KR20070094662A

KR20070094662A - 비침습성 경피 예방접종

Info

Publication number: KR20070094662A
Application number: KR1020077018740A
Authority: KR
Inventors: 그레고르 세벡; 암라 쇼프라
Original assignee: 이데아 악티엔게젤샤프트
Priority date: 1999-01-27
Filing date: 2000-01-26
Publication date: 2007-09-20
Also published as: JP2002535350A; WO2000044349A1; CA2360692A1; HUP0200315A2; AU778972B2; AR037312A1; SI1031346T1; KR20010112252A; BR0007749A; MXPA01007657A; DE69901377T2; CN1230151C; ES2173678T3; CN1342066A; HU225170B1; AU2798800A; US7867480B1; EP1031346B1; ATE216875T1; DE69901377D1

Abstract

본 발명은 예방적 또는 치료적 접종을 위해서 초변형성 담체와 결합된 항원의 비침습성 경피 투여용 백신에 관한 것으로서,

상기 백신은 (a)침투제인 경피 담체, (b)시토킨 또는 항-시토킨 활성을 특이적으로 유발하거나 또는 활성 자체를 발휘하는 화합물; 및 (c)항원, 알레르겐, 항원의 혼합물 및/또는 알레르겐의 혼합물을 포함하고, 본 발명은 방어적 또는 치료적 면역 반응을 얻기위한 포유동물에 접종하는 방법에 관한 것이다.

Description

비침습성 경피 예방접종{NON-INVASIVE VACCINATION THROUGH THE SKIN}

본 발명은 예방용 또는 치료용 예방접종을 위해서 초변형성 담체(ultradeformable carrier)가 결합된 항원의 비침습성 경피 투여용 신규한 백신에 관한 것이다. 상기 백신은 (a)응집 경향이 있는 2종 이상의 다른 형태의 물질 또는 2종의 형상이 다른 물질들로 이루어진 1층 내지 수층의 막형상 코팅재에 의해서 둘러싸인 미소액상 소적(minute fluid droplet)의 형태로 수성용매내에 현탁 또는 분산되고, 상기 물질들 또는 형상의 물질들은 바람직하게 수성 액상 매질에서 용해성이 10 배 이상 차이가 나고, 고용해성 물질들 또는 형상의 물질의 호모응집체의 평균직경 또는 상기 물질과 상기 형상의 물질 양방으로 이루어진 헤테로 응집체의 평균직경은 용해성이 낮은 물질 또는 형상의 물질의 호모 응집체의 평균직경보다 더 작으며, 및/또는 이 경우에, 고용해성 성분이 침투성 소적을 가용화하는 경향이 있으며, 그 같은 성분의 내용물은 소적을 가용화하는데 요구되는 농도의 99 몰%에 이르고, 또는 가용화되지 않는 소적내 포화농도의 99 몰%에 상응하거나 더 높으며, 및/또는 막형상 코팅재로 둘러싸인 소적의 탄성 변형 에너지는 적혈구 세포의 변형 에너지 또는 액상 지방족쇄를 갖는 인지질 이중층의 변형 에너지보다 5배 이상 낮고, 바람직하게는 10배 이상 낮으며, 이상적으로는 10배 이상 더 낮은, 침투제인 경피 담체; (b)시토킨 또는 항-시토킨 활성을 특이적으로 방출 또는 특이적으로 유발시키고, 활성 자체를 발휘하는 화합물; 및 (c)항원 또는 알레르겐을 포함한다. 본 발명은 또한 포유동물의 대응하는 치료적 또는 예방적 예방접종 방법에 관한 것이다.

몇개의 문헌이 본 명세서 내에서 인용되었다. 여기서 인용된 각 문헌(제조자의 명세서, 지시서 등을 포함)은 참고문으로 통합되었으며; 인용된 특정의 문헌은 본 발명의 실제 종래 기술로 언급되는 것은 아니다. 또한 참고문으로 통합된 것은 이데아 악티엔게젤샤프트(IDEA AG)의 명칭으로 출원되고, 발명의 명칭이 "Transnasal transport/immunization with highly adaptable carriers"인 동시 계류 출원이다.

*피부는 가장 접근가능하면서도, 각질층이 존재하기 때문에 체내로 유입되는 것이 가장 어려운 통로이다. 피부의 각질층은 이완되고, 유연성이 떨어지고, 측면이 겹쳐진 세포를 포함하여 각질층 중의 기저 세포-타일 모티프가 20-30번 반복되는, 진화과정 중에 최적화된 혈관벽과 유사한 장벽이다. 또한 피부에서 세포간 접촉부분은 고밀도로 채워지고, 정연하게 조직화된 지질 혼합물로 밀봉된다. 그러므로 각질층은 감염으로부터 생물체를 보호할 뿐만아니라 피부를 통한 항원의 효과적인 침투를 차단시킨다. 이 사실은 알레르기의 관점에서 유익하나, 피부접촉을 통하여 성공적인 면역처치(immunization) 및 예방접종을 방해하였다.

경피 송달 기구에 있어서, 시판되는 가장 큰 약제는 350Da보다 작으며(Cevc, G. Drug delivery across the skin, Exp. Opin. Invest. Drugs(1997) 6: 1887-1937), 상기의 이러한 분자만이 피부의 작은 자기-밀봉 공극을 통과할 수 있다. 후자는 친수성인 경우에 통상 폭이 1㎚ 이하이며, 소수성인 경우는 더 좁다. 그러므로 연충과 같은 생물체가 기관에 구멍을 뚫는 생화학적 기작을 사용하여 피부를 투과하여 체내에 접근할 수 있다. 자연적으로 발생하는 미소 외상(micro-lesions) 및 경로(가령 소포지선 단위)가 피부에서 또한 이용될 수 있다. 그러나 이들은 피부 표면의 0.1% 내지 0.5%를 덮고 있어서, 세균류가 국소감염을 위한 경로로 사용된다는 사실에도 불구하고 결과적으로 경피 송달에는 기여하지 않는다(Strange, P., Skov, L. Lisby, S., Nielsen, P.L., Baadsgard, O. Staphylococcal enterotoxin B applied on intact normal and intact atopic skin induces dermatoma. Arch. Dermatol.(1996) 132:27-33).

피부에 노출된 몇가지 합텐만 피부 면역반응을 일으킨다. 이는 다량의 국소적으로 부착된 합텐으로부터 충분히 작은 분자가 인지가능한 양으로 피부의 경로를 발견할 수 있음을 확인한 것이다. 그리고 먼저 상기 합텐은 기관을 자극하고, 마지막으로 과민성을 일으켜서 접촉 피부염을 일으킨다(Kondo, S., Sauder, D.N. Epidermal Cytokines in allergic contact dermatitis. J.Am. Acad. Dermatol. (1995) 33: 786-800; Nasir, A., Gaspari, A. A. Contact Dermatitis. Clinical perspectives and basic mechanisms. Clin. Rev. Allergy and Immunol.(1996) 14: 151-184). 상기 문제는 피부 침투 증강제와 같은 피부 자극제와 병용되는 저분자 량의 화학약품 물질 또는 약품일때 가장 심각하다(Cevc, 1997, op.cit.). 대형 분자는 장벽을 통과하는데 한계가 있기때문에 피부에서 알레르기를 일으킬 수 없다. 고도로 면역원성이 있는 오브알부민(Wang, L.-F., Lin, J.-Y., Hsieh, K.-H., Lin, R.-H. Epicutaneous exposure of protein antigen induces a predominant Th2-like response with IgE production in mice.J. Immunol. (1996) 156:4079-4082) 또는 콜레라 독소(Glenn, G.M., Rao, M. Matyas, (1998) 391:851; Glenn, G.M., Scharton-Karsten T, Vasell R, Mallet C.P., Hale T.L. and Alving C.R. Transcutaneous Immunization with Cholera toxin Protects Mice Against Lethal Mucosal Toxin Challenge. J. Immunol(1998)161:3211-3214)에 대한 Th2 반응은 다량의 단백질이 피부외층에 노출된 후에만 가능하고 매우 약하다. 또한, 피부로부터 각질층의 제거는 피부외층 처리된 C57BL/6 마우스의 각각 96% 또는 43%에 있어서 사람의 암배아성 항원 또는 사람의 GM-CSF 유전자를 인코딩하는 아데노바이러스에 대항하는 검출가능한 양의 특이적 항체를 제조하기 위한 전제조건이다(Deng, H., Qun, L., Khavari, P.A. Sustainable cutaneous gene delivery. Nature Biotechnology(1997) 15: 1388-1390).

상기에 언급되거나 또는 피부외층에 사용되는 항원에 대한 보호는 최근에 보고되어 있지 않다. 디프테리아 또는 파상풍 유독소 및 소혈청 알부민에 대항하는 항체는 항원을 콜레라 독소와 병용하여 BALB/c 마우스의 피부에 도포함에 의해서 생성되며(Glenn et al., 1998, op.cit), 보조제없이 매우 약한 면역반응을 일으킨다. 콜레라 독소(CT)를 포함한 후에도, 디프테리아 및 파상풍 항원에 대한 평균의 특이적 항체 역가는 각각 약 50배 및 70배 내지 4000배이고(각각의 데이타 포인트를 포함시키는 것에 좌우됨), 콜레라 독소 자체에 의해서 인출된 역가보다는 낮다(Glenn et al., 1998, op.cit.). 상응하는 각각의 역가 절대값은 14±17 및 8±16이고; 항-BSA 역가는 대략 11±11이다(평균값+/-표준편차는 공표된 숫자로부터 계산함). 낮은 역가에 있어서 치료적 또는 예방적인 효과가 증명되어 있지 않으며, 간단한 비침습성 예방접종에 대한 경로도 잘 알려져 있지 않다. 같은 그룹에 의해 공개된 최근의 연구(Glenn et al., 1998b)는 경비 공격후의 CT에 대항하는 방어를 입증하지만, 경피 예방접종에 의해 얻어질 수 있는 방어에 대한 어떤 결론도 언급되어 있지 않다.

초기의 공보에서는 역가에 의해서 판단되는 바와 같이 상기 언급된 것보다 수 오더(order)가 유효한 단백질의 경피 방출에 관해 보고되어 있으며, 기계적 감수성 및 수분 감수성, 자기-조절하는 담체(트랜스퍼좀)을 개발하였다(총설, Cevc, 1997, op.cit.참조). 강력한 항원에 있어서, 이는 피하 단백질 주입에 의해서 일어나는 것에 상응하는 항체 역가를 유발하며: BSA의 경우에, IgG 절대 역가는 각 경우에 약 200이고(Paul, A., Cevc, G. non-invasive administration of protein antigens. Epicutaneous immunization with the bovine serum albumin. Vaccine Res.(1995) 4: 145-164), 및 간극 결합 단백질에 대해서 역가가 15,000 내지 100,000으로 측정된다(Paul, A., Cevc, G., Bachhawat, B.K. transdermal immunization with large proteins by means of ultradeformable drug carriers. Eur. J. Immunol.(1995) 25:3521-3524; Paul, A., Cevc, G., Bachhawat, B.K. Transdermal immunization with an integral membrane component, gap junction protein, by means of ultradeformable drug carriers, Transfersomes. Vaccine (1997) 16: 188-195). 그러나 방어적 면역 반응의 발생은 상기 공보에서 입증되지 않았다.

오늘날 공지되어 있는 바와 같이, Th1 또는 Th2 세포의 활성은 면역 반응에서 중요한 역할을 한다: Th1 세포는 주로 세포-매개 면역성 식세포-매개 숙주 방어를 촉진할 뿐만아니라, 마우스에서 항원특이성 IgG2a 생성을 촉진한다. 반면에, Th2 세포는 식세포 비의존성 숙주-반응, IgG1, IgE 및 IgA 면역글로불린 생성을 우선적으로 유지하는 경향이 있다.

면역반응의 Th1 또는 Th2의 기체(基體, basis), 즉 Th 세포 아형으로의 분화는 시토킨 뿐만아니라, 다른 조절분자의 활성에 의해 좌우된다(Luger, T.A., Schwarz, T. The role of cytokines and neuro-endocrine hormones in cutaneous immunity and inflammation. Allergy(1995) 50: 292-302; Lohoff, M., Gessner, M., Bogdan, C., Roellinghoff, M. The Th1/Th2 paradigm and experimental murine Leishmaniasis. Int. Arch Allergy Immunol. (1998) 115:191-202.); 항원 표시 세포의 성질 및 사용된 항원의 양은 또한 중요한 역할을 한다. 시토킨은 대부분의 진핵세포에 의해서 일시적으로 생성되고, 특정 세포-표면 수용체를 통해서 작용한다. 실제로, 피부내 모든 세포는 적당한 자극후에 (글리코)단백질 인자를 방출하거나 또는 그들 수용체를 발현시킨다. 대부분의 시토킨은 다능성을 가지며, 서로를 유발하거나 또는 관련 수용체의 발현에 영향을 준다. 이는 시토킨이 소위 시토 킨 캐스케이드의 구성안에서 상승적, 첨가적 또는 길항적 양식으로 작용하도록 한다(Luger & Schwarz, 1995; op. cit.).

피부 항원 도포후 면역 활성화에서 다른 세포의 역할이 완전히 이해되지는 않았다(Luger & Schwarz, 1995; op. cit.; Lohoff et al., 1998, op. cit.). 기저상 피부영역에 위치하는 랑게르한스 세포는 면역 제시(immuno presentation)에 주된 역할을 하는 것으로 사료된다. 먼저 상기 세포는 항원과 결합하여, 처리되고, 표피에서 림프관으로 이동하고, 인접하는 배출 림프절로 이동하여 분해된 항원을 송달한다. 상기 과정동안에 랑게르한스 세포는 표현형 및 기능적 변환을 받아, (림프구) 수상돌기 세포로 분화하여 최종적으로 T 세포가 높은 내피세정맥을 통해서 림프절로 들어가는 원시적 CD4⁺ T 세포로 항원을 제공한다. 반면에, 피부내 다른 2 종류의 주형 항원 제시 세포, 대식세포 및 B 림프구는 항원을 제시하고, T 세포를 자극하기 위해 먼저 활성화를 필요로 한다. 항체는 세정맥 내피 세포에 의해서 T 세포에 제공되고, 아마도 피부의 기저세포에 의해서 제공될 것이다.

예를 들면 케라틴 세포는 IL-1α, GM-CSF 및 TNFα를 포함하는 다혈전 염증성(proinflammatory) 시토킨을 과다하게 생성함에 의해서 국부 염증을 증가시킬 수 있다(Pastore, S., Fanales-Belaso, E., Abbanesi, C., Chinni, L.M., Giannetti, A., Girolomoni, G. Granulocyte macrophage colony stimulating factor is overproduced by keratinocytes in atopic dermatitis: Implications for sustained dendritic cell activation in the skin. J. Clin. Invest.(1997) 99:3009-3017). 케라틴 세포 유도 시토킨은 랑게르한스 세포를 강력한 항원 제시 세포로 성숙화시키는데 중요하다(Nasir & Gaspari, 1996, op. cit.). 전자의 세포가 항원 제공에서 직접 참여하는 정도(Kondo & Sauder, 1995, op. cit.)는 알려져 있지 않지만, 케라틴 세포에 의한 IL-10, 비관능성 IL-12 및 TGFβ와 같은 억제성 시토킨의 제조는 확인된 사실이다(Nasir & Gaspari, 1996, op. cit.).

피부에서 섬유아세포 풀은 또한 항원처리 과정에 관여하는 세포 서브세트를 포함한다. 예를들면 섬유아세포의 한 서브세트는 강피증내 염증부위에서 시토킨에 의해서 선택적으로 모여진다(Fries, K.M., Blieden, T., Looney, R. J., Sempowski, G.D., Silvera. M.R., Willis, R.A., Phipps, R.P. Evidence of fibroblast heterogeneity and the role of fibroblast subpopulations in fibrosis. Clin. Immunol. Immunopathol.(1994) 72:283-292).

표피 항원 사용은 구강 또는 후강을 통한 종래의 투여 경로와 다른 면역 반응을 일으킨다는 것이 이미 보고되어 있다. 예를들면 피부에서 표피 오브알부민을 반복되게 노출시킨후에, 항-오브알부민 IgE-s가 우세하다(Wang et al., 1996, op.cit.). 피부에서 모델 항원으로 소의 혈청 알부민을 사용하여 매우 강한 IgA 생성이 이미 관찰되었지만(Paul et al., 1997, op.cit.), 표피 항원 제시와 생성된 면역 반응 사이의 상호 의존성에 있어서는 일치하지 않는다.

많은 다른 세포가 피부로 송달되는 거대분자에 대항하여 면역 반응을 일으키는데 참여한다. 상기에서 언급한 바와 같이, 상기의 접근방법은 방어 면역 반응을 일으키는 방법을 확립하지는 못했다. 이는 항원 주입과 같은 종래의 방법들이 피 부에 항원을 적용시킴에 의해서 얻어지는 면역 반응을 목표로 하는 방어 면역 반응을 인출할 수 있는 정도로 음미하는데 일조하지 않았다는 사실에 기인할 수 있다. 예를들면, 염증 또는 다른 종류의 피부 섭동과 같이 화학적 자극제를 포함하는 항원 주입은 피부로부터 다양한 시토킨을 방출한다는 것이 알려져 있다(피부는 신체에서 가장 중요한 기관일 뿐만아니라, 신체의 면역 시스템의 주요 부분을 차지한다). 이는 피부의 면역반응의 미세한 동조를 방지하는 것 이외에 강도를 최대화하고, 또한 이의 면역반응이 사용되는 항원의 성질에도 감수성이 있다. 고충격 백신 송달은 상기 효과로부터 유리하다.

