KR101564315B1

KR101564315B1 - 신규 포름산 탈수소효소 및 이를 이용한 포름산의 생산방법

Info

Publication number: KR101564315B1
Application number: KR1020140067378A
Authority: KR
Inventors: 이정걸; 박지현; 쿠마 씽 러우샨; 이정임; 김선창
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2014-06-03
Filing date: 2014-06-03
Publication date: 2015-10-29
Anticipated expiration: 2034-06-03

Abstract

본 발명은 신규 포름산 탈수소효소의 유전자로부터 발현되는 독립적 환원활성을 보유한 포름산 탈수소화효소, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질 전환된 균주로부터 포름산 탈수소효소를 제조하는 방법 및 환원반응을 통하여 이산화탄소 또는 바이카보네이트로부터 포름산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규 포름산 탈수소효소 및 이를 이용한 포름산의 생산방법 {A novel formate dehydrogenase and formate production using the said enzyme}

본 발명은 클로스트리디움 클로스트리디폼 유래 신규 포름산 탈수소효소 및 이 효소를 이용하여 이산화탄소에서 포름산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

생체촉매 반응들은 기존 화학촉매들이 수행할 수 없었던 반응들을 포함한 다양한 촉매반응들을 생체친화적인 환경에서 수행함으로써 생명공학의 발전과 함께 산업적으로 빠르게 성장 중인 분야이다. 대표적으로 키랄성 화합물, 알코올, 알데하이드, 아미노산 및 의약물질 중간체의 합성, 생분해 또는 생체 응용에 적합한 고분자의 합성, 분석 및 진단용 바이오센서의 개발 등에 응용되고 있다. 또한 현재 이산화탄소 농도의 증가와 이에 따른 지구 온난화로 인한 문제로 학계와 산업계에서 이산화탄소의 저감 연구와 더불어 포름산 탈수소효소 등에 의한 이산화탄소의 환원반응에 의해 새로운 에너지를 생산하고자 하는 응용분야의 연구를 수행하고 있다. 즉 포름산 탈수소효소를 통해 온실가스인 이산화탄소를 산업적으로 가치있는 포름산으로 변환할 수 있다. 이러한 중요성 및 유용성에도 불구하고 포름산 탈수소효소의 환원반응은 산화반응에 비해 거의 보고 된 바가 없다. 또한 일반적 탈수소효소의 특성상 산화반응이 환원반응에 비해 열역학적으로 월등히 유리하고 보다 잘 일어남에 따라 독립적인 환원활성을 나타내는 포름산 탈수소효소는 거의 보고된 바 없다. 따라서 이산화탄소를 포름산으로 변환하는 독립적인 환원성을 갖는 신규 포름산 탈수소효소를 확보하는 것은 이를 통해 이산화탄소로부터 산업적으로 중요한 다양한 케미칼의 생산에 막중한 역할을 할 것이다.

현재 이산화탄소를 변환시키는 방법으로는 화학적으로 메탄올, 연료 등으로 변환시키는 법과 생물학적으로 유기물로 변환시키는 방법 등이 활발히 연구되고 있다(비특허문헌 1 내지 3 참조). 이 중에서 이소시트르산탈수소효소(Isocitrate Dehydrogenase), 피브르산 탈수소효소(Pyruvate Dehydrogenase), 포름산 탈수소효소(Formate Dehydrogenase), 메탄올 탈수소효소(Methanol Dehydrogenase)를 사용하여 이산화탄소를 환원시키는 방법들이 보고되었다. 이들 중에서 이산화탄소를 포름산으로 환원시키는 연구는 상당히 장래성이 있는 방법으로 알려져 있다.

한편, 상기 효소 중 이산화탄소를 포름산으로 환원시키는 포름산 탈수소효소는 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)를 전자수용체로 사용하는 것(NAD 의존성)과 사용하지 않는 것(NAD 비의존성)이 존재한다. 이 중 NDA 비의존성 포름산 탈수소효소는 이산화탄소를 제거하는 활성은 매우 우수하나, 텅스텐이나 몰리브데넘과 같은 금속이온, 철-황 클러스터 및 셀레노시스테인과 같은 매우 예민한 작용기를 포함하고 있어(비특허문헌 3 참조) 산소에 극히 불안정하기 때문에 산업적으로 이용하기 어렵다.

