KR20230060514A - 인터루킨-2 뮤테인 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 특히, 자가면역 질환의 예방 및 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 부분적으로, 인간 인터루킨-2 뮤테인이 조절 T 세포의 증식을 활성화시킨다는 놀라운 발견을 기반으로 한다. 일 양태에서, 본 발명은 조절 T 세포의 증식을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 다른 양태에서, 야생형 IL-2 단백질과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간 인터루킨-2 (IL-2) 뮤테인이 기술되고, IL-2 뮤테인은 T111H, T37Y, E15T, M23L, P34F, E68F 및 E62A로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는다.

Description

인터루킨-2 뮤테인 및 이의 용도

[관련 출원의 교차 참조]

본 출원은 2020년 9월 1일 출원된 미국 가출원 제63/073,208호, 및 2021년 8월 10일 출원된 미국 가출원 제63/231,471호에 대한 우선권 및 이의 이득을 청구하고, 그 내용은 본 명세서에 편입된다.

자가면역 질환은 자기 및 비-자기-조직을 구별하는 면역계의 실패로 인해서, 신체의 세포 및 조직을 공격하고 파괴하여서 초래된다.

조절 T 세포 (Treg)의 기능 중 하나는 면역계의 병리학적 활성화를 억제하고 자가면역 질환을 예방하는 것이다. 조절 T 세포 (Treg)는 다른 면역 세포의 활성을 억제하고, 자기-항원에 대한 내성을 유지하는데서 중요한 역할을 하여, 면역계의 조절 및 외래 항원에 대한 반응을 조절하는 CD4+CD25+ T 세포이다. Treg 세포수 또는 세포 기능은 예를 들어, 1형 당뇨병 (T1D), 전신 홍반성 루푸스 (SLE) 및 이식편 대 숙주 질환 (GVHD)을 포함한, 몇몇 자가면역 및 염증성 질환에서 감소되는 것으로 확인된다.

인터루킨-2 (IL-2)는 조절 T 세포 (Treg)의 성장을 자극하는 것 이외에도, T 세포, B 세포, 및 단핵구를 활성화시키는 면역계의 강력한 자극인자이다. IL-2의 치료적 투여는 예를 들어, NK 세포의 비특이적 활성화로 인해서, 원치않는 독성을 야기한다.

T 세포는 전형적으로 조직에 존재하는 저농도의 IL-2에 반응하도록 CD25의 발현을 필요로 한다. CD25를 발현하는 T 세포는 자가면역 염증을 억제하는데 필수적인 FOXP3+ CD4+ 조절 T 세포 (Treg 세포)를 포함한다. 다른 한편으로, CD25를 발현하도록 활성화된 FOXP3- T 이펙터 세포는 CD4+ 또는 CD8+일 수 있고, 염증, 자가면역, 장기 이식 거부, 또는 이식편 대 숙주 질환의 원인이 된다. IL-2-자극된 STAT5 신호전달은 정상 T-reg 세포 성장 및 생존 및 높은 FOXP3 발현에 중요한 것으로 여겨진다.

면역계 조절을 위해서 Treg 세포의 생산 및/또는 활성을 선택적으로 자극시키는 요법이 필요하다. 본 발명은 특히, 조절 T 세포 (Treg)의 증식을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 특히, 조절 T 세포의 증식을 활성화시키는 인간 인터루킨-2 (IL-2) 뮤테인 및 이의 IgG Fc 융합 단백질을 제공한다. 본 발명은 특히, 자가면역 질환의 예방 및 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

자가면역 질환을 치료하기 위한 접근법은 자기유래, 생체외 확장된 Treg 세포의 이식이다. 성공적인 동물 모델 및 초기 단계 인간 임상 시험의 성공에도, 이러한 접근법은 환자 자신의 T-세포를 사용한 개인맞춤형 치료를 요구하기 때문에 기술적으로 복잡하고 침습적이이어서 도전적이다.

재조합 IL-2, 프로루킨 (Prometheus Laboratories, San Diego)은 전이성 흑색종 및 전이성 신장암의 치료를 위해 승인되었지만, 높은 독성으로 인한 중증 부작용과 연관된다. 저용량의 IL-2를 사용한 임상 치료가 만성 GVHD 및 HCV-연관 자가면역 혈관염을 치료하는데 사용되었고 증가된 Treg 수준이 입증되었다. 그러나, 저용량 IL-2의 임상 시험조차도 안전성 및 내약성 문제를 야기하였다. 그러므로, 인간을 치료하기에 안전하고 내성있는 Treg 세포를 특이적으로 표적화하고 활성화시키는 자가면역 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 치료제에 대한 요구가 존재한다.

IL-2 수용체는 T 세포, NK 세포, 호산구 및 단핵구를 포함한, 많은 유형의 면역 세포 상에서 광범위하게 발현되어서, IL-2 투여로 인한 다면발현 효과 및 높은 전신 독성을 야기한다. IL-2 수용체는 다음의 3개 형태로 존재한다: α (알파) (IL-2Ra, CD25, 또는 Tac 항원이라고도 함), β(베타) (IL-2Rb, 또는 Cd122), 및 γ(감마).

인간 환자에게 투여될 때, IL-2는 정맥내 투여 경우 85 분, 및 피하 투여 경우 3.3 시간의 짧은 반감기를 갖는다 (Kirchner, G.I. et al., 1998, Br J. Clin. Pharmacol. 46:5-10). T 세포 증식을 자극하기 위해 적어도 5-6 시간의 IL-2에 대한 노출이 요구되었다는 것이 시험관내 연구에서 확인되었으므로, 일반적으로 고용량이 필요하다고 여겨진다.

일 양태에서, 본 발명은 다른 유형의 면역 세포에 비해서 Treg 세포에 선택적인 IL-2 변이체를 사용하여 자가면역 질환을 치료하는 개선된 방법을 확인한다.

일 양태에서, IL-2 뮤테인은 순환 IL-2의 반감기를 증가시키기 위해서 IgG의 Fc 영역에 융합된다.

IL-2가 많은 유형의 면역 세포를 표적화하지만, Treg 세포는 IL2Rα (CD25), IL2Rβ (CD122) 및 IL2Rγ (CD132) 수용체로 구성된, 고친화성 수용체 IL2Rαβγ의 높은 수준의 발현 때문에 많은 다른 세포 유형에 비해서 더 낮은 농도의 IL-2에 반응한다. Treg 성장은 IL-2에 반응성이다. Treg 세포 (CD4 양성 세포)는 IL2Rα (CD25로도 알려짐)를 발현하는 반면, CD8 양성인 다른 비-Treg 세포는 IL2Rβ (CD122)를 발현한다.

본 발명은 부분적으로, 예시적인 IL-2 뮤테인이 Treg 세포를 우선적으로 확장시키거나 또는 자극시킨다는 놀라운 발견을 기반으로 한다. 본 발명은 조절 T 세포의 증식을 선택적으로 활성화시킬 수 있는 야생형 IL-2 (SEQ ID NO: 1)에 비해서 T111H, T37Y, E15T, M23L, P34F, E68F 및 E62A로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 인간 인터루킨-2 뮤테인을 제공한다.

일 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1로 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간 인터루킨-2 (IL-2) 뮤테인을 제공하고, 상기 IL-2 뮤테인은 T111H, T37Y, E15T, M23L, P34F, E68F 및 E62A로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는다. 따라서, 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 T111H 치환을 특징으로 하는 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 T37Y 치환을 특징으로 하는 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 E15T 치환을 특징으로 하는 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 M23L 치환을 특징으로 하는 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 P34F 치환을 특징으로 하는 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 E68F 치환을 특징으로 하는 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 E62A 치환을 특징으로 하는 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 하기 아미노산 치환: T111H, T37Y, E15T, M23L, P34F, E68F 및 E62A 중 하나 이상을 포함하는 아미노산 치환의 조합을 갖는다.

일부 구현예에서, 인간 인터루킨-2 (IL-2) 뮤테인은 C125A의 아미노산 치환을 더 포함한다.

일 구현예에서, 본 발명은 인간 인터루킨-2 (IL-2) 뮤테인의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 인간 인터루킨-2 (IL-2) 뮤테인, 또는 이의 염을 포함하는 약물을 제공한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 IgG Fc 융합 파트너와 융합된다.

일부 구현예에서, 약물은 Treg 활성인자이다.

일부 구현예에서, 약물은 자가면역 질환의 예방 또는 치료를 위한 작용제이다.

일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 환자에게 투여했을 때 IL-2 뮤테인의 혈청 반감기를 증가시키기 위한 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 반감기 연장 분자는 수용성 중합체 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)), 고밀도 및 저밀도 지단백질, 항체 Fc (단량체 또는 이량체), 트랜스티레틴 (TTR), 및 TGF-β잠복기 연관 펩티드 (LAP)를 포함한다. 또한 혈청 반감기 연장 분자, 예컨대 PEG화 TTR의 조합을 포함하는 IL-2 변이체를 고려한다 (US 특허 출원 공개 번호 제2003/0195154호 참조).

일부 구현예에서, 본 발명은 인간 인터루킨-2 (IL-2) 뮤테인, 또는 이의 염의 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 조절 T 세포 (Treg 세포)를 증식시키는 방법을 제공한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 인간 인터루킨-2 (IL-2) 뮤테인, 또는 이의 염의 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 자가면역 질환의 예방 또는 치료를 위한 방법을 제공한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 자가면역 질환의 치료를 위한 방법에서 사용을 위한 인간 인터루킨-2 (IL-2) 뮤테인을 제공한다. 다양한 자가면역 질환이 당분야에서 인식되고, 예를 들어, 증대된 염증성 반응과 연관된 질환 예컨대 건선 및 피부염 (예를 들어, 아토피성 피부염)을 포함한 염증성 피부 질환; 염증성 장 질환과 연관된 반응 (예컨대 크론병 및 궤양성 대장염); 피부염; 알레르기성 병태 예컨대 습진 및 천식; 류마티스성 관절염; 전신 홍반성 루푸스 (SLE) (루푸스 신염, 피부 루푸스를 포함하지만, 이에 제한되지 않음); 진성 당뇨병 (예를 들어, 1형 진성 당뇨병 또는 인슐린 의존성 진성 당뇨병); 다발성 경화증 및 소아 발병 당뇨병을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 자가면역 질환의 예방 또는 치료를 위한 작용제의 제조를 위한 인간 인터루킨-2 (IL-2) 뮤테인, 또는 이의 염의 용도를 제공한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 인간 인터루킨-2 (IL-2) 뮤테인의 유효량과 T 세포의 개체를 접촉시키는 단계를 포함하는, 조절 T 세포 (Treg)의 증식 방법을 제공한다.

본 명세서에 기술된 구현예의 임의 양태는 본 명세서에 개시된 바와 같은 임의의 다른 양태 또는 구현예와 조합될 수 있다. 본 개시가 이의 상세한 설명과 함께 기술되었지만, 전술한 설명은 본 개시의 범주를 예시하려는 의도이고 제한하려는 것이 아니며, 본 발명은 첨부된 청구항의 범위에 의해 정의된다. 다른 양태, 장점, 및 변형은 하기 청구항의 범위 내에 속한다.

본 명세서에서 인용되는 모든 미국 특허 및 공개 또는 미공개 미국 특허 출원은 참조로 편입된다. 본 명세서에서 인용되는 모든 공개된 외국 특허 및 특허 출원은 참조로 본 명세서에 편입된다. 본 명세서에서 인용되는 모든 다른 공개된 참조문헌, 문서, 원고, 및 과학 문헌은 참조로 본 명세서에 편입된다.

본 발명의 다른 특성 및 장점은 이하의 상세한 설명, 도면, 및 청구항으로부터 자명해질 것이다. 그러나, 상세한 설명, 도면, 및 청구항이 본 발명의 구현예를 나타내지만, 제한이 아니라, 단지 예시로 제공된다는 것을 이해해야 한다. 본 발명의 범위 내에서 다양한 변화 및 변형은 당업자에게 자명해 질 것이다.

