KR100394149B1 - 트레할로오스와그제조방법및용도 - Google Patents

Abstract

(목적) 트레할로오스 또는 이것을 함유하는 당질과 그 제조방법 및 용도를 제공한다.

(구성) 말토오스를 함유시킨 영양 배지에서 말토오스/트레할로오스 변환 효소 산생능 (産生能) 을 가진 미생물을 배양하여 수득되는 비환원성 당질 또는 이것을 함유하는 당질, 이 당질의 제조 방법 및 이 당질을 함유시킨 조성물을 주된 구성으로 한다.

Description

트레할로오스와 그 제조 방법 및 용도{TREHALOSE AND ITS PRODUCTION AND USE}

본 발명은 트레할로오스와 그 제조 방법 및 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 말토오스를 함유시킨 영양 배지에서 말토오스/트레할로오스 변환 효소를 산생 (産生) 할 수 있는 미생물을 배양하여 얻어지는 트레할로오스 또는 이것을 함유하는 당질 및 이 당질의 제조 방법과 그 용도에 관한 것이다.

글루코오스로 구성된 비환원성 당질로서 옛날부터 트레할로오스 (α,α-트레할로오스) 가 알려져 있는데, 문헌 [Advances in Carbohydrate Chemistry, published by Academic Press Inc., New York, New York, USA, Vol.18, pp.201∼225 (1963), 및 Applied and Environmental Microbiology, Vol.56,pp.3,213∼3,215 (1990)]에 기재되어 있는 바와 같이 그 함량은 작지만 미생물, 버섯, 곤충 등 광범위하게 존재하고 있다. 트레할로오스와 같은 비환원성 당질은 아미노산이나 단백질 등의 아미노기를 가진 물질과 아미노카르보닐 반응을 일으키지 않고 아미노산 함유물질을 상하게 하지 않으므로 갈변이나 열화 (劣化) 의 우려가 없이 이용, 가공할 수 있는 것으로 기대되어 그 공업적 제조 방법의 확립이 크게 요망되고 있다.

종래의 트레할로오스 제조 방법으로서는, 예컨대 일본국 특허 공개 제 154,485/75 호 공보에 개시 (開示) 되어 있는 미생물 균체를 이용하는 방법과, 일본국 특허 공개 제 216695/83 호 공보에 제안되어 있는 말토오스 포스포릴라아제와 트레할로오스 포스포릴라아제를 조합하여 사용함으로써 말토오스를 변환하는 방법 등이 알려져 있다. 그러나, 미생물 균체를 사용하는 방법은 이 균체를 출발 원료로 하여 여기에 함유되는 트레할로오스의 함량이 통상 고형물당 15 w/w % (이하, 본 명세서에서는 별달리 명시하지 않는 한 " w/w % "을 간단히 " % " 로 약칭한다) 이하로서 낮고, 그외에 이것을 추출, 정제하는 공정이 번잡하여 공업적 제조 방법으로서는 적당하지 않다. 또한, 말토오스 포스포릴라아제와 트레할로오스 포스포릴라아제를 사용하는 방법은 어느것이나 글루코오스-1-포스페이트를 경유하여 트레할로오스를 생성시키고 있으므로 기질인 말토오스를 비교적 고농도로 사용할 수 없고, 이들 두가지 효소가 동일 반응계에서 가역적으로 작용하므로 트레할로오스의 수율이 낮으며, 더욱이 이들 효소의 반응계를 안정하게 유지하여 반응을 원활하게 진행시키는 것이 곤란하여 아직 공업적 제조 방법으로서 실현되지 않고 있다.

이것과 관련하여 문헌 [" Monthly Food Chemicals ", 8 월호, pp.67-72 (1992), " 전분 이용 개발의 현상과 과제 " 의 " 올리고당 " 의 항] 에서 " 트레할로오스에 대해서는 현저하게 넓은 응용 범위가 고려될 수 있으나 이 당의 전분 당질로 부터의 직접 당전이, 가수분해 반응을 이용한 효소적 생산은 현재로서는 학술적으로 불가능하다고 할 수 있다 " 라고 기재되어 있는 바와 같이 전분을 원료로 하여 효소 반응에 의하여 트레할로오스를 제조한다는 것은 종래에는 학술적으로도 불가능하다고 생각되었던 것이다.

한편, 전분을 원료로 하여 제조되는 전분 부분 가수분해물, 예컨대 전분 액화물, 각종 덱스트린, 각종 말토올리고당 등은 통상 그 분자의 말단에 환원기를 가져 환원성을 나타내는 것이라 알려져 있다. 이와 같은 환원성 전분 부분 가수분해물을 본 명세서에서는 " 환원성 전분 부분 분해물 " 이라 한다. 일반적으로, 이러한 환원성 전분 부분 분해물의 환원력을 건조중량 기준으로 DE(Dextrose Equivalent) 값으로 나타내고 있다. 이 값이 큰 것은 통상 분자량이 적고 저점도이며 감미가 강한 것이기는 하나 반응성이 강하고 아미노산과 단백질 등의 아미노기를 가진 물질과 아미노카르보닐 반응을 일으키기 쉬우며 갈변하여 악취를 발생하고 쉽사리 품질이 열화하는 성질이 있다는 것이 알려져 있다.

이와 같은 환원성 전분 부분 분해물의 여러가지 특성은 BE 값의 대소에 의존하고 있고 환원성 전분 부분 분해물과 DE 값과의 관계는 극히 중요하다. 그러나, 종래 당업계에서는 이 관계를 단절시킨다는 것은 불가능하다고 믿고 있기까지 하였다.

이 관계를 단절시키는 유일한 방법은 환원성 전분 부분 분해물을 고압 수소첨가법으로 그 환원기를 당 알코올로 변환하여 비환원성 당질로 하는 방법이다. 그러나, 이 방법은 고압 오토클레이브를 필요로 하며 다량의 수소와 에너지를 소비할 뿐만 아니라 방재상으로 부터도 고도의 안전설비와 관리를 필요로 하고 있다. 그 외에 수득되는 비환원성 전분 부분 분해물의 당 알코올은 원료인 환원성 전분 부분 분해물이 글루코오스만으로 되어 있는데 대하여 글루코오스와 소르비톨로 구성되는 점에서 상이하고, 이것을 섭취함으로써 일과성이기는 하지만 난소화, 설사의 증상을 일으킬 우려도 있다. 따라서, 환원성 전분 부분 분해물의 구성당인 글루코오스를 변화시킴이 없이 그 환원력을 감소시키거나 소멸시키는 방법의 확립이 요망된다.

이것을 해결하기 위하여 본 발명자들은 일본국 특허 출원 제 144,092/94 호 명세서에서 말토오스를 트레할로오스로 변환하는 신규의 효소 (이 효소를 이후부터는 " 말토모스/트레할로오스 변환 효소 " 라 함) 를 개시함으로써 이 말토오스/트레할로오스 변환 효소를 이용하여 말토오스로 부터 트레할로오스와 이것을 함유하는 당질의 제조 방법을 확립하였다.

그러나, 미생물을 배양하여 이 효소를 산생시키는 배양시간 외에 효소 회수시간, 말토오스로 부터 트레할로오스로의 변환을 위한 효소 반응 시간이 장시간을 필요로 한다는 결점이 있음이 판명되었다. 따라서, 말토오스로 부터 트레할로오스틀 제조함에 있어서 이 효소의 생산을 포함하여 보다 간편하고 용이하게 실시할 수 있는 트레할로오스의 제조 방법의 확립이 크게 요망된다.

본 발명을 말토오스로 부터 트레할로오스를 간편하게 단시간에 제조할 수 있는 새로운 방법을 확립함과 아울러 그 용도를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 말토오스/트레할로오스 변환 효소 산생능을 가진 미생물의 배양과 이 효소의 생산에 대하여 예의 연구를 계속하여 왔다. 그 결과, 본 발명자들은 이 미생물은 말토오스/트레할로오스 변환 효소를 상당히 조기 배양 단계에서 생산하고 있음을 발견함과 아울러 배양 도중의 영양배지에 말토오스를 공존시킴으로써 용이하게 트레할로오스를 생성, 축적한다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 말토오스를 함유시킨 영양 배지에 말토오스/트레할로오스 변환효소 산생능을 가진 미생물을 배양하여 수득되는 트레할로오스 또는 이것을 함유하는 당질 및 이 당질의 제조 방법과 이 당질을 함유시킨 조성물과 그 용도를 확립하는 것이다. 본 발명에서 말토오스로서는 특히 액화 전분에 β-아밀라아제 또는 β-아밀라아제와 더불어 전분 지절 효소 (starch-debranching enzyme) 를 작용시켜 수득되는 것이 바람직하고, 또한 미생물로서는 특히 말토오스/트레할로오스 변환효소 산생능을 가진 미생물의 이용이 트레할로오스 제조에 있어서 극히 유리하다. 이와 같이 해서 수득되는 트레할로오스 또는 이것을 함유하는 당질은 안전성이 높고 취급이 용이하며 광범위한 용도에 이용할 수 있는데, 예컨대 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 말토오스/트레할로오스 변환 효소 산생능을 가진 미생물로서는 말토오스를 트레할로오스로 변환하는 효소를 산생하는 미생물이다. 이러한 효소의 예로서는 일본국 특허 출원 제 144,092/94 호 명세서에 기재되어 있는 피멜로박터속 (Pimelobacter屬), 슈우도모나스속 (Pseudomonas屬) 및 더어무스속 (Thermus屬) 에 속하는 미생물 유래의 것들이 있다.

이러한 미생물의 배양에 사용되는 영양 배지는 미생물이 생육할 수 있고, 말토오스/트레할로오스 변환 효소를 생산할 수 있는 영양 배지이면 좋고, 트레할로오스 생성을 위한 기질로서 말토오스를 함유하는 것이 사용된다. 필요에 따라 기타의 탄소원, 예컨대 글루코오스, 프룩토오스, 락토오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨, 당밀 등의 당질과, 시트르산, 숙신산 등의 유기산 또는 이들의 염을 병용할 수도 있다. 배지에 함유시키는 말토오스의 농도는 바람직한 농도는 20 w/v % 이하, 바람직하게는 15 w/v % 이하, 더욱 바람직하게는 약 5∼10 w/v %이다. 질소원으로서는 예컨대 암모늄 염, 질산 염 등의 무기 질소 화합물과, 우레아, 콘 스티프 리커, 카제인, 펩톤, 효모 엑스, 육 (肉) 엑스 등의 유기 질소화합물이 사용된다. 또한, 무기 성분으로서는, 예컨대 칼슘 염, 마그네슘 염, 칼륨 염, 나트륨 염, 인산 염, 망간 염, 아연 염, 철 염, 구리 염, 몰리브덴 염, 코발트 염 등이 적절히 사용된다. 더욱이, 필요에 따라 아미노산, 비타민 등도 적절히 사용된다.

배양은 미생물이 생육할 수 있는 호기적 조건하에서 통상적으로 4∼80℃, 바람직하게는 20∼75℃ 에서 pH 5∼9, 바람직하게는 pH 6∼8.5 에서 실시한다. 배양 시간은 미생물이 증식할 수 있는 시간 이상의 시간이면 좋고, 바람직하게는 10∼100 시간이다. 그리고, 배양액의 용존 산소 (DO : dissolved oxygen) 농도에는 특히 제한은 없으나 통상은 0.5∼20 ppm 이 바람직하다. 이러한 목적으로 통기량을조절하거나 교반하거나 통기에 산소를 추가하거나, 또한 퍼어멘터(fermenter) 내의 압력을 높이는 등의 수단을 채용할 수 있다. 그리고, 배양방식은 회분 (batch) 배양, 연속 배양 또는 반연속 배양중 어느것이라도 좋다.

이렇게 하여 말토오스를 함유시킨 영양 배지에 말토오스/트레할로오스 변환효소 산생능을 가진 미생물을 배양하여 배양중에 트레할로오스를 생성, 축적시킬 수가 있다. 또한, 필요하다면 별도로 조제한 말토오스/트레할로오스 변환효소를 배양도중의 영양 배지에 보충하거나 음이온 계면 활성제, 비이온 계면 활성제 등의 계면 활성제 및/또는 리소자임 등의 용균 효소 (lytic enzyme) 를 배양도중의 영양 배지에 가하여 트레할로오스의 생성 속도를 증가시키는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 이렇게 하여 생성, 축적시킨 트레할로오스는 배양물 중의 불용물을 제거하여 얻어지는 액체부분에 포함된다.

트레할로오스를 함유하는 배양물은 먼저 공지의 고액 (solid/liquid) 분리법, 예컨대 여과 또는 원심 분리 등에 의해 제균액 (cell-free liquid) 으로 하고 이것을 통상의 방법에 따라 농축하여 활성탄으로 탈색, H형 및 OH형 이온 교환수지로 탈염하여 정제, 농축함으로써 시럽상 제품을 얻는다. 더욱이, 건조하여 분말상 제품으로 하는 것도 마음데로이다. 필요하다면 배양물을 그대로 평막 또는 중공사막 등의 막 여과 처리하여 균체 등의 불용물과 더불어 단백질, 핵산 등의 가용성 고분자물을 제거하거나, 또는 미리 원심 분리 등에 의하여 불용물을 제거한 다음 막 여과에 의해 가용성 고분자물을 제거한 후 통상의 방법에 따라 농축, 탈색, 탈염하여 정제함으로써 트레할로오스 또는 이것을 함유한 당질 제품을 유리하게 제조할 수 있다.

이어서, 본 발명의 트레할로오스 생성에 관계하고 있는 말토오스/트레할로오스 변환 효소에 대해 설명한다. 효소의 활성은 배양물의 균체와 상청액 어느쪽에도 나타나는데, 균체와 상청액을 조 (粗) 효소액으로 하여 채취하는 것도, 그리고 배양물 전체를 조효소액으로 하여 사용하는 것도 가능하다. 배양물로 부터 균체를 제거하자면 공지의 고액 분리법이 채용된다. 예컨대, 배양물 그 자체를 그대로 원심 분리하는 방법, 혹은 프리코우트 필터 (precoated filter) 를 사용하여 균체를 여과 분리하는 방법, 평막 (平膜), 중공사막 (中空絲膜) 등의 막 여과에 의하여 분리하는 방법 등이 적절히 채용된다. 제균액을 그대로 효소액으로 사용할 수가 있으나 일반적으로는 농축하여 사용한다. 농축 방법으로서는, 예컨대 황산 암모늄 염석법, 아세톤과 알코올을 이용하는 침전법, 평막, 중공사막 등의 막을 이용하는 막 농축법 등을 사용할 수 있다.

