JP2017508446A - 二機能性融合タンパク質及びその製造方法並びに使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、CTLA4の細胞外ドメインと、抗IL−17抗体とを含有する二機能性融合タンパク質、当該タンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を含有するベクター、当該ベクターを含有する宿主細胞及び当該タンパク質を含有する医薬組成物を提供する。
Description
本発明は、二機能性融合タンパク質及びその製造方法並びに使用に関し、特に、B7/CD28シグナル経路と、IL−17A/IL−17RAシグナル経路を同時に遮断することが可能である二機能性組換え融合タンパク質、当該二機能性融合タンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を含有するベクター、当該ベクターを含有する宿主細胞及び当該二機能性融合タンパク質を含有する医薬組成物に関わる。
T細胞の機能を調節・制御することは、慢性炎症を治療する有効な方法の一つと見なされている。細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4(cytotoxic T lymphocyte−associated antigen 4,CTLA4)は、CD152とも称され、白血球分化抗原の一種である。CTLA4とCD28の配位子はいずれもB7分子であり、CTLA4とB7分子との結合によって、T細胞は無反応状態になりつつ免疫反応の負の調節に関与することになる。2005年から市販されるようになった、関節リウマチの治療用のアバタセプト(abatacept,商品名:OrenciaTM,ブリストル・マイヤーズ スクイブ株式会社製)は、単機能性融合タンパク質の一種であり、2つのCTLA4分子の細胞外ドメイン(extracellular domain,ECD)とヒトIgG1のFc領域とが結合してなり、競合的にB7とCD28との結合を遮断して、T細胞の増殖及び活性化を抑制するものである(Genovese MC, BeckerJC, SchiffM, et al.N.Engl.J.Med., 2005, 353:1114−1123)。
インターロイキン17A(IL−17又はIL−17A)は、炎症促進性サイトカインの一種であり、主としてTh17細胞から産生され、IL−17ファミリーのうち最も代表的なメンバーである(Miossec P, Kolls JK.Nat.Rev.Drug.Discov., 2012, 11:763−776)。IL−17Aとそのアクセプター(受容体)(IL−17RA)とが結合すると、多種の細胞(例えば、線維芽細胞、上皮細胞及び内皮細胞)における炎症性サイトカイン及びケモカインの発現を誘導することが可能であり、有機体の免疫防御において重要な役割を果たしている(Lin Y, Ritchea S, Logar A.Immunity, 2009, 31:799−810)。しかしながら、過度に高いレベルで発現するIL−17Aは、炎症性疾患を引き起こす可能性がある。関節リウマチ患者の滑膜組織には、IL−17Aが高発現して、重要な炎症性サイトカイン−インターロイキン6が生じるようになるものの、当該作用がIL−17A中和抗体によって抑制されることが可能である(Chabaud M, Durand JM, Buchs N, et al.Arthritis Rheum.1999, 42:963−70)。自己免疫疾患の動物モデルを用いた多数の実験によれば、抗体を用いてIL−17Aを中和することで、炎症の病態進展を効率的に抑制することが可能である(Lubberts E, Koenders MI, Oppers−Walgreen B, et al.Arthritis Rheum., 2004, 50:650−659)。販売が許可された市販のIL−17Aに関する抗体薬物がないのが現状であるものの、3つの薬物が臨床研究の段階にあり、それぞれ、Secukinumab(IL−17A標的抗体)、Ixekizumab(IL−17A標的抗体)及びBrodalumab(IL−17RA標的抗体)である。しかしながら、薬物の臨床研究の結果によれば、関節リウマチの如く一部の慢性炎症性疾患に対して、これらの薬物は所期の治療効果を奏しないことが明らかになった(Kellner H, TherAdvMusculoskelet Dis., 2013, 5:141−152)。従って、薬物の併用投与という治療モードを利用することで、関節リウマチの如く一部の慢性炎症性疾患の患者の臨床的利益を向上する可能性がある。
併用投与では、2種若しくは多種の抗体を順次に注射したり、または抗体を同種の剤型とする必要がある。しかしながら、抗体を順次に注射すると患者の治療に対するコンプライアンスを低下させて痛みを増加させる。一方、抗体によって物理化学的性質に差異があるため、異なる抗体を同種の剤型とすることは困難であるか、または可能性が殆どない。
そこで、B7/CD28シグナル経路と、IL−17A/IL−17RAシグナル経路を同時に遮断できる新型治療薬を研究する必要性は依然として存在している。
本発明は、B7/CD28シグナル経路と、IL−17A/IL−17RAシグナル経路を同時に遮断できる二機能性融合タンパク質、当該二機能性融合タンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を含有するベクター、当該ベクターを含有する宿主細胞及び当該二機能性融合タンパク質を含有する医薬組成物を提供する。
本発明の第1の態様は、CTLA4分子の細胞外ドメインと、IL−17の活性を中和する機能的断片とを含有する、二機能性融合タンパク質に関わる。一つの実施形態では、前記IL−17はIL−17Aである。
一つの実施形態では、前記二機能性融合タンパク質は結合ペプチドをさらに含有する。なお、前記CTLA4分子の細胞外ドメインは、結合ペプチドを介してIL−17の活性を中和する機能的断片のN末端またはC末端に結合される。一つの実施形態では、前記結合ペプチドのアミノ酸配列の長さは、1−25個のアミノ酸であり、例えば、20、21、22、23、24または25個のアミノ酸である。例えば、前記結合ペプチドは、配列番号3で示されるアミノ酸配列である。
一つの実施形態では、IL−17の活性を中和する機能的断片は、抗IL−17抗体またはその機能的断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体である。一つの実施形態では、CTLA4分子の細胞外ドメインは、結合ペプチドを介して抗IL−17抗体の重鎖または軽鎖のN末端に結合される。一部の実施形態では、抗IL−17抗体は、IgG、IgA、IgD、IgE、IgM抗体またはこれらのハイブリッドである。一部の実施形態では、抗IL−17抗体はIgG抗体である。
一つの実施形態では、前記CTLA4分子の細胞外ドメインは、配列番号2で示されるアミノ酸配列若しくはその機能的断片、または上記で示される配列において1個若しくは数個(例えば、2、3、4、5、10、15、20、30、50個)アミノ酸残基が置換、欠失若しくは付加された、同一機能を有するアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも70%(例えば、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%程度)の同一性を有し、かつ同一機能を有するアミノ酸配列、を含有する。
一つの実施形態では、前記抗IL−17抗体の重鎖配列は、配列番号28で示されるアミノ酸配列、または上記で示される配列において1個若しくは数個(例えば、2、3、4、5、10、15、20、30、50個)アミノ酸残基が置換、欠失若しくは付加された、同一機能を有するアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも70%(例えば、少なくとも、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%程度)の同一性を有し、かつ同一機能を有するアミノ酸配列、を含有する。前記抗IL−17抗体の軽鎖配列は、配列番号27で示されるアミノ酸配列、または上記で示される配列において1個若しくは数個(例えば、2、3、4、5、10、15、20、30、50個)アミノ酸残基が置換、欠失若しくは付加された、同一機能を有するアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも70%(例えば、少なくとも、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%程度)の同一性を有し、かつ同一機能を有するアミノ酸配列、を含有する。
一つの実施形態では、配列番号2で示されるCTLA4分子の細胞外ドメインは、配列番号3で示される結合ペプチドを介して配列番号4若しくは12で示される抗IL−17抗体の重鎖配列のN末端、または配列番号5若しくは13で示される抗IL−17抗体の軽鎖配列のN末端に結合される。
一つの実施形態では、配列番号2で示されるCTLA4分子の細胞外ドメインは、配列番号3で示される結合ペプチドを介して配列番号4若しくは12で示される抗IL−17抗体の重鎖配列のC末端、または配列番号5若しくは13で示される抗IL−17抗体の軽鎖配列のC末端に結合される。
一つの実施形態では、前記二機能性融合タンパク質を構成するアミノ酸配列は、配列番号5及び6、配列番号13及び14、配列番号4及び19、配列番号24及び25、配列番号26及び27、または上記で示される配列において1個若しくは数個(例えば、2、3、4、5、10、15、20、30、50個)アミノ酸残基が置換、欠失若しくは付加された、同一機能を有するアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも70%(例えば、少なくとも、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%程度)の同一性を有し、かつ同一機能を有するアミノ酸配列からなる群から選ばれる配列である。
本発明の第2の態様は、前記で示される二機能性融合タンパク質のコード遺伝子に関わる。
一つの実施形態では、前記コード遺伝子は、配列番号7及び8、または配列番号15及び16で示されるヌクレオチド配列を含有する。