그러므로 이산화탄소를 포름산으로 전환하는 효소로는 NAD 의존성 포름산 탈수소효소, 그 중에서도 특히 캔디다 보이디니(Candida boidinii)로부터 유래한 포름산 탈수소효소(CbFDH)가 가장 대표적으로 사용된다. 상기 캔디다 보이디니 유래 포름산 탈수소효소 역시 효소를 통한 환원 반응 과정에서 이산화탄소를 감소시키는 생촉매로서 역할을 하게 되는데, 그 활성이 중성에서 0.5mU/로서 지극히 낮다는 한계가 있다.

[선행 기술 문헌]

특허문헌 한국등록특허 제10-068049호

비특허문헌 1. Masuda, S. Energy Conv. Mgmt. 1995, 36 , 567-572.

비특허문헌 2. Kakumoto, T. Energy Conv. Mgmt . 1995, 36 , 661-664.

비특허문헌 3. Souma, Y.; Ando,H.; Fujiwara, M.; Kieffer, R. Energy Conv. Mgmt . 1995, 36 ,593-596.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 첫 번째 목적은 이산화탄소를 독립적으로 환원시키는 포름산 탈수소효소를 제공하는 것이다.

본 발명의 두 번째 목적은 상기 포름산 탈수소화효소를 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 세 번째 목적은 상기 포름산 탈수소화효소의 유전자를 포함한 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 네 번째 목적은 형질전환된 재조합 대장균을 포함하는 모든 형질전환 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다섯 번째 목적은 형질전환된 균주를 이용한 재조합 포름산 탈수소효소 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 이산화탄소 환원활성 보유 포름산 탈수소효소를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 포름산 탈수소효소는 클로스트리디움 클로스트리디폼(Clostridium clostridiiforme) 유래한 것이 바람직하나 다른 유전공학적인 방법 또는 화학적인 방법에 의하여 합성하는 것도 가능하다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 효소를 코딩하는 포름산 탈수소효소 유전자를 제공한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 포름산 탈수소효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 재조합 발현벡터로 형질전환된 균주를 배양하여 포름산 탈수소효소를 배양하여 포름산 탈수소효소를 제조하는 방법을 제공한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 포름산 탈수소효소의 환원 반응을 통해 포름산을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 방법은 기질로 바이카보네이트를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명에서는 이산화탄소로부터 포름산을 생산할 수 있는 클로스트리디움 클로스트리디폼(KCCM12099 Clostridiumclostridiiforme) 유래 신규 포름산 탈수소효소를 소개하고, 상기 시스템을 이용하여 이산화탄소로부터 효율적으로 포름산을 생산할 수 있는 반응 조건을 제시하고자 한다.

본 발명은 서어던 하이브리다이제이션과 콜로니 혼성화를 통하여 클로스트리디움 클로스트리디폼으로부터 포름산 탈수소화효소 유전자를 클로닝하는 것을 특징으로 한다. 또한 본 발명은 포름산의 생산방법에 있어서, 클로스트리디움 클로스트리디폼 유래 포름산 탈수소효소를 생성하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 유전자는 서열번호 4의 염기서열을 가지는 것이 바람직하나, 유전자 코드의 디제러시 등을 고려하여 서열번호 4에 기재된 서열과 적어도 85% 이상, 바람직하게는 적어도 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 상동성을 가지는 서열이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 그 기능적 단편을 가지는 포름산 탈수소화효소를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 상기 효소의 분자량은 79 kDa인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 본 발명의 상기 효소를 코딩하는 포름산 탈수소효소 유전자를 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명의 상기 포름산 탈수소효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 균주를 배양하여 포름산 탈수소효소를 제조하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 포름산 탈수소효소를 유효성분으로 포함하는 포름산 생산용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 포름산 탈수소효소는 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열을 가진 것을 특징으로 한다. 또, 서열번호 3의 아미노산 서열에 대해서, 이들 아미노산서열을 가진 단백질이 표시하는 포름산 탈수소효소 활성이 손상되지 않는 범위 내에서, 1 이상의 아미노산의 결실, 치환 및 부가의 적어도 1 종의 변이가 도입된 변이 포름산 탈수소효소도 본 발명에 관한 포름산 탈수소효소에 포함된다.

