KR20070085886A - 감소된 면역원성의 ｉｌ-7 변이체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 일반적으로 그의 면역원성이 감소되도록 개질된 IL-7 분자에 관한 것이다. 상기 분자에는 또한 상기 개질된 IL-7 분자 및 면역글로불린 분자 또는 그의 부분이 포함된 융합 단백질이 포함된다.

Description

감소된 면역원성의 ＩＬ-7 변이체{IL-7 VARIANTS WITH REDUCED IMMUNOGENICITY}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은, 그 전부가 본원에 참고문헌으로 포함되는 2004 년 12 월 9 일에 출원된 U.S. 임시 특허 출원 제 60/634,470 호에 대한 우선권을 청구하며, 그의 이익도 청구한다.

본 출원은 일반적으로는 그의 면역원성이 감소되도록 개질된 IL-7 분자에 관한 것이다. 상기 분자에는 또한 상기 개질된 IL-7 분자 및 면역글로불린 분자 또는 그의 일부, 특히 상응하는 Fc 융합 단백질을 포함하는 융합 단백질이 포함된다.

싸이토카인은 면역계의 자극체이며, 이에 따라 약물로서 유용하다. 예를 들어, 인터페론-알파 (IFN-α), 인터페론-베타 (IFN-β), 인터류킨-2 (IL-2) 및 과립구/마크로파지-콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 는 전부 바이러스성 감염, 암, 면역계의 잘못된 조절, 예컨대 자가면역 질환의 치료 및 암 화학치료 후 면역계의 회복 촉진에 사용되는 승인된 약물이다. 불운하게도, 상기 단백질들은 자체에 대한 면역 응답성을 자극할 수 있어, 환자로 하여금 치료 단백질에 대한 항체를 발생시키도록 한다. 상기 항체들은 또한 환자에서 내재적으로 생성된 동일한 단백질의 기능을 저해할 수 있고, 환자 건강에 대한 잠재적인 장기적 결과를 초래한다.

인터류킨-7 은 T-세포, B-세포 및 기타 면역 세포의 생존 및 증식을 촉진하는 싸이토카인이다. 이는 또한 잠재적으로는 암 화학치료, HIV 감염 또는 기타 질환, 장애 또는 화학물 노출로 인해 면역계가 손상된 환자 치료를 위한 치료 단백질이다. 그러나, 그의 면역자극 특성을 근거로 하여, 치료용으로 투여된 IL-7 은 자체에 대한 항체 응답성을 유도하는 것으로 예측된다. 따라서, 당업계에서는 덜 면역원성이나, 면역계를 자극하는 특성은 보유하는 개선된 버젼의 IL-7 을 필요로 한다.

발명의 개요

본 발명은 야생형 IL-7 에 비해 그의 면역원성이 감소되도록 개질된 인터류킨-7 (IL-7) 에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명의 IL-7 단백질은 잠재적인 T-세포 에피토프를 제거하도록 개질된다. 그 결과, 면역글로불린-IL7 융합 단백질, 바람직하게는 Fc-IL7 융합 단백질을 포함하는 본 발명의 IL-7 단백질은 야생형 IL-7 과 비교시 개선된 생물학적 특성을 갖는다.

따라서, 한 국면에서 본 발명은 인간 IL-7 부분과 80% 이상의 일치도를 가진, Gln22, Leu24, Ile30, Phe39, Met54, Phe57, Arg58, Ala60, Leu63, Lys68, Met69, Leu77, Ile88, Val96, Leu104, Leu128, Met147, Thr149 또는 Lys150 에 해당하는 하나 이상의 잔기에 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 활성 부분을 특징으로 한다. 상기 아미노산 개질은 단독으로 또는 조합되어 이용되어 항-IL-7 T-세포 응답성을 감소시킬 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 Gln22, Leu24, Ile30, Phe39, Met54, Phe57, Arg58, Ala60, Leu63, Lys68, Met69, Leu77, Ile88, Val96, Leu104, Leu128, Met147, Thr149 및 Lys150 로부터 선택되는 위치들에, 예를 들어 1 개, 2 개 이상, 4 개 이상 또는 8 개 이상의 아미노산 개질이 있는 IL-7 부분을 포함한다. 한 구현예에서, IL-7 부분은 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 또는 그 이상의 하기 치환을 포함한다: Gln22Asp, Leu24Asp, Ile30Thr, Phe39Pro, Met54Ala, Phe57Lys, Phe57Asn, Arg58Asp, Ala60Ser, Arg61Glu, Leu77Asp, Leu104Ser, Leu104Val, Leu128Ala, Leu128Val, Leu128Pro, Leu128Ser, Met147Lys, Thr149Ser 또는 Lys150Stop.

한 구현예에서, 폴리펩티드는 Phe39, Phe57, Leu77 및 Leu128 에서 하나 이상에서 치환 또는 치환들을 포함한다. 추가 구현예에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 치환들 Phe39Pro, Phe57Asn, Leu77Asp 및 Leu128Ser 중 하나 이상을 갖는다. 또다른 구현예에서, 폴리펩티드는 치환들 Phe39Pro, Phe57Asn, Leu77Asp 및 Leu128Ser 을 포함하며, 추가 구현예에서, 폴리펩티드는 치환들 Phe39Pro, Phe57Asn 및 Leu128Ser 을 포함한다.

본 발명에 따른 바람직한 치환들은 하기 위치의 것이다:

Phe39, 또는 Phe57, 또는 Leu77, 또는 Leu128;

Phe39 및 Phe57, 또는 Phe39 및 Leu77, 또는 Phe57 및 Leu77, 또는 Phe39 및 Leu128, 또는 Phe57 및 Leu128, 또는 Leu77 및 Leu128;

Phe39 및 Phe57 및 Leu77, 또는 Phe39 및 Phe57 및 Leu128, 또는 Phe57 및 Leu77 및 Leu128, 또는 Phe39 및 Leu77 및 Leu128;

Phe39 및 Phe57 및 Leu77 및 Leu128.

본 발명에 따른 바람직한 특정 치환들은 하기이다:

Phe39Pro, 또는 Phe57Lys, 또는 Leu77Asp, 또는 Leu128Ser;

Phe39Pro 및 Phe57Lys, 또는 Phe39Pro 및 Leu77Asp, 또는 Phe57Lys 및 Leu77Asp, 또는 Phe39Pro 및 Leu128Ser, 또는 Phe57Lys 및 Leu128Ser, 또는 Leu77Asp 및 Leu128Ser;

Phe39Pr 및 Phe57Lys 및 Leu77Asp, 또는 Phe39Pro 및 Phe57Lys 및 Leu128Ser, 또는 Phe57Lys 및 Leu77Asp 및 Leu128Ser, 또는 Phe39Pro 및 Leu77Asp 및 Leu128Ser;

Phe39Pro 및 Phe57Lys 및 Leu77Asp 및 Leu128Ser.

본 발명의 특정 구현예에서, 인간 IL-7 부분과 80% 이상의 일치도를 가진 폴리펩티드는 추가로 인간 Ig 부분과 같은 면역글로불린 (Ig) 부분을 포함한다. 한 구현예에서, Ig 부분은 IgG2 이다. 일부 구현예에서, Ig 부분은 Fc 부분이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따라 개질된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포에 관한 것이다. 한 구현예에서, 상기 세포는 원핵 세포이다.

추가 구현예에서, 폴리펩티드는 인간 IL-7 부분 또는 그의 활성 부분에 대해 90% 이상의 일치도를 갖고, 또다른 구현예에서 폴리펩티드는 인간 IL-7 부분 또는 그의 활성 부분에 대해 95% 이상의 일치도를 갖는다.

본 발명은 또한, 예를 들어 암 또는 HIV 로 진단된 환자에게 치료 유효량의 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는 환자 치료 방법을 특징으로 한다. 한 구현예에서, 본 발명은 약 0.01 내지 약 10 mg/kg/일 또는 0.01 내지 10.00 mg/kg/일의 본 발명의 폴리펩티드의 투여를 제공한다.

도면의 간단한 설명

도 1 은 인간 IL-7 에 대한 아미노산 서열을 도시한다. 시그널 서열은 굵은체로 나타낸다. 굵은 이탤릭체는 또한 IL-7 서열로부터 결실될 수 있는 18 개의 아미노산의 범위이다.

도 2 는 소 IL-7 에 대한 아미노산 서열을 도시한다. 시그널 서열은 굵은체로 나타낸다.

도 3 은 양 IL-7 에 대한 아미노산 서열을 도시한다. 시그널 서열은 굵은체로 나타낸다.

도 4 는, T 세포 에피토프 서열이 개질된 예시된 탈면역화 인간 IL-7 의 아미노산 서열을 도시한다.

도 5 는 박테리아에서 생산되는 탈면역화 IL-7 의 아미노산 서열을 도시한다.

도 6 은 돌연변이 F39P, F57N 및 L128S 에 대한 코돈을 포함하는 성숙 IL-7 을 코딩하는 핵산 서열을 도시한다.

도 7 은 돌연변이 F39P, F57N 및 L128S 이 있는 성숙 IL-7 의 아미노산 서열을 도시한다.

도 8 은 돌연변이 F39P, F57N, L77D 및 L128S 에 대한 코돈을 포함하는 성숙 IL-7 을 코딩하는 핵산 서열을 도시한다.

도 9 는 돌연변이 F39P, F57N, L77D 및 L128S 이 있는 성숙 IL-7 의 아미노산 서열을 도시한다.

도 10 은 아미노산 돌연변이 K68D, M69D, I88T, V96G 에 대한 코돈이 있는, E. coli 에 대해 코돈-최적화된, 박테리아가 생산하는 탈면역화 IL-7 (bDel-IL-7) 를 코딩하는 핵산 서열을 도시한다.

도 11 은 아미노산 돌연변이 K68D, M69D, I88T, V96G 에 대한 코돈이 있는, 성숙 IL-7 변이체, 탈면역화 IL-7 (Del-IL-7) 를 코딩하는 핵산 서열을 도시한다.

도 12 는 Fc 부분이 γ1 힌지, γ1 CH2 및 γ1 CH3 영역으로 이루어진, Fcγ1-IL-7 의 아미노산 서열을 도시한다.

도 13 은 Fc 부분에 γ1 힌지, γ2 CH2 도메인 및 γ2 CH3 도메인이 있는 인간 Fcγ2(h)(FN>AQ)-IL-7 의 아미노산 서열을 도시한다. Fc 부분은 아미노산 돌연변이 F296A 및 N297Q 를 포함한다.

도 14 는 아미노산 서열 GGGGSGGGGSGGGGS 의 폴리펩티드 링커를 통해 IL-7 부분에 연결되어 있는 CH2 영역, CH1 및 γ1 힌지로 이루어진 Fc 부분인 인간 Fcγ1-(링커1)-IL-7 의 아미노산 서열을 도시한다.

도 15 는 아미노산 서열 GGGGSGGGG 의 폴리펩티드 링커를 통해 IL-7 부분에 연결되어 있고, 돌연변이 Y296A 및 N297Q 를 포함하는, γ1 힌지, CH1 및 CH2 영역이 있는 γ1 Fc 부분인 인간 Fcγ1 (YN>AQ)-(링커2)-IL-7 의 아미노산 서열을 도시한다.

도 16 은 γ1 힌지, CH1 및 CH2 도메인이 있는 γ1 Fc 부분이고, 돌연변이 Y296A 및 N297Q 뿐만 아니라, Fc 부분의 C-말단 라이신 및 전방의 글리신 결실을 포함하는 인간 Fcγ1(YN>AQ,d)-(링커2)-IL-7 의 아미노산 서열을 도시한다. Fc 부분은 아미노산 서열 GGGGSGGGG 의 폴리펩티드 링커를 통해 IL-7 부분에 연결되어 있다.

도 17 은 힌지, CH1 도메인 및 CH2 도메인이 있는 Fc 부분인 Fcγ1 의 핵산 서열을 도시하며, 이들은 전부 IgG1 이다.

도 18 은 Fcγ1(YN>AQ) 의 핵산 서열을 도시하는데, 이는 힌지, CH1 도메인 및 CH2 도메인이 있는 Fc 부분이고, 전부 IgG1 이다. Fc 부분은 돌연변이 Tyr296Ala 및 Asn297Gln 을 포함한다.

도 19 는 Fcγ2(h) 의 핵산 서열을 도시하는데, 이는 IgG1 힌지 및 IgG2 CH2 및 CH3 도메인이 있는 Fc 부분이다.

도 20 은 Fcγ2(h)(FN>AQ) 의 핵산 서열을 도시하는데, 이는 IgG1 힌지 및 IgG2 CH2 및 CH3 도메인이 있는 Fc 부분이다. Fc 부분은 돌연변이 F296A 및 N297Q 를 포함한다.

도 21 은 성숙 인간 탈면역화 IL-7.1 의 아미노산 서열을 도시하는데, 여기서 IL-7 은 치환 L24D, M54A, F57K, A60S, R61E, M147K, T149S, 및 결실 잔기 K150, E151 및 H152 을 포함한다.

도 22 는 도 21 의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 도시한다.

도 23 은 치환 D76N, L77D, T87Q, I88T, V96G, L119S, L128V, M147K, T149S, 및 결실 K150, E151 및 H152 을 포함하는 성숙 인간 탈면역화 IL-7.2 의 아미노산 서열을 도시한다.

도 24 는 도 23 의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 도시한다.

도 25 는 치환 L24D, I30T, F39P, M54A, F57K, A60S, R61E, M68D, N69D, L77D, T87Q, I88T, V96G, L119S, L128A, M147K, T149S, 및 결실 K150, E151 및 H152 를 포함하는 성숙 인간 탈면역화 IL-7.3 의 아미노산 서열을 도시한다.

도 26 은 도 25 의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 도시한다.

도 27 은 링커 서열 GGGGSGGGG 을 코딩하는 핵산 서열에 이어 아미노산 치환 F39P, F57N 및 L128S (PNS) 을 포함하는 성숙 인간 IL-7 을 코딩하는 핵산 서열을 도시하며, 이는 5' 및 3' 말단에 각각 인접 제한효소 부위 XmaI 및 XhoI 을 포함한다.

도 28 은 IgG1 힌지 및, IgG2 CH2 및 CH3 도메인이 있는 인간 Fc 부분인, 돌연변이 F39P, F57N, L77D 및 L128S 를 포함하는 인간 IL-7 부분의 N-말단에 연결된, 돌연변이 F296A 및 N297Q 를 포함하는 성숙 huFcγ2(h)(FN>AQ)(링커2)-IL-7(F39P, F57N, L77D, L128S) 의 핵산 서열을 도시한다. Fc 부분 및 IL-7 부분은 링커 서열 GGGGSGGGG 에 의해 연결된다.

도 29 는 돌연변이 F39P, F57N, L77D 및 L128S 를 포함하는 인간 IL-7 부분의 N-말단에 연결되어 있는 IgG2 CH2 및 CH3 도메인 및 IgG1 힌지가 있는 인간 Fc 부분인 성숙 huFcγ2(h)-(링커2)-IL-7(F39P, F57N, L77D, L128S) 의 핵산 서열을 도시한다. Fc 부분 및 IL-7 부분은 링커 서열 GGGGSGGGG 에 의해 연결되어 있다.

도 30 은 돌연변이 F39P, F57N 및 L128S 를 포함하는 인간 IL-7 부분의 N-말단에 연결되어 있는 CH3, IgG2 CH2 도메인 및 IgG1 힌지가 있는 인간 Fc 부분인 성숙 huFcγ2(h)-(링커2)-IL-7(F39P, F57N, L128S) 의 핵산 서열을 도시한다. Fc 부분 및 IL-7 부분이 링커 서열 GGGGSGGGG 에 의해 연결되어 있다.

도 31 은 성숙 huFcγ2(h)(FN>AQ)-(링커2)-IL-7(F39P, F57N, L128S) 의 아미노산 서열을 도시하는데, 이는 IgG1 의 힌지 및 IgG2 의 CH2 및 CH3 도메인이 있는 인간 Fc 부분이다. Fc 부분이 돌연변이 F296A 및 N297Q 를 포함한다. Fc 부분은 링커 서열 GGGGSGGGG 을 통해 IL-7 부분에 연결되어 있다. IL-7 부분은 돌연변이 F39P, F57N 및 L128S 을 포함한다.

도 32 는 성숙 huFcγ2(h)(FN>AQ)-(링커2)-IL-7(F39P, F57N, L77D, L128S) 의 아미노산 서열을 도시하는데, 이는 IgG1 의 힌지 및 IgG2 의 CH2 및 CH3 도메인이 있는 인간 Fc 부분이다. Fc 부분이 돌연변이 F296A 및 N297Q 를 포함한다. Fc 부분은 링커 서열 GGGGSGGGG 를 통해 IL-7 부분에 연결되어 있다. IL-7 부분은 돌연변이 F39P, F57N, L77D 및 L128S 를 포함한다.

도 33 은 성숙 huFcγ2(h)-(링커2)-IL-7(F39P, F57N, L77D, L128S) 의 아미노산 서열을 도시하는데, 이는 IgG1 의 힌지 및 IgG2 의 CH2 및 CH3 도메인이 있는 인간 Fc 부분이다. Fc 부분이 서열 GGGGSGGGG 의 링커를 통해 IL-7 부분에 연결되어 있다. IL-7 부분은 돌연변이 F39P, F57N, L77D 및 L128S 를 포함한다.

도 34 는 성숙 huFcγ2(h)(링커2)-IL-7(F39P, F57N, L128S) 의 아미노산 서열을 도시하는데, 이는 IgG1 의 힌지 및 IgG2 의 CH2 및 CH3 도메인이 있는 인간 Fc 부분이다. Fc 부분은 서열 GGGGSGGGG 의 링커를 통해 IL-7 부분에 연결되어 있다. IL-7 부분은 돌연변이 F39P, F57N, L77D 및 L128S 를 포함한다.

도 35 는 인간, 침팬지, 비비, 머카크, 소, 돼지, 양, 래트 및 쥐과동물 공급원 유래의 IL-7 단백질의 아미노산 서열 배치이다.

도 36 은 Fc-IL-7 를 피하투여한 시험군 마우스 및 대조군 마우스 모두에 대한 ㎍/ml 로 나타낸 Fc-IL-7 혈장 농도를 도시한다.

도 37 은 Fc-IL-7 를 피하 투여한 (SC) 시험 마우스에서의 제 0 일과 제 2 일 사이, 및 제 2 일과 제 4 일 사이 혈장 Fc-IL-7 농도에서의 평균 변화 배율에 대한 값을 나타낸다.

도 38 은 대조군에서의 마우스의 평균 장기 중량과 비교한 제 7 일에 희생시킨 시험 마우스로부터 취한 평균 장기 중량을 도시한다.

도 39 는 제 7 일째의 대조군, 0.5 mg/kg 투여군, 5.0 mg/kg 투여군 및 25 mg/kg 투여군 유래의 마우스의 말초 혈액 중의 세포수/㎕ 로 나타낸 과립구 Gr-1+ 세포의 빈도 비교를 도시한다.

도 40 은 제 7 일째의 대조군, 0.5 mg/kg 투여군, 5.0 mg/kg 투여군 및 25 mg/kg 투여군 유래의 마우스의 말초 혈액 중의 세포수/㎕ 로 나타낸 CD19+ 세포의 빈도 비교를 도시한다.

도 41 은 제 7 일째의 대조군, 0.5 mg/kg 투여군, 5.0 mg/kg 투여군 및 25 mg/kg 투여군 유래의 마우스의 말초 혈액 중의 세포수/㎕ 로 나타낸 CD4+ 세포의 빈도 비교를 도시한다.

도 42 는 제 7 일째의 대조군, 0.5 mg/kg 투여군, 5.0 mg/kg 투여군 및 25 mg/kg 투여군 유래의 마우스의 말초 혈액 중의 세포수/㎕ 로 나타낸 CD8+ 세포의 빈도 비교를 도시한다.

도 43 은 표준 세포 증식 검정에서 IL-7/Fc-IL-7 농도에 대한 분 당 계수된 3 중수소화 티미딘의 혼입을 기준으로 한 야생형 IL-7 과 비교한 Fc-IL-7 의 활성을 도시한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 야생형 IL-7 에 비해 감소된 면역원성을 가진 IL-7 단백질, 및 상기 단백질의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명은 면역 응답성을 자극할 수 있는 IL-7 내의 T-세포 에피토프를 원천적으로 제거함으로써 IL-7 자체의 면역원성을 감소시키는 효과를 갖는 IL-7 부분 내의 돌연변이를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 기술에 따라 개질된 IL-7 부분을 포함하는 융합 단백질을 포함한다.

T-세포 에피토프는 구조-근거의 컴퓨터 모델링을 근거로 하는 예측 또는 펩티드 합성 및 특정 MHC 클래스 II 분자에 대한 결합에 대한 시험에 의한 예측 또는 면역원성 검정에서의 예측을 포함하는, 각종 전산 및 비전산 방법으로 동정될 수 있다. 본 발명에 따르면, 잠재적인 T-세포 에피토프는, 분리된 펩티드로서 간주하는 경우, 비-인간 종에서는 MHC 클래스 II 분자 또는 등가물에 결합할 것으로 예측되는 서열이다. 잠재적인 T-세포 에피토프는 항원-제시 세포에 대한 단백질 흡수 효율, MHC 클래스 II 에 결합할 수 있는 펩티드를 제공할 온전한 단백질 중 부위들에서의 절단 효율 등과 같은 항원 프로세싱의 다른 국면을 고려하지 않고 정의된다. 이에 따라, 동물에게 단백질을 투여한 후 MHC 클래스 II 상에 실제로 제시되는 T-세포 에피토프의 셋트는 잠재적인 T-세포 에피토프의 하위셋트이다. 본 발명에 따르면, T-세포 에피토프는 MHC 클래스 II 분자와 상호작용하는 단백질 상의 에피토프이다. 이론에 구애됨이 없이, T-세포 에피토프는 T-세포 발생 동안 음성적인 T-세포 선별 프로세스를 거치지 않은 단백질 중의 아미노산 서열이므로, MHC 클래스 II 분자에 의해 제시되고 T-세포 수용체에 의해 인식될 것으로 예측된다.

B-세포 에피토프는 또한 구조-근거 컴퓨터 모델링을 근거로 하는 예측 또는 펩티드 합성 및 특이적인 B-세포 항원 수용체 분자에 대한 결합에 대한 시험에 의한 예측 또는 면역원 검정에서의 예측을 포함하는 각종 전산 및 비전산 방법으로 동정된다. 본 발명에 따르면, 잠재적인 B-세포 에피토프는, 분리된 펩티드로서 간주하면, 비-인간 종에서는 B-세포 항원 수용체 또는 동등물에 결합하는 것으로 예측되는 서열이다. B-세포 에피토프는 B-세포 항원 수용체에 결합하거나 또는 이에 인식되는 에피토프이며, 잠재적인 B-세포 에피토프의 하위셋트이다.

본 발명은 IL-7 의 면역원성의 감소에 관한 것이다. 본 발명의 한 구현예에 따르면, 잠재적인 비-자기 T-세포 에피토프는 IL-7 의 서열에서 식별된다. 예를 들어, 잠재적인 비-자기 T-세포 에피토프는 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 모델링 펩티드를 근거로 하는 전산적인 방법에 의해 식별된다. 이어서, 치환은, 잠재적인 T-세포 에피토프를 포함하는 펩티드의 MHC 클래스 II 에 결합하는 능력이 감소되거나 또는 제거되도록 한다. MHC 클래스 II 에 결합하는 펩티드의 이러한 식별 및 개질 프로세스는 "탈-면역화" 로 지칭되며, 결과로서 개질된 단백질 분자는 "탈-면역화됨" 으로 지칭된다.