一部の実施形態では、前記ベクターにおける軽鎖と重鎖をコードするヌクレオチド配列は異なる発現カセットに存在している。
本発明の第3の態様は、機能可能なように結合された上記のコード遺伝子を含有する組換えベクターに関わる。
一部の実施形態では、前記ベクターは真核細胞発現ベクターである。一部の実施形態では、前記ベクターは、改造したことで得られた、2つの表現カセットを有するベクターX0GCである。
本発明の第4の態様は、上記の組換えベクターを含有する宿主細胞に関わる。
本発明の第5の態様は、上記の二機能性融合タンパク質を製造する方法に関わる。当該製造方法は、
上記のコード遺伝子を真核発現ベクターに機能可能なように結合し、それを宿主細胞内にトランスフェクションして発現させる、または上記の組換えベクターを宿主細胞内にトランスフェクションして発現させるステップと、
前記の二機能性融合タンパク質を精製するステップとを含む。
一つの実施形態では、前記真核発現ベクターはX0GCである。一つの実施形態では、前記宿主細胞は、HEK293−TまたはCHO細胞である。
前記の二機能性融合タンパク質を精製するステップとを含む。
一つの実施形態では、前記真核発現ベクターはX0GCである。一つの実施形態では、前記宿主細胞は、HEK293−TまたはCHO細胞である。
本発明の第6の態様は、上記の宿主細胞を適宜な発現条件下で培養し、発現されたタンパク質を分離・精製することを含む、上記の二機能性融合タンパク質を生産する方法に関わる。
本発明の第7の態様は、上記の二機能性融合タンパク質、または上記の方法によって得られる二機能性融合タンパク質を含む医薬組成物に関わる。
一つの実施形態では、上記の二機能性融合タンパク質または上記の医薬組成物は、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、多発性硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、糸球体腎炎、特発性血小板減少性紫斑病、原発性シェーグレン症候群、痛風、または臓器移植の予防、治療または改善のために用いられる。
別の実施形態では、上記の二機能性融合タンパク質または上記の医薬組成物は、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病の予防、治療または改善のために用いられる。
本発明の第8の態様は、上記の二機能性融合タンパク質、上記の方法によって得られる二機能性融合タンパク質または上記の医薬組成物の、疾患の予防、治療または改善のための薬物の製造における使用に関わる。
一つの実施形態では、前記疾患は、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、多発性硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、糸球体腎炎、特発性血小板減少性紫斑病、原発性シェーグレン症候群、痛風、または臓器移植である。
本発明の第9の態様は、治療有効量の上記の二機能性融合タンパク質、上記の方法によって得られる二機能性融合タンパク質、または上記の医薬組成物を必要とする被験者に投与するステップを含む、疾患を予防、治療または改善する方法に関わる。
一つの実施形態では、前記疾患は、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、多発性硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、糸球体腎炎、特発性血小板減少性紫斑病、原発性シェーグレン症候群、痛風、または臓器移植である。
本発明の第10の態様は、上記の二機能性融合タンパク質、上記の核酸分子、上記のベクター、または上記の宿主細胞を含むキットに関わる。
本発明によれば、次のような利点を有する。
本発明の実験結果から明らかなように、本発明にかかる二機能性融合タンパク質は、発現量が高くて、インビトロ実験において炎症性サイトカインの分泌を強く抑制し、動物モデルに対して関節炎症の進展を効果的に抑制できる。当業者に知られているように、作用メカニズムの異なる幾つかの薬物を併用する、または融合して使用することによって、拮抗、無関係、相加または相乗などの異なる効果が現れる可能性がある。二種類以上の薬物を併用する、または融合して使用することによって、どのような相互作用が現れるかについて、具体的な実験研究を通じ、大量な労力を費やしたことだけで確定できる。従来技術では、CTLA4分子と抗IL−17抗体を組み合わせて関節リウマチを治療する可能性があるものの、ヒトの有機体が複雑なものであるため、特に、関節リウマチのような病因が極めて複雑で完全に明確になっていない全身性や免疫性疾患に対して、薬物を併用したり、または融合して使用したとしても、作用メカニズムの異なる各薬物による治療効果の完全な相加または相乗効果を実現することが殆どなく、多くの場合は、無関係、さらに拮抗効果が現れる。本発明にかかる二機能性融合タンパク質は、関節リウマチに対して強化された治療効果を達成するため、関節リウマチの患者、特に中重度の関節リウマチの患者に、治療効果がより一層優れている可能性のある薬物候補を提供する。また、本発明にかかる二機能性融合タンパク質は、関節リウマチを治療するための2つの異なるターゲットに対して同時に作用し、単一ターゲットの場合での治療失敗または効果不良の確率を低減して、経済的に重要な意味を持ちつつ、社会効果を有する。本発明は、単一機能のタンパク質(例えば、CTLA4−Fc)を使用した場合に較べて、生産コストを低減し、臨床上で投与のボリュームと頻度を減少し、被験者のコンプライアンスを向上させることが可能であり、免疫性疾患の予防及び治療にきわめて広い応用前景がある。
本発明の実験結果から明らかなように、本発明にかかる二機能性融合タンパク質は、発現量が高くて、インビトロ実験において炎症性サイトカインの分泌を強く抑制し、動物モデルに対して関節炎症の進展を効果的に抑制できる。当業者に知られているように、作用メカニズムの異なる幾つかの薬物を併用する、または融合して使用することによって、拮抗、無関係、相加または相乗などの異なる効果が現れる可能性がある。二種類以上の薬物を併用する、または融合して使用することによって、どのような相互作用が現れるかについて、具体的な実験研究を通じ、大量な労力を費やしたことだけで確定できる。従来技術では、CTLA4分子と抗IL−17抗体を組み合わせて関節リウマチを治療する可能性があるものの、ヒトの有機体が複雑なものであるため、特に、関節リウマチのような病因が極めて複雑で完全に明確になっていない全身性や免疫性疾患に対して、薬物を併用したり、または融合して使用したとしても、作用メカニズムの異なる各薬物による治療効果の完全な相加または相乗効果を実現することが殆どなく、多くの場合は、無関係、さらに拮抗効果が現れる。本発明にかかる二機能性融合タンパク質は、関節リウマチに対して強化された治療効果を達成するため、関節リウマチの患者、特に中重度の関節リウマチの患者に、治療効果がより一層優れている可能性のある薬物候補を提供する。また、本発明にかかる二機能性融合タンパク質は、関節リウマチを治療するための2つの異なるターゲットに対して同時に作用し、単一ターゲットの場合での治療失敗または効果不良の確率を低減して、経済的に重要な意味を持ちつつ、社会効果を有する。本発明は、単一機能のタンパク質(例えば、CTLA4−Fc)を使用した場合に較べて、生産コストを低減し、臨床上で投与のボリュームと頻度を減少し、被験者のコンプライアンスを向上させることが可能であり、免疫性疾患の予防及び治療にきわめて広い応用前景がある。
本発明は、CTLA4分子の細胞外ドメインと、IL−17の活性を中和する機能的断片とを含有する、二機能性融合タンパク質を提供することを目的の一つとする。CTLA4分子の細胞外ドメインと、IL−17の活性を中和する機能的断片とが有効的に結合され、各々の空間構造が保たれつつ各々の生理活性が発揮されている。前記CTLA4分子の細胞外ドメインとIL−17の活性を中和する機能的断片を、各々の機能に影響を及ぼさずに直接に融合することが可能である。且つ、CTLA4分子の細胞外ドメインがIL−17の活性を中和する機能的断片のN末端またはC末端に結合される。それらの間に他のインターバル配列、例えば結合ペプチドを付加してもよい。
当業者に知られているように、本発明において前記二機能性融合タンパク質を限定する時に使用する用語は「含む」であるが、前記二機能性融合タンパク質にはその機能と関係のない他の配列を任意に追加可能であることを意味するものでもない。前記二機能性融合タンパク質の如く、複雑な構成を持つ融合タンパク質を製造する場合、融合タンパク質の各構成成分の空間構造、生物活性、細胞発現レベルを保証し、さらに前記各種の構成成分を適切に融合したり、または前記融合タンパク質の耐加水分解性を増強させるために、当業者は、前記融合タンパク質を製造する時に、必要に応じて各構成成分間にまたは前記融合タンパク質の両端に一つまたは複数の余分のアミノ酸残基を追加する。従って、閉鎖式の表現を用いて前記二機能性融合タンパク質を限定することは、これらの状況を忠実にカバーすることができないようになる。
本発明に用いられる技術用語である「CTLA4分子の細胞外ドメイン」とは、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4(cytotoxic T lymphocyte−associated antigen 4,CTLA4)の細胞外ドメインを意味する。ある実施形態では、ヒトCTLA4タンパク質の細胞外ドメイン(ECD)配列は、配列番号2で示されるものであり、ヒトCTLA4タンパク質の第37−161位アミノ酸配列(Genbank 登録号NM_005214.4)である。
一部の実施形態では、本発明に用いられる技術用語「IL−17の活性を中和する機能的断片」とは、IL−17を標的とする免疫グロブリンまたはその修飾物、機能的等価物、機能的断片または変異体を意味する。ある実施形態では、IL−17の活性を中和する機能的断片は、IL−17を標的とするIgG抗体である。ある実施形態では、IgGはキメラIgG、ヒト化IgGまたは完全ヒトIgGである。ある実施形態では、前記修飾物は、IL−17を標的とする性能が維持される限り、アシル化、アルキル化、PEG化産物の如く化学修飾物であることは可能である。ある実施形態では、前記機能的等価物とは、IL−17を標的とする前記免疫グロブリンの能力を実現できるその他のポリペプチド断片を意味する。ある実施形態では、前記機能的断片は、IL−17を標的とする能力を維持しているタンパク質断片であり、例えば、単一ドメイン抗体、単鎖抗体、単鎖可変断片(scFv)、Fab断片またはF(ab’)2断片である。ある実施形態では、前記変異体は、一つまたは複数(幾つか)の位置において1つまたは複数の改変、即ち、置換、挿入及び/又は欠失によって親タンパク質に由来するポリペプチドである。
