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DE69529026T2 - Trehalose, ihre Herstellung und ihre Verwendung - Google Patents

Trehalose, ihre Herstellung und ihre Verwendung

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DE69529026T2
DE69529026T2 DE69529026T DE69529026T DE69529026T2 DE 69529026 T2 DE69529026 T2 DE 69529026T2 DE 69529026 T DE69529026 T DE 69529026T DE 69529026 T DE69529026 T DE 69529026T DE 69529026 T2 DE69529026 T2 DE 69529026T2
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DE
Germany
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trehalose
maltose
enzyme
saccharide
weight
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DE69529026T
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Hiroto Chaen
Toshio Miyake
Tomoyuki Nishimoto
Toshiyuki Sugimoto
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Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Original Assignee
Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
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Publication date
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Trehalose sowie ihre Herstellung und Verwendung, insbesondere Trehalose oder ein Trehalose enthaltendes Saccharid, die durch das Züchten eines Mikroorganismus, der in der Lage ist, ein Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose zu produzieren, in einer Nährflüssigkeit für Kulturen mit Maltose erhalten werden können, sowie ein Verfahren zur ihrer Herstellung und ihre Verwendung.
  • Trehalose (alpha, alpha-Trehalose) ist bereits seit dem Altertum als nicht- reduzierendes Saccharid, das aus Glucose besteht, bekannt und geringe, jedoch weit verbreitete Mengen von ihr werden, wie in Advances in Carbohydrate Chemistry, veröffentlicht von Academic Press Inc., New York, New York, USA, Vol. 18, pp. 201-225 (1963) und in Applied and Enviromental Microbiology, Vol. 56, pp. 3,213-3,215 (1990) beschrieben, in Mikroorganismen, Pilzen und Insekten gefunden. Da nicht- reduzierende Saccharide, wie Trehalose, keine Aminocarbonyl-Reaktion mit Substanzen, die Aminogruppen besitzen, wie z. B. Aminosäuren und Proteine, eingehen und diese daher weder verderben noch verändern, wurden die Saccharide als nützlich für den Gebrauch und die Verarbeitung solcher Substanzen angesehen, ohne dabei ihre Verfärbung oder ihr Verderben befürchten zu müssen. Somit wurde die Einführung von Verfahren, die ihre Produktion im industriellen Maßstab erlauben würde, mit großer Hoffnung erwartet.
  • Das europäische Patent No. 0 532 807 beschreibt eine Verbindung zur Ergänzung von Energie für einen lebenden Körper, welche Neotrehalose als wirksamen Bestandteil enthält.
  • Es sind einige Verfahren bekannt, um Trehalose zu produzieren, zum Beispiel solche, die Zellen von Mikroorganismen verwenden, wie es in dem japanischen Patent Kokai No. 154,485/75 beschrieben wird, und solche, die Maltose durch Kombination von Maltose-Phosphorylase und Trehalose-Phosphorylase umwandeln, wie es in dem japanischen Patent Kokai No. 216,695/83 beschrieben wird. Das zuerst genannte Verfahren, das Zellen von Mikroorganismen verwendet, ist jedoch ungeeignet für ein Verfahren im industriellen Maßstab, da der Trehalose-Gehalt in den Zellen der Mikroorganismen als Ausgangsstoff im allgemeinen gering ist, d. h. weniger als 15 Gew.-% (bei den Prozentangaben, die im Folgenden angeführt werden, sind Gew.-% gemeint, solange es nicht anderweitig spezifiziert wird), und die Schritte zur Extraktion und Reinigung von Trehalose sehr kompliziert sind. Während das letztgenannte Verfahren, das Maltose-Phosphorylase und Trehalose- Phosphorylase verwendet, wegen des Nachteils, dass beide Enzyme üblicherweise über Glucose-1-phosphat reagieren und dies eine erhöhte Konzentration an Substrat verhindert, so dass die Ausbeute an Trehalose gering ist, weil beide Enzyme irreversibel im gleichen Reaktionssystem reagieren und es darüber hinaus sehr schwierig ist, ein solches Reaktionssystem stabil zu halten und reibungslos ablaufen zu lassen.
  • Das europäische Patent No. 0 555 540 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Trehalose, bei dem ein Mikroorganismus, der zu dem Stamm Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium oder Arthrobacter gehört und die Fähigkeit besitzt, Trehalose zu produzieren, in einem flüssigen Nährstoff erhalten wird, der Saccharose oder Maltose als eine wesentliche Quelle für Kohlenstoff enthält, und bei dem die in der Kultur produzierte und angereicherte Trehalose daraus aufgefangen wird.
  • Das französische Patent No. 2 671 099 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Trehalose über Fermentation, wobei man einen Mikroorganismus züchtet, der in der Lage ist, auf natürliche Weise in einer Nährstoffkultur, die mindestens eine Kohlenstoffquelle enthält, unter Variation des osmotischen Druckes Trehalose zu produzieren.
  • Im Zusammenhang damit kommentiert Gekkan Food Chemical (Monthly Food Chemical), "Recent Aspects and Issues in Utilization and Development of Starch", August, pp. 67-72 (1992) in der Rubrik "Oligosaccharides", dass, obwohl die Trehalose weit verbreitete Anwendung finden würde, ihre enzymatische Herstellung unter Einsatz irgendwelcher direkter Umwandlungs- oder Hydrolysierungsreaktionen von Sacchariden zur Zeit vom wissenschaftlichen Standpunkt her als unmöglich angesehen wird, und bekräftigt, dass die Produktion von Trehalose aus Stärke als Ausgangsstoff unter Einsatz von enzymatischen Reaktionen aus wissenschaftlicher Sicht als unmöglich angesehen wird.
  • Denn es ist bekannt, dass partielle Stärke-Hydrolysate, zum Beispiel verflüssigte Stärke, Dextrine und Maltooligosaccharide, die alle aus Stärke gewonnen werden, im allgemeinen aufgrund ihrer reduzierenden Endgruppen in ihren Molekülen eine Reduktionskraft zeigen. Ein solches Stärke-Hydrolysat wird in dieser Schrift als "reduzierendes partielles Stärke-Hydrolysat" bezeichnet. Die Reduktionskraft von reduzierenden partiellen Stärke-Hydrolysaten, berechnet auf trockner und fester Basis, wird üblicherweise durch das "Dextrose-Äquivalent" oder "DE" ausgedrückt. Auch ist bekannt, dass reduzierende partielle Stärke-Hydrolysate mit höheren DE- Werten, wobei es sich im allgemeinen um kleine Moleküle handelt, eine geringe Viskosität und eine starke Süßkraft ebenso wie eine hohe Reaktivität gegenüber Substanzen mit Aminogruppen, wie z. B. Aminosäuren und Proteine, zeigen, wodurch die Aminocarbonyl-Reaktion bewirkt wird, die zum Verfärben, einem unangenehmen Geschmack und zum Verderben führt.
  • Die Eigenschaften von reduzierenden partiellen Stärke-Hydrolysaten variieren in Abhängigkeit von der Größe ihres DE und aus diesem Grund ist die Beziehung zwischen den einzelnen reduzierenden partiellen Stärke-Hydrolysaten und ihren DE- Werten sehr wichtig. Es ist jedoch von den Fachleuten geglaubt worden, dass es unmöglich ist, diese Beziehung zu lösen.
  • Das einzige Verfahren, die Beziehung zu lösen, besteht darin, die reduzierenden partiellen Stärke-Hydrolysate in nicht-reduzierende partielle Stärke-Hydrolysate umzuwandeln, zum Beispiel durch Umwandlung ihrer reduzierenden Gruppen in alkoholische Gruppen durch Hydrierung unter hohem Druck. Dieses Verfahren jedoch erfordert Hochdruckautoklaven, Sicherheitseinrichtungen und eine sorgfältige Kontrolle, um Unglücke zu vermeiden, ebenso wie den Verbrauch von großen Mengen an Wasserstoff und Energie. Darüber hinaus unterscheiden sich die erhaltenen Saccharid-Alkohole von den reduzierenden partiellen Stärke- Hydrolysaten dadurch, dass die reduzierenden partiellen Stärke-Hydrolysate aus Glucose-Einheiten bestehen, während die Saccharid-Alkohole aus Glucose und Sorbitol bestehen und dies kann zur einer vorübergehenden Magenverstimmung und Diarrhöe führen. Somit bestand eine großer Bedarf, irgendwelche Verfahren einzuführen, durch welche die Reduktionskraft von reduzierenden partiellen Stärke- Hydrolysaten verringert oder sogar eliminiert wird, ohne dabei die Glucose-Einheiten, aus denen die reduzierenden partiellen Stärke-Hydrolysate aufgebaut sind, zu verändern.
  • Als Lösung dafür beschreiben die Erfinder der vorliegenden Erfindung in dem japanischen Patent No. JP-A-179,977/95 eine neuartiges Enzym (auf das hier später als "Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose" Bezug genommen wird), welches in der Lage ist, Maltose in Trehalose umzuwandeln, und führen damit ein Verfahren zur Herstellung von Trehalose oder eines Trehalose enthaltenden Saccharids aus Maltose unter Einsatz dieses Enzyms zur Umwandlung von Maltose in Trehalose ein.
  • Es wurde jedoch später gefunden, dass solch ein Verfahren ungünstigerweise eine ausgedehnte Zeit für die Züchtung der Mikroorganismen, um die Enzyme zu produzieren, für die Gewinnung der Enzyme und für die Enzymreaktion, um Maltose in Trehalose umzuwandeln, benötigte. Somit besteht eine große Nachfrage, irgendwelche Verfahren einzuführen, die für die Produktion von Trehalose aus Maltose leichter durchführbar sind, mit weniger komplizierten Schritten, einschließlich derjenigen für die Herstellung der Enzyme.
  • Ein nicht reduzierende Saccharide bildendes Enzym sowie seine Herstellung und seine Verwendung wird in dem europäischen Patent No. 0 606 753 A2 beschrieben, das einen Teil des Standes der Technik gemäß Artikel 54(3) EPC ausmacht. Das Enzym kann aus einer Kultur von Mikroorganismen, wie z. B. Rhizobium spM-11 (FERM BP-4130) und Arthrobacter spQ36 (FERM BP-4316) erhalten werden und ist in der Lage, nicht reduzierende Saccharide zu bilden, die eine Trehalose-Struktur aufweisen, wenn man es auf reduzierende partielle Stärke-Hydrolysate einwirken lässt.
  • Das europäische Patent No. 0 688 867 A1, welches einen Teil des Standes der Technik gemäß Artikel 54(3) EPC ausmacht, beschreibt ein thermostabiles, nicht- reduzierende Sacccharide bildendes Enzym, seine Herstellung sowie seine Verwendung.
  • Ein thermostabiles Trehalose freisetzendes Enzym, seine Herstellung sowie seine Verwendung werden in dem europäischen Patent No. 0 688 866 A1 beschrieben, das einen Teil des Standes der Technik gemäß Artikel 54(3) EPC ausmacht. Das Enzym kann aus einer Kultur von Mikroorganismen, wie z. B. Sulfolobus acidocaldarius (ATCC 33909 und ATCC 49426) und Sulfolobus solfataricus (ATCC 35091 und ATCC 35092) erhalten werden. Das Enzym ist in der Lage, in einem nicht-reduzierenden Saccharid, das als eine Endgruppe eine Trehalose-Struktur besitzt und einen Glucose-Polymerisationsgrad von 3 oder mehr aufweist, bei einer Temperatur von über 55ºC die Bindung zwischen einer Trehalose-Einheit und der restlichen Glycosyl-Einheit zu hydrolysieren.
  • Das europäische Patent No. 0 690 131 A1, das einen Teil des Standes der Technik gemäß Artikel 54(3) EPC ausmacht, beschreibt, dass nicht reduzierende Saccharide, einschließlich α-Glycosyl-trehalose, α-Glycosyl-α-glycoside und Trehalose auf einfache Weise durch das Züchten von Mikroorganismen produziert werden, die in der Lage sind, in Nährflüssigkeiten für Kulturen, die reduzierende partielle Stärke- Hydrolysate mit Glucose-Polymerisationsgraden von 3 oder mehr enthalten, nicht- reduzierende Saccharide bildende Enzyme zu produzieren. Die reduzierenden partiellen Stärke-Hydrolysate werden darüber hinaus mit einem Stärke abbauenden Enzym und/oder Cyclomaltodextrin-glucanotransferase innerhalb oder außerhalb des Nährstoffs für Kulturen umgesetzt.
  • Das europäische Patent No. 0 691 407 A1, das einen Teil des Standes der Technik gemäß Artikel 54(3) EPC ausmacht, beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von nicht-reduzierenden Sacchariden, wie z. B. Trehalose, α-Glycosyl-trehalosen und α- Glycosyl-αglycosiden, wobei eine Lösung von verflüssigter Stärke entweder mit einem nicht reduzierende Saccharide bildenden Enzym oder einem nicht- reduzierende Saccharide bildenden Enzym und einem Trehalose freisetzendem Enzym in Kombination mit einem Stärke abbauendem Enzym und/oder Cyclomaltodextrtin-glucanotransferase umgesetzt wird.
  • Das europäische Patent No. 0 690 130 A1, das einen Teil des Standes der Technik gemäß Artikel 54(3) EPC ausmacht, beschreibt eine Saccharid-Verbindung mit einer verminderten Reduzierbarkeit, welche durch Hydrierung einer Saccharid-Mischung gewonnen wird, die sich aus reduzierenden Sacchariden und nicht-reduzierenden Sacchariden, die aus Trehalose und/oder eine Trehalose-Struktur aufweisenden Sacchariden bestehen, zusammensetzt.
  • Die vorliegende Erfindung hat das Ziel, ein neuartiges Verfahren einzuführen, das auf leichte Weise mit einer verkürzten Verfahrensdauer Trehalose aus Maltose liefert, ebenso wie Beispiele für seine Verwendung zu liefern.
  • Im besonderen hat die vorliegende Erfindung das Ziel, Trehalose oder ein Trehalose enthaltendes Saccharid durch Züchten eines Mikroorganismus in einer Nährflüssigkeit für Kulturen mit Maltose einzuführen, wobei der Mikroorganismus in der Lage ist, ein Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose zu produzieren, ebenso wie ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung einzuführen.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben tatkräftig die Züchtung von Mikroorganismen, die in der Lage sind, ein Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose zu produzieren, sowie die Produktion von Enzymen daraus untersucht. Als Ergebnis haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung gefunden, dass die Mikroorganismen das Enzym in einer frühen Phase des Zuchtvorganges produzieren und dass Trehalose leicht durch die Zugabe von Maltose in die Nährflüssigkeit für Kulturen während des Zuchtvorganges gebildet und angereichert wird. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben diese Erfindung dann zu Ende geführt.
  • Dementsprechend liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Trehalose oder eines Trehalose enthaltenden Saccharids aus Maltose, jedoch nicht aus Saccharose, welches die Schritte umfasst:
  • a) das Züchten eines Mikroorganismus in einer Nährflüssigkeit für Kulturen mit Maltose, wobei der Mikroorganismus ein Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose produziert, das in der Lage ist, aus Maltose, jedoch nicht aus Saccharose, ein Saccharid-Produkt zu produzieren, das im wesentlichen aus Trehalose zusammen mit oder ohne Glucose besteht, um das besagte Enzym zur Bildung und Anreicherung von Trehalose in der Nährflüssigkeit zu produzieren, und
  • b) das Auffangen der gebildeten und angereicherten Trehalose oder des Trehalose enthaltenden Saccharids aus der erhaltenen Kultur.
  • Es wurde gefunden, dass bei der vorliegenden Erfindung die bevorzugten Maltose- Präparate diejenigen sind, die durch die Umsetzung einer flüssigen Stärke entweder mit beta-Amylase oder mit beta-Amylase und einem Stärke abbauenden Enzym erhalten werden können, und dass der Einsatz von Mikroorganismen, die in der Lage sind, ein Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose zu produzieren, sehr vorteilhaft im Hinblick auf die Produktion von Trehalose ist. Die Trehalose oder das Trehalose enthaltende Saccharid, die so erhalten werden, können aufgrund ihrer hervorragenden Stabilität und Handhabbarkeit vorteilhaft für eine Vielzahl von Verbindungen, einschließlich Lebensmittelprodukte, Kosmetika und Arzneimittel, eingesetzt werden.
  • Die Erfindung wird im Folgenden beispielhaft ausführlich unter Bezugnahme auf die beigefügten Abbildungen beschrieben, wobei:
  • Fig. 1 den Einfluss der Temperatur auf die Aktivität des aus Pimelobacter species R48 erhaltenen Enzyms zur Umwandlung von Maltose in Trehalose zeigt.
  • Fig. 2 den Einfluss des pH auf die Aktivität des aus Pimelobacter species R48 erhaltenen Enzyms zur Umwandlung von Maltose in Trehalose zeigt.
  • Fig. 3 die thermische Stabilität des aus Pimelobacter species R48 erhaltenen Enzyms zur Umwandlung von Maltose in Trehalose zeigt.
  • Fig. 4 die pH-Stabilität des aus Pimelobacter species R48 erhaltenen Enzyms zur Umwandlung von Maltose in Trehalose zeigt.
  • Fig. 5 den Einfluss der Temperatur auf die Aktivität des aus Pseudomas putida H262 erhaltenen Enzyms zur Umwandlung von Maltose in Trehalose zeigt.
  • Fig. 6 den Einfluss des pH auf die Aktivität des aus Pseudomas putida H262 erhaltenen Enzyms zur Umwandlung von Maltose in Trehalose zeigt.
  • Fig. 7 die thermische Stabilität des aus Pseudomas putida H262 erhaltenen Enzyms zur Umwandlung von Maltose in Trehalose zeigt.
  • Fig. 8 die pH-Stabilität des aus Pseudomas putida H262 erhaltenen Enzyms zur Umwandlung von Maltose in Trehalose zeigt.
  • Fig. 9 den Einfluss der Temperatur auf die Aktivität des aus Thermus aquaticus (ATCC33923) erhaltenen Enzyms zur Umwandlung von Maltose in Trehalose zeigt.
  • Fig. 10 den Einfluss des pH auf die Aktivität des aus Thermus aquaticus (ATCC33923) erhaltenen Enzyms zur Umwandlung von Maltose in Trehalose zeigt.
  • Fig. 11 die thermische Stabilität des aus Thermus aquaticus (ATCC33923) erhaltenen Enzyms zur Umwandlung von Maltose in Trehalose zeigt.
  • Fig. 12 die pH-Stabilität des aus Thermus aquaticus (ATCC33923) erhaltenen Enzyms zur Umwandlung von Maltose in Trehalose zeigt.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Bei den Mikroorganismen, die in der Lage sind, entsprechend der vorliegenden Erfindung ein Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose zu produzieren, handelt es sich um solche, die Enzyme produzieren, die in der Lage sind, Maltose in Trehalose umzuwandeln: Beispiele für ein derartiges Enzym umfassen solche, die aus Mikroorganismen der Stämme Pimelobacter, Pseudomas und Thermus erhalten werden, die in dem japanischen Patent No. JP-A-179,977/95 beschrieben werden.