초변형성 담체에 의한 피부통과 물질 송달은 고충격 백신 송달 방법과는 반대로 보고된 바와 같이 피부에 영향을 주지 않는다. 이는 수분 감수성의 초변형성 물체, 소위 트랜스퍼좀(Transfersomes, 상표명)^TM(Cevc, 1997, op.cit.)이 세포의 형태를 조절하는 각질 세포들 사이의 '실제 채널'을 통해서 각질층을 투과한다는 사실에 기인하는 것으로 사료된다(Schaetzlein, A., Cevc, G. Non-uniform cellular packing of the stratum corneum and permeability barrier function of intact skin: a high-resolution confocal laser scanning microscopy study using highly deformable vesicles(Transfersomes). Br. J. Dermatol.(1998) 138: 583-592). 트랜스퍼좀은 상기 과정중에 가장 약한 접촉부위에서 우선적으로 세포간 지질과 피부세포를 당긴다고 제시되었다. 이와같이 형성된 통로는 대략 평균 너비가 20nm~30nm인 것으로 보인다. 이들은 피부 표면의 몇 퍼센트(~4%)를 덮으 며(Schaetzlein & Cevc, 1998, op. cit.), 인접 표면의 배출은 포함하지 않는다. 이는 보통 분로 면적(~0.1%)보다 크며, 초변형성 담체(Paul & Cevc, 1995, op.cit.)에 의한 항원 투여후 또는 보조제로서 콜레라 독소(Glenn et al. 1998a, b, op.cit.)를 사용함에 의한 항원 투여후에 항-BSA 역가들 사이의 정량적 차이를 설명한다.

피부에서 담체에 의해서 열린 '실제 채널'은 기관을 현저히 섭동시킴이 없이 상기 담체 뿐만 아니라 담체와 결합된 물질을 장벽통과시킬 정도로 충분히 넓어보인다. 그러나, 초변형성 담체에 의해서 피부통과 인슐린 송달을 반복하면, 단백질에 대항하는 항체가 유발되지 않는다는 것이 밝혀졌다(Cevc, G., Gebauer, D., Schaetzlein, A. Blume, G. Ultraflexible Vesicles, Transfersomes, Have an Extreamly Low Permeation Resistance and Transport Therapeutic Amounts of Insulin Across the Intact Mammalian Skin. Biochim. Biophys. Acta (1998) 1368: 201-215).

그러므로 본 발명의 기초가 되는 기술적인 문제는 의학적으로 유용한 경피 면역반응을 성공적으로 유발할 수 있는 방법을 확립하는 것이다. 상기 기술적 문제에 대한 해결책은 청구범위에서 특징화된 실시양태를 제공함에 의해서 달성된다.

따라서, 본 발명은 하기 물질 (a) ~ (c)를 포함하는 경피 백신에 관한 것이다:

(a) 침투제인 경피 담체로서, 응집되는 경향이 있는 2개 이상의 다른 물질 또는 2종 이상의 다른 형상의 물질로 이루어진 1층 내지 수 층의 막형 코팅제로 둘러싸인 미소 액체 소적의 형태로 수성 용매에 현탁 또는 분산되고, 상기 물질들 또는 형상의 물질은 바람직하게 수성 액체 매질내에서 10 배 이상의 용해성 차이가 나고, 그 결과 고용해성인 물질 또는 형상의 물질의 단일-응집체의 평균 직경 또는 상기 물질과 상기 형상의 물질로 이루어진 이형-응집체의 평균 직경은 저용해성의 물질 또는 형상의 물질의 단일-응집체의 평균 직경보다 작으며, 및/또는 이 경우에 고용해성인 성분은 침투성 소적을 가용화하는 경향이 있으며, 고용해성 물질의 함유량은 소적을 용해시키는데 요구되는 농도의 99mol% 이하까지 이르고, 또는 가용화되지 않은 소적의 포화 농도의 99mol%에 상응하거나 더 높으며, 및/또는 이 경우에 막-형상 코팅제로 둘러싸인 소적의 탄성 변형 에너지는 적혈구 세포의 변형 에너지 또는 액체 지방족쇄를 갖는 인지질 이중층의 변형 에너지보다 5배 이상 낮으며, 더 바람직하게는 10배 이상 낮으며, 이상적으로는 10배 이상 더 낮은, 경피 담체;

(b) 시토킨 또는 항-시토킨 활성을 갖는 분자를 특이적으로 방출 또는 특이적으로 유발하거나 또는 목적하는 의학적으로 유용한 면역 반응을 일으키는 활성 자체를 발휘하는 화합물; 및

(c) 항원, 알레르겐, 항원 혼합물 및/또는 알레르겐의 혼합물.

99% 이하의 상기 인용된 값에 있어서, 전자의 상대 농도의 50% 이하의 값이 종종 사용된다고 알려져 있다. 유익하게도, 40 상대% 이하의 값 또는 30 상대% 전후 및 이하의 값이 선택되며, 반면 고용해성 물질에 의해서 가용화될 수 없는 소적 에 있어서 2 배 이하로 상기에 언급된 값을 초과하는 상대농도가 바람직하다.

본 발명에 있어서, "병원체(pathogen)"라는 용어는 신체내에 또는 신체상에 존재하며 병적인 상태를 유발 또는 촉진하는 요소이고, 원칙적으로 병적인 상태를 방어, 치료 또는 보조제로서 면역 요법을 시행할 수 있거나, 또는 이로부터 이득을 얻을 수 있는 상태에 있는 요소이다. 상기 병원체는 미생물 병의 원인인 병원체, 예를 들면 세포외 세균, 가령 농-형성 구균(cocci), 예컨대 스타필로코커스(Staphylococcus) 및 스트렙토코커스(Streptococcus), 그람음성균 예컨대, 메닌고코커스(Meningococcus) 및 고노코커스종(Gonococcus species), 나이스세리아종(species of Neisseria), 장내균을 포함하는 그람음성균 예컨대, 대장균(E. coli), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 슈도모나스(Pseudomonas), 디프테리아(Diptheria), 보르데텔라 페르투스시스(Bordetella Pertussis) 및 그람양성균(예컨대 바실러스 페스티스(Bacillus pestis, BCG), 특히 혐기성 균, 예컨대 클로스트리듐(Clostridium)종(예컨대, 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리듐 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 노비(Clostridium novyi), 클로스트리듐 셉티쿰(Clostridium septicum)); 숙주내에서 생존 및 복제할 수 있는 많은 박테리아 및 모든 바이러스; 후자의 그룹은 마이코박테리아(mycobacteria)[예를들면 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)] 및 리스테리아 모노시토겐스(Listeria monocytogenes)를 포함하고, 이에 한정되는 것은 아니지만, 간염(hepatitis) 바이러스, (사람의) 면역결핍 바이러스, 헤르페스(herpes) 바이러스, 천연두(small-pox)(chicken-pox), 인플루엔자(influenza), 홍역, 유행성 이하선염 및 소아마비 바이러스, 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 리노바이러스(rhinovirus) 등을 포함하는 레트로바이러스 및 아데노바이러스, 숙주세포 내부에서 번식할 수 있는 진균류; 동물기생충(원충 및 연충)을 포함하는 기생충 및 외부기생충(진드기, 좀진드기)을 포함한다. 또한 병원체는 부르셀라종(Brucella species)[예를들면 비. 멜리텐시스(B. melitensis), 비. 아보르투스(B. abortus), 비.수이스(B. suis), 비.카니스(B. canis), 비. 네오토마에(B. neotomae), 비. 오비스(B. ovis)], 콜레라 원인 작용인자[예를들면 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)], 헤모필루스종(Haemophilus) 등[헤모필루스 악티노마이세템코미탄스(Haemophilus actinomycetemcomitans), 헤모필루스 플레우롭네우모니애(Haemophilus pleuropneumoniae)], 및 파라티푸스, 플라그, 광견병, 파상풍 및 풍진 등의 질환을 유발하는 병원체를 포함한다. 또한 본 발명에서의 병원체는 이에 한정되는 것은 아니지만, 진핵세포 또는 그의 부분으로서 각종 신형성 자기-면역 질병의 원인이 되거나, 또는 병원체의 감염에 의한 결과가 아닌 동물 또는 사람 몸의 병적인 상태에 관한 병원체를 포함하는 것으로 판정한다. 특히 특정 병원체의 일부, 다양한 미생물 독소는 포린형 성질을 가지며, 결과적으로 점막층을 통과할 수 있는 능력, 또는 침투성 막의 유연성을 증대시킬 수 있는 종의 능력을 갖는다.

"방출한다" 또는 "유발한다"를 병용하는 "특이적"이라는 용어는 상기 화합물이 수용체-매개의 시토킨 방출 또는 유발에 의해서 시토킨을 방출할 수 있는 세포와 반응하는 것을 의미한다. 상기 특이적 방출 또는 유발은 예를들면 경피 주입에 의해서 얻어질 수 있는 비특이적 방출 또는 유발과 대조되는 것이다.

"알레르겐"이라는 용어는 본 발명에서 내재성 또는 이종성 기원, 예를 들면 동물 또는 식물 기원의 물질로서, 알레르겐에 노출된 신체의 목적하지 않는 면역 반응을 일으키는 많은 경우에, 급성 과민성 반응을 일으키는 물질을 기재하고 있다. 알레르기 유발 미생물 또는 그의 일부(예를들면 진드기의 부분), 식물의 부분(예를들면 꽃가루) 또는 동물의 부분(예를들면 머리카락 또는 피부 단편)을 포함할 뿐만아니라, 인공적 물질 및 무기 물질도 상기 그룹에 속한다. 한편, 신체의 면역 시스템에 의해 적당하지 않게 처리되거나 또는 노출되는 경우, 인체의 일부는 자기-면역반응을 일으키고, 상기 물질에 대한 알레르기 반응을 일으킬 수 있다. 협의의 해석으로, 이러한 기술이 사용되는 경우, 알레르겐은 체내에서 즉시형 과민증을 일으키는 물질, 물질 그룹 또는 물질의 배열이며, 피부 경유 비침습성이 실시되는지의 여부에 관계없이 면역요법에 의해서 감소 또는 제거될 수 있다.

*본 발명에서 "(치료적) 예방접종"이라는 용어는 질병이 이미 발생되었으면 임상적인 상황을 개선하기위해서 또는 질병을 예방하기 위한 목적으로 일종의 치료적인 예방접종을 설명하는 것이다. 상기 예방접종은 본 발명의 백신의 단독투여 또는 반복된 투여를 포함할 수 있다. 치료적 예방접종은 병적인 상황을 방지하거나 및/또는 임상적 상황을 개선할 것이다. 예방제로 투여되는 경우, 대개 방어적 면역 반응을 일으킨다.

면역처치는 면역반응이 치료적이거나 비치료적인 것에 관계없이 일종의 면역 반응을 일으키는 것을 의미한다.

"항체" 또는 "면역글로불린"은 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM을 나타내고, 모든 아형으로 가령 IgA1 및 IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4를 포함한다. 이들의 "유도체"라는 것은 화학적, 생물학적 및 그밖의 수득가능한 유도체로서, 가령 유전자조작된 항체 유도체를 포함한다. 단편은 내인성, 이종성, (반)합성적 또는 재조합의 기원에 관계없이 예를들면 단일쇄 단편, Fc-, Fab-, F(ab')₂ 및 다른 Ig-s의 부분을 포함한다. 본 발명은 2개 이상의 상기에 인용된 항체, 유도체 또는 단편의 복합체로 이루어진다.

"항원"은 천연의 형태 또는 단편화 또는 유도체화후의 병원체 또는 알레르겐의 일부이다. 대개, 항원이라는 용어는 거대 분자 또는 그의 단편, 특정의 합텐 부분(예를들면 단일 탄수화물, 복합체 탄수화물, 다당(多糖), 데옥시리보핵산)을 의미하며, 요약하면, 계에 투여할 때 생체의 항원 레퍼토리에 의해 인식되어 항체를 유발할 수 있는 분자이다.

"항원의 혼합물 및/또는 알레르겐의 혼합물"이라는 용어는 본 발명에서 2개 이상의 항원 또는 알레르겐의 조합물을 의미한다. 또한 1개 이상의 항원 및 1종 이상의 알레르겐을 포함하는, 항원 및 알레르겐의 혼합물도 본 발명에서 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 "시토킨"이라는 용어는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 등의 시토킨 및 이의 아형, 가령 IL-1α및 IL-1β, 종양괴사인자(TNF), 형질전환증식인자(TGF-β 및 -α), 타입 I 및 II 인터페론(IFN-α1, IFN-α2, (IFN-ω), IFN-β, IFN-γ), 이주저해인자, MIF, c-키트 리간드, 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF), 단핵세포 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 케모카인(chemokines) 뿐만아니라 상기 분자들의 모든 기능적인 유도체를 의미한다.

특히 자연 면역성을 매개하는 시토킨은 타입 I 인터페론(IFN-α및 IFN-β), 종양괴사인자(TNF), 인터루킨-1(IL-1α및 IL-1β), 인터루킨-6(IL-6) 및 백혈구 유발 및 활성 케모카인을 포함한다. 상기 방법은 항증식(예를들면 IFN-s), 전염증성(예를들면 TNF, IL-1) 또는 공동자극성(예를들면 IL-6) 작용에 의존한다. 림프구 활성, 증식 및 분화를 가장 양호하게 매개하는 시토킨은 인터루킨 2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4) 및 형질전환증식인자(TGF)를 포함한다. 결과적으로 상기 시토킨은 표적 증식에 영향을 줄 뿐만아니라 더욱이 치료적인 작용을 하는 세포에 의한 기타 시토킨의 활성화 및 제조에 영향을 준다.

세포-매개 반응에 크게 의존하는, 면역-매개 염증을 매개하는 시토킨은 인터페론-감마(IFN-γ), 림프구독소(TNF-β), 인터루킨-10(IL-10), 인터루킨-5(IL-5), 인터루킨-12(IL-12) 및 이주저해인자이다. 백혈구 증식 및 분화는 주로 인터루킨-3(IL-3), c-키트 리간드, 과립구-대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF), 대식세포 또는 과립구 콜로니 자극 인자(M-CSF 또는 G-CSF) 및 인터루킨-7(IL-7)에 의해서 영향을 받는다.

여기서 사용되는 "면역보조제"라는 용어는 특히 특정 형태의 항원 특이성 면역 반응을 증가시킴에 의한 예방적 처치의 경우 및 세포-매개 면역성을 지지함에 의한 치료적 처치의 경우에 세포형 또는 체액형 목적하는 면역반응을 지지, 증대, 활성화, 증강 또는 조절할 수 있는 물질을 의미한다. 상기는 피부 또는 다른 관여하는 말초 조직으로부터 시토킨을 방출하여 직접 또는 간접적으로 기여하는 경우, 적당한 시토킨, 그들의 혼합물 또는 길항제를 첨가하거나 또는, 피부에서 화학적 자극을 일으킴에 의해 간접적으로 이루어지며, 또는 상기 작용을 일으키는 조직중의 분자의 생합성을 촉매 또는 촉진시킴에 의해, 즉 최종의 성과를 사용하는 항원의 예방적 및/또는 치료적 작용에 의해서 예방접종의 성공율을 증가시켰다. 유용한 시토킨 풀에 간접적으로 기여하는 면역보조제의 부류는 알레르겐으로서의 능력을 갖는 소형 화학요소로서, 예컨대 특정의 알레르겐성 (금속) 이온, 가령 이에 한정되는 것은 아니지만, LiCl, HgCl₂, 몰리브덴, 산, 염기 및 기타 자극 화합물, 예를 들면 디시클로헥실메탄-4,4'-디이소시아네이트, 디트로카브(디에틸디티오카바메이트), 2,4-디니트로클로로벤젠, 이소프리노신, 이소포론디이소시아네이트, 레바미솔, (페닐)옥사졸론 등, 스완소닌(Swansonine), 시조프란(sizofran), 프탈산 무수물, 티모펜틴, (지방족) 알콜, (지방족) 아민, (지방족) 에테르, 리신 또는 기타 적당한 양쪽 친매성체, 많은 계면활성제 및 화학적 피부 투과 증강제 뿐만아니라 그의 유도체 또는 조합물; 또한 미생물로부터 유발된 (저분자량) 단편 또는 유도체, 예컨대 리포다당(가령 LPS), 코드-인자(트레할로스-디마이콜레이트) 및 막에 부착된 기타 다당, 충분한 양이 사용되는 경우 아세틸무라밀-알라닐-이소글루타민, 및 미생물의 대형 단편, 가령 세균의 외독소 및 내독소, 또는 장내독소, 가령 콜레라독소 및 대장균의 열불안정 독소(HLT) 및 그들의 거대분자 단편으로, 가령 A-쇄 유도체(이는 ADP-리보실레이트 활성을 갖는 것으로 보임), 고활력 면역보조제 LT 홀로독소 등, 세포벽구조, BCG 등의 약독화 세균이다. 덜 확립된 예로는 클로스트리디움 독소, 엠. 투베르쿨로시스의 정제된 단백질 유도체, LT-R192G, 스트렙토코커스 피로게네스의 피브로넥틴-결합 단백질 I, 그룹 B 나이세리아 메닌기티디스(GBOMP)의 외막 단백질, 다양한 기타 펩티도글리칸 등이 있다. 즉 면역보조제는 항원의 취입 또는 제시를 변형할 수 있고, 피부에서 뿐만 아니라 기타 면역담당 조직에서 항원 특이성 림프구의 증식을 활성화 또는 증가시키거나 또는 면역 반응에서 우성 조절 기작을 방해하는 분자를 포함한다. (ADP-리보실화 세균성 장내독소의 점막 보조 활성은 본 실시예에 잘 개시되어 있다). 한편, 시토킨 또는 기타 면역보조제의 (상대) 농도를 변화시키는 분자, 가령 항-면역보조제 항체 또는 면역 보조제의 작용제 또는 길항제는 본 발명에서 면역보조제이다. 이는 림프구의 호밍(homing)에 영향을 주는 분자, 예컨대 각종 셀렉틴(selectins)(LECAMS, 예를들면 다양한 CD62-s), GlyCAM-1, MadCAM-1, VCAM-1, ICAM-1, 히알루로네이트 등 및 기타 케모카인, 가령 RANTES 또는 MCP-1을 포함한다. 면역보조제의 내인성 그룹은 히스타민, 전이인자, 투프트신(tuftsin) 등을 포함한다. 상기에 언급된, 많은 면역보조제는 너무 낮은 농도 또는 때때로 너무 높은 농도에서, 또는 그 자체로 비침습성 면역처치를 한 후에 목적하는 효과를 유지하기위해서는 충분하지 않으므로 본 연구 에서 사용되는 보조제의 기능적인 한정에 의해 체내의 시토킨 농도 및 분포 패턴의 충분한 조절 및 포티오리(fortiori)에 의해 목적하는 치료적 또는 예방적 면역 반응을 일으킨다. 명확하게 할 필요가 있다면, 상기 조절 및 그의 정도는 상기 실험을 위해 측정되어야 하며, 이때 특이적 시토킨 수준이 결정된다.

