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CN102613450A - 含有益生的异麦芽-寡糖的谷物组合物及其制造和应用方法 - Google Patents

含有益生的异麦芽-寡糖的谷物组合物及其制造和应用方法 Download PDF

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CN102613450A
CN102613450A CN2012100745941A CN201210074594A CN102613450A CN 102613450 A CN102613450 A CN 102613450A CN 2012100745941 A CN2012100745941 A CN 2012100745941A CN 201210074594 A CN201210074594 A CN 201210074594A CN 102613450 A CN102613450 A CN 102613450A
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G·段
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Abstract

描述了用于生产含异麦芽寡糖的基质，块茎和谷物组合物的方法。方法包括：(a)用产麦芽酶和淀粉液化酶接触含有未糊化淀粉的基质，块茎或者谷物，生成麦芽糖；(b)用转糖苷的酶接触所述麦芽糖，其中所述步骤(a)和所述步骤(b)发生的温度低于或者等于淀粉糊化温度；和(c)获得具有酶促生成的异麦芽寡糖的基质，谷物或者块茎组合物，其中所述寡糖来源于所述谷物。产麦芽酶对于谷物可以是外源的或者是内源的。接触步骤可以是相继的或者同时的。本发明也描述了谷粉、口服再水合溶液、啤酒添加剂、食品、饲料、饮料添加剂，它们含有如所描述地制成的谷物组合物。

Description

含有益生的异麦芽-寡糖的谷物组合物及其制造和应用方法
本申请是申请日为2004年3月10日、申请号为200480006066.6、题为“含有益生的异麦芽-寡糖的谷物组合物及其制造和应用方法”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明描述了含有异麦芽寡糖(isomalto-oligosaccharides)的谷物组合物及其制造方法。该方法包括从谷物中含有的淀粉衍生异麦芽寡糖。
背景技术
异麦芽寡糖(“IMOs”)是混合的键接寡糖(mixed linkage oligosaccharides)，含有1，4α和/或1，6α糖苷键的混合物。它们也被称为不规则连接寡糖(“ALOs”)。异麦芽寡糖包含大量的分支寡糖，如异麦芽糖、4-α-葡糖基麦芽糖、异麦芽三糖、异麦芽四糖、异4-α-葡糖基麦芽糖和更加高度分支的寡糖。
存在对含有IMOs的产品的市场需求。IMO产品以粉末形式或者液体形式出售，这取决于所打算的用途。潜在的用途是在食品领域。IMO产品的例子是：调味品(蛋黄酱、醋、汤底等)，甜食(糖果、口香糖、巧克力、冰激凌、果子露、糖浆)，水果和蔬菜加工食品(果酱、柑橘酱、水果沙司、腌菜)，肉类或者鱼类食品(火腿、香肠等)，焙烤食品(面包、蛋糕、曲奇、酥皮糕点)，预先烹熟的食物(色拉、煮熟的豆等)，罐装和瓶装食品、方便食品(速溶咖啡、速溶蛋糕酒底(instant cake base)等)，和饮料，既包括含酒精的饮料(酒精饮料、seju、果酒、日本米酒、啤酒[国际公布号WO 02/20712A1]，等)又包括不含酒精的饮料(咖啡、果汁、蜜汁饮料、充气饮料或者碳酸饮料、柠檬水、可乐)。异麦芽寡糖可以进一步用作动物饲料和宠物饲料中的成分。非食物的应用领域是化妆品和药物(香烟、口红、牙膏、内服药等)。
异麦芽寡糖属于被归类为功能健康食品寡糖(“FHFO”)的一类寡糖。代表性的IMOs包括果糖-寡糖、半乳糖-寡糖、木糖-寡糖和龙胆-寡糖(gentio-oligosaccharides)。当IMOs被规则地每日口服时，与之相联系的是人类和动物的综合健康状态的增进，IMOs被归类为“益生质(prebiotics)”。益生质被定义为不易消化的物质(例如，食物纤维)，其通过选择性刺激存在于肠道或者在治疗中被导入肠道的有益微生物的生长或者生物活性，对人类施加一些生物学效应。(Przemyslaw Jan Tomasik and Piotr Tomasik.2003 American Association of CerealChemists，Inc.80(2)：113-117)。寡糖的“益生(prebiotic)”作用是增加大肠中双歧杆菌(bifidobacteria)和乳酸杆菌(lactobacilli)(″益生质″)的数量，和降低腐败细菌(putrifactive bacteria)的浓度。双歧杆菌与一些促进健康的性质有关，例如抑制病原体生长，这是通过形成酸或者是通过抗微生物活性实现的。它们也和这一类的种种效应有关，如调节免疫系统(抗肿瘤性质)，降低甘油三酯和胆固醇水平，生成维生素(B族)，降低血氨浓度，防止易位，抗菌治疗后恢复正常的肠道菌群，产生消化酶，减少与抗生素相关的副作用(Kohmoto T.，Fukui F.，Takaku H.，Machida Y.，et al.，Bifidobacteria Microflora，7(2)(1988)，61-69；Kohmoto K.，Tsuji K.，Kaneko T.，Shiota M.，et al.，Biosc.Biotech.Biochem.，56(6)(1992)，937-940；KanekoT.，Kohmoto T.，Kikuchi H.，Fukui F.，et al.，Nippon Nogeikagaku Kaishi，66(8)(1992)，1211-1220，Park J-H，Jin-Young Y.，Ok-Ho S.，Hyun-Kyung S.，et al.，Kor.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.，20(3)(1992)，237-242)。Modler，H.W.，1992，″Compoundswhich enhance the growth of Prebiotic Bacteria″，presented at the InternationalRoundtable on Animal Feed Biotechnology，Ottawa，Ontario，Canada。
异麦芽寡糖是应用D-葡糖基转移酶(E.C.2.4.1.24，转葡糖苷酶，α-葡糖苷酶)，通过酶催化的转葡糖基反应(transglucosylation reaction)合成的。此酶在与α-D-葡糖-寡糖温育时，催化水解反应和转移反应。对6-OH(葡萄糖分子的羟基基团6)的转移发生得最频繁，由D-葡萄糖产生异麦芽糖，或者从麦芽糖产生4-α-葡糖基麦芽糖。该酶也可以催化向D-葡萄糖的2-OH或者3-OH的转移，形成曲二糖(2-葡糖-α-葡糖苷)或者黑霉糖，或者回到4-OH再形成麦芽糖。转葡糖苷酶反应的结果是，麦芽寡糖转变为异麦芽寡糖，形成了含有更高比例的葡萄糖部分的一类寡糖，所述葡萄糖部分连接于葡萄糖分子非还原末端的一级羟基基团，例如，通过α-D-1，6糖苷键连接。来自黑曲霉的转葡糖苷酶仅作用于低聚合度(DP)的寡糖(McCleary B.V.，Gibson T.S.，Carbohydrate Research 185(1989)147-162；Benson C.P.，Kelly C.T.，Fogarty W.M.，J.Chem.Tech.Biotechnol.，32(1982)790-798；Pazur J.H.，Tominaga Y.，DeBrosse C.W.，Jackman L.M.，Carbohydrate Research，61(1978)279-290)。聚合度是指葡萄糖单位的数目。例如，二葡糖基分子，例如麦芽糖的DP是2。这些糖作为食品添加剂受到了越来越多的关注，原因是它们有助于预防龋齿(Oshima，et.al 1988.The caries inhibitory effects of gos-sugar in vitro and ratexperiments.Microbial Immunol.32，1093-1105)，并且可作为双歧杆菌的生长因子(益生质)，改善人类的肠道微生物作用(Komoto，et.al 1988；Effect ofIsomalto-oligosaccharides on human fecal flora，Bifidobacteria Micro flora 7，61-69)。
可以以不同方法得到异麦芽寡糖。例如，用葡糖淀粉酶处理高干固体浓度，即60-80％的葡萄糖糖浆，导致DP主要为2的异麦芽寡糖的形成。高固体水平的存在，迫使反应从有利于水解的正常方向逆转。
谷物，包括小麦、大麦等，在许多增值的功能食物成分，如小麦粉、淀粉、淀粉水解产物(葡萄糖、果糖、高麦芽糖糖浆等)和小麦麸(wheat gluten)的经济生产中，是极好的原材料。在抗生素、药物、疫苗、生物化学制品，如乙醇(既包含饮料也包括燃料)、氨基酸、有机酸等的生产中，以及最近在被称为异麦芽寡糖的功能健康食品寡糖的生产中，含有高水平麦芽糖的糖浆也被用作许多微生物发酵中的碳源。在生产淀粉水解产物，如麦芽糖糖浆的传统方法中，在水解前，通常通过淀粉液化和产麦芽α淀粉酶，将不溶的颗粒状淀粉与小麦的其它细胞成分分离。麦芽糖是由通过α1-4 D-糖苷键连接的两个葡糖基残基组成的二糖，它是麦芽寡糖家族中最小的物质。它是作为不同纯度级别的糖浆、粉末和晶体而大规模生产的。各种麦芽糖糖浆受到了明显的关注，它们可用于酿造、烘烤、罐装软饮料、糖果和其它食品和饮料工业的商业用途中。在日本，超纯麦芽糖被用作静脉内营养物。麦芽糖的催化还原形成麦芽糖醇，其被认为是低卡路里的甜味剂。近来，高麦芽糖糖浆已经成为工业生产异麦芽寡糖的重要原料(J.K.Shitty and O.J.Lantero，1999″Transglucosylation of Malto-oligosaccharides.″Paper presented at 50thStarch Convention，Detmold，Germany)。
在生产淀粉水解产物如高麦芽糖糖浆的传统方法中，在水解之前，用来自地衣形芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的耐热液化α淀粉酶[EC3.2.1.2，α(1，4)-葡聚糖葡聚糖水解酶]将不溶性淀粉分离出来。纯化淀粉(精制的)的水解是通过，在水中悬浮不溶性颗粒淀粉(30％-50％溶解固体成分[dsb])并加热至85℃至120℃之间的温度以溶解淀粉，和使其易受到酶促水解而进行的。使用麦芽糖生成酶，进一步处理液化的淀粉，以产生具有不同的糖类组成的淀粉水解产物，如真菌α淀粉酶(Genencor International，Palo Alto，CA出售，商标名为CLARASE L)用于含有少于55％麦芽糖的糖浆，β淀粉酶(Genencor International，Palo Alto，CA出售，商标名为OPTIMAL BBA)用于产生含有55％至62％的麦芽糖成分和少于1％葡萄糖的糖浆。对于＞62％的更高水平麦芽糖糖浆，联合加入脱支酶(GenencorInternational，PaloAlto，CA出售，商标名为OPTIMAXL-1000)和β淀粉酶是有用的。(Faigh，J.；Duan，G.；Strohm，B.and Shetty，J.(2002)″Production of Maltose，High Maltose&Very High Maltose Syrups，″Technical Bulletin，Genencor InternationalInc.)。