하기 도면은 오직 예시 목적이고 제한하려는 것이 아니다.
도 1A 는 2개의 예시적인 IL-2 뮤테인과 비교를 위해 IL-2Rα (CD25)에 대한 WT IL-2의 결합 친화성을 보여주는 그래프이다. 도 1B 는 IL-2 뮤테인 K77A가 IL-2Rα에 대해 WT IL-2와 유사한 결합 친화성을 갖는다는 것을 보여준다. 도 1C 는 E96A 돌연변이체가 IL-2Rα에 결합하지 않는 것을 보여준다
도 2A 는 CD25+CD4T 세포에서 pSTAT5 유도를 정량하기 위한 중간 형광 강도를 보여주는 그래프이다. 도 2B 는 CD8T 세포에서 pSTAT5 수준의 그래프를 도시한다. 도 2C 는 CD25-CD4T 세포에서 pSTAT5 수준의 그래프를 도시한다. 도 2D 는 CD25- NK 세포에서 pSTAT5 수준의 그래프를 도시한다. 도 2E 는 야생형 IL-2와 비교하여 IL-2 뮤테인 M23L, T111H, E68F, E15T, P34F, T37Y를 사용한 pSTAT5a 유도를 보여주는 일련의 그래프 및 관련 표를 도시한다.
도 3 은 WT mIL-2-HLE, F906-hIL2, F906-E62A 및 IL-2-S4B6 항체와 비교하여 E96-HLE의 처리 시 Treg 세포 (CD4+ T 세포의 foxp3+ %) 수에서 용량-의존적 증가의 비교를 보여주는 그래프이다.
도 4A 는 도 3에서 그래프 작성된, 유세포측정으로 측정된 비히클-처리 세포의 대표적인 Treg 개체군을 도시한다. 도 4B 는 WT mIL-2 HLE 세포에서 예시적인 Treg 개체군을 도시한다. 도 4C, 도 4D 및 도 4E 는 E96-HLE에 의한 예시적인 Treg 개체군에서 용량-의존적 증가를 도시한다. 도 4F 는 IL2 + SB46 항체에 의한 대표적인 대조군 유세포측정 결과를 도시한다.
도 5A 는 WT mIL-2-HLE에 비해서 마우스의 E96-HLE 처리에서 CD3+ 세포의 서브세트로서 foxp3+ 세포의 백분율의 용량-의존적 확장의 비교를 도시하는 그래프이다. 도 5B 는 WT mIL-2-HLE에 비해서 E96-HLE 처리된 마우스에서 CD3+ 세포를 포함한, 비장세포의 용량-의존적 확장의 비교를 보여주는 그래프이다.
도 6A 는 단일 투여 라운드 이후에 WT 마우스에서 E62A-HLE 및 E96A-HLE의 효과를 시험하기 위한 실험 디자인을 보여주는 개략도이다. 도 6B 는 WT 마우스에 비해서 IL-2 뮤테인 E62A-HLE 및 E96A-HLE가 투여된 마우스에서 평균 체중 백분율이다. 도 6C 는 저용량을 비롯하여 고용량 투여에서 WT mIL-2-HLE 또는 WT hIL2-HLE에 비해서 E62A-HLE 또는 E96A-HLE로 마우스 처치 시 비장세포의 총수를 채점한 그래프이다.
도 7A 는 2회 투여 라운드 이후에 WT 마우스에서 E62A-HLE 및 E96A-HLE의 효과를 시험하기 위한 실험 디자인을 보여주는 개략도이다. 도 7B 는 WT 마우스에 비해서 IL-2 뮤테인 E62A-HLE 및 E96A-HLE의 2회 라운드로 투여된 마우스에서 평균 체중 백분율을 보여주는 그래프이다. 도 7C 는 저용량을 비롯하여 고용량 투여에서 WT mIL-2-HLE 또는 WT hIL2-HLE에 비해서 E62A-HLE 또는 E96A-HLE로 마우스의 처치 시 비장세포의 총수를 채점한 그래프이다.
도 8A 및 도 8D 는 WT 또는 IL-2 E62A-HLE 또는 E96A-HLE 뮤테인으로 마우스의 처치 이후에 CD4+ 세포의 비율로서 Treg 세포 백분율을 보여주는 그래프이다. 도 8B 및 도 8E 는 WT 또는 IL-2 E62A-HLE 또는 E96A-HLE 뮤테인으로 마우스의 처치 후 CD3+ 세포의 비율로서 CD8+ 세포 백분율을 보여주는 그래프이다. 도 8C 및 도 8F 는 E62A-HLE 또는 E96A-HLE로 마우스의 처치와 WT IL-2 처치를 비교하여 CD8:Treg 비율을 보여주는 그래프이다. 도 8A-도 8C 는 IL-2 뮤테인 또는 WT IL-2의 단일 라운드 투여에 관한 것이다. 도 8D-도 8F 는 IL-2 뮤테인 또는 WT IL-2의 2 라운드 투여에 관한 것이다.
도 9A 는 2회 투약 용법으로 IL-2 뮤테인의 투여 시 최대 30주까지 모니터링된 체중 백분율의 그래프이다. 도 9B 는 2회 투약 용법으로 IL-2 뮤테인이 처치된 마우스에서 측정된 혈당 수준의 그래프이다. 도 9C 는 비히클 대조군에 비해서 IL-2 뮤테인이 처치된 마우스의 개체군에서 당뇨병 발병을 보여주는 그래프이다.
도 10A 는 비히클 대조군에 비해서 IL-2 뮤테인 치료 용법 이후에 NK 세포에서 비장세포 및 PBMC에서 CD45+ 세포 백분율의 그래프이다. 도 10B 는 비히클 대조군에 비해서 IL-2 뮤테인 치료 용법 이후에 B 세포에서 비장세포 및 PBMC에서 CD45+ 세포 백분율의 그래프이다. 도 10C 는 비히클 대조군에 비해서 IL-2 뮤테인 치료 용법 이후에 CD4+ T 세포에서 CD45+ 세포 백분율의 그래프이다. 도 10D 는 비히클 대조군에 비해서 IL-2 뮤테인 치료 용법 이후에 CD8+ T 세포에서 CD45+ 세포 백분율의 그래프이다.
도 11A 는 비히클 대조군에 비해서 IL-2 뮤테인 치료 용법 이후에 PBMC 및 비장세포에서 CD45+ Treg의 그래프이다. 도 11B 는 비히클 대조군에 비해서 IL-2 뮤테인 치료 용법 이후에 PBMC 및 비장세포에서 Treg를 발현하는 CD45+ GITR (글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자)의 그래프이다.
도 12A 및 도 12B 는 비히클 대조군에 비해서 IL-2 뮤테인 치료 용법 이후 96시간에 마우스 말초 혈액에서 면역 세포의 백분율의 그래프이다.
도 13A 및 도 13B 는 비히클 대조군에 비해서 IL-2 뮤테인 치료 용법 이후 96시간에 림프절에서 면역 세포의 백분율의 그래프이다.
도 14A 및 도 14B 는 비히클 대조군에 비해서 IL-2 뮤테인 치료 용법 이후 96시간에 비장에서 면역 세포의 백분율의 그래프이다.
도 15A 및 도 15B 는 비히클 대조군에 비해서 IL-2 뮤테인 치료 용법 이후 96 시간에 종양에서 면역 세포의 백분율의 그래프이다.
도 16A 는 WT 인간 IL-2 및 인간 CD25 (IL-2Rα) 수용체 간 결합 친화성의 그래프이다. 도 16B 는 인간 IL-2 뮤테인 및 인간 CD25 (IL-2Rα) 수용체 간 결합 친화성의 그래프이다.
도 17A 는 WT IL-2 및 CD122 (IL-2Rβ) 수용체 간 결합 친화성의 그래프이다. 도 17B 는 IL-2 뮤테인 및 CD25 (IL-2Rβ) 수용체 간 결합 친화성의 그래프이다.
도 18A 는 hCTLA4 및 IL-2 WT 융합 단백질 간 결합 친화성의 그래프이다. 도 18B 는 hCTLA4, 및 IL-2 뮤테인, E62A 간 결합 친화성의 그래프이다.
도 19A 는 다수 라운드의 투여 이후에 사이노몰거스 원숭이에서, M23L, T111H 및 WT hIL-2의 효과를 시험하기 위한 실험 디자인을 보여주는 개략도이다. 도 19B 는 비히클-처치, WT hIL-2 처치, 및 IL-2 뮤테인, M23L-처치된 사이노몰거스 원숭이에서, 치료의 0, 1, 4, 7, 8, 11 및 14일에, CD4, 기억 CD4, 미경험 CD4, CD4 Treg, 기억 Treg, 미경험 Treg, CD8, NK 및 NKT 림프구 세포의 세포수 변화를 보여주는 그래프를 도시한다. 도 19C 는 비히클-처치, WT hIL-2 처치, 및 IL-2 뮤테인, T111H-처치된 사이노몰거스 원숭이에서 처치의 0, 1, 4, 7, 8, 11 및 14일에, CD4, 기억 CD4, 미경험 CD4, CD4 Treg, 기억 Treg, 미경험 Treg, CD8, NK 및 NKT 림프구 세포의 세포수 변화를 보여주는 그래프를 도시한다.
도 20A 는 PBS, E62A-HLE 및 M23L-HLE가 처치된 마우스에서 혈당 측정의 그래프를 도시한다. 도 20B 는 E62A-HLE, M23L-HLE 및 WT hIL-2-HLE가 처치된 마우스에서 시간 경과에 따른 고혈당증의 발병율의 그래프를 도시한다.

[정의]

본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위해서, 일정 용어를 먼저 하기에 정의한다. 하기 용어 및 다른 용어에 대한 추가 정의는 본 명세서 전반에 기재된다.

본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는, 단수형 "한, "하나" 및 "그"는 달리 명확하게 명시하지 않으면 다수 참조를 포함한다.

달리 특별히 명시하지 않거나 또는 문맥에서 분명하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 용어 "또는"은 "또는" 및 "및" 둘 모두를 포함하고 포괄하는 것으로 이해한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "예를 들어" 및 "즉"은 제한하려는 의도없이, 단지 예로서 사용되고, 명세서에 명시적으로 열거된 항목만을 지칭하는 것으로 해석되어서는 안된다.

용어 "이상", "적어도", "초과" 등, 예를 들어, "적어도 하나"는 명시된 값의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 또는 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 또는 그 이상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 것으로 이해한다. 또한 그 사이의 임의의 더 큰 수 또는 분수를 포함한다.

반대로, 용어 "이하"는 명시된 값 미만의 각 값을 포함한다. 예를 들어, "100 뉴클레오티드 이하"는 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 및 0 뉴클레오티드를 포함한다. 또한 그 사이의 임의의 더 작은 수 또는 분수를 포함한다.

용어 "다수", "적어도 2", "2 이상", 또는 "적어도 제2" 등은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 or 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 또는 그 이상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 것으로 이해한다. 또한 그 사이의 임의의 더 큰 수 또는 분수를 포함한다.

본 명세서 전반에서, 단어 "포함하는", 또는 "포함하다" 또는 "포함한" 등의 변형은 명시된 구성요소, 정수 또는 단계, 또는 구성요소, 정수 또는 단계의 그룹의 포함을 암시하지만, 임의의 다른 구성요소, 정수 또는 단계, 또는 구성요소, 정수 또는 단계의 그룹의 배제는 아니라는 것을 이해할 것이다.

문맥에서 특별히 명시하지 않거나 또는 그로부터 분명하지 않으면, 용어 "약은 당업계에서 일반적으로 허용되는 범위 내, 예를 들어, 평균의 2 표준 편차 이내로서 이해한다. "약"은 명시된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01%, 또는 0.001% 이내로 이해될 수 있다. 문맥에서 달리 명확하지 않으면, 본 명세서에서 제공되는 모든 수치값은 당업자가 이해할 수 있는 정상적인 변동을 반영한다.

본 명세서에서 사용되는 융합 단백질은 일반적으로 면역글로불린 분자 및 IL-2 분자를 포함하는 융합 폴리펩티드 분자를 의미하고, 융합 단백질의 성분은 펩티드 링커를 통해서 또는 직접적으로, 펩티드-결합을 통해 서로 연결된다. 명확함을 위해서, 융합 단백질의 면역글로불린 성분의 개별 펩티드 사슬은 예를 들어, 디술피드 결합을 통해, 비공유적으로 연결될 수 있다.

융합된 은 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 또는 직접적으로, 펩티드 결합에 의해 연결되는 성분을 의미한다.

특이적 결합 은 결합이 항원에 대해 선택적이고, 원치않거나 또는 비-특이적인 상호작용과 구별될 수 있는 것을 의미한다. 특이적 항원에 결합하는 면역글로불린의 능력은 효소-연결 면역흡착 어세이 (ELISA) 또는 당업자에게 친숙한 다른 기술, 예를 들어, 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기술 (BIAcore 장비에서 분석), 및 전통적인 결합 어세이를 통해서 측정될 수 있다. 일 구현예에서, 미관련 단백질에 대한 면역글로불린의 결합 정도는 예를 들어, SPR을 통해, 측정되는 항원에 대한 면역글로불린의 결합의 약 10% 미만이다. 일정 구현예에서, 항원에 결합하는 면역글로불린은 < 1 μM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0.1 nM, < 0.01 nM, 또는 < 0.001 nM (예를 들어, 10^-8 M 이하, 예를 들어, 10^-8 M 내지 10^-13 M, 예를 들어, 10^-9 M 내지 10^-13 M)의 해리 상수 (D)를 갖는다.

친화성 또는 결합 친화성 은 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위 및 이의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 간 비공유 상호작용의 총합의 강도를 의미한다. 달리 표시하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는, 결합 친화성은 결합쌍의 구성원 (예를 들어, 항체 및 항원) 간 1:1 상호작용을 반영하는 고유한 결합 친화성을 의미한다. 분자 X의 이의 파트너 Y에 대한 친화성은 일반적으로 해리 및 결합 속도 상수 (각각 koff 및 kon)의 비율인, 해리 상수 (KD)로 표시될 수 있다. 따라서, 등가 친화성은 속도 상수의 비율이 동일한 채로 남아있는 한, 상이한 속도 상수를 포함할 수 있다. 친화성은 본 명세서에 기술된 것들을 포함하여, 당분야에 공지된 통상적인 방법을 통해서 측정될 수 있다. 친화성을 측정하기 위한 특정 방법은 표면 플라스몬 공명 (SPR)이다.

감소된 결합, 예를 들어, Fc 수용체 또는 IL-2 수용체에 대한 감소된 결합은예를 들어, SPR을 통해 측정되는, 각각의 상호작용에 대한 친화성의 감소를 의미한다. 명확함을 위히서, 이 용어는 또한 0 (또는 분석 방법의 검출 한계 미만)까지 친화성의 감소, 즉 상호작용의 완전한 파기를 포함한다. 반대로, 증가된 결합 은 각 상호작용에 대한 결합 친화성의 증가를 의미한다.

본 명세서에서 Fc 도메인 또는 Fc 영역 은 불변 영역의 적어도 일부분을 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단을 한정하는데 사용된다. 이 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. IgG Fc 영역은 IgG CH2 및 IgG CH3 도메인을 포함한다. 인간 IgG Fc 영역의 CH2 도메인 은 일반적으로 약 위치 231의 아미노산 잔기로부터 약 위치 340의 아미노산 잔기까지 연장된다. 일 구현예에서, 탄수화물 사슬은 CH2 도메인에 부착된다. 본 명세서에서 CH2 도메인은 천연 서열 CH2 도메인 또는 변이체 CH2 도메인일 수 있다. "CH3 도메인"은 Fc 영역 내 CH2 도메인에 대한 C-말단에서 잔기의 스트레치를 포함한다 (즉, IGg의 약 위치 341에 아미노산 잔기로부터 약 위치 447에 아미노산 잔기까지). 본 명세서에서 CH3 영역은 천연 서열 CH3 도메인 또는 변이체 CH3 도메인 (예를 들어, 이의 한 사슬에 "돌출부" ("노브")가 도입되고 이의 다른 사슬에 상응하게 "공동" ("홀")이 도입된 CH3))일 수 있다. 이러한 변이체 CH3 도메인은 본 명세서에 기술된 바와 같은 2개의 비-동일 면역글로불린 중쇄의 이종이량체화를 촉진하는데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카르복실-말단까지 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재할 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있다. 본 명세서에서 달리 명시하지 않으면, Fc 영역 또는 불변 영역의 아미노산 잔기의 번호매김은 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기술된 바와 같이, EU 지수라고도 하는, EU 번호매김 체계에 따른다.

이펙터 기능 은 면역글로불린 이소타입에 따라서 다양한 면역글로불린의 Fc 영역에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 의미한다. 면역글로불린 이펙터 기능의 예는 Clq 결합 및 보체 의존적 세포독성 (CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC), 항체-의존적 세포의 식세포작용 (ADCP), 사이토카인 분비, 항원 제시 세포에 의한 면역 복합체-매개 항원 흡수, 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절, 및 B 세포 활성화를 포함한다.

활성화 Fc 수용체 는 면역글로불린의 Fc 영역에 의한 개입 이후에 이펙터 기능을 수행하도록 수용체-보유 세포를 자극하는 신호전달 사건을 유발하는 Fc 수용체이다. 활성화 Fc 수용체는 FcyRIIIa (CD 16a), FcyRI (CD64), FcyRIIa (CD32), 및 FcaRI (CD89)를 포함한다. 특정 활성화 Fc 수용체는 인간 FcyRIIIa (참조" UniProt 등록 번호 P08637 (version 141))이다.

본 명세서에서 사용되는 인터루킨-2 또는 IL-2 는 달리 표시하지 않으면, 포유동물 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함한, 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 IL-2를 의미한다. 이 용어는 비프로세싱된 IL-2를 비롯하여, 세포에서 프로세싱으로 생성되는 임의 형태의 IL-2를 포괄한다. 용어는 또한 IL-2의 천연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포괄한다. 인간 IL-2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1로 표시된다. 비프로세싱된 인간 IL-2는 성숙한 IL-2 분자에 부재하는, N-말단 20개 아미노산 신호 펩티드를 추가로 포함한다.

야생형 IL-2라고도 하는 야생형 IL-2 또는 천연 IL-2 는 천연 발생 IL-2를 의미한다. 천연 인간 IL-2 분자의 서열은 SEQ ID NO: 1로 표시된다. 본 발명의 목적을 위해서, 용어 야생형은 또한 천연 발생, 천연 IL-2와 비교하여 IL-2 수용체 결합을 변경시키지 않는 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 예컨대 예를 들어, 인간 IL-2의 잔기 125에 상응하는 위치의 시스테인의 알라닌으로의 치환을 포함하는 IL-2의 형태를 포괄한다. 일부 구현예에서 본 발명의 목적을 위한 야생형 IL-2는 아미노산 치환 C125A를 포함한다 (SEQ ID NO: 3 참조).

본 명세서에서 사용되는 CD25 또는 IL-2 수용체 α 는 달리 표시하지 않으면, 포유동물 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하는, 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 CD25를 의미한다. 이 용어는 "전체-길이", 비프로세싱된 CD25를 비롯하여, 세포에서 프로세싱으로 생성되는 임의 형태의 CD25를 포괄한다. 이 용어는 또한 CD25의 천연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포괄한다. 일정 구현예에서 CD25는 인간 CD25이다.

본 명세서에서 사용되는 고친화성 IL-2 수용체 는 수용체 γ 서브유닛 (일반적인 사이토카인 수용체 γ 서브유닛, yc, 또는 CD132라고도 알려짐), 수용체 β 서브유닛 (CD122 또는 p70으로도 알려짐) 및 수용체 a-서브유닛 (CD25 또는 p55로도 알려짐)으로 이루어진, IL-2 수용체의 이종삼량체 형태를 의미한다. 대조적으로, 용어 중간 친화성 IL-2 수용체 또는 IL-2 수용체 βγ 는 a-서브유닛없이, 오직 γ-서브유닛 및 β-서브유닛만을 포함하는 IL-2 수용체를 의미한다 (고찰을 위해, 예를 들어, [Olejniczak and Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-189 (2008)] 참조).

조절 T 세포 또는 Treg 세포 는 다른 T 세포 (이펙터 T 세포)의 반응을 억제할 수 있는 CD4+ T 세포의 특수한 유형을 의미한다. Treg 세포는 CD4, IL-2 수용체 (CD25)의 a-서브유닛, 및 전사 인자 FOXP3 (forkhead box P3)의 발현을 특징으로 하고 (Sakaguchi, Annu Rev Immunol 22, 531-62 (2004)), 종양에 의해 발현되는 것을 포함하여, 항원에 대한 말초 자기-내성의 유도 및 유지에서 핵심적인 역할을 한다.

CD4+ T 세포 는 조절 T 세포이외의 CD4+ T 세포를 의미한다. 통상의 CD4+ 기억 T 세포는 FOXP3이 아닌, CD4, CD3의 발현을 특징으로 한다. 통상의 CD4+ 기억 T 세포는 CD45RA를 발현하지 않는 통상의 CD4+ 미경험 T 세포와 대조적으로, CD45RA의 발현의 결여를 더욱 특징으로 하는, 통상의 CD4+ T 세포의 서브세트이다.

Treg 세포의 선택적 활성화 란, 다른 T 세포 서브세트 (예컨대 CD4+ T 헬퍼 세포, CD8+ 세포독성 T 세포, NK T 세포) 또는 자연 살해 (NK) 세포의 공존하는 활성화가 본질적으로 없는 Treg 세포의 활성화를 의미한다. 이들 세포 유형을 확인하고 구별하기 위한 방법은 실시예에 기술된다. 활성화는 IL-2 수용체 신호전달의 유도 (예를 들어, 인산화 STAT5a의 검출을 통해 측정), 증식의 유도 (예를 들어, Ki-67의 검출을 통해 측정) 및/또는 활성화 마커 (예컨대, 예를 들어, CD25)의 발현의 상향-조절을 포함할 수 있다.

용어 펩티드 링커 는 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2-20개 아미노산을 포함하는 펩티드를 의미한다. 펩티드 링커는 당분야에 공지되어 있거나 또는 본 명세서에 기술되어 있다. 적합한, 비면역원성 링커 펩티드는 예를 들어, (G4S)n, (SG4)n 또는 G4(SG4),, 펩티드 링커를 포함하고, "n"은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4의 수이다.

용어 변형 은 펩티드 골격 (예를 들어, 아미노산 서열)의 임의 조작 또는 폴리펩티드의 번역후 변형 (예를 들어, 글리코실화)을 의미한다.

노브-인투-홀 (knob-into-hole) 변형 은 CH3 도메인의 2개 면역글로불린 중쇄 사이 계면 내 변형을 의미하고, i) 한 중쇄의 CH3 도메인에서, 아미노산 잔기는 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환되어서, 다른 중쇄의 CH3 도메인의 계면 내 공동 ("홀")에 위치할 수 있는 한 중쇄의 CH3 도메인의 계면 내 돌출부 ("노브")를 생성하고, ii) 다른 중쇄의 CH3 도메인에서, 아미노산 잔기는 더 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환되어서, 제1 CH3 도메인의 계면 내 돌출부 ("노브")가 위치할 수 있는 제2 CH3 도메인의 계면 내 공동 ("홀")을 생성한다. 일 구현예에서, "노브-인투-홀 변형"은 항체 중쇄 중 하나에 아미노산 치환 T366W 및 임의로 아미노산 치환 S354C, 및 항체 중쇄의 다른 하나에 아미노산 치환 T366S, L368A, Y407V 및 임의로 Y349C를 포함한다. 노브-인투-홀 기술은 예를 들어, 미국 특허 제5,731,168호; 미국 특허 제7,695,936호; [Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)] 및 [Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)]에 기술된다. 일반적으로, 방법은 제1 폴리펩티드의 계면에 돌출부 ("노브") 및 제2 폴리펩티드의 계면에 상응하는 공동 ("홀")을 도입하여서, 이종이량체 형성을 촉진하고 동종이량체 형성을 방해하도록 돌출부가 공동에 위치될 수 있는 단계를 포함한다. 돌출부는 제1 폴리펩티드의 계면으로부터의 소형 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 치환시켜서 구축된다. 돌출부와 동일하거나 또는 유사한 크기의 상보적 공동은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 것 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)으로 치환시켜서 제2 폴리펩티드의 계면에 생성된다. 각각 위치 S354 및 Y349에 2개 시스테인 잔기의 도입은 Fc 영역의 2개 항체 중쇄 사이에서 디술피드 가교의 형성을 일으켜서, 이량체를 더 안정화시킨다 (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).

아미노산 치환 은 폴리펩티드에서 한 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 의미한다. 일 구현예에서, 아미노산은 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 다른 아미노산으로 치환되고, 예를 들어, 보존성 아미노산 치환이다.

보존성 아미노산 치환 은 관여된 잔기의 극성, 전하, 가용성, 소수성, 친수성, 및/또는 양친매성 속성의 유사성을 기반으로 만들어질 수 있다. 예를 들어, 극성 (소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 및 메티오닌을 포함하고; 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함하고; 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신, 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 비보존성 치환은 이들 클래스 중 한 구성원을 다른 클래스로 교환하는 것을 수반할 것이다. 예를 들어, 아미노산 치환은 또한 한 아미노산을 상이한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 다른 아미노산으로의 치환, 예를 들어, 한 그룹 (예를 들어, 극성)의 아미노산을 다른 그룹 (예를 들어, 염기성)의 다른 아미노산으로의 치환을 일으킬 수 있다. 아미노산 치환은 당분야에 충분히 공지된 유전적 또는 화학적 방법을 사용해 생성될 수 있다. 유전적 방법은 부위-지정 돌연변이유발법, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 유전적 조작, 예컨대 화학적 변형이외의 방법을 통해서 아미노산의 측쇄 기를 변경시키는 방법이 또한 유용할 수 있다는 것을 고려한다. 동일한 아미노산 치환을 표시하기 위해서 다양한 명칭이 본 명세서에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 중쇄의 위치 329에서 프롤린의 글리신으로의 치환은 329G, G329, G329, P329G, 또는 Pro329Gly로서 표시될 수 있다.

기준 폴리펩티드 서열에 대한 퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성 은 서열을 정렬하고 최대 퍼센트 서열 동일성을 획득하기 위해, 필요하면, 갭을 도입시키고, 서열 동일성의 일부로서 임의 보존성 치환은 고려하지 않은 이후에, 기준 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬은 예를 들어, 공공으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여, 당분야의 기술 내에 있는 다양한 방식으로 획득될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이 상에서 최대 정렬을 획득하는데 필요한 임의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 그러나, 본 명세서의 목적을 위해서, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2을 사용해 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.가 만들었고, 소스 코드는 미국 저작권청 (Washington D.C., 20559)에 사용자 문서와 함께 제출되었고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc. (South San Francisco, California)에서 공공으로 입수가능하거나, 또는 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지탈 UNIX V4.0D를 포함한, UNIX 운용 체계 상에서 사용을 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 다양하지 않다. ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 적용되는 상황에서, 소정 아미노산 서열 B에 대한 소정 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성 (대안적으로 소정 아미노산 서열 B에 대해 일정 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 또는 포함하는 소정 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다: 분수 X/Y의 100배, 여기서 X는 A 및 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 동일한 일치로서 채점된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않을 것임을 이해할 것이다. 달리 특별히 명시하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 단락에 기술된 바와 같이 수득된다. 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 의미하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 그들 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제 또는 합성 반응에 의해 중합체에 도입될 수 있는 임의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 그들 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분이 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 합성 이후 만들어진 변형(들), 예컨대 표지와 접합을 포함할 수 있다.

본 발명의 기준 뉴클레오티드 서열과 적어도, 예를 들어, 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드란, 폴리뉴클레오티드 서열이 기준 뉴클레오티드 서열의 각 10 뉴클레오티드 당 최대 5개 점 돌연변이를 포함할 수 있는 것을 제외하고, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 기준 서열과 동일하다는 것을 의도한다. 다른 말로, 기준 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해서, 기준 서열의 뉴클레오티드의 최대 5%는 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나 또는 결실될 수 있거나, 또는 기준 서열의 전체 뉴클레오티드의 최대 5%의 다수 뉴클레오티드가 기준 서열에 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이들 변경은 기준 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단에서, 또는 개별적으로 기준 서열의 잔기들 중에서 또는 기준 서열 내 하나 이상의 인접한 그룹에 산재되는, 이들 말단 위치 사이의 임의 위치에서 일어날 수 있다. 실질적인 문제로서, 임의의 특정한 폴리뉴클레오티드 서열이 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한지 여부는 기지의 컴퓨터 프로그램, 예컨대 폴리펩티드에 대해서 상기 논의된 것들 (예를 들어, ALIGN-2)을 사용해 통상적으로 결정될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 벡터 는 이것이 연결되는 다른 핵산을 전파할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 이 용어는 자기-복제 핵산 구조로서 벡터를 비롯하여 이것이 도입되는 숙주의 게놈에 도입되는 벡터를 포함한다. 일정 벡터는 그들이 작동적으로 연결된 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본 명세서에서 "발현 벡터"라고 한다. 용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양"은 상호교환적으로 사용되고, 이러한 세포의 자손을 포함하여, 외생성 핵산이 도입된 세포를 의미한다. 숙주 세포는 초대 형질전환된 세포 및 계대수와 무관하게 그로부터 유래되는 자손을 포함하여, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함한다. 자손은 부모 세포와 핵산 함량이 완전하게 동일하지 않을 수 있지만, 돌연변이를 함유할 수 있다. 본래 형질전환된 세포에서 스크리닝 또는 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본 명세서에 포함된다. 숙주 세포는 본 발명의 융합 단백질을 생성시키는데 사용될 수 있는 임의 유형의 세포 시스템이다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들어, 포유동물 배양된 세포, 예컨대 CHO 세포, BH 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 식물 세포, 몇가지 예를 들면, 또한, 유전자이식 동물, 유전자이식 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포를 포함한다.

작용제의 유효량 은 투여되는 세포 또는 조직에 생리적 변화를 일으키는데 필요한 양을 의미한다.

작용제, 예를 들어, 약학 조성물의 치료적 유효량 은 원하는 치료적 또는 예방적 결과를 획득하기 위해, 필요한 시간 기간 동안, 및 용량에서, 효과적인 양을 의미한다. 작용제의 치료적 유효량은 예를 들어 질환의 부작용을 제거하거나, 감소시키거나, 지연시키거나, 최소화하거나, 또는 예방한다.

개체 또는 대상체 는 포유동물이다. 포유동물은 길들여진 동물 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개, 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특히, 개체 또는 대상체는 인간이다.

약학 조성물은 그에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 허용하는 형태로 존재하고, 제제가 투여되는 대상체에게 허용불가하게 독성인 추가 성분을 함유하지 않는 조제물을 의미한다.

약학적으로 허용가능한 담체 는 대상체에게 무독성인, 활성 성분 이외의, 약학 조성물의 성분을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 완충제, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

치료 (및 이의 문법적 변형, 예컨대 "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체에서 질환의 자연적 추이를 변경시키려고 시도되는 임상적 중재술을 의미하고, 예방을 위해서 또는 임상 병리학 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 원하는 효과는 질환 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 감소, 전이의 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 질환의 발병을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 둔화시키는데 사용된다.

자가면역 질환 은 개체 자신의 조직으로부터 발생되고 그에 대해 유도된 비-악성 질환 또는 장애를 의미한다. 자가면역 질환 또는 장애의 예는 염증성 반응, 예컨대 건선 및 피부염 (예를 들어, 아토피성 피부염)을 포함한 염증성 피부 질환; 염증성 장 질환과 연관된 반응 (예컨대 크론병 및 궤양성 대장염); 피부염; 알레르기성 병태 예컨대 습진 및 천식; 류마티스성 관절염; 전신 홍반성 루푸스 (SLE) (루푸스 신염, 피부 루푸스를 포함하지만, 이에 제한되지 않음); 진성 당뇨병 (예를 들어, 1형 진성 당뇨병 또는 인슐린 의존성 진성 당뇨병); 다발성 경화증 및 소아 발병 당뇨병을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 자가면역 질환의 추가예는 예를 들어, 다발성 경화증 (MS), 루푸스, 강직성 척추염, 관절염, 대장염, 1형 당뇨병, 크론병, 심장병, 이식편 대 숙주 질환, 임신 중 면역 반응으로 인한 합병증, 세포 또는 고형 장기 이식의 거부, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 및 중증 근무력증을 포함한다.

실질적으로 는 관심 특징 또는 속성의 전체 또는 거의 전체 정도 또는 범위를 나타내는 질적 상태를 의미한다. 생물학적 분야의 당업자는 생물학적 및 화학적 현상이 극히 드물게 완료되고/되거나 완전하게 진행되거나 또는 절대 결과를 획득하거나 또는 피한다는 것을 이해할 것이다. 그러므로 용어 실질적으로는 본 명세서에서 많은 생물학적 및 화학적 현상에 내재된 완전성의 잠재적 결여를 포착하는데 사용된다.

달리 정의하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 출원이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하고, 본 출원이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 바와 동일한 의미를 갖고, 이러한 기술은 그 전체로 참조로 편입된다. 분쟁의 경우에, 정의를 포함한 본 명세서가 우선하게 된다.

[구현예의 설명]

본 발명은 특히 자가면역 질환의 예방 및 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 조절 T 세포의 증식을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 조절 T 세포의 증식을 활성화시키기 위한 방법에서 인간 인터루킨-2 뮤테인을 사용한다.

본 발명의 다양한 양태가 하기 섹션에서 상세히 설명된다. 섹션의 사용은 본 발명을 제한하려는 의미가 아니다. 각 섹션은 본 발명의 임의 양태에 적용될 수 있다. 본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 명시하지 않으면 "및/또는"을 의미한다.

IL-2 뮤테인

본 명세서는 Treg 세포의 존재 및/또는 활성을 증가시키는데 사용될 수 있는 다양한 IL-2 뮤테인을 기술한다. 본 명세서에서 사용되는 IL-2 뮤테인은 자가면역 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.

IL-2 변이체 (본 명세서에서 "IL-2 뮤테인"이라고도 함)는 야생형 IL-2와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93% 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 아미노산의 서열을 포함한다. IL-2 변이체는 야생형 IL-2의 기능성 단편과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93% 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 아미노산의 서열을 더 포함한다. 본 명세서에서 사용되는, "야생형 IL-2"는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 의미한다 (표 1 참조).

변이체는 야생형 IL-2 아미노산 서열 내에 하나 이상의 치환, 결실, 또는 삽입을 함유할 수 있다. 잔기는 본 명세서에서 1글자 아미노산 코드에 이어서 IL-2 아미노산 위치로 표시된다. 치환은 본 명세서에서 1글자 아미노산 코드에 이어서 IL-2 아미노산 위치와 그 뒤에 치환되는 1글자 아미노산 코드로 표시된다.

일 양태에서 본 발명은 조절 T 세포의 증식을 선택적으로 활성화시킬 수 있는 T111H, T37Y, E15T, M23L, P34F, E68F 및 E62A로 이루어진 군으로부터 선택되는 야생형 IL-2에 대한 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 인간 인터루킨-2 뮤테인을 제공한다. 따라서, 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 T111H 치환을 특징으로 하는 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 T37Y 치환을 특징으로 하는 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 E15T 치환을 특징으로 하는 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 M23L 치환을 특징으로 하는 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 P34F 치환을 특징으로 하는 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 E68F 치환을 특징으로 하는 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 E62A 치환을 특징으로 하는 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는다.

일 양태에서, IL-2 돌연변이는 V91I, V91L, V91W, E95Q, E95S, E95N, L12Y, L19V, D84E, L19F, E95D, I92Y, E95T, I92V, L12V, I92W, D84T, D84S, M23L, I92F, M23I, H16Y, E15D, L12I, E15S, L12M, D20N, H16R, E15T, D20T, N88S, S87T, V91F, V91M, H16K, L19M, L19I, T111W, F42R, T111F, D109H, P34Q, P34W, D109W, T111N, T41Y, Y45W, L72W, L72F, E68Q, P34F, P65R, P65E, P65Q, E61W, T111H, F42M, T37Y, K43W, T111M, E68F, T111Y, N71W, L72R, E68W, K35T, E106W, K48V, P34Y, D109K, T111Q, E68R, K48S, K48H, P65N, E68Y, D109R, M104H, T41H, M104I, K48I 또는 S87E로 이루어진 군으로부터 선택된다. 따라서, 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 V91I 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 V91L 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 V91W 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 E95Q 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 E95N 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 L12Y 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 L19V 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 D84E 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 L19F 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 E95D 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 I92Y 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 E95T 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 I92V 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 L12V 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 I92W 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 D84T 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 D84S 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 M23L 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 I92F 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 M23I 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 H16Y 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 E15D 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 L12I 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 E15S 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 L12M 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 D20N 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 H16R 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 E15T 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 D20T 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 N88S 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 S87T 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 V91F 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 V91M 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 H16K 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 L19M 치환을 포함한다. L19I 치환. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 T111W 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 F42R 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 T111F 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 D109H 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 P34Q 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 P34W 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 D109W 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 T111N 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 T41Y 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 Y45W 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 L72W 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 L72F 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 E68Q 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 P34F 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 P65R 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 P65E 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 P65Q 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 E61W 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 T111H 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 F42M 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 T37Y 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 K43W 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 T111M 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 E68F 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 T111Y 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 N71W 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 L72R 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 E68W 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 K35T 치환을 포함한다. 일부 구현에서, IL-2 뮤테인은 E106W 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 K48V 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 P34Y 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 D109K 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 T111Q 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 E68R 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 K48S 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 K48H 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 P65N 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 E68Y 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 D109R 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 M104H 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 T41H 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 M104I 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 K48I 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 S87E 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 V91I, V91L, V91W, E95Q, E95S, E95N, L12Y, L19V, D84E, L19F, E95D, I92Y, E95T, I92V, L12V, I92W, D84T, D84S, M23L, I92F, M23I, H16Y, E15D, L12I, E15S, L12M, D20N, H16R, E15T, D20T, N88S, S87T, V91F, V91M, H16K, L19M, L19I, T111W, F42R, T111F, D109H, P34Q, P34W, D109W, T111N, T41Y, Y45W, L72W, L72F, E68Q, P34F, P65R, P65E, P65Q, E61W, T111H, F42M, T37Y, K43W, T111M, E68F, T111Y, N71W, L72R, E68W, K35T, E106W, K48V, P34Y, D109K, T111Q, E68R, K48S, K48H, P65N, E68Y, D109R, M104H, T41H, M104I, K48I 및 S87E로부터 선택되는 더 많은 치환을 포함한다.

일 양태에서, 본 발명은 야생형 IL-2에 비해서 IL-2Rα에 대해 더 높은 친화성을 갖는 면역억제성 IL-2 변이체를 제공한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, IL-2Rα에 대해 더 높은 친화성을 갖는 IL-2 뮤테인은 T111H, T37Y, P34F 및 E68F로부터 선택되는 아미노산 치환을 갖는 IL-2 뮤테인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 IL-2 변이체는 약 4.35 x 10^-6 (M) 내지 약 7.62 x 10-¹¹ (M)의 결합 친화성을 갖는다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 IL-2 변이체는 약 4 x 10^-6 (M), 약 5 x 10^-6 (M), 약 6 x 10^-6 (M), 약 7 x 10^-6 (M), 또는 약 8 x 10^-6 (M)의 결합 친화성을 갖는다.

일부 구현예에서, IL-2 변이체는 IL-2Rα에 접촉하거나 또는 IL-2Rα에 접촉하는 다른 위치의 배향을 변경시키는 IL-2 서열의 위치에 하나 이상의 돌연변이를 함유하여서, IL-2Rα에 대해 더 높은 친화성을 야기한다. 돌연변이는 공개된 결정 구조를 기반으로 예측되는 IL-2Rα에 밀접하게 근접한 것으로 알려진 영역 내 또는 근처 영역에 존재할 수 있다. 본 명세서는 디자인되고 시험관내 결합 어세이 및 생체내 어세이에서 기능적 성질에 대해 시험되는 특별한 IL-2 뮤테인을 기술한다.

다른 양태에서, 본 발명은 야생형 IL-2에 비해서 IL-2Rβ에 대해 더 낮은 친화성을 갖는 면역억제성 IL-2 변이체를 제공한다. 예를 들어, 일부 구현예에서 IL-2Rβ에 대해 더 낮은 친화성을 갖는 IL-2 뮤테인은 E15T 및 M23L로부터 선택되는 아미노산 치환을 갖는 IL-2 뮤테인을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-2 변이체는 1.6 x 10^-6 (M) 초과의 IL-2Rβ에 대한 친화성을 갖는다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 IL-2Rα에 대해 더 낮은 친화성을 갖는 면역억제성 IL-2 뮤테인을 제공한다. 일 구현예에서, IL-2Rα에 대해 더 낮은 친화성을 갖는 IL-2 뮤테인은 E62A 치환을 포함한다.

일 양태에서, IL-2 뮤테인은 WT IL-2에 비해서 IL-2Rβ에 대해 더 높은 결합 친화성을 갖는다.

면역억제성 IL-2 변이체는 또한 IL-2R을 통해 야생형 IL-2에 의해 활성화되는 일정 경로를 통한 변경된 신호전달이 입증되고 T-reg의 우선적인 증식/생존/활성화를 일으키는 변이체를 포함한다. IL-2R의 활성화 시에 인산화되는 것으로 알려진 분자는 STAT5, p38, ERK, SYK, LCK, AKT 및 mTOR을 포함한다. 야생형 IL-2와 비교하여, 면역억제성 IL-2 변이체는 야생형 IL-2와 비교해 AKT 및/또는 mTOR의 인산화의 감소를 통해 측정될 수 있는, FOXP3 T 세포에서의 감소된 PI3K 신호전달을 보유할 수 있다. 이러한 변이체는 IL-2Rβ 또는 IL-2Rγ와 접촉하거나 또는 IL-2Rβ 또는 IL-2Rγ와 접촉하는 다른 위치의 배향을 변경시키는 위치에 돌연변이를 포함할 수 있다.

일정 구현예에서, IL-2 변이체는 IL-2Rα 또는 IL-2Rβ 또는 둘 모두에 대한 결합을 증가시키거나 또는 감소시키는 돌연변이를 조합한 돌연변이의 조합을 포함한다. 바람직한 구현예에서, IL-2 변이체는 FOXP3-양성 조절 T 세포에서 STAT5 인산화를 자극하지만, 야생형 IL-2와 비교하여 FOXP3-음성 T 세포에서 STAT5 및 AKT 인산화를 유도하는 감소된 능력을 갖는다.

일부 구현예에서, IL-2 변이체는 IL-2Rβ 또는 L-2Rγ에 대한 친화성에 영향을 미치지 않는 야생형 IL-2 서열과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 더 포함할 수 있고, 단 IL-2 변이체는 FOXP3을 발현하지 않는 다른 T 세포에 비해서 FOXP3⁺ T-reg의 우선적 증식, 생존, 활성화 또는 기능을 촉진한다. 바람직한 구현예에서, 이러한 돌연변이는 보존성 돌연변이이다.

일부 구현예에서, 본 명세서에서 사용되는, 본 발명에 적합한 IL-2 뮤테인은 실질적인 IL-2 생물학적 활성을 보유하는 임의의 야생형 및 변형된 IL-2 변이체 (예를 들어, 아미노산 돌연변이, 결실, 삽입, 및/또는 융합 단백질을 갖는 IL-2 단백질)를 포함한다. 전형적으로, 재조합 IL-2 단백질은 재조합 기술을 사용해 생산된다. 그러나, 천연 공급원으로부터 정제되거나 또는 화학적으로 합성된 IL-2 단백질 (야생형 또는 변형)은 본 발명에 따라서 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 적합한 재조합 IL-2 뮤테인은 약 1 분, 2 분, 10 분, 15 분, 30 분, 60 분, 70 분, 80 분, 90 분, 100 분, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 12 시간, 또는 24 시간 이상의 생체내 반감기를 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 재조합 IL-2 뮤테인 또는 재조합 IL-2 융합 단백질은 약 24 시간, 30 시간, 36 시간, 42 시간, 48 시간, 54 시간, 또는 60 시간 이상의 생체내 반감기를 갖는다. 일부 구현예에서, 재조합 IL-2 뮤테인은 0.5 내지 24 시간, 1 일 내지 10 일, 1 일 내지 9 일, 1 일 내지 8 일, 1 일 내지 7 일, 1 일 내지 6 일, 또는 1 일 내지 5 일의 생체내 반감기를 갖는다.

일부 구현예에서, 본 명세서는 조작된 재조합 IL-2 변이체를 제시한다. 일부 구현예에서, 조작된 재조합 변이체는 IgG Fc에 융합된다. 일부 구현예에서, 조작된 재조합 IL-2 변이체는 인간 IgG1 Fc에 융합된다.

당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 임의의 이러한 중쇄 CDR 서열은, 본 명세서에 개시되거나 또는 달리 당분야에 공지된 바와 같은 임의 형식의 결합 분자 또는 항체에 존재할 수 있는 바와 같이, IL-2와, 예를 들어, 분자 생물학 기술을 통해서, 본 명세서에 개시되거나 또는 달리 당분야에 공지된 바와 같은 임의의 프레임워크 영역, CDR, 또는 불변 도메인, 또는 이의 일부를 포함하여, 본 명세서에 제공되거나 또는 달리 당분야에 공지된 임의의 다른 항체 서열 또는 도메인과 쉽게 조합될 수 있다.

자가면역 질환

자가면역 질환, 장애, 또는 병태는 대상체에서 Treg 증식 및/또는 활성을 촉진하는 IL-2 뮤테인의 투여로 치료할 수 있거나 또는 그에 의해 예방될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 하나 이상의 IL-2 뮤테인은 자가면역 질환, 장애, 또는 병태를 치료하는데 사용된다.

발병 및/또는 중증도가 감소될 수 있는 이러한 질환, 장애, 및 병태는 염증, 자가면역 질환, 부신생물성 자가면역 질환, 연골 염증, 섬유성 질환 및/또는 뼈 분해, 관절염, 류마티스성 관절염, 소아 관절염, 소아 류마티스성 관절염, 소관절 소아 류마티스성 관절염, 다관절 소아 류마티스성 관절염, 전신 발병 소아 류마티스성 관절염, 소아 강직성 척추염, 소아 장병성 관절염, 소아 반응성 관절염, 소아 레터 증후군, SEA 증후군 (혈청음성, 골부착부병증, 관절병증 증후군), 소아 피부근염, 소아 건선성 관절염, 소아 경피증, 소아 전신 홍반성 루푸스, 소아 혈관염, 소관절 류마티스성 관절염, 다관절 류마티스성 관절염, 전신 발병 류마티스성 관절염, 강직성 척추염, 장병성 관절염, 반응성 관절염, 레터 증후군, SEA 증후군 (혈청음성, 골부착부병증, 관절병증 증후군), 피부근염, 건선성 관절염, 경피증, 전신 홍반성 루푸스, 혈관염, 근염, 다발성 근염, 피부근염, 골관절염, 결절성 다발동맥염, 베게너 육아종증, 동맥염, 류마티스성 다발성 근육통, 유육종증, 경피증, 경화증, 원발성 담즙성 경화증, 경화성 담관염, 쇼그렌 증후군, 건선, 판상 건선, 점상 건선, 역위 건선, 농포성 건선, 홍피성 건선, 피부염, 아토피성 피부염, 죽상동맥경화증, 루푸스, 스틸병, 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 중증 근무력증, 염증성 장 질환 (IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 셀리악병, 다발성 경화증 (MS), 천식, COPD, 길랭-바레병, I형 진성 당뇨병, 갑상선염 (예를 들어, 그레이브스병), 애디슨병, 레이노 현상, 자가면역 간염, GVHD, 이식 거부, 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, T-reg-선택적 IL-2 변이체의 치료적 유효량을 포함하는 약학 조성물이 제공된다.

일부 구현예에서, 질환은 MS, 루푸스, 강직성 척추염, 관절염, 대장염, I형 당뇨병, 염증성 질환의 중증도 완화, 크론병, 심장 질환, 임신 중 면역 반응으로부터의 합병증 완화, 이식편 대 숙주 질환 (GVHD)으로부터의 합병증 완화, 알레르기 중증도 완화, HSC 또는 동종 고형 장기 이식의 거부 감소, 우울증, ALS 및/또는 중증 근무력증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

용어 "치료"는 장애의 적어도 하나의 증상 또는 다른 측면의 완화 또는 예방, 또는 질환 중증도의 감소 등을 포괄한다. T-reg-선택적 IL-2 변이체는 성공할 수 있는 치료제를 구성하기 위해서, 완전한 치유를 실시하거나, 질환의 모든 증상 또는 징후를 근절할 필요는 없다. 관련 분야에서 인식되는 바와 같이, 치료제로서 적용되는 약물은 소정 질환 상태의 중증도를 감소시킬 수 있지만, 유용한 치료제로서 간주되도록 질환의 모든 징후를 제거할 필요는 없다. 유사하게, 예방적으로 투여되는 치료는 성공할 수 있는 예방제를 구성하기 위해서 병태의 발병을 예방하는데 완전하게 효과적일 필요는 없다. 질환 영향의 단순한 감소 (예를 들어,이의 증상의 수 또는 중증도의 감소, 또는 다른 치료의 유효성 증가, 또는 다른 유리한 효과의 생성에 의함), 또는 질환이 대상체에서 발생되거나 또는 악화될 가능성의 감소로 충분하다. 본 발명의 일 구현예는 예방 또는 치료를 위해서, 즉, 특정 장애의 중증도를 반영하는 표시자의 기준점에 비해 지속적인 개선을 유도하기에 충분한 시간 동안 및 충분한 양으로 T-reg-선택적 IL-2 변이체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

자가면역 염증을 억제하는 조절 T 세포 (Treg)

조절 T 세포 (Treg) 세포는 자기-내성 및 정상 면역 항상성을 유지하고, 자가면역 염증을 억제하는데서 중요한 역할을 하는 FOXP3+ CD4+ 세포이다. 현재의 면역억제성 치료제는 일반적으로 개별 프로염증성 경로를 표적화하고 종종 부분적 효능을 나타내거나 또는 오직 특정 질환에만 적용가능하다. 본 발명은 천연 억제인자 세포의 증가된 선택적 생산 및 활성화를 포함하는 자가면역 질환을 억제하는 방법을 제공한다.

본 명세서는 T-reg 세포 증식, 생존, 활성화 및/또는 기능을 선택적으로 촉진하는 치료제를 기술한다. "선택적으로 촉진하다"란, 치료제가 T-reg 세포의 활성을 촉진하지만, 비-조절 T 세포의 활성을 촉진하는 능력이 결여되거나 또는 제한된 것을 의미한다.

일정 구현예에서, 작용제는 IL-2 변이체이다. 특히, IL-2 변이체는 T-reg 세포 성장/생존의 이들 활성을 촉진하지만, 야생형 IL-2과 비교하여, 비-조절 T-세포 (FOXP3 CD25-) 및 NK 세포 증식, 생존, 활성화 및/또는 기능을 촉진하는 감소된 능력을 가져서, 부작용을 최소화한다.

일정 구현예에서, 이러한 IL-2 변이체는 IL-2R 서브유닛 IL-2Rα (CD25)에 대한 상승된 친화성 및 신호전달 서브유닛 IL-2Rβ 및/또는 IL-2Rγ에 대한 감소된 친화성의 조합을 통해서 기능한다. IL-2 및 이의 변이체가 당분야에서, 예를 들어, 암 또는 감염성 질환을 치료하는 방법에서, 면역자극제로서 사용되어 왔지만, 본 명세서에 기술된 IL-2 변이체는 예를 들어, 염증성 장애를 치료하는 방법에서, 면역억제제로서 특히 유용하다.

IL-2 융합 단백질

일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 적합한 IL-2 뮤테인은 다른 펩티드에 융합될 수 있다. 예를 들어, 재조합 IL-2 뮤테인은 예를 들어, IL-2 단백질의 안정성, 효력 및/또는 전달을 강화 또는 증가시키거나, 또는 면역원성 또는 제거성을 감소 또는 제거시켜서, IL-2의 치료적 효과를 촉진할 수 있는 다른 도메인 또는 모이어티 및 IL-2 도메인 간 융합 단백질일 수 있다. IL-2 융합 단백질을 위한 이러한 적합한 도메인 또는 모이어티는 Fc 도메인, XTEN 도메인, 또는 인간 알부민 융합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 다른 구현예에서, IL-2 융합 단백질을 위한 이러한 적합한 도메인 또는 모이어티는 항체의 VH 도메인을 포함한다.

Fc 도메인

일부 구현예에서, 적합한 재조합 IL-2 단백질은 FcRn 수용체에 결합하는 Fc 도메인 또는 이의 일부를 포함한다. 비제한적인 예로서, 적합한 Fc 도메인은 면역글로불린 서브클래스 예컨대 IgG로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 Fc 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 Fc 도메인은 IgM, IgA, IgD, 또는 IgE로부터 유래될 수 있다. 특히 적합한 Fc 도메인은 인간 또는 인간화 항체로부터 유래된 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 Fc 도메인은 변형된 Fc 부분, 예컨대 변형된 인간 Fc 부분이다.

일부 구현예에서, 적합한 Fc 도메인은 표 1에 제공된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.

표 1. 예시적인 Fc 도메인

일부 구현예에서, 적합한 Fc 도메인은 표 1에 개시된 Fc 도메인 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상으로 상동성이거나 또는 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

Fc 도메인 및 FcRn 수용체 간 개선된 결합은 재조합 단백질의 연장된 혈청 반감기를 야기하는 것으로 여겨진다. 따라서, 일부 구현예에서, 적합한 Fc 도메인은 FcRn에 대한 개선된 결합을 야기하는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. FcRn에 대한 개선된 결합을 실행하는 Fc 도메인 내 다양한 돌연변이는 당분야에 공지되어 있고 본 발명을 실시하기 위해 적합화될 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 Fc 도메인은 EU 번호매김에 따라서, 인간 IgG1의 Thr 250, Met 252, Ser 254, Thr 256, Thr 307, Glu 380, Met 428, His 433 및/또는 Asn 434에 상응하는 하나 이상의 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.

일부 구현예에서, 적합한 Fc 도메인은 EU 번호매김에 따라서, 인간 IgG1의 L234, L235, H433 및 N434에 상응하는 하나 이상의 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.

재조합 융합 단백질의 Fc 부분은 Fc 수용체를 발현하는 세포의 표적화를 야기하여서 프로-염증성 효과를 야기할 수 있다. Fc 도메인의 일부 돌연변이는 Fc 감마 수용체에 대한 재조합 단백질의 결합을 감소시켜서 이펙터 기능을 억제한다. 일 구현예에서, 이펙터 기능은 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC)이다. 예를 들어, 적합한 Fc 도메인은 L234A (Leu234Ala) 및/또는 L235A (Leu235Ala) (EU 번호매김)의 돌연변이를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서 L234A 및 L235A 돌연변이는 또한 LALA 돌연변이라고도 한다. 비-제한적인 예로서, 적합한 Fc 도메인은 돌연변이 L234A 및 L235A (EU 번호매김)를 함유할 수 있다.

일부 구현예에서, 적합한 Fc 도메인은 H433K (His433Lys) 및/또는 N434F (Asn434Phe) (EU 번호매김)의 돌연변이를 함유할 수 있다. 비제한적인 예로서, 적합한 Fc 도메인은 돌연변이 H433K 및 N434F (EU 번호매김)를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서 H433K 및 N434F 돌연변이는 또한 NHance 돌연변이라고 한다.

일부 구현예에서, 적합한 Fc 도메인은 L234A (Leu234Ala), L235A (Leu235Ala), H433K (His433Lys) 및/또는 N434F (Asn434Phe) (EU 번호매김)의 돌연변이를 함유할 수 있다. 비제한적인 예로서, 적합한 Fc 도메인은 L234A, L235A, H433K 및 N434F (EU 번호매김)의 돌연변이를 함유할 수 있다. Fc 도메인에 포함될 수 있는 추가적인 아미노산 치환은 예를 들어, 참조로 본 명세서에 편입되는, 미국 특허 제6,277,375호; 제8,012,476호; 및 제8,163,881호에 기술된 것들을 포함한다.

예시적인 IL-2 융합 단백질

본 발명은 예를 들어, Teff 또는 NK 세포에 비해서, Treg를 우선적으로 확장시키는 IL-2 뮤테인을 제공한다. 본 명세서에서 제공되는 IL-2 뮤테인은 환자에서 부작용 또는 유해 사례의 가능성 또는 강도를 증가시킬 위험성을 증가시키지 않고 뮤테인의 혈청 반감기를 연장시키는 분자를 포함하거나 또는 그에 융합되도록 변경될 수 있다. 이러한 연장된 혈청 반감기 뮤테인의 피하 투약은 보다 낮은 전신 최대 노출 (C_max)에 의해 연장된 표적 커버리지를 허용할 수 있다. 연장된 혈청 반감기는 뮤테인의 더 낮거나 또는 덜 빈번한 투약 용법을 허용할 수 있다.

IL-2 변이체는 환자에게 투여될 때 IL-2 변이체의 혈청-반감기를 증가시키는 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 반감기 연장 분자는 수용성 중합체 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)), 고밀도 및 저밀도 지단백질, 항체 Fc (단량체 또는 이량체), 트랜스티레틴 (TTR), 및 TGF-β 잠복기 연관 펩티드 (LAP)를 포함한다. 또한 혈청 반감기 연장 분자, 예컨대 PEG화 TTR의 조합을 포함하는 IL-2 변이체가 고려된다 (미국 특허 출원 공개 번호 제2003/0195154호).

본 명세서에서 제공되는 IL-2 뮤테인의 혈청 반감기는 본질적으로 당분야에 공지된 임의 방법으로 연장될 수 있다. 이러한 방법은 신생 Fey 수용체에 결합하거나 또는 연장된 혈청 반감기를 갖는 단백질, 예를 들어, IgG 또는 인간 혈청 알부민에 결합하는 펩티드를 포함하도록 IL-2 뮤테인의 서열을 변경시키는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, IL-2 뮤테인은 융합 분자 상에서 연장된 반감기를 부여하는 폴리펩티드에 융합된다. 이러한 폴리펩티드는 IgG Fc, 또는 신생 Fey 수용체, 인간 혈청 알부민, 또는 연장된 혈청 반감기를 갖는 단백질에 결합하는 폴리펩티드에 결합하는 다른 폴리펩티드를 포함한다.

일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 IgG Fc 분자에 융합된다. IL-2 뮤테인은 IgG Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다.

본 발명의 일 구현예는 항체의 Fc 영역에 IL-2 뮤테인을 융합시켜서 생성된 2개 Fc-융합 폴리펩티드를 포함하는 이량체에 관한 것이다. 이량체는 예를 들어, 융합 단백질을 코딩하는 유전자 융합체를 적절한 발현 벡터에 삽입시키고, 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포에서 유전자 융합체를 발현시켜서, 발현된 융합 단백질이 항체 분자와 매우 유사하게 조립되게 허용하여서, 그 결과로 사슬간 결합이 Fc 모이어티 간에 형성되어 이량체를 산출하여서 만들어질 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "Fc 폴리펩티드" 또는 "Fc 영역"은 항체의 Fc 영역으로부터 유래되는 폴리펩티드의 천연 및 뮤테인 형태를 포함하고, 본 발명의 IL-2 뮤테인 융합 단백질 또는 항-IL-2 항체의 일부일 수 있다. 이량체화를 촉진하는 힌지 영역을 함유하는 이러한 폴리펩티드의 절두된 형태가 또한 포함된다. 일정 구현예에서, Fc 영역은 항체 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 연장된 혈청 반감기와 함께, Fc 모이어티 (및 그로부터 형성된 올리고머)를 포함하는 융합 단백질은 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼 상에서 친화성 크로마토그래피를 통한 손쉬운 정제의 장점을 제공한다. 바람직한 Fc 영역은 IgGl, lgG2, lgG3, 및 lgG4를 포함한, 인간 IgG로부터 유래된다. 본 명세서에서, Fc 내 특정 잔기는 위치를 통해서 확인된다. 모든 Fc 위치는 EU 번호매김 체계를 기반으로 한다.

항체의 FC 부분의 기능 중 하나는 항체가 이의 표적에 결합할 때 면역계와 통신하는 것이다. 이것은 "이펙터 기능"으로 간주된다. 통신은 항체-의존적 세포의 세포독성 (ADCC), 항체-의존적 세포의 식세포작용 (ADCP), 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 야기한다. ADCC 및 ADCP는 면역계의 세포의 표면 상에서 Fc 수용체에 Fc의 결합을 통해 매개된다. CDC는 보체계의 단백질, 예를 들어, Clq와 Fc의 결합을 통해서 매개된다.

IgG 서브클래스는 이펙터 기능을 매개하는 그들 능력이 다양하다. 예를 들어, IgG1은 ADCC 및 CDC의 매개에서 IgG2 및 lgG4 보다 우수하다. 항체의 이펙터 기능은 Fc에 하나 이상의 돌연변이를 도입시켜서, 증가될 수 있거나 또는 감소될 수 있다. 본 발명의 구현예는 이펙터 기능을 증가시키기 위해 조작된 Fc를 갖는 IL-2 뮤테인 Fc 융합 단백질을 포함한다 (미국 특허 제7,317,091호, 및 Strohl, Curr. Opin. Biotech., 20:685-691, 2009; 둘 모두 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입됨).

제조 방법

본 명세서에 기술된 IL-2 변이체는 당분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용해 생산될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, IL-2 변이체를 코딩하는 DNA 서열을 구축하는 단계 및 적절하게 형질전환된 숙주에서 이들 서열을 발현하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 본 발명의 재조합 변이체를 생산하게 될 것이다. 그러나, 변이체는 또한 화학적 합성 또는 화학적 합성 및 재조합 DNA 기술의 조합을 통해서 생산될 수 있다. 회분식 생산 또는 관류 생산 방법이 당분야에 공지되어 있다. 참조: Freshey, R. I. ( ed), 3 "Animal Cell Culture: A Practical Approach," 2nd ed., 1992, IRL Press. Oxford, England; Mather, J. P. "Laboratory Scaleup of Cell Cultures (0.5-50 liters)," Methods Cell Biolog 57: 219-527 (1998); Hu, W. S., and Aunins, J. G., "Large-scale Mammalian Cell Culture," Curr Opin Biotechnol 8: 148-153 (1997); Konstantinov, K. B., Tsai, Y., Moles, D., Matanguihan, R., "Control of long-term perfusion Chinese hamster ovary cell culture by glucose auxostat.," Biotechnol Prag 12:100-109 (1996).

본 명세서에 기술된 IL-2 변이체를 생산하는 일부 구현예에서, DNA 서열은 야생형 IL-2를 코딩하는 DNA 서열을 단리하거나 또는 합성한 다음에 부위 특이적 돌연변이유발법을 통해 하나 이상의 코돈을 변화시켜서 구축된다. 예를 들어, 하기 문헌들을 참조하고, 본 명세서에 참조로 편입시킨다: Mark et. al., "Site-specific Mutagenesis Of The Human Fibroblast Interferon Gene", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, pp. 5662-66 (1984); 및 미국 특허 제4,588,585호. 다양한 돌연변이 및 이의 생성 방식은 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 아미노산 및/또는 핵산 결실, 삽입, 치환 및/또는 융합을 포함한다.

IL-2 변이체를 코딩하는 DNA 서열을 구축하는 다른 방법은 화학 합성이다. 이것은 예를 들어 본 명세서에 기술된 성질을 나타내는 IL-2 변이체를 코딩하는 단백질 서열의 화학적 수단을 통한 펩티드의 직접 합성을 포함한다. 이러한 방법은 천연 및 비천연 아미노산 둘 모두를 도입시킬 수 있다. 대안적으로, 원하는 IL-2 변이체를 코딩하는 유전자는 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용한 화학적 수단을 통해 합성될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 올리고뉴클레오티드는 원하는 IL-2 변이체의 아미노산 서열, 및 재조합 변이체를 생산하게 되는 숙주 세포에서 선호되는 코돈의 선택을 기반으로 디자인된다. 이와 관련하여, 유전자 코드는 아미노산이 하나 초과의 코돈에 의해 코딩될 수 있어서 축퇴성이라는 것이 충분히 인식된다. 예를 들어, Phe (F)는 2개 코돈, TTC 또는 TTT에 의해 코딩되고, Tyr (Y)는 TAC 또는 TAT에 의해 코딩되고, his (H)는 CAC 또는 CAT에 의해 코딩된다. Trp (W)은 단일 코돈, TGG에 의해 코딩된다. 따라서, 특정 IL-2 변이체를 코딩하는 소정 DNA 서열에 대해서, IL-2 변이체를 코딩하게 되는 많은 DNA 축퇴성 서열이 존재할 것임을 이해할 것이다.

IL-2 변이체를 코딩하는 DNA 서열은, 부위 지정 돌연변이유발, 화학적 합성 또는 다른 방법을 통해 제조되는지 여부와 무관하게, 신호 서열을 코딩하는 DNA 서열을 또한 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 신호 서열은 존재하면, IL-2 변이체의 발현을 위해 선택된 세포에 의해 인식되는 것이다. 이것은 원핵생물, 진핵생물, 또는 둘의 조합일 수 있다. 또한 천연 IL-2의 신호 서열일 수 있다. 신호 서열의 포함은 이것이 만들어지는 재조합 세포로부터 IL-2 변이체를 분비하는 것이 바람직한지 여부에 의존한다. 일부 구현예에서, 선택된 세포가 원핵생물이면, DNA 서열은 신호 서열을 코딩하지 않는다. 일부 구현예에서, 선택된 세포가 진핵생물이면, 신호 서열이 코딩되고, 야생형 IL-2 신호 서열을 가질 수 있다.

표준 방법은 IL-2 변이체를 코딩하는 유전자를 합성하는데 적용될 수 있다. 예를 들어, 완전한 아미노산 서열이 역 번역된 유전자를 구축하는데 사용될 수 있다. IL-2 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 올리고머를 합성할 수 있다. 예를 들어, 원하는 폴리펩티드의 일부를 코딩하는 몇몇 소형 올리고뉴클레오티드를 합성한 다음에 결찰될 수 있다. 개별 올리고뉴클레오티드는 상보성 조립을 위해 5' 또는 3' 오버행을 함유할 수 있다.

(합성, 부위-지정 돌연변이유발 또는 다른 방법을 통해서) 조립되면, IL-2 변이체를 코딩하는 DNA 서열은 발현 벡터에 삽입될 것이고 원하는 형질전환된 숙주에서 IL-2 변이체의 발현을 위해 적절한 발현 제어 서열에 작동적으로 연결된다. 적절한 조립은 뉴클레오티드 시퀀싱, 제한효소 맵핑, 및 적합한 숙주에서 생물학적 활성 폴리펩티드의 발현을 통해 확인할 수 있다. 당분야에 공지된 바와 같이, 숙주에서 형질감염된 유전자의 높은 발현 수준을 수득하기 위해서, 유전자는 선택된 발현 숙주에서 기능성인 전사 및 번역 발현 제어 서열에 작동적으로 연결된다. 발현 제어 서열 및 발현 벡터의 선택은 숙주 선택에 의존할 것이다. 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 적용될 수 있다.

임의의 적합한 숙주는 박테리아, 진균 (효모 포함), 식물, 곤충, 포유동물, 또는 다른 적절한 동물 세포 또는 세포주를 비롯하여, 유전자이식 동물 또는 식물을 포함해, IL-2 변이체를 생산하는데 사용될 수 있다. 이들 숙주는 충분히 공지된 진핵생물 및 원핵생물 숙주, 예컨대 이. 콜라이 (E. coli), 슈도모나스 (Pseudomonas), 바실러스 (Bacillus), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 진균, 효모, 곤충 세포, 예컨대 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) (Sf9)의 균주, 동물 세포 예컨대 중국 햄스터 난소 (CHO) 및 마우스 세포 예컨대 NS/0, 아프리카 녹색 원숭이 세포 예컨대 COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, 및 BNT 10, 및 인간 세포를 비롯하여, 조직 배양 식물 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 동물 세포 발현 경우에, 발현되는 CHO 세포 및 COS 7 세포 및 CHO 세포주 CHO (DHFR-) 또는 HKB 세포주가 사용될 수 있다.

모든 벡터 및 발현 제어 서열이 본 명세서에 기술된 DNA 서열을 발현하도록 충분히 동등하게 기능하지 않을 것임을 이해해야 한다. 모든 숙주가 동일 발현 시스템을 사용해 동등하게 잘 기능하지 않을 수 있을 것이다. 그러나, 당업자는 이들 벡터 중에서, 과도한 실험없이 발현 제어 서열 및 숙주를 선택할 수 있다. 예를 들어, 벡터 선택에서, 숙주는 벡터가 거기서 복제되어야만 하기때문에 고려된다. 벡터 카피수, 그 카피수를 제어하는 능력, 및 항생제 마커같이, 벡터에 의해 코딩되는 임의의 다른 단백질의 발현이 또한 고려될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명에서 사용을 위한 벡터는 IL-2 변이체를 코딩하는 DNA가 카피수로 증폭되도록 허용하는 것을 포함한다. 이러한 증폭가능한 벡터는 당분야에 충분히 공지되어 있다. 그들은 예를 들어, DHFR 증폭 (참조: 예를 들어, Kaufman, 미국 특허 제4,470,461호, Kaufman and Sharp, "Construction Of A Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression", Mol. Cell. Biol., 2, pp. 1304-19 (1982)) 또는 글루타민 신써타제 ("GS") 증폭 (참조: 예를 들어, 미국 특허 제5,122,464호 및 유럽 특허 출원 공개 번호 제338,841호)을 통해서 증폭될 수 있는 벡터를 포함한다.

IL-2 변이체는 변이체를 생산하는데 사용되는 숙주 유기체에 의존하여 글리코실화될 수 있거나 또는 비글리코실화될 수 있다. 일부 구현예에서, 박테리아가 숙주로서 선택될 때, 생산된 IL-2 변이체는 비글리코실화될 것이다. 일부 구현예에서, 진핵생물 세포는 IL-2 변이체를 글리코실화시킬 것이다. 형질전환된 숙주에 의해 생산되는 IL-2 변이체는 임의의 적합한 방법에 따라서 정제될 수 있다. IL-2를 정제하기 위한 다양한 방법이 공지되어 있다. 참조: 예를 들어, Current Protocols in Protein Science, Vol. 2. Eds: John E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploehg, David W. Speicher, Paul T. Wingfield, Unit 6.5 (Copyright 1997, John Wiley and Sons, Inc).

약학 조성물 및 투여

본 발명은 본 발명에 따른 치료적 활성 성분 (예를 들어, 재조합 IL-2 뮤테인 단백질, 재조합 IL-2 뮤테인 융합 단백질 또는 재조합 IL-2 뮤테인-Fc 융합 단백질)을, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 약학 조성물을 더 제공한다. 이러한 약학 조성물은 임의로 하나 이상의 추가적인 치료적-활성 물질을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 약학 조성물의 설명이 주로 인간에 윤리적 투여에 적합한 약학 조성물에 관한 것이지만, 이러한 조성물이 일반적으로 모든 종류의 동물 투여 적합하다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 다양한 동물에게 투여에 적합한 조성물을 만들기 위해서 인간에게 투여에 적합한 약학 조성물의 변형은 충분히 이해되고, 통상의 수의학 약리학자는 있다면 단지 통상의 실험을 사용해 이러한 변형을 디자인할 수 있고/있거나 수행할 수 있다.

본 명세서에 기술된 약학 조성물의 제제는 약리학 분야에서 공지되거나 또는이후 개발되는 임의 방법을 통해서 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분을 희석제 또는 다른 부형제 또는 담체 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 회합시키는 단계, 및 다음에, 필요하고/하거나, 원한다면, 바람직한 단일-용량 또는 다수-용량 단위로 제품을 성형 및/또는 포장하는 단계를 포함한다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 대량으로, 단일 단위 용량, 및/또는 다수의 단일 단위 용량으로서, 제조, 포장, 및/또는 판매될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, "단위 용량"은 활성 성분의 사전결정된 양을 포함하는 약학 조성물의 개별 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에게 투여하려는 활성 성분의 용량 및/또는 이러한 용량의 편리한 분획, 예컨대, 예를 들어, 이러한 용량의 1/2, 또는 1/3과 동일하다.

본 발명에 따른 약학 조성물 중 활성 성분, 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체, 및/또는 임의의 추가 성분의 상대량은 치료되는 대상체의 정체, 크기, 및/또는 상태에 의존하고, 또한 조성물을 투여하려는 위치에 더 의존하여 다양할 것이다. 예로서, 조성물은 0.1% 내지 100% (w/w) 활성 성분을 포함할 수 있다.

약학 제제는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 바람직한 특정 제형에 적합하게, 임의의 모든 용매, 분산 매질, 희석제, 또는 다른 액상 비히클, 분산 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장화제, 증점제 또는 유화제, 보존제, 고형 결합제, 윤활제 등을 포함하는, 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. [Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21^st Edition, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006; 참조로 본 명세서에 편입됨)]은 약학 조성물을 제제화하는데 사용되는 다양한 부형제 및 이의 제조를 위해 공지된 기술들을 개시한다. 예컨대 임의의 원치않는 생물학적 효과를 생성시키거나 또는 달리 약학 조성물의 임의의 다른 성분(들)과 유해한 방식으로 상호작용하여서, 임의의 통상적인 부형제 매질 또는 담체가 물질 또는 이의 유도체와 상용성이 아닌 경우를 제외하고, 이의 사용은 본 발명의 범주 내인 것으로 간주된다.

일부 구현예에서, 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체는 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 순수하다. 일부 구현예에서, 부형제 또는 담체는 인간에서 사용 및 수의학적 사용을 위해 승인된다. 일부 구현예에서, 부형제 또는 담체는 미국 식품의약청이 승인한다. 일부 구현예에서, 부형제 또는 담체는 약학 등급이다. 일부 구현예에서, 부형제 또는 담체는 미국 약전 (USP), 유럽 약전 (EP), 영국 약전, 및/또는 국제 약전의 표준을 충족한다.

약학 조성물의 제조에서 사용되는 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체는 불활성 희석제, 분산제 및/또는 과립화제, 표면 활성제 및/또는 유화제, 붕해제, 결합제, 보존제, 완충제, 윤활제, 및/또는 오일을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 부형제 또는 담체는 임의로 약학 제제에 포함될 수 있다. 부형제 또는 담체 예컨대 코코어 버터 및 좌제 왁스, 착색제, 코팅제, 감미제, 풍미제, 및/또는 향료가 배합자의 판단에 따라서 조성물에 존재할 수 있다.

적합한 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체, 물, 염 용액 (예를 들어, NaCl), 염수, 완충 염수, 알콜, 글리세롤, 에탄올, 검 아라빅, 식물성 오일, 벤질 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 탄수화물 예컨대 락토스, 아밀로스 또는 전분, 당 예컨대 만니톨, 수크로스 등, 덱스트로스, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 규산, 점성 파라핀, 항유, 지방산 에스테르, 히드록시메틸셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈 등을 비롯하여, 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 약학 조제물은 원한다면, 활성 화합물과 유해하게 반응하지 않거나 또는 그들 활성을 방해하지 않는 보조제 (예를 들어, 윤활제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충제, 착색제, 풍미제 및/또는 방향족 물질 등)와 혼합될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 정맥내 투여에 적합한 수용성 담체가 사용된다.

적합한 약학 조성물 또는 약물은, 원한다면, 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 조성물은 액상 용액, 현탁액, 에멀션, 정제, 알약, 캡슐, 지속 방출 제제, 또는 분말일 수 있다. 조성물은 또한 전통적인 결합제 및 담체 예컨대 트리글리세리드를 사용해 좌제로서 제제화될 수 있다. 경구 제제는 표준 담체 예컨대 약학 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 폴리비닐 피롤리돈, 소듐 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 등을 포함할 수 있다.

약학 조성물 또는 약물은 인간에게 투여에 적합화된 약학 조성물로서 통상의 절차에 따라서 제제화될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 정맥내 투여를 위한 조성물은 전형적으로 멸균 등장성 수성 완충액 중 용액이다. 필요한 경우에, 조성물은 또한 주사 부위에서 통증 완화를 위한 국소 마취제 및 가용화제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 예를 들어, 기밀 용기 예컨대 활성제의 분량이 표시된 앰풀 또는 샤세 중 건조 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서, 단위 제형으로 함께 혼합되거나 또는 개별적으로 공급된다. 조성물을 주입을 통해 투여하려는 경우에, 멸균 약학 등급 물, 염수, 또는 덱스트로스/물을 함유하는 주입병에 분배될 수 있다. 조성물이 주사를 통해 투여되는 경우에, 주사를 위한 멸균수 또는 염수의 앰풀이, 성분을 투여 전에 혼합하기 위해 제공될 수 있다.

본 명세서에 기술된 재조합 IL-2 뮤테인 단백질 또는 재조합 IL-2 뮤테인-Fc 융합 단백질은 중성 또는 염 형태로서 제제화될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유래된 것과 같은 유리 아미노 기와 형성되는 것, 및 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘, 제2철 히드록시드, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래된 것과 같은 유리 카르복실 기와 형성되는 것을 포함한다.

약학제의 제제화 및/또는 제조에서의 일반적인 고려 사항은 예를 들어, 하기 문헌에서 확인할 수 있다: Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21^st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005 (참조로 본 명세서에 편입됨).

투여 경로

본 명세서에 기술된 재조합 IL-2 뮤테인 단백질 또는 재조합 IL-2 뮤테인-Fc 융합 단백질 (본 명세서에 기술된 재조합 IL-2 뮤테인 단백질을 함유하는 조성물 또는 약물)은 임의의 적절한 경로를 통해서 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 IL-2 뮤테인 단백질, 재조합 IL-2 뮤테인-Fc 융합 단백질 또는 이를 함유하는 약학 조성물은 전신으로 투여된다. 전신 투여는 정맥내, 피내, 흡입, 경피 (국소), 안구내, 근육내, 피하, 근육내, 경구 및/또는 경점막 투여일 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 IL-2 뮤테인 단백질, 재조합 IL-2 뮤테인-Fc 융합 단백질 또는 이를 함유하는 약학 조성물은 피하로 투여된다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "피하 조직"은 피부 바로 아래 느슨하고, 불규칙한 결합 조직의 층으로서 정의된다. 예를 들어, 피하 투여는 허벅지 영역, 복부 영역, 둔부 영역, 또는 견갑골 영역을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 영역으로 조성물을 주사하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 IL-2 뮤테인 단백질, 재조합 IL-2 뮤테인-Fc 융합 단백질 또는 이를 포함하는 약학 조성물은 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, 재조합 IL-2 뮤테인 단백질, 재조합 IL-2 뮤테인-Fc 융합 단백질 또는 이를 함유하는 약학 조성물은 경구로 투여된다. 일부 구현예에서, 재조합 IL-2 뮤테인 단백질, 재조합 IL-2 뮤테인-Fc 융합 단백질 또는 이를 함유하는 약학 조성물은 근육내로 투여된다. 일부 구현예에서, 하나 초과의 경로가 동시에 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 투여는 개체에서 오직 국부적인 효과만을 야기하지만, 다른 구현예에서, 투여는 개체의 다수 부분에 걸친 효과, 예를 들어, 전신 효과를 야기한다. 전형적으로, 투여는 전신으로 재조합 IL-2 뮤테인 단백질 또는 재조합 IL-2 뮤테인-Fc 융합 단백질의 전달을 야기한다. 일부 구현예에서, 재조합 IL-2 뮤테인 단백질 또는 재조합 IL-2 뮤테인-Fc 융합 단백질은 심장, 뇌, 척수, 횡문근 (예를 들어, 골격근), 평활근, 신장, 간, 폐, 및/또는 비장을 포함하지만, 이에 제한되지 않은 하나 이상의 표적 조적에 전달된다.

제형 및 투약 용법

일부 구현예에서, 조성물은 치료적 유효량 및/또는 특정한 원하는 결과 (예를 들어, 자가면역 질환에 대한 위험의 치료 또는 감소)와 상관되는 투약 용법에 따라서 투여된다.

본 발명에 따라서 투여하려는 특정 용량 또는 양은 예를 들어, 원하는 결과의 성질 및/또는 정도, 특히 투여 경로 및/또는 시기, 및/또는 하나 이상의 특징 (예를 들어, 체중, 연령, 개인 이력, 유전적 특징, 생활습관 변수 등, 또는 이의 조합)에 의존하여, 다양할 수 있다. 이러한 용량 또는 양은 당업자가 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 적절한 용량 또는 양은 표준 임상 기술에 따라서 결정된다. 대안적으로 또는 추가로, 일부 구현예에서, 적절한 용량 또는 양은 투여하려는 바람직하거나 또는 최적의 용량 범위 또는 양을 확인하는 것을 돕기 위해 하나 이상의 시험관내 또는 생체내 어세이의 사용을 통해서 결정된다.

다양한 구현예에서, 재조합 IL-2 뮤테인 단백질은 치료적 유효량으로 투여된다. 일반적으로, 치료적 유효량은 대상체에게 의미있는 혜택 (예를 들어, 근본 질환 또는 병태의 치료, 조절, 치유, 예방, 및/또는 개선)을 획득하기에 충분하다.

일부 구현예에서, 제공되는 조성물은 약학 제제로서 제공된다. 일부 구현예에서, 약학 제제는 자가면역 질환의 감소된 발병률 또는 위험의 획득과 상관있는 투약 용법에 따라서 투여를 위한 단위 용량이거나 또는 그를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 재조합 IL-2 뮤테인 단백질 또는 재조합 IL-2 뮤테인-Fc 융합 단백질을 포함하는 제제는 단일 용량으로서 투여된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 재조합 IL-2 뮤테인 단백질 또는 재조합 IL-2 뮤테인-Fc 융합 단백질을 포함하는 제제는 규칙적인 간격으로 투여된다. 본 명세서에서 사용되는 "간격"으로 투여는 치료적 유효량이 주기적으로 (1-회 용량과 구별됨) 투여된다는 것을 의미한다. 간격은 표준 임상 기술을 통해서 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 재조합 IL-2 뮤테인 단백질 또는 재조합 IL-2 뮤테인-Fc 융합 단백질을 포함하는 제제는 격월, 매월, 월 2회, 3주마다, 2주마다, 1주마다, 1주 2회, 1주 3회, 매일, 1일 2회, 또는 6시간 마다 투여된다. 단일 개체를 위한 투여 간격은 고정 간격일 필요는 없지만, 개체의 필요에 따라서, 시간 경과에 따라 다양할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "격월"은 2개월 당 1회 (즉, 2개월마다 1회) 투여를 의미하고; 용어 "매월"은 1개월 당 1회 투여를 의미하고; 용어 "3주마다"는 3주 당 1회 (즉, 3주마다 1회) 투여를 의미하고; 용어 "2주마다"는 2주 당 1회 (즉, 2주마다 1회) 투여를 의미하고; 용어 "매주"는 1주 당 1회 투여를 의미하고; 용어 "매일"은 1일 1회 투여를 의미한다.

일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 재조합 IL-2 뮤테인 단백질 또는 재조합 IL-2 뮤테인-Fc 융합 단백질을 포함하는 제제는 무한하게 규칙적인 간격으로 투여된다. 본 명세서에 기술된 재조합 IL-2 뮤테인 단백질 또는 재조합 IL-2 뮤테인-Fc 융합 단백질을 포함하는 제제는 한정된 기간 동안 규칙적인 간격으로 투여된다.

본 명세서에 기술된 바와 같은, 용어 "치료적 유효량"은 대체로 본 발명의 약학 조성물에 함유된 치료제의 총량을 기반으로 결정된다. 치료적 유효량은 일반적으로 다수 단위 용량을 포함할 수 있는 투약 용법으로 투여된다. 임의의 특정 조성물 경우에, 치료적 유효량 (및/또는 유효한 투약 용법 내에서 적절한 단위 용량)은 예를 들어, 투여 경로 또는 다른 약학제와의 병용에 의존하여, 다양할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 IL-2 뮤테인 중 하나 또는 다수의 치료적 유효량과 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제, 및/또는 보강제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

병용 요법: 추가 구현예에서, 본 명세서에 기술된 IL-2 뮤테인은 환자가 앓고 있는 병태를 치료하는데 유용한 다른 작용제와 병용하여 투여된다. 이러한 작용제의 예는 단백질성 및 비단백질성 약물 둘 모두를 포함한다. 다수의 투여제가 공-투여될 때, 용량은 관련 분야에서 인식되는 바와 같이, 그에 따라서 적합화될 수 있다. "공-투여" 및 병용 요법은 동시 투여에 제한되지 않고, 또한 환자에게 적어도 하나의 다른 치료제를 투여하는 단계를 포함하는 치료 과정 동안 T-reg-선택적 IL-2 변이체가 적어도 1회 투여되는 치료 용법을 포함한다.

일정 구현예에서, IL-2 뮤테인은 PI3-K/AKT/mTOR 경로의 억제제, 예를 들어, 라파마이신 (라파뮨, 시롤리무스)과 병용하여 투여된다. IL-2와 병용되는 이러한 경로의 억제제는 T-reg 농축을 선호한다.

본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 또는 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료를 하기에 기술한다. 본 명세서에서 언급되는 모든 공개물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참조는 그들 전체로 참조로 편입된다. 본 명세서에서 인용되는 참조는 청구된 발명에 대한 선행 기술로서 인정하는 것이 아니다. 또한, 재료, 방법, 및 실시예는 오직 예시적이고 제한하려는 의도가 아니다.

[실시예]

실시예 1. IL-2 뮤테인의 디자인 및 구성

이 실시예는 예시적인 IL-2 뮤테인의 디자인 및 구성을 예시한다.

표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 DNA를 조작하고 (Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), 중 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 뉴클레오티드를 함유하는 구성체를 디자인하였다 (Kabat, E. A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242). 이중 가닥 DNA의 시퀀싱을 수행하여서 구성체의 뉴클레오티드 서열을 확인하였다.

WT IL-2 단백질 (SEQ ID NO: 1)의 예시적인 뉴클레오티드 잔기를 돌연변이시켜서 예시적인 IL-2 뮤테인 (표 2)을 생성시킨 다음에, IL-2Rα, IL-2Rβ, CD25 또는 CD122에 결합하는 그들 친화성에 대해 특징규명하였다. 예시적인 IL-2 뮤테인은 T111H, T37Y, E15T, M23L, P34F, E68F 및 E62A로 이루어진 군으로부터 선택되는 야생형 IL-2 단백질 (SEQ ID NO: 1)에 대해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다.

또한, IgG 융합 IL-2 뮤테인을 구성하였다. 분자간 디술피드 결합 형성을 방지하기 위해서, C125A 돌연변이가 생성된 모든 IL-2 뮤테인에 도입되었다. 따라서, 본 발명의 일부 구현예에서, IL-2 뮤테인은 C125A 돌연변이를 포함한다. 화합성 효과 및 이종이량체화를 최소화하기 위해서, 노브 인투 홀 돌연변이가 IgG Fc 영역에 도입되었고, 모든 IL-2 뮤테인은 오직 노브 돌연변이 도입된 IgG와 융합되었다.

이 실시예는 예시적인 IL-2 뮤테인의 디자인 및 구성을 입증하였다 (표 2).

표 2. IL-2 뮤테인 ( 돌연변이된 잔기는 굵은체 )

실시예 2. IgG 융합 IL-2 뮤테인의 생산

이 실시예는 예시적인 IgG 융합 IL-2 뮤테인 단백질의 생산을 예시한다.

첫째로, 유전자 단편은 합성적 유전자 합성 및/또는 적합한 주형으로부터의 PCR을 통해서 생성되었고 표준 포유동물 발현 벡터에 서브클로닝되었다. IgG IL-2 뮤테인 융합 단백질을 생산하기 위해서, 기하급수적으로 성장하는 Expi293 세포는 ExpiFectamine 형질감염 시약을 사용하여 IgG 경쇄, 홀 돌연변이를 갖는 IgG 중쇄, 및 IL-2 뮤테인에 융합된 노브 돌연변이를 갖는 IgG 중쇄의 포유동물 발현 벡터가 공-형질감염되었다.

이후에, 융합 단백질은 PBS에 평형화시킨 단백질 A 비드를 사용한 1-단계 친화성 정제를 통해서 상청액으로부터 정제되었다. 상청액의 로딩 후, 컬럼은 먼저 PBS로 세척하였다. 융합 단백질은 0.1 M 글리신-HCl/0.3 M NaCl (pH 3.0)로 용리하였다. 분획은 1 M Tris-HCl pH 8.0 (1:10)을 사용해 중화시켰고, 투석을 통해 PBS로 완충액-교환하였다. 정제된 단백질 샘플의 단백질 농도는 아미노산 서열을 기반으로 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 nm에서의 광학 밀도 (OD)를 측정하여 결정되었다. 따라서, 정제된 IgG 융합 IL-2 뮤테인을 생성하였다.

실시예 3. IL-2 수용체에 대한 IL-2 뮤테인 융합 단백질의 결합 친화성

이 실시예는 IL-2 수용체에 대한 예시적인 IL-2 뮤테인 융합 단백질의 결합 친화성을 측정한다. IL-2 수용체에 대한 융합 단백질의 친화성은 하기 조건 하에서 재조합 IL-2Rα 및 IL-2Rβ를 사용하여 인간 IL-2Rα 및 IL-2Rβ 수용체에 대해 Octet Red96e (Forte Bio) 상에서 생물층 간섭계 (BLI)를 통해 결정되었다: SA 칩 상에 고정된 바이오틴화된 인간 IL-2Rα 또는 IL-2Rβ를 포함하는 리간드, PBS 완충액 중 25℃의 온도에서 단일 용량 IgG 융합 IL-2 뮤테인을 포함하는 분석물, 결합: 120초, 해리: 600초, 피팅: 1:1 랑뮈르 결합 모델. 친화성은 운동 속도 상수 kon 및 koff를 기반으로 결정되었다 (표 3).

표 3. IL- 2Rα 및 IL- 2Rβ에 대한 동역학 기반 친화성 측정

예를 들어, K77A IL-2 뮤테인은 WT IL-2와 유사한 IL-2Rα에 대한 결합 친화성을 나타냈다 (도 1A 및 도 1B). 대조적으로, 마우스 E96A 돌연변이체 IL-2는 IL-2Rα (CD25)에 대해 감소된 결합을 보였다 (도 1C).

이 실시예는 IL-2 수용체에 대한 예시적인 IL-2 뮤테인의 결합 친화성을 예시한다.

실시예 4. 인간 말초 혈액 세포 서브세트에서 pSTAT5a의 유도

이 실시예는 인간 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에서 STAT5a 인산화에 대한 예시적인 IL-2 뮤테인의 기능적 효과를 예시한다.

세포 표면 상의 IL-2 수용체에 대한 IL-2 결합은 STAT5a 인산화를 유도하여 몇몇 신호전달 경로를 활성화시켜서, 그 결과로 IL-2/IL-2R 경로와 연관된 다양한 기능에 기여하는 표적 유전자의 전사가 일어난다. 그러므로, 고친화성 및 중간 친화성 수용체의 다양한 조합을 통해서 매개된 IL-2에 대한 통합된 신호전달 반응을 결정하기 위해서, pSTAT5a 수준은 유세포측정을 통해 개별 세포 내에서 측정되었다.

STAT5a 인산화의 유도에 대한 IgG 융합 IL-2 뮤테인 (10 pM)의 단일 용량의 효과는 인간 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에서 평가되었다. 간략하게, 건강한 인간 성인으로부터의 냉동된 PBMC를 2 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. IgG 융합 IL-2 뮤테인 (10 pM)은 웰 당 0.5백만 세포로 100 ㎕의 PBMC에 첨가되었고 37℃에서 인큐베이션되었다. 2 시간 후에, PBMC는 예열된 용해/고정 완충액을 사용하여 10 분 동안 37℃에서 고정 및 투과시켰고, 0.2% BSA를 함유하는 PBS로 2x 세척한 다음에 -20℃ 사전-냉각된 메탄올을 사용해 20 분 동안 얼음 상에서 투과시켰다. 다음으로, 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및 이들 세포에서 STAT5a의 인산화 상태를 구별하기 위해 형광 항체의 패널을 사용해 FACS 염색을 수행하기 전에 0.2% BSA를 함유하는 PBS로 광범위하게 4x 세척되었다. 이용된 항체는 항-CD4-Alexa Fluor® 700 (클론 RPA-T4), CD3-PerCP/Cy5.5 (UCHT1), CD8-Brilliant Violet 605 (RPA-T8), 및 pSTAT5a-Alexa Fluor® 488 (pY694) (Becton Dickinson)이었다. 샘플은 LSRFortessa 세포 분석기 (Becton Dickinson)를 사용해 획득되었고 데이터는 FlowJo 소프트웨어 (FlowJo, LLC)를 사용해 분석되었다. 세포내 pSTAT5a 수준은 2개 세포 서브세트에서 정량되었고, 결과는 CD4+ 및 CD8+ 세포에서 확인되었다 (표 4).

인간 PBMC에서 pSTAT5a의 유도 및 IL-2 수용체에 대한 친화성 측정의 결과를 기반으로, 6개 클론이 추가 분석을 위해 선택되었다 (M23L, E15T, P34F, T111H, T37Y 및 E68F).

pSTAT5a 어세이에서 선택된 뮤테인의 용량 반응 분석을 수행하였다. 간략하게, 건강한 인간 성인으로부터의 냉동 PBMC는 2 시간 동안 37℃에서 인큐베이션되었다. 다양한 농도 (10 nM 내지 0.01 pM)의 IgG 융합 IL-2 뮤테인이 웰 당 0.5백만 세포로 100 ㎕의 PBMC에 첨가되었고, 37℃에서 인큐베이션되었다. 2 시간 후에, PBMC는 이전에 언급된 바와 같이 고정되었고, pSTAT5a 수준을 측정하였다.

결과는 시험된 모든 6개 뮤테인이 야생형 IL-2에 의한 유도와 동등하거나 또는 그를 초과하는 CD4+ 세포에서의 pSTAT5a 유도 활성을 보였다는 것을 확인하였다.

또한, 예시적인 E62A 돌연변이는 CD25+ CD4 T 세포에서 pSTAT5를 유도하는 인간 IL-2 돌연변이체 활성을 억제하였지만, CD8 T 세포에서는 그렇지 않았다 (도 2A 및 도 2B, 표 5). E62A 돌연변이는 CD25-CD4 T 세포 및 NK 세포에서 pSTAT5를 유도하는 인간 IL-2 돌연변이체 활성을 억제하지 않았다 (도 2C 및 도 2D). F906은 항-CTLA-4 항체의 VH 도메인이다. 펩티드 링커를 통해서 F906과 커플링된 야생형 인간 IL-2 또는 인간 IL-2 뮤테인은 Treg에 특이적으로 전달된다.

도 2E는 pSTAT5a 유도를 보여주는 일련의 그래프, 및 야생형 IL-2와 비교하여 IL-2 뮤테인 M23L, T111H, E68F, E15T, P34F, T37Y를 사용한 관련 EC50 및 Emax의 표를 도시한다.

이 실시예는 IL-2 뮤테인에 의한 예시적인 pSTAT5a 유도를 예시한다.

실시예 5. 다수 용량 후 WT 마우스에서 E96A-HLE의 효과

이 실시예는 다수 용량의 투여 후 마우스에서 예시적인 E96A-HLE 뮤테인의 생체내 효과를 예시한다.

WT mIL-2-HLE (wild-type mouse IL-2-half-life extended)와 비교하여 E96A-HLE의 생물학적 활성을 이해하기 위해서, 마우스는 이들 사이토카인으로 처치되었다. Treg를 포함하여, CD8 및 CD4 T 세포는 면역 세포 서브세트의 성장 변화에 대해 조사되었다.

각각의 생물제제는 1x PBS에 희석하였다. 각 조건에 대해서, 마우스는 20 g/마우스의 추정치를 기반으로, 복강내로, 100 ㎕ 부피를 받았다. 6-8 주령의 비 종양-보유 암컷 C57BL/6 마우스는 5일 동안 매일 처치되었고, 2일 동안 휴약한 다음에, 다시 4일 동안 처치되었다. 최종 용량 후 24 시간에, 마우스를 안락사시켰고, 비장을 PD 분석을 위해 단리하였다. 3마리 마우스가 각 그룹에서 시험되었다.

비장은 RP10에서 70 ㎛ 세포 스트레이터를 통해서 으깨주었다. 세포는 RBC 용해 완충액으로 용해된 RBC 였고, 생존 비장세포는 ViCell (Beckman Coulter)을 통해 계측되었다. 비장은 제조사 설명서에 따라서 생/사멸 e780, 항-CD3, 항-CD4, 항-CD8, 항-CD25, 및 항-foxp3 항체로 염색되었다. 비장세포를 세척하였고 염색 완충액 중 항체와 인큐베이션되었고, 세포내 염색은 foxp3 염색 완충액 세트를 사용해 수행되었다. 세포는 LSRFortessa FACS 기계 (BD)에서 분석되었고, 데이터는 FloJo 소프트웨어 (TreeStar)를 사용해 분석되었다.

림프구는 FSC/SSC를 기반으로 게이팅하였고 이중항은 배제하였다. 미경험 T 세포는 CD3+CD4+foxp3+ 로서 확인되었다 (도 4).

결과는 WT mIL-2-HLE로 마우스의 처치가 CD4+foxp3+ T 세포의 일부 확장을 일으킨 한편, E96A-HLE는 CD4+foxp3+ T 세포의 더 큰 용량-의존적 확장을 일으켰다는 것을 보여주었다 (도 3 및 도 4A-도 4F).

WT mIL-2-HLE로 마우스의 처치는 CD3+ 세포의 서브세트로서 foxp3+ 세포의 확장을 일으킨 한편, E96A-HLE로 마우스의 처치는 CD3+ 세포의 서브세트로서 foxp3+ 세포의 비율의 더 큰 용량-의존적 확장을 일으켰다 (도 5A).

E96A-HLE로 마우스의 처치는 CD3+ 세포를 포함한, 비장세포의 용량-의존적 확장을 일으켰다 (도 5B).

결과는 E96A-HLE의 투여에 따른 Treg의 용량-의존적 증가 및 IL-2-HLE의 생체내 활성을 보여주었다.

실시예 6. 단일 투여 후 WT 마우스에서 E62A-HLE 및 E96A-HLE 의 효과

이 실시예는 단일 용량 투여 후 WT hIL2-HLE 및 WT mIL2-HLE와 비교하여 E62A-HLE 및 E96A-HLE의 생체내 효과를 예시한다.

WT hIL2-HLE (wild type human IL-2-half-life extended) 및 WT mIL-2-HLE와 비교하여 E62A-HLE 및 E96A-HLE의 생물학적 활성을 이해하기 위해서, 마우스는 이들 사이토카인이 처치되었다. Treg를 포함하여, CD8 및 CD4 T 세포는 면역 세포 서브세트의 성장 변화에 대해 조사되었다. 각 생물제제는 1x PBS에 희석되었다. 각 생물제제 경우에, 마우스는 20 g/마우스의 추정치를 기반으로, 복강내로, 100 ㎕ 부피를 받았다 (도 6A).

각 그룹 경우에, 6-8 주령인, 4마리 비-종양 보유 암컷 C57BL/6은 저용량 (0.45 mg/kg/마우스) 또는 고용량 (2 mg/kg/마우스)으로, 마우스 또는 인간 WT IL2 또는 IL2 뮤테인의 단일 처치가 투여되었고, 7 일 후에, 마우스는 안락사되었다. 폐의 함수 중량을 측정하였고, 혈장 사이토카인 분석을 위해 심장 천자를 수득하였고 비장을 PD 분석을 위해 단리하였다.

평균 체중 변화율은 열중력 (TG)으로 측정되었다 (도 6B).

비장은 RP10에서 70 ㎛ 세포 스트레이터를 통해서 으깨주었다. 세포는 RBC 용해 완충액으로 용해된 RBC 였고, 생존 비장세포는 ViCell를 통해서 계측되었다. 비장은 생/사멸 e780, 항-CD3, 항-CD4, 항-CD8, 항-CD25, 및 항-foxp3으로 염색되었고, 모두 제조사 설명서에 따라서 염색되었다. 비장세포는 세척되었고 염색 완충액 중 항체와 인큐베이션되었으며, 세포내 염색은 foxp3 염색 완충액 세트를 사용해 수행되었다. 세포는 LSRFortessa FACS 기계에서 분석되었고, 데이터는 FloJo 소프트웨어를 사용해 분석되었다. 림프구는 FSC/SSC를 기반으로 게이팅되었고 이중항은 배제하였다. 미경험 T 세포는 CD3+CD4+foxp3+ 로서 확인되었다.

WT mIL-2-HLE 또는 WT hIL2-HLE로 마우스의 처치는 그 결과로 비장세포의 수 증가를 일으킨 한편 E62A-HLE 또는 E96A-HLE로 마우스 처치는 더 큰 용량-의존적 비장세포 확장을 일으켰다 (도 6C). E96A-HLE 또는 E62A-HLE로 마우스의 처치는 CD4+foxp3+ T 세포의 용량-의존적 확장을 일으켰다. WT hIL2-HLE 또는 WT mIL-2-HLE로 마우스의 처치는 CD8:Treg의 비율 감소를 일으킨 한편, E62A-HLE 또는 E96A-HLE로 마우스의 처치는 Treg의 우선적인 확장의 결과로서 CD8:Treg 비율의 더 큰 감소를 일으켰다 (도 8A-도 8C).

실시예 7. 2회 용량 후 WT 마우스에서 E62A-HLE 및 E96A-HLE의 효과

이 실시예는 2회 용량 투여 이후 WT hIL2-HLE 및 WT mIL2-HLE와 비교하여 E62A-HLE 및 E96A-HLE의 생체내 효과를 예시한다.

WT hIL2-HLE 및 WT mIL-2-HLE와 비교하여 E62A-HLE 및 E96A-HLE의 생물학적 활성을 이해하기 위해서, 마우스는 이들 사이토카인으로 처치되었다. Treg를 포함한, CD8 및 CD4 T 세포는 면역 세포 서브세트의 성장 변화에 대해 조사되었다. 각 생물제제는 1x PBS에 희석되었다. 각 생물제제 경우에, 마우스는 20 g/마우스의 추정치를 기반으로 복강내로, 100 ㎕ 부피를 받았다 (도 7A).

각 그룹 경우에, 6-8 주령인, 4마리 비-종양 보유 암컷 C57BL/6은 0.45 mg/kg/마우스의 저용량 또는 2 mg/kg/마우스의 고용량이 단일 치료로 0일에 투여되었고, 그 다음 다시 7일 후에, 다시 4일 후에 안락사되었다. 폐의 함수 중량을 측정하였고, 심장 천자를 혈장 사이토카인 분석을 위해 수득하였고 비장은 PD 분석을 위해 단리되었다.

고용량 WT 또는 돌연변이체 IL-2의 투여는 일시적인 체중 감량을 일으켰다 (도 7B).

비장은 RP10에서 70 ㎛ 세포 스트레이터를 통해서 으깨주었다. 세포는 RBC 용해 완충액으로 용해된 RBC였고, 생존 비장세포는 ViCell를 통해 계측되었다. 비장은 생/사멸 e780, 항-CD3, 항-CD4, 항-CD8, 항-CD25, 및 항-foxp3으로 염색되었고, 모두 제조사 설명서에 따라 염색되었다. 비장세포를 세척하였고 염색 완충액 중 항체와 인큐베이션하였으며, 세포내 염색은 foxp3 염색 완충 세트를 사용해 수행되었다. 세포는 LSRFortessa FACS 기계에서 분석되었고, 데이터는 FloJo 소프트웨어를 사용해 분석되었다 (TreeStar). 림프구는 FSC/SSC를 기반으로 게이팅하였고, 이중항은 배제하였다. 미경험 T 세포는 CD3+CD4+foxp3+로서 확인되었다. WT mIL-2-HLE 또는 WT hIL2-HLE의 2개 용량으로 마우스의 처치는 비장세포의 수 증가를 일으킨 한편 E62A-HLE의 2개 용량으로 마우스의 처치는 비장세포의 더 큰 용량-의존적 확장을 일으켰다 (도 7C).

E96A-HLE 또는 E62A-HLE로 마우스의 처치는 CD4+foxp3+ T 세포의 더 큰 용량-의존적 확장을 일으켰다. WT hIL2-HLE 또는 WT mIL-2-HLE로 마우스의 처치는 CD8:Treg 비율의 증가를 일으킨 한편, E62A-HLE 또는 E96A-HLE로 마우스의 처치는 Treg의 우선적 확장의 결과로서 CD8:Treg 비율의 더 큰 감소를 일으켰다 (도 8D-8F).

실시예 8. E62A-HLE의 투여는 자가면역 고혈당증으로부터 마우스를 보호하였다

이 실시예는 E62A-HLE의 투여가 생체내에서 증가된 Treg 증식을 비롯하여, 예시적인 자가면역 병태, 자가면역 고혈당증으로부터 처치된 마우스의 증가된 보호를 일으켰다는 것을 입증한다.

7 주령에서, 마우스는 비공복 혈당을 기반으로 처치 그룹으로 지정되었고, 100 ㎕/마우스의 복강내 (IP) 주사를 통해서 표 6에 따라 투약되었다. 체중, 임상적 관측, 및 비공복 혈당은 연구 기간 동안 매주 기록되었다. 연속 2일 동안 비공복 혈당 >250 mg/dL인 임의 동물은 인도적으로 안락사시켰다.

10 주령에, 처치 그룹 1 및 2의 3마리 마우스는 인도적으로 안락사되었고, 비장세포는 표준 T 세포 및 NK 세포 패널을 사용한 유세포측정을 통해서 평가되었다.

30 주령에, 연구에 남은 마우스는 인도적으로 안락사되었고 조직은 표준 T 세포 및 NK 세포 패널을 사용한 유세포측정을 위해 수집되었다.

E62A-HLE의 어떠한 투약 용법도 체중 감량을 일으키지 않았다 (도 9A).

혈당을 측정하였다 (도 9B). 결과는 20 주령 (n=10)까지 고혈당증의 60% 발병률이 입증된 대조군 마우스와 비교하여, E62A-HLE가 처치된 어떠한 마우스도 30 주령 (n=19) 까지 고혈당증이 발생되지 않은 것을 보여주어서, Treg의 확장이 자가면역 고혈당증으로부터 마우스를 보호한다는 것을 시사한다 (도 9C).

E62A-HLE-처치된 마우스의 비장세포에서, Treg가 확장되었다 (도 11A 및 도 11B). NK 세포 (도 10A) 및 CD8+ T 세포 (도 10D)가 또한 E62A-처치 마우스에서 확장되었다. B 세포는 E62A 처치된 마우스로부터의 비장세포에서 증가되었지만 (도 10B), CD4+ T 세포는 확장되지 않았다 (도 10C).

실시예 9. 다수 시점 및 다수 조직에서 E62A-HLE의 단일 투여 후 PD

이 실시예는 다수 시점 및 다수 조직에서 E62A-HLE의 단일 투여 후 PD를 입증한다.

WT hIL-2-HLE (도면에서 Cyto5 (2124-T60)라고 함)와 비교하여 E62A-HLE의 생물학적 활성을 이해하기 위해서, 마우스는 이들 사이토카인으로 처치되었다. Treg를 포함한, CD8 및 CD4 T 세포는 면역 세포 서브세트의 성장 변화에 대해 조사되었다. 암컷 C57BL/6은 0.1 mL 부피로 B16F10 종양 (8x10⁴ 세포 현탁물)이 피하 접종되었다. E62A-HLE의 단일 처치는 복강내로 투여되었다. E62A-HLE로 처치 후, 마우스는 주사 후 96시간, 168시간, 및 240시간에 안락사되었고, 전혈, 림프절, 비장, 및 종양이 분석을 위해 채취되었다. 하기 항체들이 포함되었다: 항-CD45, 항-CD8, 항-CD4, 항-ICOS, 생/사멸, 항-hCTLA-4, Ki67, 항-NKp46, 항-CD19, 항-Ly6G, 항-CD25, 항-CD62L, 항-foxp3, 항-CD44, 항-TCRb, 이들 모두는 제조사 설명서에 따라 염색되었다. 항체를 세척하였고, 염색 완충액에서 염색하였고, 세포내 염색은 foxp3 염색 완충 세트를 사용해 수행되었다. 세포는 LSRFortessa FACS 기계 (BD)에서 수행되었고, 데이터는 FloJo 소프트웨어 (TreeStar)를 사용해 분석되었다. 림프구는 FSC/SSC를 기반으로 게이팅하였고, 이중항은 배제하였다. 미경험 T 세포는 CD3+CD4+foxp3+로서 확인되었다.

혈액에서, 주사후 96시간에, E62A-HLE의 단일 투여 (도면에서 Cyto6 (2124-T61)이라고 함)는 조혈 CD45+ 세포의 비율로서 CD4+foxp3+ 의 확장을 일으켰다. 혈액에서, 주사후 96시간에, E62A-HLE의 단일 투여는 TCRb+ 세포의 비율로서 CD4+foxp3+ 의 확장을 일으켰다. 혈액에서, 주사후 96시간에, E62A-HLE의 단일 투여는 조혈 CD4+ 세포의 비율로서 CD4+foxp3+ 의 확장을 일으켰다 (도 12A 및 도 12B).

림프절에서, 주사후 96시간에, E62A-HLE의 단일 투여는 조혈 CD45+ 세포의 비율로서 CD4+foxp3+ 의 확장을 일으켰다. 림프절에서, 주사후 96시간에, E62A-HLE의 단일 투여는 TCRb+ 세포의 비율로서 CD4+foxp3+ 의 확장을 일으켰다. 림프절에서, 주사후 96시간에, E62A-HLE의 단일 투여는 조혈 CD4+ 세포의 비율로서 CD4+foxp3+ 의 확장을 일으켰다. 림프절에서, 주사후 96시간에, E62A-HLE의 단일 투여는 Ki67+Treg 의 확장을 일으켰다 (도 13A 및 도 13B).

비장에서, 주사후 96시간에, E62A-HLE의 단일 투여는 조혈 CD45+ 세포의 비율로서 CD4+foxp3+ 의 확장을 일으켰다. 비장에서, 주사후 96시간에, E62A-HLE의 단일 투여는 TCRb+ 세포의 비율로서 CD4+foxp3+ 의 확장을 일으켰다. 비장에서, 주사후 96시간에, E62A-HLE의 단일 투여는 조혈 CD4+ 세포의 비율로서 CD4+foxp3+ 의 확장을 일으켰다. 비장에서, 주사후 96시간에, E62A-HLE의 단일 투여는 Ki67+Treg 의 확장을 일으켰다. 비장에서, 주사후 96시간에, E62A-HLE의 단일 투여는 CD44+CD62L-neg Treg 의 확장을 일으켰다 (도 14A 및 도 14B).

종양에서, 주사후 96시간에, E62A-HLE의 단일 투여는 조혈 CD45+ 세포의 비율로서 CD4+foxp3+ 의 확장을 일으켰다. 종양에서, 주사후 96시간에, E62A-HLE의 단일 투여는 TCRb+ 세포의 비율로서 CD4+foxp3+ 의 확장을 일으켰다. 종양에서, 주사후 96시간에, E62A-HLE의 단일 투여는 조혈 CD4+ 세포의 비율로서 CD4+foxp3+ 의 확장을 일으켰다 (도 15A 및 도 15B).

결합 어세이의 결과는WT IL-2가 IL-2Rα (CD25)에 결합하지만 (도 16A), 이러한 능력이 E62A IL-2 뮤테인에서 상실되었다 (도 16B)는 것을 보여주었다. 결합 어세이는 또한 WT IL-2를 비롯하여 E62A IL-2Rα 뮤테인이 IL-2Rβ CD122에 결합한다는 것을 보여주었다 (도 17A 및 도 17B).

결합 어세이의 결과는 WT IL-2를 비롯하여 E62A IL-2 돌연변이체 융합 단백질이 hCTLA-4에 결합한다는 것을 보여주었다 (도 18A 및 도 18B).

실시예 10. 다수 용량의 투여 이후 사이노몰거스 원숭이에서 M23L 및 T111H의 효과

이 실시예는 원숭이에서 다수 용량의 투여 이후 WT hIL-2와 비교하여 예시적인 M23L 및 T111H 뮤테인의 생체내 효과를 예시한다.

M23L, T111H 및 WT hIL-2의 생물학적 활성을 이해하기 위해서, 원숭이는 이들 사이토카인으로 처치되었다. Treg를 포함한, CD8 및 CD4 T 세포는 면역 세포 서브세트의 성장 변화에 대해 조사되었다. 각 생물제제는 1x PBS에 희석되었다. 각 생물제제 경우, 원숭이는 800 pmol/kg의 사이토카인을, 피하로, 각 그룹에서 n=6이, 0일, 2일, 4일, 7일, 9일 및 11일에 투여받았다 (도 19A).

각 그룹의 경우, 4마리 원숭이는 다수 용량의 처치를 투여받았고 혈액은 0일, 1일, 4일, 7일, 8일, 11일 및 14일에 수집되었다. 혈액 세포는 항-CD3, 항-CD4, 항-CD8, 항-CD25, 항-CD45RA, 항-CD56, 항-CD16 및 항-Foxp3에 의해 염색되었고, 모두 제조사 설명서에 따라 염색되었다. 림프구를 세척하였고, 염색 완충액 중 항체와 인큐베이션하였고, 세포내 염색은 foxp3 염색 완충 세트를 사용해 수행되었다. 세포는 LSRFortessa FACS 기계에서 분석되었고, 데이터는 FloJo 소프트웨어를 사용해 분석되었다. 림프구는 FSC/SSC를 기반으로 게이팅하였고, 이중항은 배제하였다. 림프구는 CD4 T-세포, 기억 CD4, 미경험 CD4, CD4 Treg, 기억 Treg, 미경험 Treg, CD8 T, NK 및 NKT 세포를 확인하도록 게이팅되었다.

결과는 WT hIL-2로 원숭이의 처치가 기억 CD4 세포 및 CD4 Treg 세포의 수 증가를 일으켰다는 것을 보여주었다. 그래프에서 돌연변이체 #19로 표시되는, M23L 뮤테인으로 원숭이의 처치는 CD4 Treg 세포 수의 증가를 일으켰지만 기억 CD4 세포 수는 증가되지 않았다 (도 19B). 그래프에서 돌연변이체 #57로서 표시되는 T111H로 원숭이의 처치는 기억 CD4 세포 수의 증가를 일으켰지만 CD4 Treg 세포의 수는 증가되지 않았다 (도 19C).

실시예 11. 자가면역 고혈당증 마우스에서 M23L-HLE의 효과

이 실시예는 M23L-HLE의 투여가 예시적인 자가면역 병태, 자가면역 고혈당증으로부터 처치된 마우스의 보호를 일으켰다는 것을 입증한다.

7 주령에, 마우스는 비공복 혈당을 기반으로 처치 그룹으로 지정되었고, 100 ㎕/마우스의 복강내 (IP) 주사를 통해서 표 7에 따라 투약되었다. 체중, 임상적 관측, 및 비공복 혈당을 연구 기간 동안 매주 기록하였다. 연속 2일 동안 비공복 혈당 >250 mg/dL인 임의 동물은 인도적으로 안락사되었다.

혈당을 측정하였다 (도 20A). 결과는 20 주령 (n=16) 까지 고혈당증의 75% 발병률이 입증된 PBS 처치된 마우스와 대조적으로, E62A-HLE 처치된 마우스는 20 주령 (n=16) 까지 고혈당증이 발생되지 않았고, M23L-HLE로 처치된 30% 마우스 및 IL-2-HLE로 처치된 18% 마우스는 고혈당증이 발생된 것으로 확인되어서, M23L-HLE가 자가면역 고혈당증으로부터 마우스를 보호한다는 것을 시사한다 (도 20B).

[등가물]

당업자는 단지 통상의 실험을 사용하여서, 본 명세서에 기술된 본 발명의 특별한 구현예에 대한 많은 등가물을 인식하게 되거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범주는 상기 설명에 제한하려는 의도가 아니라, 하기 청구항에 기재된 바와 같다.

<110> TAKEDA PHARMACEUTICAL COMPANY LIMITED <120> INTERLEUKIN-2 MUTEINS AND USES THEREOF <130> 093178 <150> US63/073,208 <151> 2020-09-01 <150> US63/231,471 <151> 2021-08-10 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 2 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu 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Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 4 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Thr His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 5 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr 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<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu Lys Phe His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225

Claims (11)

1. SEQ ID NO:1로 기재된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간 인터루킨-2 (IL-2) 뮤테인으로서, 상기 IL-2 뮤테인은 T111H, T37Y, E15T, M23L, P34F, E68F 및 E62A로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 것인, 인간 인터루킨-2 (IL-2) 뮤테인.
2. 제1항에 있어서, C125A의 아미노산 치환을 더 포함하는 것인 인간 인터루킨-2 (IL-2) 뮤테인.
3. 제1항의 인간 인터루킨-2 (IL-2) 뮤테인의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드.
4. 제1항의 인간 인터루킨-2 (IL-2) 뮤테인, 또는 이의 염을 포함하는 약물.
5. 제4항에 있어서, Treg 활성인자인 약물.
6. 제4항에 있어서, 자가면역 질환의 예방 또는 치료를 위한 작용제인 약물.
7. 포유동물에서 조절 T 세포 (Treg 세포)를 증식시키는 방법으로서, 제1항의 인간 인터루킨-2 (IL-2) 뮤테인, 또는 이의 염의 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 증식 방법.
8. 포유동물에서 자가면역 질환의 예방 또는 치료를 위한 방법으로서, 제1항의 인간 인터루킨-2 (IL-2) 뮤테인, 또는 이의 염의 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 예방 또는 치료 방법.
9. 제1항에 있어서, 자가면역 질환의 치료를 위한 방법에서 사용을 위한 것인 인간 인터루킨-2 (IL-2) 뮤테인.
10. 자가면역 질환의 예방 또는 치료를 위한 작용제의 생산을 위한 제1항의 인간 인터루킨-2 (IL-2) 뮤테인, 또는 이의 염의 용도.
11. 조절 T 세포 (Treg)의 증식 방법으로서, T 세포의 개체군을 제1항의 인간 인터루킨-2 (IL-2) 뮤테인의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 증식 방법.

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