본 발명에 따르면, MHC 클래스 II 결합은, 단백질이 포유류 글리코실화 패턴을 생성하지 않는 유기체, 예컨대 효모 또는 곤충 세포 또는 박테리아에서 생산되는 경우 제거될 수 있다.

본 발명은 번잡한 컴퓨터 시뮬레이션 또는 단백질 3 차원 구조를 필요로 하지 않으면서 IL-7 에서 T-세포 에피토프의 갯수를 감소 또는 삭제하기 위한 비-전산적 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 본 발명의 방법은 항원 제시 동안 9 개 아미노산의 코어 분절이 MHC 클래스 II 분자 뿐만 아니라 T-세포 수용체와 상호작용한다는 장점을 취한다. 대부분의 N-말단 아미노산, "고정 (anchor)" 위치는, MHC 클래스 II 분자 내의 안쪽 포켓 (deep pocket) 에 결합한다. 하기 아미노산들 중 하나는 전형적으로는 고정 위치에 존재하는데, 이는 MHC 클래스 II 분자에 대한 결합에 중요하다: 류신, 발린, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판. 본 발명에 따라서, 중심 9 개의 아미노산에 근접해 추가적인 2 내지 3 개의 아미노산이 또한 MHC 분자와의 상호작용에 영향을 준다.

본 발명의 일반적인 방법에는 IL-7 에서 발생하는 임의의 류신, 발린, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신 또는 트립토판의 돌연변이화가 포함된다. 한 구현예에서, 후보자 T-세포 에피토프 중의 하나 이상의 상기 아미노산은 트레오닌, 알라닌 또는 프롤린으로 돌연변이화됨으로써, 치환되는 아미노산의 소수성 특징의 일부가 잔존한다. 본 발명의 추가 구현예에서, 하나 이상의 상기 언급된 아미노산이 후보자 T-세포 에피토프 또는 잠재적인 T-세포 에피토프로부터 결실되거나 또는 적당한 아미노산 유사체로 치환된다. 본 발명에 따르면, 아미노산이 결실되어 잠재적인 T-세포 에피토프를 파괴하는 경우, 결실 부근의 아미노산을 포함하는 신규한 T-세포 에피토프가 생성되지 않도록 주의해야 한다.

이에 따라, 본 발명은 덜 면역원성인 IL-7 단백질의 구축에 유용한 핵산 서열 및 단백질을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 류신, 발린, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신 또는 트립토판의 돌연변이가 있는 단백질을 제공한다. 임의의 지방족 또는 방향족 잔기 (류신, 발린, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 또는 타이로신) 는 MHC 분자의 포켓에 결합하는 첫번째 위치 (고정 위치) 의 아미노산이 있는 MHC 결합 펩티드를 생성할 큰 위험을 나타낸다. 따라서, 상기 언급된 아미노산이 아닌 아미노산 또는 알라닌, 프롤린 또는 트레오닌으로 임의의 상기 언급된 아미노산이 치환되면 후보자 T-세포 에피토프가 제거된다.

단백질은 인체에서 발견되는 서열에 일반적으로 상응하는 서열을 가진 인간 단백질일 수 있다. 본 발명은 또한 상기 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 본 발명의 상기 국면에 대한 핵산 서열은 플라스미드, PCR-생성 절편 또는 화학 합성으로 생성된 핵산으로서 존재할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인터류킨-7" 또는 "IL-7" 은 야생형 성숙 포유류 IL-7 에 대해 실질적인 아미노산 서열 일치성을 가진 IL-7 폴리펩티드 및 그의 유도체 및 유사체를 의미한다. 예를 들어, IL-7 은 하기의 아미노산 서열을 가진 재조합 또는 비-재조합 폴리펩티드의 아미노산 서열을 의미한다: i) IL-7 폴리펩티드의 자연 (native) 또는 자연 발생 (naturally-ocurring) 대립형질 변이체, ii) IL-7 폴리펩티드의 생물학적 활성 절편, iii) IL-7 폴리펩티드의 생물학적 활성 폴리펩티드 유사체, 또는 iv) IL-7 폴리펩티드의 생물학적 활성 변이체.

본 발명에 따라 개질된 IL-7 폴리펩티드는 임의의 종들, 예를 들어 인간, 소 또는 양으로부터 유도될 수 있다. IL-7 핵산 및 아미노산 서열은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 인간 IL-7 아미노산 서열의 Genbank 접근 번호는 NM 000880 (서열 식별 번호 1) 이며 도 1 에 나와있고; 마우스 IL-7 아미노산 서열의 Genbank 접근 번호는 NM 008371 이며; 래트 IL-7 아미노산 서열의 Genbank 접근 번호는 AF 367210 이며; 소의 IL-7 아미노산 서열의 Genbank 접근 번호는 NM 173924 (서열 식별 번호 2) 이며 도 2 에 나와있고; 양 IL-7 아미노산 서열의 Genbank 접근 번호는 U10089 (서열 식별 번호 3) 이며 도 3 에 나와있다. 각각의 폴리펩티드 종들의 시그널 서열은 각 도면에서 굵은체로 나타냈고, 일반적으로는 IL-7 부분이 담체 단백질에 대해 C-말단 융합된 곳은 포함되지 않는다.

추가로, 도 35 에서, 각종 포유류 IL-7 서열의 정렬을 나타냈다. 비-인간 영장류 유래의 IL-7 은 일반적으로 인간 IL-7 와 90% 초과로 일치한다. 쥐과동물 IL-7 서열이 70% 미만의 일치도로 인간 IL-7 서열과 가장 일치하지 않으나, 그럼에도 불구하고 인간 IL-7 수용체를 활성화시킬 수 있다. 따라서, 상기 범위의 종들의 IL-7 부분은 본 발명의 교시에 따라 특히 유용하다.

IL-7 단백질의 "변이체" 는 야생형 IL-7 과 비교시 하나 이상의 아미노산이 변경된 IL-7 아미노산 서열로서 정의된다. 변이체는 "보존성" 변화를 가질 수 있는데, 치환된 아미노산은, 예를 들어 류신의 이소류신으로의 치환은 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 갖는다. 더 드물게는, 변이체는 "비보존성" 변화, 예를 들어 글리신의 트립토판으로의 치환을 가질 수 있다. 유사한 미미한 변경에는 또한 아미노산 결실 또는 삽입 또는 이들 모두를 포함할 수 있다.

변이체 IL-7 단백질에는 또한 야생형 IL-7 에 대해 약 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 일치도를 갖는 폴리펩티드가 포함된다. 두 아미노산 서열 또는 두 핵산의 백분율 일치도를 결정하기 위해서는, 서열을 최적의 비교 목적으로 정렬한다 (예를 들어, 제 2 아미노산 또는 핵산 서열에 대한 최적의 배열을 위해 제 1 아미노산 또는 핵산 서열의 서열에 갭을 삽입할 수 있다). 두 서열 사이의 백분율 일치도는 서열들에 의해 공유되는 일치 위치의 갯수의 함수이다 (예를 들어, % 상동성 = (일치 위치들의 갯수/위치들의 총 갯수) 곱하기 100). 두 서열 사이의 백분율 상동성의 결정은 수학적 알고리즘을 이용하여 수행될 수 있다. 두 서열의 비교를 위해 이용되는 수학적 알고리즘의 비제한적 예시는 [Karlin and Altschul, (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-68] 의 알고리즘으로, [Karlin and Altschul, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-77] 에서의 것을 변형한 것이다. 그러한 알고리즘은 [Altschul 등, (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10] 의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 포함되어 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 NBLAST 프로그램, 스코어 = 100, 단어길이 = 12 로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 단어길이 = 3 로 수행될 수 있다. 비교 목적을 위해 갭이 삽입된 배치를 수득하기 위해서는, [Altschul 등, (1997) Nucleic Acids Research, 25(17): 3389-3402] 에 기재된 바와 같이 Gapped BLAST 를 이용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우, 각 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST) 의 디폴트 파라미터를 이용할 수 있다.

더욱이, 본 발명은 IL-7 부분이 결실을 포함하며 상응하는 비개질 IL-7 융합 단백질과 비교시 필적할 만한 활성을 보유하는 IL-7 융합 단백질을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 IL-7 부분이 야생형 인간 IL-7 (서열 식별 번호 1 참조) 의 서열 VKGRKPAALGEAQPTKSL (서열 식별 번호 25) 에 해당하는 18 개의 아미노산 내부 결실을 포함하는 Ig-IL-7 또는 IL-7 의 형태를 제공한다. 추가로, 본 발명은 Lys150 이 결실된 IL-7 의 활성 형태를 제공한다. IL-7 의 활성 형태를 여전히 유지하면서 Glu151 및 His152 는 또한 Lys150 와 함께 결실될 수 있다.

본 출원을 통틀어, IL-7 서열에서의 아미노산 잔기들의 아미노산 위치들은 성숙 인간 IL-7 단백질을 기준으로 제시한다. 예를 들어, 출발 메티오닌을 포함하는, 박테리아에서 생산된 인간 IL-7 단백질의 N-말단 서열 MDCDIEGK...(서열 식별 번호 22) 에서의 시스테인은 Cys2 로 언급한다.

IL-7 단백질의 개질

본 발명의 한 국면은 박테리아의 발현으로 생성되는 IL-7 이 포유류와 같은 진핵생물의 특징인 트랜슬레이션 후 개질을 포함하지 않는다는 식견으로부터 도출된다. 예를 들어, IL-7 은 위치 70, 91 및 116 에서의 3 개의 예측되는 N-연결 글리코실화 부위를 포함한다. 포유류 세포에서 발현되는 Fc-IL-7 융합 단백질에서, 위치 70 및 91 에서의 아스파라긴은 글리코실화되며, 위치 116 에서의 아스파라긴은 글리코실화되지 않는다. 인체에서 내재적으로 생산된 IL-7 이 또한 적어도 위치 70 및 91 에서, 가능하게는 위치 116 에서도 N-글리코실화되기 쉽다. 상기 N-연결 글리코실화는 박테리아에서 생산된 IL-7 에는 나타나지 않으며, 인간 면역계에 의해 "비-자기" 로, 즉 인체에 정상적으로는 존재하지 않는 것으로 인식될 수 있는 서열을 나타낸다. 이와 같이, 본 발명은 IL-7 및 관련 단백질의 면역원성을 감소시키기 위해 IL-7 상의 상기 잠재적인 에피토프 영역을 탈면역화시키는 것을 포함한다.

본 발명에 따르면, T-세포 에피토프는 표 1 에 기재한 바와 같이 위치 70 및 91 을 포함하는 IL-7 에 존재한다. 표 1 에 나타낸 에피토프는 최소한 9-머의 펩티드로 정의되며, 강한 MHC 클래스 II 고정 잔기가 첫번째 위치에 존재한다.

본 발명에 따르면, 박테리아에서 생산된 IL-7 의 면역원성을 감소시키는 한 가지 방법은 하나 이상의 하기 돌연변이를 삽입하는 것이다: Leu63Ala, Leu63Val, Leu63Pro, Leu63Thr, Lys68Asp, Met69Asp, Lys68Glu, Met69Glu, Ile88Thr, Ile88Ala, Ile88Val 및 Val96Gly. 기타 돌연변이는 위치 63, 66, 69, 88 및/또는 94 에 도입될 수 있다. 일부 돌연변이는 Met69Asp 와 짝지어진 Lys88Asp 및/또는 Val96Gly 와 짝지어진 Ile88Thr 와 같은 조합에 특히 유용하다.

상기 돌연변이를 IL-7 또는 IL-7 를 포함하는 융합 단백질에 도입하는 경우, 수득되는 돌연변이 단백질은 일반적으로 치료 단백질로서 유용한 충분한 IL-7 생물학적 활성을 갖는다. 사실, IL-7 부분의 생물학적 활성은 야생형 IL-7 의 생물학적 활성과 비교시 적어도 10%, 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 이다. 본 발명의 IL-7 의 활성은 시험관내 또는 생체내 검정에서 시험될 수 있다. 실시예 9 는 본 발명의 IL-7 변이체의 생물학적 활성을 시험하기 위한 검정을 보여준다.

추가로, 돌연변이는 일반적으로, 고분자량의 응집체 및 부정확하게 디설파이드-결합된 형태가 대부분 없는 순수한 단백질이 분리될 수 있도록 IL-7 의 적당한 폴딩을 가능하게 해 준다. 그러나, 임의의 특별한 조합의 결과인 폴딩 및 생물학적 활성은 예를 들어 실시예에서 설명한 바와 같이 시험되어 원하는 활성이 수득되는지를 밝혀낼 수 있다.

본 발명에 따르면, 박테리아가 제공하는 IL-7 의 면역원성을 감소시키는 대안적인 전략은 Asn70 및 Asn91 을 아스파르트산으로 변경하는 것이다. 이론에 구애되지 않고, Asn70 및 Asn91 의 아스파르트산으로의 돌연변이는 하기 이유로 유용할 수 있다.

외인성으로 투여되는 치료 단백질의 면역원성은, 부분적으로는 치료 단백질로부터 유도된 T-세포 에피토프의 제시를 통해 중재된다. 상기 제시는 하기 메카니즘을 통해 발생하는 것으로 여겨진다. 치료 단백질은 식균 작용에 의해 수상 세포, 마크로파지 또는 B 세포와 같은 항원-제시 세포 (APC) 에 의해 취해진다. 단백질은 초기, 중기 및 말기 엔도좀 (endosome) 을 포함하는, 엔도좀으로 명명되는 일련의 소포 (vesicle) 로 이동된다. 상기 소포에서, 환경은 점차 더욱 거칠어지며 세포외부의, 중성 pH 에서 안정하게 폴딩될 수 있는 디설파이드-결합된 단백질에 대해 덜 친화적으로 된다. 카텝신 (cathepsin) 으로 명명되는 프로테아제는 내재 단백질을 작은 펩티드로 분해한다. 이어서, 상기 단백질 절편의 일부는, MHC 클래스 II 단백질에 의해 고정되는데, 이는 상기 절편을 MHC 클래스 II/펩티드 복합체로서 세포 표면으로 이동시킨다. 상기 복합체는 CD4+ T-세포 상의 T-세포 수용체에 의해 인식된다.

외래 단백질로부터 유도된 펩티드의 경우, MHC 클래스/II 펩티드 복합체의 제시는 면역 응답성을 자극할 수 있다. 그러나, 자가 단백질로부터 유도된 펩티드의 경우, MHC 클래스 II/펩티드 복합체를 인식하는 T-세포가 결실되거나 또는 면역 응답성을 활성화시키지 않도록 하는 다중적인 메카니즘이다.

상기 두 문단을 배경지식으로 하면, N-글리코실화 단백질이 엔도좀 내에서 어떻게 변화하는지를 고려하는 것이 중요하다. 상기 단백질은 MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있는 N-연결 올리고당-포함 펩티드로 분해될 수 있다. 본 발명의 견해에 따르면, 엔도좀은 또한 아스파라긴으로부터 올리고당을 종종 제거하는 엔도글리코시다아제를 포함하며, 이렇게 함으로써 아스파라긴을 아스파르트산으로 전환시킨다. 이에 따라, 아스파라긴-연결 올리고당을 포함하는 자가 단백질 서열은 올리고당에 연결된 아스파라긴을 포함하는 펩티드로서 또는 아스파라긴 대신 아스파르트산을 포함하는 상응하는 펩티드로서 MHC 클래스 II 에 의해 제시될 수 있다.

본 발명의 일부로서, 박테리아에서 발현되는 포유류 단백질의 면역원성을 감소시키기 위한 상기 전략이 일반적인 방법에 적용될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 구체적으로, N-연결 글리코실화의 부위에서의 아스파라긴에 대한 아스파르트산의 치환은 일반적으로는 원핵생물에서 발현되는 포유류 단백질의 면역원성을 감소시키는 효과를 갖는다.

본 발명은 박테리아 또는 포유류 세포에서 발현되는 경우 IL-7 및 IL-7-포함 융합 단백질의 면역원성을 감소시키는 추가적인 돌연변이를 포함한다. 상기 돌연변이에는 하기 표 2 에 제시된 것이 포함된다. IL-7 또는 IL-7 포함 융합 단백질은 하나 이상의 이러한 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 구현예에서, IL-7 은 하나 이상의 L24D, M54A, F57K, A60S, R61E, M147K 및 T149S 중 하나 이상을 포함하며, K150, E151 및 H152 은 결실되도록 개질된다. 또다른 구현예에서, IL-7 은 하나 이상의 D76N, L77D, T87Q, I88T, V96G, L119S, M147K 및 T149S 은 포함하며, K150, E151 및 H152 은 결실되도록 개질된다. 추가 구현예에서, IL-7 은 하나 이상의 L24D, I30T, F39P, M54A, F57K, A60S, R61E, M68D, N69D, L77D, T87Q, I88T, V96G, L119S, L128A, M147K 및 T149S 을 포함하며, K150, E151 및 H152 는 결실되도록 개질될 수 있다.

또다른 구현예에서, IL-7 분자 또는 IL-7 포함 융합 단백질은 IL-7 의 잔기 39, 57, 77 및/또는 128 중 하나 이상에 대한 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 구현예에서 IL-7 는 잔기 39 에서의 돌연변이를 포함한다. 또다른 구현예에서, IL-7 은 잔기 57 에서의 돌연변이를 포함한다. 추가 구현예에서, IL-7 은 두 잔기 39 및 57 에서의 돌연변이를 포함한다. 또다른 구현예에서, IL-7 은 잔기 39, 57 및 128 에서의 돌연변이를 포함하며, 또다른 구현예에서는 IL-7 은 잔기 39, 57 및 77 에서의 돌연변이를 포함한다. 또다른 구현예에서, IL-7 은 잔기 39, 57, 77 및 128 에서의 돌연변이를 포함한다. 추가 구현예에서, 위치 39 에서의 페닐알라닌 잔기는 프롤린 잔기에 의해 치환된다 (F39P). 또다른 구현예에서, 위치 57 에서의 페닐알라닌 잔기는 아스파라긴 잔기로 치환된다 (F57N). 또다른 구현예에서, 위치 77 에서의 류신 잔기는 아스파르트산으로 치환된다 (L77D). 또다른 구현예에서, 위치 128 에서의 류신 잔기는 세린으로 치환된다 (L128S).

본 발명의 단백질의 감소된 면역성의 확인

본 발명의 돌연변이가 감소된 면역원성을 실제로 제공하는지를 확인하기 위해, 당업계에 널리 공지된 표준 실험 시험을 수행할 수 있다. 예를 들어, T-세포 자극 점정을 이용할 수 있다 (예를 들어, Jones 등, (2004), J. Interferon Cytokine Res., 24:560). 상기 검정에서, 인간 말초혈 단핵구 세포 (PBMC) 를 입수하여 표준 조건에 따라 배양한다. 임의의 사전 자극 후, 잠재적인 MHC 클래스 II 에피토프에 해당하는 펩티드를 PBMC 의 배양물에 첨가하고; 상기 PBMC 를 추가로 인큐베이션하고, 이후 삼중수소화 티미딘을 첨가한다. 펩티드는 최소한 9-머일 수 있거나, 또는 약 10 내지 15 개 또는 그 이상의 아미노산을 가질 수 있다. 세포의 추가 인큐베이션 후, 삼중수소화 티미딘을 DNA 로 혼입시킨 것을 표준 기술로 측정한다.

T-세포 자극 검정은 하기의 메카니즘으로 작용하는 것으로 여겨진다. 우선, 펩티드를 자극제로 사용하는 경우, 펩티드는 먼저 PBMC 중의 세포 상에 제시된 MHC 클래스 II 분자에 결합해야 한다. 두번째로, MHC 클래스 II/펩티드 복합체는 CD4+ T-세포 상의 T-세포 수용체와 생산적으로 상호작용해야 한다. 시험 펩티드가 MHC 클래스 II 분자와 충분히 단단하게 결합될 수 없는 경우, 시그널이 생성되지 않는다. 펩티드가 MHC 클래스 II 분자에 결합할 수 있고, 특별한 MHC 클래스 II/펩티드 복합체를 인식할 수 있는 적당히 재배열된 T-세포 수용체를 발현하는 T-세포가 있는 경우, 시그널은 생성된다. 그러나, 상기 T-세포가 음성 선택 과정의 결과로서 결실된 경우, 시그널은 생성되지 않는다. 이들 메카니즘은, 주어진 펩티드에 의한 자극으로 또는 이러한 자극의 부재 하에 단백질 서열의 면역원성을 참조로 하여 고려된다.

T-세포 인식이 적당한 T-세포 수용체가 없거나 또는 T-세포 집단의 항상성에 따르는 기타 비관련 T-세포의 증식과 관련된 확률적인 이유로 PBMC 집단에서 매우 낮은 빈도로 나타나는 경우, 시그널이 예상되었더라도 시그널이 없을 수 있다. 이에 따라, 잘못된 네거티브 결과가 발생할 수 있다. 상기 고려사항을 토대로, 다수의 상이한 근원의 PBMC 를 사용하고 이들 샘플을 독립적으로 시험하는 것이 중요하다. 또한, 일반적으로 인종이 상이한 인간 유래의 PBMC 를 시험하고 각각의 PBMC 집단에 존재하는 MHC 클래스 II 대립형질을 결정하는 것이 유용하다.

표준 T-세포 검정은 삼중수소 혼입 시그널이 종종 백그라운드 혼입보다 고작 2 배 더 크다는 단점을 갖는다. 본 발명의 단백질 및 펩티드는 또한, 예를 들어 정제된 CD4+ T-세포 및 정제된 수상 세포를 시험 펩티드의 존재 하에 함께 배양하고 삼중수소화 티미딘에 노출시킨 후, 삼중수소화 티미딘 혼입에 대해 검정하는 개량된 T-세포 검정에서 시험할 수 있다. 상기 두번째 검정은 CD8+ T-세포와 같은 무관한 세포에 대한 삼중수소화 티미딘 혼입이 본질적으로 제거되며, 이에 따라 백그라운드가 감소된다는 장점을 갖는다.

세번째 검정은 영장류와 같은 동물에서 감소된 면역원성을 가진 후보자 단백질의 시험을 수반한다. 상기 검정은 일반적으로는 IL-7 부분이 상기 기재된 것과 같은 세포-기준의 검정에서 잠재적인 면역원성에 대해 개별적인 부속 단백질을 시험함으로써 고안된 완전한 IL-7 단백질 또는 IL-7-포함 융합 단백질의 시험을 수반한다. 일단 상기 후보자 IL-7-포함 단백질을 고안하여 발현시키면, 단백질은 동물에 대한 주입에 의해 면역원성에 대해 시험된다.

개질된 IL-7-포함 단백질의 주입은 일반적으로 인간의 치료 용도에서의 예견된 전달경로와 동일한 방식으로 수행된다. 예를 들어, 피내, 피하, 근육내, 복막내 주사 또는 정맥내 주입이 이용될 수 있다. 한 가지 이상의 투여가 이용된다면, 투여는 상이한 경로일 수 있다.

