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KR100312858B1 - 말토오스-트레할로오스전환효소와그제조방법및용도 - Google Patents

말토오스-트레할로오스전환효소와그제조방법및용도 Download PDF

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KR100312858B1
KR100312858B1 KR1019940017473A KR19940017473A KR100312858B1 KR 100312858 B1 KR100312858 B1 KR 100312858B1 KR 1019940017473 A KR1019940017473 A KR 1019940017473A KR 19940017473 A KR19940017473 A KR 19940017473A KR 100312858 B1 KR100312858 B1 KR 100312858B1
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trehalose
maltose
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weight
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니시모도도모유끼
차엔히로또
스기모도도시유끼
미야께도시오
Original Assignee
도시오 미야께
가부시끼가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조
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Publication date
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Abstract

SDS-PAGE에 의한 분자량이 약 57,000∼120,000이고 양쪽성 전해질을 사용하는 등전점 전기영동법에 의한 등전점 (pI)이 약 3.8∼5.1 인 효소는 말토오스를 트레할로오스로, 트레할로오스를 말토오스로 전환시킨다. 이 효소를 피멜로박터속 (Pimelobater 屬), 슈우도모나스속 (Pseudomonas 屬) 및 테르무스속 (Thermus 屬)의 미생물로부터 분리하였다. 이 효소를 사용하여 시판품인 말토오스로부터 트레할로오스를 공업적인 규모로 저렴하게 생성시킬 수 있다. 트레할로오스와 이것을 함유하는 당질 조성물은 모두가 이 효소로 제조되는 것들인데 음식물, 화장품 조성물 및 의약품 조성물에 적절히 사용할 수 있다.

Description

말토오스-트레할로오스 전환 효소와 그 제조 방법 및 용도
제1도는 피멜로박터 sp. R48 미생물 유래의 본 발명의 말토오스-트레할로오스 전환 효소의 활성에 미치는 온도의 영향을 나타낸 그래프.
제2도는 피멜로박터 sp. R48 미생물 유래의 본 발명의 말토오스-트레할로오스 전환 효소의 활성에 미치는 pH 의 영향을 나타낸 그래프.
제3도는 피멜로박터 sp. R48 미생물 유래의 본 발명의 말토오스-트레할로오스 전환 효소의 안정성에 미치는 온도의 영향을 나타낸 그래프.
제4도는 피멜로박터 sp. R48 미생물 유래의 본 발명의 말토오스-트레할로오스 전환 효소의 안정성에 미치는 pH 의 영향을 나타낸 그래프.
제5도는 슈우도모나스 푸티다 H262 미생물 유래의 본 발명의 말토오스-트레할로오스 전환 효소의 활성에 미치는 온도의 영향을 나타낸 그래프.
제6도는 슈우도모나스 푸티다 H262 미생물 유래의 본 발명의 말토오스-트레할로오스 전환 효소의 활성에 미치는 pH 의 영향을 나타낸 그래프.
제7도는 슈우도모나스 푸티다 H262 미생물 유래의 본 발명의 말토오스-트레할로오스 전환 효소의 안정성에 미치는 온도의 영향을 나타낸 그래프.
제8도는 슈우도모나스 푸티다 H262 미생물 유래의 본 발명의 말토오스-트레할로오스 전환 효소의 안정성에 미치는 pH 의 영향을 나타낸 그래프.
제9도는 테르무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 미생물 유래의 본 발명의 말토오스-트레할로오스 전환 효소의 활성에 미치는 온도의 영향을 나타낸 그래프.
제10도는 테르무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 미생물 유래의 본 발명의 말토오스-트레할로오스 전환 효소의 활성에 미치는 pH 의 영향을 나타낸 그래프.
제11도는 테르무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 미생물 유래의 본 발명의 말토오스-트레할로오스 전환 효소의 안정성에 미치는 온도의 영향을 나타낸 그래프.
제12도는 테르무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 미생물 유래의 본 발명의 말토오스-트레할로오스 전환 효소의 안정성에 미치는 pH 의 영향을 나타낸 그래프.
본 발명은 신규의 효소와 그 제조 방법 및 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 말토오스를 트레할로오스로 전환시키거나 트레할로오스를 말토오스로 전환시키는 효소 (이하, 간단히 "말토오스-트레할로오스 전환 효소" 라 함) 와 이 효소의 제조 방법에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 상기 효소를 생성할 수 있는 미생물, 상기 효소를 사용하여 수득되는 트레할로오스, 이 트레할로오스를 함유하는 당질 조성물 및 상기 트레할로오스 또는 상기 당질 조성물을 함유하는 조성물에 관한 것이기도 하다.
글루코오스를 구성당으로 하는 비환원성 당질로서 트레할로오스 (α,α-트레할로오스) 가 알려져 있는데, 문헌 [Advances in Carbohydrate Chemistry, Vol.18, pp.201∼225 (1963), published by Academic Press, USA 및 Applied and Environmental Microbiology, Vol.56, pp.3,213∼3,215 (1990)] 에 기재되어 있는 바와 같이 그 함량은 비교적 작지만 미생물, 버섯, 곤충 등 광범위하게 존재하고 있다. 트레할로오스는 비환원성 당질이기 때문에 아미노산이나 단백질 등의 아미노기를 가진 물질과 반응하지 않으므로 이들은 아미노카르보닐 반응을 일으키지 않고 아미노산 함유 물질을 상하게 하지 않는다. 따라서, 트레할로오스는 갈변이나 열화(劣化)의 우려가 없이 이용, 가공할 수 있는 것으로 기대되어 그 공업적 제조 방법의 확립이 요망되고 있다.
종래의 트레할로오스 제조 방법으로서는, 예컨대 일본국 특허 공개 제154,485/75호 공보에 개시(開示) 되어 있는 미생물 균체를 이용하는 방법과, 일본국 특허 공개 제216695/83호 공보에 제안되어 있는 말토오스-포스포릴라아제와 트레할로오스-포스포릴라아제를 조합하여 사용함으로써 말토오스를 변환하여 트레할로오스를 얻는 방법 등이 알려져 있다. 그러나, 미생물 균체를 사용하는 방법은 이 균체를 출발 원료로 하여 여기에 함유되는 트레할로오스의 함량이 통상 고형물당 15w/w％ (이하, 본 명세서에서는 별달리 명시하지 않는 한 "w/w％"을 간단히 "％" 로 약칭한다) 이하로서 낮고, 그외에 이것을 추출, 정제하는 공정이 번잡하여 공업적 제조 방법으로서는 적당하지 않다. 또한, 말토오스-포스포릴라아제와 트레할로오스-포스포릴라아제를 사용하는 방법은 어느것이나 (가)글루코오스-1-포스페이트를 경유하여 트레할로오스를 생성시키고 있으므로 기질인 말토오스를 비교적 고농도로 사용할 수 없고, (나)포스포릴라아제의 효소 반응계가 가역 반응이므로 목적물인 트레할로오스의 수율이 낮으며, (다)이들 효소의 반응계를 안정하게 유지하여 반응을 원활하게 진행시키는 것이 곤란하여 아직 공업적 제조 방법으로서 실현되지 않고 있다.
한편, 전분을 원료로 하여 제조되는 전분 부분 가수분해물, 예컨대 전분 액화물, 각종 덱스트린, 각종 말토올리고당 등은 통상 그 분자의 말단에 환원기를 가져 환원성을 나타내는 것이라 알려져 있다. 이와 같은 환원성 전분 부분 가수분해물은 본 명세서에서는 "환원성 전분 부분 분해물" 이라 한다. 일반적으로, 이러한 환원성 전분 부분 분해물의 환원력을 건조 중량 기준으로 DE(Dextrose Equivalent) 값으로 나타내고 있다. 이 값이 큰 것은 통상 분자량이 적고 저점도이며 감미가 강한 것이기는 하나 반응성이 강하고 아미노산과 단백질 등의 아미노기를 가진 물질과 아미노카르보닐 반응을 일으키기 쉬우며 갈변하여 악취를 발생하고 쉽사리 품질이 열화하는 성질이 있다는 것이 알려져 있다.
이와 같은 환원성 전분 부분 분해물의 여러가지 특성은 DE 값의 대소에 의존하고 있고 환원성 전분 부분 분해물과 건조 중량 기준으로 DE 와의 관계는 극히 중요하다. 종래 당업계에서는 이 관계를 단절시킨다는 것은 불가능하다고 믿고 있기까지 하였다.
트레할로오스의 제조에 관해서는 문헌 ["Food Chemicals", No.88. pp.67∼72 (August, 1992), "전분 이용 개발의 현상과 과제" 의 "올리고당" 의 항]에서 "트레할로오스에 대해서는 현저하게 넓은 응용 범위가 고려될 수 있으나 이 당의 전분 당질로 부터의 직접 당전이 반응 또는 가수분해 반응을 이용한 효소적 생산은 현재로서는 학술적으로 불가능하다고 할 수 있다" 라고 기재되어 있는 바와 같이 전분을 원료로 하여 효소 반응에 의하여 트레할로오스를 제조한다는 것은 종래에는 학술적으로도 불가능하다고 생각되었던 것이다.
그러나, 본 발명자들은 당업계의 이러한 상식을 뒤엎어 일본국 특허 출원 제362,131/92호 명세서에 개시되어 있는 바와 같이 전분을 원료로 하여 제조되는 글루코오스 중합도가 3이상인 환원성 전분 부분 분해물에, 이로부터 그 말단에 트레할로오스 구조를 가지며 글루코오스 중합도가 3이상인 비환원성 당질을 생성하는 비환원성 당질 생성 효소와 글루코아밀라아제를 작용시킴으로써 환원성 전분 부분 분해물로부터 트레할로오스를 효소적으로 직접 생산하는데 성공하고 있다. 그러나, 이 방법은 2종 이상의 효소를 필요로 하고 글루코오스 중합도 3이상인 비교적 고점도 및 고분자량의 전분질당을 원료로 사용하고 있다. 더욱이, 수득한 생성물의 당조성이 상당히 복잡하므로 생산비가 많이 소요된다. 따라서, 공업적으로 생산되고 있어 안정적인 공급이 가능하고 현재 시판되고 있는 글루코오스 중합도 3이상의 전분 부분 분해물과 말토오스로부터 트레할로오스의 생성율을 더욱 향상시키는 트레할로오스의 신규 제조 방법의 확립이 요망된다.
본 발명의 목적은 공업적으로 생산되며 안정하게 공급이 가능한 말토오스를 트레할로오스로 전환하는 말토오스-트레할로오스 전환 효소와, 트레할로오스의 신규의 제조방법 및 용도와, 상기 효소로 제조된 트레할로오스 함유 당질 조성물을 제공함에 있다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 말토오스로부터 트레할로오스를 생성하는 전혀 새로운 당전환 효소를 생성할 수 있는 미생물을 널리 검색하여 왔다. 그 결과, 먼저 일본국 오카야마시의 토양으로 부터의 분리균인 피멜로박터속(Pimelobacter 屬) 에 속하는 미생물 피멜로박터 sp. R48 과, 일본국 니시노미야시의 토양으로 부터의 분리균인 슈우도모나스속(Pesudomonas 屬) 에 속하는 슈우도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) H262 및 테르무스속 (Thermus 屬) 에 속하는 미생물이 말토오스를 트레할로오스로 전환시키는 신규의 말토오스-트레할로오스 전환 효소인 것을 발견하여 트레할로오스의 제조 방법과, 이 트레할로오스를 함유하는 당질 조성물 및 상기 트레할로오스 또는 당질 조성물을 함유하는 음식물, 화장품, 의약품 등의 조성물을 확립하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 말토오스-트레할로오스 전환 효소와 그 제조 방법 및 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 말토오스를 트레할로오스로 전환시키거나 트레할로오스를 말토오스로 전환시키는 신규의 말토오스-트레할로오스 전환 효소와 그 제조 방법에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 상기 효소를 생성할 수 있는 미생물, 상기 효소를 사용하여 수득되는 트레할로오스, 이 트레할로오스를 함유하는 당질 조성물 및 상기 트레할로오스 또는 상기 당질 조성물을 함유하는 조성물에 관한 것이다.
이어서, 본 발명의 피멜로박터속에 속하는 미생물인 "피멜로박터 sp. R48" 및 슈우도모나스속에 속하는 미생물인 "슈우도모나스 푸티다 H262" 의 확인 시험 결과에 대하여 설명한다. 그런데, 이 확인 시험은 "미생물의 분류와 동정" (일본국 長谷川式治編, 학회출판센터, 1985년) 에 준하여 하였다.
피멜로박터 sp. R48 의 결과는 다음과 같다.
