpの融合)、λファージ PＬ、PＲなどに由来するプロモーターなどが利用できる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどを用いることができる。これらの中で、市販のｐＳＥ４２０（Invitrogen製）のマルチクローニングサイトを一部改変したベクターｐＳＥ４２０Ｄ（特開2000-189170に記載）が好適に利用できる。
【００４８】
バチルス属においては、ベクターとしてpUB110系プラスミド、pC194系プラスミドなどが利用可能であり、染色体にインテグレートすることもできる。また、プロモーター、ターミネーターとしてapr(アルカリプロテアーゼ)、npr(中性プロテアーゼ)、amy(α−アミラーゼ)などが利用できる。
【００４９】
シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)などで宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター(RSF1010などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）pKT240などが利用可能であり、プロモーター、ターミネーターとして、リパーゼ（特開平5-284973）遺伝子などが利用できる。
【００５０】
ブレビバクテリウム属特に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)においては、pAJ43(Gene 39, 281 (1985))などのプラスミドベクターが利用可能である。プロモーター、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。
【００５１】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)においては、pCS11(特開昭57-183799)、pCB101(Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984)などのプラスミドベクターが利用可能である。
【００５２】
ストレプトコッカス(Streptococcus)属においては、pHV1301(FEMS Microbiol. Lett. 26, 239 (1985)、pGK1（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (1985)）などがプラスミドベクターとして利用可能である。
【００５３】
ラクトバチルス(Lactobacillus)属においては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1（J. Bacteriol. 137, 614 (1979)）などが利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。
【００５４】
ロドコッカス(Rhodococcus)属においては、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)から単離されたプラスミドベクターが使用可能である (J. Gen. Microbiol. 138,1003 (1992) )。
【００５５】
ストレプトマイセス(Streptomyces)属においては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories (1985)に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)においては、pIJ486 (Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986)、pKC1064(Gene 103,97-99 (1991) )、pUWL-KS (Gene 165,149-150 (1995) )が使用できる。また、ストレプトマイセス・バージニア(Streptomyces virginiae)においても、同様のプラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11, 46-53 (1997) ）。
【００５６】
サッカロマイセス(Saccharomyces)属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae)においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミドが利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームＤＮＡとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター（EP 537456など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ADH(アルコール脱水素酵素)、GAPDH(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素)、PHO(酸性フォスファターゼ)、GAL(β−ガラクトシダーゼ)、PGK(ホスホグリセレートキナーゼ)、ENO(エノラーゼ)などのプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００５７】
クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラスミド、pKD1系プラスミド（J. Bacteriol. 145, 382-390 (1981)）、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS系プラスミド、リボソームＤＮＡなどとの相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（EP 537456など）などが利用可能である。また、ADH、PGKなどに由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００５８】
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のARS (自律複製に関与する遺伝子)及びサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクターが利用可能である（Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986)）。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用できる（EMBO J. 6, 729 (1987)）。特に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００５９】
チゴサッカロマイセス属(Zygosaccharomyces)においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ(Zygosaccharomyces rouxii)由来のpSB3（Nucleic Acids Res. 13, 4267 (1985)）などに由来するプラスミドベクターが利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来 PHO5 プロモーターや、チゴサッカロマイセス・ロウキシ由来 GAP-Zr(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素)のプロモーター（Agri. Biol. Chem. 54, 2521 (1990)）などが利用可能である。
【００６０】
ピキア(Pichia)属においては、ピキア・アンガスタ（旧名：ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)）において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律複製に関与する遺伝子（HARS1、HARS2）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である（Yeast 7, 431-443 (1991)）。また、メタノールなどで誘導されるAOX（アルコールオキシダーゼ)、FDH(ギ酸脱水素酵素)のプロモーターなどが利用可能である。また、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子 (PARS1、 PARS2)などを利用した宿主ベクター系が開発されており（Mol. Cell. Biol. 5, 3376 (1985)）、高濃度培養とメタノールで誘導可能なAOXなど強いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids Res. 15, 3859 (1987)）。
【００６１】
キャンディダ(Candida)属においては、キャンディダ・マルトーサ(Candida maltosa)、キャンディダ・アルビカンス(Candida albicans)、キャンディダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、キャンディダ・ウチルス(Candida utilis)などにおいて宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ＡＲＳがクローニングされ（Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587 (1987)）、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターは強力なプロモーターが開発されている（特開平 08-173170）。
【００６２】
アスペルギルス(Aspergillus)属においては、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 、アスペルギルス・オリジー (Aspergillus oryzae) などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989)）。
【００６３】
トリコデルマ(Trichoderma)属においては、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーターなどが利用できる（Biotechnology 7, 596-603 (1989)）。
【００６４】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Nature 315, 592-594 (1985)）や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。
【００６５】
本発明において使用する（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素生産能を有する微生物は、ＮＡＤ＋依存性（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素生産能を有するツーグレア属に属するすべての菌株、突然変異株、変種、遺伝子操作技術の利用により作成された本発明の酵素生産能を獲得した形質転換株を含む。
【００６６】
本発明は、前記（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のケトンの還元によるアルコール、特に（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールの製造用途に関する。酵素分子、その処理物、酵素分子を含む培養物、あるいは酵素を生成する微生物等の形質転換体が生きた状態で反応溶液と接触させることにより、目的とする酵素反応を行わせることができる。なお、酵素と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定されるものではない。
【００６７】
反応溶液は、基質や酵素反応に必要な補酵素であるＮＡＤＨを酵素活性の発現に望ましい環境を与える適当な溶媒に溶解したものである。本発明における（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を含む微生物の処理物には、具体的には界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどが含まれる。
【００６８】
本発明によるアルコールの製造方法におけるケトンとしては、例えば、下記の一般式Iまたは一般式IIで表されるケトンを示すことができる。これらのケトンに本発明の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を作用させることにより、ケト基が立体選択的に還元され、光学活性アルコールが生成される。
【化１】
【化２】
【００６９】
一般式Iまたは一般式IIにおいて、Xは水素原子、ハロゲン原子又は水酸基を示表し、R1は水素原子、置換基を有してもよいC1〜C6の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、置換基を有してもよいC1〜C6の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または置換基を有してもよいC1〜C6の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を示し、R2は水素原子、カルボニル基、水酸基、置換基を有してもよいC1〜C6の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、置換基を有してもよいC1〜C6の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または置換基を有してもよいC1〜C6の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を示している。また、R1とR2は結合して環を形成してもよい。
【００７０】
より具体的には、本発明によるアルコールの製造方法におけるケトンとしては、２，３−ブタンジオン、２，３−ペンタンジオン、アセトイン、２−ブタノンが挙げられる。これらの化合物を基質として用いることにより、それぞれ、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ペンタンジオール、（Ｓ）−１，２−プロパンジオール、（Ｓ）−２−ブタノールを合成することができる。
【００７１】
本発明は、前記（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素によるアルコールの酸化反応によるケトンの製造用途に関する。酵素分子、その処理物、酵素分子を含む培養物、あるいは酵素を生成する微生物等の形質転換体が生きた状態で反応溶液と接触させることにより、目的とする酵素反応を行わせることができる。なお、酵素と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定されるものではない。
【００７２】
反応溶液は、基質や酵素反応に必要な補酵素であるＮＡＤ＋を酵素活性の発現に望ましい環境を与える適当な溶媒に溶解したものである。本発明における（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を含む微生物の処理物には、具体的には界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどが含まれる。
【００７３】
本発明によるケトンの製造方法におけるアルコールとしては、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールが挙げられ、（Ｓ）−アセトインを合成することができる。
【００７４】
本発明は、更に、前記（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を用いてラセミ体アルコールを基質として、不斉酸化能を利用した光学活性アルコールの生産にも利用できる。すなわち、本発明の酵素によって、光学異性体の一方を優先的に酸化し、残存する光学活性アルコールを取得することにより、光学活性アルコールが生産される。より具体的には、ラセミ２−ブタノールまたはラセミ１、２−プロパンジオールの (S)体と(R)体とが混在するラセミ体に、本発明による（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をNAD＋共存下で作用させるのである。
立体選択性に優れる本発明による（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、（Ｓ）体に対して特異的に作用し、これを酸化してケトンとするが、（Ｒ）体のアルコールには作用しないので、やがて（Ｒ）体の割合が大きくなってくる。こうして蓄積する（Ｒ）体を分離すれば、最終的にラセミ体から（Ｒ）体のアルコールを回収することができる。このようにしてラセミ２−ブタノールまたはラセミ１、２−プロパンジオールからそれぞれ、（Ｒ）−２−ブタノール、（Ｒ）−１，２−プロパンジオールを得ることができる。
【００７５】
なお本発明における「光学活性アルコール」とは、ある光学異性体が別の光学異性体より多く含まれるアルコール、もしくはある光学異性体のみからなるアルコールを意味する。さらに、本発明の「光学異性体」は、一般的に「光学活性体」および「鏡像異性体」と呼ばれる場合もある。
【００７６】
上記還元反応に付随してＮＡＤＨから生成するＮＡＤ＋の、ＮＡＤＨへの再生は、微生物の持つＮＡＤ＋還元能（解糖系、メチロトローフのＣ１化合物資化経路など）を用いて行うことができる。これらＮＡＤ＋還元能は、反応系にグルコースやエタノール、ギ酸などを添加することにより増強することが可能である。また、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを生成する能力を有する微生物やその処理物、酵素を反応系に添加することによっても行うことができる。たとえば、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などを含む微生物、その処理物、ならびに部分精製もしくは精製酵素を用いてＮＡＤＨの再生を行うことができる。これらのＮＡＤＨ再生に必要な反応を構成する成分は、本発明によるアルコールの製造のための反応系に添加する、固定化したものを添加する、あるいはＮＡＤＨの交換が可能な膜を介して接触させることができる。
【００７７】
