JP2603677B2 - 新規なチトクロムｐ−４５０及びその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の目的〕 本発明は新規な酸素添加酵素であるチトクロムＰ−45
0に関するものである。

従来チトクロムＰ−450は動物、植物、微生物に存在
し、重要な生理活性物質の生合成を行なったり、生体外
異物の解毒作用を行なう一原子酸素添加酵素である。基
質としては天然物、薬物等の広い範囲にわたる。チトク
ロムＰ−450は補酵素としてNAD（Ｐ）Ｈ、電子伝達系蛋
白質、分子状酸素を要求し、下記の如き機構が考えられ
ている。

上記の図において、還元力として使用される電子はNA
D（Ｐ）Ｈから電子伝達系蛋白により供給される。

公知のチトクロムＰ−450は真核生物由来の水不溶性
のチトクロムＰ−450が多い。原核生物から精製された
チトクロムＰ−450としては例えばシュードモナス・プ
チダ（Pseudomonas putida）のＰ−450_cam（ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Che
m.）249巻、94頁、1974年）、バチルス・メガテリウム
（Bacillus megaterium）ATCC14581のＰ−450_BM-1（ビ
オキミカ・ビオフイジカ・アクタ（Biochim.Biophys,Ac
ta.）838巻,302頁,1985年）、及びＰ−450_BM-3（ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.C
hem.）261巻,7160頁,1986年）、リゾビウム・ジャポニ
カム（Rhizobium japonicum）のＰ−450a,P−450b及び
Ｐ−450c（ビオキミカ・ビオフイジカ・アクタ（Biochi
m.Biophys.Acta）147巻,399頁,1967年）、ノカルデイア
NHI（Nocardia NHI）のＰ−450_npd（ミクロビオス（Mic
robios）９巻,119頁,1974年）等が知られている。しか
しながら、ストレプトミセス（Streptomyces）属放線菌
から精製されたチトクロムＰ−450の例は少ない。例え
ばストレプトミセス・グリゼウス（Streptomyces gris
eus）のチトクロムＰ−450が大豆粉から誘導されること
（バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサー
チ・コミュニケーション（Biochem.and Biophys.Res.Co
mm.）141巻,405頁,1986年）や、サッカロポリスポラ・
エリスラエア（Saccharopolyspora erythraea）（以前
はストレプトミセス・エリスラエウス（Streptomyces e
rythraeus）として分類されていた）の６−デオキシエ
リスロノライドＢの水酸化を触媒する２つのチトクロム
Ｐ−450の精製と性質についての報告がある（バイオケ
ミストリー（Biochemstyr）26巻,6204頁,1987年）にす
ぎない。

〔発明の構成〕

本発明のチトクロムＰ−450_sca-1,同Ｐ−450_sca-2お
よび同Ｐ−450_sca-3はストレプトミセス・カルボフィラ
スSANK 62585（Streptomyces carbophilus SANK 6258
5,FERM BP−1145）から抽出精製された。

次に、本発明の使用菌であるストレプトミセス・カル
ボフィラスSANK 62585株の菌学的性状を述べる。

1. 形態学的特徴 形態はISP〔インターナショナル・ストレプトマイセ
ス・プロジェクト（International Streptomyces Proje
ct）〕規定の培地上、28℃、14日間培養後、顕微鏡下で
観察した。SANK62585株の基生菌糸は分枝して良く伸長
し、気菌糸は単純分枝である。

SANK 62585株の胞子鎖の形態は通常直状〜曲状である
が螺旋状を示す場合もある。胞子鎖の表面構造は平滑
（smooth）を示す。また気菌糸の車軸分枝、菌核、基生
菌糸の断裂、胞子のうなどの特殊器官は観察されなかっ
た。

2. 各種培養基上の諸性質 各種培養基上で28℃、14日間培養後の性状は表Ｉに示
す通りである。色調の表示は日本色彩研究所版、“標準
色票”のカラーチップ ナンバーを表わす。

3. 生理学的性質 SANK 62585株の生理学的性質は表IIに示す通りであ
る。

表II SANK 62585株の性状 澱粉の水解 陽 性 ゼラチンの液化 陰 性 硝酸塩の還元 陽 性 ミルクの凝固 陽 性 ミルクのペプトン化 陽 性 生育温度範囲（培地１）^＊ 4〜45℃ 生育適正温度（培地１） 15〜35℃ メラニン様色素生産地（培地２） 陰 性 （培地３） 疑陽性^＊＊ （培地４） 陰 性 ＊：培地1;イーストエキス・麦芽エキス寒天（ISP 2） 2;トリプトン・イーストエキス・ブロス（ISP 1） 3;ペプトン・イーストエキス・鉄寒天（ISP 6） 4;チロシン寒天（ISP 7） ＊＊：培養後期にメラニン様色素が生産される場合もあ
る。

また、プリドハム・ゴトリーブ、寒天培地を使用し
て、14日間培養後の炭素源、即ちＤ−グルコース、Ｌ−
アラビノース、Ｄ−キシロース、イノシトール、Ｄ−マ
ンニトール、Ｄ−フルクトース、Ｌ−ラムノース、シュ
クロース、ラフイノース、セロビオース、トレハロース
の資化性を調べた。SANK 62585株は炭素源無添加の対照
培地でも良好に生育がみられるため、正確な資化性を記
述することは困難である。しかしながら、Ｄ−グルコー
ス、Ｄ−キシロース、イノシトール、ラフイノース、セ
ロビオース、トレハロース添加培地では無添加対照培地
に比べ著しく良好な生育がみられた。

4. 菌体成分について SANK 62585株の細胞壁はビー・ベッカーらの方法〔B.
Becker et al.,アプライド・マイクロバイオロジー（Ap
plied Microbiology）、12巻,421〜423頁,1964年〕に従
い検討した結果、L,L−ジアミノピメリン酸およびグリ
シンが検出されたことから、細胞壁タイプＩであること
が確認された。また、SANK 62585株の全細胞中の糖成分
をエム・ピー・レシエバリエの方法〔M.P.Lechevalier,
ジャーナル・オブ・ラボラトリイ・アンド・クリニカル
・メデイシン（Journal of Laboratory and Clinical M
edicine）,71巻,934頁,1968年〕に従い検討した結果、
特徴的なパターンは認められなかった。

以上のことから、本菌株は放線菌の中でもストレプト
ミセス属に属することが判明したので、ストレプトミセ
ス・カルボフイラス（Streptomyces carbophilus）SANK
62585（微工研条寄第1145号（FERM BP−1145））と命
名された。

なお、SANK 62585株の同定はISP〔ジ・インターナシ
ョナル・ストレプトマイセス・プロジェクト（The Inte
rnational Streptomyces Project）〕基準〕バージーズ
・マニュアル（Bergey's Manual of Determinative Bac
teriology）版；エス・エイ・ワックスマン（S.A.Waksm
an）著ジ・アクチノミセイテス（The Actinomycetes）
第２巻および放線菌に関する最近の文献によって行っ
た。

以上、SANK 62585株について説明したが、放線菌は諸
性質は一定したものでなく、自然的、人工的に容易に変
化することは周知のとおりであり、本発明で使用しうる
菌株はストレプトミセス属に属し、本発明のチトクロム
Ｐ−450を生産し得る菌株すべてを包含するものであ
る。

次に本酵素の製造法について具体的に述べる。

本発明における菌株の培養は適当な炭素源、窒素源
等、例えば無機塩類、脱脂大豆、小麦、コーンスチープ
リカー、グルコース、酵母エキス、ペプトン等を適宜含
有させ、常法により殺菌した液体培地（pH5〜８に調節
したもの）に種菌を接種して行なう。そしてＰ−450
_sca-1,P−450_sca-2,P−450_sca-3を生産するには、培養
を以下の方法で行なう。即ち、接種後４時間〜３日後に
適当な誘導剤を１〜5mM、好ましくは2mMを加え、その後
２時間から１週間、特に１日間培養を行なうのが好適で
ある。培養温度は20〜45℃、好ましくは25〜30℃、最適
には28℃付近が望ましい。また、培養は振盪、通気培養
のいずれを用いてもよい。培養して得られた菌体を緩衝
液中で超音波破砕し、次いで遠心分離して得られた上清
を粗酵素液として用いる。電気泳動的に均一なＰ−450
_sca-1,P−450_sca-2,P−450_sca-3を得るには、粗酵素液
をイオン交換カラムクロマトグラフィーによる吸着及び
溶出、ハイドロキシルアパタイトカラムクロマトグラフ
ィーによる吸着及び溶出、ゲル過等を適宜選択、組合
せて実施する。

本発明の酵素は水酸化酵素として有用である。これら
は種々の化合物を水酸化する。

酵素を基質と接触させるには、好ましくは水性媒体中
である。例えばリン酸緩衝液中でpH範囲が５〜９、好ま
しくは6.5〜8.0、最適には約7.4である。反応温度は好
ましくは20〜45℃であり、更に好ましくは25〜30℃であ
る。最適には約30℃である。基質濃度は好ましくは0.01
〜5.0％重量の範囲である。反応に要する時間は通常１
分〜５日であり、好ましくは１〜５日であるが、反応混
合物中の基質濃度、反応温度、その他の要因により変わ
る。

変換反応終了後、得られた水酸化化合物は常法、例え
ばろ過、抽出、クロマトグラフィー、再結晶その他の分
取手段により分取される。

本発明は更に互に著るしく構造の異なる化合物、即ち
ミルベマイシンのようなマクロライド化合物やML−236B
化合物に関する。

16員環マクロライド構造をもつ数種の既知化合物が各
種微生物の醗酵あるいはそのような天然醗酵産物からの
化学的誘導により半合成的に得られ、そして殺ダニ、殺
虫、駆虫およびその他の殺寄生虫活性を示す。ミルベマ
イシン類とアベルメクチン類は既知化合物のこのような
二つのクラスの例であるが、他にもまた種々のクラスが
存在し、別の名称あるいはコード番号によって同定され
ている。これらの種々のマクロライド化合物の名称は、
一般に各クラスの天然物を産生する微生物の名称または
コード番号から採られてきた。そしてこれらの名称は、
従来そのような化合物に一般的に使用しうる標準的組織
的な命名法がなかったために、さらに同じクラスの化学
的誘導体に対しても用いられる。天然のミルベマイシン
類は次のように式（Ａ）で定義されている。

疑いを避けるために、式（Ａ）は本発明化合物に最も
適切な若干の炭素原子の番号をも示している。４位のメ
チル基の炭素原子には26と番号を付けられた。

天然に産生されたミルベマイシンA₃およびA₄はその他
多数のものと共に特公昭56−45890に、またミルベマイ
シンＤは特開昭56−32481に公表された。これら特許に
おいてミルベマイシンは「化合物Ｂ−41」として示され
た。これらの化合物は、上記式（Ａ）において25位にそ
れぞれメチル基、エチル基またはイソプロピル基が置換
している。25位がsec−ブチル基が置換したミルベマイ
シン類縁体は特開昭54−145699に公表されている。

13−ヒドロキシ−５−ケトミルベマイシン誘導体は米
国特許第4423209号に公表されている。ミルベマイシン
５−オキシム誘導体は特開昭60−14299に、そして特開
昭62−89685に公表された。特開昭61−180787は５位の
ヒドロキシまたはエステル化ヒドロキシ置換基と組合せ
て13位にエステル化カルボキシ置換基をもつミルベマイ
シン誘導体を公表した。

ミルベマイシン類のように、アベルメクチン類も16員
環マクロライド構造を有している。アベルメクチン類は
例えば、Antimicrobial Agents Chemotherapy 1979,15,
361（1979）およびJ.Am.Chem.Soc.,1981,103,4216に公
表された。これらの化合物は13位が４′−（α−Ｌ−オ
レアンドロシル）−α−Ｌ−オレアンドロシルオキシ基
で置換されている以外、上記式（Ａ）によって表わされ
る。25位はイソプロピル基またはsec−ブチル基で置換
されていて、そして22位と23位の間は炭素−炭素二重結
合があるかまたは23位に水酸基があり、４位にメチルが
置換されている。

アベルメクチン類は（文献によってはC076化合物と称
されている）次のように定義される。

“db"は22位と23位の間の二重結合を示し、 “sb"は22位と23位の間の一重結合を示す。

アベルメクチンA₂a,A₂b,B₂aおよびB₂bの23位ケト誘導
体は特開昭57−18684から知られている。22,23位ジヒド
ロアベルメクチン類は22位および23位の間の二重結合の
還元によって得られ、特開昭54−61198に公表されてい
る。ミルベマイシン類縁体であるアベルメクチン類のア
グリコン誘導体からさらに種々の誘導体が知られてい
る。例えば、特開昭54−61197は13位が低級アルカノイ
ル基で置換されたような誘導体を公表した。

特開昭58−59988は４位メチル基において誘導されて
いるアベルメクチン化合物を公表した。４位メチル基の
ヒドロキシメチル基への変換がアセチルオキシメチル、
ベンゾイルオキシメチルおよびその他のカルボニルオキ
シメチル化合物のような各種のオキシメチル誘導体の形
成と共に記載されている。

特開昭61−10589はコード番号LL−F28249によって一
括して同定され、醗酵により産生され、生物活性を有す
る一群の化合物を公表した。それらのうちの若干のもの
は23位が水酸基によって、また25位が１−メチル−１−
プロペニル、１−メチル−１−ブテニルまたは1,3−ジ
メチル−１−ブテニルで置換された上記式（Ａ）に対応
する16員環マクロライド構造を有している。これらの化
合物の中で、５位の水酸基はメトキシ基によって置換さ
れることもある。

Ｓ−541として同定される同一または類似の化合物は
特開昭61−118387に知られている。Ｓ−541の23位ケト
誘導体および23位デオキシ誘導体は特開昭61−280496に
知られている。22位および23位に炭素−炭素二重結合を
もつＳ−541誘導体は特開昭62−67087に公表されてい
る。Ｓ−541およびＳ−541の23位ケトおよび23位デオキ
シ誘導体の26位ヒイドロキシおよび26位C_1-4アルカノイ
ルオキシ誘導体は特開昭62−226984に知られている。

特開昭61−280496は５位に水酸基または置換された水
酸基、23位に水酸基、置換された水酸基、またはケト
基、また25位にα−分岐したアルケニル基を有し、上記
式（Ａ）に対応するマクロライド抗生物質の他の一群を
公表した。

上記の各種のクラスのミルベマイシン関連マクロライ
ド化合物はすべて駆虫剤、殺外部寄生虫剤、殺ダニ剤あ
るいはその他の農薬としての一つまたはそれ以上の活性
を有するといわれている。

本発明の酵素を用いて、水酸化マクロライド化合物が
製造できる。

次に、ML−236Bナトリウムの６β−ヒドロキシ体はCS
−514である。両者は共にコレステロール生合成の律速
酵素である３−ヒドロキシ−３−メチルグリタリルコエ
ンザイムＡレダクターゼの拮抗阻害剤であるが、CS−51
4の方がより臓器特異的である（ビオキミカ・ビオフイ
ジカ・アクタ（Biochim.Biophys.Acta）877巻,50頁,198
6年）。本発明のチトクロムＰ−450_sca-1、同_sca-2およ
び同_sca-3を適当な補酵素とくみ合わせればML−236Bナ
トリウムを６−ヒドロキシ−ML−236Bナトリウムへ変換
しうる。

本発明によって得られるチトクロムＰ−450_sca-1,同
_sca-2および同_sca-3の諸性質について述べ、併せてこれ
らの酵素が従来公知のチトクロムＰ−450と異なる新規
な酵素であることについて述べる。

（１） 作 用 いずれもフエレドキシン、フエレドキシン−NADP⁺−
レダクターゼ、NADPHおよび溶存酸素の存在下で、少な
くともミルベマイシンA₄の13位の水酸化およびML−236B
ナトリウムの６位の水酸化を行なう。

主生成物として６β−ヒドロキシ−ML−236Bナトリウ
ムが得られ、副生成物として６α−ヒドロキシ−ML−23
6Bナトリウムが得られる。

なお、補酵素としてはフエレドキシン、フエレドキシ
ン−NADP⁺−レダクターゼ、酸素およびNADPHに特定され
るものではなく、チトクロムＰ−450の活性種を作りう
るものならば何でもよい。

（２） 基質特異性 いずれも少なくともミルベマイシンA₄およびML−236B
ナトリウムを基質とするが、これに限定されるものでは
はい。

（３） 至適pH及び安定pH範囲 イ フエレドキシン、ロ フエレドキシン−NADP⁺−
レダクターゼ、ハ NADP⁺、ニ NADPHを再生する系、お
よびホ 溶存酸素存在下で、基質としてML−236Bナトリ
ウムを用いた場合、いずれも反応至適pHは6.5−8.0であ
った。

また、pH6.0−9.0の範囲で、いずれも４℃で24時間安
定であった。

（４） 酵素の局在 いずれもストレプトミセス・カルボフイラスSANK 625
85（FERMBP−1145）の粗酵素液（界面活性剤等は含まれ
ない）を105,000gで１時間遠心分離した上清に存在す
る。

（５） 酵素の誘導 当該酵素はいずれも培地中に適当な誘導剤をストレプ
トミセス・カルボフイラスSANK 62585（FERM BP−114
5）がある程度生育した後に添加しないと、生産されな
い。即ち、いずれも適当な誘導剤による誘導酵素であ
る。

（６） 精製方法 精製方法を表１に示す。菌体破砕後、透析、イオン交
換クロマトグラフィー、ゲル過及びハイドロキシルア
パタイトカラムクロマトグラフィーにより精製した。な
お、ハイドロキシルアパタイトクロマトグラフィーにお
いて、チトクロムＰ−450_sca-1はリン酸緩衝液濃度約0.
06M,同_sca-2は約0.08M,同_sca-3は約0.10Mにて溶出され
た。

（７） 単一性 いずれも精製標品はSDS−ポリアクリルアミド電気泳
動法により陽極側へ移動し単一なバンドを与えた。

（８） 分子量 SDS−ポリアクリルアミド電気泳動法により測定した
結果、本酵素の分子量はいずれも約46,000±1,000であ
った。

（９） 活性測定法 チトクロムＰ−450_sca-1,同_sca-2および同_sca-3の
測定法 大村と佐藤らの方法（J.Biol.Chem.,239巻,2370頁,19
64年）に従って測定した。即ち、CO−差スペクトルの45
0nmと490nmの吸収強度の差から次式により、チトクロム
Ｐ−450_sca-1,同_sca-2および同_sca-3を定量する。

チトクロムＰ−450（nmol/ml） ＝（O.D.450nm−O.D.490nm）×1,000/91（nmol/ml） ML−236BナトリウムからCS−514への変換速度測定
法 表２の系を用い全量配合の後、30℃で５分間振盪し、
10μの６規定の水酸化ナトリウムで反応を止め、生成
されたCS−514をHPLCで測定した。 表 ２ Ｐ−450を含む酵素液 0.14 ml NADPH再生系 NADP⁺ 0.26 mM グルコース−６−リン酸 14.0 mM グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ 0.2 unit ニコチンアミド 10.0 mM 塩化マグネシウム 2.5 mM フエレドキシン−NADP⁺−レダクターゼ（ホウレンソ
ウ） 0.04 unit フエレドキシン（ホウレンソウ） 320 μｇML−236Bナトリウム 0.233mM 合計容量 0.20 ml （10） 温度による失活、及びpHによる失活 いずれもpH7.4,20％グリセロール,2mMジチオスレイト
ール存在下で70℃で60分間の熱処理で完全に失活する。

いずれも20％グリセロール、2mMジチオスレイトール
存在下でpH3およびpH11以上（４℃,24時間処理）で完全
に失活する。

（但し、ML−236Bナトリウムを基質として反応させた場
合である） （11） 作用適温 いずれも作用適温は４℃〜60℃の範囲内にあり、特に
30℃付近が最適である（イ フエレドキシン、ロ フエ
レドキシン−NADP⁺−レダクターゼ、ハ NADP⁺、ニ NA
DPHを再生する系、およびホ 溶存酸素の存在下で、基
質としてML−236Bナトリウムを用いて、pH7.4のもとに
５分間作用させた場合）。

（12） 阻害剤 チトクロムＰ−450_sca-1,チトクロムＰ−450_sca-2,チ
トクロムＰ−450_sca-3に対する阻害剤及び金属イオンの
影響を前記の（９）活性測定法のの方法で、検討し
た。その結果を第３に示す。

いずれの酵素もCo²⁺,Mn²⁺,Cu²⁺により有意に阻害され
た。また、いずれの酵素もSKF−525A（２−ジエチルア
ミノエチル−2,2−ジフェニルバレレイトヒドロクロラ
イド）、シメチジン、一酸化炭素等の典型的なチトクロ
ムＰ−450の阻害剤により阻害された。

（13） 吸収スペクトル 絶対スペクトルはいずれも417nmで吸収極大を有す
る。

CO−差スペクトルはチトクロムＰ−450_sca-1は449n
m、同_sca-2および同_sca-3は448nmで吸収極大を有する。

（14） アミノ酸組成 アミノ酸分析は以下の如く行なった。

システィン（Cys）とトリプトファン（Trp）を除い
たすべてのアミノ酸は6N塩酸で110℃,24時間試料を加水
分解することにより得られた（詳細にはJ.W.Eveleigh a
nd G.D.Winter（1970）Protein Sequence Determinatio
n,Ed SBNeedleman,Springer−Verlag,92を参照）。

システィンに関してはE.Schrau et al（Biochem,
J.57,33,（1954））の方法によって分析を行なった。即
ち、過酸化水素−ギ酸の系でまず試料を酸化し、次に塩
酸加水分解して得られるシスティン酸を定量した。より
詳細には以下の通りである。

80μの試料水溶液を100μの99％ギ酸と20μ
のメタノールに溶解する。次に10μの過酸化水素と
190μの99％ギ酸を25℃で２時間静置する。との
両溶液は−10℃で30分冷却後、合わせる。この混合液を
−10℃で2.5時間静置する。そして、そのうちの160μ
の反応混合液の溶媒を留去し、凍結乾燥し、さらに6N塩
酸で110℃で24時間加水分解を行なった。

トリプトファンは3Nメルカプトエタンスルホン酸で
110℃、24時間加水分解することにより得られた（詳細
にはB Penke et al in Anal.Biochem.60,45,（1974）
参照）。

以上の全てのアミノ酸の定量は日立アミノ酸分析器Mo
del 835により行なわれた。

そして、以下のデータが得られた。

分析データの誤差は試料が完全に純粋だとすれば通常
±５％の範囲にある。加水分解を24時間,48時間,72時間
というように経時的に行なえば誤差範囲を±２％まで下
げることもできるデータの信頼性は２つの要因によって
左右される。その一つは各ペプチド結合の加水分解のさ
れやすさである。例えばVal−Val,Val−Gly等の結合さ
は比較的加水分解されにくい。これは加水分解の時間を
のばすことによりさけられる。他の一つは各アミノ酸の
加水分解の際の安定性である。例えばSerやThr等は比較
的不安定であることが知られている。この誤差は逆に加
水分解の時間をのばすことにより増大していく。

以上のように、まずＰ−450_sca-1,同_sca-2および同
_sca-3は105,000gで１時間遠心分離した上清に存在する
点で従来の真核生物中の膜結合性チトクロムＰ−450と
は異なる。また、分子量が46,000±1,000であること、
特有のアミノ酸組成を有すること等から、従来の原核生
物中のチトクロムＰ−450とも異なり、更にこれらはス
トレプトミセス属放線菌由来である点で文献未記録の新
規な酵素であると認めた。

次に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明はこれらの実施例に制約されるものではな
い。

実施例 ２％グルコース、１％ペプトン、0.1％酵母エキスを
含み、pH7.0に調整した培地20mlずつを10本の100ml容三
角フラスコに分注したものを121℃、15分間加熱殺菌し
た後、ストレプトミセス・カルボフイラスSANK 62585
（FERM BP−1145）を一白金耳接種し、28℃,220rpmにて
３日間前培養を行なった。同じ培地が100mlずつを50本
の500ml容三角フラスコに分注したものを121℃,15分間
加熱殺菌した。次いで、前培養液0.5mlずつを各500ml容
三角フラスコに接種して、同条件にて本培養を行なっ
た。本培養１日後、ML−236Bナトリウムを培地中0.1％
になるように添加し、更に１日間培養を行なった。培養
後、遠心分離機で菌体を採取し、190gの菌体を得た。こ
の菌体を２倍量の2mMジチオスレイトール及び20％グリ
セリンを含むpH7.4の80mMトリス−塩酸緩衝液に懸濁
し、超音波による菌体破砕を行なった。遠心分離により
細胞片を除き上清を粗酵素液として得た。この粗酵素液
に対して表１に示す方法でチトクロムＰ−450_sca-1,同
_sca-2および同_sca-3を精製した。粗酵素液を透析後、DE
AE−トヨパールクロマトグラフィーを２回実施し、次い
でセルロフアインクロマトグラフィーによるゲル過を
実施した。最後にハイドロキシルアパタイトカラムクロ
マトグラフィーに付して、リン酸を溶離剤として溶出し
た。チトクロムＰ−450_sca-1はリン酸緩衝液濃度約0.06
Mで、同_sca-2は約0.08M、同_sca-3は約0.10Mで溶出され
た。いずれも電気泳動的に均一なＰ−450を得た。精製
結果を下の表４に示す。

〔発明の効果〕 試験例1. チトクロムＰ−450_sca-1,同_sca-2または同_sca-3を用
いてML−236BナトリウムよりCS−514が生産される。

即ち、下記の系で常法に従い30℃で１時間、ML−236B
ナトリウムを基質として反応させた。

Ｐ−450（精製標品） NADPH再生系 NADP⁺ 0.26mM グルコース−６−リン酸 14.0 mM グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ 0.2 unit ニコチンアミド 10.0 mM 塩化マグネシウム 2.5 mM フエレドキシン−NADP⁺−レダクターゼ（ホウレンソ
ウ） 0.04unit フエレドキシン（ホウレンソウ） 320 μｇML−236Bナトリウム 2.33mM 合計容量 0.2 ml 但し、Ｐ−450の量はＰ−450_sca-1の系では0.862n mo
l,同_sca-2の系では1.292n mol,同_sca-3の系では0.377n
molであった。

結果を表５に示す。

表５から明らかのようにML−236ナトリウムから高い
ジアステレオ選択性でCS−514が得られた。

試験例2. チトクロムＰ−450_sca-1,同_sca-2または同_sca-3を用
いてミルベマイシンA₄より13−ヒドロキシミルベマイシ
ンA₄が生産される。

即ち、下記の系で常法に従い30℃で１時間、ミルベマ
イシンA₄を基質として反応させた。

Ｐ−450（精製標品） NADPH再生系 NADP⁺ 0.26mM グルコース−６−リン酸 14.0 mM グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ 0.2unit ニコチンアミド 10.0 mM 塩化マグネシウム 2.5 mM フエレドキシン−NADP⁺−レダクターゼ（ホウレンソ
ウ） 0.04unit フエドキシン（ホウレンソウ） 320 μｇ ミルベマイシンA₄ 0.92mM 1.4−ジオキサン 1.0 μ 合計容量 0.2 ml 但し、Ｐ−450の量はＰ−450_sca-1の系では0.431n mo
l,同_sca-2の系では0.646n mol,同_sca-3の系では0.188n
molであった。

結果を表６に示す。

表６から明らかのようにミルベマイシンA₄から13−ヒ
ドロキシミルベマイシンA₄が得られた。

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】放線菌由来であり、且つ可溶性であること
   を特徴とし、 以下の理化学的性状を有するチトクロムＰ−450_sca-1,
   同_sca-2および同_sca-3: （１）作用：少なくとも下記の反応を触媒する。 （２）基質特異性：いずれも少なくとも、ML−236Bナト
   リウムを基質として６位への水酸基の導入を行なう。 （３）至適pH:いずれも至適pHは6.5−8.0 （pH7.4,30℃でフェレドキシン、フェレドキシン−NADP
   ⁺−レダクターゼ、NADP⁺、NADPH再生系および溶存酸素
   の存在下でML−236Bナトリウムを基質として反応させた
   場合）である。 （４）安定pH:いずれも安定pHは6.0−9.0［４℃、24時
   間処理］（ML−236Bナトリウムを基質として反応させた
   場合）である。 （５）酵素の性状：いずれも可溶性である。 （６）酵素の誘導：いずれも少なくともML−236Bナトリ
   ウムによる誘導酵素である。 （７）精製方法：ハイドロキシアパタイトクロマトグラ
   フィーにおいて、チトクロムＰ−450_sca-1はリン酸緩衝
   液濃度約0.06Mで溶出、同_sca-2は約0.08Mで溶出、およ
   び同_sca-3は約0.10Mで溶出する。 （８）分子量：いずれも46,000±1,000である。 （９）温度による失活及びpHによる失活：いずれも70
   ℃、60分で完全に失活する。 また、いずれもpH3以下およびpH11以上で完全に失活す
   る。 （ML−236Bナトリウムを基質として反応させた場合） （10）作用適温：いずれも最適作用温度は30℃付近であ
   る。（pH7.4でフェレドキシン、フェレドキシン−NADP⁺
   −レダクターゼ、NADP⁺、NADPH再生系および溶存酸素の
   存在下でML−236Bナトリウムを基質として反応させた場
   合） （11）阻害剤：いずれもSKF−525A（２−ジエチルアミ
   ノエチル−2,2−ジフェニルバレレイトヒドロクロライ
   ド）、ジメチジンにより阻害をうける。また、いずれも
   一酸化炭素をふきこむことによっても阻害される。ま
   た、いずれもCo²⁺,Mn²⁺,Cu²⁺により有意に阻害される。
   （pH7.4,30℃でフェレドキシン、フェレドキシン−NADP
   ⁺−レダクターゼ、NADP⁺、NADPH再生系および溶存酸素
   の存在下でML−236Bナトリウムを基質として反応させた
   場合） （12）吸収スペクトル： 絶対スペクトルはいずれも417nmで吸収極大を有す
   る。 CO−差スペクトルはチトクロムＰ−450_sca-1は449n
   m、同_sca-2および同_sca-3は448nmで吸収極大を有する。
2. 【請求項２】ストレプトミセス属に属するML−236Bナト
   リウムを６−ヒドロキシ−ML−236Bナトリウムに変換す
   る放線菌を、ML−236Bの存在下で培養し、次いでその菌
   体より特許請求の範囲１記載のチトクロムＰ−45
   0_sca-1、同_sca-2および／又は同_sca-3を抽出、精製する
   ことを特徴とする、チトクロムＰ−450_sca-1、同_sca-2
   および／又は同_sca-3の製造法。
3. 【請求項３】ストレプトミセス属に属する、ML−236Bナ
   トリウムを６−ヒドロキシML−236Bナトリウムに変換す
   る放線菌がストレプトミセス・カルボフィラスSANK6258
   5（FERM BP−1145）である特許請求の範囲２記載の製造
   法。