已经报道了一种将颗粒淀粉(精制的)转变为可溶性水解产物的方法，这是通过在低于淀粉糊化温度的温度，与细菌α淀粉酶温育(Leach et.al 1978；美国专利号4,113,509)，随后由β淀粉酶水解，产生高麦芽糖糖浆(Leach et.al 1975；美国专利号3,922,196)实施的。然而，通过这种方法产生的糖浆形成的麦芽糖仅占总含糖量的55％，而含有的麦芽三糖水平非常高。欧洲专利申请0905256(Christophersen，et.al 2000)和美国专利5,141,859(Nimmi，et.al 1992)，描述了应用液化的淀粉(糊化后，应用耐热α淀粉酶水解)生产高麦芽糖糖浆的方法。此过程麻烦、昂贵，并且需要将淀粉从其它细胞组分中分离出来，添加的麦芽糖生成酶的成本高，需要高温处理和较长的反应时间。欧洲专利申请0350737A2(Shinke，et.al 1989)公开了一种生成麦芽糖糖浆的方法，方法是应用来自嗜热脂肪芽孢杆菌的α淀粉酶，在60℃，水解来自玉米、小麦、马铃薯和甘薯的颗粒状(纯化的)淀粉，没有传统的液化步骤(凝胶化，随后在高温下液化)。然而，该水解的淀粉导致麦芽糖浓度范围为50％至55％。该糖浆含有的麦芽三糖水平也非常高(30-36％)。不论淀粉的来源如何，此方法均造成麦芽糖与麦芽三糖的比率少于2.0。由于代谢麦芽三糖的难度大，含有高水平麦芽三糖的麦芽糖糖浆在许多微生物发酵包括酵母的乙醇发酵中，不是碳供给的优选底物(J.K.Shetty and O.J.Lantero，1999″Transglucosylation of Malto-oligosaccharides.″，论文在德国Detmold第50届淀粉大会上发布)。美国专利6,361,809描述了生产麦芽糖和极限糊精的方法，方法为用水解酶，分类为EC 3.2.1.133的来自嗜热脂肪芽孢杆菌的maltogenaseα淀粉酶处理纯化的颗粒状蜡质玉米淀粉，随后应用超滤方法分离麦芽糖。对含有麦芽糖的稀释透过物(dilute permeate)的蒸发是昂贵的，因为能源花费高，并且存在着微生物污染的高风险。
传统地，谷物如小麦、麦芽、高粱属(买罗高梁)、黍(鸭脚稗)，特别地是整个的谷物，可作为宏量(micro-)元素和微量元素、蛋白质、纤维和维生素的载体，被用在营养品中。谷物谷物中的大多数似乎太容易被消化，以至于不能作为益生质或者甚至作为营养物质(nutraceuticals)而起到有效的作用。已经建议，设计遗传修饰的、较不易消化的、适于作为益生质的谷物，以调节肠道微生物群(Gibson，G.R，and Roberfroid，M.B.1995，Dietary modulation of the human colonicmicrflora：Introducing the concept of prebiotics.J.Nutr.125，1401-1412)。
生产含有异麦芽寡糖的谷物组合物的方法一直受到关注，希望在这样的方法中在转葡糖苷反应(transglucosidation action)之前，不需要将淀粉与其它谷物成分分离开来和/或使底物的淀粉遭受蒸气加压的高温，便能从源底物例如谷物或者块茎酶促地衍生出异麦芽寡糖。用于最小化微生物污染的低pH方法，也一直受到关注。本发明即是针对这些关注。
发明概述
本发明描述了用于生产异麦芽寡糖谷物组合物的方法，所述方法包括：(a)用产麦芽酶(maltogenic enzyme)和淀粉液化酶(starch liquefying enzyme)接触含有未糊化淀粉的谷物，以生成麦芽糖；(b)用转糖苷的酶(transglucosidic enzyme)接触所述麦芽糖，其中所述步骤(a)和所述步骤(b)发生的温度是低于或者等于淀粉糊化温度；和(c)获得具有酶促生成的异麦芽寡糖的谷物组合物，其中所述寡糖来源于所述谷物。
可任选地，在一种实施方案中，步骤(a)和(b)同时发生。在另一种实施方案中，该方法进一步包括干燥所述谷物组合物的步骤。在另一种实施方案中，所述谷物选自小麦、黑麦、大麦、麦芽和水稻。在另一种实施方案中，所述谷物选自高粱、黍和水稻。在另一种实施方案中，所述产麦芽酶是β淀粉酶。在另一种实施方案中，所述产麦芽酶对所述谷物来说，是内源性的。在另一种实施方案中，所述产麦芽酶对所述谷物来说，是外源性的。在另一种实施方案中，所述淀粉液化酶是源自杆菌(Bacillus)的α淀粉酶。在另一种实施方案中，所述淀粉液化酶源自地衣形芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌。在另一种实施方案中，所述转葡糖苷的酶是转葡糖苷酶(transglucosidase)。在另一种实施方案中，转葡糖苷酶源自曲霉菌(Aspergillus)。在另一种实施方案中，转葡糖苷酶源自黑曲霉(Aspergillusniger)。本发明的其它实施方案包括根据上面所描述方法而产生的谷物组合物。本发明的另一种实施方案包括含有上面所描述谷物组合物的食品添加剂。
本发明也描述了在等于或者低于糊化温度时生产异麦芽寡糖强化谷粉的方法，其中使带有内源性的产麦芽酶的未糊化谷物接触选自杆菌的溶解酶(solubilizing enzyme)，以产生麦芽糖糖浆。使麦芽糖糖浆接触转葡糖苷酶，产生基质(块茎或者谷物)组合物，所述组合物包括来源于它们的异麦芽-糖类。
本发明也描述了在等于或者低于糊化温度时生产异麦芽寡糖强化谷粉的方法，其中将带有内源性的产麦芽酶的未糊化谷物(小麦、大麦等)与不带有内源性的产麦芽酶的未糊化谷物(例如，高粱、黍或者水稻)混合，将该谷物混合物接触选自杆菌的溶解酶，以生成麦芽糖糖浆。将该麦芽糖糖浆接触于转葡糖苷酶，产生基质(块茎或者谷物)组合物，所述组合物包括来源于它们的异麦芽-糖类。
本发明也描述了用于制造小麦谷物组合物的方法，所述方法包括：(a)将含有内源性的产麦芽β淀粉酶的未糊化小麦谷物与来自杆菌的淀粉液化α淀粉酶接触，以产生麦芽糖；(b)用转葡糖苷酶接触所述麦芽糖，其中所述步骤(a)和步骤(b)发生在低于小麦糊化温度的温度；和(c)获得含有酶促生成的异麦芽寡糖的小麦谷物组合物，其中所述寡糖来源于所述的未糊化谷物。
可任选地，在另一种实施方案中，本方法应用上述方法来制造用于制造食品添加剂的谷物组合物。另一种实施方案包括由此制成的谷物组合物。另一种实施方案包括含有如上所述的谷物组合物的谷粉。另一种实施方案包括根据上面所述方法制成的异麦芽寡糖。另一种实施方案包括含有上述的异麦芽寡糖的口服再水合溶液。另一种实施方案包括含有未糊化谷物和至少一种异麦芽寡糖的谷物组合物，其中所述异麦芽寡糖酶促地来源于所述的未糊化谷物。在另一种实施方案中，谷物组合物含有重量大于1％的至少一种异麦芽寡糖。
附图简述
图1是描述异麦芽寡糖强化谷粉生产的流程图。
图2是描述异麦芽寡糖强化小麦粉生产的另一个流程图。
发明详述
定义
术语“谷物(grain)”是指植物，其被归类为谷类(cereal)或者属于禾本目的单子叶植物，尤其是属于禾本科的单子叶植物。属于此类的植物的例子是选自小麦属(小麦)，大麦属(大麦)；黑麦属(黑麦)；玉蜀黍属(玉米(corn))或者玉蜀黍(maize))；燕麦属(燕麦)，荞麦属(荞麦)；高粱属(高粱或者买罗高梁)，黍属或者狗尾草属(黍或者鸭脚稗)；或者稻属(稻)。
例如，在一种实施方案中，术语“小麦(wheat)”是指植物，其被分类为或者曾经被分类为小麦(Triticum aestivum)品系。
例如，在一种实施方案中，术语“大麦(barely)”是指植物，其被分类为或者曾经被分类为大麦(Hordeum vulgare)品系。
例如，在一种实施方案中，术语“黑麦(rye)”是指植物，其被分类为或者曾经被分类为黑麦(Secale cereal)品系。
例如，在一种实施方案中，术语“玉米(corn)”是指植物，其被分类为或者曾经被分类为玉米(Zea mays)品系。
例如，在一种实施方案中，术语“燕麦(oats)”是指植物，其被分类为或者曾经被分类为燕麦(Avena sativa)品系。
例如，在一种实施方案中，术语“荞麦(buckwheat)”是指植物，其被分类为或者曾经被分类为荞麦(Fagopyrum esculentum)品系。
例如，在一种实施方案中，术语“高粱(sorghum)”是指植物，其被分类为或者曾经被分类为高梁(Sorghum bicolor)品系。
例如，在一种实施方案中，术语“黍(millet)”是指植物，其被分类为或者曾经被分类为黍(Panicum miliaceum)或者粟(Setaria italic)品系。
例如，在一种实施方案中，术语“稻(rice)”是指植物，其被分类为或者曾经被分类为水稻(Orvza sativa)品系。
术语“块茎(tuber)”是指淀粉贮存器官(例如马铃薯、甘薯、山药、树薯等)，其由地下茎或者根的远端膨胀而形成。
例如，在一种实施方案中，术语“马铃薯(potao)”是指植物，其被分类为或者曾经被分类为马铃薯(Solanum tuberosum)品系。
例如，在一种实施方案中，术语“甘薯(sweet potato)”是指植物，其被分类为或者曾经被分类为甘薯(ipom[oe]a batatas)品系。
例如，在一种实施方案中，术语“山药(yam)”是指植物，其被分类为或者曾经被分类为山药(Dioscorea sativa、D.villosa、C.batatas)品系。
术语底物(substrate，本文中有时也称为“基质”)是指可以酶促地转变为麦芽糖并从而转变为IMOs的物质。术语“底物”包括，例如，谷物和块茎。进一步地，术语底物包括谷物(去外壳的或者未去外壳的)或者块茎的所有形式，如完整谷物、破碎的谷物、粗粉和面粉以及任何植物部分。
术语“淀粉(strach)”是指由植物的复杂多糖碳水化合物组成的任何物质，由式子为(C6H10O5)x的直链淀粉和支链淀粉组成，其中X可以是任何数字。
术语“颗粒淀粉(granular strach)”是指未煮过的(生的)淀粉，其还未被糊化。术语“糊化(gelatinization)”是指淀粉分子的溶解，形成粘性的悬浮物。
术语“含有未糊化淀粉的“底物”、“谷物”或者“块茎””是指未糊化的底物、谷物或者块茎，其未遭受高于淀粉糊化温度的温度，所述的淀粉糊化温度导致底物中包含的淀粉糊化或者液化。
术语“麦芽糖(maltose)”是指具有两个葡糖基残基的二糖，这两个葡糖基残基通过α1，4D-糖苷键连接。
术语“异麦芽糖(isomaltose)”是指具有两个葡糖基残基的二糖，这两个葡萄糖残基通过α1，6D-糖苷键连接。
术语“异麦芽寡糖(isomalto-oligosaccharide，IMO)”是指具有至少两个葡糖基残基的糖，所述残基通过在非还原端的α1，6糖苷键连接。此外，该术语可指不规则连接的寡糖，既有α1，6糖苷键又有α1，4糖苷键的糖。代表性的异麦芽寡糖包括异麦芽糖、4-α-葡糖基麦芽糖(panose)和异麦芽三糖(isomalto-triose)。