また、本発明のＤＮＡを含む組み換えベクターで形質転換した微生物の生菌体を前記アルコールの製造方法に利用する場合には、ＮＡＤＨ再生のための付加的な反応系を不要とできる場合がある。すなわち、ＮＡＤＨ再生活性の高い微生物を用いることにより、形質転換体を用いた還元反応において、ＮＡＤＨ再生用の酵素を添加することなく効率的な反応が行える。さらに、ＮＡＤＨ再生に利用可能なグルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などの遺伝子を、本発明のＮＡＤＨ依存性（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするＤＮＡと同時に宿主に導入することによって、より効率的なＮＡＤＨ再生酵素とＮＡＤ＋依存性（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の発現、還元反応を行うことも可能である。
これらの２つもしくはそれ以上の遺伝子の宿主への導入には、不和合性を避けるために複製起源のことなる複数のベクターに別々に遺伝子を導入した組み換えベクターにより宿主を形質転換する方法や、単一のベクターに両遺伝子を導入する方法、一方、もしくは、両方の遺伝子を染色体中に導入する方法などを利用することができる。
【００７８】
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター、ターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
【００７９】
本発明の酵素を用いた還元反応は、水中もしくは水に溶解しにくい有機溶媒、たとえば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサンなどの有機溶媒中、もしくは、水性媒体との2相系により行うことができる。本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
【００８０】
本発明の反応は、反応温度４−６０℃、好ましくは１５−３０℃、ｐＨ３−１１、好ましくはｐＨ６−９．５、基質濃度０．０１−９０%、好ましくは０．１−３０%で行うことができる。反応系には必要に応じて補酵素ＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＨが０．００１mM−１００mM、好ましくは、０．０１−１０mM添加できる。また、基質は反応開始時に一括して添加することも可能であるが、反応液中の基質濃度が高くなりすぎないように連続的、もしくは非連続的に添加することが望ましい。
【００８１】
ＮＡＤＨの再生のために、たとえば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくはイソプロパノールなどが反応系に添加される。これらの化合物は、基質ケトンに対してモル比で０．１−２０、好ましくは１−５倍過剰に添加することができる。一方、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素などの、ＮＡＤＨ再生用の酵素は、本発明のＮＡＤＨ依存性カルボニル脱水素酵素に比較して酵素活性で０．１−１００倍、好ましくは０．５−２０倍程度添加することができる。
【００８２】
本発明のケトンの還元により生成するアルコールの精製は、菌体、タンパク質の遠心分離、膜処理などによる分離、溶媒抽出、蒸留などを適当に組み合わせることにより行うことができる。
【００８３】
たとえば、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールでは、微生物菌体を含む反応液を遠心分離し、微生物菌体をのぞいた後、限外濾過によりタンパク質を除去し、その濾液に酢酸エチルなどの溶媒を添加して（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールを溶媒層に抽出する。これを相分離後、蒸留することにより純度の高い（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を精製することができる。
【００８４】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
［実施例１］（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の精製
ツーグレア・ラミゲラ DSM 287株をグリセロールをＣ源とした１．２ＬのYPD培地中で、２８℃、５４時間培養し、遠心分離により湿菌体を調製した。得られた湿菌体約３０gを５０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１mM ２−メルカプトエタノール−５０mLに澱懸し、マルチビーズショッカー（安井器械社製）により破砕後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液にプロタミン硫酸を添加し、遠心分離により除核酸した上清を得た。この上清に硫安を３０％飽和になるまで添加し、３０％硫安を含む標準緩衝液（１０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）及び０．０１％ ２−メルカプトエタノール）で平衡化したフェニル−セファロース（２．６ cm × １０ cm）に添加した。同緩衝液でカラムを洗浄した後、３０％から０％硫安飽和の勾配溶出を行った。溶出した（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性画分を回収し、限外濾過により濃縮した。
【００８５】
濃縮した酵素液を標準緩衝液に対して透析した後、同緩衝液で平衡化したＭｏｎｏＱカラム（１．６ cm × １０ cm）に添加し、同緩衝液で洗浄した後、０から１ M 塩化ナトリウムの濃度勾配溶出を行った。活性画分を限外濾過により濃縮した。濃縮した酵素液を標準緩衝液に対して透析した後、同緩衝液で平衡化したブルーセファロースカラム（１．６ cm × ２．５ cm）に添加し、同緩衝液で洗浄した後、０から１ M 塩化ナトリウムの濃度勾配溶出を行った。活性画分を限外濾過により濃縮した。濃縮した酵素液を０．０１％ ２−メルカプトエタノールを含む１ mM リン酸カリウム緩衝液に対して透析した後、同緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（０．５ cm × １０ cm）に添加し、同緩衝液で洗浄した後、１から３５０ mM リン酸カリウム緩衝液により濃度勾配溶出を行った。活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した結果、ほぼ単一バンドであった（図１）。
【００８６】
精製酵素の比活性は（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性で約６０．９ U/mg-proteinであった。精製の要約を表１に示す。
【００８７】
【表１】
【００８８】
［実施例２］（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の分子量測定実施例１で得られた酵素のサブユニットの分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより求めた結果、２７，０００であった。
【００８９】
［実施例３］（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の酸化反応における至適pH
リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を用いてpHを変化させて、実施例１で得られた酵素の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性を調べ、最大活性を１００とした相対活性で表し、図２に示した。酸化反応の至適ｐＨは１１．０であった。
【００９０】
［実施例４］（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の還元反応の至適pH
Britton and Robinson広域緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液を用いてpHを変化させて、実施例１で得られた酵素の２，３−ブタンジオン還元酵素活性を調べ、最大活性を１００とした相対活性で表し、図３に示した。還元反応の至適ｐＨは５．０−５．５であった。
【００９１】
［実施例５］（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の作用至適温度
実施例１で得られた酵素を標準反応条件のうち温度だけを変化させて（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性を測定し、最大活性を１００とした相対活性で表し、図４に示した。至適温度は４５℃であった。
【００９２】
［実施例６］（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の基質特異性実施例１で得られた酵素を様々な基質に50mMに対して、標準反応条件で脱水素酵素活性を測定した。（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールに対する脱水素酵素活性を１００とした相対活性で表し、表２に示した。実施例１で得られた酵素を様々な基質に50mMに対して反応させ、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールに対する活性を１００とした相対活性で表し、表２に示した。
【００９３】
【表２】
-------------------------------------------------
基質 相対活性 (%)
-------------------------------------------------
(2S,3S)-2,3-ブタンジオール 100
(2R,3R)-2,3-ブタンジオール 2.89
meso-2,3-ブタンジオール 0
アセトイン 0.26
(S)-2-ブタノール 43.3
(R)-2-ブタノール 1.11
(S)-1,2-プロパンジオール 55.3
(R)-1,2-プロパンジオール 0.90
(S)-3-クロロ-1,2-プロパンジオール 0
(R)-3-クロロ-1,2-プロパンジオール 3.62
-------------------------------------------------
【００９４】
実施例１で得られた酵素を様々な基質に50mMに対して、標準反応条件で還元活性を測定した。２，３−ブタンジオンに対する還元活性を１００とした相対活性で表し、表３に示した。
【００９５】
【表３】
【００９６】
［実施例７］（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の活性化測定種々の２価イオン（１mM）を含む標準反応条件で（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性を測定し、イオンを添加しない条件の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性を１００とした相対活性で表し、表４に示した。本発明による（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は２価イオンによってほとんど活性化されなかった。
【００９７】
【表４】
【００９８】
［実施例８］（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の部分アミノ酸配列
実施例１で得られた酵素を用いて、プロテインシーケンサーによりＮ末端アミノ酸配列を解析した。アミノ酸配列を配列番号：３に示した。また、SDS-PAGEのゲルより、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を含むゲル断片を切り出し、２回洗浄後、リジルエンドペプチダーゼを用いて、３５℃で終夜イン・ゲル・ダイジェスションを行った。消化したペプチドを逆相HPLC（東ソー製TSK gel ODS-80-Ts、２．０mm × ２５０mm）を用い、０．１％トリフルオロ酢酸（TFA）中でアセトニトリルのグラジエント溶出によりペプチドを分離し、分取した。分取したペプチド断片をプロテインシーケンサー（アプライド・バイオシステム製）によりアミノ酸配列を解析した結果、１種類のアミノ酸配列が得られた。ペプチドＡのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：４に示した。
【００９９】
配列番号：３：N末端アミノ酸配列
Met-Ser-Leu-Asn-Gly-Lys-Val-Ile-Leu-Val-Thr
配列番号：４：ペプチドA
Ile-Ile-Asn-Ala-Cys-Ser-Ile-Ala-Gly-His
【０１００】
［実施例９］ツーグレア・ラミゲラからの染色体ＤＮＡの調製
ツーグレア・ラミゲラ DSM 287株よりCTAB法（Current Protocol, Unit 2.4 Preparation of Genomic DNA from Bacteria）により、染色体ＤＮＡを精製した。
【０１０１】
［実施例１０］（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子のコア領域のＰＣＲによるクローニング
N末端アミノ酸配列に対応するセンスプライマーN及びペプチドAに対応したアンチセンスプライマーA、Bを合成した。それぞれの塩基配列を配列番号：５(プライマーN)、６(プライマーA)、７(プライマーB)に示した。
【０１０２】
プライマーN（配列番号：５）
GTCGAATTCAAYGGCAARGTSATYYTSGTNAC
プライマーA（配列番号：６）
GTCGAATTCGCRATSGARCASGCRTTRATDA
プライマーB（配列番号：７）
GTCGAATTCGCRATRCTRCASGCRTTRATDA
【０１０３】
［実施例１１］ＰＣＲ条件
ツーグレア・ラミゲラ由来染色体ＤＮＡ２５０ng、ExTaq ２．０Ｕ、プライマーN２０pmol、プライマーAとプライマーＢを等量混合したプライマー混合物２０pmol、ｄＮＴＰ２０nmol、ＥｘＴａｑ用緩衝液を含む５０μLの反応液をGeneAmp PCRSystem 2400（Applied Biosystems製）に添加し、９４℃、２分間３０秒熱処理し、更に９４℃３０秒、４５℃３０秒、７０℃１分のサイクルを計３０回行った。その結果、特異的なバンドが取得できた。
【０１０４】
［実施例１２］（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子のコア領域のＰＣＲ断片のサブクローニング
実施例１１で得られたＤＮＡ断片をアガロースを用いて電気泳動して精製した。精製したＤＮＡ断片を制限酵素EcoRIで切断し得られた断片を、ベクターpUC118 EcoR I/BAP（宝酒造製）と、Takara Ligation Kitを用いてライゲーションし、大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン（５０μg/mL）を含むＬＢ培地（１%バクト−トリプトン、０．５%バクト−酵母エキス、１%塩化ナトリウム、以下、LB培地と略す）プレート上で生育させた。
【０１０５】
目的とするプラスミドを有する形質転換株よりプラスミドを精製し、挿入ＤＮＡの塩基配列を解析した。ＤＮＡ塩基配列の解析には、BigDye Terminator Cycle Sequencing ready Reaction Kit (Applied Biosystems製)を用いてＰＣＲを行い、PRISM 377 DNA Sequencer(Applied Biosystems製)により行った。決定されたコア領域の塩基配列をそれぞれ配列番号：８として示した。
【０１０６】
［実施例１３］（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子のコア領域の周辺ＤＮＡのサブクローニング
ツーグレア・ラミゲラの染色体ＤＮＡを制限酵素BstYI, NspI, EcoRI, ,BamHI, PstI, XbaIでそれぞれ消化し、T4リガーゼを用いて16℃で終夜セルフ・ライゲーション反応により、各断片を環化させた。次にプライマーZrDH-c5u（配列番号：９）、ZrDH-c3d（配列番号：１０）を各１００pmol、dNTP１０nmol、セルフ・ライゲーションさせたＤＮＡ１００ng、La-Taq用緩衝液(宝酒造製)、La-Taq２．０Ｕ（宝酒造製）を含む５０μLの反応液を用い、変性（９４℃、３０秒）、アニール（６０℃、３０秒）、伸長（７２℃、１０分）を30サイクル、GeneAmp PCR System 2400（Applied Biosystems製）を用いて行った。PCR反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、BstYI, BamHIで消化した鋳型ＤＮＡに対応して、約２８００ bp、３６００ bpのＤＮＡ断片が検出できた。得られたそれぞれのDNA断片をZrDH-1、ZrDH-2とする。
【０１０７】
ZrDH-c5u（配列番号：９）
GCGAGATCAGCGCCTTCC
ZrDH-c3d（配列番号：１０）
TGTCGACGGCGTGCTCTG
【０１０８】
ＰＣＲで増幅されたそれぞれのＤＮＡ断片をアガロースを用いて電気泳動して精製した。精製したＤＮＡ断片をDye Terminator Cycle Sequencing FS ready Reaction Kit (Applied Biosystems製)を用いてＰＣＲを行い、PRISM 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems製)により行った。
解析したそれぞれのDNA断片の塩基配列を、コア領域の５’−上流側（５U）、３’−下流側に分け、それぞれZrDH-５U（配列番号：１１）、ZrDH-３D（配列番号：１２）として示した。
【０１０９】
ZrDH-1, ZrDH-2の各塩基配列から、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）検索により（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子の配列を決定した。決定したＤＮＡ配列は配列番号：１に、コードするタンパク質の配列は配列番号：２に示す。これらの合成、ＯＲＦ検索は、Genetyx-ATSQ/WIN、およびGenetyx-WIN（ともにソフトウェア開発株式会社製）ソフトの上で行った。
【０１１０】
［実施例１４］（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子のクローニング
（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の構造遺伝子の塩基配列を元に発現ベクター構築用のプライマーZrDH-AT1（配列番号：１３）、ZrDH-TA1（配列番号：１４）を合成した。プライマーを各２０pmol、dNTP２０nmol、ツーグレア・ラミゲラ由来染色体ＤＮＡ１００ng、Pfu-DNA polymerase用緩衝液 (STRATAGENE製)、Pfu-DNA polymerase２．５Ｕ (STRATAGENE製)を含む５０μLの反応液を用い、変性（９５℃、３０秒）、アニール（５５℃、１分）、伸長（７２℃、１分３０秒）を３０サイクル、GeneAmp PCR System 2400 (Applied Biosystems製)を用いて行った。