A. 세포형태
(1) 육즙 한천 배양 (27℃) 했을 때의 세포의 특징
통상 0.5∼0.9×1.5∼4.0㎛ 의 간균(桿菌) ;
단독으로 존재하나 드물게는 V 형상의 쌍을 이루고 연쇄 형태 세포도 관찰됨 ;
운동성 없음, 무포자, 비항산성 ;
그램 양성.
(2) 효모 및 말토엑스 (malto-extract) 첨가 한천 배지 배양 (27℃) 했을 때의 세포의 특징
크기는 1일 배양에서 0.6∼1.0×1.3∼4.2㎛ 이고, 3일 배양에서는 크기가 0.6∼1.0×1.0∼2.5㎛ 인 거의 구균현상으로 존재 ;
다형성 있음 ;
단독으로 존재하나 드물게는 V 형상의 쌍을 이루고 연쇄형태도 관찰됨.
B. 배양적 성질
(1) 육즙 한천 평판 배양, 27℃
형상 : 원형, 직경은 24시간 배양에서 0.5㎜ 이고 3일 배양에서 1.5∼2㎜ ;
주연(周緣) : 파상(波狀) ;
융기 : 반렌즈상 ;
광택 : 없음 ;
표면 : 주름형상 ;
색조 : 불투명 또는 크리임색 ;
(2) 효모 및 말토엑스 첨가 한천 평판 배양 (27℃) 했을 때의 세포의 특징
형상 : 원형, 직경은 3일 배양에서 약 1∼1.5㎜ ;
주연 : 파상(波狀) ;
융기 : 반렌즈상 ;
광택 : 없음 ;
표면 : 주름형상 ;
색조 : 불투명, 크리임색 ;
(3) 육즙 한천 사면 배양, 27℃
생육 : 양호 ;
형상 : 실(絲) 형상 ;
(4) 육즙 젤라틴 천자 배양, 27℃
액화하지 않음.
C. 생리학적 성질
(1) 질산염의 환원 : 양성 ;
(2) 탈질 반응 : 음성 ;
(3) 메틸 레드 시험 : 음성 ;
(4) VP 시험 : 음성 ;
(5) 인돌의 생성 : 음성 ;
(6) 황화 수소의 생성 : 양성 ;
(7) 전분의 가수분해 : 음성 ;
(8) 시트르산의 이용 : 양성 ;
(9) 무기 질소원의 이용 : 암모늄염과 질산염을 이용 ;
(10) 색소의 생성 : 없음 ;
(11) 우레아제 : 음성 ;
(12) 옥시다아제 : 음성 ;
(13) 카탈라아제 : 음성 ;
(14) 생육의 범위 : pH 5∼9, 온도 15∼40℃ ;
(15) 산소에 대한 태도 : 호기성 ;
(16) 탄소원의 이용성과 산 생성의 유무 ;
(17) 아미노산의 탈탄산 시험 (decarboxylase test) : L-리신, L-아르기닌 및 L-오르니틴에 대하여 음성 ;
(18) 아미노산의 이용 : L-글루탐산 나트륨과 L-아스파르트산 나트륨을 이용함 ;
(19) DNase : 음성 ;
(20) 3-케토락토오스의 생성 : 음성 ;
(21) DNA 의 구아닌 (G) 및 시토신 (C) 함량 (mol ％) : 72％ ;
(22) 세포벽의 주요 디아미노산 : LL-디아미노피멜산.
슈우도모나스 푸티다 H262 의 결과는 다음과 같다.
A. 세포 형태
(1) 육즙 한천 배양 (27℃) 했을 때의 세포의 특징
통상 0.5∼0.7 × 1.0∼2.0㎛ 의 간균(桿菌) ; 무포자 ;
단독으로 존재하나 드물게는 직쇄상의 두 쌍을 이루고 연쇄 형태 세포도 관찰됨 ;
운동성 있음, 편모는 주편모(周鞭毛) : 비항산성 ;
그램 음성 ;
(2) 효모 및 말토엑스 첨가 한천 배지 배양 (27℃) 했을 때의 세포의 특징
크기는 1일 배양에서 0.6∼0.8×2.0∼4.0㎛
B. 배양적 성질
(1) 육즙 한천 평판 배양, 27℃
형상 : 원형, 직경은 24시간 배양에서 1∼2㎜ 이고 3일 배양에서 3.5∼4㎜ ;
주연(周緣) : 전연(全緣) ;
융기 : 반렌즈상 ;
광택 : 습윤광택 있음 ;
표면 : 평활 ;
색조 : 백색의 불투명, 크리임색 ;
(2) 효모 및 말토엑스 첨가 한천 평판 배양 (27℃) 했을 때의 세포의 특징
형상 : 원형, 직경은 3일 배양에서 약 4∼5㎜ ;
주연 : 전연 ;
융기 : 반렌즈상 ;
광택 : 습윤광택 있음 ;
표면 : 평활 ;
색조 : 백색의 불투명 또는 크리임색 ;
(3) 육즙 한천 사면 배양, 27℃
생육 : 양호 ;
형상 : 실(絲) 형상 ; 표면이 평활하고 습윤광택이 있으며 불투명의 황색 크리임을 띤 비교적 얇은 융기를 생성함 ;
(4) 육즙 젤라틴 천자 배양, 27℃
액화하지 않음.
C. 생리학적 성질
(1) 숙신산 배지에서의 질산염의 환원 : 양성 ;
(2) 탈질 반응 : 음성 ;
(3) 메틸 레드 시험 : 음성 ;
(4) VP 시험 : 음성 ;
(5) 인돌의 생성 : 음성 ;
(6) 황화 수소의 생성 : 음성 ;
(7) 전분의 가수분해 : 음성 ;
(8) 폴리-β-히드록시부틸레이트의 축적 : 음성 ;
(9) 프로카테츄에이트의 분해 : 오르트형 ;
(10) 시트르산의 이용 : 양성 ;
(11) 무기 질소원의 이용 : 암모늄염과 질산염을 이용 ;
(12) 색소의 생성 : 담황색 ;
(13) 형광색소의 생성 : 양성 ;
(14) 우레아제 : 양성 ;
(15) 옥시다아제 : 양성 ;
(16) 카탈라아제 : 양성 ;
(17) 생육의 범위 : pH 5.6∼9.0, 온도 10∼37℃ ;
(18) 산소에 대한 태도 : 호기성 ;
(19) 탄소원의 이용성과 산 생성의 유무 :
(20) 아미노산의 탈탄산 시험 (decarboxylase test) : L-리신 및 L-오르니틴에 대하여 음성, L-아르기닌에 대하여 양성 ;
(21) 아미노산의 이용 : L-글루탐산 나트륨과 L-아스파르트산 나트륨, 나트륨 L-아르기닌, L-히스티딘, L-발린 및 D-알라닌을 이용함, L-트립토판을 이용않음 ;
(22) DNase : 음성 ;
(23) 3-케토락토오스의 생성 : 음성 ;
(24) DNA 의 구아닌 (G) 및 시토신 (C) 함량 (mol ％) : 63％ ;
이상의 균학적 성질에 의거하여 문헌 [Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol.1 (1984)]을 참고로 하여 공지 균과의 이동(異同)을 검토하였다. 그 결과, 슈우도모나스속에 속하는 미생물인 것이 판명되었다.
이들 결과로부터 본 발명자 등은 이 균을 신규 미생물인 "슈우도모나스푸티다 H262" (Pseudomonas putida H262)로 명명하여 1994년 2월 23일자로 일본국 공업 기술원 생명 공업 기술 연구소에 기탁하여 동일자로 접수되어 미생물 수탁번호 FERM BP-4579로 수탁되어 있다.
본 발명에서는 상기 균 뿐만아니라 슈우도모나스속에 속하는 기타 균주, 더욱이는 이들 균주의 변이주 등도 본 발명의 말토오스-트레할로오스 전환 효소를 생성할 수 있는 것이면 어느것이나 본 발명에서 적절히 이용할 수 있다.
더욱이, 본 발명에서 사용되는 미생물로서는 테르무스속 (Thermus 屬) 에 속하는 미생물, 예컨대 테르무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 25104), 테르무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923), 테르무스 필리포르미스 (Thermus filiformis) (ATCC 43280), 테르무스루베르 (Thermus ruber) (ATCC 35948), 테르무스 sp. (ATCC 43814) 및 테르무스 sp. (ATCC 43815) 등도 유리하게 이용할 수 있다.
본 발명의 미생물의 배양에 사용하는 배지는 미생물이 생육할 수 있고 본 발명의 효소를 생산할 수 있는 영양 배지이면 좋고, 합성 배지와 천연 배지 어느것이라도 좋다. 탄소원으로서는 미생물이 자화 (資化) 할 수 있는 물질이면 좋은데, 예컨대 글루코오스, 프룩토오스, 트레할로오스 락토오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨, 당밀, 전분 부분 분해물 등의 당질, 또는 시트르산, 숙신산 등의 유기산 또는 이들의 염 등도 사용할 수가 있다. 배지에서의 이들 탄소원의 농도는 탄소원의 종류에 따라 적절히 선택된다. 예를 들자면, 글루코오스인 경우에는 통상 건조 고형분 기준 (d.s.b.) 으로 40w/v％ 이하가 바람직하고, 균의 생육과 증식의 면에서는 10w/v％ 이하가 바람직하다. 질소원으로서는 예컨대 암모늄 염, 질산 염 등의 무기 질소 화합물과, 예컨대 우레아, 콘 스티프 리커, 카제인, 펩톤, 효모 엑스, 육(肉) 엑스 등의 유기 질소 화합물이 사용된다.
또한, 무기 성분으로서는 예컨대 칼슘 염, 마그네슘 염, 칼륨 염, 나트륨 염, 인산 염, 망간 염, 아연 염, 철 염, 구리 염, 몰리브덴 염, 코발트 염 등이 적절히 사용된다.
본 발명에서 사용되는 배양 조건은 미생물이 생육할 수 있고 본 발명의 효소를 생성할 수 있는 조건, 예컨대 온도 약 4℃∼80℃, 바람직하게는 약20℃∼75℃, pH 약 5∼9, 바람직하게는 pH 6∼8.5 에서 선택되는 조건에서 호기적으로 실시한다. 배양 시간은 미생물이 증식하기 시작하는 시간 이상의 시간이면 좋고, 바람직하게는 10시간∼100시간이다. 그리고, 배양액의 용존 산소 (DO : dissolved oxygen) 농도에는 특히 제한은 없으나 통상은 0.5∼20ppm 이 바람직하다. 따라서, 통기량을 조절하거나 교반하거나 통기에 산소를 추가하거나, 또한 퍼어멘터 (fermenter) 내의 압력을 높이는 등의 수단을 채용하여 DO 농도 범위내로 유지할 수 있다. 또한, 배양 방식은 회분 (batchwise) 배양 또는 연속 배양중 어느것이라도 좋다.
이와 같이 하여 미생물을 배양한 후 본 발명의 효소를 회수한다. 이 효소의 활성은 배양물의 균체와 제균액 어느쪽에도 나타나는데, 균체와 제균액을 조(粗) 효소액으로 하여 채취하는 것도, 그리고 배양물 전체를 조효소액으로 하여 사용하는 것도 가능하다. 배양물로부터 균체를 제거하자면 공지의 고액 분리법이 채용된다. 예컨대, 배양물 그 자체를 그대로 원심 분리하는 방법 혹은 프리 코우트 필터 (precoat filter) 등을 사용하여 원심 분리하는 방법, 또는 여과조제를 첨가하여 세포를 여과하는 방법, 평막(平膜), 중공사막(中空絲膜) 등의 막 여과에 의하여 분리하는 방법 등이 적절히 채용된다. 제균액을 그대로 효소액으로 사용할 수가 있으나 일반적으로는 농축하여 사용한다. 농축 방법으로서는, 예컨대 황산 암모늄 염석법, 아세톤과 알코올을 이용하는 침전법, 평막, 중공사막 등의 막을 이용하는 막 농축법 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 효소가 세포내 효소인 경우에는 종래의 방법으로 균체로부터 효소를 추출하고 그 추출액을 조효소 (crude enzyme) 로 사용할 수 있다. 예를 들자면, 초음파에 의한 파쇄법, 유리 비이드 (bead) 와 알루미나에 의한 기계적 파쇄법, 프렌치 프레스에 의한 파쇄법 등으로 균체로부터 효소를 추출하여 원심 분리 또는 막 여과 등으로 청징한 조효소액을 얻을 수 있다.