ある実施形態では、前記結合断片の長さは5−30個のアミノ酸である。ある実施形態では、前記結合断片の長さは25個のアミノ酸である。ある実施形態では、前記結合断片の配列は、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSである。本発明に用いられる結合断片は、融合タンパク質の2つの構成成分の間隔として機能し、各構成成分がそれぞれ空間構造を的確に形成して、生物活性、細胞発現レベルを維持できる限り、特に制限されるものではない。
ある実施形態では、前記二機能性融合タンパク質を構成するアミノ酸配列は、配列番号5及び6、配列番号13及び14、配列番号4及び19、配列番号24及び25、配列番号26及び27、または上記で示される配列において1個若しくは数個(例えば、1、2、3、4、5、10、15、20、30、50個)アミノ酸残基が置換、欠失若しくは付加された、同一機能を有するアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも70%(例えば、少なくとも、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%程度)の同一性を有し、かつ同一機能を有するアミノ酸配列からなる群から選ばれる配列である。アミノ酸の保守アミノ酸は、本分野で公知のものである。
本発明に用いられる技術用語である「同一性」は、本分野での一般的に知られている意味を有する。異なる配列間の同一性を測定する規則、標準は当業者にもよく知られているものである。本発明において異なる程度の同一性で限定された配列は、CTLA4分子の細胞外ドメインやIL−17の活性を中和することを同時に有する必要がある。如何に上記した活性を用いて変異体配列を選別する方法及び手段は当業者に知られているものである。当業者は、本願の開示内容中の示唆によりこのような変異体配列を容易に取得することが可能である。
一つの実施形態では、本発明は、上記の二機能性融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有するコード遺伝子に関わる。
当業者に知られているように、本発明において、前記コード遺伝子を限定する時に使用する用語は「含有する」であるが、前記コード遺伝子の両端にはその機能と関係のない他の配列を任意に追加可能であることを意味するものでもない。当業者に知られているように、組換えの操作に対する要求を満たすために、前記コード遺伝子の両端に適切な制限エンドヌクレアーゼの切断部位を追加したり、または開始コドン、終止コドンなどを余分に増加する必要がある。従って、閉鎖式の表現を用いて前記コード遺伝子を限定することは、これらの状況を忠実にカバーすることができないようになる。
当業者に知られているように、コードされるアミノ酸を変更しない場合、前記コード遺伝子配列における一つまたは複数のコドン(例えば、一つまたは幾つかのコドン、1、2、3、4、5、6、8、9、10、15、20、30、40、50個のコドン)を同義コドンで置換することが可能である。コドン使用表は本分野で公知のものである。
一つの実施形態では、本発明は、機能可能なように結合された上記のコード遺伝子を含有する組換えベクターに関わる。前記組換えベクターは、組換え発現ベクターであり、原核発現ベクターでもよいし、真核発現ベクターでもよいが、好ましくは、真核発現ベクターであり、より好ましくは、哺乳動物における真核発現に用いられる組換え発現ベクターである。
本発明に用いられる技術用語である「機能可能なように結合」とは、前記コード遺伝子の複製、転写または発現が的確かつ順調にできるように、前記コード遺伝子をベクターの適切な部位に結合させる、というような結合方式を意味する。
一つの実施形態では、本発明は、上記の組換えベクターによってトランスフォーメーションされ、またはトランスフェクションされた宿主細胞に関わる。前記宿主細胞は、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞を含む。
一つの好適な実施形態では、前記宿主細胞は、CHO細胞、HEK293細胞、NSO細胞及びSP2/0細胞を含む。
一つの実施形態では、本発明は、前記二機能性融合タンパク質を生産する方法に関わる。当該生産方法は、適宜なポリペプチド発現条件下で上記の宿主細胞を培養して、細胞培地から発現したポリペプチドを分離・精製することを含む。好ましくは、前記精製後のポリペプチドの純度は50%より大きい。より好ましくは、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%または99.9%より大きい。
一つの実施形態では、本発明は、上記の二機能性融合タンパク質と、薬学的に受容可能なベクターとを含有する医薬組成物に関わる。前記二機能性融合タンパク質は、前記医薬組成物の唯一の有効成分であってもよく、有効成分の一つであってもよい。その他の有効成分は、前記二機能性融合タンパク質と組み合わて使用可能な他の治療剤である。
一つの好適な実施形態では、本発明の医薬組成物は、単回投与剤型、局所投与剤型及び全身投与剤型を含む。
一つの実施形態では、本発明にかかる前記の二機能性融合タンパク質または上記の医薬組成物は、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、多発性硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、糸球体腎炎、特発性血小板減少性紫斑病、原発性シェーグレン症候群、痛風、または臓器移植の予防、治療または改善のために用いられる。一部の実施形態では、前記の二機能性融合タンパク質または上記の医薬組成物は、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病の予防、治療または改善のために用いられる。
一部の実施形態では、本発明は、治療有効量の上記の二機能性融合タンパク質、上記の方法によって生産される二機能性融合タンパク質または上記の医薬組成物を必要とする被験者に投与するステップを含む、疾患を予防、治療または改善する方法に関わる。
一つの実施形態では、前記疾患は、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、多発性硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、糸球体腎炎、特発性血小板減少性紫斑病、原発性シェーグレン症候群、痛風、または臓器移植である。
本発明に用いられる技術用語である「治療有効量」とは、投与時に被験者の体内に薬理作用を奏することができる剤量を意味する。「治療有効量」は、患者の年齢、体重、疾患状態などに応じて当業者によって容易に決定されるものである。
一つの実施形態では、本発明は、上記の二機能性融合タンパク質、上記の方法によって得られる二機能性融合タンパク質または上記の医薬組成物の、疾患の予防、治療または改善のための薬物の製造における使用に関わる。
一つの実施形態では、前記疾患は、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、多発性硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、糸球体腎炎、特発性血小板減少性紫斑病、原発性シェーグレン症候群、痛風、または臓器移植である。
当業者に知られているように、上述した内容において本発明にかかる二機能性融合タンパク質によって予防、治療または改善可能な病状が挙げられているものの、本発明にかかる二機能性融合タンパク質によって対応可能な病状は上述した具体的な病状のみに限定されるものでもなく、B7/CD28シグナル経路とIL−17A/IL−17RAシグナル経路を同時に遮断することで予防、治療または改善のメリットが得られる病状はいずれも本発明の保護範囲内に含まれる。
本発明の上記の技術案によれば、本発明は下記のような優れた効果を有する。
1)CTLA4タンパク質の細胞外ドメインと抗IL−17抗体をそれぞれ生産するのに対して、B7とIL−17Aとの二つのシグナル経路を遮断する分子(ヒトCTLA4の細胞外ドメインと抗IL−17抗体)を一つの分子に融合して発現・生産することで、操作方法及び生産コストを大幅に軽減した。
2)ヒトCTLA4タンパク質の細胞外ドメインと抗IL−17抗体とを結合してなる目標タンパク質は、4量体構造であり、よって、CTLA4の細胞外ドメインが活性を発揮するのに2量体構造が必要であるという要求を満たすばかりでなく、抗IL−17A抗体の力価を依然として2価に維持する。従って、目標タンパク質の総力価は3価である。なお、結合様式のスクリーニング比較及びインビトロの結合実験により、本発明における有効な結合様式は、CTLA4分子の細胞外ドメインとその配位子B7との結合、及び抗IL−17抗体とIL−17との結合には影響を及ぼさないことが示された。
3)本発明にかかる二機能性タンパク質は、更なる改造によって、キメラ体またはヒト化類似体を形成し、その結合活性を保ちつつ免疫原性をさらに低下させた。
4)疾患モデル実験結果から明らかなように、二機能性融合タンパク質は疾患動物モデルの炎症反応を効果的に軽減することができた。
1)CTLA4タンパク質の細胞外ドメインと抗IL−17抗体をそれぞれ生産するのに対して、B7とIL−17Aとの二つのシグナル経路を遮断する分子(ヒトCTLA4の細胞外ドメインと抗IL−17抗体)を一つの分子に融合して発現・生産することで、操作方法及び生産コストを大幅に軽減した。
2)ヒトCTLA4タンパク質の細胞外ドメインと抗IL−17抗体とを結合してなる目標タンパク質は、4量体構造であり、よって、CTLA4の細胞外ドメインが活性を発揮するのに2量体構造が必要であるという要求を満たすばかりでなく、抗IL−17A抗体の力価を依然として2価に維持する。従って、目標タンパク質の総力価は3価である。なお、結合様式のスクリーニング比較及びインビトロの結合実験により、本発明における有効な結合様式は、CTLA4分子の細胞外ドメインとその配位子B7との結合、及び抗IL−17抗体とIL−17との結合には影響を及ぼさないことが示された。