【０１１１】
ZrDH-AT1（配列番号：１３）
GTCGAATTCAATCATGAGTTTAAATGGCAAAGTCATTTTGGTAACC
ZrDH-TA1（配列番号：１４）
GTCAAGCTTCTAGATTAACGATAGACGATACCGCCATC
【０１１２】
ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的なバンドが検出できた。
得られたＤＮＡ断片を、１％低融点アガロースを用いて電気泳動して精製した。精製したＤＮＡ断片を制限酵素EcoRI、HindIIIで二重消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Sephaglas (ファルマシア製) により精製した。
【０１１３】
得られたＤＮＡ断片を、EcoRI、HindIIIで二重消化したpSE420D（特開2000-189170）とTakara Ligation Kitを用いて、ライゲーションし、大腸菌JM109株を形質転換した。
【０１１４】
形質転換株をアンピシリン（５０μg/mL）を含むＬＢ培地プレート上で生育させ、いくつかのコロニーよりプラスミドを精製し、挿入断片の塩基配列を解析した。目的とする（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子を持つプラスミドをpSE-ZRD1とした。構築したプラスミドpSE-ZRD1のマップを図５に示した。
【０１１５】
［実施例１５］組換え（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の大腸菌による生産
（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子の発現プラスミドpSE-ZRD1で形質転換された大腸菌JM109株をアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、0.1mM IPTG（イソプロピルチオガラクトピラノシド）を加え、さらに４時間培養を行った。
【０１１６】
菌体を遠心分離により集菌後、０．０２% ２−メルカプトエタノールを含む１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、密閉式超音波破砕装置ＵＣＤ−２００ＴＭ（コスモバイオ製）を用いて４分間処理することで、菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液中として回収した。
【０１１７】
［実施例１６］組換え（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の活性測定
実施例１５で調製した組換え（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を用いて種々の基質に対する活性を測定し、プラスミドを含有しない状態で実施例１５と同様に調製した無細胞抽出液の活性と比較した、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールに対する酸化反応の結果を表５に、２，３−ブタンジオンに対する還元反応の結果を表６に示した。
【０１１８】
【表５】
【０１１９】
【表６】
【０１２０】
［実施例１７］ （２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素とマイコバクテリウム由来ギ酸脱水素酵素遺伝子を共発現するプラスミドpSF-ZRD1の構築実施例１４で構築したpSE-ZRD1をEcoRI,HindIIIの2つの制限酵素で二重消化し、ツーグレア・ラミゲラ由来の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を含むＤＮＡ断片を調製した。
【０１２１】
マイコバクテリウム由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を発現するプラスミドpSE-MF26 (特願2002-207507)をEcoRI,HindIIIの2つの制限酵素で二重消化し、マイコバクテリウム由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を含むDNA断片を調製、pSE-ZRD1より同酵素で切り出したツーグレア・ラミゲラ由来の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片とT4 DNAリガーゼで連結し、ギ酸脱水素酵素と（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を同時に発現可能なプラスミドpSF-ZRD1を得た。構築したプラスミドpSF-ZRD1のマップを図６に示した。
【０１２２】
［実施例１８］ （２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素とマイコバクテリウム由来ギ酸脱水素酵素の大腸菌における同時発現
マイコバクテリウム由来のギ酸脱水素酵素とツーグレア・ラミゲラ由来の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を共発現可能なプラスミドpSF-ZRD1により大腸菌JM109株を形質転換した。
組換え大腸菌を液体LB培地に植菌し、３０℃で終夜培養した後、IPTGを０.１ mM添加し、さらに４時間培養した。得られた大腸菌を集菌し、酵素活性の測定をおこなった。
【０１２３】
［実施例１９］ pSF-ZRD1で形質転換した大腸菌の酵素活性
実施例１８により調製したpSF-ZRD1で形質転換した大腸菌（培養液6.3 mL相当）を、実施例１５に記載の方法により菌体破砕し、菌体抽出液を調製し、酵素活性の測定に用いた。ギ酸脱水素酵素活性の測定は、100 mMリン酸カリウム緩衝液 (pH 7.0 ) 、２.５ mM ＮＡＤ＋、１００ mM ギ酸及び酵素を含む反応液中で３０℃でおこなった。１Ｕは、上記反応条件において1分間に１μmolのNADHの生成を触媒する酵素量とした。組換え大腸菌から得た粗酵素液の酵素活性は、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性で17.4 U/mg-protein、ギ酸脱水素酵素活性で0.105 U/mg-proteinであった。
【０１２４】
【発明の効果】
光学活性アルコールなどの生産に有用なＮＡＤ＋依存性の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素ならびにそれをコードするＤＮＡが提供された。本酵素を利用することにより、光学純度の高い（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールならびに（Ｓ）−２−ブタノールの効率的な生産方法が提供された。本発明の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、ＮＡＤＰ＋よりも安定なＮＡＤ＋依存性であることから、より容易に工業的な製造工程に応用することができる。
【０１２５】
本発明による光学純度の高い（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール、（Ｓ）−２−ブタノールの製造方法は、液晶や医薬品原料等の製造方法として有用である。
【０１２６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 （２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性を示す画分を濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析を行った結果を示す写真である。
【図２】 （２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の酸化反応における至適pHの測定結果を示した図である。最大活性を１００とした相対活性で表した。
【図３】 （２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の還元反応における至適pHの測定結果を示した図である。最大活性を１００とした相対活性で表した。
【図４】 （２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の作用至適温度の測定結果を示す図である。最大活性を１００とした相対活性で表した。
【図５】 実施例１４で得られたプラスミドpSE-ZRD1のプラスミドマップである。
【図６】 実施例１７で得られたプラスミドpSF-ZRD1のプラスミドマップである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド依存性の新規な（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素に関する。また本発明は、該酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド、該酵素の製造方法、該酵素を用いた光学活性アルコール、特に（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール、（Ｓ）−２−ブタノールを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、微生物によるグルコースを原料とした（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールの発酵生産において、また、微生物における２，３−ブタンジオール代謝において重要な役割を有する酵素である。またこの酵素反応によって生成する（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールは、液晶、医薬品などの合成原料として有用な化合物である。また、酵素反応によって生成する（Ｓ）−２−ブタノールは、香料、医薬品などの合成原料として有用な化合物である。
【０００３】
なお、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素とは、２，３−ブタンジオールの３種類の異性体のうち（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールを優先的に酸化する活性を有する脱水素酵素である。
【０００４】
従来、２，３−ブタンジオール脱水素活性を有する酵素に関しては、２，３−ブタンジオールの生合成、代謝に関する研究によって、たとえば以下のような微生物において（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールに対する脱水素酵素活性が報告されている(文献１／Arch. Microbiol. 116, 197-203 ,1978、J. Ferment. Technol. 61, 467-471 ,1983)。しかし、いずれも無細胞抽出液を用いた活性測定のみであり、様々な酵素が混在しているために、２，３−ブタンジオール脱水素酵素の立体選択性、比活性などの諸性質は明らかにされていない。
【０００５】
セラチア・マルセッセンス （Serratia marcescens）、
スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、
エンテロバクター・アエロゲネス （Enterobacter aerogenes）、
エルビニア・キャロトボラ （Erwinia carotovora）、
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum C-1012）、
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス （Brevibacterium ammoniagenes IAM 1641）
【０００６】
高度に精製され、諸性質が明らかにされた酵素としては、以下に示すような酵素が２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性を有することが示されている。しかし、ＤＬ体に対する活性のみでその立体選択性は報告されていない。また、ピキア・オフナエンシスを除き、２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性は、グリセロール脱水素酵素活性と同レベルかそれ以下の活性しか有せず、その比活性は一般に低い。
【０００７】
アクロモバクター・リキダム（Achromobacter liquidum KY 3047）由来のグリセロール脱水素酵素（特許文献１／特公昭 58-40467）、
バチルス・エスピー（Bacillus sp. G-1）由来のグリセロール脱水素酵素（特許文献２／特公平 03-72272）、
バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）由来のグリセロール脱水素酵素（文献２／Biochim. Biophys. Acta 994, 270-279 (1989)）、
シトロバクター・フロインディー（Citrobacter freundii DSM 30040）由来のグリセロール脱水素酵素（文献３／J. Bacteriol. 177, 4392-4401 (1995)）、
エルビニア・アロイデア（Erwinia aroideae IFO 3830）由来のグリセロール脱水素酵素（文献４／Chem. Pharm. Bull. 26, 716-721 (1978)）、
ジオトリカム・キャンディダム（Geotrichum candidum IFO 4597）由来のグリセロール脱水素酵素（特許文献３／特公平 01-27715）、
ピキア・オフナエンシス（Pichia ofunaensis AKU 4328）由来のジヒドロキシアセトン還元酵素（文献５／J. Biosci. Bioeng. 88, 148-152 (1999)）、
シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）由来のグリセロール脱水素酵素（文献６／J. Gen. Microbiol. 131, 1581-1588 (1985)）
【０００８】
高度に精製され、かつ、２，３−ブタンジオールの（２Ｓ，３Ｓ）体に対する高い選択性が明らかにされている酵素としては、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum C-1012）の生産するL-2,3-ブタンジオール脱水素酵素（文献７／Biosci. Biotechnol. Biochem., 65, 1876-1878, (2001)）が公知であるが、２−ブタノールに関して活性が無く、光学活性２級アルコールの選択性についての報告がなされていない（文献７／Biosci. Biotechnol. Biochem., 65 (8), 1876-1878, 2001）。
【０００９】
更に、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）より２，３−ブタンジオール代謝に関与する２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードする遺伝子がクローニングされ、大腸菌で発現されている（文献８／FEMS Microbiol. Lett. 124 (2), 141-150 (1994)）が、その立体選択性は報告されていない。また、シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）のゲノム解析の結果、シュードモナス・プチダ由来の２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子に高いホモロジーを有する遺伝子が同定されているが、実際に、この遺伝子を発現させ、その酵素活性、立体選択性などは確認されていない。
【００１０】
（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール、（Ｓ）−２−ブタノールなどの光学活性アルコールの生産に有用な、立体選択性が高く、比活性の高い（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の探索、特に、該酵素を容易に大量生産を可能にするため、該酵素をコードする遺伝子の単離、該酵素を発現可能な形質転換体の調製は、産業上重要な課題となっている。
【００１１】
【文献１】
Arch. Microbiol. 116, 197-203 ,1978、J. Ferment. Technol. 61, 467-471 ,1983)
【文献２】
Biochim. Biophys. Acta 994, 270-279 (1989)
【文献３】
J. Bacteriol. 177, 4392-4401 (1995)
【文献４】
Chem. Pharm. Bull. 26, 716-721 (1978)
【文献５】
J. Biosci. Bioeng. 88, 148-152 (1999)
【文献６】
J. Gen. Microbiol. 131, 1581-1588 (1985)
【文献７】
Biosci. Biotechnol. Biochem., 65, 1876-1878, (2001)
【文献８】
FEMS Microbiol. Lett. 124 (2), 141-150 (1994)
【特許文献１】
特公昭 58-40467
【特許文献２】
特公平 03-72272
【特許文献３】
特公平 01-27715
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＮＡＤ＋を補酵素として利用しうる（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の提供を課題とする。また本発明は、２，３−ブタンジオンを基質とする光学活性（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールの酵素的な製造工程に利用した場合に、光学的純度の高い生成物を収率良く与えることができる（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を提供することも課題としている。また、２−ブタノンを基質とする光学活性（Ｓ）−２−ブタノールの酵素的な製造工程に利用した場合に、光学的純度の高い生成物を収率良く与えることができる（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を提供することも課題としている。
【００１３】