더욱이, 제균액과 그 농축물 및 추출액을 공지의 방법으로 고정화 할 수도 있다. 예를 들자면, 이온 교환체에의 결합법, 수지와 막 등과의 공유결합 및 흡착법, 고분자 물질을 사용한 포괄법 등을 채용할 수 있다. 그리고, 배양물로부터 분리한 균체도 더 처리하지 않고 그대로 조효소로서 사용할 수가 있으나, 이것을 고정화하여 사용하여도 좋다. 한가지 예로서 이것을 알긴산 나트륨과 혼합하여 염화 칼슘 수용액중에 적하해서 입상(粒狀) 으로 겔화시켜 고정화한다. 이 입상화물을 다시 폴리에틸렌 이민 또는 글루타르알데히드로 처리하여 고정화하여도 좋다.
이 효소액을 그대로 사용할 수 있으나 공지의 방법으로 다시 정제하여 사용할 수도 있다. 한가지 예로서 파쇄 처리된 균체된 균체의 추출물을 황산 암모늄 염석하여 농축한 조효소 표품(標品)을 투석한 후 DEAE-Toyopearl 수지를 사용한 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 이어서 부틸 Toyopearl 수지 (소수성 수지)를 사용한 소수(疎水) 칼럼 크로마토그래피 (이상의 제품들은 모두가 일본국의 Tosoh 사제임), Mono Q HR5/5 음이온 교환 수지 (스웨덴국의 Pharmacia LKD 사제)를 사용한 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피 및 Toyopearl HW-55 수지 (일본국의 Tosoh 사제)를 사용한 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 정제함으로써 전기 영동적으로 단일의 효소를 얻을 수 있다.
이들 방법에 의해 전기영동적으로 단일 밴드를 나타내는 효소를 제조할 수 있다. 이와 같이 하여 얻게 되는 본 발명의 말토오스-트레할로오스 전환 효소는 아래와 같은 물리화학적 성질을 가진다.
(1) 작용
말토오스를 트레할로오스로 전환시키고 트레할로오스를 말토오스로 전환시킴.
(2) 분자량
SDS-PAGE (소디움 도데실술페이트-폴리아크릴아미드겔 전기영동법) 에 의하여 약 57,000∼120,000 돌턴 ;
(3) 등전점 (pI)
양쪽성 전해질 함유 전기영동법에서 약 3.8∼5.1 ;
(4) 활성억제
1 mM Cu++, Hg++및 Tris-HCl 완충액에 의해 억제됨.
(5) 기원
미생물 유래임.
특히 본 발명의 효소의 물리화학적 성질은 아래에 나온 바와 같이 그 기원에 따라 달라진다.
피멜로박터 sp. R48 유래의 본 발명의 말토오스-트레할로오스 전환 효소는 아래와 같은 물리화학적 성질을 가진다.
(1) 작용
말토오스를 트레할로오스로, 그리고 트레할로오스를 말토오스로 전환시킴.
말토오스 1몰로부터 트레할로오스 약 1몰을 생성하거나 트레할로오스 1몰로부터 말토오스 약 1몰을 생성함.
(2) 분자량
SDS-PAGE (소디움 도데실술페이트-폴리아크릴아미드겔 전기영동법) 에 의하여 약 57,000∼67,000 돌턴 ;
(3) 등전점 (pI)
양쪽성 전해질 함유 전기영동법에서 약 4.1∼5.1 ;
(4) 활성억제
1 mM Cu++, Hg++및 Tris-HCl 완충액에 의해 억제됨.
(5) 최적 온도
pH 7.0 및 60분간 배양에서 약 20℃ ;
(6) 최적 pH
25℃ 및 60분간 배양에서 약 7.0∼8.0 ;
(7) 열적 안정성
pH 7.0에서 60분간 유지하여 약 30℃ 부근까지 안정 ;
(8) pH 안정성
20℃에서 60분간 유지하여 pH 약 6.0∼9.0에서 안정 ;
슈우도모나스 푸티다 H262 유래의 말토오스-트레할로오스 전환 효소는 아래와 같은 물리화학적 성질을 가진다.
(1) 작용
말토오스를 트레할로오스로, 그리고 트레할로오스를 말토오스로 전환시킴.
말토오스 1몰로부터 트레할로오스 약 1몰을 생성하거나 트레할로오스 1몰로부터 말토오스 약 1몰을 생성함.
(2) 분자량
SDS-PAGE (소디움 도데실술페이트-폴리아크릴아미드겔 전기 영동법) 에 의하여 약 110,000∼120,000 돌턴 ;
(3) 등전점 (pI)
양쪽성 전해질 함유 전기 영동법에서 약 4.1∼5.1 ;
(4) 활성억제
1 mM Cu++, Hg++및 50mM Tris-HCl 에 의해 억제됨.
(5) 최적 온도
pH 7.0 및 60분간 배양에서 약 37℃ ;
(6) 최적 pH
pH 7.0 및 60분간 배양에서 약 7.3∼8.3 ;
(7) 열적 안정성
pH 7.0에서 60분간 유지하여 약 40℃ 부근까지 안정 ;
(8) pH 안정성
35℃에서 60분간 유지하여 pH 약 6.0∼9.5에서 안정 ;
테르무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 유래의 말토오스-트레할로오스 전환 효소는 아래와 같은 물리화학적 성질을 가진다.
(1) 작용
말토오스를 트레할로오스로, 그리고 트레할로오스를 말토오스로 전환시킴.
말토오스 1몰로부터 트레할로오스 약 1몰을 생성하거나 트레할로오스 1몰로부터 말토오스 약 1몰을 생성함.
(2) 분자량
SDS-PAGE (소디움 도데실술페이트-폴리아크릴아미드겔 전기 영동법) 에 의하여 약 100,000∼110,000 돌턴 ;
(3) 등전점 (pI)
양쪽성 전해질 함유 전기 영동법에서 약 3.8∼4.8 ;
(4) 활성억제
1 mM Cu++, Hg++및 50mM Tris-HCl 완충액에 의해 억제됨.
(5) 최적 온도
pH 7.0 및 60분간 배양에서 약 65℃ ;
(6) 최적 pH
40℃ 및 60분간 배양에서 약 6.0∼6.7 ;
(7) 열적 안정성
pH 7.0에서 60분간 유지하여 약 80℃ 부근까지 안정 ;
(8) pH 안정성
60℃에서 60분간 유지하여 pH 약 5.5∼9.5에서 안정 ;
본 발명의 말토오스-트레할로오스 전환 효소의 활성은 다음과 같이 하여 측정한다. 기질로서 말토오스 20w/v％ (10mM 인산 완충액, pH 7.0) 1㎖ 에 효소액을 1㎖ 가하고 25℃, 35℃ 또는 60℃에서 60분간 반응시킨 후 반응액을 100℃에서 10분간 가열하여 반응을 정지시켰다. 수득한 반응 혼합물에 50mM 인산 완충액 (pH 7.5)을 정확히 11배량을 가해 희석한 다음 이 희석액 0.4㎖를 트레할라아제 1단위/㎖를 함유한 트레할로오스액 0.1㎖ 와 혼합하였다. 45℃에서 120분간 유지한 다음 글루코오스-옥시다아제법으로 글루코오스의 양을 측정한다. 대조로서 트레할라아제와 효소액을 100℃에서 10분간 가열하여 효소를 실활시킨 것을 사용하여 위와 마찬가지 방법으로 효소액의 활성을 구한다. 위의 측정 방법에서 본 발명의 말토오스-트레할로오스 전환 효소에 의해 생성된 트레할로오스의 함유량을 글루코오스 생성량에 대하여 구하고 1분간에 1μmole의 트레할로오스를 생성시키는 효소의 양을 효소활성 1단위로 정의하였다. 반응 온도에 대해서는 피멜로박터속 미생물의 효소인 경우에는 25℃, 슈우도모나스속 미생물의 효소인 경우에는 35℃, 그리고 헤르무스속 미생물의 효소인 경우에는 60℃로 설정한다.
본 발명의 말토오스-트레할로오스 전환 효소는 말토오스를 트레할로오스로, 또는 그 반대로 전환시키므로 최종 용도에 부합하도록 말토오스 또는 트레할로오스를 기질로 사용할 수 있다. 트레할로오스 제조용 기질로서 말토오스를 사용한다.
본 발명의 말토오스-트레할로오스 전환 효소의 작용을 받았을 때 트레할로오스로 전환되는 말토오스이면 어느것이나 본 발명에서 사용할 수 있는데, 일반적으로 최고 가능한 순도, 바람직하게는 순도가 건조 고형분 기준으로 70％ 이상인 말토오스 고함유 제품을 적절히 사용할 수 있다. 시판품인 말토오스 제품이나 종래의 전분 당화법으로 제조된 것들도 사용된다.
전분으로부터 말토오스로 제품화된 것들의 예에 관해서는 일본국 특허 공고 제11,437/87호 및 제17,078/81호에 개시되어 있는데, 즉 호화 및 액화 전분에 β-아밀라아제를 작용시켜 말토오스를 생성시킨 다음 고분자량의 덱스트린과 분리하여 말토오스 고함유 제품을 얻고 있다. 또 다른 예로서는 일본국 특허 공고 제13,089/72호 및 제3,938/79호에 개시된 것들이 있는데, 즉 이소아밀라아제, 풀룰라나아제 등의 전분 지절(枝切) 효소 (debranching enzyme) 와 더불어 호화 및 액화 전분에다 β-아밀라아제를 작용시켜 말토오스를 생성시킨 다음 말토오스 고함유 제품을 회수하여서 된 것들이다.
위의 제조 방법으로 제조된 말토오스 고함유 제품중에 존재하는 말토트리오스 등의 협잡 당류에 일본국 특허 공고 제28,153/81호, 제3,356/82호 및 제28,154/81호 등에 기재된 효소를 가하여 말토오스 함유량을 증가시킨다.
말토오스 고함유 제품중의 말토오스 함유량을 일본국 특허 공개 제23,799/83호에 개시된 강산성 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피에 의해 협잡당류를 제거함으로써 양호하게 증가시킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는 기질의 농도는 특히 한정되지 않는다. 예컨대 0.1％의 말토오스 용액으로 하여 사용했을 경우나 50％의 말토오스 용액으로 하여 사용했을 경우에도 본 발명의 효소 반응은 진행하여 트레할로오스를 생성한다. 또한, 기질 용액중에 완전히 용해하지 않는 불용성 기질을 함유하는 것이어도 좋다. 반응 온도는 효소 반응이 진행하는 온도, 즉 80℃ 부근까지에서 실시하면 좋은데, 바람직하게는 약 0∼70℃ 의 범위를 이용한다. 반응 pH 는 통상 5.5∼9.0의 범위로 조정하면 좋은데, 바람직하게는 약 pH 6.0∼8.5 의 범위로 조정한다. 반응 시간은 효소 반응의 진행 상태에 따라 적절히 선택하면 좋은데, 통상 기질 고형물 그램당 약 0.1∼100 단위의 효소 사용량에서 0.1∼100시간 정도이다.
본 발명의 효소 반응에 의해 말토오스로부터 트레할로오스로의 전환율을 비교적 크게 할 수 있는데, 예컨대 최고 전환율은 약 70∼85% 이다.
이와 같이 수득한 반응액은 통상의 방법에 따라 여과, 원심분리에 의해 불용물을 제거한 후 활성탄으로 탈색하고 H형 및 OH형 이온 교환 수지로 탈염한 후 농축하여 시럽상 제품으로 한다. 더욱이, 시럽상 제품을 건조하여 분말상 제품 또는 결정질 제품으로 하는 것도 가능하다.
또한, 다시 정제, 예컨대 이온 교환 크로마토그래피에 의한 분획, 활성탄 칼럼 크로마토그래피에 의한 분획, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의한 분획 및 알칼리 처리에 의한 잔존 환원성 당질의 분해제거 등의 방법으로 정제함으로써 최고 순도의 트레할로오스 제품을 제조하는 것도 용이하다. 이러한 칼럼 크로마토그래피법으로 분리되는 말토오스를 본 발명의 말토오스-트레할로오스 전환 효소에 의한 말토오스의 트레할로오스로의 전환용 기질로 사용할 수 있다.
이와 같이 하여 제조한 트레할로오스를 함유한 본 발명의 당질 조성물을 필요에 따라 글루코아밀라아제, α-글루코시다아제 등으로 가수분해 하거나 시클로말토덱스트린 글루카노트란스퍼라아제 및/또는 글루코실트란스퍼라아제 등에 의해 당전이 반응을 시켜 감미성, 환원력 등을 조정하고 점성을 저하시키거나 하는 것도, 그리고 수득한 트레할로오스 제품중의 환원성 당질을 알칼리 처리하여 분해한 다음 효모로 발효시키거나 수소 첨가하여 당알코올로 변환시켜 환원력을 소멸시키는 등의 가공 처리를 실시하는 것도 가능하다. 이것을 전술의 정제방법, 예컨대 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 등에 의하여 글루코오스를 제거하여 트레할로오스 고함유 획분을 채취한다. 이 획분을 정제, 농축하여 시럽상 제품을 얻는 것도, 시럽상 제품을 더욱 농축하여 과포화 용액으로 해서 결정화하여 트레할로오스 함수 결정 또는 무수 결정 트레할로오스를 제조하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.