"면역보조제 조작"이라는 용어는 피부의 비화학적 처치를 의미하며, 가령 피부 마찰, 압축, 가열, 전기적 또는 기계적, 예를들면 초음파의 장에 노출하는 것, 또는 비-면역원 제제를 피부에 주입하는 것이며, 단 상기 처치는 피부 또는 기타 말초 면역 활성 조직으로부터 면역보조제 화합물을 방출시키거나 또는 길항제의 농도/작용 지속 시간을 감소시켜서, 목적하는 예방접종을 한다. 그러나, "면역보조제 조작"이라는 용어는 본 발명에 따르면 피부를 면역조절제 및/또는 시토킨 및/또는 시토킨 방출 인자, 특히 히스타민으로 전처리하는 것을 의미한다.

"면역원"이라는 용어는 면역학적 담체에 결합된 합텐 또는 항원, 또는 담체와 결합한 항원을 의미하며, 면역 반응을 유발할 수 있다.

"면역-관용"이라는 용어는 항원에 대한 목적하지 않는 면역 반응을 누락시키거나 또는 감소시키는 것을 의미한다.

항체에 관련된 Th1(T-헵퍼 세포 타입 I)은 IgG2a, IgG2b 및 IgG3를 포함한다.

항체에 관련된 Th2(T-헬퍼 세포 타입 II)는 IgG1, IgG4 및 IgE의 부류를 포함한다.

본 발명에 관련된 "2개의 형상의 물질"이라는 용어는 동일 물질의 두가지의 이온화된 상태 또는 염 형태로, 상기 물질의 두가지 다른 복합체를 의미한다.

"비침습성 투여" 또는 "비침습성 송달"이라는 용어는 미처치(intact) 피부를 통해서 본 발명에서의 생물학적 용도에서 미처치 장벽을 통해서 도포되거나 또는 송달되는 것을 의미한다.

"관통성"이라는 용어는 비교적 다량의 요소를 장벽을 통해서 비-확산적으로 이동하는 것을 의미한다. 상기 과정은 장벽의 한정된 공극으로 침투제를 적응시키는 여부에 좌우되며, 공극 너비 또는 채널 개구와 같은 장벽 저항성에서 관통성이 감소되지만; 그러나 상기 방법은 장벽을 가로지르는 침투제 농도 구배에 의존하는 것은 아니다.

"투과"는 반-투과성 장벽을 통한 확산 운동을 언급하는 것이다. 상기에 대한 주된 예로는 장벽을 통과하는 투과성 종 농도 구배의 영향하에서 분자 또는 분자 응집체의 송달이 있다.

결과적으로 침투제는 장벽을 투과하기에는 큰, 단일 분자 또는 분자의 배열을 포함하는 요소로서, 장벽의 한정된 통로(공극)의 형태 및/또는 직경에 침투제가 적합하기 때문에 장벽을 통과할 수 있다. 상기 적합성은 예를들면 공극 직경보다 2배 이상 큰 침투제가 공극크기까지 단편화하지 않고 이중층을 통과할 것이라는 사실로부터 알 수 있다. 한편 투과제는 피부와 같은 반투과성 장벽을 통해서 투과할 수 있는 요소이다. 외부장에서 침투제는 적용되는 장 및 명목상의 침투제 크기에 비례하여, 자연발생할 가능성이 있는 추진력을 받는다. 상기 힘은 미처치 비폐색 피부상의 각질층을 통과하는 물농도구배로부터 배향되는 것으로 사료되며, 상기 힘 이 침투제를 변형시키고, 장벽에서의 통로를 충분히 넓혀서 크기 제한의 문제를 해결하기에 충분히 강하다면, 피부를 포함하는 장벽을 통한 침투제를 이동시킬 수 있다.

상기 복합체 변형성, 대응하는 작용기작, 침투제 성분 또는 선택된 제제의 목록의 관점에서 침투제에 관련된 추가적인 정의에 대해서는, 등록 또는 계류중인 특허 (DE 41 07 152, PCT/EP91/01596, PCT/EP96/04526, DE 44 47 287)를 참조한다. 크기가 커서 장벽을 통과할 수 없는 항원성 (거대)분자 및/또는 면역보조제가 부하된 침투제 및 그의 제조방법에 관한 상세한 정보는 PCT/EP98/06750에서 알 수 있다.

전형적으로 담체를 형성하는 응집물질중에서 용해성이 낮은 것은 지질 또는 지질형 물질, 특히 극성 지질이 있고, 반면에 현탁액에 의해 더 잘 용해되고, 소적 적합성을 증가시키는 물질은 계면활성제를 포함하고, 계면활성제형 성질을 갖는다. 전형적으로 전자의 성분은 생물기원의 지질 또는 지질형 물질 또는 상응하는 합성 지질 또는 그의 수식체이고, 상기 지질은 종종 하기 화학식 1의 구조를 갖는 순수한 인지질의 부류에 속한다:

(상기 화학식 1에서, R₁ 및 R₂는 지방족 쇄, 전형적으로 C₁₀ _-20-아실, 또는 C₁₀ _-20-알킬, 또는 부분적으로 불포화된 지방산 잔기, 특히 올레오일-, 팔미트올레오일-, 엘라이도일-, 리놀레일-, 리놀레닐-, 리놀레노일-, 아라키도일-, 바시닐-, 라우로일-, 미리스토일-, 팔미토일- 및 스테아로일 쇄이며; R₃은 수소, 2-트리메틸아미노-1-에틸, 2-아미노-1-에틸, C₁ _-4-알킬, 카르복시 치환 C₁ _-5-알킬, 히드록시 치환 C₂ _-5-알킬, 카르복시 및 히드록시 치환 C₂ _-5-알킬, 또는 카르복시 및 아미노 치환 C₂ _-5-알킬, 이노시톨, 스핀고신, 또는 상기 물질의 염이고; 상기 지질은 글리세리드, 이소프레노이드 지질, 스테로이드, 스테린 또는 스테롤, 또는 황-함유 또는 탄수화물 함유 지질, 또는 기타 이중층 형성 지질, 특히 반 프로톤화 액체 지방산을 포함하며, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티드산, 포스파티딜세린, 스핀고미엘린 또는 기타 스핀고포스포리피드, 글리코스핀고리피드(세레브로사이드, 세라마이드폴리헥소사이드, 설파티드, 스핀고플라스마로겐 포함), 간글리오사이드, 또는 기타 당지질 또는 합성 지질, 특히 상응하는 스핀고신 유도체 또는 기타 당지질의 그룹으로부터 선택되고, 두개의 유사하거나 또는 다른 사슬은 주쇄로 에스테르화할 수 있거나(디아실 및 디알케노일 화합물에서) 또는 에테르 결합을 갖는 주쇄(디알킬-지방에서)에 부착될 수 있다.

보통 사용되는 계면활성제는 비이온성, 양쪽이온성, 음이온성 또는 양이온 성, 특히 지방산 또는 지방족-알콜, 알킬-트리/디/메틸-암모늄염, 알킬설페이트염, 콜레이트, 데옥시콜레이트, 글리코콜레이트, 글리코데옥시콜레이트, 타우로데옥시콜레이트, 타우로콜레이트 등의 일가염, 아실- 또는 알카노일-디메틸-아미녹사이드, 특히 도데실- 디메틸-아미녹시드, 알킬- 또는 알카노일-N-메틸글루카미드, N-알킬-N,N-디메틸글리신, 3-(아실디메틸암모니오)-알칸설포네이트, N-아실-설포베타인, 폴리에틸렌-글리콜-옥틸페닐 에테르, 특히 노나에틸렌-글리콜-옥틸페닐 에테르, 폴리에틸렌-아실 에테르, 특히 노나에틸렌-도데실 에테르, 폴리에틸렌-글리콜-이소아실에테르, 특히 옥타에틸렌-글리콜-이소트리데실 에테르, 폴리에틸렌-아실 에테르, 특히 옥타에틸렌도데실 에테르, 폴리에틸렌-글리콜-소르비탄-아실 에스테르, 가령 폴리에틸렌글리콜-20-모노라우레이트(Tween 20) 또는 폴리에틸렌글리콜-20-소르비탄-모노올레이트(Tween 80), 폴리히드록시에틸렌-아실 에테르, 특히 폴리히드록시에틸렌-라우릴, 폴리히드록시에틸렌-미리스토일, 폴리히드록시에틸렌-세틸스테아릴, 또는 폴리히드록시에틸렌-올레오일 에테르, 가령 폴리히드록시에틸렌-4 또는 6 또는 8 또는 10 또는 12 등, 폴리히드록시에틸렌-라우릴 에테르(Brij계) 또는 상응하는 에스테르로, 예를들면 폴리히드록시에틸렌 8-스테아레이트(Myrj 45), 미리스테이트-, -라우레이트, 리놀레이트-, 리놀레네이트-, 팔미톨레에이트-, 또는 -올레이트형, 또는 폴리에톡실화 캐스터오일 40, 소르비탄-모노알킬레이트(예를들면 Arlacel 또는 Span), 특히 소르비탄-모노라우레이트, -미리스테이트, -리놀레에이트, -리놀레네이트-, 팔미톨레에이트-, 또는 -올레에이트, 아실- 또는 알카노일-N-메틸글루카미드, 특히 데카노일- 또는 도데카노일-N-메틸글루카미드, 알킬-설페 이트(염), 예를들면 라우릴-, 미리스토일-, 팔미토일-, 올레오일-, 팔미톨레오일-, 리놀레닐-, 리놀레오일-, 박시닐-, 또는 엘라이도일-설페이트, 소듐 디옥시콜레이트, 소듐 글리코데옥시콜레이트, 소듐 올레이트, 소듐 타우레이트, 지방산염, 바람직하게는 상기에 기술된 바와 같은 지방산 사슬로, 리소포스포리피드, 가령 n-옥타데실렌(=올레오일)-글리세로포스파티드산, -포스포릴글리세롤, 또는 -포스포릴세린, n-아실, 예를들면 라우릴, 미리스토일, 팔미토일, 올레오일-, 팔리톨레오일-, 엘라이딜-, 박시닐-, 리놀레일-, 리놀레닐-글리세로-포스파티드산, -포스포릴글리세롤 또는 -포스포릴세린 또는 상응하는 이중단쇄 인지질, 가령 도데실-포스파티딜 콜린 또는 계면활성 폴리펩티드이다. 그러나 극성 지질과 기타 양쪽성 물질의 복합체는 담체의 코팅에서 계면활성제의 역할을 할 수 있고, 극성 지질의 다른 이온화 또는 다른 염 상태는 그들의 성질에 있어서 크게 구별된다는 것이 중요하다. 그러므로 막에서 함께 혼합된 같은 (극성) 지질의 두개의 다른 생리화학적 성질이 고도로 변형가능한 담체를 제조하여 본 연구의 조건을 만족시킬 것으로 사료된다.

지질 현탁액에서 일반적인 정보는 'Liposomes'(Gregoriadis, G., Hrsg., CRC Press, Boca Raton, Fl., Vols 1-3, 1987)를 다루는 핸드북 및 'Liposomes as drug carriers'(Gregoriadis, G., Hrsg., John Wiley & Sons, New York, 1988) 또는 실험 메뉴얼인 'Liposomes, A Practical Approach'(New, R., Oxford-Press, 1989)에 개시되어 있다. 생체-적합성 면역침투제를 제조하는데 사용될 수 있는 인지질의 성질은 'Phospholipids Handbook'(Cevc, G., ed., Dekker, New York, 1995)에 개시되어 있다.

제제의 pH값은 제조직후 또는 도포직전에 조절하는 것이 편리할 수 있다. 상기 조절은 생리학적 적합성을 손상시키지 않으면서 초기 pH의 조건하에서 개개의 시스템 성분 및/또는 약물 담체의 악화를 방지한다. 침투제 현탁액을 중화하기위해서, 3 내지 12, 종종 5 내지 9, 특히 6 내지 8의 pH 값을 갖는 완충액을 제조하는데 생체적합성 산 또는 염기를 사용할 수 있다. 생리학적 허용가능 산은 예를들면 무기산, 가령 염산, 황산, 또는 인산, 또는 유기산, 가령 카르복시알칸산 예컨대 아세트산의 희석된 수용액이다. 생리학적 허용가능 염기로는 예를들면 희석된 수산화나트륨, 적당하게 이온화된 인산등이 있다.

필요하다면, 면역원 현탁액은 도포전에 희석되거나 또는 농축될 수 있으며(예를들면 초원심분리 또는 한외-여과); 첨가제는 또한 이 시점에 또는 그 전에 현탁액에 첨가될 수 있다. 상기 첨가제는 종종 주위의 스트레스에 대한 제제의 감수성을 감소시키는 물질, 예를들면 살생물제, 항산화제, 목적하지 않는 효소작용의 길항제, 냉동보존제, 증점제 등으로부터 선택된다. 그러나 시스템을 조작한 후에, 담체 특징을 확인하고, 필요하다면 재조절할 수 있다.

본 발명에 있어서, 본 명세서에 기술되어 있는 초변형성 지질 응집체와 결합된 거대분자 항원(면역 침투제)은 상기 침투제의 평균직경이 평균 공극/채널 직경을 초과한다는 사실 및 상기 면역-침투제가 치료적 또는 예방적 면역 반응을 나타낸다는 사실에도 불구하고, 인공적 다공성 장벽 뿐만아니라 피부를 통과할 수 있다는 것이 판명되었다. 단, 상기 면역-침투제는 시토킨 활성을 나타내거나 또는 피부 및/또는 신체에서 기타 면역적합 기관으로부터 시토킨의 발생 및/또는 방출을 유발하는 화합물과 결합되어야 한다. 선택적으로 상기 화합물은 시토킨의 활성에 길항한다. 상기 후자는 각각의 다른 경로를 차단함에 의해서 Th1 또는 Th2 의존성 면역 반응으로 면역 반응이 유익하게 지향시킨다. 본 발명에서 기술된 항원 담체는 과정전 및 과정중에 충분한 안정성을 유지한다. 또한 생성된 면역반응은 도포되는 용량에 정비례하지 않으며, 이는 항원의 양이 변화될 수 있다는 것을 의미한다. 상기 양은 최적의 효과를 내도록 선택되어야 한다. 항원의 최적 양 또는 항원의 선택범위는 본 명세서에 개시된 내용을 고려하여 당분야의 통상의 지식을 가진 자의 기술범위내에 있다.