3)本発明にかかる二機能性タンパク質は、更なる改造によって、キメラ体またはヒト化類似体を形成し、その結合活性を保ちつつ免疫原性をさらに低下させた。
4)疾患モデル実験結果から明らかなように、二機能性融合タンパク質は疾患動物モデルの炎症反応を効果的に軽減することができた。
以下、本発明を制限的ではない実施例により、さらに具体的に説明する。当業者に知られているように、本発明は、その趣旨を逸脱しない範囲で様々な形態に変形して実施することができる。このような変形も本発明の範囲内に入る。
特に断らない限り、下記の実験方法は通常のものであり、実験で使用される実験材料は販売会社から容易に購入できるものである。
特に断らない限り、下記の実験方法は通常のものであり、実験で使用される実験材料は販売会社から容易に購入できるものである。
実施例
実施例1:二機能性融合タンパク質A発現ベクターの構築
(1)二機能性融合タンパク質Aのアミノ酸及びコードヌクレオチド配列
二機能性融合タンパク質Aを発現させるために用いられるシグナルペプチド配列は、配列番号1で示されるものである。ヒトCTLA4タンパク質の細胞外ドメイン(ECD)配列は、配列番号2で示されるものであり、ヒトCTLA4タンパク質における第37−161位のアミノ酸配列(Genbank 登録番号NM_005214.4)である。結合ペプチドは(G4S)5であり、配列は配列番号3で示されるものである。二機能性融合タンパク質Aにおける抗IL−17A(コントロール抗体A)の可変部配列はUS7846443(ラット1D10)に由来するものであり、その定常部配列はマウスIgG2aの定常部配列である。即ち、抗IL−17A抗体の重鎖(hc)配列は配列番号4で示されるものであり、軽鎖(lc)配列は配列番号5で示されるものである。ヒトCTLA4ECD−結合ペプチド−anti−IL−17A mAb hc−Aのアミノ酸配列は、配列番号6で示されるものである。
実施例1:二機能性融合タンパク質A発現ベクターの構築
(1)二機能性融合タンパク質Aのアミノ酸及びコードヌクレオチド配列
二機能性融合タンパク質Aを発現させるために用いられるシグナルペプチド配列は、配列番号1で示されるものである。ヒトCTLA4タンパク質の細胞外ドメイン(ECD)配列は、配列番号2で示されるものであり、ヒトCTLA4タンパク質における第37−161位のアミノ酸配列(Genbank 登録番号NM_005214.4)である。結合ペプチドは(G4S)5であり、配列は配列番号3で示されるものである。二機能性融合タンパク質Aにおける抗IL−17A(コントロール抗体A)の可変部配列はUS7846443(ラット1D10)に由来するものであり、その定常部配列はマウスIgG2aの定常部配列である。即ち、抗IL−17A抗体の重鎖(hc)配列は配列番号4で示されるものであり、軽鎖(lc)配列は配列番号5で示されるものである。ヒトCTLA4ECD−結合ペプチド−anti−IL−17A mAb hc−Aのアミノ酸配列は、配列番号6で示されるものである。
配列番号6で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して哺乳動物細胞コドンバイアスの最適化が施され、その配列は配列番号7で示されるものである。配列番号5で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して哺乳動物細胞コドンバイアスの最適化が施され、その配列は配列番号8で示されるものである。配列番号7及び配列番号8は、GenScript Corporation(南京金斯瑞生物科技有限公司)によって合成され、TAクローニング法によってpUC57ベクターに挿入された。得られた陽性クローンをシーケンシング法により検証し、それぞれpUC57−CTLA4−anti−IL−17A mAb hc−A、pUC57−anti−IL−17A mAb lc−Aと称す。
(2)二機能性融合タンパク質A発現ベクターの構築及びトランスフェクションプラスミドの準備
pUC57−CTLA4−anti−IL−17A mAb hc−Aプラスミド(GenScript Corporation製)を鋳型として用いて、通常のPCR法により、シグナルペプチド−ヒトCTLA4ECD−結合ペプチド−anti−IL−17A mAb hc−Aをコードする配列を増幅した。使用した上流プライマーは、Hind III切断部位を有し、その配列がCCCAAGCTTGCCACCATGGGGGTCCTG(配列番号9)である。下流プライマーはEcoR I切断部位を有し、その配列がCCGGAATTCTCATTTGCCTGGGGTTCT(配列番号10)である。
pUC57−anti−IL−17A mAb lc−Aプラスミド(GenScript Corporation製)を鋳型として用いて、通常のPCR法によりanti−IL−17A mAb lc−Aをコードする配列を増幅した。使用した上流プライマーは、Hind III切断部位を有し、その配列が配列番号9である。下流プライマーはEcoR I切断部位を有し、その配列が CCGGAATTCTCAGCACTCATTCCG(配列番号11)。
pUC57−CTLA4−anti−IL−17A mAb hc−Aプラスミド(GenScript Corporation製)を鋳型として用いて、通常のPCR法により、シグナルペプチド−ヒトCTLA4ECD−結合ペプチド−anti−IL−17A mAb hc−Aをコードする配列を増幅した。使用した上流プライマーは、Hind III切断部位を有し、その配列がCCCAAGCTTGCCACCATGGGGGTCCTG(配列番号9)である。下流プライマーはEcoR I切断部位を有し、その配列がCCGGAATTCTCATTTGCCTGGGGTTCT(配列番号10)である。
pUC57−anti−IL−17A mAb lc−Aプラスミド(GenScript Corporation製)を鋳型として用いて、通常のPCR法によりanti−IL−17A mAb lc−Aをコードする配列を増幅した。使用した上流プライマーは、Hind III切断部位を有し、その配列が配列番号9である。下流プライマーはEcoR I切断部位を有し、その配列が CCGGAATTCTCAGCACTCATTCCG(配列番号11)。
増幅したことで得られたシグナルペプチド−ヒトCTLA4 ECD−結合ペプチド−anti−IL−17A mAb hc−A、及びanti−IL−17A mAb lc−Aをコードする配列(長さはそれぞれ1881bp及び717bp)を、1%濃度のアガロースゲル電気泳動によって、対応する断片を回収した。回収して得られた遺伝子断片と本社製の真核発現ベクターX0GC(特許US20100120089)とを、Hind III及びEcoR Iによって切断した後、結合して、組換えプラスミドX0GC−CTLA4−anti−IL−17A mAb hc−AとX0GC−anti−IL−17A mAb lc−Aが得られ、それぞれ大腸菌DH5αを形質転換して、組換え菌DH5α/X0GC−CTLA4−anti−IL−17A mAb hc−AとDH5α/X0GC−−anti−IL−17A mAb lc−Aが得られた。PCRにより陽性クローンのスクリーニングを行い、DNAシーケンシング解析により組換えプラスミドの正確な構築を検証した。
陽性DH5α/X0GC−CTLA4−anti−IL−17A mAb hc−AとDH5α/X0GC−anti−IL−17A mAb lc−Aをそれぞれ1LのLB/Amp液体培地(1%ペプトン(BD社)、0.5%酵母抽出物(BD社)、1%NaCl(Sinopharm Chemical Reagent株式会社(国薬集団化学試剤有限公司)))に接種し、37℃、180rpmにて一晩振盪培養した。翌日にエンドトキシンフリープラスミドマキシプレップキット(Qiagen,12381)を用いてプラスミドを抽出して、HEK293−T(中国科学院上海生命科学研究院細胞資源センター)のトランスフェクションのために用いた。
実施例2:二機能性融合タンパク質B発現ベクターの構築
(1)二機能性融合タンパク質Bのアミノ酸及びコードヌクレオチド配列
二機能性融合タンパク質Bを発現させるために用いるシグナルペプチド配列は配列番号1で示されるものである。ヒトCTLA4タンパク質のECD配列は、配列番号2で示されるものであり、ヒトCTLA4タンパク質における第37−161位のアミノ酸配列(Genbank 登録番号NM_005214.4)である。結合ペプチドは(G4S)5であり、その配列は配列番号3で示されるものである。二機能性融合タンパク質Bにおける抗IL−17A抗体の配列は、特許US7846443(ヒト化1610)に由来のものであり、その重鎖(hc)配列は配列番号12で示されるものであり、軽鎖(lc)配列は配列番号13で示されるものである。ヒトCTLA4 ECD−結合ペプチド−anti−IL−17A mAb hc−Bのアミノ酸配列は、配列番号14で示されるものである。
(1)二機能性融合タンパク質Bのアミノ酸及びコードヌクレオチド配列
二機能性融合タンパク質Bを発現させるために用いるシグナルペプチド配列は配列番号1で示されるものである。ヒトCTLA4タンパク質のECD配列は、配列番号2で示されるものであり、ヒトCTLA4タンパク質における第37−161位のアミノ酸配列(Genbank 登録番号NM_005214.4)である。結合ペプチドは(G4S)5であり、その配列は配列番号3で示されるものである。二機能性融合タンパク質Bにおける抗IL−17A抗体の配列は、特許US7846443(ヒト化1610)に由来のものであり、その重鎖(hc)配列は配列番号12で示されるものであり、軽鎖(lc)配列は配列番号13で示されるものである。ヒトCTLA4 ECD−結合ペプチド−anti−IL−17A mAb hc−Bのアミノ酸配列は、配列番号14で示されるものである。
