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KR102068515B1 - 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질 중의 트리글리세리드의 소거 방법 - Google Patents

저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질 중의 트리글리세리드의 소거 방법 Download PDF

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KR102068515B1
KR102068515B1 KR1020147032230A KR20147032230A KR102068515B1 KR 102068515 B1 KR102068515 B1 KR 102068515B1 KR 1020147032230 A KR1020147032230 A KR 1020147032230A KR 20147032230 A KR20147032230 A KR 20147032230A KR 102068515 B1 KR102068515 B1 KR 102068515B1
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surfactant
triglyceride
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모토코 오타
Original Assignee
덴카 세이켄 가부시키가이샤
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Publication date
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Abstract

원심분리, 전기 영동 등의 번잡한 전처리 조작 없이 시료를 직접, 자동 분석 장치 등을 사용하여 간편성, 특이성, 정밀성이 우수한 LDL-TG의 분별 정량 측정하는 방법을 제공하는 것을 가능하게 하기 위해서, 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질 중의 트리글리세리드를 선택적으로 소거하는 방법이 개시되어 있다. 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질 중의 트리글리세리드의 소거 방법은, 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질에 작용하는 계면활성제 또는 LDL의 보호 작용을 갖는 계면활성제의 존재 하에서, 시료에 리포프로테인리파아제, 콜레스테롤에스테라제, 글리세롤키나제 및 글리세롤-3인산 옥시다아제를 작용시켜 발생한 과산화수소를 소거하는 것을 포함한다.

Description

저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질 중의 트리글리세리드의 소거 방법{METHOD FOR REMOVAL OF TRIGLYCERIDES IN LIPOPROTEINS OTHER THAN LOW-DENSITY LIPOPROTEINS}
본 발명은 시료 중의 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질 중의 트리글리세리드의 소거 방법에 관한 것이다.
혈청·혈장 중의 지질의 주요한 성분은 콜레스테롤, 트리글리세리드, 인지질 등이며, 이들 혈중 지질은 아포단백질과 결합하여 리포단백질로서 혈액 중을 순환한다. 이들 리포단백질은 밀도의 차에 의해 카이로미크론(이하, CM이라고 칭한다), 초저밀도 리포단백질(이하, VLDL이라고 칭한다), 중간 밀도 리포단백질(이하, IDL이라고 칭한다), 저밀도 리포단백질(이하, LDL이라고 칭한다), 고밀도 리포단백질(이하, HDL이라고 칭한다) 등으로 분류된다. 이들 리포단백질 중, HDL은 조직에 침착한 과잉의 콜레스테롤을 간장으로 운반하는 작용이 있어, 항동맥경화 작용이 있다. 또한, LDL은 간장으로부터 각 조직으로의 콜레스테롤의 주된 운반체이며, LDL의 증가는 동맥경화 발생과 밀접한 관계가 있다고 생각되고 있다. 이러한 것으로부터, LDL 중의 콜레스테롤(이하, LDL-C라고 칭한다)은 동맥경화증, 허혈성 심질환(관동맥 질환) 등의 위험 인자로 생각되어, LDL-C의 함유량을 아는 것은 이들 질환의 진단·치료 및 예방에 있어서 중요한 지표로 여겨지고 있다. 한편, 혈액 중의 LDL-C가 정상 범위여도 허혈성 심질환 등이 발병하는 예도 다수 확인되어, 최근에는 LDL 입자의 질의 변화나 콜레스테롤 이외의 구성 성분에도 주목하게 되었다.
트리글리세리드를 많이 포함하는 LDL(이하, TG-rich LDL이라고 칭한다)은 콜레스테롤의 함유량이 높은 정상의 LDL과는 성상이 다른 리포단백질로, 간질환 환자 혈액 내에 많이 보이며, 간질환의 진행에 따라 혈액 중 농도는 증가하여 간질환 말기에는 혈액 중에 존재하는 리포단백질의 대부분을 차지한다는 보고가 있다. 또한, TG-rich LDL은 매크로퍼지를 포말화하지만, 이 TG-rich LDL에 의한 매크로퍼지 포말화율과 산화 LDL의 일종인 말론디알데히드 수식 LDL의 혈청 중 농도가 정비례하는 것, 건강한 사람 혈액 중에는 과산화 트리글리세리드가 거의 검출되지 않는 것에 대해, 간질환 환자 혈액 중에는 과산화 트리글리세리드의 현저한 증가가 보이는 것 등의 보고에 의해, LDL 중의 트리글리세리드는 산화 LDL과의 관련도 깊다고 생각되고 있다. 즉, LDL 중의 트리글리세리드양은 간질환이나, 산화 LDL이 관여하는 여러 가지 동맥경화증, 관동맥 질환 등에 관계되는 중요한 지표라고 생각된다.
LDL 중의 트리글리세리드(이하, LDL-TG라고 칭한다)의 정량 방법으로서는 분획 분리와 트리글리세리드 정량의 2가지의 단계조작을 조합해서 구하는 방법이 있다. 분획 분리 조작은 초원심법, 전기 영동법, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용한 방법 등이 있고, 정량법으로서는 예를 들면 임상 검사장에서 사용되고 있는 자동 분석 장치를 사용하여 트리글리세리드 측정용 시약에 의해 정량을 행하는 방법 등이 있다. 이 양자를 조합해서 LDL-TG의 정량을 행할 수 있지만, 이것들은 LDL과 LDL 이외의 리포단백질을 완전히 분리하는 전처리 공정과 측정을 행하는 공정의 2단계로 행해지기 때문에, 조작이 번잡해서 시간이 걸린다. 또한 분리 방법에 따라서는 분리한 시료 그 자체의 회수가 곤란하거나, 정량적으로 회수하는 것이 곤란하거나, 정량적으로 회수할 수 있는 방법이어도 작업에 숙련이 필요하거나, 특별한 기기가 필요하거나 한다. 이것들은 비용도 고액으로 되어, 간편성이나 경제성에 있어서 보급되기 어려운 방법이다.