  • Bei den Nährflüssigkeiten für Kulturen, die beim Züchten eines solchen Mikroorganismus eingesetzt werden, handelt es sich um solche, die Maltose als Substrat für die Bildung von Trehalose enthalten und in denen der Mikroorganismus wachsen und das Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose produzieren kann. Bei Bedarf kann man wahlweise in Kombination andere Kohlenstoffquellen, einschließlich der Saccharide, wie z. B. Glucose, Fructose, Lactose, Saccharose, Mannitol, Sorbitol, sowie Melasse, organische Säuren, wie z. B. Zitronensäure und Succinsäure, und ihre Salze einsetzen. Bevorzugte Konzentrationen für Maltose in der Nährflüssigkeit für die Kulturen betragen 20 Gew.-% oder weniger, wünschenswert 15 Gew.-% oder weniger, besonders wünschenswert ca. 5-10 Gew.-%. Beispiele für Stickstoffquellen sind anorganische Salze, wie z. B. Ammoniumsalze und Nitrate, und organische Stickstoffverbindungen, wie z. B. Harnstoff, flüssiges eingeweichtes Getreide, Kasein, Pepton, Hefeextrakt und Fleischextrakt. Beispiele für Mineralstoffe sind Calciumsalze, Magnesiumsalze, Kaliumsalze, Natriumsalze, Phosphate, Mangansalze, Zinksalze, Eisensalze, Kupfersalze, Molybdänsalze und Kobaltsalze. Bei Bedarf können wahlweise Aminosäuren und Vitamine eingesetzt werden.
  • Das Züchten wird üblicherweise unter aeroben Bedingungen durchgeführt, bei denen die Mikroorganismen wachsen können, üblicherweise bei 4-80ºC, wünschenswert 20-75ºC, und bei pH 5-9, wünschenswert pH 6-8.5. Die Zeit zum Züchten wird auf eine Dauer festgelegt, bei der die Mikroorganismen sich vermehren können, zum Beispiel 10-100 Stunden. Es bestehen keine besonderen Einschränkungen bei der Sauerstoffkonzentration in den Kulturen, jedoch liegen die bevorzugten Bereiche bei 0.5-20 ppm. Zu diesem Zweck kann man die Luftzufuhr kontrollieren, rühren, Sauerstoff zuführen und/oder den Druck im Gärbehälter erhöhen. Das Züchten kann im Batchbetrieb, kontinuierlich oder halbkontinuierlich durchgeführt werden.
  • Somit kann Trehalose durch Züchten eines Mikroorganismus in einer Nährflüssigkeit für Kulturen, wobei der Mikroorganismus in der Lage ist, ein Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose zu produzieren, in Kulturen gebildet und angereichert werden. Es ist vorteilhaft, während des Züchtens die Nährflüssigkeit für Kulturen mit einem separat vorbereitetem Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose, einem oberflächenaktiven Mittel, wie z. B. einem Anion oder einem nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel und/oder einem lytischen Enzym, wie z. B. Lysozym, zu ergänzen oder zu versetzen, um die Bildung von Trehalose zu beschleunigen. Die auf diese Weise gebildete und angereicherte Trehalose liegt in einer flüssigen Phase vor, die durch Abtrennung der unlöslichen Substanzen gewonnen werden kann.
  • Kulturen, die Trehalose enthalten, werden zunächst über konventionelle Verfahren zur Fest/Flüssig-Trennung, zum Beispiel Filtration und Zentrifugalabscheidung, zu zellfreien Flüssigkeiten aufbereitet und die Flüssigkeiten werden dann konzentriert, mit Aktivkohle entfärbt, über Ionenaustauscher in der H- oder OH-Form deionisiert und weiter auf konventionelle Weise zu sirupartigen Produkten konzentriert. Diese Produkte können weiter zu Pulvern getrocknet werden. Bei Bedarf ist es für die Produktion von Trehalose oder eines Trehalose enthaltenden Saccharids vorteilhaft, die gesamten Kulturen einer Membranfiltration, wie z. B. über Flachfilter oder Hohlfasern, zu unterziehen, um sowohl Zellen als auch löslichen Polymere, wie z. B. Proteine und Nukleinsäuren zu entfernen, oder zunächst die unlöslichen Substanzen durch Zentrifugalabscheidung und dann die löslichen Polymere vor dem Konzentrieren, dem Entfärben und der Deionisierung zum Zwecke der Reinigung über Membranfilter zu entfernen.
  • Als Nächstes wird das Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose, das bei der erfindungsgemäßen Bildung von Trehalose beteiligt ist, erläutert. Enzymaktivitäten werden sowohl in den Zellen als auch in den überstehenden Flüssigkeiten von Kulturen gefunden und somit kann man diese als rohes Enzympräparat wiederverwerten oder die gesamten Kulturen unversehrt als rohes Enzympräparat einsetzen. Um die Zellen aus den Kulturen zu entfernen, bedient man sich konventioneller Methoden zur Fest/Flüssig-Trennung. Zum Beispiel kann man wahlweise ein Verfahren aussuchen, bei dem die Kulturen einer Zentrifugalabscheidung unterzogen werden, ein anderes Verfahren, bei dem die Kulturen über Filtration unter Einsatz von Anschwemmfiltern aufgetrennt werden, und noch ein weiteres Verfahren, bei dem die Kulturen über Membranfiltration unter Einsatz von Flachmembranen und Hohlfasern aufgetrennt werden. Zellfreie Flüssigkeiten können unversehrt als rohes Enzympräparat eingesetzt werden, jedoch werden sie gewöhnlich vor dem Gebrauch konzentriert. Die Konzentration kann beispielsweise über das Verfahren der Fällung mit Ammoniumsulfat, das Verfahren der Fällung mit Aceton/Alkohol und die Konzentration über Membranen unter Einsatz von Flachmembranen und Hohlfasern ausgeführt werden.
  • Zellfreie Flüssigkeiten und ihre Konzentrate können auf konventionelle Weise fixiert werden. Zu diesem Zweck bedient man sich beispielsweise der Bindung an Ionenaustauscher, der kovalente Bindung oder Adsorption an Harze und Membranen und der Einlagerung unter Einsatz von Polymeren. Zellen, die von den Kulturen abgetrennt wurden, werden unversehrt als rohes Enzympräparat eingesetzt oder vor dem Einsatz fixiert. Zum Beispiel werden die Zellen zunächst mit Natriumarginat vermischt und dann in eine Calciumchlorid-Lösung getropft und in Form von Granulaten geliert. Die Granulate können darüber hinaus mit Polyäthylenimin oder Glutaraldehyd behandelt werden. Man kann die Enzyme aus den Zellen extrahieren und das Extrakt als rohes Enzymflüssigkeit einsetzen. Zum Beispiel werden die Zellen zunächst für die Extraktion der Enzyme einer Zerstörung mit Ultraschall, einer mechanischen Zerstörung unter Einsatz von Glaskugeln und Aluminium oder einer Zerstörung mit Hilfe einer französischen Presse und dann einer Zentrifugalabscheidung oder Membranfiltration unterzogen, um auf diese Weise eine transparente rohe Enzymflüssigkeit zu erhalten.
  • Eine solche Enzymflüssigkeit wird unversehrt eingesetzt oder vor dem Einsatz darüber hinaus auf konventionelle Art gereinigt. Beispielsweise wird ein rohes Enzympräparat aus einer Kultur, die zunächst einem Aussalzen mit Ammoniumsulfat und einer Konzentration unterzogen wurde, zunächst dialysiert, dann gereinigt über eine Säulenchromatographie zum Austausch von Anionen unter Einsatz von "DEAE TOYOPEARL®", eine hydrophobe Säulenchromatographie unter Einsatz von "BUTYL TOYOPEARL®" und eine chromatographischen Gel-Filtration unter Einsatz von "TOYOPEARL® HW-55", welche allesamt Produkte der Tosoh Corp., Tokyo, Japan sind, um auf diese Weise ein elektrophoretisch homogenes Enzympräparat zu erhalten.
  • Die Enzyme zur Umwandlung von Maltose in Trehalose, die auf diese Weise erhalten werden, besitzen allgemein die folgenden physikochemischen Eigenschaften:
  • (1) Wirkung:
  • ist in der Lage, Maltose in Trehalose umzuwandeln, ebenso wie Trehalose in Maltose umzuwandeln.
  • (2) Molekulargewicht:
  • ca. 57,000-120,000 Dalton, bestimmt über SDS-Gel-Elektrophorese
  • (3) Isoelektrischer Punkt:
  • ungefähr pI 3.8-5.1, bestimmt über Elektrophorese mit Ampholin
  • (4) Hemmung der Aktivität:
  • gehemmt durch 1 mM Cu²&spplus;, Hg²&spplus; und 50 mM Tris-HCl-Puffer
  • (5) Ursprung:
  • durch Mikroorganismen produzierte Enzyme
  • Einige aus unterschiedlichen Mikroorganismen erhaltene Enzyme werden im Folgenden erläutert:
  • Aus Pimelobacter species R48 erhaltenes Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose
  • (1) Wirkung:
  • ist in der Lage, Maltose in Trehalose umzuwandeln, ebenso wie Trehalose in Maltose umzuwandeln. Bildet aus ein Mol Maltose oder Trehalose jeweils ca. 1 Mol Trehalose oder Maltose.
  • (2) Molekulargewicht:
  • ca. 57,000-67,000 Dalton, bestimmt über SDS-Gel-Elektrophorese
  • (3) Isoelektrischer Punkt:
  • ungefähr pI 4.1-5.1, bestimmt über Elektrophorese mit Ampholin
  • (4) Hemmung der Aktivität:
  • gehemmt durch 1 mM Cu²&spplus;, Hg²&spplus; und 50 mM Tris-HCl-Puffer
  • (5) Optimale Temperatur:
  • ca. 20ºC, wenn man es bei pH 7 für 60 Minuten reagieren lässt
  • (6) Optimaler pH:
  • ca. pH 7.0-8.0, wenn man es bei 25ºC für 60 Minuten reagieren lässt
  • (7) Thermische Stabilität:
  • stabil bis zu ca. 30ºC, bei einer Inkubationszeit von 60 Minuten bei pH 7.0
  • (8) pH-Stabilität:
  • ca. pH 6.0-9.0, bei einer Inkubationszeit von 60 Minuten bei 20ºC
  • Aus Pseudomas putida H262 erhaltenes Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose
  • (1) Wirkung:
  • ist in der Lage, Maltose in Trehalose umzuwandeln, ebenso wie Trehalose in Maltose umzuwandeln. Bildet aus ein Mol Maltose oder Trehalose jeweils ca. 1 Mol Trehalose oder Maltose.
  • (2) Molekulargewicht:
  • ca. 110,000-120,000 Dalton, bestimmt über SDS-Gel-Elektrophorese
  • (3) Isoelektrischer Punkt:
  • ungefähr pI 4.1-5.1, bestimmt über Elektrophorese mit Ampholin
  • (4) Hemmung der Aktivität:
  • gehemmt durch 1 mM Cu²&spplus;, Hg²&spplus; und 50 mM Tris-HCl-Puffer
  • (5) Optimale Temperatur:
  • ca. 37ºC, wenn man es bei pH 7 für 60 Minuten reagieren lässt
  • (6) Optimaler pH:
  • ca. pH 7.3-8.3, wenn man es bei 35ºC für 60 Minuten reagieren lässt
  • (7) Thermische Stabilität:
  • stabil bis zu ca. 40ºC, bei einer Inkubationszeit von 60 Minuten bei pH 7.0
  • (8) pH-Stabilität:
  • ca. pH 6.0-9.5, bei einer Inkubationszeit von 60 Minuten bei 35ºC
  • Aus Thermus aquaticus ATCC33923 erhaltenes Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose
  • (1) Wirkung:
  • ist in der Lage, Maltose in Trehalose umzuwandeln, ebenso wie Trehalose in Maltose umzuwandeln. Bildet aus ein Mol Maltose oder Trehalose jeweils ca. 1 Mol Trehalose oder Maltose.
  • (2) Molekulargewicht:
  • ca. 100,000-110,000 Dalton, bestimmt über SDS-Gel-Elektrophorese
  • (3) Isoelektrischer Punkt:
  • ungefähr pI 3.8-4.8, bestimmt über Elektrophorese mit Ampholin
  • (4) Hemmung der Aktivität:
  • gehemmt durch 1 mM Cu²&spplus;, Hg²&spplus; und 50 mM Tris-HCl-Puffer
  • (5) Optimale Temperatur:
  • ca. 65ºC, wenn man es bei pH 7 für 60 Minuten reagieren lässt
  • (6) Optimaler pH:
  • ca. pH 6.0-6.7, wenn man es bei 60ºC für 60 Minuten reagieren lässt
  • (7) Thermische Stabilität:
  • stabil bis zu ca. 80ºC, bei einer Inkubationszeit von 60 Minuten bei pH 7.0
  • (8) pH-Stabilität:
  • ca. pH 5.5-9.5, bei einer Inkubationszeit von 60 Minuten bei 60ºC
  • Enzyme zur Umwandlung von Maltose in Trehalose werden wie folgt untersucht: 1 ml von 20 Gew.-% Maltose als Substrat in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7.0) wird mit 1 ml Enzym-Lösung versetzt, man lässt sie bei 25ºC, 35ºC oder 60ºC für 60 Minuten reagieren und erhitzt für 10 Minuten auf 100ºC, um die Reaktion zu unterbrechen. Die Reaktionsflüssigkeit wird in genau der 11-fachen Menge 50 mM Phosphatpuffer (pH 7.5) gelöst und 0,4 ml der gelösten Lösung wird mit 0.1 ml einer 1 Einheit pro ml enthaltenden Trehalose-Lösung versetzt, bei 45ºC für 120 Minuten gezüchtet und mit der Glucose-Oxidase-Methode auf den Glucose-Gehalt untersucht. Zur Kontrolle wird eine Enzym-Lösung und Trehalase, die durch Erhitzen auf 100ºC deaktiviert wurde, analog wie oben beschrieben behandelt. Der Anteil an Trehalose, die durch das Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose gebildet wird, wird über den erhöhten Anteil an Glucose, der nach obigen Messung bestimmt wurde, ermittelt, wobei eine Einheit des Enzyms als die Menge an Enzym definiert ist, die ein Mikromol Trehalose pro Minute bildet.
  • Bei dieser Untersuchung wird die Reaktionstemperatur auf 25ºC festgesetzt für die Enzyme zur Umwandlung von Maltose in Trehalose, die aus dem Stamm Pimelobacter erhalten wurden, auf 35ºC für diejenigen, die aus dem Stamm Pseudomas erhalten wurden, und auf 60ºC für diejenigen, die aus dem Stamm Thermus erhalten wurden.
  • Bei den Stärken, die für die vorliegende Erfindung einsetzbar sind, handelt es sich um terrestrische Stärken, wie z. B. Kornstärke, Reisstärke und Weizenstärke, sowie unterirdische Stärken, wie z. B. Kartoffelstärke, Stärke aus süßen Kartoffeln und Tapiokastärke. Um eine solche Stärke zu verflüssigen, wird sie üblicherweise in Wasser suspendiert, vorzugsweise bis 10% oder mehr, besonders bevorzugt bis zu ca. 20-50%, erhitzt und einer mechanischen, enzymatischen oder einer Verflüssigung mittels Säure unterzogen. Der Grad der Verflüssigung ist relativ gering, im besonderen geringer als 15, bevorzugt geringer als 10, gerechnet in DE- Einheiten. Im Falle der Verflüssigung mit Säuren wird beispielsweise zunächst Salzsäure, Phosphorsäure oder Oxalsäure eingesetzt, dann wird Calciumcarbonat, Calciumoxid oder Natriumcarbonat zur Neutralisation auf den vorgeschriebenen pH eingesetzt. Im Falle der Verflüssigung mit Enzymen werden alpha-Amylasen, im besonderen hitzebeständige, flüssig machende alpha-Amylasen bevorzugt.
  • Die beta-Amylasen, die bei der vorliegenden Verbindung eingesetzt werden, um Maltose aus Lösungen von verflüssigten Stärken zu produzieren, können auf konventionelle Weise aus Pflanzen, wie z. B. süße Kartoffeln, Sojabohnen und Weizenkleie sowie aus Kulturen von Mikroorganismen des Stammes Bacillus hergestellt werden. Natürlich können auch wahlweise kommerziell erhältliche Enzym- Präparate eingesetzt werden. Weil es sich bei den die Stärke abbauenden Enzymen, die bei der vorliegenden Erfindung einsetzbar sind, um solche handelt, die auf verflüssigte Stärken mit einem relativ geringen DE, vorzugsweise weniger als DE 15 einwirken, um die Ketten darin zu hydrolysieren, können mit dieser Zielsetzung vorzugsweise konventionelle Pullulanase und Isoamylase ebenso wie kommerziell erhältliche Enzym-Präparate eingesetzt werden.
  • Die Mengen an Enzymen, die eingesetzt werden müssen, können wahlweise in Abhängigkeit von den Reaktionsbedingungen einschließlich der Reaktionszeit ausgewählt werden. Üblicherweise wird beta-Amylase gegenüber Lösungen von verflüssigter Stärke als Substrat zu einem Anteil von ca. 1-100 Einheiten pro g Feststoff eingesetzt, dagegen ein Stärke abbauendes Enzym zu ca. 1-2,000 Einheiten pro g Feststoff.
  • Die so erhaltene Maltose kann vorteilhaft als Saccharid-Quelle für Trehalose oder ein Trehalose enthaltendes Saccharid bei der Züchtung nach der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Der Zeitpunkt der Zugabe der Maltose in die Nährflüssigkeit für Kulturen kann wahlweise ausgesucht werden und sie kann vor oder während des Züchtens, sobald die Trehalose gebildet wird, zugegeben werden. Im Falle des Züchtens auf kontinuierliche oder halbkontinuierlicher Weise kann beispielsweise während des Züchtens ein Teil der Kultur, in der sich Trehalose gebildet hat, herausgenommen werden und eine frische Nährflüssigkeit für Kulturen mit Maltose mit dem gleichen Volumen wird dann zu der Kultur ergänzend zugegeben. Solch eine Züchtung kann wahlweise mit einer Nährflüssigkeit für Kulturen ausgeführt werden, die entweder mit beta-Amylase oder mit beta-Amylase und einem Stärke abbauenden Enzym versetzt worden war.
  • Die erhaltenen Kulturen mit Trehalose werden auf konventionelle Weise einer Filtration und einer Zentrifugalabscheidung unterzogen, um die unlöslichen Substanzen, wie z. B. Zellen, zu entfernen, mit Aktivkohle entfärbt, deionisiert, gereinigt über Ionenaustauscher der H- und OH-Form und zu sirupartigen Produkten konzentriert. Die Produkte können wahlweise zu Pulver getrocknet werden. Trehalose der höchst möglichen Reinheit kann auf einfache Weise durch weiteres Reinigen der sirupartigen Produkte mit Hilfe eines oder mehrerer Verfahren, zum Beispiel Fraktionierung unter Einsatz von Säulenchromatographie, wie z. B. Säulenchromatographie mit Ionenaustauschern, Säulenchromatographie mit Aktivkohle und Säulenchromatographie mit Silikagel, fraktionierte Fällung unter Einsatz von organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Alkohol und Aceton, Abtrennung unter Einsatz von Membranen mit geeignetem Trennvermögen, fermentative Behandlung mit Hefe und Behandlung mit Alkali, um auf diese Weise bei Bedarf die verbleibenden reduzierenden Saccharide zu entfernen oder zu zersetzen.