配列番号14で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して哺乳動物細胞コドンバイアスの最適化が施され、その配列は配列番号15で示されるものである。配列番号13で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して哺乳動物細胞コドンバイアスの最適化が施され、その配列は配列番号16で示されるものである。配列番号15及び配列番号16は、GenScript Corporationによって合成され、TAクローニング法によってpUC57ベクターに挿入された。得られた陽性クローンをシーケンシング法により検証し、それぞれ、pUC57−CTLA4−anti−IL−17A mAb hc−B、pUC57−anti−IL−17A mAb lc−Bと称す。
(2)二機能性融合タンパク質B発現ベクターの構築及びトランスフェクションプラスミドの準備
pUC57−CTLA4−anti−IL−17A mAb hc−Bプラスミド(GenScript Corporation製)を鋳型として用いて、通常のPCR法によりシグナルペプチド−ヒトCTLA4 ECD−結合ペプチド−anti−IL−17A mAb hc−Bをコードする配列を増幅した。使用した上流プライマーは、Hind III切断部位を有し、その配列が配列番号9である。下流プライマーはEcoR I切断部位を有し、その配列がCCGGAATTCTCACTTTCCTGGTGACAGACTCA(配列番号17)である。
pUC57−CTLA4−anti−IL−17A mAb hc−Bプラスミド(GenScript Corporation製)を鋳型として用いて、通常のPCR法によりシグナルペプチド−ヒトCTLA4 ECD−結合ペプチド−anti−IL−17A mAb hc−Bをコードする配列を増幅した。使用した上流プライマーは、Hind III切断部位を有し、その配列が配列番号9である。下流プライマーはEcoR I切断部位を有し、その配列がCCGGAATTCTCACTTTCCTGGTGACAGACTCA(配列番号17)である。
pUC57−anti−IL−17A mAb lc−Bプラスミド(GenScript Corporation製)を鋳型として用いて、通常のPCR法によりanti−IL−17A mAb lc−Bをコードする配列を増幅した。使用した上流プライマーは、Hind III切断部位を有し、その配列が配列番号9である。下流プライマーは、EcoR I切断部位を有し、その配列がCCGGAATTCTCAGCACTCGCCCCGGTTG(配列番号18)。
増幅して得られたシグナルペプチド−ヒトCTLA4 ECD−結合ペプチド−anti−IL−17A mAb hc−B、及びanti−IL−17A mAb lc−Bをコードする配列(長さはそれぞれ1887bp及び735bp)に対して、1%濃度のアガロースゲル電気泳動によって、対応する断片を回収した。回収して得られた遺伝子断片と本社製の真核発現ベクターX0GC(特許US20100120089)とを、Hind III及びEcoR Iによって切断した後、結合して、組換えプラスミドX0GC−CTLA4−anti−IL−17A mAb hc−BとX0GC−anti−IL−17A mAb lc−Bが得られ、それぞれ、大腸菌DH5αを形質転換し、組換え菌DH5α/X0GC−CTLA4−anti−IL−17A mAb hc−BとDH5α/X0GC−anti−IL−17A mAb lc−Bが得られた。PCRにより陽性クローンのスクリーニングを行い、DNAシーケンシング解析により組換えプラスミドの正確な構築を検証した。
陽性DH5α/X0GC−CTLA4−anti−IL−17A mAb hc−BとDH5α/X0GC−anti−IL−17A mAb lc−Bをそれぞれ1LのLB/Amp液体培地(1%ペプトン(BD社)、0.5%酵母抽出物(BD社)、1%NaCl(Sinopharm Chemical Reagent株式会社))に接種し、37℃、180rpmにて一晩振盪培養した。翌日にエンドトキシンフリープラスミドマキシプレップキット(Qiagen,12381)を用いてプラスミドを抽出して、HEK293−T(中国科学院上海生命科学研究院細胞資源センター)のトランスフェクションのために用いた。
実施例3:二機能性融合タンパク質A及びBの発現
成長状態が良好で、生存力(活細胞の比率、「生存率」とも記述される)が95%以上に達したHEK293−T細胞を、1.8×107個の細胞の接種量で10層の細胞工場(NUNC社製、カタログ番号:140400)に接種し、10%牛胎児血清(Gibco社)含有DMEM培地(Corning社)を用いて培養した。細胞工場を繰り返して転倒混和させて均一にした後、37℃、5%CO2のインキュベーター内で48時間培養した。細胞は完全に接着し、密度が80%に達して、瞬時トランスフェクションに用いる。
成長状態が良好で、生存力(活細胞の比率、「生存率」とも記述される)が95%以上に達したHEK293−T細胞を、1.8×107個の細胞の接種量で10層の細胞工場(NUNC社製、カタログ番号:140400)に接種し、10%牛胎児血清(Gibco社)含有DMEM培地(Corning社)を用いて培養した。細胞工場を繰り返して転倒混和させて均一にした後、37℃、5%CO2のインキュベーター内で48時間培養した。細胞は完全に接着し、密度が80%に達して、瞬時トランスフェクションに用いる。
プラスミドX0GC−CTLA4−anti−IL−17A mAb hc−AとX0GC−anti−IL−17A mAb lc−Aを同時に細胞にトランスフェクションして、二機能性融合タンパク質Aを発現させるために用いる。プラスミドX0GC−CTLA4−anti−IL−17A mAb hc−BとX0GC−anti−IL−17A mAb lc−Bを同時に細胞にトランスフェクションして、二機能性融合タンパク質Bを発現させるために用いる。0.22μmの濾過膜を用いて濾過し、それぞれに対して1330μg吸引して、66mlの無血清DMEM培地に加えた。2660μgのトランスフェクション試薬PEI(Sigma社)を吸引して、66mlの無血清DMEM培地に添加して、それぞれ均一に混合した後、得られたPEI混合液をプラスミド含有DMEMに添加して均一に混合した。室温で15分間静置した後、プラスミドとPEIとを含有する混合物を、1.3Lの無血清DMEM培地に添加して充分に混合した後、細胞工場内に徐々に加えた。細胞工場を37℃、5%CO2のインキュベーター内に放置して培養した。4時間後、266ml Cell Boost5(Thermo Fisher社)を加え、均一に混合してから引き続いて6日培養した。7000rpmで20分間遠心分離し、上清を収集してタンパク質の精製に用いた。ELISA法により上清の濃度測定を行った結果、二機能性融合タンパク質AとBは各バッチでタンパク質発現量が4−8mg/Lである。
実施例4:二機能性融合タンパク質AとBの精製
細胞工場からの上清を0.2μmの濾過膜で濾過した後、限外濾過膜で限外濾過を行い濃縮させ(公称分画分子量10kDa)、溶液を、150mMのNaClを含有する20mMのリン酸塩溶液(pH7.4)に置換した。カラムクロマトグラフィーによる精製の前に、0.2μmの濾過膜でろ過して沈殿物を除去した。このステップは4℃で行われた。
タンパク質精製システムAKTA explorer 100(GE Healthcare)及びアフィニティークロマトグラフィー rProtein A Sepharose Fast Flow(16mm I.D.,22ml,GE Healthcare)を用いて4℃で精製を行った。先ず、ベースラインが安定するまで、移動相A(20mMのリン酸ナトリウム緩衝液、150mMの塩化ナトリウム、pH7.4)でカラムを平衡化した。その後、前記のように処理された細胞上清のサンプルを注入し、流速を5ml/minとする。その後、移動相Aで溶出した。その後、移動相B1(0.5Mのアルギニンを含有する移動相A)で5つのカラム体積を送液した後、移動相B2(100mMのクエン酸、pH3.0)で5つのカラム体積を送液し、溶出ピークを目標タンパク質ピークとした。上記の溶出ステップにおける流速は何れも5ml/minである。クロマトグラムは図1A及びBで示されるものである。標識された溶出ピーク(図1AとBの灰色領域)を集め、1Mの酢酸ナトリウム溶液を滴下することでpH5.0に調整した。
細胞工場からの上清を0.2μmの濾過膜で濾過した後、限外濾過膜で限外濾過を行い濃縮させ(公称分画分子量10kDa)、溶液を、150mMのNaClを含有する20mMのリン酸塩溶液(pH7.4)に置換した。カラムクロマトグラフィーによる精製の前に、0.2μmの濾過膜でろ過して沈殿物を除去した。このステップは4℃で行われた。
タンパク質精製システムAKTA explorer 100(GE Healthcare)及びアフィニティークロマトグラフィー rProtein A Sepharose Fast Flow(16mm I.D.,22ml,GE Healthcare)を用いて4℃で精製を行った。先ず、ベースラインが安定するまで、移動相A(20mMのリン酸ナトリウム緩衝液、150mMの塩化ナトリウム、pH7.4)でカラムを平衡化した。その後、前記のように処理された細胞上清のサンプルを注入し、流速を5ml/minとする。その後、移動相Aで溶出した。その後、移動相B1(0.5Mのアルギニンを含有する移動相A)で5つのカラム体積を送液した後、移動相B2(100mMのクエン酸、pH3.0)で5つのカラム体積を送液し、溶出ピークを目標タンパク質ピークとした。上記の溶出ステップにおける流速は何れも5ml/minである。クロマトグラムは図1A及びBで示されるものである。標識された溶出ピーク(図1AとBの灰色領域)を集め、1Mの酢酸ナトリウム溶液を滴下することでpH5.0に調整した。
タンパク質精製システムAKTA explorer 100(GE Healthcare)及び強陰イオン交換クロマトグラフィーカラムHiTrap Q Sepharose FF(5mL,GE Healthcare)を用いて、4℃で精製を行った。先ず、ベースラインが安定するまで、移動相A(20mMの酢酸ナトリウム、pH5.0)でクロマトグラフィーカラムを平衡化した。その後、前実験で収集してpH調整された溶出液サンプルを注入し、流速を5mL/minとし、フロースルーピークを収集して目標タンパク質ピークとした。サンプルの注入終了後、移動相B(20mMの酢酸ナトリウム、1Mの塩化ナトリウム、pH5.0)を用いて定組成溶離(isocratic elution)を行い、流速を5ml/minとした。クロマトグラムは図2A及びBで示されるものである。標識された成分(図2AとBの灰色領域)を集め、限外濾過管(公称分画分子量30kDa)による濃縮を行い、クリーンベンチにて0.2μmの濾過膜で無菌濾過した後、紫外分光光度計(280nm)により定量し、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー(SE−HPLC)により純度分析を行った。その結果、図3AとBに示すように、二機能性融合タンパク質A及びBの単量体の純度はそれぞれ96.6%、97.4である。