또, 본 발명에는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가진 포름산 탈수소효소를 코딩하는 포름산 탈수소효소 유전자가 포함되고, 그 유전자 서열로서는 서열번호 4 로 표시되는 것을 들 수 있다. 또, 이들 서열번호 4의 염기서열을 변이시켜서 얻게 되는 상기한 변이 포름산 탈수소효소를 코딩하는 변이 포름산 탈수소효소 유전자도 본 발명에 관한 포름산 탈수소효소 유전자에 포함된다.

또, 본 발명에는, 상기 포름산 탈수소효소 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터에 의해서 형질전환된 형질전환체가 포함된다. 또한, 본 발명에는 이 형질전환체를 배양하여 얻게 되는 배양물로부터 포름산 탈수소효소를 분리하는 것을 특징으로 하는 포름산 탈수소효소의 제조방법이 포함된다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 포름산 탈수소화효소 유전자는 클로스트리디움 클로스트리디폼의 균체로부터 분리된 것이다. 포름산 탈수소화효소 유전자를 가진 균주로부터 염색체 DNA를 취득한 후, 설계한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하고, 클로스트리디움 클로스트리디폼 균주의 염색체 DNA를 주형으로 해서 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 행하여, 포름산 탈수소효소 유전자를 부분적으로 증폭한다. 이와 같이 해서 얻게 된 PCR 증폭 단편은 클로스트리디움 클로스트리디폼 균주의 포름산 탈수소효소 유전자에 100% 가까운 상동성을 가진 단편으로서, 콜로니하이브리디제이션을 행할 때의 프로브로서 높은 S/N비를 기대할 수 있는 동시에, 하이브리디제이션의 스트린전시(stringency)제어를 용이하게 한다. 상기의 PCR 증폭 단편을 적당한 시약을 사용해서 표지하고, 상기 염색체 DNA 라이브러리에 대해서 콜로니 하이브리디제이션을 행하여, 포름산 탈수소효소 유전자를 선발한다 (Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 603페이지, 1994년).

상기의 방법에 의해 선발된 대장균으로부터 알칼리법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 161페이지, 1994년)을 사용하여 플라스미드를 회수함으로써, 포름산 탈수소효소 유전자를 함유하는 DNA단편을 얻을 수 있다. 또한, 상기 방법에 의해 염기서열을 결정한 후에는, 상기 염기서열을 가진 DNA단편의 제한효소에 의한 분해에 의해 조제한 DNA 단편을 프로브로 사용하여 하이브리다이즈함으로써 본 발명의 전체 유전자를 얻는 것이 가능하다. 서열번호 4에는 본 발명의 포름산 탈수소효소 유전자의 염기서열을 서열번호 3에는 상기 유전자가 코딩하는 아미노산서열을 표시한다.

본 발명의 형질전환된 미생물은 본 발명의 재조합벡터를 상기 재조합벡터를 제작할 때 사용한 발현벡터에 적합한 숙주 속에 도입함으로써 얻게 된다. 본 발명에 사용된 발현벡터로서는 pET28a을 사용하였으나 상기의 요건을 만족하는 발현벡터이면 어느 것이나 사용 가능하다.

본 발명에 관한 포름산 탈수소효소의 제조는, 이것을 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터에 의해 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물(배양균체 또는 배양상청액) 속에 유전자 산물인 포름산 탈수소효소를 생성 축적시켜, 배양물로부터 효소를 취득함으로써 행하여진다.

포름산 탈수소효소의 취득 및 정제는, 얻게 되는 배양물로부터 균체 또는 상청액을 원심 회수하여, 균체파쇄, 친화성 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환 크로마토그래피 등을 단독으로 또는 조합함으로써 행할 수 있다.