  • Bei einer Produktion im industriellen Maßstab ist es vorteilhaft, Ionenaustauscher- Säulenchromatographie mit einem stark sauren Kationenaustauscher einzusetzen, zum Beispiel solche, die in den japanischen Patenten No. 23,799/83 und 72,598/83 beschrieben werden, um auf diese Weise verunreinigende Saccharide zu entfernen und auch die Anteile der gewünschten Trehalose zu erhöhen. In diesem Fall kann wahlweise das Festbett-Verfahren, das Fließbett-Verfahren und das simulierte Fließbett-Verfahren eingesetzt werden.
  • Die so erhaltenen erfindungsgemäßen Trehalose enthaltenden Saccharide können weiteren Behandlungsschritten unterzogen werden, insbesondere dem Abbau durch Glucoamylase oder alpha-Glucosidase, um ihre Süßkraft und ihre Reduktionskraft zu kontrollieren und ebenso ihre Viskosität zu verringern, oder der Hydrierung zu Alkoholen, um auf diese Weise die Reduktionskraft, die durch die verbleibenden reduzierenden Saccharide hervorgerufen wird, zu eliminieren.
  • Insbesondere wenn das gemäß der vorliegenden Erfindung erhältliche, Trehalose enthaltende Saccharid mit Glucoamylase oder alpha-Glucosidase zu einer Lösungsmischung aus Trehalose und Glucose umgesetzt wird, die dann weiter der oben beschriebenen Reinigung unterzogen wird, zum Beispiel einer Ionenaustauscher-Säulenchromatographie zur Entfernung der Glucose, kann man mit Trehalose angereicherte Fraktionen erhalten. Die Fraktionen können gereinigt und zu einem sirupartigen Produkt konzentriert werden, welches dann weiter zu einem übersättigten Zustand konzentriert und zu kristallinem Trehalosehydrat oder wasserfreier kristalliner Trehalose kristallisiert werden kann.
  • Um beispielsweise kristallines Trehalosehydrat herzustellen, wird eine Flüssigkeit mit einem hohen Trehalose-Gehalt, einer Reinheit von ca. 60% oder mehr und einer Konzentration von ca. 65-90% in ein Kristallisationsgefäß gegeben und schrittweise auf 95ºC oder tiefer gekühlt, bevorzugt auf 10-90ºC, gegebenenfalls in Gegenwart von 0.1-20% Kristallisationskeimen, um eine Masse zu erhalten, die kristallines Trehalosehydrat enthält. In diesem Fall kann man vorteilhaft kontinuierliche Kristallisationsverfahren verwenden, bei denen die Trehalose während der Konzentrierung unter vermindertem Druck kristallisiert wird. Beispiele für Verfahren, die kristallines Trehalosehydrat oder feste Saccharid-Mischungen, die dasselbe enthalten, aus solch einer Masse ergeben, umfassen die konventionelle Abtrennung von Kristallen, das Pulverisieren eines festen Blockes, die Fließbett- Granulation und das Sprühtrocknen.
  • Das Verfahren der Abtrennung von Kristallen ist geeignet, um kristallines Trehalosehydrat mit erhöhter Reinheit zu produzieren, wobei die Massen üblicherweise in eine Trommelzentrifuge gegeben, in der sie in kristallines Trehalosehydrat und Mutterlauge getrennt werden, wonach die zuerst genannten Kristalle zum Waschen mit einer Minimalmenge an gekühltem Wasser besprüht werden. Beim Sprühtrocknen werden die Massen mit einer Konzentration von 70-85% und einem Kristallisationsgrad bis zu 20-60% üblicherweise durch eine Düse, die mit einer Hochdruckpumpe kombiniert ist, versprüht, in einem Heißluftstrom bei einer Temperatur, bei der das kristalline Pulver nicht schmilzt, beispielsweise 60-100ºC, getrocknet und in einem Heißluftstrom bei einer Temperatur von 30-60ºC für ca. 1-20 Stunden gealtert, wobei man auf leichte Weise eine nicht, oder wenig hygroskopische Mischung aus kristallinen Feststoffen erhält. Beim Verfahren des Pulverisierens von festen Blöcken kristallisiert man die Massen mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 10-20% und einem Kristallisationsgrad bis zu 10-60% üblicherweise dadurch aus, dass man sie über ca. 0.1-3 Tage in Form von Blöcken fest werden läßt, die dann durch Schneiden und Hobeln pulverisiert und getrocknet werden, wobei man eine nicht, oder wenig hygroskopische Mischung aus kristallinen Feststoffen erhält.
  • Um jedoch wasserfreie kristalline Trehalose herzustellen, wird kristallines Trehalosehydrat durch Trocknen umgewandelt oder alternativ wird eine hochkonzentrierte Trehalose-Lösung mit einem Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 10% üblicherweise in ein Kristallisationsgefäß gegeben und bei 50-160ºC, bevorzugt 80-140ºC, in Gegenwart von Kristallisationskeimen gerührt, um eine Masse zu erhalten, die dann unter relativ heißen und trocknen Bedingungen, beispielsweise durch die Blockpulverisierung, die Fließbett-Granulation und die Sprühtrocknung, kristallisiert und pulverisiert wird.
  • Die gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlichen Trehalose sowie das Trehalose enthaltende Saccharid, die auf diese Weise erhalten werden, bewirken weder ein Braunwerden noch einen unangenehmen Geschmack noch ein Verderben bei anderen Substanzen, insbesondere bei solchen mit Aminosäuren, wie z. B. Aminosäuren, Oligopeptiden und Proteinen, wenn sie mit ihnen vermischt oder verarbeitet werden, da die Saccharide aufgrund ihrer verminderten Reduktionskraft stabil sind. Darüber hinaus besitzen die Saccharide eine geringe Reduktionskraft und eine geringe Viskosität und zeigen gewöhnlich eine qualitativ hochwertige und milde Süße.
  • Darüber hinaus wird die nach der vorliegenden Erfindung erhältliche Trehalose als Kalorie verdaut, absorbiert und genutzt wenn sie oral eingenommen wird, da sie durch Trehalase abgebaut wird. Noch darüber hinaus ist sie als wenig Zahnkaries verursachender Süßstoff verwendbar, da sie nur schwer von Zahnkaries verursachenden Mikroorganismen fermentiert wird. Weiter darüber hinaus besitzt sie weitere wünschenswerte Eigenschaften, wie z. B. das Vermögen die Osmose zu kontrollieren, das Vermögen Form und Glanz zu verleihen, das Vermögen Feuchtigkeit zurückzuhalten, Viskosität, das Vermögen die Kristallisation von anderen Sacchariden zu verhindern, eine verminderte Fermentierbarkeit und das Vermögen die Rückbildung von gelierter Stärke zu verhindern.
  • Die gemäß der vorliegenden Erfindung erhältliche Trehalose kann vorteilhaft als Energie-Ergänzung für Lebewesen dienen, da sie leicht ohne Gefahr von Toxizität und Nebenwirkungen metabolisiert und genutzt wird, wenn sie parenteral als Nährlösung oder als Infusion verabreicht wird. Kristallines Trehalosehydrat kann vorteilhaft als Mittel zum Ummanteln von Tabletten in Verbindung mit Bindern, wie z. B. Pullulan, Hydroxyäthyl-Stärke und Polyvinyl-Pyrrolidon, eingesetzt werden, da Trehalose als stabiler Süßstoff wirkt.
  • Während wasserfreie kristalline Trehalose vorteilhaft als Trockenmittel für wasserhaltige Substanzen, wie z. B. Lebensmittel, Kosmetika, Arzneimittel sowie Rohstoffe und Zwischenprodukte dafür eingesetzt werden kann, um die Produktion von stabilen und hochwertigen Feststoffprodukten, einschließlich Pulver, Granulaten und Tabletten, zu erleichtern.
  • Somit kann die gemäß der vorliegenden Erfindung erhältliche Trehalose oder das Trehalose enthaltende Saccharid vorteilhaft als Süßstoff, Mittel zur Geschmacksverbesserung, Mittel zur Qualitätsverbesserung, Stabilisator, als Mittel zur Formgebung und als Trockenmittel in einer Vielzahl von Verbindungen, einschließlich Lebensmittelprodukten, Tabak, Zigaretten, Futtermitteln, Kosmetika und Arzneimitteln, eingesetzt werden.
  • Die gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlichen Trehalose sowie das Trehalose enthaltende Saccharid können ohne zusätzliche Behandlung als Gewürzstoff zum Süßen eingesetzt werden. Gegebenenfalls können sie vor dem Gebrauch mit einer passenden Menge eines oder mehrerer anderer Süßstoffe und/oder Füllstoffe gemischt werden, beispielsweise Stärkesirup-Pulver, Glucose, Maltose, Saccharose, Isomerzucker, Honig, Ahornzucker, Isomalto-Oligosaccharid, Galacto- Oligosaccharid, Fructo-Oligosaccharid, Lactosucrose, Sorbitol, Maltitol, Lactitol, Dihydrochalcon, Steviosid, alpha-Glycosyl-Steviosid, Rhebaudiosid, Glycyrrhizin, L- Aspartyl-L-Phenylalanin-Methylester, Saccharin, Glycin, Dextrin, Stärke und Lactose.
  • Die gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlichen Trehalose sowie das Trehalose enthaltende Saccharid können ohne zusätzliche Behandlung oder gegebenenfalls zusammen mit einem Füllstoff, Träger und Binder in die gewünschte Formen, beispielsweise Granulat, Kugel, Stab, Scheibe, Würfel und Tablette, überführt werden.
  • Die gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlichen Trehalose sowie das Trehalose enthaltende Saccharid können allgemein vorteilhaft zum Süßen oder zur Geschmacks- und Qualitätsverbesserung von Lebensmitteln eingesetzt werden, da sie überragend mit einer Vielzahl von Substanzen mit anderen Geschmacksrichtungen, wie z. B. einem sauren, salzigen, zusammenziehenden, wohlschmeckendem und bitteren Geschmack, harmonisieren.
  • Beispielsweise können sie vorteilhaft in einer Vielzahl von Gewürzen, wie z. B. Aminosäuren, Peptiden, Sojasauce, pulverförmige Sojasauce, "miso", pulverförmiges "miso", "moromi", "hishio", "furikake", Mayonnaise, Dressing, Essig, "sanbai-zu", pulverförmigem Essig für "sushi", "chuka-no-moto", "tentsuyu", "mentsuyu", Sauce, Ketchup, "yakiniku-no-tare" Curry-Mehlschwitze, Grundstoff für Braten, Grundstoff für Suppen, "dashi-no-moto", Nukleinsäuren-Würze, Gewürzmischung, "mirin", "shin- mirin", als Tafelzucker und Zucker für Kaffee eingesetzt werden.
  • Darüber hinaus können sie beispielsweise vorteilhaft zum Süßen und/oder zur Verbesserung des Geschmacks und der Qualität einer Vielzahl von Süßigkeiten nach japanischer Art eingesetzt werden, wie z. B. "senbei", "arare", "okoshi", "ame", "manju", "uiro", Bohnenbrei, "yokan", "mizu-yokan", "kingyoku", Gelee, Castella, und "amedama"; Süßigkeiten nach westlicher Art, wie z. B. bun, Biskuit, Kekse, Plätzchen, Torte, Pudding, Buttercreme, Eierschaumcreme, Windbeutel, Waffeln, Schaumpudding, Berliner, Schokolade, Kaugummi, Karamel, und Hartbonbons; gefrorenen Nachspeisen, wie z. B. Eiscreme und Sorbet; Sirup, wie z. B. eingelegte Früchte und "kori-mitsu"; Pasten, wie z. B. Mehlpaste, Erdnußbutter, Fruchtbrei und Brotaufstrich; verarbeitete Früchte und Gemüse, wie z. B. Konfitüre, Marmelade, eingelegte Früchte und Gemüse sowie "toka"; Gurken und eingelegte Produkte, wie z. B. "fukuzin-zuke", "bettara-zuke", "semai-zuke", und "rakkyo-zuke; Grundstoffe für eingelegte Produkte, wie z. B. "takuan-zuke-no-moto", hakusai-zuke-no-moto"; Fleischprodukte, wie z. B. Schinken und Wurst; Fischprodukte, wie z. B. Fischschinken, Fischwurst, "kamaboko", chikuwa" und "tenpura"; Rettich, wie z. B. "uni-no-shiokara", "ika-no-shiokara", "su-konbu", "saki-surume" und "fugu-no-mirin- boshi"; "tsukudani", wie z. B. solche aus Tang, "sansai", "summe", kleine Fische und Schalentieren; Beilagen, wie z. B. "nimame", Kartoffelsalat und "konbu-maki"; Milchprodukte, wie z. B. Yoghurt und Käse; Produkte in Dosen und Flaschen, wie z. B. solche mit Fisch, Fleisch, Früchten und Gemüse; alkoholische Getränke, wie z. B. Sake, synthetisches Sake, Liköre und alkoholische Getränke nach westlicher Art; alkoholfreie Getränke, wie z. B. Kaffee, Tee, Kakao, Saft, kohlensäurehaltige Getränke, Milchsäure enthaltende Getränke und Getränke, die Milchsäurebakterien enthalten; Fertiggerichte, wie z. B. Puddingmischungen, Pfannkuchenmischungen, "sokuseki-shiruko" und Fertigsuppen; und andere Arten von Lebensmittelprodukten, wie z. B. Babynahrung, Nahrungsmittel zur Behandlung, Getränke in Flaschen, Peptid-haltige Nahrungsmittel, gekühlte Nahrungsmittel und getrocknete Nahrungsmittel.
  • Darüber hinaus können sie noch vorteilhaft mit dem Ziel eingesetzt werden, die Geschmacksqualität von Futtermitteln, wie z. B. solche für Haustiere, Geflügel, Honigbienen, Seidenraupen und Fisch, zu verbessern. Sie können ebenfalls vorteilhaft eingesetzt werden in einer Vielzahl von Verbindungen in fester, pastenförmiger oder flüssiger Form, wie z. B. Tabak, Zigaretten, Kosmetika, und Arzneimittel, einschließlich Zahnpasta, Lippenstift, Lippencreme, Medizin für die innere Anwendung, Tabletten, Dragees, Lebertrantropfen, Mundspray und Mundwasser.
  • Die Verwendung als Mittel zur Qualitätsverbesserung oder Stabilisator umfasst Anwendungen bei einer Vielzahl von bioaktiven Substanzen und Lebensmitteln für die Gesundheit sowie Arzneimitteln, die diese enthalten, deren wirksame Bestandteile und Aktivitäten anfällig dafür sind, unwirksam zu werden. Beispiele für solche bioaktiven Substanzen sind Lymphokine, wie z. B. Interferon-alpha, Interferon- beta, Interferon-gamma, Tumor-Nekrosis-Faktor-alpha, Tumor-Nekrosis-Faktor-beta, Makrophage-Migrationsinhibitor-Faktor, Kolonie-Anregungssfaktor, Transfer-Faktor und Interleukin-2; Hormone, wie z. B. Insulin, Wachstumshormone, Prolactin, Erythropoietin und Follikel anregende Hormone; biologische Präparate, wie z. B. BCG-Impfstoff, Impfstoff gegen den Virus der japanischen Enzephalitis, Impfstoff gegen Masern, Impfstoff gegen Kinderlähmung, Impfstoff gegen Pocken, Tetanus- Toxoid, Trimeresurus-Gegengift und menschliches Immunoglobin; Antibiotika, wie z. B. Penicillin, Erythromycin, Chloramphenicol, Tetracyclin, Streptomycin und Kanamycinsulfat; Vitamine, wie z. B. Thiamin, Riboflavin, L-Ascorbinsäure, Lebertran, Carotenoid, Ergosterol und Tocopherol; Enzyme, wie z. B. Lipase, Elastase, Urokinase, Protease, beta-Amylase, Isoamylase, Glucanase, und Lactase; Extrakte, wie z. B. Extrakte von Ginseng, Schnappschildkröten, Chlorella, Aloe, und Propolis; lebende Mikroorganismen, wie z. B. Lebendviren, Milchsäurebakterien und Hefe; und andere Arten von bioaktiven Substanzen, einschließlich Götterspeise. Somit können stabile und qualitativ hochwertige Reformprodukte und Arzneimittel in flüssiger, pastöser oder fester Form leicht hergestellt werden, ohne dass die Wirksamkeit oder wirksame Bestandteile verloren gehen.
  • Um in eine solche Verbindung Trehalose oder ein Trehalose enthaltendes Saccharid einzubauen, werden diese, bevor ihre Verarbeitung fertiggestellt ist, über konventionelle Verfahren eingelagert, wie beispielsweise Mischen, Lösen, Schmelzen, Tränken, Durchdringen, Besprühen, Auftragen, Ummanteln, Versprühen, Injizieren, Kristallisieren und Ausfällen. Die Mengen, die eingelagert werden, liegen üblicherweise bei 0.1% oder mehr, bevorzugt 1% oder mehr. Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden unter Bezugnahme auf einige Experimente genauer erklärt.
  • Zunächst werden Enzyme zur Umwandlung von Maltose in Trehalose aus den neuartigen Mikroorganismen Pimelobacter species R48 sowie Pseudomas putida H262 und Thermus aquaticus (ATCC33923) erklärt, anschließend solche aus herkömmlichen Mikroorganismen.
  • Experiment 1 Herstellung des Enzyms
  • Proben mit jeweils 100 ml einer flüssigen Nährlösung für Kulturen, die aus 2.0 Gew.-% Glucose, 0.5 Gew.-% Polypepton, 0.1 Gew.-% Hefeextrakt, 0.1 Gew.-% Dikaliumhydrogenphosphat, 0.06 Gew.-% Natriumdihydrogenphosphat, 0.05 Gew.-% Magnesiumsulfat-heptahydrat, 0.5 Gew.-% Calciumcarbonat und Wasser besteht, wurden in 500 ml Kolben verteilt, zur Sterilisation bei 115ºC für 30 Minuten im Autoklaven behandelt, gekühlt, mit einer Keimkultur Pimelobacter species R48 (FERM BP-4315) geimpft und bei 27ºC und 200 Umdrehungen pro Minute für 24 Stunden gezüchtet, um eine Keimkultur zu erhalten.
  • Ca. 20 Liter eines frischen Präparats der gleichen Nährlösung, wie sie oben beschrieben ist, wurde in einen 30 Liter Gärbehälter gegeben, durch Erhitzen sterilisiert, auf 27ºC gekühlt, mit 1 Vol.-% Keimkultur geimpft und ca. 40 Stunden lang unter Rühren und Belüften bei 27ºC und pH 6.0-8.0 gezüchtet.
  • Die Aktivität des Enzyms zur Umwandlung von Maltose in Trehalose in der Kultur betrug ca. 0.55 Einheiten/ml. Ein Teil der Kultur wurde als Probe entnommen und über eine Zentrifuge in Zellen und überstehende Lösung getrennt und die Zellen wurden dann in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7.0) suspendiert, um das gleiche Volumen wie die als Probe entnommene Kultur zu erhalten; anschließend wurden die Enzymaktivitäten in der Zellsuspension und in der überstehenden Flüssigkeit bestimmt, wobei sich zeigte, dass ca. 0.5 Einheiten/ml in der Zell-Suspension gefunden wurden, während in der überstehenden Flüssigkeit ca. 0.05 Einheiten/ml gefunden wurden. Die Enzymaktivitäten wurden bei 25ºC bestimmt.