본 발명의 백신에서 담체로 사용되는 적어도 이성분 면역-응집체는 고변성에서 우수하고, 대부분의 경우 높은 유연성 막을 갖는 소포의 형태를 갖는다. 비록 상기 담체가 면역처리 프로토콜전에 사용되어 질 수 있다고 하더라도, 이전에 가정된 담체인 면역보조제 활성은 시토킨 활성 화합물 또는 거기에 적당한 길항제, 바람직하게는 IL-4, IL-10, TGF-β, IL-5, IL-6, IL-9 및 IL-13을 포함시킬 필요성 또는 목적하는 방어 면역 반응을 달성하기 위해, T-세포 수용체의 예비자극후, IL-1을 포함시킬 필요성을 배제하지 않는 것은 의외였다. 동일한 논지에 의해, IL-12, IFN-γ 및 림프독(LT 또는 TNF-β)은 Th1 반응을 촉진하고, 세포-매개 면역반응을 매개하며, 바이러스 및 기타 기생충병을 치료하거나 또는 면역-관용성을 촉진하는 것을 포함한다. 예를들면 IFNγ, IL-12 및 항 IL-4의 조합물 또는 단순하게 IL-12의 첨가는 Th2 반응을 Th1형태로 역전시킬 것으로 기대된다. 넓은 의미로는 전자에서 면역반응 초기에 IL-12 및 IL-4의 상대량을 증가시키는 것은 침투제 매개 면역처치의 경우에 Th1 반응을 촉진시키는데 유용하다고 제시된 반면에, IL-2는 NK 및 B 세포 성장을 유지하여 항체의 합성을 자극하고, 일반적으로 T-세포 의존성 면역 반응의 크기에 영향을 준다. 이와 같이 항체 역가가 항원 및 선택적으로 면역보조제와 조합하여 적당한 담체를 사용하여 유발될 수 있다는 것이 종래에 입증된 반면에, 얻어진 면역반응은 방어적이라는 것을 입증하지는 못했다.

본 발명의 특정 잇점은 본 발명에서 기술된 침투제의 이동이 피부내에서 시토킨 조성물의 본질적인 방해를 이끌어내지 않는다는 사실에 있다. 즉, 피부를 통한 상기 담체의 이동은 시토킨의 필수적인 방출을 유발하지 않을 것이다. 그러므로 상기 시토킨을 방출할 수 있는 적당한 기타 기관의 세포 또는 피부내 세포로부터 시토킨을 특이적으로 유발 또는 방출하는 화합물을 본 발명의 백신에 포함시킴에 의해서 목적하는 면역 반응을 유발시키는 것이 현재 연구되고 있다. 이와 같이 목적하는 면역 반응의 동조가 가능하다. 선택적으로 시토킨의 활성을 갖거나 또는 발휘하는 화합물은 본 발명의 백신으로 포함될 수 있다. 또한, 시토킨 활성의 길항제는 상기 시토킨의 작용을 특이적으로 저해하는데 사용될 수 있다. 상기 구체예에서, 면역 반응은 유익하게 Th1 또는 Th2 경로로 직접 이어진다. 상기 화합물은 항원성질에 의존하여 시토킨을 특이적으로 유발 또는 방출시키는 것이 중요하다. 이와같이 본 발명에 따르면, 이들은 면역 반응을 비특이적이고, 넓게 유지하는 보조제와는 구별된다.

그러므로 결론적으로 본 발명의 백신의 적용은 제공된 항원에 대해서 목적하는 면역 반응을 미세하게 동조할 수 있으며, 항원의 성질은 물론 소정의 역할을 수 행한다. 상기 면역 반응은 예를들면 보조제에 의해서 유발되는 비특이적 면역반응에 의해서 향상될 수 있다. 면역반응을 미세하게 동조시키는 선택은 특히 오직 백신의 주입만을 사용하는 종래기술보다 특히 유용하며, 그 이유는 이의 주입 과정 자체가 피부에서 시토킨 상대 농도를 크게, 비특이적으로 방해하기 때문이다.

상기의 기준을 고려하여, 피부의 세포 및 말초 면역시스템으로 (담체에 의해서) 적당한 종류의 면역을 제시하는 기초가 될 뿐만아니라, 인체에 항원-중화 항체를 우선적으로 발생시키는 세포-매개 면역 반응을 일으키거나 항원에 대항하는 관용을 점차적으로 발달시키거나 또는 세포-매개 면역성을 특이적으로 촉진시키는 것에서 면역과정을 보증하는 것이다.

본 발명에 따르면, 비침습성 경피 예방접종의 결과는 면역-침투제(항원 담체) 조성물에 의해서 크게 영향을 받는다는 것을 알았다. 다른 순도의 항원을 사용하면, 예기치 못하게 매우 다른 면역 반응을 일으킬 수 있다. 상기는 다른 최종 항원 이소타입 패턴으로 인해 유사한 전체 역가를 갖는 생물체가 수준의 방어를 나타낸다는 관찰을 반영하였다.

또한, 종래의, 저분자량 면역 보조제, 모노포스포릴 지질 A를 첨가하면, 이미 알려져 있는 측정된 항체역가에서 더 작은 표준편차가 증명하는 바와 같이, 표피에서의 면역처치의 결과를 보다 강하게 할 수 있었다. 또한 면역 담체로서 면역보조제를 사용하여, 의외로 마우스에서 얻어진 경험과는 반대로, IgG2b의 방출이 증가되고, IgG2a는 덜 강하지만, IgA제조를 향상시키지는 못했다. Th1-형 면역글로불린인 IgG1의 존재는 적어도 마우스에 있어서, 파상풍균 독소에 대항하는 적어 도 마우스의 방어에서 필수적인 것이 추론되었지만, 지질 A 또는 세균 항원의 역할이 먼저 알려져 있었다. 본 발명에 개시된 기술의 의학적 및 상업적인 용도를 위해, 높은 (특이) 항체 역가가 양호한 방어 결과를 나타내지 않는 것을 인식하고 있는 것이 중요하며, 충분한 방어를 달성하기 위해서, 일정 항체 이소타입의 종류와 상대량이 필요하고, 그 결과 우세하게 Th1-형 또는 Th2-형 면역 반응을 제공할 것이다(선행 고찰 참고).

소망하는 목표를 이루는데 적당한 기본적인 제형은 당분야에 공지되어 있다: 예를들면 더 상세한 보충적인 정보에 대해서 DE 41 07 152, PCT/EP91/01596, PCT/EP96/04526, DE 44 47 287을 참조한다. 본 발명의 백신은 예방적 또는 치료적인 예방접종에 유용하지는 않지만, 알레르기 치료 또는 사람 및 가축용 의약품에서 세포외 및 세포내 세균, 바이러스 및 기생충을 포함하는 미생물에 대항하는 면역을 얻기위해서 적용될 수 있다.

상기에 언급된 침투제와 조합하여, 면역활성 물질과 같은 항원이 전자와 함께 물리적 또는 화학적 복합체를 형성하여 장벽을 통과하여 송달된다.

피부에 남아있는 시토킨의 풀로부터 잇점을 얻기 위해서, 예방접종의 특히 유용한 방법으로서 상기에 정의된 바와 같은 면역보조제 조작에 의해서 기관을 전처리한 후에 피부에 면역원을 도포하는 방법이 제안된다.

특히 유용한 것은 부가적인 알레르겐 투여의 과정을 최적화하기 위해 패치평가에 대한 상기 언급된 국소 면역 반응으로부터 해독값을 이용하고, 치료적 또는 예방적 예방접종의 성과에 우수한 영향을 준다는 것이다. 상기의 접근 방식은 적 용된 알레르겐에 대해 피험자를 면역-관용에 도달하도록 또는 이를 향상시키는데 유리하게 사용하여 얻을 수 있는 것으로 사료된다.

1차 면역처치가 전형적으로 피하주입 또는 기타 적당한 피부 장벽 천공/파괴 방법을 사용하여 침습적으로 행해진다면, 높은 IgM의 수준을 얻을 것으로 사료되지만, 그후의 추가투여 면역처치는 본 발명에 기술된 바와 같이 비침습적 방법으로 실시될 수 있다.

마지막으로, 고변형성 침투제에 근거한 면역원 및 예방접종을 개선하는데 사용될 수 있는 몇가지 최적화 방법이 제시되었다. 충분히 해명된 장벽의 다양한 공극을 통과하는 면역원과 조합된 침투제의 흐름이 장벽을 통과하는 적당한 추진력 또는 작용 압력의 변수로서 결정되며, 그리고 상기 데이타를 특징적인 곡선에 의해서 간편하게 도출하는데, 이후에 제제의 최적화 또는 적용의 최적화에 채용하는 방법이다. 그의 공극은 적당한 추진력 또는 압력의 함수로서 충분히 해명된 장벽의 공극을 통과하는 면역침투제의 흐름의 결정인자이며, 특징적인 곡선에 의해서 생성된 데이타 분석은 이후에 다른 데이타 세트와의 비교에 근거하여 제제의 최적화 또는 적용의 최적화에 채용될 수 있다. 상기는 Cevc et.al.(1998, op.cit.)에 의한 예에서 기술된 바와 같이 공지된 피부 투과 능력의 면역원이 없는 침투제 현탁액의 침투 결과와의 비교를 포함한다. 보충적으로, 바람직하고, 구체적인 다양한 면역조절제 또는 면역조절 과정이 Th1- 또는 Th2-관련된 시토킨 제조에 있어서 시험되고, 그리고 상기 결과가 최종의 치료적 또는 예방적 사용을 위해서 적당하게 선택되어 사용된다.

면역처치는 전형적으로 실내온도에서 실시되지만, 그러나 다소 높은 온도가 또한 적당할 수 있다. 이들은 실내와 피부 온도 또는 기타 장벽 온도 사이에 견고한 합성 물질을 포함하는 제제가 있음을 알 수 있다.

제조온도는 통상 0 ℃ 내지 95℃ 범위에서 선택된다. 바람직하게 10℃-70℃이고, 더 바람직한 온도는 15℃ 내지 45℃에서 작업하지만, 이 경우 중요한 제제성분이 조성물내에서 또는 물리적 상태에서 비가역적으로 변화될 수 있는 가능성이 있는 온도 보다 낮은 온도에서 작업한다. 피부 온도는 통상 32℃이다. 다른 온도 범위도 가능하지만, 동결가능 또는 비휘발성 성분, 저온- 또는 열안정성 제제 등을 포함하는 시스템에 대해서 가장 현저하다.

개개의 시스템 성분의 완전성 및 목적하는 성질을 유지하고 싶다면, 담체 제제는 항원과 결합되거나 또는 결합되지 않고 냉장(예를들면 4℃)에서 보관할 수 있다. 비활성 대기, 예를들면 질소하에서 제조 및 저장은 가능하며, 경우에 따라 적당하다. 면역원 제제의 저장기한은 이중결합 수가 비정상적으로 적은 물질을 사용함에 의해서, 즉 불포화도가 낮은 것, 항산화제, 킬레이트제 및 기타 안정화제를 첨가함에 의해서, 또는 동결건조 또는 건조 혼합물로부터 특별히 또는 원위치에서 면역-침투제를 제조함에 의해서 연장될 수 있다.

본 발명에 따른 백신의 바람직한 구체예에서, 시토킨 활성 또는 항-시토킨 활성을 갖는 분자를 특이적으로 방출하거나 또는 특이적으로 유발하는 화합물 및 항원을 침투제와 결합시킨다.

본 발명에 따른 백신의 추가적인 바람직한 구체예에서, 용해성이 낮은 자기 응집성 분자는 극성 지질이고, 더 용해성인 성분은 계면활성제 또는 계면활성제형 분자 또는 본 발명의 목적을 위해서 충분히 가용성인 형상의 극성 지질이다.

본 발명에 따른 백신의 추가적인 바람직한 구체예에서, 침투제의 평균직경은 30nm 내지 500nm이고, 바람직하게는 40nm 내지 250nm이며, 더 바람직하게는 50nm 내지 200nm이고, 특히 바람직하게는 60nm 내지 150nm이다.

하나의 추가적인 바람직한 구체예에서 본 발명은 백신에 관한 것으로서, 사람 또는 동물의 피부에 사용하기위한 제제에서 소적의 총 중량은 총 질량의 0.01중량%(w-%) 내지 40중량%이고, 특히 0.1중량% 내지 30중량%이고, 더 바람직하게는 5중량% 내지 20중량%이다.

본 발명에 따른 백신의 또 다른 바람직한 구체예에서, 전체 항원농도는 전체 침투제 질량의 0.001중량% 내지 40중량%이고, 특히 0.01중량% 내지 30중량%이며, 더 바람직하게는 0.1중량% 내지 20중량%이고, 더욱 바람직하게는 0.5중량% 내지 10중량%이다.

본 발명에 따른 백신의 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 추가적으로 (da)저분자량의 화학적 자극제 및/또는 (db) 병원체로부터의 저분자량 화합물 또는 단편 또는 유도체를 포함한다.

본 발명에 따른 백신의 또 다른 바람직한 구체예에서, 시토킨 활성을 발휘하는 화합물은 IL-4, IL-3, IL-2, TGF, IL-6, IL-7, TNF, IL-1α및/또는 IL-1β, 타입 I 인터페론, 바람직하게는 IFN-α 또는 IFN-β, IL-12, IFN-γ, TNF-β, IL-5 또는 IL-10이 있다.

본 발명에 따른 백신의 바람직한 구체예에서, 항-시토킨 활성을 나타내는 화합물은 항-시토킨 항체 또는 상응하는 활성 단편, 그의 유도체 또는 유사체가 있다.

상기에서 "활성 단편 또는 그의 유도체"라는 용어는 상기에 인용된 활성이 사용되는 물질에 의해서 실질적으로 유지되거나 또는 모방된 것을 의미한다.

본 발명에 따른 백신의 또 다른 바람직한 구체예에서, 항원은 병원체로부터 유발된다.

본 발명에 따른 백신의 특히 바람직한 구체예에서, 상기 병원체는 스타필로코커스(Staphylococcus) 및 스트렙토코커스(Streptococcus)와 같은 농-형성 구균(cocci)을 포함하는 세포외 세균, 메닌고코커스(Meningococcus) 및 고노코커스종(Gonococcus species)과 같은 그람음성세균, 나이스세리아종(species of Neisseria), 대장균(E. coli), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 슈도모나스(Pseudomonas), 디프테리아(Diptheria), 보르데텔라 페르투스시스(Bordetella Pertussis)(백일해군)과 같은 장내균체를 포함하는 그람음성세균 및 그람양성세균(예를들면 바실러스 페스티스(Bacillus pestis, BCG), 특히 클로스트리듐종[예컨대, 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리듐 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 노비(Clostridium novyi), 클로스트리듐 셉티쿰(Clostridium septicum)]과 같은 혐기성균; 마이코박테리아(mycobacteria)(예를들면 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)(결핵균) 및 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes)를 포함하고, 간염(hepatitis) 바 이러스, (사람의) 면역결핍 바이러스, 헤르페스(herpes) 바이러스, 천연두(small-pox)(chicken-pox), 인플루엔자(influenza), 홍역, 유행성 이하선염, 소아마비 바이러스, 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 리노바이러스(rhinovirus) 등을 포함하는 레트로 바이러스 및 아데노 바이러스를 포함하는 숙주세포내에서 생존하고 복제할 수 있는 세균 및 바이러스, 및 숙주세포 내부에서 번식할 수 있는 진균류(fungi); 동물기생충(원충 및 연충)을 포함하는 기생충 및 외부기생충(진드기, 좀진드기), 또는 부르셀라종(Brucella species)(예를들면 비. 멜리텐시스(B. melitensis), 비. 아보르투스(B. abortus), 비.수이스(B. suis), 비.카니스(B. canis), 비. 네오토마에(B. neotomae), 비. 오비스(B. ovis), 콜레라 원인 작용 인자(예를들면 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 헤모필루스 악티노마이세템코미탄스(Haemophilus actinomycetemcomitans), 헤모필루스 플레우롭네우모니애(Haemophilus pleuropneumoniae) 등의 헤모필루스종(Haemophilus) 뿐만아니라 파라티푸스, 플라그, 광견병, 파상풍 및 풍진 등의 질환을 유발하는 병원체, 및 여러 종양의 새로운 형성, 자기-면역 질병의 원인 및 병원체의 감염에 의한 결과가 아닌 동물 또는 사람 신체의 병적인 상태와 관련된 병원체로부터 선택된다.

본 발명에 따른 백신의 바람직한 구체예에서, 알레르겐은 이종성 또는 외인성의 것, 미생물, 동물 또는 식물유래의 것, 알레르겐에 노출된 신체를 급성 과민성 반응을 이끄는 것으로서, 대부분의 알레르겐은 진드기, 꽃가루, 동물의 털 또는 피부 파편 또는 인공적 및/또는 자극성 무기물질 그룹에 속하는 것, 또는 인체 면역 시스템에 의해 적당하지 않게 처리되거나 또는 노출되는 인체의 성분에 속한다.

본 발명에 따른 추가적인 바람직한 구체예에서, 사용된 시토킨 활성을 나타내는 각 화합물의 농도는 항원 및 선택된 면역보조제로서 제제를 피하주입하거나 또는 생체외 시험을 실시함에 의해서 수행한 상응하는 시험에서 확립된 최적 농도는 1000배 이하, 바람직하게는 100배 이하, 종종은 50배 이하, 더 바람직하게는 20배 이하로 더 높은 것이 선택된다.

본 발명에 따른 백신의 다른 바람직한 구체예에서, 병원체 추출물 또는 화합물은 리포다당, 코드-인자(트레할로스-디마이콜레이트), 무라밀 디펩티드 또는 병원체 막의 면역학적 활성 부분과 동일하거나 또는 유사한 기타 (다)당 또는 (폴리)펩티드이며; 병원체 추출물이 세균성 외래독소 또는 내독소, 바람직하게는 콜레라 독소 또는 대장균의 열불안정 독소(HLT), A-쇄 유도체, ADP-리보실레이트 활성을 갖는 성분, 펩티도글리칸, 클로스트리디움 독소, 또는 엠. 투베르쿨로시스의 정제된 단백질 유도체, LT-R192G, 스트렙토코커스 피로게네스의 피브로넥틴-결합 단백질 I 또는 그룹 B 나이스세리아 메닌기티디스(GBOMP)의 외막 단백질; 또는 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 같은 세균성 또는 바이러스성 핵산이다.