이온 교환 칼럼 크로마토그래피로서는 일본국 특허 공개 제23,799/83호 공보와 특허 공개 제72,598/83호 공보 등에 개시되어 있는 염형 강산성 양이온 교환 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피가 있다. 이러한 칼럼 크로마토그래피에 의해 미정제 트레할로오스 제품중의 협잡 당류를 제거하여 트레할로오스 고함유 획분을 채취하는 방법을 유리하게 실시할 수 있다. 이 경우에 있어서 고정상 방식, 이동상 방식, 의사(擬似) 이동상 방식중의 어느 방법을 사용해도 좋다.
트레할로오스 함수 결정을 제조하자면, 농도 약 65∼90% 의 트레할로오스 (순도 60% 이상) 고함유액을 결정화기에 넣고 0.1∼20% 의 종정(種晶 : Seed Crystal) 존재하 또는 부재하에 온도 95℃ 이하, 바람직하게는 10℃∼90℃ 의 범위에서 교반하면서 서서히 냉각하여 트레할로오스 함수 결정을 함유하는 매스키트 (massecuite) 를 제조한다. 목적으로 하는 당질을 감압하에 농축하여 결정화하는 연속 결정화법을 사용할 수도 있다. 매스키트로부터 트레할로오스 함수 결정 또는 이것을 함유하는 당질 결정을 제조하는 방법은, 예컨대 분리법, 블록 분쇄 방법, 유동 조립(造粒) 방법, 분무 건조 방법 등 공지의 방법을 사용하면 좋다.
분리법의 경우에는 통상 매스키트를 바스켓형 원심 분리기에서 처리하여 트레할로오스 함수 결정과 모액을 분리하고, 필요에 따라 이 결정에 소량의 냉수를 분무하여 트레할로오스 함수 결정을 세척하여 보다 고순도의 트레할로오스 함수 결정을 용이하게 제조할 수 있다.
분무 건조 방법의 경우에는 통상 건조 고형분 기준으로 농도 약 60∼85%, 결정화율 약 20∼60% 정도의 매스키트를 고압 펌프로 노즐로부터 분무하여 결정 분말이 용해하지 않는 온도, 예컨대 60℃∼100℃ 의 열풍으로 건조한 다음 30℃∼60℃의 온풍으로 약 1∼20시간 숙성하면 비흡습성 또는 난(難)흡습성의 당질 결정을 용이하게 제조할 수 있다.
또한, 블록 분쇄 방법의 경우에는 통상 건조 고형분 기준으로 수분 약 10∼25%, 결정화율 약 10∼60% 정도의 매스키트를 약 수시간 내지 3일간 정치하여 전체를 블록상으로 결정화하고, 고화시킨 다음 이것을 분쇄 또는 절삭 등의 방법으로 분말화하여 건조하면 비흡습성 또는 난흡습성의 당질 결정을 용이하게 제조할 수 있다.
또한, 무수 결정 트레할로오스를 제조하자면 트레할로오스 함수 결정을 건조하여 무수 상태의 것으로 변환시킬 수도 있으나, 일반적으로는 수분 10% 미만의 고농도 트레할로오스 고함유 용액을 결정화기에 넣고 종정 존재하에 50℃∼160℃, 바람직하게는 80℃∼140℃ 의 범위에서 교반하면서 무수 결정 트레할로오스를 함유하는 매스키트를 제조하고, 이것을 비교적 고온 건조 조건하에서 예컨대 블록 분쇄, 유동 조립(造粒), 분무 건조 등의 방법으로 결정화하고 분말화하여 무수 결정 트레할로오스를 제조한다.
이와같이 하여 제조되는 본 발명의 트레할로오스는 환원력이 없고 안정하여 기타 소재, 특히 아미노산 및 올리고펩티드, 단백질 등의 아미노산 또는 아미노기함유물질과 혼합 가공하여도 갈변하는 일도 없고 악취를 발생하는 일도 없으며, 혼합한 다른 소재를 상하게 하는 일도 없다. 또한, 그 자신이 양질로서 상품의 감미를 가지고 있다. 더욱이, 트레할로오스는 트레할라아제에 의하여 용이하게 글루코오스로 까지 분해되므로 트레할로오스는 경구 섭취에 의하여 소화 흡수되어 칼로리원으로서 이용된다. 더욱이, 본 발명의 트레할로오스는 충치 유발균 등에 의하여 발효되기 어려우므로 충치를 일으키기 어려운 감미료로서도 이용할 수 있다.
그리고, 본 발명의 트레할로오스는 안정한 감미료이므로, 특히 결정 제품의 경우에는 풀룰란, 히드록시에틸 전분 및 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제와 병용하여 정제(錠劑) 의 당의제로서 이용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 또한, 본 발명의 트레할로오스는 삼투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성, 기타 당의 결정화 방지성, 난(難)발효성, 호화 전분의 노화 방지성 등의 성질을 구비하고 있다.
따라서, 본 발명의 트레할로오스 및 이것을 함유하는 당질 조성물은 감미료, 정미(呈味)개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제 등으로서 음식물, 기호물, 사료, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
본 발명의 트레할로오스 및 이것을 함유하는 당질 조성물은 그대로 감미 부여를 위한 조미료로서 사용할 수 있다. 필요하다면, 예컨대 분말 시럽, 글루코오스, 말토오스, 수크로오스, 이성화당, 꿀, 메이플 슈거, 소르비톨, 말티톨, 락티톨, 디히드로칼콘, 스테비오시드, α-글리코실 스테비오시드, 레바우디오시드, 글리시리진, L-아스파르틸 L-페닐알라닌 메틸 에스테르, 사카린, 글리신 및 알라닌 등과 같은 기타 감미료의 1종 또는 2종 이상의 적당량과 혼합해서 사용하여도 좋고, 또한 필요하다면 덱스트린, 전분, 락토오스 등과 같은 중량제와 혼합하여 사용할 수도 있다.
또한, 본 발명의 트레할로오스 및 이것을 함유하는 분말 내지 결정상 당질 조성물 제품은 그대로 또는 필요에 따라 중량제, 부형제, 결합제, 희석제 등과 혼합하여 과립, 구상, 단봉상, 판상, 입방체, 정제 등 각종 형상으로 성형하여 사용할 수도 있다.
그리고, 본 발명의 저환원성의 트레할로오스 및 이것을 함유하는 당질 조성물의 감미는 신맛, 짠맛, 떫은 맛, 감칠 맛, 쓴 맛 등의 기타 정미를 가진 각종 물질과 잘 조화하고, 내산성과 내열성도 크므로 일반적인 음식물의 감미료, 맛개선제 및 품질 개량제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.
본 발명의 트레할로오스와 이것을 함유하는 당질 조성물은 간장, 분말 간장, 된장, 분말 된장, 정제술, 정제 간장, 어육 조미품, 마요네즈, 드레싱, 식초, 산바이 주 (설탕, 간장, 식초로 된 소오스), 초밥용 분말 식초, 츄가노 모토 (중화 요리용 인스탄트 믹스), 텐츠유 (일본식 튀김 식품용 소오스), 멘츠유 (일본식 버어미셀리용 소오스), 소오스, 켓찹, 배추 겉절임용 프리믹스, 야구니쿠노 타레 (일본식 불고기용 소오스), 커리 루우, 인스탄트 스튜우 믹스, 인스탄트 수우프 믹스, 다시 노 모토 (인스탄트 스톡 믹스), 복합 조미료, 미린 (감미나는 술), 신미린 (합성 미린), 테이블 슈거, 커피 슈거 등 각종 조미료로서 유리하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 트레할로오스와 이것을 함유하는 당질 조성물은 각종 일본식 과자류 [예 : 센베이 (쌀 크래커), 아라레모치 (입방체의 쌀떡), 오코시 (기장과 쌀로 된 케이크), 모치 (쌀풀), 만주 (팥 잼 넣은 만두), 우이로 (단맛의 젤리), 안 (팥 잼), 요캉 (단맛의 팥 젤리), 미즈 요캉 (연질의 아즈키 팥 젤리), 킹요쿠 (요캉의 일종), 젤리, 파오드 카스텔라, 아메다마 (일본식 토피)] ; 양과자류 [예 : 빵, 비스켓, 크래커, 쿠우키, 파이, 푸딩, 버터 크리임, 커스터드 크리임, 크리임 퍼프, 와플, 스폰지 케이크, 도우넛, 초콜렛, 츄잉 검, 카라멜, 캔디] ; 빙과류 [예 : 아이스 크리임, 셔어벳] ; 시럽류 [예 : 과실의 시럽 절임, 빙수용 설탕 시럽 ] ; 페이스트류 [예 : 플라워 페이스트, 피이넛 페이스트, 푸루트 페이스트, 스프레드] ; 과실과 야채의 가공 식품류 [예 : 잼, 마아멀레이드, 시럽 즈케 (과실 피클류), 토카 (당과)] ; 절임 및 절임 제품 [예 : 푸쿠진 즈께 (적색의 무우 피클), 베타라 츠케 (통무우 피클), 센마이 즈케 (썰은 무우 절임), 라쿄 즈케 (파 절임)] ; 축육 제품류 [예 : 햄, 소오세지] ; 어육제품 [예 : 어육햄, 어육 소오세지, 어묵, 치쿠와 (어묵의 일종), 튀김] ; 각종 진미류 [예 : 성게 내장젓, 오징어젓, 가공된 다시마, 말린 오징어채, 미린으로 조미된 말린 복어] ; 츠쿠다니 (간장에 끓인 음식) [예 : 김, 산채, 말린 오징어, 소어(小魚), 조개] ; 평상시 식품 [예 : 볶은 팥, 감자 샐러드, 다시 말이] ; 우유 제품 [예 : 축육, 어육, 과실, 야채 등의 통조림, 병조림] ; 주류 [예 : 합성주, 와인, 양주 등] ; 청량 음료수 [예 : 커피, 차, 코코아, 주우스, 탄산 음료, 유산 음료, 유산균 음료 등] ; 즉석 식품 [예 : 인스탄트 푸딩 믹스, 인스탄트 핫 케이크 밀스, 즉석 시루코, 즉석 수우프 믹스] ; 각종 음식물 [예 : 이유식, 치료식, 드링크제, 펩티드 식품, 냉동 식품 등] 에 대한 감미 부여, 맛 개량, 품질 개량 등에 유리하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 트레할로오스와 이것을 함유하는 당질 조성물은 가축, 가금, 꿀벌, 누에, 물고기 등의 사육 동물을 위한 사료, 이료 등의 기호성을 향상시킬 목적으로 사용할 수 있다. 그외에 담배, 치약, 입술 연지, 립 크림, 내복액, 정제, 트로치, 간유 드롭, 구중 청량제, 구중 향제 가아글제 등, 각종 고형물, 페이스트상, 액상 등으로 하여 기호물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 대한 감미제로서 또는 정미 개량제, 교미제로서, 더욱이는 품질 개량제, 안정제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.
본 발명의 트레할로오스와 이것을 함유하는 당질 조성물은 유효 성분, 활성 등을 상실하기 쉬운 각종 생리 활성 물질 또는 이것을 함유한 건강 식품, 의약품 등에 품질 개량제와 안정제로서 유리하게 적용할 수 있다. 예를 들자면, 림포카인류 [예 : α-β- 및 γ-인터페론, 종양괴사인자-α (TNF-α), 종양 괴산인자-β (TNF-β), 대식세포 유주(游走) 저지인자, 콜로니 자극인자, 트랜스퍼 팩터, 인터로이킨 Ⅱ등] ; 호르몬류 [예 : 인슐린, 성장 호르몬, 프롤락틴, 에리트로포이에틴, 단세포 자극 호르몬, 태반 호르몬 등] ; 생물제제 [예 : BCG 백신, 일본 뇌염 백신, 홍역 백신, 폴리오 생백신, 천연두 백신, 파상풍 톡소이드, 반시뱀 항독소, 인간 면역 글로불린 등] ; 항생물질 [예 : 페니실린, 에리드로마이신, 클로람페니콜, 테트라사이클린, 스트렙토마이신, 황산 카나마이신 등] ; 비타민류 [예 : 티아민, 리보플라빈, L-아스코르브산, 간유, 카로티노이드, 에르고스테롤, 토코페롤 등] ; 효소류 [예 : 라파아제, 엘라스타아제, 우로키나아제, 프로테아제, β-아밀라아제, 이소아밀라아제, 글루카나아제, 락타아제 등] ; 엑스류 [예 : 약용 인삼 엑스, 자라 엑스, 글로렐라 엑스, 알로에 엑스, 프로폴리스 엑스 등] ; 생균류 [예 : 바이러스, 유산균, 효모 등] ; 기타 생리 활성 물질 [예 : 로얄젤리 등] 도 그 유효 성분, 활성을 상실함이 없이 안정하고도 고품질의 액상, 페이스트상 또는 고상의 건강 식품이나 의약품 등을 용이하게 제조할 수 있게 된다.