更に本発明は、目的とする性状を備えた（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするＤＮＡを単離し、組換え体として得ることを課題とする。加えて、新規な（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素による光学活性（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール、（Ｓ）−２−ブタノールの酵素的な製造方法の提供をも課題とするものである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ツーグレア・ラミゲラに関する研究を進めてきた。２，３−ブタンジオールの（Ｓ）配置の水酸基に対して高い活性と高い選択性を併せ持つ、新規な（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を見出した。
更に、本酵素をコードするＤＮＡを単離し、本酵素を高発現する組換え菌を造成し、本発明を完成した。
【００１５】
すなわち本発明は、以下の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素、この酵素をコードするＤＮＡ、この酵素の製造方法、および用途に関する。
〔１〕次の（１）から（３）に示す理化学的性質を有する（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素。
（１）作用
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールに作用し、（Ｓ）−アセトインを生成する。還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、２，３−ブタンジオンを還元し、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールを生成する。
（２）基質特異性
酸化反応の補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを利用する。還元反応の補酵素として還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを利用する。また、２，３−ブタンジオールの３種類の異性体のうち（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールを優先的に酸化する。
（３）２価イオンによる活性化
Ｍｇ２＋イオン、Ｃａ２＋イオン、Ｂａ２＋イオン、Ｃｏ２＋イオン、Ｍｎ２＋イオンによって実質的に活性化されない。
〔２〕更に付加的に、次の（４）に示す理化学的性質を有する〔１〕に記載の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素。
（４）基質特異性
i) ２-ブタノールの（Ｓ）配置の水酸基を優先的に酸化する。
ii) １，２−プロパンジオールの（Ｓ）配置の水酸基を優先的に酸化する。
〔３〕ツーグレア（Ｚｏｏｇｌｏｅａ）属に属する微生物によって産生される〔１〕に記載の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素。
〔４〕ツーグレア属に属する微生物が、ツーグレア・ラミゲラ (Zoogloea ramigera)である〔３〕に記載の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素。
〔５〕下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
（ｅ）配列番号：１に記載の塩基配列と７０%以上の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド。
〔６〕〔５〕に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。
〔７〕〔５〕に記載されたポリヌクレオチドを含むベクター。
〔８〕〔５〕に記載されたポリヌクレオチド、または〔７〕に記載のベクターを保持する形質転換体。
〔９〕ツーグレア属に属し、〔１〕に記載の酵素、または〔６〕に記載のタンパク質を産生する微生物を培養する工程を含む、〔１〕に記載の酵素、または〔６〕に記載のタンパク質の製造方法。
〔１０〕ツーグレア属に属する微生物が、ツーグレア・ラミゲラ(Zoogloea ramigera)である〔９〕に記載の製造方法。
〔１１〕〔８〕に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、〔１〕もしくは〔６〕に記載の蛋白質の製造方法。
〔１２〕〔１〕に記載の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素、〔６〕に記載のタンパク質、それらを産生する微生物、およびそれらの処理物からなる群から選択されるいずれかの酵素活性物質を、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下でケトンに作用させ、生成するアルコールを回収する工程を含むアルコールの製造方法。
〔１３〕ケトンが、２，３−ブタンジオンであり、アルコールが（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールである〔１２〕に記載のアルコールの製造方法。
〔１４〕〔１〕に記載の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素、〔６〕に記載のタンパク質、それらを産生する微生物、およびそれらの処理物からなる群から選択されるいずれかの酵素活性物質を、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下で、ラセミ体アルコールに作用させ、光学異性体の一方を優先的に酸化し、残存する光学活性アルコールを取得することを特徴とする、光学活性アルコールの製造方法。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明による（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、補酵素としてＮＡＤ＋を利用しうること、２，３−ブタンジオールの（Ｓ）配置の水酸基を優先的に酸化すること、また、ＮＡＤＨを補酵素として２，３−ブタンジオンを還元し、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールを生成することによって特徴付けられる。
【００１７】
本発明において、酵素の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールに対する酸化活性、および、２，３−ブタンジオンに対する還元活性は、次のようにして確認することができる。
【００１８】
（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールに対する酸化活性測定法:
５０mM グリシン-水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１．０）、２．５mM ＮＡＤ＋、５０mM （２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール及び酵素を合む反応液中30℃で反応させ、ＮＡＤＨの増加にともなう３４０nmの吸光度の増加を測定する。１Uは、１分間に１μmolのＮＡＤＨの増加を触媒する酵素量とする。
【００１９】
２，３−ブタンジオンに対する還元活性測定法:
５０mM リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５）、０．２mM ＮＡＤＨ、２０mM ２，３−ブタンジオン及び酵素を合む反応液中30℃で反応させ、ＮＡＤＨの減少にともなう３４０nmの吸光度の減少を測定する。１Uは、１分間に１μmolのＮＡＤＨの減少を触媒する酵素量とする。タンパク質の定量は、バイオラッド製タンパク質アッセイキットを用いた色素結合法により行うことができる。
２価のイオンによる活性化効果は、上記の反応液中に１mMの金属イオンを添加し、上記の方法で活性を測定する。ここで、酵素活性が実質的に活性化されないとは、金属イオンを添加しない時の活性を１００とした時、金属イオンを加えた際の相対活性が１２０を超えない場合をいう。
【００２０】
また、本発明において（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素が２，３−ブタンジオールの（２Ｓ，３Ｓ）配置の水酸基を「優先的」に酸化するとは、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の、（２Ｓ，３Ｓ）配置の２，３−ブタンジオールに対する酵素活性を１００としたとき、（２R、３Ｒ）配置の２，３−ブタンジオールとメソ配置の２，３−ブタンジオールに対する酵素活性が２０以下、好ましくは１０以下、更に好ましくは５以下である場合を言う。
また、本発明において（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素が２−ブタノールの（Ｓ）配置の水酸基を「優先的」に酸化するとは、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の、（Ｓ）配置の２−ブタノールに対する酵素活性を１００としたとき、（R）配置の２−ブタノールに対する酵素活性が２０以下、好ましくは１０以下、更に好ましくは５以下である場合を言う。また、本発明において（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素が１，２−ブタンジオールの（Ｓ）配置の水酸基を「優先的」に酸化するとは、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の、（Ｓ）配置の１，２−ブタンジオールに対する酵素活性を１００としたとき、（R）配置の１，２−ブタンジオールに対する酵素活性が２０以下、好ましくは１０以下、更に好ましくは５以下である場合を言う。
【００２１】
上記のような理化学的性状を持つ（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、たとえばツーグレア属細菌の培養物より精製することができる。ツーグレア属細菌としては、ツーグレア・ラミゲラ(Zoogloea ramigera)が特に本発明による（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の産生能に優れる。本発明の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を得るために利用することができるツーグレア・ラミゲラは、たとえば、DSM 287としてDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHより入手することができる。
【００２２】
上記微生物は、ＹＰＤ（１％酵母エキス、１％ペプトン、２％グルコースを含むｐＨ６．０の培地）培地等の真菌の培養に用いられる一般的な培地で培養することができる。本発明の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を生産するには、ＹＰＤ培地のグルコースをメタノールもしくはグリセロールに変えた培地でも培養可能である。
【００２３】
得られた菌体を、2-メルカプトエタノール(2-mercaptoethanol)等の還元剤や、フェニルメタンスルホニルフルオリド(phenylmethansulfonyl fluoride;PMFS)やエチレンジアミン４酢酸（以下、ＥＤＴＡと略す）、プロテアーゼ阻害剤を加えた緩衝液中でガラスビーズとの物理的な衝撃やミニラボ、フレンチプレスなどの高圧を利用するなどして破砕し、無細胞抽出液を得る。無細胞抽出液から、蛋白質の溶解度による分画（アセトンやジメチルスルホキシドなどの有機溶媒による沈澱や硫安などによる塩析など）や、陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィーや、キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより本発明の酵素を精製する事ができる。例えば、無細胞抽出液をブルー−セファロース、フェニル−セファロース、Mono-Q（いずれもファルマシア製）、ヒドロキシアパタイト（株式会社高研製）などのカラムクロマトグラフィーを組み合わせることにより、電気泳動的にほぼ単一バンドにまで精製することができる。
【００２４】
ツーグレア・ラミゲラに由来する本発明の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は以下の（１）−（３）の理化学的性質を有する蛋白質である。
（１）作用
ＮＡＤ＋を補酵素として、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールに作用し、（Ｓ）−アセトインを生成する。ＮＡＤＨを補酵素として、２，３−ブタンジオンを還元し、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールを生成する。
（２）基質特異性
酸化反応の補酵素としてＮＡＤ＋を、また還元反応の補酵素としてＮＡＤＨを利用する。また、２，３−ブタンジオールの３種類の異性体のうち、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３ブタンジオールを優先的に優先的に酸化する。
（３）２価イオンによる活性化
Ｍｇ２＋イオン、Ｃａ２＋イオン、Ｂａ２＋イオン、Ｃｏ２＋イオン、Ｍｎ２ ＋イオンによって実質的に活性化されない。
（４）基質特異性
２−ブタノールの（Ｓ）配置の水酸基を優先的に酸化する。
（５）基質特異性
１，２−プロパンジオールの（Ｓ）配置の水酸基を優先的に酸化する。
更に本発明の酵素は、以下の性状（６）−（８）によって特徴付けることができる。
（６）至適ｐＨ
（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール酸化反応の至適ｐＨが１１．０。
（７）分子量
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（以下SDS-PAGEと省略する）によるサブユニットの分子量が２７，０００。
（８）作用適温
至適温度は４５℃である。
【００２５】
ツーグレア・ラミゲラに由来する（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、補酵素として酸化反応におけるＮＡＤＰ＋、あるいは還元反応におけるＮＡＤＰＨを実質的に利用することができない。しかし、ＮＡＤＰ＋やＮＡＤＰの利用性に関わらず、前記物理学化学的性状（１）−（３）、望ましくは（１）−（５）、あるいは更に望ましくは（１）−（８）を備えた酵素は、本発明に含まれる。
【００２６】
本発明は、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドおよびそのホモログに関する。本発明において、ポリヌクレオチドは、DNAやRNA等の天然のポリヌクレオチドに加え、人工的なヌクレオチド誘導体を含む人工的な分子であることもできる。また本発明のポリヌクレオチドは、DNA-RNAのキメラ分子であることもできる。本発明の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドは、たとえば配列番号：１に示す塩基配列を含む。配列番号：１に示す塩基配列は、配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしており、このアミノ酸配列を含むタンパク質は、本発明による（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の好ましい態様を構成する。
【００２７】
本発明の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドのホモログとは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、前記理化学的性質（１）−（３）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。当業者であれば、配列番号：１記載のポリヌクレオチドに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982) , Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991) などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することによりポリヌクレオチドのホモログを得ることが可能である。
変異
【００２８】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、たとえば１００以下、通常５０以下、好ましくは３０以下、より好ましくは１５以下、更に好ましくは１０以下、あるいは５以下のアミノ酸残基の変異は許容される。本発明のホモログにおけるアミノ酸残基の変異は、保存的置換であることが望ましい。一般に蛋白質の機能の維持のためには、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸であることが好ましい。このようなアミノ酸残基の置換は、保存的置換と呼ばれている。
【００２９】
例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trpは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性としては、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glnが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、AspおよびGluが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Lys、Arg、Hisが挙げられる。
【００３０】
また、本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは、配列番号：１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドであって、かつ、前記理化学的性質（１）−（３）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含む。ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号：１に記載中の任意の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、たとえば４０、６０または１００個の連続した配列を一つまたは複数選択したＤＮＡをプローブＤＮＡとし、たとえばECL direct nucleic acid labeling and detection system (Amersham Pharmaica Biotech社製)を用いて、マニュアルに記載の条件（wash：42℃、0.5x SSCを含むprimary wash buffer）において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。