면역원성 시험 목적으로, 시그널을 증가시키고 이용해야 할 동물의 개체수를 최소화하기 위해 아쥬반트를 함께 투여하는 것이 유용할 수 있다. 아쥬반트를 사용하는 경우, 비메틸화 CpG 디뉴클레오티드가 있는 비-코딩 DNA, 박테리아의 지질 A, N-포르밀 메티오닌 또는 기타 박테리아성 비-단백질 구성원과 같은 단백질 구성원이 없는 아쥬반트를 사용하는 것이 가능하다. 이론에 구애됨없이, 단백질-포함 아쥬반트를 회피하기 위한 이론적 근거는, 다른 단백질들이 후보자 단백질에 대한 항체 응답성을 궁극적으로 제공할 T-세포 에피토프를 제공할 수 있다는 점이다.

후보자 IL-7-포함 단백질의 1 회 이상의 투여 후, 항-IL-7 항체의 존재는 ELISA 방법과 같은 표준 기술에 따라 시험된다. 본 발명의 변경된 IL-7-포함 분자는 정상적인 인간 IL-7 을 포함하는 상응하는 분자보다 항체 형성을 덜 빈번하게 더 낮은 정도로 유도한다는 것이 발견되었다.

본 발명의 다수의 단백질들은 IL-7 의 표면 잔기를 변경시킨다. 본 발명의 단백질들은, 인간 IL-7 를 포함하는 상응하는 단백질보다 덜 면역원성이면서, 항체의 형성을 여전히 때때로 유도할 수 있는 것으로 여겨진다. 본 발명의 단백질의 B-세포 에피토프가 일반적으로 비개질 IL-7 의 것과 상이하기 때문에, 본 발명의 단백질에 대한 항체는 내재 IL-7 과는 교차반응하지 않으며, 본 발명의 단백질에 대한 항체의 형성은 환자의 건강에 장기적으로 영향을 주지 않는다.

Fc-IL-7 융합 단백질

본 발명의 핵심적인 국면은 본 발명에 따라 개질된 IL-7 이 담체 단백질과 융합되어 융합 단백질을 형성할 수 있다는 것이다. 한 구현예에서, 담체 단백질은 융합 단백질의 N-말단을 향해 위치하고, IL-7 은 C-말단을 향해 위치한다. 또다른 구현예에서, IL-7 은 융합 단백질의 N-말단을 향해 위치하며, 담체 단백질은 C-말단을 향해 위치한다.

담체 단백질은 IL-7 단백질에 공유결합으로 융합되는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 한 구현예에서, 담체 단백질은 알부민, 예를 들어 인간 혈청 알부민이다. 알부민 부분은 IL-7 부분의 C-말단 또는 N-말단 끝에 융합될 수 있다. 또다른 구현예에서, 담체 단백질은 면역글로불린 (Ig) 부분, 예컨대 Ig 중쇄이다. Ig 쇄는 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 로부터 유래될 수 있다. 본 발명에 따르면, Ig 부분은 온전한 항체일 수 있고, 신체의 특이적인 표적 부위에 대한 IL-7 융합 단백질을 지령할 수 있다. 항체 표적을 이용하는 융합 단백질은 당업계에 공지되어 있다.

한 구현예에서, Ig 부분은 Fc 영역을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "Fc 부분" 은 불변 영역의 절편, 유사체, 변이체, 돌연변이체 또는 유도체를 포함하여, 면역글로불린, 예컨대 인간 면역글로불린의 불변 영역으로부터 유도된 도메인을 포괄한다. 적합한 면역글로불린에는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 기타 클래스가 포함된다. 면역글로불린의 불변 영역은 면역글로불린 C-말단 영역과 동일원인 자연-발생 또는 합성-제조 폴리펩티드로서 정의되며, 힌지, CH2 도메인, CH3 도메인 또는 CH4 도메인이 개별적으로 또는 임의의 조합으로 포함될 수 있다. 본 발명에서, Fc 부분은 일반적으로는 적어도 CH2 도메인을 포함한다. 예를 들어, Fc 부분은 힌지-CH2-CH3 를 포함할 수 있다. 대안적으로, Fc 부분은 힌지 영역, CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. Fc-IL-7 융합 단백질의 제조 방법은 U.S. 임시 특허 출원 제 60/533,406 호에 개시되어 있다.

면역글로불린의 불변 영역은 Fc 수용체 (FcR) 결합 및 보체 고정을 포함하는 다수의 중요한 항체 기능에 원인을 제공한다. IgA, IgG, IgD, IgE 및 IgM 로 분류되는 5 가지 주된 클래스의 중쇄 불변 영역이 있다. 예를 들어, IgG 는 각각 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 로 공지되어 있는 하기의 4 가지 γ 하위클래스로 분류된다: γ1 , γ2, γ3 및 γ4.

IgG 분자는 항체의 IgG 클래스에 특이적인 Fcγ 수용체 (FcγR) 의 세 클래스, 즉 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 를 포함하는 세포 수용체의 다중 클래스와 상호작용한다. FcγR 수용체에 대한 IgG 의 결합을 위한 중요한 서열은 CH2 및 CH3 도메인에 위치하는 것으로 보고된 바 있다. 항체의 혈청 반감기는 Fc 수용체 (FcR) 에 결합하는 상기 항체의 능력에 영향을 받는다. 유사하게, 면역글로불린 융합 단백질의 혈청 반감기는 또한 상기 수용체에 결합하는 능력에 영향을 받는다 (Gillies 등, (1999) Cancer Res. 59:2159-66). IgG1 의 것에 비해, IgG2 및 IgG4 의 CH2 및 CH3 도메인은, Fc 수용체의 생화학적으로 검출불가능하거나 또는 감소된 결합 친화성을 갖는다. IgG2 또는 IgG4 의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린 융합 단백질이 IgG1 의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 상응하는 융합 단백질과 비교하여 더 긴 혈청 반감기를 갖는다는 것이 보고되었다 (U.S. 특허 제 5,541,087 호; Lo 등, (1998) Protein Engineering, 11:495-500). 따라서, 본 발명의 특정 구현예에서, CH2 및 CH3 도메인은 감소된 수용체 결합 친화성 및 예를 들어 IgG2 또는 IgG4 와 같은 효과기 기능을 가진 항체 이소타입 유래이다.

힌지 영역은 일반적으로 중쇄 불변 영역의 CH1 도메인의 C-말단에 위치한다. IgG 이소타입에서, 디설파이드 결합은 전형적으로는 상기 힌지 영역 내에 발생하여, 최종 4 량체 분자가 형성되도록 한다. 상기 영역은 프롤린, 세린 및 트레오닌이 주가 된다. 본 발명에 포함될 때, 힌지 영역은 전형적으로는 2 개의 Fc 부분을 연결하는 디설파이드 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 포함하는 자연-발생 면역글로불린 영역과 적어도 상동이다. 인간 및 마우스 면역글로불린에 대한 힌지 영역의 대표적인 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 문헌 [Borrebaeck, C. A. K., ed., (1992) Antibody Engineering, A Practical Guide, W. H. Freeman and Co.] 에서 찾을 수 있다. 본 발명에 적합한 힌지 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 기타 면역글로불린 클래스로부터 유도될 수 있다.

IgG1 힌지 영역은 3 개의 시스테인을 갖는데, 이들 중 2 개는 면역글로불린의 두 중쇄 사이에 디설파이드 결합으로 얽혀있다. 상기 동일한 시스테인은 Fc 부분의 효율적인 일정한 디설파이드 결합이 가능하도록 한다. 따라서, 한 구현예에서의 본 발명의 힌지 영역은 IgG1, 예컨대 인간 IgG1 으로부터 유도된다. IgG1 힌지가 이용되는 경우, 첫번째 시스테인은 또다른 아미노산, 예컨대 세린으로 돌연변이화될 수 있다.

IgG2 이소타입 힌지 영역은 올리고머화를 촉진하는 경향이 있으며 재조합 시스템에서의 분비 동안 디설파이드 결합을 부정확하게 할 수 있는 4 개의 디설파이드 결합을 갖는다. 적합한 힌지 영역은 IgG2 힌지로부터 유래될 수 있다. 한 구현예에서, IgG2 힌지의 첫번째 두 시스테인은 또다른 아미노산으로 돌연변이화된다.

IgG4 의 힌지 영역은 사슬간 디설파이드 결합을 비효율적으로 형성하는 것으로 공지되어 있다. 그러나, 본 발명에 적합한 힌지 영역은 IgG4 힌지 영역으로부터 유도될 수 있으며, 중쇄-유도성 부분들 사이의 디설파이드 결합의 바른 형성을 증강시키는 돌연변이를 포함할 수 있다 (Angal 등, (1993) Mol. Immunol., 30: 105-8).

본 발명에 따르면, Fc 영역은 CH2 및/또는 CH3 및/또는 CH4 도메인, 및 상이한 항체 이소타입, 예컨대 하이브리드 Fc 부분으로부터 유도된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 구현예에서, Fc 부분은 IgG2 또는 IgG4 유래의 CH2 및/또는 CH3 도메인 및 IgG1 유래의 돌연변이 힌지 영역을 포함한다. 대안적으로, 또다른 IgG 서브클래스 유래의 돌연변이 힌지 영역은 하이브리드 Fc 부분에 이용된다. 예를 들어, 두 중쇄 사이의 효율적인 디설파이드 결합을 가능하게 하는 IgG4 힌지의 돌연변이 형태가 이용될 수 있다. 돌연변이 힌지는 또한 첫번째 두 시스테인이 각각 또다른 아미노산으로 돌연변이화된 IgG2 힌지로부터 유도될 수 있다. 상기 하이브리드 Fc 부분은 높은 수준의 발현을 촉진하며, Fc-IL-7 융합 단백질의 정확한 어셈블리를 개선시킨다. 상기 하이브리드 Fc 부분의 어셈블리는 당업계에 공지되어 있으며, U.S. 공개 특허 출원 제 2003-0044423 호에 기재되어 있다.

일부 구현예에서, Fc 부분은 Fc 융합 단백질의 혈청 반감기를 일반적으로 연장시키는 아미노산 개질을 포함한다. 상기 아미노산 개질에는 Fc 수용체 결합 또는 보체 고정 활성을 실질적으로 감소 또는 제거하는 돌연변이가 포함된다. 예를 들어, 면역글로불린 중쇄의 Fc 부분 내의 글리코실화 부위가 제거될 수 있다. IgG1 에서, 글리코실화 부위는 아미노산 서열 Gln-Tyr-Asn-Ser (서열 식별 번호 26) 내의 Asn297 이다. 다른 면역글로불린 이소타입에서, 글리코실화 부위는 IgG1 의 Asn297 에 해당한다. 예를 들어, IgG2 및 IgG4 에서, 글리코실화 부위는 아미노산 서열 Gln-Phe-Asn-Ser (서열 식별 번호 28) 내의 아스파라긴이다. 따라서, IgG1 의 Asn297 의 돌연변이는 IgG1 로부터 유도된 Fc 부분의 글리코실화 부위를 제거한다. 한 구현예에서, Asn297 은 Gln 으로 대체된다. 다른 구현예에서, 아미노산 서열 Gln-Tyr-Asn-Ser (서열 식별 번호 26) 내의 타이로신은 추가로 돌연변이화되어 아스파라긴 돌연변이에 기인한 잠재적인 비-자가 T-세포 에피토프를 제거한다. 예를 들어, IgG1 중쇄 내의 아미노산 서열 Gln-Tyr-Asn-Ser (서열 식별 번호 26) 은 Gln-Ala-Gln-Ser (서열 식별 번호 27) 아미노산 서열로 대체될 수 있다.

유사하게, IgG2 또는 IgG4 에서, 아미노산 서열 Gln-Phe-Asn-Ser (서열 식별 번호 28) 내의 아스파라긴의 돌연변이는 IgG2 또는 IgG4 중쇄로부터 유도되는 Fc 부분에서 글리코실화 부위를 제거한다. 한 구현예에서, 아스파라긴은 글루타민으로 치환된다. 다른 구현예에서, 아미노산 서열 Gln-Phe-Asn-Ser (서열 식별 번호 28) 내의 페닐알라닌은 추가로 돌연변이화되어 아스파라긴 돌연변이로 인한 잠재적인 비-자가 T 세포 에피토프를 제거한다. 예를 들어, IgG2 또는 IgG4 중쇄 내의 아미노산 서열 Gln-Phe-Asn-Ser (서열 식별 번호 28) 은 Gln-Ala-Gln-Ser (서열 식별 번호 27) 아미노산 서열로 치환될 수 있다. Fc 수용체 결합 저감에 유용한 다른 돌연변이들은 U.S. 특허 출원 제 09/256,156 호에 개시되어 있다.

Fc 부분 및 비-Fc 부분의 연결부 부근의 아미노산의 변경이 Fc 융합 단백질의 혈청 반감기를 극적으로 증가시킬 수 있다는 것이 또한 관찰되었다 (U.S. 공개 특허 출원 제 2002-0147311 호). 따라서, 본 발명의 Fc-IL-7 또는 IL-7-Fc 융합 단백질의 연결부 영역은 면역글로불린 중쇄 및 IL-7 의 자연-발생 서열과 관련하여, 연결부 지점의 약 10 개 이내의 아미노산 내에서의 변경을 포함할 수 있다. 상기 아미노산 변화들은 Fc 부분의 C-말단 라이신을 알라닌 또는 류신과 같은 소수성 아미노산으로 변화시킴으로써 소수성 증가를 제공할 수 있다 (참고로, 예를 들어 서열 식별 번호 34). 본 발명의 또다른 구현예에서, Fc 부분의 C-말단 라이신 및 후속하는 글리신은 결실된다 (참고로, 예를 들어 서열 식별 번호 35).

다른 구현예에서, Fc 부분은 면역글로불린 중쇄의 Fc 부분의 C-말단 부근의 Leu-Ser-Leu-Ser 분절의 아미노산 변경을 포함한다. Leu-Ser-Leu-Ser (서열 식별 번호 29) 분절의 아미노산 치환은 잠재적인 연결부의 T-세포 에피토프를 제거한다. 한 구현예에서, Fc 부분의 C-말단 부근의 Leu-Ser-Leu-Ser (서열 식별 번호 29) 아미노산 서열은 Ala-Thr-Ala-Thr (서열 식별 번호 30) 아미노산 서열로 대체된다. 다른 구현예에서, Leu-Ser-Leu-Ser (서열 식별 번호 29) 분절 내의 아미노산은 글리신 또는 프롤린과 같은 다른 아미노산으로 대체된다. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 기타 면역글로불린 클래스 분자의 C-말단 부근의 Leu-Ser-Leu-Ser (서열 식별 번호 29) 분절의 아미노산 치환을 생성시키는 상세한 방법, 및 연결부의 T-세포 에피토프 변경을 위한 기타 예시적인 개질은, U.S. 공개 특허 출원 제 2003-0166877 호에 기재되어 있다.

한 구현예에서, 스페이서 또는 링커 펩티드를 담체 단백질 및 IL-7 단백질 사이에 삽입한다. 스페이서 또는 링커 펩티드는 비하전성 또는 무극성 또는 소수성일 수 있다. 스페이서 또는 링커 펩티드의 길이는 1 내지 약 100 아미노산, 또는 1 내지 약 50 아미노산, 또는 1 내지 약 25 아미노산, 또는 1 내지 약 15 아미노산이다. 한 구현예에서, 스페이서는 서열 (G₄S)_n 을 포함하는데, 여기서 n 은 10 미만이다. 또다른 구현예에서, 링커 서열은 GGGGSGGGG (서열 식별 번호 67) 이다. 또다른 구현예에서, 스페이서는 N-연결 글리코실화 부위로서 인식되는 모티프를 포함한다. 본 발명의 또다른 구현예에서, 담체 단백질 및 IL-7 융합 단백질은 스페이서 또는 링커 펩티드를 통해 연결된다. 본 발명의 대안적인 구현예에서, 담체 단백질 및 IL-7 융합 단백질은 합성 스페이서, 예를 들어 PNA 스페이서로 분리된다. 스페이서는 비하전성, 또는 무극성 또는 소수성일 수 있다.

IL -7 융합 단백질의 생산

본 발명의 교시에 따른 IL-7 개질을 포함하는 융합 단백질은 본원에 기재된 비제한적 방법으로 합성될 수 있다. 시험관내 동물 모델에서 본 발명에 따라 개질된 IL-7 을 포함하는 융합 단백질의 약동학적 활성 시험에 유용한 검정은 또한 본원에 기재된다.

본 발명의 IL-7 융합 단백질은 당업계에 공지된 재조합 발현 벡터를 이용하여 생산될 수 있다. 용어 "발현 벡터" 는 원하는 IL-7 융합 단백질을 코딩하며, (1) 유전자 발현에서 조절 역할을 가진 유전적 구성원(들), 예를 들어 프로모터, 오퍼레이터 또는 인핸서로서, (2) mRNA 로 전사되고 단백질로 번역될 원하는 IL-7 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열에 작동적으로 연결되어 있는 것, 및 (3) 적당한 전사 및 번역 개시 및 종결 서열의 집합체를 포함하는 전사 단위체를 포함하는, DNA 발현에 사용되는 복제가능한 DNA 구축물을 의미한다. 프로모터 및 기타 조절 구성원의 선택은 일반적으로 의도하는 숙주 세포에 따라 가변적이다.

IL-7 융합 단백질을 코딩하는 핵산은 재조합 DNA 기술을 이용하여 숙주 세포로 트랜스펙션된다. 본 발명의 문맥에서, 외래 DNA 에는 본 발명의 단백질을 코딩하는 서열이 포함된다. 적합한 숙주 세포에는 원핵세포, 효모 또는 고등 진핵 세포가 포함된다. 한 구현예에서, 숙주는 원핵 유기체이다.

재조합 IL-7 융합 단백질은 사카로마이세스 (Saccharomyces) 종 유래와 같은 효모 숙주, 예컨대 사카로마이세스 세레비시애 (S. cerevisiae) 에서 발현될 수 있다. 피키아 (Pichia) 또는 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 와 같은 기타 속 (genera) 의 효모가 또한 이용될 수 있다. 효모 벡터는 일반적으로 효모 플라스미드 유래의 복제 기원 또는 자발적 복제 서열 (ARS), 프로모터, IL-7 융합 단백질을 코딩하는 DNA, 폴리아데닐화 및 전사 종결을 위한 서열 및 선별 유전자를 포함한다. 효모 벡터 중의 적합한 프로모터 서열에는 메탈로티오네인, 3-포스포글리세레이트 키나아제 또는 기타 당분해 효소, 예컨대 에놀라아제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나아제, 헥소키나아제, 피루베이트 디카르복실라아제, 포스포프룩토키나아제, 글루코오스-4-포스페이트 이소머라아제, 3-포스포글리세레이트 뮤타아제, 피루베이트 키나아제, 트리오스포스페이트 이소머라아제, 포스포글루코오스 이소머라아제 및 글루코키나아제에 대한 프로모터가 포함된다.

각종 포유류 또는 곤충 세포 배양계가 재조합 단백질의 발현에 이용될 수 있다. 곤충 세포에서의 단백질 생산을 위한 바큘로바이러스계 (Baculovirus systems) 는 당업계에 널리 공지되어 있다. 적합한 포유류 숙주 세포주의 예시에는, NS/0 세포, L 세포, C127, 3T3, 중국 햄스터 난소 (CHO), HeLa 및 BHK 세포주가 포함된다. 추가적인 적합한 포유류 숙주 세포에는, 모두 원숭이 신장으로부터 유도된 CV-1 세포 (ATCC CCL70) 및 COS-7 세포가 포함된다. 또다른 적합한 원숭이 신장 세포주, CV-1/EBNA 는, 엡스테인-바아 (Epstein-Barr) 바이러스 핵 항원-1 (EBNA-1) 을 코딩하는 유전자 및 CMV 조절 서열을 포함하는 벡터를 이용한 CV-1 세포주의 트랜스펙션으로 유도된다 (McMahan 등, (1991), EMBO J. 10:2821). EBNA-1 유전자는, EBV 복제 기원을 포함하는 발현 벡터, 예컨대 HAV-EO 또는 pDC406 의 에피솜 복제를 가능하게 한다.

포유류 발현 벡터는 비-전사성 구성원, 예컨대 복제의 기원, 발현할 유전자에 연결된 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 기타 5' 또는 3' 근접 비전사 서열 및 5' 또는 3' 비번역 서열, 예컨대 필요한 리보솜 결합 부위, 폴리-아데닐화 부위, 스플라이스 공여자 및 수여자 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로 사용되는 프로모터 및 인핸서는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 시미안 바이러스 40 (SV40), 및 인간 싸이토메갈로바이러스로부터 유도된다. SV40 바이러스 게놈으로부터 유도되는 DNA 서열, 예를 들어 SV40 기원, 조기 및 만기 프로모터 (early and late promoter), 인핸서, 스플라이스 및 폴리아데닐화 부위가 이종 기원의 DNA 서열의 발현에 필요한 기타 유전자 구성원 제공을 위해 이용될 수 있다.

숙주 세포에서의 IL-7 융합 단백질의 분비가 요망되는 경우, 발현 벡터는 시그널 또는 리더 펩티드를 코딩하는 DNA 를 포함할 수 있다. 본 발명에서, IL-7 의 자연성 시그널 서열이 사용될 수 있거나, 또는 대안적으로 이종 기원의 시그널 서열, 예컨대 인터류킨-4 유래의 시그널 서열이 부가될 수 있다.

본 발명은 또한 발현을 촉진하는 조건 하에 IL-7 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 본 발명의 재조합 단백질의 제조 방법을 제공한다. 이어서, 원하는 단백질은 배양 배지 및 세포 추출물로부터 정제한다. 예를 들어, 배양 배지에 재조합 단백질을 분비하는 발현계 유래의 상청액은 시판되어 입수가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 단위체를 이용하여 먼저 농축할 수 있다. 농축 단계에 이어, 농축물은 당업계에 공지된 바와 같은 적합한 정제 매트릭스에 적용할 수 있다.

"분리된" 또는 "정제된" IL-7 융합 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부분은 세포 물질 또는 IL-7 융합 단백질이 유도되는 세포 또는 조직 공급원 유래의 기타 오염 단백질이 실질적으로 없거나, 또는 화학적으로 합성된 경우 화학물 전구체 또는 기타 화학물이 실질적으로 없다. 용어 "세포 물질이 실질적으로 없음" 에는, 분리되거나 또는 재조합적으로 생산된 세포의 세포 구성원으로부터 단백질이 분리된, IL-7 융합 단백질의 제제가 포함된다. 한 구현예에서, 용어 "세포 물질이 실질적으로 없음" 에는, 약 30% (건조 중량) 미만의 비-IL-7 융합 단백질 (본원에서는 "오염 단백질" 로도 지칭됨), 약 20% 미만의 비-IL-7 융합 단백질, 약 10% 미만의 비-IL-7 융합 단백질 또는 약 5% 미만의 비-IL-7 융합 단백질이 있는 IL-7 융합 단백질의 제제가 포함된다. IL-7 융합 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부분이 재조합 공급원으로부터 정제되는 경우, 한 구현예에서, 배양 배지가 실질적으로 없음, 즉 배양 배지가 단백질 제제의 총 부피의 약 20% 미만, 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만임을 나타낸다.

용어 "실질적으로 순수한 Ig-IL-7 융합 단백질" 또는 "실질적으로 순수한 IL-7 융합 단백질" 은 IL-7 함유 융합 단백질이 제제 중 단백질의 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상을 구성하는 제제를 나타낸다.