본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 상기 리포다당은 지질 A 또는 그의 유도체 및 변형체로 가령 모노포스포릴 지질 A, 또는 그의 유사체, 가령 사카로스의 지방산 유도체가 있다.

본 발명에 따른 백신의 특히 바람직한 구체예에서, 병원체 유래의 병원 화합물의 농도는 유사한 항원을 사용하는 상응하는 주입 제제로 사용하는 것보다는 10 배 이하 내지 1000배 이하로 더 많으며, 피부상에 투여하는 면역 보조제 농도는 대부분의 경우 주입되는 면역보조제 농도와 0.5 내지 100의 팩터, 또는 1 내지 50의 팩터, 더 바람직하게는 2 내지 25의 팩터 구별된다.

본 발명에 따른 백신의 특히 바람직한 구체예에서, 저분자량의 자극제는 알레르겐 금속이온, 산, 염기, 자극성 액체, (지방족) 알콜, (지방족) 아민, (지방족) 에테르, (지방족) 설포네이트, 인산에스테르 등, 또는 적당한 용매 또는 양쪽성 용매 또는, 종종 피부 투과 상승 능력을 갖는 계면활성제형 분자 뿐만아니라 그의 유도체 또는 조합물로 이루어진 부류에서 선택된다.

본 발명에 따른 백신의 바람직한 구체예에서, 저분자량 자극제의 농도는 상기 자극제의 시험과 병용하여 사용되는 통상의 방법 및 기준에 의해서 평가하는 경우 같거나 상응하는 피험자에서의 독립적인 실험에서, 국소 자극때문에 허용될 수 없는 농도 이하에서 2 이상의 팩터, 종종 5 이상의 팩터, 바람직하게는 10 이상의 팩터에서 선택된다.

본 발명에 따른 백신의 특히 바람직한 구체예에서, 알레르겐은 흡입성 알레르겐으로 다양한 꽃가루, 포자, 동물 털, 피부, 가죽, 천연 및 합성 직물의 소편, 밀, (집)먼지로, 진드기를 포함하며; 음식 및 약물 알레르겐; 접촉 알레르겐; 주입, 침습 및 축적소 알레르겐, 예컨대 각종 (위장관-거주) 연충, 에치노코시(echinococci), 선모충 등, 이식재부품 등의 부류를 포함한다.

본 발명에 따른 백신의 바람직한 구체예에서, 항원의 적용 용량은 다른 방법으로 면역처치 과정에 있어서 주입되는 용량과 0.1 내지 100팩터의 차이를 보이지 만, 종종 0.5 내지 50의 범위, 더 바람직하게는 1 내지 20, 이상적으로는 주입에 사용되는 것보다 10배 이상 높다.

본 발명에 따른 백신의 또 다른 바람직한 구체예에서, 적용된 침투제의 용량은 0.1mg/㎠ 내지 15mg/㎠, 종종 0.5mg/㎠ 내지 10mg/㎠, 바람직하게는 1mg/㎠ 내지 5mg/㎠이다. 또한 도포면역원 용량을 조절하기 위해서 용이하게 접근할 수 있는 또는 보호된 인체 부위(예컨대 흉부 또는 등부, 팔, 목의 측면으로 예를들면 귀의 뒤쪽, 두피부분)에 다른 투여 면적을 사용하는 것이 유익하다.

본 발명에 따른 백신의 다른 바람직한 구체예에서, 상기 항원은 순수하거나 또는 정제된 항원이다. 본 발명의 백신에서 고도로 정제된 항원의 사용은 방어적 면역반응을 발생시키는데 특히 유익하다.

본 발명은 또한 병에 담거나 또는 포장된 형태로, 1용량 이상의 백신을 포함하는 키트(kit)에 관한 것이다.

본 발명에 따른 바람직한 구체예에서, 상기 키트는 상기에 기술된 1주입가능 용량 이상을 포함한다.

본 발명은 또한 상기에 기술된 백신으로 포유동물에 예방접종하는 것을 포함하는, 포유동물에서 방어 면역 반응을 발생시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 방법의 또 다른 바람직한 구체예에서, 적용된 면역원 용량 및 치료적 예방접종의 결과를 제어하기 위해 다른 치료부위를 선택한다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예에서, 항원이 없는 침투제 현탁액을 투여 하루전, 바람직하게는 제제를 피부상에 투여하기 360분전에, 더 바람직하게는 60분전에 및 더욱 바람직하게는 30분전에 항원과 결합시킨다.

본 발명에 따른 방법의 다른 바람직한 구체예에서, 면역보조제 조작에 의해서 기관을 전처리한 후에 본 발명의 백신을 피부상에 사용되고, 상기 조작은 예를들면 피부 마찰, 압착, 가열, 전기적 또는 기계적, 예를들면 초음파 장에 노출시키는 것, 또는 피부에 비면역원 제제를 주입하는 것을 포함하며, 단 특정의 처치는 면역보조제 화합물을 피부 또는 다른 말초 면역-활성 조직으로부터 방출시키거나 또는 길항제의 농도/작용지속시간을 감소시켜서 목적하는 예방접종을 한다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예에서, 면역원이 비폐색 패치에 적용된다. 상기 구체예는 또한 침투제 현탁액 중의 표피 투여 면역원에 대한 피부반응을 평가하는 목적으로 사용될 수 있고, 전자는 적어도 알레르기성이고, 예를 들면 생성된 피부의 붉어짐, 자극 등에서 볼 수 있는 바와 같이 급성의 국부적인 과민성 반응을 일으킨다.

본 발명에 따른 방법의 또 다른 바람직한 구체예에서, 1용량 이상의 백신을 투여한다.

본 발명의 방법의 구체예는 본 발명의 백신의 반복적인 투여를 포함한다. 반복된 투여는 피부상에 한번 이상의 반복투여 또는 피부에 비반복 투여, 예컨대 비경구 투여의 병용을 포함한다. 상기에서, 본 발명의 키트는 본 발명의 백신을 포함하는 1개 이상의 용기 또는 앰플을 포함하는 것을 키트로서 유익하게 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 특히 바람직한 구체예에서, 상기 백신을 추가로 예방 접종과 투여한다.

본 발명에 따른 방법의 가장 바람직한 구체예에서, 1차 면역처치를 침습적으로, 일반적으로 피하 주사 또는 다른 적당한 피부 장벽 천공/파괴 방법을 사용하여 실시하며, 계속해서 1회 이상의 추가투여 면역처치가 비침습적으로 실시된다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예에서, 백신은 비알레르겐성 항원을 사용하는 경우 2회 내지 10회, 바람직하게는 2회 내지 7회, 더 바람직하게는 5회 이하, 더욱 바람직하게는 3회 이하 투여하고, 또는 알레르겐의 경우에 적당한 평가 방법에 따라 측정될 수 있는 면역-관용을 달성하기 위해서 또는 감염을 막는데 요구되는 횟수로 투여한다.

본 발명에 따른 방법의 특히 바람직한 구체예에서, 연속적인 예방접종들사이의 시간 간격은 2주 내지 5년, 종종 1개월 내지 3년, 더 자주는 2개월 내지 1.5년으로 선택된다. 또한 바람직한 구체예에서, 반복 면역원의 투여는 치료적 예방접종의 최종 효과를 최대화하도록 실시한다. 비-알레르겐을 사용하는 경우 2회 내지 10회, 종종 2회 내지 7회, 전형적으로 5회이하, 더 바람직하게는 3회 이하의 면역처치를 사용하는 것이 제시되었고, 횟수는 알레르겐의 경우, 상기에서 기술된 것과 같이 측정하거나 또는 다른 적당한 평가 방법에 의해서 목적하는 면역-관용을 달성하기 위해 요구되는 횟수이다. 연속된 예방접종들 사이에서 시간간격은 피험자가 첫번째 예방접종으로 면역처치되는 경우에 바람직하게 2주 내지 5년, 종종은 1개월 내지 3년이하, 더 바람직하게는 2개월 내지 1.5년이다. 마우스와 같은 설치류 및 토끼가 2주 간격으로 면역처치되고, 원숭이 및 종종 사람과 같은 영장류는 3-6개월 간격으로 추가접종이 요구된다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예에서, 윤곽이 명확한 장벽에서 다양한 공극을 통해서 면역원을 통과하여 운반하는 침투제의 흐름이 장벽을 가로질러 작용하는 적당한 추진력 또는 압력의 함수로 측정되고, 상기 데이타를 특성 곡선에 의해서 편리하게 개시하였으며, 이 곡선을 사용하여 제제화 또는 추가적인 적용을 최적화한다.

본 발명은 최종적으로 방어 또는 관용원(tolerogenic)성 면역 반응을 유발하는 백신을 제조하기 위해 상기 정의된 것의 경피 담체, 시토킨 또는 항-시토킨 활성을 특이적으로 방출 또는 특이적으로 유발하거나 또는 활성을 발휘하는 화합물, 및 항원 또는 알레르겐, 및 선택적으로 미생물로부터의 추출물 또는 화합물 또는 단편 또는 그의 유도체 및/또는 저분자량의 화학적 자극제의 용도에 관한 것이다.

실시예는 본원 발명을 설명하기 위한 것으로 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

[실시예]

일반적인 실험 구성 및 시료 제조

스위스 알비노종(Swiss albino strain)의 마우스(18 g ~ 20 g)를 국립 영양연구소로부터 얻었다(인도, 하이데라바드). 이들은 첫번째 면역처치 시점에서 8-12주된 것이고, 보통은 4개 내지 6개의 그룹으로 서스펜션 케이지에 보관했다. 동물들은 표준 음식 및 물에 자유롭게 접근가능했다. 면역처치되기 1일 전에 마우스 의 등의 접종영역의 털을 조심스럽게 면도했다. 항원은 고정밀 피펫으로 피부표면상에 투여하고, 부분적으로 건조시켰다. 면역원이 마멸되는 것을 방지하기위해서, 동물들은 개개의 케이지로 넣고, 각 표피 물질의 투여 후 18시간을 유지했다.

전신마취는 시험동물의 스트레스를 없애고, 면역처치를 포함하는 조작을 하는 동안 조용하게 하기위해서 실시한다. 상기 목적을 위해서 케타베트(Ketavet) 및 롬펀(Rompun) 혼합물의 복강내 주사제[마우스당 0.0071%의 롬펀(Bayer, Leverkusen, Germany) 및 14.3㎎/㎖ 케타베트(Parke-Davis, Rochester, N.Y)를 포함하는 등장성 NaCl용액 0.3㎖]를 사용했다. 이 조작에 의해 동물들은 대략 2시간동안 잠들었다.

면역원

본 연구에서 검토한 초변형성 면역-담체 또는 면역-침투제(면역-트랜스퍼좀)는 (올리고)이층 소포의 형태를 갖는다. 상기는 생물적합성 (인)지질, 가령 포스파티딜콜린, 및 (생물)계면활성제, 가령 콜산나트륨 또는 폴리소르베이트(Tween 80)를 포함하며, 높은 응집변형성을 유지하는 다른 조성물이 가능하다. 추가의 성분들은 요구에 따라 다양한 면역보조제 활성을 갖는 모노포스포릴 지질 A 및 항원이다.

종래의 소포인 리포좀은 콩 포스파티딜콜린(SPC; Nattermann 인지질, Rhone-Poulene Rorer, Cologne, Germany)을 포함하며, 하기에 기술된 바와 같이 제조했다. 보조제인 모노포스포릴 지질 A(MLA)를 SPC에 대해 0.04mol%로 포함하거나 또는 포함하지 않는 유기지질용액을 먼저 진공(10Pa, 하룻밤)하에서 건조시켰다. 생 성된 지질막을 인산완충액(pH=6.5) 중의 파상풍 유독소 용액(2.0㎎/㎖; Accurate antibodies, NY, USA)에 의해 수화하여, 10중량%의 지질 현탁액을 수득한다. 지질 소포의 조제 현탁액은 800㎚, 400㎚ 및 200㎚의 공극을 갖는 일련의 폴리카보네이트막으로 추출되어 최종의 소포 크기 분포를 좁혔다.

고변형성 소포인 트랜스퍼좀은 상기에 기술된 바와 같이 제조한다(Paul et al., 1995 op.cit.). 요약하면, 에탄올성 SPC 용액을 콜산나트륨(Merck, Darmstadt, Germany)(3.75/1㏖/㏖) 및 필요에 따라 보조제와 함께 혼합한다. 상기 혼합물을 10mM 인산 완충액(pH=6.5)에 분산시켰다. 이를 용액 중에 존재하는 파상풍 유독소와 혼합하여 현탁액 1㎖당 0.25㎎ 내지 2.0㎎의 단백질로 하였다. 그후 소포 현탁액을 동결시키고, 3회 동결융해시켰다. 계속해서, 상기 제제를 가압하에서 미세소공 필터(200nm; Poretics, CA)를 통과시킨다. 소포 제조의 재현성을 확인하기위해서 각 제조물에 대해서 400nm에서의 광학밀도를 측정하고, 대략 일정한 것이 확인되었다.

계면활성제 대 지질의 비율을 변화시킴에 의해서, 소포응집 변형성은 높은 계면활성제의 농도때문에 막이 불안정해지는 농도 이하으로 조절되고, 미셀형태가 된다. 트랜스퍼좀보다 적어도 10배 이상 낮은 유연성을 갖는 막을 가지며, 일반적으로 리포좀으로 알려져 있으며, 계면활성제가 첨가되지 않은 지질 소포를 음성 대조군으로 사용하였다.

총 지질 농도는 다른 언급이 없는한 10중량% 이다. 항원농도는 일반적으로 1㎎/㎖의 오더(order)이지만, 필수적인 것은 아니다. 살미생물제를 포함하는 완충 액은 체적상을 제공한다. 다른 적당한 조성물에 대해서, 전문가는 우리의 실험실과 다른 공보 및 특허가 명확하게 언급된다.

면역처치는 항원이 없는 초변형성 소포를 포함하는 다른 제제에 의해 실시하고; 그리고 소포는 파상풍 유독소(지질 A를 포함 또는 포함하지 않음) 및 부유(free) 면역원을 포함한다. 각 제제는 다른 언급이 없는 한 6마리의 마우스로 시험하였다.

피하 면역처치의 경우에, 마우스 한마리에 대해서 40㎍의 면역원을 주입한다. 비침습성 투여를 위해서, 다른 담체들과 함께 1㎍ 내지 80㎍의 파상풍 유독소를 마우스의 등 상부의 미처치 피부상에 투여한다. 비주사 제제를 고정밀 피펫으로 도포하고, 건조시킨다. 상기 기간동안 마우스들은 각 케이지에 분리되어서 방치하여 마우스의 등이 다른 것들에 의해서 벗겨지는 것을 방지하기 위해 도포된 물질이 벗겨지는 것을 최소화하였다. 동물들을 매 2주마다, 즉 14일 및 28일째에 추가접종하고, 총 면역처리의 구성도는 3용량으로 이루어지고, 1차와 2차의 추가접종으로 이루어진다.

동물은 7일, 21일, 35일에 채혈한다. 수집된 혈액은 먼저 혈병(血餠)시킨다. 마이크로 원심분리기에서 간단하게 원심분리한후, 혈청을 분리하고, 30분동안 56℃에서 30분간 보체제거하고, 총 항체농도 및 특이 항체 이소타입을 결정할 때까지 -20℃에서 저장하였다.

흡광도 측정은 표준 UV-vis 분광기를 사용하여 실시하였다.

ELISA에 의한 혈청 중의 파상풍 유독소(TT) 특이 항체의 측정. 항-파상풍 항체의 수준이 종래의 방법으로 ELISA에 의해서 일반적으로 2중 측정 정량하였다. 간단하게 설명하면, ELISA 플레이트(Maxisorp: NUNC, Germany)를 37℃에서 3시간동안 코팅제 완충액(Na₂CO₃/NaHCO₃, pH=9.6)중의 분획량(10㎍의 TT/㎖를 포함하는 100㎕)으로 피복하였다. 웰을 먼저 세척 완충액의 200㎕/웰로 세번 세척하고, 37℃에서 3시간동안 세척액(1000㎖에 대해 8g의 NaCl, 1.45g의 Na₂HPO₄·2H₂O, 0.2g 의 KH₂PO₄, 0.2g의 KCl 및 0.05%의 Tween-20)내 2% 우유로 블로킹하였다. 세척완충액 200㎖/웰로 한번 세척한 후에, 상기 플레이트를 시험 혈청의 다양한 희석액(1/50 내지 1/6400)에 의해 배양한다. 4℃에서 한밤동안 배양한 후에, 상기 플레이트를 200㎕/웰의 세척 완충액으로 세번 세척하고, 100㎕의 2차 항체와 배양한다. IgG, IgA 또는 IgM의 정량을 측정하는 경우, 적당한 항-Ig에 결합된 호스 래디시 퍼옥시다아제(hrp, horse radish peroxidase)를 사용했다. 37℃에서 3시간 배양한 후에, 상기 플레이트를 200㎕/웰의 세척 완충액으로 세번 세척하고, hrp기질로서 o-페닐디아민을 사용하여 발색시켰다. 상기 목적으로 1㎖당 0.4㎕의 H₂O₂를 갖는 인산-시트르산 완충액(pH 4.5) 중의 o-페닐 디아민의 0.4㎎/㎖를 사용하였다. 2분후에, 2N의 H₂SO₄ 50㎕를 첨가하여 반응을 정지시킨다. 흡광도는 492nm에서 측정하였다.