术语“异麦芽寡糖”谷物组合物是指谷物组合物，其特征为异麦芽-糖(isomalto-sugars)水平占总含糖量的至少1％(w/w％)，如由高效液相色谱方法所测定。
术语“产麦芽酶(maltogenic enzyme)”是指将淀粉转变为麦芽糖的酶。代表性的产麦芽酶包括源自真菌、细菌和植物的α淀粉酶和β淀粉酶。
术语“淀粉酶(amylases)”是指催化淀粉水解的酶。
术语“α-淀粉酶(α-amylases)”是指(E.C.)3.2.1.1类别和/或3.2.1.133类别的酶，其催化α-1，4-糖苷键的水解。这些酶也被描述为，在含有1，4-α连接的D-葡萄糖单位的多糖中，外切水解或者内切水解1，4-α-D-糖苷键的那些酶。用以描述这些酶的另一个术语是糖原酶。代表性的酶包括α-1，4-葡聚糖4-葡聚糖水解酶葡聚糖水解酶。
术语“β-淀粉酶(β-amylases)”是指(E.C.)3.2.1.2类别的酶，其催化α-1，4-糖苷键水解，释放麦芽糖单位。这些酶也被描述为，使多糖中1，4-α-D-糖苷键水解，以致从链的非还原末端移除连续的麦芽糖单位的那些酶。
术语“转糖苷的(transglucosidic)”酶是指在和αD-葡糖-寡糖(αD-gluco-oligosaccharides)温育时，催化水解和转移两种反应的酶。代表性的酶包括转葡糖苷酶(transglucosidases)和/或(E.G.)2.4.1.24类别的那些酶，例如，D-葡糖基转移酶。这些酶也被称为1，4-α-葡聚糖-α-葡糖基转移酶和寡葡聚糖分支糖基转移酶。
术语脱支酶(debranching enzyme)是指催化α-1，6-糖苷键水解的酶。就此而论，E.C.3.2.1.41类的酶是有用的。此类的代表性酶是普鲁兰酶(pullanase)，也被称为α-糊精内切-1，6-α葡糖苷酶、极限糊精酶、脱支酶、支链淀粉1，6-葡聚糖水解酶。(E.C.)3.2.1.41类的其它代表性酶，例如，支链淀粉酶(pullulanases)，[α-(1-6)-葡聚糖6-葡聚糖水解酶，也被称为α-(1，6)-葡糖苷酶])。
术语“淀粉糊化温度(starch gelatinizing temperatures)”是指足够地高以致可以有效液化或者糊化颗粒淀粉的温度。在水中加热淀粉引起淀粉颗粒膨胀。在足够的固体浓度时，膨胀的颗粒占据了大部分空间，称为糊(paste)的粘性物质产生。淀粉分子的溶解被称为糊化。糊化伴随着双折射的丧失。术语淀粉糊化温度是指糊化发生时的温度。
术语“淀粉液化酶(starch liquefying enzyme)”是指实现颗粒淀粉的流体化的酶。代表性的淀粉液化酶包括(E.C.)3.2.1.1.类的α淀粉酶。
术语“内源性”是指在谷物或者块茎中存在的酶，而无需求助于向谷物加入该产麦芽酶。
术语“外源性”是指在谷物中不存在的酶。代表性的外源性酶包括，例如，在野生型底物例如，稻、黍等中不存在的酶。
术语“总含糖量(total sugar content)”是指在淀粉、谷物或者块茎组合物中存在的糖的总量。
术语“IMO数(IMO No.)”计算为，异麦芽糖、4-α-葡糖基麦芽糖、异麦芽三糖和DP大于3的分支糖的总和。IMO数提供了在化合物或者溶液中存在的IMO化合物的量的指示。
术语“分支糖的比(ratio of branched sugars，RBS)”是指，在谷物中存在的麦芽糖(DP2)与得到的谷物组合物中存在的麦芽三糖(DP3)水平的比。
术语“糖化力程度(Degrees of Diastatic Power)”(DP°)单位是指，在0.10ml的酶制备物样品5％溶液中含有的酶量，其在20℃(68°F)和100ml底物温育1小时，会生成足够的还原糖，以还原5ml Fehling′s溶液。
术语“DE”或者“右旋糖当量(dextrose equivalent)”是用于测定总还原糖的浓度的工业标准，所述总还原糖的浓度在被计算时是换作为D-葡萄糖来计算的，按干重计算(on a dry weight basis)。未水解的颗粒淀粉的DE基本上是0，D-葡萄糖的DE是100。
术语“总含糖量(total sugar content)”是指在淀粉组合物中存在的糖的总含量。
术语“干固体成分(dry solid basis)”和“dsb”是指浆体中的化合物例如面粉的总量(以％表示)，按干重计算。
术语“Brix”是指用于测定特定温度下溶液的糖含量的公知的比重计标度值(hydrometer scale)。因此，术语“Brix”是指溶液中溶解的糖的量度。Brix标度值测定的是每100克的含水糖溶液中存在的蔗糖的克数(总的溶解固体含量)。例如，1.00Brix的测定值是指溶液中的糖大约是10mg/ml。Brix的测定值通常是通过应用液体比重计或者折射计而完成的。
术语“聚合程度(degree of polymerization，DP)”是指在特定糖类中吡喃型葡糖酐单元的数目(n)。DP1的例子是单糖，如葡萄糖和果糖。DP2的例子是二糖，例如麦芽糖和蔗糖。DP4+意味着聚合度大于3的聚合物。
术语“酶促生成(enzymatically produced)”是指底物被酶促催化为IMO，这不同于IMO的化学合成或者有机化学合成。
术语“丝状真菌(filamentous fungi)”是指真菌亚门(subdivision Eumycotina)的所有丝状形式(参见，Alexopoulos，C.J.(1962)，INTRODUCTORY MYCOLOGY，New York：Wiley)。这些真菌的特征在于营养菌丝体，其带有由壳素、纤维素和其它复合多糖组成的细胞壁。本发明的丝状真菌在形态学、生理学和遗传学上不同于酵母。丝状真菌的营养生长是借助于丝菌延长，并且碳分解代谢是专性需氧的。在本发明中，丝状真菌亲代细胞可以是下列属的细胞，但不限于这些细胞：木霉菌属(Trichoderma)，例如，里氏木霉(Trichoderma reesei)(以前被归类为长枝木霉(T.longibrachiatum)，目前被称为Hypocrea jecorina)、绿色木霉(Trichodermaviride)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、哈兹木霉(Trichoderma harzianum)；青霉菌属(Penicillium sp.)；腐质霉属(Humicola sp.)，包括Humicola insolens和Humicola grisea；金孢霉菌属(Chrysosporium sp.)，包括C.lucknowense；粘帚霉属(Gliocladium sp.)；曲霉属(Aspergillus sp.)，包括米曲霉(A.oryzae)、构巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉(A.niger)和泡盛曲霉(A.awamori)；镰刀菌属(Fusariumsp.)、脉抱菌属(Neurospora sp.)、肉座菌属(Hypocrea sp.)和裸孢壳属(Emericellasp.)。也参考Innis et al.，(1985)Sci.228：21-26。
术语“曲霉菌”或者“曲霉属”是指以前被归类为曲霉菌或者目前被归类为曲霉菌的任何霉菌。
术语“细菌”是指芽孢杆菌属(Bacillus)，包括但不限于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciesn)、缓慢芽孢杆菌(B.lentus)、B.Carlsberg、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)。
术语“植物起源(plant origin)”是指由植物来源中衍生、提取、分离、表达的酶，所述植物来源例如大麦麦芽、大豆、小麦或者大麦。
术语“接触”是指将各个酶(一种或者多种)放置在足够近地接近于各自的底物的位置，以便酶(一种或多种酶)能够将底物转变为所需的终产物。本领域的技术人员将认识到，将所述酶或者所述多种酶的溶液与各自的底物混合，可以实现接触。
术语“温育(incubating)”是指在特定的条件下，在限定的时间期间将含有底物的基质与分别的酶混合，所述的酶例如，液化酶或者产麦芽麦或者转葡糖苷酶。
术语“酶促转化(enzymatic conversion)”是指对对稻底物进行修饰，产生可溶的水解颗粒状稻淀粉，优选地产生葡萄糖。
术语“浆(slurry)”是指含有不溶颗粒淀粉的含水混合物。有时术语“浆”和“悬浮液”在此处可交换使用。
术语“培养”是指在合适条件下，在液体或者固体介质中生长一群微生物细胞。在一种实施方案中，培养是指颗粒淀粉底物发酵性的生物转化为葡萄糖糖浆或者其它所需的终产物(典型地在容器或者反应器中)。
例如，在一种实施方案中，术语α淀粉酶单位被定义为，在pH5.2和40℃的标准分析条件下，1分钟内水解1微摩尔淀粉底物的α淀粉酶量。
例如，在一种实施方案中，术语β淀粉酶单位被定义为，在pH4.6和20℃的标准分析条件下，1分钟内水解1微摩尔淀粉底物的β淀粉酶量。
例如，在一种实施方案中，术语转葡糖苷酶单位被定义为，在pH4.8和37℃的标准分析条件下，1分钟内转化1微摩尔麦芽糖底物的转葡糖苷酶量。
在另一种实施方案中，术语转葡糖苷酶单位被定义为，在pH4.8和37℃的标准分析条件下，每分钟生成1微摩尔4-α-葡糖基麦芽糖的转葡糖苷酶量。
例如，在一种实施方案中，术语一个Liquefon单位(LU)是碘溶液产生颜色变化所需的消化时间的量度，它表示了在pH5.6和25℃的标准分析条件下，淀粉底物糊精化的确定时期。
“ATCC”是指美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，位于Manassas，VA20108(ATCC，www/atcc.org)。
“NRRL”是指农业研究菌种保藏中心，美国国家农业效用研究中心(Agricultural Research Service Culture Collection，National Center for AgriculturalUtilization Research)(以前被称为美国农业部北区研究实验室(USDA NorthernRegional Research Laboratory)，Peoria，ILL。
“NCBI”是指美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)，Natl Library Med.(www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数含义，除非上下文另外清楚地指明。
本发明描述了用于制造异麦芽寡糖基质(substrate)，谷物或者块茎组合物的方法，所述方法包括：(a)用产麦芽酶和淀粉液化酶接触含有未糊化淀粉的基质，例如谷物或者块茎，以生成麦芽糖；(b)用转葡糖苷的酶接触所述麦芽糖，其中所述步骤(a)和所述步骤(b)发生的温度低于或者等于淀粉糊化温度；和(c)获得具有酶促生成的异麦芽寡糖的基质，谷物或者块茎组合物，其中所述寡糖来源于所述基质，谷物或者块茎。图1描述了本发明的一种实施方案。
本发明也描述了在等于或者低于糊化温度的温度，制造富含异麦芽寡糖的基质，谷物或者块茎组合物，粉末，口服再水合溶液，和/或食品添加剂的方法，其中将具有或含有未糊化淀粉和含有内源性产麦芽酶的基质与选自芽孢杆菌的溶解酶接触，产生麦芽糖糖浆。然后，在等于或者低于糊化温度或者液化温度的温度，将麦芽糖糖浆与转葡糖苷酶接触，产生具有异麦芽寡糖的谷物组合物。在一种实施方案中，该谷物组合物的特征在于，在糖组成中麦芽糖多于60％和分支糖的比大于2.0至1.0。从底物到IMO的转化可以酶促地产生。