이상 설명한 각종 물질과 조정물에 본 발명의 트레할로오스와 이것을 함유한 당질 조성물을 함유시키는 방법은, 예를 들자면 혼화, 용해, 융해, 침지, 침투, 살포, 도포, 피복, 분무, 주입, 결정화, 고화 등 공지의 방법이 적절히 선택된다. 트레할로오스와 이것을 함유하는 당질 조성물의 첨가량은 통상적으로 건조 고형분 기준으로 0.1% 이상, 바람직하게는 1% 이상 함유시키는 것이 바람직하다.
이하 실험에 의하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
[실험 1]
[효소의 제조]
글루코오스 2.0w/v%, 폴리펩톤 0.5w/v%, 효모 엑스 0.1w/v%, 인산 수소 2 나트륨 0.06w/v%, 인산 수소 칼륨 0.1w/v%, 황산 마그네슘 7 수화물 0.05w/v5%, 탄산 칼륨 0.5w/v% 및 물로 된 액체 배지 100㎖씩을 500㎖ 용량의 삼각 플라스크에 넣고 오토클레이브에서 115℃에서 30분간 멸균하고 냉각한 다음 피멜로박터 sp. R48 (FERM BP-4315)을 접종하고, 27℃, 200 r.p.m.에서 24시간 배양한 것을 종배양액 (seed culture) 으로 하였다.
용량 30ℓ의 퍼어멘터 (fermentor)에 종배양의 경우와 동일한 조성의 배지 약 20ℓ씩을 넣고 멸균 후 냉각하여 온도 27℃로 한 후 종배양액 1v/v%을 접종하고 온도 27℃, pH 6.0∼8.0에서 유지하면서 약 40시간 통기 교반 배양 하였다.
배양액의 말토오스-트레할로오스 전환 효소의 효소 활성은 0.55단위/㎖이었다. 배양액의 일부를 취하여 원심 분리하여 균체와 배양 상청액으로 분리하고, 다시 균체를 50mM 인산 완충액 (pH 7.0)으로 원래의 배양액과 동일한 액량의 현탁액으로 한 후 균체 현탁액과 배양 상청액의 효소 활성을 측정한 결과, 각각 0.5단위/㎖ 및 0.05단위/㎖ 이었다. 그리고, 이 효소 활성은 25℃에서 측정한 값이다.
[실험 2]
[효소 정제]
실험1에서 얻은 배양액을 원심 분리하여 약 0.5㎏의 습윤 균체를 얻은 다음 10mM 인산 완충액 (pH 7.0)에 현탁시켰다. 균체 현탁액을 세포 파쇄 장치 (VIBROGEN-ZELLMHLE : 독일국의 Edmund Bhler 사제) 로 파쇄한 후, 수득한 혼합물을 원심 분리 (15,000 × g, 30분간)하여 상청액 4.5ℓ를 얻었다.
이 상청액에 황산 암모늄을 가하여 용해시켜 포화도 0.3의 용액으로 한 후 이 용액을 4℃에서 4 시간 방치한 다음 원심 분리하여 상청액을 얻었다.
수득한 상청액에 다시 황산 암모늄을 가하여 용해시켜 포화도 0.8의 용액을 얻어 이것을 4℃에서 하룻밤 방치한 후 원심 분리하여 침강물을 얻었다.
이 침강물을 10mM 인산 완충액 (pH 7.0)에 용해하여 동일한 완충액에 대하여 24시간 투석하고 원심 분리하여 불용물을 제거하였다. 이 투석액 400㎖ 를2회에 나누어 DEAE-Toyopearl 겔 (일본국 Tosoh 주식회사제)을 사용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 (겔의 양 300㎖)를 하였다.
본 발명의 말토오스-트레할로오스 전환 효소를 이온 교환 수지에 흡착시켜 식염을 함유한 동일한 인산 완충액으로 칼럼으로부터 용출시켰다. 칼럼에서 용출된 효소 활성 획분을 회수하여 한데 모아 1M 황산 암모늄 함유의 동일한 완충액에 대해 투석하였다. 이 투석액을 원심 분리하여 불용물을 제거하고 수득되는 상청액을 "부틸-Toyopearl 650" (일본국의 Tosoh 주식회사제의 소수성 (疎水性) 겔)을 사용한 소수 칼럼 크로마토그래피 (겔의 양 : 300㎖)를 하였다. 겔에 흡착된 말토오스-트레할로오스 전환 효소를 황산 암모늄 1M으로부터 0M 까지의 직선 기울기에 의하여 칼럼으로부터 용출시켜 효소 활성 획분을 회수한 다음 MONO Q HR5/5 겔 (스웨덴국의 Pharmacia LKB 사제)을 사용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 (겔의 양 : 10㎖)를 하여 효소 활성 획분을 회수하였다. 정제의 각 공정에서의 효소 활성량, 비활성(比活性) 및 수율을 표 1에 나타내었다.
위의 정제법으로 수득한 정제 효소 제품을 소디움 도데실술페이트 폴리아크릴아미드 겔 (겔 농도 7.5%)을 사용하는 전기 영동법으로 순도를 검정한 결과 단백질 밴드는 단 하나가 나타났고, 수득한 효소 제품은 상당히 고순도의 것이었다.
[실험 3]
[효소의 성질]
실험2에서 수득한 정제 말토오스-트레할로오스 전환 효소 제품 일부를 SDS(소디움 도데실술페이트)-폴리아크릴아미드 겔 (겔 농도 10%)을 사용하는 전기 영동법으로 처리하고, 동시에 영동 처리된 분자량 마아커 (marker) (일본국의 Japan Bio-Rad Laboratory 주식회사제) 와 비교하여 이 효소의 분자량을 측정한 결과 분자량 약 57,000∼67,000 돌턴이었다.
정제 말토오스-트레할로오스 전환 효소 제품을 폴리아크릴아미드 겔 (2v/v% " Ampholine" 함유, 스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechnology AB 사제의 양쪽성 전해질)을 사용하는 등전점 전기영동법으로 처리한 후, 수득한 겔을 잘게 썰어 겔의 pH를 측정하여 이 효소의 등전점 (pI)을 구한 결과, 등전점은 약 4.1∼5.1 이었다.
이 효소의 활성에 대한 온도의 영향과 pH의 영향을 효소 활성 측정 방법에 준하여 조사하였다. 그 결과는 제1도(온도의 영향)와 제2도 (pH의 영향)에 각각 나와 있다. 효소의 최적 온도는 pH 7.0에서 60분간 반응에서는 20℃부근이었고, 최적 pH는 25℃에서 60분간 반응에서 약 7.0∼8.0이었다. 이 효소의 열적 안정성은 효소 용액 (50mM 인산 완충액을 함유, pH 7.0)을 각 온도에서 60분간 유지하고 물로 냉각한 후 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 그리고, pH안정성은 이 효소를 각기 상이한 pH의 50mM 인산 완충액 중에서 20℃에서 60분간 유지한 후 pH를 7.0으로 조정하고 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 각각의 결과는 제3도(열적 안정성)와 제4도 (pH안정성)에 나와 있다. 이 효소의 열적 안정성은 30℃부근까지 안정하였고, pH안정성은 약 6.0∼9.0이었다. 1mM Cu++또는 Hg++와 50mM Tris-HCl 완충액은 이 효소에 대해 억제활성이 있었다.
[실험 4]
[당질에 대한 작용]
각종 당질에 대해 본 발명의 효소에 대하여 기질로 사용할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해 시험을 하였다. 글루코오스, 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스, 말토헵타오스, 가용성 전분, 평균 중합도 18의 아밀로오스, 트레할로오스, 네오트레할로오스, 젠티오비오스, 코지비오스, 이소말토오스, 셀로비오스, 말티톨, 수크로오스, 말툴로오스, 투라노오스, 파라티노오스, 트레할룰로오스 또는 락토오스의 용액을 제조하였다. 글루코오스 및 동일량의 α-글루코오스 1-포스페이드 또는 β-글루코오스 1-포스페이트를 함유한 용액을 제조하였다.
이들 용액에 각각 기질 1g당 실험2의 방법으로 제조한 말토오스-트레할로오스 전환 효소 2단위를 혼합하고 기질 농도를 5w/v%로 조정한 후 20℃, pH 7.0에서 24시간 효소 반응시켰다. 효소 반응 전후의 용액을 KIESELGEL 60 (20×20㎝) (미합중국의 Merck사제의 TLC용 알루미늄판)을 사용하는 박층 크로마토그래피 (TLC) 처리하여 이 효소가 당질에 작용하는지를 조사하였다. 수득한 생성물을 1-부탄올, 피리딘 및 물 (= 6 : 4 : 1 체적비)의 전개 용매계로 판위에 한번 전개하였다. 알루미늄 판위의 생성물에 20v/v% 메탄올-황산 용액을 분무하여 110℃에서 10분간 가열하여 발색시켰다. 그 결과는 표2에 나와 있다.
표2의 결과로부터 명백한 바와 같이 본 발명의 효소는 기타 여러 가지 당질 중에서도 말토오스와 트레할로오스에 대해서만 작용을 하고, 특히 글루코오스와 α-글루코오스 1-포스페이트 또는 β-글루코오스 1-포스페이트를 함유하는 계에 대해서는 작용하지 않는다는 것이 확인되었다. 이들 결과로부터 본 발명의 효소는 종래의 말토오스- 및 트레할로오스-포스포릴라아제와는 상이한 신규의 효소인 것으로 결론 지을 수 있다.
[실험 5]
[말토오스 또는 트레할로오스로 부터의 제조]
실험2의 방법으로 제조한 말토오스-트레할로오스 전환 효소를 건조 고형분 기준으로 기질인 말토오스 1g등 2단위로 하여 말토오스 수용액에 가하여 최종 기질 농도를 5w/v%로 한 다음 20℃, pH 7.0에서 24시간 효소 반응 시켰다. 수득한 반응 혼합물의 당질 조성을 가스 크로마토그래피 (이하, 간단히 " GLC " 라 함)로 분석하였다. 반응 혼합물의 일부를 취해 건조한 다음 피리딘에 용해하여 트리메틸실릴화함으로써 분석용 시료인 제품을 얻었다. GLC 분석장치와 분석조건을 " CG-16A " (일본국의 Shimadzu 사제의 가스 크로마토그래프) ; 스테인레스강제의 칼럼 [직경 3mm, 길이 2m, 2% "SILICONE OV-17/CHROMOSORB W" (일본국의 GL Science 사 판매) 충전] ; 캐리어 가스로서 질소 가스를 사용하여 유속 40㎖/min ; 오븐중에서의 온도 상승속도 ; 160℃∼320℃ 의 범위에서 7.5℃/min 이었다. 당질 조성은 수소 플레임 (hydrogen flame) 이온화 검출기로 분석하였다. 그 결과는 표3에 나와 있다.
표3의 결과로부터 명백한 바와 같이 반응 생성물X의 생성량과 체류 시간은 시판품인 트레할로오스와 일치함을 확인하였다, 반응 생성물X을 확인하기 위하여 아래의 확인 시험을 하였다. 위에서 사용한 것과 동일한 말토오스 수용액을 20mM 아세트산 완충액 (pH 4.5)으로 희석하여 말토오스 농도를 2w/v%로 한 다음 0.5㎖를 취해 글루코아밀라아제 (일본국 Seikagaku-Kogyo 사 판매) 0.1 단위와 혼합한 후 40℃에서 20시간 효소 반응시켰다.
마찬가지로 위에서 사용한 것과 동일한 말토오스 수용액을 20mM 아세트산 완충액 (pH 7.0)으로 희석하여 말토오스 농도를 2w/v%로 한 다음 0.5㎖를 취해 트레할라아제 0.5단위와 혼합한 후 40℃에서 20시간 효소 반응시켰다. 미처리의 잔류 말토오스 수용액과 글루코아밀라아제 및 트레할라아제로 처리된 말토오스 수용액을 GLC에서 분석한 다음 그 데이터를 연구한 결과 말토오스는 글루코아밀라아제에 의해 완전히 분해되어 글루코오스를 생성하였으나 반응 생성물X는 변화없이 그대로 유지되고 있었음을 확인하였다.