더욱이, 제균액과 그 농축물을 공지의 방법으로 고정화 할 수도 있다. 이러한 목적으로 예를 들자면, 이온 교환체에의 결합법, 수지와 막 등과의 공유 결합 또는 흡착법, 고분자 물질을 사용한 포괄법 등을 채용할 수 있다. 그리고, 배양물로 부터 분리한 균체도 그대로 조효소액으로 사용할 수가 있으나, 이것을 고정화하여 사용하여도 좋다. 한가지 예로서, 균체를 먼저 알긴산 나트륨과 혼합하여 염화 칼슘 수용액중에 적하해서 입상 (粒狀) 으로 겔화시켜 고정화 한다. 이 입상화물을 다시 폴리에틸렌이민 또는 글루타르알데히드로 처리하여 고정화하여도 좋다. 균체로 부터 효소를 추출하고 그 추출액을 조효소액으로 사용할 수도 있다. 예를 들자면, 초음파에 의한 파쇄법, 유리 비이드 (bead) 와 알루미나에 의한 기계적 파쇄법, 프렌치 프레스 (French press) 에 의한 파쇄법 등으로 균체로 부터 효소를 추출하여 원심 분리 또는 막 여과 등으로 투명한 조효소액을 얻을 수 있다.

이 효소액을 그대로 사용할 수 있으나 공지의 방법으로 다시 정제하여 사용할 수도 있다. 한가지 예로서, 배양액의 처리물을 황산 암모늄 염석하여 농축한 조효소 표품 (標品) 을 투석한 후 " DEAE-TOYOPEARL " 수지를 사용한 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 이어서 " BUTYL TOYOPEARL " 을 사용한 소수 (疎水) 칼럼 크로마토그래피 및 " TOYOPEARL HW-55 " 을 사용한 겔 여과 크로마토그래피(이상의 제품들은 모두가 일본국의 Tosoh 사제임) 로 정제함으로써 전기 영동적으로 단일의 효소를 얻을 수 있다.

이와 같이 하여 얻게 되는 말토오스/트레할로오스 변환 효소는 아래와 같은 물리화학적인 성질을 가진다.

(1) 작용

말토오스를 트레할로오스로 변환하고 트레할로오스를 말토오스로 변환함.

(2) 분자량

SDS-겔 전기 영동법으로 약 57,000∼120,000 달톤

(3) 등전점

앰폴라인 (Ampholine) 함유 전기 영동법으로 pI 약 3.8∼5.1

(4) 활성저해

1 mM Cu²⁺, Hg²⁺및 50 mM Tris-HCl 완충액에 의해 저해를 받음.

(5) 기원

미생물에 의해 산생된 효소임.

상이한 미생물 유래의 몇가지 효소의 예는 아래와 같다.

피멜로박터 sp. R48 유래의 말토오스/트레할로호스 변환 효소

(1) 작용

말토오스를 트레할로오스로 변환하고 트레할로오스를 말토오스로 변환함.

1 몰의 말토오스 또는 트레할로오스로 부터 각각 약 1 몰의 트레할로오스 또는 말토오스를 생성함.

(2) 분자량

SDS-겔 전기 영동법으로 약 57,000∼67,000 달톤

(3) 등전점

앰폴라인 함유 전기 영동법으로 pI 약 4.1∼5.1

(4) 활성저해

1 mM Ca²⁺, Hg²⁺및 50 mM Tris-HCl 완충액에 의해 저해를 받음.

(5) 최적 온도

pH 7.0 및 60 분간 반응에서 약 20℃ 부근.

(6) 최적 pH

25℃ 에서 60분간 반응에서 pH 약 7.0∼8.0

(7) 열적 안정성

pH 7.0에서 60분간 유지하였을 때 30℃ 부근까지 안정.

(8) pH 안정성

20℃ 에서 60분간 유지했을 때 pH 약 6.0∼9.0

슈우도모나스 푸티다 H262 유래의 말토오스/트레할로오스 변환 효소

(1) 작용

말토오스를 트레할로오스로 변환하고 트레할로오스를 말토오스로 변환함.

1 몰의 말토오스 또는 트레할로오스로 부터 각각 약 1 몰의 트레할로오스 또는 말토오스를 생성함.

(2) 분자량

SDS-겔 전기 영동법으로 약 110,000∼120,000 달톤

(3) 등전점

앰폴라인 함유 전기 영동법으로 pI 약 4.1∼5.1

(4) 활성저해

1 mM Cu²⁺, Hg²⁺및 50 mM Tris-HCl 완충액에 의해 저해를 받음.

(5) 최적 온도

pH 7.0 및 60분간 반응에서 37℃ 부근.

(6) 최적 pH

35℃ 에서 60분간 반응에서 pH 약 7.3∼8.3

(7) 열적 안정성

pH 7.0에서 60 분간 유지하였을 때 40℃ 부근까지 안정.

(8) pH 안정성

35℃ 에서 60 분간 유지했을 때 pH 약 6.0∼9.5

더어무스 아쿠아티쿠스 ATCC 33923 유래의 말토모스/트레할로오스 변환 효소

(1) 작용

말토오스를 트레할로오스로 변환하고 트레할로오스를 말토오스로 변환함.

1 몰의 말토오스 또는 트레할로오스로 부터 각각 약 1 몰의 트레할로오스 또는 말토오스를 생성함.

(2) 분자량

SDS-겔 전기 영동법으로 약 100,000∼110,000 달톤

(3) 등전점

앰폴라인 함유 전기 영동법으로 pI 약 3.8∼4.8

(4) 활성저해

1 mM Cu²⁺, Hg²⁺및 50 mM Tris-HCl 완충액에 의해 저해를 받음.

(5) 최적 온도

pH 7.0 및 60 분간 반응에서 약 65℃ 부근.

(6) 최적 pH

60℃ 에서 60 분간 반응에서 pH 약 6.0∼6.7

(7) 열적 안정성

pH 7.0에서 60 분간 유지하였을 때 80℃ 부근까지 안정.

(8) pH 안정성

60℃에서 60 분간 유지했을 때 pH 약 5.5∼9.5

말토오스/트레할로오스 변환 효소의 활성은 다음과 같이 하여 측정한다.

기질로서 말토오스 20 w/v % (10 mM 인산염 완충액, pH 7.0)

1 ㎖ 에 효소액 1 ㎖ 을 가하고 25℃, 35℃ 또는 60℃에서 60분간 반응시킨 후 100℃ 에서 10분간 가열하여 반응을 정지시켰다. 이 반응액을 정확히 50 mM 인산염 완충액 (pH 7.5)으로 11 배로 희석하고, 그 희석액 0.4 ㎖에 트레할라아제 함유 용액 (1단위/㎖) 을 0.1 ㎖ 첨가한 것을 45℃ 에서 120 분간 인큐베이트한 후 이 반응액중의 글루코오스양을 글루코오스 옥시다아제법으로 정량한다. 대조로서 미리 100℃ 에서 10분간 가열하여 실활시킨 효소액 및 트레할라아제를 사용하여 위와 마찬가지로 측정한다. 위의 측정 방법을 이용하여 증가하는 글루코오스 양으로 부터 말토오스/트레할로오스 변환 효소에 의해 생성되는 트레할로오스양을 구하여 효소의 활성 1 단위는 1 분간에 1 μmol 의 트레할로오스를 생성하는 효소량으로 정의한다.

이 측정 방법에서 반응 온도는 말토오스/트레할로오스 변환 효소가 피멜로박터속 유래의 경우에는 25℃ 로 하고, 슈우도모나스속 유래의 경우에는 반응 온도를 35℃ 로 하며, 더어무스속 유래의 경우에는 60℃ 로 한다.

본 발명에서 사용되는 전분은 옥수수 전분, 쌀 전분, 밀 전분 등의 지상 (地上) 전분과 감자 전분, 고구마 전분, 타피오카 전분 등의 지하 (地下) 전분이다. 이러한 전분을 액화하자면 통상적으로 전분을 물에 농도 10 % 이상, 보다 바람직하게는 약 20∼50 % 로 하여 현탁하고 가열하여 기계적으로 액화하거나 산 또는 효소로 액화한다. 액화도는 비교적 낮은 것이 적합한데, 바람직하게는 DE 15 미만, 보다 바람직하게는 DE 10 미만의 것이 적합하다. 산으로 액화할 경우에는 예컨대 염산, 인산 또는 옥살산으로 액화한 후 탄산 칼슘, 산화 칼슘 또는 탄산 나트륨으로 소정의 pH로 중화한다. 효소로 액화할 경우에는 α-아밀라아제, 특히 내열성의 액화형 α-아밀라아제가 바람직하다.

본 발명에서 액화 전분액으로 부터 말토오스를 제조하는데 사용되는 β-아밀라아제는 공지 방법으로 고구마, 대두, 밀기울 등의 식물, 바실루스속에 속하는 미생물의 배양물 등으로 부터 제조할 수 있다. 물론, 시판되고 있는 효소제를 사용할 수도 있다. 그리고, 본 발명에서 사용되는 전분 지절 효소는 전분을 비교적 낮은 DE 로 액화한 것, 바람직하게는 DE 15 미만의 액화 전분에 작용하여 전분의 지분 (branch) 결합을 가수분해하는 효소인데, 이러한 목적으로 공지의 풀룰라나아제, 이소아밀라아제 등이 유리하게 사용할 수 있으며, 또한 시판의 효소제를 사용할 수도 있다.

효소의 사용량은 반응 시간을 비롯한 반응 조건에 따라 적절히 선택한다.

통상적으로 기질인 액화 전분액에 대해 고형물 1 g 당 β-아밀라아제의 경우 약 1∼100 단위의 양으로 사용하고, 전분 지절 효소의 경우에는 고형물 1 g 당 약 1~2000 단위를 사용한다.

이와 같이 하여 수득한 말토오스를 본 발명의 배양 방법에서 트레할로오스 또는 이것을 함유한 당질 제조용 당원으로 유리하게 사용할 수 있다. 말토오스를 영양 배지에 함유시키는 시기는 트레할로오스를 생성할 수 있는 한 배양전 또는 배양도중에 함유시킬 수 있다. 연속식 또는 반연속식으로 배양할 경우에 있어서 예컨대 트레할로오스를 생성시킨 영양 배지의 일부를 취하여 이것과 동일 체적의 말토오스를 함유시킨 영양 배지를 배양물에 추가하여 배양하여도 좋다. 이러한 배양을 액화 전분 용액에 β-아밀라아제 또는 β-아밀라아제와 전분 지절 효소를 공존시킨 영양 배지에서 실시하는 것도 마음데로이다.

이와 같이 하여 수득되는 트레할로오스 함유 배양물을 통상의 방법으로 여과, 원심 분리 처리하여 균체 등의 불용물을 제거한 후 농축, 활성탄으로 탈색, H 형 및 OH 형 이온 교환 수지로 탈염하여 정제하고 농축하여 시럽상 제품을 얻는다. 더욱이, 건조하여 분말상 제품으로 하는 것도 마음데로이다. 필요하다면 시럽상 제품을, 예컨대 이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 활성탄 칼럼 크로마토그래피, 실리카 겔 크로마토그래피 등의 칼럼 크로마토그래피에 의한 분획, 알코올 및 아세톤 등의 유기 용매에 의한 분별, 적당한 분리 성능을 가진 막에 의한 분리, 효모에 의한 발효 처리 및 알칼리 처리 등에 의한 잔존해 있는 환원성 당질의 제거 또는 분해 등의 방법을 1 종 이상을 조합하여 정제함으로써 최고 순도의 트레할로오스 제품을 쉽사리 얻을 수 있다.

공업적 대량 생산에 있어서 강산성 양이온 교환 수지에 의한 이온교환 칼럼 크로마토그래피를 이용하는 것이 적합한데, 예컨대 일본국 특허 공개 제 23,799/83호 및 특허 공개 제 72,598/83 호 공보 등에 개시되어 있는 강산성 양이온 교환 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피에 의해 협잡 당류를 제거하여 목적의 트레할로오스 함량을 증가시킨다. 이 경우에 있어서 고정상 (fixed bed) 방식, 이동상 (moving bed) 방식 및 의사 (擬似) 이동상 방식중에서 어떤 방식을 마음데로 채용할 수 있다.

이렇게 하여 수득한 트레할로오스 함유 당질을 필요에 따라 글루코아밀라아제 또는 α-글루코시다아제로 분해하여 감미도와 환원성을 조절하고, 또한 점성을 저하시키거나 또는 수소 첨가하며 잔존하고 있는 환원성 당질을 당알코올로 하여 환원력을 소멸시키는 것 등의 추가적인 가공 처리를 실시할 수도 있다.

특히, 본 발명에 의한 트레할로오스 함유 당질에 글루코아밀라아제 또는 α-글루코시다아제를 작용시켜 트레할로오스와 글루코오스의 혼합 용액을 얻은 다음, 이것을 위에 나온 정제 방법, 예컨대 이온 교환 칼럼 크로마토그래피에 의해 글루코오스를 제거하면 트레할로오스 고함유 획분을 얻을 수 있다. 이 획분을 정제하고 농축하여 시럽상 제품을 얻은 다음 이것을 더욱 농축하여 과포화 상태로 하여 결정화함으로써 트레할로오스 함수 결정 또는 무수 결정 트레할로오스를 제조할 수도 있다.

트레할로오스 함수 결정을 제조하자면, 예컨대 순도 약 60 % 이상, 농도 약 65∼90 % 이상의 트레할로오스 고함유액을 결정화기 (crystallizer) 에 넣고 필요에 따라 0.1∼20 % 의 씨 결정 (seed crystal) 존재하에 95℃ 이하, 바람직하게는 10∼90℃ 에서 교반하면서 서서히 냉각하여 트레할로오스 함수 결정을 함유하는 매스키트 (massecuite) 를 제조한다. 이 경우에 있어서 감압 농축하면서 트레할로오스를 결정화하는 연속 결정화법을 채용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 매스키트로 부터 트레할로오스 함수 결정 또는 이것을 함유하는 당질 혼합물 고형물을 제조하는 방법의 예로서는 종래의 결정 분리법, 블록 분쇄 방법, 유동조립법 (造粒法) 및 분무 건조법 등을 채용한다.

결정 분리법은 통상적으로 매스키트를 바스켓형 원심 분리기에 넣고 트레할로오스 함수 결정과 모액을 분리한 후, 이 결정에 소량의 냉수를 분무하여 세척하여 고순도의 트레할로오스 함수 결정을 제조하는데 적합하다. 분무 건조법에서는 농도가 70∼85 %, 결정화물 20∼60 % 인 매스키트를 고압 펌프로 노즐로 부터 분무하여 결정 분말이 용해하지 않는 온도, 예컨대 60∼100℃ 의 열풍으로 건조하고, 이어서 30∼60℃의 온풍으로 약 1∼20 시간 숙성하면 비흡습성 또는 난흡습성의 결정질 혼합물 고형물을 쉽사리 제조할 수 있다. 블록 분쇄법에서는 수분 함량 10∼20 %, 결정화율 10∼60 % 인 매스 키트를 약 0.1∼3 일 동안 정치하여 전체를 블록상으로 고화시켜 이것을 분쇄 또는 절삭 등의 방법으로 분말화해서 건조함으로써 비흡습성 또는 난흡습성의 결정질 혼합물 고형물을 쉽사리 제조할 수 있다.

무수 결정 트레할로오스를 제조하자면 트레할로오스 함수 결정을 건조하여 변환 시킬 수도 있으나 일반적으로는 수분 약 10 % 미만의 고농도 트레할로오스 고함유 용액을 결정화기에 넣고 씨 결정 존재하에 50∼160℃, 바람직하게는 80∼140℃에서 교반하여 매스키트를 제조한 다음, 이것을 비교적 고온 건조 조건하에서 예컨대 블록 분쇄법, 유동 조립법 및 분무 건조법 등의 방법으로 결정화와 분말화하여 제조한다.

이렇게 하여 제조되는 본 발명의 트레할로오스 또는 이것을 함유하는 당질은 환원력이 낮고 안정하여 기타의 소재, 특히 아미노산, 올리고펩티드, 단백질 등의 아미노산을 가진 물질과 혼합하여 가공해도 갈변이나 이취 (異臭) 를 발생하는 일이 없고 혼합된 기타 소재를 손상하는 일도 적다. 그리고, 이들은 환원력이 낮음에도 불구하고 저점도이고 고품위의 혼화한 감미를 가진다.

더욱이, 본 발명의 트레할로오스는 트레할라아제에 의해 용이하게 분해되므로 경구 섭취할 경우 소화 흡수되어 칼로리원으로서 이용된다. 더욱이, 이들은 충치 유발균 등에 의해 발효되지 않으므로 충치를 일으키기 어려운 감미료로서도 이용할 수 있다. 그리고, 이들은 삼투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성, 기타 당의 결정화 방지성, 난발효성, 호화 (湖化) 전분의 노화 방지성 등의 성질을 구비하고 있다.

본 발명의 트레할로오스는 경관 영양제 또는 수액제 (輪液劑) 로서 비경구적으로 사용할 경우 특성, 부작용의 우려도 없으므로 쉽사리 대사되고 이용되어 생체에의 에너지 보급에 유리하게 이용할 수 있다. 그리고, 트레할로오스는 안정한 감미료이므로 트레할로오스 함수 결정의 경우에는 풀룰란, 히드록시에틸 전분 및 폴리비닐 피롤리돈 등의 결합제와 병용하여 정제 (tablet) 의 당의제로서 유리하게 이용할 수 있다.

또한, 무수 결정 트레할로오스는 식품, 의약품, 화장품, 그 원재료 또는 가공 중간물 등의 함수물의 탈수제로서도 유리하게 사용할 수 있어 안정한 고품질의분말, 과립, 정제 등의 고상물을 용이하게 제조할 수 있다.

따라서, 본 발명의 트레할로오스 또는 이것을 함유하는 당질은 감미료, 정미(呈味) 개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제, 탈수제 등으로서 음식물, 기호물, 사료, 이료, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.

본 발명의 트레할로오스 또는 이것을 함유하는 당질은 그대로 감미 부여를 위한 감미료로서 사용할 수 있다. 필요하다면, 예컨대 분말 엿, 글루코오스, 말토오스, 수크로오스, 이성화당, 꿀, 메이플 슈거, 이소말토올리고당, 갈락토올리고당, 프룩토올리고당, 락토수크로오스, 소르비톨, 말티톨, 락티톨, 디히드로칼콘, 스테비오시드, α-글리코실스테비오시드, 레바우디오시드, 글리시리진, L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸 에스테르, 사카린, 글리신, 알라닌, 덱스트린, 전분 및 락토오스 중의 한가지 이상의 적당량의 감미료 및/또는 증량제와 혼합하여 사용할 수도 있다.

그리고, 본 발명의 트레할로오스 또는 이것을 함유한 당질의 분말 내지 결정상 제품은 그대로 또는 필요에 따라 증량제, 부형제, 결합제 등과 혼합하여 과립, 구상, 단봉상, 판상, 입방체, 정제 등의 각종 형상으로 성형하여 사용할 수도 있다.

또한, 본 발명의 트레할로오스 또는 이것을 함유하는 당질의 감미는 신 맛, 짠 맛, 떫은 맛, 단 맛, 쓴 맛 등의 기타의 맛을 가진 각종 물질과 잘 조화되므로 일반 음식물의 감미 부여 및/또는 정미 개량제 또한 품질 개량제 등에 유리하게 사용할 수 있다.

예컨대, 이들은 예를 들자면, 아미노산, 펩티드류, 간장, 분말 간장, 된장, 분말 된장, 모로미, 히시오, 후리카케, 마요네즈, 드레싱, 식초, 산바이 주, 초밥용 분말 식초, 츄가-노-모토, 텐츠유, 멘츠유, 소오스, 켓첩, 야구니쿠-노-타레, 커리루우, 스튜스톡, 수우프스톡, 다시-노-모토, 핵산계 조미료, 복합 조미료, 미린, 신미린, 테이블 슈거, 커피 슈거 등의 각종 조미료로서 유리하게 사용할 수 있다.

더욱이, 이들을 예컨대, 센베이, 아라베, 오코시, 아메, 만주, 우이로, 팥 페이스트, 요캉, 미즈요캉, 킹요쿠, 젤리, 카스텔라, 아메다마 등의 각종 일본식 과자 ; 빵, 비스켓, 크래커, 쿠우키, 파이, 푸딩, 버터 크리임, 커스터드 크리임, 크리임 퍼프, 와플, 스폰지 케이크, 도우넛, 초콜렛, 츄잉 검, 카라멜, 캔디 등의 양과자 ; 아이스 크리임, 셔어벳 등의 빙과 ; 과실의 시립 절임, 빙수용 설탕 시럽 등의 시럽류 ; 플라워 페이스트, 피이넛 페이스트, 푸루트 페이스트, 스프레드 등의 페이스트류 ; 잼, 마아말레이드, 가공 과일 및 야채, 토카 등의 과실과 야채의 가공식품류 ; 푸쿠진-즈케, 베타라-즈케, 센마이-즈케, 라쿄-조케 등의 절임 및 절임제품류 ; 햄, 소오세지 등의 축육 제품류 ; 어육 햄, 어육 소오세지, 어묵, 치쿠와, 튀김 등의 어육제품류 ; 성게 내장젓, 오징어젓, 가공된 다시마, 말린 모징어채, 미린으로 조미된 말린 복어 등의 각종 진미류 ; 김, 산채, 말린 오징어, 소어 (小魚), 조개 등의 츠쿠다니 ; 볶은 팥, 감자 샐러드, 다시마 말이 등의 평상시 식품 ; 요구르트, 치이즈 등의 유 (乳) 제품 ; 축육, 어육, 과실, 야채 등의 통조림, 병조림류 ; 청주, 합성주, 소주, 양주 등의 주류 ; 커피, 홍차, 코코아, 주우스,탄산 음료, 유산 음료, 유산균 음료 등의 청량 음료수 ; 푸딩 믹스, 핫 케이크 밀스, 즉석 시루코, 즉석 수우프 등의 즉석 식품, 더욱이는 이유식, 치료식, 드링크제, 펩티드 식품, 냉동 식품, 건조 식품 등의 각종 음식물에 대한 감미 부여 및/또는 정미 개량 또한 품질 개량 등에 유리하게 이용할 수 있다.

또한, 가축, 가금, 꿀벌, 누에, 물고기 등의 사육 동물을 위한 사료, 이료 등의 기호성을 향상시킬 목적으로 사용할 수 있다. 그외에 담배, 치약, 입술 연지, 립 크림, 내복액, 정제, 트로치, 간유 드롭, 구중 청량제, 구중 향제, 가아글제 등, 각종 고형물, 페이스트상, 액상 등으로 하여 기호물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 대한 감미제로서 또는 정미 개량제, 교미제로서, 더욱이는 품질 재량제, 안정제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.

본 발명의 트레할로오스 및 이를 함유하는 당질 조성물은 유효 성분, 활성 등을 상실하기 쉬운 각종 생리 활성 물질 또는 이것을 함유한 건강 식품, 의약품 등에 품질 개량제와 안정제로서 유리하게 적용할 수 있다. 예를 들자면, 림포카인류 [예 : α-, β- 및 γ-인터페론, 종양 괴사인자-α(TNF-α), 종양 괴사인자-β (TNF-β), 대식세포 유주 (遊走) 저지인자, 콜로니 자극인자, 트랜스퍼 팩터, 인터로이킨 II (IL-2)등] ; 호르몬류 [예 : 인슐린, 성장호르몬, 프로락틴, 에리트로포이에틴, 난세포 자극 호르몬 등] ; 생물제제 [예 : BCG 백신, 일본 뇌염 백신, 홍역 백신, 폴리오 생백신, 천연두 백신, 파상풍 톡소이드, 반시뱀 항독소, 인간 면역 글로불린 등] ; 항생 물질 [예 : 페니실린, 에리드로마이신, 클로람페니콜, 테트라사이클린, 스트렙토마이신, 황산 카나마이신 등] ; 비타민류 [예 : 디아민, 리보플라빈, L-아스코르브산, 간유, 카로티노이드, 에르고스테롤, 토코페롤 등] ; 효소류 [예 : 리파아제, 엘라스타아제, 우로키나아제, 프로테아제, β-아밀라아제, 이소아밀라아제, 글루카나아제, 락타아제 등] ; 엑스류 [예 : 약용 인삼 엑스, 자라 엑스, 글로렐라 엑스, 알로에 엑스, 프로폴리스 엑스 등] ; 생균류 [ 예 : 바이러스, 유산균, 효모 등] ; 기타 생리활성 물질 [예 : 로얄젤리 등] 도 그 유효 성분과 활성을 상실함이 없이 안정한 고품질의 액상, 페이스트상 또는 고상의 건강 식품이나 의약 등으로 용이하게 제조할 수 있게 된다.

이상 설명한 각종 조성물에 트레할로오스 또는 이것을 함유하는 당질을 함유시키는 방법은 그 제품이 완성되기 까지의 공정에서 함유시키면 좋은데, 예컨대 혼화, 용해, 융해, 침지, 침투, 살포, 도포, 피복, 분무, 주입, 결정화, 고화 등 공지의 방법이 적절히 선택된다. 그 첨가량은, 통상적으로 0.1 % 이상, 바람직하게는 1 % 이상 함유시키는 것이 적당하다.

이어서, 몇가지 실험에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

먼저, 신규 미생물 피멜로박터 sp. R48, 슈우도모나스 푸티다 H262 및 더어무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 으로 부터의 말토오스/트레할로오스 변환 효소에 대해 설명한 다음, 다른 공지의 미생물로 부터의 말토오스/트레할로오스 변환 효소에 대해 설명한다.

실험 1 : 효소의 제조

글루코오스 2.0 w/v %, 폴리펩톤 0.5 w/v %, 효모 엑스 0.1 w/v %, 인산 수소 2 칼륨 0.1 w/v %, 인산 2 수소 나트륨 0.06 w/v %, 황산 마그네슘 7 수화물0.05 w/v %, 탄산 칼슘 0.5 w/v % 및 물로 된 액체 배지 100 ㎖ 씩을 500 ㎖ 용량의 삼각 플라스크에 넣고 115℃ 에서 30 분간 오토클레이브 하여 멸균한 다음 냉각하여 피멜로박터 sp. R48 (FERM BP-4315) 을 접종하고, 27℃ 및 200 r.p.m. 에서 24 시간 회전 진탕 배양하여 종배양액 (seed culture) 을 얻었다.

용량 30 ℓ의 피어멘터에 위에서와 동일한 조성의 배지를 약 20 ℓ 넣고 가열멸균하고 냉각하여 온도 27℃로 한 후 종배양액 1 v/v % 을 접종하고, 온도 27℃ 및 pH 6.0∼8.0 로 유지하면서 약 40 시간 통기 교반 배양하였다.

배양액의 말토오스/트레할로오스 변환 효소의 효소 활성은 약 0.55 단위/㎖이었다. 배양액의 일부를 채취하고 원심 분리하여 균체와 배양 상청액으로 분리한 다음, 이 균체를 50 mM 인산염 완충액 (pH 7.0) 에 현탁하여 원래의 배양액과 동일한 액량으로 한 후 균체 현탁액과 배양 상청액의 말토오스/트레할로오스 변환 효소의 활성을 측정한 결과, 균체 현탁액에는 0.5 단위/㎖ 의 활성이 나타났고, 배양 상청액에는 0.05단위/㎖의 활성이 나타났다. 그리고, 이 효소 활성은 25℃ 에서 측정하였다.

실험 2 : 효소 정제

실험 1 에서 얻은 배양액을 원심 분리하여 습중량 약 0.5 kg 의 균체를 회수한 다음 이것을 10 mM 인산염 완충액 (pH 7.0)에 현탁하였다. 이 균체 현탁액 약 5 ℓ을 " VIBROGEN ZELLMUHLE " (Edmund Buhler 사제의 균체 파쇄기) 로 처리하여 균체를 파쇄하고, 수득물을 15,000 rpm 에서 30 분간 원심 분리함으로써 약 4.5 ℓ 의 상청액을 얻었다. 이 상청액에 포화도 0.3 이 되도록 황산암모늄을 가하여 4℃에서 4 시간 방치한 후 원심 분리하여 상청액을 회수하였다.

더욱이, 이 상청액에 포화도 0.8 이 되도록 황산 암모늄을 가하고 4℃ 에서 하룻밤 방치한 후 원심 분리함으로써 황산 암모늄 염색물을 회수하였다.

수득한 황산 암모늄 염석물을 10 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 에 용해한 후 동일한 완충액에 대해 24 시간 투석하고 원심 분리하여 불용물을 제거하였다. 이 투석액 400 ㎖ 을 두 부분으로 나누어 " DEAE-TOYOPEARL " 300 ㎖ 을 사용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 처리를 하였다.

본 발명의 말토오스/트레할로오스 변환 효소는 " DEAE-TOYOPEARL " 에 흡착되어 식염을 함유한 동일한 완충액으로 칼럼으로 부터 용출되었다. 용출된 효소 활성 획분을 회수한 후 1 M 황산 암모늄을 함유한 동일한 완충액에 대해 투석하고, 이 투석액을 원심 분리하여 불용물을 제거한 다음, " BUTYL-TOYOPEARL 650 " 300 ㎖ 을 사용한 소수 칼럼 크로마토그래피를 하였다. 칼럼에 흡착된 말토오스/트레할로오스 변환 효소를 황산 암모늄 1 M 로 부터 0 M 까지 감소하는 선형 기울기로 칼럼으로 부터 용출시켜 효소 활성 획분을 회수하였다.

이어서, 이 획분을 " MONO Q HR5/5 " (스웨덴국의 Pharmacia 사제) 10㎖ 을 사용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 하여 효소 활성 획분을 회수하였다. 각각의 정제 단계에서의 효소 활성, 비활성 및 수율은 표 1 에 나와 있다.

표 1

정제된 효소에 대해 농도 7.5 % 의 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의한 순도를 검정한 결과, 단 하나의 단백질 밴드가 나타나서, 이로 부터 이것이 순도가 높은 단일의 것이었음을 확인하였다.

실험 3 : 효소의 성질

실험 2 의 방법으로 얻은 정제 말토오스/트레할로오스 변환 효소를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법 (겔 농도 : 10 w/v %) 으로 처리하고, 동일한 겔에 대해 영동 처리된 분자량 마아커 (marker) (일본국의 Japan Bio-Rad Laboratory 주식회사제) 와 비교하여 이 효소의 분자량을 측정한 결과 분자량 약 57,000~67,000 달톤이었다.

정제 말토오스/트레할로오스 변환 효소를 2 w/v % 앰폴라인 (스웨덴국 Pharmacia 사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법으로 처리한 후 단백질 밴드 및 겔의 pH 를 측정하여, 이 효소의 등전점을 구한 결과, 이 효소의 등전점 (pI) 은 약 4.1∼5.1 이었다.

이 효소의 활성에 미치는 온도와 pH 의 영향을 활성 측정 방법에 준하여 조사하였다. 그 결과는 제 1 도 (온도의 영향) 와 제 2 도 (pH 의 영향) 에 나와있다. 효소의 최적 온도는 pH 7.0에서 60분간 반응시켰을 때 20℃ 부근이었고, 최적 pH 는 25℃ 에서 60 분간 반응시켰을 때 약 7.0~8.0 이었다.

이 효소의 열적 안정성은 효소를 50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 중에서 각기 상이한 온도에서 60 분간 유지하여 물로 냉각한 후 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 그리고, pH 안정성은 이 효소를 각기 상이한 pH의 50 mM 인산 완충액 중에서 20℃ 에서 60 분간 유지한 후 pH 를 7.0 으로 조정하여 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과는 제 3 도 (열적 안정성) 와 제 4 도 (pH 안정성) 에 나와 있다. 이 효소의 열적 안정성은 30℃ 부근까지이고 pH 안정성은 약 6.0~9.0 이었다. 효소 활성은 1 mM Cu²⁺, Hg²⁺및 50 mM Tris-HCl 완충액에 의해 저해되었다.

실험 4 : 각종 당질에 대한 작용

각종 당질을 사용하여 기질로의 가능성에 대해 시험하였다. 글루코오스, 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스, 가용성 전분, 평균 중합도 18 의 아밀로오제, 트레할로오스, 네오트레할로오스, 겐티오비오스, 코지비오스, 이소말토오스, 셀로비오스, 말티톨, 수크로오스, 말툴로오스, 투라노오스, 팔라티노오스, 트레할룰로오스 또는 락토오스의 용액 및α-글루코오스 1-포스페이트 또는 β-글루코오스 1-포스페이트와 동일량의 글루코오스를 함유한 용액을 제조하였다.

각각의 용액에 실험 2 의 방법으로 제조한 정제 말토오스/트레할로오스 변환효소를 기질 고형물 1 g당 각각 2 단위씩 가하고 기질 농도를 5 w/v %가 되도록 조정하여, 이것을 20℃, pH 7.0 에서 24 시간 반응시켰다. 효소 반응 전후의 반응액을 " KIESELGEL 60 " (미합중국의 Merck 사제의 길이 20 cm 의 알루미늄판) 을 사용한 박층 크로마토그래피 (TLC) 처리하여 각각의 당질에 대한 효소 작용의 유무를 확인하였다. TLC 는 전개 용매로서 1-부탄올 : 피리딘 : 물 = 6 : 4 : 1 (체적비) 의 혼합 용매를 사용하고 실온에서 전개하였다. 발색은 20 % 황산-메탄올 용액을 분무한 다음 110℃에서 10 분간 가열함으로써 실시하였다. 그 결과는 표 2 에 나와 있다.

표 2

(주) - : 반응 전후에 변화 없음.

+ : 기질의 스포트가 상당히 감소하며 반응 생성물이 검출됨.

++ : 기질의 스포트가 실질적으로 감소하여 반응 생성물이 검출됨.

표 2 의 결과로 부터 명백한 바와 같이 본 발명의 효소는 시험에 사용된 여러가지 당질중에서 말토오스와 트레할로오스에만 작용하지만, 다른 당질, 특히 α-글루코오스 1-포스페이트와 글루코오스를 함유한 계와 β-글루코오스 1-포스페이트와 글루코오스를 함유한 계에 작용하지 않으므로, 이로 부터 이 효소는 종래 공지되어 있는 말토오스 포스포릴라아제와 트레할로오스 포스포릴 라아제와는 다른 신규의 효소인 것이 판명되었다.

실험 5 : 말토오스 또는 트레할로오스로 부터의 생성물

최종 농도 5 % 의 말토오스 수용액에 실험 2 의 방법으로 얻은 정제 말토오스/트레할로오스 변환 효소를 기질 고형물 1 g당 2 단위 가하고 20℃, pH 7.0 에서 24 시간 반응시켰다. 효소 반응액의 당조성을 가스 크로마토그래피 (GLC) 로 분석하였다. 효소 반응액의 일부를 건조하여 고화하고 피리딘에 용해한 후 트리메틸실릴화 한 것을 분석에 사용하였다. GLC 장치는 일본국의 주식회사 島律제작소제 " CG-16A " 이었고, 칼럼은 일본국의 GL Science 주식회사제 " 2 % SILICONE OV-17/CHROMOSORB W " 을 충전한 스테인레스강 칼럼 (직경 3 mm, 길이 2 m)을 사용하였으며, 캐리어 가스는 질소 가스를 유량 40 ㎖/분으로 하였고, 칼럼 오븐 온도는 160℃ 부터 320℃ 까지 7.5℃/분의 승온 속도로 하여 분석하였다. 검출은 수소염 이온 검출기를 사용하였다. 그 결과는 표 3 에 나와 있다.

표 3

(주) * : 트레할로오스의 유지 시간과 동일함.

표 3 의 결과로 부터 명백한 바와 같이 반응 생성물 X 가 다량으로 생성하여 그 유지 시간이 시판 트레할로오스의 것과 일치하고 있음이 판명되었다. 반응생성물 X를 확인하기 위해 다음의 확인 시험을 하였다. 즉, 위에 나온 말토오스를 기질로 하여 얻은 효소 반응 생성물중의 일부를 당농도 2 % 가 되도록 20 mM 아세트산 완충액 (pH 4.5) 으로 희석하고, 0.5 ㎖ 를 샘플링하여 글루코아밀라아제 (일본국의 生化學공업주식회사제) 를 0.1 단위 가하여 40℃ 에서 20 시간 반응시켰다.

그리고, 마찬가지로 효소 반응 생성물을 당농도 2 % 가 되도록 20 mM 인산완충액 (pH 7.0) 으로 희석하고, 0.5 ㎖ 를 샘플링하여 트레할라아제를 0.5 단위 가하고 40℃ 에서 20시간 반응시켰다. 말토오스를 기질로 하여 얻은 효소반응 생성물과 그 글루코아밀라아제 처리액 또는 트레할라아제 처리액을 GLC 로 분석하여 비교한 결과, 글루코아밀라아제 처리에 의해 말토오스는 완전히 글루코오스로 분해되었고 반응 생성물 X는 분해되지 않고 잔존해 있었다.

한편, 트레할라아제로 처리후에는 말토오스는 잔존해 있으나 반응 생성물 X는 완전히 글루코오스로 분해되었다. 글루코아밀라아제 및 트레할라아제의 반응특성을 고려하면 본 발명의 신규 효소에 의해 말토오스로 부터 생성된 올리고당은 트레할로오스이었음이 판명되었다.

더욱이, 트레할로오스를 기질로 하여 말토오스의 경우와 마찬가지 조건에서 정제 효소를 작용시켜 그 반응액을 마찬가지로 GLC 로 분석한 결과, 본 발명의 효소에 의해 트레할로오스로 부터 말토오스가 생성되었음이 판명되었다. 이상의 GLC 분석 결과는 표 4 에 나와 있다.

표 4

(주) A : 본 발명의 효소에 의한 반응 혼합물중의 당조성 (%),

B : 글루코아밀라아제 처리 후의 당조성 (%),

C : 트레할라아제로 처리 후의 당조성 (%).

표 4 의 결과로 부터 명백한 바와 같이 본 발명의 효소는 말토오스를 트레할로오스를 변환하고 트레할로오스를 말토오스로 변환한다. 그 평형점은 트레할로오스쪽으로 치우쳐 있으므로 말토오스로 부터의 트레할로오스로의 변환율이 높아 약 70 % 이상으로 되었음이 판명되었다.

실험 6 : 트레할로오스 생성에 미치는 말토오스 농도의 영향

말토오스를 2.5 %, 5 %, 10 %, 20 % 또는 40 % 로 하여, 여기에 온도 20℃ 및 pH 7.0 에서 실험 2 의 방법으로 얻은 정제 말토오스/트레할로오스 변합 효소를 말토오스 1 g 당 2 단위 가하고 반응시켜 반응도중 반응액을 경시적으로 채취하여 100℃ 에서 10분간 가열하여 효소를 실활시켰다.

이 반응액을 안트론-황산법으로 총 당 (total sugar) 의 양을 정량하고 소모기-넬슨법 (Somogyi-Nelson method) 으로 환원당의 양을 정량하여 총 당의 양에 대한 환원당 양의 비율을 환원력으로 해서 산출하였다.

그리고, 별도로 이 반응액들을 당 농도 1 % 가 되도록 각각 희석하여 소량 한외 여과기인 " MOL-CUT II LGC " (일본국의 Japan Millipore 사제)로 단백질을 제거한 다음 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 로 당조성을 분석하였다. HPLC 장치는 일본국의 Tosoh 사제의 " CCPP SYSTEM " 을 사용하였고, 분석 칼럼은 " YMC-PACK PA-03 " (일본국의 YMC 사제, 직경 4.6 mm, 길이 250 mm)를 사용하였으며 용리액은 아세토니트릴 : 물 = 78 :22 (체적비) 의 혼합액을 유속 1.2 ㎖/분으로 하여 주입하였고 검출은 시차 (示差) 굴절계로 하였다. 그 결과는 표 5 에 나와 있다.

표 5

표 5 의 결과로 부터 명백한 바와 같이 기질인 말토오스 농도에 관계없이 말토오스로 부터의 트레할로오스로의 변환 반응은 용이하게 진행하여 약 80 % 의 변화율을 나타내고 있다.

실험 7 : 트레할로오스 생성에 미치는 온도의 영향

농도 20 % 의 말토오스 용액 각각을 pH 7.0 으로 조정하고 여기에 실험 2 의 방법으로 제조한 정제 말토오스/트레할로오스 변환 효소를 말토오스 1 g 당 2 단위 가하여 5℃, 10℃, 15℃, 20℃ 또는 25℃에서 반응시키고, 반응도중 반용액을 경시적으로 샘플링하여 100℃ 에서 10분간 가열하여 효소를 실활시켰다. 이 요소 반응액을 실험 6 과 마찬가지로 하여 HPLC 로 당조성을 분석하였다. 각각의 반응 온도와 반응 시간에서의 트레할로오스 함량은 표 6 에 나와 있다.

표 6

표 6의 결과로 부터 명백한 바와 같이 반응 온도가 높을수록 트레할로오스 생성 속도는 커지는 경향이 있었으나 5℃ 에서도 말토오스로 부터 트레할로오스의 변환 반응은 잘 진행하여 약 82 % 의 변환율을 나타내었다.

실험 8 : 말토오스로 부터 트레할로오스의 제조

말토오스 (일본국의 주식회사 林原생물화학 연구소제) 10 중량부를 물 40 중량부에 용해하고,온도 15℃, pH 7.0 에서 실험 2의 방법으로 얻은 정제 말토오스/트레할로오스 변환 효소를 말토오스 1 g 당 2 단위가하고 48 시간 반응시킨 다음 100℃ 에서 10 분간 가열하여 효소를 실활시켰다. 수득한 용액에는 트레할로오스를 건조 고형물당 약 74 % 함유하고 있었다. 이 용액을 활성탄으로 탈색하고 이온 교환 수지 (H 형 및 OH 형) 로 탈염해서 정제한 다음 농도 약 78 % 로 농축하여 트레할로오스 함수 결정을 씨 결정으로하여 고형물당 0.1 % 첨가하고 실온에서 하룻밤 방치하여 결정을 석출하였다. 수득한 매스키트를 분리하고 결정에 소량의 물을 분무하여 결정을 세척함으로써 순도 99.8 % 의 극히 고순도의 트레할로오스 함수 결정을 약 3.0 중량부 얻었다.

실험 9 : 효소 제조

글루코오스 2.0 w/v %, 황산 암모늄 1.0 w/v %, 인산 수소 2 칼륨 0.1 w/v %, 인산 2 수소 나트륨 0.06 w/v %, 황산 마그네슘 0.05 w/v %, 탄산 칼슘 0.3 w/v % 및 물로 된 액체 배지를 100 ㎖ 씩을 취하여 500 ㎖ 용량의 삼각 플라스크에 넣고 115℃ 에서 30분간 오토클레이브 하여 멸균하고 냉각하여 슈우도모나스 푸티다 H262 (FERM BP-4579) 을 접종하고, 27℃, 200 r.p.m. 에서 24 시간 회전 진탕 배양하여 종배양액을 얻었다.

용량 30 ℓ의 퍼어멘터에 위의 종배양의 경우와 동일한 조성의 액체 배지 약 20 ℓ넣고 가열 멸균하여 27℃ 로 냉각한 후 종배양액 1 v/v % 을 접종하고 27℃, pH 6.5~8.0 으로 유지하면서 약 20 시간 통기 교반 배양하였다.

배양액의 말토오스/트레할로오스 변환 효소의 활성은 약 0.12 단위/㎖ 이었다. 배양액의 일부를 취하고 원심 분리하여 균체와 배양 상청액으로 분리하고, 다시 균체를 50 mM 인산염 완충액 (pH 7.0) 에 현탁하여 원래의 배양액과 동일한 액량으로 한 후 균체 현탁액과 배양 상청액의 말토오스/트레할로오스 변환 효소활성을 측정한 결과, 균체 현탁액에는 0.11 단위/㎖ 의 활성이 나타났고, 배양 상청액에는 0.01 단위/㎖ 의 활성이 나타났다. 그리고, 이 효소의 활성은 35℃에서 측정하였다.

실험 10 : 효소 정제

실험 9 에서 얻은 배양액을 원심 분리하여 습중량 약 0.45 kg 의 균체를 회수하고 이것을 10 mM 인산 완충액 (pH 7.0)에 현탁하였다. 이 균체 현탁액 약 2 ℓ 을 초고압 균체 파쇄 장치 (일본국 大日本제약 주식회사제 판매의 " MINI LABO ") 로 처리하여 균체를 파쇄하고, 이 파쇄 처리액을 원심 분리 (15,000 rpm, 30 분)함으로써 약 1.7 ℓ의 상청액을 얻었다. 이 상청액에 포화도 0.7 이 되도록 황산 암모늄을 가하고 4℃ 에서 하룻밤 방치한 후 원심 분리함으로써 황산 암모늄 염석물을 회수하였다. 수득한 황산 암모늄 염석물을 10 mM 인산완충액 (pH 7.0) 에 용해한 후 동일한 완충액에 대해 24 시간 투석하여 원심 분리함으로써 불용물을 제거하였다. 이 투석액 (약 400 ㎖) 을 두 부분으로 나누어 " DEAE-TOYOPEARL " 300 ㎖ 을 사용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 처리하였다.

본 발명의 말토오스/트레할로오스 변환 효소는 " DEAE-TOYOPEARL " 에 흡착되어 염화 나트륨을 함유한 동일한 완충액으로 칼럼으로 부터 용출되었다. 용출된 효소 활성 획분을 회수한 후 동일한 완충액에 대하여 투석하고, 다시 " DEAE-TOYOPEARL " 80 ㎖ 을 사용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 처리를 하였다. 칼럼에 흡착된 말토오스/트레할로오스 변환 효소를 염화 나트륨 0.1 M 로 부터 0.3 M 로 증가하는 선형 기울기로 칼럼으로 부터 용출시켜 효소 활성 획분을 회수하였다.

이어서, 이 획분을 " TOYOPEARL HW-55S " (일본국의 Tosoh 사제) 400 ㎖ 을 사용한 겔 여과 크로마토그래피를 하여 용출된 효소 활성 획분을 회수하였다. 각각의 공정 단계에서의 효소 활성, 비활성 및 수율은 표 7 에 나와 있다.

표 7

정제 효소 제품의 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 (겔 농도 : 7.5 w/v %) 에 의한 순도 검정 결과 단백질 밴드는 단 하나로서 고순도 균질의 표품이었다.

실험 11 : 효소의 성질

실험 10 의 방법으로 얻은 정제 말토오스/트레할로오스 변환 효소를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법 (겔 농도 : 7.5 w/v %) 으로 처리하여 동시에 영동처리된 분자량 마아커 (일본국의 Japan Bio-Rad Laboratory 제) 와 비교하여 이 효소의 분자량을 측정한 결과 분자량 약 110,000~120,000 달톤이었다.

정제 말토오스/트레할로오스 변환 효소를 2 v/v % 앰폴라인 (스웨덴국의Pharmacia LKB Biotechnology AB 사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법으로 처리한 후, 단백질 밴드와 겔의 pH 를 측정하여 이 효소의 등전점을 구한 결과, 등전점은 pI 약 4.1∼5.1 이었다.

이 효소 활성에 미치는 온도와 pH 의 영향을 활성 측정 방법에 준하여 조사하였다. 그 결과는 제 5 도 (온도의 영향) 와 제 6 도 (pH 의 영향) 에 각각 나와 있다. 효소의 최적 온도는 pH 7.0 에서 60 분간 반응시켰을 때 37℃ 부근이었고, 최적 pH 는 35 ℃ 에서 60 분간 반응시켰을 때 약 7.3~8.3 이었다. 이 효소의 열적 안정성은 효소 용액 (50 mM 인산 완충액, pH 7.0) 을 각기 상이한 온도에서 60 분간 유지하여 물로 냉각한 후 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 그리고, pH 안정성은 이 효소를 각각의 pH 의 50mM 인산 완충액 중에서 35℃ 에서 60 분간 유지한 후 pH 를 7.0 으로 조정하여 잔존 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과는 제 7 도 (열적 안정성) 와 제 8 도 (pH 안정성) 에 나와 있다. 이 효소의 열적 안정성은 40℃ 부근까지인 반면 pH 안정성은 약 6.0~9.5이었다. 이 효소의 활성은 1 mM Cu²⁺또는 Hg²⁺및 50 mM Tris-HCl 완충액에 의해 저해되었다.

실험 12 : 각종 당질에 대한 작용

반응 온도를 35℃ 로 한 이외에는 실험 4 의 방법에 준하여 실험 10 에서 얻은 슈우도모나스 푸티다 H262 의 정제 효소를 각종 당질에 작용시켜 기질로서의 가능성 실험을 하였다. 그 결과, 슈우도모나스 푸티다 H262 의 효소는 피멜로박터 sp. R48 의 효소와 마찬가지로 말토오스와 트레할로오스에만 작용하여 말토오스를트레할로오스로 변환하고, 트레할로오스를 말토오스로 변환하였다. 그 평형점은 트레할로오스쪽으로 치우쳐 있었으므로 말토오스로 부터 트레할로오스로의 변환율이 높아 약 70 % 가 된다는 것이 판명되었다.

실험 13 : 트레할로오스 생성에 미치는 말토오스 농도의 영향

말토오스를 5 %, 10 %, 20 % 또는 30 %로 하고 여기에 실험 10의 방법으로 얻은 정제 말토오스/트레할로오스 변환 효소를 말토오스 1 g 당 2 단위 가하여 35℃ 및 pH 7.0 에서 반응시켜 경시적으로 반응액을 채취하여 100℃ 에서 10 분간 가열하여 효소를 실활시켰다. 이 반응액을 사용하여 실험 6 과 마찬가지로 환원력과 당조성을 조성하였다. 그 결과는 표 8 에 나와 있다.

표 8

표 8 (계속)

표 8 의 결과로 부터 명백한 바와 같이 기질인 말토오스 농도에 관계 없이 말토오스로 부터 트레할로오스로 변환이 쉽사리 진행하여 트레할로오스를 약 70 % 생성하였다.

실험 14 : 말토오스로 부터 트레할로오스 제조

말토오스 (일본국의 주식회사 林原생물화학 연구소 판매) 10 중량부를 물 40 중량부에 용해하고 온도를 35℃ 및 pH 7.0 으로 하여 실험 10 의 방법으로 얻은 정제 말토오스/트레할로오스 변환 효소를 말토오스 고형물 1 g 당 2 단위 가하고 반응시킨 다음 100℃ 에서 10 분간 가열하여 효소를 실활시켰다. 수득한 용액에는 트레할로오스를 고형물당 약 69 % 함유하고 있었다. 이 용액을 활성탄으로 탈색하고 이온 교환 수지 (H 형 및 OH 형) 로 탈염하여 정제한 후 농도 약 78 % 로 농축한 다음 여기에 트레할로오스 함수 결정을 씨 결정으로 하여 고형물당 0.1 % 첨가하고 실온에서 하룻밤 방치하여 결정을 석출하였다. 수득한 매스키트를 분리하고 결정에 소량의 물을 분무하여 결정을 세척함으로써 순도 99.7 % 의 극히 고순도의 함수 결정 트레할로오스를 약 2.3 중량부 얻었다.

실험 15 : 효소의 제조

폴리펩톤 0.5 w/v %, 효모 엑스 0.1 w/v %, 질산 암모늄 0.07 w/v %, 인산 수소 2 나트륨 0.01 w/v %, 황산 마그네슘 0.02 w/v % 및 물로 된 액체 배지를 pH 7.5 로 조정한 후 100 ㎖ 씩을 취하여 용량 500 ㎖ 의 플라스크에 각각 나누어 넣고 120℃ 에서 20 분간 오토클레이브 하여 멸균하고 냉각한 후 더어무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33293)를 접종하고, 60℃, 200 r.p.m.에서 24시간 회전 진탕 배양하여 종배양액을 얻었다.

용량 30 ℓ의 퍼어멘터 2 개에 종배양의 경우와 동일한 조성의 액체 배지를 각각 약 20ℓ넣고 가열 멸균하여 냉각하고 온도 60℃ 로 한 후 종배양액 1 v/v % 을 접종하고 60℃, pH 6.5~8.0 으로 유지하면서 약 24 시간 통기 교반배양하였다.

배양액중의 말토오스/트레할로오스 변환 효소의 활성은 약 0.35 단위/㎖이었다. 배양액의 일부를 취하고 원심 분리하여 균체와 배양 상청액으로 분리하고, 다시 균체를 50 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 에 현탁하여 원래의 배양액과 동일한 액량으로 한 후, 균체 현탁액과 배양 상청액의 말토오스/트레할로오스 변환 효소 활성을 측정한 결과, 균체 현탁액에는 약 0.33 단위/㎖의 효소 활성이 나타났고, 배양상청액에는 약 0.02 단위/㎖ 의 효소 활성이 나타났다. 그리고, 이 효소 활성을 60℃ 에서 측정하였다.

실험 16 : 효소 정제

실험 15 의 방법으로 얻은 배양액을 원심 분리하여 습중량 약 0.28 kg 의 균체를 회수하고, 이것을 10 mM 인산 완충액 (pH 7.0) 에 현탁하였다. 이 균체 현탁액 약 1.9 ℓ을 초음파 파쇄기 (일본국 주식회사 日本精機제작소제 " MDEL US300 ") 로 처리하여 균체를 파쇄하였다. 이 파쇄 처리액을 15,000 rpm에서 30분간 원심 분리하여 약 1.8 ℓ의 상청액을 얻었다. 이 상청액에 포화도 0.7 이 되도록 황산 암모늄을 가하고 4℃ 에서 하룻밤 방치한 후 원심 분리하여 황산암모늄 염석물을 회수하였다.

수득한 황산 암모늄 염색물을 10 mM 인산 완충액 (pH 7.0)에 용해한 후 동일한 완충액에 대해 24 시간 투석하고 원심 분리하여 불용물을 제거하였다. 이 투석액 약 1,560 ㎖ 을 세 부분으로 나누어 " DEAE-TOYOPEARL 650 " 530 ㎖ 을 사용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 하였다.

" DEAE-TOYOPEARL " 에 흡착된 본 발명의 말토오스/트레할로오스 변환 효소를 염화 나트륨을 함유한 동일한 완충액으로 칼럼으로 부터 용출시켰다. 용출된 효소 활성 획분을 회수한 후, 1 M 황산 암모늄을 함유한 동일한 완충액에 대하여 투석한 다음 " BUTYL TOYOPEARL 650 " 380 ㎖ 을 사용한 소수 칼럼 크로마토그래피를 하였다. 흡착된 말토오스/트레할로오스 변환 효소를 황산 암모늄 1 M 으로 부터 0M 까지 감소하는 선형 기울기로 칼럼에서 용출시켜 효소 활성 획분을 회수하였다.

이어서, " TOYOPEARL HW-55S " 380 ㎖ 을 사용한 겔 여과 칼럼 크로마토그래피를 하여 용출된 효소 활성 획분을 회수하였다.

계속하여 " MONO Q HR5/5 " (스웨덴국의 Pharmacia LKB 사제) 1.0 ㎖ 를 사용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 하고, 염화 나트륨 0.1 M로 부터 0.35 M로 증가하는 선형 기울기로 용출시킨 효소 활성 획분을 회수하였다. 정제 공정의 각 단계에서의 효소 활성, 비활성 및 수율은 표 9 에 나와 있다.

.표 9.

정제 효소를 겔 농도 5 w/v % 의 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법으로 처리하여 순도를 검정한 결과 단백질 밴드는 단 하나가 나타나서 단일의 고순도 제품이었다.

실험 17 : 효소의 성질

실험 16 의 방법으로 얻은 말토오스/트레할로오스 변환 효소를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법 (겔 농도 : 7.5 w/v %) 으로 처리하고, 동일한 겔에 대해영동처리된 분자량 마아커 (일본국의 Jopan Bio-Red Laboratories 사판매) 와 비교하여 분자량을 측정한 결과, 분자량 100,000∼110,000 달톤이었다.

정제 말토오스/트레할로오스 변환 효소를 2 w/v % 앰폴라인 (스웨덴국의 Pharmacia LKB 사제) 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법으로 처리한 후, 단백질 밴드와 겔의 pH 를 측정하여 이 효소의 등전점을 구한 결과 등전점은 PI 약 3.8∼4.8 이었다.

이 효소 활성에 미치는 온도와 pH 의 영향을 활성 측정 방법에 준하여 조사하였다. 그 결과는 제 9 도 (온도의 영향) 와 제 10 도 (pH 의 영향) 에 나와있다. 효소의 최적 온도는 pH 7.0에서 60 분간 반응시켰을 때 65℃ 부근이었고 최적 pH 는 60℃ 에서 60 분간 반응시켰을 때 약 6.0∼6.7 이었다.

이 효소의 열적 안정성은 효소 용액 (50 mM 인산 완충액을 함유, pH 7.0) 을 각 온도에서 60 분간 유지하고 물로 냉각한 후 잔존 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 그리고, pH 안정성은 이 효소를 각각의 pH 의 50 mM 인산 완충액중에서 60℃에서 60 분간 유지한 후 pH 를 7.0 으로 조정하고 잔존 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과는 제 11 도 (열적 안정성) 와 제 12 도 (pH 안정성) 에 나와 있다. 이 효소의 열적 안정성은 80℃ 부근까지 이었고 pH 안정성은 약 5.5∼9.5 이었다. 그리고, 이 효소의 활성은 1 mM Cu²⁺또는 Hg²⁺및 50 mM TriS-HCl 완충액에 의해 저해되었다.

실험 18 : 각종 당질에 대한 작용

반응 온도를 50℃ 로 한 것 이외에는 실험 4 의 방법에 준하여 실험 16 에서 얻은 더어무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 의 정제 효소를 각종 당질에 작용시켜 기질로서의 가능성을 실험하였다. 그 결과, 더어무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 의 효소는 피멜로박터 sp. R48 의 효소 혹은 슈우도모나스가 푸티다 H262 의 효소와 마찬가지로 말토오스와 트레할로오스에만 작용하여 말토오스를 트레할로오스로 변환하고, 트레할로오스를 말토오스로 변환하였다. 그 평형점은 트레할로오스쪽으로 치우쳐 있어서 말토오스로 부터 트레할로오스로의 변환율이 높아 70 % 이상으로 됨이 판명되었다.

실험 19 : 트레할로오스 생성에 미치는 말토오스 농도의 영향

농도가 각각 2.5 %, 5 %, 10 %, 20 % 또는 40 % 인 말토오스 용액에 실험 16 의 방법으로 얻은 정제 말토오스/트레할로오스 변환 효소를 말토오스 고형물 1 g당 2단위 가하고 60℃, pH 6.5 에서 반응시키고, 72 시간 경과후 반응액을 취하여 100℃ 에서 30 분간 가열하여 효소를 실활시켰다. 이 반응액을 사용하여 실험 6 과 마찬가지로 환원력과 당조성을 측정하였다. 그 결과는 표 10 에 나와 있다.

표 10

표 10 의 결과로 부터 명백한 바와 같이 기질인 말토오스 농도에 관계 없이 말토오스로 부터 트레할로오스로 변환이 쉽사리 진행하여 변환율은 약 70 % 이었다.

실험 20 : 트레할로오스 생성에 미치는 온도의 영향

농도가 각각 20 % 인 말토오스 용액을 pH 6.5 로 조정하고 여기에 실험 16 의 방법으로 얻은 더어무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 의 정제 말토오스/트레할로오스 변환 효소를 말토오스 고형물 1 g 당 2.5 단위 가하고 40℃, 50℃, 60℃ 또는 70℃ 에서 반응시켜 반응도중 반응액을 주기적으로 채취하여 100℃ 에서 30 분간 가열하여 효소를 실활시켰다. 이 반응액을 실험 6 과 마찬가지로 HPLC 로 당조성을 분석하였다. 각각의 반응 온도와 반응 시간에서의 트레할로오스 함량을 표 11 에 나타내었다.

표 11

표 11 의 결과로 부터 명백한 바와 같이 말토오스로 부터 트레할로오스의 변환율은 반응 온도가 낮을수록 높고, 40℃ 에서 트레할로오스의 변환율은 약 80 % 이었다.

실험 21 : 기타의 미생물로 부터 말토오스/트레할로오스 변환효소의 생산과 그 성질

공지의 미생물중에서 본 발명의 말토오스/트레할로오스 변환 효소 산생능이 확인된 특정의 미생물을 실험 15 의 방법에 준하여 플라스크에서 48 시간 배양하였다. 배양액의 효소활성을 조사한 후 실험 16 의 방법에 준하여 배양액을 균체 파쇄하고, 그 상청액을 투석하여 부분 정제 효소를 얻은 다음, 실험 17 의 방법에 준하여 그 성질을 조사하였다. 그 결과는 표 12 에 나와 있다.

표 12

더어무스속에 속하는 공지의 미생물 유래의 부분 정제 효소를 사용하여 실험 18 의 방법에 따라 각종 당질에 대한 작용을 시험한 결과, 더어무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 유래의 효소와 마찬가지로 이들은 말토오스와 트레할로오스에만 작용하여 말토오스로 부터 트레할로오스를 생성하고, 트레할로오스로 부터 말토오스를 생성함이 판명되었다. 그리고, 더어무스 루버 (Thermus ruber : ATCC 35948) 유래의 말토오스/트레할로오스 변환 효소는 더어무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 유래의 효소에 비해 그 최적 온도와 열적 안정성은 낮았으나 다른 더어무스 속의 효소는 더어무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 의 효소와 거의 동일한 성질을 나타내고 내열성이 높은 것임이 판명되었다.

실험 22 : 제조된 트레할로오스의 물리화학적 성질

실험 8 의 방법으로 제조한 고순도 트레할로오스를 사용하여 물리화학적 성질을 시험하였다. 융점 97.0℃, 비선광도+ 199°(C=5), 융해열 57.8 KJ/mole, 용해도는 25℃ 의 물에 대해 무수물로서 77.0 g이었다. 이들 물성치는 동시에 측정한 시판 트레할로오스 함수 결정 (일본국의 和光純藥공업주식회사제) 의 값과 잘 일치하였다.

실험 23 : 생체내에서의 이용 시험

Atsuji 등이 문헌 [Rinsho Eiyo (Clinical Nutrition), Vol.41, No.2, pp.200~208 (1972)] 에 보고한 방법에 준하여 실험 8 에서 제조한 고순도 트레할로오스 (순도99.8 %) 30 g 을 20 w/v % 수용액으로 제조하여 26세, 27세, 30세의 건강한 남자 3 명에게 경구 투여한 후 혈액을 주기적으로 채취하여 혈당치와 인슐린치를 측정하였다. 대조로서 글루코오스를 사용하였다. 그 결과, 트레할로오스는 글루코오스의 경우와 마찬가지의 거동을 나타내어 혈당치, 인슐린치 모두 투여후 약 0.5~1 시간에서 최대치를 나타내었다. 트레할로오스는 용이하게 소화 흡수 대사 이용되어 에너지원으로 되는 것이 판명되었다. 따라서, 본 발명의 방법으로 제조되는 트레할로오스 및 이것을 함유한 당질은 에너지 보급용 당원으로서 적합하다.

실험 24 : 급성 독성 시험

실시예 A-6 에서 제조한 고순도 트레할로오스를 마우스에 경구 투여하여 급성 특성 시험을 하였다. 그 결과, 트레할로오스는 저독성의 물질로서 투여 가능한 최대 투여량에서도 사망예는 보이지 않았다. 따라서, 그 LD₅₀은 약 50 g/kg 이상이었다.

실험 25 : 배양에 의한 트레할로오스 생성에 미치는 말토오스 농도의 영향

말토오스/트레할로오스 변환 효소 산생능을 가진 미생물을 말토오스를 2~20 w/v % 첨가한 영양 배지에서 배양하여 배양물중의 트레할로오스 수득량에 미치는 말토오스 농도의 영향을 조사하였다. 즉, 피멜로박터 sp. R48 (FERM BP-4315) 의 경우에 있어서 글루코오스 2.0 w/v % 대신에 별도로 멸균된 말토오스를 2∼20 w/v % 첨가한 영양 배지로 한 것 외에는 실험 1 과 마찬가지로 하여 퍼어멘터에서 27℃ 에서 72시간 배양하고, 다시 여기에 " TWEEN 40 " (일본국의 和光純藥공업주식회사 판매의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 팔미데이트 함유의 계면 활성제) 을 0.1 v/v % 가하고 24 시간 배양하였다. 그리고, 더어무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 의 경우에는 영양 배지를 별도로 멸균된 말토오스를 2∼20 w/v % 함유시킨 배지로 한 것 외에는 실험 15 와 마찬가지로 퍼어멘터에서 60℃ 에서 24 시간 배양하고, " TWEEN 40 " 을 0.1 v/v % 가하여 24 시간 배양하였다. 배양물을 원심 분리하여 상청액에 함유되는 트레할로오스 함량 (mg/㎖) 를 HPLC 로 측정하였다. 그 결과는 표 13 에 나와 있다.

표 13

표 13 의 결과로 부터 명백한 바와 같이 영양 배지중의 말토오스가 농도 20 w/v % 이하, 바람직하게는 15 w/v % 이하, 더욱 바람직하게는 5~10 w/v % 에서 트레할로오스 수득량이 증가되므로 트레할로오스 생산에 적합함이 판명되었다.

본 발명의 말토오스/트레할로오스 변환 효소를 사용하여 트레할로오스 또는 이 트레할로오스를 함유하는 당질의 제조 방법을 실시예 A 에서 설명하고, 트레할로오스 또는 이 트레할로오스를 함유하는 당질을 함유시킨 조성물을 실시예 B에서 설명한다.

실시예 A-1

농도 약 10 % 의 감자 전분 현탁액 (pH 5.5) 에 " SPITASE HS " (일본국의 Nagase 생화학공업 주식회사의 α-아밀라아제) 를 전분 1 g 당 2 단위 가하고 교반하에 가열하여 호화 (糊化), 액화한 즉시 120℃ 에서 20 분간 오토클레이브한 다음 온도 50℃, pH 5.0 으로 조정하였다. 여기에 β-아밀라아제 (일본국의 Nagase 생화학공업 주식회사제)를 전분 1 g당 20 단위와 이소아밀라아제 (주식회사 林原생물화학 연구소제) 를 전분 1 g 당 500 단위의 비율로 가하고 24 시간 반응시킨 다음 95℃ 로 가열하여 효소를 실활시키고 여과, 탈색하여 말토오스 함량 약 92 % 의 당액을 얻었다. 당원으로서 글루코오스 2.0 w/v % 대신에 위에 나온 당액을 별도로 멸균하여 고형물 1 g 당 10 w/v % 사용한 이외는 실험 1 의 방법에 준하여 제조한 영양 배지를 퍼어멘터에 취하고, 여기에 말토오스/트레할로오스 변환 효소 산생능을 가진 피멜로박터 sp. R48 (FERM BP-4315) 의 종배양액을 1 v/v % 접종하고 실험 1 과 마찬가지로 27℃ 에서 72 시간 통기 교반 배양한 다음, " TRITON X-100 " (일본국의 和光純藥공업 주식회사 판매, 알킬페놀 폴리옥시에틸렌 에테르 함유의 계면 활성제) 을 0.2 v/v % 가하고 24시간 배양하였다. 이 배양물을 여과하여 불용물을 제거하고, 수득되는 여액을 95℃ 로 가열하여 효소를 실활시킨 후 농축하여 통상의 방법에 따라 활성탄으로 탈색, 여과하고 H 형 및 OH 형 이온 교환 수지로 탈염하여 정제한 후 다시 농축하여 농도 약 70 % 의 시럽을 고형물당 약 65 % 의 수율로 얻었다. 이 제품은 고형물당 트레할로오스를 약 44 % 함유하고 있고 온화한 감미, 적당한 점도, 보습성을 가지므로 감미료, 정미 개량제, 안정제, 부형제 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 A-2

실시예 A-1 의 방법으로 제조한 배양물의 여액에 고형물 1 g 당 10단위의 "GLUCOZYME " (일본국의 Nagase 생화학공업 주식회사제의 글루코아밀라아제) 를 pH 5.0 및 50℃ 에서 24 시간 작용시킨 다음 가열하여 효소를 실활시키고, 탈색, 탈염 정제하여 수득되는 당액을 원당액으로 하여 트레할로오스 함량을 높이기 위해 나트륨형 강산성 양이온 교환 수지인 " XT-1016 " (일본국의 東京유기화학공업 주식회사제, 가교도 4 %) 을 사용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 하였다. 수지를 내경 5.4 cm의 자켓부 스테인레스제 칼럼 4개에 충전하고 직렬로 연결하여 수지층 전체 길이를 20 m 로 하였다. 칼럼내 온도를 60℃ 로 유지하면서 당액을 수지에 대해 5 v/v % 가하고, 여기에 60℃ 의 온수를 SV 0.15 로 흘려 분획하여 글루코오스를 제거한 다음 트레할로오스 소함유 획분을 회수하였다. 이 획분을 다시 정제, 농축하고 진공 건조하여 분쇄함으로써 트레할로오스 고함유 분말을 고형물당 약 35 % 의 수율로 얻었다. 이 제품은 트레할로오스를 약 97 % 함유하고 있고 극히 낮은 환원성, 온화한 상품의 감미를 가지므로 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 A-3

실시예 A-2 의 방법으로 제조한 트레할로오스 고함유 획분을 통상의 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고 이온 교환 수지로 탈염하여 정제한 용액을 농도 약 70 % 로 농축한 후 결정화기에 넣고 씨 결정으로서 트레할로오스 함수 결정 약 2 % 을 가하고 서냉하여 결정화도 약 45 % 의 매스키트를 얻었다. 이 매스키트를 건조탑위의 노즐로 부터 150 kg/㎠의 고압으로 분무하였다. 이와 동시에 85℃ 의 열풍을 건조탑 상부에서 송풍하고 저부에 설치된 이종금망 컨베이어위에 포집하여 컨베이어 아래에서 45℃ 의 온풍을 보내면서 금망 컨베이어위에 포집한 결정 분말을 건조탑 밖으로 서서히 이동시켜 배출하였다. 이 배출된 결정 분말을 숙성탑에 충전하고 온풍을 보내면서 10 시간 숙성시켜 결정화와 건조를 완료하여 트레할로오스 함수 결정 분말을 원료인 트레할로오스 고함유 당액에 대해 고형물당 약 90 % 의 수율로 얻었다. 이 제품은 실질적으로 흡습성을 나타내지 않고 취급이 용이하여 감미료, 정미 개량제, 안정제 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 A-4

실시예 A-2 의 방법으로 얻은 트레할로오스 고함유 획분을 실시예 A-3 과 마찬가지로 정제한 다음 증발 가마에 넣고 감압하에 끓여 수분 함량 약 3.0 % 의 시럽으로 하였다. 이어서, 결정화기로 옮겨 여기에 씨 결정으로서 무수 결정 트레할로오스를 시럽 고형물당 1 % 가하고 120℃ 에서 교반하면서 결정화한 다음 알루미늄제 바트에 넣고 100℃ 에서 6시간 결정화 및 속성시켜 블록을 제조하였다. 이어서, 이 블록을 절삭기로 분쇄하고 유동 건조하여 수분 함량 약 0.3 % 의 무수 결정 트레할로오스를 원료인 트레할로오스 고함유 당액에 대해 고형물당 약 85 % 의 수율로 얻었다. 이 제품은 식품, 화장품, 의약품, 그 원재료, 또는 가공 중간물 등의 함수물의 탈수제로서 뿐만 아니라 상품의 감미를 가진 백색 분말 감미료로서도 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 A-5

농도 33 %의 옥수수 전분 현탁액에 탄산 칼슘을 0.1 % 가한 후 pH 6.5로 조정하고 여기에 α-아밀라아제 (덴마크국의 Novo Industri AS 제, " TERMAMYL 60L ") 를 전분 1 g 당 0.2 % 가하고 95℃ 에서 15 분간 반응시켰다. 이 반응액을 120℃ 에서 30분간 오토클레이브한 후 55℃ 로 냉각하고, 여기에 이소아밀라아제 (일본국의 주식회사 林原생물화학 연구소제) 를 전분 1 g 당 500 단위와 β-아밀라아제 (일본국의 Nagase 생화학공업 주식회사제) 를 전분 1 g 당 30 단위 가하고 48 시간 반응시킨 다음 95℃ 로 가열하여 효소를 실활시키고 여과, 탈색하여 말토오스 함량 약 84 % 의 당액을 얻었다. 당원으로서 위에 나온 당액을 별도로 멸균하여 고형물당 10 w/v % 를 추가한 이외는 실험 9 의 방법에 준하여 제조한 영양 배지를 퍼어멘터에 넣고 여기에 말토오스/트레할로오스 변환 효소 산생능을 가진 슈우도모나스 푸티다 H262 (FERM BP-4579) 의 종배양물을 1 v/v % 접종하고 실험 9 와 마찬가지로 27℃ 에서 48 시간 통기교반배양하고, 계면 활성제 " TWEEN 40 "을 0.2 v/v % 가하고 24시간 배양을 계속하였다. 이 배양물을 여과하여 불용물을 제거하고 수득되는 여액을 95℃ 로 가열하여 효소를 실활시킨 후 농축하고 통상의 방법에 따라 활성탄으로 탈색, 여과하고 H 형 및 OH 형 이온 교환 수지로 탈염하여 정제한 다음 다시 농축하여 농도 약 70 % 의 시럽을 고형물당 약 50%의 수율로 얻었다. 이 제품은 고형물당 트레할로오스를 약 64 % 함유하고 있고 저환원성,

온화한 감미, 적당한 점도, 보습성을 가지며 각종 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 A-6

실시예 A-5 의 방법으로 얻은 시럽을 농도 약 80 % 로 농축하여 결정화기에 넣고 씨 결정으로서 트레할로오스 함수 결정 분말 약 1 % 을 가하고 교반하면서 서서히 냉각하여 결정화하였다. 이어서, 수득한 매스키트중의 결정을 바스켓형 원심 분리기에서 분리하고 결정을 소량의 물로 분무하여 세척하여 고순도 트레할로오스 함수 결정을 고형물당 약 20 % 의 수율로 얻었다. 이 제품은 실험 22 와 마찬가지의 이화학적 성질을 나타내어 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다. 더욱이, 공업 시약, 화학 원료 등에도 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 A-7

농도 10 %의 옥수수 전분 현탁액 (pH 5.5)에 시판품 α-아밀라아제인 " SPITASE HS " 를 전분 1 g 당 2 단위 가하고 교반하에 가열 호화, 액화시킨 즉시 120℃ 에서 20분간 오토클레이브한 후 55℃ 및 pH 5.0으로 조정하였다. 여기에, 이소아밀라아제 (일본국의 주식회사 林原생물화학 연구소제) 를 전분 1 g 당 300 단위 및 β-아밀라아제 (일본국의 Nagase 생화학공업 주식회사제)를 전분 1 g 당 20 단위의 비율이 되도록 가하여 24 시간 반응시킨 다음 95℃ 로 가열하여 효소를 실활시키고 탈색, 여과하여 말토오스 함량 약 92 % 의 당액을 얻었다. 당원으로서 위에 나온 당액을 별도로 멸균하여 고형물당 10 w/v % 추가한 이외는 실험 15 의 방법에 준하여 제조한 영양배지를 퍼어멘터에 넣고 여기에 말토오스/트레할로오스 변환 효소 산생능을 가진 더어무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 의 종배양물을 1 v/v % 접종하고 실험 15 와 마찬가지로 60℃ 에서 40 시간 통기 교반 배양한 후 계면활성제 " TRITON X-100 "을 0.1 v/v %와 배양액 1 ℓ 당 난백 리소자임 50 mg을 가하고 16 시간 배양을 계속하였다. 이 배양율을 여과하여 불용물을 제거하고 수득되는 여액을 95℃ 로 가열하여 효소를 실활시킨 후 농축하고 통상의 방법에 따라 활성탄으로 탈색, 여과하여 H 형 및 OH 형 이온 교환 수지로 탈염하고 정제한 다음 다시 농축하여 농도 약 70 % 의 시럽을 고형물당 약 55 % 의 수율로 얻었다. 이 제품은 고형물당 트레할로오스를 약 68 % 함유하고 있고 온화한 감미, 적당한 점도, 보습성을 가지므로 감미료, 정미 개량제, 안정제, 부형제 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 A-8

실시예 A-7 의 방법으로 얻은 시럽을 농도 약 85 % 로 농축하고 결정화기에 넣어 씨 결정 약 1 % 을 혼합한 후 바트에 옮겨 20℃ 에서 4일간 정치하여 결정화 및 고화하였다. 이어서, 절삭기로 분쇄하고 건조하여 트레할로오스 함수 결정 혼합물 분말을 고형물당 약 95 % 의 수율로 얻었다. 이 제품은 실질적으로 흡습성을 나타내지 않고 취급이 용이하여 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 A-9

실시예 A-7 의 방법으로 얻은 시럽을 농도 약 85 % 로 농축하고 결정화기에 넣고 실시에 A-6 과 마찬가지로 결정화하고 수득한 결정을 분리하여 고순도 트레할로오스 함수 결정을 고형물당 약 20 % 의 수율로 얻었다. 이 제품은 실험 22 와 마찬가지의 물리화학적 성질을 나타내어 실시예 A-6 과 마찬가지로 각종 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물, 더욱이는 공업 시약, 공업 원료, 화학 원료 등에 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 B-1 : 감미료

실시예 A-3 의 방법으로 제조한 트레할로오스 함수 결정 분말 1 중량부에 " ALPHA G Sweet " (일본국의 東洋精糖 주식회사 판매의 α-글리코실 스테비오시드) 0.01 중량부와 " ASPARAME " (일본국의 Ajinomoto 주식회사 판매의 L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸 에스테르) 0.01 중량부를 균일히 혼합하여 과립 성형기에서 과립상 감미료를 제조하였다. 이 제품은 감미의 질이 우수하여 수크로오스의 약 2 배의 감미도를 가지며 감미도당 칼로리는 수크로오스의 약 1/2 로 저하되어 있다. 이 감미료는 여기에 배합된 고감미도 감미물의 분해도 없고 안정성이 우수하여 저칼로리 감미료로서 칼로리 섭취를 제한하고 있는 비만자, 당뇨병자 등을 위한 저칼로리 음식물 등에 대한 감미 부여에 적당하다. 또한, 이 감미료는 충치 유발균에 의한 산의 생성도 적고 불용성 글루칸의 생성도 적으므로 충치를 억제하는 음식물 등에 대한 감미 부여에도 적당하다.

실시예 B-2 : 하아드 캔디

농도 55 % 수크로오스 용액 100 중량부에 실시예 A-1 의 방법으로 제조한 트레할로오스 함유 시럽 30 중량부를 가열 혼합한 다음 감압하에 수분 2 % 이하가 될 때까지 가열 농축하고, 여기에 시트르산 1 중량부와 레몬 향료 적당량과 착색료를 혼화하여 통상의 방법에 따라 성형하여 제품을 얻었다. 이 제품은 깨물기와 맛이 양호하고 수크로오스의 결정화와 변형을 일으키지 않는 고품질의 하아드 캔디이다.

실시예 B-3 : 초콜렛

카카오 페이스트 40 중량부, 카카오 버터 10 중량부, 수크로오스 30 중량부, 실시예 A-6 의 방법으로 제조한 고순도 트레할로오스 함수 결정 20 중량부를 혼합하고 리파이너를 통과시켜 입도를 작게 한 후 콘체에 넣어 50℃ 에서 2일 동안 반죽하였다. 이 사이에 레시틴 0. 5 중량부를 가하고 충분히 혼화 분산시킨 다음 온도 조절기로 31℃ 로 조절하여 버터가 굳기 직전에 모울드에 부어 넣어 진동기로 탈기를 하였다. 10℃ 의 냉각 터널을 20 분간 통과시켜 고화시켰다. 이것을 탈형하고 포장하여 제품을 얻었다. 이 제품은 흡습성이 없고 색, 광택 모두 양호하며 내부 조직도 양호하여 입속에서 원만히 녹아 상품의 감미와 온화한 풍미를 가진다.

실시예 B-4 : 츄잉 검

검 베이스 3 중량부를 유연하게 될 정도로 가열 용융하고, 여기에 수크로오스 4 중량부와 실시예 A-3 의 방법으로 제조한 트레할로오스 함수 결정 분말 3 중량부를 가하고, 적당량의 향료와 착색료를 혼합한 후 통상의 방법에 따라 로울에서 반죽하여 성형, 포장함으로써 제품을 얻었다. 이 제품은 텍스쳐와 풍미가 모두 양호한 츄잉 검이다.

실시예 B-5 : 가당 연유

원유 100 중량부에 실시예 A-5 의 방법으로 제조한 트레할로오스 함유 시럽 3 중량부와 수크로오스 1 중량부를 용해하고 플레이트 히이터에서 가열 살균한 다음 70 % 로 농축하고 무균 상태에서 통조림하여 제품을 얻었다. 이 제품은 온화한 감미로서 풍미도 좋아서 유유아 (乳幼兒) 식품, 과실, 커피, 코코아, 차 등의 조미용으로 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 B-6 : 유산균 음료

탈지 분유 175 중량부, 실시예 A-2 의 방법으로 제조한 트레할로오스 고함유 분말 8 중량부 및 일본국 특허 공개 제 281,795/92 호 공보에 개시되어 있는 락토수크로오스 고함유 분말 50 중량부를 물 1,200 중량부에 용해하고, 65℃ 에서 30 분간 살균하여 40℃ 로 냉각한 후 여기에 통상의 방법에 따라 스타아터(starter) 를 30 중량부 가하고 37℃ 에서 8 시간 배양하여 유산균 음료를 제조하였다. 이 제품은 풍미가 양호한 유산균 음료이고, 또한 이 제품은 올리고당을 함유하여 유산균을 안정하게 유지할 뿐만아니라 비피도균 증식 촉진작용을 가지고 있다.

실시예 B-7 : 분말 쥬우스

분무 건조에 의해 제조한 오렌지 과즙 분말 33 중량부에 대하여 실시예 A-6 의 방법으로 제조한 고순도 트레할로오스 함수 결정 50 중량부, 수크로오스 10 중량부, 무수 시트르산 0.65 중량부, 말산 0.1 중량부, L-아스코르브산 0.1 중량부, 시트르산 나트륨 0.1 중량부, 풀룰란 0.5 중량부 및 분말 향료 적당량을 잘 혼합, 교반하고 분쇄하여 미분말로 한 후, 이것을 유동층 조립기 (造粒機) 에서 배풍 온도 40℃ 로 하여 여기에 실시예 A-5 의 방법으로 제조한 트레할로오스 고함유 시럽을 바인더로 하여 분무해서 30 분간 조립 (造粒) 하고 계량, 포장해서 제품을 얻었다. 이 제품은 과즙 함유율이 약 30 % 인 분말 쥬우스이고 만족하지 못한 맛과 냄새가 없으며 장기간 안정하였다.

실시예 B-8 : 커스타드 크리임

옥수수 전분 100 중량부, 실시예 A-1 의 방법으로 제조한 트레할로오스 함유 시럽 100 중량부, 말토오스 80 중량부, 수크로오스 20 중량부 및 식염 1 중량부를 충분히 혼합하고 계란 280 중량부를 가하여 교반하였다. 여기에 끓인 우유 1000 중량부를 서서히 가한 후 교반하면서 계속 가열하여 옥수수 전분이 완전히 호화하여 전체가 반투명하게 되었을 때 가열을 중지하고 냉각하여 적당량의 바닐라 향료를 가하고 계량, 충전, 포장하여 제품을 얻었다. 이 제품은 평활한 표면과 광택을 가지며 온화한 감미를 가지고 있다.

실시예 B-9 : 우이로-노-모토 (Uiro-no-moto)

쌀가루 90 중량부에 옥수수 전분 20 중량부, 수크로오스 40 중량부, 실시예 A-3 의 방법으로 제조한 트레할로오스 함수 결정 분말 80 중량부 및 풀룰란 4 중량부를 균일히 혼합하여 우이로-노-모토를 제조하였다. 이것을 적당량의 녹차 분말 및 물과 혼련하고 용기에 나누어 넣어 60 분간 증기찜하여 녹차 분말 우이로를 제조하였다. 이 제품은 광택과 깨물기가 양호하고 풍미도 양호하다. 또한, 전분의 노화도 억제되어 비교적 장기간 보존할 수 있다.

실시예 B-10 : 안 (An : 팥 페이스트)

원료인 아즈키 (adzuki) 팥 10 중량부에 통상의 방법에 따라 물을 가하여 끓인 다음 팥의 고유한 불만족스런 냄새와 떫은 맛을 제거하고 수용성 협잡물을 제거하여 " 아즈키-쯔부-안 (adzuki-tsubu-an) " 약 21 중량부를 얻었다. 여기에 수크로오스 14 중량부와 실시예 A-7 의 방법으로 제조한 트레할로오스 함유 시럽 5 중량부 및 물 4 중량부를 가하고 끓인 다음, 여기에 소량의 샐러드 오일을 가하고 조심스럽게 반죽하여 제품인 안 (an : 팥 페이스트) 약 35 중량부를 얻었다. 이 제품은 퇴색도 없고 텍스쳐, 맛과 풍미가 우수하여 " 팥빵, " 만주 (manju) ", " 당고 (dango) ", " 모나카 (monaka) " 및 빙과 등의 재료로서 적당하다.

실시예 B-11 : 빵

밀가루 100 중량부, 효모 2 중량부, 설탕 5 중량부, 실시예 A-2의 방법으로 제조한 트레할로오스 고함유 분말 1 중량부와 무기 푸우드 0.1 중량부를 통상의 방법에 따라 물과 반죽하여 26℃ 에서 2시간 동안 발효시킨 다음 다시 30 분 숙성한 후 불에 구웠다. 이 제품은 색상도 좋고 양호하게 부풀어 올라있어 적당한 탄력, 온화한 감미를 가진 고품질의 빵이다.

실시예 B-12 : 햄

돼지 넓적다리 고기 1000 중량부에 식염 15 중량부와 질산 칼륨 3 중량부를 균일히 갈아 냉실에서 하룻밤 퇴적한 후, 물 500 중량부, 식염 100 중량부, 질산 칼륨 3 중량부, 실시예 A-2 의 방법으로 제조한 트레할로오스 고함유 분말 40 중량부 및 향신료 (spice) 적당량으로 된 염지액에 냉실에서 7 일간 침지한 다음 통상의 방법에 따라 냉수로 세척하고 끈으로 말아 훈연하여 쿠킹해서 냉각포장하여 제품을 얻었다. 이 제품은 색상, 맛, 풍미가 양호한 고품질의 햄이다.

실시예 B-13 : 분말 펩티드

40 % 식품용 대두 펩티드 용액 " HINUTE S " (일본국의 不二製油 주식회사 제조) 1 중량부에 실시예 A-6 의 방법으로 제조한 고순도 트레할로오스 함수 결정 분말 2 중량부를 혼합하고 플라스틱제 용기에 넣어 50℃ 에서 감압 건조하고 분쇄하여 분말 펩티드들 제조하였다. 이 제품은 풍미가 양호하여 프리믹스, 냉과 등의 제과용 재료로서 뿐만아니라 경구 유동식, 경관 유동식 등의 이유식, 치료용 영양제 등으로서도 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 B-14 : 분말 된장

적색 된장 1 중량부에 실시예 A-4 의 방법으로 제조한 무수 결정 트레할로오스 분말 3 중량부를 혼합하고 다수의 반구상 凹부를 가진 금속판에 부어 넣어 이것을 실온하에서 하룻밤 정치하여 고화한 후 이형하여 1 개당 약 4 g 되는 고형 된장을 얻어 이것을 분쇄기에서 분쇄하여 분말 된장을 얻었다. 이 제품은 즉석 라면, 즉석 수우프 등의 조미료로서 유리하게 이용할 수 있다. 또한, 고형 된장은 고형 조미료로서 뿐만아니라 된장 과자 등으로서도 이용할 수 있다.

실시예 B-15 : 분말 난황

생란 (生卵) 으로 부터 제조한 난황을 플레이트 히이터식 가열 살균기에서 60~64℃ 에서 살균하여 얻은 액상 난황 1 중량부에 대하여 실시예 A-4 의 방법으로 제조한 무수 결정 트레할로오스 분말 4 중량부의 비율로 혼합한 후 용기에 옮겨 하룻밤 방치하여 트레할로오스 함수 결정으로 변환시켜 블록을 제조하였다. 이 블록을 절삭기에서 분말화하여 분말 난황을 얻었다. 이 제품은 프리믹스, 냉과, 유화제 등의 제과용 재료로서 뿐만아니라 경구 유동식, 경관 유동식 등의 이유식, 치료용 영양제 등으로서도 유리하게 이용할 수 있으며, 피부 정화제, 육모제 등으로서도 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 B-16 : 화장용 크리임

폴리옥시에틸렌 글리콜 모노스테아레이트 2 중량부, 자기 유화형 글리세린 모노스테아레이트 5 중량부, 실시예 A-2 의 방법으로 제조한 트레할로오스 고함유 분말 2 중량부, α-글리코실 루틴 1 중량부, 유동 파라핀 1 중량부, 글리세린 트리옥타네이트 10 중량부 및 적당량의 방부제를 통상의 방법에 따라 가열 용해하였다. 여기에 L-락트산 2 중량부, 1,3-부틸렌 글리콜 5 중량부 및 정제수 66 중량부를 가하여 오모게나이저로 유화하여 향료를 적당량 가하고 교반하여 크리임을 제조하였다. 이 제품은 항산화성을 가지며 안정성이 높아 고품질의 햇빛 그을음 방지제, 피부 정화제, 색백제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 B-17 : 분말 약용 인삼 엑스

약용 인산 엑스 0.5 중량부에 실시예 A-4 의 방법으로 제조한 무수 결정 트레할로오스 분말 1.5 중량부를 혼합한 후 용기에 옮겨 2 일간 방치하여 트레할로오스 함수 결정으로 변환시켜 블록을 제조하였다. 이 블록을 절삭기에서 분말화하고 분급 (分級) 하여 분말 약용 인삼 엑스를 제조하였다. 이 제품을 적당량의 비타민 B1 및 비타민 B2 와 함께 과립 성형기에서 비타민 함유 과립상 약용 인삼 엑스로 하였다. 이 제품은 피로 회복제, 강장, 강정제 등으로 유리하게 이용할 수 있다. 또한, 육모제 등으로서도 이용할 수 있다.

실시예 B-18 : 고체 제제

인간의 천연형 인터페론-α제품 (일본국의 주식회사 林原생물화학 연구소 제조) 을 통상의 방법에 따라 고정화 항인터페론-α항체 칼럼에다 가하여 이 제품에 함유된 인간의 천연형 인터페론-α를 흡착시키고, 안정제인 소혈청 알부민을 통과시킨 다음, 인간의 천연형 인터페론-α을 실시예 A-6 의 방법으로 제조한 고순도 트레할로오스 함수 결정을 5 % 함유하는 생리 식염수를 사용하여 생리 식염수의 pH 를 변화시키면서 용출하였다. 이 용출액를 정밀 여과하고 여액을 약 20 배량의 " FINETOSE " (일본국의 주식회사 林原상사 판매의 무수결정 말토오스 분말) 에 가하여 탈수, 분말화한 다음, 이것을 타정기에서 타정하여 1 정 (약 200 mg) 당 인간의 천연형 인터페론-α를 약 150 단위 함유하는 정제를 제조하였다. 이 제품은 설하정 (舌下錠) 등으로 하여 하루에 성인 1~10 정 정도를 경구 투여하여 바이러스성 질환, 알레르기성 질환, 류머티즘, 당뇨병, 악성 종양 등의 치료에 유리하게 이용할 수 있다. 특히, 근년에 와서 환자수가 급증하고 있는 에이즈, 간염 등의 치료제로서 유리하게 이용할 수 있다. 이 제품은 본 발명의 비환원성 당질과 무수 결정 말토오스가 함께 안정제로서 작용하여 실온에서 방치하더라도 그 활성을 장기간 잘 유지한다.

실시예 B-19 : 당의정

중량 150 mg 의 소정 (素錠) 을 심제 (core material) 로 하고, 여기에 실시예 A-9 의 방법으로 제조한 고순도 트레할로오스 함수 결정 분말 40 중량부, 풀룰란 (평균 분자량 200,000) 2 중량부, 물 30 중량부, 탈크 25 중량부 및 산화 티탄 3 중량부로 된 용액을 코우팅하여 정제 중량이 약 230 mg 되게 한 다음 동일한 트레할로오스 함수 결정 분말 65 중량부, 풀룰란 1 중량부 및 물 34 중량부로 된 용액을 사용하여 코우팅한 후 왁스액으로 광택을 나게 해서 외관이 우수한 당의정을 제조하였다. 이 제품은 내충격성도 우수하며 고품질을 장기간 유지한다.

실시예 B-20 : 치약

위에 나온 재료를 통상의 방법에 따라 혼합하여 치약을 제조하였다. 이 제품은 적당한 감미를 가지고 있어 특히 어린이용 치약으로 적당하다.

실시예 B-21 : 유동식용 고체 제제

실시예 A-6 의 방법으로 제조한 고순도 트레할로오스 함수 결정 500 중량부, 분말 난황 270 중량부, 탈지 분유 209 중량부, 염화 나트륨 4.4 중량부, 염화칼륨 1.8 중량부, 황산 마그네슘 4 중량부, 티아민 0.01 중량부, 아스코르브산 나트륨 0.1 중량부, 비타민 E 아세테이트 0.6 중량부 및 니코틴아미드 0.04 중향부로 된 배합물을 제조하고, 이 배합물 25 g 씩을 방습성 라미네이트 소형봉지에 충전하고 히이트 시일하여 제품을 얻었다. 이 제품은 봉지 하나를 약 150∼300 ㎖ 의 물에 용해하여 유동식으로 해서 경구적 또는 비강 (鼻腔), 위, 장 등에 경관적 사용 방법에 따라 이용되며 생체에의 에너지 보급용으로 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 B-22 : 수액제 (輸液劑)

실시예 A-6 의 방법으로 제조한 고순도 트레할로오스 함수 결정을 물에 농도 약 10 w/v % 되게 용해한 다음 통상의 방법에 따라 정밀 여과하여 파이로젠 (pyrogen) 을 제거한 후 플라스틱제 병에 무균적으로 충전하여 마개로 밀봉함으로써 제품을 얻었다. 이 제품은 방치하여도 변화가 없는 안정한 수액제로서 정맥내, 복강내 등에 투여하는데 적합하다. 이 제품은 농도 10 w/v % 에서 혈액과 등장 (等張) 이어서 글루코오스의 경우의 2 배 농도에서 에너지를 보급할 수 있다.

실시예 B-23 : 수액제

실시예 A-9 의 방법으로 제조한 고순도 트레할로오스 함수 결정과 아래의 조성의 아미노산 배합물이 각각 5 w/v % 및 30 w/v % 되도록 물에 혼합, 용해한 다음 실시예 B-22 와 마찬가지로 정제하여 파이로젠이 제거된 용액을 얻고, 이것을 플라스틱제 병에 충전하고 마개로 밀봉하여 제품을 얻었다.

이 제품은 당질과 아미노산의 복합 수액제임에도 불구하고 트레할로오스가 환원성을 나타내지 않으므로 방치하여도 변화하지 않는 안정한 수액제이어서 정맥내, 복강내 등에 투여하는데 적당하다. 이 제품은 생체에의 에너지 보급 뿐만아니라 아미노산 보급을 하기 위해서도 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 B-24 : 외상 치료용 연고

실시예 A-8 의 방법으로 제조한 트레할로오스 함수 결정 분말 200 중량부와 말토오스 300 중량부에 요오드 3 중량부를 용해한 메탄올 50 중량부를 가하여 혼합하고, 여기에 10 w/v % 풀룰란 수용액 200 중량부를 가하여 혼합해서 적당한 확포성과 부착성을 가진 외상 치료용 연고를 제조하였다. 이 제품은 요오드에 의한 살균 작용 뿐만아니라 트레할로오스에 의한 세포에의 에너지 보급제로서도 작용하기 때문에 치유 기간이 단축되고 상처난 곳도 깨끗이 아문다.

이상으로 부터 명백한 바와 같이 말토오스를 함유시킨 영양 배지에 말토오스/트레할로오스 변환 효소 산생능을 가진 미생물을 배양함으로써 배양물로 부터 비환원성 당질을 극히 간편히 단시간에 제조할 수 있게 되어 트레할로오스 또는 이것을 함유하는 당질의 공업적인 제조를 용이하게 한다. 그리고, 말토오스로서 전분을 액화한 용액에 β-아밀라아제 또는 β-아밀라아제와 더불어 전분 지절 효소를 작용시켜 얻어지는 말토오스를 이용하면 전분으로 부터의 트레할로오스의 수득량을 현저히 높여 그 공업적인 제조를 용이하게 한다. 이와 같이 하여 제조되는 트레할로오스 또는 이것을 함유한 당질은 안정성이 우수하고 양질의 고품의 감미를 가지고 있다. 또한, 경구섭취에 의해 소화흡수되어 칼로리원으로 된다. 특히, 트레할로오스는 비경구적으로도 사용되어 양호하게 대사이용된다. 따라서, 본 발명의 트레할로오스 또는 이것을 함유한 당질은 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.

본 발명의 확립은 값싸고 무한한 자원인 전분으로 부터, 종래 필요는 하였으나 쉽사리 제조할 수 없었던 트레할로오스 또는 이것을 함유한 당질을 공업적으로 대량으로 값싸게 제공할 수 있는 아주 새로운 길을 개척하게 되어, 이것이 미치는 영향은 식품, 화장품, 의약품 업계는 말할 것도 없고, 농수축산업, 화학 공업에도 미쳐 이들 산업계에 기여하는 공업적 의의는 헤아릴 수 없다 하겠다.

제 1 도는 피멜로박터 sp. R48 유래의 말토오스/트레할로오스 변환 효소의 활성에 미치는 온도의 영향을 나타낸 그래프.

제 2 도는 피멜로박터 sp. R48 유래의 말토오스/트레할로오스 변환 효소의 활성에 미치는 pH 의 영향을 나타낸 그래프.

제 3 도는 피멜로박터 sp. R48 유래의 말토오스/트레할로오스 변환 효소의 열적 안정성을 나타낸 그래프.

제 4 도는 피멜로박터 sp. R48 유래의 말토오스/트레할로오스 변환 효소의 pH 안정성을 나타낸 그래프.

제 5 도는 슈우도모나스 푸티다 H262 유래의 말토오스/트레할로오스 변환 효소의 활성에 미치는 온도의 영향을 나타낸 그래프.

제 6 도는 슈우도모나스 푸티다 H262 유래의 말토오스/트레할로오스 변환 효소의 활성에 미치는 pH 의 영향을 나타낸 그래프.

제 7 도는 슈우도모나스 푸티다 H262 유래의 말토오스/트레할로오스 변환 효소의 열적 안정성을 나타낸 그래프.

제 8 도는 슈우도모나스 푸티다 H262 유래의 말토오스/트레할로오스 변환 효소의 pH 안정성을 나타낸 그래프.

제 9 도는 더어무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 유래의 탈토오스/트레할로오스 변환 효소의 활성에 미치는 온도의 영향을 나타낸 그래프.

제 10 도는 더어무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 유래의 말토오스/트레할로오스 변환 효소의 활성에 미치는 pH 의 영향을 나타낸 그래프.

제 11 도는 더어무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 유래의 말토오스/트레할로오스 변환 효소의 열적 안정성을 나타낸 그래프.

제 12 도는 더어무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 유래의 말토오스/트레할로오스 변환 효소의 pH 안정성을 나타낸 그래프.

Claims (14)

1. 영양 배지에서 배양할 경우 수크로오스로부터의 트레할로오스 산생능은 없으나, 말토오스/트레할로오스 변환 효소 산생능을 가진 미생물을 말토오스를 함유시킨 영양 배지에서 배양하여 수득되는 트레할로오스 또는 이것을 함유하는 당질.
2. 제1항에 있어서, 말토오스가 액화전분에 α-아밀라아제 또는 β-아밀라아제와 더불어 전분 지절 효소를 작용시켜 수득되는 것인 트레할로오스 또는 이것을 함유 하는 당질.
3. 제1항에 있어서, 미생물이 피멜로박터속, 슈우도모나스속 또는 더어무스속에 속하는 미생물인 것을 특징으로 하는 트레할로오스 또는 이것을 함유하는 당질.
4. 제1항에 있어서, 트레할로오스가 함수 결정형 또는 무수 결정형인 트레할로오스 또는 이것을 함유하는 당질.
5. (가) 말토오스를 함유시킨 영양 배지에서 말토오스/트레할로오스 변환 효소 산생능을 가진 미생물을 배양하고, (나) 수득되는 배양물로 부터 트레할로오스 또는 이것을 함유하는 '당질을' 채취하는 것을 특징으로 하는 트레할로오스 또는 이것을 함유하는 당질의 제조 방법.
6. 제5항에 있어서, 영양 배지에 말토오스를 20 w/v % 이하 함유시킨 것을 특징으로 하는 트레할로오스 또는 이것을 함유하는 당질의 제조 방법.
7. 제5항에 있어서, 영양 배지에 말토오스와 더불어 계면 활성제를 함유시킨 것을 특징으로 하는 트레할로오스 또는 이것을 함유하는 당질의 제조방법.
8. 제5항에 있어서, 미생물이 피멜로박터속, 슈우도모나스속 또는 더어무스속에 속하는 미생물인 것을 특징으로 하는 트레할로오스 또는 이것을 함유하는 당질의 제조 방법.
9. 제5항에 있어서, 배양을 회분식, 연속식 또는 반연속식으로 실시하는 것을 특징으로 하는 트레할로오스 또는 이것을 함유하는 당질의 제조 방법.
10. 제5항에 있어서, 배양물 또는 이것으로 부터 수득되는 당질에 글루코아밀라아제 또는 α-글루코시다아제를 작용시키는 것을 특징으로 하는 트레할로오스 또는 이것을 함유하는 당질의 제조 방법.
11. 제1항에 기재된 트레할로오스 또는 이 트레할로오스를 함유하는 당질을 1종 이상의 기타의 음식물 재료와 함께 함유시키거나, 흑은 제1항에 기재된 트레할로오스 또는 이 트레할로오스를 함유하는 당질을 소요의 음식물로 제조하는 단계를 포함하는 음식물의 제조방법.
12. 제1항에 기재된 트레할로오스 또는 이 트레할로오스를 함유하는 당질을 1종 이상의 기타의 화장품 재료와 함께 함유시키는 단계를 포함하는 화장품의 제조방법.
13. 제1항에 기재된 트레할로오스 또는 이 트레할로오스를 함유하는 당질을 1종 이상의 기타의 의약품 재료와 함에 함유시키는 단계를 포함하는 의약품의 제조방법.
14. 제 11 항 내지 제 13항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 트레할로오스가 무수 결정 형태 혹은 함수 결정의 형태인 제조방법.