본 발명에서 환원성을 보이는 포름산 탈수소효소를 개발하고자 클로스트리디움 클로스트리디폼으로부터 포름산 탈수소효소 유전자를 클로닝하였다. 발현된 재조합 클로스트리디움 클로스트리디폼 유래의 포름산 탈수소효소가 NADH를 조효소로 사용한 환원반응을 통해 이산화탄소로부터 포름산를 제조할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 산업적으로 유용한 포름산 탈수소효소를 제조하기 위하여 클로스트리디움 클로스트리디폼의 유전자로부터 포름산 탈수소효소를 암호화하는 유전자를 클로닝하고, 전기 유전자의 염기서열 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 분석한다. 본 발명의 포름산 탈수소효소는 인산화탄소를 기질로 하여 환원반응을 촉매하여 포름산를 형성하는 효소로서, 보다 바람직하게는 환원반응에 대한 특이성을 갖고 이산화탄소를 포름산으로 전환시킬 수 있는 능력을 갖는 포름산 탈수소효소를 의미한다.

본 발명의 포름산 탈수소효소는 다음의 특징을 갖는다: (ⅰ) 분자량이 약 79 kDa; (ⅱ) 기존에 알려진 포름산 탈수소효소는 단독으로 이산화탄소를 포름산로 환원시키는 활성을 보이는 것은 클로스트리디움 칼복시데보란스외엔 보고되지 않고 있다. 본 발명의 포름산 탈수소효소는 다중효소 시스템이 아닌 단독으로 NADH 조효소를 사용하여 이산화탄소를 환원시켜 포름산을 생산한다. 따라서 이산화탄소에서 포름산을 생산하는 본 발명의 효소는 매우 특이하다 할 것이며, 경제적인 포름산의 생물촉매 생산에 유용하게 적용될 것이다.

본 발명에서 규명한 클로스트리디움 클로스트리디폼 유래의 포름산 탈수소효소는 NADH 조효소를 이용하고 이산화탄소를 환원시켜 포름산을 효율적으로 생산할 수 있다.

도 1은 벡터 pET28a의 벡터맵으로 클로스트리디움 클로스트리디폼의 염색체에서 포름산 탈수소효소 유전자를 지니고 있는 단편을 찾아 대장균에서 이용되는 벡터에 클로닝한 것이다.
도 2는 클로스트리디움 클로스트리디폼으로부터 유래된 포름산 탈수소화효소의 SDS-PAGE 젤 사진이다.
도 3은 환원반응을 통해 포름산의 생산을 위한 최적 pH를 나타낸 도이다.
도 4는 환원반응을 통해 포름산 탈수소효소의 동역학적 매개변수 그래프이다.

이하, 본 발명을 비한정적인 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것이나 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 클로스트리디움 클로스트리디폼으로부터 신규 포름산 탈수소효소 유전자의 클로닝

클로스트리디움 클로스트리디폼을 37에서 배양하고, 원심분리(8000 g, 10분)하여 균체를 수득하였다. 수득된 균체로부터 게놈 DNA를 분리하고, 프라이머 ClFDH 5'-CAT ATG ATG GAT AAA AAA GTT TTA ACT GTT-3' (서열번호 1) ClFDH 5'-CTC GAG TTA AAC ATT CAT CTT TTT CTT TA-3' (서열번호 2)를 제작하여 PCR을 행하였다. PCR 산물 즉, 클로스트리디움 클로스트리디폼에서 증폭된 효소 유전자를 pGEM T-easy 벡터에 삽입하여 염기서열을 분석하였다 (서열번호 4).

실시예 2: 재조합 발현 벡터 및 재조합 균주 제조

상기 실시예 1에 따른 포름산 탈수소효소를 암호화하는 유전자를 이용하여, 전기 포름산 탈수소효소를 대장균에서 대량으로 발현시키기 위하여, 발현 벡터 pET28a(Novagen, 미국)의 Nde1과 Xho1 부위에 상기 효소 유전자를 삽입한 후 대장균 BL21(DE3)(NEB, 영국)에 형질 전환시켰다

실시예 3: 재조합 포름산 탈수소효소의 발현 및 순수 분리

상기 실시예 2에서 제조된 재조합 균주를 LB 배지에 접종하고 16℃에서 24시간 동안 배양한 후 SDS-PAGE 젤에서 발현된 단백질을 확인하였다 (도 2).

상기 실시예 2의 방법으로 발현시킨 재조합 포름산 탈수소효소를 정제하기 위하여, 재조합 균주 배양액을 원심분리 (8000×g, 10분)하여 균체만을 모은 후, 초음파 처리하여 대장균의 세포벽을 파쇄하고, 20,000×g에서 20분간 원심분리하여 침전물(균체)을 제거하고 상등액을 수득하였다. 수득한 후, 최종적으로 Ni-NTA His-tag 결합 크로마토그래피(Qiagen, 독일)를 수행하여, 재조합 포름산 탈수소효소를 순수 분리하였다.