IL-7 단백질을 이용하는 치료 방법

본 발명의, 융합 단백질을 포함하는 IL-7 단백질은 면역 결핍 치료, 및 예를 들어, 자연에서 면역억제성인 치료 또는 질환 이후 발생하는 면역계의 자연 재건을 가속함에 있어서 유용하다. 예를 들어, IL-7 단백질은 바이러스 감염, 면역 장애의 치료 및 특정 세포 유형의 성장 (증식 포함) 을 증강하기 위해 사용될 수 있다. 더욱이, IL-7 단백질은 방광암, 폐암, 뇌암, 유방암, 피부암 및 전립선암과 같은 암의 치료에 이용될 수 있다. 한 구현예에서, 면역 세포를 벌충시키는 것을 보조하기 위해, 상기 기재된 바와 같은 IL-7 단백질을 이용하여 1 회 이상의 화학치료를 한 환자의 치료에 유용하다. 대안적으로, 노년의 HIV 환자, 이식받은 환자 또는 면역계 기능이 억제된 기타 환자에게 상기 기재된 IL-7 단백질을 투여하는 것이 유용하다.

투여

본 발명의 IL-7 및 IL-7 융합 단백질은 모두 투여에 적합한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 상기 조성물은 전형적으로는 IL-7 또는 IL-7 융합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유한다. 본원에 사용된 바로는, 용어 "약제학적으로 허용되는 담체" 는 임의의 모든 용매, 분산매, 코팅, 항박테리아 및 항진균제, 등장화제의 흡수 지연제 등이 포함되는 것으로 의도된다. 약제학적 활성 물질에 대한 상기 매질 및 제의 이용은 당업계에 널리 공지되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 그의 의도하는 투여 경로에 상용성이 되도록 제형화된다. 투여 경로의 예시에는, 예를 들어 정맥내, 피내, 피하, 경구 (예를 들어, 흡입), 경피 (국소), 경점막 및 직장 투여가 포함된다. 비경구, 피내 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기의 구성원을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 식염수 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항박테리아제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 산화방지제, 예컨대 아스코르브산 또는 나트륨 비설파이트; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 등장성 조정제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로오스. pH 는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨을 이용하여 조정될 수 있다. 비경구용 제제는 앰플, 1 회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다중 투여량 바이알에 봉입될 수 있다.

본 발명의 IL-7 단백질을 함유하는 의약은, 그 양이 의약의 투여 형태에 따라 가변적이기는 하지만, 0.01 내지 100% (w/w) 의 농도를 가질 수 있다.

투여량은 환자의 체중, 질환의 심각성 및 담당의의 의견에 좌우된다. 그러나, 일반적으로 주사의 경우 약 0.01 내지 약 10 mg/kg 체중으로 매일, 약 0.02 내지 약 2 mg/kg/일 또는 약 0.5 mg/kg/일의 투여가 권장된다. 투여량은 질환의 심각성 및 담당의의 의견에 따라 매일 1 회 또는 수회 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 하나 이상의 기타 치료제, 예를 들어 혈액 세포의 벌충에 유용한 것으로 공지된 분자와 병용투여되는 경우 유용하다. 예를 들어, 상기 분자는 적혈구를 벌충하기 위해 사용되는 것으로 공지된 에리트로포이에틴, 중성구를 벌충하기 위해 사용되는 것으로 공지된 G-CSF 또는 과립구 및 마크로파지를 벌충하기 위해 사용되는 G-CSF 일 수 있다.

본 발명의 국면들은 하기 실시예로 추가로 설명된다.

실시예

실시예 1: 전산적인 방법에 의한 T-세포 에피토프의 동정

본 발명에 따르면, IL-7 의 에피토프는 면역계와의 그의 상호작용을 조절하기 위한 단백질에 돌연변이를 도입하기 위한 방법을 이용하여 개질될 수 있다. 상기 방법들은 U.S. 공개 특허 출원 제 2003-0166877 호에 공지된 것과 같다. 본 발명에 따르면, 본 발명에 따라 적용될 수 있는 당업계에 공지된 방법에는, 선행기술 (WO 92/10755 및 WO 96/40792 (Novo Nordisk), EP 0519 596 (Merck & Co.), EP 0699 755 (Centro de lmmunologia Moelcular), WO 98/52976 및 WO 98/59244 (Biovation Ltd.) 에 기재된 것들 또는 연관된 방법이 포함된다.

그러나, 유리한 돌연변이 단백질은, 상기 에피토프가 본 발명에 상세히 기재되어 있고, IL-7 에 적용되는 하기의 방법으로 실현된다면 수득될 수 있다. 단백질, 폴리펩티드 또는 면역글로불린의 전체 구조 결정에 중요한 역할을 하는 다수의 인자들이 있다. 우선, 펩티드 결합, 즉 사슬 중의 아미노산을 함께 결합시키는 결합은 공유 결합이다. 상기 결합은 구조적으로는 평면, 필수적으로 치환된 아미드이다. "아미드" 는 -CONH- 기를 포함하는 유기 화합물의 임의의 군이다.

인접한 아미노산의 Cα를 연결하는 평면 펩티드 결합은 하기 도시한 바와 같이 나타낼 수 있다:

O=C 및 C-N 원자가 비교적 고정된 평면 상에 놓이므로, 상기 축에 대해서는 자유 회전이 일어나지 않는다. 따라서, 파단선으로 도식적으로 묘사된 평면은 때때로 "아미드" 또는 "펩티드 평면" 으로 불리며, 여기에 펩티드 골격의 산소 (O), 탄소 (C), 질소 (N), 및 수소 (H) 원자가 놓인다. 상기 아미드 평면의 반대 코너에는 Cα원자가 위치한다. 펩티드 또는 아미드 평면에서 O=C 및 C-N 원자에 대해 실질적으로 회전이 없으므로, 폴리펩티드 사슬은 Cα원자를 연결하는 일련의 평면 펩티드 연결을 포함한다.

폴리펩티드 또는 단백질의 전체 구조 또는 배치를 정의하는데 있어 중요한 역할을 하는 두번째 요인은 공통 Cα연결에 대한 각각의 아미드 평면의 회전각이다. "회전각" 및 "비틀기 (torsion) 각" 이라는 용어는 이후 동일한 용어로 간주된다. O, C, N, 및 H 원자가 아미드 평면에 존재한다고 가정하면 (일부 배치의 경우, 상기 원자의 평면성이 약간의 차이가 있을 수 있지만, 통상적으로 타당한 가정임), 상기 회전각은 N 및 R 폴리펩티드의 골격 배치, 즉 이웃 잔기 사이에서 존재하는 구조를 정의한다. 상기 두 가지의 각은 φ및 ψ로 공지되어 있다. 따라서 한 세트의 각 φ_i, ψ_i (여기서 아래첨자 i 는 폴리펩티드 사슬의 특정 잔기를 나타냄) 는 폴리펩티드를 효과적으로 정의한다. φ, ψ각을 정의하는데 사용되는 관례, 즉 아미드 평면이 0 도 각을 형성하는 참조점 및 어느 각이 φ이고 어느 각이 ψ인지에 대한 정의는, 주어진 폴리펩티드에 대하여 문헌에 정의되어 있다. 예컨대, 본원에 참고문헌으로 도입된 [Ramachandran 등.Adv. Prot. Chem. 23: 283-437 (1968), 페이지 285-94] 를 참고.

본 발명의 방법은 임의 단백질에 적용될 수 있으며, 인간에서 MHC 클래스 II 분자 결합 그루브의 일차 포켓 1 고정 위치는 특정 아미노산 측쇄에 대해 잘 고안된 특이성을 갖는다는 발견에 부분적으로는 근거한다. 상기 포켓의 특이성은 MHC 클래스 II 분자의 베타 사슬의 86 번 위치에서 아미노산의 정체 (identity)에 의해 결정된다. 상기 부위는 포켓 1 의 저부에 위치하며, 상기 포켓에 의해 조절될 수 있는 측쇄의 크기를 결정한다 [Marshall, K. W., J. Immunol., 152: 4946-4956 (1994)]. 상기 잔기가 글리신이라면, 모든 소수성 지방족 및 방향족 아미노산 (소수성 지방족원: 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌; 및 방향족원: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판) 은 포켓 내에 수용될 수 있고, 방향족 측쇄가 바람직하다. 상기 포켓 잔기가 발린이라면, 상기 아미노산의 측쇄는 포켓 내로 돌출하여, 소수성 지방족 측쇄만이 수용될 수 있도록, 수용될 수 있는 펩티드 측쇄의 크기를 제한한다. 따라서, 아미노산 잔기 서열에서, 소수성 지방족 또는 방향족 측쇄를 갖는 아미노산이 발견된다면, MHC 클래스 II 에 제한된 T 세포 에피토프가 존재할 가능성이 있다. 그러나, 측쇄가 소수성 지방족이라면, 방향족 측쇄보다 대략 2 배 더 T 세포 에피토프와 회합될 가능성이 있다 (전체 집단에 대해 포켓 1 유형의 대략적인 균일한 분포로 가정함).

예시적인 전산적 방법은 하기와 같이 T 세포 에피토프를 포함할 가능성이 있는 IL-7 의 펩티드 영역을 프로필한다:

(1) 소정의 길이의 펩티드 분획의 일차 서열을 스캐닝하고, 존재하는 모든 소수성 지방족 및 방향족 측쇄를 확인한다. (2) 소수성 지방족 측쇄에 방향족 측쇄보다 더 큰 값; 바람직하게는 방향족 측쇄에 지정된 약 2 배의 값, 예컨대, 소수성 지방족 측쇄에 대한 값을 2 로, 방향족 측쇄에 대한 값을 1 로 지정한다. (3) 존재하는 것들에 대해 결정된 값을 펩티드 내의 소정의 균일한 길이인 각각의 중복되는 아미노산 잔기 분획 (윈도우) 에 대해 합산하고, 특정 분획 (윈도우) 에 대한 전체 값을 분획의 중간 위치에 있는 단일 아미노산 잔기 (윈도우) 에, 바람직하게는 샘플링된 분획의 정중앙 근처의 잔기 (윈도우) 에 부여한다. 상기 절차를 각각의 샘플링된 중복 아미노산 잔기 분획 (윈도우) 에 대해 반복한다. 따라서, 펩티드의 각 아미노산 잔기에는 특정 분획편 (윈도우) 에 존재할 T 세포 에피토프의 가능성에 관련된 값이 부여된다. (4) 상기 단계 3 에 기재된 바에 따라 계산되어 부여된 값을 평가되는 전체 아미노산 잔기 서열의 아미노산 축에 대해 플롯팅할 수 있다. (5) 소정의 값, 예컨대 값 1 의 스코어를 갖는 서열의 모든 부분은, T 세포 에피토프를 포함하는 것으로 간주될 수 있고, 필요하다면 변형될 수 있다.

본 발명의 상기 특정 양태는 IL-7 의 T 세포 에피토프를 나타낼 수 있는 일반적인 방법을 제공한다. 상기 영역에서의 펩티드 변형은 MHC 클래스 II 결합 특징을 변형시킬 수 있는 잠재성을 갖는다.

본 발명의 또다른 양태에 따르면, MHC 클래스 II 대립유전자의 모델과 펩티드의 상호작용을 고려한 보다 복잡한 전산적 방법을 이용하여, T 세포 에피토프가 보다 정확히 예측될 수 있다.

상기 특정 양태에 따른 펩티드 내에 존재하는 T 세포 에피토프의 전산적 예측에는, 모든 공지된 MHC 클래스 II 분자의 구조를 기반으로 하는 42 개 이상의 MHC 클래스 II 대립유전자 모델의 구축 및 T 세포 에피토프의 컴퓨터적 동정에 있어서 상기 모델을 이용하는 방법; 상대적인 펩티드 골격 알파 탄소 (Cα) 위치에 있어서 공지된 변화를 가능케 하기 위한 각각의 모델에 대한 펩티드 골격 라이브러리의 구축; 펩티드 및 MHC 클래스 II 분자 사이의 상호작용에 결정적인 위치에서 각각의 20 개 아미노산 대안물에 대한 각 모델과 도킹하는 각각의 골격에 대한 아미노산 측쇄 배치의 라이브러리 구축; 및 특정 MHC 클래스 II 분자와 도킹된 특정 펩티드에 대한 최적의 골격 및 측쇄 배치, 및 상기 상호작용으로부터의 결합 스코어 편차를 선택하기 위한 스코어링 함수와 함께 상기 골격 및 측쇄 배치 라이브러리의 사용이 고려된다.

MHC 클래스 II 분자의 모델은 Brookhaven 단백질 데이타 뱅크 ("PDB") 에서 찾을 수 있는 여러 유사한 구조로부터 상동성 모델링을 통해 유도될 수 있다. 이들은 에너지 최소화를 위한 CHARMm 역장 (force-field) (Molecular Simulations Inc., San Diego, Ca. 에서 구입가능) 와 함께 시뮬레이션된 어닐링 함수를 도입한 반자동 상동성 모델링 소프트웨어 (Modeller, Sali A. & Blundell TL., 1993. J. Mol Biol 234: 779-815) 를 이용하여 수행될 수 있다. 대안적인 모델링 방법도 또한 이용할 수 있다.

MHC 클래스 II 분자의 작은 세트에 대한 결합 그루브 내 각각의 위치에서 대안적인 각각의 아미노산의 실험적으로 유도된 결합 데이타의 라이브러리를 이용하는 다른 전산적 방법 (Marshall, K. W., 등, Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids, 1(3): 157-162) (1995) 이 공지되어 있으며; 또는 그루브 내에서 특정 유형의 결합 포켓의 결합 특징을 정의하기 위해, 다시 MHC 클래스 II 분자의 비교적 작은 서브세트를 이용한 후 상기 포켓 라이브러리의 포켓 유형을 추가적인 '버츄얼' MHC 클래스 II 분자를 인공적으로 생성시키기 위해 '혼합 및 매칭' 시키는 유사한 실험적 결합 데이타를 이용하는 또다른 전산적 방법 (Sturniolo T., 등, Nat. Biotech, 17(6): 555-561 (1999)) 도 마찬가지로 공지되어 있다. 두 가지 방법 모두, 분석의 복잡성 및 다수의 펩티드 변이체를 합성해야 한다는 필요성으로 인해, 단지 소수의 MHC 클래스 II 분자만이 실험적으로 스캐닝될 수 있다는 주요 단점을 갖는다. 따라서, 첫번째 종래 방법은 소수의 MHC 클래스 II 분자만을 예측할 수 있다. 두번째 종래 방법은 또한, 상이한 클래스 II 대립유전자와 함께 있는 경우, 한 분자 내의 유사한 아미노산이 배열된 포켓이 동일한 결합 특징을 갖는다고 가정하고, 포켓 라이브러리 내에 포함되는 포켓을 포함하는 MHC 클래스 II 분자만이 '버추얼하게' 생성될 수 있다는 추가 단점을 갖는다. 본원에 기재된 모델링 접근법을 이용하여, 임의의 수 및 유형의 MHC 클래스 II 분자의 구조를 유추할 수 있고, 따라서 전체 집단을 대표하도록 대조유전자를 특이적으로 선택할 수 있다. 또한, 스캐닝되는 MHC 클래스 II 분자의 수는 복잡한 실험을 통해 추가적인 데이타를 생성시킨 것보다 더 많은 모델을 만들어서 증가시킬 수 있다.

골격 라이브러리의 이용은 특정한 MHC 클래스 II 분자로 도킹되는 경우, 스캐닝되는 다양한 펩티드의 Cα원자의 위치에서의 변화를 허용한다. 이는 다시, 특히 포켓에서의 아미노산 결합의 스캐닝을 위해 단순화한 펩티드 골격의 이용에 의존하는 상기 기재된 대안적인 종래의 다른 컴퓨터적 방법과 대조적이다. 이러한 단순화된 골격은 '실제' 펩티드에서 발견되는 골격 배치의 대표물이 아닐 수 있어, 펩티드 결합의 예측이 부정확해진다. 본 발명의 골격 라이브러리는 단백질 데이타 뱅크 내에서 발견되는 MHC 클래스 II 분자에 결합한 모든 펩티드의 골격을 포개고, 결합 그루브 내에 위치하는 11 개 아미노산 각각의 Cα원자 사이의 제곱 평균 (RMS) 편차를 확인함으로써 생성된다. 상기 라이브러리는 소수의 적합하고 이용가능한 마우스 및 인간 구조 (현재 13 개) 에서 유도될 수 있지만, 더욱 큰 다양성을 가능케하기 위해, 각각의 C"-α위치에 대한 RMS 수를 50% 증가시킨다. 이어서 각각의 아미노산의 평균 Cα위치를 결정하고, 그 반경이 그 지점에서의 RMS 편차 + 50% 가 되는 상기 지점 근처로 구를 그린다. 상기 구는 허용되는 모든 Cα위치를 나타낸다.

최소의 RMS 편차를 갖는 Cα로부터 작업시 (결합 그루브의 11 개 잔기의 위치 2 에 해당하는, 상기 언급된 포켓 1 의 아미노산의 것), 구는 3 차원적으로 격자형이며, 격자 내의 각각의 정점이 상기 아미노산의 Cα의 가능한 위치로서 사용된다. 후속 아미노산에 대한 펩티드 결합에 해당되는, 후속 아미드 평면은 각각의 상기 Cα들에 그래프트되며, φ및 Ψ각은 후속 Cα의 위치를 정하기 위해, 설정된 간격으로 단계적으로 회전된다. 후속 Cα가 상기 Cα 에 대해 '허용되는 위치의 구' 내에 속하는 경우, 디펩티드의 방위 (orientation)가 허용되지만, 구의 외부에 속하는 경우 디펩티드는 거부된다. 이어서, 상기 절차를, 모든 9 개의 후속 Cα들이 선행 Cα들의 가능한 모든 순열로부터 위치될 때까지, 각각의 후속 Cα위치에 대해 펩티드가 포켓 1 Cα'시드 (seed)' 로부터 성장하도록 반복한다. 이어서 상기 절차를 단일 Cα선행 포켓 1 에 대해 1 번 더 반복하여, 결합 그루브 내에 위치하는 골격 Cα위치의 라이브러리를 생성시킨다.

생성되는 골격의 수는 여러 요인에 근거한다: '허용된 위치의 구' 의 크기; 포켓 1 위치에서 '일차 구' 의 격자의 세밀함; 후속 Cα의 위치를 정하는데 사용되는 Φ및 Ψ각의 단계적 회전의 적합성. 상기 절차를 이용하여, 커다란 골격 라이브러리가 생성될 수 있다. 골격 라이브러리가 커질수록, MHC 클래스 II 분자의 결합 그루브 내의 특정 펩티드에 대한 최적의 체결성이 발견될 가능성이 높아질 것이다. 결합 도메인의 아미노산과의 충돌로 인해, 모든 골격이 모든 MHC 클래스 II 분자 모델의 도킹에 적합하지는 않을 것이므로, 각각의 대립유전자에 대해, 상기 대립유전자가 수용될 수 있는 골격을 포함하는 라이브러리의 서브세트를 생성한다. MHC 클래스 II 분자 모델과 함께 골격 라이브러리의 이용은 각각의 허용되는 골격에 도킹된 각각의 MHC 클래스 II 분자에 대한 결합 그루브의 각 위치에서 각각의 아미노산에 대해 허용된 측쇄 배치로 구성되는 방대한 데이타베이스를 생성시킨다. 상기 데이타 세트는 MHC 클래스 II 분자가 골격에 도킹되고, 아미노산 측쇄가 목적하는 위치의 골격상에 그래프트되는 단순한 입체 오버랩 함수를 이용하여 생성된다. 측쇄의 각각의 회전가능한 결합은 설정된 간격으로 단계적으로 회전되며, 원자의 생성된 위치는 언급된 결합에 근거한다. 상기 원자와 결합 그루브의 측쇄 원자의 상호작용이 주지되며, 위치는 하기 기준에 따라 허용되거나 거부된다: 위치된 모든 원자의 오버랩의 총 합은 소정 값을 초과하지 말아야 한다. 따라서, 배치 탐색의 엄격성 (stringency) 은 결합의 단계적 회전에 사용되는 간격 및 총 오버랩에 대한 소정의 한계치의 함수이다. 상기 후자의 값은 특정 포켓이 고정된 것으로 공지된 경우 작을 수 있지만, 엄격성은 포켓 측쇄의 위치가 비교적 유동적인 것으로 공지된 경우 완화될 수 있다. 따라서, 결합 그루브의 포켓 내에서 유연성의 변동을 모방할 수 있다. 이어서 각각의 MHC 클래스 II 분자와 도킹된 경우, 상기 배치 탐색을 각 골격의 매 위치마다 각각의 아미노산에 대해 반복하여 측쇄 배치의 방대한 데이타베이스를 생성시킨다.

상술된 골격/측쇄 배치의 거대 데이타베이스를 스캐닝하여 실험적으로 유도되어야 하는 펩티드 리간드 배치와 함께 MHC 클래스 II 분자 모델 사이의 결합 에너지를 추정하기 위해, 적합한 수학적 표현을 사용한다. 따라서, 하기 계산에 9 내지 20 개 아미노산 길이 (길이는 각각의 스캐닝에 대해 일정하게 유지됨) 의 각각의 가능한 펩티드를 적용시켜, 잠재적인 T 세포 에피토프에 대해 단백질을 스캐닝한다: 상기 분자에 대해 허용되는 펩티드 골격과 함께 MHC 클래스 II 분자를 선택하고, 목적하는 펩티드 서열에 해당하는 측쇄를 그 위에 그래프트한다. 골격 상의 특정 위치에서 특정 측쇄에 대한 원자 정체 및 원자간 거리 데이타를 상기 아미노산에 허용되는 각각의 배치에 대해 수집한다 (상술한 데이타베이스로부터 수득됨). 이를 골격 및 스코어링 함수를 이용하여 유도된 펩티드 스코어에 따라 각각의 측쇄에 대해 반복한다. 상기 골격에 대한 최적 스코어를 유지하고, 선택된 모델에 대해 허용된 각각의 골격에 대해 상기 절차를 반복한다. 허용된 모든 골격에 대한 스코어를 비교하고, 최고 스코어를 상기 MHC 클래스 II 모델에서 목적하는 펩티드에 대한 펩티드 스코어로 간주한다. 이어서 상기 절차를 스캐닝되는 단백질에서 유도되는 가능한 모든 펩티드로 각각의 모델에 대해 반복하고, 모델에 대비한 펩티드 스코어를 나타낸다.

본 발명에 있어서, 결합 친화성 계산에 제시되는 각각의 리간드는 상술한 바와 같은 펩티드 또는 단백질에서 선택되는 아미노산 분획이다. 따라서, 상기 리간드는 공지된 서열의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에서 유도되는 약 9 내지 20 개 아미노산 길이의 아미노산 연장물에서 선택된다. "아미노산" 및 "잔기" 라는 용어는 이후 동일한 용어로 간주된다. 골격 라이브러리로부터 골격 상에 그래프트될 것으로 조사된 펩티드의 연속 아미노산 형태인 리간드를, 펩티드 골격의 C"-α원자의 축를 통해 MHC 클래스 II 분자 모델 라이브러리로부터의 MHC 클래스 II 분자의 결합 틈 내에 위치시키고, 각각의 측쇄에 허용되는 배치를 허용되는 배치의 데이타베이스로부터 선택한다. 관련된 원자 정체 및 원자간 거리를 또한 상기 데이타베이스로부터 검색하고, 펩티드 결합 스코어를 계산하는데 사용한다. MHC 클래스 II 결합 포켓에 대한 높은 결합 친화성을 갖는 리간드를 위치 지정 돌연변이형성 (mutagenesis)에 대한 후보물로 지정한다. 지정된 리간드 (즉 관심 단백질 내임) 의 아미노산 치환을 수행한 후, 스코어링 함수를 이용해서 재시험하여, 결합 친화성을 소정 임계값 미만으로 감소시키는 변화를 결정한다. 이어서, 상기 변화를 관심 단백질 내로 도입하여 T 세포 에피토프를 제거시킬 수 있다.