다양한 이소타입을 검출하는데 사용되는 방법이 또한 ELISA법에 근거한다. IgG1(1:1000), IgG2a(1:1000), IgG2b(1:1000) 및 IgG3(1:200)(모두 ICN ImmunoBiologicals에서 입수함)에 대해 특이성을 갖는 퍼옥시다아제-표식, 친화도 정제된 2차 항체에 의존한다. 또한 2차 항체는 호스-래디시 퍼옥시다아제에 결합된 IgA(1:1000) 및 IgM(1:1000)을 포함한다(Sigma, Neu-Ulm, Germany). 대응하게 표식된 항-마우스 IgE는 PharMingen(San Diego, CA)에서 구입되었다. 항원을 다시 시험 플레이트상에서 흡착시키고, 과량의 항원을 세척한 후에 시험 혈청과 배양하였다. 연속적으로 100㎕의 적정 특이성 2차 항체용액을 6개의 다른 플레아트중 하나에 첨가하여, 항-IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgM 각각을 측정한다. 상기 플레이트를 37℃에서 3시간동안 배양하고, 상기에서 기술된 바와 같이 처리하였다.

항원(파상풍 독소)에 의한 생체내 공격. 35일째에 시험동물에 파상풍 독소의 LD₅₀의 50배량을 피하(s.c.) 주입하여 공격하였다(LD₅₀의 실제 값은 각 실험에서 고정되어 있고, 이때 중량조합된 동물 16 마리에 독소량을 증가시킴에 의해서 피하공격하고, 생존수를 측정한다). 예방접종한 동물에서 급성 TT 독성을 측정하기위해서, 상기 시험 마우스의 임상적인 상태를 최초 공격후에 4일동안 기록했다.

비방어 마우스는 24시간후에 마비의 증세를 보이고, 36시간후에는 사망했다. 공격후 4일동안 마비 또는 이상증세를 보이지 않는 동물은 파상풍에 대해서 면역을 형성한 것으로 생각된다.

장기간의 면역성은 모든 면역처치된 마우스에 대해 LD₅₀의 50배에 해당하는 투여량의 독소에 의해 월 1회 반년 이상동안 공격처리하여 시험하였다.

실시예 1-2:

응집체 크기(안정성) 효과

고변형성 소포(트랜스퍼좀^TM:IDEA):

콩으로부터의 포스파티딜콜린(SPC) 87.4㎎

콜산나트륨(NaChol) 12.6㎎

SPC에 대한 0.04몰%의 모노포스포릴 지질 A(MLA, LA)

0.9㎖의 인산 완충액, 10mM, pH 6.5

0.1㎖의 에탄올

(혼합 지질) 미셀:

콩으로부터의 포스파티딜콜린(SPC) 65mg

콜산나트륨(NaChol) 35mg

SPC에 대한 0.04몰% 모노포스포릴 지질 A(MLA)

0.9ml의 인산 완충액, 10mM, pH 6.5

0.1ml의 에탄올

마우스당 40㎍(20㎕) 또는 80㎍(20㎕)의 투여량으로 사용된 파상풍 유독소(2mg/mL; Accurate Antibodies): 도포영역: 마우스의 상부 등에서 40㎍ 또는 80㎍의 TT에 대해 1㎠ 또는 2㎠.

각종 표피 투여 제제의 면역학적 성질에 있어서 제제의 안정성 효과를 시험하기위해서, 두 종류의 응집체를 제조하였다: 비교적 큰 소포(직경 100nm 내지 200nm) 및 비교적 작은 미셀(직경 50nm 이하). 후자는 최적이하의 조건하에서(지 질 붕괴 또는 부적당한 응집체 조성물때문에) 전자로부터 발생할 가능성이 있다고 기대되어 선택된다.

항체 역가는 492nm에서의 혈청 흡광도를 반영된 바와 같이 도 1에 개시되어 있다. 이들은 혼합 지질 미셀이 같은 양의 TT가 부하된 초변형성 혼합 지질 소포(Tfs)보다 덜 효과적인 항원 담체라는 것을 보여준다. 저강도 세정제(피부 침투증강능력이 떨어짐)를 포함하는 혼합 미셀은 효력이 낮은 면역반응 매개체이다.

동물 방어 데이타는 도 1의 하단에서 볼 수 있는 바와 같은 유사한 경향을 나타낸다.

실시예 3-4:

응집체 변형성 효과

종래의 지질 소포(리포좀):

콩으로부터의 포스파티딜콜린(SPC) 100㎎

SPC에 대해 0.4mol-%의 모노포스포릴 지질 A(MLA)

0.5㎖의 인산 완충액, 10mM, pH 6.5

2mg/mL 파상풍 유독소(Accurate Antibodies)

고변형성 소포(트랜스퍼좀^TM)

콩으로부터의 포스파티딜콜린(SPC) 87.4mg

콜산나트륨(NaChol) 12.6mg

SPC에 대해서 0.04몰% 모노포스포릴 지질 A(MLA)

0.9ml의 인산 완충액, 10mM, pH 6.5

0.1ml의 에탄올

40㎍ 또는 80㎍ TT/마우스/면역처치의 투여량으로 사용한 파상풍 유독소:

도포면적: 상부 등에 40㎍ 또는 80㎍ TT/마우스/면역처치에 대한 1㎠ 또는 2㎠.

종래의 담체로 얻어지는 결과는 고변형성 소포로 측정한 데이타와는 구별된다: 장벽의 좁은 공극을 통과할 수 없는 단순 리포좀은 실제 항체 역가를 나타내지 않는다. 역으로, 높은 유연성 및 변형성을 갖고 따라서 적합한 막을 갖는 소포는 장벽내 좁은 공극을 통해서 용이하게 통과 이동하는 것이 개시되어 있으며, 혈청 흡광도 측정의 결과에 따라 미처치 피부상에 도포되는 경우 인식할 수 있는 양의 항체가 발생한다(도 2 참조)

실시예 5-10

항원 용량 효과

고변형성 소포:

콩으로부터의 포스파티딜콜린(SPC) 86.3mg

콜산나트륨(NaChol) 13.7mg

SPC에 대해 0.04몰% 모노포스포릴 지질 A(MLA)

0.9mL의 인산 완충액, 10mM, pH 6.5

0.1mL의 에탄올

파상풍 유독소(TT: Accurate Antibodies, New York, USA) 농도:

없음, 0.25mg/mL, 0.5mg/mL, 1mg/mL, 2mg/mL은 0㎍, 10㎍, 20㎍, 40㎍ 또는 80㎍ TT/마우스/면역처치에 상당하다.

도포면적: 상부 등에서 0㎍, 10㎍, 20㎍, 40㎍ TT/마우스/면역처치에 대해서는 1㎠ 및 80㎍ TT/마우스/면역처치에 대해서는 2㎠

상기 실험의 결과는 도 3에 개시되어 있다. 도 3은 초변형성 담체 중의 표피 투여 파상풍 유독소의 용량을 증가시킴으로써 TT에 대한 면역 반응이 증가되는 것을 분명하게 보여준다. 상기는 혈청 흡광도(20㎍/면역처치의 용량 이하), 특이 항체 역가(40㎍/면역처치의 용량이하) 및 생존율 데이타(80㎍/면역처치 이하의 용량에 대해서 포화되지 않음)를 반영한다.

IgG1(반응 포화를 강하게 나타냄) 및 IgG2b(아마도, 면역처치당 40㎍ 내지 80㎍에서 포화)를 제외하고, 이소타입 분포 패턴에 대해서는 명확하지 않았다. IgM은 IgG1의 것과 유사한 용량 의존성을 보인다. IgG2a에 대해서 얻어진 도면은 구별하기 어렵다.

실시예 11-13

항원 정제 효과

고변형성 소포:

실시예 5-10에 기술된 바와 같다(불순한 TT로 처리된 그룹은 면역보조제 지질 A를 수용하지 않는다는 것은 제외한다.)

파상풍 유독소: 80㎍ TT/마우스/면역처치에 상응하는, 2mg/ml

도포면적: 상부 등에서 2㎠

항원 순도는 유독소를 비침습적으로 피부에 도포하는 경우 파상풍 독소에 대항하는 마우스의 방어 수준에 큰 영향을 준다.(항원의 주입에 의해 얻어진 결과와 유사한 결과는 개시하지 않았다)

상기에서 언급된 것과 같이, 생체외에서 증식한 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani)의 배양물에서 배지 여과물을 미정제한 항원으로 사용하였다. 부분적으로 정제된 항원을 얻기위해서, 상기 여과물이 10kDa 배제(cut-off)막을 통과하고, pH 6.5의 인산 완충액으로 충분히 세척하고, 공정에서 상기 배양 여과물은 15배로 농축시켰다. 정제된 유독소는 Accurate Antibodies(NY, USA)에서 구입한다.

스위스 알비노 마우스(n=6)를 동일한 명목용량의 미정제 항원, 모노포스포릴 지질 A가 보충된 부분적으로 정제된 항원 또는 모노포스포릴 지질 A가 첨가된 정제된 항원에 의해 면역처리하였다. 상기 항원은 항상 유사한 트랜스퍼좀과 결합되어 있다. 상기 후자에 대한 조성물 및 제조방법은 이전의 실시예에 기술된 것과 같다. 면역처치 계획 상세, 채혈시간 및 공격처리 뿐만아니라 분석방법은 상기에 언급된 것과 유사하다.

상기 결과가 도 4에 개시되어 있다. 상기 결과는 TT에 대항하는 면역 반응의 강도 뿐만아니라 품질을 측정하는데 항원의 순도가 중요한 역할을 하는 것이 입증하였다. 또한 도 4에 개시되어 있는 데이타는 특이 항체 역가의 흡광도가 표피 예방접종의 치료 효과, 즉 예방 효과의 신뢰를 얻을 수 있는 것이 없다는 것을 보여준다. 상기는 충분하게 순수한 항원을 사용한다면 Th2-형 IgG1 성분과 비교하여 Th1-형 IgG2b의 실질량만을 포함하는 특이 항체 이소타입에서 큰 차이에 의한 것이다(12페이지 참조).

실시예 14-15

표피 투여 및 피하 투여의 비교

고변형성 소포, 트랜스퍼좀^TM(IDEA):

실시예 5-10에서 기술된 것과 같다.

파상풍 독소의 용량:

표피 면역처치당 80㎍의 TT

(2㎠의 도포면적 및 2mg의 TT/mL를 사용)

피하 주입당 40㎍ TT(2mg TT/mL를 사용)

실시예 1-4에서 기술된 것과 같은 실험방법을 사용하여 항체-특이성 혈청 역가, 파상풍 독소에 대항하는 동물 방어의 수준 및 다른 특이 항체 이소타입의 상대 발현율을 측정하였다.

상기 결과는 도 5에 개시되어 있다. 면역처치 의존성의 혈청흡광도의 증가는 침습성 및 비침습성 항원 투여후에 필적하며, 후자의 경우에 역가는 1차 면역처치 후에 6의 팩터로 낮고, 2차 추가 접종후 8의 팩터로 다소 낮다. 마찬가지로, Th2-를 나타내는 IgG1의 TT-특이성 수준은 본 실험의 양방에서 유사하고, 다른 항체의 서브타입에 대한 특이적 해독, 특히 IgG2a에 대해 및 IgG2b에 대한 초기 시점에서 각각 25 및 3의 팩터로 나타났으며, 항원 주입후에 더 높았다. 그러나, 통상 치사량의 파상풍 독소를 주입하여 시험 마우스를 이후의 공격에도 생존할 수 있는 가능성은 적어도 일련의 실험의 구성안에서 항원 투여 경로에 무관했다.

실시예 16-17:

보조제 피부 처리(사전주입) 효과

고변형성 소포, 트랜스퍼좀^TM(IDEA):

콩으로부터의 포스파티딜콜린(SPC) 89.3mg

콜산나트륨(NaChol) 10.7mg

SPC에 대해 0.04몰% 모노포스포릴 지질 A(MLA)

0.9mL 인산 완충액, 10mM, pH 6.5

0.1mL 에탄올

파상풍 유독소: 미정제 항원을 사용하는 그룹당 6마리의 스위스 알비노 마우스의 80㎍ TT/마우스/면역처치에 상당하는 2mg/mL

도포면적: 상부 등에서 2㎠

피부를 통과하는 트랜스퍼좀과 결합된 거대분자의 경피 송달은 매우 극단적이지 않은 것으로 보이며; 항원을 소량으로 사용되거나 또는 미정제상태라면 Th2-형 면역 반응에 대한 면역 시스템을 활성화시키는 것은 어렵다. 상황을 변화시키기위해서, 피부를 (사전에) 자극시켜, 초변형성 소포에 의한 실제 비-침습성 항원 투여전에 기관으로부터 상응하는 송달 분자(messenger molecular)를 방출시킬 수 있다. 이런 목적으로 우리는 0.1mL의 식염수를 도포부위에 먼저 주입하거나, 항원 담체 소포로서 사용하는, 유사한 조성물의 생분해성 물질로부터 사용하기 하루 전에 제조된 비항원성 소포의 마일드한 제제를 미리 주입한다. 추가적인 대조군으로서, 불완전한 프로인드(Freund)의 보조제를 또한 피부상에 면역-담체를 도포하기 24시간전에 다른 동물에 주입한다.

결과를 설명하는 예는 도 6에 개시되어 있다. 도 6은 대조군으로 제공된 피부상 담체 제제의 마우스보다 사전에 주사처리한 마우스에서 특이 항체 역가, 특히 방어가 개선됨을 보여준다. 불완전한 프로인드 보조제의 효과는 매우 약하다.

혈청 흡광도 또는 특이 항체 역가 및 방어적 백신 접종의 효과를 나타내는 동물 생존율은 서로 관련이 없다.

실시예 18-21:

저분자량 보조제(지질 A) 효과

고변형성 면역-조절된 TT-트랜스퍼좀^TM(IDEA):

콩으로부터의 포스파티딜콜린(SPC) 86.3mg

콜산나트륨(NaChol) 13.7mg

SPC에 대한 0.04mol% 모노포스포릴 지질 A(LA)

0.9mL의 인산 완충액, 10mM, pH 6.5

0.1mL 에탄올

고변형성 표준 면역-소포, TT-트랜스퍼좀^TM(IDEA):

LA가 첨가되지 않았다는 것이외에는 상기에서와 같다.

파상풍 유독소: 2mg/mL, 40㎍ 또는 80㎍ TT/면역처치에 상응하는 20㎕ 또는 40㎕에 의함.

도포면적: 상부 등에 각각 1㎠ 또는 2㎠

우리는 항원의 목적하는 면역 작용을 달성하기 위해서, 면역 활성의, 전형적으로는 면역을 활성화시키는 분자는 신체에 항원을 제공할 때 장벽을 통하여 TT 담체에 의해서 피부에 존재해야하는 것으로 생각된다. 상기 결론을 입증하기위해서, 우리는 공지되어 있는 면역 자극제, 예컨대 인체에서 TNF의 발생을 나타내는 것으로 알려져 있는 모노포스포릴 지질 A(LA)를 포함하거나 또는 포함하지 않는 트랜스퍼좀에 의해서 TT의 비침습성 면역제공의 결과를 비교하였다. 두개의 다른 항원 용량을 사용했다. 양방의 경우에, 실제 역가 및 측정가능한 예방적 면역 반응(부분적인 면역성)에 도달했다.

혈청의 흡광도는 기대만큼 증가된다(도 7 참조). 역으로, LA의 효과는 사용한 고용량보다도 낮은 용량이 좋다는 것을 볼 수 있다. 이는 실험적인 변수에 기인하는 것이며, 전형적인 면역처리 데이타의 용량 대 작용곡선의 비직선성을 반영하고 있는 가능성이 있다. 예를들면 보조제는 저용량 범위에서 더 유효한 가능성이 있는, 반면에 고용량 조건에서는 상기 시스템은 준-포화(quasi-saturation)되고, 보조제가 실험 설정의 범위내에서 면역 반응을 추가적으로 향상시키는 가능성을 남긴다. 50배의 LD₅₀으로 치명적인 공격에 대항하는 동물의 완전한 방어가 LA만으로 병용한 고 TT 용량으로 일련의 시험에서 달성되었다.

또한 Th1-시토킨 IgG2b는 LA를 받지 않은 그룹과 비교하여 LA그룹에 의해 더 높게 관찰된다. 상기의 차이는 고용량에 대한 것보다는 4팩터에 의해 저용량에 대해서 더 현저하고, 고용량의 경우는 오직 2팩터만의 증강이 관찰되었다. Th2-시토킨 IgG1은 저용량에서 IgG2B가 비교적 기여하는 LA 군에서의 저용량의 경우를 예외로서 우위에 존재했다는 것은 예외이다.