  • Experiment 2 Reinigung des Enzyms
  • Die Kultur, die nach dem Experiment 1 erhalten wurde, wurde über eine Zentrifugalabscheidung separiert, um ca. 0.5 kg Nassgewicht Zellen aufzufangen, die dann in 10 mM Phophatpuffer (pH 7.0) suspendiert wurden. Ca. 5 Liter der Zellsuspension wurden in einer "VIBROGEN ZELLMÜHLE®", einem Zellzerkleinerer, der von Edmund Bühler vertrieben wird, umgesetzt, um die Zellen zu zerkleinern, und das resultierende Produkt wurde bei 15,000 rpm für 30 Minuten zentrifugiert, um ca. 4.5 Liter einer überstehenden Flüssigkeit zu erhalten. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit Ammoniumsulfat versetzt, um einen Sättigungsgrad von 0.3 zu erhalten, bei 4ºC für vier Stunden stehengelassen, zentrifugiert und anschließend wurde die überstehende Flüssigkeit zurückgewonnen.
  • Die überstehende Flüssigkeit wurde weiter mit Ammoniumsulfat versetzt, um einen Sättigungsgrad von 0.8 zu ergeben, bei 4ºC über Nacht stehengelassen und zentrifugiert, um das Sediment zu erhalten.
  • Das Sediment wurde in 10 mM Phosphatpuffer gelöst (pH 7.0), gegen ein frisches Präparat des gleichen Puffers für 24 Stunden dialysiert und dann zentrifugiert, um die unlöslichen Substanzen zu entfernen. Die dialysierte Lösung (ca. 400 ml) wurde in zwei Teile geteilt, die dann getrennt einer Ionaustauscher-Säulenchromatographie über 300 ml "DEAE TOYOPEARL®" unterzogen wurden.
  • Das erfindungsgemäße Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose, das von "DEAE TOYOPEARL®" absorbiert worden war, wurde davon mit einem frischen Präparat des gleichen Puffers, das jedoch zusätzlich Natriumchlorid enthielt, eluiert. Die so erhaltenen enzymaktiven Fraktionen wurden gegen ein frisches Präparat des gleichen Puffers, das jedoch zusätzlich 1 M Ammoniumsulfat enthielt, dialysiert und dann zentrifugiert, um die unlöslichen Substanzen zu entfernen, wonach die erhaltene überstehende Flüssigkeit einer hydrophoben Säulenchromatographie über 300 ml "BUTYL TOYOPEARL® 650" unterzogen wurde. Das Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose, das in der Säule absorbiert worden war, wurde davon mit einem linearen Gradienten für Ammoniumsulfat von 1 M bis 0 M eluiert, anschließend wurden die enzymaktiven Fraktionen aufgefangen.
  • Die Fraktionen wurden dann einer Ionenaustauscher-Säulenchromatographie über 10 ml "MONO Q® HR5/5", die von Pharmacia LKB, Uppsala, Schweden, vertrieben wird, unterzogen und die enzymaktiven Fraktionen wurden aufgefangen. Die Enzymaktivitäten, die spezifischen Aktivitäten und die Ausbeuten in den jeweiligen Reinigungsstufen sind in der Tabelle 1 wiedergegeben. Tabelle 1
  • Bei der Prüfung der Reinheit des gereinigten Enzyms über Polyacrylamid-Gel- Elektrophorese mit einer Gel-Konzentration von 7.5 Gew.-% zeigte es ein einziges Proteinband, was bestätigte, dass es homogen war und eine hohe Reinheit besaß.
  • Experiment 3 Eigenschaften des Enzyms
  • Das gereinigte Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose, das nach dem Verfahren in Experiment 2 erhalten wurde, wurde einer SDS-Polyacrylamid-Gel- Elektrophorese mit einer Gel-Konzentration von 10 Gew.-% unterworfen und im Vergleich mit den von Japan Bio-Rad Laboratories, Tokyo, Japan vertriebenen Molekulargewicht-Standards, die einer Elektrophorese über das gleiche Gel unterzogen worden waren, auf das Molekulargewicht untersucht, wobei sich ergab, dass das Molekulargewicht des Enzyms bei ca. 57,000-67,000 Dalton lag.
  • Das gereinigte Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose wurde einer Elektrophorese über Polyacrylamid-Gel unter Einsatz von 2 Gew.-% Ampholin, das von Pharmacia LKB, Uppsala, Schweden vertrieben wird, unterzogen und dann wurden die pH-Werte des Protein-Bandes und des Gels bestimmt, wobei sich ergab, dass der isoelektrische Punkt des Enzyms bei ca. pI 4.1-5.1 lag.
  • Die Auswirkungen der Temperatur und des pH auf die Enzymaktivität wurden gemäß der Prüfmethode untersucht. Die Ergebnisse für den Einfluß der Temperatur sind in Fig. 1 aufgezeigt, die für den Einfluß des pH in Fig. 2. Die optimale Temperatur des Enzyms lag bei ca. 20ºC, wenn man es bei pH 7.0 für 60 Minuten reagieren ließ, während der optimale pH bei ca. 7.0-8.0 lag, wenn man es bei 25ºC für 60 Minuten reagieren ließ. Die thermische Stabilität des Enzyms wurde durch Inkubation des Enzyms für 60 Minuten bei verschiedenen Temperaturen in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7.0), Kühlen mit Wasser und Prüfen der Restaktivität bestimmt. Während die pH-Stabilität durch Inkubation bei 20ºC für 60 Minuten in 50 mM Phosphatpuffer bei verschiedenen pH-Werten, Einstellen auf pH 7.0 und Prüfen der Restaktivität bestimmt wurde. Die jeweiligen Resultate werden für die thermische Stabilität in Fig. 3 und für die pH-Stabilität in Fig. 4 aufgezeigt. Die thermische Stabilität ging bis zu 30ºC, während die pH-Stabilität bei ca. pH 6-9 lag. Die Enzymaktivität wurde durch 1 mM Cu²&spplus;, Hg²&spplus; und 50 mM Tris-HCl-Puffer gehemmt.
  • Experiment 4 Umsetzung von verschiedenen Sacchariden
  • Eine Vielzahl von Sacchariden wurde auf ihre Brauchbarkeit als Substrat getestet. Vorbereitet wurden jeweils Lösungen von entweder Glucose, Maltose, Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose, Maltohexaose, Maltoheptaose, lösliche Stärke, Amylase mit einem mittleren Polymerisationsgrad von 18, Trehalose, Neotrehalose, Gentiobiose, Kojibiose, Isomaltose, Cellobiose, Maltitol, Saccharose, Maltulose, Turanose, Palatinose, Trehalulose oder Lactose sowie Lösungen, die Glucose zusammen mit dem gleichen Anteil entweder an alpha-Glucose-1-phosphat oder beta-Glucose-1-phosphat enthalten.
  • Jede Lösung wurde pro g Substrat mit 2 Einheiten eines gereinigten Enzyms zur Umwandlung von Maltose in Trehalose, das nach dem Verfahren in Experiment 2 erhalten wurde, versetzt, jeweils auf eine Substrat-Konzentration von 5 Gew.-% eingestellt und bei 20ºC und pH 7.0 für 24 Stunden umgesetzt. Vor und nach der Reaktion wurden die Lösungen einer Dünnschicht-Chromatographie (TLC) über "KIESELGEL® 60", einer Aluminiumplatte, mit einer Länge und Breite von jeweils 20 cm, die von Merck & Co., Inc., New Jersey, USA, vertrieben wird, unterzogen, um die Enzymreaktion der jeweiligen Saccharide zu bestimmen. Die TLC wurde bei Zimmertemperatur mit einer Lösungsmittelmischung aus 1-Butanol, Pyridin und Wasser (6 : 4 : 1, bezogen auf das Volumen) entwickelt. Die Färbung wurde zunächst durch Besprühen mit einer 20%igen Schwefelsäure/Methanol-Lösung und anschließendes Erhitzen für 10 Minuten auf 110ºC durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben.
  • Tabelle 2
  • Substrat Enzymreaktion
  • Glucose -
  • Maltose ++
  • Maltotriose -
  • Maltotetraose -
  • Maltopentaose -
  • Maltohexaose -
  • Maltoheptaose -
  • Lösliche Stärke -
  • Amylose mit einem mittleren Polymerisationsgrad von 18 -
  • Trehalose +
  • Neotrehalose -
  • Gentiobiose -
  • Fortsetzung Tabelle 2
  • Substrat Enzymreaktion
  • Kojibiose -
  • Isomaltose -
  • Cellobiose -
  • Maltitol -
  • Saccharose -
  • Maltulose -
  • Turanose -
  • Palatinose -
  • Trehalulose -
  • Lactose -
  • Alpha-Glucose-1-phosphat + Glucose -
  • Beta-Glucose-1-phosphat + Glucose -
  • Anmerkung: Das Symbol "-" bedeutet, dass keine Veränderungen vor und nach der Reaktion beobachtet wurde; "+", Flecken der Substrate waren deutlich angewachsen und es wurden Reaktionsprodukte nachgewiesen; und "++", Flecken der Substrate waren wesentlich angewachsen und es wurden Reaktionsprodukte nachgewiesen.
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 2 ersichtlich ist, reagierte das erfindungsgemäße Enzym unter einer Vielzahl von getesteten Sacchariden nur mit Maltose und Trehalose, jedoch nicht mit anderen Sacchariden, insbesondere nicht mit den Systemen, die Glucose und entweder alpha-Glucose-1-phosphat oder beta- Glucose-1-phosphat enthielten, was bestätigte, dass das Enzym neuartig und verschieden von konventioneller Maltose-Phosphorylase und Trehalose- Phosphorylase ist.
  • Experiment 5 Produkte aus Maltose oder Trehalose
  • Eine wässerige Maltose-Lösung mit einer endgültigen Konzentration von 5% wurde pro g festes Substrat mit 2 Einheiten eines gereinigten Enzyms zur Umwandlung von Maltose in Trehalose versetzt, das nach dem Verfahren in Experiment 2 erhalten worden war, und für 24 Stunden bei 20ºC und pH 7.0 umgesetzt. Die Saccharid- Zusammensetzung der Flüssigkeit der Enzymreaktion wurde über Gaschromatographie (GLC) analysiert. Ein Teil der Flüssigkeit der Enzymreaktion wurde durch Trocknen verfestigt, in Pyridin gelöst und vor der Analyse mit Trimethylsilan silanisiert. Bei der eingesetzten GLC-Apparatur handelte es sich um ein "GC 16A", vertrieben von Shimazdu Corp., Kyoto, Japan, die mit einer mit "2% SILICONE OV-17/CHROMOSORB W®", das von GL Sciences, Tokyo, Japan, vertrieben wird, gepackten Edelstahlkolonne mit einem Innendurchmesser von 3 mm und einer Länge von 2 m ausgerüstet ist, welche mit Stickstoffgas als Träger mit einer Fließgeschwindigkeit von 40 ml/Minute beschickt wurde, während die Temperatur in der Kolonne von 160ºC auf 320ºC mit einer Heizrate von 7.5ºC/Minute erhöht wurde. Bei dem eingesetzten Detektor handelte es sich um einen Flammen-Ionisations-Detektor. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 wiedergegeben. Tabelle 3
  • Anmerkung: Das Symbol "*" bedeutet, dass die Retentionszeit die gleiche wie diejenige von Trehalose war.
  • Wie aus den Ergebnissen in der Tabelle 3 ersichtlich, wurde gefunden, dass ein großer Anteil an Produkt "X" gebildet wurde, das die gleiche Retentionszeit zeigte wie die handelsübliche Trehalose. Um das Reaktionsprodukt "X" zu identifizieren, wurden die folgenden Tests zur Bestätigung durchgeführt. Ein Teil des Produktes der Enzymreaktion aus Maltose als Substrat wurde aufgelöst, um eine Saccharid- Konzentration von 2% in 20 mM Acetatpuffer (pH 4.5) zu ergeben, und 0.5 ml der resultierenden Lösung wurde als Probe entnommen, mit 0.1 Einheiten Glucoamylase, vertrieben von Seikagaku Corp., Tokyo, Japan, versetzt und für 20 Stunden bei 40ºC umgesetzt.
  • Ein weiterer Teil des Produktes der Enzymreaktion wurde aufgelöst, um eine Saccharid-Konzentration von 2% in 20 mM Phosphatpuffer (pH 7.0) zu ergeben, und 0.5 ml der resultierenden Lösung wurden mit 0.5 Einheiten Trehalase versetzt und für 20 Stunden bei 40ºC umgesetzt.
  • Produkt der Enzymreaktion von Maltose als Substrat sowie seine mit Glucoamylase bzw. Trehalase behandelten Produkte wurden über GLC analysiert und miteinander verglichen, wobei bestätigt wurde, dass Maltose durch Glucoamylase vollständig zu Glucose abgebaut wurde, während das Reaktionsprodukt "X" nicht abgebaut wurde und unversehrt zurückblieb.
  • Darüber hinaus blieb Maltose nach der Behandlung mit Trehalase unversehrt zurück, während das Reaktionsprodukt "X" vollständig zu Glucose abgebaut wurde. Unter Berücksichtigung der Reaktionseigenheiten von Glucoamylase und Trehalase wurde das Oligosaccharid, das von dem neuartigen erfindungsgemäßen Enzym aus Maltose gebildet wurde, als Trehalose identifiziert.
  • Darüber hinaus wurde Trehalose als Substrat unter den gleichen Bedingungen wie im Fall der Maltose dem gereinigten Enzym ausgesetzt und die Reaktionsflüssigkeit wurde analog über GLC analysiert, wobei bestätigt wurde, dass das erfindungsgemäße Enzym Maltose aus Trehalose bildet. Die Ergebnisse der oben genannten GLC-Analysen werden in der Tabelle 4 wiedergegeben.
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 4 ersichtlich, wandelt das erfindungsgemäße Enzym Maltose in Trehalose um, ebenso wie es Trehalose in Maltose umwandelt. Es wurde gefunden, dass der Gleichgewichtspunkt auf der Seite der Trehalose liegt und daher der Umwandlungsgrad von Maltose in Trehalose hoch ist, insbesondere ca. 70% und mehr. Tabelle 4
  • Anmerkung: Das Symbol "A" bedeutet die Saccharid-Verbindungen (%) in den Reaktionsprodukten mit dem erfindungsgemäßen Enzym; "B", die Saccharid-Verbindungen (%) nach der Behandlung mit Glucoamylase; "C", die Saccharid-Verbindungen nach der Behandlung mit Trehalase
  • Experiment 6 Einfluss der Maltose-Konzentration auf die Bildung von Trehalose
  • Maltose-Lösungen mit einer Konzentration von jeweils 2.5%, 5%, 10%, 20% oder 40% wurden pro g fester Maltose mit 2 Einheiten eines gereinigten Enzyms zur Umwandlung von Maltose in Trehalose versetzt, das nach dem Verfahren in Experiment 2 erhalten worden war, und bei 20ºC und pH 7.0 umgesetzt und während der Reaktion wurden aus den Reaktionslösungen periodisch Proben genommen und für 10 Minuten auf 100ºC erhitzt, um das Enzym zu deaktivieren.
  • Die Reaktionsflüssigkeiten wurden quantitativ über das Anthron-Schwefelsäure- Verfahren auf den Gehalt an Gesamtzucker und über das Somogyi-Nelson-Verfahren auf den Gehalt an reduzierendem Zucker bestimmt und das Verhältnis von reduzierendem Saccharid zu Gesamtanteil an Saccharid wurde als Reduktionskraft berechnet.
  • Einzeln wurden die Reaktionslösungen verdünnt, um jeweils eine Saccharid- Konzentration von ca. 1% zu ergeben, zur Entfernung der Proteine über "MOLCUT® II LGC", einen miniaturisierten Ultrafilter, der von Japan Millipore Ltd., Tokyo, Japan, vertrieben wird, gegeben und dann über Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) auf die Saccharid-Zusammensetzung untersucht. Bei der eingesetzten HPLC-Apparatur handelte es sich um ein "CCPD SYSTEM®", das von Tosoh Corp., Tokyo, Japan, vertrieben wird und mit "YMC-PACK® PA-03", einer analytischen Säule mit einem Innendurchmesser von 4.6 mm und einer Länge von 250 mm, die von YMC Co., Ltd., Kyoto, Japan, vertrieben wird, ausgerüstet ist; diese wurde mit einer Mischung aus Acetonitril und Wasser (78 : 22, bezogen auf das Volumen) mit einer Fließgeschwindigkeit von 1.2 ml/Minute als Extraktionsmittel beschickt und die Bestimmung wurde mit Hilfe eines Differential-Reflektometers durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 5 wiedergegeben.
  • Wie aus den Ergebnissen in der Tabelle 5 ersichtlich, verläuft die Umwandlung von Maltose in Trehalose problemlos, unabhängig von der Konzentration der Maltose als Substrat, wobei sich eine Umwandlungsrate von ca. 80% zeigt. Tabelle 5
  • Experiment 7 Einfluss der Temperatur auf die Bildung von Trehalose
  • Maltose-Lösungen mit einer Konzentration von jeweils 20% wurden auf pH 7.0 eingestellt, pro g fester Maltose mit 2 Einheiten eines gereinigten Enzyms zur Umwandlung von Maltose in Trehalose, das nach dem Verfahren in Experiment 2 erhalten worden war, versetzt und entweder bei 5ºC, 10ºC, 15ºC, 20ºC oder 25ºC umgesetzt und während der Reaktion wurden den Reaktionsflüssigkeiten periodisch Proben entnommen und für 10 Minuten auf 100ºC erhitzt, um das Enzym zu deaktivieren. Die Flüssigkeiten der Enzymreaktion wurden über HPLC analog wie in Experiment 6 auf ihre Saccharid-Zusammensetzung untersucht. Die Trehalose- Gehalte bei den jeweiligen Reaktionstemperaturen und Reaktionszeiten sind in Tabelle 6 wiedergegeben. Tabelle 6
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 6 ersichtlich, verlief die Umwandlung von Maltose in Trehalose, auch wenn die Bildungsgeschwindigkeit bei einer höheren Temperatur günstiger war, selbst bei 5ºC problemlos und zeigte dabei eine Umwandlungsrate von ca. 82%.
  • Experiment 8 Herstellung von Trehalose aus Maltose
  • Zehn Gewichtsanteile Maltose, vertrieben von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okoyama, Japan, wurden in 40 Gewichtsanteilen Wasser gelöst, bei 15ºC und pH 7.0 pro g fester Maltose mit 2 Einheiten eines gereinigten Enzyms zur Umwandlung von Maltose in Trehalose versetzt, das nach dem Verfahren in Experiment 2 erhalten worden war, für 48 Stunden umgesetzt und für 10 Minuten auf 100ºC erhitzt, um das Enzym zu deaktivieren. Die resultierende Lösung enthielt ca. 74% Trehalose, berechnet auf trockner und fester Basis. Die Lösung wurde dann mit Aktivkohle entfärbt, mit Hilfe von Ionenaustauschern der H- und OH-Form deionisiert und gereinigt, auf ca. 78% konzentriert, mit 0.1% kristallinem Trehalosehydrat, berechnet auf trockner und fester Basis, als Kristallisationskeime versetzt und bei Zimmertemperatur über Nacht zur Kristallisation stehengelassen. Die resultierende Masse wurde abgetrennt und die Kristalle wurden zum Waschen mit einem geringen Anteil an Wasser besprüht, wobei ca. 3.0 Gewichtsanteile eines extrem reinen Trehalosehydrats mit einer Reinheit von 99.8% erhalten wurden.