펩티드 리간드 및 MHC 클래스 II 분자의 결합 그루브 사이의 결합에는 하기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 비공유 상호작용이 관여된다: 수소 결합, 정전기적 상호작용, 소수성 (친유성) 상호작용 및 반 데르 발스 상호작용. 이들은 하기에 상세히 설명되는 바와 같은 펩티드 스코어링 함수에 포함된다. 수소 결합은 극성 또는 대전된 기 사이에 형성될 수 있는 비공유 결합이고, 2 개의 다른 원자에 의해 공유되는 수소 원자로 구성된다는 것이 이해되어야 한다. 수소 공여자의 수소는 양전하를 갖는 반면, 수소 수용자는 부분적인 음전하를 갖는다. 펩티드/단백질 상호작용을 위해, 수소 결합 공여자는 수소가 부착된 질소, 또는 산소 또는 질소에 부착된 수소일 수 있다. 수소 결합 수용자 원자는 수소에 부착되지 않은 산소, 수소가 부착되지 않고 1 또는 2 개 연결을 갖는 질소, 또는 1 개 연결만을 갖는 황일 수 있다. 특정 원자, 예컨대 수소에 부착된 산소 또는 이민 질소 (예, C=NH) 는 수소 수용자 및 공여자 둘 다 될 수 있다. 수소 결합 에너지는 3 내지 7 Kcal/몰 범위이고, 반 데르 발스 결합보다 훨씬 더 강하지만, 공유 결합보다는 약하다. 수소 결합은 또한 상당한 방향성이 있고, 공여자 원자, 수소 원자 및 수용자 원자가 함께 선형이 될때 가장 강하다. 정전기적 결합은 반대로 하전된 이온쌍 사이에서 형성되며, 상호작용의 강도는 쿨롱의 법칙에 따라 원자간 거리의 제곱에 반비례한다. 이온쌍 사이의 최적 거리는 약 2.8Å 이다. 단백질/펩티드 상호작용에서, 정전기적 결합은 아르기닌, 히스티딘 또는 리신 및 아스파테이트 또는 글루타메이트 사이에 형성될 수 있다. 결합의 강도는 이온화기의 pKa 및 매질의 유전 상수에 의존할 것이지만, 이들은 대략 수소 결합의 강도와 유사하다.

친유성 상호작용은 단백질 및 펩티드 리간드 사이에 일어나는 친화적인 소수성-소수성 접촉이다. 통상적으로, 이들은 용매에 노출되지 않게 결합 그루브의 포켓 내에 묻혀있는 펩티드의 소수성 아미노산 측쇄 사이에 일어날 것이다. 소수성 잔기의 용매로의 노출은, 주변 용매 분자가 서로 우리 모양의 포접 구조를 형성하도록 수소 결합이 유도되므로 매우 불리하다. 생성되는 엔트로피의 감소도 매우 불리하다. 친유성 원자는 극성이나 수소 수용자가 아닌 황이거나 극성이 아닌 탄소 원자일 수 있다.

반 데르 발스 결합은 3 - 4Å 떨어진 원자 사이에서 발견되는 비특이적 힘이다. 이들은 수소 및 정전기적 결합보다 약하고 덜 특이적이다. 원자 주위의 전하 분포는 시간에 따라 변화하며, 어떤 경우에도 전하 분포는 비대칭이다. 상기 일시적인 전하의 비대칭은 주위 원자에서도 유사한 비대칭을 유도한다. 원자 사이에 생성된 인력은 반 데르 발스 접촉 거리에서 최대에 이르지만, 약 1Å 내지 약 2Å 에서 급격히 감소한다. 반대로, 원자가 상기 접촉 거리 미만으로 분리되면, 원자의 외부 전자 구름이 겹치면서 증가되는 강한 반발력이 우세해진다. 인력이 정전기적 및 수소 결합에 비해 비교적 약하지만 (약 0.6 Kcal/몰), 반발력은 특히 펩티드 리간드가 단백질에 성공적으로 결합할 수 있는지의 여부를 결정하는데 매우 중요할 수 있다.

하나의 구현예에서, Boehm 스코어링 함수 (SCORE1 접근법) 를 사용하여 결합 상수를 추정한다 (Boehm, H. J., J. Comput Aided Mol. Des., 8(3): 243-256 (1994), 본원에 그 전문이 도입됨). 또다른 구현예에서, 스코어링 함수 (SCORE2 접근법) 를 사용하여, T 세포 에피토프를 포함하는 리간드의 지표로서 결합 친화성을 추정한다 (Boehm, H. J., J. Comput Aided Mol. Des., 12(4): 309-323 (1998) 본원에 그 전문이 도입됨). 그러나, 상기 참고문헌에 기재된 바와 같은 Boehm 스코어링 함수는 리간드가 단백질에 성공적으로 결합할 수 있음이 이미 공지되어 있고, 단백질/리간드 복합체의 구조가 해석되었으며, 해석된 구조가 단백질 데이타 뱅크 ("PDB") 에 존재하는, 단백질에 대한 리간드의 결합 친화성을 추정하는데 사용된다. 따라서, 스코어링 함수는 공지된 포지티브 결합 데이타의 이점과 함께 개발되었다. 포지티브 및 네거티브 결합자들 사이의 구별을 위해, 반발 항이 공식에 부가될 수 있다. 또한, 상기 Boehm 함수의 에너지 항에 근거한 영역을 이용하기보다 한쌍씩 (pairwise)의 친유성 상호작용을 계산하여, 보다 만족스러운 결합 에너지의 추정이 얻어진다. 따라서, 한가지 구현예에서, 결합 에너지는 변형 Boehm 스코어링 함수를 이용하여 추정된다. 변형 Boehm 스코어링 함수에서, 단백질 및 리간드 사이의 결합 에너지 (ΔG_bind) 는 하기 변수를 고려하여 추정된다: 리간드의 이행 (translational) 및 회전 엔트로피의 전체적인 소실로 인한 결합 에너지의 감소 (ΔG₀); 1 개 이상의 파트너가 중성인 이상적인 수소 결합의 분포 (ΔG_hb); 비교란 이온 상호작용의 분포 (ΔG_ionic); 친유성 리간드 원자 및 친유성 수용자 원자 사이의 친유성 상호작용 (ΔG_lipo); 리간드의 내부 자유도의 동결 (freezing), 즉 각각의 C-C 결합에 대한 회전 자유의 감소로 인한 결합 에너지의 소실 (ΔG_rot); 단백질 및 리간드 사이의 상호작용 에너지 (E_VdW). 상기 항을 고려하여 수학식 1 을 얻는다:

여기서, N 은 특정 항에 대해 자격을 부여하는 상호작용의 수이고, 하나의 구현예에서, ΔG₀, ΔG_hb, ΔG_ionic, ΔG_lipo 및 ΔG_rot 은 각각 하기 값을 갖는 상수이다: 5.4, -4.7, -4.7, -0.17, 및 1.4.

항 N_hb 는 하기 수학식 2 에 따라 계산된다:

f (ΔR, Δα) 는 이상적인 상황에 대한 수소 결합의 큰 편차를 설명하는 페널티 함수이며, 수학식 3 에 따라 계산된다:

f (ΔR, Δ-α) = f1 (ΔR) × f2 (Δα)

여기서, ΔR ≤TOL 인 경우 f1 (ΔR) = 1 이거나

ΔR ≤0.4 + TOL 인 경우 f1 (ΔR) = 1 - (ΔR - TOL)/0.4 이거나

ΔR > 0.4 + TOL 인 경우 f1 (ΔR) = 0 이고,

또한: Δα < 30°인 경우, f2 (Δα) = 1 이거나

Δα ≤ 80°인 경우, f2 (Δα) = 1 - (Δα-30)/50 이거나

Δα > 80°인 경우, f2 (Δα) = 0 이다.

TOL 은 수소 결합 길이 = 0.25Å 에서의 관용 편차이다.

ΔR 은 이상값 = 1.9Å 로부터 H-O/N 수소 결합 길이의 편차이다.

Δα는 그 이상값 180°로부터 수소 결합각 ∠_{N/O-H..O/ N} 의 편차이다.

f(N_neighb) 는 단백질 표면의 오목부 및 볼록부를 구별하므로, 단백질 표면에서 발견되는 것보다 포켓에서 발견되는 극성 상호작용에 더 큰 무게를 부여한다. 상기 함수는 하기 수학식 4 에 따라 계산된다:

식 중,

N_neighb 는 임의의 주어진 단백질 원자에 대해 5Å 보다 더 가까운 비수소 단백질 원자의 수이다.

N_{neighb ,0} 는 상수 = 25 이다.

f_pcs 는 수소 결합 당 극성 접촉 표면적을 허용하는 함수이므로, 강한 및 약한 수소 결합 사이를 구분하며, 그 값은 하기 기준에 따라 결정된다:

A_polar/N_HB < 10Ų 인 경우 f_pcs = β이거나

A_polar/N_HB > 10Ų 인 경우 f_pcs = 1 이다.

A_polar 는 극성 단백질-리간드 접촉 표면의 크기이다.

N_HB 는 수소 결합의 수이다.

β는 값이 1.2 인 상수이다.

변형 Boehm 스코어링 함수의 실행을 위해, 이온성 상호작용으로부터의 분포 ΔG_{ion ic} 은 동일한 기하 의존성이 가정되었으므로, 상술된 수소 결합으로부터와 유사한 방식으로 계산된다.

항 N_lipo 는 하기 수학식 5 에 따라 계산된다:

f(r_1L) 은 모든 친유성 리간드 원자 l 및 모든 친유성 단백질 원자 L 에 대해 하기 기준에 따라 계산된다:

r_lL ≤ R1 인 경우 f(r_lL) =1,

R2 < r_lL > R1 인 경우 f(r_lL) = (r_lL-R1)/ (R2-R1),

r_lL ≥ R2 인 경우 f(r_1L) = 0

여기서, R1 = r_l ^vdw + r_L ^vdw + 0.5 이고

R2 = R1 + 3.0 이고

r_l ^vdw 은 원자 l 의 반 데르 발스 반경이고

r_L ^vdw 은 원자 L 의 반 데르 발스 반경이다.

항 N_rot 는 아미노산 측쇄의 회전가능한 결합의 수이며, 비환식 sp³-sp³ 및 sp³-sp² 결합의 수로 고려된다. 말단 -CH₃ 또는 -NH₃ 의 회전은 고려되지 않는다.

최종 용어 E_VdW 는 하기 수학식 6 에 따라 계산된다:

여기서, ε₁ 및 ε₂ 는 원자 정체에 근거하는 상수이며,

r₁ ^vdw + r₂ ^vdw 는 반 데르 발스 원자 반경이고,

r 은 원자 쌍 사이의 거리이다.

수학식 6 에 있어서, 하나의 구현예에 의하면, 상수 ε₁ 및 ε₂ 는 하기 주어진 원자 값이다: 각각 C: 0.245, N: 0.283, O: 0.316, S: 0.316 (즉, 각각 탄소, 질소, 산소 및 황 원자에 대한 것). 수학식 5 및 6 에 대해, 반 데르 발스 반경은 하기 주어진 원자 값이다: C: 1.85, N: 1.75, O: 1.60, S: 2.00Å.

상기 수학식에서 주어진 모든 소정의 값 및 상수는 특히 본원에서 수행되는 계산의 유형에 따라 단백질 리간드 상호작용의 현재 이해의 제약 내에서 결정되는 것임이 이해되어야 한다.

상술한 바와 같이, 스코어링 함수는 측쇄 배치, 원자 정체 및 원자간 거리의 데이타베이스에서 추출되는 데이타에 적용된다. 본 발명의 설명을 위해, 상기 데이타베이스에 포함되는 MHC 클래스 II 분자의 수는 42 모델 + 4 개의 해석된 구조이다. 상기 설명으로부터, 본 발명의 컴퓨터적 방법의 구축의 모듈 특성은, 신규 모델이 쉽게 추가되고, 펩티드 골격 라이브러리 및 측쇄 배치 탐색 함수로 스캐닝될 수 있어, 상술한 바와 같은 펩티드 스코어링 함수에 의해 처리될 수 있는 부가적인 데이타 세트를 생성시킬 수 있음을 의미하는 것이 자명하다. 이는, 존재하는 대립유전자의 보다 정확한 모델을 생성하는데 데이타가 이용가능하다면, 스캐닝된 MHC 클래스 II 분자의 목록이 쉽게 증가되거나 구조 및 회합 데이타가 대체될 수 있게 한다.

본 발명의 예측 방법은 각종 MHC 클래스 II 분자에 대한 그의 친화성이 실험적으로 이전에 결정된 다수의 펩티드를 포함하는 데이터 셋트에 대해 보정될 수 있다. 계산된 데이터 대 실험 데이터의 비교로써, 모든 실험적으로 결정된 T-세포 에피토프가 정확하게 예측되는 것으로 공지된 값의 경계가 상기에서 결정될 수 있다.

상기 스코어링 함수가 이용가능한 일부 복잡한 방법론에 비해 비교적 간단하지만, 계산은 극히 신속히 수행됨이 이해되어야 한다. 또한, 그 목적이 선택된 MHC 클래스 II 단백질의 결합 그루브 내에 도킹된 각각의 펩티드에 대한 자체 실제 결합 에너지를 계산하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 기본적인 목적은 선택된 단백질의 일차 서열 (즉, 아미노산 서열) 을 근거로 T 세포 에피토프의 위치 예측에 도움을 주는 비교 결합 에너지 데이타를 수득하는 것이다. 상대적으로 높은 결합 에너지 또는 상기 선택된 임계값 초과의 결합 에너지는 리간드 중 T 세포 에피토프의 존재를 제시할 것이다. 이어서, 리간드를 1 차 이상의 아미노산 치환에 적용시켜 결합 에너지를 재계산한다. 신속한 계산 특성으로 인해, 상기 펩티드 서열의 조작은 효율적인 비용으로 이용가능한 컴퓨터 하드웨어 상의 프로그램의 사용자 인터페이스 내에서 쌍방향으로 수행될 수 있다. 따라서, 컴퓨터 하드웨어에 대한 거대한 투자가 요구되지는 않는다.

당업자에게는, 동일한 목적을 위해 다른 이용가능한 소프트웨어를 이용할 수 있음이 자명할 것이다. 특히, 단백질 결합 부위 내로 리간드를 도킹시킬 수 있는 보다 복잡한 소프트웨어를 에너지 최소화와 함께 이용할 수 있다. 도킹 소 프트웨어의 예에는 하기가 있다: DOCK (Kuntz 등, J. Mol. Biol., 161: 269-288 (1982)), LUDI (Boehm, H. J., J. Comput Aided Mol. Des., 8: 623-632 (1994)) 및 FLEXX (Rarey M., 등, ISMB, 3: 300-308 (1995)). 분자 모델링 및 조작 소프트웨어의 예에는 하기가 포함된다: AMBER (Tripos) 및 CHARMm (Molecular Simulations Inc.). 상기 전산적 방법의 이용은 필요한 계산을 수행하는데 걸리는 처리 시간의 길이로 인해, 본 발명의 방법의 효율을 상당히 제한할 것이다. 그러나, 상기 방법이 본 발명의 방법을 통해 '포지티브 결합자' 로 발견되는 펩티드에 대해 보다 정확한 결합 에너지의 계산을 얻기 위한 '2 차 스크린' 으로 사용될 수 있다. 복잡한 분자 기계적 또는 분자 동역학적 계산을 위한 가공 시간의 제한은 상기 계산을 가능하게 하는 소프트웨어의 고안 및 컴퓨터 하드웨어의 현재 기술 한계 둘 다에 의해 정의되는 것이다. 미래에는, 보다 효율적인 코드의 기록 및 지속적인 컴퓨터 프로세서의 속도 증가로 인해, 보다 제어가능한 시간틀 내에서 상기 계산이 이루어질 것임을 예견할 수 있다. 폴딩된 단백질 구조 내에서 일어나는 다양한 상호작용의 고려 및 거대분자에 적용되는 에너지 함수에 대한 추가 정보는 하기 문헌에서 찾아볼 수 있고: [Brooks, B. R., 등, J. Comput. Chem., 4: 187-217 (1983)], 일반적인 단백질-리간드 상호작용에 관한 추가 정보는 하기 문헌에서 찾아볼 수 있으며: [Dauber-Osguthorpe 등, Proteins 4(1): 31-47 (1988)], 이들은 본원에 그 전문이 참고문헌으로 도입된다. 유용한 배경 정보는 또한, 예를 들어 하기 문헌에서 찾아볼 수 있다 [Fasman, G. D. 편저, Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Plenum Press, New York, ISBN: 0-306 4313-9].

실시예 2: 비분획화 PBMC 배양에 의한 잠재적인 CD4 + T 헬퍼 세포 에피토프 로서의 IL -7 유도성 펩티드의 시험관내 분석

IL-7 단백질의 N-연결 글리코실화 부위 주변의 서열이 면역원성이라는 전산적 예측을 근거로 하여, 성숙 인간 IL-7 단백질에서의, 예를 들어 Leu63 내지 Ser71 (LRQFLKMNS 서열 식별 번호 4) 또는 Ile88 내지 Val96 (ILLNCTGQV 서열 식별 번호 7) 에 편재하는 상기 영역들을 포함하는 펩티드를 그의 면역원성에 대해 분석하는데, 이는 시험관내에서 T-세포 증식을 유도하는 그의 능력으로 측정한다. 핵심적으로, 인간 혈액에서 분리한 PBMC 는 개별적인 중첩되는 15-머 펩티드와 인큐베이션하고, 증식 응답성은 ³H-티미딘 혼입으로 측정한다. 원칙적으로, PBMC 의 혼합물에서의 T-세포는, 이들이 자기조직 유래의 APC (항원 제시 세포) 상에서 개별적인 펩티드-MHC 복합체를 인식하는 경우에만 증식하며, 이에 따라 증식은 펩티드 면역원성의 표식이다.

예를 들어, 3 개의 아미노산이 엇갈리게 배열된, 예를 들어 인간 IL-7 에서 Met54 에서 Leu80 까지의 영역에 편재하는 15-머 펩티드가 합성되어 (Pepscan Systems, Netherlands), DMSO (Sigma Chemical, St. Louis, MO, U.S.A.) 에 재현탁되고, 배양 배지 중 5% DMSO 중에 5 μM 의 최종 농도로 사용된다.

PBMC 는 Ficoll-Hypaque 구배 원심분리에 의해 건강한 공여자 유래의 말초혈로부터 분리되며, 액체 질소 중에 냉동되어 저장된다. 추가로, 각각의 PBMC 샘 플은 QiaAmp Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA) 로 분리된 DNA 상에서 SSP PCR 타이핑 키트 (Bio-Synthesis, Lewisville, TX) 를 이용하여 HLA 유형화된다.

전형적인 증식 검정에서, 각각의 중첩되는 15-머 펩티드는 40 명의 나이브 공여자로부터 배양된 6 개씩의 PBMC 배양물에서 검정된다. 간략하게, 사용 전에 재빨리 해동시킨 2 x 10⁵ PBMC 를 5 μM 의 각각의 펩티드와 혼합하고 5% CO₂ 중에 37℃ 에서 7 일 동안 배양했다. 양의 대조군으로서, 샘플을 파상풍 독소 유도성 펩티드 MQYIKANSKFIGI (서열 식별 번호 15) 와 인큐베이션하면서, 음성 대조군 샘플은 0.5% DMSO 와 인큐베이션한다. 인큐베이션의 마지막 12 시간 동안, 배양물에 [메틸-³H]티미딘 (0.5 μCi/웰) (NEN Life Science Products, Boston, MA) 을 펄스하고, 배양물을 필터 매트에 수합하고, 티미딘 혼입을 Wallac 마이크로플레이트 베타 탑 플레이트 신틸레이션 카운터 (Perkin Elmer, Boston, MA) 를 이용하여 분 당 계수 (CPM) 로서 측정한다. 각각의 펩티드에 대한 자극 지수는 주어진 펩티드의 CPM 값을 음성 대조군으로부터 수득한 CPM 값으로 나누어 계산된다.

양성 대조군 펩티드의 자극 지수는 1 (음성 대조군의 자극 지수) 보다 훨씬 더 크며, 코어 서열 LRQFLKMNS (서열 식별 번호 4), FLKMNSTGD (서열 식별 번호 5) 또는 LKMNSTGDF (서열 식별 번호 6) 를 포함하는 펩티드, 예컨대, 예를 들어 펩티드 ARKLRQFLKMNSTGD (서열 식별 번호 10), LRQFLKMNSTGDFDL (서열 식별 번호 11), 또는 FLKMNSTGDFDLHLL (서열 식별 번호 12) 는 자극 지수에서 증가됨을 발견했다. 따라서, LRQFLKMNS (서열 식별 번호 4) 또는 LKMNSTGDF (서열 식별 번호 6) 와 같은 펩티드 서열은 당연히 잠재적인 T-세포 에피토프를 나타낸다.

유사한 분석이 코어 펩티드 ILLNCTGQV (서열 식별 번호 7) 및 LLNCTGQVK (서열 식별 번호 8) 로 규정되는 영역을 포함하는 일련의 15-머 펩티드로 수행되며, 상기 펩티드 서열도 잠재적인 T-세포 에피토프를 나타낸다는 것을 발견했다.

실시예 3: 분화된 인간 수상체 세포 ( DC ) 를 이용한 시험관 내에서의 CD4 + T 헬퍼 세포 에피토프의 맵핑

성숙 수상체 세포 (DC) 는, T-세포에 효율적으로 항원 펩티드 또는 전체 단백질을 제시하는 강력한 항원-제시 세포 (APC) 이다. 항원 펩티드를 시험관내에서 펄스한 분리된 DC 는 시험관내 증식 검정에서 측정될 수 있는 1 차적인 T-세포 응답성을 유도하기 위해 사용된다. 분화된 DC 는, 예를 들어 하기의 과정에 의해 생성된다: 우선, 인간 단핵구는 PBMC 를 플라스틱 조직 배양 플라스크에 붙게 하거나 또는 CD14⁺ PBMC 를 자성적으로 표지된 항원 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) 으로 정제하여 생성된다. 이어서, 정제된 단핵구 (0.5 내지 1.5 x 10⁶ 세포/ml) 를 1000 U/ml GM-CSF (Endogen; Woburn, MA) 및 500 U/ml IL-4 (Endogen; Woburn, MA) 을 함유하는 AIM V 배지 (GIBCO BRL1 Grand Island, NY1 U.S.A.) 에서 3 일 동안 배양한다. 후속적으로, 상기 미성숙 DC 는 5 ㎍/ml 의 실험군 또는 대조군 펩티드로 펄스하고, 1000 U/ml TNF-α (Endogen; Woburn, MA), 1000 U/ml GM-CSF 및 500 U/ml IL-4 의 조합을 이용하여 48 시간 더 인큐베이션한다. 성숙 DC 는 CD80⁺, CD86⁺ 및 HLA-DR 의 높은 수준의 표면 발현으로 모니터링한다.