트레할라아제로 처리했을 경우 말토오스는 변화가 없었으나 반응 생성물 X는 왼전히 분해되어 글루코오스를 생성하였다. 글루코아밀라아제와 트레할라아제의 반응 메카니즘을 고려하면 결론적으로는 본 발명의 효소가 말토오스로부터 올리고 당인 트레할로오스를 생성한다는 것이다. 더욱이, 본 발명에 의한 정제 효소를 말토오스의 경우에서 사용한 것과 동일한 조건하에 기질인 트레할로오스에 작용시켜 수득한 반응 혼합물을 GLC로 분석하였다. 데이터로부터 본 발명의 효소는 트레할로오스로부터 말토오스를 생성함이 확인되었다. 그 결과는 표4에 나와 있다.
표4의 결과로부터 명백한 바와 같이 본 발명의 효소는 말토오스를 트레할로오스로, 그리고 트레할로오스를 말토오스로 전환시킨다. 이러한 전환 반응의 평형 위치는 트레할로오스 생성쪽으로 있는데, 즉 말토오스로부터 트레할로오스로의 전환율은 약 70% 이상으로서 트레할로오스로부터 말토오스로의 전환율보다 훨씬 높다는 것을 확인하였다.
[실험 6]
[말토오스 농도가 트레할로오스 생성에 미치는 영향]
말토오스를 2.5, 5, 10, 20 또는 40w/v% 함유하는 용액에 실험2의 방법으로 제조한 말토오스-트레할로오스 전환 효소 정제품을 건조 고형분 기준으로 말토오스 1g당 2단위 가하여 혼합한 다음 20℃, pH 7.0에서 효소 반응시켰다. 효소 반응 도중 반응 혼합물을 샘플링하여 100℃에서 10분간 가열함으로써 효소를 실활시켰다. 반응 혼합물중의 총 당 함량은 안트론-황산법으로 측정하였다. 환원당 함량을 소모기-넬슨법 (Somogyi-Nelson method) 으로 글루코오스의 항으로 정량하고 환원력은 총 당 함량에 대한 환원당 함량의 비로 하여 측정하였다. 시료를 희석하여 약 1w/v%의 당질 농도로 한 다음 " MOL-CUT Ⅱ LGC " (일본국의 Japan MIllipore 사제) 로 처리하여 단백질을 제거한 후 고속 액체 크로마토그래피 (이하, 간단히 " HPLC " 라 함) 로 당질 조성을 분석하였다. 이 분석에 사용된 장치와 조건은 " CCPP 시스템 " (일본국의 Tosoh 사제의 HPLC 장치), "YMC-PACK PA-03 " (일본국의 YMC 사제의 직경 4.6mm, 길이 250mm 의 칼럼), 아세토니트릴과 물로된 용리계 (= 78 : 22 체적비), 유속 1.2㎖/min 및 검출기로서 시차 굴절계 (differential refractometer) 이었다. 그 결과는 표5 에 나와 있다.
표5의 결과로부터 명백한 바와 같이 말토오스로부터 트레할로오스로의 전환 반응은 말토오스 농도와는 관계없이 전환율 약 80%로서 원활하게 진행하였음을 알 수 있다.
[실험 7]
[트레할로오스 생성에 미치는 온도의 영향]
20w/v% 말토오스 용액에 실험2의 방법으로 제조한 말토오스-트레할로오스 전환 효소 정제품을 건조 고형분 기준으로 말토오스 1g당 2단위 가하여 혼합해서 5, 10, 15, 20 또는 25℃에서 효소 반응시켰다. 효소 반응 도중 일정 시간 간격으로 시료를 샘플링하여 100℃에서 10분간 가열함으로써 효소를 실활시켰다. 실험6에서와 마찬가지로 시료의 당질 조성을 HPLC로 분석하였다. 각각 상이한 온도와 반응 시간에서 샘플링된 각 시료중의 트레할로오스 함량은 표6에 나와 있다.
표6의 결과로부터 명백한 바와 같이 트레할로오스 생성속도는 반응 온도가 올라감에 따라 증가하고 있고 말토오스로부터 트레할로오스로의 전환 반응은 5℃에서도 원활히 진행하여 약82%의 전환율을 나타내고 있다.
[실험 8]
[말토오스로부터 트레할로오스 제조]
말토오스 (일본국의 林原 Biochemical Laboratories 사제 판매) 10중량부를 물 40중량부에 용해하고, 이 용액에 실험2의 방법으로 제조한 말토오스-트레할로오스 전환 효소 정제품을 건조 고형분 기준으로 말토오스 1g당 2단위 가하여 혼합한 다음 pH 7.0, 15℃에서 48시간 효소 반응시킨 후 반응 혼합액을 100℃에서 10분간 가열하여 잔존 효소를 실활시켰다. 건조 고형분 기준으로 트레할로오스를 약 74% 함유하는 반응 혼합액을 활성탄으로 탈색하고 H형 및 OH형 이온 교환 수지로 탈염하여 약 78w/v% 농도의 용액으로 농축한 다음 종정(種晶) 으로서 트레할로오스 결정 0.1%(d.s.b.)와 혼합한 후 주위 온도에서 하룻밤 방치하여 결정화하였다. 수득한 매스키트를 결정으로 분리한 다음 소량의 물과 함께 분무, 세척한 후 순도 99.8%의 고순도 트레할로오스 결정 약 3.0 중량부를 회수하였다.
[실험 9]
[효소의 제조]
글루코오스 2.0w/v%, 황산 암모늄 1.0w/v%, 인산 수소 2칼륨 0.1w/v%, 인산 2수소 나트륨 0.06wv%, 황산 마그네슘 0.05w/v%, 탄산 칼슘 0.3w/v% 및 물로 된 액체 배지 100㎖ 씩을 500㎖ 용량의 삼각 플라스크에 넣고 오토클레이브에서 115℃에서 30분간 멸균하고 냉각한 다음, 슈우도모나스 푸티다 (FERM BP-4579)를 접종하고, 27℃, 200 r.p.m.에서 24시간 배양한 것을 종배양액 (seed culture)으로 하였다.
용량 30ℓ의 퍼어멘터 (fermenter)에 위의 종배양의 경우와 동일한 조성의 액체 배지 약 20ℓ씩을 넣고 멸균 후 냉각하여 온도 27℃로 한 후 종배양액 1v/v%을 접종하고 온도 27℃, pH6.5∼8.0에서 유지하면서 약 20시간 통기 교반 배양하였다.
수득한 배양액의 말토오스-트레할로오스 전환 효소의 효소 활성은 0.12단위/㎖이었다. 배양액의 일부를 취하여 원심 분리하여 균체와 배양 상청액으로 분리하고, 다시 균체를 50mM 인산 완충액 (pH 7.0) 으로 원래의 배양액과 동일한 액량의 현탁액으로 한 후 균체 현탁액과 배양 상청액의 효소 활성을 측정한 결과, 각각 0.11단위/㎖ 및 0.01단위/㎖이었다. 이 효소 활성은 35℃에서 측정한 것이다.
[실험 10]
[효소 정제]
실험9에서 얻은 배양액을 원심 분리하여 약 0.45㎏의 습윤 균체를 얻은 다음 10mM 인산 완충액 (pH 7.0)에 현탁하였다. 이 균체 현탁액 약 2ℓ를 초고압 균체 파쇄 장치 " MINI-RABO " (일본국 大日本제약 주식회사제)로 처리하여 함유된 균체를 파쇄하였다. 처리액을 원심 분리 (15,000 × g, 30분간) 함으로써 약 1.7ℓ의 상청액을 얻었다. 이 액에 포화도 0.7 이되도록 황산 암모늄을 용해시키고 4℃에서 4시간 방치한 후 원심 분리함으로써 침강물을 회수하였다.
수득한 침강물을 10mM 인산 완충액 (pH 7.0)에 용해시킨 후 동일한 완충액에 대하여 24시간 투석하고 원심 분리하여 불용물을 제거하였다. 이 투석액 (400㎖)을 2회에 나누어 DEAE-Toyopearl 겔 (일본국 Tosoh주식회사제)을 사용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 (겔의 양 : 300㎖)를 하였다.
본 발명의 말토오스-트레할로오스 전환 효소를 겔에 흡착시켜 식염을 함유한 동일한 완충액으로 칼럼으로부터 용출하였다. 각각의 효소 활성 획분을 각각 회수하여 "DEAE-Toyopearl 겔" (일본국의 Tosoh주식회사제의 겔)을 사용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 (겔의 양 : 300㎖)를 하였다. 겔에 흡착된 말토오스-트레할로오스 전환 효소를 염 0.1M으로부터 0.3M까지의 직선 기울기에 의하여 칼럼으로부터 용출시켜 효소 활성 획분을 회수한 다음 Toyopearl HW-55S 겔 (일본국의 Tosoh주식회사제)을 사용한 겔 여과 칼럼 크로마토그래피 (겔의 양 : 400㎖)를 하여 용출된 효소 활성 획분을 회수하였다. 정제의 각 공정에서의 효소 활성량, 비활성(比活性) 및 수율을 표7에 나타내었다.
정제 효소 제품을 소디움 도데실술페이트 겔 (겔 농도 7.5w/v%)을 사용하는 겔 전기영동법으로 순도를 검정한 결과 단백질 밴드는 단 하나가 나타났고, 수득한 효소 제품은 전기영동적으로 단일의 고순도의 것이었다.
[실험 11]
[효소의 성질]
실험10의 방법으로 수득한 말토오스-트레할로오스 전환 효소 정제품 일부를 SDS (소디움 도데실술페이트)-폴리아크릴아미드 겔 (겔 농도 7.5w/v%)을 사용하는 전기영동법으로 처리하고, 동식에 전기영동 처리된 분자량 마아커 (marker) (일본국의 Japan Bio-Rad Laboratory 주식회사제)와 비교하여 이 효소의 분자량을 측정한 결과 분자량 약 110,000∼120,000 돌턴이었다.
말토오스-트레할로오스 전환 효소 정제품을 폴리아크릴아미드 겔 (2w/v% "Ampholine"함유, 스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechnology AB 사제의 양쪽성 전해질)을 사용하는 등전점 전기영동법으로 처리한 후, 겔을 잘게 썰어 겔의 pH를 측정하여 이 효소의 등전점 (pI)을 구한 결과, 등전점은 약 4.1∼5.1이었다.
이 효소 활성에 대한 온도의 영향과 pH의 영향을 활성 측정 방법에 준하여 조사하였다. 그 결과는 제5도(온도의 영향)와 제6도(pH의 영향)에 각각 나와 있다. 효소의 최적 온도는 pH 7.0에서 60분간 반응에서는 20℃부근이었고, 최적 pH 는 35℃에서 60분간 반응에서 약 7.3∼8.3이었다. 이 효소의 열적 안정성은 효소 용액 (50mM 인산 완충액을 함유, pH 7.0)을 각 온도에서 60분간 유지하고 물로 냉각한 후 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 그리고, pH안정성은 이 효소를 각각 상이한 pH의 50mM 인산 완충액 중에서 35℃에서 60분간 유지한 후 pH를 7.0으로 조정하고 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 효소의 열적 안정성과 pH안정성은 제7도와 제8도에 각각 나와 있다. 이 효소의 열적 안정성은 40℃ 부근까지 안정하였고, pH안정성은 약 6.0∼9.5이었다. 1mM Cu++또는 Hg++와 50mM Tris-HCl 완충액은 이 효소에 대해 억제활성이 있었다.
[실험 12]
[당질에 대한 작용]
반응온도를 35℃로 한 것외에는 실험4의 방법에 따라 실험 10에서 제조한 슈우도모나스 푸티다 H262 유래의 본 발명의 효소에 대한 기질로서 사용할 수 있는지의 여부에 대해 각종 당질을 시험하였다. 슈우도모나스 푸티다 H262 유래의 효소는 피멜로박터 sp. R48 유래의 효소와 마찬가지로 말토오스와 트레할로오스에 특이하게 작용하여 말토오스를 트레할로오스로, 그리고 트레할로오스를 말토오스로 전환시켰다. 전환 반응의 평형 위치는 트레할로오스 생성쪽에 있었는데, 즉 말토오스로부터 트레할로오스로의 전환율은 약 70%정도로서 높았음이 확인되었다.
[실험 13]
[말토오스 농도가 트레할로오스 생성에 미치는 영향]
말토오스를 5, 10, 20 또는 30% 함유하는 용액에 실험10의 방법으로 제조한 말토오스-트레할로오스 전환 효소 정제품을 건조 고형분 기준으로 말토오스 1g당 2단위 가하여 혼합한 다음 35℃, pH 7.0에서 효소 반응시켰다.