이들 문제점을 해소하는 방법으로 분획 조작을 행하지 않고 자동 분석 장치 등으로 측정 가능한 방법으로서는, 제 1 공정에서 LDL 이외의 모든 리포단백질 중의 트리글리세리드를 제거한 후 제 2 공정에서 남은 LDL 중의 트리글리세리드를 측정하는 방법(특허문헌 1)이나, 제 1 공정에서(유리형 글리세롤 및) HDL 중의 트리글리세리드를 제거한 후 제 2 공정에서 LDL 중의 트리글리세리드만을 측정하는 방법(특허문헌 2)이 알려져 있다.
그러나, 이들 방법은 VLDL 중의 트리글리세리드나 CM 중의 트리글리세리드가 높은 검체에 있어서는 제 1 공정에서 전부 제거할 수 없어 제 2 공정으로 반응이 미루어져 정(正)의 영향을 받는 경우가 있다. 또는, 이들 방법은 제 2 공정에서 반응이 억제되어 있어야 할 VLDL 중 트리글리세리드가 전부 억제되지 않아 반응이 일부 촉진됨으로써 정의 영향을 받는 경우가 있다. 실제로 이들 방법과 기준법인 초원심법을 다수의 검체로 비교하면 정의 상관성이 있는 것은 알 수 있지만, 크게 괴리되는 검체가 보이거나 불균형이 큰 것 등 검체에 대한 특이성, 정밀성에 있어서 큰 문제가 있는 것을 알 수 있다.
일본 특허공개 2006-180707호 공보 일본 특허 재공표 2000-043537호 공보
이것으로부터, 본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 원심분리, 전기 영동 등의 번잡한 전처리 조작 없이 시료를 직접, 자동 분석 장치 등을 사용하여 간편성, 특이성, 정밀성이 우수한 LDL-TG의 분별 정량 측정하는 방법을 제공하는 것을 가능하게 하기 위해서, 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질 중의 트리글리세리드를 선택적으로 소거하는 방법을 제공하는 것에 있다.
본원 발명자는 소정 종류의 계면활성제와 리포프로테인리파아제를 조합해서 시료에 작용시킴으로써, 시료 중의 LDL 이외의 리포단백질인 CM, VLDL, IDL, HDL 중 트리글리세라이드가 다소 반응을 일으켜서 해체되고, 이들 리포단백질 중의 트리글리세리드가 분해되는 것을 발견했다. 본 발명자는 또한 선택성, 특이성을 향상시킴으로써 LDL 이외의 리포단백질 중의 트리글리세리드를 극한까지 분해하고, 뒤에 계속되는 공정에서 잔존하는 LDL과 반응하는 계면활성제를 첨가함으로써 LDL을 해체시키고, LDL 중의 트리글리세리드를 리포프로테인리파아제의 작용에 의해 분해, 생성된 과산화수소를 정량함으로써 LDL 중의 트리글리세리드를 정량할 수 있다고 생각했다. 거기에 검토를 더 진행시켜서 콜레스테롤에스테라제를 첨가함으로써 매우 선택적, 특이적으로 시료 중의 CM, VLDL, IDL, HDL을 해체하고, 이들 LDL 이외의 리포단백질 분획 중의 트리글리세라이드를 분해할 수 있는 것을 발견했다. 이것에, 반응의 결과 발생하는 트리글리세리드의 분해산물인 과산화수소가 뒤에 계속되는 공정에서 검출되어버리는 것을 억제하기 위해서, 과산화수소를 소거하는 반응계를 도입함으로써 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질 중의 트리글리세리드를 선택적으로 소거하는 것에 성공하고, 본 발명을 완성시키는 것에 이르렀다.
즉, 본 발명은 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질에 작용하는 계면활성제 또는 LDL의 보호 작용을 갖는 계면활성제의 존재 하에서, 시료에 리포프로테인리파아제, 콜레스테롤에스테라제, 글리세롤키나제 및 글리세롤-3인산 옥시다아제를 작용시켜 발생한 과산화수소를 소거하는 것을 포함하는, 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질 중의 트리글리세리드의 소거 방법을 제공한다.
(발명의 효과)
본 발명의 방법에 의하면, LDL 이외의 리포단백질 중의 트리글리세리드를 원심 조작 등 번잡한 처리를 행하지 않고 간편하게 소거할 수 있다.
도 1은 초원심법에 의한 LDL 중의 트리글리세리드의 정량값과, 하기 비교예 2의 방법에 의한 LDL 중의 트리글리세리드의 정량값의 상관 관계를 나타내는 도면이다.
도 2는 초원심법에 의한 LDL 중의 트리글리세리드의 정량값과, 하기 실시예 5의 방법에 의한 LDL 중의 트리글리세리드의 정량값의 상관 관계를 나타내는 도면이다.
도 3은 초원심법에 의한 LDL 중의 트리글리세리드의 정량값과, 하기 실시예 6의 방법에 의한 LDL 중의 트리글리세리드의 정량값의 상관 관계를 나타내는 도면이다.
도 4는 초원심법에 의한 LDL 중의 트리글리세리드의 정량값과, 하기 실시예 7의 방법에 의한 LDL 중의 트리글리세리드의 정량값의 상관 관계를 나타내는 도면이다.