상기 성숙 항원-펄스된 DC 에는 4200 Rad 를 조사하고, 정제된 자기조직 CD4⁺ T-세포 (CD4+ T-세포는 시험관내 DC 분화에 단핵구를 제공하는 동일한 공여자 유래의 냉동된 PBMC 분취물을 사용하여, 자성으로 표지된 항체 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) 로 정제됨) 를 이용한 증식 검정에 사용된다. 전형적인 검정에서, 항원-펄스된 DC (2 × 10⁵/mL) 는, 5% CO₂ 에서 7 일 동안 37℃ 로 하여 둥근바닥 96-웰 플레이트에서 자기조직 CD4⁺ T-세포 (2 × 10⁶ 세포/mL) 와 함께 인큐베이션한다. 배양의 마지막 12 시간 동안 0.5 μCi/웰로 [메틸-³H]티미딘 (NEN Life Science Products, Boston, MA) 을 첨가하고, 샘플을 수합하여 유리 필터 상에서 해리하고, ³H-티미딘 혼입은 신틸레이션 카운터로 측정한다.

실시예 1 에 기재된 바와 같이, 15-머 펩티드는 상기 검정에서 시험하고, 표준 펩티드 및 기타 대조군들과 비교한다. 상기 검정은 실시예 1 에 기재된 검정보다 더욱 민감하다는 것이 발견되어, T-세포 증식 유도에 대한 개별 펩티드들의 능력 격차가 더 나도록 한다. 코어 서열 LRQFLKMNS (서열 식별 번호 4), FLKMNSTGD (서열 식별 번호 5), LKMNSTGDF (서열 식별 번호 6), ILLNCTGQV(서열 식별 번호 7) 또는 LLNCTGQVK (서열 식별 번호 8) 을 포함하는 IL-7 펩티드는 물론 현저한 T-세포 증식을 유도한다는 것을 발견했으며, 따라서 상기 서열들은 잠재적인 T-세포 에피토프를 나타낸다.

실시예 4: IL - 7 에서의 탈면역화 아미노산 치환의 시험관내 분석

IL-7 단백질이 덜 면역원성이 되도록 하는 것으로 간주되는, 상기 기재된 펩티드 영역 내의 아미노산 치환은 실시예 1 및 실시예 2 에 기재된 바와 같은 시험관내 검정에서 시험한다. 예를 들어, 서열 LRQFLDDNS (서열 식별 번호 13) 을 포함하는 변이체 IL-7 펩티드는 LRQFLKMNS (서열 식별 번호 4) 을 포함하는 야생형 모 펩티드에 비해 훨씬 더 감소된 T-세포 증식 응답성을 제공하는 것으로 예상된다. 유사하게, 서열 TLLNCTGQG (서열 식별 번호 14) 를 포함하는 변이체 IL-7 펩티드는 ILLNCTGQV (서열 식별 번호 7) 를 포함하는 야생형 모 펩티드에 비해 훨씬 더 감소된 T-세포 증식 응답성을 제공하는 것으로 예상된다.

실시예 1 에 기재된 바와 같은 변이체 IL-7 서열 LRQFLDDNS (서열 식별 번호 13) 또는 TLLNCTGQG (서열 식별 번호 14) 를 포함하는 일련의 IL-7 유도성 15-머 펩티드가 합성된다. 추가로, 변이체 IL-7 단백질, 또는 변이체 IL-7 를 포함하는 융합 단백질은, 본 발명의 치환을 포함하는데, 원핵성 또는 진핵성 발현계 (Del-IL-7 의 것) 의 것에서 제작된다. 예를 들어, 아미노산 치환 K68D, M69D, I88T 및 V94G 을 포함하는 변이체 IL-7 이 제조된다. (추가로, 원핵생물에서 제조된 IL-7 단백질에는 출발 메티오닌이 포함된다.) 상기 펩티드 및 정제된 단백질, 및 이들의 부모격인 짝들은 (parental counterpart), 실시예 1 에 기재된 전체 PBMC 를 이용한 검정에서 또는 실시예 2 에 기재된 바와 같은 인간 DC 펄스로 T-세포 증식을 유도하는 그의 능력을 시험한다. PBMC 을 자극하거나 또는 DC 를 펄스하기 위해 25 ㎍/ml 의 단백질을 사용한다.

일반적으로, 변이체 IL-7 서열에서 유도된 펩티드는 야생형 인간 IL-7 단백 질로부터 유도된 상응하는 단백질에 비해 T-세포 증식 유도 능력이 훨씬 더 감소된다는 것을 발견했다. 따라서, 상기 변이체 펩티드 서열은 훨씬 더 열악한 잠재적인 T-세포 에피토프이다. 마찬가지로, 박테리아에서 생산하는 변이체 IL-7 단백질은 또한 야생형 IL-7 보다 T-세포 증식 유도 능력이 감소되며, 이는 상기 돌연변이 영역들이 원핵세포에서 제공되는 IL-7 의 면역원성에 상당한 기여를 할 수 있음을 시사한다.

실시예 5: 잠재적인 B-세포 에피토프로서의 IL -7 유도성 펩티드의 분석

박테리아에서 생산되는, 글리코실화되지 않은 인간 IL-7 단백질에 대해, IL-7 의 N-연결 글리코실화 부위를 둘려싼 서열들은 인간 면역계에 의해 "비-자기" 로서 인식될 수 있는데, 항체 응답성을 설명한다. 핵심적으로, 상기 서열들이 선형 B-세포 에피토프를 나타내는지 여부를 평가하기 위해, 상기 서열에 편재하는 펩티드를 토끼 면역화에 사용하고, 박테리아에서 생산되는 자연 인간 IL-7 및 변성된 인간 IL-7 에 대한 수득한 항체의 반응성을 시험한다. 추가 대조군으로서, 자연 진핵생물에서 생산되는 글리코실화 huFc-IL-7 융합 단백질을 사용한다.

예를 들어 토끼에서 특이적 펩티드 항원에 대한 폴리클로날 항체를 제공하기 위한 방법 및 재료, 및 그의 후속 정제는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있으며, 그에 대한 참고문헌은 예를 들어 하기에서 찾을 수 있다: Antibodies: A Laboratory Manual, E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Press.

간략하게, 한 예에서, 코어 서열 FLKMNSTGD (서열 식별 번호 5) 을 포함하는 펩티드, 예컨대 LRQFLKMNSTGDFDL[C] (서열 식별 번호 18) 또는 [C]LRQFLKMNSTGDFDL (서열 식별 번호 19) 는 3 가지 상이한 담체 단백질인 키홀 림페트 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin) (KLH, EMD Biosciences, San Diego, CA), BSA (EMD Biosciences, San Diego, CA), 및 오브알부민 (Pierce, Rockford, IL) 에 첨가되는 말단 시스테인을 통해 SMCC (Pierce, Rockford, IL) 와 같은 커플링제를 이용하여 커플링되며, 아쥬반트의 존재 하에 각각의 펩티드 콘쥬게이트를 연속하여 주사하여 여러마리의 토끼를 면역화시킨다. 면역 응답성은 매달 간격을 두고 1 회의 펩티드-캐리어 콘쥬게이트의 추가적인 주사를 이용해 부스팅하고, 각각의 토끼로부터 수득한 항혈청을 펩티드가 커플링하는 Sulfo-Link 컬럼 (Pierce, Rockford, IL) 상에서 친화성-정제하고, 항체를 히드록시아파타이트 컬럼 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) 상에서 더 농축한다.

정제된 항체는 표준 과정에 이어 ELISA 검정에서의 박테리아에서 제공된 자연 인간 IL-7, 변성된 인간 IL-7 및 진핵세포에서 제공된 글리코실화 huFc-IL-7 융합 단백질에 대해 시험한다. 간략하게, 정제된 단백질 제제로 코팅된 ELISA 플레이트는 시험 항체 샘플과 인큐베이션하고, 플레이트를 세척하고, 고추냉이 퍼옥시다아제-커플링된 항-토끼 IgG 와 같은 2 차 항체와 인큐베이션하고, 다시 세척하고 발색성 기질 용액과 인큐베이션하여 결합된 항체의 농도를 표시했다.

유사하게, 항체들은 인간 IL-7 에서의...MNSTG... (서열 식별 번호 20) 글리코실화 부위 (Asn70 에서) 를 포함하는 기타 펩티드, 또는 ...LNCTG... (서열 식별 번호 21) 글리코실화 부위 (Asn91 에서) 를 포함하는 펩티드로 몰린다. 상기 접근법을 이용하여, 일반적으로 박테리아에서 제공되는 변성된 인간 IL-7 은 항체 에 의해 잘 인식되고, 글리코실화 huFc-IL-7 융합 단백질은 그렇지 않다는 것을 발견했다. 박테리아에서 제공되는 자연 인간 IL-7 단백질과 반응하는 항체로 제공되는 펩티드는 글리코실화 부위에서의 선형 B-세포 에피토프가 인식됨을 나타낸다. 실시예 9 에 기재된 바와 같은 세포-기재 증식 검정에서, 상기 실시예의 펩티드에 대해 몰리는 항체가 IL-7-자극 세포 증식 저해 효과를 갖는다는 것을 추가로 발견했다. 상기 결과는 상기 항체들이 중화 활성을 갖는다는 것을 나타낸다.

실시예 6: 잠재적인 T-세포 에피토프가 결여된 인간 IL -7 변이체의 구축

박테리아 발현에 적합하거나 또는 진핵세포 발현에 적합한, 인간 IL-7 변이체의 예를 들어 융합 단백질로서의 버젼을 코딩하는 핵산이 구축된다. 예를 들어, 치환 K68D, M69D, I88T 및 V96G (Del-IL-7 서열 식별 번호 16) 을 포함하는 성숙 인간 IL-7 변이체를 코딩하는 핵산은 당업자에게 익숙한 표준 방법으로 이용하여 구축된다. 도 11 은 아미노산 잔기의 코돈 치환 K68D, M69D, 188T 및 V96G (서열 식별 번호 24) 이 있는 성숙 IL-7 변이체, Del-IL-7 를 코딩하는 상기 DNA 서열의 예시를 보여준다.

박테리아 발현에 대해, 출발 메티오닌을 포함하는 Del-IL-7 의 단백질 서열 (bDel-IL-7 서열 식별 번호 17) 은 최적의 E. coli 발현에 적합한 코돈 바이어스를 이용하여 역-번역된다 (reverse-translated). 수득되는 핵산 서열은 추가로 원하는 특징들, 예컨대 정지 코돈 또는 제한효소 부위를 포함하도록 (또는 원하지 않는 것을 배재되도록) 조정되며, 박테리아 발현 벡터, 예를 들어, pET 계열 (EMD Biosciences, San Diego, CA) 로부터의 적당한 벡터에 대한 클로닝을 촉진하는 서열이 추가된다. 핵산 서열은 전체 유전자 합성에 의해 합성되며 (Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA), 발현 벡터에 삽입된다. 아미노산 잔기의 코돈 치환 K68D, M69D, I88T, V96G 이 있는 E. coli 에 대한 코돈-최적화된 bDel-IL-7 을 코딩하는 DNA 서열의 예시는 도 10 에 나타낸다 (서열 식별 번호 23).

huFc-Del-IL-7 융합 단백질로서의 진핵세포 발현을 위해, 성숙 인간 IL-7 의 핵산 서열은 상기 기재된 본 발명의 바람직한 아미노산 돌연변이에 대한 코돈을 혼입하도록 개질된다 (참고로 예를 들어, 서열 식별 번호 24). 서열은 추가로 IgG1 의 CH2 및 CH3 영역인 힌지 (hinge) 를 코딩하는 pdCs-huFc 발현 벡터에 들어가는 (in-frame) XmaI/XhoI 절편으로서 삽입되기 위한 특별한 제한효소절단 부위를 가진 인접 서열을 혼입하도록 바뀌어 (참고문헌은, Lo 등, (1998), Protein Engineering 11:495), 전체 유전자 합성으로 합성된다 (Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA). 이어서, 합성 XmaI/XhoI Del-IL-7 절편은 pdCs-huFc 벡터에 클로닝되어, huFc-Del-IL-7 를 코딩하는 발현 플라스미드를 제공한다. 본 발명의 기타 IL-7 및 Fc-I L-7 변이체들은 유사한 방법으로 제조될 수 있다.

구체적으로, 인간 탈면역화 Fc-IL-7 융합 단백질 huFcγ2(h)(FN>AQ)-(링커2)-IL-7(PNS) 및 huFcγ2(h)(FN>AQ)-(링커2)-IL-7(PNDS) 을 코딩하는 핵산은 하기와 같이 생성된다. huFcγ2(h)(FN>AQ)-(링커2)-IL-7(PNS) 는 링커 서열 GGGGSGGGG 를 통해 IgG1 힌지가 있는 인간 IgG2 Fc 도메인의 C-말단에 유전자적으로 융합된 인간 IL-7 의 N-말단을 포함하는 인간 Fc-IL-7 융합 단백질이다. Fc 부분은 돌연변이 Phe296Ala 및 Asn297Gln 을 포함한다. IL-7 부분은 돌연변이 F39P, F57N 및 L128S 을 포함한다. huFcγ2(h)(FN>AQ)-(링커2)-IL-7(PNDS) 는 huFcγ2(h)(FN>AQ)-(링커2)-IL-7(PNS) 와 동일하나, IL-7 부분에 추가적인 돌연변이 L77D 를 포함한다는 점이 다르다. 서열은 또한 ATAT 로 대체될 Fc 부분의 C-말단 부근에 LSLS 서열의 돌연변이체 대한 코돈을 포함한다. 추가로, 핵산 서열에는 Fc 부분의 C-말단 라이신이 알라닌 잔기로 대체된 코돈을 포함한다.

도 27 에 제시된 서열의 핵산은 다시 (de novo) 합성되는데 (Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA), 이는 5'- 및 3' 말단에 각각 인접하여 제한효소 부위 XmaI 및 XhoI 를 포함하는, 아미노산 치환 F39P, F57N 및 L128S (IL-7(PNS)) 을 포함하는 성숙 인간 IL-7 가 후속하는 링커 서열 GGGGSGGGG 를 코딩한다. 상기 정제된 XmaI/XhoI 절편은 마찬가지로 절단되고 정제된 pdCs-huFc 계열의 벡터 절편, pdC10-huFcγ2(h)(FN>AQ) 에 라이게이션되어 huFcγ2(h)(FN>AQ)-(링커2)-IL-7(PNS) 를 코딩하는 플라스미드를 형성한다 [Lo 등, (1998), Protein Engineering 11:495]. 코딩 서열은 서열분석으로 확인된다.

L77D 의 IL-7(PNS) 에 대한 치환의 추가적인 도입은 위치지정돌연변이유발 프라이머 M(s) (5'-TGACTTTGATGACCACCTGTTAAAAGTTTC-3' (서열 식별 번호 50); 돌연변이화 코돈에 밑줄) 및 M(a) (5'-AACAGGTGGTCATCAAAGTCACCAGTGC-3') (서열 식별 번호 51) 를 이용하는 표준 PCR 위치지정돌연변이유발 방법으로 수행된다. 간략하게, 분리된 PCR 반응은 (링커2)-IL-7(PNS) 을 포함하는 플라스미드 템플레이트 상에서, 한 번은 M(s) 및 하류 프라이머 5'-CTCGAGTCAGTGTTCTTTAGTGCCCATC-3' (서 열 식별 번호 52) 로, 나머지 한 번은 M(a) 및 상류 프라이머 5'-CCCGGGTGCTGGAGGTGGAGGATCAGGTG-3' (서열 식별 번호 53) 로 수행하여, PCR 절편을 정제하고 상류 프라이머 5'-CCCGGGTGCTGGAGGTGGAGGATCAGGTG-3'(서열 식별 번호 54) 및 하류 프라이머 5'-CTCGAGTCAGTGTTCTTTAGTGCCCATC-3'(서열 식별 번호 55) 를 다시 사용하는 두번째 PCR 을 위한 템플레이트로서 조합했다. 수득한 정제된 절편은 TA 클로닝 벡터 pCR2.1 ((Invitrogen, Carlsbad, CA) 에 삽입하고, 그의 서열을 확인했다. (링커2)-IL-7(PNDS) 를 코딩하는 XmaI/XhoI 절편을 잘라내고, 마찬가지로 절단되어 정제된 pdCs-huFc 계열의 벡터 절편, pdC10-huFcγ2(h)(FN>AQ) 에 라이게이션하여 huFcγ2(h)(FN>AQ)-(링커2)-IL-7(PNDS) 를 코딩하는 플라스미드를 생성했다.

유사하게, Fc 부분이 상이한 상기 융합 단백질의 변이체를 코딩하는 플라스미드를 수득한다; 예를 들어, huFcγ2(h)(링커2)-IL-7(PNDS) 를 코딩하는 플라스미드는 (링커2)-IL-7(PNDS) 를 코딩하는 XmaI/XhoI 절편을, 마찬가지로 절단되고 정제된 pdCs-huFc 계열의 벡터 절편인, pdC10-huFcγ2(h) 에 라이게이션하여 수득한다.

실시예 7: IL -7 변이체의 발현 및 정제

huFc-Del-IL-7 융합 단백질의 진핵세포 발현을 위해서, 융합 단백질을 코딩하는 DNA 를 마우스 골수종 NS/0 세포주에 도입하기 위해 전기천공이 이용된다. 전기천공 수행을 위해서, NS/0 세포를 10% 가열-불활성화 우태아 혈청, 2 mM 글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 Dulbecco's 변형 Eagle's 배지에서 배양한다. 약 5 x 10⁶ 개의 세포를 PBS 로 1 회 세척하고, 0.5 ml PBS 에 재현탁시킨다. huFc-Del-IL-7 에 대한 10 ㎍ 의 선형화 플라스미드 DNA 를 얼음 상의 Gene Pulser Cuvette (0.4 cm 전극 갭, BioRad) 내의 세포와 10 분 동안 인큐베이션한다. 전기천공은 0.25 V 및 500 μF 으로 설정된 Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) 를 이용하여 수행된다. 세포는 얼음 위에서 10 분 동안 회복되도록 한 후, 이들을 성장 배지에 재현탁시키고 2 개의 96 웰 플레이트에 플레이팅한다.

안정하게 트랜스펙션된 클론을, 트랜스펙션 이틀 후 성장 배지에 첨가되는 100 nM 메토트렉세이트 (MTX) 의 존재 하에 그의 성장으로 선별한다. 세포를 매 3 일마다 2 내지 3 회 더 주입하고, MTX-저항성 클론은 2 내지 3 주 내에 나타난다. IL-7 융합 단백질을 다량 제공하는 클론의 식별을 위해 클론 유래의 상청액을 항-Fc ELISA 로 검정한다. 많이 생성된 클론을 분리하고, 100 nM MTX 를 포함하는 성장 배지에서 증식시킨다. 일반적으로, 무혈청 성장 배지, 예컨대 H-SFM 또는 CD 배지 (Life Technologies) 가 사용된다.

Fc-포함 융합 단백질의 표준 정제는 단백질 A 에 대한 Fc 단백질 부분의 친화성을 근거로 수행된다. 간략하게, 융합 단백질을 발현하는 NS/0 세포, 예컨대 huFc-Del-IL-7 는 조직 배양 배지에서 성장하며, 발현 단백질을 포함하는 상청액을 수집하고 미리 평형화된 Fast Flow Protein A Sepharose 컬럼에 로딩한다. 이어서, 상기 컬럼은 완충액 (예컨대, 100 mM 나트륨 포스페이트, 150 mM NaCl, 중성 pH) 을 사용하여 세척한다. 결합된 단백질은 동일 완충액 중 낮은 pH (pH 2.5 - 3) 에서 상기와 같이 용출시켜, 분획을 즉시 중화시킨다.

bDel-IL-7 의 박테리아 발현 및 정제는 본질적으로 박테리아에서 생산된 IL-7 에 대한, Cosenza 등에 의해 기재된 바와 같이 수행한다 (참고문헌은, Cosenza 등, (1997) JBC, 272:32995). 핵심적으로, bDel-IL-7 은 봉입체로부터 분리되어, 변성시키고 다시 폴딩시킨다. 간략하게, 예를 들어, bDel-IL-7 를 코딩하는 발현 벡터로 형질전환된 박테리아 발현 배양을 중간-로그상 (mid-log phase) 까지 성장시키고, 재조합 단백질 발현을 유도한다. 유도 후, 박테리아를 수합하여 초음파로 해리시키고, 봉입체를 완충액 A (50 mM Tris HCl (7.5), 5 mM EDTA, 20% 수크로오스) 에서 분리한다. 집중적인 세척 후, 봉입체를 구아니딘 변성 완충액 (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 M 구아니딘 HCl, 5 mM EDTA) 에 재현탁시키고, 살짝 초음파처리하고 6 mM DTT 에서 환원시킨다. 이어서, 변성된 bDel-IL-7 단백질은 변성 크기 배제 HPLC 로 추가로 정제한다. 이어서, 단백질은 리폴딩 완충액 (50 mM 글리신, 30 mM NaOH, 0.4 M L-아르기닌, 1 mM DTT, pH 10) 에서 리폴딩시키고, 포스페이트 완충액으로 투석하고, 크기 배제 HPLC 로 추가로 정제한다.

실시예 8: IL -7 변이체의 생화학적 분석

IL-7 단백질의 통합성에 대한 도입된 돌연변이의 유효성은 일상적인 환원 및 비-환원 SDS-PAGE 분석 및 크기 배제 크로마토그래피로 평가한다.

예를 들어, NS/0 세포로부터 발현된 융합 단백질 huFc-Del-IL-7 는, 그것이 분비된 조직 배양 배지로부터 Protein A Sepharose beads (Repligen, Needham, MA) 에 포획되어, β-메르캅토에탄올과 같은 환원제의 존재 또는 부재 하에 단백질 샘플 완충액 중에서 끓여서 용출시킨다. 샘플은 SDS-PAGE 로 분획화하고, 단백질 밴드는 Coomassie 염색으로 가시화한다. 적당한 폴딩을 충분히 방해하는 IL-7 돌연변이를 포함하는 융합 단백질은 SDS-PAGE 로 분해된 생성물을 더 잘 나타낼 것으로 예상된다.

정제된 huFc-Del-IL-7 은 또한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 로 분석하여 융합 단백질이 응집된 정도를 평가한다. 간략하게, 세포 배양 상청액은 미리 평형화된 Fast-Flow Protein A Sepharose 컬럼에 로딩하고, 컬럼을 생리학적 완충액 (예컨대, 100 mM 나트륨 포스페이트, 150 mM NaCl, 중성 pH) 에서 집중적으로 세척하고, 결합된 단백질은 상기와 동일한 염 완충액 내에서 약 pH 2.5 내지 3 에서 용출시킨다. 분획은 바로 중화시키고, 정점 분획을 모아서, 분취물을 분석용 SEC 컬럼 상에서 분획화시킨다.

실시예 9: IL -7 변이체의 시험관내 활성

본 발명의 돌연변이를 포함하는 IL-7 변이체가 시험관내에서 그의 사이토카인 활성을 유지하는지 여부를 결정하기 위해, 세포 증식 생물검정을 수행한다. 인간 PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells) 를 PHA-P 로 활성화시켜 IL-7 에 응답성인 세포를 제공한다. 증식은 표준 티미딘 혼입 검정에서 측정한다.