실시예 4: 환원 반응을 통한 포름산 생산을 위한 최적 pH

상기 실시예 3에서 제조한 포름산 탈수소효소를 이용하여 포름산의 생산실험을 다음과 같은 조건에서 수행하였다. 포름산 탈수소효소를 이용하는 본 발명의 포름산 생산방법에서, 반응 시 pH를 변화시키면서 포름산의 생산량을 확인하였다.

효소 정제 방법은 실시예 3과 같이 수행하였으며, 100 mM의 기질 용액, 30℃에서, pH 4.0-9.0까지 변화시키면서 포름산의 생산량을 확인하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, pH를 8.0으로 유지하였을 때, 포름산의 생산량이 가장 높았다. 따라서, 본 발명의 포름산 생산 방법에서 최적 pH는 8.0임을 알 수 있었다.

실시예 5: 포름산 탈수소효소의 동역학변수

다양한 농도의 기질(0.1-500 mM)을 이용하여 효소 반응을 시킨 후, 비선형 회귀분석을 통하여 동역학적 매개변수를 측정하였다(도 4). 포름산 탈수소효소의 바이카보네이트 대한 K_m 값은 65.7 mM, V_max값은 12.1 U mg-protein^-1로 결정되었다.

실시예 6: 바이카보네이트로부터 포름산의 생산실험

최적화한 조건에서 클로스트리디움 클로스트리디폼 유래 포름산 탈수소효소를 이용한 포름산 생산실험을 수행하였다. 반응액 내의 포름산 탈수소효소 20 ㎕, 75 mM 기질 농도, pH 8 및 반응온도 30℃로 조절한 후 실험한 결과 3시간 반응시켰을 때 약 24%의 전환율을 보였다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> A novel formate dehydrogenase and formate production using the said enzyme <130> HY140561 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 catatgatgg ataaaaaagt tttaactgtt 30 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 ctcgagttaa acattcatct ttttcttta 29 <210> 3 <211> 709 <212> PRT <213> Clostridium clostridiiforme <400> 3 Met Asp Lys Val Lys Leu Thr Val Cys Pro Tyr Cys Gly Ala Gly Cys 1 5 10 15 Asn Leu Tyr Leu His Val Lys Asn Gly Lys Ile Ile Lys Ala Glu Pro 20 25 30 Ala Asn Gly Arg Thr Asn Glu Gly Ser Leu Cys Arg Lys Gly His Phe 35 40 45 Gly Trp Asp Phe Leu Asn Asp Pro Lys Ile Leu Thr Cys Arg Ile Lys 50 55 60 His Pro Met Ile Arg Lys Asn Gly Glu Leu Glu Glu Val Ser Trp Asp 65 70 75 80 Glu Ala Ile Ser Phe Thr Ala Ser Arg Leu Ser Gln Ile Lys Glu Lys 85 90 95 Tyr Gly Pro Asp Ala Ile Met Gly Thr Gly Cys Ala Arg Gly Ser Gly 100 105 110 Asn Glu Ala Asn Tyr Ile Met Gln Asn Phe Met Arg Ala Val Ile Gly 115 120 125 Thr Asn Lys Val Asp His Cys Ala Arg Val Cys His Ala Pro Ser Val 130 135 140 Ala Gly Leu Ala Tyr Val Leu Gly Asn Gly Ala Met Ser Asn Gly Ile 145 150 155 160 His Glu Ile Asp Asp Thr Asp Leu Leu Leu Met Phe Gly Tyr Asn Gly 165 170 175 Ala Ala Ser His Ala Ile Val Ala Lys Arg Ile Val Arg Ala Lys Gln 180 185 190 Lys Gly Ala Lys Val Ile Val Val Asp Pro Arg Ile Thr Glu Ser Gly 195 200 205 Arg Ile Ala Asp Leu Trp Leu Pro Ile Lys Asn Gly Ile Asn Met Val 210 215 220 Leu Val Asn Thr Phe Ala Asn Ile Leu Ile Asn Lys Gln Phe Tyr Asn 225 230 235 240 Lys Gln Tyr Val Glu Asp His Thr Val Gly Phe Glu Glu Tyr Arg Ser 245 250 255 Ile Val Glu Asn Tyr Thr Pro Glu Tyr Ala Glu Lys Val Thr Gly Ile 260 265 270 Pro Ser Glu Asp Ile Val Glu