  • Experiment 9 Produktion des Enzyms
  • Proben von jeweils 100 ml einer Nährflüssigkeit für Kulturen, bestehend aus 2.0 Gew.-% Glucose, 1.0 Gew.-% Ammoniumsulfat, 0.1 Gew.-% Di- Kaliumhydrogenphosphat, 0.06 Gew.-% Natriumdihydrogenphosphat, 0.05 Gew.-% Magnesiumsulfat, 0.3 Gew.-% Calciumsulfat und Wasser, wurden in 500 ml Kolben gegeben, zur Sterilisation bei 115ºC für 30 Minuten im Autoklaven behandelt, gekühlt, mit einer Vorratskultur Pseudomonas putida (FERM BP-4579) geimpft und bei 27ºC mit 200 rpm für 24 Stunden unter Schütteln gezüchtet, um eine Keimkultur zu erhalten.
  • Ca. 20 Liter eines frischen Präparats der gleichen Nährflüssigkeit für Kulturen, wie oben beschrieben, wurde in einen 30 Liter Gärbehälter gegeben, durch Erhitzen sterilisiert, auf 27ºC gekühlt, mit 1 Vol.-% Keimkultur geimpft und bei 27ºC für 20 Stunden unter Durchleiten von Luft und Schütteln gezüchtet, wobei 27ºC und pH 6.5-8.0 eingehalten wurden.
  • Die Aktivität des Enzyms zur Umwandlung von Maltose in Trehalose betrug ca. 0.12 Einheiten/ml. Ein Teil der Kultur wurde als Probe entnommen und über eine Zentrifuge in Zellen und überstehende Flüssigkeit getrennt und die Zellen wurden dann in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7.0) suspendiert, um das gleiche Volumen zu ergeben wie das der Kultur, der die Probe entnommen wurde, anschließend wurden die Enzymaktivitäten in der Zell-Suspension und in der überstehenden Flüssigkeit bestimmt, wobei zu beobachten war, dass in der Zell-Suspension eine Enzymaktivität von ca. 0.11 Einheiten/ml gefunden wurden, während in der überstehenden Flüssigkeit ca. 0.01 Einheiten/ml gefunden wurden. Die Enzymaktivitäten wurden bei 35ºC bestimmt.
  • Experiment 10 Reinigung des Enzyms
  • Die in Experiment 9 erhaltene Kultur wurde in der Zentrifuge separiert, um die Zellen von ca. 0.45 kg Nassgewicht aufzufangen, die dann in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7.0) suspendiert wurden. Die Zell-Suspension wurde im "MINI LABO®" behandelt, einem Ultra-Hochdruck-Zellzerkleinerer, der von Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan, vertrieben wird, um die Zellen zu zerkleinern, und das erhaltene Produkt wurde mit 15,000 rpm für 30 Minuten zentrifugiert, um 1.7 Liter einer überstehenden Flüssigkeit zu erhalten. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit Ammoniumsulfat versetzt, um einen Sättigungsgrad von 0.7 zu ergeben, über Nacht bei 4ºC stehengelassen, zentrifugiert und anschließend wurde das Sediment aufgefangen.
  • Das Sediment wurde in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7.0) gelöst und für 24 Stunden gegen ein frisches Präparat des gleichen Puffers dialysiert und dann zentrifugiert, um die unlöslichen Substanzen zu entfernen. Die Dialyselösung, ca. 400 ml, wurde in zwei Teile aufgeteilt, die dann separat einer Ionenaustauscher- Säulenchromatographie über 300 ml "DEAE TOYPEARL®" unterzogen wurden.
  • Das erfindungsgemäße Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose, welches an "DEAE TOYPEARL®" adsorbiert worden war, wurde davon mit einem frischen Präparat des gleichen Puffers, das jedoch zusätzlich Natriumchlorid enthielt, eluiert. Die enzymatisch aktiven Fraktionen wurden darüber hinaus einer Ionenaustauscher- Säulenchromatographie über 80 ml "DEAE TOYOPEARL®" unterzogen. Das Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose, das in der Säule adsorbiert worden war, wurde daraus mit einem von 0.1 M auf 0.3 M zunehmenden linearen Gradienten für Natriumchlorid eluiert und anschließend wurden die enzymatisch aktiven Fraktionen aufgefangen.
  • Die Fraktionen wurden einer Gel-Filtration-Säulenchromatographie über 400 ml "TOYOPEARL® HW-55S", das von Tosoh Corp., Tokyo, Japan, vertrieben wird, unterzogen und die enzymatisch aktiven Fraktionen wurden aufgefangen. Die Enzymaktivitäten, die spezifischen Aktivitäten und Ausbeuten bei den jeweiligen Reinigungsschritten sind in der Tabelle 7 wiedergegeben. Tabelle 7
  • Nach dem Prüfen der Reinheit des gereinigten Enzyms über eine elektrophoretische Behandlung mit Polyacrylamid-Gel mit einer Gel-Konzentration von 7.5 Gew.-% ergab sich ein einziges Proteinband, was bestätigte, dass das Enzym rein und homogen vorlag.
  • Experiment 11 Eigenschaften des Enzyms
  • Das gereinigte Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose, das nach den Verfahren in Experiment 10 erhalten worden war, wurde einer elektrophoretischen Behandlung über SDS-Polyacrylamid-Gel mit der Gel-Konzentration von 7.5 Gew.-% unterzogen und dann im Vergleich mit Molekulargewicht-Standards, die von Japan Bio-Rad Laboratories, Tokyo, Japan, vertrieben werden und über das gleiche Gel elektrophoretisch behandelt worden waren, auf das Molekulargewicht untersucht, wobei sich herausstellte, dass das Molekulargewicht des Enzyms ca. 110,000-120,000 Dalton betrug.
  • Das gereinigte Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose wurde einer Elektrophorese über Polyacrylamid-Gel unter Einsatz von 2 Gew.-% Ampholin, das von Pharmacia LKB, Uppsala, Schweden, vertrieben wird, unterzogen und die pH- Werte der Proteinbänder und des Gels wurden bestimmt, wobei sich herausstellte, dass der isoelektrische Punkt des Enzyms ca. pI 4.1-5.1 betrug.
  • Die Auswirkungen der Temperatur und des pH auf die Enzymaktivität wurden gemäß den Prüfungsverfahren untersucht. Die Ergebnisse sind für den Einfluß der Temperatur in Fig. 5 und für den Einfluß des pH in Fig. 6 wiedergegeben. Die optimale Temperatur lag bei ca. 37ºC, wenn man die Reaktion bei pH 7.0 für 60 Minuten ablaufen ließ, während der optimale pH bei ca. 7.3-8.3 lag, wenn man die Reaktion bei 35ºC für 60 Minuten ablaufen ließ. Die thermische Stabilität des Enzyms wurde bestimmt, indem man das Enzym in 50 mM Phosphat-Puffer (pH 7.0) bei verschiedenen Temperaturen für 60 Minuten züchtete, mit Wasser kühlte und die restlichen Enzymaktivitäten bestimmte. Während die pH-Stabilität bestimmt wurde, indem man das Enzym in 50 mM Phosphat-Puffer bei verschiedenen pH-Werten bei 35ºC für 60 Minuten züchtete, den pH auf 7.0 einstellte und die restlichen Enzymaktivitäten bestimmte. Die jeweiligen Ergebnisse für die thermische Stabilität sind in Fig. 7 und die für die pH-Stabilität in Fig. 8 wiedergegeben. Die thermische Stabilität des Enzyms reichte bis zu ca. 40ºC, während die pH-Stabilität bei ca. 6.0-9.5 lag. Die Enzymaktivität wurde mit 1 mM Cu²&spplus;, Hg²&spplus; und 50 mM Tris-HCl-Puffer gehemmt.
  • Experiment 12 Wirkung auf verschiedene Saccharide
  • Es wurden verschiedene Saccharide auf ihre Verwendbarkeit als Substrat für das gereinigte Enzym aus Pseudomas putida H262, das in Experiment 10 gemäß dem Verfahren in Experiment 4 erhalten worden war, mit der Ausnahme, dass die Reaktionstemperatur auf 35ºC eingestellt wurde. Das Ergebnis war, dass das Enzym aus Pseudomas putida H262, ähnlich wie das Enzym aus Pimelobacter species R48, nur mit Maltose und Trehalose reagierte, um Maltose in Trehalose ebenso wie Trehalose in Maltose umzuwandeln. Es wurde gefunden, dass das Gleichgewicht auf Seiten der Trehalose lag und deshalb das Verhältnis der Umwandlung von Maltose in Trehalose hoch war und insbesondere ca. 70% betrug.
  • Experiment 13 Einfluss der Maltose-Konzentration auf die Bildung von Trehalose
  • Maltose-Lösungen mit einer Konzentration von jeweils 5%, 10%, 20% oder 30% wurden pro g fester Maltose mit 2 Einheiten eines gereinigten Enzyms zur Umwandlung von Maltose in Trehalose versetzt, das nach dem Verfahren in Experiment 10 erhalten worden war, und bei 35ºC und pH 7.0 umgesetzt und während der Reaktion wurden aus den Reaktionslösungen periodisch Proben entnommen und für 10 Minuten auf 100ºC erhitzt, um das Enzym zu deaktivieren.
  • Die Reaktionsflüssigkeiten wurden ähnlich wie in Experiment 6 auf die Reduktionskraft und die Saccharid-Zusammensetzung geprüft. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 wiedergegeben. Tabelle 8
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 8 ersichtlich, verläuft die Umwandlung von Maltose in Trehalose problemlos, unabhängig von der Konzentration der Maltose als Substrat, wobei sich eine Umwandlungsrate von ca. 70% zeigt.
  • Experiment 14 Herstellung von Trehalose aus Maltose
  • Zehn Gewichtsanteile Maltose, vertrieben von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, wurden in 40 Gewichtsanteilen Wasser gelöst, bei 35ºC und pH 7.0 pro g fester Maltose mit 2 Einheiten eines gereinigten Enzyms zur Umwandlung von Maltose in Trehalose, das nach dem Verfahren in Experiment 10 erhalten worden war, versetzt, für 48 Stunden umgesetzt und für 10 Minuten bei 100ºC umgesetzt, um das Enzym zu deaktivieren. Die resultierende Lösung enthielt ca. 69% Trehalose, berechnet auf trockner und fester Basis. Die Lösung wurde dann mit Aktivkohle entfärbt, mit Hilfe von Ionenaustauschern der H- und OH-Form deionisiert und gereinigt, auf ca. 78% konzentriert, mit 0.1% kristallinem Trehalosehydrat, berechnet auf trockner und fester Basis, als Kristallisationskeim versetzt und bei Zimmertemperatur über Nacht zur Kristallisation stehengelassen. Die resultierende Masse wurde abgetrennt und die Kristalle wurden zum Waschen mit einem geringen Anteil an Wasser besprüht, wobei ca. 2.3 Gewichtsanteile eines extrem reinen Trehalosehydrats mit einer Reinheit von 99.7% erhalten wurden.
  • Experiment 15 Produktion des Enzyms
  • Proben von jeweils 100 ml einer Nährflüssigkeit für Kulturen, bestehend aus 0.5 Gew.-% Polypepton, 0.1 Gew.-% Hefeextrakt, 0.07 Gew.-% Ammoniumnitrat, 0.01 Gew.-% Dinatriumhydrogenphosphat, 0.02 Gew.-% Magnesiumsulfat und Wasser, wurden in 500 ml Kolben gegeben, zur Sterilisation bei 120ºC für 20 Minuten im Autoklaven behandelt, gekühlt, mit einer Vorratskultur Thermus aquaticus (ATCC33923) geimpft und bei 60ºC mit 200 rpm für 24 Stunden unter Schütteln gezüchtet, um eine Keimkultur zu erhalten.
  • Ca. 20 Liter eines frischen Präparats der gleichen Nährflüssigkeit für Kulturen, wie oben beschrieben, wurde in zwei 30 Liter Gärbehälter gegeben, durch Erhitzen sterilisiert, auf 60ºC gekühlt, mit 1 Vol.-% Keimkultur geimpft und bei 60ºC für 20 Stunden unter Durchleiten von Luft und Schütteln gezüchtet, wobei 60ºC und pH 6.5-8.0 eingehalten wurden.
  • Die Aktivität des Enzyms zur Umwandlung von Maltose in Trehalose in der Kultur betrug ca. 0.35 Einheiten/ml. Ein Teil der Kultur wurde als Probe entnommen und über eine Zentrifuge in Zellen und überstehende Flüssigkeit getrennt und die Zellen wurden dann in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7.0) suspendiert, um das gleiche Volumen zu ergeben wie das der Kultur, der die Probe entnommen worden war, anschließend wurden die Enzymaktivitäten in der Zell-Suspension und in der überstehenden Flüssigkeit bestimmt, wobei zu beobachten war, dass in der Zell- Suspension eine Enzymaktivität von ca. 0.33 Einheiten/ml gefunden wurden, während in der überstehenden Flüssigkeit ca. 0.02 Einheiten/ml gefunden wurden. Die Enzymaktivitäten wurden bei 60ºC bestimmt.
  • Experiment 16 Reinigung des Enzyms
  • Die in Experiment 15 erhaltene Kultur wurde in der Zentrifuge separiert, um die Zellen von ca. 0.28 kg Nassgewicht aufzufangen, die dann in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7.0) suspendiert wurden. Ca. 1.9 Liter der Zell-Suspension wurden in einem Ultraschall-Zellzerkleinerer "MODEL US300®" behandelt, der von Nippon Seiki Co., Ltd., Niigata, Japan, vertrieben wird, um die Zellen zu zerkleinern, und das erhaltene Produkt wurde mit 15,000 rpm für 30 Minuten zentrifugiert, um 1.8 Liter einer überstehenden Flüssigkeit zu erhalten. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit Ammoniumsulfat versetzt, um einen Sättigungsgrad von 0.7 zu ergeben, über Nacht bei 4ºC stehengelassen, zentrifugiert und anschließend wurde das Sediment aufgefangen.
  • Das Sediment wurde in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7.0) gelöst und gegen ein frisches Präparat des gleichen Puffers für 24 Stunden dialysiert und dann zentrifugiert, um die unlöslichen Substanzen zu entfernen. Die Dialyselösung, ca. 1,560 ml, wurde in drei Teile aufgeteilt, die dann separat einer Ionenaustauscher- Säulenchromatographie über 530 ml "DEAE TOYO PEARL® 650" unterzogen wurden.
  • Das erfindungsgemäße Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose, welches an "DEAE TOYOPEARL®" adsorbiert worden war, wurde davon mit einem frischen Präparat des gleichen Puffers, das jedoch zusätzlich Natriumchlorid enthielt, eluiert. Die so erhaltenen enzymatisch aktiven Fraktionen wurden aufgefangen, gegen ein frisch bereitetes Präparat des gleichen Puffers, das jedoch zusätzlich 1 M Ammoniumsulfat enthielt, dialysiert und einer hydrophoben Ionenaustauscher- Säulenchromatographie über 380 ml "BUTYL TOYOPEARL® 650" unterzogen. Das Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose, das in der Säule adsorbiert war, wurde daraus mit einem von 1 M auf 0 M abnehmenden linearen Gradienten für Ammoniumsulfat eluiert und anschließend wurden die enzymatisch aktiven Fraktionen aufgefangen.
  • Die Fraktionen wurden einer Gel-Filtration-Säulenchromatographie über 380 ml "TOYOPEARL® HW-55S" unterzogen und die enzymatisch aktiven Fraktionen wurden aufgefangen.
  • Danach wurden die Fraktionen einer Ionenaustauscher-Säulenchromatographie über 1.0 ml "MONO Q® HR5/5", das von Pharmacia LKB, Uppsala, Schweden, vertrieben wird, unterzogen und mit einem linearen, von 0.1 M auf 0.35 M anwachsenden Gradienten für Natriumchlorid eluiert, anschließend wurden die enzymatisch aktiven Fraktionen aufgefangen. Die Enzymaktivitäten, spezifischen Aktivitäten und Ausbeuten für die jeweiligen Reinigungsschritte sind in Tabelle 9 wiedergegeben.
  • Nach der Reinheitsprüfung des gereinigten Enzyms über Polyacrylamid-Gel- Elektrophorese mit einer Gel-Konzentration von 5 Gew.-% ergab sich ein einziges Proteinband, was bestätigte, dass das Enzym homogen und hochrein war. Tabelle 9
  • Experiment 17 Eigenschaften des Enzyms
  • Ein gereinigtes Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose, das nach dem Verfahren in Experiment 16 erhalten worden war, wurde einer elektrophoretischen Behandlung über SDS-Polyacrylamid-Gel mit einer Gel-Konzentration von 7.5 Gew.-% unterzogen und dann durch den Vergleich mit Molekulargewicht-Standards, die von Japan Bio-Rad Laboratories, Tokyo, Japan, vertrieben werden und über das gleiche Gel elektrophoretisch behandelt worden waren, auf das Molekulargewicht untersucht, wobei sich herausstellte, dass das Molekulargewicht des Enzyms ca. 100,000-110,000 Dalton betrug.
  • Das gereinigte Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose wurde einer Elektrophorese über Polyacrylamid-Gel unter Einsatz von 2 Gew.-% Ampholin, das von Pharmacia LKB, Uppsala, Schweden, vertrieben wird, unterzogen und die pH- Werte der Proteinbänder und des Gels wurden bestimmt, wobei sich herausstellte, dass der isoelektrische Punkt des Enzyms ca. pI 3.8-4.8 betrug.
  • Die Auswirkungen der Temperatur und des pH auf die Enzymaktivität wurden gemäß den Prüfungsverfahren untersucht. Die Ergebnisse sind für den Einfluß der Temperatur in Fig. 9 und für den Einfluß des pH in Fig. 10 wiedergegeben. Die optimale Temperatur für das Enzym lag bei ca. 65ºC, wenn man die Reaktion bei pH 7.0 für 60 Minuten ablaufen ließ, während der optimale pH bei ca. 6.0-6.7 lag, wenn man die Reaktion bei 60ºC für 60 Minuten ablaufen ließ. Die thermische Stabilität des Enzyms wurde bestimmt, indem man das Enzym in 50 mM Phosphat-Puffer (pH 7.0) bei verschiedenen Temperaturen für 60 Minuten züchtete, mit Wasser kühlte und die restlichen Aktivitäten bestimmte. Während die pH-Stabilität bestimmt wurde, indem man das Enzym in 50 mM Phosphat-Puffer bei verschiedenen pH-Werten bei 60ºC für 60 Minuten züchtete, den pH auf 7.0 einstellte und die restlichen Enzymaktivitäten bestimmte. Die jeweiligen Ergebnisse für die thermische Stabilität sind in Fig. 11 und die für die pH-Stabilität in Fig. 12 wiedergegeben. Die thermische Stabilität des Enzyms reichte bis zu ca. 80ºC, während die pH-Stabilität bei ca. 5.5-9.0 lag. Die Enzymaktivität wurde mit 1 mM Cu²&spplus;, Hg²&spplus; und 50 mM Tris- HCl-Puffer gehemmt.
  • Experiment 18 Wirkung auf verschiedene Saccharide
  • Es wurden verschiedene Saccharide auf ihre Verwendbarkeit als Substrat für das gereinigte Enzym aus Thermus aquaticus (ATCC33923), das in Experiment 16 gemäß dem Verfahren in Experiment 4 erhalten worden war, mit der Ausnahme, dass die Reaktionstemperatur auf 50ºC eingestellt wurde. Das Ergebnis war, dass das Enzym aus Thermus aquaticus (ATCC33923), ähnlich wie die Enzyme aus Pimelobacter species R48 und Pseudomas putida H262, nur mit Maltose und Trehalose reagierte, um Maltose in Trehalose ebenso wie Trehalose in Maltose umzuwandeln. Es wurde gefunden, dass das Gleichgewicht auf Seiten der Trehalose lag und deshalb das Verhältnis der Umwandlung von Maltose in Trehalose hoch war, insbesondere ca. 70% und mehr betrug.