예를 들어, huFc-Del-IL-7 및 bDel-IL-7 의 싸이토카인 활성을 측정한다. 간략하게, PBMC 는 먼저 5 일 동안 10 ㎍/ml PHA-P 과 인큐베이션하고, 세포를 세 척한 후, 일련의 희석으로 제조한 huFc-Del-IL-7 또는 bDel-IL-7 이 있는 배지에서 총 48 시간 동안 인큐베이션한다. 최종 12 시간 동안, 샘플을 0.3 μCi 의 [메틸-³H]티미딘 (Dupont-NEN-027) 으로 펄스한다. 이어서, 세포를 집중적으로 세척하고, 수합한 후 유리 필터로 해리한다. DNA 에 혼입된 ³H-티미딘을 신틸레이션 계수기로 측정한다. 표준으로서, R&D Systems (Minneapolis, MN) 으로부터 입수되거나, 또는 National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) 로부터 입수되는 야생형 huIL-7 단백질을 검정한다.

huFc-Del-IL-7 또는 bDel-IL-7 에 대한 세포 증식의 ED₅₀ 값은, 표준 기법에 따른 투여량 응답성 곡선의 그래프 및 최대값의 절반인 응답성을 제공하는 단백질 농도의 결정으로 수득된다.

실시예 10: 야생형 IL-7 및 IL -7 변이체에 의한 원숭이에서의 항-인간 IL -7 항체의 유도

원숭이에게 투여되는 박테리아에서 유도된 야생형 인간 IL-7 은 종종 항-인간 IL-7 항체 역가의 중화를 초래하는 것으로 공지되어 있다 (Storek 등, (2003), Blood, 101 :4209; Fry 등, (2003), Blood, 101 :2294). 이에 따라, 원핵세포에서 제공되는 변이체 IL-7 및 야생형 IL-7 단백질 뿐만 아니라 야생형 또는 변이체 IL-7 폴리펩티드를 포함하는, 진핵세포에서 제공되는 융합 단백질의, 비인간 영장류에서의 항체 중화를 유도하는 경향을 평가한다. 일반적인 실험에서, 짧은꼬리 원숭이에 40 ㎍/kg 의 단백질 샘플을 4 주 동안 1 일 1 회 피하주사한다. 예를 들어, 단백질 샘플은 시판되어 입수가능한, 원핵세포에서 제공되는 IL-7 (PeproTech, Rocky Hill, NJ), 원핵세포에서 제공되는 변이체 IL-7 (K68D, M69D, I88T, V94G), 및 포유류 발현계에서 제공되는 등가의 Fc-IL-7 융합 단백질이다. 정기적인 간격을 두고, 혈청을 동물에서 채취하고, 인간 IL-7 에 대한 항체의 혈청 농도를 인간 IL-7 코팅 96 웰 플레이트 (Nunc, Naperville, IL) 를 이용하는 ELISA 로 측정한다. 일반적으로, 각 혈청 샘플의 일련의 희석물을 각각의 웰에 3 개씩 2 시간 동안 첨가하고, PBS 중 0.05% Tween (Tween 20) 로 세척하고, PBS 중 1% BSA 1% 염소 혈청으로 블로킹한다. 각각의 샘플에 고추냉이 퍼옥시다아제-콘쥬게이트 항-짧은꼬리 원숭이 IgG 를 첨가하고 (샘플 완충액 중 1:60,000), 37℃ 에서 2 시간 동안 인큐베이션하고, 플레이트를 PBS 중 0.05% Tween 으로 8 회 세척한다. 이어서, 샘플을 비색 기질 용액 OPD (o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드) 을 이용하여 490 nm 에서의 OD 를 측정하고, 650 nm 에서 검독한 배경 OD 를 차감하여 측정함으로써 검정한다.

원핵세포에서 제공되는 야생형 IL-7 단백질도 물론 높은 항-IL-7 항체 역가를 제공하는 것으로 발견되었다. 대조적으로, 원핵세포에서 제공되는 변이체 IL-7 의 항체 역가는 훨씬 더 낮은 항 IL-7 항체 역가를 제공한다. 또한, 포유류에서 제공되는 야생형 및 변이체 Fc-IL-7 융합 단백질 (N-연결 글리코실화 부위 부근에 돌연변이가 있음) 이 투여된 동물들에 의해 제공되는 항 IL-7 항체 역가 수준 차이가 공지된 것과 같지 않음을 발견했다. 상기 결과는 원핵세포에서 제공되는 단백질에서의 상기 부위들에서의 글리코실화 결핍이 상기 단백질의 면역원성 에 기여한다는 것을 나타낼 수 있다.

실시예 11: 면역능력이 있는 마우스에서의 Fc - IL - 7 의 급성 용인능

Fc-IL-7 융합 단백질 huFcγ2(h)(N>Q)(링커2)-hulL-7 은 실시예 6 에 기재된 방법에 따라 제조되고, 정제된 후 5O mM 포스페이트, 15O mM 염화나트륨 pH 7.00, 0.05% (v/v) Tween 80 에 제형화되었다. 희석된 용액의 단백질 농도는 280 nm 에서의 흡광도 및 0.98 mg/OD₂₈₀ 의 이론적인 소멸 계수를 이용하여, 공지된 단백질 서열을 기준으로 하여 결정했다. 마우스 투여량에 대해서는, 각 샘플의 분취물을 스톡 바이알로부터 취해, 투여 1 시간 이내에 0.9% 식염수를 이용하여 희석했다.

17 주령의 C57B1/6 마우스 (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) 를, 각각 2 마리씩 무리지어 나누고, Fc-IL-7 융합 단백질을 5 일간 연속하여 피하주사했다. 각 군에 0.5, 5.0, 25 mg/kg 의 투여량 또는 비히클 대조군을 매일 투여한다. 마우스를 희생시킨 시점인 제 7 일까지 처리했던 모든 마우스가 생존했다.

Fc-IL-7 혈장 수준은 제 0, 2, 4 및 7 일째 투여 6 시간 후 안후동 (retro-orbital sinus) 으로부터 혈액 샘플을 수득하여 측정한다. 혈액 샘플은 응집 방지용 헤파린을 포함하는 관에 수집했다. 세포를 원심분리로 제거하고, 혈장 중 온전한 Fc-IL-7 융합 단백질의 농도를 표준 ELISA 과정을 이용하여 측정했다. 시험 마우스에 대한 ㎍/㎕ 로 한 Fc-IL-7 의 혈장 수준을 도 36 에 나타낸다. 마우스의 혈장은 시험한 모든 시점에서 투여량 의존성 Fc-IL-7 농도 증가를 나타냈으며, 각각의 투여에 이어 더욱 증가했다. 그러나, 도 37 에 나타낸 바와 같이, 증가의 규모는 각 투여 후 감소했다.

Fc-IL-7 의 관능 활성은 투여 개시 후 제 7 일째에 B 세포 및 T 세포에서의 증가를 측정하여 확인했다. IL-7 은 B 세포 및 T 세포와 같은 면역 효과기 세포의 생산을 부스팅하므로, 비장의 중량 및 세포충실도 (cellularity) 가 증가할 것으로 예상되었다. 마우스를 제 7 일째에 희생시키고, 장기를 취해 칭량했다. 도 38 은 제 7 일째의 평균 장기 중량을 보여준다. 예상한 바와 같이, 비장 중량은 초기 투여 1 주 후 3 내지 5 배 증가했다. 폐 중량은 림프구 침윤으로 인해 Fc-IL-7 의 2 배 더 많은 투여 후 2 배 더 증가했다. 신장 또는 간에서는 중량 변화가 없었다.

모든 군에서의 B 세포 (CD19+, CD4+, CD8+ 및 과립구 (Gr-1+)) 의 응답성은 제 7 일째에 관찰했다. 도 39 는 각 군의 2 마리의 마우스의 말초혈에서의 Gr-1⁺ 세포의 빈도를 보여준다. 데이터가 나타내듯이, 과립구는 일반적으로 Fc-IL-7 에 무응답성이다. 도 40 은 각 군의 2 마리의 마우스의 말초혈에서의 CD19⁺ 세포의 빈도를 보여준다. 도 41 은 각 군의 2 마리의 마우스의 말초혈에서의 CD4+ 세포의 빈도를 보여주며, 도 42 는 각 군의 2 마리의 마우스의 말초혈에서의 CD8+ 세포의 빈도를 보여준다. B 세포 (도 40) 및 T 세포 (도 41 및 42) 수의 증가는 대조군 및 0.5 mg/kg 투여군에 비해 T 세포 및 B 세포수의 현저한 증가를 보여주는 각각의 시험된 마우스가 있는 5 mg/kg 투여군에서 최대값이었다. 그러나, 25 mg/kg 투여군에서 마우스에 대해 T 세포수는 감소하거나 또는 증가했다. 세포의 모든 측정치는 혈액의 ㎕ 당 세포수로 나타낸다.

실시예 12. 인간 Fc - IL -7 활성 평가

실시예 11 에서 시험된 Fc-IL-7 융합 단백질의 생물학적 활성은 [Yokota 등, (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:5894; 및 Stern 등, (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6808-6812] 에 기재된 방법에 따라, 인간 IL-7 을 표준으로 이용하여 말초혈 단핵 세포 (PBMC) PHA 블라스트를 이용하는 표준 세포 증식 검정에서 삼중수소 티미딘 흡수로 측정되었다. 도 43 에 나타낸 바와 같이, Fc-IL-7 분자에 대한 삼중수소 티미딘의 흡수로 측정되는 세포 증식은 표준 NIBSC 인간 IL-7 (World Health Organization) 의 것과 유사하여, Fc-IL-7 분자의 활성이 야생형 인간 IL-7 와 유사하다는 것을 나타낸다.