実施例5:二機能性融合タンパク質の安定細胞株の構築
CHO/DG44(dhfr−)細胞を蘇生させた後、2−3回継代培養した。その生存率が95%になった時に、トランスフェクション実験に用いることが可能である。トランスフェクション試薬Lipofectamine 2000(Invitrogen,11668019)を用いて、マニュアルに従ってCHO/DG44細胞のトランスフェクションを行った。詳しくは、一つの遠心チューブに、5μgのプラスミドと3mlのα−MEM培地(SAFC,51451C)とを混合する同時に、別の遠心チューブにおいて20μLのトランスフェクション剤と3mLのα−MEM培地とを混合した。クリーンベンチにおいて、室温で5分間静置した後、上記の希釈されたプラスミドとトランスフェクションとを混合して、引き続いて30分間静置した。そして、6mLの混合物を75cm2の細胞培養角瓶(細胞コンフルエンスが70〜80%であるCHO/DG44細胞を含む)に徐々に加えた。そして、角瓶を細胞インキュベータ内(37℃、5%CO2)に設置した。一晩培養した後、トランスフェクション試薬混合物を除去し、新鮮なα−MEM培地を加え、10%透析ウシ胎児血清(Gibco,30067−334)を添加した。そして、角瓶を細胞インキュベータ内(37℃、5%CO2)に設置し、1〜2日培養した。その後、1mg/mLG418(Cellgro,61−234RG)添加の新鮮な培地で細胞を2週間持続して培養した。
CHO/DG44(dhfr−)細胞を蘇生させた後、2−3回継代培養した。その生存率が95%になった時に、トランスフェクション実験に用いることが可能である。トランスフェクション試薬Lipofectamine 2000(Invitrogen,11668019)を用いて、マニュアルに従ってCHO/DG44細胞のトランスフェクションを行った。詳しくは、一つの遠心チューブに、5μgのプラスミドと3mlのα−MEM培地(SAFC,51451C)とを混合する同時に、別の遠心チューブにおいて20μLのトランスフェクション剤と3mLのα−MEM培地とを混合した。クリーンベンチにおいて、室温で5分間静置した後、上記の希釈されたプラスミドとトランスフェクションとを混合して、引き続いて30分間静置した。そして、6mLの混合物を75cm2の細胞培養角瓶(細胞コンフルエンスが70〜80%であるCHO/DG44細胞を含む)に徐々に加えた。そして、角瓶を細胞インキュベータ内(37℃、5%CO2)に設置した。一晩培養した後、トランスフェクション試薬混合物を除去し、新鮮なα−MEM培地を加え、10%透析ウシ胎児血清(Gibco,30067−334)を添加した。そして、角瓶を細胞インキュベータ内(37℃、5%CO2)に設置し、1〜2日培養した。その後、1mg/mLG418(Cellgro,61−234RG)添加の新鮮な培地で細胞を2週間持続して培養した。
モノクローナル細胞株を得られるために、限界希釈実験を行う必要がある。詳しくは、10%透析ウシ胎児血清及び1mg/mLのG418添加のα−MEM培地を用いて細胞懸濁液を希釈して、細胞濃度を5個細胞/mLとし、細胞懸濁液を96ウェルのマイクロプレートに接種した。単一の細胞が独立した群落に成長するまで、細胞をインキュベータ内(37℃、5%CO2)で培養した。トリプシン消化法により、単一の細胞から成長した群落を選択して、24ウェルのマイクロプレートに継代した。そして、細胞を12ウェルのマイクロプレート、6ウェルのマイクロプレートに順次に継代した。6ウェルのマイクロプレートにおけるモノクローナル細胞株の細胞コンフルエンスが90%に達した時に、ELISA法により目標タンパク質の発現レベルを測定し、発現レベルの高いクローンが得たことを鑑定し、その結果、それぞれクローン52号(14mg/L)、クローン85号(56mg/L)、クローン103号(59mg/L)である。
実施例6:二機能性融合タンパク質の小規模発酵
クローン103号を選択し、5Lの生物反応器(Sartorius,Bplus twin 5L)において生産させた。5×105の細胞密度でHyclone SFM4CHO培地(4g/Lのグルコース、0.3g/Lのグルタミン)に接種した。生物反応器の作業ボリュームは2.4Lであり、プロセスの開始条件として37℃、pH7.1、溶存酸素40%−60%、攪拌速度40rpmである。その後、1日あたり攪拌速度を5rpm上げて、5日後、温度を0.5℃/時間の速度で34℃まで下げて、0.3mMの酪酸ナトリウムを加えた。二週間後、反応器の発酵液を収集して、7000rpmで20分間遠心分離し、上清を収集して保存した。ELISA法により測定した結果、濃度は240mg/Lである。
クローン103号を選択し、5Lの生物反応器(Sartorius,Bplus twin 5L)において生産させた。5×105の細胞密度でHyclone SFM4CHO培地(4g/Lのグルコース、0.3g/Lのグルタミン)に接種した。生物反応器の作業ボリュームは2.4Lであり、プロセスの開始条件として37℃、pH7.1、溶存酸素40%−60%、攪拌速度40rpmである。その後、1日あたり攪拌速度を5rpm上げて、5日後、温度を0.5℃/時間の速度で34℃まで下げて、0.3mMの酪酸ナトリウムを加えた。二週間後、反応器の発酵液を収集して、7000rpmで20分間遠心分離し、上清を収集して保存した。ELISA法により測定した結果、濃度は240mg/Lである。
実施例7:二機能性融合タンパク質A、Cと、ヒト及びマウスIL−17Aとの結合親和力
結合親和力実験では、二機能性融合タンパク質Aと類似した二機能性融合タンパク質Cを構築した。二機能性融合タンパク質Cのアミノ酸配列は、SEQ ID NO.19(CTLA4 ECD−結合ペプチド−anti−IL−17A mAb lc)と配列番号4で示されるものであり、即ち、そのCTLA4 ECDは結合ペプチドを介してanti−IL−17A mAbの軽鎖に結合され(即ち、配列番号5に結合される)、二機能性融合タンパク質AのCTLA4 ECDが結合ペプチドを介してanti−IL−17A mAbの重鎖に結合される(即ち、配列番号4に結合される)ことに相違する。なお、コントロール抗体Aは、二機能性融合タンパク質AとCのコントロール抗体とし、そのアミノ酸配列が配列番号4(コントロール抗体Aの重鎖)と配列番号5(コントロール抗体Aの軽鎖)で示されるものであり、即ち、コントロール抗体Aは、二機能性融合タンパク質A及びCにおける抗IL−17A抗体の部分に対応している。
結合親和力実験では、二機能性融合タンパク質Aと類似した二機能性融合タンパク質Cを構築した。二機能性融合タンパク質Cのアミノ酸配列は、SEQ ID NO.19(CTLA4 ECD−結合ペプチド−anti−IL−17A mAb lc)と配列番号4で示されるものであり、即ち、そのCTLA4 ECDは結合ペプチドを介してanti−IL−17A mAbの軽鎖に結合され(即ち、配列番号5に結合される)、二機能性融合タンパク質AのCTLA4 ECDが結合ペプチドを介してanti−IL−17A mAbの重鎖に結合される(即ち、配列番号4に結合される)ことに相違する。なお、コントロール抗体Aは、二機能性融合タンパク質AとCのコントロール抗体とし、そのアミノ酸配列が配列番号4(コントロール抗体Aの重鎖)と配列番号5(コントロール抗体Aの軽鎖)で示されるものであり、即ち、コントロール抗体Aは、二機能性融合タンパク質A及びCにおける抗IL−17A抗体の部分に対応している。
該方法は、以下のように具体的に実施される。炭酸ナトリウム溶液(15mMの炭酸ナトリウム、35mMの炭酸水素ナトリウム、pH9.6)を1μg/mLの濃度で、96ウェルの高吸着ELISAプレート(Corning,2592)にヒトIL−17A(シノバイオロジカル社(北京義[堯羽]神州生物技術有限公司)、カタログ番号:12047−HNAE)またはマウスIL−17A(シノバイオロジカル社、カタログ番号:51065−MNAE)をコーティングし、各ウェルに100μLずつ注入して、4℃で一晩コーティングした。PBST(Sigma,カタログ番号:P−3563)で該プレートを5回洗浄した。1%BSA含有PBSTで該プレートをブロッキングし、各ウェルに300μLずつ注入し、25℃で少なくとも1時間インキュベートした。該プレートをPBSTで5回洗浄した。1%BSA含有PBSTで希釈された特定濃度の検体を、各ウェルに100μLずつ加え、25℃で1時間インキュベートした。PBSTで該プレートを5回洗浄した。そして、1:10000となるように1%BSA含有PBSTで希釈された、ホースラディッシュペルオキシダーゼで標識された抗マウスIgG抗体(Abcam,カタログ番号:Ab7068)を、各ウェルに100μLずつ注入し、25℃で1時間インキュベートした。PBSTで該プレートを5回洗浄した。比色基質TMB(BD OptEIA,カタログ番号:555214)を各ウェルに100μLずつ注入し、室温で10分間発色させた。1MのH2SO4を各ウェルに100μLずつ注入して、発色反応を終了させた。マイクロプレートリーダーで450nmのでの吸光度を読み取った。
その結果、図4及び5に示すように、本発明にかかる二機能性融合タンパク質Aと二機能性タンパク質Cは、その抗原であるヒトIL−17A(図4)及びマウスIL−17A(図5)と結合する高親和力を有し、且つその親和力がコントロール抗体Aと類似した。上記の結果から明らかなように、結合ペプチドを介してコントロール抗体Aの重鎖または軽鎖のN末端に結合されたCTLA4 ECDは、コントロール抗体Aそのものと抗原との親和力に大きい影響を及ぼさない。
なお、本発明にかかる二機能性融合タンパク質Bは、マウスIL−17Aに結合することができなく、ヒトIL−17Aに結合する高親和力を有するものであり(本発明では、ELISA法により測定した数値は、EC50=103pM)、特許(US7846443)に記載の数値に接近する。
実施例8:CTLA4の異なる結合様式による二機能性融合タンパク質とB7との親和力への影響
