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KR20040097214A - 악티노마듀라에 의한 컴팩틴의 프라바스타틴으로의 전환방법 - Google Patents

악티노마듀라에 의한 컴팩틴의 프라바스타틴으로의 전환방법 Download PDF

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KR20040097214A
KR20040097214A KR10-2004-7015109A KR20047015109A KR20040097214A KR 20040097214 A KR20040097214 A KR 20040097214A KR 20047015109 A KR20047015109 A KR 20047015109A KR 20040097214 A KR20040097214 A KR 20040097214A
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KR
South Korea
Prior art keywords
compactin
pravastatin
actinomadura
cell
hydroxylase
Prior art date
Application number
KR10-2004-7015109A
Other languages
English (en)
Inventor
아놀드 엘. 드망
유린 펭
야곱 야쉬페
조셉 데이비스
Original Assignee
매사츄세츠 인스티튜트 오브 테크놀러지
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 매사츄세츠 인스티튜트 오브 테크놀러지 filed Critical 매사츄세츠 인스티튜트 오브 테크놀러지
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Abstract

본 발명은 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시키는 방법에 관한 것이다. 컴팩틴이 제공되며, 이는 악티노마듀라로부터 얻어진 제와, 제가 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시키는 조건하에서 접촉된다. 또한, 본 발명은 악티노마듀라 균주, 악티노마듀라 무세포 추출물, 악티노마듀라 히드록실라아제, 및 포유동물에서 콜레스테롤을 저하시키는 방법을 제공한다.

Description

악티노마듀라에 의한 컴팩틴의 프라바스타틴으로의 전환방법 {CONVERSION OF COMPACTIN TO PRAVASTATIN BY ACTINOMADURA}
본 발명은 섬유상 세균 악티노마듀라(Actinomadura)로부터 얻어진 물질을 사용하여 컴팩틴(compactin)을 프라바스타틴(pravastatin)으로 전환시키는 방법, 포유동물내 콜레스테롤 수준을 감소시키는 방법 및 악티노마듀라와 악티노마듀라 히드록실라아제에 관한 것이다.
동맥경화증 및 관상동맥 질환의 주요 원인 중 하나는 높은 혈중 콜레스테롤 수준 때문이다. 전체 신체 콜레스테롤의 약 50% 이상이 새로운 콜레스테롤 합성으로부터 얻어지는 것으로 추정되고 있다. 콜레스테롤 생합성 경로에서의 주요 속도제한 단계는 3-히드록시-3-메틸글루타릴(HMG)-CoA 환원효소에 의해 촉진된다. 컴팩틴 및 프라바스타틴은 HMG-CoA 환원효소의 경쟁적인 억제제인 것으로 보고되어 있으며, 그 중 하나가 존재하면 콜레스테롤 생합성을 억제할 수 있다.
미생물에 의한 컴팩틴의 수산화에 의하면 수산화된 형태의 컴팩틴, 예를 들면 프라바스타틴을 제조할 수 있다. 보고된 바에 따르면, 몇가지 수산화된 형태가 HMG-CoA의 경쟁적인 억제제로서 컴팩틴보다 효과적이다. 상기 수산화는 다양한 속(genus)의 진균류에 의해 다른 정도로 달성될 수 있으며, 세균류 노카르디아(Nocardia) 및 스트렙토미세스 로세오크로모지너스(Streptomyces roseochromogenus) 및 스트렙토미세스 카르보필루스(Streptomyces carbophilus)로부터도 달성될 수 있다[참조: 미국 특허 제5,179,013호; 미국 특허 제4,448,979호; 미국특허 제4,346,227호; 미국 특허 제4,537,859호; 캐나다 특허 제1,150,170호; 캐나다 특허 제1,186,647호; Serizawa et al., J. Antibiotics, 36:887-891(1983)].
프라바스타틴의 제조에 진균류를 사용하는데 있어서 문제점은 그들이 일반적으로 배양 배지에 첨가되는 컴팩틴 양의 증가를 견딜 수 없다는 것인데, 그 이유는 아마도 컴팩틴의 항진균 활성 때문이다[참조: Serizawa et al., J. Antibiotics, 36:887-891(1983)].
시토크롬 P450 시스템이 스트렙토마이세스 카르보필루스에서 컴팩틴의 프라바스타틴으로의 수산화를 위해 필요한 것으로 보고되어 있다[참조: Matsuoka et al., Eur. J. Biochem., 184:707-713(1989)]. 그러한 효소를 사용하는데 있어서의 문제점은 그것이 단일 단백질이 아니라 단백질의 복합체이어서 재조합 DNA 조작을 어렵게 하고, 시토크롬 P450 시스템의 유도인자인 컴팩틴이 매우 고가라는 것이다.
본 발명은 유도인자로서 컴팩틴을 필요로 하지 않고, 컴팩틴 양의 증가를 견딜 수 있는 악티노마듀라 구성 히드록실라아제를 사용하여, 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시키는 방법 및 이러한 방법에 사용되는 악티노마듀라 구성 히드록실라아제를 제공하고자 한다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 효과적이고 비교적 저렴한 컴팩틴의 프라바스타틴으로의 전환방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 섬유상 세균인 악티노마듀라(Acinomadura)를 사용하여, 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시키는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 악티노마듀라 히드록실라아제를 사용하여, 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시키는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 유도인자로서 컴팩틴을 필요로 하지 않는 악티노마듀라 구성 히드록실라아제를 사용하여, 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시키는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시키는 악티노마듀라 히드록실라아제로부터 얻어진 프라바스타틴을 사용하여, 포유동물의 혈중 콜레스테롤 수준을 감소시키기 위하여 포유동물을 치료하는 것이다.
본 발명에 따르면, 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시키는 방법이 제공된다.
컴팩틴(compactin)이 제공되어, 악티노마듀라(Actinomadura)로부터 얻어진 제, 예를 들면 수산화 효소, 예를 들면, 구성적이고 시토크롬 P450 시스템 비의존성인 히드록실라아제와, 이러한 제가 컴팩틴을 프라바스타틴(pravastatin)으로 전환시키는 조건에서 접촉된다. 어떤 구체예에서는, 프라바스타틴이 단리된다.
바람직하게는, 컴팩틴은 예를 들면 컴팩틴을 생성하는 미생물, 예를 들면 진균 또는 세균, 또는 컴팩틴을 생성하는 미생물의 무세포 추출물, 또는 컴팩틴을 생성하는 미생물의 예비생장된 배양물로부터의 무세포 배양 배지, 또는 컴팩틴을 포함하는 용액, 또는 반정제된 컴팩틴, 또는 실질적으로 정제된 컴팩틴을 제공함으로써 제공된다.
어떤 구체예에서, 컴팩틴은 예를 들면, 악티노마듀라의 전세포와 컴팩틴을 접촉시키거나, 악티노마듀라의 무세포 추출물과 컴팩틴을 접촉시키거나, 악티노마듀라의 예비생장된 배양물로부터의 무세포 배양 배지와 컴팩틴을 접촉시키거나, 악티노마듀라 제를 포함하는 용액과 컴팩틴을 접촉시키거나, 반정제되거나 거의 정제된 악티노마듀라 제와 컴팩틴을 접촉시킴으로써 제와 접촉된다.
예를 들면, 컴팩틴을 생성하는 미생물의 배양물, 예를 들면 예비생장된 배양물 또는 초기 배양물, 또는 무세포 추출물, 또는 반정제되거나 거의 정제된 컴팩틴을 예를 들면, 악티노마듀라의 배양물, 예를 들면 예비생장된 배양물 또는 초기 배양물, 또는 무세포 추출물, 또는 반정제되거나 거의 정제된 악티노마듀라 제와 접촉시키는 변형이 가능하다.
본 발명의 또 다른 면은 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시키는 물질, 예를 들면 히드록실라아제를 포함하는 악티노마듀라로부터 얻어진 무세포 추출물이다.
본 발명의 또 다른 면은 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시키는 악티노마듀라로부터의 히드록실라아제, 예를 들면 반정제되거나 실질적으로 정제된 히드록실라아제인데, 히드록실라아제는 구성 효소이고, 히드록실라아제의 활성은 ATP, 아스코르브산 및 Mg2+중의 어떤 것에 의해서도 촉진되나, Fe2+또는 Fe3+에 의해서는 촉진되지 않으며, 히드록실라아제는 시토크롬 P450 시스템 비의존성이다.
본 발명의 또 다른 면은 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시키기 위한 물질을 갖는 정제된 악티노마듀라 ATCC 55678이다.
본 발명의 또 다른 면은 포유동물의 혈중 콜레스테롤 수준을 감소시키기 위한 포유동물의 치료방법이다. 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시키는 악티노마듀라로부터 얻어진 물질, 예를 들면 히드록실라아제와 컴팩틴을 접촉시켜 컴팩틴으로부터 얻어진 프라바스타틴이 제공된다. 프라바스타틴이 포유동물내 혈중 콜레스테롤 수준이 감소되도록 치료를 필요로 하는 포유동물에 투여된다.
본 발명의 상기 및 기타 목적, 특징 및 장점이 하기 명세서로부터 더 잘 이해될 것이다.
본 발명은 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시키는 방법을 제공한다. 컴팩틴을 공급하여, 악티노마듀라로부터 얻어진 제와, 이러한 제가 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시키는 조건에서 접촉된다. 어떤 구체예에서는, 프라바스타틴이 단리된다.
컴팩틴(메바스타틴(mevastatin), ML-236B 및 CS-500이라고도 함)은 예를 들면, 산 형태(ML-236B 카르복실산이라고도 함), 락톤 형태(ML-236B 락톤이라고도 함), 및 그의 염 및 에스테르를 포함하는 것을 의미한다. 컴팩틴의 락톤 형태는 식(I)에 의해 표현될 수 있다:
바람직한 컴팩틴은 컴팩틴의 나트륨염이다.
프라바스타틴(엡타스타틴(eptastatin), 메자로틴(mezalotin), 프라바콜(pravachol), CS-514 및 SQ-31000이라고도 함)은 예를 들면, 산 형태, 락톤 형태, 및 이들의 염 및 에스테르를 포함하는 것을 의미한다. 프라바스타틴의 3β-히드록시 락톤 형태는 식(II)으로 표현될 수 있다:
다른 형태의 수산화된 컴팩틴은 히드록실기가 컴팩틴 분자의 다른 위치, 예를 들면 위치 6에 부가된 화합물을 포함한다.
컴팩틴은 제가 그것에 작용하도록 할 수 있는 어떠한 방식으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 컴팩틴은 컴팩틴을 생성하는 미생물, 예를 들면 진균 또는 세균을 제공함으로써 제공될 수 있다. 미생물은 예를 들면, 완전하거나(intact) 고정화되거나(immobillized) 투과된(permeabilized) 미생물 세포를 포함하는 것을 의미한다.
미생물에 의한 컴팩틴의 생성은 그 자신의 본래 유전자 또는 유전자들, 또는 이들의 단편을 사용하여 컴팩틴을 생성하는 미생물 및/또는 외래 유전자 또는 유전자들, 또는 이들의 단편을 사용하여 컴팩틴을 생성하는 미생물을 포함하는 것을 의미한다. 외래 유전자는 당업계에 공지된 표준 분자 클로닝 기술 또는 미생물에서 컴팩틴 생성 유전자 또는 유전자들, 또는 이들의 단편을 발현시키는 다른 수단에 의해서, 미생물로 도입될 수 있다. 어떤 구체예에서, 컴팩틴은 컴팩틴을 생성하는 미생물의 무세포 추출물을 사용함으로써 제공된다. 무세포 추출물은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들면 세포를 파괴하기 위한 물리적 또는 화학적 수단에 의해서 제조될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들면, 분쇄, 초음파 처리, 또는 효소 또는 계면활성제에 의한 처리를 포함한다. 바람직하게는, 무세포 추출물은 프렌치 프레스(French Press)로 제조된다. 무세포 추출물은 모든 제조방법, 또는 모든 제조방법으로부터의 용해성 분획에 기인하는 물질을 포함하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 무세포 추출물은 본질적으로 미립자성 세포 잔해, 예를 들면 세포벽이 없는, 예를 들면 세포벽이 본질적으로 제거된 세포 함유물을 포함한다. 무세포 추출물은 미리 수득한 세포로부터, 세포의 활성 생장 동안에 또는 그 후에 제조될 수 있다. 다른 구체예에서, 컴팩틴은 컴팩틴을 생성하는 미생물의 예비생장된 배양물로부터의 무세포 배양 배지를 제공함으로써 제공될 수 있다. 다른 구체예에서, 컴팩틴은 컴팩틴을 포함하는 용액을 제공함으로써 제공될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 컴팩틴은 반정제되거나 거의 정제된 컴팩틴을 사용하여 제공될 수 있다. 컴팩틴은 유리되거나 고정화될 수 있다. 컴팩틴의 어떠한 다른 공급원도 본 발명에서 사용될 수 있다. 컴팩틴은 본 발명에서 프라바스타틴이 제조되기만 하면 어떠한 농도로도 사용될 수 있다. 바람직하게는, 컴팩틴 농도는 약 0.1 내지 약 100g/L, 보다 바람직하게는, 약 0.2 내지 25g/L, 가장 바람직하게는, 약 1 내지 10g/L이다. 어떤 구체예에서, 컴팩틴은 악티노마듀라 제에 샷(shots)으로 첨가된다. 샷이란 물질의 연속적인 첨가를 의미한다(참조: 실시예 3).
컴팩틴은 악티노마듀라로부터 얻어진 제와 접촉된다. 악티노마듀라는 섬유상 세균류, 방선균류(actinomycetes)에 속하는 속이다. 악티노마듀라는 야생형(wild type) 또는 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시키는 능력을 가진 돌연변이주를 포함하는 것을 의미한다. 돌연변이주는 예를 들면, 자연적으로, 또는 물리적 제, 예를 들면 자외선, 고진동수의 전자파 또는 핵 방사선, 또는 화학적 물질로부터, 또는 유전공학 기술로부터 얻어질 수 있다.
본 발명에 포함되는 새롭게 분리된 균주의 형태학적 및 분류학적 성질을 유사한 분류군의 것과 비교하여, 그 결과 균주는 악티노마듀라 속에 포함됨을 알 수 있었다. 악티노마듀라 세포(균주 2966)를 ATCC(American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852)에 1995년 6월 1일자로 기탁하고, 기탁번호 ATCC 55678을 부여받았다.
악티노마듀라로부터 얻어진 물질은 예를 들면 효소, 예를 들면 수산화 효소, 예를 들면 히드록실라아제, 또는 이의 활성 부분을 포함하는 것을 의미하는데, 이것은 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시킬 수 있다. 악티노마듀라 제는 생체내 또는 시험관내에서, 예를 들면 무세포 시스템에서 또는 화학 합성에 의해서 제조될 수 있다. 제는 야생형 및 돌연변이형을 포함한다. 돌연변이된 제는 자연적으로 또는 악티노마듀라를 예를 들면, 물리적 또는 화학적 물질로 또는 당업자에게 공지된 유전공학 기술을 이용하여 돌연변이시킴으로써 얻어질 수 있다. 돌연변이된 제는 또한 당업자에게 공지된 화학적 기술에 의해 합성될 수 있다. 제는 또한 예를 들면, 악티노마듀라의 유전공학적으로 처리된 균주로부터 얻어진 제를 포함하는 것을 의미하는데, 이 제 또는 이의 어떤 활성부분을 코딩하고 있는 핵산은 그 물질에 관한 야생형 조절 영역과는 상이한 조절 영역 또는 이의 일부에 작동적으로 연결되어 있다. 어떤 구체예에서, 악티노마듀라 제를 코딩하고 있는 핵산이 다른 형태의 세포, 예를 들면 세균, 예를 들면 대장균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 브레비스(Bacillus brevis) 또는 스트렙토미세스 리비단(Streptomyces lividans); 진균, 예를 들면 사카로미세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 한세뉼라 폴리모파(Hansenula polymorpha); 곤충 세포; 유전자이식(transgenic) 식물; 또는 유전자이식 동물로 클로닝된다. 바람직한 구체예에서, 악티노마듀라 제는 예를 들면, 미생물 자체의 유전자 또는 외래 유전자에 의해 컴팩틴을 생성할 수 있는 미생물로 클로닝된다.
본 발명의 물질은 구성 효소이므로, 컴팩틴에 의한 유도를 필요로 하지 않는다(참조: 실시예 6). Mg2+, ATP 및 아스코르브산은 단독으로 또는 조합하여 물질의 효소활성을 촉진하지만, Fe2+또는 Fe3+는 촉진하지 않는다(참조: 실시예 8). 바람직하게는, NADPH가 H+공여체로서 사용되지만, NADH 또는 기타 H+공여체도 사용될 수 있다. 보조인자, 예를 들면 α-케토글루타레이트, CoCl2, NiCl2, CuSO4, FMN 또는 FAD는 제의 효소활성을 촉진하지 않는다. 제는 시토크롬 P450 시스템 비의존성이다(참조: 실시예 7).
제가 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시키도록 할 수 있는 어떠한 방식으로든 컴팩틴이 제와 접촉될 수 있다. 예를 들면, 컴팩틴은 악티노마듀라의 전세포, 또는 악티노마듀라의 무세포 추출물, 또는 악티노마듀라의 예비생장된 배양물로부터의 무세포 배양 배지, 또는 악티노마듀라 제를 포함하는 용액, 또는 반정제되거나 거의 정제된 악티노마듀라 제와 접촉될 수 있다.
어떤 구체예에서, 컴팩틴을 생성하는 미생물의 예비생장된 배양물은 악티노마듀라의 예비생장된 배양물과 접촉된다. 예비생장된 배양물이란 세포로 접종되어 얼마간, 바람직하게는 약 1 내지 약 8일, 보다 바람직하게는 약 1 내지 약 5일, 가장 바람직하게는 약 2 내지 약 4일 동안 배양된 배양물을 의미한다. 다른 구체예에서, 미생물의 예비생장된 배양물은 악티노마듀라의 초기 배양물과 접촉된다. 초기 배양물이란 예를 들면 사면 배양물, 동결된 배양물, 동결건조된 배양물 또는 액체 종균 배양물로부터의 세포로 접종된 배양물을 의미한다. 다른 구체예에서, 컴팩틴을 생성하는 미생물의 초기 배양물은 악티노마듀라의 예비 배양물과 접촉된다. 다른 구체예에서, 컴팩틴을 생성하는 미생물의 초기 배양물은 악티노마듀라의 초기 배양물과 접촉된다. 배양물의 혼합물은 얼마간, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 8일, 보다 바람직하게는 약 1 내지 약 5일, 가장 바람직하게는 약 2 내지 약 4일 동안 생장된다.
다른 구체예에서, 컴팩틴을 생성하는 미생물의 무세포 추출물은 악티노마듀라의 배양물, 예를 들면 초기 또는 예비생장된 배양물과 접촉된다. 다른 구체예에서, 컴팩틴을 생성하는 미생물의 배양물, 예를 들면 초기 또는 예비생장된 배양물은 악티노마듀라의 무세포 추출물과 접촉된다. 그리고, 또 다른 구체예에서, 컴팩틴을 생성하는 미생물의 무세포 추출물은 악티노마듀라의 무세포 추출물과 접촉된다. 다른 구체예에서, 컴팩틴을 생성하는 미생물의 배양물, 예를 들면 초기 또는 예비생장된 배양물은 악티노마듀라의 무세포 추출물과 접촉된다. 반정제되거나 거의 정제된 컴팩틴, 또는 반정제되거나 거의 정제된 악티노마듀라 제를 사용한 조합도 또한 본 발명에 포함된다.
컴팩틴의 프라바스타틴으로의 전환 반응은 프라바스타틴이 제조되는 어떠한 조건에서도 수행될 수 있다. 어떠한 배양법이든 사용될 수 있는데, 그 예로는 발효 기술, 예를 들면, 배치 배양, 유가-배치 배양(fed-batch culture), 연속 또는 고상 배양이 있다. 바람직하게는, 교반 액침 배양(agitated liquid submerged culture)이 사용되고, 가장 바람직하게는 대규모 공업적 발효에 유용한 형태의 교반 액침 배양이 사용된다. 첨가제가 생장 중에 사용될 수 있는데, 이것은 세포 내수산화 시스템의 발달에 기여한다.
바람직한 온도는 약 18℃ 내지 약 50℃, 보다 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 37℃, 및 가장 바람직하게는 약 28℃ 내지 약 31℃이다. 바람직한 pH는 약 5 내지 약 10, 보다 바람직하게는 약 6 내지 약 8.5, 및 가장 바람직하게는 약 7.2 내지 약 8.0이다. 바람직하게는, 호기성 생물(aerobiosis)이 예를 들면, 교반(agitation) 및/또는 통기(aeration)에 의해서 제공된다. 바람직한 교반 조건은 약 0rpm 내지 약 400rpm, 보다 바람직하게는 약 200rpm 내지 약 250rpm, 및 가장 바람직하게는 약 220rpm이다.
본 발명은 악티노마듀라 제에 의한 컴팩틴의 프라바스타틴으로의 어떠한 전환율도 포함하는 것을 의미하며, 전환율은 바람직하게는 약 10% 이상, 보다 바람직하게는 약 25% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 40% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 50% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 60% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 70% 이상 및 가장 바람직하게는 약 80% 이상이다. 전환율은 프라바스타틴의 농도를 충전된(초기에 첨가된) 컴팩틴의 농도로 나누고 100을 곱해서 계산한다.
바람직한 구체예에서, 프라바스타틴은 단리(isolation)된다. 단리된다는 것은 예를 들면, 농축되거나 분리(separation)되거나 정제되는 것을 포함하는 것을 의미한다. 단리는 당업자에게 공지된 어떠한 방법에 의해서도 수행될 수 있는데, 예를 들면 침전; 예를 들면, 용매, 예를 들면 에틸 아세테이트 또는 부탄올에 의한 추출 및 예를 들면 증류에 의한 용매의 제거; 크로마토그래피, 예를 들면 박막 크로마토그래피 또는 예를 들면 매트릭스, 예를 들면 알루미나 또는 실리카 겔을 사용하여 용리시키는 칼럼 크로마토그래피가 있다. 바람직한 크로마토그래피법으로는 예를 들면 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)가 있다(참조: Serizawa et al., J. Avtibiotics(1983)).
본 발명은 또한 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시키는 제, 예를 들면 히드록실라아제를 가지는 악티노마듀라로부터의 무세포 추출물을 포함한다. 무세포 추출물은 앞서 정의한 방법을 포함한 어떠한 방법에 의해서도 수득될 수 있다. 바람직하게는, 무세포 추출물은 본질적으로 미립자성 세포 잔해, 예를 들면 세포벽이 없는, 예를 들면 세포벽이 본질적으로 제거된 세포 함유물을 포함한다. 바람직하게는, 무세포 추출물에 의한 컴팩틴의 프라바스타틴으로의 전환율은 약 10% 이상, 보다 바람직하게는 약 25% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 40% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 50% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 60% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 70% 이상 및 가장 바람직하게는 약 80% 이상이다.
본 발명은 또한 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시키는 악티노마듀라로부터의 히드록실라아제, 예를 들면 반정제되거나 거의 정제된 히드록실라아제를 포함한다. 히드록실라아제는 구성 효소이다. 히드록실라아제의 활성은 ATP, 아스코르브산 및 Mg2+중의 어느 하나, 또는 이들의 조합에 의해서는 촉진되나, Fe2+또는 Fe3+에 의해서는 촉진되지 않는다. 바람직하게는, NADPH가 H+공여체로서 사용되지만, NADH 또는 기타 H+공여체도 사용될 수 있다. 공동인자, 예를 들면 α-케토글루타레이트, CoCl2, NiCl2, CuSO4, FMN 또는 FAD는 히드록실라아제의 활성을 촉진하지 않는다. 히드록실라아제는 시토크롬 P450 시스템 비의존성이다.
본 발명은 또한 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시키는 제, 예를 들면 히드록실라아제를 가지는 악티노마듀라 ATCC 55678을 포함한다.
더욱이, 본 발명은 포유동물의 혈중 콜레스테롤 수준을 감소시키기 위한 포유동물의 치료방법을 포함한다. 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시키는 악티노마듀라로부터 얻어진 물질, 예를 들면 히드록실라아제와 접촉시켜 컴팩틴으로부터 얻어진 프라바스타틴이 제공된다. 프라바스타틴이 포유동물내 혈중 콜레스테롤 수준을 감소시키는 치료를 필요로 하는 포유동물에 투여된다.
포유동물이란 인간이 아닌 포유동물 뿐만 아니라 인간도 의미한다. 혈중 콜레스테롤 수준을 감소시키기 위한 포유동물의 치료는 예를 들면, 높은 혈중 콜레스테롤 수준을 예방하는 것 또는 감소시키는 것을 포함하는 것을 의미한다.
프라바스타틴의 투여는 프라바스타틴을 이의 표적에 도달하도록 할 수 있는 어떠한 방법에 의해서도 달성될 수 있다. 표적이란 프라바스타틴이 포유동물에서 콜레스테롤 생합성 경로를 저해할 수 있는 위치를 의미한다. 투여방법은 예를 들면, 주사, 침착(deposition), 내이식, 좌약, 경구 섭취, 흡입, 국소 투여, 또는 프라바스타틴이 표적으로 접근될 수 있는 투여의 어떠한 다른 방법을 포함한다. 주사는 예를 들면, 정맥, 피내, 피하, 근육내 또는 복막내 주사일 수 있다. 내이식은 이식가능한 약물 전달 시스템, 예를 들면 미소구체, 히드로겔, 중합성 저장기(polymeric reservoir), 콜레스테롤 매트릭스, 중합성 시스템, 예를 들면 매트릭스 부식 및/또는 확산 시스템 및 비중합성 시스템, 예를 들면 압축, 융합 또는 부분 융합 펠릿의 삽입을 포함한다. 좌약은 글리세린 좌약을 포함한다. 경구 섭취 복용형태, 예를 들면 환제는 장용성 제피될 수 있다. 흡입은 프라바스타틴을 흡입기내의 에어러졸에 의해 단독으로 또는 흡수될 수 있는 담체에 부착된 형태로 투여하는 것을 포함한다.
프라바스타틴은 액체에, 예를 들면 용해된 형태 또는 콜로이드성 형태로 현탁될 수 있다. 액체는 용매, 부분 용매 또는 비용매 일 수 있다. 많은 경우에, 물 또는 유기 액체가 사용될 수 있다. 프라바스타틴은 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 어떤 구체예에서, 프라바스타틴은 적합한 담체, 예를 들면 약학적으로 허용되는 담체와 조합될 수 있다. 어떤 구체예에서, 프라바스타틴은 리포솜에 혼입되거나 고분자 방출 시스템에 혼입된다.
본 발명의 어떤 구체예에서, 투여는 일정한 시간 동안, 예를 들면 몇 시간, 몇 일, 몇 주, 몇 달 또는 몇 년 동안, 프라바스타틴에 연속적으로 노출되도록 설계될 수 있다. 이것은 상기한 방법 중의 하나로 프라바스타틴을 반복 투여하거나, 프라바스타틴이 반복 투여 없이 연장된 기간 동안 포유동물에 전달되는 조절 방출 전달 시스템에 의해 달성될 수 있다. 이러한 시스템의 투여는 예를 들면, 지효성(持效性) 경구 복용 형태, 대형환제 주입, 경피성 패치 및 피하 이식에 의해 이루어질 수 있다.
프라바스타틴은 높은 혈중 콜레스테롤 수준의 발현 전 또는 후에 투여될 수있다. 어떤 구체예에서, 프라바스타틴은 높은 혈중 콜레스테롤 수준의 가계 이력을 가지거나, 이러한 상태에 관한 유전적 소질을 가지는 피검자에 투여된다. 다른 구체예에서, 프라바스타틴은 특별한 연령이 되었을때 높은 혈중 콜레스테롤 수준이 되기에 보다 쉬운 피검자에 투여된다. 또 다른 구체예에서, 프라바스타틴은 상태의 초기 또는 경과된 증상을 나타내는 피검자에 투여된다. 프라바스타틴은 또한 예방책으로서 투여될 수도 있다.
프라바스타틴은 포유동물에 치료적 유효량으로 투여된다. 치료적 유효량이란 높은 혈중 콜레스테롤 수준을 부분적으로 또는 전체적으로 예방하거나 반전시킬 수 있는 양을 의미한다. 치료적 유효량은 개개인을 기초로 결정될 수 있고, 부분적으로 또는 전체적으로 포유동물의 종, 포유동물의 크기, 사용되는 전달 시스템의 형태, 혈중 콜레스테롤의 수준에 비례한 투여기간의 고려, 단일, 복수 및 조절되는 방출 투여 섭생법 중 어느 하나가 사용된다. 치료적 유효량은 당업자에 의해 그러한 인자를 사용하고 단지 일상적인 실험을 사용하여 결정될 수 있다.
바람직하게는, 인간에 대한 프라바스타틴의 투여량은 약 0.1 내지 약 5000mg/일, 보다 바람직하게는 약 1 내지 약 500mg/일, 및 가장 바람직하게는 약 10 내지 약 50mg/일이다. 바람직하게, 투여 형태는 이것이 거의 포유동물에 해로운 영향을 주지 않도록 하는 것이다.
실시예
실시예 1:악티노마듀라의 완전한 세포에 의한 컴팩틴의 프라바스타틴으로의 생전환(bioconversion)
본 실시예는 악티노마듀라의 세포에 의한 컴팩틴의 프라바스타틴으로의 생전환을 예시한다. 악티노마듀라 ATCC 55678을 YM 배지(리터 당 이스트 추출물 3g, 맥아 추출물 3g, 펩톤 5g, 글루코스 10g, pH 6.5)에서 48시간 동안 28℃에서 220rpm으로 진탕시키면서 생장시켰다. 그런 다음, Na 컴팩틴(Fluka Chemical Corp., New York, NY) 500μg/ml을 가하였다. 악티노마듀라 배양물을 동일한 배지에서 1, 2, 3, 4 또는 5일 동안 추가 배양하였다. 상기 기간의 각 말기에서, 컴팩틴(CP) 및 프라바스타틴(PV)의 양을 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 측정하였다.
사용된 HPLC 조건은 3μm 리크로스페르 100 알피-18 칼럼(Lichrospher: RP-188 column)(EM Separations Technology, Gibbstown, NJ); 이동상 A: 아세토니트릴 200ml 및 메탄올 110ml이 첨가되고, pH가 85% H3PO4에 의해 2.5로 조절된 밀리-큐(Milli-Q) 물 800ml 내에 용해된 NaH2PO42.5g; 이동상 B: 물 200ml, 아세토니트릴 800ml, 메탄올 110ml 및 85% H3PO41ml의 혼합물; 주입량 10μl; 유량 1ml/min; UV 237nm에서 검출하였다. 구배 표는 다음과 같다:
HPLC 결과는 표 1과 같다. PV는 프라바스타틴이고; CP는 컴팩틴이다.
표 1. 5일간의 배양 동안 악티노마듀라에 의한 생전환
단위: μg/ml
전환율은 사용된 컴팩틴이 아니라, 충전된 컴팩틴을 기준으로 하여 계산하였다(첨가하기 전에 컴팩틴의 중량을 측정하였지만, 충전량은 시작 시점에서 HPLC 분석에 의해 측정하였다).
실시예 2:악티노마듀라의 완전한 세포에 의한 컴팩틴의 프라바스타틴으로의 생전환의 반응속도론(kinetics)
본 실시예는 악티노마듀라에 의한 컴팩틴의 프라바스타틴으로의 생전환의 반응속도론(kinetics)을 예시한다. 글루코스 2%, 펩톤 0.5%, 이스트 추출물 0.3% 및 맥아 추출물 0.3%를 포함하는 배양 배지를 제조하고 pH를 5.5로 조절하였다. 각각 배지 20ml를 포함하고 있는 250ml 부피의 삼각 플라스크들을 121℃에서 15분 동안 살균하였다. 그런 다음, 각각을 사면(slant) 배양물로부터의 악티노마듀라 ATCC 55678의 세포를 함유한 백금이(platinum loop)로 접종시킨 후, 250rpm으로 진탕시키면서 28℃에서 5일 동안 배양하였다. 이 공정 결과, 펠릿 및 탁한 액체를 포함하는 현탁액을 수득하였고, 배양물의 탁한 부분 2ml를 배지 20ml가 있는 또 다른250ml 삼각 플라스크에 접종한 다음 250rpm으로 진탕시키면서 28℃에서 2일 동안 배양하여, 종균 배양물을 수득하였다. 상기 배지의 50ml 분량을 500ml 삼각 플라스크에 가하고, 121℃에서 15분 동안 살균하였다. 종균 배양물 5ml를 각 플라스크에 가하였다. 2일 경과 후에, 컴팩틴을 각 플라스크에 500μg/ml 수준으로 가한 다음, 36시간 동안 추가 배양하였다. 생전환의 36시간 동안 상이한 시간 간격으로 프라바스타틴의 제조 속도를 실시예 1과 동일한 방법으로 측정하였다. 그 결과는 표 2와 같다.
표 2. 36시간의 배양 동안 악티노마듀라에 의한 생전환
단위: μg/ml
16시간 동안 프라바스타틴 제조 및 컴팩틴 소비는 모두 직선형이었다.
추가의 실험을 생전환을 검사하기 위해 7시간 동안 더 짧은 시간 간격으로, 200μg/ml 및 500μg/ml의 컴팩틴 농도에서 수행하였다. 결과를 표 3 및 4에 나타내었다.
표 3. 200μg/ml 컴팩틴
단위: μg/ml
표 4. 500μg/ml 컴팩틴
단위: μg/ml
상기 결과로부터, 프라바스타틴의 제조 속도에 있어서 두 컴팩틴 농도 사이에 본질적으로 어떠한 차이도 없음을 명백히 알 수 있었다.
실시예 3:컴팩틴이 샷으로 첨가될 때, 악티노마듀라의 완전한 세포에 의한 컴팩틴의 프라바스타틴으로의 생전환
본 실시예는 악티노마듀라의 완전한 세포에 의한 컴팩틴의 프라바스타틴으로의 생전환에 기인하는 프라바스타틴 농도가 컴팩틴이 샷으로 첨가될 때 증가됨을 예시한다. 악티노마듀라 ATCC 55678을 실시예 2와 동일한 방법으로 생장시키고, 컴팩틴 500μg/ml을 역시 동일한 방법으로 가하였다. 첫 번째 날에 컴팩틴 300μg/ml를 추가로 가하고, 두 번째 날에 컴팩틴 300μg/ml를 또 한번 추가로 가하였다. 컴팩틴 및 프라바스타틴의 양을 실시예 1과 동일한 방법으로 측정하였다. 그 결과는 표 5와 같다.
표 5. 샷으로 첨가된 컴팩틴의 악티노마듀라에 의한 생전환
단위: μg/ml
상기 결과는 컴팩틴이 샷으로 첨가될 때 매우 고농도의 프라바스타틴(821μg/ml)이 7일 경과 후에 수득됨을 나타낸다. 컴팩틴이 오직 한번(비쇼츠) 첨가되는 것을 제외하고는, 유사한 조건에서 수행한 실험에 의하면, 더 낮은 농도의 프라바스타틴이 제조되었다. 게다가, 표 5에서 보듯이, 생전환율은 샷 실험에서 78%로 증가되었다. 따라서, 샷으로 컴팩틴을 첨가하면 더 높은 프라바스타틴 농도 및 더 높은 전환율을 얻을 수 있다. 컴팩틴의 프라바스타틴으로의 생전환 속도는 증가되지 않았다.
실시예 4:한정된 배지에서 생장된 악티노마듀라의 세포에 의한 컴팩틴의 프라바스타틴으로의 생장 및 생전환
본 실시예는 한정된 배지가 악티노마듀라 생장을 지지하고, 복합 배지보다 컴팩틴의 프라바스타틴으로의 생전환에 효과적임을 예시한다. 화학적으로 한정된 배지(배지 A라고 함)은 하기를 포함한다:
성 분 g/L
자당 30
NaNO3 2
K2HPO4 1
MgSO4·7H2O 0.5
KCl 0.5
FeSO4 0.01
pH는 7.2로 조절
악티노마듀라 ATCC 55678을 배지 A 및 복합 YM 배지(리터 당 이스트 추출물 3g, 맥아 추출물 3g, 펩톤 5g, 글루코스 10g, pH 6.5), 5ml/250ml 플라스크에서 28℃에서 220rpm으로 진탕시키면서 생장시켰다. 컴팩틴(250μg/ml)을 45시간 경과 후에 가하였다. 배양을 8시간 동안 계속하였다. 그런 다음, 생물량(biomass)을 측정하였는데, 그것은 YM 매질에서 생장된 세포에서 보다 배지 A에서 생장된 세포에 대해 약 25% 적었다. 세포가 더 적음에도 불구하고, 컴팩틴의 프라바스타틴으로의 생전환율은 YM 매질에서 생장된 세포에서 보다 배지 A에서 생장된 세포에 대해 더 높았다. 전환율은 YM에서는 6.7%이고, 매질 A에서는 13%이었다.
실시예 5:악티노마듀라의 무세포 추출물에 의한 컴팩틴의 프라바스타틴으로의 효소 전환의 NADPH에의 의존
본 실시예는 악티노마듀라의 무세포 추출물이 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시키고, 상기 효소 전환에는 NADPH가 NADH 보다 더 우수한 H+공여체임을 예시한다.
악티노마듀라의 무세포 추출물을 악티노마듀라 ATCC 55678의 배양물 150ml를 2일 동안 YM 배지에서 실시예 1과 동일한 방법으로 생장시켜 수득하였다. 세포를 15,000rpm으로 30분 동안 원심분리하여 회수하였다. 세포를 신선한 YM 배지 20ml에 재현탁시키고, Na 컴팩틴을 약 500μg/ml로 가한 다음 29℃에서 220rpm으로 3시간 동안 배양하였다. 이러는 동안, 컴팩틴 196μg/ml이 없어지고 프라바스타틴 70μg/ml이 생겼다. 세포를 원심분리에 의해 회수하고, 냉수로 두 번 및 완충액 A(20% 글리세롤 및 2mM DTT가 추가된 80mM 트리스-HCl 완충액, pH 7.4)로 한 번 세척하였다. 세포를 완충액 A 5ml에 재현탁시키고 -80℃에서 저장하였다. 나중에, 세포 현탁액을 해동하고 프렌치 프레스(French Press)에서 분쇄하였다. 균질물을 30,000rpm에서 60분 동안 원심분리하였다. 상청액을 무세포 추출물로서 -80℃에서 저장하였다.
반응 조건은 무세포 추출물 160μl, 0.26mM NADH 또는 NADPH, 0.23mM 컴팩틴, 전체 부피 220μl, 30℃, 250rpm이었다. 무세포 추출물이 없는 완충액 A의 대조구가 포함되었다. 프라바스타틴의 양을 실시예 1과 동일한 방법으로 HPLC에 의해 측정하였다. 그 결과를 표 6에 나타내었다.
표 6. 악티노마듀라의 무세포 추출물에 의한 전환에서 H+공여체로서 NADH및 NADPH의 비교
그 결과, 무세포 추출물에 의한 컴팩틴의 프라바스타틴으로의 효소 전환이 있고, 그것은 H+공여체로서 NADH 보다 NADPH을 사용할 경우 더 우수함을 알 수 있었다.
실시예 6:무세포 추출물에서 측정된 "유도된" 및 유도되지 않은 악티노마듀라에 의한 컴팩틴의 프라바스타틴으로의 효소 전환
본 실시예는 무세포 추출물에서 효소 전환을 측정할 때, 악티노마듀라에서 컴팩틴의 프라바스타틴으로의 효소 전환이 유도를 필요로 하지 않으므로, 악티노마듀라 히드록실라아제가 구성 효소임을 예시한다.
무세포 추출물을 컴팩틴 "유도된" 세포 및 유도되지 않은 세포 모두로부터 제조하였다. 악티노마듀라 ATCC 55678 세포를 온도가 29℃였다는 점을 제외하고는실시예 2와 동일한 방법으로 2일 동안 생장시켜 회수하고, 두 개의 플라스크로 분리하였다. 그런 다음, 컴팩틴을 상기 플라스크 중 하나에 약 300μg/ml의 농도로 가하였다("유도된" 배양물). 양 플라스크를 29℃에서 250rpm으로 3시간 동안 배양하였다. 이 때 세포를 회수하고, 무세포 추출물을 프렌치 프레스로 실시예 4와 동일한 방법으로 제조하였다. 반응 조건은 무세포 추출물 160μl, 0.26mM NADPH, 0.23mM 컴팩틴, 전체 부피 220μl, 30℃, 250rpm이었고, 60분 동안 배양하였다.무세포 추출물 반응의 효소 전환을 실시예 1과 동일한 방법으로 0, 10, 30 및 60분에서 HPLC에 의해 측정하였다. 그 결과를 표 7에 나타내었다.
표 7. 악티노마듀라의 "유도된" 및 유도되지 않은 무세포 추출물에 의한 전환
이 결과는 "유도"가 효소 전환의 속도를 증가시키지 않았음을 나타낸다. 따라서, 악티노마듀라 히드록실라아제는 구성 효소이다.
실시예 7:악티노마듀라의 무세포 추출물에서 시토크롬 P450의 측정
본 실시예는 악티노마듀라의 히드록실라아제 활성이 시토크롬 P450 효소에 의한 것이 아님을 예시한다. 악티노마듀라 ATCC 55678의 무세포 추출물을 실시예 5와 동일한 방법으로 제조하였다. 조제 1, 2 및 3을 완충액 A(2mM DTT 및 20% 글리세롤이 추가된 80mM 트리스-HCl, pH 7.4)에 재현탁시키고, 조제 4는 인산염 완충액에 재현탁시켰다. 반응 조건은 무세포 추출물 160μl, 0.26mM NADPH, 0.23mM 컴팩틴, 전체 부피 220μl, 30℃, 250rpm이었다. 히드록실라아제 활성은 실시예 1과 동일한 방법으로 HPLC에 의해 측정하였다.
시토크롬 P450 활성은 다음과 같이 측정하였다. 나트륨 디티오네이트 2mg을악티노마듀라 ATCC 55678의 무세포 추출물 3ml에 가하여 P450을 환원시켰다. 무세포 추출물을 베크만(Beckman) 모델 24 분광광도계의 시료 셀 및 대조 셀에 넣었다. 400nm 내지 500nm의 흡광도를 기록하였다. 시료 셀에 있는 무세포 추출물에 CO를 1분 동안 버블링하여 P450-CO 착체를 제조하였다. 다시 스펙트럼을 기록하였다. 이 두 스펙트럼 사이의 차이는 P450 차이 스펙트럼이다.
다른 무세포 추출물 조제의 P450 함량 및 히드록실라아제 활성을 표 8에 나타내었다. 무세포 추출물(CFE)에 관한 상이한 수는 비의존성 무세포 추출물 조제를 나타낸다.
표 8. 악티노마듀라의 상이한 무세포 추출물 조제의 히드록실라아제 및 P450 특이 활성
히드록실라아제 활성과 시토크롬 P450 활성 사이에는 아무런 관련이 없었다. 따라서, 악티노마듀라로부터 얻어진 히드록실라아제 활성은 시토크롬 P450 효소에 의한 것이 아니다.
실시예 8:악티노마듀라의 무세포 추출물에서 컴팩틴의 프라바스타틴으로의 전환에 대한 다양한 인자의 효과
본 실시예는 Mg2+, ATP 및 아스코르브산이 단독으로 또는 조합하여 악티노마듀라 무세포 추출물에서 컴팩틴의 프라바스타틴으로의 전환을 촉진하나, Fe2+또는 Fe3+은 촉진하지 않음을 예시한다. Mg2+은 많은 효소의 통상적인 공동인자이다. ATP는 효소반응에 대한 통상적인 에너지 공급자이다. Fe2+및 Fe3+은 많은 옥시게나아제의 활성 위치에 있다. 아스코르브산은 옥시게나아제 반응을 위해 때때로 필요한 환원제이다. 반응 조건은 무세포 추출물 160μl, 0.72mM NADPH, 0.2mM 컴팩틴, 전체 부피 211μl, 30℃, 250rpm, 60분이었다. 인자를 다음과 같은 농도로 시작 시점에서 첨가하였다:2.4mM MgCl2, 0.09mM FeSO4,0.1mM FeCl3, 1.9mM ATP 및 12mM 아스코르브산. 그 결과를 표 9 및 10에 나타내었다.
표 9. 악티노마듀라로부터 얻어진 무세포 추출물에 대한 MgCl2, FeSO4, FeCl3, ATP 및 아스코르브산의 효과
표 10. 악티노마듀라로부터 얻어진 무세포 추출물에 대한 MgCl2, ATP 및 아스코르브산의 효과
실시예 9:페실로미세스의 예비생장된 배양물과 악티노마듀라의 초기 배양물의 접촉에 의한 프라바스타틴의 제조
진균 페실로미세스(Paecilomyces) 종(sp.) M2016(Endo et al., J. Antibiotics, 39:1609-1610(1986))을 글루코스 3.5%, 녹말 1%, 대두분 2%, 고기 추출물 0.5%, 펩톤 0.5%, NaCl 0.2%, KH2PO40.05% 및 MgSO4·7H2O 0.05%를 포함하고, pH가 5.8로 조절된 배지에서 생장시켰다. 각각 배지 20ml를 포함하고 있는 250ml 부피의 삼각 플라스크들을 121℃에서 15분 동안 살균하였다. 각 플라스크를 사면 배양물로부터의 페실로미세스 종 M2016의 백금이로 접종하고, 250rpm으로 진탕시키면서 25℃에서 7일 동안 배양하였다. 생성된 컴팩틴을 실시예 1과 동일한 방법으로 HPLC에 의해 검출하였다. 제조된 컴팩틴은 40μg/ml이었다. 그런 다음, pH를 7.2로 조절하였다. 악티노마듀라 ATCC 55678의 종균 배양물을 실시예 2와 동일한 방법으로 제조하고 페실로미세스 종의 7일 동안의 배양물에 가하였다. 28℃에서 250rpm으로 하루 동안 배양한 후에, 배양물 내 프라바스타틴을 실시예 1과 동일한 방법으로 HPLC에 의해 검출하였다. 배양물 내 프라바스타틴의 농도는 30μg/ml이었다.
실시예 10:페실로미세스의 초기 배양물과 악티노마듀라의 무세포 추출물의 접촉에 의한 프라바스타틴의 제조
진균 페실로미세스 종 M2016의 배양물을 사면 배양물로부터의 접종 후에 즉시 혼합하는 것(7일간의 예비배양 생략)을 제외하고는, 실시예 9와 동일한 방법으로 제조하였다. 악티노마듀라 ATCC 55678의 무세포 추출물을 실시예 5와 동일한 방법으로 제조하였다. 페실로미세스 종의 배양물의 pH를 7.5로 조절하였다. 악티노마듀라 무세포 추출물 5ml를 페실로미세스 종의 배양물 20ml에 가하였다. 컴팩틴으로부터 제조된 프라바스타틴을 실시예 1과 동일한 방법으로 HPLC에 의해 검출하였다. 배양물 내 프라바스타틴의 농도는 30μg/ml이었다.
실시예 11:높은 혈중 콜레스테롤 수준의 치료
본 실시예는 인간의 콜레스테롤 수준을 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시키는 악티노마듀라 히드록실라아제로부터 얻어진 프라바스타틴으로 감소시키는 방법을 예시한다. 환자에 상기 프라바스타틴 20mg을 하루에 두 번 환제의 형태로 경구투여하였다. 3개월 동안 투여하였다. 치료 결과, 환자의 혈중 콜레스테롤 수준이 감소하였다.
당업자는 본 명세서에서 설명된 본 발명의 구체적인 구체예과의 많은 균등물을 단지 일상적인 실험을 사용하여 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물 및 기타 모든 균등물은 하기 청구의 범위내에 포함될 것이다.
본 발명에 의해 유도인자로서 컴팩틴을 필요로 하지 않고, 컴팩틴 양의 증가를 견딜 수 있는 악티노마듀라 구성 히드록실라아제를 사용하여, 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시키는 방법 및 이러한 방법에 사용되는 악티노마듀라 구성 히드록실라아제가 제공된다.

Claims (5)

  1. 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시키는 히드록실라아제를 포함하며, 이러한 히드록실라아제가 구성효소이고, 이의 효소활성이 ATP, 아스코르브산 및 Mg2+중의 어느 하나에 의해서는 촉진되나, Fe2+또는 Fe3+에 의해서는 촉진되지 않으며, 이러한 히드록실라아제가 시토크롬 P450 시스템 비의존성 히드록실라아제인, 악티노마듀라 ATCC 55678로부터 얻어진 무세포 추출물.
  2. 제1항에 있어서, 무세포 추출물이 미립자성 세포 잔해가 본질적으로 제거된 악티노마듀라의 파괴된 세포로부터 얻어짐을 특징으로 하는 무세포 추출물.
  3. 제1항에 있어서, 컴팩틴의 프라바스타틴으로의 전환율이 50% 이상임을 특징으로 하는 무세포 추출물.
  4. 제1항에 있어서, 컴팩틴의 프라바스타틴으로의 전환율이 75% 이상임을 특징으로 하는 무세포 추출물.
  5. 컴팩틴을 프라바스타틴으로 전환시키는, 악티노마듀라 ATCC 55678로부터 얻어진 히드록실라아제에 있어서,
    히드록실라아제가 구성 효소이고;
    히드록실라아제의 활성이 ATP, 아스코르브산 및 Mg2+중의 어느 하나에 의해서는 촉진되나, Fe2+또는 Fe3+에 의해서는 촉진되지 않으며;
    히드록실라아제가 시토크롬 P450 시스템 비의존성인 히드록실라아제.
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