Ala Met Lys Met Tyr Ser Gly Ala Lys 275 280 285 Asn Ala Met Ile Leu Tyr Gly Met Gly Val Cys Gln Phe Ala Gln Ala 290 295 300 Lys Asp Gly Val Lys Gly Leu Ala Ser Ile Ala Ala Leu Thr Gly Asn 305 310 315 320 Lys Gly Ile Pro Ala Val Gly Ile Gly Pro Val Arg Gly Gln Asn Asn 325 330 335 Val Gln Gly Ala Cys Asp Met Gly Ala Leu Pro Asn Val Tyr Pro Gly 340 345 350 Tyr Gln Ser Val Thr Asp Asp Ala Gly Arg Ile Lys Lys Glu Lys Ala 355 360 365 Trp Gly Val Lys Leu Pro Asn Lys Val Gly Tyr His Leu Thr Gln Val 370 375 380 Pro Glu Leu Thr Leu Lys Glu Asp Lys Ile Lys Ala Tyr Tyr Ile Met 385 390 395 400 Gly Glu Asp Pro Val Gln Ser Asp Pro Asp Ser Asn Glu Met Arg Glu 405 410 415 Thr Leu Asp Lys Met Glu Leu Val Ile Val Gln Asp Ile Phe Met Asn 420 425 430 Lys Thr Ala Leu His Ala Asp Val Ile Leu Pro Ser Thr Ser Trp Gly 435 440 445 Glu His Glu Gly Val Phe Ser Ser Ala Asp Arg Gly Phe Gln Arg Phe 450 455 460 Arg Lys Ala Val Glu Pro Lys Gly Asp Val Lys Pro Asp Trp Glu Ile 465 470 475 480 Ile Ser Lys Ile Ala Cys Ala Met Gly Tyr Asn Met His Tyr Asn Asn 485 490 495 Thr Glu Glu Ile Trp Asn Glu Leu Ile Asn Leu Cys Pro Asn Phe Lys 500 505 510 Gly Ala Thr Tyr Lys Arg Leu Glu Glu Leu Gly Gly Ile Gln Trp Pro 515 520 525 Cys Pro Ser Glu Asn His Pro Gly Thr Ser Tyr Leu Tyr Lys Gly Asn 530 535 540 Lys Phe Asn Thr Pro Thr Gly Lys Ala Asn Leu Phe Ala Ala Glu Trp 545 550 555 560 Arg Pro Pro Val Glu Gln Thr Asp Lys Asp Tyr Pro Leu Val Leu Ser 565 570 575 Thr Val Arg Glu Val Ala His Tyr Ser Val Arg Thr Met Thr Gly Asn 580 585 590 Cys Arg Ala Leu Gln Gln Leu Ala Ala Glu Pro Ile Tyr Val Val Val 595 600 605 Asn Gly Met Asp Ala Lys Ala Lys Gly Ile Ile Asp Gly Glu Leu Met 610 615 620 Arg Ile Ser Ser Arg Arg Gly Ser Val Val Ala Arg Ala Leu Ile Thr 625 630 635 640 Glu Arg Ala Asn Lys Gly Ala Val Leu Met Glu Tyr Ala Trp Ser Val 645 650 655 Gly Ala Cys Asn Glu Leu Thr Ser Asn Asn Leu Asp Pro Val Ser Lys 660 665 670 Thr Pro Glu Leu Lys Tyr Cys Ala Glu Lys Ile Gly Ala Ile Ile Asp 675 680 685 Asp Lys Glu Glu Gln Lys Phe Ser Lys Asp Gln Tyr Asp Leu Leu Lys 690 695 700 Lys Lys Met Asn Val 705 <210> 4 <211> 2130 <212> DNA <213> Clostridium clostridiiforme <400> 4 atggacaagg tcaagctcac cgtctgcccc tactgcggcg ccggctgcaa cctctacctc 60 cacgtcaaga acggcaagat catcaaggcc gaacccgcca acggccgcac caacgaaggc 120 tccctctgcc gcaagggcca cttcggctgg gacttcctca acgaccccaa gatcctcacc 180 tgccgcatca agcaccccat gatccgcaag aacggcgaac tcgaagaagt ctcctgggac 240 gaagccatct ccttcaccgc ctcccgcctc tcccagatca