ハイブリダイゼーションは、ニトロセルロース膜またはナイロン膜などを用いて慣用の方法にて実施することができる（Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories; Ausubel, F.M. et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishe Associates/ John Wiley and Sons, New York. NY）。
【００３１】
上記のストリンジェントな条件を更に具体的に例示すれば、例えば6×SSC、0.5%(W/V) SDS、100μg/ml 変性サケ精子DNA、5×デンハルト溶液（１×デンハルト溶液は0.2%ポリビニールピロリドン、0.2%牛血清アルブミン、および0.2%フィコールを含む）を含む溶液中、45℃、好ましくは55℃、より好ましくは60℃、さらに好ましくは65℃で一晩ハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて、4×SSC、0.5% SDS、20分を３回の洗浄を行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 4×SSC、0.5% SDS、20分を2回、2×SSC、0.5% SDS、20分を1回の洗浄を行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 4×SSC、0.5% SDS、20分を2回、続いて 1×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 2×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 1×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 0.5×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 2×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 1×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 0.5×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 0.1×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。
【００３２】
さらに、本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%または９０%、より好ましくは９５%以上のホモロジーを有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。タンパク質のホモロジー検索は、たとえばDAD, SWISS-PROT, PIRなどの蛋白質のアミノ酸配列に関するデータベースや DDBJ、EMBL、あるいはGene-BankなどのＤＮＡ配列に関するデータベース、ＤＮＡ配列を元にした予想酸配列に関するデータベースなどを対象に、BLAST, FASTAなどのプログラムを利用して、例えば、インターネット通じて行うことができる。
【００３３】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列を用いてDADを対象にBLASTプログラムを用いてホモロジー検索を行った結果、既知のタンパク質の中でもっとも高いホモロジーを示したのは、クレブジラ・ニューモニアエ（Klebsiella pneumoniae）のアセトイン還元酵素であった。このアセトイン還元酵素はmeso-ブタンジオールのみに特異的に作用し、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３-ブタンジオールには作用しないことが知られている(J. Ferment. Technol. 83, 32-37 ,1997)。このアセトイン還元酵素に対するホモロジーはIdentityで５６％、Positiveで６７％であった。本発明の７０％以上のホモロジーとは、例えば、BLASTプログラムを用いたIdentityの相同性の値を表す。
【００３４】
本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質に関する。本発明はまた、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質のホモログを含む。
【００３５】
本発明の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のホモログとは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を意味する。本発明において、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等とは、当該タンパク質が前記（１）−（３）に示した物理化学的性状を有することを意味する。当業者であれば、配列番号：１記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982) , Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991) ）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。その（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドを宿主に導入して発現させることにより、配列番号：２に記載の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のホモログを得ることが可能である。
【００３６】
さらに、本発明の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のホモログとは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%または９０%、より好ましくは９５%以上のホモロジーを有するタンパク質をいう。タンパク質のホモロジー検索は、たとえばDAD,SWISS-PROT, PIRなどの蛋白質のアミノ酸配列に関するデータベースやDDBJ、EMBL、あるいはGene-BankなどのＤＮＡ配列に関するデータベース、ＤＮＡ配列を元にした予想酸配列に関するデータベースなどを対象に、BLAST、FASTAなどのプログラムを利用して、例えば、インターネット通じて行うことができる。
【００３７】
本発明の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドは、たとえば、以下のような方法によって単離することができる。
【００３８】
配列番号：１に記載の塩基配列を元にＰＣＲ用のプライマーを設計し、酵素生産株の染色体ＤＮＡもしくは、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うことにより本発明のＤＮＡを得ることができる。
【００３９】
さらに、得られたＤＮＡ断片をプローブとして、酵素生産株の染色体ＤＮＡの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを利用して、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどにより、本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。
【００４０】
また、ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、得られた配列から、既知のＤＮＡの外側に伸長させるためのＰＣＲプライマーを設計し、酵素生産株の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、自己環化反応によりＤＮＡを鋳型として逆ＰＣＲを行うことにより（Genetics 120, 621-623 (1988)）、また、ＲＡＣＥ法（Rapid Amplification of cDNA End、「ＰＣＲ実験マニュアル」p25-33, ＨＢＪ出版局）などにより本発明のポリヌクレオチドを得ることも可能である。
【００４１】
なお本発明のポリヌクレオチドには、以上のような方法によってクローニングされたゲノムＤＮＡ、あるいはｃＤＮＡの他、合成によって得られたＤＮＡが含まれる。
【００４２】
このようにして単離された、本発明による（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドを公知の発現ベクターに挿入することにより、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素発現ベクターが提供される。
【００４３】
また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、本発明の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を組み換え体から得ることができる。
【００４４】
本発明においてＮＡＤ＋を電子受容体とする（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、ＮＡＤ＋を電子受容体とする（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換され、ＮＡＤ＋を電子受容体とする（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。利用可能な微生物としては、たとえば以下のような微生物を示すことができる。
エシェリヒア(Escherichia)属
バチルス(Bacillus)属
シュードモナス(Pseudomonas)属
セラチア(Serratia)属
ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属
コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属
ストレプトコッカス(Streptococcus)属
ラクトバチルス(Lactobacillus)属など宿主ベクター系の開発されている細菌
ロドコッカス(Rhodococcus)属
ストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌
サッカロマイセス(Saccharomyces)属
クライベロマイセス(Kluyveromyces)属
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属
チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属
ヤロウイア(Yarrowia)属
トリコスポロン(Trichosporon)属
ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属
ピキア(Pichia)属
キャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母
ノイロスポラ(Neurospora)属
アスペルギルス(Aspergillus)属
セファロスポリウム(Cephalosporium)属
トリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ
【００４５】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories)。微生物中などにおいて、本発明のＮＡＤＨを電子供与体とする（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子を発現させるためには、まず微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中にこのＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。
【００４６】
そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の5'-側上流に、より好ましくはターミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる必要がある。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−などに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8, 423-488 (1992)、などに詳細に記述されている。
【００４７】
例えばエシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミドベクターとして、pBR、pUC系プラスミドを利用でき、lac(β−ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペロン)、tac、 trc (lac、trpの融合)、λファージ PＬ、PＲなどに由来するプロモーターなどが利用できる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどを用いることができる。これらの中で、市販のｐＳＥ４２０（Invitrogen製）のマルチクローニングサイトを一部改変したベクターｐＳＥ４２０Ｄ（特開2000-189170に記載）が好適に利用できる。
【００４８】
バチルス属においては、ベクターとしてpUB110系プラスミド、pC194系プラスミドなどが利用可能であり、染色体にインテグレートすることもできる。また、プロモーター、ターミネーターとしてapr(アルカリプロテアーゼ)、npr(中性プロテアーゼ)、amy(α−アミラーゼ)などが利用できる。
【００４９】
シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・セパシア(Pseudomonas cepacia)などで宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター(RSF1010などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）pKT240などが利用可能であり、プロモーター、ターミネーターとして、リパーゼ（特開平5-284973）遺伝子などが利用できる。
【００５０】
ブレビバクテリウム属特に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)においては、pAJ43(Gene 39, 281 (1985))などのプラスミドベクターが利用可能である。プロモーター、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。
【００５１】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)においては、pCS11(特開昭57-183799)、pCB101(Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984)などのプラスミドベクターが利用可能である。
【００５２】
ストレプトコッカス(Streptococcus)属においては、pHV1301(FEMS Microbiol. Lett. 26, 239 (1985)、pGK1（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (1985)）などがプラスミドベクターとして利用可能である。
【００５３】
ラクトバチルス(Lactobacillus)属においては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1（J. Bacteriol. 137, 614 (1979)）などが利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。
【００５４】
ロドコッカス(Rhodococcus)属においては、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)から単離されたプラスミドベクターが使用可能である (J. Gen. Microbiol. 138,1003 (1992) )。
【００５５】
ストレプトマイセス(Streptomyces)属においては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories (1985)に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)においては、pIJ486 (Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986)、pKC1064(Gene 103,97-99 (1991) )、pUWL-KS (Gene 165,149-150 (1995) )が使用できる。また、ストレプトマイセス・バージニア(Streptomyces virginiae)においても、同様のプラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11, 46-53 (1997) ）。
【００５６】
サッカロマイセス(Saccharomyces)属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cerevisiae)においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミドが利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームＤＮＡとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター（EP 537456など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ADH(アルコール脱水素酵素)、GAPDH(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素)、PHO(酸性フォスファターゼ)、GAL(β−ガラクトシダーゼ)、PGK(ホスホグリセレートキナーゼ)、ENO(エノラーゼ)などのプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００５７】
クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラスミド、pKD1系プラスミド（J. Bacteriol. 145, 382-390 (1981)）、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS系プラスミド、リボソームＤＮＡなどとの相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（EP 537456など）などが利用可能である。また、ADH、PGKなどに由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００５８】
シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のARS (自律複製に関与する遺伝子)及びサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクターが利用可能である（Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986)）。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用できる（EMBO J. 6, 729 (1987)）。特に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００５９】
チゴサッカロマイセス属(Zygosaccharomyces)においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ(Zygosaccharomyces rouxii)由来のpSB3（Nucleic Acids Res. 13, 4267 (1985)）などに由来するプラスミドベクターが利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来 PHO5 プロモーターや、チゴサッカロマイセス・ロウキシ由来 GAP-Zr(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素)のプロモーター（Agri. Biol. Chem. 54, 2521 (1990)）などが利用可能である。
【００６０】
ピキア(Pichia)属においては、ピキア・アンガスタ（旧名：ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)）において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律複製に関与する遺伝子（HARS1、HARS2）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である（Yeast 7, 431-443 (1991)）。また、メタノールなどで誘導されるAOX（アルコールオキシダーゼ)、FDH(ギ酸脱水素酵素)のプロモーターなどが利用可能である。また、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子 (PARS1、 PARS2)などを利用した宿主ベクター系が開発されており（Mol. Cell. Biol. 5, 3376 (1985)）、高濃度培養とメタノールで誘導可能なAOXなど強いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids Res. 15, 3859 (1987)）。
【００６１】
キャンディダ(Candida)属においては、キャンディダ・マルトーサ(Candida maltosa)、キャンディダ・アルビカンス(Candida albicans)、キャンディダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、キャンディダ・ウチルス(Candida utilis)などにおいて宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ＡＲＳがクローニングされ（Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587 (1987)）、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターは強力なプロモーターが開発されている（特開平 08-173170）。
【００６２】
アスペルギルス(Aspergillus)属においては、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 、アスペルギルス・オリジー (Aspergillus oryzae) などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989)）。
【００６３】
トリコデルマ(Trichoderma)属においては、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーターなどが利用できる（Biotechnology 7, 596-603 (1989)）。
【００６４】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Nature 315, 592-594 (1985)）や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。
【００６５】
本発明において使用する（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素生産能を有する微生物は、ＮＡＤ＋依存性（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素生産能を有するツーグレア属に属するすべての菌株、突然変異株、変種、遺伝子操作技術の利用により作成された本発明の酵素生産能を獲得した形質転換株を含む。
【００６６】
本発明は、前記（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素のケトンの還元によるアルコール、特に（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールの製造用途に関する。酵素分子、その処理物、酵素分子を含む培養物、あるいは酵素を生成する微生物等の形質転換体が生きた状態で反応溶液と接触させることにより、目的とする酵素反応を行わせることができる。なお、酵素と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定されるものではない。
【００６７】
反応溶液は、基質や酵素反応に必要な補酵素であるＮＡＤＨを酵素活性の発現に望ましい環境を与える適当な溶媒に溶解したものである。本発明における（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を含む微生物の処理物には、具体的には界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどが含まれる。
【００６８】
本発明によるアルコールの製造方法におけるケトンとしては、例えば、下記の一般式Iまたは一般式IIで表されるケトンを示すことができる。これらのケトンに本発明の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を作用させることにより、ケト基が立体選択的に還元され、光学活性アルコールが生成される。
【化１】
一般式Iまたは一般式IIにおいて、Xは水素原子、ハロゲン原子又は水酸基を示表し、R1は水素原子、置換基を有してもよいC1〜C6の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、置換基を有してもよいC1〜C6の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または置換基を有してもよいC1〜C6の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を示し、R2は水素原子、カルボニル基、水酸基、置換基を有してもよいC1〜C6の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキル基、置換基を有してもよいC1〜C6の直鎖もしくは分岐鎖状のアルケニル基、または置換基を有してもよいC1〜C6の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を示している。また、R1とR2は結合して環を形成してもよい。
【００７０】
より具体的には、本発明によるアルコールの製造方法におけるケトンとしては、２，３−ブタンジオン、２，３−ペンタンジオン、アセトイン、２−ブタノンが挙げられる。これらの化合物を基質として用いることにより、それぞれ、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ペンタンジオール、（Ｓ）−１，２−プロパンジオール、（Ｓ）−２−ブタノールを合成することができる。
【００７１】
本発明は、前記（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素によるアルコールの酸化反応によるケトンの製造用途に関する。酵素分子、その処理物、酵素分子を含む培養物、あるいは酵素を生成する微生物等の形質転換体が生きた状態で反応溶液と接触させることにより、目的とする酵素反応を行わせることができる。なお、酵素と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定されるものではない。
【００７２】
反応溶液は、基質や酵素反応に必要な補酵素であるＮＡＤ＋を酵素活性の発現に望ましい環境を与える適当な溶媒に溶解したものである。本発明における（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を含む微生物の処理物には、具体的には界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどが含まれる。
【００７３】
本発明によるケトンの製造方法におけるアルコールとしては、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールが挙げられ、（Ｓ）−アセトインを合成することができる。
【００７４】
本発明は、更に、前記（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を用いてラセミ体アルコールを基質として、不斉酸化能を利用した光学活性アルコールの生産にも利用できる。すなわち、本発明の酵素によって、光学異性体の一方を優先的に酸化し、残存する光学活性アルコールを取得することにより、光学活性アルコールが生産される。より具体的には、ラセミ２−ブタノールまたはラセミ１、２−プロパンジオールの (S)体と(R)体とが混在するラセミ体に、本発明による（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をNAD＋共存下で作用させるのである。
立体選択性に優れる本発明による（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、（Ｓ）体に対して特異的に作用し、これを酸化してケトンとするが、（Ｒ）体のアルコールには作用しないので、やがて（Ｒ）体の割合が大きくなってくる。こうして蓄積する（Ｒ）体を分離すれば、最終的にラセミ体から（Ｒ）体のアルコールを回収することができる。このようにしてラセミ２−ブタノールまたはラセミ１、２−プロパンジオールからそれぞれ、（Ｒ）−２−ブタノール、（Ｒ）−１，２−プロパンジオールを得ることができる。
【００７５】
なお本発明における「光学活性アルコール」とは、ある光学異性体が別の光学異性体より多く含まれるアルコール、もしくはある光学異性体のみからなるアルコールを意味する。さらに、本発明の「光学異性体」は、一般的に「光学活性体」および「鏡像異性体」と呼ばれる場合もある。
【００７６】
上記還元反応に付随してＮＡＤＨから生成するＮＡＤ＋の、ＮＡＤＨへの再生は、微生物の持つＮＡＤ＋還元能（解糖系、メチロトローフのＣ１化合物資化経路など）を用いて行うことができる。これらＮＡＤ＋還元能は、反応系にグルコースやエタノール、ギ酸などを添加することにより増強することが可能である。また、ＮＡＤ＋からＮＡＤＨを生成する能力を有する微生物やその処理物、酵素を反応系に添加することによっても行うことができる。たとえば、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などを含む微生物、その処理物、ならびに部分精製もしくは精製酵素を用いてＮＡＤＨの再生を行うことができる。これらのＮＡＤＨ再生に必要な反応を構成する成分は、本発明によるアルコールの製造のための反応系に添加する、固定化したものを添加する、あるいはＮＡＤＨの交換が可能な膜を介して接触させることができる。
【００７７】
また、本発明のＤＮＡを含む組み換えベクターで形質転換した微生物の生菌体を前記アルコールの製造方法に利用する場合には、ＮＡＤＨ再生のための付加的な反応系を不要とできる場合がある。すなわち、ＮＡＤＨ再生活性の高い微生物を用いることにより、形質転換体を用いた還元反応において、ＮＡＤＨ再生用の酵素を添加することなく効率的な反応が行える。さらに、ＮＡＤＨ再生に利用可能なグルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などの遺伝子を、本発明のＮＡＤＨ依存性（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素をコードするＤＮＡと同時に宿主に導入することによって、より効率的なＮＡＤＨ再生酵素とＮＡＤ＋依存性（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の発現、還元反応を行うことも可能である。
これらの２つもしくはそれ以上の遺伝子の宿主への導入には、不和合性を避けるために複製起源のことなる複数のベクターに別々に遺伝子を導入した組み換えベクターにより宿主を形質転換する方法や、単一のベクターに両遺伝子を導入する方法、一方、もしくは、両方の遺伝子を染色体中に導入する方法などを利用することができる。
【００７８】
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター、ターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
【００７９】
本発明の酵素を用いた還元反応は、水中もしくは水に溶解しにくい有機溶媒、たとえば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサンなどの有機溶媒中、もしくは、水性媒体との2相系により行うことができる。本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
【００８０】
本発明の反応は、反応温度４−６０℃、好ましくは１５−３０℃、ｐＨ３−１１、好ましくはｐＨ６−９．５、基質濃度０．０１−９０%、好ましくは０．１−３０%で行うことができる。反応系には必要に応じて補酵素ＮＡＤ＋もしくはＮＡＤＨが０．００１mM−１００mM、好ましくは、０．０１−１０mM添加できる。また、基質は反応開始時に一括して添加することも可能であるが、反応液中の基質濃度が高くなりすぎないように連続的、もしくは非連続的に添加することが望ましい。
【００８１】
ＮＡＤＨの再生のために、たとえば、グルコース脱水素酵素を利用する場合のグルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アルコール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくはイソプロパノールなどが反応系に添加される。これらの化合物は、基質ケトンに対してモル比で０．１−２０、好ましくは１−５倍過剰に添加することができる。一方、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素などの、ＮＡＤＨ再生用の酵素は、本発明のＮＡＤＨ依存性カルボニル脱水素酵素に比較して酵素活性で０．１−１００倍、好ましくは０．５−２０倍程度添加することができる。
【００８２】
本発明のケトンの還元により生成するアルコールの精製は、菌体、タンパク質の遠心分離、膜処理などによる分離、溶媒抽出、蒸留などを適当に組み合わせることにより行うことができる。
【００８３】
たとえば、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールでは、微生物菌体を含む反応液を遠心分離し、微生物菌体をのぞいた後、限外濾過によりタンパク質を除去し、その濾液に酢酸エチルなどの溶媒を添加して（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールを溶媒層に抽出する。これを相分離後、蒸留することにより純度の高い（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を精製することができる。
【００８４】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
［実施例１］（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の精製
ツーグレア・ラミゲラ DSM 287株をグリセロールをＣ源とした１．２ＬのYPD培地中で、２８℃、５４時間培養し、遠心分離により湿菌体を調製した。得られた湿菌体約３０gを５０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１mM ２−メルカプトエタノール−５０mLに澱懸し、マルチビーズショッカー（安井器械社製）により破砕後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液にプロタミン硫酸を添加し、遠心分離により除核酸した上清を得た。この上清に硫安を３０％飽和になるまで添加し、３０％硫安を含む標準緩衝液（１０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）及び０．０１％ ２−メルカプトエタノール）で平衡化したフェニル−セファロース（２．６ cm × １０ cm）に添加した。同緩衝液でカラムを洗浄した後、３０％から０％硫安飽和の勾配溶出を行った。溶出した（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性画分を回収し、限外濾過により濃縮した。
