CN115161355B - 一种利用发酵工艺制备高稳定性普伐他汀的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用发酵工艺制备高稳定性普伐他汀的方法，属于微生物技术领域。该方法包括以下步骤：S01，马杜拉放线菌种子培养；S02，马杜拉放线菌发酵；所述S02马杜拉放线菌发酵中，发酵培养基中含有复合提取物。本发明的利用发酵工艺制备高稳定性普伐他汀的方法，通过向发酵培养基中和发酵过程中添加菊苣提取物和豆粕提取物，可以显著提高普伐他汀的转化率。本发明的利用发酵工艺制备高稳定性普伐他汀的方法，添加的提取物的原料常见，提取的方法简单，成本低。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种利用发酵工艺制备高稳定性普伐他汀的方法。
背景技术
普伐他汀（Pravastatin）是三羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，能使VLDL（极低密度脂蛋白）和LDLC（低密度脂蛋白）降低，尤其是总胆固醇降低明显，对磷脂作用较弱，但对甘油三酯的作用不明显。
目前发酵法生产普伐他汀是两步发酵过程，首先，通过桔青霉等微生物发酵生产获得其次级代谢产物美伐他汀Mevastatin，又名康百汀Compactin，然后，通过微生物酶的转化作用，将美伐他汀转化为普伐他汀。
马杜拉放线菌的培养基显著影响普伐他汀转化的效率。CN108070623A公开了一种提高普伐他汀发酵产量的方法，发酵培养基中添加麸皮浸汁。CN102757986A公开了一种用马杜拉放线菌转化康百汀生产普伐他汀的发酵工艺，向发酵培养基中加入微量元素溶液。CN108977469A公开了米糠粕浸汁在生产普伐他汀中的应用，将米糠粕浸汁添加到培养基中。
发明内容
本发明的研究人员广泛筛选了常见的植物果蔬和粮食作物，发现了菊苣提取物和豆粕提取物对于马杜拉放线菌转化美伐他汀为普伐他汀的影响，本专利即是基于该发现。
本发明在于公开一种利用发酵工艺制备高稳定性普伐他汀的方法，包括以下步骤：
S01，马杜拉放线菌种子培养；
S02，马杜拉放线菌发酵；
所述S02马杜拉放线菌发酵中，发酵培养基中含有复合提取物，所述复合提取物包括菊苣提取物和豆粕提取物。
在本发明的一些优选的实施方式中，还包括S02马杜拉放线菌发酵中补充复合提取物的步骤。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述菊苣提取物为菊苣根提取物或菊苣茎提取物。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述复合提取物包括菊苣根提取物和豆粕提取物。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述菊苣提取物的制备方法为用乙醇水溶液提取。优选地，菊苣根或茎粉碎后，用10倍（mL/g）的95%乙醇浸泡24h后，在80℃水浴锅中回流浸提2h，再重复2次,合并滤液，真空减压浓缩后冷冻干燥，得到状所述菊苣根提取物。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述豆粕提取物的制备方法为先用乙醇水溶液提取，再用乙酸乙酯提取。优选地，低温豆粕用10倍（mL/g）的60-80%乙醇水溶液，在55-70℃水浴锅中回流浸提1.5-2.5h，提取1-3次，合并滤液，真空减压浓缩，回收乙醇，加入1.5-2.5倍（mL/g）的乙酸乙酯，乙酸乙酯相真空减压浓缩后冷冻干燥，得到所述豆粕提取物。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述复合提取物中菊苣提取物和豆粕提取物的重量比为（1-5）：（1-5），优选为（2-4）：1。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述复合提取物在发酵培养基中的含量为0.3-2g/L，优先为1-1.5g/L。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述补充复合提取物在发酵进行50-80h后添加，添加的量为0.3-2g/L培养液，优先为1-1.5g/L培养液。
在本发明的一些优选的实施方式中，S01中，种子培养基接种斜面种子马杜拉放线菌，三角瓶摇床30-34℃培养55-65h，得到种子液；
优选每升所述种子培养基包括葡萄糖25-35g，酵母膏15-25g，大豆蛋白胨3-8g，K2HPO4·3H2O1-3g，MgSO4·7H2O0.5-1g，大豆油0.5-1.5g。
在本发明的一些优选的实施方式中，S02中，发酵培养基按5-15%的体积比例接种种子液，生物发酵罐中31-34℃培养35-45h后，调节温度至28-30℃，持续加入美伐他汀至170-185h，保持美伐他汀在培养基中的浓度为0.3-0.8g/L，190-200h结束发酵；
优选，所述每升发酵培养基包括葡萄糖45-55g，酵母提取物20-30g，大豆蛋白胨5-10g，K2HPO4·3H2O2-5g，MgSO4·7H2O0.5-1.5g，复合提取物0.3-2g，大豆油0.5-1.5g。
在本发明的一些优选的实施方式中，S01中，在培养至90-120h时，按0.5-1.5g/L发酵液的量，向发酵罐中补充复合提取物。
在本发明的一些优选的实施方式中，为了考察美伐他汀不同浓度下，马杜拉放线菌的生长率和对普伐他汀的转化率，采用以下公式进行估算：
其中，
为最大比生长速率，h-1；
为美伐他汀浓度，g·L-1；
为马杜拉放线菌
浓度，g·L-1；
和
为常数，
为普伐他汀浓度，g·L-1；
其中，
为马杜拉放线菌对美伐他汀的得率系数，g·g-1；
为马杜拉放线菌对普
伐他汀的得率系数，g·g-1；
经过Monod模型的回归分析，
为0.26，
为0.95，
为0.08，
为0.06。
上述参数，可以很好的对马杜拉放线菌的生长和对普伐他汀转化的进行估算，用于调整发酵液中适宜的美伐他汀的浓度。
本发明中，所述菊苣为菊科菊苣属植物Cichoriumintybus，所述低温豆粕为市售商品，符合《低温食用豆粕（GB/T21494-2008)》的标准。
本发明的有益技术效果是：
本发明的利用发酵工艺制备高稳定性普伐他汀的方法，通过向发酵培养基中和发酵过程中添加菊苣提取物和豆粕提取物，可以显著提高普伐他汀的转化率。
本发明的利用发酵工艺制备高稳定性普伐他汀的方法，添加的提取物的原料常见，提取的方法简单，成本低。
本发明的利用发酵工艺制备高稳定性普伐他汀的方法，可以很好的对马杜拉放线菌的生长和对普伐他汀转化的进行估算，用于调整发酵液中适宜的美伐他汀的浓度。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
下述实施例和对比例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例和对比例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例和/或对比例中，加入2倍体积的乙酸乙酯，是以初始的低温豆粕剂量，即每100g低温豆乙醇水溶液粕提取后，加入200mL的乙酸乙酯。发酵过程中每10h检测发酵液中美伐他汀的浓度，若低于0.4g/L，则加美伐他汀至0.5g/L。为了方便进料，可以用少量溶剂溶解。
若非特别指出，实施例和对比例为组分、组分含量、制备步骤、制备参数相同的平行试验。
实施例1
一种利用发酵工艺制备高稳定性普伐他汀的方法，包括以下步骤：
（1）制备菊苣根提取物
取100g干燥的菊苣根，粉碎，1000mL的95%乙醇浸泡24h后，在80℃水浴锅中回流浸提2h，再重复2次。合并滤液，真空减压浓缩后冷冻干燥，得到状所述菊苣根提取物。
（2）制备豆粕提取物
取100g低温豆粕，加入250ml纯化水，加入750ml的95%乙醇，在60℃水浴锅中回流浸提2h，再重复2次。合并滤液，真空减压浓缩，回收乙醇，加入2倍体积的乙酸乙酯，乙酸乙酯相真空减压浓缩后冷冻干燥，得到所述豆粕提取物。
（3）种子培养：
种子培养基接种斜面种子马杜拉放线菌，三角瓶摇床32℃培养60h，得到种子液。
所述每升种子培养基包括葡萄糖30g，酵母膏20g，大豆蛋白胨5g，K2HPO4·3H2O2g，MgSO4·7H2O0.5g，大豆油1.0g。121℃湿热灭菌20min。
（4）发酵培养
发酵培养基按10%的体积比例接种种子液，生物发酵罐中32℃培养40h后，调节温度至30℃，持续加入美伐他汀至180h，保持美伐他汀在培养基中的浓度为0.5g/L，192h结束发酵。在培养至110h时向发酵罐中补充1g/L复合提取物。
所述每升发酵培养基包括葡萄糖50g，酵母提取物25g，大豆蛋白胨7g，K2HPO4·3H2O3g，MgSO4·7H2O1g，复合提取物1g，大豆油1.0g。121℃湿热灭菌20min。
1g复合提取物中包括0.75g菊苣根提取物和0.25g豆粕提取物。
实施例2
一种利用发酵工艺制备高稳定性普伐他汀的方法，包括以下步骤：
（1）制备菊苣根提取物
取100g干燥的菊苣根，粉碎，1000mL的95%乙醇浸泡24h后，在80℃水浴锅中回流浸提2h，再重复2次。合并滤液，真空减压浓缩后冷冻干燥，得到状所述菊苣根提取物。
（2）制备豆粕提取物
取100g低温豆粕，加入250ml纯化水，加入750ml的95%乙醇，在60℃水浴锅中回流浸提2h，再重复2次。合并滤液，真空减压浓缩，回收乙醇，加入2倍体积的乙酸乙酯，乙酸乙酯相真空减压浓缩后冷冻干燥，得到所述豆粕提取物。
（3）种子培养：
种子培养基接种斜面种子马杜拉放线菌，三角瓶摇床32℃培养60h，得到种子液。
所述每升种子培养基包括葡萄糖30g，酵母膏20g，大豆蛋白胨5g，K2HPO4·3H2O2g，MgSO4·7H2O0.5g，大豆油1.0g。121℃湿热灭菌20min。
（4）发酵培养
发酵培养基按10%的体积比例接种种子液，生物发酵罐中32℃培养40h后，调节温度至30℃，持续加入美伐他汀至180h，保持美伐他汀在培养基中的浓度为0.5g/L，192h结束发酵。在培养至110h时向发酵罐中补充1g/L复合提取物。
所述每升发酵培养基包括葡萄糖50g，酵母提取物25g，大豆蛋白胨7g，K2HPO4·3H2O3g，MgSO4·7H2O1g，复合提取物1g，大豆油1.0g。121℃湿热灭菌20min。
1g复合提取物中包括0.50g菊苣根提取物和0.50g豆粕提取物。
实施例3
一种利用发酵工艺制备高稳定性普伐他汀的方法，包括以下步骤：
（1）制备菊苣根提取物
取100g干燥的菊苣根，粉碎，1000mL的95%乙醇浸泡24h后，在80℃水浴锅中回流浸提2h，再重复2次。合并滤液，真空减压浓缩后冷冻干燥，得到状所述菊苣根提取物。
（2）制备豆粕提取物
取100g低温豆粕，加入250ml纯化水，加入750ml的95%乙醇，在60℃水浴锅中回流浸提2h，再重复2次。合并滤液，真空减压浓缩，回收乙醇，加入2倍体积的乙酸乙酯，乙酸乙酯相真空减压浓缩后冷冻干燥，得到所述豆粕提取物。
（3）种子培养：
种子培养基接种斜面种子马杜拉放线菌，三角瓶摇床32℃培养60h，得到种子液。
所述每升种子培养基包括葡萄糖30g，酵母膏20g，大豆蛋白胨5g，K2HPO4·3H2O2g，MgSO4·7H2O0.5g，大豆油1.0g。121℃湿热灭菌20min。
（4）发酵培养
发酵培养基按10%的体积比例接种种子液，生物发酵罐中32℃培养40h后，调节温度至30℃，持续加入美伐他汀至180h，保持美伐他汀在培养基中的浓度为0.5g/L，192h结束发酵。在培养至110h时向发酵罐中补充1g/L复合提取物。
所述每升发酵培养基包括葡萄糖50g，酵母提取物25g，大豆蛋白胨7g，K2HPO4·3H2O3g，MgSO4·7H2O1g，复合提取物1g，大豆油1.0g。121℃湿热灭菌20min。
1g复合提取物中包括0.25g菊苣根提取物和0.75g豆粕提取物。
实施例4
一种利用发酵工艺制备高稳定性普伐他汀的方法，包括以下步骤：
（1）制备菊苣根提取物
取100g干燥的菊苣根，粉碎，1000mL的95%乙醇浸泡24h后，在80℃水浴锅中回流浸提2h，再重复2次。合并滤液，真空减压浓缩后冷冻干燥，得到状所述菊苣根提取物。
（2）制备豆粕提取物
取100g低温豆粕，加入250ml纯化水，加入750ml的95%乙醇，在60℃水浴锅中回流浸提2h，再重复2次。合并滤液，真空减压浓缩，回收乙醇，加入2倍体积的乙酸乙酯，乙酸乙酯相真空减压浓缩后冷冻干燥，得到所述豆粕提取物。
（3）种子培养：
种子培养基接种斜面种子马杜拉放线菌，三角瓶摇床32℃培养60h，得到种子液。
所述每升种子培养基包括葡萄糖30g，酵母膏20g，大豆蛋白胨5g，K2HPO4·3H2O2g，MgSO4·7H2O0.5g，大豆油1.0g。121℃湿热灭菌20min。
（4）发酵培养
发酵培养基按10%的体积比例接种种子液，生物发酵罐中32℃培养40h后，调节温度至30℃，持续加入美伐他汀至180h，保持美伐他汀在培养基中的浓度为0.5g/L，192h结束发酵。在培养至110h时向发酵罐中补充1g/L复合提取物。
所述每升发酵培养基包括葡萄糖50g，酵母提取物25g，大豆蛋白胨7g，K2HPO4·3H2O3g，MgSO4·7H2O1g，复合提取物0.8g，大豆油1.0g。121℃湿热灭菌20min。
1g复合提取物中包括0.75g菊苣根提取物和0.25g豆粕提取物。
实施例5
一种利用发酵工艺制备高稳定性普伐他汀的方法，包括以下步骤：
（1）制备菊苣根提取物
取100g干燥的菊苣根，粉碎，1000mL的95%乙醇浸泡24h后，在80℃水浴锅中回流浸提2h，再重复2次。合并滤液，真空减压浓缩后冷冻干燥，得到状所述菊苣根提取物。
（2）制备豆粕提取物
取100g低温豆粕，加入250ml纯化水，加入750ml的95%乙醇，在60℃水浴锅中回流浸提2h，再重复2次。合并滤液，真空减压浓缩，回收乙醇，加入2倍体积的乙酸乙酯，乙酸乙酯相真空减压浓缩后冷冻干燥，得到所述豆粕提取物。
（3）种子培养：
种子培养基接种斜面种子马杜拉放线菌，三角瓶摇床32℃培养60h，得到种子液。
所述每升种子培养基包括葡萄糖30g，酵母膏20g，大豆蛋白胨5g，K2HPO4·3H2O2g，MgSO4·7H2O0.5g，大豆油1.0g。121℃湿热灭菌20min。
（4）发酵培养
发酵培养基按10%的体积比例接种种子液，生物发酵罐中32℃培养40h后，调节温度至30℃，持续加入美伐他汀至180h，保持美伐他汀在培养基中的浓度为0.5g/L，192h结束发酵。在培养至110h时向发酵罐中补充1g/L复合提取物。
所述每升发酵培养基包括葡萄糖50g，酵母提取物25g，大豆蛋白胨7g，K2HPO4·3H2O3g，MgSO4·7H2O1g，复合提取物1.5g，大豆油1.0g。121℃湿热灭菌20min。
1g复合提取物中包括0.75g菊苣根提取物和0.25g豆粕提取物。
对比例1
与实施例1的区别在于，发酵培养基的菊苣根提取物用菊苣茎提取物代替，其中，菊苣茎提取物的提取方法与菊苣根提取物的提取方法相同。
对比例2
与实施例1的区别在于，乙醇相（即分离乙酸乙酯相后剩余的）的物质真空减压浓缩后冷冻干燥，得到所述豆粕提取物。
对比例3
与实施例1的区别在于，所述发酵培养基中不含复合提取物。
实验例
取实施例和对比例的结束发酵的培养液，测定其中的美伐他汀和普伐他汀的含量，计算转化率。转化率=普伐他汀的量/美伐他汀的量×100%。结果见表1。
表1复合提取物对转化率的影响
同一列数据中，不同的小写字母表示差异显著，P＜0.05
从表1中可以看出，添加菊苣根提取物和豆粕提取物的实施例1-5，转化率均显著优于不添加的对比例3，表明了菊苣根提取物和豆粕提取物对转化率的影响。实施例1-3中，实施例1为最优，表明了菊苣根提取物和豆粕提取物的不同比例对转化率的显著影响。对比例2与对比例3相比，转化率没有显著差异，对比例2与实施例1相比，转化率有显著差异，表明了豆粕提取溶剂的重要影响。对比例1与实施例1、对比例3相比，转化率有显著差异，表明了菊苣根提取物和菊苣茎提取物不来来源的影响。
取实施例和对比例的结束发酵的马杜拉放线菌菌丝，蒸馏水冲洗，离心，得到湿菌体，统计生物量，结果显示，实施例1-5的生物量与对比例1均没有统计学上的显著差异，表明了菊苣根提取物和豆粕提取物对转化率的影响不是基于马杜拉放线菌的生物量。
以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。
Claims (6)
1.一种利用发酵工艺制备高稳定性普伐他汀的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S01，马杜拉放线菌种子培养；
S02，马杜拉放线菌发酵；
所述S02马杜拉放线菌发酵中，发酵培养基中含有复合提取物，所述复合提取物包括菊苣提取物和豆粕提取物；
所述菊苣提取物为菊苣根提取物或菊苣茎提取物；
所述菊苣提取物的制备方法为用乙醇水溶液提取；
所述豆粕提取物的制备方法为先用乙醇水溶液提取，再用乙酸乙酯提取；
所述复合提取物中菊苣提取物和豆粕提取物的重量比为（1-5）：（1-5）；
S01中，每升种子培养基包括葡萄糖25-35g，酵母膏15-25g，大豆蛋白胨3-8g，K2HPO4·3H2O1-3g，MgSO4·7H2O0.5-1g，大豆油0.5-1.5g；
S02中，每升发酵培养基包括葡萄糖45-55g，酵母提取物20-30g，大豆蛋白胨5-10g，K2HPO4·3H2O2-5g，MgSO4·7H2O0.5-1.5g，复合提取物0.3-2g，大豆油0.5-1.5g。
2.根据权利要求1所述的利用发酵工艺制备高稳定性普伐他汀的方法，其特征在于，还包括S02马杜拉放线菌发酵中补充所述复合提取物的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的利用发酵工艺制备高稳定性普伐他汀的方法，其特征在于，S02中，所述复合提取物在发酵培养基中的含量为0.3-2g/L；
和/或，S02中，在发酵进行50-80h后添加所述复合提取物，添加的量为0.3-2g/L培养液。
4.根据权利要求1或2所述的利用发酵工艺制备高稳定性普伐他汀的方法，其特征在于，S01中，种子培养基接种斜面种子马杜拉放线菌，三角瓶摇床30-34℃培养55-65h，得到种子液。
5.根据权利要求1或2所述的利用发酵工艺制备高稳定性普伐他汀的方法，其特征在于，S02中，发酵培养基按5-15%的体积比例接种种子液，生物发酵罐中31-34℃培养35-45h后，调节温度至28-30℃，持续加入美伐他汀至170-185h，保持美伐他汀在培养基中的浓度为0.3-0.8g/L，190-200h结束发酵。
6.根据权利要求1或2所述的利用发酵工艺制备高稳定性普伐他汀的方法，其特征在于，S01中，在培养至90-120h时，按0.5-1.5g/L发酵液的量，向发酵罐中补充复合提取物。
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