  • Experiment 19 Einfluss der Maltose-Konzentration auf die Bildung von Trehalose
  • Maltose-Lösungen mit einer Konzentration von jeweils 2.5%, 5%, 10%, 20% oder 40% wurden pro g fester Maltose mit 2 Einheiten eines gereinigten Enzyms zur Umwandlung von Maltose in Trehalose versetzt, das nach dem Verfahren in Experiment 16 erhalten worden war, bei 60ºC und pH 6.5 versetzt und umgesetzt und nach Ablauf von 72 Stunden wurden aus den Reaktionslösungen Proben entnommen und für 30 Minuten auf 100ºC erhitzt, um das Enzym zu deaktivieren. Die Reaktionsflüssigkeiten wurden ähnlich wie in Experiment 6 auf die Reduktionskraft und die Saccharid-Zusammensetzung geprüft. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 wiedergegeben. Tabelle 10
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 10 ersichtlich, verläuft die Umwandlung von Maltose in Trehalose problemlos, unabhängig von der Konzentration der Maltose als Substrat, wobei sich eine Umwandlungsrate von ca. 70% zeigt.
  • Experiment 20 Einfluss der Temperatur auf die Bildung von Trehalose
  • Maltose-Lösungen mit einer Konzentration von jeweils 20% wurden auf pH 6.5 eingestellt, pro g fester Maltose mit 2.5 Einheiten eines gereinigten Enzyms zur Umwandlung von Maltose in Trehalose aus Thermus aquaticus (ATCC33923), das nach dem Verfahren in Experiment 16 erhalten worden war, versetzt und entweder bei 40ºC, 50ºC, 60ºC oder 70ºC umgesetzt und während der Reaktion wurden den Reaktionsflüssigkeiten periodisch Proben entnommen und für 30 Minuten auf 100ºC erhitzt, um das Enzym zu deaktivieren. Die Flüssigkeiten der Enzymreaktion wurden über HPLC analog wie in Experiment 6 auf ihre Saccharid-Zusammensetzung untersucht. Die Trehalose-Gehalte bei den jeweiligen Reaktionstemperaturen und Reaktionszeiten sind in Tabelle 11 wiedergegeben. Tabelle 11
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 11 ersichtlich, verlief die Umwandlung von Maltose in Trehalose problemlos und zeigte dabei eine Umwandlungsrate von ca. 80%, auch wenn die Bildungsgeschwindigkeit bei einer tieferen Temperatur von 40ºC günstiger war.
  • Experiment 21 Herstellung und Eigenschaften des Enzyms zur Umwandlung von Maltose in Trehalose aus anderen Mikroorganismen
  • Von den konventionellen Mikroorganismen wurden die bestimmten Mikroorganismen, die für die Produktion des erfindungsgemäßen Enzyms zur Umwandlung von Maltose in Trehalose ausgesucht worden waren, in Kolben für 48 Stunden gemäß dem Verfahren in Experiment 15 gezüchtet. Die jeweiligen Kulturen wurden auf ihre Enzymaktivität untersucht und dann gemäß dem Verfahren in Experiment 16 mit einem Zellzerkleinerer verarbeitet und die überstehenden Flüssigkeiten wurden dialysiert, um partiell gereinigte Enzyme zu erhalten, die dann auf ihre Eigenschaften gemäß dem Verfahren in Experiment 17 untersucht wurden. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 12 wiedergegeben.
  • Nach dem Prüfen der partiell gereinigten Enzyme, die aus diesen konventionellen Mikroorganismen des Stammes Thermus bei der Umsetzung gemäß dem Verfahren in Experiment 18 mit verschiedenen Sacchariden erhalten worden waren, wurde gefunden, dass sie, ähnlich wie das aus dem Thermus aquaticus (ATCC33923) erhaltenen Enzym, nur mit Maltose und Trehalose reagierten, um Trehalose aus Maltose ebenso wie Maltose aus Trehalose zu bilden.
  • Es wurde auch gefunden, dass das Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose aus dem Thermus ruber (ATCC35948) in der optimalen Temperatur und der thermischen Stabilität niedriger lag als das aus dem Thermus aquaticus (ATCC33923), jedoch die Enzyme aus den anderen Mikroorganismen nahezu die gleichen Eigenschaften wie die aus dem Thermus aquaticus (ATCC33923) sowie eine hohe Hitzebeständigkeit aufwiesen. Tabelle 12
  • Experiment 22 Physikochemische Eigenschaften von Trehalose-Präparaten
  • Eine hochreine Trehalose, die nach dem Verfahren in Experiment 8 hergestellt worden war, wurde auf ihre physikochemischen Eigenschaften geprüft. Der Schmelzpunkt betrug 97.0ºC; die spezifische Drehung [alpha]D²&sup0; +199º (c = 5); die Schmelzwärme 57.8 kJ/Mol; und sie besaß mit 77.0 g in 25ºC warmem Wasser eine Löslichkeit wie eine wasserfreie Substanz. Diese physikalischen Werte standen in guter Übereinstimmung mit denen eines gleichzeitig getesteten handelsüblichen kristallinen Trehalosehydrates, einem Produkt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan.
  • Experiment 23 Untersuchung der Assimilation an lebenden Personen
  • Gemäß dem Verfahren, das von Atsuji et al. in Rinsho Eiyo (Clinical Nutrition), Vol. 41, No. 2, pp. 200-208 (1972) beschrieben wird, wurden 30 g einer hochreinen Trehalose mit einer Reinheit von 99.8%, die in Experiment 8 hergestellt worden war, zu einer wässerigen Lösung von 20 Gew.-% verarbeitet und oral drei gesunden Menschen im Alter von 26, 27 und 30 Jahren verabreicht, danach wurden von ihrem Blut periodisch Proben genommen und auf Blutzucker und den Insulingehalt untersucht. Zur Kontrolle wurde Glucose herangezogen. Das Ergebnis war, dass sich Trehalose ähnlich wie Glucose verhielt und der Blutzucker und der Insulingehalt ein Maximum ca. 0.5-1 Stunde nach der Einnahme erreichte. Somit wurde bestätigt, dass Trehalose leicht verdaut und absorbiert wurde und dann metabolisiert und als Energiequelle gebraucht wurde. Somit sind Trehalose und Trehalose enthaltende Saccharide als Saccharid-Quelle für die Ergänzung von Energie geeignet.
  • Experiment 24 Untersuchung der akuten Toxizität
  • Ein Test der akuten Toxizität wurde mit einer hochreinen Trehalose, die nach dem Beispiel A-6 hergestellt worden war, durchgeführt, indem man sie oral Mäusen verabreichte. Das Ergebnis war, dass sich Trehalose eine wenig toxische Substanz erwies, die selbst in der höchst möglichen Dosis nicht zum Tode führte. Somit liegt ihr LD50 im Bereich von 50 g/kg oder mehr.
  • Experiment 25 Einfluss der Maltose-Konzentration auf die Bildung der Trehalose bei der Kultivierung
  • Der Einfluss der Maltose-Konzentration auf den Trehalose-Gehalt in Kulturen wurde durch die Kultivierung verschiedener Arten von Mikroorganismen, die in der Lage sind, das Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehlaose zu produzieren, in einer Nährflüssigkeit für Kulturen mit 2-20% Maltose geprüft. Insbesondere im Falle des Pimelobacter species R48 (FERM BP-4315) wurde die Züchtung in einem Gärbehälter bei 27ºC für 72 Stunden ähnlich wie in Experiment 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass in der Nährflüssigkeit 2.0 Gew.-% Glucose durch 2-20 Gew.-% Maltose ersetzt wurden, die getrennt sterilisiert worden war, die Nährflüssigkeit wurde mit 0.1 Vol.-% "TWEEN 40", einem oberflächenaktiven Stoff, der Polyoxyäthylen-sorbitan-palmitat enthält und von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan, vertreiben wird, versetzt und für weitere 24 Stunden kultiviert. Im Falle des Thermus aquaticus (ATCC33923) wurde die Züchtung in einem Gärbehälter bei 60ºC für 24 Stunden ähnlich wie in Experiment 15 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass eine Nährflüssigkeit für Kulturen mit 2-20 Gew.-% Maltose, die getrennt sterilisiert worden war, eingesetzt wurde, mit 0.1 Vol.-% "TWEEN 40" versetzt und für weitere 24 Stunden kultiviert wurde. Die Kulturen wurden in der Zentrifuge separiert und die überstehenden Flüssigkeiten wurden über HPLC auf ihren Trehalose-Gehalt (mg/ml) untersucht. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 13 wiedergegeben.
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 13 ersichtlich, wurde gefunden, dass eine Maltose-Konzentration von 20 Gew.-% oder weniger, vorzugsweise 15 Gew.-% oder weniger, besonders bevorzugt 5-10 Gew.-%, günstig für die Produktion von Trehalose war, da sie eine erhöhte Trehalose-Ausbeute bewirkte. Tabelle 13
  • Die folgenden Beispiele A sollen Verfahren zur Herstellung von Trehalose oder Trehalose enthaltenden Sacchariden unter Einsatz des erfindungsgemäßen Enzyms zur Umwandlung von Maltose in Trehalose erläutern, während die Beispiele B Verbindungen aufzeigen sollen, die diese jeweils enthalten.
  • Beispiel A-1
  • Kartoffelstärke wurde als ca. 10%ige Suspension (pH 5.5) pro g fester Stärke mit 2 Einheiten "SPITASE® HS", einer alpha-Amylase, die von Nagase Biochemical Ltd., Kyoto, Japan, vertrieben wird, versetzt, unter Rühren und Erhitzen geliert und verflüssigt, unmittelbar darauf im Autoklaven für 20 Minuten bei 120ºC behandelt und dann auf 50ºC und pH 5.0 eingestellt. Das resultierende Produkt wurde pro g fester Stärke mit 20 Einheiten beta-Amylase, vertrieben von Nagase Biochemical Ltd., Kyoto, Japan, zusammen mit 500 Einheiten Isoamylase, vertrieben von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, versetzt, für 24 Stunden umgesetzt, auf 95ºC erhitzt, um die Enzyme zu deaktivieren, filtriert und entfärbt, um eine Saccharid-Flüssigkeit mit einem Maltose-Gehalt von ca. 92% zu erhalten. Eine Nährflüssigkeit für Kulturen wurde gemäß dem Verfahren in Experiment 1 hergestellt, mit der Ausnahme, dass anstatt der 2.0 Gew.-% Glucose die oben genannte Saccharid-Flüssigkeit als Saccharid-Quelle separat sterilisiert und zu einem Anteil von 10 Gew.-%, bezogen auf den Feststoff, hinzugegeben wurde, das ganze wurde in einen Gärbehälter gegeben und mit 1 Gew.-% Keimkultur der Pimelobacter species R48 (FERM BP-4315), einem Mikroorganismus, der in der Lage ist, das Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose zu produzieren, geimpft, bei 27ºC für 72 Stunden ähnlich wie in Experiment 1 unter Schütteln und Durchleiten von Luft gezüchtet, mit 0.2 Vol.-% "TRITON® X-100", einer oberflächenaktiven Substanz, die Alkylphenol-polyoxyäthylen-äther enthält und von Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan, vertrieben wird, versetzt und für weitere 24 Stunden kultiviert. Die Kultur wurde filtriert, um die unlöslichen Substanzen zu entfernen und das resultierende Filtrat wurde auf 95ºC erhitzt, um das Ezym zu deaktivieren, konzentriert, mit Aktivkohle entfärbt, filtiert, mit Ionenaustauschern der H- und OH-Form auf die übliche Weise deionisiert und gereinigt und weiter bis ca. 75% konzentriert, um auf diese Weise ein sirupartiges Produkt in einer Ausbeute von ca. 65%, berechnet auf trockner und fester Basis, zu erhalten. Das Produkt, das ca. 44% Trehalose enthält, kann vorteilhaft als Süßstoff, Mittel zur Geschmacksverbesserung, Stabilisator und Mittel zur Formgebung in einer Vielzahl von Verbindungen eingesetzt werden, einschließlich Lebensmittelprodukte, Kosmetika und Arzneimittel, denn es besitzt eine milde Süße und eine passende Viskosität sowie die Fähigkeit, Feuchtigkeit zurückzuhalten.
  • Beispiel A-2
  • Ein Filtrat einer Kultur, die nach dem Verfahren in Beispiel A-1 erhalten worden war, wurde bei pH 5.0 und 50ºC für 24 Stunden pro g Feststoff mit 10 Einheiten "GLUCOZYME®", einer Glucoamylase, die von Nagase Biochemical Ltd., Kyoto, Japan, vertrieben wird, umgesetzt, erhitzt, um das Enzym zu deaktivieren, entfärbt, deionisiert und gereinigt, um eine Saccharid-Flüssigkeit zu erhalten, die dann als Saccharid-Ausgangslösung einer Ionenaustauscher-Säulenchromatographie unter Einsatz von "XT-1016", einem stark sauren Kationenaustauscher der Natrium-Form mit einem Verknüpfungsgrad von 4%, der von Tokyo Organic Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Japan, vertrieben wird, unterzogen wurde, um so den Trehalose-Gehalt zu erhöhen. Der Ionenaustauscher war in vier ummantelten Kolonnen aus Rostfrei- Stahl mit jeweils einem Innendurchmesser von 5.4 cm gepackt, die dann kaskadenförmig angeordnet warten, um eine Gesamtlänge von 20 m zu ergeben. Während die Temperatur im Innern der Säulen auf 60ºC gehalten wurde, wurden sie mit 5 Vol.-% Saccharid-Flüssigkeit im Verhältnis zum Harz versetzt und mit 60ºC warmem Wasser beschickt mit einer SV von 0.15, um die Glucose durch Fraktionierung zu entfernen, anschließend wurden die mit Trehalose angereicherten Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen wurden gereinigt, konzentriert, im Vakuum getrocknet und pulverisiert, um mit einer Ausbeute von ca. 35%, berechnet auf trockner fester Basis, ein pulverförmiges Produkt mit einem hohen Trehalose-Gehalt zu erhalten. Das Produkt, das ca. 97% Trehalose, berechnet auf trockner fester Basis, enthält, kann vorteilhaft als Süßstoff, Mittel zur Geschmacksverbesserung, Mittel zur Qualitätsverbesserung, Stabilisator, Mittel zur Formgebung bei einer Vielzahl von Verbindungen, einschließlich Lebensmittelprodukte, Kosmetika und Arzneimittel, eingesetzt werden, denn es besitzt eine extrem niedrige Reduktionskraft und eine milde und angenehme Süße.
  • Beispiel A-3
  • Eine mit Trehalose angereicherte Fraktion, die nach dem Verfahren in Beispiel A-2 erhalten worden war, wurde mit Aktivkohle entfärbt, mit Ionenaustauschern auf die übliche Weise deionisiert und gereinigt, auf ca. 70% konzentriert, in ein Kristallisationsgefäß gegeben, mit ca. 2% kristallinem Trehalosehydrat versetzt und schrittweise gekühlt, um eine Masse mit einem Kristallisationsgrad von ca. 45% zu erhalten. Die Masse wurde dann mit 150 kg/cm² mittels einer Hochdruckdüse, die an dem oberen Teil eines Trockenturms angebracht war, versprüht, während von dem oberen Teil des Trockenturms 85ºC heiße Luft nach unten geleitet wurde und das resultierende kristalline Pulver auf einem netzartigen Metallband, das am Boden des Trockenturms angebracht war, aufgefangen wurde. Das kristalline Pulver wurde schrittweise entfernt und aus dem Trockenturm geschafft, während 45ºC warme Luft nach oben durch das durch das Förderband geleitet wurde. Das kristalline Pulver wurde in einen Auslagerungsturm gegeben, in dem das Pulver für 10 Stunden in einem Strom von gewärmter Luft gealtert wurde, um die Kristallisation und das Trocknen zu vervollständigen, womit ein kristallines Trehalosehydrat-Pulver in einer Ausbeute von ca. 90% im Verhältnis zu der mit Trehalose angereicherten Ausgangslösung, berechnet auf trockner fester Basis, erhalten wurde. Das Produkt kann vorteilhaft als Süßstoff, Mittel zur Geschmacksverbesserung und Stabilisator in einer Vielzahl von Verbindungen, einschließlich Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln, eingesetzt werden, denn es ist im wesentlichen frei von Hygroskopizität und leicht zu handhaben.
  • Beispiel A-4
  • Eine mit Trehalose angereicherte Fraktion, die nach dem Verfahren in Beispiel A-2 erhalten worden war, wurde ähnlich wie in Beispiel A-3 gereinigt, in ein Vakuumgefäß gegeben und im Vakuum gekocht, um einen Sirup mit einem Feuchtigkeitsgehalt von ca. 3.0% zu ergeben. Der Sirup wurde in ein Kristallisationsgefäß gegeben, mit 1% wasserfreier kristalliner Trehalose, gerechnet auf trockner fester Basis, als Kristallisationskeim versetzt, unter Rühren bei 120ºC kristallisiert, auf Aluminiumwannen verteilt und bei 100ºC für 6 Stunden zur Kristallisation und Alterung stehengelassen, wobei ein festes Produkt in Form eines Blockes entstand. Die Produkte wurden mit einer Schneidemaschine verarbeitet und im Fließbettverfahren getrocknet, um wasserfreie kristalline Trehalose als Pulver zu erhalten mit einem Feuchtigkewitsgehalt von ca. 0.3% in einer Ausbeute von ca. 85%, bezogen auf die mit Trehalose angereicherte Ausgangsfraktion, berechnet auf trockner fester Basis. Das Produkt kann vorteilhaft als weißer pulverisierter Süßstoff mit einer milden Süße in einer Vielzahl von Verbindungen, einschließlich Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln, eingesetzt werden, ebenso wie als Trockenmittel für Lebensmittelprodukte, Kosmetika, Arzneimittel und Ausgangsstoffe sowie Zwischenprodukte dafür.