【００８５】
濃縮した酵素液を標準緩衝液に対して透析した後、同緩衝液で平衡化したＭｏｎｏＱカラム（１．６ cm × １０ cm）に添加し、同緩衝液で洗浄した後、０から１ M 塩化ナトリウムの濃度勾配溶出を行った。活性画分を限外濾過により濃縮した。濃縮した酵素液を標準緩衝液に対して透析した後、同緩衝液で平衡化したブルーセファロースカラム（１．６ cm × ２．５ cm）に添加し、同緩衝液で洗浄した後、０から１ M 塩化ナトリウムの濃度勾配溶出を行った。活性画分を限外濾過により濃縮した。濃縮した酵素液を０．０１％ ２−メルカプトエタノールを含む１ mM リン酸カリウム緩衝液に対して透析した後、同緩衝液で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（０．５ cm × １０ cm）に添加し、同緩衝液で洗浄した後、１から３５０ mM リン酸カリウム緩衝液により濃度勾配溶出を行った。活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した結果、ほぼ単一バンドであった（図１）。
【００８６】
精製酵素の比活性は（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性で約６０．９ U/mg-proteinであった。精製の要約を表１に示す。
【００８７】
【表１】
［実施例２］（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の分子量測定実施例１で得られた酵素のサブユニットの分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより求めた結果、２７，０００であった。
【００８９】
［実施例３］（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の酸化反応における至適pH
リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を用いてpHを変化させて、実施例１で得られた酵素の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性を調べ、最大活性を１００とした相対活性で表し、図２に示した。酸化反応の至適ｐＨは１１．０であった。
【００９０】
［実施例４］（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の還元反応の至適pH
Britton and Robinson広域緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液を用いてpHを変化させて、実施例１で得られた酵素の２，３−ブタンジオン還元酵素活性を調べ、最大活性を１００とした相対活性で表し、図３に示した。還元反応の至適ｐＨは５．０−５．５であった。
【００９１】
［実施例５］（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の作用至適温度
実施例１で得られた酵素を標準反応条件のうち温度だけを変化させて（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性を測定し、最大活性を１００とした相対活性で表し、図４に示した。至適温度は４５℃であった。
【００９２】
［実施例６］（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の基質特異性実施例１で得られた酵素を様々な基質に50mMに対して、標準反応条件で脱水素酵素活性を測定した。（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールに対する脱水素酵素活性を１００とした相対活性で表し、表２に示した。実施例１で得られた酵素を様々な基質に50mMに対して反応させ、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールに対する活性を１００とした相対活性で表し、表２に示した。
【００９３】
【表２】
-------------------------------------------------
基質 相対活性 (%)
-------------------------------------------------
(2S,3S)-2,3-ブタンジオール 100
(2R,3R)-2,3-ブタンジオール 2.89
meso-2,3-ブタンジオール 0
アセトイン 0.26
(S)-2-ブタノール 43.3
(R)-2-ブタノール 1.11
(S)-1,2-プロパンジオール 55.3
(R)-1,2-プロパンジオール 0.90
(S)-3-クロロ-1,2-プロパンジオール 0
(R)-3-クロロ-1,2-プロパンジオール 3.62
-------------------------------------------------
【００９４】
実施例１で得られた酵素を様々な基質に50mMに対して、標準反応条件で還元活性を測定した。２，３−ブタンジオンに対する還元活性を１００とした相対活性で表し、表３に示した。
【００９５】
【表３】
［実施例７］（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の活性化測定種々の２価イオン（１mM）を含む標準反応条件で（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性を測定し、イオンを添加しない条件の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性を１００とした相対活性で表し、表４に示した。本発明による（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は２価イオンによってほとんど活性化されなかった。
【００９７】
【表４】
［実施例８］（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の部分アミノ酸配列
実施例１で得られた酵素を用いて、プロテインシーケンサーによりＮ末端アミノ酸配列を解析した。アミノ酸配列を配列番号：３に示した。また、SDS-PAGEのゲルより、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を含むゲル断片を切り出し、２回洗浄後、リジルエンドペプチダーゼを用いて、３５℃で終夜イン・ゲル・ダイジェスションを行った。消化したペプチドを逆相HPLC（東ソー製TSK gel ODS-80-Ts、２．０mm × ２５０mm）を用い、０．１％トリフルオロ酢酸（TFA）中でアセトニトリルのグラジエント溶出によりペプチドを分離し、分取した。分取したペプチド断片をプロテインシーケンサー（アプライド・バイオシステム製）によりアミノ酸配列を解析した結果、１種類のアミノ酸配列が得られた。ペプチドＡのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：４に示した。
【００９９】
配列番号：３：N末端アミノ酸配列
Met-Ser-Leu-Asn-Gly-Lys-Val-Ile-Leu-Val-Thr
配列番号：４：ペプチドA
Ile-Ile-Asn-Ala-Cys-Ser-Ile-Ala-Gly-His
【０１００】
［実施例９］ツーグレア・ラミゲラからの染色体ＤＮＡの調製
ツーグレア・ラミゲラ DSM 287株よりCTAB法（Current Protocol, Unit 2.4 Preparation of Genomic DNA from Bacteria）により、染色体ＤＮＡを精製した。
【０１０１】
［実施例１０］（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子のコア領域のＰＣＲによるクローニング
N末端アミノ酸配列に対応するセンスプライマーN及びペプチドAに対応したアンチセンスプライマーA、Bを合成した。それぞれの塩基配列を配列番号：５(プライマーN)、６(プライマーA)、７(プライマーB)に示した。
【０１０２】
プライマーN（配列番号：５）
GTCGAATTCAAYGGCAARGTSATYYTSGTNAC
プライマーA（配列番号：６）
GTCGAATTCGCRATSGARCASGCRTTRATDA
プライマーB（配列番号：７）
GTCGAATTCGCRATRCTRCASGCRTTRATDA
【０１０３】
［実施例１１］ＰＣＲ条件
ツーグレア・ラミゲラ由来染色体ＤＮＡ２５０ng、ExTaq ２．０Ｕ、プライマーN２０pmol、プライマーAとプライマーＢを等量混合したプライマー混合物２０pmol、ｄＮＴＰ２０nmol、ＥｘＴａｑ用緩衝液を含む５０μLの反応液をGeneAmp PCRSystem 2400（Applied Biosystems製）に添加し、９４℃、２分間３０秒熱処理し、更に９４℃３０秒、４５℃３０秒、７０℃１分のサイクルを計３０回行った。その結果、特異的なバンドが取得できた。
【０１０４】
［実施例１２］（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子のコア領域のＰＣＲ断片のサブクローニング
実施例１１で得られたＤＮＡ断片をアガロースを用いて電気泳動して精製した。精製したＤＮＡ断片を制限酵素EcoRIで切断し得られた断片を、ベクターpUC118 EcoR I/BAP（宝酒造製）と、Takara Ligation Kitを用いてライゲーションし、大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン（５０μg/mL）を含むＬＢ培地（１%バクト−トリプトン、０．５%バクト−酵母エキス、１%塩化ナトリウム、以下、LB培地と略す）プレート上で生育させた。
【０１０５】
目的とするプラスミドを有する形質転換株よりプラスミドを精製し、挿入ＤＮＡの塩基配列を解析した。ＤＮＡ塩基配列の解析には、BigDye Terminator Cycle Sequencing ready Reaction Kit (Applied Biosystems製)を用いてＰＣＲを行い、PRISM 377 DNA Sequencer(Applied Biosystems製)により行った。決定されたコア領域の塩基配列をそれぞれ配列番号：８として示した。
【０１０６】
［実施例１３］（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子のコア領域の周辺ＤＮＡのサブクローニング
ツーグレア・ラミゲラの染色体ＤＮＡを制限酵素BstYI, NspI, EcoRI, ,BamHI, PstI, XbaIでそれぞれ消化し、T4リガーゼを用いて16℃で終夜セルフ・ライゲーション反応により、各断片を環化させた。次にプライマーZrDH-c5u（配列番号：９）、ZrDH-c3d（配列番号：１０）を各１００pmol、dNTP１０nmol、セルフ・ライゲーションさせたＤＮＡ１００ng、La-Taq用緩衝液(宝酒造製)、La-Taq２．０Ｕ（宝酒造製）を含む５０μLの反応液を用い、変性（９４℃、３０秒）、アニール（６０℃、３０秒）、伸長（７２℃、１０分）を30サイクル、GeneAmp PCR System 2400（Applied Biosystems製）を用いて行った。PCR反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、BstYI, BamHIで消化した鋳型ＤＮＡに対応して、約２８００ bp、３６００ bpのＤＮＡ断片が検出できた。得られたそれぞれのDNA断片をZrDH-1、ZrDH-2とする。
【０１０７】
ZrDH-c5u（配列番号：９）
GCGAGATCAGCGCCTTCC
ZrDH-c3d（配列番号：１０）
TGTCGACGGCGTGCTCTG
【０１０８】
ＰＣＲで増幅されたそれぞれのＤＮＡ断片をアガロースを用いて電気泳動して精製した。精製したＤＮＡ断片をDye Terminator Cycle Sequencing FS ready Reaction Kit (Applied Biosystems製)を用いてＰＣＲを行い、PRISM 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems製)により行った。
解析したそれぞれのDNA断片の塩基配列を、コア領域の５’−上流側（５U）、３’−下流側に分け、それぞれZrDH-５U（配列番号：１１）、ZrDH-３D（配列番号：１２）として示した。
【０１０９】
ZrDH-1, ZrDH-2の各塩基配列から、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）検索により（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子の配列を決定した。決定したＤＮＡ配列は配列番号：１に、コードするタンパク質の配列は配列番号：２に示す。これらの合成、ＯＲＦ検索は、Genetyx-ATSQ/WIN、およびGenetyx-WIN（ともにソフトウェア開発株式会社製）ソフトの上で行った。
【０１１０】
［実施例１４］（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子のクローニング
（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の構造遺伝子の塩基配列を元に発現ベクター構築用のプライマーZrDH-AT1（配列番号：１３）、ZrDH-TA1（配列番号：１４）を合成した。プライマーを各２０pmol、dNTP２０nmol、ツーグレア・ラミゲラ由来染色体ＤＮＡ１００ng、Pfu-DNA polymerase用緩衝液 (STRATAGENE製)、Pfu-DNA polymerase２．５Ｕ (STRATAGENE製)を含む５０μLの反応液を用い、変性（９５℃、３０秒）、アニール（５５℃、１分）、伸長（７２℃、１分３０秒）を３０サイクル、GeneAmp PCR System 2400 (Applied Biosystems製)を用いて行った。
【０１１１】
ZrDH-AT1（配列番号：１３）
GTCGAATTCAATCATGAGTTTAAATGGCAAAGTCATTTTGGTAACC
ZrDH-TA1（配列番号：１４）
GTCAAGCTTCTAGATTAACGATAGACGATACCGCCATC
【０１１２】
ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的なバンドが検出できた。
得られたＤＮＡ断片を、１％低融点アガロースを用いて電気泳動して精製した。精製したＤＮＡ断片を制限酵素EcoRI、HindIIIで二重消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Sephaglas (ファルマシア製) により精製した。
【０１１３】
得られたＤＮＡ断片を、EcoRI、HindIIIで二重消化したpSE420D（特開2000-189170）とTakara Ligation Kitを用いて、ライゲーションし、大腸菌JM109株を形質転換した。
【０１１４】
形質転換株をアンピシリン（５０μg/mL）を含むＬＢ培地プレート上で生育させ、いくつかのコロニーよりプラスミドを精製し、挿入断片の塩基配列を解析した。目的とする（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子を持つプラスミドをpSE-ZRD1とした。構築したプラスミドpSE-ZRD1のマップを図５に示した。
【０１１５】
［実施例１５］組換え（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の大腸菌による生産
（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子の発現プラスミドpSE-ZRD1で形質転換された大腸菌JM109株をアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、0.1mM IPTG（イソプロピルチオガラクトピラノシド）を加え、さらに４時間培養を行った。
【０１１６】
菌体を遠心分離により集菌後、０．０２% ２−メルカプトエタノールを含む１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、密閉式超音波破砕装置ＵＣＤ−２００ＴＭ（コスモバイオ製）を用いて４分間処理することで、菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液中として回収した。
【０１１７】
［実施例１６］組換え（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の活性測定
実施例１５で調製した組換え（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を用いて種々の基質に対する活性を測定し、プラスミドを含有しない状態で実施例１５と同様に調製した無細胞抽出液の活性と比較した、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールに対する酸化反応の結果を表５に、２，３−ブタンジオンに対する還元反応の結果を表６に示した。
【０１１８】
【表５】
【表６】
［実施例１７］ （２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素とマイコバクテリウム由来ギ酸脱水素酵素遺伝子を共発現するプラスミドpSF-ZRD1の構築実施例１４で構築したpSE-ZRD1をEcoRI,HindIIIの2つの制限酵素で二重消化し、ツーグレア・ラミゲラ由来の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を含むＤＮＡ断片を調製した。
【０１２１】
マイコバクテリウム由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を発現するプラスミドpSE-MF26 (特願2002-207507)をEcoRI,HindIIIの2つの制限酵素で二重消化し、マイコバクテリウム由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を含むDNA断片を調製、pSE-ZRD1より同酵素で切り出したツーグレア・ラミゲラ由来の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片とT4 DNAリガーゼで連結し、ギ酸脱水素酵素と（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を同時に発現可能なプラスミドpSF-ZRD1を得た。構築したプラスミドpSF-ZRD1のマップを図６に示した。
【０１２２】
［実施例１８］ （２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素とマイコバクテリウム由来ギ酸脱水素酵素の大腸菌における同時発現