本发明也描述了用于制造异麦芽寡糖基质，谷物或者块茎组合物的方法，该方法包括：(a)用产麦芽酶和淀粉液化酶接触含有淀粉的基质，谷物或者块茎，生成麦芽糖；(b)用转葡糖苷的酶接触麦芽糖，其中所述步骤(a)和所述步骤(b)发生的温度低于或者等于淀粉糊化温度；和(c)获得具有酶促生成的异麦芽寡糖的基质，谷物或者块茎组合物，其中所述寡糖来源于基质，谷物或者块茎。本发明可任选地进一步描述了将不溶性组成成分与可溶性组成成分分离的附加步骤。本发明进一步描述了干燥基质，谷物或者块茎组合物的附加步骤。在一种实施方案中，谷物选自小麦、黑麦、大麦、麦芽、荞麦、高梁(买罗高梁)、黍(鸭脚稗)和稻。在另一种实施方案中，产麦芽酶是β淀粉酶。在另一种实施方案中，产麦芽酶对于谷物来说是内源性的。在另一种实施方案中，淀粉液化酶是来源于杆菌的α淀粉酶。在另一种实施方案中，淀粉液化酶来源于地衣芽孢杆菌或者嗜热脂肪芽孢杆菌。在另一种实施方案中，转葡糖苷的酶是转葡糖苷酶。在另一种实施方案中，转葡糖苷酶来源于曲霉菌。在另一种实施方案中，曲霉菌是黑曲霉。本发明也描述了根据上面描述方法生成的谷物组合物、食品添加剂、口服再水合溶液和/或者粉末。
在另一种实施方案中，本发明描述了用于制造小麦谷物组合物的方法，所述方法包括：(a)将具有内源性产麦芽β淀粉酶的未糊化小麦谷物与来自杆菌的淀粉液化α淀粉酶接触，生成麦芽糖；(b)用转葡糖苷酶接触麦芽糖，其中所述步骤(a)和所述步骤(b)发生的温度低于或者等于淀粉糊化温度；和(c)获得具有酶促生成的异麦芽寡糖的小麦谷物组合物，其中所述寡糖来源于所述的未糊化谷物。图2描述了本发明的一种实施方案。
在另一种实施方案中，上面描述的方法可以被用于制造食品添加剂、焙烘产品、口服再水合溶液和/或者粉末。在另一种实施方案中，产麦芽酶是β淀粉酶。在另一种实施方案中，产麦芽酶对于谷物来说是内源性的。在另一种实施方案中，淀粉液化酶是来源于细菌来源的α淀粉酶。在另一种实施方案中，细菌来源是芽孢杆菌属。在另一种实施方案中，淀粉液化酶来源于地衣芽孢杆菌或者嗜热脂肪芽孢杆菌。在另一种实施方案中，转葡糖苷的酶是转葡糖苷酶。在另一种实施方案中，转葡糖苷酶来源于真菌来源。在另一种实施方案中，真菌来源是曲霉菌属。在另一种实施方案中，曲霉菌是黑曲霉。本发明也描述了根据上面描述方法生成的谷物组合物、食品添加剂、口服再水合溶液和/或者粉末。谷物组合物可以含有重量大于1％的至少一种异麦芽寡糖。所述的至少一种异麦芽寡糖可以选自异麦芽糖、4-α-葡糖基麦芽糖、异麦芽三糖。在本发明的进一步实施方案中，内源性产麦芽酶选自β淀粉酶或者α淀粉酶。在本发明的再进一步的实施方案中，溶解酶是来源于芽孢杆菌的液化α淀粉酶。在本发明的再进一步的实施方案中，液化淀粉酶来源于地衣芽孢杆菌或者嗜热脂肪芽孢杆菌。
基质(或者底物)(substrates)
本发明包括含有淀粉的基质，例如含有淀粉的谷物或者块茎，其与产麦芽酶和淀粉液化酶接触，产生麦芽糖。术语基质是指可以酶促地转变为麦芽糖并从而转变为MIO的物质。代表性的基质可以是选自谷物和块茎的至少一种基质。麦芽糖可以是富含麦芽糖的糖浆或者浆液的形式。
淀粉以两种形式存在，直链淀粉，一种线性链多糖，和支链淀粉，一种分支链多糖。直链淀粉含有长的不分支的链，其中所有D-葡萄糖单位由α-1，4-键(“α-1，4-键”或者“1，4-α-D-葡糖基键”)连接。支链淀粉是高度分支的，骨架的糖苷键是α-1，4键，但是分支点的糖苷键是α-1，6键。淀粉的主要成分可以以两种不同方式被酶促地水解。直链淀粉可以由α淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，例如，α-(1-4)-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(α-(1-4)-glucan 4-glucanohydrolase)水解。α淀粉酶水解α-(1，4)键，产生葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖和更高级的糖的混合物。直链淀粉也可以由β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)[α(1，4)-葡聚糖麦芽水解酶，1，4-α-D-葡聚糖麦芽水解酶]水解。此酶从非还原末端开始切掉连续的麦芽糖单位，定量地产生麦芽糖。α淀粉酶和β淀粉酶也水解支链淀粉。α淀粉酶和β淀粉酶均不能水解支链淀粉分支位置的α(1-6)键。β-淀粉酶对支链淀粉彻底作用的终产物是大的、高度分支的核心结构或者β极限糊精。脱支酶(E.C.3.2.1.41，例如，pullulanases，[α-(1-6)-葡聚糖6-葡聚糖水解酶，也称为α-(1，6)-葡糖苷酶])可以水解分支位置的α-(1-6)键。因此，β-淀粉酶和α1，6葡萄糖苷酶联合作用可以彻底降解支链淀粉为麦芽糖和葡萄糖，导致麦芽糖含量高达总含糖量的60％、65％、79％、75％、80％或者更高。
对于本发明的目的，含有淀粉的基质可以是谷物或者块茎或者其混合物。谷物可以是含有淀粉的任意谷类作物或者种子。基质可以被碾碎、磨碎或者否则减小其尺寸，以增加基质与各自的酶接触的表面面积。例如，依照需要，基质可以是被湿磨或者干磨的。在本发明的一种实施方案中，淀粉是颗粒状的淀粉。预期可以应用在本发明中的谷物包括，目前被用于烘焙、面团或者其它用途的任何谷物。预期的代表性谷物包括但不限于，选自下列中至少一种：小麦(小麦属，包括但不限于一粒小麦(T.monococcum)、圆锥小麦(T.turgidum)、斯卑尔脱小麦(T.spelta)和/或者普通小麦(T.aestivum))、大麦(例如，大麦(Hordeum vulgare)和美国专利6,492,576表1中描述的变种)、黑麦(黑麦属(Secale sp.)，包括但不限于黑麦(S.cereal))、玉米(玉米属，包括但不限于玉米(Zea mays))、荞麦(荞麦属，包括但不限于甜荞(F.esculentum))、麦芽(例如，发芽的大麦)、高梁(高梁属，包括但不限于高梁(Sorghum bicolor)或者另被称为买罗高梁、黍(鸭脚稗)(黍属和狗尾草属，包括但不限于黍(P.milaceum)；狗尾草属包括但不限于栗(S.italica))和稻(稻属，包括但不限于稻(Oryza sativa))。可以预期，野生型植物和具有有益特性的转基因植物，都可用作含淀粉的基质，所述的有益特性例如内源性酶水平增加或者外源性酶的存在。
发芽谷类，例如，麦芽，被用作许多食品和健康饮料配方的关键成分之一，原因是它们具有高营养价值，例如，含麦芽食品(表A)。发芽导致了内源性的产麦芽酶和蛋白水解酶的合成和活化。因此，发芽谷类是含内源性产麦芽酶的谷物的好的来源。麦芽粉和麦芽提取物也被用作酿造和烘培应用中的消化酶的来源。然而，大麦的发芽致使谷物成分太容易消化，以致于不能作为益生质(prebiotics)或者甚至作为营养保健物质(nutraceuticals)起有效作用，因为它们趋向于在到达下胃肠道之前全面地被消化。不幸的是，益生质化合物的有益作用在下胃肠道最得到认同。因此，将高度可消化的麦芽-糖类转化为较不易消化的异麦芽-糖类，使修饰的麦芽能够起到益生质的作用，使麦芽能够到达下胃肠道并提供额外的功能和健康益处。例如，表A提供了含有麦芽提取物的合适的商业上可获得的食品。
表A
含有麦芽提取物的商业食品
  商标名   制造商   地点
  HORLICKS   Glaxosmithkline   旁遮普，印度
  MALTOVA   Glaxosmithkline   旁遮普，印度
  VIVA   Glaxosmithkline   旁遮普，印度
  BOURNAVITA   Cadbury   孟买，印度
  BOOST   Jagjit Industries   旁遮普，印度
  MILO   Nestle   新德里，印度
因此，应用麦芽作为含淀粉的基质，将包含在该基质中的颗粒淀粉中的一些转变为寡糖的其它有益形式，例如，IMO。
另外，含淀粉的基质可以是块茎。可以预期的块茎包括马铃薯(茄属(Solanumsp.)，包括但不限于马铃薯(S.tuberosum))、甘薯(蕃薯属(Ipomoea sp.)，包括但不限于甘薯(Ipomoea batatas))、树薯[tapioca，cassava](木薯属(Manihot sp.)，包括但不限于木薯(Manihot esculenta、Manihot aipi和Manihot utilissima))和/或芋头根(芋属(Colocasia sp.)，包括但不限于C.esculenta或C.macrorhiza)。
含淀粉的基质可以是含水的浆体，特征是具有10％至50％的溶解固体(DS)浓度。在另一种实施方案中，含淀粉基质的特征是具有2％至90％的DS浓度。在另一种实施方案中，含淀粉基质的特征是具有5％至70％的DS浓度。在另一种实施方案中，含淀粉基质的特征是具有10％至60％的DS浓度。在另一种实施方案中，含淀粉基质的特征是具有20％至40％的DS浓度。在另一种实施方案中，含淀粉基质的特征是具有25％至35％的DS浓度。
在本发明的另一种实施方案中，含淀粉基质的pH是1.00至9.00之间。在本发明的另一种实施方案中，含淀粉基质的pH是2.00至8.00之间。在本发明的另一种实施方案中，含淀粉基质的pH是3.00至7.50之间。在本发明的另一种实施方案中，含淀粉基质的pH是4.00至6.50之间。在本发明的另一种实施方案中，含淀粉基质的pH是4.25至5.75之间。
酶
本发明包括，用产麦芽酶和淀粉液化酶接触含淀粉的基质，生成麦芽糖。“产麦芽”意味着酶可以酶促地转变淀粉为麦芽糖。代表性的产麦芽酶包括α淀粉酶和β淀粉酶。如前面所描述，直链淀粉可以被α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，例如，α-(1-4)-葡聚糖4-葡聚糖水解酶水解。α淀粉酶水解α-(1，4)-键，产生葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖和更高级糖的混合物。直链淀粉也可以被β淀粉酶(E.C.3.2.1.2)[α(1，4)-葡聚糖麦芽糖水解酶，1，4-α-D-葡聚糖麦芽糖水解酶]水解。此酶从非还原末端开始切掉连续的麦芽糖，产生一定数量的麦芽糖。α淀粉酶和β淀粉酶也水解支链淀粉。
α淀粉酶
在本发明所包括的一些实施方案中，α淀粉酶是真菌中的酶或者微生物中的酶，具有E.C.编号，E.C.3.2.1.1-3，特别是E.C.3.2.1.1。在一些实施方案中，α淀粉酶是耐热的真菌α淀粉酶。合适的α淀粉酶可以是天然发生的，也可以是重组和突变的α淀粉酶。在一些实施方案中，α淀粉酶来源于芽孢杆菌。优选的芽孢杆菌包括解淀粉芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌。在特别优选的实施方案中，α淀粉酶来源于曲霉菌。优选的曲霉菌包括黑曲霉和米曲霉菌。也参考NCIB 11837的菌株。
可用于本发明方法的商业上可得到的α淀粉酶包括CLARASE L([米曲霉]Genencor International Inc.)和NOVAMYL([嗜热脂肪芽孢杆菌]NovozymeBiotech.)。