二機能性融合タンパク質とB7との親和力に対して、CTLA4の異なる結合様式による影響を比較するために、異なるCTLA4結合様式を有する二機能性融合タンパク質の類似体を構築した。
(1)二機能性融合タンパク質C:その配列は、前記で示されるものであり、即ち、配列番号19(CTLA4 ECD−結合ペプチド−anti−IL−17A mAb lc)及び配列番号4である。即ち、そのCTLA4 ECDは、結合ペプチドを介してanti−IL−17A mAbの軽鎖のN末端に結合され(即ち、配列番号5に結合される)、二機能性融合タンパク質AのCTLA4 ECDが結合ペプチドを介してanti−IL−17A mAbの重鎖のN末端に結合される(即ち、配列番号4に結合される)ことに相違する。
(2)二機能性融合タンパク質D:使用したシグナルペプチド配列は配列番号1で示されるものである。ヒトCTLA4タンパク質の細胞外ドメイン(ECD)配列は配列番号2で示されるものである。結合ペプチドは(G4S)5であり、その配列は配列番号3で示されるものである。抗体IL−17A抗体は、重鎖(hc)の配列が配列番号4で示されるものであり、軽鎖(lc)の配列が配列番号5で示されるものである。anti−IL−17A mAb hc−A−結合ペプチド−CTLA4 ECDのアミノ酸配列は配列番号20で示されるものであり、即ち、二機能性融合タンパク質DのCTLA4は結合ペプチドを介してコントロール抗体Aの重鎖のC末端に結合される。
(3)二機能性融合タンパク質E:使用したシグナルペプチド配列は配列番号1で示されるものである。ヒトCTLA4タンパク質の細胞外ドメイン(ECD)配列は配列番号2で示されるものである。結合ペプチドは(G4S)5であり、その配列は配列番号3で示されるものである。抗体IL−17A抗体は、重鎖(hc)の配列が配列番号4で示されるものであり、軽鎖(lc)の配列が配列番号5で示されるものである。anti−IL−17A mAb lc−A−結合ペプチド−CTLA4 ECDのアミノ酸配列は配列番号21で示されるものであり、即ち、二機能性融合タンパク質EのCTLA4は結合ペプチドを介してコントロール抗体Aの軽鎖のC末端に結合される。
二機能性融合タンパク質とB7との親和力に対して、CTLA4の異なる結合様式による影響を比較するために、異なるCTLA4結合様式を有する二機能性融合タンパク質の類似体を構築した。
(1)二機能性融合タンパク質C:その配列は、前記で示されるものであり、即ち、配列番号19(CTLA4 ECD−結合ペプチド−anti−IL−17A mAb lc)及び配列番号4である。即ち、そのCTLA4 ECDは、結合ペプチドを介してanti−IL−17A mAbの軽鎖のN末端に結合され(即ち、配列番号5に結合される)、二機能性融合タンパク質AのCTLA4 ECDが結合ペプチドを介してanti−IL−17A mAbの重鎖のN末端に結合される(即ち、配列番号4に結合される)ことに相違する。
(2)二機能性融合タンパク質D:使用したシグナルペプチド配列は配列番号1で示されるものである。ヒトCTLA4タンパク質の細胞外ドメイン(ECD)配列は配列番号2で示されるものである。結合ペプチドは(G4S)5であり、その配列は配列番号3で示されるものである。抗体IL−17A抗体は、重鎖(hc)の配列が配列番号4で示されるものであり、軽鎖(lc)の配列が配列番号5で示されるものである。anti−IL−17A mAb hc−A−結合ペプチド−CTLA4 ECDのアミノ酸配列は配列番号20で示されるものであり、即ち、二機能性融合タンパク質DのCTLA4は結合ペプチドを介してコントロール抗体Aの重鎖のC末端に結合される。
(3)二機能性融合タンパク質E:使用したシグナルペプチド配列は配列番号1で示されるものである。ヒトCTLA4タンパク質の細胞外ドメイン(ECD)配列は配列番号2で示されるものである。結合ペプチドは(G4S)5であり、その配列は配列番号3で示されるものである。抗体IL−17A抗体は、重鎖(hc)の配列が配列番号4で示されるものであり、軽鎖(lc)の配列が配列番号5で示されるものである。anti−IL−17A mAb lc−A−結合ペプチド−CTLA4 ECDのアミノ酸配列は配列番号21で示されるものであり、即ち、二機能性融合タンパク質EのCTLA4は結合ペプチドを介してコントロール抗体Aの軽鎖のC末端に結合される。
CTLA4 ECDは、その配位子であるB7分子と結合することができる。B7との結合親和力を測定する実験では、フローサイトメトリー法により、B7分子の発現レベルの高いRaji細胞において、二機能性融合タンパク質A、C、及びD、Eと、B7分子との結合能力を測定した。該方法は、以下のようなプロセスにより実施された。1000rpmで5分間遠心分離してRaji細胞(ATCC,カタログ番号:CCL−86)を収集した。2%FBS(GIBCO,カタログ番号:10099141)含有PBS(PromoCell,カタログ番号:C−40232)を用いて1回洗浄した。EP管においてRaji細胞を再懸濁させ、各管に、1×106個細胞を、2%FBS且つ最終濃度を0.5nMとした検体を含有する200μLの冷たいPBSに再懸濁させた。EP管を氷上で30分間インキュベートした。2%FBS含有PBSで2回洗浄した。そして、2%FBS且つFITCによって標記された抗マウスIgG抗体(1:50に希釈)を含有する200μLの冷たいPBSに再懸濁させた。遮光して氷上で30分間インキュベートした。2%FBS含有PBSで2回洗浄し、2%FBSを含有する500μLの冷たいPBSに再懸濁させた。該細胞懸濁液をフローサイトメトリーで測定・分析した。
その結果、表1に示すように、二機能性融合タンパク質Aは、その配位子B7分子の発現の高いRaji細胞に結合する能力を有し、且つその結合力が二機能性融合タンパク質C、二機能性融合タンパク質D及び二機能性融合タンパク質Eに較べて明らかに大きい。上記の結果から明らかなように、CTLA4 ECDと抗IL−17A抗体との異なる結合様式は、それとB7分子との結合能力に大きく影響した。
実施例9:二機能性融合タンパク質AによるIL−17Aで誘導されるHT−29細胞からのGROα分泌の抑制
ヒト結腸直腸癌細胞株HT−29はATCCに由来するものである。HT−29細胞を、10%ウシ胎児血清(Gibco,カタログ番号:10099)含有RPMI−1640培地(Gibco,カタログ番号:22400)に培養し、37℃、5%CO2の細胞インキュベーターに設置して、毎週2回継代培養した。
IL−17Aによって誘導されるGROα分泌を抑制する実験は、具体的に以下のように実施される。検体を10%ウシ胎児血清含有RPMI1640完全培地で勾配希釈し、細胞培養プレート(Coring,カタログ番号:3599)の各ウェルに50μLずつ注入した。さらに、細胞培養プレートに、同一の完全培地で希釈された、濃度が240ng/mLのヒトIL−17Aを各ウェルに50μLずつ注入した。37℃、5%CO2の細胞インキュベーターに設置して、1時間インキュベートした。そして、HT−29細胞を完全培地に再懸濁させて、96ウェルの細胞培養プレート内に接種し、各ウェルに100μL(約20000個の細胞)注入した。細胞を37℃、5%CO2のインキュベーターに設置して48時間インキュベートした。1000rpmで細胞培養プレートを5分間遠心分離して、上清を取り出した。マニュアルに従って、GROα ELISAキット(R&D,カタログ番号:DY275)を用いてGROαのレベルを測定した。
ヒト結腸直腸癌細胞株HT−29はATCCに由来するものである。HT−29細胞を、10%ウシ胎児血清(Gibco,カタログ番号:10099)含有RPMI−1640培地(Gibco,カタログ番号:22400)に培養し、37℃、5%CO2の細胞インキュベーターに設置して、毎週2回継代培養した。
IL−17Aによって誘導されるGROα分泌を抑制する実験は、具体的に以下のように実施される。検体を10%ウシ胎児血清含有RPMI1640完全培地で勾配希釈し、細胞培養プレート(Coring,カタログ番号:3599)の各ウェルに50μLずつ注入した。さらに、細胞培養プレートに、同一の完全培地で希釈された、濃度が240ng/mLのヒトIL−17Aを各ウェルに50μLずつ注入した。37℃、5%CO2の細胞インキュベーターに設置して、1時間インキュベートした。そして、HT−29細胞を完全培地に再懸濁させて、96ウェルの細胞培養プレート内に接種し、各ウェルに100μL(約20000個の細胞)注入した。細胞を37℃、5%CO2のインキュベーターに設置して48時間インキュベートした。1000rpmで細胞培養プレートを5分間遠心分離して、上清を取り出した。マニュアルに従って、GROα ELISAキット(R&D,カタログ番号:DY275)を用いてGROαのレベルを測定した。
その結果、図6に示すように、コントロール抗体Aと二機能性融合タンパク質Aのいずれも、IL−17Aによって誘導されるHT−29細胞からのGROα分泌を抑制することが可能であり、IC50はそれぞれ532pMと911pMである。
実施例10:二機能性融合タンパク質Bによるヒト末梢血単核細胞からのIL−2の分泌の抑制
混合リンパ細胞反応により、本発明にかかる二機能性融合タンパク質Bの免疫抑制活性、即ち、Tリンパ球活性化を抑制する活性を測定した。簡単に言えば、二つの異なる個体からのヒト末梢血単核細胞を取り(PBMC)、一つのPBMCを不活性化させて刺激細胞とし、もう一つのPBMCを反応細胞とした。この2つのPBMCを混合すると、刺激細胞は反応細胞の免疫反応を活性化させて、サイトカインIL−2を大量分泌させる。この混合PBMC系と共に、サンプルをインキュベートして、IL−2分泌への影響を測定した。
混合リンパ細胞反応により、本発明にかかる二機能性融合タンパク質Bの免疫抑制活性、即ち、Tリンパ球活性化を抑制する活性を測定した。簡単に言えば、二つの異なる個体からのヒト末梢血単核細胞を取り(PBMC)、一つのPBMCを不活性化させて刺激細胞とし、もう一つのPBMCを反応細胞とした。この2つのPBMCを混合すると、刺激細胞は反応細胞の免疫反応を活性化させて、サイトカインIL−2を大量分泌させる。この混合PBMC系と共に、サンプルをインキュベートして、IL−2分泌への影響を測定した。