  • Beispiel A-5
  • Kornstärke wurde als 33%ige Suspension mit 0.1% Calciumcarbonat versetzt, auf pH 6,5 eingestellt, mit 0.2%, berechnet auf trockner fester Basis, "TERMAMYL® 60L", einer alpha-Amylase, die von Novo Industri AS, Copenhagen, Dänemark, vertrieben wird, versetzt und bei 95ºC für 15 Minuten umgesetzt. Die Reaktionsflüssigkeit wurde für 30 Minuten bei 120ºC im Autoklaven behandelt, auf 55ºC gekühlt, pro g fester Stärke mit 500 Einheiten Isoamylase, vertrieben von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, zusammen mit 30 Einheiten beta-Amylase, vertrieben von Nagase Biochemical Ltd., Kyoto, Japan, pro g fester Stärke versetzt, für 48 Stunden umgesetzt, auf 95ºC erhitzt, um die Enzyme zu deaktivieren, filtriert und entfärbt, um eine Saccharid-Flüssigkeit zu erhalten mit einem Maltose-Gehalt von ca. 84%. Eine Nährlösung für Kulturen wurde entsprechend dem Verfahren in Experiment 9 hergestellt, mit der Ausnahme, dass die oben genannte Sacccharid-Flüssigkeit als Saccharid-Quelle separat sterilisiert wurde und zu einem Anteil von 10 Gew.-%, bezogen auf den Feststoff, der Nährlösung als Ergänzung zugegeben wurde, die dann in einen Gärbehälter gegeben wurde, mit 1 Vol.-% Keimkultur aus Pseudomonas putida H262 (FERM BP- 4579), einem Mikroorganismus, der in der Lage ist, das Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose zu produzieren, geimpft, für 48 Stunden bei 27ºC unter Durchleiten von Luft und Schütteln ähnlich wie in Experiment 9 gezüchtet, mit 0.2 Vol.-% "TWEEN® 40" versetzt und für weitere 48 Stunden kultiviert wurde. Die Kultur wurde filtriert, um die unlöslichen Substanzen zu entfernen und das erhaltene Filtrat wurde auf 95ºC erhitzt, um das Enzym zu deaktivieren, konzentriert, mit Aktivkohle entfärbt, filtriert, über Ionenaustauscher der H- und OH-Form auf die übliche Weise deionisiert und gereinigt und darüber hinaus auf ca. 70% konzentriert, wobei ein sirupartiges Produkt mit einer Ausbeute von 50%, berechnet auf trockner fester Basis, erhalten wurde. Das Produkt, das ca. 64% Trehalose enthielt, kann vorteilhaft in einer Vielzahl von Verbindungen, einschließlich Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln eingesetzt werden, denn es besitzt eine verringerte Reduktionskraft, eine milde Süße, eine geeignete Viskosität und die Fähigkeit, Feuchtigkeit zurückzuhalten.
  • Beispiel A-6
  • Ein Sirup, der nach dem Verfahren in Beispiel A-5 erhalten worden war, wurde auf ca. 80% konzentriert, in ein Kristallisationsgefäß gegeben, mit 1% kristallinem Trehalosehydrat als Kristallisationskeim versetzt und schrittweise unter Rühren gekühlt, um die Kristallisation zu bewirken. Die Kristalle in der erhaltenen Masse wurden mit einer Korbzentrifuge abgetrennt und zum Waschen mit einer minimalen Menge an Wasser besprüht, um ein hochreines kristallines Trehalosehydrat in einer Ausbeute von ca. 20%, berechnet auf trockner und fester Basis, zu erhalten. Das Produkt, das ähnliche physikochemische Eigenschaften zeigte wie die in Experiment 22, kann vorteilhaft als Süßstoff, Mittel zur Geschmacksverbesserung, Mittel zur Qualitätsverbesserung und Stabilisator in einer Vielzahl von Verbindungen, einschließlich Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln, eingesetzt werden. Das Produkt ist auch verwendbar als Reagenz in industrieller Anwendung und als chemisches Ausgangsmaterial.
  • Beispiel A-7
  • Kornstärke wurde als 10%ige Suspension (pH 5.5) pro g fester Stärke mit 2 Einheiten "SPITASE® HS", einer kommerziell erhältlichen alpha-Amylase, versetzt, geliert und unter Rühren und Erhitzen verflüssigt, sofort anschließend bei 120ºC für 20 Minuten im Autoklaven behandelt und dann auf 55ºC und pH 5.0 eingestellt. Die resultierende Lösung wurde pro g fester Stärke mit 300 Einheiten Isoamylase, vertrieben von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, zusammen mit 20 Einheiten beta-Amylase, vertrieben von Nagase Biochemical Ltd., Kyoto, Japan, versetzt, für 24 Stunden umgesetzt, auf 95ºC erhitzt, um die Enzyme zu deaktivieren, filtriert und entfärbt, um ein flüssiges Saccharid mit einem Maltose- Gehalt von ca. 92% zu erhalten. Es wurde eine Nährlösung für Kulturen nach dem Verfahren in Experiment 15, mit der Ausnahme, dass das oben genannte flüssige Saccharid separat sterilisiert und der Nährlösung zu einem Anteil von 10 Gew.-%, berechnet auf trockner fester Basis, als Saccharid-Quelle zugegeben wurde, hergestellt, in einen Gärbehälter gegeben, mit 1 Vol.-% Keimkultur des Thermus aquaticus (ATCC33923), einem Mikroorganismus, der in der Lage ist, das Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose zu produzieren, geimpft, für 40 Stunden ähnlich wie in Experiment 15 bei 60ºC gezüchtet, mit 0.1 Vol.-% "TRITON® X-100" zusammen mit 50 mg Eiweiß-Lysozym pro Liter Kultur versetzt und für weitere 16 Stunden kultiviert. Die Kultur wurde filtriert, um die unlöslichen Substanzen zu entfernen und das erhaltene Filtrat wurde auf 95ºC erhitzt, um das Enzym zu deaktivieren, konzentriert, mit Aktivkohle entfärbt, filtriert, auf die übliche Weise über Ionenaustauscher der H- und OH-Form deionisiert und gereinigt und weiter auf ca. 70% konzentriert, um auf diese Weise ein sirupartiges Produkt mit einer Ausbeute von ca. 55%, berechnet auf trockner und fester Basis, zu erhalten. Das Produkt, das ca. 68% Trehalose, berechnet auf trockner und fester Basis, enthält, kann vorteilhaft als Süßstoff, Stabilisator und Mittel zur Formgebung in einer Vielzahl von Verbindungen eingesetzt werden, einschließlich Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln, da es eine milde Süße, eine passende Viskosität und die Fähigkeit Feuchtigkeit zurückzuhalten besitzt.
  • Beispiel A-8
  • Ein Sirup, der nach dem Verfahren in Beispiel A-7 erhalten worden war, wurde auf ca. 85% konzentriert, in ein Kristallisationsgefäß gegeben, mit 1% Kristallisationskeimen versetzt, auf Schalen verteilt, bei 20ºC für 4 Tage stehengelassen, um eine Kristallisation und Verfestigung zu bewirken, mit einem Zerkleinerungsaggregat pulverisiert und getrocknet, um eine kristalline Mischung eines Pulvers zu erhalten, die Trehalose mit einer Ausbeute von ca. 95%, berechnet auf trockner und fester Basis, enthielt. Das Produkt kann vorteilhaft als Süßstoff, Mittel zur Geschmacksverbesserung, Mittel zur Qualitätsverbesserung und Stabilisator in einer Vielzahl von Verbindungen eingesetzt werden, einschließlich Lebensmittelprodukten, Kosmetika, und Arzneimitteln, da es im wesentlichen nicht hygroskopisch und leicht zu handhaben ist.
  • Beispiel A-9
  • Ein Sirup, der nach dem Verfahren in Beispiel A-7 erhalten worden war, wurde auf ca. 80% konzentriert, in ein Kristallisationsgefäß gegeben und ähnlich wie in Beispiel A-6 kristallisiert und die erhaltenen Kristalle wurden separiert, um ein hochreines kristallines Trehalosehydrat mit einer Ausbeute von ca. 20%, berechnet auf trockner und fester Basis, zu erhalten. Das Produkt, das wie das Produkt in Beispiel A-6 ähnliche physikochemische Eigenschaften besitzt wie die in Experiment 22, kann vorteilhaft in einer Vielzahl von Verbindungen, einschließlich Lebensmittelprodukte, Kosmetika und Arzneimittel, ebenso wie in industriellen oder chemischen Reagenzien und Ausgangsstoffen eingesetzt werden.
  • Beispiel B-1 Süßstoff
  • Ein Gewichtsanteil kristallines Trehalosehydrat-Pulver, das nach dem Verfahren in Beispiel A-3 erhalten wurde, wurde homogen mit 0.01 Gewichtsanteilen "ALPHA G SWEET®", einem alpha-Glycosyl-Steviosid, das von Toyo Sugar Refining Co., Ltd., Tokyo, Japan, vertrieben wird, und 0.01 Gewichtsanteilen "ASPARTAME®", einem L- Aspartyl-L-Phenylalanin-Methylester, der von Ajinomoto Inc., Tokyo, Japan, vertrieben wird, vermischt und die Mischung wurde in einem Granulator verarbeitet, um einen Süßstoff als granuliertes Produkt zu erhalten. Das Produkt besitzt eine überragende Süßqualität und eine ca. zweimal so hohe Süßkraft wie Saccharose und sein Kaloriengehalt liegt pro Süßkraft bei ca. der Hälfte des Gehaltes für Saccharose. Da das Produkt eine überragende Stabilität besitzt und keine Zersetzung der Zusätze, die eine hohe Süßkraft aufweisen, zeigt, ist es als kalorienarmer Süßstoff zum Süßen von kalorienarmen Lebensmittelprodukten für Personen mit Diabetes und Übergewicht geeignet, deren Kalorienaufnahme eingeschränkt ist. Darüber hinaus ist das Produkt zum Süßen von Lebensmittelprodukten geeignet, die Zahnkaries unterdrücken, da es weniger die Bildung von Säuren und unlöslichen Glucanen durch Karies verursachende Mikroorganismen induziert.
  • Beispiel B-2 Hartbonbon
  • Einhundert Gewichtsanteile einer 55%igen Saccharose-Lösung wurden mit 30 Gewichtsanteilen eines Trehalose enthaltenden Sirups, der nach dem Verfahren in Beispiel A-1 erhalten wurde, unter Erhitzen vermischt, im Vakuum unter Erhitzen auf einen Feuchtigkeitsgehalt von unter 2% konzentriert, mit einem Gewichtsanteil Zitronensäure und einer passenden Menge Lemon-Geschmack und Farbstoff vermischt und auf die übliche Weise geformt, um die fertigen Produkte zu erhalten. Bei den Produkten handelt es sich um qualitativ hochwertige Hartbonbons, die fest sind, einen überragenden Geschmack besitzen und keine Saccharose-Kristallisation und Zersetzung aufweisen.
  • Beispiel B-3 Schokolade
  • Vierzig Gewichtsanteile Kakaopaste, 10 Gewichtsanteile Kakaobutter, 30 Gewichtsanteile Saccharose, 20 Gewichtsanteile eines hochreinen kristallinen Trehalosehydrats, das nach dem Verfahren in Beispiel A-6 erhalten wurde, wurden vermischt, in eine Reibmaschine gegeben, um die Teilchengröße zu reduzieren, und in einer Konche bei 50ºC für 2 Tage geknetet. Während des Knetens wurden 0.5 Gewichtsanteile Lecithin zugegeben und ausreichend homogen dispergiert. Das resultierende Produkt wurde mit einem Thermoelement auf 31ºC eingestellt, unmittelbar vor dem Festwerden der Butter in Formen gegeben, mit einem Vibrator entlüftet und zum Festwerden für 20 Minuten durch einen 10ºC kalten Kühltunnel geschickt. Der Inhalt wurde aus den Formen genommen und verpackt, um die fertigen Produkte zu erhalten. Die Produkte weisen keine Hygroskopizität auf, besitzen jedoch eine überragende Farbe, Glanz und Konsistenz und lösen sich im Mund leicht auf, um eine feine Süße und ein mildes Aroma und milden Geschmack zu ergeben.
  • Beispiel B-4 Kaugummi
  • Drei Gewichtsanteile einer Gummibasis wurden durch Schmelzen unter Erhitzen aufgeweicht, mit 4 Gewichtsanteilen Saccharose und 3 Gewichtsanteilen eines Pulvers eines kristallinen Trehalosehydrats versetzt, das nach dem Verfahren in Beispiel A-3 erhalten wurde, mit einer passenden Menge Geschmacks- und Farbstoffen vermischt, mit Walzen auf die übliche Weise geknetet, geformt und zum fertigen Produkt verpackt. Bei dem Produkt handelt es sich um einen Kaugummi mit einer überragenden Konsistenz, einem überragenden Geschmack und Aroma.
  • Beispiel B-5 Gesüßte Kondensmilch
  • In 100 Gewichtsanteilen frischer Milch wurden 3 Gewichtsanteile eines Sirups, der Trehalose enthielt, die nach dem Verfahren in Beispiel A-5 erhalten wurden, und 1 Gewichtsanteil Saccharose gelöst und die Mischung wurde durch Erhitzen auf einer Heizplatte pasteurisiert, auf 70% konzentriert und steril zu den fertigen Produkten abgefüllt. Das Produkt, das eine milde Süße und einen überragenden Geschmack und Aroma besitzt, kann vorteilhaft zum Würzen von Babynahrung, Früchten, Kaffee, Kakao und Tee eingesetzt werden.
  • Beispiel B-6 Milchsäurebakterien enthaltende Getränke
  • Einhundertundfünfundsiebzig Gewichtsanteile fettarmer Milch, 8 Gewichtsanteile eines Pulvers mit einem hohen Anteil an Trehalose, die nach dem Verfahren in Beispiel A-2 erhalten wurde, und 50 Gewichtsanteile eines Pulvers mit einem hohen Anteil an Lactosucrose, beschrieben in dem japanischen Patent Kokai No. 281,795/92, wurden in 1,200 Gewichtsanteilen Wasser gelöst, für 30 Minuten bei 65ºC pasteurisiert, auf 40ºC gekühlt, mit 30 Gewichtsanteilen eines Startmaterials versetzt und für 8 Stunden bei 37ºC auf die übliche Weise gezüchtet, um ein Getränk zu erhalten, das Milchsäurebakterien enthielt. Das Produkt besitzt einen überragenden Geschmack und Aroma. Die Oligosaccharide in dem Produkt halten die Milchsäurebakterien stabil und regen das Wachstum von Bifido-Bakterien an.
  • Beispiel B-7 Pulverisierter Saft
  • Dreiunddreißig Gewichtsanteile eines Orangensaft-Pulvers, das durch Sprühtrocknen hergestellt wurde, wurden unter Rühren homogen mit 50 Gewichtsanteilen eines hochreinen kristallinen Trehalosehydrats, das nach dem Verfahren in Beispiel A-6 erhalten wurde, 10 Gewichtsanteilen Saccharose, 0.65 Gewichtsanteilen Ziitronensäureanhydrid, 0.1 Gewichtsanteilen Maleinsäure, 0.1 Gewichtsanteilen L- Ascorbinsäure, 0.1 Gewichtsanteilen Natriumcitrat, 0.5 Gewichtsanteilen Pullulan und einer passenden Menge eines pulverisierten Geschmacksstoffes vermischt, zu einem feinen Pulver vermahlen, in einen Fließbett-Granulator gegeben, mit einem Sirup mit einem hohen Trehalose-Gehalt als Binder, der nach dem Verfahren in Beispiel A-5 erhalten wurde, bei einer Dampftemperatur von 40ºC besprüht, für 30 Minuten granuliert, in vorgegebene Mengen aufgeteilt und zum fertigen Produkt verpackt. Bei dem Produkt handelt es sich um einen pulverisierten Saft mit einem Fruchtanteil von ca. 30%. Das Produkt wies keinen unangenehmen Geschmack und Geruch auf und war über einen langen Zeitraum stabil.
  • Beispiel B-8 Eiermilch-Creme
  • Einhundert Gewichtsanteile Kornstärke, 100 Gewichtsanteile eines Sirups, der Trehalose enthielt, die nach dem Verfahren in Beispiel A-1 erhalten wurde, 80 Gewichtsanteile Maltose, 20 Gewichtsanteile Saccharose und ein Gewichtsanteil Natriumchlorid wurden homogen miteinander vermischt, mit 280 Gewichtsanteilen Eiern versetzt, gerührt, schrittweise mit 1,000 Gewichtsanteilen kochender Milch versetzt, weiter bei geringer Hitze gerührt, bis die Kornstärke vollständig geliert war und der Inhalt ein halbtransparentes Aussehen aufwies, wonach das resultierende Produkt gekühlt wurde, mit einer passenden Menge Vanille-Aroma versetzt wurde, in vorgegebene Anteile aufgeteilt wurde und zum fertigen Produkt verpackt wurde. Das Produkt besitzt einen weichen Glanz, eine milde Süße und einen überragenden Geschmack.
  • Beispiel B-9 "Uiro-no-moto"
  • Neunzig Gewichtsanteile Reispulver wurden homogen mit 20 Gewichtsanteilen Kornstärke, 40 Gewichtsanteilen Saccharose, 80 Gewichtsanteilen eines kristallinen Trehalosehydrat-Pulvers, das nach dem Verfahren in Beispiel A-3 erhalten wurde, und 4 Gewichtsanteilen Pullulan vermischt, um "uiro-no-moto" zu erhalten. Das "uiro- no-moto" wurde dann mit einer passenden Menge "matcha" oder pulverisiertem grünem Tee in Wasser homogen geknetet, in Kessel gegeben und für 60 Minuten mit Dampf behandelt, um "matcha-uiro" zu erhalten. Das Produkt besitzt einen hervorragenden Glanz, Konsistenz, Geschmack und Aroma. Das Produkt besitzt eine ausgedehnte Lebensdauer, da die Rückbildung von Stärke wirkungsvoll unterdrückt wird.
  • Beispiel B-10 "An (Bohnenbrei)"
  • Auf die übliche Weise wurden 10 Gewichtsanteile Adzuki-Bohnen als Ausgangsmaterial mit Wasser versetzt, gekocht und der zusammenziehende Geschmack, der scharfe Geschmack und die wasserlöslichen Begleitstoffe wurden entfernt, um so ca. 21 Gewichtsanteile eines klumpigen rohen Adzuki-Bohnenbreis zu erhalten. Der rohe Bohnenbrei wurde dann mit 14 Gewichtsanteilen Saccharose, 5 Gewichtsanteilen eines Sirups, der Trehalose enthielt, die nach dem Verfahren in Beispiel A-7 erhalten wurde, sowie 4 Gewichtsanteilen Wasser versetzt, gekocht, weiterhin mit einer geringen Menge Salatöl versetzt und sorgsam, um nicht die Granulate der Adzuki-Bohnen zu zerstören, geknetet, wodurch man ca. 35 Gewichtsanteile eines Bohnenbrei-Fertigproduktes erhielt. Das Produkt, das keine Verfärbung aufweist und eine hervorragende Konsistenz, Geschmack und Aroma besitzt, ist als Ausgangsstoff für "anpan", "manju", "dango", "monaka" und gefrorene Nachspeisen geeignet.
  • Beispiel B-11 "Bun"
  • Auf die übliche Weise wurden 100 Gewichtsanteile Weizenmehl, 2 Gewichtsanteile Hefe, 5 Gewichtsanteile Saccharose, 1 Gewichtsanteil eines Pulvers mit einem hohen Gehalt an Trehalose, das über das Verfahren nach Beispiel A-2 erhalten wurde, und 0.1 Gewichtsanteile anorganische Nährstoffe in Wasser geknetet, bei 26ºC für 2 Stunden fermentiert, für 30 Minuten gealtert und gebacken. Bei dem Produkt handelt es sich um ein qualitativ hochwertiges "bun" mit einer hervorragenden Farbe und Konsistenz, einer passenden Elastizität und einer milden Süße.
  • Beispiel B-12 Schinken
  • Eintausend Gewichtsanteile des oberen Teils der Schweinekeule wurde gleichmäßig mit 15 Gewichtsanteilen Natriumchlorid und 3 Gewichtsanteilen Kaliumnitrat gesalzen und an einem gekühlten Platz für einen Tag aufgeschichtet. Das resultierende Produkt wurde an einem gekühlten Platz für 7 Tage in eine Salzlösung eingelegt, die aus 500 Gewichtsanteilen Wasser, 100 Gewichtsanteilen Natriumchlorid, 3 Gewichtsanteilen Kaliumnitrat, 40 Gewichtsanteilen eines Pulvers mit einem hohen Trehalose-Gehalt, das über das Verfahren in Beispiel A-2 erhalten wurde, und Gewürzen bestand, mit gekühltem Wasser gewaschen, gebunden, geräuchert, gekocht, gekühlt und zum fertigen Produkt verpackt. Das Produkt ist ein qualitativ hochwertiger Schinken mit einer hervorragenden Farbe, Geschmack und Aroma.