aggaaaagta cggccccgac 300 gccatcatgg gcaccggctg cgcccgcggc tccggcaacg aagccaacta catcatgcag 360 aacttcatgc gcgccgtcat cggcaccaac aaggtcgacc actgcgcccg cgtctgccac 420 gccccctccg tcgccggcct cgcctacgtc ctcggcaacg gcgccatgtc caacggcatc 480 cacgaaatcg acgacaccga cctcctcctc atgttcggct acaacggcgc cgcctcccac 540 gccatcgtcg ccaagcgcat cgtccgcgcc aagcagaagg gcgccaaggt catcgtcgtc 600 gacccccgca tcaccgaatc cggccgcatc gccgacctct ggctccccat caagaacggc 660 atcaacatgg tcctcgtcaa caccttcgcc aacatcctca tcaacaagca gttctacaac 720 aagcagtacg tcgaagacca caccgtcggc ttcgaagaat accgctccat cgtcgaaaac 780 tacacccccg aatacgccga aaaggtcacc ggcatcccct ccgaagacat cgtcgaagcc 840 atgaagatgt actccggcgc caagaacgcc atgatcctct acggcatggg cgtctgccag 900 ttcgcccagg ccaaggacgg cgtcaagggc ctcgcctcca tcgccgccct caccggcaac 960 aagggcatcc ccgccgtcgg catcggcccc gtccgcggcc agaacaacgt ccagggcgcc 1020 tgcgacatgg gcgccctccc caacgtctac cccggctacc agtccgtcac cgacgacgcc 1080 ggccgcatca agaaggaaaa ggcctggggc gtcaagctcc ccaacaaggt cggctaccac 1140 ctcacccagg tccccgaact caccctcaag gaagacaaga tcaaggccta ctacatcatg 1200 ggcgaagacc ccgtccagtc cgaccccgac tccaacgaaa tgcgcgaaac cctcgacaag 1260 atggaactcg tcatcgtcca ggacatcttc atgaacaaga ccgccctcca cgccgacgtc 1320 atcctcccct ccacctcctg gggcgaacac gaaggcgtct tctcctccgc cgaccgcggc 1380 ttccagcgct tccgcaaggc cgtcgaaccc aagggcgacg tcaagcccga ctgggaaatc 1440 atctccaaga tcgcctgcgc catgggctac aacatgcact acaacaacac cgaagaaatc 1500 tggaacgaac tcatcaacct ctgccccaac ttcaagggcg ccacctacaa gcgcctcgaa 1560 gaactcggcg gcatccagtg gccctgcccc tccgaaaacc accccggcac ctcctacctc 1620 tacaagggca acaagttcaa cacccccacc ggcaaggcca acctcttcgc cgccgaatgg 1680 cgcccccccg tcgaacagac cgacaaggac taccccctcg tcctctccac cgtccgcgaa 1740 gtcgcccact 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Claims

서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 이산화탄소 환원활성 보유 포름산 탈수소효소.
제 1항에 있어서, 상기 포름산 탈수소효소는 클로스트리디움 클로스트리디폼(Clostridium clostridiiforme)으로부터 유래한 것을 특징으로 하는 포름산 탈수소효소.
제 1항의 효소를 코딩하는 포름산 탈수소효소 유전자.
제 3항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 포름산 탈수소효소 유전자.
제 3항 또는 제 4항의 포름산 탈수소효소 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
제 5항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 균주를 배양하여 포름산 탈수소효소를 배양하여 포름산 탈수소효소를 제조하는 방법.
제 1항의 포름산 탈수소효소의 환원 반응을 통해 포름산을 생산하는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 방법은 기질로 바이카보네이트를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항의 포름산 탈수소효소를 유효성분으로 포함하는 포름산 생산용 조성물.