반응 도중 일정 시간 간격으로 반응 혼합물을 샘플링하였다. 각 샘플링을 100℃에서 10분간 가열하여 잔존 효소를 실활시켰다.
각 시료의 환원력과 당질 조성을 실험6에서와 마찬가지로 측정하였다.
그 결과는 표8에 나와 있다.
표8의 결과로부터 명백한 바와 같이 본 발명의 효소는 기질인 말토오스의 농도와는 관계없이 말토오스로부터 트레할로오스를 약 70%의 수율로 생성하였다.
[실험 14]
[말토오스로부터 트레할로오스 제조]
말토오스 (일본국의 林原 Biochemical Laboratories 사제 판매) 10중량부를 물 40중량부에 용해하고, 이 용액에 말토오스-트레할로오스 전환 효소 정제품을 건조 고형분 기준으로 말토오스 1g당 2단위 가하여 혼합한 다음 pH 7.0, 35℃에서 48시간 효소 반응시킨 후 반응 혼합액을 100℃에서 10분간 가열하여 잔존 효소를 실활시켰다. 건조 고형분 기준으로 트레할로오스를 약 69% 함유하는 반응 혼합액을 활성탄으로 탈색하고 H형 및 OH형 이온 교환 수지로 탈염하여 약 78w/v% 농도의 용액으로 농축한 다음 종정(種晶) 으로서 트레할로오스 결정 0.1%(d.s.b.)와 혼합한 후 주위 온도에서 하룻밤 방치하여 결정화하였다. 수득한 매스키트를 결정으로 분리한 다음 소량의 물과 함께 분무, 세척한 후 순도 99.7%의 고순도 트레할로오스 결정 약 2.3 중량부를 회수하였다.
[실험 15]
[효소의 제조]
폴리펩톤 0.5w/v%, 효모 엑스 0.1w/v%, 질산 나트륨 0.07w/v%, 인산 수소 2칼륨 0.01w/v%, 황산 마그네슘 0.02w/v%, 염화 칼슘 0.01w/v% 및 물로 된 액체 배지를 100㎖씩을 pH 7.5로 조정하여 500㎖ 용량의 삼각 플라스크에 넣고 오토클레이브에서 120℃에서 20분간 멸균하고 냉각한 다음, 테르무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33293)를 접종하고, 60℃, 200 r.p.m.에서 24시간 배양한 것을 종배양 (seed culture) 하였다.
용량 30ℓ의 퍼어멘터 (fermentor)에 위의 종배양의 경우와 동일한 조성의 액체 배지 약 20ℓ를 넣고 멸균 후 냉각하여 온도 60℃로 한 후 종배양액 1v/v%을 접종하고 온도 60℃, pH 6.5∼8.0에서 유지하면서 약 20시간 통기 교반 배양하였다. 수득한 배양액의 말토오스-트레할로오스 전환 효소의 효소 활성은 0.35단위/㎖이었다. 배양액의 일부를 취하여 원심 분리하여 균체와 배양 상청액으로 분리하고, 다시 균체를 50mM 인산 완충액 (pH 7.0)으로 원래의 배양액과 동일한 액량의 현탁액으로 한 후 균체 현탁액과 배양 상청액의 효소 활성을 측정한 결과, 각각 0.33단위/㎖ 및 0.02단위/㎖ 이었다. 이 효소 활성은 60℃에서 측정한 것이다.
[실험 16]
[효소 정제]
실험15에서 얻은 배양액을 원심 분리하여 약 0.28㎏의 습윤 균체를 얻은 다음 10mM 인산 완충액 (pH 7.0)에 현탁하였다. 이 균체 현탁액 약 1.9ℓ를 초음파 파쇄장치 "MODEL US300" (일본국 Nippon Seiki 주식회사제)로 처리하여 함유된 균체를 파쇄하였다. 처리액을 원심 분리 (15,000 × g, 30분간)함으로써 약 1.9ℓ의 상청액을 얻었다. 이 액에 포화도 0.7이 되도록 황산 암모늄을 용해시키고 4℃에서 4시간 방치한 후 원심 분리함으로써 침강물을 회수하였다.
수득한 침강물을 10mM 인산 완충액 (pH 7.0)에 용해시킨 후 동일한 완충액에 대하여 24시간 투석하고 원심 분리하여 불용물을 제거하였다. 이 투석액 (1,560㎖)을 3회에 나누어DEAE-Toyopearl 650겔 (일본국 Tosoh 주식회사제)을 사용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 (겔의 양: 530㎖)를 하였다.
본 발명의 말토오스-트레할로오스 전환 효소를 겔에 흡착시켜 식염을 함유한 동일한 완충액으로 칼럼으로부터 용출하였다. 각각의 효소 활성 획분을 각각 회수하여 1M 황산 암모늄 함유의 동일한 완충액에 대하여 투석한 다음 "부틸-Toyopearl 650 겔" (일본국의 Tosoh 주식회사제의 소수성 (疎水性) 겔)을 사용한 소수 칼럼 크로마토그래피 (겔의 양 : 380㎖)를 하였다. 겔에 흡착된 말토오스-트레할로오스 전환 효소를 염 1M으로부터 0M 까지의 직선 기울기에 의하여 칼럼으로부터 용출시켜 효소 활성 획분을 회수한 다음 Toyopearl HW-55S 겔 (일본국의 Tosoh 주식회사제)을 사용한 겔 여과 칼럼 크로마토그래피 (겔의 양 : 380㎖)를 하여 용출된 효소 활성 획분을 회수하였다. 획분율 "MONO Q HR5/5" (스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechndogy AB 제)를 1.0㎖ 사용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 하였다. 이 효소를 염 0.1M로부터 0.35M까지의 직선 기울기에서 칼럼으로부터 용출시켜 효소 활성 획분을 회수하였다. 정제의 각 공정에서의 효소 활성량, 비활성(比活性) 및 수율을 표9에 나타내었다.
정제 효소 제품을 소디움 도데실술페이드 폴리아크릴아미드 겔 (겔 농도 5w/v%)을 사용하는 겔 전기 영동법으로 순도를 검정한 결과 단백질 밴드는 단 하나가 나타났고, 수득한 효소 제품은 전기영동적으로 단일의 고순도의 것이었다.
[실험 17]
[효소의 성질]
실험16의 방법으로 수득한 말토오스-트레할로오스 전환 효소 정제품 일부를 SDS (소디움 도데실술페이트)-폴리아크릴아미드 겔 (겔 농도 7.5w/v%)을 사용하는 전기영동법으로 처리하고, 동시에 영동 처리된 분자량 마아커 (marker) (일본국의 Japan Bio-Rad Laboratory 주식회사제)와 비교하여 이 효소의 분자량을 측정한 결과 분자량 약 100,000∼110,000 돌턴이었다.
말토오스-트레할로오스 전환 효소 정제품을 폴리아크릴아미드 겔 (2w/v% "Ampholine"함유, 스웨덴국의 Pharmacia LKB Biotechnology AB 사제의 양쪽성 전해질)을 사용하는 등전점 전기영동법으로 처리한 후, 겔을 잘게 썰어 겔의 pH를 측정하여 이 효소의 등전점 (pI)을 구한 결과, 등전점은 약 3.8∼4.8이었다.
이 효소 활성에 대한 온도의 영향과 pH의 영향을 활성 측정 방법에 준하여 조사하였다. 그 결과는 제9도 (온도의 영향)와 제10도 (pH의 영향)에 각각 나와 있다. 효소의 최적 온도는 pH 7.0에서 60분간 반응에서는 65℃부근이었고, 최적 pH 는 60℃에서 60분간 반응에서 약 6.0∼6.7이었다. 이 효소의 열적 안정성은 효소 용액 (50mM 인산 완충액을 함유, pH 7.0)을 각 온도에서 60분간 유지하고 물로 냉각한 후 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 그리고, pH안정성은 이 효소를 각각 상이한 pH의 50mM 인산 완충액 중에서 60℃에서 60분간 유지한 후 pH를 7.0로 조정하고 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 효소의 열적 안정성과 pH안정성의 결과는 제11도와 제12도에 각각 나와 있다. 이 효소의 열적 안정성은 80℃ 부근까지 안정하였고, pH안정성은 약 5.5∼9.5이었다. 1mM Cu++또는 Hg++와 50mM Tris-HCl 완충액은 이 효소에 대해 억제활성이 있었다.
[실험 18]
[당질에 대한 작용]
반응온도를 50℃로 한 것외에는 실험4의 방법에 따라 제조한 테르무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 유래의 본 발명의 효소에 대한 기질로서 사용할 수 있는지의 여부에 대해 각종 당질을 시험하였다. 피멜로박터 sp. R48 과 슈우도모나스 푸티다 H262 유래의 효소와 마찬가지로 테르무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 유래의 효소는 말토오스와 트레할로오스에 특이하게 작용하여 말토오스를 트레할로오스로, 그리고 트레할로오스를 말토오스로 전환시켰다. 전환 반응의 평형 위치는 트레할로오스 생성쪽에 있었는데, 즉 말토오스로부터 트레할로오스로의 전환율은 약 70% 이상 이었음이 확인되었다.
[실험 19]
[말토오스 농도가 트레할로오스 생성에 미치는 영향]
말토오스를 2.5, 5, 10, 20 또는 40% 함유하는 용액에 실험16의 방법으로 제조한 테르쿠스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 유래의 말토오스-트레할로오스 전환 효소 정제품을 건조 고형분 기준으로 말토오스 1g당 2.5단위 가하여 혼합한 다음 60℃, pH 6.5에서 효소 반응시켰다. 반응 개시후 72시간 되었을 때 반응 혼합물을 샘플링하였다. 각 시료를 100℃에서 30분간 가열하여 잔존 효소를 실활시켰다. 각 시료의 환원력과 당질 조성을 실험6에서와 마찬가지로 측정하였다.
그 결과는 표10에 나와 있다.
표10의 결과로부터 명백한 바와 같이 본 발명의 효소는 기질인 말토오스의 농도와는 관계없이 말토오스로부터 트레할로오스를 약 70%의 수율로 생성하였다.
[실험 20]
[트레할로오스 생성에 미치는 온도의 영향]
pH 6.5의 20% 말토오스 용액에 실험16의 방법으로 제조한 테르무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 유래의 말토오스-트레할로오스 전환 효소 정제품을 건조 고형분 기준으로 말토오스 1g당 2.5단위 가하여 혼합해서 40, 50, 60 또는 70℃에서 효소 반응시켰다. 효소 반응 도중 일정 시간 간격으로 시료를 샘플링하여 100℃에서 30분간 가열함으로써 잔존 효소를 실활시켰다. 수득한 반응 혼합물에 대해 실험6에서와 마찬가지로 시료의 당질 조성을 HPLC로 분석하였다. 각각 상이한 온도와 반응 시간에서 샘플링된 각 시료중의 트레할로오스 함량은 표11에 나와 있다.
표11의 결과로부터 명백한 바와 같이 말토오스로부터 트레할로오스로의 전환 속도는 반응 온도가 내려감에 따라 증가하고 있고 말토오스로부터 트레할로오스로의 효소의 전환 반응은 약 80%의 전환율을 나타내고 있다.
[실험 21]
[미생물로부터 말토오스-트레할로오스 전환 효소의 제조 및 그 성질]
종래의 미생물중에서 본 발명의 말토오스-트레할로오스 전환 효소를 생성할 수 있는 능력을 가진 것으로 확인된 미생물을 삼각 플라스크중에서 실험15에 따라 48시간 배양하였다. 효소 활성을 분석한 후 배양액을 실험 16에 따라 균체 파쇄 장치에서 균체를 파쇄하였다. 수득한 혼합물로부터 상청액을 회수하여 투석함으로써 부분 정제된 효소를 얻은 다음 실험17에 따라 그 특성을 분석하였다. 그 결과는 표12에 나와 있다.
표12에 있는 테르무스속에 속하는 공지의 미생물 유래의 부분 정제된 효소의 실험18의 방법에 따른 각종 당질에 대한 작용을 검토하였다. 그 결과, 테르무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 유래의 효소와 마찬가지로 부분 정제된 효소는 말토오스와 트레할로오스에 특이하게 작용하여 말토오스로부터 트레할로오스를 생성하였음이 확인되었다.
또한, 테르무스 루베르 (ATCC 35948)의 말토오스-트레할로오스 전환 효소는 테르무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923)보다 최적 온도와 열적 안정성이 낮은 반면 테르무스속에 속하는 미생물 유래의 효소들은 테르무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923)과 거의 동일한 특성 및 비교적 높은 열적 안정성을 가지고 있음이 확인 되었다.