本领域技术人员理解，用于本发明方法的α淀粉酶的量，取决于α淀粉酶的酶活性。一般来说，将α淀粉酶以大约0.01至5.0kg的量加入1公吨(MT)含淀粉的底物中。在一些实施方案中，α淀粉酶以每MT大约0.05至4.0kg的量被加入。在其它的实施方案中，α淀粉酶以每MT大约0.1至2.5kg，也可以每MT大约0.5至1.5kg的量被加入。在进一步的实施方案中，其它的量被应用。例如，通常地，大约0.01至1.5kg之间的量的CLARASE L(Genencor International Inc.)被加入1MT淀粉中。在其它的实施方案中，酶加入的量是，每MT淀粉CLARASEL大约0.05至1.0kg之间；大约0.1至0.6kg之间；大约0.2至0.6kg之间和大约0.4至0.6kg之间。
β淀粉酶
在本发明包括的一些实施方案中，产麦芽酶是β淀粉酶。虽然，从将含淀粉的基质与α淀粉酶接触会提供麦芽糖这个意义上说，α淀粉酶是产麦芽的，但是β淀粉酶的应用是有用的，这是因为它们和颗粒淀粉接触会提供更多量的麦芽糖而不是其它的糖类，例如葡萄糖。在一些实施方案中，β淀粉酶是植物酶或者微生物酶，具有E.C.编号，E.C.3.2.1.2(例如，美国专利4,970,158和4,647,538中描述的那些β淀粉酶)。在一些实施方案中，β淀粉酶是耐热的细菌β淀粉酶是。合适的β淀粉酶可以是天然发生的，也可以是重组和突变的β淀粉酶。术语“细菌的”是指来源于杆菌，例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、解淀粉芽孢杆菌和/或缓慢芽孢杆菌的酶。特别优选的β淀粉酶来源于芽孢杆菌菌株嗜热脂肪芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。也参考NCIB 11608菌株。术语“植物来源”是指，酶衍生、提取、分离、表达于植物来源，例如，大麦麦芽、大豆、小麦或者大麦。
商业上可得到的预期可用于本发明方法的β淀粉酶包括OPTIMAL BBA、Spezyme DBA和OPTIMAL ME(Genencor International Inc.)。其它商业上可得到的小麦β淀粉酶在本发明的方法中也是有用的。
在一些实施方案中，含淀粉的基质，例如，小麦、黑麦、大麦、麦芽，包含内源性的产麦芽酶，其水平足以产生足够的麦芽糖，用于转变为异麦芽寡糖。术语“内源性的”是指谷物或者块茎中存在的酶，无需向谷物加入产麦芽酶或者对谷物进行遗传修饰以提供产麦芽酶。
在含淀粉基质不包含内源性产麦芽酶或者内源性产麦芽酶水平低的实施方案中，例如，基质为稻、黍、高梁和/或玉米，任何的外源性产麦芽酶的等量加入也被发明人所预期。外源性的产麦芽酶可以被加入，例如，通过遗传学操纵宿主细胞以表达足够水平的产麦芽酶，和/或提供来自另一来源的产麦芽酶浓缩物或者产麦芽酶材料。术语外源性产麦芽酶是指谷物中不存在的产麦芽酶。在此实施方案中，产麦芽酶以足够的量接触于底物，以产生麦芽糖。
在一种实施方案中，与含淀粉基质接触的外源性产麦芽酶的量是，0.050至5.000糖化力程度(″DP°″)单位/克的产麦芽酶。在本发明的另一种实施方案中，将0.100至2.000DP°单位/克的产麦芽酶与含淀粉谷物接触。在又一种实施方案中，将0.100至3.000DP°单位/克的产麦芽酶与含淀粉谷物接触。
在另一种实施方案中，接触于含淀粉基质的外源性产麦芽酶的量是以每公吨底物产麦芽酶的千克数表示的。在一种实施方案中，接触于基质的外源性产麦芽酶的量是每公吨干固体成分(dry solid basis)中产麦芽酶大约0.05kg(″kg/mt dsb″)。在另一种实施方案中，外源性产麦芽酶的量是每公吨干固体成分中产麦芽酶大约0.1kg(″kg/mt dsb″)。在其它的实施方案中，0.2、0.4、0.6、0.8和/或1.0kg/mt dsb提供了足量的产麦芽酶，例如，β-淀粉酶。
在另一种实施方案中，接触于含淀粉基质的外源性产麦芽酶的量是以每公吨基质产麦芽酶的千克数表示的。在一种实施方案中，接触于基质的外源性产麦芽酶的量是每公吨溶解淀粉成分(dissolved starch basis)中产麦芽酶大约0.05kg(″kg/mt dsb″)。在另一种实施方案中，外源性产麦芽酶的量是每公吨溶解淀粉成分中产麦芽酶大约0.1kg(″kg/mt dsb″)。在其它的实施方案中，0.2、0.4、0.6、0.8和/或1.0kg/mt溶解淀粉成分提供了足量的产麦芽酶，例如，β-淀粉酶。
在另一种实施方案中，要与谷物接触的产麦芽酶量是用产麦芽酶单位来表示的。用于测定产麦芽活性的分析包括在实施例中描述的那些分析和描述β淀粉酶活性的那些分析。术语DP°单位是指包含在5％的样品酶制备物溶液0.10ml中的酶量，当与100ml底物在20℃(68F°)温育1小时时，会产生足够的还原糖，以还原Fehling′s溶液5ml。
在另一种实施方案中，具有内源性产麦芽酶的谷物(大麦、小麦等)可以和需要外源性产麦芽酶的那些谷物混合。发明人预期了，具有内源性产麦芽酶的谷物与利用外源性产麦芽酶的谷物之比为30∶70、60∶40、50∶50、60∶40、70∶30的混合物，条件是混合物中存在足够量的产麦芽酶(内源性来源或者外源性来源)。应用内源性来源的产麦芽酶，可以减少加入到谷物混合物或者与谷物混合物接触的外源性酶的量。
淀粉液化酶(starch liquefying enzymes)
将淀粉液化酶与淀粉接触，以降低液化的淀粉或者溶解的淀粉的粘性。在本发明的一种实施方案中，淀粉液化酶是选自E.C.3.2.1.1的酶，例如，α淀粉酶。代表性的α淀粉酶可以衍生、分离或者提取自细菌来源。在一种实施方案中，细菌来源是杆菌。在另一种实施方案中，来源于杆菌的α淀粉酶包括那些衍生于选自下列的至少一种细菌来源的酶：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和缓慢芽孢杆菌。地衣芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌中的那些酶特别有用。发明人预期了其它的淀粉酶，例如但不限于EC3.2.1.133(美国专利6,361,809号)的那些。其它被发明人预期的淀粉酶包括，特征是氧化或者热稳定增加的酶，包括在美国专利5,763,385；5,824,532；5,958,739和/或6,008,026中的那些突变体或者遗传修饰的淀粉酶或者变异的淀粉酶。有用的α淀粉酶是那些源于地衣芽孢杆菌株NCIB 8059、ATCC 6598、ATCC 6634、ATCC8480、ATCC 9945A、ATCC 11945的酶。有用的α淀粉酶是那些源于嗜热脂肪芽孢杆菌株ATCC 39709的酶。这样的酶包括商标名为“SPEZYME AA”或者“SPEZYME FRED”、“SPEZYME LT300”和“SPEZYME LT75”的酶，可以从Genencor International(Palo Also，California，USA)得到。其它这样的酶包括来自嗜热脂肪芽孢杆菌的α淀粉酶，其以商标名GZYME G997、GC007出售，和来自地衣芽孢杆菌的α淀粉酶，其以商标名GC262SP出售，也可以从GenencorInternational得到。
将产麦芽酶和淀粉液化酶与含淀粉的谷物接触，产生麦芽糖。如本领域的技术人员所理解，用于本发明方法的淀粉液化酶的量，将取决于淀粉液化酶的酶活性。在一种实施方案中，将淀粉液化酶以0.01至25Liquefon单位/gm的量与含淀粉的谷物接触。在另一种实施方案中，将1至10Liquefon单位/gm的淀粉液化酶与含淀粉的谷物接触。一个Liquefon单位(LU)是使碘溶液产生颜色变化所需要的消化时间的量度，这表示的是在特定条件下淀粉底物糊精化的特定时段。
在一种实施方案中，将0.1kg淀粉液化酶加入每公吨的谷物溶解固体成分(grain dissolved solid basis)(kg/mt dsb)。在其它的实施方案中，将0.2、0.4、0.6、0.8或者1.0kg淀粉液化酶加入每公吨谷物(kg/mt溶解淀粉成分)。在一种实施方案中，将0.1kg淀粉液化酶加入每公吨的谷物溶解淀粉成分(kg/mt溶解淀粉成分)。在其它的实施方案中，将0.2、0.4、0.6、0.8或者1.0kg淀粉液化酶加入每公吨谷物(kg/mt溶解淀粉成分)。用于确定淀粉液化活性的分析包括，在此处的实施例中描述的那些。用于α淀粉酶活性测定的代表性的分析也在美国专利5,763,385；5,824,532；5,958,739和/或6,008,026中描述，这些专利在此并入为参考。
转葡糖苷的酶(Transglucosidic enzyme)
将麦芽糖与转葡糖苷的酶接触，获得具有来源于含淀粉谷物的酶促生成的异麦芽寡糖的谷物组合物。当与α-D-葡糖-寡糖温育时，转葡糖苷的酶催化水解反应和转移反应，产生异麦芽糖、4-α-葡糖基麦芽糖、曲二糖或者黑曲霉糖(nigerose)。DP2二糖的增加量提示了这些糖的存在和因此由转葡糖苷的酶介导的转化。转葡糖苷的酶(E.C.2.4.1.24)可以是转葡糖苷酶(transglucosidase)。代表性的转葡糖苷酶有TRANSGLUCOSIDASE L-1000(Genencor International，Inc.)和AmanoEnzymes，Inc.，(Nagoya，Japan)的TRANSGLUCOSIDE L。在一种实施方案中，转葡糖苷的酶来源于丝状真菌来源，例如，曲霉菌属。来源于曲霉菌的转葡糖苷的酶可以来源于黑曲霉。在一种实施方案中，黑曲霉菌株是ATCC14916。
在一种实施方案中，将足够量的转葡糖苷的酶与基质，例如含淀粉的谷物接触，产生麦芽糖。如本领域技术人员所理解，用于本发明方法的转葡糖苷的酶的量，将取决于α淀粉酶的酶活性。在一种实施方案中，将0.01至25.00转葡糖苷酶单位(“TGU”)/gm的转葡糖苷酶与含淀粉的谷物接触。在本发明的另一种实施方案中，将0.05TGU至10.00TGU/gm的转葡糖苷酶与含淀粉的谷物接触。在本发明的又一种实施方案中，将0.10TGU至5.00TGU/gm的转葡糖苷酶与含淀粉的谷物接触。术语TGU是指在分析条件下，每分钟产生1微摩尔4-α-葡糖基麦芽糖所需的酶活性。
在一种实施方案中，将0.05至6.00kg转葡糖苷的酶加入每公吨谷物(kg/mtdsb)。在另一种实施方案中，将0.10至5.00kg转葡糖苷的酶加入每公吨谷物(kg/mtdsb)。在另一种实施方案中，将0.25至3.00kg转葡糖苷的酶加入每公吨谷物(kg/mtdsb)。在另一种实施方案中，将0.50至1.50kg转葡糖苷的酶加入每公吨谷物(kg/mtdsb)。用于确定转葡糖苷活性的其它分析包括，那些在实施例中描述和在Shetty，J.，et al(美国专利4,575,487(1986)，题目是″Method for determination oftransglucosidase″)中描述的分析，它们在此并入为参考。
在一种实施方案中，将0.05至6.00kg转葡糖苷的酶加入每公吨溶解淀粉(kg/mt淀粉dsb)。在另一种实施方案中，将0.10至5.00kg转葡糖苷的酶加入每公吨谷物(kg/mt淀粉dsb)。在另一种实施方案中，将0.25至3.00kg转葡糖苷的酶加入每公吨谷物(kg/mt dsb)。在另一种实施方案中，将0.50至1.50kg转葡糖苷的酶加入每公吨谷物(kg/mt淀粉dsb)。