실시예 22-23:

고분자량 보조제, IL -12 시토킨 효과

고변형성 소포, 트랜스퍼좀^TM(IDEA):

실시예 5-10에 기술된 것 + 면역원 현탁액 1ml당 0.01mg의 IL-12

파상풍 유독소, 80㎍ TT/마우스/면역처치에 상응하는 2mg/mL

(실시예 9-11에서 기술된 것과 것이 부분적으로 정제)

도포면적: 스위스 알비노 마우스의 상부 등에 2㎠

파상풍 유독소로 비침습성 표피 예방접종의 결과에 있어서 시토킨의 효과를 연구하기위해서, 0.4㎍ IL-12/마우스와 모노포스포릴 지질 A의 조합물을 사용하였다. 파상풍 유독소 및 모노포스포릴 지질 A를 부하한 트랜스퍼좀과 조합하여 마우스당 80㎍의 IL-12를 투여하였다. 면역처치 스케쥴의 상세, 채혈 간격 및 파상풍 독소에 대한 최종 공격처리는 상기에서 언급된 것과 같다.

일련의 실험의 결과가 도 8에 개시되어 있다. 표피 TT 투여후의 면역제시의 과정동안 피부에서 프로(pro) Th2 시토킨의 존재는 예방접종결과에 있어서 긍정적 인 영향을 준다는 결과를 얻었다. 이는 혈청 흡광도, 특이적 항체 역가 뿐만아니라 시험 동물의 생존율에서 알 수 있다.

실시예 22-23에서 얻어진 효과는 IL-12 이외의 시토킨을 면역원 제제로 첨가함에 의해서 입증되었다. 상기 결과는 도 9에 개시되어 있다.

실시예 24-25:

고분자량 보조제( IFN -γ 및 GM - CSF + IL -4) 효과

고변형성 소포, 트랜스퍼좀^TM(IDEA):

실시예 5-8에서 기술된 것 + 면역원 현탁액의 1mL당 0.05mg IFN-γ 및 0.004mg GM-CSF 및 0.004mg IL-4

파상풍 유독소, 80㎍ TT/마우스/면역처치에 상응하는 2mg/mL(미정제)

도포면적: 스위스 알비노 마우스의 상부 등에 2㎠

실시예 22-23에서 기술된 효과는 다른 시토킨 혼합물로 확인되었다. 상기 결과는 도 10에 개시되었다.

실시예 28-29:

추가접종 효과(면역 반응의 성숙)

대부분의 이전의 실시예에서, 면역처치의 시간과정동안 흡광도를 측정할 때마다 일정한 패턴이 관찰되었다. 1차 면역처치후 수득된 반응과 비교하여 면역 반응은 각 추가접종에서 증가되었다(도 3, 4, 5, 6, 7, 8 참조). 1차 반응은 IgM이 우세하고, 다음으로 제1 추가접종후 IgG가 점차적으로 나타나고, 제2 추가접종 후 에 IgG의 최대량이 나타나며, 동시에 IgM은 사라진다. 이러한 이소타입의 형태는 면역반응에서 친화도 성숙을 의미한다. 상기 과정동안, 특이 항체의 혼합물의 평균 친화도는 반복되는 면역처치에 의해 증가된다.

다양한 표피 예방접종 실험의 결과는 비침습성 1차 접종과 비침습성 2차(추가접종) 면역처치를 조합시키는 것이 유익하다는 것을 제시하였다.

실시예 30-72:

트랜스퍼좀에 의한 생체외 피부로부터의 시토킨 방출

고변형성 소포(C형 트랜스퍼좀):

콩으로부터의 포스파티딜콜린(SPC) 87.4mg

콜산나트륨(NaChol) 12.6mg

0.9mL의 인산 완충액, 50mM, pH 7.3

그의 2.5㎕

고변형성 소포(T형 트랜스퍼좀):

콩으로부터의 포스파티딜콜린(SPC) 50mg

폴리소르베이트(Tween 80) 50mg

0.9mL의 인산 완충액, 50mM, pH 6.5

그의 2.5㎕

양성 대조군 A:

2.5㎕의 5% 도데실황산나트륨(SDS)

양성 대조군 B:

100㎕의 리포다당(LPS; 10⁵U/ml)

음성 대조군:

2.5㎕의 인산 완충된 식염수(PBS)

모든 생성물은 희석되지 않고 시험되었다.

세포형태: 완전한 각질층을 갖는 다층화 표피형성의 보통의 사람 케라틴세포를 사용하였다: 조직학은 생체내에서 사람 표피와 크게 닮은 것을 밝힌다.

방법: 0.63㎠의 폴리카보네이트 필터 삽입물에서 케라틴 세포를 화학적으로 규정한, 보충된 배지내에 접종하고, 공기-액체의 계면에서 17일동안 배양하였다.

시험 측정: 각 시험 생성물의 주어진 정량을 마이크로피펫으로 넣고, 소형 무균장치를 사용하여 8개의 재구성된 표피의 각질층 표면에 균일하게 핀다. 배양물은 37℃, 5% CO₂에서 24시간동안 배양한다. 4개의 복제 배양물(중복하여 배양한 LPS 처리 세포는 제외함)을 0.5mL의 PBS로 세척되고, 37℃, 5% CO₂에서 3시간동안 0.5mg/ml MTT의 300㎕에서 배양하였다.

조직을 이루는 배지에 방출된 염증성 매개체(IL1α, IL2, IL4, IL8, IL10, IFN-γ 및 TNF-α)를 측정되는 면역-매개체의 각 유형에 특이적인 ELISA 키트(R&D systems UK; Quantikine)를 사용하여 정량하였다.

	IL1-α(pg/mL) 평균 +/- SD	IL8 (pg/mL) 평균 +/- SD	TNF-α(pg/mL)
음성 대조군 (PBS, n=2)	5.1+/-0.5	<31	검출되지 않음
양성 대조군 A (SDS 5%, n=2)	314.2+/-6.1	147.5+/-32	검출되지 않음
양성 대조군 B (LPS, n=1)	32.0	5161	113.4
트랜스퍼좀 C (02-05,n=2)	12.3+/-0.9	68.3+/-16.8	검출되지 않음
트랜스퍼좀 T (TT0009/175, n=2)	11.7+/-1.2	50.8+/-14.0	검출되지 않음
트랜스퍼좀 O (TT0017/15, n=2)	185.5+/-170.1	58.4+/-27.0	검출되지 않음

트랜스퍼좀 O에서 관찰되는 비교적 큰 표준편차는 생성물이 재구성된 표피의 각질층에서 균일하게 분산되는 것이 어렵다는 사실에 의해서 설명될 수 있다.

TNF-α수준은 세포가 세포를 확립시키는 면역보조제인 LPS를 포함하는 양성 대조군과 접촉하는 경우 113.43pg/ml의 수준으로 증가한다.

트랜스퍼좀과 세포배양한 후 IL8 농도는 2의 팩터로 검출되는 하한을 초과하고, 한가지 경우는 그렇지 않고, 다른 경우에는 95%의 신뢰도를 나타내며, 어떤 상황에서도 167배 이상의 값을 제공하는 면역보조제 LPS를 포함하는 양성 대조군에서 증가되는 것과 비교하여 무시할 수 있다.

비특이성 자극제인 SDS는 피부세포로부터 다량의 IL-1α를 생체외 수용배지(bathing medium)로 방출한다. 가능성으로는, 높은 농도에서 잠재적으로 자극성을 갖는 올레산을 포함하는 트랜스퍼좀 O와 배양된 세포로부터 다량이 방출되었지만, 후자의 시험 시스템에서 얻어진 결과에서 큰 표준 편차에 의해서 견고한 결론이 방해되었다.

A형 및 B형의 다른 시험된 트랜스퍼좀에 대한 IL-1α농도가 배경수준의 대략 2배로 변화했다. 상기 차이점은 음성 대조군과 비교하여 통계적으로 중요하지만, 실제로 무시할 수 있고, LPS를 포함하는 양성 대조군에서 관찰된 증가는 60배이상이다.

IFN-γ, IL-2, IL-4 또는 IL-10은 측정가능한 수준으로 증가되지 않으며, 이는 다른 시험조건하에서 시토킨의 방출이 부족한 것을 의미한다.

상기 언급된 발견으로부터 트랜스퍼좀은 피부세포로부터 상기 분자의 발생을 유발하거나 또는 시토킨을 방출하지 않는다. 이는 항원 또는 알레르겐이 담체와 함께 피부통과 송달되어 치료적 또는 예방적 면역 반응을 발휘하여 면역보조제/조절제를 사용할 필요가 있음을 의미한다.

실시예 73-82:

특이적 면역 보조제로서 세균벽 성분, 콜레라 독소:

고변형성 소포, 트랜스퍼좀^TM:

콩으로부터의 포스파티딜콜린(SPC) 86.3mg

콜산나트륨(NaChol) 13.7mg

0.9mL의 인산 완충액, 10mM, pH 6.5

콜레라 독소(CT; Sigma, Neu-Ulm), 10㎍/면역처치 + 필요하다면 파상풍 유독소(TT, 순수; Accurate Antibodies) 2mg/ml,

0㎍ TT/마우스/면역처치(음성 대조군), 1㎍ TT/마우스, 5㎍ TT/마우스, 10㎍ TT/마우스, 20㎍ TT/마우스, 40㎍ TT/마우스(CT사용의 경우에) 및 80㎍ TT/마우 스(CT 없음)에 상응하는 용량을 사용하고, 4-6마리의 스위스 알비노 마우스의 상부 등에 2㎠ 이하의 면적으로 표피투여하였으며; 20㎍ TT/마우스/면역처치가 양성 대조군의 상응하는 부위에 피하 주입하였다. 면역처치되지 않은 마우스는 다른 음성 대조군으로 사용한다.

콜레라 독소를 파상풍 유독소와 병용하여 시험 제제로 포함시킨 경우, 표피 항원 투여의 방어 효과는 우수하다. 상기 면역보조제가 없는 제제는 4마리중 1마리(25%)가 파상풍 독소로 공격한 후에 마비를 일으키며, 방어효과가 낮았다.

도 10에 개시되어 있는 결과는 과량의 20㎍/면역처치의 항원 용량이 완전한 방어를 유지하지만, 다른 시험 보조제 또는 보조제 처리(이전의 실시예를 참조)의 경우는 아니라는 것을 나타낸다. 더 낮은 항원 투여량은 정량적으로 유사한 효과를 나타내지만, 모든 시험마우스의 생존을 보장하기에는 불충분하며, 5㎍ TT/면역처치된 시험군은 예외이다. (상기는 1㎍/면역처치 내지 15㎍/면역처치의 TT 용량이 과도적 영역에 속한다는 것을 의미한다). 그러나, 기타 용량의 콜레라 독소는 동등하거나 그 이상으로 유익하다.

실시예 83-85

대장균의 열불안정 독소( HLT )가 면역-보조제로서 작용한다

고변형성 소포, 트랜스퍼좀^TM:

콩으로부터의 포스파티딜콜린(SPC) 86.3mg

콜산나트륨(NaChol) 13.7mg

0.9mL의 인산 완충액, 10mM, pH 6.5

열불안정 독소(HLT; SIGMA, Neu-Ulm), 1mg/ml + 필요하다면 파상풍 유독소(TT, 순수; Accurate Antibodies) 2mg/ml

각종 상대 보조제/항원 농도를 사용하여 경피 예방접종용으로 가장 일반적으로 사용되는 ADP 리보실레이트 효소들 중 하나의 효과를 시험하였다. 트랜스퍼좀은 이전의 실시예에서 기술된 바와 같이 제조하였다. 다른 실험에 대한 상세한 설명(동물 사육; 항원투여; 역가 측정)은 이후에 기술하였다.

피하주입을 위해서 20㎍ TT/마우스/표피 면역처치 및 1㎍ 내지 2㎍ HLT/마우스/표피 면역처치에 상당하는 부피용량 및 피하주입용 0.5㎍ TT에 의한 양성 대조군을 사용하여 스위스 알비노 마우스를 면역처치하였다. 상기 결과는 도 11에서 설명하였다.

항-TT 역가는 보조제로 HLT를 사용하는 경우 무보조제 항원의 피하 주입과 비교하거나 또는 피부상 트랜스퍼좀내 TT의 무보조제 투여와 비교하여 증가되는 것을 발견하였다. 통상적으로는 치사성의 파상풍 독소의 공격에 대항하는 체액 반응 및 방어가 용량에 의존하며, 항-TT 역가가 높아지고, 고용량 HLT에 대해 생존율이 개선된다는 것이 확인되었다. 상기 측정된 결과(데이타를 개시하지 않음)는 유용한 HLT 투여량이 100ng/용량에서 시작하여, 일련의 실험에서 사용되는 실험 조건하에서 더 높은 실질적으로 유용한 용량은 대략 100배 이상임을 제시하였다. 이는 표피 투여 트랜스퍼좀과 함께 사용되어야 하는 보조제 용량에 대한 상한은 종래의 침습성 (경피) 면역처치에서 사용된 차수에 상당하며, 대부분 10배 이상이어야 하 며, 우리의 의견으로는 실제의 하한은 전형적인 피하(s.c.)용량보다 1-2의 차수 작았다. 유사한 관계가 또한 기타 관련된 면역-보조제에 대해서도 제시된다.

실시예 86-87:

히스타민에 의한 국소 전처리

고변형성 소포, 트랜스퍼좀^TM:

콩으로부터의 포스파티딜콜린(SPC) 86.3mg

콜산나트륨(NaChol) 13.7mg

0.9mL의 인산 완충액, 10mM, pH 6.5

파상풍 유독소 (TT, 순수; Accurate Antibodies) 2mg/ml

인산 완충액내 1mg/ml의 히스타민 용액, 10mM, pH 6.5

면역-반응 조절 대체 수단의 효과를 시험하기위해서, 트랜스퍼좀 중의 항원의 피부투여하기 직전에 또는 15분전에 10㎍의 히스타민 용액을 마우스의 표피 면역처치 부위에 주입한다. 상기 처치가 피부로부터 시토킨 방출을 유발하고, 및/또는 비침습성 경피 면역처치의 결과에 약간의 긍정적인 효과를 갖는 것이 기대된다. 상기 가설을 시험하기위해서, 트랜스퍼좀을 상기 실시예에서 기술된 바와 같이 제조하고, 상기에 기술된 바와 같은 스위스 알비노 마우스로 실시하였다(히스타민으로 전처리한 것은 예외)

도 12는 상기 언급된 작업 가설을 확인하다. 상기 결과는 파상풍 독소에 의한 공격에 대항하는 방어수준을 달성하기 위해서 히스타민 주입과 표피 면역처치사 이의 시간이 필요한 조건 및 양호한 체액 반응을 보인다. 이와 같이 보조제 없이 표피상에 트랜스퍼좀 중의 TT로 측정된 결과와 비교하면, 히스타민 주입은 동물 면역반응을 추가자극하는데 도움을 준다는 것을 볼 수 있다.

실시예 88-89

1차 및 추가접종 면역처치를 위한 다른 투여경로

고변형성 소포, 트랜스퍼좀^TM:

콩으로부터의 포스파티딜콜린(SPC) 86.3mg

콜산나트륨(NaChol) 13.7mg

0.9mL 인산 완충액, 10mM, pH 6.5

콜레라 독소(CT; SIGMA, Neu-Ulm), 0-1㎍/면역처치

파상풍 유독소(TT, 순수; Accurate Antibodies) 2mg/ml

소포 제조 및 동물 실험의 상세한 설명이 이전의 실시예에서 발견할 수 있다.

20㎍ TT 단독 또는 0.5㎍ TT + 1㎍ CT에 상응하는 부피 용량은 1차 면역처치를 위해서 피하주입하였지만, 추가 면역처치를 위해서는 표피도포하였다. 상기 조합은 이미 언급한 바와 같이 실질적으로 면역처치의 효율을 증대시켰다.

항-TT 역가는 파상풍 독소에 의한 공격에 대항하여 100% 방어를 수득하는데 충분하였다(도 13). 보조제가 없는 TT-Tfs로 피부상에서 실시되는 이전의 실시예로부터의 데이타와 비교하면, 피하/표피 병용 면역처치 프로토콜의 유용성을 명확 히 입증하였다.

그러므로 상기 데이타는 피부에 도포된 항원 부하 트랜스퍼좀^TM이 침습성 항원 투여에 흥미있는 보충수단을 제공하는 것을 제시하며, 특히 2차 면역처치를 위해서 중요하다.

실시예 90:

항원으로서 파상풍 유독소 및 콜레라 독소에 의한 2회 예방접종

고변형성 소포, 트랜스퍼좀^TM:

콩으로부터의 포스파티딜콜린(SPC) 86.3mg

콜산나트륨(NaChol) 13.7mg

0.9mL의 인산 완충액, 10mM, pH 6.5

콜레라 독소(CT, SIGMA, Neu-Ulm), 10㎍/면역처치

파상풍 유독소(TT, 순수; Accurate Antibodies) 2mg/ml

콜레라 독소는 보조제로서 작용하여 항-TT 반응을 개선시킬 뿐만아니라(상기 실시예를 참조), 그 자체가 항원이다. 결과적으로 보조제는 특정의 농도로 사용되는 경우 2차 항원의 역할을 한다. 보조활성 및 면역원성은 직선적으로 상관되어 있지 않지만, 면역처치의 결과의 성과를 최적화하기 위한 흥미있는 가능성을 제시한다(또한 부작용 및 알레르기를 유발함). 마우스에서 시험된 트랜스퍼좀 중의 CT에 의한 연구로, 우리는 도포 1회당 50ng 이하 내지 10㎍ 이상의 CT 용량이 상기에서 기술된 본 발명의 목적을 위해서 유용하다는 것을 발견하였다.