リンパ球混合反応は、以下のような方法により実施される。2つの異なる個体から、異なるロット番号のPBMC(Lonza,カタログ番号:CC−2702)を蘇生させて10%ウシ胎児血清(Gibco,カタログ番号:10099)含有RPMI−1640(Gibco,カタログ番号:22400)完全培地に再懸濁させた。一つのPBMCを刺激細胞とし、もう一つを反応細胞とした。刺激細胞と共に、50μg/mlのマイトマイシンC(Wako,カタログ番号:50−07−7)を37℃で45分間インキュベートした。その後、細胞をDPBS(PromoCell,カタログ番号:C−40232)で2回洗浄した後、RPMI1640完全培地に再懸濁させた。刺激細胞と反応細胞の何れに対しても、細胞数のカウント(Innovatis Cedex)と細胞生存率測定(トリパンブルー色素、Invitrogen社、カタログ番号:15250−061)を行った。そして、反応細胞を96ウェルの細胞培養プレート(Corning,カタログ番号:3799)に接種し、各ウェルに50μL(1×105個の細胞)注入し、さらに各ウェルに100μLの既定濃度の二機能性融合タンパク質B、市販されている陽性対照試薬アバタセプト(OrenciaTM,ブリストル・マイヤーズスクイブ社)またはエタネルセプト(商品名:エンブレル(益賽普),上海中信国健薬業株式会社製)を加えた。そして、各サンプルに対して3つのウェルを設定した。1ウェル当たり50μLの刺激細胞(1×105個の細胞)を加えた。細胞培養プレートを37℃、5%CO2のインキュベーターに設置してインキュベートした。72時間後、1ウェルあたり100μLの上清を取り出して、−70℃に保存した。マニュアルに従って、IL−2ELISAキット(Raybiotech,カタログ番号:ELH−IL2−001)を用いてIL−2のレベルを測定した。
その結果、図7に示すように、ヒトPBMCとを混合する反応において、二機能性融合タンパク質B、アバタセプト及びエタネルセプトについて、IL−2分泌を抑制するEC50は、それぞれ3nM、12nM及び21nMである。二機能性融合タンパク質Bは、市販されている陽性対照物質であるアバタセプト及びエタネルセプトに較べて、より強いIL−2分泌抑制活性を示した。追加した実験により明らかなように、二機能性融合タンパク質Aも、アバタセプトに近い、比較的強いIL−2分泌抑制活性を示した。
実施例11:二機能性融合タンパク質Aのキメラ体及びヒト化類似体
二機能性融合タンパク質Aの定常部アミノ酸配列、即ち、コントロール抗体Aの定常部アミノ酸配列を、ヒトIgG1定常部配列に置換した。ヒトIgG1の重鎖の定常部配列は配列番号22で示されるものであり、軽鎖の定常部配列は配列番号23で示されるものである。これにより二機能性融合タンパク質Aキメラ体類似体を得た。そのアミノ酸配列は配列番号24と配列番号25で示されるものである。当該キメラ体類似体はねずみ(鼠)由来成分を減少し、タンパク質の免疫原性を効率的に減少することが可能である。
二機能性融合タンパク質Aの定常部アミノ酸配列、即ち、コントロール抗体Aの定常部アミノ酸配列を、ヒトIgG1定常部配列に置換した。ヒトIgG1の重鎖の定常部配列は配列番号22で示されるものであり、軽鎖の定常部配列は配列番号23で示されるものである。これにより二機能性融合タンパク質Aキメラ体類似体を得た。そのアミノ酸配列は配列番号24と配列番号25で示されるものである。当該キメラ体類似体はねずみ(鼠)由来成分を減少し、タンパク質の免疫原性を効率的に減少することが可能である。
なお、配列番号24及び配列番号25の部分配列に対してさらに改造し、その可変部におけるフレームワーク領域のアミノ酸の置換及び変異を行って、ねずみ(鼠)由来成分をさらに減少した。これにより得られた二機能性融合タンパク質Aヒト化類似体のアミノ酸配列は配列番号26及び配列番号27で示されるものである。
二機能性融合タンパク質A、キメラ体及びそのヒト化類似体に対して抗原親和力測定を行った。その結果、表2に示すように、キメラ体及びヒト化類似体は母体の抗原結合活性を良好的に保留した。
二機能性融合タンパク質A、キメラ体及びそのヒト化類似体に対して抗原親和力測定を行った。その結果、表2に示すように、キメラ体及びヒト化類似体は母体の抗原結合活性を良好的に保留した。
実施例12:二機能性融合タンパク質Aヒト化類似体のII型コラーゲンに誘導されるラット関節炎(CIA)モデルにおける薬効の研究
ラットCIAモデルは、関節リウマチの病因の研究及び治療薬剤のスクリーニングに広く用いられている動物モデルである。実験動物として、7週齢のWistar系雌ラット(HFK Bio−Technology社(北京華阜康生物科技株式会社)から購入)を選択した。一週間かけて環境に適応させた後、ランダムに5匹のラットを選んで正常対照ラットとし、その他のラットをラットCIAモデルの構築のために用いた。ラットに対して初回免疫と追加免疫を行うことによりCIAモデルが得られた。初回免疫では、200μgのII型ウシコラーゲン(Chondrex,カタログ番号:20022)と不完全フロイントアジュバント(Sigma−Aldrich,カタログ番号:F5506)とを混合して乳剤を形成し、皮内注射によりラットの尾根部に注射した。一週間後、追加免疫を行った。追加免疫では、100μgのII型ウシコラーゲンと不完全フロイントアジュバントとを混合して乳剤を形成し、皮内注射によりラットの尾根部に注射した。追加免疫後、ラットの四肢の腫れなどの臨床的関節炎症を観察した後、ランダムに1群を6匹として分けた。
ラットCIAモデルは、関節リウマチの病因の研究及び治療薬剤のスクリーニングに広く用いられている動物モデルである。実験動物として、7週齢のWistar系雌ラット(HFK Bio−Technology社(北京華阜康生物科技株式会社)から購入)を選択した。一週間かけて環境に適応させた後、ランダムに5匹のラットを選んで正常対照ラットとし、その他のラットをラットCIAモデルの構築のために用いた。ラットに対して初回免疫と追加免疫を行うことによりCIAモデルが得られた。初回免疫では、200μgのII型ウシコラーゲン(Chondrex,カタログ番号:20022)と不完全フロイントアジュバント(Sigma−Aldrich,カタログ番号:F5506)とを混合して乳剤を形成し、皮内注射によりラットの尾根部に注射した。一週間後、追加免疫を行った。追加免疫では、100μgのII型ウシコラーゲンと不完全フロイントアジュバントとを混合して乳剤を形成し、皮内注射によりラットの尾根部に注射した。追加免疫後、ラットの四肢の腫れなどの臨床的関節炎症を観察した後、ランダムに1群を6匹として分けた。
CIAモデルのラットの各群に対してそれぞれ投与した。薬物溶媒(PBS)、アバタセプト(272nmol/kg,第1、5、8、11日にそれぞれ投与した)、二機能性融合タンパク質Aヒト化類似体(33nmol/kg,2日毎に1回腹腔内注射し、計7回)。投与後、前後四肢の病変状態を観察し、関節炎症に関してインデックスの採点を行った。0=赤腫なし;1=足首関節または足根関節に紅斑や軽度の腫脹あり;2=足首関節から足根関節にかけて紅斑や軽度の腫脹あり;3=足首関節から中足骨関節にかけて紅斑や中程度の腫脹;4=足首関節、足、足趾関節を含めて腫脹紅斑や重度の腫脹または四肢関節強直である。ラットの四肢に対し炎症採点を行い、各ラットの最多得点は16点である。
実験結果は図8に示すように、正常コントロール群のラットでは炎症反応がみられなく、溶媒群のCIAモデルラットでは顕著な炎症反応がみられた。二機能性融合タンパク質Aヒト化類似体投与群のCIAモデルラットの関節炎インデックスが顕著に抑制され、アバタセプト投与群に較べて優れた炎症緩解効果を示した。
Claims (10)
- CTLA4分子の細胞外ドメインと、抗IL−17抗体とを含有し、好ましくは、前記IL−17がIL−17Aである二機能性融合タンパク質。
- アミノ酸配列が以下の配列の組み合わせから選ばれるものである請求項1に記載の二機能性融合タンパク質。
a)配列番号5と6、配列番号13と14、配列番号4と19、配列番号24と25、配列番号26と27で示される配列、
b)配列番号5と6、配列番号13と14、配列番号4と19、配列番号24と25、配列番号26と27で示される配列において1個若しくは数個アミノ酸残基が置換、欠失若しくは付加された、B7とIL−17Aシグナル経路を同時に遮断する活性を有するアミノ酸配列、又は
c)配列番号5と6、配列番号13と14、配列番号4と19、配列番号24と25、配列番号26と27で示される配列に対して少なくとも70%の同一性を有し、B7とIL−17Aシグナル経路を同時に遮断する活性を有するアミノ酸配列。 - 請求項1または2に記載の二機能性融合タンパク質をコードすることができるコード遺伝子。
- 機能可能なように結合された請求項3に記載のコード遺伝子を含有する組換えベクター。
- 請求項4に記載の組換えベクターを含有する宿主細胞。
- 請求項1または2に記載の二機能性融合タンパク質を製造する方法であって、
(1)請求項3に記載のコード遺伝子を真核発現ベクターに機能可能なように結合し、それを宿主細胞内にトランスフェクションして発現させる、または請求項4に記載の組換えベクターを宿主細胞内にトランスフェクションして発現させるステップと、
(2)前記二機能性融合タンパク質を精製するステップと、を含み、
好ましくは、前記真核発現ベクターはX0GCであり、前記宿主細胞はHEK293−TまたはCHO細胞である、二機能性融合タンパク質を製造する方法。 - 請求項1または2に記載の二機能性融合タンパク質、または請求項6に記載の方法によって得られる二機能性融合タンパク質を含む医薬組成物。
- 請求項1または2に記載のタンパク質、または請求項6に記載の方法によって得られるタンパク質、または請求項7に記載の医薬組成物の、疾患を予防、治療または改善するための薬物の製造における使用。
- 前記疾患が、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、多発性硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、糸球体腎炎、特発性血小板減少性紫斑病、原発性シェーグレン症候群、痛風、または臓器移植である、請求項8に記載の使用。
- 請求項1または2に記載のタンパク質、請求項3に記載のコード遺伝子、請求項4に記載の組み換えベクター、または請求項5に記載の宿主細胞を含むキット。
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