作为转葡糖苷酶作用的结果，麦芽-寡糖被转变为异麦芽-寡糖，形成新的类别的多糖，其含有更高比例的在非还原末端与葡萄糖分子的一级羟基基团连接的葡糖基残基。此方法产生的异麦芽-寡糖包括异麦芽糖、4-α-葡糖基麦芽糖、异麦芽-三糖、异麦芽-四糖、异麦芽-五糖、异麦芽-己糖和异麦芽-庚糖。这些糖作为食品添加剂得到了越来越多的关注，因为它们帮助预防龋齿(Oshima，et.al 1988，Thecaries inhibitory effects of gos-sugar in vitro and rat experiments.Microbial Immunol.32.1093-1105))和改善人肠道菌群，作为双歧杆菌的生长因子(益生质)而起作用(Komoto，et.al 1988；Effect of Isomalto-oligosaccharides on human fecal flora，Bifidobacteria Micro flora 7，61-69)。
为了确定IMO的产生，可以应用试验和/或其它分析方法，来确定产生的IMO的量。确定生成的IMO的水平的一种方法包括高效液相色谱(HPLC)。例如，混合物的分析可以提供对由该方法产生的各种糖的水平的提示。有用的评价是混合物的聚合程度(DP)。术语聚合程度是分子中葡萄糖残基数的相对量的量度。例如，葡萄糖(一个葡糖基单位，最低的聚合水平)通常被认为是DPI。异麦芽-寡糖通常被认为是DP2(两个葡萄糖单位)。在一种实施方案中，谷物组合物含有重量大于至少1％、至少5％、至少25％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％的至少一种异麦芽-寡糖。在一种实施方案中，所述的至少一种异麦芽-寡糖选自异麦芽糖、4-α-葡糖基麦芽糖和/或异麦芽-三糖。在一种实施方案中，谷物组合物中生成的异麦芽-寡糖的量占谷物组合物的1％至99％之间。在一种实施方案中，谷物组合物中生成的异麦芽-寡糖的量占谷物组合物的1％至90％之间。在一种实施方案中，谷物组合物中生成的异麦芽-寡糖的量占谷物组合物的1％至80％之间。在一种实施方案中，谷物组合物中生成的异麦芽-寡糖的量占谷物组合物的1％至70％之间。在本发明的一种实施方案中，上述程序之后的谷物组合物中存在的总糖，包括占总糖含量的大于50％、大于60％、大于70％或大于80％的麦芽糖水平。大于50％的麦芽糖水平包括从50％至85％、从55％至80％和/或从60％至75％的范围。术语RBS比是指谷物中存在的麦芽糖(DP2)与得到的谷物组合物中存在的麦芽三糖(DP3)水平的比。更高的PBS值提示，存在更高量的麦芽糖和因此淀粉更彻底地转变为麦芽糖，这与存在其它的较不需要的终产品如麦芽三糖是不同的。在一种实施方案中，RBS比大于2.0。在一种实施方案中，RBS比大于3.0、大于4.0。代表性的范围包括，2.0至50.00、2.0至30.00和/或2.0至10.00的RBS比。实施例中描述了各种RBS比。已指出，液化淀粉被商业上的β淀粉酶(大麦或者小麦)水解，通常产生的麦芽糖含量在55％至65％之间。为了应用液化淀粉得到大于50％的麦芽糖含量，之前需要加入脱支酶和/或者液化淀粉的非常低的起始DE。可任选地，加入脱支酶可以用于增加麦芽糖的产生。术语脱支酶是指催化α-1，6-键的水解的酶。就这一点，E.C.3.2.1.41类的酶是有用的。此类的代表性酶是pullanase，也称为α-糊精内切-1，6-α葡糖苷酶、极限糊精酶、脱支酶、支链淀粉1，6-葡聚糖水解酶。
将含淀粉的谷物与产麦芽酶接触，生成麦芽糖，并将麦芽糖与转葡糖苷的酶接触，其发生时的温度低于所使用的谷物的淀粉的糊化温度。将基质与分别的酶接触或者温育，温育时间为至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少30小时和/或至少36小时。至少一个被提及的时间的期间是指12-80小时、至少18-60小时和/或至少24-48小时的期间。术语温育时间是指麦芽糖或者底物转变为IMO的时间期间。可以将转糖苷的酶与基质例如含淀粉的谷物、产麦芽酶例如α淀粉酶或者β淀粉酶，和/或液化酶，例如α淀粉酶分别或者同时接触或加入。在一种实施方案中，转糖苷的酶和液化酶同时加入。因此在一种实施方案中，步骤(a)和步骤(b)同时进行。在另一种实施方案中，步骤(a)和步骤(b)按顺序或者分别进行。在另一种实施方案中，步骤(a)早于步骤(b)进行。术语糊化温度是指谷物中含有的淀粉改变相或者形成凝胶状的温度。尽管具体的温度依谷物不同而有所不同的，但足以使得淀粉糊化的温度包括大于45℃、大于50℃、大于60℃、大于70℃、大于80℃和/或大于90℃的温度。大于指出的糊化温度的代表性温度包括45℃至120℃、50℃至110℃、50°至100℃。在一种实施方案中，例如，小麦，糊化温度是谷物被保持在低于，例如，选自低于50℃至70℃的温度，在另一种实施方案中，低于55℃至65℃，在另一种实施方案中，低于60℃。例如，已经描述了玉米、马铃薯、小麦、木薯、蜡质玉米、高梁、稻、西贡米、竹芋、淀粉玉米(arrowroot amylomaize)和/或甘薯的糊化温度，如表1中所显示(Beynum，G.M.A and Roels，J.A.，Starch Conversion Technology(Marcel Dekker，Inc.，New York，New York(1985)，pp.15-45)：
表1
  淀粉  Kolfier糊化温度范围(℃)  Brabenber糊化温度(℃)
  玉米  62-67-72  75-80
  马铃薯  58-63-68  60-65
  小麦  58-61-64  80-85
  木薯  59-64-69  65-70
  蜡质玉米  63-68-72  65-70
  高梁   68-74-78   75-80
  稻   68-74-78   70-75
  西贡米   60-66-72   65-70
  竹芋   62-66-70
  淀粉玉米   67-80-92   90-95
  甘薯   58-65-72   65-70
在本发明的另一种实施方案中，温育时间过后，浆体可以进行一段时期的快速加热，其足以中止进一步的酶活性，但是并不使浆体糊化或者液化。例如，可以将浆体加热至80℃、85℃、90℃、95℃或者100℃的温度，持续时间为5-60分钟、10.0至40.0分钟或者30.0分钟。
本发明的另一种实施方案进一步包括，将浆体分离为不溶物和可溶物的步骤。分离步骤可以是本领域中已知的任何色谱分析方法，例如但不限于HPLC，大小排阻和/或者电荷层析。过滤可以被用于将可溶物与不溶物分离。不溶物或者全部浆体可以进行本申请中随后描述的干燥步骤。在另一种实施方案中，从分离步骤中得到的可溶物，可以通过蒸发例如旋转蒸发、盘式烘燥等而浓缩。蒸发后的浓缩物可以进行炭处理(通过炭粒进行过滤)和/或进一步的色谱处理，以提供分离的IMO液体浓缩物。分离的IMO浓缩物可以具有大于75％、大于80％、大于90％、大于95％、大于97％和/或大于99％的IMO浓度。
本发明的另一种实施方案是，在口服再水合溶液中应用或者整合进这种糖浆(酶促地来源于具有未糊化淀粉的基质的异麦芽-寡糖)。异麦芽-寡糖的量可以是美国专利4,981,687；5,096,894和/或5,733,579中描述的量或者配方。
本发明的另一种实施方案是，干燥前述的异麦芽-寡糖基质，谷物或者块茎组合物，产生含有谷物组合物的粉末。典型地，干燥步骤通过加热而加速。通过应用合适的干燥方法，例如但不限于喷射式干燥器、盘式烘燥器、转筒式干燥机、转鼓式干燥器或者箱式干燥机，谷物组合物可以被干燥为所需的潮湿水平。可以应用其它的干燥方法学，例如喷射干燥、降压蒸发干燥。
通过干燥谷物组合物、浆体、分离的不溶物和/或分离的可溶物，从中得到粉末或者其它的干燥粉末。可以将得到的粉末或者粉状物并入需要异麦芽-寡糖的组合物，例如，食品(早餐谷类，干面包)、食品添加剂和烘焙制品中。术语食品添加剂是指将异麦芽-寡糖散布于材料上，将其用作制造其它食品时的配料，和/或作为加入到食品的局部成分应用。
在另一种实施方案中，干燥的粉末可以被并入食物增补剂(food supplements)。可以以任何可接受的增补或者形式将干燥的粉末并入食物增补剂。饮食增补剂可以在基质中配制成适于口服施用的形式，例如但不限于，药粉、晶体、粒状物、微粒(包括尺寸为微米级别的颗粒，如微球体和微胶囊)、颗粒(包括尺寸为微米级别的颗粒)、珠、微珠、小球、丸剂、微片剂、压缩片剂或者研磨片剂(tablettriturates)、模制片剂或者片剂研磨物(tablet triturates)，还可以配制于胶囊中，其是硬或软的，并且含有形式为粉末、颗粒、珠、溶液或者悬浮物的组合物。饮食增补剂也可以在含水液体中配制成用于口服的溶液或者悬浮液，可以是整入到胶囊中的液体，或者可以配制成适于施用或者适于直肠施用的任何其它方便的形式，例如栓剂、灌肠剂或者其它方便的形式。异麦芽-寡糖组合物也可以作为可控制的释放系统而被提供。
饮食增补剂制剂也可以包括任何类型的可接受的赋形剂、添加剂或者载体。例如，但不是为了限制，稀释剂或者填充剂，如葡萄糖结合剂(dextrates)、磷酸二钙、硫酸钙、乳糖、纤维素、高岭土、甘露醇、氯化钠、干淀粉、山梨醇、蔗糖、肌醇、糖粉、膨润土、微晶纤维素或者羟丙基甲基纤维素，可以被加入异麦芽-寡糖组合物，以增加组合物的体积。同样，粘合剂例如但不限于，淀粉、明胶、蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糖蜜、乳糖、阿拉伯树胶、藻酸钠、爱尔兰藓(角叉菜)提取物、panwar胶、茄替(ghatti)胶、isapgol husks胶黏液、羧甲基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硅酸镁铝(改性)(veegum)和淀粉阿拉伯半乳聚糖、聚乙二醇、甲基纤维素、单硬脂酸甘油酯和蜡，可以被加入制剂，以增加其黏附性质。
另外地，润滑剂，例如但不限于，甘油单硬脂酸酯、滑石、硬脂酸镁15、硬脂酸钙、硬脂酸、氢化植物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、醋酸钠、氯化钠、亮氨酸、碳蜡(carbowax)、月桂硫酸钠(sodium laurylsulfate)和月桂硫酸镁可以被加入制剂。同样，助流剂，例如但不限于二氧化硅胶质、硅酸锰或者云母可以被加入，以改善粉末制剂的流动性质。最后，崩解剂，例如但不限于，淀粉、粘土、纤维素、褐藻酸、树脂、交联的聚合物(例如，交联羧甲纤维素、交聚维酮和淀粉乙醇酸钠)、硅酸镁铝(改性)、甲基纤维素、琼脂、膨润土、纤维素和木材制品、天然海绵(natural sponge)、阳离子交换树脂、褐藻酸、瓜尔胶、柑橘果肉(citruspulp)、羧甲基纤维素或者带有淀粉的月桂硫酸钠，也可以被加入，以协助制剂在胃或者肠中分解。