  • Beispiel B-13 Pulverisierte Peptide
  • Ein Gewichtsanteil "HIMUTE S®", ein Sojabohnen-Peptid in einer 40%igen Lösung, das für den Gebrauch in Lebensmitteln bestimmt ist und von Fuji Oil Co., Ltd., Osaka, Japan, vertrieben wird, wurde mit 2 Gewichtsanteilen eines hochreinen kristallinen Trehalosehydrats, das nach dem Verfahren in Beispiel A-6 erhalten wurde, vermischt, in Plastikbehälter gegeben, bei 50ºC im Vakuum getrocknet und zerkleinert, um ein pulverförmiges Peptid-Produkt zu erhalten. Das Produkt, das einen hervorragenden Geschmack und Aroma besitzt, kann vorteilhaft als Ausgangsstoff für Süßigkeiten, wie z. B. Konfektmischungen und Eisnachtisch, ebenso als Babynahrung sowie als Nährlösung für den therapeutischen Einsatz, einschließlich orale und parenterale Flüssignahrung, eingesetzt werden.
  • Beispiel B-14 Pulverisiertes "miso"
  • Ein Gewichtsanteil rotes "miso" wurde mit 3 Gewichtsanteilen eines wasserfreien kristallinen Trehalose-Pulvers, das nach dem Verfahren in Beispiel A-4 erhalten wurde, vermischt, in eine Vielzahl von Vertiefungen in einer Metallplatte gegossen, zur Verfestigung bei Zimmertemperatur über Nacht stehengelassen und von der Platte entfernt, um "miso"-Festkörper zu erhalten, jeder mit ca. 4 g, die dann in einer Zerkleinerungsapparatur zu Pulver verarbeitet wurden. Das Produkt kann vorteilhaft als Gewürz in Nudeln nach chinesischer Art und "suimono", einer Art klarer Suppe, eingesetzt werden. Während die "miso"-Festkörper unzerkleinert als Konfekt sowie als festes Gewürz eingesetzt werden können.
  • Beispiel B-14 Pulverisiertes Eigelb
  • Rohes Eigelb wurde bei 60-64ºC auf einer Heizplatte pasteurisiert und das so erhaltene flüssige Eigelb wurde mit 4 Gewichtsanteilen eines wasserfreien kristallinen Trehalose-Pulvers, das nach dem Verfahren in Beispiel A-4 erhalten wurde, pro Gewichtsanteil flüssiges Eigelb vermischt, auf Behälter verteilt und über Nacht stehengelassen, um die Trehalose in die kristalline Hydratform zu überführen, wodurch feste Produkte in blockiger Form erhalten wurden. Die festen Produkte wurden dann in einer Zerkleinerungsapparatur verarbeitet, um ein pulverisiertes Eigelb zu erhalten. Das Produkt kann vorteilhaft als Ausgangsstoff für Süßigkeiten, wie z. B. gemischtes Konfekt, Eisnachtisch und als Emulgierhilfe ebenso wie für Babynahrung und Nährlösung für den therapeutischen Einsatz, einschließlich orale und parenterale Flüssignahrung, eingesetzt werden.
  • Beispiel B-16 Kosmetische Creme
  • Zwei Gewichtsanteile Polyoxyäthylen-Glycol-Monostearat, 5 Gewichtsanteile selbst emulgierendes Glycerin-Monostearat, 2 Gewichtsanteile eines Pulvers mit einem hohen Anteil an Trehalose, das nach dem Verfahren in Beispiel A-2 erhalten wurde, 1 Gewichtsanteil alpha-Glycosyl-Rutin, ein Gewichtsanteil flüssiges Paraffin, 10 Gewichtsanteile Glyceryl-Trioctanat und eine passende Menge Antiseptikum wurden auf die übliche Weise unter Erhitzen gelöst, mit 2 Gewichtsanteilen L-Milchsäure, 5 Gewichtsanteilen 1,3-Butylen-Glycol und 66 Gewichtsanteilen destilliertem Wasser versetzt, zur Bildung einer Emulsion in einen Rührbehälter gegeben und unter Rühren mit einer geeigneten Menge Aromastoff versetzt, um eine Creme als Produkt zu erhalten. Das Produkt, welches eine Antioxidationswirkung und eine erhöhte Stabilität besitzt, kann vorteilhaft als qualitativ hochwertiges Mittel gegen Sonnenbrand, Mittel zur Verfeinerung der Haut und Mittel zum Aufhellen der Haut eingesetzt werden.
  • Beispiel B-17 Pulverisiertes Ginseng-Extrakt
  • Ein halber Gewichtsanteil Ginseng-Extrakt wurde zusammen mit 1.5 Gewichtsanteilen eines wasserfreien kristallinen Trehalose-Pulvers, das nach dem Verfahren in Beispiel A-4 erhalten wurde, geknetet, in flache Behälter gefüllt und für 2 Tage stehengelassen, um die Trehalose in die kristalline Hydratform zu überführen, wobei feste Produkte in blockiger Form erhalten wurden. Die festen Produkte wurden dann zur Pulverisierung in eine Zerkleinerungsapparatur gegeben und gesiebt, um ein pulverförmiges Ginseng-Extrakt zu erhalten. Das Pulver wurde zusammen mit einer geeigneten Menge Vitamin B1 und Vitamin B2, beide in Pulverform, in einem Granulator zu einem körnigen, Vitamine enthaltenden Ginseng-Extrakt verarbeitet. Das Produkt kann vorteilhaft als Stimulans eingesetzt werden. Darüber hinaus kann das Produkt auch als Haarwuchsmittel eingesetzt werden.
  • Beispiel B-18 Fester Wirkstoff
  • Ein natürliches "menschliches Interferon-alpha"-Präparat, das von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, vertrieben wird, wurde auf die übliche Weise über eine stationäre Kolonne mit Gegenkörpern für "menschliches Interferon-alpha" gegeben, um das "menschliche Interferon-alpha" zu absorbieren sowie gleichzeitig das Rinderserum-Albumin als Stabilisator durchzulassen; das absorbierte natürliche "menschliche Interferon-alpha" wurde mit einer physiologischen Salzlösung, die 5% hochreines kristallines Trehalosehydrat enthielt, das nach dem Verfahren in Beispiel A-6 gewonnen wurde, eluiert, wobei der pH-Wert in der Salzlösung sich veränderte. Die so erhaltene Flüssigkeit wurde über eine Membran filtriert, zum Trocknen mit der zwanzigfachen Menge "FINESTONE®" versetzt, einer wasserfreien kristallinen Maltose, die von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, vertrieben wird, pulverisiert und in einer Tablettenmaschine verarbeitet, um Tabletten mit jeweils ca. 200 mg zu erhalten, die ca. 150 Einheiten natürliches "menschliches Interferon-alpha" pro Tablette enthielten. Das Produkt kann vorteilhaft als Lutschtablette bei der Behandlung von Virusinfektionen, allergischen Reaktionen, Rheumatismus, Diabetes und bösartigen Tumoren eingesetzt werden, wobei das Produkt oral mit einer Dosis von 1-10 Tabletten pro Tag pro Erwachsener verabreicht wird. Ganz besonders vorteilhaft kann das Produkt bei der Behandlung von AIDS und Hepatitis, deren Häufigkeit in den letzten Jahren rapide zugenommen hat, eingesetzt werden. Das Produkt behält seine Wirksamkeit über einen langen Zeitraum, selbst wenn man es bei Zimmertemperatur stehenläßt, weil sowohl das erfindungsgemäße nicht reduzierenden Saccharid als auch die wasserfreie kristalline Maltose als Stabilisator wirken.
  • Beispiel B-19 Mit Zucker ummantelte Tablette
  • Nicht ummantelte Tabletten von jeweils 150 mg als Kernmaterial wurden mit einer Grundierungsflüssigkeit, die aus 40 Gewichtsanteilen eines hochreinen kristallinen Trehalosehydrats, das nach dem Verfahren in Beispiel A-8 erhalten wurde, 2 Gewichtsanteilen Pullulan mit einem mittleren Molekulargewicht von 200,000 Dalton, 30 Gewichtsanteilen Wasser, 25 Gewichtsanteilen Talk und 3 Gewichtsanteilen Titanoxid bestand, ummantelt, um pro Tablette ein Gewicht von ca. 230 mg zu ergeben, anschließend für die endgültige Ummantelung mit einer Flüssigkeit, die aus 65 Gewichtsanteilen des gleichen kristallinen Trehalosehydrats, einem Gewichtsanteil Pullulan und 34 Gewichtsanteilen Wasser bestand, ummantelt und mit flüssigem Wachs poliert, um mit Zucker ummantelte Tabletten mit einem überragend glänzendem Aussehen zu erhalten. Das Produkt besitzt eine hervorragende Stoßfestigkeit und behält seine hohe Qualität über einen langen Zeitraum.
  • Beispiel B-20 Zahnpasta
  • Zusammensetzung (Gewichtsanteile):
  • Calciumhydrogenphosphat 45.0
  • Pullulan 2.95
  • Natriumlaurylsulfat 1.5
  • Glycerin 20.0
  • Polyoxyäthylen-Sorbitan-Laurat 0.5
  • Antiseptikum 0.05
  • Kristallines Trehalosehydrat-Pulver, erhalten nach dem Verfahren in Beispiel A-8 12.0
  • Maltitol 5.0
  • Wasser 13.0
  • Die oben beschriebenen Ausgangsmaterialien wurden auf die übliche Weise gemischt, um eine Zahnpasta zu erhalten. Das Produkt, das eine geeignete Süße besitzt, ist als Zahnpasta für Kinder geeignet.
  • Beispiel B-21 Fester Wirkstoff für Flüssignahrung
  • Eine Verbindung, die aus 500 Gewichtsanteilen eines hochreinen kristallinen Trehalosehydrats, das nach dem Verfahren in Beispiel A-6 hergestellt wurde, 270 Gewichtsanteilen pulverisiertes Eigelb, 4.4 Gewichtsanteilen Natriumchlorid, 1.8 Gewichtsanteilen Kaliumchlorid, 4 Gewichtsanteilen Magnesiumsulfat, 0.01 Gewichtsanteilen Thiamin, 0.1 Gewichtsanteilen Natriumascorbat, 0.6 Gewichtsanteilen Vitamin-E-Acetat und 0.04 Gewichtsanteilen Nicotinamid bestand, wurde zu Proben von jeweils 25 g aufgeteilt, die dann zum fertigen Produkt in wasserdicht laminierte Beutel verpackt und hitzeversiegelt wurden. Ein Beutel des Produktes wird in ca. 150-300 ml Wasser zu einer Flüssignahrung aufgelöst, die dann über die Mund- oder Nasenhöhle, den Magen oder den Darm als Energieersatz dem lebenden Körper verabreicht wird.
  • Beispiel B-22 Infusionsmittel
  • Ein hochreines kristallines Trehalosehydrat, das nach dem Verfahren in Beispiel A-6 hergestellt wurde, wurde zu 10 Gew.-% in Wasser gelöst, durch eine Membran gegeben, um fiebererregende Stoffe zu entfernen, steril in Plastikflaschen abgefüllt und auf die übliche Weise versiegelt. Das Produkt ist ein stabiles Infusionsmittel, das im Laufe der Zeit keiner Veränderung unterliegt und für eine intravenöse und intraperitoneale Darreichung geeignet ist. Bei einer Konzentration von 10 Gew.-% verhält sich das Produkt isotonisch zu Blut und ist daher in der Lage, bei dieser Konzentration zweimal mehr Energie als im Falle des Einsatzes von Glucose zu ersetzen.
  • Beispiel B-23 Infusionsmittel
  • Ein hochreines kristallines Trehalosehydrat, das nach dem Verfahren in Beispiel A-9 erhalten wurde, und eine Aminosäuren-Mischung mit der unten beschriebenen Zusammensetzung wurden in Wasser gemischt und zu 5 Gew.-% bzw. 30 Gew.-% gelöst, ähnlich wie in Beispiel B-22 gereinigt, um die fiebererregenden Stoffe zu entfernen, auf Plastikbeutel verteilt und versiegelt.
  • Zusammensetzung der Aminosäuren-Mischung (mg/100 ml)
  • L-Isoleucin 180
  • L-Leucin 410
  • L-Lysin-Hydrochlorid 620
  • L-Methionin 240
  • L-Phenylalanin 290
  • L-Threonin 180
  • L-Tryptophan 60
  • L-Valin 200
  • L-Arginin-Hydrochlorid 270
  • L-Histidin-Hydrochlorid 130
  • Glycin 340
  • Das Produkt ist ein stabiles Infusionsmittel, das im Laufe der Zeit keiner Veränderung unterliegt und vorteilhaft intravenös und über das Bauchfell verabreicht werden kann, da Trehalose selbst bei dieser Art von Saccharid- und Aminosäuren- Zusammensetzung keine Reduktionskraft zeigt. Das Produkt kann vorteilhaft zur Ergänzung sowohl der Energie als auch der Aminosäuren am lebenden Objekt eingesetzt werden.
  • Beispiel B-24 Salbe zur Behandlung von äußerlichen Verletzungen
  • Zweihundert Gewichtsanteile eines kristallinen Trehalosehydrat-Pulvers, das nach dem Verfahren in Beispiel A-8 hergestellt wurde, und 300 Gewichtsanteile Maltose wurden zunächst mit 3 Gewichtsanteilen Iod in 50 Gewichtsanteilen Methanol, dann mit 200 Gewichtsanteilen einer 10 Gew.-%igen wässerigen Lösung von Pullulan vermischt, wodurch eine Salbe mit einer geeigneten Dehnbarkeit und einem geeigneten Haftvermögen erhalten wurde. Die Verwendung des Produktes heilt äußerliche Wunden hervorragend bei einer verkürzten Behandlungsdauer, da Iod und Trehalose in dem Produkt als Desinfektionsmittel und als Mittel zur Energieversorgung für lebende Zellen wirken.
  • Wie aus dem oben Gesagten ersichtlich ist, können nicht reduzierende Saccharide leicht mit einem verringerten Zeitaufwand aus Kulturen durch Züchten eines Mikroorganismus, der in der Lage ist, ein Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose zu bilden, in einer Nährlösung für Kulturen mit Maltose hergestellt werden, wodurch die Produktion von Trehalose oder Trehalose enthaltenden Sacchariden im Industriemaßstab erleichtert wird. Der Einsatz von Maltose, die durch Umsetzung von verflüssigter Stärke entweder mit beta-Amylase oder mit beta-Amylase und einem Stärke abbauenden Enzym erhalten werden kann, vergrößert die Ausbeute an Trehalose aus Stärke enorm, wodurch die Produktion von Trehalose im industriellen Maßstab noch mehr erleichtert wird. Die Trehalose oder das Trehalose enthaltende Saccharid besitzen eine überragende Stabilität und ebenso eine hohe Qualität und eine milde Süße. Darüber wird jede von beiden verdaut und als Kalorienquelle absorbiert, wenn sie oral eingenommen werden. Besonders Trehalose wird leicht metabolisiert und verbraucht, selbst wenn sie parenteral eingesetzt wird. Somit können die erfindungsgemäßen nicht-reduzierenden Saccharide und die wenig reduzierenden Saccharide, die dieselben enthalten, bei einer Vielzahl von Verbindungen, einschließlich Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Arzneimitteln, vorteilhaft als Süßstoff, Mittel zur Geschmacksverbesserung, Stabilisator und Mittel zur Formgebung eingesetzt werden.
  • Die vorliegende Erfindung sollte einen vollkommen neuen Weg zur Produktion im industriellen Maßstab öffnen, um aus Stärke als kostengünstiger und unbeschränkter Quelle bei geringen Kosten gewünschte Mengen an Trehalose oder Trehalose enthaltende Saccharide zu liefern, für die eine große Nachfrage bestand, die jedoch bisher nicht einfach zu erhalten waren. Somit sollte sich die Bedeutung der vorliegenden Erfindung auf die Landwirtschaft, die Fischerei sowie die Lagerhaltung und die chemische Industrie ebenso wie auf die Lebensmittel-, Kosmetik-, und pharmazeutische Industrie auswirken und ihre industrielle Bedeutung sollte unschätzbar sein.

Claims (11)

1. Verfahren zur Herstellung von Trehalose oder eines Trehalose enthaltenden Saccharids aus Maltose, jedoch nicht aus Saccharose, welches die Schritte umfasst:
a) das Züchten eines Mikroorganismus in einer Nährflüssigkeit für Kulturen mit Maltose, um das besagte Enzym zur Bildung und Anreicherung von Trehalose in der Nährflüssigkeit zu produzieren, wobei der Mikroorganismus ein Enzym zur Umwandlung von Maltose in Trehalose produziert, das in der Lage ist, aus Maltose, jedoch nicht aus Saccharose, ein im wesentlichen aus Trehalose bestehendes Saccharid-Produkt zusammen mit oder ohne Glucose zu bilden, und
b) das Auffangen der gebildeten und angereicherten Trehalose oder des Trehalose enthaltenden Saccharids aus der erhaltenen Kultur.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem 20 Gew.-% oder weniger Maltose der Nährflüssigkeit für Kulturen zugegeben wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem ein oberflächenaktiver Stoff zusammen mit Maltose der Nährflüssigkeit für Kulturen zugegeben wird.
4. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das Züchten im Batchbetrieb, kontinuierlich oder halbkontinuierlich durchgeführt wird.
5. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Keimkultur oder das Saccharid, das daraus erhalten werden kann, zusätzlich mit Glucoamylase oder alpha-Glucosidase umgesetzt wird und Trehalose oder ein Trehalose enthaltendes Saccharid aus der erhaltenen Mischung aufgefangen werden kann.
6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, bei dem das besagte Saccharid Trehalose sowie ein oder mehrere Mitglieder aus der Gruppe, die aus Glucose und Maltose besteht, enthält.
7. Verfahren zur Herstellung einer Trehalose enthaltenden der Ernährung dienenden Verbindung, das die Schritte umfasst:
a) die Herstellung der Trehalose oder eines Trehalose enthaltenden Saccharids nach einem Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6 und
b) die Einlagerung der Trehalose oder des Trehalose enthaltenden Saccharids in einen der Ernährung dienenden Stoff.
8. Verfahren zur Herstellung einer Trehalose enthaltenden kosmetischen Verbindung, das die Schritte umfasst:
a) die Herstellung der Trehalose oder eines Trehalose enthaltenden Saccharids nach einem Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6 und
b) die Einlagerung der Trehalose oder des Trehalose enthaltenden Saccharids in einen kosmetisch einsetzbaren Stoff.
9. Verfahren zur Herstellung einer Trehalose enthaltenden pharmazeutischen Verbindung, welches die Schritte umfasst:
a) die Herstellung von Trehalose oder eines Trehalose enthaltenden Saccharids nach einem Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6 und
b) die Einführung der Trehalose oder des Trehalose enthaltenden Saccharids in einen pharmazeutisch einsetzbaren Stoff.
10. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche, bei dem die besagte Trehalose in kristalliner wasserhaltiger oder kristalliner wasserfreier Form vorliegt.
11. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche, bei dem es sich bei dem besagten Mikroorganismus um ein Mitglied aus der Gruppe, die aus den Stämmen Pimelobacter, Pseudomas und Thermus besteht, handelt.
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