피부상에 다른 용량의 시험 제제(10㎍ TT 및 10㎍ CT에 상응함)에 의해 면역처치된 마우스에서 항콜레라 독소 항체는 CT항원성을 암시한다. 이는 2종 이상의 항원함유 트랜스퍼좀^TM에 근거한 2가 이상의 백신을 제조하기 위한 초변형성 소포로 확인된다.

도 14는 같은 담체내 TT 및 CT에 의해 이미 면역처치된 마우스로 측정된 TT 및 CT 역가를 나타낸다.

도 1: 혼합형 미셀 대 트랜스퍼좀 . 도 1은 매우 불안정한 트랜스퍼좀(transfersome)이 보통 혼합 지질 미셀로 분해되기 때문에, 정제된 TT가 부하된 혼합 미셀 또는 트랜스퍼좀에 의해 표피 면역처치된 동물의 생존율에 관한 데이타를 나타내며, 응집체 크기(안정성) 효과를 설명한다.

도 2: 리포좀 대 트랜스퍼좀 . 피부에 투여한 종래의 지질 소포(리포좀)과 정제된 TT를 운반하는 초변형성 지질 소포(트랜스퍼좀)에 대한 면역반응들을 비교한다. 혈청중의 해당하는 특정 항체 농도에 대한 정보(흡광도로 표시함)를 상부 패널에 개시한다.

도 3: 항원 용량 효과. 도 3은 항원 및 모노포스포릴 지질 A(LA)가 부하된 SPC:NaChol(3.75:1)로부터 트랜스퍼좀에 의한 표피 면역처치의 결과에 대한 항원 용량 증대의 영향을 설명한다. 상기 결과는 흡광도 변화, 항체 역가 또는 동물 생존율로서 상응하는 특이 항체 이소타입 데이타로 표시하였다. 항원 용량은 10㎍, 20㎍, 40㎍ 및 80㎍이다. Ag가 없는 것(4마리의 동물)을 제외하고는 각 군당 6마리의 동물을 사용한다.

도 4: 항원 순도 효과. 도 4는 SPC:NaCh(3.75:1)로부터 트랜스퍼좀 중의 파상풍 유독소 및 모노포스포릴 지질 A(LA)에 의한 표피 면역처치의 결과에 항원 순도가 미치는 영향을 나타내며, 동물 생존율의 시간 의존성에 대한 정보를 포함한다. 모든 데이터는 두번째 추가 접종 및 7일 후에 수득하였다.

도 5: 표피 대 피하 면역처치 . 도 5는 트랜스퍼좀 중의 TT에 의한 반복 침 습성(피하) 면역처치 및 비침습성(표피) 면역처치의 결과를 비교하며, 동물의 생존율, 혈청농도(흡광도에 의함), 특이 항체 역가 및 항체 분포 패턴값을 포함한다.

도 6: 전주입 ( pre - injection ) 효과. 도 6은 피부를 통한 트랜스퍼좀(SPC:Tw-80 1:1) 매개 TT(40㎍) 송달에 의한 면역반응에 있어서 피부전처리(비특이 공격)의 영향을 나타낸다. 전주입 그룹에서 마우스에게 40㎍의 항원을 적용하기 24시간전에 주입하였다. 식염수(pre-S), 10%의 SPC:NaCh 4.5:1 빈(empty) 트랜스퍼좀(Pre-empty Tfs) 및 불완전한 프로인드의 보조제(Freund's adjuvant)를 각각 0.1 ㎖ 전주입에 사용하였다. 상기 실험에서 모든 마우스는 2차 추가 투여 7일후에 독소의 LD 50용량으로 50회 공격했다. 여기서 (ec)는 표피, (sc)는 피하 및 (Tfs)는 트랜스퍼좀을 의미한다.

도 7: 보조제 효과: 예컨대 모노포스포릴 지질 A. 도 7은 트랜스퍼좀 중의 TT와 함께 미처리 경피 송달되는 비교적 저분자량의 면역자극제, 모노포스포릴 지질 A(LA)의 보조제 효과를 나타낸다.

도 8: 보조제 효과: 예컨대 시토킨 IL -12. 도 8은 SPC:NaCh로부터의 트랜스퍼좀에 의해서 TT와 함께 경피(ec) 송달되는 시토킨, 인터루킨-12(IL-12)의 면역-보조 활성을 입증한다.

도 9: 면역조절제 효과, 예컨대 시토킨 . 도 9는 트랜스퍼좀에 있어서 비침습적으로 경피송달되는 불순한 파상풍 유독소(TT) 항원에 대항하는 마우스의 반응의 다양한 시토킨에 의한 면역-조절을 나타낸다. 2차 추가 접종후 7일째에 분석용으로 혈청을 수집하였다. 어느 그룹에서도 보호가 관찰되지 않았다.

도 10: 면역보조제 효과: 예컨대 콜레라 독소( CT ). 도 10은 생성을 유지하기위해서 트랜스퍼좀(SPC:NaCh 3.75:1) 중의 순수한 파상풍 유독소(TT)에 의한 피부상에 처리된 마우스의 면역반응자극에 있어서 실험적 증가를 나타내지만, 이 경우에 담체가 10㎍의 콜레라 독소(CT)를 포함하여 특이 항체 생산을 유지하여, 그 결과 파상풍 독소에 의한 다른 경우에는 치사적인 공격에 대한 동물의 방어를 유지한다. 한 그룹당 4-6마리의 동물을 사용하였다. 도면에서 *의 표시는 마우스 4 마리중 1 마리가 마비된 것을 나타낸다.

도 11: 보조제 효과: 예컨대 대장균에서 얻은 열불안정 독소( HLT ). 도 11은 대장균(E.coli)으로부터 얻은 열불안정 독소를 면역-보조제로서 사용하는 것을 나타낸다.

도 12: 히스타민 효과: 피부상에서 트랜스퍼좀에 의한 면역처치 후 항-파상풍균 역가 및 생존율에 대한 효과, 도 12는 트랜스퍼좀에 의한 경피항원 적용과 조합하여 국소피부 히스타민 전처리의 면역-조절 효과를 나타낸다.

도 13: 피하의 초회항원자극 : 표피 추가투여후 항 -파상풍균 역가 및 생존율에 있어서의 효과. 도 13은 표피 예방접종 숙주의 생존율 및 항-파상풍균 역가에 대한 피하 초회항원자극 효과를 나타낸다.

도 14: 2가( Bi - valent ) 백신: 피부상에서 트랜스퍼좀 중의 항원들의 투여에 대한 항-파상풍균 및 항-콜레라 반응. 도 14는 항원으로 사용한 콜레라 독소 및 파상풍 유독소에 의한 2가 예방접종의 효과를 나타낸다.

Claims

(a) 침투제인 경피 담체로서, 수성 용매내에 현탁 또는 분산되어 있고, 그 형상은 응집 경향이 있는 2개의 다른 물질 또는 2종의 다른 형상의 물질로 이루어진 층의 막형 코팅에 의해 둘러싸인 미소 액상 소적이고(2개의 다른 물질 또는 2종의 다른 형상의 물질에서, 저용해성 물질은 극성 지질이고 고용해성 물질은 계면활성제 또는 계면활성제성 분자이다), 상기 물질 또는 형상의 물질은 수성 액체 매질에서 10 배 이상의 용해성 차이가 나고, 그 결과 고용해성인 물질 또는 형상의 물질의 단일-응집체의 평균 직경 또는 상기 물질과 형상의 물질로 이루어진 이형-응집체의 평균 직경은 저용해성의 물질 또는 형상의 물질의 단일-응집체의 평균 직경보다 작은 것을 특징으로 하는 경피 담체;

(b) 시토킨 또는 항-시토킨 활성을 방출 또는 유발하거나 또는 활성 자체를 발휘하는 화합물(시토킨 활성을 발휘하는 화합물은 IL-4, IL-2, TGF, IL-6, TNF, IL-1α, IL-1β, 타입 I 인터페론, IFN-α, IFN-β, IL-12, IFN-γ, TNF-β, IL-5 또는 IL-10이고 항-시토킨 활성을 보이는 화합물은 항-시토킨 항체 또는 대응하는 그의 활성 단편, 유도체임); 및

(c) 항원 또는 알레르겐(상기 항원은 순수 또는 정제된 항원임)을 포함하는 것을 특징으로 하는 경피 백신.
제 1 항에 있어서,

고용해성 물질은 침투성 소적을 가용화하는 경향이 있고, 고용해성 물질의 함유량은 소적을 가용화하는데 필요한 농도의 99 몰% 이하에 이르거나 가용화되지 않은 소적의 포화 농도의 99 몰%에 이르는 것을 특징으로 하는 경피 백신.
제 1 항에 있어서,

상기 막형 코팅으로 둘러싸인 소적의 탄성 변형 에너지는 적혈구 세포의 변형 에너지, 또는 액상 지방족쇄를 갖는 인지질 이중층의 변형 에너지보다 5 배 이하로 낮은 것을 특징으로 하는 경피 백신.
제 3 항에 있어서,

상기 소적의 탄성 변형 에너지는 적혈구 세포의 변형 에너지, 또는 액상 지방족쇄를 갖는 인지질 이중층의 변형 에너지보다 10 배 이하로 낮은 것을 특징으로 하는 경피 백신.
제 1 항에 있어서,

시토킨 또는 항-시토킨 활성 및 항원을 나타내거나 또는 유발하는 화합물 및 항원이 침투제와 결합하는 것을 특징으로 하는 경피 백신.
제 1 항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,

저용해성 자기-응집 분자는 극성 지질이고, 고용해성 성분은 본 발명의 목적 에 맞게 충분히 용해성인 계면활성제 또는 계면활성제형 분자 또는 이 형상의 극성 지질인 것을 특징으로 하는 경피 백신.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

침투제의 평균 직경은 30 nm 내지 500 nm인 것을 특징으로 하는 경피 백신.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

사람 또는 동물의 피부에 사용되는 제제 중의 소적의 총 중량은 총 질량의 0.01 중량% 내지 40 중량%인 것을 특징으로 하는 경피 백신.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

총 항원 농도는 총 침투제 질량의 0.001 중량% 내지 40 중량%인 것을 특징으로 하는 경피 백신.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

(da)저분자량 화학적 자극제; 또는

(db)병원체로부터의 추출물 또는 화합물 또는 그의 단편 또는 유도체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 경피 백신.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

항원은 병원체에서 유발되는 것을 특징으로 하는 경피 백신.
제 11 항에 있어서,

상기 병원체는 스타필로코커스(Staphylococcus) 및 스트렙토코커스(Streptococcus)와 같은 농-형성 구균(cocci)을 포함하는 세포외 세균, 메닌고코커스(Meningococcus) 및 고노코커스종(Gonococcus species)과 같은 그람음성세균, 나이스세리아종(species of Neisseria), 대장균(E. coli), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 슈도모나스(Pseudomonas), 디프테리아(Diptheria), 보르데텔라 페르투스시스(Bordetella Pertussis)(백일해군)과 같은 장내균체를 포함하는 그람음성세균 및 그람양성세균(예를들면 바실러스 페스티스(Bacillus pestis, BCG), 특히 클로스트리듐종[예컨대, 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리듐 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 노비(Clostridium novyi), 클로스트리듐 셉티쿰(Clostridium septicum)]과 같은 혐기성균; 마이코박테리아(mycobacteria)(예를들면 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)(결핵균) 및 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes)를 포함하고, 간염(hepatitis) 바이러스, (사람의) 면역결핍 바이러스, 헤르페스(herpes) 바이러스, 천연두(small-pox)(chicken-pox), 인플루엔자(influenza), 홍역, 유행성 이하선염, 소아마비 바이러스, 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 리노바이러스(rhinovirus) 등을 포함하는 레트로 바이러스 및 아데노 바이러스를 포함하는 숙주세포내에서 생존하고 복제할 수 있는 세균 및 바이러스, 및 숙주세포 내부에서 번식할 수 있는 진균류(fungi); 동물기생충(원충 및 연충)을 포함하는 기생충 및 외부기생충(진드기, 좀진드기), 또는 부르셀라종(Brucella species)(예를들면 비. 멜리텐시스(B. melitensis), 비. 아보르투스(B. abortus), 비.수이스(B. suis), 비.카니스(B. canis), 비. 네오토마에(B. neotomae), 비. 오비스(B. ovis), 콜레라 원인 작용 인자(예를들면 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 헤모필루스 악티노마이세템코미탄스(Haemophilus actinomycetemcomitans), 헤모필루스 플레우롭네우모니애(Haemophilus pleuropneumoniae) 등의 헤모필루스종(Haemophilus) 뿐만아니라 파라티푸스, 플라그, 광견병, 파상풍 및 풍진 등의 질환을 유발하는 병원체, 및 여러 종양의 새로운 형성, 자기-면역 질병의 원인 및 병원체의 감염에 의한 결과가 아닌 동물 또는 사람 신체의 병적인 상태와 관련된 병원체로부터 선택되어지는 것을 특징으로 하는 경피 백신.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

알레르겐은 미생물, 동물 또는 식물로부터 유발되는 이종성 기원 또는 내인성 기원의 것이며, 또는 인공적 또는 자극성 무기물질의 그룹에 속하는 것 또는 인체의 면역 시스템에 적당하지 않게 처리되거나 또는 노출되는 인체의 일부 또는 성분에 속하는 것인 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 경피 백신.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

사용되는 시토킨 활성을 나타내는 각 화합물의 농도는 항원 용량과 선택된 면역보조제로서 제제를 주사하거나 또는 생체외 시험을 실시함으로써 수행한 대응하는 시험에 있어서 확립된 최적 농도보다 1000배 이하로 더 높은 것이 선택되는 것을 특징으로 하는 경피 백신.
제 10 항에 있어서,

병원체 추출물 또는 화합물은 리포다당(多糖), 코드-인자(트레할로스-디마이콜레이트) 및 무라밀 디펩티드, 또는 병원체 막의 면역학적으로 활성 부분과 동일하거나 또는 유사한 다른 (다)당 또는 (폴리)펩티드이며; 병원체의 추출물이 세균성 외독소 및 내독소, 바람직하게는 콜레라 독소 및 대장균의 열불안정 독소, A-쇄 유도체, ADP-리보실화 활성을 갖는 성분, 펩티도글리칸, 클로스트리디알 독소, 또는 엠. 투베르쿨로시스(결핵균)의 정제 단백질 유도체, LT-R192G, 스트렙토코커스 피로게네스(화농연쇄구균)의 피브로넥틴-결합 단백질 I 또는 그룹 B 나이세리아 메닌기티디스(GBOMP)의 외막 단백질; 또는 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 같은 세균성 또는 바이러스성 핵산인 것을 특징으로 하는 경피 백신.
제 15 항에 있어서,

상기 리포다당은 리피드 A 또는 그의 유도체 및 변형체로, 예컨대 모노포스포릴 지질 A, 또는 그의 유사체, 예를 들면 사카로스의 지방산 유도체인 것을 특징으로 하는 경피 백신.
제 10 항에 있어서,

병원체에서 유래되는 병원체 화합물의 농도는 유사한 항원을 사용하는 상응하는 주입 배합물을 사용한 것보다 10배 이하 내지 1000배 이하 더 높고, 피부 상에 투여하는 면역보조제 농도는 대부분의 경우 주사된 면역보조제 농도와 0.5 내지 100 배 이상 다른 것을 특징으로 하는 경피 백신.
제 10 항에 있어서,

상기 저분자량 자극제는 알레르겐 금속이온, 산, 염기, 자극성 액체, (지방족) 알콜, (지방족) 아민, (지방족) 에테르, (지방족) 황산에스테르, 인산에스테르 등의 부류, 또는 기타 적당한 용매 또는 양쪽성 용매, 또는 피부 침투 상승 능력을 갖는 계면활성제형 분자의 그룹 뿐만아니라 그의 유도체 또는 조합물로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 경피 백신.
제 10 항에 있어서,

상기 저분자량 자극제의 농도는 자극제를 시험하기 위한 통상의 표준방법과 기준에 의해 평가한 경우, 동일하거나 동등한 피험자의 독립한 시험에서 국부적인 자극 때문에 허용되지 않는 농도의 2 배 이상으로 낮은 것이 선택되는 것을 특징으로 하는 경피 백신.
제 10 항에 있어서,

알레르겐은 흡입성 알레르겐의 부류에 속하며, 이에 한정되는 것은 아니지만, 각종 꽃가루, 포자, 동물 털, 피부, 가죽, 천연 및 합성 직물의 파편, 밀, (집)먼지를 포함하며, 진드기; 음식 및 약물 알레르겐; 접촉 알레르겐; 주입, 침습 및 축적소 알레르겐, 예를 들면 각종 (위장-거주) 연충, 에치노코시(echinococci), 선모충 등, 이식재부품 등의 일부 등의 부류를 포함하는 것을 특징으로 하는 경피 백신.