등가물

본 발명은 그의 진의 또는 핵심적인 특징을 벗어나지 않고도 다른 특이적인 형태로 구현될 수 있다. 따라서, 제시되었던 구현예들은 본원에 기재된 본 발명을 제한하려는 의도라기 보다는 모두 설명의 측면으로 간주될 것이다. 따라서, 본 발명의 범위는 제시된 명세서보다는 첨부된 청구의 범위로 표시되며, 청구범위의 등가물의 의미 및 범위 내에서의 모든 변경들은 본원에 포함되는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> Gillies, Stephen D. 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Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu 50 55 60 Arg Gln Phe Leu Asp Asp Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu 65 70 75 80 Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Thr Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln 85 90 95 Gly Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys 100 105 110 Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp 115 120 125 Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn 130 135 140 Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 <210> 6 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding mature IL-7 with codon substitutions for F39P, F57N, and L128S. <400> 6 gattgtgata ttgagggtaa ggatggcaaa cagtacgaga gtgttctaat ggtgagcatc 60 gaccagttat tggacagcat gaaggagatt gggagcaatt gcctgaataa cgaacccaac 120 ttctttaaga gacacatctg cgatgccaat aaggaaggga tgtttttaaa ccgtgctgcc 180 cgcaagttga ggcaattcct taaaatgaac agcactggtg actttgatct ccacctgtta 240 aaagtttcag aaggcaccac aatcctgttg aactgcactg gccaggtgaa aggaaggaaa 300 cctgctgccc tgggtgaagc tcaaccaaca aagagtttgg aggagaataa atctttaaag 360 gaacagaaaa aactgaatga cagctgtttc ctaaagagac tactgcaaga gataaaaact 420 tgctggaata aaatcttgat gggcactaaa gaacac 456 <210> 7 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of mature IL-7 with codons for amino acid substitutions F39P, F57N, and L128S <400> 7 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 1 5 10 15 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 20 25 30 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Pro Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp 35 40 45 Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 50 55 60 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu 65 70 75 80 Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val 85 90 95 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Ser 115 120 125 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys 130 135 140 Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 <210> 8 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding mature IL-7 with codons for amino acid substitutions F39P, F57N, L77D, and L128S. <400> 8 gattgtgata ttgagggtaa ggatggcaaa cagtacgaga gtgttctaat ggtgagcatc 60 gaccagttat tggacagcat gaaggagatt gggagcaatt gcctgaataa cgaacccaac 120 ttctttaaga gacacatctg cgatgccaat aaggaaggga tgtttttaaa ccgtgctgcc 180 cgcaagttga ggcaattcct taaaatgaac agcactggtg actttgatga ccacctgtta 240 aaagtttcag aaggcaccac aatcctgttg aactgcactg gccaggtgaa aggaaggaaa 300 cctgctgccc tgggtgaagc tcaaccaaca aagagtttgg aggagaataa atctttaaag 360 gaacagaaaa aactgaatga cagctgtttc ctaaagagac tactgcaaga gataaaaact 420 tgctggaata aaatcttgat gggcactaaa gaacac 456 <210> 9 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of mature IL-7 with codons for amino acid substitutions F39P, F57N, L77D, and L128S. <400> 9 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 1 5 10 15 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 20 25 30 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Pro Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp 35 40 45 Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 50 55 60 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Asp His Leu Leu 65 70 75 80 Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val 85 90 95 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Ser 115 120 125 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys 130 135 140 Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 <210> 10 <211> 462 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding bacterially produced deimmunized IL-7, codon-optimized for E. coli with codons for amino acid substitutions K68D, M69D, I88T, V96G. <400> 10 atggactgcg acatcgaagg taaagacggc aaacagtacg aatccgttct gatggtttcc 60 atcgaccagc tgctggactc catgaaagaa atcggctcca actgcctgaa caacgaattc 120 aacttcttca aacggcacat atgcgacgct aacaaagaag gcatgttcct gttccgcgct 180 gctcgcaaac tgcgccagtt cctggatgat aactctaccg gtgacttcga cctgcacctg 240 ctgaaagttt ctgaaggtac tactaccctg ctgaactgca ctggccaggg taaaggccgc 300 aagccggccg ctctgggcga agctcagccg actaaatctc tagaagaaaa caaatccctg 360 aaagaacaga agaagctgaa cgacctgtgc ttcctgaaac gcctgctgca ggaaatcaaa 420 acttgctgga acaaaatcct gatgggcact aaagaacact ag 462 <210> 11 <211> 459 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding a mature deimmunized IL-7 variant with codons for amino acid substitutions K68D, M69D, I88T, V96G. <400> 11 gattgtgata ttgaaggtaa agatggcaaa caatatgaga gtgttctaat ggtcagcatc 60 gatcaattat tggacagcat gaaagaaatt ggtagcaatt gcctgaataa tgaatttaac 120 ttttttaaaa gacatatctg tgatgctaat aaggaaggta tgtttttatt ccgtgctgct 180 cgcaagttga ggcaatttct tgacgataat agcactggtg attttgatct ccacttatta 240 aaagtttcag aaggcacaac aaccctgttg aactgcactg gccagggcaa aggaagaaaa 300 ccagctgccc tgggtgaagc ccaaccaaca aagagtttgg aagaaaataa atctttaaag 360 gaacagaaaa aactgaatga cttgtgtttc ctaaagagac tattacaaga gataaaaact 420 tgttggaata aaattttgat gggcactaaa gaacactga 459 <210> 12 <211> 384 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid Sequence for Human Fcgamma1-IL-7. <400> 12 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp 225 230 235 240 Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu 245 250 255 Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn 260 265 270 Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu 275 280 285 Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr 290 295 300 Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile 305 310 315 320 Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu 325 330 335 Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys 340 345 350 Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln 355 360 365 Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 370 375 380 <210> 13 <211> 383 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid Sequence for Human Fcgamma2(h)(FN>AQ)-IL-7. <400> 13 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 35 40 45 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 50 55 60 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Ala 65 70 75 80 Gln Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp 85 90 95 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 100 105 110 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg 115 120 125 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 130 135 140 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 145 150 155 160 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 165 170 175 Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 180 185 190 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 195 200 205 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 210 215 220 Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly 225 230 235 240 Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp 245 250 255 Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe 260 265 270 Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe 275 280 285 Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly 290 295 300 Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu 305 310 315 320 Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly 325 330 335 Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu 340 345 350 Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu 355 360 365 Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 370 375 380 <210> 14 <211> 398 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid Sequence for Human Fcgamma1-(linker1)-IL-7 <400> 14 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 225 230 235 240 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys 245 250 255 Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser 260 265 270 Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe 275 280 285 Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg 290 295 300 Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp 305 310 315 320 Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu 325 330 335 Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu 340 345 350 Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln 355 360 365 Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile 370 375 380 Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 385 390 395 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A polypeptide linker. <400> 15 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 16 <211> 393 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid Sequence for Human Fcgamma1(YN>AQ)-(linker2)-IL-7. <400> 16 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Ala Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 225 230 235 240 Gly Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val 245 250 255 Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly 260 265 270 Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys 275 280 285 Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu 290 295 300 Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu 305 310 315 320 Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln 325 330 335 Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys 340 345 350 Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp 355 360 365 Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn 370 375 380 Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 385 390 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A polypeptide linker. <400> 17 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 18 <211> 391 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid Sequence for Human Fcgamma1(YN>AQ,d)-(linker2)-IL-7. <400> 18 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Ala Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Ala Thr Ala Thr Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp 225 230 235 240 Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met 245 250 255 Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn 260 265 270 Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala 275 280 285 Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln 290 295 300 Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu Lys 305 310 315 320 Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys 325 330 335 Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu 340 345 350 Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys 355 360 365 Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile 370 375 380 Leu Met Gly Thr Lys Glu His 385 390 <210> 19 <211> 911 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic Acid Sequence for Human Fcgamma1. <400> 19 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccaggtaa gccagcccag 60 gcctcgccct ccagctcaag gcgggacagg tgccctagag tagcctgcat ccagggacag 120 gccccagccg ggtgctgaca cgtccacctc catctcttcc tcagcacctg aactcctggg 180 gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac 240 ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa 300 ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta 360 caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg 420 caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat 480 ctccaaagcc aaaggtggga cccgtggggt gcgagggcca catggacaga ggccggctcg 540 gcccaccctc tgccctgaga gtgaccgctg taccaacctc tgtccctaca gggcagcccc 600 gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cacgggagga gatgaccaag aaccaggtca 660 gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca 720 atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct 780 tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct 840 catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc gccaccgcga 900 ccccgggcgc c 911 <210> 20 <211> 911 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic Acid Sequence for Human Fcgamma1(YN>AQ). <400> 20 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccaggtaa gccagcccag 60 gcctcgccct ccagctcaag gcgggacagg tgccctagag tagcctgcat ccagggacag 120 gccccagccg ggtgctgaca cgtccacctc catctcttcc tcagcacctg aactcctggg 180 gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac 240 ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa 300 ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcaggc 360 ccagagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg 420 caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat 480 ctccaaagcc aaaggtggga cccgtggggt gcgagggcca catggacaga ggccggctcg 540 gcccaccctc tgccctgaga gtgaccgctg taccaacctc tgtccctaca gggcagcccc 600 gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cacgggagga gatgaccaag aaccaggtca 660 gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca 720 atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct 780 tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct 840 catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc gccaccgcga 900 ccccgggcgc c 911 <210> 21 <211> 908 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic Acid Sequence for Human Fcgamma2(h). <400> 21 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccaggtaa gccagcccag 60 gcctcgccct ccagctcaag gcgggacagg tgccctagag tagcctgcat ccagggacag 120 gccccagctg ggtgctgaca cgtccacctc catctcttcc tcagcaccac ctgtggcagg 180 accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc 240 tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cccgaggtcc agttcaactg 300 gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccacgggagg agcagttcaa 360 cagcacgttc cgtgtggtca gcgtcctcac cgttgtgcac caggactggc tgaacggcaa 420 ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc 480 caaaaccaaa ggtgggaccc gcggggtatg agggccacat ggacagaggc cggctcggcc 540 caccctctgc cctgagagtg accgctgtac caacctctgt ccctacaggg cagccccgag 600 aaccacaggt gtacaccctg cccccatcac gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc 660 tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg 720 ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac ggctccttct 780 tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat 840 gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcgcc accgcgaccc 900 cgggcgcc 908 <210> 22 <211> 908 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic Acid Sequence for Human Fcgamma2(h)(FN>AQ). <400> 22 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccaggtaa gccagcccag 60 gcctcgccct ccagctcaag gcgggacagg tgccctagag tagcctgcat ccagggacag 120 gccccagctg ggtgctgaca cgtccacctc catctcttcc tcagcaccac ctgtggcagg 180 accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc 240 tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cccgaggtcc agttcaactg 300 gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccacgggagg agcaggccca 360 gagcacgttc cgtgtggtca gcgtcctcac cgttgtgcac caggactggc tgaacggcaa 420 ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc 480 caaaaccaaa ggtgggaccc gcggggtatg agggccacat ggacagaggc cggctcggcc 540 caccctctgc cctgagagtg accgctgtac caacctctgt ccctacaggg cagccccgag 600 aaccacaggt gtacaccctg cccccatcac gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc 660 tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg 720 ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac ggctccttct 780 tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat 840 gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcgcc accgcgaccc 900 cgggtgca 908 <210> 23 <211> 149 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for mature human deimmunized-IL-7.1. <400> 23 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 1 5 10 15 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Asp Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 20 25 30 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp 35 40 45 Ala Asn Lys Glu Gly Ala Phe Leu Lys Arg Ala Ser Glu Lys Leu Arg 50 55 60 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu 65 70 75 80 Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val 85 90 95 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu 115 120 125 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys 130 135 140 Ile Leu Lys Gly Ser 145 <210> 24 <211> 450 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding mature human deimmunized IL-7.1. <400> 24 gattgtgata ttgaaggtaa agatggcaaa caatatgaga gtgttctaat ggtcagcatc 60 gatcaattag acgacagcat gaaagaaatt ggtagcaatt gcctgaataa tgaatttaac 120 ttttttaaaa gacatatctg tgatgctaat aaggaaggtg cctttttaaa gcgtgcttcc 180 gagaagttga ggcaatttct taaaatgaat agcactggtg attttgatct ccacttatta 240 aaagtttcag aaggcacaac aatactgttg aactgcactg gccaggttaa aggaagaaaa 300 ccagctgccc tgggtgaagc ccaaccaaca aagagtttgg aagaaaataa atctttaaag 360 gaacagaaaa aactgaatga cttgtgtttc ctaaagagac tattacaaga gataaaaact 420 tgttggaata aaattttgaa aggcagctga 450 <210> 25 <211> 149 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for mature human deimmunized IL-7.2. <400> 25 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 1 5 10 15 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 20 25 30 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp 35 40 45 Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 50 55 60 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asn Asp His Leu Leu 65 70 75 80 Lys Val Ser Glu Gly Thr Gln Thr Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Gly 85 90 95 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Ser Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Val 115 120 125 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys 130 135 140 Ile Leu Lys Gly Ser 145 <210> 26 <211> 450 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding mature human deimmunized IL-7.2. <400> 26 gattgtgata ttgaaggtaa agatggcaaa caatatgaga gtgttctaat ggtcagcatc 60 gatcaattat tggacagcat gaaagaaatt ggtagcaatt gcctgaataa tgaatttaac 120 ttttttaaaa gacatatctg tgatgctaat aaggaaggta tgtttttatt ccgtgctgct 180 cgcaagttga ggcaatttct taaaatgaat agcactggtg attttaacga tcacttatta 240 aaagtttcag aaggcacaca gacactcttg aactgcactg gccagggcaa aggaagaaaa 300 ccagctgccc tgggtgaagc ccaaccaaca aagagtttgg aagaaaataa atcttctaag 360 gaacagaaaa aactgaatga cgtgtgtttc ctaaagagac tattacaaga gataaaaact 420 tgttggaata aaattttgaa aggcagctga 450 <210> 27 <211> 149 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for mature human deimmunized IL-7.3. <400> 27 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 1 5 10 15 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Asp Asp Ser Met Lys Glu Thr Gly Ser 20 25 30 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Pro Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp 35 40 45 Ala Asn Lys Glu Gly Ala Phe Leu Lys Arg Ala Ser Glu Lys Leu Arg 50 55 60 Gln Phe Leu Asp Asp Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Asp His Leu Leu 65 70 75 80 Lys Val Ser Glu Gly Thr Gln Thr Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Gly 85 90 95 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Ser Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Ala 115 120 125 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys 130 135 140 Ile Leu Lys Gly Ser 145 <210> 28 <211> 450 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding mature human DeI-IL-7.3. <400> 28 gattgtgata ttgaaggtaa agatggcaaa caatatgaga gtgttctaat ggtcagcatc 60 gatcaattag acgacagcat gaaagaaacc ggtagcaatt gcctgaataa tgaacctaac 120 ttttttaaaa gacatatctg tgatgctaat aaggaaggtg cctttttaaa gcgtgcttcc 180 gagaagttga ggcaatttct tgacgataat agcactggtg attttgatga ccacttatta 240 aaagtttcag aaggcacaca gacactcttg aactgcactg gccagggcaa aggaagaaaa 300 ccagctgccc tgggtgaagc ccaaccaaca aagagtttgg aagaaaataa atcttctaag 360 gaacagaaaa aactgaatga cgcctgtttc ctaaagagac tattacaaga gataaaaact 420 tgttggaata aaattttgaa aggcagctga 450 <210> 29 <211> 502 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence encoding GGGGSGGGG linker sequence following by mature human IL-7 containing the amino acid substitutions F39P, F57N, and L128S. <400> 29 cccgggtgct ggaggtggag gatcaggtgg tggcggtgat tgtgatattg agggtaagga 60 tggcaaacag tacgagagtg ttctaatggt gagcatcgac cagttattgg acagcatgaa 120 ggagattggg agcaattgcc tgaataacga acccaacttc tttaagagac acatctgcga 180 tgccaataag gaagggatgt ttttaaaccg tgctgcccgc aagttgaggc aattccttaa 240 aatgaacagc actggtgact ttgatctcca cctgttaaaa gtttcagaag gcaccacaat 300 cctgttgaac tgcactggcc aggtgaaagg aaggaaacct gctgccctgg gtgaagctca 360 accaacaaag agtttggagg agaataaatc tttaaaggaa cagaaaaaac tgaatgacag 420 ctgtttccta aagagactac tgcaagagat aaaaacttgc tggaataaaa tcttgatggg 480 cactaaagaa cactgactcg ag 502 <210> 30 <211> 1394 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of mature human Fcgamma2(h)(FN>AQ)-(linker2)-IL-7(F39P, F57N, L77D, L128S). <400> 30 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccaggtaa gccagcccag 60 gcctcgccct ccagctcaag gcgggacagg tgccctagag tagcctgcat ccagggacag 120 gccccagctg ggtgctgaca cgtccacctc catctcttcc tcagcaccac ctgtggcagg 180 accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc 240 tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cccgaggtcc agttcaactg 300 gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccacgggagg agcaggccca 360 gagcacgttc cgtgtggtca gcgtcctcac cgttgtgcac caggactggc tgaacggcaa 420 ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc 480 caaaaccaaa ggtgggaccc gcggggtatg agggccacat ggacagaggc cggctcggcc 540 caccctctgc cctgagagtg accgctgtac caacctctgt ccctacaggg cagccccgag 600 aaccacaggt gtacaccctg cccccatcac gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc 660 tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg 720 ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac ggctccttct 780 tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat 840 gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcgcc accgcgaccc 900 cgggtgctgg aggtggagga tcaggtggtg gcggtgattg tgatattgag ggtaaggatg 960 gcaaacagta cgagagtgtt ctaatggtga gcatcgacca gttattggac agcatgaagg 1020 agattgggag caattgcctg aataacgaac ccaacttctt taagagacac atctgcgatg 1080 ccaataagga agggatgttt ttaaaccgtg ctgcccgcaa gttgaggcaa ttccttaaaa 1140 tgaacagcac tggtgacttt gatgaccacc tgttaaaagt ttcagaaggc accacaatcc 1200 tgttgaactg cactggccag gtgaaaggaa ggaaacctgc tgccctgggt gaagctcaac 1260 caacaaagag tttggaggag aataaatctt taaaggaaca gaaaaaactg aatgacagct 1320 gtttcctaaa gagactactg caagagataa aaacttgctg gaataaaatc ttgatgggca 1380 ctaaagaaca ctga 1394 <210> 31 <211> 1394 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of mature human Fcgamma2(h)-(linker2)-IL-7(F39P, F57N, L128S). <400> 31 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccaggtaa gccagcccag 60 gcctcgccct ccagctcaag gcgggacagg tgccctagag tagcctgcat ccagggacag 120 gccccagctg ggtgctgaca cgtccacctc catctcttcc tcagcaccac ctgtggcagg 180 accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc 240 tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cccgaggtcc agttcaactg 300 gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccacgggagg agcagttcaa 360 cagcacgttc cgtgtggtca gcgtcctcac cgttgtgcac caggactggc tgaacggcaa 420 ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc 480 caaaaccaaa ggtgggaccc gcggggtatg agggccacat ggacagaggc cggctcggcc 540 caccctctgc cctgagagtg accgctgtac caacctctgt ccctacaggg cagccccgag 600 aaccacaggt gtacaccctg cccccatcac gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc 660 tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg 720 ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac ggctccttct 780 tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat 840 gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcgcc accgcgaccc 900 cgggtgctgg aggtggagga tcaggtggtg gcggtgattg tgatattgag ggtaaggatg 960 gcaaacagta cgagagtgtt ctaatggtga gcatcgacca gttattggac agcatgaagg 1020 agattgggag caattgcctg aataacgaac ccaacttctt taagagacac atctgcgatg 1080 ccaataagga agggatgttt ttaaaccgtg ctgcccgcaa gttgaggcaa ttccttaaaa 1140 tgaacagcac tggtgacttt gatctccacc tgttaaaagt ttcagaaggc accacaatcc 1200 tgttgaactg cactggccag gtgaaaggaa ggaaacctgc tgccctgggt gaagctcaac 1260 caacaaagag tttggaggag aataaatctt taaaggaaca gaaaaaactg aatgacagct 1320 gtttcctaaa gagactactg caagagataa aaacttgctg gaataaaatc ttgatgggca 1380 ctaaagaaca ctga 1394 <210> 32 <211> 1394 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of mature huFcgamma2(h)-(linker2)-IL-7(F39P, F57N, L77D, and L128S). <400> 32 gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccaggtaa gccagcccag 60 gcctcgccct ccagctcaag gcgggacagg tgccctagag tagcctgcat ccagggacag 120 gccccagctg ggtgctgaca cgtccacctc catctcttcc tcagcaccac ctgtggcagg 180 accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc 240 tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cccgaggtcc agttcaactg 300 gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccacgggagg agcagttcaa 360 cagcacgttc cgtgtggtca gcgtcctcac cgttgtgcac caggactggc tgaacggcaa 420 ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc 480 caaaaccaaa ggtgggaccc gcggggtatg agggccacat ggacagaggc cggctcggcc 540 caccctctgc cctgagagtg accgctgtac caacctctgt ccctacaggg cagccccgag 600 aaccacaggt gtacaccctg cccccatcac gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc 660 tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg 720 ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac ggctccttct 780 tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat 840 gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcgcc accgcgaccc 900 cgggtgctgg aggtggagga tcaggtggtg gcggtgattg tgatattgag ggtaaggatg 960 gcaaacagta cgagagtgtt ctaatggtga gcatcgacca gttattggac agcatgaagg 1020 agattgggag caattgcctg aataacgaac ccaacttctt taagagacac atctgcgatg 1080 ccaataagga agggatgttt ttaaaccgtg ctgcccgcaa gttgaggcaa ttccttaaaa 1140 tgaacagcac tggtgacttt gatgaccacc tgttaaaagt ttcagaaggc accacaatcc 1200 tgttgaactg cactggccag gtgaaaggaa ggaaacctgc tgccctgggt gaagctcaac 1260 caacaaagag tttggaggag aataaatctt taaaggaaca gaaaaaactg aatgacagct 1320 gtttcctaaa gagactactg caagagataa aaacttgctg gaataaaatc ttgatgggca 1380 ctaaagaaca ctga 1394 <210> 33 <211> 392 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of mature human Fcgamma2(h)(FN>AQ)-(linker2)-IL-7(F39P, F57N, L77D, L128S). <400> 33 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 35 40 45 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 50 55 60 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Ala 65 70 75 80 Gln Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp 85 90 95 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 100 105 110 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg 115 120 125 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 130 135 140 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 145 150 155 160 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 165 170 175 Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 180 185 190 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 195 200 205 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 210 215 220 Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 225 230 235 240 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 245 250 255 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 260 265 270 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Pro Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp 275 280 285 Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 290 295 300 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Asp His Leu Leu 305 310 315 320 Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val 325 330 335 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 340 345 350 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Ser 355 360 365 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys 370 375 380 Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 385 390 <210> 34 <211> 392 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of mature human Fcgamma2(h)(FN>AQ)-(linker2)-IL-7(F39P, F57N, L128S). <400> 34 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 35 40 45 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 50 55 60 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Ala 65 70 75 80 Gln Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp 85 90 95 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 100 105 110 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg 115 120 125 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 130 135 140 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 145 150 155 160 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 165 170 175 Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 180 185 190 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 195 200 205 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 210 215 220 Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 225 230 235 240 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 245 250 255 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 260 265 270 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Pro Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp 275 280 285 Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 290 295 300 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu 305 310 315 320 Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val 325 330 335 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 340 345 350 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Ser 355 360 365 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys 370 375 380 Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 385 390 <210> 35 <211> 392 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of mature human Fcgamma2(h)-(linker2)-IL-7(F39P, F57N, L77D, L128S). <400> 35 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 35 40 45 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 50 55 60 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 65 70 75 80 Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp 85 90 95 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 100 105 110 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg 115 120 125 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 130 135 140 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 145 150 155 160 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 165 170 175 Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 180 185 190 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 195 200 205 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 210 215 220 Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 225 230 235 240 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 245 250 255 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 260 265 270 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Pro Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp 275 280 285 Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 290 295 300 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Asp His Leu Leu 305 310 315 320 Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val 325 330 335 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 340 345 350 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Ser 355 360 365 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys 370 375 380 Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 385 390 <210> 36 <211> 392 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of mature human Fcgamma2(h) (linker2)-IL-7(F39P, F57N, L128S). <400> 36 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 35 40 45 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 50 55 60 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 65 70 75 80 Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp 85 90 95 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 100 105 110 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg 115 120 125 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 130 135 140 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 145 150 155 160 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 165 170 175 Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 180 185 190 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 195 200 205 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 210 215 220 Ala Thr Ala Thr Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 225 230 235 240 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 245 250 255 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 260 265 270 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Pro Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp 275 280 285 Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 290 295 300 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu 305 310 315 320 Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val 325 330 335 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 340 345 350 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Ser 355 360 365 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys 370 375 380 Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 385 390 <210> 37 <211> 152 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 1 5 10 15 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 20 25 30 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp 35 40 45 Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 50 55 60 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu 65 70 75 80 Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val 85 90 95 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu 115 120 125 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys 130 135 140 Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 <210> 38 <211> 126 <212> PRT <213> Pan troglodytes <400> 38 Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe 1 5 10 15 Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg 20 25 30 Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp 35 40 45 Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu 50 55 60 Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu 65 70 75 80 Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln 85 90 95 Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile 100 105 110 Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 115 120 125 <210> 39 <211> 152 <212> PRT <213> Papio sp. <400> 39 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 1 5 10 15 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 20 25 30 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Leu Cys Asp 35 40 45 Asp Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 50 55 60 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu 65 70 75 80 Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Lys Val 85 90 95 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Pro Gln Pro Thr Lys Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Ser 115 120 125 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Lys Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys 130 135 140 Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 <210> 40 <211> 152 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 40 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu 1 5 10 15 Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser 20 25 30 Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Leu Cys Asp 35 40 45 Asp Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg 50 55 60 Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu 65 70 75 80 Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Lys Val 85 90 95 Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Pro Gln Pro Thr Lys Ser 100 105 110 Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Ser 115 120 125 Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Lys Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys 130 135 140 Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 <210> 41 <211> 151 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 41 Asp Cys Asp Ile Ser Gly Lys Asp Gly Gly Ala Tyr Gln Asn Val Leu 1 5 10 15 Met Val Asn Ile Asp Asp Leu Asp Asn Met Ile Asn Phe Asp Ser Asn 20 25 30 Cys Leu Asn Asn Glu Pro Asn Phe Phe Lys Lys His Ser Cys Asp Asp 35 40 45 Asn Lys Glu Ala Ser Phe Leu Asn Arg Ala Ser Arg Lys Leu Arg Gln 50 55 60 Phe Leu Lys Met Asn Ile Ser Asp Asp Phe Lys Leu His Leu Ser Thr 65 70 75 80 Val Ser Gln Gly Thr Leu Thr Leu Leu Asn Cys Thr Ser Lys Gly Lys 85 90 95 Gly Arg Lys Pro Pro Ser Leu Ser Glu Ala Gln Pro Thr Lys Asn Leu 100 105 110 Glu Glu Asn Lys Ser Ser Lys Glu Gln Lys Lys Gln Asn Asp Leu Cys 115 120 125 Phe Leu Lys Ile Leu Leu Gln Lys Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile 130 135 140 Leu Arg Gly Ile Lys Glu His 145 150 <210> 42 <211> 151 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 42 Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Gly Val Tyr Gln Asn Val Leu 1 5 10 15 Met Val Ser Ile Asp Asp Leu Asp Arg Met Ile Asp Phe Asp Ser Asn 20 25 30 Cys Leu Asn Asn Glu Pro Asn Phe Leu Lys Lys His Ser Cys Asp Asp 35 40 45 Asn Lys Glu Ala Ser Phe Leu Tyr Arg Ala Ala Arg Lys Leu Lys Gln 50 55 60 Phe Ile Lys Met Asn Ile Ser Glu Glu Phe Asn His His Leu Ser Thr 65 70 75 80 Val Ser Gln Gly Thr Leu Thr Leu Phe Asn Cys Thr Ser Lys Val Lys 85 90 95 Gly Arg Lys Pro Pro Ser Leu Gly Glu Ala Gln Leu Thr Lys Asn Leu 100 105 110 Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Arg Gln Gly Asp Leu Cys 115 120 125 Phe Leu Lys Ile Leu Leu Gln Lys Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile 130 135 140 Leu Arg Gly Ala Lys Glu Tyr 145 150 <210> 43 <211> 151 <212> PRT <213> Ovis aries <400> 43 Asp Cys Asp Phe Ser Gly Lys Asp Gly Gly Ala Tyr Gln Asn Val Leu 1 5 10 15 Met Val Ser Ile Asp Asp Leu Asp Asn Met Ile Asn Phe Asp Ser Asn 20 25 30 Cys Leu Asn Asn Glu Pro Asn Phe Phe Lys Lys His Ser Cys Asp Asp 35 40 45 Asn Lys Glu Ala Ser Phe Leu Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Lys Gln 50 55 60 Phe Leu Lys Met Asn Ile Ser Asp Asp Phe Lys Leu His Leu Ser Thr 65 70 75 80 Val Ser Gln Gly Thr Leu Thr Leu Leu Asn Cys Thr Ser Lys Gly Lys 85 90 95 Gly Arg Lys Pro Pro Ser Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Asn Leu 100 105 110 Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Arg Lys Gln Asn Asp Leu Cys 115 120 125 Phe Leu Lys Ile Leu Leu Gln Lys Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile 130 135 140 Leu Arg Gly Ile Thr Glu His 145 150 <210> 44 <211> 129 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 44 Asp Cys His Ile Lys Asp Lys Asp Gly Lys Ala Phe Gly Ser Val Leu 1 5 10 15 Met Ile Ser Ile Asn Gln Leu Asp Lys Met Thr Gly Thr Asp Ser Asp 20 25 30 Cys Pro Asn Asn Glu Pro Asn Phe Phe Lys Lys His Leu Cys Asp Asp 35 40 45 Thr Lys Glu Ala Ala Phe Leu Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln 50 55 60 Phe Leu Lys Met Asn Ile Ser Glu Glu Phe Asn Asp His Leu Leu Arg 65 70 75 80 Val Ser Asp Gly Thr Gln Thr Leu Val Asn Cys Thr Ser Lys Glu Glu 85 90 95 Lys Thr Ile Lys Glu Gln Lys Lys Asn Asp Pro Cys Phe Leu Lys Arg 100 105 110 Leu Leu Arg Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Lys Gly Ser 115 120 125 Ile <210> 45 <211> 129 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 45 Glu Cys His Ile Lys Asp Lys Glu Gly Lys Ala Tyr Glu Ser Val Leu 1 5 10 15 Met Ile Ser Ile Asp Glu Leu Asp Lys Met Thr Gly Thr Asp Ser Asn 20 25 30 Cys Pro Asn Asn Glu Pro Asn Phe Phe Arg Lys His Val Cys Asp Asp 35 40 45 Thr Lys Glu Ala Ala Phe Leu Asn Arg Ala Ala Arg Lys Leu Lys Gln 50 55 60 Phe Leu Lys Met Asn Ile Ser Glu Glu Phe Asn Val His Leu Leu Thr 65 70 75 80 Val Ser Gln Gly Thr Gln Thr Leu Val Asn Cys Thr Ser Lys Glu Glu 85 90 95 Lys Asn Val Lys Glu Gln Lys Lys Asn Asp Ala Cys Phe Leu Lys Arg 100 105 110 Leu Leu Arg Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Lys Gly Ser 115 120 125 Ile <210> 46 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys 1 5 10 15 Ser Leu <210> 47 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal sequence of bacterially produced human IL-7 protein. <400> 47 Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys 1 5 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A T cell epitope present in IL-7 including position 70. <400> 48 Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A T-cell epitope present in IL-7 including position 70. <400> 49 Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A T-cell epitope present in IL-7 including position 70. <400> 50 Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe 1 5 <210> 51 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A T-cell epitope present in IL-7 including position 70. <400> 51 Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu 1 5 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A T-cell epitope present in IL-7 including position 91. <400> 52 Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val 1 5 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A T-cell epitope present in IL-7 including position 91. <400> 53 Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys 1 5 <210> 54 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A glycosylation site in Fc portion of IgG1. <400> 54 Gln Tyr Asn Ser 1 <210> 55 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A glycosylation site in Fc portion of IgG1. <400> 55 Gln Phe Asn Ser 1 <210> 56 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A glycosylation site in Fc portion of IgG1. <400> 56 Gln Ala Gln Ser 1 <210> 57 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A sequence near the C-terminus of Fc portion. <400> 57 Leu Ser Leu Ser 1 <210> 58 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A modified sequence near the C-terminus of the Fc portion. <400> 58 Ala Thr Ala Thr 1 <210> 59 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A tetanus toxin derived peptide. <400> 59 Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile 1 5 10 <210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A peptide containing a T-cell epitope. <400> 60 Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp 1 5 10 15 <210> 61 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A peptide containing a T-cell epitope. <400> 61 Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu 1 5 10 15 <210> 62 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A peptide containing a T-cell epitope. <400> 62 Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu 1 5 10 15 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A variant IL-7 peptide sequence. <400> 63 Leu Arg Gln Phe Leu Asp Asp Asn Ser 1 5 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A variant IL-7 peptide sequence. <400> 64 Thr Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Gly 1 5 <210> 65 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A peptide containing a T-cell epitope. <400> 65 Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu Cys 1 5 10 15 <210> 66 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A peptide containing a T-cell epitope. <400> 66 Cys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu 1 5 10 15 <210> 67 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A sequence containing a glycosylation site. <400> 67 Met Asn Ser Thr Gly 1 5 <210> 68 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A sequence containing a glycosylation site. <400> 68 Leu Asn Cys Thr Gly 1 5 <210> 69 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer M(s). <400> 69 tgactttgat gaccacctgt taaaagtttc 30 <210> 70 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer M(a). <400> 70 aacaggtggt catcaaagtc accagtgc 28 <210> 71 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Downstream primer. <400> 71 ctcgagtcag tgttctttag tgcccatc 28 <210> 72 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Upsteam primer. <400> 72 cccgggtgct ggaggtggag gatcaggtg 29

Claims (19)

1. 항-IL-7 T-세포 응답성이 감소되도록 개질된 T-세포 에피토프를 가진 개질된 인간 IL-7 분자 또는 그의 활성 부분을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 개질된 IL-7 이, Gln22, Leu24, Ile30, Phe39, Met54, Phe57, Arg58, Ala60, Arg61, Leu63, Lys68, Met69, Leu77, Ile88, Val96, Leu104, Leu128, Met147, Thr149, 또는 Lys150 에 해당하는 야생형 IL-7 의 하나 이상의 잔기에서의 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드.
2. 제 1 항에 있어서, 2 개 이상의 상기 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드.
3. 제 1 항에 있어서, 4 개 이상의 상기 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 치환이 잔기 Phe39, Phe57, Leu77 및 Leu128 의 하나 이상에서의 치환인 폴리펩티드.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기의 치환들 중 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드: Gln22Asp, Leu24Asp, Ile30Thr, Phe39Pro, Met54Ala, Phe57Lys, Phe57Asn, Arg58Asp, Ala60Ser, Arg61Glu, Leu77Asp, Leu104Ser, Leu104Val, Leu128Ala, Leu128Val, Leu128Pro, Leu128Ser, Met147Lys, Thr149Ser, 또는 Lys150Stop.
6. 제 5 항에 있어서, 치환 Phe39Pro, Phe57Asn, Leu77Asp 및 Leu128Ser 의 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드.
7. 제 6 항에 있어서, 치환 Phe39Pro, Phe57Asn, Leu77Asp 및 Leu128Ser 을 포함하는 폴리펩티드.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 인간 야생형 IL-7 와 80% 이상 일치하는 폴리펩티드.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 상기 개 질된 IL-7 분자 또는 그의 활성 절편에 융합된 면역글로불린 분자 또는 그의 일부를 추가로 포함하는 폴리펩티드.
10. 제 9 항에 있어서, 상기 면역글로불린 분자 또는 그의 일부가 그의 C-말단을 통해 상기 개질된 IL-7 분자 또는 그의 활성 절편의 N-말단으로 융합되는 폴리펩티드.
11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 상기 면역글로불린 분자가 인간 면역글로불린인 폴리펩티드.
12. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 분자가 IgG2 인 폴리펩티드.
13. 제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린이 Fc 부분인 폴리펩티드.
14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자.
15. 제 14 항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
16. 제 15 항의 발현 벡터를 포함하는 원핵 세포.
17. 암 질환 또는 HIV 치료용 의약 제조를 위한 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 용도.
18. 제 17 항에 있어서, 환자에게 투여되는 폴리펩티드의 유효량이 0.01 내지 10 mg/kg/일인 용도.
19. 치료 유효량의 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 환자에게 투여함으로써, 암 질환 또는 HIV 를 앓는 환자를 치료하는 방법.

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