도 5는 초원심법에 의한 LDL 중의 트리글리세리드의 정량값과, 하기 비교예 3의 방법에 의한 LDL 중의 트리글리세리드의 정량값의 상관 관계를 나타내는 도면이다.
도 6은 초원심법에 의한 LDL 중의 트리글리세리드의 정량값과, 하기 실시예 8의 방법에 의한 LDL 중의 트리글리세리드의 정량값의 상관 관계를 나타내는 도면이다.
도 7은 초원심법에 의한 LDL 중의 트리글리세리드의 정량값과, 하기 실시예 9의 방법에 의한 LDL 중의 트리글리세리드의 정량값의 상관 관계를 나타내는 도면이다.
도 8은 초원심법에 의한 LDL 중의 트리글리세리드의 정량값과, 하기 실시예 10의 방법에 의한 LDL 중의 트리글리세리드의 정량값의 상관 관계를 나타내는 도면이다.
본 발명의 방법은 하기 방법에 의해 시료 중의 LDL 이외의 리포단백질 중의 트리글리세리드를 소거한다. LDL 이외의 리포단백질에는 CM, VLDL, IDL 및 HDL이 있다. CM, VLDL, IDL 및 HDL 중의 트리글리세리드가 소거되므로, 뒤에 계속되는 공정에서 리포단백질을 분해하고 트리글리세리드를 정량하면, 그 트리글리세리드는 주로 시료 중의 LDL 중의 트리글리세리드이다.
본 발명의 방법에 제공되는 시료로서는 CM, VLDL, IDL, LDL 및 HDL 등의 리포단백질을 포함할지도 모르는 시료이면 어느 것이라도 되고, 예를 들면 혈액, 혈청, 혈장 등의 체액이나 그 희석물을 들 수 있지만, 이것들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서의 상기 「트리글리세리드를 소거」란, 트리글리세리드를 분해하고 또한 그 분해산물이 뒤에 계속되는 공정에서 검출되지 않도록 하는 것을 의미한다. LDL 이외의 리포단백질, 즉, CM, VLDL, IDL 및 HDL 등에 포함되는 트리글리세리드를 선택적으로 소거하는 방법으로서는 이하의 방법에 의해 행한다.
즉, LDL 이외의 리포단백질에 작용하는 계면활성제, 또는 LDL의 보호 작용을 갖는 계면활성제의 존재 하에 있어서, 리포프로테인리파아제, 콜레스테롤에스테라제, 글리세롤키나제 및 글리세롤-3인산 옥시다아제를 작용시켜 발생한 과산화수소를 소거한다.
과산화수소를 소거하는 방법으로서는 카탈라아제를 작용시켜서 물과 산소로 분해하는 방법, 및 퍼옥시다아제를 이용하여 페놀계 또는 아닐린계 수소공여체 화합물과 과산화수소를 반응시켜서 무색 퀴논으로 전화하는 방법을 들 수 있지만, 어느 방법을 사용해도 되고, 또한 이들 방법에 한정되는 것은 아니다. 이들 과산화수소의 소거 방법 자체는 이 분야에 있어서 주지이다.
반응액 중의 리포프로테인리파아제 농도는 0.01~2000KU/L 정도가 바람직하고, 0.05~1000KU/L 정도가 더욱 바람직하다. 글리세롤키나제의 농도는 0.02~80.0KU/L 정도가 바람직하고, 0.05~40.0KU/L 정도가 더욱 바람직하다. 글리세롤-3인산 옥시다아제의 농도는 0.2~20.0KU/L 정도가 바람직하고, 0.5~10.0KU/L 정도가 더욱 바람직하다. 또한, 과산화수소를 물과 산소로 분해할 경우의 카탈라아제의 농도는 40~5000KU/L 정도가 바람직하고, 50~2000KU/L 정도가 더욱 바람직하다.
또한, 반응액 중의 과산화수소를 무색 퀴논으로 전화할 경우의 퍼옥시다아제의 농도는 1~40KU/L가 바람직하고, 2~30KU/L가 더욱 바람직하다. 이때 첨가하는 페놀계 또는 아닐린계 수소공여체 화합물의 농도로서는 0.2~3mmol/L가 바람직하다.
본 발명의 방법에서 사용되는 콜레스테롤에스테라제의 바람직한 예로서 분자량이 50kDa 이하인 콜레스테롤에스테라제, 또는 분자량이 50kDa 이상인 콜레스테롤에스테라제여도 분자량이 50kDa 이하의 서브 유닛을 갖는 콜레스테롤에스테라제를 들 수 있다. 또한, 콜레스테롤에스테라제의 기원은 조금도 한정되는 것은 아니고, 어느 동물 유래, 미생물 유래여도 되고, 특히 Pseudomonas sp. 유래의 콜레스테롤에스테라제를 적합하게 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 상기 콜레스테롤에스테라제 농도는 10~8000U/L 정도가 바람직하고, 50~4000U/L 정도가 더욱 바람직하다.
본 발명의 방법에서 사용되는 LDL 이외의 리포단백질에 작용하는 계면활성제, 또는 LDL의 보호 작용을 갖는 계면활성제의 바람직한 예로서, HLB값이 13 이상 15 이하인 폴리옥시알킬렌 유도체를 들 수 있다. 유도체의 예로서는 고급 알콜 축합물, 고급 지방산 축합물, 고급 지방산 아미드 축합물, 고급 알킬아민 축합물, 고급 알킬메르캅탄 축합물, 알킬페놀 축합물을 들 수 있다.
HLB값이 13 이상 15 이하인 폴리옥시알킬렌 유도체의 바람직한 구체예로서는, 폴리옥시에틸렌라우릴에테르, 폴리옥시에틸렌세틸에테르, 폴리옥시에틸렌올레일에테르, 폴리옥시에틸렌 고급 알콜에테르, 폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르, 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르, 폴리옥시에틸렌벤질페닐에테르, 폴리옥시알킬렌 다환 페닐에테르 등을 들 수 있지만, 이것들에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 방법에서 사용되는 계면활성제로서, 양이온 계면활성제를 사용할 수도 있다. 여기서 사용되는 양이온 계면활성제의 예로서는 제 4급 암모늄염을 친수기로서 갖는 것을 들 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 또한, 이들 계면활성제는 1종류의 것을 단독으로 사용할 수도 있고, 2종류 이상의 것을 조합해서 사용할 수도 있다.
사용되는 상기 계면활성제의 농도는 0.01~20g/L 정도가 바람직하고, 0.1~10g/L 정도가 더욱 바람직하다.
본 발명의 방법은 pH5~9의 완충액 중에서 행하는 것이 바람직하고, 완충액으로서는 트리스, 트리에탄올아민, 굿의 완충액 등의 아민을 포함하는 완충액이 바람직하다. 특히 굿 완충액인 Bis-Tris, PIPES, MOPSO, BES, HEPES 및 POPSO가 바람직하고, 완충액의 농도는 5~5000mM 정도가 바람직하며, 10~1000mM 정도가 더욱 바람직하다.
본 발명의 방법에서는 LDL과의 반응을 억제해서 다른 리포단백질의 소거를 더욱 높이기 위해서, 또는 반응액 중의 효소류의 활성 작용을 보강, 안정화시키기 위해서 반응액 중에 2가 금속 이온을 포함시켜도 된다. 2가의 금속 이온으로서는 구리 이온, 철 이온, 칼슘 이온 및 마그네슘 이온을 사용할 수 있지만, 특히 마그네슘 이온이 바람직하다. 2가 금속 이온의 농도는 1~500mM 정도가 바람직하고, 5~200mM 정도가 더욱 바람직하다.
반응 온도는 예를 들면 15~55℃이고, 25~45℃ 정도가 적당하며, 37℃가 가장 바람직하다. 또한, 반응 시간은 1~30분간 정도가 좋고, 더욱 바람직하게는 2~15분간 정도이다.
본 발명의 방법에서는 반응의 결과 발생하는 잔해물이 LDL과의 반응에 간섭하는 것을 방지하기 위해서 알부민을 첨가해도 된다. 알부민의 존재 하에서 행함으로써 반응의 결과 발생하는 잔해물이 알부민에 흡착되어, 뒤에 계속되는 공정에서 이들 잔해가 반응에 간섭하는 것을 방지할 수 있다. 알부민은 알부민이면 어떠한 한정도 되는 것은 아니고, 혈청 알부민 등 시판의 알부민을 적절하게 사용할 수 있다. 또한, 알부민의 기원도 조금도 한정되는 것은 아니고, 인간, 소, 돼지, 말 등 어느 동물이어도 되고, 특히, 널리 사용되고 있는 소혈청 알부민을 적절하게 사용할 수 있다. 반응 용액 중의 상기 알부민의 농도는 0.01~30.0g/L가 바람직하고, 0.3~20.0g/L가 더욱 바람직하다.
본 발명의 방법이 있어서 계면활성제, 리포프로테인리파아제, 콜레스테롤에스테라제, 글리세롤키나제 및 글리세롤-3인산 옥시다아제로 이루어지는 LDL 이외의 리포단백질에 작용해 이들의 리포단백질을 분해하는 효소, 및 카탈라아제 등의 과산화수소를 소거하기 위한 효소는 동시에 첨가해도 되고, 또한 각각 첨가해도 된다. 바람직하게는, 이들 시약 전부를 포함하는 시약을 조제해 두고, 시료와 혼합하면 좋다.
상기한 본 발명의 방법에 의해 LDL 이외의 리포단백질 중의 트리글리세리드가 선택적으로 소거되므로, 뒤에 계속되는 공정에서 리포단백질을 분해하고, 트리글리세리드를 정량함으로써 LDL 중의 트리글리세리드를 정량할 수 있다.
이것은, 예를 들면 적어도 LDL에 작용하는 계면활성제를 첨가해, 본 발명의 방법을 실시한 후 반응계에 남아 있는 리포프로테인리파아제, 글리세롤키나제 및 글리세롤-3인산 옥시다아제의 작용에 의해 발생한 과산화수소를 정량함으로써 행할 수 있다. 또한, 이것들의 정량에 필요한 효소류는 본 발명의 방법에 있어서 반응계에 남아 있는 것 이외에 추가로 더 첨가해도 된다. 또한, 이들 반응에 관여하는 효소류는 본 발명의 방법에 있어서도, 뒤에 계속되는 공정에 있어서도 1종류에 한정되는 것은 아니고, 2종류 이상의 효소를 조합해서 사용할 수도 있다.
이 후에 계속되는 공정에 있어서, 적어도 LDL에 작용하는 계면활성제는 LDL에만 선택적으로 작용하는 계면활성제여도 되고, 모든 리포단백질에 작용하는 계면활성제여도 된다.
모든 리포단백질에 작용하는 계면활성제의 바람직한 예로서, HLB값이 11 이상, 바람직하게는 12 이상인 폴리옥시알킬렌 유도체를 들 수 있다. 유도체의 예로서는 고급 알콜 축합물, 고급 지방산 축합물, 고급 지방산 아미드 축합물, 고급 알킬아민 축합물, 고급 알킬메르캅탄 축합물, 알킬페놀 축합물을 들 수 있다.
HLB값이 11 이상인 폴리옥시알킬렌 유도체의 바람직한 구체예로서, 폴리옥시에틸렌라우릴에테르, 폴리옥시에틸렌세틸에테르, 폴리옥시에틸렌올레일에테르, 폴리옥시에틸렌 고급 알콜에테르, 폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르, 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르, 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르, HLB값 13 미만의 폴리옥시알킬렌 다환 페닐에테르 등을 들 수 있지만, 이것들에 한정되는 것은 아니다.
또한, LDL에만 선택적으로 작용하는 계면활성제의 예로서는 음이온 계면활성제나, 카르복시베타인계의 양성 계면활성제 등을 들 수 있다. 여기서 사용되는 음이온 계면활성제로서는 방향환에 탄소수 4~18의 직쇄상 또는 분기상 알킬기가 결합한 것을 갖는 것, 방향환은 벤젠, 나프탈렌, 디페닐 등 탄소와 수소만으로 이루어지는 것, 또한 상기 방향환에 술폰산염과 같은 친수기가 결합한 것을 들 수 있지만, 이것들에 한정되는 것은 아니다.
뒤에 계속되는 공정에서 사용되는 계면활성제의 농도는 0.1~100g/L 정도가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 1~50g/L 정도이다. 또한, 계면활성제는 1종류의 것을 단독으로 사용할 수도 있고, 2종류 이상의 것을 조합해서 사용할 수도 있다.
뒤에 계속되는 공정에 있어서의 기타 바람직한 반응 조건은, 제 1 공정에 있어서의 바람직한 반응 조건과 마찬가지이다.
발생한 과산화수소의 정량은 상법에 의해 행할 수 있고, 예를 들면 과산화수소 존재 하에서 퍼옥시다아제의 작용에 의해 4-아미노안티피린과 페놀계 또는 아닐린계 수소공여체 화합물을 산화 축합시켜 발생한 색소를 정량하면 된다. 페놀계 또는 아닐린계 수소공여체 화합물로서는, 예를 들면 N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린(HDAOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3-메톡시아닐린(TOOS), N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-숙시닐에틸렌디아민(EMSE) 등을 들 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예에 의거해 구체적으로 설명한다. 무엇보다 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
비교예 1
이하의 조성으로 이루어지는 LDL-TG 정량 시약을 조제했다.
제 1 시약(시약 A)
PIPES 완충액(pH6.5) 50mmol/L
계면활성제*1 2.0g/L
소혈청 알부민 3.0g/L
트린더 시약(TOOS) 0.5g/L
염화마그네슘 4.0g/L
글리세롤키나제 3.0KU/L
글리세롤-3인산 옥시다아제 7.5KU/L
리포프로테인리파아제 100KU/L
카탈라아제 1000KU/L
*1 : 폴리옥시알킬렌 유도체(HLB값 13.2)
제 2 시약(시약 a)
PIPES 완충액(pH7.0) 50mmol/L
계면활성제*2 6.0g/L
4-아미노안티피린 4.0mmol/L
리포프로테인리파아제 5.0KU/L
퍼옥시다아제 5.0KU/L
아지화나트륨 0.05%
*2: 폴리옥시에틸렌알킬에테르(HLB값 13.3)
실시예 1
이하의 조성으로 이루어지는 LDL-TG 정량 시약을 조제했다.
제 1 시약(시약 B)
PIPES 완충액(pH6.5) 50mmol/L
계면활성제*3 2.0g/L
소혈청 알부민 3.0g/L
트린더 시약(TOOS) 0.5g/L
염화마그네슘 4.0g/L
글리세롤키나제 2.0KU/L
글리세롤-3인산 옥시다아제 7.5KU/L
리포프로테인리파아제 100KU/L
콜레스테롤에스테라제#1 0.6KU/L
카탈라아제 1000KU/L
*3 : 폴리옥시알킬렌 유도체(HLB값 13.2)
#1 : 약 30kDa(Peudomonas sp. 유래)
제 2 시약(시약 a)
PIPES 완충액(pH7.0) 50mmol/L
계면활성제*4 6.0g/L
4-아미노안티피린 4.0mmol/L
리포프로테인리파아제 5.0KU/L
퍼옥시다아제 5.0KU/L
아지화나트륨 0.05%
*4 : 폴리옥시에틸렌알킬에테르(HLB값 13.3)
실시예 2
이하의 조성으로 이루어지는 LDL-TG 정량 시약을 조제했다.
제 1 시약(시약 C)
PIPES 완충액(pH6.5) 50mmol/L
계면활성제*5 2.0g/L
소혈청 알부민 3.0g/L
트린더 시약(TOOS) 0.5g/L
염화마그네슘 4.0g/L
글리세롤키나제 1.0KU/L
글리세롤-3인산 옥시다아제 4.0KU/L
리포프로테인리파아제 0.3KU/L
콜레스테롤에스테라제#2 0.7KU/L
카탈라아제 1000KU/L
*5 : 폴리옥시알킬렌 유도체(HLB값 13.2)
#2 : 약 30kDa(Peudomonas sp. 유래)
제 2 시약(시약 b)
PIPES 완충액(pH7.0) 50mmol/L
계면활성제*6 6.0g/L
4-아미노안티피린 4.0mmol/L
리포프로테인리파아제 400KU/L
퍼옥시다아제 5.0KU/L
아지화나트륨 0.05%
*6 : 폴리옥시에틸렌알킬에테르(HLB값 12.4)
실시예 3
평가에 사용하는 시료로서는, 예를 들면 초원심법을 이용하여 CM, VLDL을 일괄해서 회수한 분획(비중 0.96 미만~1.006), 또는 CM, VLDL, IDL을 일괄해서 회수한 분획(비중 0.96 미만~1.019), LDL 분획(비중 1.019~1.063), HDL 분획(비중 1.063~1.210)을 분취하고, 시료로 한다. 이것들 분획 시료 각각의 총 트리글리세리드양을 측정하고, 상기 실시예 시약을 사용하여 정량한 트리글리세리드양과 비교했다. 또한, 초원심법은 「신 생화학 실험법 강좌 4 지질I 중성지방과 리포단백질」, (주)토쿄카가쿠도우진슈판에 기재되어 있는 방법에 따라 실시했다.
비교예 1, 실시예 1 및 실시예 2의 시약은 이하와 같이 조작했다. 검체를 2㎕ 채취하고, 제 1 시약 195㎕와 혼화, 37℃에서 5분간 가온해서 반응을 행하고, 반응 5분 후의 반응액의 흡광도(E1)를 주파장 600㎚, 부파장 700㎚에서 측정했다. 이어서 이 반응액에 제 2 시약 65㎕를 혼화하고, 37℃에서 5분간 더 가온해서 반응을 행하고, 반응 5분 후의 반응액의 흡광도(E2)를 주파장 600㎚, 부파장 700㎚에서 측정했다. 이들 측정한 흡광도의 E2에서 E1을 뺌으로써 흡광도 변화량(ΔE)을 산출했다. 이때, 검체가 각 리포단백질 분획 시료였을 경우의 흡광도 변화량에서 검체가 각 리포단백질 분획 시료 대신에 생리식염수 등이었을 경우의 흡광도 변화량을 뺌으로써, 본 실시예의 시약을 사용한 각 리포단백질 분획 시료에 있어서의 반응 흡광도를 산출할 수 있다. 또한 이때, 비교예 1 또는 실시예 1의 제 2 시약(시약 a)과 실시예 2(시약 b)의 제 2 시약을 바꿔서 사용해도 조금도 문제없이 검체를 측정할 수 있다.
이밖에, 본 실시예의 시약 대신에 동등의 정색을 나타내는 총 트리글리세리드 측정 시약을 사용하여 마찬가지의 조작을 행하였다. 그것에 의해 산출된 반응 흡광도는 각 리포단백질 분획 시료의 총 트리글리세리드양이며, 상술의 본 실시예의 시약을 사용한 각 리포단백질 분획 시료에 있어서의 반응 흡광도와 비교함으로써 각각의 시료에 있어서의 본 실시예의 시약의 반응률을 산출할 수 있다. 여기서 말하는 「총 트리글리세리드양의 반응 흡광도와 실시예의 시약을 사용한 반응 흡광도와 비교한다」란 예를 들면, 실시예의 시약을 사용한 반응 흡광도를 총 트리글리세리드양의 반응 흡광도로 나누는 것을 의미한다. 또한, 동등의 정색을 나타내는 총 트리글리세리드 측정 시약이란, 예를 들면, TG-EX 「세이켄」(효소법)(트리글리세리드 키트) 등이 있다.
이것에 의해 산출한 반응률을 표로 정리한 것을 이하에 나타낸다.
Figure 112014110774863-pct00001
실시예 1 및 실시예 2에서는 LDL 분획에서 특이적으로 반응하고 있어, CM 분획, VLDL 분획, IDL 분획, 및 HDL 분획과 LDL 분획의 차별화가 되어 있는 것을 확인할 수 있다. 비교예 1에서는 CM 분획, VLDL 분획, IDL 분획에 있어서의 트리글리세리드의 소거가 되어 있지 않거나, 또는 반응이 억제되어 있지 않다. 또한 비교예 1에서는 HDL 분획에 있어서는 소거가 되어 있거나, 또는 반응이 억제되어 있지만, 실시예 1, 실시예 2에서는 보다 양호한 특이성 결과인 것을 확인할 수 있다. 또한, 이들 분획의 총 트리글리세리드양은 CM·VLDL 분획 또는 CM·VLDL·IDL 분획에 있어서는 대략 450~950mg/dL이고, LDL 분획에 있어서는 대략 50~220mg/dL이며, HDL 분획에 있어서는 대략 35~80mg/dL이다.
이어서, 초원심법 및 본 발명의 시약을 사용하여, 신선한 인간 혈청을 검체로 해서 각 검체 중의 LDL-TG를 정량했다.
실시예 4
(1) 초원심법에 의한 LDL-TG의 정량 측정
초원심법은 상법(「신 생화학 실험법 강좌 4 지질 I 중성지방과 리포단백질」, (주)토쿄카가쿠도우진슈판에 기재되어 있는 방법)에 따라 비중 1.019~1.063의 LDL 분획을 원심분리하고, 얻어진 LDL 분획 중의 트리글리세리드양을 TG-EX「세이켄」(효소법)(덴카세이켄사제)을 이용하여 측정했다.
비교예 2
인간 혈청을 검체로 해서, 상기 비교예 1과 마찬가지의 조성으로 이루어진 시약 A 및 시약 a의 조합 시약을 이용하여, 이하와 같이 조작했다.
(2) 본 발명의 시약을 사용한 LDL-TG의 정량 측정
검체를 2㎕ 채취하고, 제 1 시약 195㎕와 혼화, 37℃에서 5분간 가온해서 반응을 행하고, 반응 5분 후의 반응액의 흡광도(E1)를 주파장 600㎚, 부파장 700㎚에서 측정했다. 이어서 이 반응액에 제 2 시약 65㎕를 혼화하고, 37℃에서 5분간 더 가온해서 반응을 행하고, 반응 5분 후의 반응액의 흡광도(E2)를 주파장 600㎚, 부파장 700㎚에서 측정했다. 이들 측정한 흡광도의 E2에서 E1을 뺌으로써 흡광도 변화량(ΔE)을 산출했다. 이때, 검체가 인간 혈청이었을 경우의 흡광도 변화량에서 검체가 인간 혈청 대신 생리식염수 등이었을 경우의 흡광도 변화량을 뺌으로써, 본 실시예의 시약을 사용한 인간 혈청 시료에 있어서의 반응 흡광도를 산출했다.
(3) 검량선의 작성
초원심법에 의한 측정에 의해 LDL-TG 농도가 판명되어 있는 신선한 인간 혈청수 검체를 표준품으로 해서 검량선을 작성하고, (2)에서 산출한 반응 흡광도를 mg/dL 측정값으로 환산했다.
실시예 5
인간 혈청-01부터 인간 혈청-14를 검체로 하고, 상기 실시예 1과 마찬가지의 조성으로 이루어진 시약 B 및 시약 a의 조합 시약을 사용하여 상술의 (2), (3)에 기재한 것과 마찬가지의 조작을 행하였다.
실시예 6
인간 혈청-01부터 인간 혈청-14를 검체로 하고, 상기 실시예 2와 마찬가지의 조성으로 이루어진 시약 C 및 시약 b의 조합 시약을 사용하여 상술의 (2), (3)에 기재한 것과 마찬가지의 조작을 행하였다.
실시예 7
이하의 조성으로 이루어지는 LDL-TG 정량 시약을 조제했다.
제 1 시약(시약 D)
PIPES 완충액(pH6.5) 50mmol/L
계면활성제*7 2.5g/L
소혈청 알부민 3.0g/L
트린더 시약(TOOS) 0.5g/L
염화마그네슘 4.0g/L
글리세롤키나제 1.0KU/L
글리세롤-3인산 옥시다아제 4.0KU/L
리포프로테인리파아제 100KU/L
콜레스테롤에스테라제#3 6.0KU/L
카탈라아제 1000KU/L
*7 : 폴리옥시알킬렌 유도체(HLB값 13.2)
#3 : 분자량 불명(Microbial 유래. 메이커 공칭)
제 2 시약(시약 c)
PIPES 완충액(pH7.0) 50mmol/L
계면활성제*8 6.0g/L
4-아미노안티피린 4.0mmol/L
리포프로테인리파아제 400KU/L
퍼옥시다아제 5.0KU/L
아지화나트륨 0.05%
*8 : 폴리옥시에틸렌알킬에테르(HLB값 12.4)
인간 혈청-01부터 인간 혈청-14를 검체로 하고, 시약 D 및 시약 c의 조합 시약을 사용하여 상술의 (2), (3)에 기재한 것과 마찬가지의 조작을 행하였다.
인간 혈청-01부터 인간 혈청-14의 인간 혈청 14 검체에 대해서, 상기 (1)에 의해 산출한 실시예 4의 초원심법 LDL-TG 측정값(mg/dL)과, 상기 (2), (3)에 의해 산출한 비교예 2, 실시예 5, 실시예 6, 및 실시예 7의 LDL-TG 측정값(mg/dL) 및 상관 그래프를 이하 표 2, 및 도 1, 도 2, 도 3, 도 4에 나타낸다.
Figure 112014110774863-pct00002
실시예 4와의 상관성에 대해서, 비교예 2에서는 상관계수의 자승이 0.481인 것에 대해서, 실시예 5에서는 상관계수의 자승은 0.970, 실시예 6에서는 0.977, 실시예 7에서는 0.856이다.
본 발명의 실시예에 의하면, 정확한 측정이 가능한 것이 알려져 있는 실시예 4의 초원심법과의 상관성이 비교예 2와 비교해서 분명하게 높은 것을 알 수 있다.
비교예 3
이하의 조성으로 이루어지는 LDL-TG 정량 시약을 조제했다.
제 1 시약(시약 A)
PIPES 완충액(pH6.5) 50mmol/L
계면활성제*9 2.0g/L
소혈청 알부민 3.0g/L
트린더 시약(TOOS) 0.5g/L
염화마그네슘 4.0g/L
글리세롤키나제 3.0KU/L
글리세롤-3인산 옥시다아제 7.5KU/L
리포프로테인리파아제 100KU/L
카탈라아제 1000KU/L
*9 : 폴리옥시알킬렌 유도체(HLB값 13.2)
제 2 시약(시약 d)
PIPES 완충액(pH7.0) 50mmol/L
계면활성제*10 6.0g/L
4-아미노안티피린 4.0mmol/L
퍼옥시다아제 10.0KU/L
아지화나트륨 0.05%
*10 : 폴리옥시에틸렌알킬에테르(HLB값 13.3)
인간 혈청-15부터 인간 혈청-30을 검체로 하고, 시약 A 및 시약 d의 조합 시약을 사용하여 상술의 (2), (3)에 기재한 것과 마찬가지의 조작을 행하였다.
실시예 8
이하의 조성으로 이루어지는 LDL-TG 정량 시약을 조제했다.
제 1 시약(시약 F)
PIPES 완충액(pH6.5) 50mmol/L
계면활성제*11 2.0g/L
소혈청 알부민 10.0g/L
트린더 시약(TOOS) 0.5g/L
염화마그네슘 1.5g/L
글리세롤키나제 1.0KU/L
글리세롤-3인산 옥시다아제 4.0KU/L
리포프로테인리파아제 100KU/L
콜레스테롤에스테라제#4 0.7KU/L
카탈라아제 1000KU/L
*11 : 폴리옥시알킬렌 유도체(HLB값 13.2)
#4 : 약 30kDa(Peudomonas sp. 유래)
제 2 시약(시약 d)
PIPES 완충액(pH7.0) 50mmol/L
계면활성제*12 6.0g/L
4-아미노안티피린 4.0mmol/L
퍼옥시다아제 10.0KU/L
아지화나트륨 0.05%
*12 : 폴리옥시에틸렌알킬에테르(HLB값 13.3)
인간 혈청-15부터 인간 혈청-30을 검체로 하고, 시약 F 및 시약 d의 조합 시약을 사용하여 상술의 (2), (3)에 기재한 것과 마찬가지의 조작을 행하였다.
실시예 9
이하의 조성으로 이루어지는 LDL-TG 정량 시약을 조제했다.
제 1 시약(시약 G)
PIPES 완충액(pH6.5) 50mmol/L
계면활성제*13 1.5g/L
소혈청 알부민 10.0g/L
트린더 시약(TOOS) 0.5g/L
염화마그네슘 1.5g/L
글리세롤키나제 1.0KU/L
글리세롤-3인산 옥시다아제 4.0KU/L
리포프로테인리파아제 100KU/L
콜레스테롤에스테라제#5 1.5KU/L
카탈라아제 1000KU/L
*13 : 폴리옥시알킬렌 유도체(HLB값 13.2)
#5 : 약 300kDa(Peudomonas sp．유래. 메이커 공칭)(SDS-PAGE로 약 60kDa, 약 30kDa의 밴드를 확인)
제 2 시약(시약 d)
PIPES 완충액(pH7.0) 50mmol/L
계면활성제*14 6.0g/L
4-아미노안티피린 4.0mmol/L
퍼옥시다아제 10.0KU/L
아지화나트륨 0.05%
*14 : 폴리옥시에틸렌알킬에테르(HLB값 13.3)
인간 혈청-15부터 인간 혈청-30을 검체로 하고, 시약 G 및 시약 d의 조합 시약을 사용하여 상술의 (2), (3)에 기재한 것과 마찬가지의 조작을 행하였다.
실시예 10
이하의 조성으로 이루어지는 LDL-TG 정량 시약을 조제했다.
제 1 시약(시약 H)
PIPES 완충액(pH6.5) 50mmol/L
계면활성제*15 1.5g/L
소혈청 알부민 10.0g/L
트린더 시약(TOOS) 0.5g/L
염화마그네슘 1.5g/L
글리세롤키나제 1.0KU/L
글리세롤-3인산 옥시다아제 4.0KU/L
리포프로테인리파아제 100KU/L
콜레스테롤에스테라제#6 1.5KU/L
카탈라아제 1000KU/L
*15 : 폴리옥시알킬렌 유도체(HLB값 13.2)
#6 : 분자량 불명(Microorganism 유래. 메이커 공칭)(SDS-PAGE로 약 70kDa, 약 30kDa의 밴드를 확인)
제 2 시약(시약 d)
PIPES 완충액(pH7.0) 50mmol/L
계면활성제*16 6.0g/L
4-아미노안티피린 4.0mmol/L
퍼옥시다아제 10.0KU/L
아지화나트륨 0.05%
*16 : 폴리옥시에틸렌알킬에테르(HLB값 13.3)
인간 혈청-15부터 인간 혈청-30을 검체로 하고, 시약 H 및 시약 d의 조합 시약을 사용하여 상술의 (2), (3)에 기재한 것과 마찬가지의 조작을 행하였다.
인간 혈청-15부터 인간 혈청-30의 인간 혈청 16 검체에 대해서, 상기 (1)에 의해 산출한 대조예의 초원심법 LDL-TG 측정값(mg/dL)과, 상기 (2), (3)에 의해 산출한 비교예 3, 실시예 8, 실시예 9, 실시예 10의 LDL-TG 측정값(mg/dL) 및 상관 그래프를 이하 표 3, 및 도 5, 도 6, 도 7, 도 8에 나타낸다.
Figure 112014110774863-pct00003
실시예 4와의 상관성에 대해서, 비교예 3에서는 상관계수의 자승이 0.031인 것에 대해서, 실시예 8에서는 상관계수의 자승은 0.936, 실시예 9에서는 0.883, 실시예 10에서는 0.887이다.
본 발명의 실시예에 의하면, 정확한 측정이 가능한 것이 알려져 있는 실시예 4의 초원심법과의 상관성이 비교예 3과 비교해서 분명하게 높은 것을 알 수 있다.

Claims (3)

  1. 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질에 작용하는 계면활성제 또는 저밀도 리포단백질의 보호 작용을 갖는 계면활성제의 존재 하에서, 시료에 리포프로테인리파아제, 콜레스테롤에스테라제, 글리세롤키나제 및 글리세롤-3인산 옥시다아제를 작용시키고, 발생한 과산화수소를 소거하는 것을 포함하는 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질 중의 트리글리세리드의 소거 방법으로서,
    상기 계면활성제는 HLB값이 13 이상 15 이하의 폴리옥시알킬렌 유도체인 것을 특징으로 하는 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질 중의 트리글리세리드의 소거 방법.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 폴리옥시알킬렌 유도체는 HLB값이 13 이상 15 이하의 폴리옥시알킬렌 다환 페닐에테르인 것을 특징으로 하는 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질 중의 트리글리세리드의 소거 방법.
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