KR100637762B1

KR100637762B1 - 저콜레스테롤 란을 생산하기 위한 가금류용 사료첨가제 및 이를 이용한 저콜레스테롤 란의 생산방법

Info

Publication number: KR100637762B1
Application number: KR1020040060480A
Authority: KR
Inventors: 김정학; 김현진; 홍성출
Original assignee: 주식회사 지니스
Priority date: 2004-07-30
Filing date: 2004-07-30
Publication date: 2006-10-23
Also published as: JP2008508259A; WO2006011702A1; EP1778218A1; BRPI0418928A; US20090181150A1; KR20060011578A; CN1993122A; EP1778218A4; CN1993122B

Abstract

본 발명은 저콜레스테롤 란을 생산하기 위한 가금류용 콜레스테롤 저하제, 이를 포함하는 사료 및 사료첨가제, 이를 이용한 저콜레스테롤 란의 생산방법과 생산된 저콜레스테롤 란에 관한 것으로, 본 발명에서는 미생물 유래 스타틴의 일반식(Ⅴ) 중 6번 탄소에 메칠기(-CH3)가 없는 스타틴을 이용하여 저콜레스테롤 란을 생산한다. 본 발명에 따르면 산란율은 저하되지 않으면서 콜레스테롤 저하 효과가 뛰어난 콤팩틴 및 그 유도체, 프라바스타틴 및 그 유도체를 이용함으로써 종래의 합성 스타틴을 이용한 방법에 비해 많게는 1/20 에서 1/4까지 생산단가를 낮출 수 있으며, 나아가 미생물 배양액의 정제과정에서 발생하는 중간산물 및 산업부산물 등을 활용함으로써 일반 란과 비교해도 생산단가의 큰 상승없이 저콜레스테롤 란을 생산할 수 있다.

(Ⅴ)

저콜레스테롤 란, 콜레스테롤, 스타틴, 콤팩틴, 프라바스타틴, 계란, 사료

Description

저콜레스테롤 란을 생산하기 위한 가금류용 사료첨가제 및 이를 이용한 저콜레스테롤 란의 생산방법 {Cholesterol lowering supplements and low cholesterol eggs}

본 발명은 저콜레스테롤 란을 생산하기 위한 가금류용 사료첨가제, 이를 포함하는 사료 및 이를 이용한 저콜레스테롤 란의 생산방법과 생산된 저콜레스테롤 란에 관한 것이다.

콜레스테롤은 모든 동물성식품에 존재하는 지방의 일종으로 세포의 구성성분이며 호르몬 합성에 필수적인 성분이나 지나치게 많은 콜레스테롤은 오히려 인체에 악영향을 미치기 때문에 적정수준의 콜레스테롤 유지가 건강에 매우 중요하다.

사람의 혈중 콜레스테롤 수치가 200mg/dL 이상인 경우를 고콜레스테롤증이라고 하는데 세계 성인인구의 52%에서 찾아볼 수 있을 정도로 흔한 만성질환으로, 고콜레스테롤증은 동맥경화의 직접적인 원인이며 궁극적으로는 고혈압, 협심증, 심근경색증, 뇌졸중 등과 같은 각종 심혈관질환을 일으키는 원인이다. 1900년대의 통계에 의하면 심장병은 폐렴과 인플루엔자, 결핵, 설사나 장염에 이어서 네 번째 사 인(死因)으로 전체 사망자의 불과 8%에 지나지 않았으나 현대에 와서는 인류의 첫 번째 사망 원인으로 등장했다. 이는 알제품(계란), 육제품(고기), 유제품(우유, 버터) 등과 같은 동물성식품의 과다섭취로 인한 고콜레스테롤증 환자의 증가로 인한 결과로 생각되고 있다.

그러나 현재 동물성식품의 섭취량은 매년 증가하고 있는 추세이며 특히 경제가 발전할수록 동물성식품의 소비가 늘어나고 있어 동물성식품의 섭취를 획기적으로 줄이는 것은 현실적으로 거의 불가능한 것으로 생각되고 있다. 때문에 최근에는 동물성식품 자체의 소비량을 줄이려는 노력보다는 동물성식품에 함유되어 있는 콜레스테롤의 함량을 낮추어 저콜레스테롤 동물성식품으로 개발하는 연구가 다양한 방법으로 진행되고 있다.

계란과 같은 알제품은, 영양적인 관점에서는 고품질의 단백질, 포화 및 불포화 지방산, 미네랄 그리고 비타민으로 구성된 매우 훌륭한 식품이다. 그러나 이러한 알제품, 특히 계란의 경우 계란 1개 당 약 200 mg 이상의 콜레스테롤을 포함하고 있어 음식으로 섭취되는 콜레스테롤의 주요 공급원으로 생각되고 있다. 최근 혈중 콜레스테롤 수치와 심혈관질환의 발병률간의 연관성이 밝혀지고, 음식물로 섭취하는 콜레스테롤의 양이 증가되면 심혈관질환의 위험이 증가한다고 추측됨에 따라 (Weggemans et al., 2001), 건강을 생각하는 소비자들은 콜레스테롤 섭취량을 제한하고 있다. 미국심장협회의 콜레스테롤 일일 섭취 권장량은 300㎎으로, 이 권장량을 지키기 위해서 많은 소비자들이 식단에서 계란을 제한하고 있으며 이로 인 해 일인당 계란 소비량은 계속 감소하고 있다 (National Institutes of Health Consensus Development Panel, 1985). 미국에서 식이 섭취 콜레스테롤에 대한 일반 소비자들의 의식수준의 변화는 일인당 계란 소비량이 지난 35년 동안 303개에서 256개로 감소한 데서도 알 수 있다 (US Department of Agriculture, 2002). 그러므로 저콜레스테롤 계란은 건강의식이 있는 소비자에게나 고부가가치 기능성 제품개발을 원하는 축산업체들에게 매력적인 상품이 된다. 본 발명은 바로 저 콜레스테롤 란을 생산하는 방법에 관한 것이다.

미국특허 6,177,121에 의하면, 저콜레스테롤 계란을 만들기 위해, 콜레스테롤 저하제인 로바스타틴, 심바스타틴, 아토르바스타틴을 산란계용 사료첨가제로 사용하는 방법이 개시되어 있다 (Elkin et al., J. Nutr 1999:129:1010-1019, Elkin et al., J. Agric. Food Chem 2003:51:3473-3481). 이 문헌에서는 심바스타틴이나 아토르바스타틴을 0.03~0.06%로 5주간 급이시 저콜레스테롤 계란이 생산된다고 보고하고 있으나, 실제 이 방법은 저콜레스테롤 계란의 생산에 활용되지 못했다. 그 이유는 심바스타틴이나 아토르바스타틴은 유기합성에 의해 생산된 고가의 의약품으로 이를 사료첨가제로 이용시 저콜레스테롤 계란 생산에 소요되는 비용이 일반 란 생산가격의 최소 수십배 이상이 된다는 점이다. 또 한가지 문제점은 심바스타틴이나 아토르바스타틴의 급이에 따라 산란율이 현저히 떨어지는 원치 않는 부작용이 있고, 이것이 저콜레스테롤 계란의 생산원가를 더욱 높이는 원인이 된다. 상기 특허는 심바스타틴과 아토르바스타틴 이외에도 로바스타틴을 예시하고 있으나, 로바스타틴 0.06%는 콜레스테롤 저하 효과가 최대 3~6%로 저콜레스테롤 계란 생산에 효 과적이지 못한 것으로 나타나 있다. 따라서 로바스타틴, 심바스타틴 또는 아토르바스타틴을 이용한 저콜레스테롤 계란이 상품화될 가능성은 매우 희박하다고 할 수 있다.

콜레스테롤 저하제인 스타틴은 콜레스테롤 생합성 제한효소인 3-히드록시-3-메틸글루타릴 코엔자임 A 리덕타제(3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzyme A reductase, HMG-CoA reductase)를 저해하여 콜레스테롤 생합성 저해효과를 가지는 화학물질을 말한다. 사람이나 가축을 포함한 온혈동물의 체내에서 콜레스테롤은 아세틸코에이(acetyl-CoA)로부터 출발해 다단계 과정을 거쳐 합성되는데, 콜레스테롤 생합성 과정 중에서 가장 핵심적인 역할을 하는 과정은 HMG-CoA reductase에 의해 메발론산(mevalonic acid)이 합성되는 과정이다 (화학식 1).

스타틴은 메발론산과 유사한 구조를 가짐으로써 HMG-CoA reductase를 저해하는 콜레스테롤 생합성 저해물질이다. 이 계열의 약품으로는, 메바스타틴(mevastatin: 미국특허 3,983,140), 로바스타틴(lovastatin: 미국특허 4,231,938), 프라바스타틴(pravastatin: 미국특허 4,346,227), 심바스타틴(simvastatin: 미국특허 4,444,784와 4,450,171), 플루바스타틴(fluvastatin: 미국특허 4,739,073), 아토르바스타틴(atorvastatin: 미국특허 5,273,995), 세리바스타틴(cerivastatin: 5,502,199) 등이 있다.

상기 스타틴 중에서 콤팩틴(메바스타틴), 로바스타틴, 프라바스타틴만이 미생물 유래 스타틴으로 구분되며 나머지는 모두 유기합성을 통해 생산된다. 미생물 유래 스타틴은 다음 일반식(Ⅴ)와 같은 구조를 공통으로 가지는데, 6번 탄소의 반응기(R group)에 따라 콤팩틴(R:-H), 로바스타틴(R:-CH3), 프라바스타틴(R:-OH)으로 나눈다. 이들 스타틴은 하기 일반식(Ⅴ)의 산 (acid) 구조 이외에도 락톤 (lactone) 또는 염(salt) 형태로 존재한다.

(Ⅴ)

콤팩틴은 일반식(Ⅴ)의 구조에서 반응기가 수소(R; -H)인 구조로 페니실리움 (Penicillium)의 발효 배양액으로부터 처음 알려졌다 (미국 특허 3,983,140). 이후 콤팩틴 생산 균주들이 페니실리움 (P. citrinum, P. brevicompactum, P. cyclopium, P. adametzioides), 트리코더마 (Trichoderma viridae), 아스퍼질러스 (Aspergillus terreus), 글리오클라디움 (Gliocladium sp.) 등 여러 속에서 보고되었다 (미국 특허 3,983,140; 4,049,495; 4,137,322; 5,691,173; 한국특허 832801; 832329; 10-0378640). 콤팩틴은 콜레스테롤 저하제로 개발하기 위해 임상실험을 진행하던 중 심각한 인체독성이 보고되면서 임상실험이 중단된 바 있다. 그후 콤 팩틴 유도체들로 3-hydroxy cmpactin, 6-hydroxy compactin, 8a-hydroxy compactin, 4a, 5-dihydrocompactic acid, 5'-phosphocompactic acid, ML-236A 등이 알려져 연구되고 있다 (Chakravarti et al., 2004, Appl. Microbial. Biotechnol. 64:618-624).

프라바스타틴은 일반식(Ⅴ)의 6번 탄소에 하이드록실기(R: -OH)가 붙어있는 구조로, 역시 콤팩틴과 마찬가지로 인체에서 혈중 콜레스테롤 저하 효과를 가진다. 그러나 6번 탄소에 수소기를 가지는 콤팩틴과는 달리 하이드록실기를 가지는 프라바스타틴의 경우에는 콤팩틴의 문제점이었던 심각한 인체독성은 없어, 고콜레스테롤증 환자들을 위한 콜레스테롤 저하제로 사용되고 있다. 따라서 프라바스타틴은 콤팩틴을 이용하여 콤팩틴의 6번 탄소에 결합된 수소를 하이드록실기로 전환시키는 공정으로 생산되며 이 전환에는 효소나 또는 생전환 (bioconversion) 미생물 균주가 이용하고 있다 (미국특허 4,346,227). 프라바스타틴 생산에 사용되는 생전환 미생물 균주들은 스트렙토마이세스 (Streptomyces carbophilus, S. roseochromogenus subsp.), 노카디아 (Nocardia), 악티노마두라 (Actinomadura) 속등이 다양하게 보고되어 있다 (미국특허 5,942,423; 5,179,013; 4,537,859; 4,448,979; 4,346,227; 캐나다특허 1,150,170; 1,186,647; 한국특허 10-0414334; 10-0180706; Serizawa et al., 1983, J. Antibiotics 36: 887-891).

본 발명은 상용화가 가능한 경제성이 있는 방법으로 콜레스테롤 함량을 크게 저하시킨 저콜레스테롤 란을 생산하는 것을 목적으로 한다.

이를 위해 본 발명자들은, 아토르바스타틴이나 심바스타틴 등 종래의 스타틴을 이용한 방법에서 산란율의 저하가 저콜레스테롤 계란의 생산원가를 더욱 높이는 추가상승 원인이 되고 있다는 점에서 산란계의 산란율에 영향을 주지 않으면서 동시에 소량 사용으로도 알제품에 함유된 콜레스테롤을 저하시키는 효과가 큰 물질을 찾게 되었다.

본 발명에서는, 미생물 유래의 스타틴 중 일반 구조식(Ⅴ)의 구조에서 6번 탄소에 메칠기(-CH3)가 없는 스타틴의 경우 산란계의 산란율에는 영향을 주지 않으면서 알제품에 함유된 콜레스테롤를 저하시킬 수 있음이 밝혀진다.

또한, 본 발명에서는 미생물 유래 스타틴의 일반 구조식(Ⅴ)의 구조에서 6번 탄소에 메칠기(-CH3)가 없는 콤팩틴 및 그 유도체, 프라바스타틴 및 그 유도체는 아토르바스타틴이나 심바스타틴, 로바스타틴에 비해 1/10 내지 1/2 정도의 소량 사용으로도 알제품에 함유된 콜레스테롤을 크게 저하시킬 수 있음이 밝혀진다.

본 발명에서는 상기와 같은 연구결과를 토대로, 저콜레스테롤 란을 생산하기 위한 가금류용 콜레스테롤 저하제, 이를 포함하는 사료 및 사료첨가제, 이를 이용한 저콜레스테롤 란의 생산방법과 생산된 저콜레스테롤 란을 제공한다.

본 발명의 다른 목적 및 장점들은 하기에 설명될 것이며, 본 발명의 실시에 의해 더 잘 알게 될 것이다.

본 명세서에서 "가금류"는 그 알을 식용할 목적으로 사람이 사육 또는 양식하는 모든 조류를 포함하는 의미로 사용되며, 특히 닭, 오리, 타조, 칠면조 등이 이에 포함된다.

본 명세서에서 "알" 또는 "란"은 가금류로부터 식용을 목적으로 생산되는 모든 알제품을 포함하는 의미로 사용되며, 특히 계란, 메추리알, 타조알, 오리알 등이 이에 포함된다.

본 명세서에서 "저콜레스테롤 란" 또는 "저콜레스테롤 알제품"이란 특별히 한정하지 않는 한 정상 평균 알제품에 비해 콜레스테롤 수치가 유의성있게 낮아진 알제품을 의미한다.

본 발명에서는,

6번 탄소 위치에 수소기(-H)를 갖는 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 스타틴 구조 또는 그 염이나 에스테르로 표시되는 콤팩틴 또는 그 유도체를 저콜레스테롤 란을 생산하기 위한 유효성분으로 포함하는 가금류용 콜레스테롤 저하제가 제공된다.

(Ⅰ)

(Ⅱ)

콤펙틴은 메바스타틴(mevastatin) 또는 ML236B로도 불리는데, 일반식(Ⅰ)의 락톤(lactone) 구조, 일반식(Ⅱ)의 산(free acid) 구조, 또는 염이나 에스테르(salt와 ester)의 형태를 갖는 것을 모두 포함한다. 콤팩틴 유도체는 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 스타틴 구조 또는 그 염이나 에스테르로 표시되며 6번 탄소 위치에 수소기(-H)를 갖는 스타틴 유도체면 모두 포함되며, 예를 들어 3-히드록시 콤팩틴(3-hydroxy cmpactin), 6-히드록시 콤팩틴, 8a-히드록시 콤팩틴, 4a,5-디하이드로 콤 팩틴산(4a,5-dihydrocompactic acid), 5'-포스포콤팩틴산(5'-phosphocompactic acid), ML-236A, 등이 이에 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 콤팩틴 유도체 역시 미생물로부터 유래되는 콜레스테롤 생합성 저해물질이며, 이들을 생산하는 것으로 알려진 균주에는 Streptomyces roseochromogenus (3-hydroxy compactin), Mucor hiemalis (6-hydroxy compactin), Schizophyllum commune (8a-hydroxy compactin), Penicillum citrinum (4a, 5-dihydrocompactic acid), Carcinella muscae (5'-phosphocompactic acid), Emericella unguis (ML-236A) 등이 있다.

또한, 본 발명에서는

6번 탄소 위치에 히드록실기(-OH)를 갖는 일반식(Ⅲ) 또는 (Ⅳ)의 스타틴 구조 또는 그 염이나 에스테르로 표시되는 프라바스타틴, 프라바스타틴염 또는 그 유도체를 저콜레스테롤 란을 생산하기 위한 유효성분으로 포함하는 가금류용 콜레스테롤 저하제가 제공된다.

(Ⅲ)

(Ⅳ)

프라바스타틴은 콤팩틴의 미생물 생전환으로 얻어지는데, 엡타스타틴 (eptastatin), 메잘로틴(mezalotin), 또는 프라바콜 (pravachol)로도 불린다. 본 발명에서 프라바스타틴은 일반식(Ⅲ)의 락톤(lactone) 구조, 일반식(Ⅳ)의 산(carboxylic acid) 구조, 또는 그 염(salt)이나 에스테르(ester) 형태를 갖는 것을 모두 포함한다. 프라바스타틴 유도체는 일반식(Ⅲ) 또는 (Ⅳ)의 스타틴 구조 또는 그 염이나 에스테르로 표시되며 6번 탄소 위치에 히드록실기(-OH)를 갖는 스타틴 유도체면 모두 포함된다.

또한, 본 발명에서는 상기 가금류용 콜레스테롤 저하제를 포함하는 사료첨가제와 사료가 제공된다.

또한, 본 발명에서는

6번 탄소 위치에 수소기(-H)를 갖는 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 스타틴 구조 또는 그 염이나 에스테르로 표시되는 콤팩틴 또는 그 유도체를 가금류에 급이하여 저콜레스테롤 란을 생산하는 방법이 제공된다.

상기 콤팩틴 또는 그 유도체는 사료에 첨가하여 급이하거나 직접 급이할 수 있으며, 바람직하게는 0.0001∼3 중량%로 사료에 첨가되어 급이된다. 0.0001∼3 중량%로 사료에 첨가되어 1일 1회 이상, 5일 이상 급이할 경우 생산 란에서 통상 유의성 있는 콜레스테롤 저하 효과를 나타내게 되나, 이에 한정되는 것은 아니고 가금류의 종류에 따라 필요한 최소 급이량 및 급이 기간은 달라질 수 있다.

또한, 본 발명에서는 6번 탄소 위치에 히드록실기(-OH)를 갖는 일반식(Ⅲ) 또는 (Ⅳ)의 스타틴 구조 또는 그 염이나 에스테르로 표시되는 프라바스타틴 또는 그 유도체를 가금류에 급이하여 저콜레스테롤 란을 생산하는 방법이 제공된다.

프라바스타틴 및 그 유도체 또한 상기 콤팩틴 및 그 유도체와 같은 방법으로 가금류에 급이되어 저콜레스테롤 란을 생산할 수 있다.

본 발명에서 콤팩틴 및 그 유도체, 프라바스타틴 및 그 유도체로는, 정제된 제품외에 미생물 배양액의 정제과정에서 발생하는 중간산물 또는 공정 부산물로 발생되는 산업부산물 또는 이로부터 분리된 물질 등이 사용될 수 있다.

콤팩틴이나 프라바스타틴 및 그들 유도체는 유기합성된 스타틴이 아니라 미생물에 의해 생합성되는 미생물 유래의 스타틴이므로, 미생물 배양액의 정제 과정 을 거쳐 의약품으로 생산되게 된다. 즉, 미생물로부터 유래되는 콤팩틴이나 프라바스타틴 등을 생산하기 위해서는 먼저 이들 스타틴 생성 미생물을 배양한 후 스타틴이 포함되어 있는 배양액을 농축, 정제하는 과정을 거치게 되는데, 이때 공정 단계별로 스타틴이 포함된 부산물이 나오게 된다.

예를 들어, 프라바스타틴의 생산공정을 보면 C-6 hydroxylation 기능이 있는 미생물, 예를 들어 스트렙토마이세스를 증식시킨다. 다음 스트렙토마이세스 배양액에 콤팩틴을 첨가하면 콤팩틴의 생전환, 즉 C-6 hydroxylation 과정을 거쳐 프라바스타틴이 생산된다. 생전환이 일어난 미생물 배양액에서 스트렙토마이세스 균체를 제거하면 배양액이 남는데 이를 컬럼 크로마토그래피 등의 방법으로 정제하여 고순도의 프라바스타틴을 생산하게 된다. 이때 콤팩틴이 프라바스타틴으로 생전환되는 비율은 통상적으로 40~70%이므로, 배양액에는 사용되지 않은 콤팩틴과 생전환으로 생성된 프라바스타틴 및 불완전한 hydroxylation에 의한 콤팩틴 유도체 등이 존재하게 된다. 또한 배양액으로부터 분리된 균체물의 경우 역시 콤팩틴, 콤팩틴 유도체 또는 프라바스타틴 등 여러 종류의 스타틴이 소량 존재하게 된다. 또, 배양액으로부터 유기용매를 이용한 스타틴 분리정제과정에서 불완전한 회수로 인해 전처리액이나 컬럼 세척액, 컬럼 용출액 등 스타틴을 포함하는 산업부산물이 나오게 된다.

이와 같은 의약품 생산공정에서의 중간산물이나 공정 부산물로 발생되는 산업부산물은 추가정제 과정을 거치지 않고는 의약품 원재료로는 사용될 수 없으나 가축용으로는 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 이러한 중간산물이나 산업 부산물을 본 발명의 목적인 저콜레스테롤 란을 생산하기 위한 사료첨가제로 사용하여, 저렴한 비용으로 저콜레스테롤 란을 생산한다. 액상 형태인 이들 중간산물 및 산업부산물은 바람직하게는 열건조에 의해 고체상태의 건조물로 만들어서 사료첨가제로 사용될 수 있다.

이하 본 명세서에서 "중간산물 및 산업부산물"은, 공정 중간의 미생물 배양액, 배양액의 전처리 후 산물, 배양액으로부터 제거된 균체물, 컬럼 세척액이나 용출액, 생산공정 단계별로 얻어지는 공정부산물 등을 모두 포함하는 의미로 사용된다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 다음의 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술사상과 아래에 기재될 특허청구범위의 균등범위내에서 다양한 수정 및 변형이 가능한 것은 물론이다.

실시예 1

콤팩틴을 이용한 저콜레스테롤 계란

(1) 콜레스테롤 저하 사료첨가제의 급이

본 실험에서 실험동물은 45주령의 ISA brown 산란계를 사용하였다. 실험 산란계는 계사에 한 마리씩 분리하여 넣었으며, 대조군 8마리, 각 실험군 처리당 6마리씩으로 완전 임의 배치하였다. 실험동물 사육실의 실내온도는 25℃, 상대습도 50%, 명암 16L:8D 조건으로 조절하였다. 산란계를 계사와 사료에 2주간 적응시킨 후 실험을 시작하였다. 대조군의 식이는 옥수수와 대두를 바탕으로 하였고 구체적인 식이 조성은 표 1과 같다. 실험군의 식이는 대조군의 식이에 99% 정제 콤팩틴 염(시그마알드리치코리아 제품)을 0.003 및 0.03%로 첨가하여 급이하였다. 물과 실험식이를 자유급식하여 6주 동안 사육하였으며 사료 섭취량, 난생산량 및 난중량을 측정하였다. 산란율은 총 계란 수를 산란계 수로 나눈 백분율로 계산하였다.

(2) 산란계의 난 생산성

45주령 ISA brown 산란계에 대한 콤팩틴의 난 생산효과를 난중량과 산란율 측면에서 검토한 결과는 표 2와 같다. 사료에 0.003 및 0.03 중량% 비율로 콤팩틴 염(salt)을 첨가하여 6주의 실험기간 동안 급이한 처리군에서 난중량은 급이 후에도 60 g 이상을 유지하였다. 또한 0.003%와 0.03%로 콤팩틴 염을 처리한 두 개의 처리군 모두에서 산란율이 콤팩틴염의 첨가가 없는 대조군(0.000%)과 비슷한 정도 로 나타나 산란율의 큰 저하가 없는 것으로 관찰되었다. 이는 5주간 급이시 산란율이 70% 이하로 떨어지는 아토르바스타틴과 비교할 때 매우 큰 차이라고 할 수 있다.

(3) 계란의 콜레스테롤 분석

계란의 콜레스테롤 함량을 분석하기 위해 계란을 수집하여 난황을 난백으로부터 분리시킨 후 무게를 재고 분석을 실시하였다. 난황의 지방은 폴크(Folch) 법으로 추출하였다. 먼저 계란 난황 1 g을 33% KOH 용액 3 ㎖에서 균질화한 후 95% 메탄올 30 ㎖을 넣고 65℃의 항온수조에서 90분간 배양하였다. 다음에 헥산 10 mL과 물 3 mL을 넣은 후 10분간 진탕배양하였다. 표준용액으로는 5알파-콜레스탄(cholestan, Sigma C-8300)을 이용하였다. 콜레스테롤 분석은 VB-1 컬럼(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm, VICI Inc.)을 사용한 가스크로마토그래피(Shimadzu, Japan)를 이용하였다. 가스크로마토그래피의 주입기, 컬럼, 검출기의 온도는 각각 275℃, 290℃, 340℃이고 운반 기체는 질소를 사용하였으며 컬럼용출 속도는 0.54 mL/min이었다.

콜레스테롤 함량의 분석결과는 표 3과 같다. 대조군의 평균 난황 무게는 17.2g 으로, 콤팩틴은 대조군에 비해 약간의 난황 중량 감소를 보이는 것으로 나타났다. 대조군의 콜레스테롤 농도는 난황 1g 당 12.8mg이며, 콤팩틴 처리군은 대조군에 비해 콜레스테롤 농도가 유의성 있게 감소된 것으로 나타났다. 계란 내 콜레스테롤의 총 함량을 보면 0.003% 콤팩틴 처리군에서는 16%가 줄어 들었고, 특히 0.03% 콤팩틴 처리군에서는 콜레스테롤 함량이 29% 나 저하된 것으로 나타났다. 이러한 결과는 저콜레스테롤 계란의 생산을 위한 콤팩틴의 최소 급이량이 0.03% 미만임을 나타내는 것으로, 이는 종래 저콜레스테롤 란의 생산을 위해 사용되던 아토르바스타틴에 비해 최소한 2배 내지 3배 이상의 뛰어난 콜레스테롤 저하 효과를 나타내는 것이다.

실시예 2

프라바스타틴을 이용한 저콜레스테롤 계란

콜레스테롤 저하 사료첨가제로 콤팩틴염 대신에 프라바스타틴을 사료에 0.003, 및 0.03 중량% 비율로 첨가하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으 로 산란계에 급이하고, 동일한 방법으로 난 생산성과 계란의 콜레스테롤 함량을 측정하였다.

난중량과 산란율로 측정한 난 생산성의 결과는 표 4와 같다. 프라바스타틴 처리군은, 6주 동안의 실험 급이 후에도 산란율이 80% 이상으로 대조군과 비교시 유의성 있는 차이를 보이지 않았다. 이는 대조군에 비해 산란율이 15% 이상 저하되는 아토르바스타틴과는 매우 큰 차이이다.

계란의 콜레스테롤 함량을 분석한 결과는 표 5와 같다. 계란 콜레스테롤 함량은 프라바스타틴 첨가량에 비례하여 감소하였는데, 평균 난황 무게와 콜레스테롤 농도 모두 대조군보다 감소하였다. 특히 0.03%의 프라바스타틴 처리군에서는 콜레스테롤 함량이 24%나 저하된 저콜레스테롤 계란이 생산되는 것으로 확인되었다.

실시예 3

스타틴을 포함하는 산업부산물을 이용한 저콜레스테롤 계란

콜레스테롤 저하 사료첨가제로 콤팩틴의 생전환 반응이 완료된 스트렙토마이세스 배양액과 이 배양액으로부터 분리된 균체물을 다음과 같은 방법으로 건조하여 사용하였다.

먼저 콤팩틴의 생전환을 위한 미생물인 스트렙토마이세스 카르보필러스 (Streptomyces carbophilus) 단일 콜로니(colony)를 500㎖ 삼각플라스크에 들어있는 100㎖의 R2YE배지에 접종하여 27℃에서 200rpm으로 3일간 배양하였다. 배양액 10㎖을 500㎖ 삼각플라스크에 들어있는 100㎖의 생전환배지(glucose 2.0%, corn steep liquor 0.2%, K₂HPO₄ 0.15%, yeast extract 0.1%, MgSO₄.7H₂O 0.15%, ZnSO₄7H₂O 0.001%, NH₄NO₃ 0.1%, peptone 0.1%, pH 7.0)에 접종한 후 역시 27℃에서 200rpm으로 3일간 배양하였다. 다음 filter sterilization한 콤팩틴염(compactin salt)을 0.1 중량% 투입한 후 배양을 4일간 계속하였다. 생전환 반응이 일어난 배양액을 TLC로 정성분석한 결과 콤팩틴과 프라바스타틴이 동량으로 섞여 있었다. 이 배양액을 동결 건조기에서 24시간 건조시켜 얻어진 배양액 건조물을 콜레스테롤 저하 사료첨가제로 사용하였다. 또한 반응이 일어난 배양액을 3,000 X g로 원심분리하여 반응액과 균체를 분리하여 균체물을 얻고 이를 60℃ 건조기에서 24시간 건조시켜 얻어진 균체 건조물을 콜레스테롤 저하 사료첨가제로 사용하였다.

콜레스테롤 저하 사료첨가제로 콤팩틴염 대신에 상기와 같이 준비된 배양액 건조물 및 균체 건조물을 각각 0.5% 및 1% 중량로 사료에 첨가하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 산란계에 급이하고, 동일한 방법으로 난 생산성과 계란의 콜레스테롤 함량을 측정하였다.

난중량과 산란율로 측정한 난 생산성의 결과는 표 6과 같다. 계란의 중량은 대조군과 비교하여 처리군에서 큰 변화를 보이지 않았으며, 산란율은 대조군에 비해 오히려 약간 증가한 것으로 나타났다.

계란의 콜레스테롤 함량을 분석한 결과는 표 7과 같다. 계란의 콜레스테롤 함량은 산업부산물의 첨가량에 비례하여 감소하였으며, 평균 난황 무게와 콜레스테롤 농도 모두 대조군보다 감소하였다. 이로 인한 계란의 콜레스테롤 함량 변화를 보면 배양액 건조물의 경우 0.5%와 1% 처리군에서 각각 17%와 24%의 현저한 콜레스테롤 함량 저하 효과를 나타내었다. 균체 건조물의 경우도 0.5%와 1% 처리군에서 각각 13%와 17%의 콜레스테롤 함량 저하효과를 나타내었다.

본 발명에서는 산란율은 저하되지 않으면서 콜레스테롤 저하 효과가 뛰어난 콤팩틴 및 그 유도체, 프라바스타틴 및 그 유도체를 이용함으로써 종래의 합성 스타틴을 이용한 방법에 비해 많게는 1/20 에서 1/4까지 생산단가를 낮출 수 있으며, 나아가 미생물 배양액의 정제과정에서 발생하는 중간산물 및 산업부산물 등을 활용함으로써 일반 란과 비교해도 생산단가의 큰 상승없이 저콜레스테롤 란을 생산할 수 있다. 본 발명은 콜레스테롤 함량을 크게 낮춘 저콜레스테롤 란을 저렴한 방법으로 제공하여 1일 콜레스테롤 권장량 기준을 지키면서도 영양이 우수한 알제품을 충분히 섭취할 수 있도록 하며, 궁극적으로 식품을 통해 섭취되는 콜레스테롤 양을 줄여 현대인의 고콜레스테롤증 예방에 기여할 수 있다.

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Claims

6번 탄소 위치에 수소기(-H)를 갖는 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 스타틴 구조 또는 그 염이나 에스테르로 표시되는 콤팩틴 또는 그 유도체를, 산란계의 산란율을 저하시키지 않으면서 계란의 콜레스테롤 함량을 저하시키는 유효성분으로 포함하는 산란계용 사료첨가제.

(Ⅰ)

(Ⅱ)
청구항 1에 있어서,

상기 콤팩틴 또는 그 유도체는 미생물 배양액의 정제과정에서 발생하는 중간산물이나 산업부산물 또는 이로부터 분리된 물질의 형태로 사료에 포함되는 것을 특징으로 하는 산란계용 사료첨가제.
6번 탄소 위치에 히드록실기(-OH)를 갖는 일반식(Ⅲ) 또는 (Ⅳ)의 스타틴 구조 또는 그 염이나 에스테르로 표시되는 프라바스타틴 또는 그 유도체를, 산란계의 산란율을 저하시키지 않으면서 계란의 콜레스테롤 함량을 저하시키는 유효성분으로 포함하는 산란계용 사료첨가제.

(Ⅲ)

(Ⅳ)
청구항 1에 있어서,

상기 프라바스타틴 또는 그 유도체는 미생물 배양액의 정제과정에서 발생하는 중간산물이나 산업부산물 또는 이로부터 분리된 물질의 형태로 사료에 포함되는 것을 특징으로 하는 산란계용 사료첨가제.
6번 탄소 위치에 수소기(-H)를 갖는 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 스타틴 구조 또는 그 염이나 에스테르로 표시되는 콤팩틴 또는 그 유도체를, 산란계의 산란율을 저하시키지 않으면서 계란의 콜레스테롤 함량을 저하시키는 유효성분으로 포함하는 산란계용 사료.

(Ⅰ)

(Ⅱ)
청구항 5에 있어서,

상기 콤팩틴 또는 그 유도체는 미생물 배양액의 정제과정에서 발생하는 중간산물이나 산업부산물 또는 이로부터 분리된 물질의 형태로 사료에 포함되는 것을 특징으로 하는 산란계용 사료.
6번 탄소 위치에 히드록실기(-OH)를 갖는 일반식(Ⅲ) 또는 (Ⅳ)의 스타틴 구조 또는 그 염이나 에스테르로 표시되는 프라바스타틴 또는 그 유도체를, 산란계의 산란율을 저하시키지 않으면서 계란의 콜레스테롤 함량을 저하시키는 유효성분으로 포함하는 산란계용 사료.

(Ⅲ)

(Ⅳ)
청구항 7에 있어서,

상기 프라바스타틴 또는 그 유도체는 미생물 배양액의 정제과정에서 발생하는 중간산물이나 산업부산물 또는 이로부터 분리된 물질의 형태로 사료에 포함되는 것을 특징으로 하는 산란계용 사료.
6번 탄소 위치에 수소기(-H)를 갖는 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 스타틴 구조 또는 그 염이나 에스테르로 표시되는 콤팩틴 또는 그 유도체를 산란계에 급이하여 산란율을 저하시키지 않으면서 저콜레스테롤 란을 생산하는 방법.

(Ⅰ)

(Ⅱ)
청구항 9에 있어서,

상기 콤팩틴 또는 그 유도체는 미생물 배양액의 정제과정에서 발생하는 중간산물이나 산업부산물 또는 이로부터 분리된 물질의 형태로 산란계에 급이되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 9에 있어서,

상기 콤팩틴 또는 그 유도체는 0.0001∼3 중량%로 사료에 첨가되어 1일 1회 이상, 5일 이상 급이되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 9 내지 11 중 어느 한 항의 방법으로 생산된 저콜레스테롤 란.
6번 탄소 위치에 히드록실기(-OH)를 갖는 일반식(Ⅲ) 또는 (Ⅳ)의 스타틴 구조 또는 그 염이나 에스테르로 표시되는 프라바스타틴 또는 그 유도체를 산란계에 급이하여 산란율을 저하시키지 않으면서 저콜레스테롤 란을 생산하는 방법.

(Ⅲ)

(Ⅳ)
청구항 13에 있어서,

상기 프라바스타틴 또는 그 유도체는 미생물 배양액의 정제과정에서 발생하는 중간산물이나 산업부산물 또는 이로부터 분리된 물질의 형태로 산란계에 급이되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 13에 있어서,

상기 프라바스타틴 또는 그 유도체는 0.0001∼3 중량%로 사료에 첨가되어 1일 1회 이상, 5일 이상 급이되는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 13 내지 15 중 어느 한 항의 방법으로 생산된 저콜레스테롤 란.