本发明的另一种实施方案是，将此处描述的新的基质，块茎或者谷物组合物，应用于面粉的生产，所述的面粉用于各种烘焙制品。术语烘焙制品涉及发酵的制品和未发酵的制品。术语“发酵的”是指在烘焙过程中应用了酵母的烘焙制品。而术语“未发酵”是指在烘焙过程中不应用酵母的烘焙制品。代表性的制品包括面包、饼干、蛋糕、馅饼、点心、naan、百吉饼、意大利面食、薄脆饼干、卷制品、油炸圈饼、皮塔饼和面粉糕饼。代表性的未发酵物品包括无酵饼、印度薄饼、早餐谷类食品和玉米粉圆饼。本发明的另一种实施方案是，将新的谷物组合物应用于面食，例如面条(短通心面、实心细面条、宽面条、玉米面条等)。本发明的另一种实施方案是，根据上述方法制成的基质，块茎或者谷物组合物。本发明的另一种实施方案是，包含根据上述方法制成的基质，块茎或者谷物组合物的面粉。本发明的另一种实施方案是，包含上述的异麦芽-寡糖的口服再水合溶液。根据上述方法，可以制成包含基质，块茎或者谷物组合物的粉末。本发明的另一种实施方案是，根据上述方法制成的基质、块茎或者谷物组合物。
本发明的另一种实施方案是，根据上述方法制成的基质，块茎或者谷物组合物。本发明的另一种实施方案是，将新的谷物组合物应用于发酵/啤酒麦芽汁或者基质中。例如，新的谷物组合物可以如所描述地用于啤酒发酵，如国际公开号WO02/20712A1中所描述，其在此并入为参考。新的谷物组合物也可以整入啤酒添加剂。
含异麦芽-寡糖的基质还可以进行额外的步骤，通过生成的麦芽糖例如麦芽糖浆的提取和分离，回收麦芽糖。可以通过本领域熟悉的方法，将糖浆从谷物组合物中提取和/或分离，例如在美国专利3,922,196和4,113,509中的方法，其在此并入为参考。
增加甜度或者异麦芽-寡糖含量的另一途径是，用水解酶(以可溶形式或者固定化的形式)处理产生的异麦芽-寡糖糖浆，水解酶优选地或者甚至是专一地水解麦芽-寡糖，并且对异麦芽-寡糖仅有小的亲和力或者没有亲和力。这种酶的例子是来自黑曲霉或者其它来源如曲霉菌属或者根霉菌属的葡糖淀粉酶，其优选地水解麦芽-寡糖(Manjunath P.，Shenoy B.C.，Raghavendra Rao M.R.，Journal of AppliedBiochemistry，5(1983)，235-260；Meagher M.M.，et al.，Biotechnology andBioengineering，34(1989)，681-693；Pazur J.H.，Kleppe K.，The Journal of BiologicalChemistry，237(4)(1962)，1002-1006；Hiromi K.，Nitta Y.，et al.，Biochimica etBiophysica Acta，302(1973)，362-37)。
也可以应用如来自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-D-吡喃葡糖苷酶的酶。此酶不能水解异麦芽-寡糖，仅降解富含异麦芽-寡糖的糖浆中存在的麦芽-寡糖(Suzuki Y.，Shinji M.，Nobuyuki E.，Biochimica et Biophysica Acta，787(1984)，281-289)。也可以应用被称为麦芽糖酶的其它的α-D-葡糖苷酶。例如，来自酵母的麦芽糖酶仅会水解麦芽糖和较少程度地水解麦芽三糖(Kelly C.T.，Fogarty W.M.，ProcessBiochemistry，May/June(1983)，6-12)。麦芽-寡糖水解为葡萄糖之后，通过色谱技术或者通过纳米过滤或者超滤技术，糖浆可以富集异麦芽-寡糖。
下面的实施例是为了说明本发明的主要实施方案。
实施例
下面的具体实施例进一步说明了本发明的组合物和方法。应该理解，这些实施例仅是为了说明目的，它们可以应用于富含淀粉和含有内源性的麦芽糖生成酶的其它合适物质，例如，小麦、稻、大麦、麦芽、马铃薯、甘薯等。
酶活性测定
转糖苷酶活性是通过Shetty，J.，et al，1986(美国专利4,575,487)的方法测定的。
通过在pH 4.6和20℃，水解淀粉底物30分钟，测定β淀粉酶的活性。水解产生的还原糖基团在应用碱性铁氰化物的滴定程序中被测定。淀粉酶活性表示为DP程度，其一个单位是指包含在样品酶制备物的5％溶液0.1ml中的酶量，当其与100ml底物在20℃温育1小时时，会生成足以还原5ml Fehlings’溶液的还原糖。
基于Megazyme(Aust.)Pty.Ltd提供的终止点分析试剂盒(end-point assay kit)，测定α淀粉酶活性。将一小瓶底物(p-硝基苯基麦芽七糖苷，BPNPG7)溶解在10ml无菌水中，随之在分析缓冲液(50mM马来酸缓冲液，pH 6.7，5mM氯化钙，0.002％吐温20)中进行1∶4的稀释。在25℃，向透明容器中的790μl底物中加入10μl的淀粉酶，进行分析。水解的速率被测定为75秒的延迟之后410nm处的吸光度的变化速率。该分析是线性的，直至0.2个吸收单位/分钟的速率。
应用牛血清白蛋白标准，基于Bradford，Anal.Biochem.，Vol.72，p.248(1976)的方法，用标准的Bio-Rad Assay(Bio-Rad Laboratories)，测定α淀粉酶的蛋白浓度。
底物(基质)
在所有实施例中被用作底物(基质)的小麦粉，从零售商店买到。其它的块茎或者谷物底物，例如，用作底物的稻和大麦可以从商业来源购得(Huai An LiujunFood processing company，Jiangshu province，China)。
寡糖分析
通过配有HPLC柱(Rezex 8u8％H，单糖(Monosaccharides))的HPLC(Agilent1010，Palo Alto，California，USA)，其被维持在60℃并配有折射率(RI)检测器(ERC-7515A，RI Detector，来自The Anspec Company，Inc.)，测定寡糖反应产物的组成。将稀释的硫酸(0.01N)用作流动相，流速为每分钟0.6ml。将20微升4.0％溶液注到柱上。该柱根据糖的分子量进行分离。例如，DP1的意义为单糖，如葡萄糖；DP2的意义为二糖，如麦芽糖；DP3的意义为三糖，如麦芽三糖；DP4+的意义为聚合程度(DP)是4或者更多的寡糖。术语高级糖(higher sugar，″Hr.Sugar″)是指DP大于3的糖。
对于异糖(iso-saccharides)或者分支糖(branched sugars)，通过配有HPLC柱(Shodex Rspak Oligosaccharide Column#DC-613)的HPLC(Agilent 1010，PaloAlto，California，USA)，其被维持在50℃并配有折射率(RI)检测器(ERC-7515A，RI Detector，来自The Anspec Company，Inc.)，反应产物得以测定。70(乙腈)∶25(甲醇)∶5水用作流动相，流速是每分钟2.5ml。将20微升4.0％溶液注在柱上。该柱根据糖的分子量进行分离。标准的糖，葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、异麦芽糖、4-α-葡糖基麦芽糖和异麦芽-三糖(Sigma Chemicals，St.Louis，Missouri，USA)被用来对柱进行校准。
实施例1
比较来自地衣芽孢杆菌的α淀粉酶(由Genencor International，Palo Alto，CA出售的一种α淀粉酶，商标名是GC262SP)和来自嗜热脂肪芽孢杆菌的α淀粉酶(由Genencor International，Palo Alto，CA出售的一种α淀粉酶，商标名是GC007)利用小麦粉进行的麦芽糖生产。将来自商业零售来源的小麦粉150克悬浮于450ml去离子水中。室温搅拌悬浮液15分钟，以均匀混合(pH 5.5)。用6.0N硫酸(H2SO4)调整pH值。将得到的悬浮液保持在水浴中，维持在60℃，并且在酶加入之前搅拌以均匀混合。在60℃持续搅拌下，分别加入来自嗜热脂肪芽孢杆菌的淀粉酶大约6000LU/g(0.6kg的GC007[来自Genencor International.Inc.]/公吨(Mt.)淀粉dsb)和来自地衣芽孢杆菌的淀粉酶15,100LU/g(0.6kg的GC262 SP[来自GenencorInternational.Inc.]/Mt.淀粉dsb)，并温育。在预先确定的不同时间间隔收取样品并用高压液相色谱(HPLC)分析总糖组分。在预先确定的时间间隔，用塑料移液管从每一容器中取出2ml样品，转移至离心管中。将样品在8000prm离心3分钟。从离心管收取上清液并将几滴加入Lecia AR200(Leica Microsystems，Inc.，Buffalo，NY，USA)数字手持折光仪的样品孔中，并作记录(表2)。测定溶液的Brix(作为溶解的糖的测定值)(表2)。
表2
小麦粉温育期间，液化α淀粉酶对麦芽糖生成的比较，pH5.5，60℃
Figure BDA0000145138470000241
Figure BDA0000145138470000251
表2中的结果显示，与同来自地衣芽孢杆菌的α淀粉酶温育时的麦芽糖含量相比，同来自嗜热脂肪芽孢杆菌的α淀粉酶温育时小麦粉生成了更高的麦芽糖含量。与不加入α淀粉酶时小麦粉的温育相比，小麦粉和α淀粉酶的温育导致由于颗粒淀粉水解而获得的溶解固体显著增加。在此感兴趣地指出，与来自地衣芽孢杆菌的α淀粉酶相比，来自嗜热脂肪芽孢杆菌的α淀粉酶的反应产物导致麦芽糖与葡萄糖以及麦芽糖与麦芽三糖的比率更高。这些结果提示，来自地衣芽孢杆菌的α淀粉酶在产生很高含量麦芽糖的糖浆方面是特别有用的酶。
实施例2
同小麦粉温育期间，地衣芽孢杆菌α淀粉酶(由Genencor international，PaloAlto，CA出售的α淀粉酶，商标名是GC 007)浓度对麦芽糖生成的影响。实验条件与实施例1中所说明的一致。此外，嗜热脂肪芽孢杆菌(6,000单位/克)以0.1Kg、0.2Kg和0.6Kg/MT淀粉dsb被加入。结果总结于表3中。
表3
小麦粉温育期间，α淀粉酶[GC007]浓度对麦芽糖生成的影响，pH5.5，60℃
Figure BDA0000145138470000252
在小麦粉温育期间，没有观察到α淀粉酶的不同水平对麦芽糖含量或者对溶解固体有显著影响。因此，对于进一步的优化研究，应用0.1Kg GC007/MT淀粉，dsb。
实施例3
将小麦粉150克悬浮于去离子水450ml中，并且用6.0N H2SO4将pH值调节为pH5.00、4.50和4.00。充分振荡浆液使均匀混合，调节pH直至稳定在特定的pH值。以0.1Kgs/MT淀粉dsb的量将GC007加入每一实验组，并在60℃温育。在预先确定的不同时间间隔抽取样品，测定糖的组成和brix，如实施例1所描述。(表4)。
表4
小麦粉和GC007温育期间，pH对麦芽糖产量的影响
Figure BDA0000145138470000261
当小麦粉温育时的pH值从5.5降低，麦芽糖含量增加，并且在pH4.5时达到最大，大约68％，接着在pH 4.0时降低。在应用植物β淀粉酶进行淀粉水解的期间，不加入脱支酶而产生了大于60％的麦芽糖含量，这是个意外的结果。液化的淀粉通过商业β淀粉酶(大麦或者小麦)的水解，通常产生含量在55％和60％之间的麦芽糖。为了应用液化的淀粉得到大于60％的麦芽糖含量，需要加入脱支酶或者需要液化的淀粉极低的起始DE。重要的是，在此要指出，本发明所描述的方法允许麦芽糖制造商在pH 4.5和60℃进行生产，以降低目前方法的微生物污染的高风险。
实施例4