マイコバクテリウム由来のギ酸脱水素酵素とツーグレア・ラミゲラ由来の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素を共発現可能なプラスミドpSF-ZRD1により大腸菌JM109株を形質転換した。
組換え大腸菌を液体LB培地に植菌し、３０℃で終夜培養した後、IPTGを０.１ mM添加し、さらに４時間培養した。得られた大腸菌を集菌し、酵素活性の測定をおこなった。
【０１２３】
［実施例１９］ pSF-ZRD1で形質転換した大腸菌の酵素活性
実施例１８により調製したpSF-ZRD1で形質転換した大腸菌（培養液6.3 mL相当）を、実施例１５に記載の方法により菌体破砕し、菌体抽出液を調製し、酵素活性の測定に用いた。ギ酸脱水素酵素活性の測定は、100 mMリン酸カリウム緩衝液 (pH 7.0 ) 、２.５ mM ＮＡＤ＋、１００ mM ギ酸及び酵素を含む反応液中で３０℃でおこなった。１Ｕは、上記反応条件において1分間に１μmolのNADHの生成を触媒する酵素量とした。組換え大腸菌から得た粗酵素液の酵素活性は、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性で17.4 U/mg-protein、ギ酸脱水素酵素活性で0.105 U/mg-proteinであった。
【０１２４】
【発明の効果】
光学活性アルコールなどの生産に有用なＮＡＤ＋依存性の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素ならびにそれをコードするＤＮＡが提供された。本酵素を利用することにより、光学純度の高い（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールならびに（Ｓ）−２−ブタノールの効率的な生産方法が提供された。本発明の（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素は、ＮＡＤＰ＋よりも安定なＮＡＤ＋依存性であることから、より容易に工業的な製造工程に応用することができる。
【０１２５】
本発明による光学純度の高い（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール、（Ｓ）−２−ブタノールの製造方法は、液晶や医薬品原料等の製造方法として有用である。
【０１２６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 （２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素活性を示す画分を濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析を行った結果を示す写真である。
【図２】 （２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の酸化反応における至適pHの測定結果を示した図である。最大活性を１００とした相対活性で表した。
【図３】 （２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の還元反応における至適pHの測定結果を示した図である。最大活性を１００とした相対活性で表した。
【図４】 （２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素の作用至適温度の測定結果を示す図である。最大活性を１００とした相対活性で表した。
【図５】 実施例１４で得られたプラスミドpSE-ZRD1のプラスミドマップである。
【図６】 実施例１７で得られたプラスミドpSF-ZRD1のプラスミドマップである。
Claims (9)
- 下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号：１に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、下記（i）から（iv）に示す活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
(i) ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールに作用し、（Ｓ）−アセトインを生成する、
(ii) 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、２，３−ブタンジオンを還元し、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールを生成する、
(iii) ２-ブタノールの（Ｓ）配置の水酸基を優先的に酸化する、及び
(iv) １，２−プロパンジオールの（Ｓ）配置の水酸基を優先的に酸化する；
（ｄ）配列番号：１に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ下記（i）から（iv）に示す活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、
(i) ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールに作用し、（Ｓ）−アセトインを生成する、
(ii) 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、２，３−ブタンジオンを還元し、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールを生成する、
(iii) ２-ブタノールの（Ｓ）配置の水酸基を優先的に酸化する、及び
(iv) １，２−プロパンジオールの（Ｓ）配置の水酸基を優先的に酸化する。 - 請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質。
- 請求項１に記載されたポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項１に記載されたポリヌクレオチド、または請求項３に記載のベクターを保持する形質転換体。
- ツーグレア・ラミゲラ(Zoogloea ramigera)を培養する工程を含む配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の製造方法。
- 請求項４に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、請求項２に記載の蛋白質の製造方法。
- 請求項２に記載の蛋白質、それらを産生する微生物、およびそれらの処理物からなる群から選択されるいずれかの酵素活性物質を、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下でケトンに作用させ、生成するアルコールを回収する工程を含むアルコールの製造方法。
- ケトンが、２，３−ブタンジオンであり、アルコールが（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ブタンジオールである請求項７に記載のアルコールの製造方法。
- 請求項２に記載の蛋白質、それらを産生する微生物、およびそれらの処理物からなる群から選択されるいずれかの酵素活性物質を、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの存在下で、ラセミ体アルコールに作用させ、光学異性体の一方を優先的に酸化し、残存する光学活性アルコールを取得することを特徴とする、光学活性アルコールの製造方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003162872A JP4294382B2 (ja) | 2003-06-06 | 2003-06-06 | （２ｓ，３ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素 |
| US10/858,707 US20050003500A1 (en) | 2003-06-06 | 2004-06-02 | (2S, 3S) -2,3-butanediol dehydrogenase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003162872A JP4294382B2 (ja) | 2003-06-06 | 2003-06-06 | （２ｓ，３ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004357639A JP2004357639A (ja) | 2004-12-24 |
| JP4294382B2 true JP4294382B2 (ja) | 2009-07-08 |
Family
ID=33549180
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003162872A Expired - Lifetime JP4294382B2 (ja) | 2003-06-06 | 2003-06-06 | （２ｓ，３ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20050003500A1 (ja) |
| JP (1) | JP4294382B2 (ja) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1985700A4 (en) | 2006-02-14 | 2009-08-12 | Kaneka Corp | NEW (S, S) -BUTANEDIOL DEHYDROGENASE, GENES FOR IT AND USE THEREOF |
| US8828704B2 (en) | 2006-05-02 | 2014-09-09 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Fermentive production of four carbon alcohols |
| US8962298B2 (en) * | 2006-05-02 | 2015-02-24 | Butamax Advanced Biofuels Llc | Recombinant host cell comprising a diol dehydratase |
| KR20090033864A (ko) | 2006-06-05 | 2009-04-06 | 다이셀 가가꾸 고교 가부시끼가이샤 | 광학 활성 알코올의 제조방법 |
| US8426174B2 (en) * | 2007-05-02 | 2013-04-23 | Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc | Method for the production of 2-butanol |
| US20080274522A1 (en) * | 2007-05-02 | 2008-11-06 | Bramucci Michael G | Method for the production of 2-butanone |
| CA2727549C (en) | 2008-06-09 | 2014-08-26 | Lanzatech New Zealand Limited | Production of butanediol by anaerobic microbial fermentation |
| EP2445890B1 (en) * | 2009-06-22 | 2015-05-06 | SK Biopharmaceuticals Co., Ltd. | Method for preparation of carbamic acid (r)-1-aryl-2-tetrazolyl-ethyl ester |
| US8404461B2 (en) * | 2009-10-15 | 2013-03-26 | SK Biopharmaceutical Co. Ltd. | Method for preparation of carbamic acid (R)-1-aryl-2-tetrazolyl-ethyl ester |
| WO2014209230A1 (en) * | 2013-06-25 | 2014-12-31 | National University Of Singapore | Preparation of enantiopure vicinal diols and alpha-hydroxyketones from racemic and meso-epoxides by tandem biocatalysis via enantioselective hydrolysis and oxidations |
| CN111718965A (zh) * | 2020-06-17 | 2020-09-29 | 宁波酶赛生物工程有限公司 | 一种(2s,3s)-2,3-丁二醇的制备方法 |
| CN114075526B (zh) * | 2021-11-22 | 2023-09-05 | 齐鲁工业大学 | 一种高效生产(2s,3s)-2,3-丁二醇的基因工程菌及其构建方法与应用 |
| CN114703156B (zh) * | 2022-02-15 | 2023-07-11 | 浙江大学杭州国际科创中心 | meso-2,3-丁二醇脱氢酶及其突变体和应用 |
-
2003
- 2003-06-06 JP JP2003162872A patent/JP4294382B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-06-02 US US10/858,707 patent/US20050003500A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2004357639A (ja) | 2004-12-24 |
| US20050003500A1 (en) | 2005-01-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4630486B2 (ja) | 新規な（ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素、その製造方法、及びこれを利用した光学活性アルコールの製造方法 | |
| JP4651896B2 (ja) | （ｒ）−２−オクタノール脱水素酵素、該酵素の製造方法、該酵素をコードするｄｎａおよびこれを利用したアルコールの製造方法 | |
| US6969600B2 (en) | Carbonyl reductase, method for producing said enzyme, DNA encoding said enzyme, and method for producing alcohol using said enzyme | |
| JP4213524B2 (ja) | 新規なカルボニル還元酵素、その酵素をコードするｄｎａを含むポリヌクレオチド、その製造方法、およびこれを利用した光学活性アルコールの製造方法 | |
| JP4294382B2 (ja) | （２ｓ，３ｓ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素 | |
| US7250278B2 (en) | α-keto acid reductase, method for producing the same, and method for producing optically active α-hydroxy acids using the same | |
| JP4587348B2 (ja) | 新規な（ｒ）−２，３−ブタンジオール脱水素酵素 | |
| JP4688313B2 (ja) | 新規なエノン還元酵素、その製造方法、およびこれを利用したα，β−不飽和ケトンの炭素−炭素２重結合を選択的に還元する方法 | |
| JP4396972B2 (ja) | 新規ｒ体特異的アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子、及び、これを利用した光学活性アルコールの製造方法 | |
| JP5030067B2 (ja) | 新規アルカンポリオール脱水素酵素 | |
| JP2005218348A (ja) | 光学活性α−ヒドロキシアミドの製造方法 | |
| JP4603171B2 (ja) | （ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造に有用な酵素をコードする遺伝子、その取得方法、およびこれを利用した光学活性アルコールの製造方法 | |
| JP4884996B2 (ja) | 新規な（ｓ）−ｎ−ベンジル−３−ピロリジノール脱水素酵素、その製造方法、及びこれを利用したアルコールの製造方法 | |
| JP4397088B2 (ja) | 還元酵素をコードする遺伝子 | |
| JP2005095022A (ja) | 光学活性アルコールの製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060317 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20070611 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20081112 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090107 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090406 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090408 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120417 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4294382 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120417 Year of fee payment: 3 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120417 Year of fee payment: 3 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130417 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130417 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140417 Year of fee payment: 5 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |