ES2225874T3 - Activacion de receptor mediante gas. - Google Patents

Abstract

SE HA IDENTIFICADO UN ACTIVADOR DE LAS PROTEINAS TIROSIN QUINASAS DE LOS RECEPTORES RSE Y MER. EL ACTIVADOR ES CODIFICADO POR EL GEN 6 ESPECIFICO DE LA DETENCION DEL CRECIMIENTO (GAS6). POR CONSIGUIENTE, LA INVENCION SUMINISTRA UN PROCEDIMIENTO DE ACTIVACION DEL RECEPTOR RSE O MER UTILIZANDO EL POLIPEPTIDO GAS6. ADEMAS, LA INVENCION SUMINISTRA UN PROCEDIMIENTO PARA AUMENTAR LA SUPERVIVENCIA, LA PROLIFERACION O LA DIFERENCIACION DE CELULAS QUE POSEEN EL RECEPTOR RSE O MER INCORPORADO EN SUS MEMBRANAS CELULARES QUE IMPLICA A ESTAS CELULAS CON EL POLIPEPTIDO GAS6. LOS TIPOS DE CELULAS QUE PUEDEN TRATARSE SEGUN EL PROCEDIMIENTO INCLUYEN CELULAS GLIALES, TALES COMO LAS CELULAS DE SCHWANN Y LA CELULAS MONONUCLEARES. TAMBIEN SE DESCRIBEN ESTUCHES DE ENSAYO Y ARTICULOS FABRICADOS QUE INCLUYEN EL POLIPEPTIDO GAS6. ESTA INVENCION TAMBIEN TRATA DE VARIANTES DE GAS6.

Description

Activación de receptor mediante gas6.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La invención hace referencia a los procedimientos de activación de los receptores tirosina quinasa Rse o Mer. En particular, la invención hace referencia a los procedimientos para aumentar la supervivencia, la proliferación y/o la diferenciación de células que contienen el receptor Rse (como por ejemplo las células glía) o el receptor Mer (p.ej., los monocitos) utilizando gas6. La invención también hace referencia a las variantes de gas6, en particular aquellas que están menos \gamma-carboxiladas que el propio gas6 aislado de la naturaleza.

Descripción de materias relacionadas

Las señales específicas que controlan el crecimiento y la diferenciación de células en el desarrollo de tejidos adultos ejercen a menudo sus efectos mediante la unión a y la activación de receptores de superficie celular que tienen actividad tirosina quinasa intrínseca. Mark y col., describieron recientemente las secuencias de DNA complementarias humanas y murinas del receptor tirosina quinasa Rse que se expresa preferentemente en el cerebro adulto (Mark y col., J. Biol. Chem. 269:10720 [1994]). El dominio extracelular del receptor Rse está compuesto de dos repeticiones similares a la inmunoglobulina (Ig-L) seguido de dos repeticiones de tipo III de la fibronectina. Las secuencias de DNA complementarias que codifican proteínas idénticas al receptor Rse humano (Ohashi y col., Oncogene 9:699 [1994]) y murino (Lai y col., Oncogene 9:2567 [1994]) se han publicado de forma independientemente, y se han denominado Sky y Tyro3, respectivamente. Véase también Fujimoto y Yamamoto, Oncogene 9:693 (1994) en relación con el equivalente murino de Rse que denominan brt, y Dai y col., Oncogene 9:975 (1994) en relación con la molécula humana que denominan tif.

Se ha investigado la expresión de Rse en diversos tejidos. Lai y col., supra, hallaron que en el cerebro adulto el mRNA de Rse se localiza en neuronas del neocórtex, cerebelo e hipocampo. Schulz y col., de forma similar hallaron que el Rse se expresa a niveles elevados en el córtex cerebral, el septo lateral, el hipocampo, el bulbo olfativo y en el cerebelo. Los mayores niveles de expresión de Rse en el cerebro se hallaron asociados con las neuronas. (Schulz y col., Molec. Brain. Res. 28:273-280 [1995]). En el sistema nervioso central (CNS) de ratones, la expresión de Rse se detecta a niveles superiores durante estadios embrionales y después del nacimiento, coincidiendo con el establecimiento y mantenimiento de circuitos sinápticos en las neuronas corticales e hipocampo (Lai y col., supra y Scheneider y col., Cell 54:787-793 [1988]). Se cree que este proceso está regulado localmente, por las células que están en contacto directo o cercanas unas a otras. Mediante análisis de transferencia de Northern, Mark y col., supra, observaron niveles elevados del mRNA de Rse en muestras de RNA de cerebro y riñón. Dai y col., supra, hallaron que el Rse se expresaba a niveles elevados en ovario y testículos humanos. Estos autores también analizaron la expresión de Rse en diversas líneas celulares humanas. Mediante transferencia de Northern de las muestras de mRNA de los monocitos de la línea celular THP-1 o de las células RAJI similares a linfoblastos, la expresión detectada del mRNA fue nula o escasa. Sin embargo, el transcrito de Rse se detectó en diversas líneas hematopoyéticas, incluyendo células de la línea K562 de leucemia mielógena mieloide y las células U937 mielomonocíticas) y las líneas de leucemia megacariocítica DAMI y CMK11-5, así como la línea celular MCF-7 de carcinoma mamario humano. En las líneas celulares examinadas, el mayor nivel de expresión se observó en las células Hep 3B, una línea celular de hepatocarcinoma.

El Rse está relacionado estructuralmente con el Axl (también conocido como Ufo o Ark) y comparte el 43% de identidad de secuencia aminoacídica con este receptor tirosina quinasa. Véase O'Bryan y col., Mol. Cell. Biol. 11:5016 (1991), Janssen y col., Oncogene 6:2113 (1991), Rescigno y col., Oncogene 5:1908 (1991) y Bellosta y col., 15:614 (1995) respecto a Axl. El Rse y el Axl junto con Mer (Graham y col., Cell Growth Differ, 5:647 [1994]), definen una clase de receptores tirosina quinasa cuyos dominios extracelulares se parecen a las moléculas de reconocimiento y adhesión de células nerviosas (revisado por Ruitishauser, U. en Current Opinion. Neurobiology 3:709 [1993] y Brummendorf y Rathjen en J. Neurochemistry 61:1207 [1993]). Al igual que el Rse, el Axl también se expresa en el sistema nervioso, aunque mucho más que el Rse en los tejidos periféricos.

Se detectó mRNA de Mer en células mononucleares de sangre periférica, células mononucleares de médula ósea y en monocitos, pero no en granulocitos. A pesar del hecho de que el mRNA de Mer se expresa en las líneas de células B y T neoplásicas, no se detecta en linfocitos normales B o T (Graham y col., Cell Growth Differ. 5:647 [1994]). El receptor Mer se expresa ampliamente en tejidos humanos, pero los niveles mayores de mRNA de Mer se detectaron en testículos, ovario, próstata, pulmón y riñón (Graham y col., Cell Growth Differ. 5:647 [1994]).

La expresión anómala de Mer, Rse y Axl se asocia con la transformación celular. Por ejemplo, Axl se aisló del DNA de pacientes con leucemia mielógena crónica (O'Bryan y col., supra) y el trastorno mieloproliferativo crónico (Janssen y col., supra) utilizando un ensayo de transfección/tumoregenicidad. Mer se clonó de una línea de células B neoplásicas y se expresa en muchas líneas de células de leucemia linfocítica aguda T transformadas (Graham y col., supra). Rse y Axl, cuando se sobreexpresan en fibroblastos, inducen la transformación celular (O'Bryan y col., supra; Ohashi y col., Oncogene 9:669 [1994]; Taylor y col., J. Biol Chem. 270:6872-6880 [1995]; y McCloskey y col., Cell Growth and Diff. 5:1105-1117 [1994]). El mRNA de Rse y la proteínas también se sobreexpresan en tumores mamarios derivados de animales transgénicos que sobreexpresan tanto los oncogenes wnt-1 o fgf-3 (Taylor y col., J. Biol. Chem. 270.6872-6880 [1994]).

Se han descrito ligandos putativos para Rse y Axl. Varnum y col., Nature 373:623 (1995) y Stitt y col., Cell:80 661-670 (1995) publicaron que gas6 (apelativo de gen 6 específico del paro del crecimiento) es un ligando de Axl. Gas6 pertenece a un grupo de genes murinos que se expresan a niveles elevados durante la privación de suero en células NIH 3T3 (Schneider y col., Cell 54:787-793 [1988]). Estos genes se denominaron genes específicos del paro de crecimiento, ya que su expresión está regulada negativamente durante la inducción del crecimiento. El homólogo humano de gas6 murino también se clonó y secuenció por Manfioletti y col., en Molec. Cell Biol. 13(8):4976-4985 (1993). Estos autores concluyeron que gas6 es una proteína dependiente de la vitamina K y especularon que puede desempeñar un papel en la regulación de una cascada de proteasas importante para la regulación del crecimiento. Gas6 se expresa en diversos tejidos incluyendo el cerebro. Véase también Colombo y col., Genome 2:130-134 (1992) y Ferrero y col., J. Cellular Physiol. 158:263-269 (1994) en relación con gas6.

Sitt y col., supra describieron que la proteína S es el ligando de Tyr3. La proteína S es una proteína plasmática dependiente de la vitamina K que funciona como un anticoagulante actuando como un cofactor para estimular la inactivación proteolítica de los factores Va y VIIIa por la proteína C activada. Revisado en Easmon y col., Aterioscler. Thromb, 12:135 (1992). Según ello, la proteína S es un regulador negativo importante de la cascada de coagulación sanguínea. Véase Walker y col., J. Biol. Chem. 255:5521-5524 (1980), Walker y col., J. Biol. Chem. 256:11128-11131 (1981), Walker y col., Arch. Biochem. Biophys. 252:322-328 (1991), Griffin y col., Blood 79:3203 (1992) y Easmon, D., Aterioscler. Thromb. 12:135(1992). El descubrimiento de que aproximadamente la mitad de la proteína S en el plasma humano se une a C4BP apoya la idea de que la proteína S esté implicada en la cascada del complemento. Dahlback y col., PNAS (USA) 78:2512-2516 (1981). También se ha publicado el papel de la proteína S como mitógeno para las células musculares lisas. Gasic y col., PNAS (USA) 89:2317-2320 (1992).

La proteína S se puede dividir en cuatro dominios (véanse las figuras 1A, 1C y 1D). Los residuos 1-52 (Región A) son ricos en residuos de ácido \gamma-carboxiglutámico (Gla) que median la unión dependiente del Ca^{2+} de la proteína S con los fosfolípidos cargados negativamente (Walker, J. Biol. Chem. 259:10335 [1984]). La región B incluye un bucle sensible a la trombina. La región C contiene cuatro repeticiones similares al factor de crecimiento epitelial (EGF). La región D es homóloga a la proteína globulina de unión a la hormona esteroidea (SHBG) (Hammond y col., FEBS Lett. 215:100 [1987]). Tal como se discutió por Joseph y Baker (FASEB J. 6:2477 [1994]), esta región es homóloga a los dominios en la cadena A de la laminina (23% de identidad) y la merosina (22% de identidad) y a un dominio de crumbs de Drosophila (19%).

Los cDNAs de gas6 murino y humano codifican proteínas con una identidad de secuencia del 43 y 44%, respectivamente, con la proteína S humana.

Resumen de la invención

La presente invención hace referencia a las variantes de gas6 que no están \gamma-carboxiladas o lo están menos que gas6 derivado de una fuente endógena de la molécula. Ejemplos de dichas variantes incluyen las variantes de gas6 que carecen de uno o más residuos de ácido glutámico del dominio A de gas6 y que son normalmente fragmentos \gamma-carboxilados de gas6 que carecen del dominio A, así como los fragmentos que consisten en el dominio D de gas6 (o un fragmento del dominio G de gas 6).

La invención proporciona además un procedimiento de activación del receptor Rse o Mer mediante la exposición de una célula (preferentemente una célula humana) que contiene el receptor Rse o Mer a variantes de gas6 de la invención en una cantidad efectiva para activar el receptor Rse o Mer. En dicho procedimiento, el receptor Rse o Mer está unido normalmente a la célula y gas6 es preferentemente el humano. La invención también proporciona un procedimiento para aumentar la supervivencia, proliferación y/o diferenciación de una célula que tenga el receptor Rse o Mer incorporado en la membrana celular mediante exposición de la célula a variantes de gas6 de la invención en una cantidad efectiva para la supervivencia, proliferación y/o diferenciación de la célula. La célula puede ser una neurona o una célula glía, como la célula de Schwann, o un monocito (p.ej., un macrófago). La célula puede hallarse en un cultivo celular o en un mamífero (p.ej., un humano) que padezca una enfermedad o trastorno neurológico. A menudo, se proporciona gas6 en un vehículo aceptable fisiológicamente.

La invención también proporciona los equipos y artículos de fabricación que comprenden las variantes de gas6 de la invención. El artículo de fabricación comprende generalmente las instrucciones para utilizar la variante de gas6 en un cultivo celular in vitro o para la administración de la variante de gas6 a un mamífero.

Descripcion resumida de las figuras

Las Figs. 1a-1D proporcionan una representación esquemática de la proteína S y de gas6 (Fig. 1A) y una comparación de la identidad de secuencia aminoacídica entre las formas bovina (b) y humana (h) de la proteína S (Figs. 1C y 1D, respectivamente) con la gas6 humana (Fig. 1B). Para hgas6, los recuadros representan la región Gla (es decir, el dominio A), la región del bucle (es decir, el dominio B), las 4 repeticiones similares a EGF (marcadas C1-C4) que forman el dominio C y la región homóloga a la globulina de unión de la hormona sexual (es decir, el dominio D), que también está relacionada con los dominios G de la cadena A de la laminina y la merosina y la proteína de Drosophila, crumbs. El porcentaje de identidad aminoacídica compartida entre la h gas6 y la b proteína S o la h proteína S se indica dentro de los recuadros correspondientes. Los aminoácidos se indican en los extremos de las regiones encima de cada uno de los recuadros.

Fig. 2 muestra una comparación de las secuencias aminoacídicas de gas6 murino (m gas6) [SEC ID Nº:1], h gas6 [SEC ID Nº2] y la h proteína S [SEC ID Nº 3]. Se detallan los residuos de las secuencias "pre" y "pro" (indicándose con una flecha el último residuo de cada secuencia precursora). Los dominios A-D están remarcados, al igual que los dos dominios G que residen en el dominio D (es decir, dominio G 1 y dominio G 2).

Figs. 3A-3D son gráficos que muestran la caracterización de Rse-L en suero bovino fetal (FBS). La Fig. 3A muestra la unión de I^{125}-Rse-IgG en función de la concentración de FBS. La unión, porcentaje del contenido total añadido que está asociado a membranas (100 x B/T, es decir, unido/total), se representa en función de la concentración de FBS. Los resultados se ajustaron a un modelo de 4 parámetros y se obtuvo un EC_{50} del 0,58% v/v. La Fig. 3B muestra la unión de I^{125}-Rse-IgG como una función de la concentración de Ca^{2+}, con una concentración de FBS constante. La unión se realizó igual que en la Fig. 3A, bien en presencia de FBS al 10% diafiltrado o en su ausencia y variando la concentración de Ca^{2+} añadido. El EC50 del Ca^{2+} estimado por 4 parámetros correspondió a 0,18 mM. La Fig. 3C es un análisis de Scatchard de la unión de I^{125}-Rse-IgG con las membranas de CMK11-5 mediada por FBS. Se utilizó una sola concentración de I^{125}-Rse-IgG, FBS y Ca^{2+} con concentraciones crecientes de Rse-IgG no marcado, y se representó la unión en relación con el cociente de unido y libre (B/F) después de su corrección para una unión inespecífica. Se muestran los experimentos con FBS al 1% (Kd=0,82 nM) y al 10% (Kd=2,2 nM). La Fig. 3D es un análisis KIRA de activación dependiente de la dosis de la fosforilación de Rse por la fracción enriquecida de Q-Sepharose (QSE) del FBS. El gráfico muestra que la actividad de Rse-L se neutraliza específicamente mediante incubación con Rse-IgG. La fosforilación de Rse se observa en las células privadas de suero (-); o en las células tratadas con la fracción QSE en ausencia de proteínas IgG (QSE) añadidas; o con las QSE incubadas con Rse-IgG o CD4-IgG tal como se indica.

La Fig. 4 es un dibujo que muestra el KIRA/ELISA para el receptor Rse descrito en el Ejemplo 4.

La Fig. 5 muestra la inhibición de la unión de I^{125}-Rse-IgG con gas6 con el Rse-IgG no marcado. Se añadieron cantidades crecientes de Rse-IgG marcado a los tubos con concentraciones constantes de I^{125}-Rse-IgG y gas6. Con los resultados, se realizó un ajuste no lineal por mínimos cuadrados utilizando una sola clase de sitios que proporcionaran una constante de disociación en equilibrio estimada de 0,46+0,04 nM. El gráfico muestra un trazado de Scatchard de unidos (B) respecto a no unidos/libres (B/F) después de la corrección para la unión inespecífica.

Las Figs. 6A-6C muestran actividad Rse-L en cultivos de astrocitos. Para determinar si los astrocitos secretan ligando de Rse, el medio sin suero que había sido condicionado durante 3 días se concentró 10-veces en un dispositivo de ultrafiltración de centrifugación Centricon-10 y se añadió directamente a tubos de ensayo para proporcionar las concentraciones finales indicadas. En la Fig. 6A, se permitió la unión de I^{125}-Rse-IgG a las membranas CMK11-5 mediante adición de medio condicionado de astrocitos (ACM), con un efecto máximo medio logrado al 13% de ACM v/v. La Fig. 6B es un análisis KIRA de fosforilación de Rse por ACM. La Fig. 6C muestra que la fosforilación de Rse por ACM se inhibe por incubación con Rse-IgG, pero no con CD4-IgG. La neutralización se llevó a cabo tal como se describe en la leyenda de la Fig. 3.

Tal como se muestra en la Fig. 7, el análisis de las deleciones de gas6 indica que los dominios G son suficientes para la unión con Rse in vitro. El gas6 o la proteína S, o las variantes de truncación N-terminal etiquetados con un epitopo (gD) (conteniendo los residuos indicados) se construyeron y se expresaron de forma transitoria en células 239 siguiendo esencialmente el procedimiento descrito en el Ejemplo 6. Se detectaron las proteínas de peso molecular correcto en los sobrenadantes celulares no fraccionados (entrada), utilizando un anticuerpo dirigido contra la etiqueta epitópica. En cambio, la proteína S y los derivados de gas6 se precipitaron a partir de los sobrenadantes celulares mediante Rse-IgG. La unión fue específica para el dominio extracelular de Rse porque las proteínas no se precipitaron por el Fc humano control. Para la cuantificación, los carriles no fraccionados (entrada) representaron el 20% del material utilizado para la precipitación.

La Fig. 8 muestra que el gas6 induce la proliferación de las células de Schwann de rata P45 de forma dependiente de la dosis. Las células se plaquearon en placas de 24 pocillos en medio F12/DME con 10 \mug/ml de insulina y transferrina y 5 \mug/ml de vitamina E con las correspondientes concentraciones de gas6 humano recombinante. Al cabo de 48 horas, se contaron las células con un contador Coulter. Para cada tratamiento, se muestran la media y la desviación estándar de 6 pocillos.

La Fig. 9 muestra que la proliferación inducida por gas6 de las células de Schwann de rata P45 se neutraliza por Rse-IgG. Las células se plaquearon tal como se describe en la leyenda de la Fig. 8. Las células control no recibieron adiciones posteriores. Todas las otras células se trataron con dos purificaciones distintas de gas6 (es decir, lote #15 y lote #9) y con 10 \mug/ml de Rse-IgG (Rse marcado) o CD4-IgG (CD4Fc marcado).

La Fig. 10 muestra una curva de respuesta dependiente de la dosis para la activación de la fosforilación de Rse en el ensayo KIRA, tal como se describe en el Ejemplo 10.

La Fig. 11 muestra la cromatografía de intercambio iónico de los medios condicionados por las células que expresan gas6 recombinante humano. El medio (700 ml) se dializó contra el tampón A (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, benzamidina 5 mM), se ajustó con CHAPS al 0,1% y se cargó en una columna Resource-Q de 6 ml (Pharmacia) a una velocidad de flujo de 10 ml/minuto. La columna se lavó con el tampón A y se eluyó con un gradiente lineal de 70 ml de 0 a 0,4 M de NaCl en tampón A a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min y se recolectaron fracciones de 2,0 ml. Las fracciones se analizaron por su capacidad para unirse y activar Rse utilizando el procedimiento de unión del cloruro de bario descrito en el Ejemplo 6 y el ensayo KIRA descrito en el Ejemplo 4. La actividad de unión se expresó como el porcentaje de radioactividad total añadida que se precipita con cloruro de bario. La actividad KIRA se expresa como unidades/ml respecto a un estándar.

Las Figs. 12A-12C muestran el efecto de gase6 y otros factores de crecimiento sobre el crecimiento de células de Schwann y la síntesis de DNA. Todos los resultados se han representado como la media + error estándar (n=4). La Fig. 12A muestra las curvas de respuesta dependientes de la dosis de células de Schwann respecto a gas6 en distintas condiciones. El número de células se cuantificó mediante un contador Coulter a las 84 horas después del cultivo con las concentraciones indicadas de gas6. La Fig. 12B muestra que gas6 aumentó la incorporación de timidina en las células de Schwann cultivadas como en la Fig. 12A en presencia de diferentes concentraciones de gas6. Se añadió H^{3}-[metil]-timidina (0,5 \muCi/ml) a las 48 horas de cultivo. Las células se cosecharon a las 96 horas de cultivo y se procesaron para cuantificar la radioactividad incorporada en el DNA. La Fig. 12C muestra la influencia de factores de crecimiento sobre el crecimiento de células de Schawnn en presencia de 8F. Las Células de Schwann se plaquearon en 8F con o sin PDGF (10 ng/ml, FGF básico (20 ng/ml), IL-1\alpha (1 ng/ml), TGF-\beta1 (1 ng/ml) y gas6 (30 ng/ml). El número de células se estimó al cabo de 108 horas.

La Fig. 13 muestra una gráfica en función del tiempo del crecimiento de células de Schwann humanas en cultivo. Las células de Schwann humanas se plaquearon a 2x10^{4} células/pocillo en multiplacas de 24 pocillos en medio F12/DME (1:1) suplementado con 8F con o sin gas6, o suero bovino fetal diafiltrado al 10% (FBS). De cada grupo, se utilizaron 4 pocillos de cultivo para el contaje celular cada 24 horas. Los resultados se muestran como la media + error estándar (n=4).

La Fig. 14 muestra la neutralización de la fosforilación de Rse inducida por gas6 por proteínas de fusión receptor-Fc cuantificadas en un ensayo KIRA. Se muestra el porcentaje de fosforilación de Rse observado en las células CHO Rse.gD tratadas con gas6 purificado en presencia de las concentraciones indicadas de la proteína de fusión del receptor en relación con el porcentaje observado con las células tratadas únicamente con gas6.

Las Figs. 15A-15D muestran un análisis cinético de unión del ligando a Mer-Fc. Mer-Fc se unió a la capa de dextrano carboximetilado en la superficie de un biosensor BIAcore^{TM}. Gas6 purificado (Figs. 15A, B y C) o la proteína S (Fig. 15D) a una concentración de 100 nM (línea interrumpida) o 140 nM (línea continua) se inyectó sobre la superficie del biosensor a los 160 s. A los 340 s, el bucle del inyector se conectó con el tampón para proseguir con la disociación. Se bloqueó la unión de gas6 con Mer-Fc en el chip mediante preincubación con Mer-Fc soluble (Fig. 15B), pero no con CD4-Fc (Fig. 15C). No se observó la unión de la Proteína S con Mer-Fc (Fig. 15D).

Descripcion detallada de las realizaciones preferidas 1. Definiciones

Tal como se utiliza aquí, los términos "gas6" y "polipéptido de gas6" (salvo que se indique lo contrario) hacen referencia a un polipéptido que es capaz de activar el receptor Rse o el receptor Mer y abarca las formas maduras, pre-, prepro- y pro- del polipéptido gas 6, purificado a partir de una fuente natural, sintetizado químicamente o producido de forma recombinante. La definición presente incluye específicamente el polipéptido gas6 "humano" que comprende la secuencia aminoacídica publicada en Manfioletti y col., Mol. Cell Biol. 13(8):4976-4985 (1993) (disponible a partir de EMBL/GenBank/DDBJ con el número de acceso X59846) y otros polipéptidos de gas6 de mamífero (como el gas6 murino, ver Manfioletti y col., supra). Si el polipéptido gas6 tiene la secuencia aminoacídica del polipéptido gas6 de la naturaleza, es referido aquí como polipéptido "nativo" o de "secuencia nativa" independientemente del procedimiento mediante el cual se produce (p.ej., se puede aislar a partir de una fuente endógena de la molécula o producirse mediante técnicas sintéticas).

Gas6 tiene diversas "regiones" aminoacídicas o "dominios" que están delineados en las Figs. 1A-B y la Fig. 2. El dominio A o la "región Gla" en el extremo amino terminal del polipéptido tiene residuos que son ricos en ácido \gamma-carboxiglutámico (residuos Gla) que parecen facilitar la unión dependiente del calcio de gas6 respecto a los fosfolípidos cargados negativamente en las membranas celulares. Los tramos del dominio A que comprende los residuos 46-86 de gas6 murino y los residuos 49-89 de gas6 humano. El siguiente "dominio B" comprende un "bucle" sensible a la trombina y comprende los residuos 87-114 del gas6 murino y los residuos 90-117 del gas6 humano. El tercer dominio denominado "dominio C" en la presente invención tiene cuatro repeticiones similares al factor de crecimiento epitelial (EGF) (C1-C4 en la Fig. 1B). Este dominio comprende aproximadamente los residuos 115-275 del gas6 murino y los residuos 118-278 del gas6 humano. El "dominio D" restante es homólogo a la globulina de unión con la hormona esteroidea (SHBG) y comprende los residuos 275-673 de gas6 murino y los residuos 279-678 de gas6 humano. El dominio D comprende un par de "dominios G" denominados "Dominio G" (es decir, aproximadamente los residuos 311-486 para gas6 murino y los residuos 314-471 para gas6 humano) y el "Dominio G 2" (es decir, los residuos 500-666 para gas6 murino y 503-671 para gas6 humano).

Los términos "gas6" y "polipéptido de gas6" también abarcan "variantes" o "mutantes" de gas6 nativo. Dichas variantes incluyen los fragmentos de la secuencia de gas6 humana; los polipéptidos en donde uno o más residuos aminoacídicos se añaden al extremo N- o C-terminal de, o entre, la secuencia de gas6 humana; uno o más residuos aminoacídicos se delecionan y opcionalmente, se sustituyen por uno o más residuos aminoacídicos; y derivados de las proteínas anteriores, polipéptidos, o fragmentos de lo mismo, en donde un residuo aminoacídico se ha modificado covalentemente, de modo que el producto resultante es un aminoácido no natural. Las variantes de gas6 pueden producirse sintéticamente, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida o por PCR, o pueden existir de forma natural, como es el caso de las formas alélicas y de otras variantes naturales de la secuencia aminoacídica traducida que se describen por Manfioletti y col., que pueden ocurrir en la especie humano y otras especies animales.

Una variante de gas6 se incluye dentro del ámbito de la invención siempre que sea funcionalmente activa. Tal como se utiliza aquí, "funcionalmente activa" y "actividad funcional" respecto a gas6 hacen referencia a que gas6 es capaz de activar el receptor Rse y/o el receptor Mer y/o promover la proliferación, la supervivencia y/o la diferenciación de células que contienen el receptor Rse o Mer como las neuronas, las células glía o los monocitos. Una "célula glía" se deriva del sistema nervioso central y periférico y puede seleccionarse a partir de la oligodendroglia, astrocito, célula ependimal, o de las células microgliales así como también de las células satélites de ganglios y del neurolema o las células de Schwann alrededor de las fibras nerviosas periféricas. Una "célula monocítica" es un leucocito mononuclear como un macrófago.

Las variantes de gas6 de la presente invención comparten por lo menos el 75% (preferentemente más del 80% y más preferentemente superior al 90%) de identidad de secuencia con la secuencia aminoacídica traducida que codifica la proteína gas6 madura o fragmentos de ésta después de alinear las secuencias para proporcionar la máxima homología, tal como se determinó, por ejemplo, por Fitch y col., PNAS (USA) 80:1382-1386 (1983), la versión del algoritmo descrito por Needleman y col., J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970). Con el fin de seleccionar variantes de gas6 activas funcionalmente, se puede someter una variante a uno o más de uno de los ensayos de actividad siguientes:

(a) Ensayos de activación del receptor que cuantifica la regulación negativa o la activación de la actividad del receptor quinasa (p.ej., la transferencia de western utilizando un anticuerpo anti-fosfotirosina para determinar si la variante es capaz de activar el receptor Rse o Mer, véase el Ejemplo 3).

(b) KIRA ELISA para determinar la capacidad de activación del receptor Rse o Mer de la variante tal como se describe en el Ejemplo 4 de más adelante.

(c) Ensayo de proliferación de células de Schwann para establecer si la variante es capaz o no de incrementar la proliferación de células de Schwann en el cultivo de células. Véase el Ejemplo 9.

Las variantes de secuencia aminoacídica de gas6 pueden prepararse introduciendo cambios nucleotídicos adecuados en el DNA de gas6 y expresando a continuación el DNA modificado resultante en una célula huésped, o mediante la síntesis in vitro. Dichas variantes incluyen, por ejemplo, deleciones, o inserciones o sustituciones de residuos aminoacídicos en la secuencia aminoacídica de gas6 descrita por Manfioletti y col. Cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución puede producir una variante de secuencia aminoacídica de gas6, siempre que dicha variante posea las características deseadas descritas aquí. Los cambios que se producen en la secuencia aminoacídica para generar una variante de secuencia aminoacídica de gas6 pueden producir modificaciones posteriores de gas6 tras su expresión en las células huéspedes, por ejemplo, mediante dichos cambios es posible introducir o desplazar sitios de glicosilación.

Existen dos variables principales en la construcción de las variantes de secuencia aminoacídica de gas6: la localización del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación. Estas variantes son propias de la secuencia aminoacídica de gas6 y pueden representar formas alélicas de gas6 que se producen de forma natural, o formas mutantes predeterminadas de gas6 producidas mediante mutagénesis del DNA de gas6, bien para conseguir un alelo o bien una variante no hallada en la naturaleza. En general, la localización y la naturaleza de la mutación elegida dependerán de la característica de gas6 a modificar.

Por ejemplo, debido a la degeneración de las secuencias codificantes nucleotídicas, las mutaciones pueden realizarse en la secuencia nucleotídica de gas6 humana sin afectar la secuencia aminoacídica codificada de gas6. Se pueden realizar otras mutaciones que den como resultado un gas6 con una secuencia aminoacídica distinta a la descrita por Manfiolleti y col., pero que sea activa funcionalmente. Dichas variantes de secuencia aminoacídica de gas6 activas funcionalmente se seleccionan, por ejemplo, sustituyendo uno o más residuos en la secuencia aminoacídica de gas6 humana con otros residuos aminoacídicos de una polaridad o carga similar o distinta.

Una aproximación de utilidad es la denominada "mutagénesis por cribaje de alaninas". Se identifica un residuo o grupo aminoacídico de los residuos diana (p.ej., residuos cargados como la arg, asp, his, lys y glu) y mediante la tecnología del DNA recombinante, se reemplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (más preferentemente, la alanina o la polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con el entorno acuoso en o fuera de la célula. Cunningham y col., Science, 244:1081-1085 (1989). Los dominios que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se estudian con mayor profundidad introduciendo otras variantes en o para los sitios de sustitución.

Así, aunque el sitio de introducción de una variante de secuencia aminoacídica está predeterminada, la naturaleza de la mutación per se no lo está necesariamente. Por ejemplo, para optimizar la realización de una mutación en un sitio dado, se lleva a cabo el cribaje de alaninas o la mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y se rastrean las variantes expresadas de gas6 por su actividad funcional, tal como se describió anteriormente.

Las deleciones de secuencia aminoacídica se hallan generalmente en un intervalo de 1 a 30 residuos, más preferentemente de 1 a 10 residuos y en general son contiguos. Las deleciones de regiones de homología esencial con otros ligandos del receptor tirosina quinasa, por ejemplo, afectan más probablemente a la actividad funcional de gas6. En general, el número de deleciones consecutivas se seleccionará para conservar la estructura terciaria de gas6 en el dominio afectado, p.ej., la hoja plegada-\beta o la hélice \alpha. Las variantes de la invención carecen de uno o más residuos de ácido glutámico en el dominio A de gas6 (es decir, los residuos E en el dominio A de gas6 que se muestran en la Fig. 2) o carecen completamente del dominio A. Un mutante de deleción preferido de gas6 es el que consiste en el dominio D de gas6 o en los dominios G.

Las inserciones de secuencia aminoacídica incluyen las fusiones amino- y/o carboxi-terminal en un intervalo de extensión que abarca desde un aminoácido a polipéptidos que contienen un centenar o más de residuos, así como también las inserciones intra-secuencias de uno o múltiples residuos aminoacídicos (es decir, inserciones realizadas en la secuencia aminoacídica de gas6) pueden ser de aproximadamente 1 a 10 residuos, más preferentemente de 1 a 5 y más preferentemente de 1 a 3. Ejemplos de inserciones terminales incluyen gas6 con un residuo metionil N-terminal (lo que puede ser el resultado de la expresión directa de gas6 en el cultivo de células recombinantes) y gas6 con una secuencia señal N-terminal heteróloga para mejorar la secreción de gas6 de las células huéspedes recombinantes. Otras inserciones incluyen la fusión del extremo N- o C-terminal de gas6 de los polipéptidos inmunogénicos (por ejemplo, polipéptidos bacterianos como la \beta-lactamasa o una enzima codificada por el locus trp de E. coli, o una proteína de levadura) y las fusiones C-terminales con proteínas que tengan una vida media más prolongada como las regiones constantes de las inmunoglobulinas, la albúmina, o la ferritina, tal como se describe en la PCT Pub. de la patente internacional WO 89/02922 (publicada el 6 de Abril de 1989).

El tercer grupo de variantes son aquellas en las que al menos un residuo aminoacídico en la secuencia aminoacídica de gas6, y preferentemente sólo uno, se ha eliminado y en su lugar se ha insertado un residuo distinto. Los sitios de mayor interés para realizar dichas sustituciones se hallan en las regiones de la secuencia aminoacídica de gas6 que tengan la mayor homología con otros ligandos del receptor tirosina quinasa. Dichos sitios son probablemente importantes para la actividad funcional de gas6. Según ello, para retener la actividad funcional, aquellos sitios, y en especial los que se hallan dentro de una secuencia de por lo menos otros tres sitios conservados de forma idéntica, se sustituyen de manera relativamente conservadora. Dichas sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 bajo el título de "Sustitución preferida". Si dichas sustituciones no dan como resultado un cambio de la actividad funcional, entonces se pueden introducir cambios más importantes, denominados "Ejemplos de Sustituciones" en la Tabla 1, o como se describe más adelante en la referencia a las clases de aminoácidos, se puede introducir y analizar a continuación la actividad funcional de la variante de gas6 resultante.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

1

Para mejorar la estabilidad de gas6, pueden realizarse cambios insercionales, delecionales y de sustitución en la secuencia aminoacídica de gas6. Por ejemplo, los sitios de corte de la tripsina se identifican mediante inspección de la secuencia aminoacídica codificada por un residuo arginil o lisinil. Estos residuos se inactivan para la proteasa sustituyendo el residuo por otro, preferentemente por un residuo básico como la glutamina o un residuo hidrofóbico como la serina; delecionando el residuo; o insertando un residuo prolil inmediatamente después del residuo. También, puede sustituirse cualquier residuo cisteína no implicado en mantener la conformación propia de gas6 para su actividad funcional, generalmente con serina para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir el entrecruzamiento anómalo.

El DNA que codifica las variantes de secuencia aminoacídica de gas6 se prepara mediante diversos procedimientos conocidos en la materia. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, el aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia aminoacídica de gas6) o la preparación mediante mutagénesis dirigida (o mediada por oligonucleótidos), mutagénesis por PCR y mutagénesis por casette de un DNA preparado con anterioridad que codifica una forma variante o no de gas6.

La mutagénesis dirigida es uno de los procedimientos preferidos para preparar variantes de sustitución, deleción e inserción del DNA de gas6. Esta técnica es bien conocida en la materia (véase p.ej., Zoller y col., Meth. Enz. 100:4668-500 [1983]; Zoller y col., Meth. Enz. 154:329-350 [1987]; Carter, Meth. Enz. 154:382-403 [1987]; y Horwitz y col., Meth. Enz. 185:599-611 [1990]), y se ha utilizado, por ejemplo, para producir variantes de secuencia aminoacídica de la tripsina y la lisozima de T4 con las propiedades funcionales deseadas. Perry y col., Science 226:555-557 (1984); y Craik y col., Science 228:291-297 (1985).

En resumen, en la mutagénesis dirigida del DNA de gas6, se altera el DNA de gas6 hibridando en primer lugar un oligonucleótido que codifique la mutación deseada a una cadena sencilla de dicho DNA de gas6. Después de la hibridación, se utiliza una polimerasa de DNA para sintetizar una segunda cadena, utilizando el oligonucleótido hibridado como cebador y utilizando la cadena sencilla del DNA de gas6 como molde. En consecuencia, el oligonucleótido que codifica la mutación deseada se incorpora en el DNA de cadena doble resultante.

La mutagénesis por PCR también es adecuada para producir las variantes de secuencia aminoacídica de gas6. Véase Higuchi, en PCR Protocols, pp. 177-183 (Academic Press, 1990); y Vallette y col., Nuc. Acids. Res. 17:723-733 (1989). En resumen, cuando cantidades pequeñas del DNA molde se utilizan como material de partida en una PCR, pueden utilizarse cebadores que difieran ligeramente en la secuencia de la región correspondiente de un DNA molde para generar cantidades relativamente grandes de fragmentos de DNA específicos que difieran de la secuencia molde únicamente en aquellas posiciones en donde los cebadores diferían del molde.

Otro procedimiento para preparar variantes, la mutagénesis en cassette, se basa en la técnica descrita por Wells y col., Gene 34:315-323 (1985). El material de inicio es el plásmido (u otro vector) que comprenda el DNA de gas6 a mutar. Se identifica el codón (codones) en el DNA de gas6 a mutar. Es imprescindible que exista una diana de restricción única en cada lado del sitio(s) de mutación identificado. Si no existiera tal diana de restricción, puede generarse utilizando el procedimiento mediado por oligonucleótidos descritos anteriormente e introducir así las dianas en las localizaciones adecuadas en el DNA de gas6. El DNA plasmídico se corta por dichas dianas para su linearización. Se sintetiza un oligonucleótido de cadena sencilla que codifica la secuencia del DNA entre las dianas de restricción pero que contiene la mutación(es) deseada utilizando procedimientos estándares, en donde las dos cadenas del oligonucleótido se sintetizan separadamente y luego se hibridan juntas utilizando técnicas estándares. Este oligonucleótido de cadena doble es referido como el cassette. Este cassette se diseña para tener extremos 5' y 3' que sean compatibles con los extremos del plásmido linearizado, para que pueda ligarse directamente al plásmido. Este plásmido contiene ahora la secuencia de DNA de gas6 mutado.

Las modificaciones covalentes de las moléculas de gas6 también se incluyen dentro del ámbito de la presente invención. Por ejemplo, se introducen modificaciones covalentes en gas6 haciendo reaccionar los residuos aminoacídicos diana de gas6 con un agente modificador orgánico capaz de reaccionar con las cadenas laterales de los aminoácidos seleccionados o con los residuos N- o C-terminales.

Los residuos de cisteína se hacen reaccionar generalmente con los \alpha-haloacetatos (y aminas correspondientes), como el ácido cloroacético o la cloroacetamida, para producir derivados carboximetil o carboxiamidometil. Los residuos de cisteinil también se modifican haciéndolos reaccionar con bromotrifluoroacetona, ácido \alpha-bromo-\beta-(5-imidozoil) propiónico, cloracetil fosfato, N-alquilmaleimidas, 3-nitro-2-piridil disulfuro, metil-2-piridil disulfuro, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenceno-2-oxa-1,3-diazol.

Los residuos de histidil se modifican mediante la reacción con dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0 ya que dicho agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidil. El para-bromofenacil bromuro también es de utilidad; la reacción se realiza preferentemente en cacodilato sódico 0,1 M a pH 6,0.

Los residuos lisinil y amino-terminales reaccionan con succínico u otros anhidros de ácido carboxílico. La modificación con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos lisinil. Otros reactivos adecuados para modificar los residuos que contienen \alpha-amino incluyen los imidoésteres como el metil picolinimidato; el fosfato de piridoxal; el piridoxal; el clorobrohidruro; el ácido trinitrobencenosulfónico; la O-metilisourea; la 2,4-pentanediona, y la reacción catalizada por transaminasas con glioxilato.

Los residuos de arginil se modifican haciéndolos reaccionar con uno o varios reactivos convencionales, entre los que se hallan el fenilglioxal, la 2,3- butanediona, la 1,2-ciclohexanediona y la nihidrina. La modificación de residuos de arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al elevado pK, del grupo funcional de guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina así como también con el grupo épsilon-amino de la arginina.

La modificación específica de los residuos de tirosil puede realizarse, con un interés particular introduciendo marcajes espectrales en los residuos de tirosil al hacerlos reaccionar con compuestos de diazonio aromáticos o el tetranitrometano. Más comúnmente, se utiliza el N-acetilmidizol y el tetranitrometano para formar especies de O-acetil tirosil y derivados 3-nitro, respectivamente. Los residuos tirosil se yodinan utilizando I^{125} o I^{131} para preparar proteínas marcadas para su utilización en radioinmunoensayos, siendo adecuado el procedimiento de la cloramina T descrito anteriormente.

Los grupos carboxilo (aspartil o glutamil) se modifican selectivamente haciéndolos reaccionar con carbodiimidas (R'-N=C=N-R'), donde R y R' son distintos grupos alquilo, como la 1-ciclohexil-3(2-morfolinil-4-etil) carbodiimida o la 1-etil-3-(4-azonia-4,4dimetilpentil) carbodiimida. Además, los residuos aspartil y glutamil se convierten en residuos asparraguinil y glutamil mediante la reacción con iones amonio.

La modificación con agentes bifuncionales se utiliza para la unión de gas6 a una matriz soporte insoluble en agua o una superficie para utilización diagnóstica y/o terapéutica. Los agentes de unión utilizados comúnmente incluyen, p.ej., el 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, los ésteres con ácido 4-azido-salicílico, los imidoésters homobifuncionales, incluyendo los ésteres de disuccinimidil como los 3,3'-ditiobis (succinimidil-propionato) y las maleimidas bifuncionales como el bis-N-maleimido-1,8-octano. Los agentes modificadores como el metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato rinden intermediarios fotoactivables que son capaces de formar uniones en presencia de luz. Alternativamente, las matrices insolubles en agua reactivas como los carbohidratos activados con bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos descritos en la patente americana U.S. 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; y 4.330.440 se utilizan para la inmovilización de la proteína.

Los residuos glutaminil y asparraguinil se desamidan frecuentemente a los residuos glutamil y aspartil correspondientes. Alternativamente, estos residuos se desamidan en condiciones ligeramente acídicas. Cualquier forma de estos residuos se halla dentro del ámbito de la presente invención.

Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxil de residuos seril o treonil, la metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de la lisina, arginina e histidina, la acetilación de la amina N-terminal y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal. Creighton, Proteins; Structure and Molecular Properties, pp. 79-86 (W.H. Freeman & Co., 1983). Gas6 también está unido covalentemente a polímeros no proteicos, p.ej., el polietilén glicol, el polipropilén glicol o los polioxialquilenos, en la forma indicada en las patentes americanas U.S. 4.179.337; 4.301.144; 4.496.689; 4.640.835; 4.670.417; o 4.791.192.

El gas6 preferido es uno que "no sea inmunogénico en el hombre", lo que significa que tras contactar el polipéptido en un vehículo aceptable farmacéuticamente y en una cantidad efectiva terapéuticamente con el tejido adecuado de un humano, no se demuestra ningún estado de sensibilidad o resistencia al polipéptido después de la segunda administración del polipéptido tras un período de latencia adecuado (p.ej., 8 a 14 días).

Una variante de gas6 de la invención es una que esencialmente no esté "\gamma-carboxilada" o esté menos carboxilada que el gas6 "nativo" derivado de una fuente endógena para la molécula (p.ej., el suero), o el gas6 nativo producido por una célula recombinante en donde las condiciones para el cultivo de dichas células facilitan la \gamma-carboxilación de gas6 (p.ej., está presente la vitamina K en el medio de cultivo). La vitamina K es un cofactor para la enzima carboxilasa. El dominio A del gas6 nativo tiene diversos residuos de ácido glutámico que normalmente están \gamma-carboxilados (véase Manfioletti y col., supra). En consecuencia, las variantes de gas6 de la invención carecen de uno o más residuos E del dominio A de gas6 nativo (véase la Fig. 2), o carecen totalmente de este dominio. La magnitud de la \gamma-carboxilación puede cuantificarse mediante el análisis de secuencia aminoacídica o el ensayo del cloruro de bario descrito en el Ejemplo 11.

El término "antagonista de gas6" o "antagonista" hace referencia a una sustancia que se opone o interfiere con una actividad funcional de gas6. Ejemplos de antagonistas de gas6 incluyen anticuerpos de neutralización, Rse-IgG, el dominio extracelular de Rse (Rse ECD), Axl-IgG, Axl ECD, Mer-IgG y Mer ECD.

El término "anticuerpo" se utiliza en sentido amplio y abarca específicamente los anticuerpos monoclonales anti-gas6 (incluyendo los anticuerpos agonistas y antagonistas) y las composiciones de anticuerpo anti-gas6 con especificidad poliepitópica.

El término "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza aquí hace referencia a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos esencialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos con excepción de posibles mutaciones que ocurren de forma natural y que pueden estar presentes en pequeñas cantidades. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un sitio antigénico único. Además, al contrario que las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que incluyen típicamente los anticuerpos dirigidos contra determinantes distintos (epitopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un determinado único en el antígeno.

Los anticuerpos monoclonales incluyen los anticuerpos híbridos y recombinantes producidos por el ayuste de un dominio variable (incluyendo el hipervariable) de un anticuerpo anti-gas6 con un dominio constantes (p.ej., "anticuerpos humanizados"), o una cadena ligera con una cadena pesada, o una cadena de una especie con una cadena de otra especie, o las fusiones con proteínas heterólogas, independientemente de su origen o la designación de clase o subclase de inmunoglobulina, así como los fragmentos de anticuerpos (p.ej., Fab, F(ab')2 y Fv), siempre que presenten la actividad biológica deseada. (Véase, p.ej., la patente americana U.S. 4.816.567 y Mage & Lamoyi, en Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 79-97 (Marcel Dekker, Inc., New York [1987]).

En consecuencia, el modificador "monoclonal" indica que el anticuerpo se ha obtenido a partir de una población homogénea de anticuerpos y sin considerar que la producción del anticuerpo requiera ningún procedimiento en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar de acuerdo con la presente invención pueden generarse por el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler & Milstein, Nature, 256:495 (1975), o mediante procedimientos del DNA recombinantes (patente americana U.S., 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse a partir de librerías de fagos generadas utilizando, por ejemplo, las técnicas descritas por McCafferty y col., Nature 348:552-554 (1990).

Las formas "humanizadas" de los anticuerpos no-humanos (p.ej., murinos) son inmunoglobulinas quiméricas específicas, cadenas o fragmentos de inmunoglobulinas (como el Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de unión al antígeno de los anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no-humana. En la mayoría de los casos, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas (anticuerpo receptor) en los que los residuos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor se reemplazan por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) como el ratón, la rata o el conejo que tengan la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de entramado (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no-humanos correspondientes. Además, el anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se hallen ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada ni en las secuencias de la región de entramado. Estas modificaciones se realizan para ajustar y optimizar la realización del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá esencialmente al menos uno, y generalmente dos, dominios variables, en los que todas las regiones CDR corresponden con las de una inmunoglobulina no humana y todas o esencialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también incluirá de forma óptima al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), en general la de una inmunoglobulina humana.

El término "anticuerpo neutralizante" tal como se utiliza aquí hace referencia a un anticuerpo que es capaz de unirse específicamente a gas6, y que es capaz de inhibir o eliminar la actividad funcional de gas6 in vivo y/o in vitro. En general, un anticuerpo neutralizante inhibirá la actividad funcional de gas6 al menos en un 50% y preferentemente en más de un 80%, según se determine por ejemplo en un KIRA ELISA (véase el Ejemplo 4 de más adelan-
te).

Los anticuerpos policlonales dirigidos contra gas6 se producen generalmente en animales mediante inyecciones subcutáneas o intraperitoneales múltiples de gas6 y un adyuvante. Puede ser útil conjugar gas6 o un fragmento peptídico con una proteína transportadora que sea inmunogénica en las especies a inmunizar, como la hemocianina de la lapa, la albúmina sérica, la tiroglobulina bovina, o el inhibidor de tripsina de soja, utilizando un agente bifuncional o modificador, por ejemplo, el éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (conjugación por los residuos de lisina), el glutaraldehído, el anhídrido succínico, SOCl_{2}, o R'N=C=NR, si R y R' son grupos alquil distintos.

Los animales se inmunizan con dichos conjugados de la proteína transportadora de gas6 combinando 1 mg o 1 \mug del conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución intradérmicamente en sitios múltiples. Un mes más tarde, los animales se estimulan con 1/5-1/10 parte de la cantidad original del conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en sitios múltiples. De 7 a 14 días más tarde, los animales se sangran y el suero se analiza para titular el anticuerpo anti-gas6. Los animales se estimularon hasta alcanzar la meseta de titulación del anticuerpo. Preferentemente, el animal se estimula mediante inyección con un conjugado del mismo gs6 con una proteína transportadora distinta y/o a través de un agente de unión distinto. Los conjugados de gas6 y una proteína transportadora adecuada también pueden generarse mediante cultivo de células recombinantes como proteínas de fusión. También, se utilizan los agentes agregantes como el alumbre para aumentar la respuesta inmune.

Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el gas6 se producen utilizandocualquier procedimiento de producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Ejemplos de procedimientos adecuados para la preparación de anticuerpos monoclonales incluyen el procedimiento de hibridomas original de Kohler y col., Nature 256:495-497 (1975) y el procedimiento de hibridomas de células B, Kozbor, J. Immunol. 133:3001 81984), Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).

Son bien conocidos en la materia los procedimientos para la humanización de anticuerpos no humanos. En general, un anticuerpo humanizado tiene uno o más de un residuo aminoacídico introducido procedente de una fuente que no es humana. Estos residuos aminoacídicos a menudo son referidos como residuos de "importación" y comúnmente se importan de un dominio variable. La humanización puede realizarse según diversos procedimientos conocidos en la materia (Jones y col., Nature 321:552- 525 [1986]; Riechmann y col., Nature 332:323-327 [1987]; y Verhoeyen y col., Science 239:1534-1536 [1988]), sustituyendo las regiones determinantes de la complementariedad de roedores (CDRs) por las regiones correspondientes de un anticuerpo humano.

Alternativamente, es posible en la actualidad producir animales transgénicos (p.ej., ratones) que sean capaces, tras inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota del gen de la región de unión de cadena pesada del anticuerpo (JH) en ratones mutantes de línea germinal y quiméricos resulta en la inhibición completa de la producción de anticuerpo endógeno. La transferencia de una serie de genes de inmunoglobulina de línea germinal humana en dichos ratones mutantes de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos contra el antígeno. Véase, por ejemplo, Jakobovits yc ol., PNAS 90:2551-2555 (1993); Jakobovits y col., Nature 362:255-258 81993); y Bruggermann y col., Year in Immuno. 7:33 (1993). Los anticuerpos humanos pueden también producirse en librerías de expresión de fagos. Hoogenboorn y col., J. Mol. Biol. 227:381 (1991); y Marks y col., J. Mol. Biol. 222:581 (1991).

El término "inmunoadhesina" se utiliza de forma intercambiable con las expresiones de "quimeras de gas6-inmunoglobulina" ("gas6-Ig"), "quimera de Rse-inmunoglobulina" ("Rse-Ig") y "quimera de Mer-inmunoglobulina" ("Mer-Ig") y hace referencia a una molécula quimérica que combina una variante de gas6 activa funcionalmente (p.ej., el dominio D), Rse o Mer (p.ej., el ECDs) con una secuencia de inmunoglobulina. Preferentemente, aunque no necesariamente, la secuencia de inmunoglobulina es un dominio constante de inmunoglobulina. La porción de inmunoglobulina en las quimeras de la presente invención puede obtenerse de subtipos de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, IgA, IgE, IgD o IgM, pero preferentemente IgG1 o IgG3.

Las quimeras construidas a partir de una secuencia proteica (p.ej., ECD del receptor Rse o Mer) unida a una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina (inmunoadhesinas) son conocidas en la materia. Las inmunoadhesinas publicadas en la literatura incluyen las fusiones del receptor de células T (Gascoigne y col., PNAS (USA) 84:2936-2940 [1987]; CD4 (Capon y col., Nature 337:525-53d1 [1989]; Traunecker y col., Nature 339:68-70 [1989]; Zettmeissi y col., DNA Cell Biol. USA 9:347-353 [1990]; y Byrn y col., Nature 344:667-670 [1990]): L-selectina (Watson y col., J. Cell Biol. 110:2221-2229 [1990]; y Watson y col., Nature 349:164-167 [1991]); CD44 (Aruffo y col., Cell 61:1303-1313 [1990]); CD28 y B7 (Linsley y col., J. Exp. Med. 173.721-730 [1991]); CTLA-4 (Lisley cy col., J. Exp. Med. 174:561-569 [1991]); CD22 (Stamenkovic y col., Cell 66:1133-1144 [1991]); y el receptor de TNF (Ashknazi y col., PNAS (USA) 88:1035-10539 [1991]).

El diseño más simple y sencillo de inmunoadhesina combina la región(regiones) activa funcionalmente de la proteína "adhesina" con las regiones bisagra y FC de una cadena pesada de inmunoglobulina. En general, cuando se preparan las quimeras de gas6-, Mer-, o Rse-inmunoglobulina de la presente invención, el ácido nucleico que codifica el dominio extracelular del receptor Rse o Mer o el que codifica gas6 (o un fragmento de lo mismo) se fusionará por el extremo C-terminal con el ácido nucleico que codifica el extremo N-terminal de una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina, aunque también son posibles las fusiones N-terminales.

De forma característica, en dichas fusiones el polipéptido quimérico codificado retendrá al menos la bisagra activa funcionalmente y los dominios CH_{2} y CH_{3} de la región constante de cadena pesada de una inmunoglobulina. Las fusiones también se realizan en el extremo C-terminal de la porción Fc de un dominio constante, o inmediatamente con el extremo N-terminal del CH_{2} de la cadena pesada o la región correspondiente de cadena ligera.

En lugar preciso donde se realiza la fusión no es crítico; los sitios concretos son bien conocidos en la materia y pueden seleccionarse con el fin de optimizar la actividad biológica, la secreción, o las características de unión de las quimeras Rse-, Mer-, o gas6-inmunoglobulina.

Las quimeras de Rse-, Mer- o gas6-inmunoglobulina pueden ensamblarse como monómeros, hetero- u homo-multímeros, y en particular como dímeros o tetrámeros, esencialmente tal como se describe en la patente internacional WO 91/08298.

La secuencia de gas6 o la secuencia del dominio extracelular de secuencia del receptor Rse o Mer puede fusionarse con el extremo N-terminal del dominio de Fc de la inmunoglobulina G1 (IgG1). Es posible fusionar la región constante de la cadena pesada con la secuencia de gas6, o del receptor Mer o Rse. Sin embargo, se utiliza de forma preferente en la fusión una secuencia que se inicia en la región bisagra justo cadena arriba del sitio de corte de la papaína que define químicamente la Fc de IgG (es decir el residuo 216, considerando como primer residuo de la región constante de cadena pesada el 114), o los sitios análogos de otras inmunoglobulinas. La secuencia aminoacídica de gas6 o del receptor Mer o Rse puede fusionarse a: (a) la región bisagra y CH_{2} y CH_{3} o (b) el CH_{1}, la bisagra, los dominios CH_{2} y CH_{3}, de una cadena pesada de IgG1, IgG2 o IgG3. El sitio preciso por donde se realiza la fusión no es crítico, pudiéndose determinar el sitio óptimo mediante experimentación de rutina.

Las quimeras de Rse-, Mer- o gas6-inmunoglobulina pueden ensamblarse como multímeros, y en particular como homodímeros o tetrámeros. En general, estas inmunoglobulinas ensambladas tendrán estructuras de unidades conocidas. Una unidad estructural básica es la forma natural de la IgG, IgD e IgE. Una unidad de cuatro cadenas se repite en las inmunoglobulinas de mayor peso molecular; la IgM existe normalmente como un pentámero de cuatro unidades básicas que se mantienen juntas por puentes disulfuro. La globulina IgA y ocasionalmente la globulina IgG también pueden existir en la forma multimérica en el suero. En el caso de multímeros, cada una de las cuatro unidades puede ser idéntica o distinta.

Alternativamente, las secuencias de Rse, Mer o gas6 pueden insertarse entre las secuencias de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina, de modo que se obtiene una inmunoglobulina que comprende una cadena pesada quimérica. En esta realización, las secuencias Rse, Mer o gas6 se fusionan por el extremo 3' de una cadena pesada de inmunoglobulina en cada uno de los brazos de una inmunoglobulina, bien entre la bisagra y el dominio CH_{2}, o entre los dominios CH_{2} y CH_{3}. Se han publicado construcciones similares por Hoogenboom y col., Mol. Immunol. 28:1027-1037 (1991).

Aunque no es necesaria la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en las inmunoadhesinas de la presente invención, una cadena ligera de inmunoglobulina puede estar asociada de forma covalente a un polipéptido de fusión de Rse-, Mer- o gas6-inmunoglobulina de cadena pesada, o directamente fusionada con el receptor Mer o Rse o con gas6. En el primer caso, el DNA que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina se coexpresa normalmente con el DNA que codifica la proteína de fusión de Rse-, Mer- o gas6- cadena pesada de inmunoglobulina. Después de la secreción, el híbrido de cadena pesada y cadena ligera se asociará covalentemente para proporcionar una estructura similar a una inmunoglobulina que comprende dos pares de cadenas pesadas-cadenas ligeras de inmunoglobulina unidas por puentes disulfuros. Los procedimientos adecuados para la preparación de dichas estructuras son, por ejemplo, los descritos en la patente americana U.S. 4.816.567.

Las secuencias de inmunoglobulinas utilizadas en la construcción de las inmunoadhesinas de la presente invención pueden proceder de un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina IgG. Para las inmunoadhesinas, es preferible la utilización de secuencias de inmunoglobulina, IgG1 e IgG humana. Una gran ventaja de utilizar la IgG1 es que éstas inmunoadhesinas IgG1 pueden purificarse de forma eficaz para inmovilizar la proteína A. Por el contrario, la purificación de IgG3 requiere la proteína G, un medio mucho menos versátil. Sin embargo, deberían considerarse otras propiedades estructurales y funcionales de las inmunoglobulinas cuando se elige la pareja de fusión Ig para una construcción de inmunoadhesina determinada. Por ejemplo, la bisagra de IgG3 es más larga y más flexible, con lo que se pueden acomodar dominios de "adhesina" mayores que quizás no se plieguen o funcionen adecuadamente cuando estén fusionados con IgG1. Otra característica a considerar puede ser la valencia; las inmunoadhesinas de IgG son homodímeros bivalentes, mientras que los subtipos de Ig como la IgA y la IgM pueden producir estructuras diméricas o pentaméricas, respectivamente, de la unidad del homodímero de Ig básica. Para las inmunoadhesinas de Rse-, Mer- o gas6 diseñadas para la aplicación in vitro, las propiedades farmacocinéticas y las funciones especificadas por la región Fc son también importantes. Aunque la IgG1, IgG2 y la IgG4 tienen una vida media in vivo de 21 días, sus potencias relativas en la activación del sistema del complemento son distintas. La IgG4 no activa el complemento, y la IgG2 es significativamente más débil en la activación del complemento que la IgG1. Además, al contrario que la IgG1, la IgG2 no se une a los receptores Fc en las células mononucleares o neutrófilos. Mientras que la IgG3 es óptima para la activación del complemento, su vida media in vivo es aproximadamente un tercio de la de los otros isotipos de IgG. Otra consideración importante para las inmunoadhesinas diseñadas para ser utilizadas como terapéuticos humanos es el número de variantes alotípicas del isotipo en particular. En general, son preferibles los isotipos de IgG con menos alotipos definidos serológicamente. Por ejemplo, la IgG1 tiene sólo cuatro sitios alotípicos definidos serológicamente, dos de los cuales (G1m y 2) se localizan en la región Fc; y uno de estos sitios, G1m1, no es inmunogénico. Por el contrario, hay 12 alotipos definidos serológicamente en IgG3, todos ellos en la región Fc; sólo tres de estos sitios (G3m5, 11 y 2) tienen un solo alotipo que sea inmunogénico. En consecuencia, la inmunogenicidad potencial de una inmunoadhesina \gamma3 es mayor que la de una inmunoadhesina \gamma1.

Las inmunoadhesinas de gas6, Mer y Rse se construyen mejor fusionando las secuencias del cDNA que codifica la porción de gas6, Mer, o Rse en la misma pauta de lectura con una secuencia de cDNA de Ig. Sin embargo, la fusión con fragmentos genómicos puede también utilizarse (véase, p.ej., Gascoigne y col., supra; Aruffo y col., Cell 61:1303-1313 [1990]; y Stamenkovic y col., Cell 66:1133-1144 [1991]). El último tipo de fusión requiere la presencia de secuencias reguladoras de Ig para la expresión. Los cDNAs que codifican las regiones constantes de cadena pesada de IgG pueden obtenerse a partir de secuencias publicadas de librerías de cDNA derivadas del bazo o de linfocitos de sangre periférica, mediante hibridación o mediante técnicas de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los cDNAs que codifican la "adhesina" y las porciones de Ig de la inmunoadhesina se insertan en tándem en un vector plasmídico que dirija la expresión eficiente en las células huésped elegidas. Para la expresión en células de mamífero, son útiles los vectores basados en pRK5 (Schall y col., Cell 61:361-370 [1990]) y los vectores basados en CDM8 (véase, Nature 329.840 [1989]). Puede lograrse una unión exacta puede eliminando las secuencias extra entre los codones de unión diseñados mediante mutagénesis delecional dirigida por oligonucleótidos (Zoller y Smith, Nucleic Acids Res. 10:6487 [1982]; y Capon y col., Nature 337:525-531 [1989]). Pueden utilizarse oligonucleótidos sintéticos, en los que cada una de sus mitades es complementaria con la secuencia de la cadena complementaria de unión deseada; idealmente, son de 36 a 48-mers. Alternativamente, las técnicas de PCR pueden utilizarse para unir las dos partes de la molécula en la misma pauta de lectura con un vector adecuado.

La elección de la línea celular huésped para la expresión de la inmunoadhesina depende principalmente del vector de expresión. Otro factor a considerar es la cantidad de proteína que se necesita. A menudo, es posible obtener cantidades del orden de miligramos mediante transfecciones transitorias. Por ejemplo, la línea de riñón embrional humano 293 transformada con adenovirus EIA puede transfectarse transitoriamente con vectores derivados de pRK5 mediante una modificación del procedimiento del fosfato cálcico para permitir la expresión eficiente de inmunoadhesinas. Los vectores derivados de CDM8 pueden utilizarse para transfectar células COS mediante el procedimiento de DEA-dextrano (Aruffo y col., Cell 61:1303-1313 [1990]; y Zetmeiss y col., DNA Cell Biol. (US) 9:347-353 [1990]). Si se desea obtener grandes cantidades de proteína, la inmunoadhesina puede expresarse mediante transfección estable de una línea celular huésped. Por ejemplo, un vector derivado de pRK5 puede introducirse en las células de ovario de hámster chino (CHO) en presencia de un plásmido adicional que codifique la dihidrofolato reductasa (DHFR) y confiera resistencia a G418. A continuación, se seleccionan los clones resistentes a G418 en cultivo. Estos clones crecen en presencia de niveles crecientes de metrotexato, inhibidor de DHFR, y de este modo se seleccionan aquellos en los que se ha co-amplificado un número de copias de genes que codifican DHFR y las secuencias de inmunoadhesinas. Si la inmunoadhesina contiene una secuencia líder hidrofóbica en su extremo N-terminal, probablemente se procesará y secretará por las células transfectadas. La expresión de las inmunoadhesinas con estructuras más complejas puede necesitar únicamente células huésped adecuadas. Por ejemplo, los componentes como la cadena ligera o la cadena J pueden proporcionarse por ciertas células huésped de mieloma o hibridoma (Gascoigne y col., supra; y Martin y col., J. Virol. 67:3561-3568 [1993]).

Las inmunoadhesinas pueden purificarse de forma adecuada mediante cromatografía de afinidad. La idoneidad de la proteína A como un ligando de afinidad depende de las especies e isotipos del domino Fc de inmunoglobulina que se utilice en la quimera. La proteína A puede utilizarse para purificar las inmunoadhesinas que se basan en las cadenas pesadas \gamma1, \gamma2, \gamma3, o \gamma4 humanas (Lindmark y col., J. Immunol. Meth. 62:1-13 [1983]). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para la forma \gamma3 (Guss yc ol., EMBO J. 5:1567-1575 [1986]). La matriz a la cual se une el ligando es generalmente la agarosa, aunque existen otras matrices igualmente disponibles. Las matrices estables mecánicamente como las de vidrio de poro controlado o las de poli(estirenodivinil)benceno permiten velocidades de flujo mayores y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con la agarosa. Las condiciones para la unión de una inmunoadhesina a la proteína A o a la columna de afinidad G están dictadas completamente por las características del dominio Fc; es decir, su especie e isotipo. En general, cuando se elige el ligando adecuado, se produce una unión eficiente directamente del fluido de cultivo no condicionado. Una característica diferenciadora de las inmunoadhesinas es que, para las moléculas \gamma1, la capacidad de unión para la proteína A disminuye algo en comparación con un anticuerpo del mismo tipo Fc. La inmunoadhesina unida puede eluirse de forma eficiente a pH acídico (a o por encima de 3,0), o en un tampón neutro que contenga una sal medianamente caotrópica. Esta etapa de cromatografía de afinidad puede dar como resultado una preparación de inmunoadhesinas que sea >95% pura.

La expresión "dominio extracelular de Rse" o "ECD de Rse" cuando se utiliza aquí hace referencia a una secuencia polipeptídica que comparte una función de unión de ligando del dominio extracelular del receptor Rse. La "función de unión al ligando" hace referencia a la capacidad del polipéptido de unirse al ligando de Rse, como por ejemplo gas6. Según ello, no es necesario incluir el dominio extracelular completo ya que fragmentos más pequeños son adecuados generalmente para la unión al ligando. El término ECD abarca las secuencias polipeptídicas en las que se ha delecionado la secuencia del dominio citoplasmático y del dominio transmembrana hidrofóbico (y opcionalmente, 1-20 aminoácidos amino-terminales al dominio transmembrana) del receptor Rse. En general, El ECD del receptor Rse comprende los residuos aminoacídicos desde el 1-428 de la secuencia del receptor Rse maduro descrita por Mark y col., supra.

La expresión "dominio extracelular Mer" o "ECD de Mer" cuando se utiliza aquí hace referencia a una secuencia polipeptídica que comparte una función de unión al ligando del dominio extracelular del receptor Mer. La "función de unión al ligando" hace referencia a la capacidad del polipéptido para unirse a un ligando de Mer, como el gas6. Según ello, no es necesario incluir el dominio extracelular completo ya que generalmente son adecuados fragmentos más pequeños para la unión al ligando. El término ECD abarca las secuencias polipeptídicas en las que se han delecionado la secuencia del dominio citoplasmático y del dominio transmembrana hidrofóbico (y opcionalmente, 1-20 aminoácidos amino-terminales al dominio transmembrana) del receptor Mer. En general, El ECD del receptor Mer comprende los residuos aminoacídicos desde el 1-499 de la secuencia del receptor Rse maduro descrita en la base de datos de GenBank (número de acceso U08023).

El término "etiquetado con un epítopo", cuando se utiliza aquí, hace referencia a un polipéptido quimérico que comprende el gas6 activo funcionalmente fusionado con un "polipéptido etiqueta". El polipéptido etiqueta tiene suficientes residuos para proporcionar un epitopo contra el que pueda prepararse un anticuerpo, y es suficientemente corto para no interferir con la actividad funcional de gas6. Preferentemente, el polipéptido gas6 también será lo bastante único para que el anticuerpo contra éste no reaccione de forma cruzada con otros epitopos. En general, polipéptidos etiqueta adecuados tienen al menos 6 residuos aminoacídicos y en general entre 8-50 residuos aminoacídicos (preferentemente entre 9-30 residuos). La etiqueta epitópica se proporciona generalmente en el extremo amino- o carboxi-terminal de gas6. Dichas formas etiquetadas epitópicamente son las preferidas, ya que su presencia puede detectarse utilizando un anticuerpo marcado contra el polipéptido etiqueta. También, la presencia de una etiqueta epitópica facilita que gas6 se purifique fácilmente mediante purificación por afinidad utilizando un anticuerpo anti-etiqueta.

Los polipéptidos etiqueta y sus respectivos anticuerpos son bien conocidos en la materia. Ejemplos incluyen el polipéptido etiqueta HA del virus de la gripe y su anticuerpo 12AC5 (Field y col., Mol.Cell. Biol. 8:2159-2165 [1988]); la etiqueta c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 (Evan y col., Molecular and Cellular Biology 5(12):3610-3616 [1985]); y la etiqueta de glicoproteína D (gD) del virus Herpes Simplex y su anticuerpo (Paborsky y col., Protein Engineering 3(6):547-553 [1990]). Se han descrito otros polipéptidos etiqueta, cuyos ejemplos incluyen el péptido-Flag (Hopp y col., BioTechnology 6:1204-1210 [1988]); un péptido epitópico KT3 (Martin y col., Science 255:192-194 [1993]); y el péptido epitópico de la \alpha-tubulina (Skinner y col., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 [1991]); y la etiqueta peptídica de la proteína 10 del gen T7 (Lutz-Freyermuth y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6393-6397 [1990]). Una vez el polipéptido etiqueta se ha seleccionado, se puede generar un anticuerpo utilizando las técnicas descritas aquí.

Las fusiones polipeptídicas de la etiqueta-Gas6 se construyen de manera más adecuada fusionando la secuencia del cDNA que codifica la porción de gas6 en la misma pauta de lectura que la secuencia de DNA del polipéptido etiqueta y expresando la construcción de fusión del DNA resultante en las células huésped adecuadas. Generalmente, cuando se preparan las quimeras del polipéptido etiqueta- gas6 de la presente invención, el ácido nucleico que codifica gas6 (o un fragmento de éste) se fusionará por su extremo 3' con el ácido nucleico que codifica el extremo N-terminal del polipéptido etiqueta, aunque también son posibles las fusiones en 5'.

El gas6 etiquetado con un epitopo puede purificarse por cromatografía de afinidad utilizando un anticuerpo anti-etiqueta. La matriz a la cual se une el anticuerpo de afinidad es generalmente agarosa, pero están disponibles otras matrices (p.ej., vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno). El gas6 etiquetado con un epitopo puede eluirse de una columna de afinidad, por ejemplo variando el pH del tampón o la fuerza iónica o añadiendo agentes caotrópicos.

Un compuesto "exógeno", tal como se define aquí, hace referencia a un compuesto foráneo a una célula y/o un mamífero a tratar con dicho compuesto, u homólogo a un compuesto que se halle en la célula o mamífero pero que se produce fuera de la célula o del mamífero.

El término "aislado", cuando se utiliza para describir las diversas proteínas descritas aquí, hace referencia a la proteína que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir con la utilización diagnóstica o terapéutica de la proteína, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, la proteína se purificará (1) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia aminoacídica N-terminal o de la secuencia interna utilizando un secuenciador spinning cup, o (2) a homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones no-reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o preferentemente, tinción de plata.

El término "esencialmente puro" hace referencia a una composición que comprende al menos el 90% en peso de la proteína, según el peso total de la composición, y preferentemente al menos el 95% en peso. Proteína "esencialmente homogénea" significa una composición que comprende al menos el 99% en peso de la proteína, según el peso total de la composición.

Se han descrito "receptores Rse" de mamífero o "receptores Rse protein tirosin quinasa" (es decir, "rPTKs") por Mark y col., J. Biol. Chem., 269:10720 (1994). Cuando en esta solicitud se utiliza la expresión "receptor Rse" se refiere al receptor Rse endógeno presente en una célula de interés, así como al receptor Rse presente en una célula que ha sido transformada con ácido nucleico que codifica el receptor Rse. De esta manera, el receptor Rse puede ser una variante aminoacídica o covalente de uno de los receptores Rse nativos descritos por Mark y col., siempre que sea "activo funcionalmente" (es decir, capaz de activarse por un ligando Rse como gas6). El receptor Rse preferido es el receptor Rse humano endógeno presente en la membrana celular de una célula humana.

El término "activación del receptor Rse" hace referencia a la etapa causante de que el dominio quinasa intracelular del receptor Rse fosforile los residuos tirosina en un polipéptido sustrato. A menudo, los residuos de tirosina son intrínsecos al receptor Rse (es decir, "el sustrato" comprende el dominio intracelular del receptor Rse). En consecuencia, el grado de activación se correlaciona con la "autofosforilación" del receptor Rse. La autofosforilación del receptor Rse puede detectarse mediante transferencia de Western utilizando un anticuerpo anti-fosfotirosina (véase el Ejemplo 3) o mediante KIRA ELISA (véase el Ejemplo 4). Sin embargo, la activación del receptor Rse puede correlacionarse con la fosforilación de un sustrato distinto al del receptor Rse (p.ej., una tirosina quinasa adyacente al receptor Rse). Esto puede detectarse cuantificando la fosforilación de tirosina de un sustrato (p.ej., la transferencia de Western).

Se han descrito "receptores Mer" de mamífero por Graham y col., Cell Growth Differ. 5:647 81994) (véase el número de acceso del GenBank U08023 para la secuencia correcta de Mer humana) y Graham y col., Oncogene 10(12):2349-2359 (1995). La expresión "receptor Mer", tal como se utiliza en la presente solicitud, hace referencia al receptor Mer endógeno presente en una célula de interés, así como al receptor Mer que está presente en una célula que ha sido transformada con un ácido nucleico que codifica el receptor Mer. El receptor Mer preferido es el receptor Mer humano presente en una célula humana.

El término "activación del receptor Mer" hace referencia a la etapa causante de que el dominio quinasa intracelular del receptor Mer fosforile los residuos tirosina en un polipéptido sustrato. A menudo, los residuos de tirosina son intrínsecos al receptor Mer (es decir, "el sustrato" comprende el dominio intracelular del receptor Mer). En consecuencia, el grado de activación se correlaciona con la "autofosforilación" del receptor Mer. La autofosforilación del receptor Mer puede detectarse mediante transferencia de Western utilizando un anticuerpo anti-fosfotirosina o mediante KIRA ELISA (véase el Ejemplo 4). Sin embargo, la activación del receptor Mer puede correlacionarse con la fosforilación de un sustrato distinto al del receptor Mer (p.ej., una tirosina quinasa adyacente al receptor Mer). Esto puede detectarse cuantificando la fosforilación de la tirosina del sustrato (p.ej., mediante transferencia de Western).

El término "aumento de la supervivencia celular" hace referencia al hecho de aumentar el período de existencia de una célula en relación con una célula no tratada que no ha sido expuesta a gas6, bien in vivo como in vitro.

El término "aumento de la proliferación celular" abarca la etapa de aumento del crecimiento y/o reproducción de la célula, respecto a una célula no tratada, in vivo o in vitro. Un aumento de la proliferación celular en un cultivo de células puede detectarse contando el número de células antes y después de la exposición a gas6 (véase el Ejemplo 9). La magnitud de la proliferación puede cuantificarse examinando al microscopio el grado de confluencia. La proliferación celular también puede cuantificarse midiendo la incorporación de H^{3} por las células.

Por "aumento de la diferenciación de una célula" se hace referencia al hecho de aumentar la magnitud de la adquisición o posesión de una o más características o funciones distintas a las de la célula original (es decir, la especialización celular). Ello se puede detectar mediante el rastreo de un cambio en el fenotipo de la célula (p.ej., identificando cambios morfológicos en la célula, véase el Ejemplo 9 de más adelante).

Los vehículos, excipientes o estabilizantes "aceptables fisiológicamente" son aquellos compuestos no tóxicos para la célula o mamífero a ser expuesto a las dosificaciones y concentraciones utilizadas. Un vehículo aceptable fisiológicamente es una solución acuosa a pH tamponada. Ejemplos de vehículos aceptables fisiológicamente incluyen los tampones como el fosfato, el citrato y otros ácidos orgánicos; los antioxidantes incluyen el ácido ascórbico; los polipéptidos de bajo peso molecular (menos de 10 residuos); las proteínas, como la albúmina sérica, la gelatina, o las inmunoglobulinas; los polímeros hidrofílicos como la polivinilpirrolidona; los aminoácidos como la glicina, la asparraguina, la arginina o la lisina; los monosacáridos, los disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo la glucosa, la manosa, o las dextrinas; los agentes quelantes como el EDTA; los alcoholes de azúcar como el manitol o el sorbitol; las parejas de iones formadoras de sales como el sodio; y/o los tensoactivos no iónicos como el Tween, el Pluronics o el polietilén glicol (PEG).

Los términos "tratamiento" y "terapia" hacen referencia a la terapia curativa, la terapia profiláctica y a la terapia preventiva.

El término "mamífero" hace referencia a cualquier mamífero clasificado como mamífero, incluyendo los humanos, cerdos, caballos, perros y gatos. En una realización preferida de la invención, el mamífero es un humano.

La expresión "secuencias control" hace referencia a secuencias de DNA necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen el promotor, opcionalmente una secuencia operadora, un sitio de unión a ribosomas y posiblemente, otras secuencias todavía poco conocidas. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y secuencias de intensificación de la transcripción o intensificadores.

El ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se halla en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el DNA de una presecuencia o líder secretor está unido operativamente al DNA para un polipéptido que se exprese como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas está unido operativamente a una secuencia codificante si está colocado para facilitar la traducción. En general, "unido operativamente" quiere decir que las secuencias de DNA que se unen son contiguas y; en el caso de un líder secretor, contiguas y en la misma pauta de lectura. Sin embargo, los intensificadores no tienen porque ser contiguos. La unión se logra mediante ligación en las dianas de restricción adecuadas. Si dichas dianas no existen, se utilizan adaptadores o engarces oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

2. Producción de Gas6

Las técnicas adecuadas para la producción de gas6 nativo o de variantes de gas6 son bien conocidas en la materia e incluyen el aislamiento de gas6 a partir de una fuente endógena de este polipéptido (p.ej., a partir del suero), la síntesis del péptido (utilizando un sintetizador peptídico) y técnicas recombinantes (o cualquier combinación de estas técnicas). La técnica preferida para la producción de gas6 nativo o de una variante de gas6 es una técnica recombinante. Las variantes de gas6 de la presente invención están esencialmente no \gamma-carboxiladas. Ello implica la creación de una molécula que carezca de uno o más residuos de ácido glutámico en el dominio A de gas6 nativo que normalmente están \gamma-carboxilados. Opcionalmente, el dominio A completo puede eliminarse de la molécula nativa mediante corte enzimático, pero en general se aislará una molécula de ácido nucleico que codifique el fragmento deseado (p.ej., el dominio D o un dominio G). Esta molécula de ácido nucleico puede derivarse del ácido nucleico de gas6 nativo.

El ácido nucleico que codifica gas6 puede aislarse a partir de una librería de cDNA preparada a partir de tejido que supuestamente contiene el mRNA del polipéptido y lo expresa a un nivel detectable (p.ej., tejido cerebral, véase el Ejemplo 6 de más adelante). Las librerías se rastrean con sondas (como anticuerpos u oligonucleótidos de aproximadamente 20-80 bases) diseñadas para identificar el gen gas6 o su proteína codificada. El rastreo de librerías de cDNA o genómicas con la sonda seleccionada puede realizarse utilizando procedimientos estándares, tal como se describe en los capítulos 10-12 de Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Las técnicas para la generación de variantes de gas6 mediante la modificación del ácido nucleico de tipo salvaje se han discutido anteriormente. El ácido nucleico (p.ej., cDNA o DNA genómico) que codifica la variante de gas6 se inserta en un vector replicable para su posterior clonaje (amplificación del DNA) o para su expresión. Existen muchos vectores disponibles, cuyos componentes incluyen en general, pero sin limitarse a ellos, uno o más de uno de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento intensificador, un promotor y una secuencia de finalización de la transcripción.

La variante de gas6 puede producirse como un polipéptido de fusión con una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de corte específico en el extremo N-terminal de la proteína madura o polipéptido. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del DNA que se inserta en el vector. La secuencia señal heteróloga seleccionada es preferentemente uno que se reconoce y procesa (es decir, se corta por una peptidasa señal) por la célula huésped. Para las células procariotas, la secuencia señal puede sustituirse por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, a partir del grupo de la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, lpp, o los líderes de la enterotoxina II termo-estable. Para la secreción en levaduras, las secuencia señales nativas pueden sustituirse por ejemplo, por el líder de la invertasa de levaduras, el líder de factor alfa (incluyendo los líderes del factor-\alpha de Saccharomyces y Kluyveromyces, este último se describe en la patente americana U.S. 5.010.182, publicada el 23 de abril de 1991), o el líder de la fosfatasa ácida, el líder de la glucoamilasa de C. albicans (patente europea EP 362.179, publicada el 4 de abril de 1990), o la secuencia señal descrita en la patente internacional WO 90/1346, publicada el 15 de noviembre de 1990. En la expresión en células de mamífero, es suficiente la secuencia señal de gas6 nativa, aunque pueden resultar adecuadas otras secuencias señal de mamíferos, así como líderes secretores virales, por ejemplo, la secuencia señal gD del herpes simplex. El DNA para dicha región precursora se liga en la misma pauta de lectura que el DNA que codifica el gas6 nativo/gas6 variante.

Tanto los vectores de expresión como los de clonaje contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. En general, en los vectores de clonaje esta secuencia ha de permitir que el vector se replique de forma independiente al DNA cromosómico del huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónoma. Dichas secuencias son bien conocidas para una gran variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2 \mu es adecuado para levaduras y diversos orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para el clonaje de vectores en células de mamífero. En general, el componente del origen de replicación no es necesario para los vectores de expresión en mamíferos (el origen de SV40 puede ser de forma característica utilizado únicamente porque contiene el promotor temprano).

Los vectores de expresión y clonaje deberían contener un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, p.ej., ampicilina, neomicina, metrotexato, o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suplementan nutrientes críticos no disponibles a partir del medio complejo, p.ej., el gen que codifica la racemasa D-alanina para Bacilli. Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para parar el crecimiento de una célula huésped. Las células que se transforman satisfactoriamente con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia al fármaco y en consecuencia sobreviven al régimen de selección. Ejemplos de dichas selección dominante utilizan fármacos como la neomicina (Southern y col., J. Molec. Appl. Genet. 1:327 [1982]), el ácido micofenólico (Mulligan y col., Science 209:1422 [1980]) o la higromicina (Sugden y col., Mol. Cell. Biol. 5:410-413 [1985]). Los tres ejemplos anteriores utilizan genes bacterianos bajo el control eucariótico para proporcionar resistencia al fármaco adecuado G418 o neomicina (geneticin), xpgt (ácido micofenólico), o higromicina, respectivamente.

Otro ejemplo de marcadores adecuados para las células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para incorporar el ácido nucleico de la variante de gas6, como el DHFR o la timidina quinasa. Los transformantes de células de mamífero se someten a una presión de selección de modo que únicamente los transformantes adaptados sobreviven al haber incorporado el marcador. La presión de selección se impone cultivando los transformantes en condiciones en las que se cambia sucesivamente la concentración del agente de selección en el medio, conduciendo a la amplificación del gen de selección y del DNA que codifica la variante de gas6. De este modo se sintetizan a partir del DNA amplificado cantidades crecientes de gas6. Otros ejemplos de genes de amplificación incluyen la metalotioneina-I y -II, preferentemente genes de metalotioneínas de primate, la adenosina desaminasa, la ornitina descarboxilasa, etc.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican en primer lugar cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contenga metrotexato (Mtx), un antagonista competitivo del DHFR. Cuando se utiliza el DHFR de tipo salvaje, una célula huésped adecuada es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada tal como se describe por Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980). Las células transformadas se exponen a continuación a niveles crecientes de metotrexato. Esto conduce a la síntesis de copias múltiples del gen DHFR, y, en consecuencia, múltiples copias del otro DNA comprendido en los vectores de expresión, como el DNA que codifica la variante de gas6. Esta técnica de amplificación puede utilizarse con cualquier huésped adecuado, p.ej., ATCC nº CCL61 CHO-K1, a pesar de la presencia del DHFR endógeno si, por ejemplo, se utilizara un gen DHFR mutante que sea altamente resistente a Mtx (patente europea EP 117.060).

Alternativamente, las células huésped (en particular los huéspedes de tipo salvaje que contengan el DHFR endógeno) transformado o co-transformado con las secuencias de DNA que codifican la variante de gas6, la proteína DHFR de tipo salvaje, y otro marcador seleccionable como la aminoglicósido 3'-fosfotransferasa (APH) puede seleccionarse mediante crecimiento celular en un medio que contenga un agente de selección para el marcador de selección como el antibiótico aminoglicósido, p.ej., la kanamicina, la neomicina, o el G418. Ver la patente americana, U.S. 4.965.199.

Un gen de selección adecuado para utilizar con levaduras es el gen trp1 en el plásmido YRp7 (Stinchcomb y col., Nature 282:39 [1979]; o Tschemper y col., Gene 10:517 [1980]). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levaduras carente de la capacidad para crecer con triptófano, por ejemplo, ATCC Nº 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics 85:12 [1977]). La presencia de la lesión trp en el genoma de la célula huésped de levadura proporciona un entorno eficaz para la detección de la transformación al crecerlas en ausencia de triptófano. De modo similar, las cepas de levadura deficientes Leu2 (ATCC 20.622 ó 38.626) se complementan con plásmidos conocidos que portan el gen Leu2.

Además, los vectores derivados del plásmido circular 1,6 \mum pKDI pueden utilizarse para la transformación de levaduras Kluyveromyces. Bianchi y col., Curr. Genet. 12:185 (1987). Más recientemente, un sistema de expresión para la producción a gran escala de la quimosina vacuna recombinante se publicó por K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology 8:135 (1990). Los vectores multicopias de expresión estable para la secreción de la albúmina sérica humana recombinante madura mediante cepas industriales de Kluyveromyces también se describen en Fleer y col., Bio/Technology 9:968-975 (1991).

Los vectores de expresión y clonaje contienen generalmente un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está unido operativamente al ácido nucleico de gas6. Se conoce un gran número de promotores para diversas células huéspedes potenciales. Estos promotores están unidos operativamente al DNA que codifica la variante de gas6 al eliminar el promotor de la fuente de DNA mediante digestión con enzimas de restricción e inserción de la secuencia del promotor aislada en el vector.

Los promotores adecuados para utilizar con los huéspedes eucariotas incluyen los sistemas de la \beta-lactamasa y el promotor de la lactosa (Chang y col., Nature 275:615 [1978]; y Goeddel y col., Nature 281:544 [1979]), la fosfatasa alcalina, un sistema de promotor del triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 [1980] y la patente europea EP 36.776) y los promotores híbridos como el promotor tac (deBoer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 [1983]). Sin embargo, son también adecuados otros promotores bacterianos conocidos, cuyas secuencias nucleotídicas están publicadas, lo que permite a un experto en la materia su ligación con el DNA que codifica gas6 (Siebenlist y col., Cell 20:269 [1980]) utilizando engarces o adaptadores para facilitar cualquier diana de restricción necesaria. Los promotores para utilizar en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al DNA que codifica gas6.

Se conocen las secuencias promotoras para eucariotas. En general, todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT localizada aproximadamente a 25-30 bases cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción. Otra secuencia que se halla a 70-80 bases cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción de muchos genes es una región CXCAAT en donde X puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de muchos genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que puede ser la secuencia señal para la adición de la cola poli A en el extremo 3' de la secuencia codificante. Todas las secuencias se insertan de forma adecuada en vectores de expresión eucariotas.

Ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para utilizar con huéspedes de levaduras incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y col., J. Biol. Chem. 255:2073 [1980]) u otras enzimas glicolíticas (Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149 [1968]; y Holland, Biochemistry 17:4900 [1978]), como la enolasa, la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, la hexoquinasa, la piruvato descarboxilasa, la fosfofructosa, la glucosa-6-fosfato isomerasa, la 3-fosfoglicerato mutasa, la piruvato quinasa, la triosafosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa y la glucoquinasa.

Otros promotores de levaduras, que son inducibles presentan la ventaja adicional de poder controlar la transcripción dependiendo de las condiciones de cultivo, son las regiones promotoras de la alcohol deshidrogenasa 2, la isocitocromo C, la fosfatasa ácida, las enzimas de degradación asociadas con el metabolismo del nitrógeno, la metalotioneína, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y las enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para utilizar en la expresión con levaduras se describen además en Hitzeman y col., patente europea EP 73.657A. Los intensificadores de levadura también se utilizan ventajosamente con los promotores de levaduras.

La transcripción de la variante de gas6 a partir de vectores en células huésped de mamífero se controla, por ejemplo, por promotores obtenidos de genomas de virus como el polioma, el virus de la viruela aviar (patente inglesa U.K. 2.211.504, publicada el5 de julio de 1989), el adenovirus (como el Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y más preferentemente el Simian Virus 40 (SV40), por promotores heterólogos de mamífero, p.ej., el promotor de la actina o un promotor de inmunoglobulina o promotores de proteínas de choque térmico.

Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen de forma adecuada como un fragmento de restricción que también contiene el origen de replicación viral de SV40. Fiers y col., Nature 273:113 (1979); Mulligan y Berg, Science 209:1422-1427 (1980); Pavlakis y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:7398-7402 (1981). El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene como un fragmento de restricción HindIII. Greenaway y col., Gene 18:355-360 (1982). Un sistema para expresar el DNA en huéspedes de mamífero utilizando el virus del papiloma bovino como un vector se describe en la patente americana U.S. 4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en la patente americana U.S. 4.601.978. Véase también Gray y col., Nature 295:503-508 (1982) sobre la expresión del cDNA que codifica el interferón inmune en células de mono; Reyes y col., Nature 297:598-601 (1982) sobre la expresión del cDNA del interferón-\beta humano en células de ratón bajo el control un promotor de timidina quinasa del virus herpes simplex; Canaani y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5166-5170 (1982) sobre la expresión del gen del interferón \beta1 humano en células cultivadas de ratón y conejo; y Gorman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777-6781 (1982) sobre la expresión de secuencias CAT bacterianas en células de riñón de mono CV-1, fibroblastos de embrión de pollo, células de ovario de hámster chino, células HeLa y células NIH-3T3 utilizando la repetición larga del virus del sarcoma de Rous como un promotor.

La transcripción del DNA que codifica la variante de gas6 por los eucariotas superiores a menudo se incrementa insertando una secuencia intensificadora en el vector. Los intensificadores son relativamente independientes de la orientación y posición, habiéndose hallado tanto en 5' (Laimins y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:993 [1981]) y 3' (Lusky y col., Mol. Cell. Biol. 3:1108 [1983]) de la unidad de transcripción, dentro de un intrón (Banerji y col., Cell 33:729 [1983]), así como también dentro de la propia secuencia codificante (Osborne y col., Mol. Cell Biol., 4:1293 [1984]). En la actualidad se conocen muchas secuencias intensificadoras de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Aunque en general se utilizará un intensificador de un virus de célula eucariota. Como ejemplos se incluye el intensificador de SV40 en la región tardía del origen de replicación (pb 100-270), el intensificador del promotor temprano del citomegalovirus, el intensificador del polioma en la región tardía del origen de replicación y los intensificadores de adenovirus. Véase también, Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) sobre elementos intensificadores para la activación de promotores eucariotas. El intensificador puede ayustarse en el vector en una posición 5' o 3' de la secuencia codificante de gas6, pero se localiza preferentemente en 5' del promotor.

Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanos, o células nucleadas de organismos multicelulares) contendrán también las secuencias necesarias para la finalización de la transcripción y la estabilización del mRNA. Dichas secuencias están disponibles comercialmente a partir de las regiones no traducidas del extremo 5' y, ocasionalmente del 3' de DNAs o cDNAs eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del mRNA que codifica la variante de gas6.

La construcción de vectores adecuados que contengan uno o más componentes de los enumerados anteriormente utiliza técnicas de ligación estándares. Los plásmidos aislados o los fragmentos de DNA se cortan, se convierten sus extremos en romos y se religan en la forma deseada para generar los plásmidos necesarios.

En el análisis de verificación de las secuencias de los plásmidos construidos, las mezclas de ligación se utilizan para transformar la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC 31.446) y se seleccionan los transformantes satisfactorios por su resistencia a ampicilina o tetraciclina, según convenga. Los plásmidos de los transformantes se preparan, se analizan mediante digestión con endonucleasas de restricción y/o se secuencian por el método de Messing y col., Nucleic Acids Res., 9:309 (1981) o por el método de Maxam y col., Methods in Enzymology 65:499 (1980).

De especial interés en la práctica de esta invención son los vectores de expresión que proporcionan una expresión transitoria en células de mamífero del DNA que codifica las variantes de gas6. En general, la expresión transitoria implica la utilización de un vector de expresión que sea capaz de replicarse eficientemente en una célula huésped, de modo que la célula huésped acumule muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetice niveles elevados de un polipéptido codificado por el vector de expresión. Sambrook y col., supra, pp. 16.17-16.22. Los sistemas de expresión transitoria, que comprenden un vector de expresión adecuado y una célula huésped, permiten la identificación positiva de los polipéptidos codificados por los cDNAs clonados, así como el cribaje rápido de las variantes de gas6 que tengan las especificidades/afinidades de unión deseadas.

Otros procedimientos, vectores y células huésped adecuados para la síntesis de variantes de gas6 en el cultivo de células de vertebrados se describe en Gething y col., Nature 293:620-625 (1981); Mantel y col., Nature 281:40-46 (1979); Levinson y col., la patente europea EP 117.060; y la patente europea EP 117.058. Un plásmido de especial utilidad para el cultivo de células de mamífero para la expresión de gas6 es el pRK5 (patente europea EP 307.247) o el pSVI6B (PCT pub. Nº WO 91/08291 publicada el 13 de junio de 1991).

La elección de una línea celular para la expresión de la variante de gas6 depende principalmente del vector de expresión. Puede ser de interés seleccionar una célula huésped que no tenga la enzima \gamma-carboxilasa. En tal caso, la célula huésped de utilidad no será una célula de mamífero (sino, p.ej., una célula procariota que sea deficiente en dicha enzima). Alternativamente, también se puede utilizar una línea celular de mamífero deficiente en dicha enzima.

Las células huésped adecuadas para el clonaje o la expresión de vectores son las procariotas, las levaduras, los hongos u otras células eucariotas superiores descritas anteriormente. Las procariotas para dicho propósito incluyen las eubacterias, como las Gram-negativas o las Gram-positivas, por ejemplo, las Enterobacteriáceas como Escherichia, p.ej., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, p.ej., Salmonella typhimurium, Serratia, p.ej., Serratia marcescans y Shigella, así como Bacilli, B. subtilis y B. licheniformis (p.ej., B. licheniformis 41P descrito en la patente DD 266.710, publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas como P. aeruginosa y Streptomyces. Un huésped de clonaje preferido de E. coli es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque otras cepas como E. coliB, E. coliX 1778 (ATCC 31.537) y E. coli W3110 (ATCC 27.325) son también adecuadas. Estos ejemplos se ofrecen a modo ilustrativo y no como una limitación. La cepa W3110 es un huésped preferido o huésped parental ya que es una cepa huésped común para los productos de fermentación del DNA recombinante. Preferentemente, la célula huésped debería secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la cepa W3110 puede modificarse para producir una mutación genética en los genes que codifican proteínas, siendo un ejemplo de dicho huésped la cepa 27C7 de E. coli W3110. El genotipo completo de 27C7 es tonA \Delta ptr3 phoA \DeltaE15 \Delta(argF-lac) 169 ompT\Delta degp41karf. La cepa 27C7 se depositó el 30 de octubre de 1991 en el American Type Culture Collection como ATCC nº 55.244. Alternativamente, se puede utilizar la cepa de E. coli que tiene la proteasa periplásmica mutante descrita en la patente americana U.S. 4.946.783, publicada el 7 de agosto de 1990. Alternativamente, también son adecuados los procedimientos de clonaje, p.ej., la PCR u otras reacciones de la polimerasa de ácidos nucleicos.

Además de los microbios procariotas, los eucariotas como los hongos filamentosos o las levaduras son huéspedes adecuados para el clonaje o la expresión de vectores codificantes de variantes de gas6. Entre los microorganismos huéspedes eucariotas inferiores, el más común es Sacharomyces cerevisiae o la levadura del pan. Sin embargo, otros genes, especies y cepas están también disponibles y son de utilidad, como Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature 290:140 [1981]; la patente europea EP 139.383 publicada el 2 de mayo de 1985), huéspedes de Kluyveromyces (patente americana U.S. 4.943.529; Fleer y col., supra) como por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt y col., J. Bacteriol., 737 [1983]), K. fragilis (ATCC 12.424). K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wiceramii 8ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg y col., supra), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (patente europea EP 402.226); Pichia pastoris (patente europea EP 183.070; Sreekrishna y col., J. Basic Microbiol. 28:265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (patente europea EP 244.234); Neurospora crassa (Case y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces como Schwanniomyces occidentalis (patente europea EP 394.538, publicada el 31 de octubre de 1990); y los hongos filamentosos como, por ejemplo Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (patente internacional WO 91/00357, publicada el 10 de enero de 1991) y huéspedes de Aspergillus como A. nidulans (Ballance y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112:284-289 [1983]; Tilburn y col., Gene 26:205-221 [1983]; Yelton y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1470-1474 [1984]) y A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J. 4.475-479 [1985]).

Las células huésped adecuadas para la expresión de variantes de gas6 glicosiladas se derivan de organismos multicelulares. Dichas células huésped son capaces de realizar procesos complejos y de presentar actividad de glicosilación. En principio, cualquier cultivo de célula eucariota superior es factible, bien sea un cultivo de células de vertebrados o de invertebrados. Ejemplos de células de invertebrados incluyen las células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus y variantes y las células huésped de insectos correspondientes procedentes de huéspedes como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori. Véase, p.ej., Luckow y col., Bio/Technology 6:47-55 (1988); Miller y col., en Genetic Engineering, Setlow y col., eds., Vol 8 (Plenum Publishong, 1986), pp. 277-279; y Maeda y col., Nature 315:592-594 (1985). Son de disponibilidad pública diversas cepas virales para la transfección, p.ej., la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV. Dichos virus pueden utilizarse aquí de acuerdo con la presente invención, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

Se pueden utilizar como huéspedes las células vegetales en cultivo del algodón, el maíz, la patata, la soja, la petunia, el tomate y el tabaco. En general, las células vegetales se transfectan mediante incubación con ciertas cepas de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, que ha sido previamente manipulada para contener el DNA variante de gas6. Durante la incubación del cultivo celular con A. tumefaciens, el DNA que codifica para la variante de gas6 se transfiere a la célula vegetal huésped, con lo que la célula se transfecta y en las condiciones adecuadas se expresará el DNA de la variante de gas6. También, se dispone de secuencias reguladoras y señal compatibles con las células vegetales, como por ejemplo el promotor de la nopalina sintasa y las secuencias señal de poliadenilación. Depicker y col., J. Mol. Appl. Gen. 1:561 (1982). Además, los segmentos de DNA de la región cadena arriba del gen T-DNA 780 son capaces de activar o incrementar los niveles de transcripción de genes de expresión en plantas en tejido vegetal que contenga el DNA recombinante. Patente europea EP 321.196, publicada el 21 de junio de 1989.

La propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento de rutina en los últimos años (Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Patterson, editores [1973]. Ejemplos de líneas celulares huésped de mamíferos son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embrionario humano (293 o las células 293 subclonadas para crecer en un cultivo en suspensión, Graham y col., J. Gen Virol. 36:59 [1977]); las células de riñón de bebé hámster (BHK, ATCC CCL 10); las células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 [1980]); las células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 [1980]); las células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); las células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); las células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); las células de riñón canino (MDK, ATCC CCL 34); las células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); las células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); las células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); las células TRI (Mather y col., Annals N.Y. Acad. Sci. 282:44-68 [1982]); las células MRC 5; las células FS4; y una línea de hepatocarcinoma humano (Hep G2).

Las células huéspedes se transfectan con los vectores de expresión o de clonaje propios de esta invención, arriba descritos, y se cultivan en medios con nutrientes convencionales modificados apropiadamente para la inducción de promotores, selección de transformantes, o amplificación de genes codificantes de las secuencias deseadas. En función de la célula huésped utilizada, se transfecta con técnicas estándares adecuadas para esas células. El tratamiento con calcio, que utiliza cloruro de calcio, tal como se describe en la sección 1.82 de Sambrook y col., supra, o la electroporación, generalmente se utiliza en procariotas u otras células que presenten barreras importantes como sus paredes celulares. La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de ciertas células vegetales, tal como se describe por Shaw y col., Gene 23:315(1983) y la patente internacional WO 89/05859 publicada el 29 de Junio de 1989. Además, las plantas pueden ser transfectadas con el tratamiento de ultrasonidos, tal como se describe en la patente internacional WO 91/00358 publicada el 10 de enero de 1991.

Para las células de mamífero sin tales paredes celulares, se prefiere el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology 52:456-457(1978). Los aspectos generales de las transformaciones de sistemas de células huésped de mamífero han descrito, por Axel, en la patente americana U.S. No. 4.399.216 publicada el 16 de agosto de 1983. Las transformaciones en levaduras se llevan a cabo generalmente según el procedimiento de Van Sollingen y col., J. Bact. 130:946(1977) y Hsiao y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76:3829(1979). Otros métodos que pueden utilizarse para introducir el DNA en las células son la microinyección nuclear, la electroporación, la fusión de protoplastos bacterianos con células intactas, o policationes, p.ej., el polibreno, la poliomitina, etc. Para técnicas diversas de transformación de células de mamífero, véase Keown y col., Methods in Enzymology (1989), Keown y col., Methods in Enzymology 185:527-537 (1990) y Mansour y col., Nature 336:348-352 (1988).

Las células procariotas utilizadas para producir la variante de gas6 de la presente invención, se cultivan en los medios adecuado tal como se describe de manera general en Sambrook y col., supra.

Las células huésped de mamífero empleadas para producir la variante de gas6 de la presente invención pueden cultivarse en una gran variedad de medios. Los medios disponibles comercialmente como por ejemplo el Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y Dulbecco's Modifified Eagle's Medium ([DMEM], Sigma) resultan ser adecuados para el cultivo de células huésped. Además, cualquier medio de los descritos en Ham y Wallace, Meth. Enz. 58:44(1979), Barnes y Sato, Anal. Biochem.102:225 (1980), según las patentes americanas U.S. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; o 4.560.655; las patentes internacionales WO 90/03430; WO 87/00195; la patente americana U.S. Re. 30.985; o la patente americana U.S. 5.122.469, cuya información se ha incorporado aquí como referencia, pueden utilizarse como medios de cultivo para las células huésped. Todos estos medios deben suplementarse, si es necesario, con hormonas y/o otros factores de crecimiento (como la insulina, la transferrina, o el factor de crecimiento epidérmico), sales (como el cloruro sódico, el calcio, el magnesio y el fosfato), tampones (como el HEPES), nucleósidos (como la adenosina y la timidina), antibióticos (como el fármaco Gentamicina^{TM}), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos normalmente presentes en unas concentraciones finales de rango micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro suplemento necesario, conocido por los expertos en la materia, también puede incluirse a la concentración adecuada.

En ciertas realizaciones, es deseable cultivar las células transformadas huéspedes en ausencia de vitamina K ya que esto reduce la \gamma-carboxilación del dominio A del polipéptido gas6. Alternativamente, las células transformadas huésped pueden cultivarse en presencia de un inhibidor de la carboxilasa, como la warfarina.

Las condiciones de cultivo, como la temperatura, el pH, y otras, son idénticas a las empleadas previamente en las células huésped seleccionadas para la expresión, y serán evidentes para los técnicos expertos en la materia. En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos de células de mamífero pueden encontrarse en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed., IL Press, 1991. Las células huésped citadas en dicha referencia, abarcan tanto las células en cultivo como las que se hallan en un animal huésped.

La variante de gas6 se recupera preferentemente del medio de cultivo como un polipéptido secretado si bien también puede recuperarse de los lisados de las células huésped.

Cuando la variante de gas6 se produce en una célula recombinante diferente que en una de origen humano, está libre por completo de proteínas o polipéptidos de origen humano. Sin embargo, es necesario purificar gas6 de las proteínas o polipéptidos celulares para obtener preparaciones de gas6 que sean sustancialmente homogéneas. Como primer paso, los desechos particulados, tanto de células huésped como de fragmentos lisados, se extraen, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración; de manera opcional, la proteína se concentra con un filtro de concentración proteica disponible comercialmente, seguido de la separación de gas6 de otras impurezas mediante uno o más pasos seleccionados de una cromatografía de Sepharose con heparina, cromatografía de inmunoafinidad, fraccionamiento en columna de intercambio iónico, (p.ej., en DEAE o matrices que contengan grupos carboximetil o sulfopropil), cromatografía en Blue-Sepharose, CM Blue-Sepharose, MONO-Q, MONO-S, lentil-Sepharose, WGA-Sepharose, Con A-Sepharose, Ether Toyopcarl. Butyl Toyopearl, Phenyl Toyopearl o proteína A Sepharose, cromatografía de SDS-PAGE, cromatografía de sílice, cromatoenfoque, HPLC de fase inversa (p.ej. gel de sílice con grupos alifáticos añadidos), filtración en gel mediante p.ej., Sephadex con tamiz molecular o cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía en columnas que selectivamente unen gas6, y etanol o precipitación con sulfato amónico. Puede incluirse un inhibidor de proteasa en alguno de los pasos anteriores para inhibir la proteolisis, y antibióticos para prevenir el crecimiento de posibles contaminantes. Como ejemplos de inhibidores adecuados de proteasas se incluirían fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF), la leupeptina, la peptastina, la aprotinina, el 4-(2-aminoetil)-benzenosulfonil fluoruro hidrocloruro-bestatin, la quimostatina y la benzamidina.

Las variantes de gas6 en las que los residuos han sufrido delección, inserciones o substituciones, se obtienen de la misma manera que el gas6 nativo, pero teniendo en cuenta cualquier cambio sustancial en sus propiedades producido a consecuencia de la variación. Por ejemplo, la preparación de un gas6 etiquetado epitópicamente facilita la purificación en una columna de inmunoafinidad con un anticuerpo para un antígeno que absorberá el polipéptido de fusión. Las columnas de inmunoafinidad, como una columna con un anticuerpo policlonal anti-gas6 de conejo, se emplean para absorber la variante de gas6 uniéndola con al menos uno de los inmunoepitopos. Un experto en la materia, valorará la necesidad de modificar los procedimientos de purificación adecuados para la gas6 nativa producida en un cultivo celular recombinante, según sean los cambios en las características de gas6 o el de sus variantes.

3. Utilizaciones de las variantes de Gas6 in vitro e in vivo

La presente invención proporciona los procedimientos para activar el receptor Rse o el receptor Mer y/o aumentar la supervivencia, la proliferación y la diferenciación de las células que presentan estos receptores mediante variantes de gas6. Las variantes de gas6, útiles en la práctica de la presente invención, pueden prepararse según las diferentes formas que se han descrito en la sección anterior (véase también el Ejemplo 6, más adelante).

La variante gas6 puede tener un origen humano o de cualquier otra especie no humana. Por ejemplo, un mamífero podría ser tratado con variantes de gas6 de especies de diferentes mamífero (p.ej., el ratón puede tratarse con gas6 humano). Al existir una homología importante (alrededor del 81% de identidad de secuencia aminoacídica) entre el gas6 murino y el gas6 humano, es de esperar, que puedan utilizarse indistintamente gas6 de diferentes especies de mamíferos. Sin embargo, los mamíferos se tratan preferiblemente con gas6 homólogos (p.ej. los humanos se tratan con gas6 humano) para evitar la inmunogenicidad potencial adversa de gas6 en los mamíferos.

La presente invención incluye procedimientos de activación de los receptores Rse y Mer y/o aumento de la supervivencia, proliferación, o diferenciación de las células que presentan dichos receptores Rse o Mer in vivo e in vitro. Normalmente, estas células se tratan con variantes del polipéptido gas6. También se incluyen dentro del ámbito de la presente invención, los enfoques de terapia génica descritos en la materia. Estas técnicas incluyen la introducción de un gen en la célula mediante el uso de adenovirus, el virus herpes simplex I o adenovirus asociados, así como sistemas de introducción basados en lípidos (p.ej. liposomas). Los retrovirus son adecuados para enfoques de terapia génica ex vivo. Según ello, es posible administrar los ácidos nucleicos codificantes de la variante de gas6, resultando en la expresión del polipéptido variante de gas6 en un paciente o en un cultivo de tejidos. Como ejemplo de técnicas de terapia génica véase la patente internacional WO 93/25673 y las referencias que se citan.

De acuerdo con los procedimientos in vitro de la presente invención, las células que presentan los receptores Rse o Mer se suministran e incluyen en un medio de cultivo. Como ejemplos de células que presentan el receptor Rse se incluyen las células neurales, p.ej., células del cerebro (como las neuronas del neocortex, cerebelo e hipocampo); células de la glía (p.ej. células de Schwann o astrocitos); células derivadas del riñón y la mama; células derivadas de los ovarios o los testículos; fibroblastos como las células 3T3 de ratón; células del sistema hematopoyético como las CMK11-5. Como ejemplos de células que presentan el receptor Mer se incluyen las células mononucleares de sangre periférica, las células mononucleares de la médula ósea, los monocitos, las células hematopoyéticas primarias y las células derivadas de los testículos, ovario, próstata, pulmón, riñón, páncreas, leucocitos de sangre periférica, placenta, timo, intestino delgado, colon o hígado. Como ejemplos de líneas celulares para el cultivo con gas6 se incluyen las líneas celulares de leucemias linfocito T (p.ej. CCRF-HSB-2-, JURKAT, HPB-ALL y Peer); línea celular K-562; líneas celulares de leucemia monocítica/linfoma (como U-937); la línea celular de leucemia megacarioblástica (p.ej. UT-7) y otras líneas celulares que expresan el receptor Mer tal como se describe en Graham y col., Cell Growth Differ, 5:647 (1994).

Los medios de cultivo adecuados para tejidos son bien conocidos por las personas experimentadas en ese campo e incluyen, pero no de manera limitante, el Minimal Essential Medium (MEM), el RPMI-1640, y el Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM). Estos medios de cultivo de tejidos están disponibles comercialmente en Sigma Chemical Company (St. Lous. MO) y GIBCO (Grand Island, NY). Las células se cultivan en el medio de cultivo celular en condiciones suficientes para que permanezcan viables y crezcan en presencia de una cantidad efectiva de gas6. Las células pueden cultivarse de diversas formas, incluyendo el cultivo en agregados, agar o cultivo líquido.

El cultivo celular se realiza a una temperatura aceptable fisiológicamente como, por ejemplo, 37º, en presencia de una cantidad efectiva de la variante de gas6. La cantidad de gas6 variante puede cambiar, pero preferentemente se halla en un intervalo de 10 ng/ml a 1 mg/ml. La variante de gas6 puede añadirse al cultivo a una dosis determinada empíricamente por los expertos en la materia y sin experimentación excesiva. La concentración de la variante de gas6 en el cultivo dependerá de varios factores, como son las condiciones en que se cultivan las células con gas6. La temperatura específica y la duración de la incubación, así como de otras condiciones de cultivo, pueden variarse en función de dichos factores como, p.ej., la concentración del gas6 variante, y el tipo de células y de medio. Los expertos en la materia serán capaces de determinar de manera operativa las condiciones óptimas del cultivo sin experimentación excesiva. La proliferación, diferenciación y/o supervivencia de las células (p.ej. neuronas o células mononucleares) en los cultivos, puede determinarse mediante varios ensayos conocidos en la materia, como los descritos con anterioridad.

Se contempla la utilidad de la variante de gas6 para aumentar la supervivencia, el crecimiento y/o la diferenciación celular in vitro de varias formas. Por ejemplo, las células neurales cultivadas in vitro en presencia de la variante de gas6 pueden infundirse en un mamífero que sufra una reducción en el nivel de células. En otras realizaciones, la variante de gas6 puede utilizarse en cultivos de células hematopoyéticas (como monocitos/macrófagos) ex vivo, los cuales pueden administrarse a pacientes que tengan niveles disminuidos de esas células sanguíneas (por ejemplo cuando el paciente ha seguido una terapia de quimio o radiación). Los cultivos estables in vitro pueden utilizarse para el aislamiento de factores celulares específicos y para la expresión de proteínas endógenas o producidas de manera recombinante en la célula. También, la variante de gas6, puede ser útil para aumentar la supervivencia, la proliferación y/o la diferenciación de células que apoyen el crecimiento y/o la diferenciación de otras células en cultivo celular (p.ej. células estromales, células de sostén no adherentes de la médula ósea). De este sentido, las células de Schwann pueden promover la supervivencia de las neuronas en cultivo celular.

La variante de gas6 se considera particularmente útil para el crecimiento de las células de Schwann ex vivo. Es deseable disponer de dichas poblaciones celulares en cultivo para aislar factores celulares específicos, p.ej. el P75^{NGFR}, marcador específico de las células de Schwann. Estos factores son útiles como herramientas de diagnóstico o, en el caso de P75^{NGFR}, pueden emplearse como antígenos para generar anticuerpos para uso diagnóstico. Es también deseable disponer de poblaciones estables de células de Schwann en cultivo celular para facilitar la caracterización de otros mitógenos y agentes inhibidores del crecimiento de dichas células.

La invención también proporciona utilizaciones in vivo para las variantes de gas6. En base a la capacidad de gas6 en promover la proliferación de células gliales (ver Ejemplo 9), se cree que esta molécula es particularmente útil para el tratamiento de las enfermedades que impliquen desmielinización, daño o pérdida de células gliales (p.ej. la esclerosis múltiple).

También se piensa que gas6 es útil en promover el crecimiento, el mantenimiento, y/o la regeneración de neuronas in vivo, incluyendo el sistema nervioso central (cerebro y médula espinal), el sistema nervioso periférico (simpático, parasimpático, las neuronas sensoriales y las entéricas) y las motoneuronas. De acuerdo con ello, las variantes de gas6 pueden utilizarse en procedimientos para el diagnóstico y/o el tratamiento de una variedad de "enfermedades o trastornos neurológicos" con efecto en el sistema nervioso de un mamífero, como por ejemplo un humano.

Tales enfermedades o trastornos pueden aparecer en pacientes en los que el sistema nervioso ha sido dañado a causa de, p.ej., trauma, cirugía, infarto, isquemia, infección, enfermedad metabólica, deficiencia nutricional, procesos malignos, o agentes tóxicos. El agente se diseña para promover la supervivencia o el crecimiento de las neuronas. Por ejemplo, la variante de gas6 pude emplearse en promover la supervivencia o el crecimiento de las motoneuronas que dañadas por un trauma o cirugía. También puede emplearse la variante de gas6 para tratar trastornos de las motoneuronas, como en la esclerosis lateral amiotrófica (la enfermedad de Lou Gehrig), la parálisis de Bell, y varias condiciones que implican la atrofia muscular espinal o la parálisis. Gas6 puede utilizarse para el tratamiento de "trastornos neurodegenerativos" humanos como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la epilepsia, la esclerosis múltiple, el corea de Huntington, el síndrome de Down, la sordera nerviosa y la enfermedad de Ménière.

Además, la variante de gas6 puede utilizarse para el tratamiento de neuropatías, y especialmente la neuropatía periférica. La "neuropatía periférica" se refiere a un trastorno que afecta al sistema nervioso periférico, que con frecuencia se manifiesta como una combinación de disfunción neural motora, sensorial, sensorimotora o autónoma. La amplia variedad de morfologías exhibida por las neuropatías periféricas puede atribuirse a diversas causas similares. Por ejemplo, las neuropatías periféricas pueden adquirirse de manera genética, ser el resultado de una enfermedad sistémica, o así mismo, ser inducidas por un agente tóxico. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan, a la neuropatía distal sensorimotora, o a neuropatías autónomas tales como las que reducen la motilidad del tracto gastrointestinal o la atonía de la vejiga urinaria. Ejemplos de neuropatías asociadas con la enfermedad sistémica incluyen el síndrome de post-polio; ejemplos de neuropatías hereditarias incluyen la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, la enfermedad de Refsum, la abetalipoproteinemia, la enfermedad de Tangier, la enfermedad de Krabbe, la leucodistrofia metacromática, la enfermedad de Fabry, y el síndrome de Dejerine-Sottas; y ejemplos de neuropatías causadas por agentes tóxicos incluyen aquellos causados por el tratamiento con agentes quimoterapeúticos como la vincristina, el cisplatino, el metotrexato, o la 3'-azido-3'-deoxitimidina.

Dada la expresión del receptor Rse y el receptor Mer en las células hematopoyéticas, la variante de gas6 puede ser usada para aumentar la repoblación de linajes de células sanguíneas maduras en pacientes que han seguido terapia con quimio o radiación o terapia de transplante de médula ósea. Se contempla que gas6 actúa mediante un aumento de la proliferación y/o diferenciación de células hematopoyéticas (p.ej. monocitos y megacariocitos). La variante de gas6, en este sentido, es útil para tratar enfermedades caracterizadas por una disminución de las células sanguíneas. Ejemplos de estas enfermedades incluyen la anemia (anemia macrocítica y anemia aplásica); la trombocitopenia; la monocitopenia; la hipoplasia; la trombocitopenia púrpura inmune (autoinmune) (ITP); y la ITP inducida por VIH. Gas6 puede también utilizarse para promover el crecimiento y/o la reparación de tejidos (p.ej. testículos, ovario, próstata, pulmón o riñón) que expresan uno o ambos receptores. La variante de gas6, así mismo, puede intervenir para aumentar la función reproductora, aumentando la expresión del receptor Mer en los testículos y en los ovarios.

Respecto a Mer, que se expresa en las células mononucleares, se contempla que la variante de gas6 pueda utilizarse para tratar condiciones en las que se pretenda la proliferación y/o la diferenciación de las células. Por ejemplo, la variante de gas6 puede utilizarse para aumentar los niveles de monocitos (p.ej. macrófagos) en un paciente que lo requiera.

En otras realizaciones, las variantes de gas6 se utilizan para modular la función que poseen los receptores Mer o Rse. Por ejemplo, se utilizan las variantes de gas6 para activar monocitos/macrófagos en situaciones en las que su activación es deseable. (p.ej. para tratar infecciones).

Las formulaciones terapéuticas de las variantes de gas6 se preparan mezclando las variantes de gas6 con el deseado grado de pureza, con vehículos, excipientes o estabilizantes opcionales farmacéuticamente aceptables y bien conocidos en la materia. Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables no han de ser tóxicos para el paciente en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones como el fosfato, el citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menores de alrededor de 10 residuos); proteínas, tales como la albúmina sérica, la gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como la polivinilpirrolidona; amino ácidos como la glicina, la glutamina, asparraguina, la arginina o la lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo la glucosa, la manosa, o las dextrinas; agentes quelantes como el EDTA; alcoholes de azúcar como el manitol y el sorbitol; iones salinos como el sodio; y/o tensoactivos no iónicos como el Tween, el Plurónics o el polietilén glicol (PEG).

Puede ser de interés adsorber la variante de gas6 a una membrana, como una membrana silástica, que puede implantarse en la proximidad del tejido neural dañado, o incorporar la variante de gas6 en liposomas. Patente internacional, WO 91/04014 (publicada el 4 de Abril de 1991). En otra aplicación, se utiliza la variante de gas6 por su efecto terapéutico y consiste en la variante de gas6 unida covalentemente a otra proteína tal como un dominio inmunoglobulina (por ejemplo, para producir gas6-IgG).

La variante de gas6 se combina de manera opcional o se administra junto con otros factores neurotróficos para alcanzar el efecto terapéutico deseado. Por ejemplo, la variante de gas6 puede utilizarse con el factor de crecimiento nervioso (NGF), las neurotrofinas (NT-3), el factor nervioso derivado del hueso (BDNF), las neurotrofinas-4 y -5 (NT4/NT5), un factor de crecimiento similar a la insulina (p.ej. IGF-1 o IGF-2) u otro factor neurotrófico para alcanzar un efecto estimulador sinérgico en el crecimiento de las neuronas sensoriales, ahí el término "sinérgico" significa que el efecto de la combinación de gas6 con una segunda sustancia es mayor que el que se alcanza con cualquiera de esas sustancias utilizada individualmente.

Por su utilidad en la hematopoyesis, la variante de gas6 puede administrase junto con una o más citoquinas. Se incluyen en estas citoquinas, la hormona del crecimiento, los factores de crecimiento similares a la insulina, la hormona de crecimiento humana, la N-metionil hormona de crecimiento humana, la hormona de crecimiento bovina, la hormona paratiroidea, la tiroxina, la insulina, la proinsulina, la relaxina, la prorelaxina, las hormonas glicoproteicas como la hormona estimulante del folículo (FSH), la hormona estimulante de la tiroides (TSH), y la hormona luteinizante (LH), el factor de crecimiento hematopoyético, el factor de crecimiento hepático, el factor de crecimiento de fibroblastos, la prolactina, lactógeno placentario, el factor de la necrosis tumoral-\alpha y -\beta, la sustancia inhibidora mülleriana, el péptido asociado a la gonadotropina de ratón, la inhibina, la activina, el factor de crecimiento endotelial, la integrina, la trombopoyetina, el factor de crecimiento nervioso como el NGF-\beta, el factor de crecimiento plaquetario, los factores de crecimiento transformantes (TGFs) como el TGF-\alpha y el TGF-\beta factor semejante a la insulina-I y -II, la eritropoyetina (EPO), los factores osteoinductivos, los interferones como el interferón-\alpha, -\beta y \gamma-, los factores estimuladores de colonias (CSFs) como el CSF de macrófagos (M-CSF), el CSF de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), y el CSF de granulocitos (G-CSF), las interleucinas (ILs) como IL-1, IL-1\alpha, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL12 y otros factores polipeptídicos incluidos el LIF, SCF, y el ligando del equipo. Tal como se utilizan aquí, los términos precedentes incluyen las proteínas de fuentes naturales o de cultivos celulares recombinantes. Así mismo, estos términos incluyen los equivalentes biológicos activos; p.ej. los que difieren en uno o más aminoácidos de la secuencia aminoacídica o en el tipo y la extensión de la glicosila-
ción.

Para la administración in vivo, la variante de gas6 debe de ser estéril. Para ello se filtra una solución de gas6 variante a través de membranas de filtración estériles. Después de esto, la solución filtrada se dispone en un recipiente con un puerto de acceso estéril, por ejemplo una bolsa de solución intravenosa o un vial presentando un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica. La solución filtrada, también puede liofilizarse para producir gas6 variante estéril en forma de polvo.

Los procedimientos para la administración de las variantes de gas6 in vivo incluyen la inyección o la infusión por vía intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intratecal, intramuscular, intraocular, intraarterial o intralesional y por medio de formulaciones de liberación prolongada.

La liberación prolongada de las formulaciones consiste generalmente en gas6 variante y una matriz de la que se liberan gas6 o su antagonista durante un período de tiempo. Las matrices idóneas son matrices de polímeros semipermeables que se presentan como artículos con formas diferentes, por ejemplo, membranas, fibras o microcápsulas. Las matrices de liberación prolongada comprenden los poliésteres, los hidrogeles, los poliláctidos de la patente americana U.S. 3.773.919, los copolímeros del ácido L-glutámico y el \gamma-etil-L-glutamato, Sidman y col., Biopolymers 22:547-556 (1983), poly(2-hydrometil-metacrilato), o etilén vinil acetato, Langer y col., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981); y Langer Chem. Tech. 12:98-105(1982).

En una realización de la invención, la formulación terapéutica comprende la inmovilización de la variante de gas6 con o formando un complejo con liposomas. Por ejemplo, la variante de gas6 unida covalentemente a la porción del glicofosfatidil inositol puede emplearse para formar un liposoma que contenga la variante de gas6. En otra realización, la formulación terapéutica comprende células productoras activas de la variante de gas6. Estas células pueden introducirse directamente en el tejido de un paciente, o pueden encapsularse con membranas porosas que se implanta en el paciente, y en cualquier caso proporcionar la liberación de la variante de gas6 a áreas del cuerpo del paciente donde se necesite aumentar o disminuir la concentración de gas6. Alternativamente, puede utilizarse un vector de expresión que contenga el DNA de la variante de gas6 para la transformación in vivo de células de un paciente para conseguir el mismo resultado.

La cantidad efectiva de la variante de gas6 adecuada para utilización terapéutica dependerá de la vía de administración y del estado del paciente. Según ello, el terapeuta necesitará titular la dosificación y modificar la forma de administración según las necesidades para obtener un efecto terapéutico óptimo. Una dosificación diaria corriente, debe hallarse entre 1 \mug/kg y 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados más arriba. Cuando sea posible, es deseable determinar los intervalos de dosificación adecuados, primero in vitro, por ejemplo, mediante ensayos de supervivencia o crecimiento celular conocidos en este campo, y después en modelos animales adecuados, en los que pueda extrapolarse el intervalo de dosificación para los pacientes humanos. En una realización específica de la invención, una composición farmacéutica efectiva que promueva la supervivencia o el crecimiento de neuronas, deberá proporcionar una concentración local de gas6 in vivo de entre 0,1 a 10 ng/ml aproximadamente.

La invención, además, proporciona un artículo de manufactura y un equipo que contiene materiales útiles para la activación de los receptores Rse o Mer o aumentar la supervivencia, proliferación o diferenciación de las células que presentan los receptores Rse o Mer. El artículo de manufactura comprende un recipiente con la marca. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales y tubos de ensayo. Los recipientes pueden estar formados por diversos materiales, como por ejemplo el cristal y el plástico. El recipiente retiene una composición que es efectiva para la activación de los receptores de Rse o Mer y/o para aumentar la supervivencia, proliferación, y/o diferenciación de células que presentan el receptor de interés. El agente activo en la composición es la variante de gas6. La etiqueta del recipiente indica la composición que se utiliza para activar los receptores Rse o Mer y/o aumentar la supervivencia, proliferación y/o diferenciación de células que presentan ese receptor y también indica las directrices para el uso in vivo o in vitro, tal como se ha descrito más arriba.

El equipo de la invención comprende el recipiente descrito más arriba y un segundo recipiente que contiene un tampón. Pueden incluirse otros materiales deseables desde el punto de vista comercial o del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, y paquetes de material adicional con las instrucciones de uso.

Algunos de los siguientes ejemplos ilustran la invención, otros proporcionan una información útil. Sin embargo, no deberían interpretarse como limitantes del alcance de la invención.

Ejemplo 1 Producción de la proteína de fusión Rse-IgG

Para identificar una fuente de ligando de Rse (Rse-L), una proteína de fusión que contiene el dominio extracelular de un Rse humano seguido por la porción Fc de una IgG humana (Rse-IgG) se emplea como sonda para cribar las células por su superficie unida a Rse-L con citometría de flujo (ver Ejemplo 2 de más adelante). El Rse-IgG se construyó fusionando una secuencia codificante del dominio extracelular (aminoácidos 1-428) del Rse humano (Mark et al., Journal of Biological Chemistry 269(14):10720-10728[1994]) a los aminoácidos 216-443 de la IgG\gamma humana, a través de un engarce BstEII (añadiendo los aminoácidos Val y Thr). El engarce se añadió a la secuencia Rse mediante PCR con los cebadores: (5'-TCAAGACAATGGAACCCAGG [SEC ID NO: 4] y 5'-CATGGAATTCGGT
GACCGATGTGCGGCTGTGAGGAG [SEC ID NO: 5]. El cDNA codificante de Rse-IgG se transfirió a un vector de expresión derivado de SV40 y se introdujo en células CHO DHFR^{-} mediante electroporación (250 voltios, 960 \muF). Las células DHFR^{+} se seleccionaron y se determinó la expresión individual de los clones Rse-IgG mediante un ELISA Fc-específico de humano. El Rse-IgG se purificó en una columna de A-Sepharose (Pharmacia).

Ejemplo 2 Ensayo de unión

El análisis mediante la técnica de separación celular activada por fluorescencia (FACS) con Rse-IgG, se realizó según Goodwin y col., Cell 73:447(1993). Las células de la línea CMK11-5 de leucemia megacariocítica (Adachi y col., Exp. Hematol, 19:923[1991]) se unen específicamente a Rse-IgG pero no así a proteínas de fusión control que contienen un dominio Fc idéntico como HGFr-IgG (Mark y col., J. Biol. Chem. 267:26166[1992]) o CD4-IgG (Capon y col., Nature 337:525 [1989]). La unión de Rse-IgG se incrementó por la adición de Ca^{2+} y se eliminó por tratamiento con EDTA 2 mM.

A continuación, se realizó un ensayo de unión in vitro para caracterizar la interacción de ^{125}I-Rse-IgG con el Rse-L putativo unido a la superficie celular. Las células CMK 11-5 se suspendieron en TrisCl 10 mM, pH 7,5 durante 10 min en hielo, se lisaron combinando la sonicación y el cizallamiento, se recogieron todas las membranas por centrifugación y se almacenaron en Tris-Cl 50 mM pH 7,5, glicerol al 20% a -80ºC. Las membranas equivalentes a 200.000 células se combinaron con suero bovino fetal (SBF) o fracciones de la columna, competidores, y ^{125}I-RseIgG en un volumen total de 0,1-0,12 ml. Después de una incubación de 30 min a temperatura ambiente, se añadió a cada tubo 1 ml de tampón de ensayo enfriado en hielo. La radioactividad asociada a la membrana, se recogió por centrifugación durante 4 min a 15000g, y se separó de la radioactividad no unida por aspiración del fluido sobrenadante y se contó en un contador \gamma. El tampón de ensayo utilizado fue Tris-HCl 50 mM, Tween-20 al 0,05%, BSA al 0,1 y CaCl_{2}5 mM.

Debido a que el análisis de citometría de flujo se realizó en presencia de suero, se determinó el efecto del SBF en el ensayo de unión a la membrana. El grado de unión resultó ser completamente dependiente de la concentración de SBF; no se observó desplazamiento de la unión en ausencia de SBF y se alcanzó el 50% de unión máxima con SBF al 0.58% (Fig. 3A).

La unión resultó también dependiente del Ca^{2+}; el 50% de unión máxima se obtuvo con Ca^{2+} 0,18 mM (Fig. 3B). Aunque el número aparente de lugares de unión para Rse-IgG resultó ser dependiente de la concentración de SBF, la afinidad no cambió demasiado [K_{d} de 0,82 nM en SBF al 1% versus 2,2 nM en SBF al 10%] (Fig. 3C). La unión resultó específica; otras proteínas de fusión-IgG recombinantes como CD4-IgG, no compitieron por la unión con ^{125}I-Rse-IgG.

Ejemplo 3 Receptor Rse etiquetado epitópicamente y su activación

Con el fin de caracterizar mejor un Rse-L, se generaron células de ovario de hámster chino (CHO) que expresaban una versión del receptor Rse con una etiqueta C-terminal de la glicoproteína D (gD) del virus Herpes simplex tipo I (HSV-1) (Paborsky et al., Protein Engineering 3(6):547-553[1990]).

Se emplearon oligonucleótidos de doble cadena sintéticos para reconstituir la secuencia codificante para los 10 aminoácidos (880-890) C-terminales del Rse humano y añadir 21 aminoácidos adicionales que contenían el epitopo gD para el anticuerpo 5B6 (Paborksy y col., supra) y un codón de parada. La secuencia final de la porción sintética del gen de fusión fue:

cadena codificante

5'-GCAAGGGCTACTGCCACACTCGAGCTGCGCAGATGCTAGCCTCAAGATGGCT G

ATCCAAATCGATTCCGCGGCAAAGATCTTCCGGTCCTGTAGA-3'[SEC ID No: 6]

cadena no codificante

5'-AGCTTCTACAGGACCGGAAGATCTTTGCCGCGGAATCGATTTGGATCAGCCATCTT G

AGGCTAGCATCTGCGCAGCTCGAGTGTGGCAGTAGCCCTTGCTGCA-3'[SEC.ID No:7]

El DNA sintético se ligó con el cDNA codificante para los aminoácidos 1-880 del Rse humano en la diana PstI empezando en el nucleótido 2644 de la secuencia publicada para el cDNA del Rse humano (Mark et al., Jornal of Biological Chemistry 269(14):10720-10728[1994]) y la diana HindIII en el poliengarce del vector de expresión pSV17.ID.LL (ver PCT/US94/13329) derivado del vector pRK (Suva et al., Science, 237:893-896[1987]) para crear el plásmido de expresión pSV.ID.Rse.gD. Brevemente, el plásmido de expresión comprende un transcrito primario dicistrónico que contiene la secuencia codificante de DHFR unida por los sitios de ayuste intrónicos, 5' donante y 3' aceptor, seguido por la secuencia que codifica para Rse.gD. El mensajero de longitud completa (no ayustado) contiene el DHFR como primera pauta de lectura y por tanto genera la proteína DHFR que permitirá la selección de transformantes estables.

Las células dp12.CHO (patente europea EP 307.247 publicada el 15 de marzo de1989) se electroporaron con pSV.ID.Rse.gD que había sido linearizado por la diana única Not1 del plásmido. El DNA se precipitó con etanol después de la extracción con fenol/cloroformo y se resuspendió en 10 \mul de Tris/EDTA 10/1. A continuación, se incubaron 20 \mug de DNA con 10^{7} células CHO.dp12 en 1 ml de PBS en hielo durante 10 min antes de la electroporación a 350 voltios y 330 \muf. Las células se devolvieron al hielo 1O min antes de sembrarse en un medio no selectivo. Después de 24 h, se suministró a las células medio sin nucleósidos para seleccionar clones DHFR^{+} estables.

Para identificar la línea celular que expresa los ácidos nucleicos de Rse.gD, se cribaron los clones candidatos por FACS con el antisuero policlonal 19B que reconocía epitopos en el dominio extracelular de Rse. Para confirmar que las colonias evaluadas como positivas por FACS expresaban el ácido nucleico de longitud completa de Rse.gD, se preparó un lisado celular (Lokker et al., EMBO J, 11:2503-2510[1992]), que se solubilizó y se inmunoprecipitó el Rse.gD con el antisuero 19B. Las proteínas inmunoprecipitadas se fraccionaron en condiciones reductoras en PAGE al 7%, se transfirieron a filtros de nitrocelulosa y a continuación se hibridaron con el anticuerpo anti-gD 5B6 (Paborsky y col., supra), detectándose a continuación con un anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano.

Se determinó por transferencia de Western La capacidad de los clones de Rse.gD para autofosforilarse en respuesta a SBF al 20%, a fracciones parcialmente purificadas de SBF que contienen la actividad de unión del receptor Rse.gD (es decir, dilución 1:10 de la fracción QSE obtenida en el Ejemplo 5 de más adelante), o en el control (sin aditivos). En resumen, 5 x 10^{5} células dp12.CHO transformadas con los ácidos nucleicos de Rse.gD, tal como se describió más arriba, se sembraron en placas de 60 mm en presencia de suero durante 6 h. Las células se lavaron con tampón fosfato salino (PBS) y se privaron de suero durante 16 h. Las células privadas de suero se expusieron a la muestra durante 10 min. La proteína Rse.gD se inmunoprecitó del lisado de células CHO con el anticuerpo monoclonal anti-gD 5B6. Las proteínas se fraccionaron en SDS-PAGE al 7% en condiciones reductoras y se transfirieron a nitrocelulosa. La fosforilación del Rse se detectó con el anticuerpo anti-fosfotirosina 4G10 (obtenido comercialmente de UBI, New York).

La adición de SBF al 20% o de fracciones parcialmente purificadas de SBF que contenían la actividad de unión del Rse-IgG a células sin suero que expresaban Rse-gD, resultó en la fosforilación de los residuos de tirosina del receptor Rse de 140 kDa. El receptor Rse no se activó con el control.

Ejemplo 4 KIRA ELISA

La actividad en presencia de SBF que activaba el Rse.gD se caracterizó completamente utilizando un procedimiento basado en el ensayo de ELISA "KIRA" (Activación del Receptor Quinasa) que permite un análisis de alto rendimiento de las fuentes potenciales de Rse-L. Ver la Figura 4 para una representación esquemática de este ensayo.

Las células CHO.dp12 transformadas con Rse.gD, obtenidas tal como se describió en el Ejemplo 3, se sembraron (5x10^{4} por pocillo) en pocillos de fondo plano de placas de cultivo de 96 pocillos con 100 \mul de medio y se cultivaron toda la noche a 37ºC en CO_{2} al 5%. A la mañana siguiente, los sobrenadantes de los pocillos se decantaron, golpeándose las placas suavemente sobre una servilleta de papel. A continuación, se añadió a cada pocillo 50 \mul de medio que contenía la fracción QSE obtenida tal como se describe en el Ejemplo 5 de más adelante, o con el control (p.ej. únicamente medio). Para los experimentos de neutralización, las fuentes de ligando potencial, se trataron a temperatura ambiente durante 30 minutos con Rse-IgG o CD4-IgG (100 \mug/ml) antes de añadirse a las células. Las células se estimularon a 39ºC durante 30 min, los sobrenadantes de los pocillos se decantaron, golpeándose otra vez las placas ligeramente sobre una servilleta de papel para eliminar los restos de sobrenadante. Para lisar las células y solubilizar los receptores, se añadió a cada uno de los pocillos, 100 \mul de tampón de lisis. El tampón de lisis consistió en NaCl 150 mM que contenía HEPES 50 mM (GIBCO), Tritón-X 100 al 0,5% (Gibco), timerosal al 0,01%, 30 KIU/ml de aprotinina (ICN Biochemicals, Aurora, OH), 1 mM 4-(-2-aminoetil)-benzenosulfonil fluoruro hidrocloruro (AEBSF; ICN Biochemicals), 50 \muM de leupeptina (ICN Biochemicals) y ortovanadato de sodio 2 mM (Na_{3}VO_{4}; Sigma Chemical Co, St Louis, MO), pH 7,5. La placa se agitó lentamente en un agitador de placas (Bellco Instruments, Vineland, NJ) durante 60 min a temperatura ambiente.

Mientras las células se solubilizaban, se preparó la microplaca de ELISA (Nunc Maxisorp, Inter Med, Denmark). La microplaca se recubrió con el anticuerpo monoclonal anti-gD (0,05 \mug/ml en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6, 100 \mul/pocillo) y se incubó durante toda la noche a 4ºC. Después se decantó, se golpeó sobre una servilleta de papel y se bloqueó con 150 \mul/pocillo de tampón de bloqueo (PBS que contenía BSA al 0,5% [Intergen Company, Purchase, NY] y timerosal al 0,01%) durante 60 min a temperatura ambiente, en agitación ligera. Después de 60 minutos, el exceso de anti-gD 5B6 que recubría las placas, se lavó 6 veces con tampón de lavado (PBS que contenía Tween-20 al 0,05% y timerosal al 0,01%) en un lavador de placas automático (Scan Washer 300, Skatron Instruments, Inc, Sterling, VA).

El lisado que contenía el Rse.gD solubilizado procedente del pocillo de la microplaca de cultivo celular se transfirió (85 \muL/pocillo) a los pocillos de ELISA recubiertos con anti-gD 5B6 y bloqueados, incubándose durante 2 h a temperatura ambiente en agitación ligera. El Rse.gD libre se extrajo mediante lavados con tampón de lavado y se añadió a cada pocillo 100 \mul de 4G10 biotinilado (anti-fosforotirosina) a 0,15 \mug/ml en tampón (PBS que contenía BSA al 0,5%, Tween-20 al 0,05%, EDTA 5 mM y timerosal al 0,01%). Después de la incubación de 2h a temperatura ambiente, la placa se lavó y se añadieron a cada pocillo 100 \mul de HRPO-conjugado con streptavidina (Zymed Laboratories, S. San Francisco, CA) diluida a 1:6x10^{4} en tampón de dilución. La placa se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación ligera. El conjugado de avidina libre se extrajo y se añadieron a cada pocillo, 100 \mul de solución de substrato preparada extemporáneamente (tetrametilbenzidina [TMB]; componente 2 de sustrato del equipo; Kirkegard and Perry, Gaithersburg, MD). La reacción se dejó progresar durante 10 minutos, después de lo cual se detuvo la aparición de color por adición de 100 \mul/pocillo de H_{3}PO_{4} 1,0 M. La absorbancia a 450 nm se leyó con una longitud de onda de referencia de 650 nm (ABS_{450/650}), mediante un lector de placas vmax (Molecular Devices, Palo Alto, CA) controlado con un Macintosh Centris 650 (Apple Computers, Cupertino, CA) y un programa DeltaSoft (BioMetallics, Inc, Princeton, NJ).

La fosforilación del Rse.gD se estimuló de forma dependiente de la dosis y esta actividad se neutralizó con Rse-IgG pero no por el control CD4-IgG (Fig. 3D). Estos resultados indican que un ligando capaz de activar al Rse está presente en el SBF.

Ejemplo 5 Caracterización del Ligando de Rse

El Rse-L se purificó del SBF por cromatografía de intercambio iónico y de afinidad por Rse (ver Tabla 2 de más adelante).

TABLA 2 Purificación del Ligando de Rse de SBF

3

El suero bovino fetal (SBF) se dializó (con un peso molecular de corte de 6000 Da) en Tris HCl 50 mM pH 7,5 y se filtró en condiciones estériles (nitrato de celulosa de 0,22 \mu, Corning) antes de cargarse en una columna de Q-Sepharose equilibrada en tampón A, Tris HCl 10 mM, pH 7.5 El Tampón B se preparó añadiendo NaCl 1M al tampón A. La columna se eluyó en un gradiente de 0 al 18% de B, con 1volumen de columna, a continuación con un gradiente del 18 al 60% de B con 10 volúmenes de columna 10. Las fracciones activas, eluidas con NaCl 0,4 M, se precipitaron y dializaron en Tris HCL 50 Mm pH 7,.5 y benzamidina 5 mM. Esta fracción enriquecida de Q-sepharose (QSE) se aplicó a una columna de afinidad Rse-IgG. La columna se lavó con Tris HCl 50 mM, pH 7,5 y benzamidina 5 mM y se eluyó con Urea 4 M, Tris HCl 0,1 M, pH 7,5 y benzamidina 5 mM. El eluido se concentró y dializó por ultrafiltración centrífuga (Centricon 10). Las columnas de Rse-IgG se prepararon utilizando 2 mg de Rse-IgG por ml de resina Emphase según las instrucciones suministradas por el fabricante (Pierce). Las cantidades tabuladas son relativas a 100 ml del material de partida del SBF. Una unidad de actividad de unión se define como la cantidad presente en 1 ml de muestra con una EC_{50} del 1% v/v en el ensayo de activación de la unión in vitro descrito en el Ejemplo 2, más
arriba.

La electroforesis en gel de poliacrilamida y sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE) de la preparación de Rse-L purificada por afinidad mostró una banda ancha centrada en los 60 kDa en muestras no reducidas que se resolvió en condiciones reductoras en bandas cercanas de 65 a 68 kDa. Las fracciones se calentaron durante 10 min a 90º en tampón de muestra, se resolvieron en geles de poliacrilamida al 4-20% (Novex) y se visualizaron por tinción con plata. El eluído de Rse-IgG purificado por afinidad con Rse-L, se redujo con 25 mM DTT antes de la electroforesis.

La preparación de Rse-L se separó con SDS-PAGE en condiciones reductoras, se electrotransfirió y se secuenció. La transferencia se llevó a cabo en una membrana PSQ Millipore Immobilion durante 1 h con una corriente constante de 250 mA, en una unidad Biorad de transferencia transblot tal como se ha descrito (P. Matsudaira, J.Biol. Chem. 262:10035 [1987]). La membrana se tiñó con Azul de Comassie R-250 al 0,1% en metanol al 50% durante 30 s, se destiñó con ácido acético al 10% en metanol al 50% durante 2 ó 3 min, se lavó rápidamente con agua destilada, se secó y guardó a 4ºC. Se realizó una secuenciación automática de la proteína en los modelos 473A y 490A de Applied Biosystems Sequencers equipados con analizadores conectados a la red, PTH. Los picos se integraron con el programa Justice Innovation con un Nelson Analytical de 760 interfases. La interpretación de las secuencias se realizó tal como se ha descrito (Henzel y col., J. Chromatogr. 404:41 [1987]).

La preparación rindió una secuencia amino-terminal de XQVLIRRXRANTL [SEC ID NO:8], que correspondía con la proteína S bovina. Las secuencias de la proteína S se obtuvieron de preparaciones independientes de Rse-L. Después del SDS-PAGE, algunas preparaciones se caracterizaron por la presencia de especies de 14 kDa con una secuencia N-terminal de ANTL [SEC ID NO:9]; como ya se había descrito para la proteína S bovina, junto con especies de 60-70 kDa con secuencias que correspondían con el corte de la región del bucle sensible a la trombina en la proteína S bovina. Después del corte con CnBr, >99% de todos los residuos identificables del filtro de secuenciación se explicaron por una mezcla fragmentos CnBr de la proteína S. Además, la actividad Rse-L no pudo separarse de la proteína S por cromatografía de intercambio aniónico en presencia de Ca^{2+}, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de interacción cromatográfica, cromatografía de Sepharose Blue o electroforesis en gel no desnaturalizante. La actividad Rse-L presente en SBF y las fracciones purificadas pudieron neutralizarse con antisuero policlonal contra la proteína S.

El suero humano o la proteína recombinante humana S expresada en células 293 mostró baja actividad en KIRA o en ensayos de unión con Rse-IgG. El suero humano se obtuvo de Pierce y de bancos locales de sangre. La proteína humana S (Calbiochem, Enzyme Research Labs, o Celsus Labs) tiene una EC_{50} de >250 nM en el ensayo de unión a la membrana. En comparación, la proteína S bovina purificada tiene una E_{50} de 1,2 nM en este ensayo. En el ensayo KIRA, concentraciones tan altas como 150 nM de proteína S humana dieron como resultado una baja fosforilación de Rse. El cDNA de la proteína humana se obtuvo por PCR a partir de 1 \mug de cDNA humano fetal de hígado (Clontech) como molde y la polimerasa de DNA, Pfu (Stratagene) tal como se describió en Mark y col., (1992), supra. La proteína S humana se expresó en células 293 en crecimiento, en presencia de 2 \mug/ml de Vitamina K, exactamente como se ha descrito más arriba para la gas6 humana, y la expresión se verificó por marcaje metabólico de los cultivos y/o por transferencia de Western con un antisuero policlonal anti-proteína S. La proteína S humana purificada se une a ^{125}I-Rse-IgG, pero con una afinidad 200 veces de menor que la proteína S bovina purificada.

Se ha hipotetizado que un homólogo de la proteína S podría ser más efectivo. Una búsqueda en el banco de datos GENBANK reveló una similitud importante (una identidad de de secuencia aminoacídica del 44% y una estructura de dominios similar) entre la secuencia aminoacídica de la proteína S humana y el producto predicho para el gen 6 (gas6) humano específico para la detener el crecimiento (Manfioletti et al., supra).

Ejemplo 6 Producción recombinante de gas6

Se determinó si el gas6 humano era un ligando para Rse. Para ello se obtuvieron clones de cDNA de gas6 por la reacción en cadena de la polimerasa a partir del RNA de cerebro humano retrotranscrito. EL clon con la secuencia completa humana de gas6 se construyó uniendo los cDNAs codificantes de los aminoácidos 1-318 y 319-678. El cDNA de gas6 se obtuvo por PCR con 1 \mug del cDNA de cerebro humano fetal (Clontech) como molde para la polimerasa de DNA, Pfu, tal como se ha descrito (Mark et al., J Biol. Chem. 267:25166[1992]). Los cebadores diseñados, sentido de transcripción 5' y 3' para obtener los segmentos de hgas6 fueron:

(5'-GATATCGATCCATGGCCCCTTCGCTCTC [SEC ID NO:10];

5'-CATGGATCCTCCGGAAGTCAAACTCAGCTA [SEC ID NO:11])

y

(5'-GATATCGATGAGTGTGAAGTCCTTGTAC [SEC ID NO:12];

5'-GTCGGATCCGACAGAGACTGAGAAGCC [SEC ID NO: 13]),

respectivamente.

Células humanas de riñón 293 se transfectaron transitoriamente, tal como se describe en Mark y col., J. Bio. Chem. 267:26166(1992). Después de 4h de incubación, el medio se reemplazó con medio de crecimiento más antibióticos y 2 \mug/ml de Vitamina K. Las condiciones del marcaje metabólico con ^{35}S-Cys y ^{35}S-Met se describieron por Mark y col. Para la precipitación de proteínas de fusión IgG, en primer lugar se preclarificaron los sobrenadantes marcados radioactivamente con pansorbina (Calbiochem) durante 30 min a temperatura ambiente, después se incubaron con 10 \mug de proteína de fusión-IgG durante 4 h a 4ºC. Las proteínas de fusión se precipitaron con 20 \mul de pansorbina, los complejos se recogieron por centrifugación a 14.000 x g durante 1 min y después se lavaron 3 veces con PBS que contenía Tritón-X 100 al 0,1%. Los precipitados se analizaron por SDS-PAGE en condiciones reductoras (Capon y col., Nature 337:525 [1989]). La radioactividad retenida en el gel, una vez seco, se analizó con un Phosphomager de Fuji.

El medio condicionado de las células marcadas metabólicamente después de la transfección con un vector de expresión de gas6 que contenía la proteína de 70 kDa, que pudo ser precipitada selectivamente con la proteína de fusión Rse-IgG, pero no con la proteína de fusión control CD4-IgG. El medio condicionado de las transfecciones aumenta la unión de ^{125}I-Rse-IgG a las membranas e indujo la fosforilación del receptor Rse expresado en las células CHO. Estos resultados indicaron que la proteína gas6 recombinante humana se une y activa el receptor humano Rse.

Se purificó la proteína gas6 recombinante del medio condicionado mediante cromatografía de afinidad. Se transfectaron transitoriamente células 293 de riñón humano fetal transientoriamente, tal como se describe en Mark y col. (1992), supra. Al cabo de 4 h de incubación, el medio se substituyó por medio de crecimiento sin suero más antibióticos y 2 \mug/ml de Vitamina K. El medio condicionado se recogió al cabo de 2 y 4 días después de la transfección. El medio condicionado de las células transfectadas, pero no el de las no-transfectadas o las células 293 transfectadas con un blanco, activó la unión de ^{125}I-Rse-IgG. Un litro del medio condicionado se clarificó por centrifugación, se diluyó con 1 volumen de tampón A (TrisHCl 50 mM, pH 7,5, CHAPS al 0,1%, benzamidina 5 mM), y se aplicó a una columna de 6 ml Resource Q (Pharmacia) previamente equilibrado con el tampón A. La columna se eluyó con 12 volúmenes de columna de un gradiente de NaCl de 0 a 0,4 M en tampón A. Las fracciones activas se agruparon y diluyeron en 1 volumen de tampón A y se aplicaron a una columna de afinidad Rse-IgG que se lavó y desarrolló tal como se ha descrito (ver Ejemplo 5 de más arriba).

La identidad del gas6 recombinante se verificó por la secuencia amino terminal. La secuencia del material recombinante empieza con la secuencia ^{49}AFQVFEEA^{56} [SEC ID NO: 14]. La señal para los residuos del ácido glutámico en esta secuencia fue débil, consistente con la \gamma-carboxilación.

Una característica bien conocida de las proteínas que contienen Gla es su coprecipitación con sales insolubles de bario (Dahlbeck, Biochem J. 209:837[1979]); Discipio y Davie, Biochemistry 18:899 [1979]). Un ensayo basado en esta propiedad nos permitió analizar la unión de gas6 purificada con la proteína de fusión ^{125}I-Rse-IgG en ausencia de membranas celulares. Se combinaron muestras conteniendo varias diluciones de Rse-L en HEPES 25 mM pH 7,2 BSA al 0,1% y Tween-20 al 0,05% y se mezclaron con ^{125}I-Rse-IgG diluido en el mismo tampón en un volumen total de 100-120 ml. Después de 45 min de incubación a temperatura ambiente, 1 ml de suspensión de BaCl_{2} (10 mM) en tampón fosfato salino enfriado en hielo y preparado extemporáneamente se añadió a cada tubo y se precipitó y la radioactividad precipitable se recogió por centrifugación y aspiración del fluido sobrenadante. La constante de disociación para Rse-IgG y gas6 cuantificada de esta manera en el ensayo fue de 0.46 nM (Fig.5).

La proteína gas6 purificada estimuló la fosforilación de Rse de forma dependiente de la dosis. Un experimento en función del tiempo mostró que la fosforilación de Rse se induce en los dos minutos posteriores a la adición de gas6 purificada. La activación de la fosforilación de Rse se neutralizó con Rse-IgG pero no así con CD4-IgG.

Ejemplo 7 Expresión y caracterización de Gas6

Se investigó la expresión de gas6 y del receptor Rse en tejidos humanos de cerebro en adultos. Una transferencia que contenía 2 \mug de RNA poliadenilado de tejidos humanos de cerebro (Clontech) se hibridó con sondas marcadas por random-primed, que correspondían con los aminoácidos 1-420 de Rse y/o a los aminoácidos 358-605 de gas6,. Los tejidos empleados fueron amígdala, núcleo caudato, cuerpo calloso, hipocampo, hipotálamo, sustancia nigra, núcleo subtalámico y tálamo.

Consistente con la hipótesis de que gas6 podría ser un ligando para Rse, se halló que el mRNA de gas6 y Rse se coexpresaba en cada uno de estos tejidos humanos.

Los astrocitos, se ha descrito que los astrocitos sintetizan factores neurotróficos que favorecen el crecimiento y la supervivencia de las neuronas. Moetto et al., J. Neuropath & Exp. Neuro. 53:78 (1994) Y Lin y col. Science 260:1130(1993). Se determinó si los astrocitos de rata cultivados también sintetizaban un ligando para Rse. Se preparó una transferencia de Northern con 1 \mug de RNA poli-adenilado correspondiente a 1 día del período postnatal de las neuronas del hipocampo preparadas a partir de embriones E18 de rata. Los astrocitos se prepararon tal como se ha publicado (Banker y Goslin, Culturing Nerve Cells [MIT Press, Cambridge, 1991], pp 260-261) y se cultivaron en medio sin suero durante 1, 3, ó 5 días. Las neuronas del hipocampo se cultivaron en medio definido sin suero durante 0, 3 ó 4 días. La transferencia de Western se hibridó con una sonda marcada con ^{32}P que correspondía con los aminoácidos 1-460 de gas6 murino. A continuación, la membrana de la transferencia se deshibridó y se rehibridó con una sonda de actina marcada con ^{32}P para confirmar la integridad del RNA de las muestras.

El mRNA de gas6 se detectó en un cultivo de tipo1 de astrocitos de rata preparados en el día 1 del período postnatal, aunque no pudo detectarse en neuronas del hipocampo en el período E18.

Los resultados de la expresión de gas6 y de Rse obtenidos aquí y en otros trabajos se resumen en la tabla siguiente.

TABLA 3 Expresión de Gas6 y Rse en cultivos celulares primarios y en líneas celulares

4

Se investigó también la capacidad de los astrocitos cultivados de rata para sintetizar un ligando del receptor de Rse. Ver las leyendas de las figuras 6A-6C. Los medios condicionados de los astrocitos contenían el factor que se unía a ^{125}I-Rse-IgG (Fig. 6A) y estimulaba la fosforilación de las tirosinas de Rse (Fig. 6B). Esta actividad se neutralizó con Rse-IgG pero no con CD4 IgG (Fig. 6C).

Ejemplo 8 Variantes de gas6

Para mejor caracterizar las interacciones de gas6 con las membranas celulares y con Rse, se construyeron series de variantes por delección N-terminal que contenían la etiqueta epitópica.

Las secuencias codificantes de la secuencia señal de gD y la secuencia epitópica (Mark y col., [1992], supra) se fusionaron por una diana XhoI que se añadió por PCR a las secuencias codificantes inmediatamente antes del primer aminoácido de gas6 maduro (gD gas6: cebador sentido 5' de la transcripción: 5'-AGCTGCTCGAGGCGCTGTTGCCGG
CGC [SEC ID NO: 15], o proteína S (gD proteína S; cebador sentido 5' de la transcripción: 5'AGCTGCTCGAGG
CAAATTCTTTACTTGAA [SEC ID NO: 16], o aminoácidos 118 (gD gas6.118-C; cebador sentido 5' de la transcripción: 5'-AGCTGCTCGAGGACCAGTGCACGCCCAACC [SEC ID NO: 17] y 279 (gD gas6.279-C, cebador sentido 5' de la transcripción: 5'-GCTGCTCGAGGACATCTTGCCGTGCGTG [SEC ID NO: 18]) de gas6. El cebador de sentido 3' de la transcripción para gD.gas6 y gD.gas6.118-C fue: 5'-CATGGATCCTACCGGAAGTCAAACT
CAGCTA [SEC ID NO: 11]. Los cebadores de sentido 3' de transcripción para gD.gas6.279-C y gD.proteína S fueron 5'-GTCGGATCCGACAGAGACTGAGAAGCC- [SEC ID NO: 13] y 5'-CATTCATTTATGTCAAATTCA [SEC ID NO:19], respectivamente. Gas6.gD se construyó por unión de secuencias codificantes de gas6 con el extremo C-terminal de la etiqueta gD utilizada para Rse.gD por la diana NheI, que se añadió por PCR con los cebadores 5'-ATG
GAGATCAAGGTCTG [SEC ID NO:20] y 5'-CATCTTGAGGCTAGCGGCTGGCGGGCTCCAC [SEC ID NO:21]. Los polipéptidos se expresaron en células 293 mediante el procedimiento descrito para la secuencia completa de gas6 en el Ejemplo 6.

gD.gas6.118-C y gD.gas6.279-C, que contienen repeticiones EGF y dominios G en tándem en el dominio D, o sólo los dominios D, respectivamente, se precipitaron con Rse-IgG (Fig.7) procedente de sobrenadantes de cultivos celulares. La proteína S humana no precipitó en ese ensayo, lo que es consistente con las observaciones anteriores que indican una menor afinidad de la proteína S humana se por Rse con que la proteína gas6 humana. Estos derivados de gas6 que fueron truncados por el dominio Gla (es decir el dominio A) tampoco lograron asociarse con las membranas de forma dependiente de Ca^{2+}.

Estos resultados muestran que gas6 se une a Rse a través de dominios G, que lasactividades de unión a la membrana y unión a Rse son separables, y sugiere que el dominio Gla es necesario para la asociación dependiente de Ca^{2+} con las membranas celulares.

Las variantes de gas6 descritas en este ejemplo son activas funcionalmente. En particular, gD.gas6.118-C y gD.gas
6.279-C activaron la fosforilación de Rse en el ensayo KIRA descrito en el Ejemplo 4 de manera tan efectiva como la secuencia completa de gas6 etiquetado con gD (Fig. 7).

Ejemplo 9 Ensayo de proliferación con células de Schwann

En la línea celular Schwann de rata rhESC, que se deriva de la raíz del ganglio dorsal de ratas E14, se detectó el mRNA de Rse pero no el de gas6. La adición de gas6 purificado a estas células resultó en un incremento dependiente de la dosis del número de células (incremento del 50% en 48 horas) con un EC_{50} de \sim 0,3 nM (Fig. 8). El tratamiento con gas6 también alteró la morfología de estas células; las células sin tratar eran multipolares con numerosas prolongaciones, mientras que las células tratadas con gas6 se volvieron fusiformes con dos polos principales y alineadas en filas paralelas. Se demostró también que la proliferación inducida por gas6 se neutraliza con Rse-IgG pero no con CD4-IgG. Ver Fig. 9.

Mediante anticuerpos específicos contra Rse y Axl, los receptores tirosina quinasas Rse y Axl se detectaron también en células de Schwann humanas. Se determinó así mismo la capacidad de gas6 para aumentar la proliferación de las células de Schwann.

En la Escuela de Medicina la Universidad de Miami, se obtuvo tejido nervioso periférico, tal como se ha había descrito con anterioridad (Levi et al., J. Neuroscience 15(2):1329-1340 [1995]), con el consentimiento adecuado de los pacientes. Los trozos de fibras nerviosas periféricas se colocaron en una solución de Belzer UW y se enviaron a California. Una vez recibidas, las fibras nerviosas se lavaron con F12/DME (1:1) fresco y se incubaron con una solución de colagenasa/dispasa (Boehringer) al 1%, a 37ºC y durante 30 min. Después, el tejido se lavó ligeramente 3 veces, transfiriéndose a continuación a un nuevo medio de cultivo fresco. Las fibras se sembraron en placas de Petri de 100 mm en medio sin suero suplementado con la siguiente fórmula para las células de Schwann de rata; F12/DME (1:1) suplementado con insulina (10 \mug/ml), transferrina (10 \mug/ml), \alpha-tocopherol (5 \mug/ml), heregulina humana recombinante \beta_{177-244} producida según se describe en Holmes y col., Science, 256: 1205-1210 (1992) (10 nmol/l), forskolina (5 \mumolar), progesterona (3 X 10^{-8} molar) y extracto bovino de pituitaria (BPE) (3 \mul/ml). Las células de Schwann se cultivaron en suspensión durante 48 horas para permitir la desmielinización parcial. Después, las fibras nerviosas se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos y se resuspendieron y dispersaron por pipeteado minucioso.

Las células de Schwann dispersadas, se sembraron a 8x10^{3} células/pocillo en multiplacas de cultivo de tejidos de 48 pocillos recubiertas con laminina (Gibco BRL) y medio definido con adición de aprotinina (25 mg/ml) y 50 \mul/ml de lípidos definidos químicamente (Sigma Cat# 11905-015; Gibco BRL). Estos cultivos se denominaron como "cultivos primarios". El medio se cambió cada 5 días. Se obtuvieron cultivos confluentes de células de Schawnn puras a las 2 semanas. En el primer y segundo pase, las células se extrajeron de la placa con colagenasa/dispasa (Boerhinger Mannheim), se lavaron con el medio que contenía BSA al 3% y se sembraron, tal como se ha descrito. Los medios utilizados fueron el medio "6F": F12/DME (1:1) suplementado con insulina (10 \mug/ml), transferrina (10 \mug/ml), \alpha-tocopherol (5 \mug/ml), progesterona (3x10^{8} molar), aprotinina (25 ug/ml) y lípidos definidos químicamente (Sigma Cat # 11905-015; Gibco BRL). El medio "8F" contiene los suplementos del medio 6F así como la heregulina humana recombinante \beta_{177-244} (10 nmoles/l) y la forskolina (5 \muM). El efecto de gas6 en la supervivencia y proliferación de las células de Schwann se estudió mediante la adición de gas6 o la privación de ésta a cualquiera de estos medios de cultivo.

Gas6 estimula el crecimiento de las células de Schwann en cultivo de forma dependiente de la dosis (Fig. 12A) con un efecto significativo a 1 ng/ml (14 pM) y un efecto máximo con dosis superiores a 10 ng/ml. Gas6 sólo, produce un significativo aumento del número de células de Schwann en comparación con el medio de control. En presencia del activador del cAMP, la fosrkolina, el incremento en el número total de células con gas6 es más pronunciado. Un efecto sinergístico se observó también entre gas6 y la heregulina. Gas6 incrementó tanto el número como la incorporación de timidina en presencia de concentraciones preferentes de forskolina y heregulina (Fig. 12B).

En presencia de concentraciones preferentes de tanto foskolina como de heregulina, otros factores de crecimiento ya descritos por estimular el crecimiento de las células de Schwann, no tuvieron efecto (PDGF, FGF-\beta), o redujeron el número de células (IL-1\alpha y TGF-\beta1) (Fig. 12C). La adición de proteína S humana o bovina a 10 ng-5 \mug, no incrementa el número de células de Schwann al cabo de 5 días de cultivo. Por el contrario, gas6 a 30 \mug/ml incrementa al máximo el número de células. La combinación de gas6 con forskolina y heregulina resulta en un crecimiento celular máximo a los 5 días, un período comparable al que se observa cuando se combina 6F + forskolina + heregulina + SBF al 5%.

Gas6 tiene un marcado efecto en la morfología celular tal como se determina por las micrografías en contraste de fases de las células de Schwann humanas crecidas con 6F+heregulaina; 6F+heregulina+gas6; 8F+gas6; y 8F+ suero bovino fetal al 10%. Las micrografías se tomaron al cabo de 96 horas de cultivo. Las células de Schwann crecidas en presencia de gas6 tienen prolongaciones más largas que las descritas en las células crecidas en presencia de heregulina o heregulina con forskolina. También se observaron más claramente figuras mitóticas en los cultivos con 8F+gas6, incluso en aquellas células con la morfología fusiforme de células de Schwann completamente desarrollada. La adición de suero a los cultivos 8F altera la morfología de las células provocando que las células se aplanen, se extiendan y eventualmente, se vuelvan vacuoladas.

Las células se tiñeron por inmunofluorescencia con los marcadores GFPA y proteína S100 para células de Schwann. En resumen, las células de Schwann humanas en el pase 4 y crecidas en 8F+gas6 se cultivaron durante 24 horas en portaobjetos con cámara cubiertas de laminina y se fijaron con formalina al 10% en PBS. Las células fijadas se bloquearon con suero de cabra al 10% y se incubaron con anti-GFAP (ICN) de conejo y anti-proteína S-100 (ICN) a las diluciones recomendadas por el distribuidor. La unión específica del anticuerpo primario se tiñó con anticuerpo de cabra anti-IgG (Fab')_{2} deconejo con FITC. Las células se contratiñeron con el colorante de DNA, yoduro de propidio. Como controles negativos se utilizaron las células WI-38 que dan tinción negativa. Las células crecidas mostraron un 100% de tinción inmunofluorescente para los marcadores de células de Schwann, GFPA y proteína S100 después de 4 subcultivos.

Se investigó la capacidad de gas6 para estimular la proliferación celular en las células de Schwann humanas a través de los receptores Axl-Rse de la familia tirosín-quinasa. Las células de Schwann se estimularon con 0, 0.01, 0.1 ó 1 \mug/ml de gas6 humana (hgas6) durante 15 minutos en un incubador a 37ºC. Los lisados celulares se prepararon e inmunoprecipitaron con el anticuerpo de conejo anti-proteína de fusión hRseFc y el anticuerpo de conejo anti h-Axl. La fosforilación de tirosinas de los receptores hRse y hAxl se detectó con el anticuerpo antifosforilación 4G10. Se crecieron 10^{6} células de Schwann casi confluentes en medio definido (8F+gas6) y se cambiaron a 6F 24 horas antes del experimento. Las células se trataron con hgas6 recombinante purificada, durante 15 minutos en un incubador a 37ºC y se lisaron en hielo con 1 ml de tampón de lisis (HEPES 20 mM, pH 7.4, NaCl 135 mM, NaF 50 mM, vanadato de sodio 1 mM y molibdato de sodio 1 mM, EDTA 2mM y EGTA 2 mM, glicerol al 10%, NP40 al 1%, ácido okadaico 1 \muM, PMSF 1 mM y AEBSF 1 mM). Los lisados celulares se clarificaron por centrifugación a 14.000xg 4ºC durante 10 minutos. Las inmunoprecipitaciones se realizaron con 1 \mug del anticuerpo de conejo anti proteína de fusión h-RseFc o 2 \mul de antisuero de conejo anti-hAxl, un antisuero dirigido contra los 10 aminoácidos del COOH-terminal de hAxl a 4ºC durante 2 h. El inmunocomplejo se recogió con 10 \mul de bolas (perlas) de Proteína A Sepharose CL-4B. Las proteínas se separaron en un en gel de gradiente Novex al 4-12% y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. A continuación se realizaron las inmunotransferencias con antifosforotirosina utilizando el anticuerpo de ratón anti-fosforotirosina 4G10 (UBI), el anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con peroxidase rábano y se reveló con el equipo ECL (Amersham). La adición del gas6 humano a las células de Schwann causa autofosforilación de ambos receptores, Axl y Rse, en sus residuos de tirosina. La activación de Axl y Rse pudo detectarse con gas6 a 1,4-14 \muM. Esta fosforilación de Axl y Rse no se observó en los cultivos estimulados con heregulina. La expresión de gas6 en las células de Schwann de rata en cultivo no se detectó por transferencia de Northern. Además, no se observó actividad gas6 en el medio condicionado de las células de Schwann de rata. Es posible que gas6 se produzca por los axones en crecimiento o por los fibroblastos cercanos (en los que gas6 se clonó inicialmente). Esta activación de los receptores Axl-Rse en células de Schwann por gas6 es altamente específico, ya que factores de crecimiento que se conoce actúan vía otros receptores tirosina quinasa, como el PDGF y el FGF, no aumentan la proliferación celular de las células de Schwann en estas condiciones definidas. Los factores de crecimiento de las células de Schwann, GGF/heregulina, que actúan de manera independiente a través de la familia de receptores erbB, sinergizan con gas6 en este estudio.

Resulta beneficioso tener diferentes poblaciones de células de Schwann de mamíferos (preferentemente células de Schwann humanas) para su utilización como prótesis celulares, o para el transplante en las áreas lesionadas de la médula espinal para intentar la regeneración de axones centrales interrumpidos y ayudar en la reparación de lesiones de nervios periféricos y como alternativa a los autoinjertos múltiples. Ver Levi et al., J. Neuroscience 14(3): 1309-1319 (1994). El uso de técnicas de cultivo celular para obtener una fuente abundante de material para el injerto autólogo partiendo de una pequeña biopsia, ya ha conocido un gran éxito clínico en el suministro de células epiteliales humanas para cubrir extensas quemaduras (Gallico et al., N. Eng.J. Med., 311:338-451 [1984]). Más aún, se ha demostrado que las células de Schwann de xenoinjertos son capaces de remielinizar y regenerar los axones periféricos de un ratón que haya sido inmunosuprimido (Aguayo y col., Nature 268:753-755 [1977], y Aguayo et al., Soc. Neurosci. Symp. 4:361-383 [1979]). En este sentido, es de esperar que este último enfoque tenga éxito en mamíferos, incluyendo los humanos.

Ejemplo 10 Inmunoadhesina de gas 6

La construcción gD.gas6.279-C.IgG se generó por fusión de las secuencias codificantes de gD.gas6.279-C (ver Ejemplo 8) con los aminoácidos 216-443 de la IgG\gamma humana a través de un engarce BstEII (añadiendo los aminoácidos Val y Thr). El engarce se añadió a las secuencias gD.gas.6.279-C mediante PCR con los cebadores 5'-ATGGAGATCAAGGTCTG [SEC ID NO:20] y 5'-GTCGGTGACCGCTGCTGCGGGCTCCAC [SEC ID NO: 22].

Con la inmunoadhesina de gas6 formada se realizó un ensayo KIRA según se describe en el Ejemplo 4 más arriba. En resumen, se analizaron en un ensayo KIRA diferentes diluciones de medios condicionados de células que expresaban de manera transiente gD.gas6.279-C.IgG. El material de partida tenía una concentración de gD.gas6.279-C.IgG de \sim230 ng/ml. La EC_{50} para la activación aproximadamente de 0,4 nM. Ver Fig. 10. No se observó actividad en medios condicionados de líneas celulares control transfectadas transitoriamente.

Ejemplo 11 Activación de Rse por gas6 no \gamma carboxilado

Los medios (700 ml) condicionados de 3 días de células 293 transfectadas con gas6 humano (hgas6.17) se dializaron en 2 x 8 l de Tris-HCl 50 mM pH 7,5, benzamidina 5 mM (tampón A). Al producto dializado se añadió CHAPS al 0,1% y se cargó en una columna Resource-Q (Pharmacia) de 6 ml a 10 ml/minuto. La columna se lavó con el tampón A, y se eluyó con 70 ml de un gradiente lineal de 0 a 0,4 M NaCl en tampón A, a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min, recogiéndose fracciones de 2,0 ml.

Las fracciones se analizaron por su capacidad para unirse y activar Rse mediante el procedimiento de unión del cloruro de bario, descrito en el Ejemplo 6 y el ensayo KIRA descrito en el Ejemplo 4. El ensayo del cloruro de bario sólo pudo detectar la unión de los Gla contenidos en los ligandos de Rse, mientras que el ensayo KIRA es sensible a todos los activadores de Rsa. La actividad de unión se centró en la fracción 31, mientras que el KIRA mostró un pico temprano adicional que eluyó centrado en la fracción 24.

Se analizaron alícuotas (10 ml) de las fracciones del 20 al 44 en geles (Novex) de acrilamida al 8% y SDS y las proteínas se visualizaron por tinción con plata. En esas fracciones, una banda de 75 kDa co-migró con el hgas6 estándar. Las intensidades integradas de la banda de 75 kDa se cuantificaron en un escáner de láser (Molecular Dynamics) y un analizador de imágenes (NIH Image). Las intensidades de los picos que se encontraron en las fracciones 24 a 31, correspondieron con las 2 regiones de actividad KIRA. La cantidad de hgas6 en cada fracción se estimó a partir de la intensidad de tinción de una cantidad conocida (0,34 \mug) de una preparación estándar de hgas6 migrada en el mismo gel, asumiendo una relación lineal entre la intensidad de la tinción y la carga de la proteína.

El análisis por secuenciación de las bandas de 75 kD de las fracciones 24 a 31 se realizó después de la electroforesis en SDS-PAGE y electrotransferencia a membranas de PVDF. La secuencia amino terminal de las dos bandas se identificó sin ambigüedad como la de hgas6 (AFQVF), pero las dos podrían diferenciarse por la presencia o ausencia de residuos de ácido glutámico modificado en los últimos ciclos. La secuencia de la fracción 31 perdió una señal del ácido glutámico en los ciclos 6, 7, 14 y 16, consistente con la modificación \gamma-carboxil de estos residuos. La secuencia de la fracción 24 fue consistente con el ácido glutámico sin modificación en todas estas posiciones.

Tanto el análisis de secuencia como el comportamiento de la unión del eluido temprano de la forma hgas6 son consistentes con su identificación como una forma no modificada de hgas6, carente de la modificación \gamma-carboxil del ácido glutámico característica. Esta segunda forma descubierta del hgas6 recombinante parece ser más activa que la primera forma descrita que contenía Gla. La actividad específica de las dos formas se calculó a partir de los resultados del KIRA en la Fig. 1 y de la cuantificación densitométrica de hgas6. La actividad específica de la fracción 31 (forma 1) es 1170 unidades KIRA/mg P, mientras que la de la fracción 24 (forma 2) es de 3158. Esto indica que la forma 2, carente de la modificación de Gla, es más potente en activar a Rse que la que contiene la forma 1 de Gla.

Ejemplo 12 Activación del receptor de Mer por gas6

Se obtuvo un cDNA codificante del Mer humano analizando una librería de cDNA de testículo humano preparado en lambda DR2 (Clontech, Palo Alto CA) con las sondas de oligonucleotídicas siguientes:

5'-GAAATTACAGATCCGCAGCCCCGGGATGGGGCCGGCCCCGCTGCCGCTGC [SEC ID NO:23],

5'-CCTTGGATTCTAGCAAGCACGACTGAAGGAGCCCCATCAGTAGCACCTTT [SEC ID NO: 24]

5'-TCTTAAAATTAAGCTTCAGCTGCTCCTTGATATTAACCTTTGTACAGAGT-3'[SEC ID NO: 25]

Se purificaron los fagos positivos y se determinó el tamaño de los insertos. Tres clones solapantes hMer.cl4, hMer.c25, hMer.c16, (correspondientes respectivamente con los nucleótidos 1-561, 223-2025, y 1902-3608 de la secuencia publicada, se combinaron para obtener un cDNA codificante de la secuencia completa en la misma pauta de lectura que el Mer humano.

Se construyó Mer-Fc por fusión de la secuencia codificante de los aminoácidos 1-499 del Mer humano con los aminoácidos 216-443 de la IgG\gamma1 humana a por el engarce Narl-BstEII (5'-GCGCCTGGCAACGCG-3'[SEC ID NO: 26], 5'-GTGACCGCGTTGCCAG-3' [SEC ID NO: 27]) (añadiendo los aminoácidos glicina e histidina). Las células embrionales de riñón humano (HEK) 293 que expresan Mer-Fc se seleccionaron con un ELISA específico para un Fc humano. El Mer-Fc se purificó en una columna de proteína A- Sepharose (Pharmacia).

El gD.Mer etiquetado epitópicamente se construyó por fusión de las secuencias codificante de los aminoácidos 1-53 de la glicoproteína D (gD) del virus herpes simplex de tipo 1 (HSV) con las secuencias codificantes de los aminoácidos 36-961 del Mer humano. Ver ejemplo 3 anterior. Los oligos (5'-CGAATTCCTCGAGCCGGGACCTTTTCCAGG
GAGC-3'[SEC ID NO: 28] y 5'-CCAACTGTGTGTTTGAAGGCAAGAGGCGG-3'[SEC ID NO: 29] se utilizaron para añadir una diana XhoI al cDNA de Mer humano, por PCR. El cDNA de gD.Mer se insertó en un vector de expresión derivado de CMV y se transfectaron las células HEK 293, se seleccionaron, se analizaron por transferencia de Western y las células se clasificaron por un seleccionador activado por fluorescencia, tal como se describió más arriba en el Ejemplo 3.

La proteína gas6 humana recombinante y la Proteína S se expresaron tal como se describió en Godowski et al., Cell 82:355-358(1995). La expresión se verificó por marcaje metabólico de los cultivos con ^{35}S-Cys y ^{35}S-Met (Mark et al., J Biol. Chem. 267:26166(1992)y/o por transferencia de Western con un antisuero de conejo policlonal anti-gas6 o anti Proteína S (Sigma). Se construyeron versiones etiquetadas en el extremo N-terminal de la Proteína S o de gas6, tal como se describe en Godowski y col.; (1995) supra.

Los procedimientos para detectar la fosforilación de Rse con el ELISA KIRA y el análisis por transferencia de Western con anticuerpos anti-fosfotirosina se han descrito en los Ejemplos 3 y 4. Para los experimentos de neutralización, se trataron fuentes de ligandos potencial a temperatura ambiente durante 30 minutos con la proteína de fusión indicada antes de añadirse a las células. Para analizar la capacidad de los ligandos potenciales para inducir la fosforilación de gD.Mer, se sembraron 500.000 células en una placa de 60 mm en presencia de suero durante 6 h. Después, las células se lavaron dos veces con PBS y se privaron de suero durante 16 h. Los ligandos potenciales se añadieron a las células y se inmunoprecipitó el gD.Mer de los lisados con 5B6. Se analizaron en SDS-PAGE en condiciones reductoras y se transfirieron a una membrana, hibridándose a continuación con el anticuerpo anti-fosfotirosina (4G10).

Para la unión de Rse-Fc, Axl-Fc, y Mer-Fc, los medios condicionantes que contenían 5-10 nM de gas6 o de proteína S se preclarificaron con proteína A- Sepharose (Calbiochem) durante 30 minutos a temperatura ambiente, después se incubaron con 5 \mug de la proteína de fusión Fc-receptor durante 4 h a 4ºC. Las proteínas de fusión se inmunoprecipitaron con 20 \mul de proteína A Sepharose y los complejos se recogieron por centrifugación a 14.000 x g durante 1 min, y después se lavaron 3 veces con PBS que contenía Tritón X-100 al 0,1%. Los precipitados se analizaron en SDS-PAGE en condiciones reductoras. Las transferencias de Western de los geles de SDS-PAGE se analizaron con el anticuerpo 5B6.

El análisis de interacción proteica con instrumentos BlAcore^{TM} se realizó con Mer-Fc acoplado a chips sensores BlAcore CM5 utilizando gas6 purificado y Proteína S. Para los experimentos de neutralización, 5 \mug de Mer-Fc como CD4-Fc se mezclaron con gas6 durante 30 min a temperatura ambiente antes de la inyección en el chip. Se analizaron los sensogramas con el programa de evaluación BlA 2.1 de Pharmacia Biosensor AB. La velocidad de las constantes de disociación aparentes (kd) y la velocidad de las constantes de asociación (ka) se obtuvieron evaluando el sensograma con el ajuste de tipo 1 A+B=AB. La constante de disociación K_{d} se calculó como kd/ka.

Resultados

La capacidad de Mer-Fc para neutralizar la fosforilación de Rse inducida por gas6 se investigó en ensayos KIRA basados en ELISA. La activación de Rse por gas6 se bloqueó con Rse-Fc y Mer-Fc de forma dependiente de la dosis (Fig. 14). La neutralización resultó específica para Rse-Fc y Mer-Fc, mientras la proteína de control CD4-Fc no inhibió en ese ensayo. Rse-Fc fue algo más potente que Mer-FC en neutralizar gas6. Estos resultados sugieren que Mer-Fc, al igual que Rse-Fc, bloquea la activación de Rse al unirse a gas6.

La capacidad de Axl-Fc, Rse-Fc y mer-Fc para unirse directamente a gas6 se determinó con la utilización de un ensayo de co-precipitación. Se determinó también, la capacidad de éstos receptores para unirse a la Proteína S. Para permitir una comparación más cuantitativa de sus propiedades de unión, se emplearon versiones de gas6 y Proteína S que contenían etiquetas epitópicas. Los medios condicionados de células que expresaban el gas6 o la Proteína S etiquetados epitópicamente se incubaron con cada uno de los tipos de proteína de fusión del receptor. Las proteínas de fusión Fc y las proteínas unidas a ellas, se recuperaron con proteína A y se lavaron extensamente. Las proteínas etiquetadas que se unieron a las proteínas de fusión Fc se revelaron por transferencia de Western y se detectaron con un anticuerpo dirigido contra la etiqueta epitópica. Tanto Axl-FC como Rse-Fc se unieron a gas6 pero no a la Proteína S. Un resultado idéntico se observó con Mer-Fc. La unión fue específica y ni la proteína gas6 ni la Proteína S se unieron al control CD4-Fc.

La cinética de la interacción de gas6 con los dominios extracelulares de Mer y Rse se comparó utilizando un instrumento BlAcore. Mer-Fc se inmovilizó en un chip biosensor, y se pasaron diversas concentraciones de gas6. Un sensograma representativo de este experimento se muestra en la Fig. 15A. No se observó unión con la Proteína S, la unión de gas6 a Mer-Fc inmovilizado en un chip se bloqueó con Mer-Fc soluble, pero no CD4-Fc (Fig. 15). La constante de disociación (K_{d}) para la interacción de gas6 con Mer-Fc fue de 6 nM. La K_{d} para la unión de gas6 a Rse-Fc fue de 4,2 nM. Las células HEK 293 se transfectaron con un vector de expresión codificante de una versión de Mer que contenía una etiqueta epitópica aminoterminal. Una línea celular candidata (denominada 293.gD.Mer) que expresaba gD.Mer se identificó por separación de células activado por fluorescencia utilizando el anticuerpo 5B6, un anticuerpo monoclonal que reconoce la etiqueta epitópica. La incubación de estas células con el anticuerpo 5B6 resultó en una fosforilación rápida de proteínas nuevas de aproximadamente 180 y 200 kDa, ausente en el control, célula no transfectadas HEK 293. No se observó fosforilación del receptor cuando las células se incubaron con un anticuerpo control. Estos resultados indican que Mer codifica para una tirosina quinasa funcional.

Se investigó la capacidad de la proteína gas6 humana y de la Proteína S para activar la actividad quinasa de Mer. Mer no se fosforiló cuando estas células se trataron con Proteína S. Sin embargo, la fosforilación del receptor se detectó en células tratadas con gas6. Un experimento en función del tiempo, demostró que Mer se fosforilaba minutos después de la adición de gas6 y la fosforilación podía detectarse después de la estimulación de las células con gas6 a una concentración de 1-3 nM.

Se determinó la capacidad de gas6 para inducir la fosforilación de Mer expresada endógenamente. El mRNA de Mer se detectó en una línea celular de leucemia monocítica THP-1 por transcripción inversa y PCR. Con un anticuerpo policlonal dirigido contra el dominio extracelular de Mer, pudo confirmarse la expresión de Mer en la superficie de las células THP-1. El tratamiento de dichas células con gas6 indujo la fosforilación rápida de la proteína de 180 kDa que se inmunoprecipitó con anticuerpos para Mer. Estas observaciones demuestran que gas6 es un ligando funcional para Mer.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Genentech, Inc.

\hskip3.9cm

Chen, Jian

\hskip3.9cm

Godowski, Paul J.

\hskip3.9cm

Hammonds, R. Glenn

\hskip3.9cm

Mark, Melanie

\hskip3.9cm

Mather, Jennie P.

\hskip3.9cm

Li, Ronghao

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ACTIVACIÓN DEL RECEPTOR POR GAS6

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 29

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A)

DIRECCIÓN: Genentech, Inc.

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(B)

CALLE: 460, Point San Bruno Blvd

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(C)

CIUDAD: South San Francisco

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(D)

ESTADO: California

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(E)

PAÍS: USA

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 94080

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(v)

FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO MEDIO: disco blando de 1,44 Mb, 3,5 pulgadas

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO:PC-DOS/MS/DOS

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(D)

SOFTWARE: WinPatin (Genentech)

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(vi)

FECHA ACTUAL DE SOLICITUD:

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(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD:

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(B)

FECHA DE SOLICITUD:

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

FECHA ANTERIOR DE SOLICITUD:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/402253

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(B)

FECHA DE SOLICITUD: 3/10/95

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(vii)

FECHA ANTERIOR DE SOLICITUD:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/438861

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(B)

FECHA DE SOLICITUD: 5/10/95

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(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL AGENTE/GESTOR DE PATENTES:

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(A)

NOMBRE: Lee, Wendy M.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 00.000

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(c)

NÚMERO DE REFERENCIA/SUMARIO: P0929P2PCT

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(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

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(A)

TELEFONO: 415/225-1994

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(B)

TELEFAX; 415/952-9881

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(c)

TELEX.910/371-7168

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:1

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 673 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC IDE Nº 1:

5

6

7

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:2

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(i)

CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 678 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC IDE Nº 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

80

8

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:3

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 676 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC IDE Nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

13

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:4

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC IDE Nº 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCAAGACAAT GGAACCCAGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:5

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC IDE Nº 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATGGAATTC GGTGACCGAT GTGCGGCTGT GAGGAG

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:6

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 95 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC IDE Nº 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCAAGGGCTA CTGCCACACT CGAGCTGCGC AGATGCTAGC CTCAAGATGG

\hfill

50

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGATCCAAA TCGATTCCGC GGCAAAGATC TTCCGGTCCT GTAGA

\hfill

95

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:7

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 103 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC IDE Nº 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTTCTACA GGACCGGAAG ATCTTTGCCG CGGAATCGAT TTGGATCAGC

\hfill

50

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATCTTGAGG CTAGCATCTG CGCAGCTCGA GTGTGGCAGT AGCCCTTGCT

\hfill

100

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCA

\hfill

103

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:8

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC IDE Nº 8:

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:9

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC IDE Nº 9:

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:10

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC IDE Nº 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATATCGATC CATGGCCCCT TCGCTCTC

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:11

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC IDE Nº 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATGGATCCT ACCGGAAGTC AAACTCAGCT A

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:12

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC IDE Nº 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATATCGATG AGTGTGAAGT CCTTGTAC

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:13

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC IDE Nº 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCGGATCCG ACAGAGACTG AGAAGCC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:14

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC IDE Nº 14:

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:15

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC IDE Nº 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTGCTCGA GGCGCTGTTG CCGGCGC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:16

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC IDE Nº 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTGCTCGA GGCAAATTCT TTACTTGAA

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:17

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC IDE Nº 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTGCTCGA GGACCAGTGC ACGCCCAACC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:18

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC IDE Nº 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTGCTCGAG GACATCTTGC CGTGCGTG

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:19

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC IDE Nº 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATTCATTTA TGTCAAATTC A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:20

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC IDE Nº 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGGAGATCA AGGTCTG

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:21

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC IDE Nº 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATCTTGAGG CTAGCGGCTG CGGCGGGCTC CAC

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:22

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC IDE Nº 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCGGTGACC GCTGCTGCGG GCTCCAC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:23

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 50 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC IDE Nº 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAATTACAG ATCCGCAGCC CCGGGATGGG GCCGGCCCCG CTGCCGCTGC

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:24

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 50 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC IDE Nº 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTTGGATTC TAGCAAGCAC GACTGAAGGA GCCCCATCAG TAGCACCTTT

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:25

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 50 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC IDE Nº 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTTAAAATT AAGCTTCAGC TGCTCCTTGA TATTAACCTT TGTACAGAGT

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:26

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC IDE Nº 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGCCTGGCA ACGCG

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:27

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC IDE Nº 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGACCGCGT TGCCAG

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:28

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC IDE Nº 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGAATTCCTC GAGCCGGGAC CTTTTCCAGG GAGC

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:29

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCAACTGTGT GTTTGAAGGC AAGAGGCGG

\hfill

29

Claims (25)

1. Variante del polipéptido gas6 que carece de uno o más residuos de ácido glutámico del dominio A de gas6 nativo, o de un fragmento del mismo, en donde la variante o el fragmento comparte por lo menos un 75% de identidad de secuencia aminoacídica con el gas6 nativo y maduro que tiene la secuencia aminoacídica mostrada en la Figura 2, y es capaz de activar el receptor Rse y/o el receptor Mer y/o promover la proliferación, la supervivencia y/o la diferenciación de células que contienen el receptor Rse o Mer.

2. Variante de gas6 de la reivindicación 1, que carece del dominio A de gas6 nativo.

3. Variante de gas6 de la reivindicación 2, la cual es el dominio D de gas6.

4. Variante de gas6 de la reivindicación 2, que comprende los dominios G tal como se muestran en la Fig.2 de
gas6.

5. Variante de gas6 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que se deriva de gas6 humano.

6. Composición que comprende la variante de gas6 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un vehículo fisiológicamente aceptable.

7. Ácido nucleico que codifica la variante de gas6 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

8. Vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 7.

9. Célula hospedadora que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 7.

10. Procedimiento para generar un polipéptido gas6 que comprende el cultivo de una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 9 para expresar el ácido nucleico y la recuperación de la variante de gas6 del cultivo de células.

11. Procedimiento in vitro de activación del receptor Rse que comprende la etapa de exposición de una célula que comprende el receptor Rse con el polipéptido gas6 exógeno en una cantidad efectiva para activar el receptor Rse, en donde el polipéptido gas6 es la variante gas6 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la variante de gas6 no está esencialmente \gamma-carboxilada.

13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12, en donde la variante de gas6 comprende una inmunoadhesina.

14. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en donde la célula es una célula glía.

15. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la célula glía es una célula de Schwann.

16. Procedimiento in vitro para aumentar la supervivencia, la proliferación o la diferenciación de una célula que contiene el receptor Rse; comprendiendo dicho procedimiento la etapa de exposición de la célula al polipéptido gas6 exógeno en una cantidad efectiva para aumentar la supervivencia, la proliferación o la diferenciación de la célula y en donde el polipéptido gas6 es la variante de gas6 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

17. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la célula es una célula humana.

18. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16 o la reivindicación 17, que comprende aumentar la proliferación de la célula.

19. Procedimiento in vitro de activación del receptor Mer que comprende la etapa de exposición de una célula que contiene el receptor Mer a un polipéptido gas6 exógeno en una cantidad efectiva para activar el receptor Mer, y en donde el polipéptido gas6 es la variante de gas6 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

20. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19, en donde la célula es una célula mononuclear.

21. Procedimiento in vitro para aumentar la supervivencia, la proliferación o la diferenciación de una célula que comprende el receptor Mer, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de exposición de la célula a un polipéptido gas6 exógeno en una cantidad efectiva para aumentar la supervivencia, la proliferación o la diferenciación de la célula, y en donde el polipéptido gas6 es la variante de gas6 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

22. Polipéptido variante de gas6 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para utilizar en un procedimiento de tratamiento médico.

23. Utilización de un polipéptido variante de gas6 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la preparación de un medicamento destinado a la activación del receptor Rse o Mer de una célula.

24. Utilización de un polipéptido variante de gas6 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la preparación de un medicamento destinado al aumento de la supervivencia, la proliferación o la diferenciación de una célula que contiene el receptor Rse o el Mer.

25. Utilización de acuerdo con la reivindicación 23 o la reivindicación 24, en donde la célula se selecciona entre una célula glía, una célula neuronal, una célula hematopoyética, una célula mononuclear o células de los testículos, ovario, próstata, pulmón o riñón.