将小麦粉150克悬浮于去离子水450ml中，并且将浆液的pH值调节至pH4.5。充分振荡浆液使均匀混合并且用6.0N H2SO4调节pH直至pH值稳定。将得到的悬浮液保持在水浴中，维持在60℃，在酶加入之前振荡使均匀混合。加入淀粉液化酶，例如，嗜热脂肪芽孢杆菌α淀粉酶，其出售时的商标名是“GC 007”(GenencorInternational，Inc.)，量为0.1Kg/MT，dsb。然后，以0.25Kg、0.5Kg和1.0Kg/MT dsb的量加入脱支酶，该脱支酶为以商标名OPTIMAX L-1000(Genencor International，Inc.)出售的pullulanase，并在60℃温育。在预先确定的不同时间间隔(2、4、6和24小时)抽取样品，测定糖的组成和brix，如实施例1所描述。记录结果(表5)。
表5
小麦粉和GC007(0.1Kg/MT，dsb)温育期间，脱支酶(OPTIMAXL-1000)对麦芽糖产量的影响，pH4.5，60℃
Figure BDA0000145138470000271
Figure BDA0000145138470000281
产麦芽酶(如β淀粉酶)或者淀粉液化α淀粉酶(如GC007)不能水解α1-6糖苷键，其为分支淀粉淀粉底物中的分支点。因此，在通常的实践中，在淀粉底物和β淀粉酶温育期间，加入脱支酶，pullulanase(OPTIMAX L-1000，来自GenencorInternational Inc)，用于产生大于65％的麦芽糖。小麦粉和GC007孵育期间，OPTIMAX L-1000浓度的影响被研究，结果显示在表5中。与对照相比，OPTIMAXL-1000的加入导致了显著更高的麦芽糖(DP2)水平(＞75％)。
实施例5
在工业上，应用通过利用高温(＞90℃)酶液化的淀粉底物的酶促方法所产生的高麦芽糖糖浆，继而用葡萄糖基转移酶处理以产生异麦芽-寡糖糖浆，通常是常见的实践。本实施例说明了在单个步骤中转变小麦粉中的颗粒淀粉为异麦芽-寡糖的方法。在本实施例中，将小麦粉275克放置在烧瓶中并加入去离子水688ml。然后，振荡15分钟以均匀混合，然后，用6.ON H2SO4将pH调节至4.5。将得到的悬浮液保持在水浴中，维持在60℃，在加入酶之前振荡以均匀混合。加入淀粉液化酶，例如嗜热脂肪芽孢杆菌α淀粉酶([由Genencor International提供的GC007](0.1Kgs/MT dsb)和脱支酶，例如pullulanase(由Genencor International提供的OPTIMAX L-1000)(0.5kgs/MT dsb)。而后，将悬浮液分为两个等份。对于该两份中的一份，加入以商标名“TRANSGLUCOSIDASE L-500”出售的黑曲霉转葡糖苷酶(Genencor International)，量为1.0Kg/MT dsb，并且保持在水浴中，维持在60℃(样品1)。另一份先在60℃温育四小时，随后加入以商标名“TRANSGLUCOSIDASE L-500”出售的黑曲霉转葡糖苷酶(GenencorInternational)，量为1.0Kg/MT dsb，并且保持在水浴中，维持在60℃(样品2)。表6中显示的结果提示，底物到IMO的转变发生，其伴随或者不伴随着加入转葡糖苷酶之前底物(小麦粉)的预温育。
表6
在小麦粉与GC007和OPTIMAXL-1000孵育期间，异麦芽-寡糖的形成，pH4.5，60℃，利用TRANSGLUCOSIDASE L-500
Figure BDA0000145138470000291
IMO数：计算为异麦芽糖、4-α-葡糖基麦芽糖、异麦芽三糖和大于DP3的分支糖的总和。
含有高含量麦芽糖的修饰小麦粉和转葡糖苷酶温育，产生与通过传统方法生成的组合物相同的异麦芽-寡糖。该方法简单、经济并且可以容易地规模化，以用于商业生产。
实施例6
谷物如小麦、大麦和黑麦含有高水平的β淀粉酶，是普通的常识。这些谷物在55℃-60℃，pH5.5温育，通常形成含有大于50％麦芽糖的糖浆。通过将280gm的各粉末加入到720gm去离子水中，分别制备出小麦、大麦和黑麦粉的28％浆液。将嗜热脂肪芽孢杆菌α淀粉酶(例如，由Genencor International以商标名“GC007”下出售的嗜热脂肪芽孢杆菌α淀粉酶)以0.2kg/MT粉末的量加入到每一制备物中。然后，用6.0N H2SO4将pH调节至5.5，在60℃温育4.5小时。然后，用6.0NH2SO4将温育样品的pH调节至4.5，以1.25kg转葡糖苷酶(例如，由GenencorInternational以商标名“TRANSGLUCOSIDASE L-500”出售的转葡糖苷酶)/MT粉末的量加入转葡糖苷酶。之后，在60℃水浴温育浆液48小时。然后，离心样品并分析IMO组成(表7)，如实施例1中所阐述。
表7
与GC007和“TRANSGLUCOSIDASE L-500”温育之后，小麦、大麦和黑麦的可溶性糖类组分
Tg L-500*指“TRANSGLUCOSIDASE L-500”
实施例7
在一个实验中，将140克麦芽(Cargill Malt/Schreier-Malting Company，Wisconsin，USA)与360克蒸馏水混合。室温振荡浆液15.0分钟以均匀混合，然后，用稀释的乙酸将pH调节至4.5。pH稳定后，将浆液保持在水浴中，维持在60℃。持续温育30分钟，同时持续振荡，并抽取2ml样品用于Brix和HPLC分析(0，时间)。以1.5kg/MT麦芽的量加入TRANSGLUCOSIDASE L-500，并在60℃温育。温育期间在预先确定的不同时间间隔，例如，2、4、6、12和24小时，抽取样品，确定Brix和IMO组分(表8)，如实施例1所描述。
表8
与TRANSGLUCOSIDASE L-500孵育之后，麦芽的可溶糖类组合物
表8中的结果显示，商业上可获得的麦芽提取物可以用作合适的底物，用于产生含有异麦芽-寡糖的麦芽提取物。可以通过控制酶的剂量，调节反应时间和麦芽提取物的IMO糖组成。产麦芽酶的加入可以增加得到的组合物的IMO含量。
实施例8：高梁、黍和稻(外源性产麦芽酶)
在另一实验中，分别取280克高梁、黍和稻粉末，分别与去离子水720克混合。将悬浮液的pH值调节至5.5，并以0.5kg/mt粉末的量加入以商标名“GC007”出售的嗜热脂肪芽孢杆菌α淀粉酶(Genencor International)。均一混合后，将悬浮液保持在水浴中，维持在75℃。在6小时的温育期间，持续搅拌反应混合物。然后，降低温度至60℃并以1.0kg/mt粉末的量加入β淀粉酶(由GenencorInternational以商标名OPTIMAL BBA出售)。持续温育另外10-15小时(取样品进行Brix和HPLC)。在指定时间之后，用6.0N H2SO4将pH降低至4.5，并以1.0kg/mt粉末的量加入黑曲霉转葡糖苷酶(由Genencor International以商标名“TRANSGLUCOSIDASE L-500”下出售)。在24小时和48小时，取样品进行分析(表9)。
表9
“TRANSGLUCOSIDIDASE L-500”处理之后，高梁、黍和稻的可溶糖类组分
Figure BDA0000145138470000311
如图9所示，得到了41至54％(52.20、53.03、43.90、41.19、54.40和51.25)的IMO数值。
实施例9：混合的谷物/谷类组合物
实施例5中小麦的数据和实施例6中大麦和黑麦的数据显示了相当量的内源性产麦芽酶活性，这导致形成含非常高麦芽糖的糖浆。另一方面，已知不含有内源性产麦芽酶的谷物，例如，高梁、黍和稻，需要加入外源性产麦芽酶，以产生适于转葡糖苷酶处理的底物。在本实验中，我们研究了用含产麦芽酶的谷类例如小麦或者大麦补充高梁和稻，将淀粉转变为含高麦芽糖水平的基质。在典型的实验中，通过在720克去离子水中悬浮140克粉末，制备出高梁和稻的15％悬浮液。用6.0N H2SO4将pH调节至5.5，并以0.5/MT粉末的量加入嗜热脂肪芽孢杆菌α淀粉酶，其出售时的商标名是“GC007”(Genencor International)。之后，将得到的悬浮液在水浴中维持在75℃。持续搅拌悬浮液6小时。然后，将温度降低至60℃。通过加入大麦粉，粉末例如预先处理的稻粉的固体内容物，从15％增加至30％。相似地，将小麦加入预先处理的高梁，使终浓度达到30％。然后，在60℃继续温育另外10-12小时。降低pH为4.5，以1.0kg/mt粉末的量加入TRANSGLUCOSIDASE L-500。60℃继续温育24小时和48小时。取样品进行HPLC分析和brix；结果显示于表10中。
表10
黍和大麦；稻和小麦的可溶糖类组分
Figure BDA0000145138470000321
如上面的表10显示，黍和大麦以及稻和小麦的混合物，导致了在上面所述的温育期后，得到的悬浮物中IMO为45％至56％。
应该理解，此处所描述的实施例和实施方案仅是为了说明的目的，对其的各种修改或者变化对于本领域普通技术人员来说，是已提示的，并且它们包含在本申请的精神和范围内以及权利要求的范围内。此处引用的所有的出版物、专利、和专利申请以其整体在此并入作为参考，用于所有论题。

Claims (12)

1.用于制造异麦芽寡糖底物组合物的方法，所述方法包括：
(a)将含有淀粉的未糊化底物与产麦芽酶和淀粉液化酶接触，生成麦芽糖，所述含有淀粉的底物选自谷物、块茎，和其混合物；
(b)将所述麦芽糖与转糖苷的酶接触，其中所述步骤(a)和步骤(b)在低于或者等于所述淀粉的糊化温度的温度发生；和
(c)获得具有酶促生成的异麦芽寡糖的麦芽寡糖底物组合物，其中所述寡糖从所述含有淀粉的底物获得。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(a)和(b)同时发生。
3.根据权利要求1所述的方法，进一步包括干燥所述异麦芽寡糖底物组合物的步骤。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述含有淀粉的底物是选自小麦、黑麦、大麦和麦芽的谷物。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述含有淀粉的底物是选自黍、高梁和稻的谷物。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述产麦芽酶是β淀粉酶。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述产麦芽酶对于所述含有淀粉的底物是内源性的。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述淀粉液化酶是获自芽孢杆菌的α淀粉酶。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述淀粉液化酶获自地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)或者嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述转糖苷的酶是转葡糖苷酶。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述转葡糖苷酶来源于曲霉菌。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述曲霉菌是黑曲霉(Aspergillus niger)。
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