[실험 22]
[말토오스-트레할로오스 전환 효소의 부분 아미노산 서열]
실험2의 방법으로 얻은 피멜로박터 sp. R48, 실험10의 방법으로 얻은 슈우도모나스 푸티다 H262 또는 실험16의 방법으로 얻은 테르무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 유래의 정제 효소 일부를 증류수에대하여 투석하여 이 투석액의 단백질 약 80㎍을 효소의 N말단 함유 부분 아미노산 서열 분석용 시료로 사용 하였다. N말단을 단백질 시퀀서 (미합중국의 Applied Biosystems 사제의 PROTEIN SEQUENCER MODEL 473A)로 분석하였다. 각 효소의 N말단을 가진 부분 아미노산 서열은 표13에 나와 있다.
표 13 의 결과로부터 명백한 바와 같이 피멜로박터 sp. R48, 슈우도모나스 푸티다 H262 및 테르무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 유래의 효소들은 동족성이 큰 부분 아미노산을 가지고 있었다. 피멜로박터속에 속하는 미생물 유래의 10번째 아미노산인 "Trp" 로부터 16번째 아미노산인 "Phe" 까지의 부분 아미노산 서열 사이에서 비교적 동족성이 크게 나타났다. 그리고, 슈우도모나스 푸티다속에 속하는 미생물 유래의 3번째 아미노산인 "Trp" 로부터 9번째 아미노산인 "Phe" 까지의 부분 아미노산 서열 사이에서 비교적 동족성이 크게 나타났다. 이 부분 아미노산 서열을 Trp-X1-Arg-X2-Ala-X3-Phe (여기서 "X1" 은 "Phe" 또는 "Pro"를 뜻하고, "X2" 는 "Thr" 또는 "Pro"를 뜻함)으로 나타낼 수 있다. 피멜로박터속에 속하는 미생물 유래의 14번째 아미노산인 "Ala"에서부터 17번째 아미노산인 "Tyr" 까지의 부분 아미노산 서열 사이와 테르무스속에 속하는 미생물 유래의 9번째 아미노산인 "Ala" 로부터 12번째 아미노산인 "Tyr" 까지의 부분 아미노산 서열 사이에서 비교적 큰 동족성이 나타났다. 이 부분 아미노산 서열을 Ala-Val-X4-Tyr (여기서 "X4" 는 "Phe" 또는 "Ile"를 뜻함)로 나타낼 수 있다.
[실험 23]
[트레할로오스의 물리화학적 성질]
실험 8의 방법으로 제조한 고순도 트레할로오스 시료의 물리화학적 성질에 대해 조사하였다. 그 결과, 융점은 97.0℃, 비선광도는 [α]D 20+ 199°(c = 5), 융해열은 57.8 kJ/mole 이었고 25℃에서의 물에 대한 용해도는 무수 트레할로오스의 경우 77.0g이었다. 이들 데이터는 위에 나온 바와 같이 해서 실험을 한 시판품인 트레할로오스 함수 결정 (일본국 和光純藥 공업(주) 제) 의 데이타와 양호하게 일치하였다.
[실험 24]
[생체내에서의 이용시험]
厚治등이 臨床營養, 제 41 권, 제 2 호, 제 200-208 페이지 (1972년)에서 보고하고 있는 방법에 준하여 실험8의 방법으로 수득한 고순도 트레할로오스 제품 (순도 99.8%) 30g을 20w/v% 수용액으로 하고, 이것을 건강한 남성 지원자 3명 (26세, 27세 및 30세)에게 각각 경구 투여하여 경시적으로 채혈하고, 혈당치와 인슐린치를 측정하였다. 대조로서는 글루코오스를 사용하였다. 그 결과, 트레할로오스는 글루코오스의 경우와 마찬가지의 거동을 나타내어 혈당치와 인슐린치 모두에 있어서 투여후 약 0.5∼1시간에서 최대치를 나타내였다. 본 발명의 트레할로오스는 용이하게 소화 흡수되고 대사 이용되어 에너지원으로 되는 것이 판명되었다. 따라서, 본 발명의 트레할로오스와 이것을 함유하는 당질 조성물을 에너지 보충 당질로 적절히 사용할 수 있다.
[실험 25]
[급성 독성]
마우스를 사용하여 실험8에서 제조한 고순도 트레할로오스 제품(순도 99.8%)을 경구 투여하여 급성 독성 시험을 한 결과, 트레할로오스는 저독성의 물질이고, 투여 가능한 최대 투여량에 있어서도 사망예는 확인되지 않았다. 따라서, 정확한 값이라고는 할 수 없으나 트레할로오스 제품의 LD50값은 50g/kg 이상이었다.
본 발명의 말토오스-트레할로오스 전환 효소로 제조된 트레할로오스와 이것을 함유하는 당질 조성물 및 그 제조 방법에 대해서는 실시예 A 에서 설명하고, 트레할로오스를 함유하거나 이것을 함유하는 당질 조성물을 함유해서 된 본 발명의 조성물에 대해서는 실시예 B 에서 설명한다.
[실시예 A-1]
실험 1 의 방법에 따라 피멜로박터 sp. R48 (FERM BP-4315) 미생물 종배양액을 글루코오스 농도를 4.0w/v% 로 조정한 외에는 실험1에서 사용된 것과 동일한 배지에서 퍼어멘터 (fermenter) 중에서 통기 교반 조건하에 약 60시간 배양하였다. 수득한 배양액중의 본 발명의 말토오스-트레할로오스 전환 효소의 활성은 0.75단위/㎖ 이었다. 이 배양액 일부를 원심 분리하여 균체와 배양 상청액을 얻은 다음 이들의 효소 활성을 측정하였다. 그 결과, 균체에서는 효소 활성이 약 65% 나타났고 배양 상청액에서는 효소 활성이 약 35% 나타났다. 균체를 함유한 배양액 약 35ℓ를 초고압 균체 파쇄기인 "MINI-RABO" (일본국의 大日本 제약 주식회사제)로 처리하여 균체를 파쇄하였다. 수득한 균체 현탁액을 원심 분리하여 상청액을 얻어 이것을 UF 멤브레인으로 여과한 다음 본 발명의 말토오스-트레할로오스 전환 효소를 약 15단위/㎖ 함유하는 농축액 약 1.2ℓ를 회수하였다.
감자 전분의 10w/v% 현탁액 (pH 5.5)에 α-아밀라아제인 "SPITASE HS" (일본국의 Nagase Biochemicals 사제)를 건조 고형분 기준으로 전분 1g당 2단위 가하고 이 혼합액을 교반 가열하면서 호화 및 액화한 즉시 120℃에서 20분간 유지한 후 50℃, pH 5.0으로 조정하였다. 이렇게 하여 얻은 혼합물을 전분 1g 당 β-아밀라아제 (일본국의 Nagase Biochemicals 사제) 20단위 및 이소아밀라아제 (일본국의 林原 Biochemical Laboratories 사제) 500단위와 혼합한 다음 24시간 효소 반응시켜 말토오스를 약 92w/v%함유하는 당용액을 얻었다. 이 반응 혼합물을 100℃에서 20분 가열한 다음 10℃로 가열해서 pH 7.0 으로 조정하여 건조 물질 1g 당 위에서 제조한 말토오스-트레할로오스 전환 효소를 1단위 가하고 96시간 효소 반응시켰다.
이 반응 혼합물을 95℃에서 10분 유지한 후 냉각하고 통상의 방법으로 활성탄으로 탈색, 여과하였다. 여액을 H형 및 OH형 이온 교환 수지로 탈염하여 정제한 후 농축하여 농도가 약 70w/v%인 시럽을 약 95%의 수율로 얻었다.
이 제품은 건조 고형분 기준으로 트레할로오스를 약 69% 함유하며 DE 18.2의 낮은 환원력을 가진 것으로서 온화한 감미와 적당한 점도 및 보습성을 가지고 있기 때문에 감미료, 맛부여제, 안정제, 희석제, 부형제 및 충전제 등으로서 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 적절히 사용된다.
[실시예 A-2]
말토오스-트레할로오스 전환의 효소 반응이 정지된 반응 혼합물을 실시예 A-1의 방법으로 제조하여 글루코아밀라아제인 "GLUCOZYME" (일본국의 Nagase Biochemicals 사제) 10단위/g 과 혼합하고 pH 5.0, 50℃에서 24시간 효소 반응시켰다. 수득한 반응 혼합물을 가열하여 잔존 효소를 실활하고 탈색, 탈염 및 정제하여당용액을 얻어 이것을 공급액으로 사용하였다. 이 당용액을 "XT-1016 (Na+ 형, 중합도 4%)" (일본국의 Tokyo Organic Chemical 사제)을 사용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피 처리하였다. 수지를 직렬로 연결된 4자켓부 스테인레스강제 칼럼 (직경 5.4cm)에 충전하여 총 겔층 깊이를 20m되게 하였다.
칼럼 내부 온도를 60℃로 유지하면서 당용액을 칼럼에 5v/v% 의 양으로 공급하고, 칼럼에 60℃의 온수를 SV (공간 속도) 0.15로 공급하여 분획함으로써 글루코오스를 제거한 다음 트레할로오스 고함유 획분을 회수하였다. 이들 획분을 모아 정제, 농축, 감압 건조 및 분쇄하여 트레할로오스 고함유 분말을 건조 고형물 기준으로 약 55%의 수율로 얻었다.
이 제품은 건조 고형분 기준으로 트레할로오스를 약 97% 함유하며 양호한 저환원력과 온화한 고품질의 감미를 가진 것으로서 감미료, 맛부여제, 품질 개선제, 안정제, 희석제, 부형제 및 충전제로서 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 사용할 수 있다.
[실시예 A-3]
실시예 A-2의 방법으로 제조한 트레할로오스 고함유 획분을 통상의 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고 이온 교환 수지로 탈염하여 정제하였다. 여액을 농도 약 70w/v% 되게 농축한 후 결정화기에 넣고 종정으로서 트레할로오스 함수 결정 약 2%를 가한 다음 서냉하여 결정화율 약 45%의 매스키트를 얻었다. 이 매스키트를 건조탑 위의 노즐로부터 150㎏/㎠ 의 고압으로 분무하였다.
분무 단계에서 85℃의 열풍을 건조탑의 상부에서 동시에 매스키트에다 송풍하고, 저부에 설치된 이송금망 컨베이어 위에 결정 분말을 포집하여 컨베이어 밑으로부터 45℃의 온풍을 보내면서 이 분말을 건조탑 밖으로 서서히 이동시켜 배출하였다. 이 결정 분말을 숙성탑에 충전하여 온풍을 보내면서 10시간 숙성시켜 결정화와 건조를 완료함으로써 트레할로오스 함수 결정 분말을 원료인 트레할로오스 고함유 당액에 대하여 건조 고형물당 약 90%의 수율로 얻었다.
이 제품은 실질적으로 흡습성을 나타내지 않아 취급이 용이하므로 감미료, 맛 개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
[실시예 A-4]
실시예 A-2의 방법으로 제조한 트레할로오스 고함유 획분을 실시예 A-3과 마찬가지로 정제한 다음 증발가마에 넣고 감압하에 끓여 수분 약 3.0%의 시럽으로 하였다. 이어서, 이 시럽을 결정화기에 옮겨 여기에 종정으로 무수 결정 트레할로오스를 시럽 고형물당 1% 가하고 120℃에서 교반하여 결정화한 다음 알루미늄제 용기에 넣고 100℃에서 6시간 숙성시켜 블록을 제조하였다.
이어서, 이 블록을 절삭기에서 분쇄하고 유동 건조하여 수분 약 0.3%의 무수 결정 트레할로오스 분말을 원료인 트레할로오스 고함유 당액에 대하여 건조 고형물당 약 85%의 수율로 얻었다.
이 제품은 식품, 화장품, 의약품, 그 원재료 또는 가공 중간물 등의 함수물의 탈수제로서 뿐만아니라 상품의 감미를 가진 백색 분말 감미료로서도 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
[실시예 A-5]
실험1의 방법에 준하여 피멜로박터 sp. R48 (FERM BP-4315)의 종배양액을 접종하고 영양배지에서 배양한 다음, 배양액을 원심 분리하여 본 발명의 효소 약 800단위의 활성을 가진 습윤 균체 100g을 얻어, 이것을 알긴산 나트륨 (점도 300∼400 cp, 일본국 和光純藥 주식회사 판매) 2.5%을 미리 10mM 인산 완충액에 용해하여둔 10mM 인산 완충액 100㎖ 와 혼합하였다.
균체를 함유한 슬러리를 용액 표면위의 약 20cm되는 높이에서 자석 교반기로 교반중인 0.1M 염화 칼슘 용액중에 계속하여 방울씩 떨어뜨려 직경이 약 2mm인 구형(球形)의 겔을 만들었다. 이들 겔을 주위 온도에서 약 2시간 동안 용액중에 방치한 후 흡인 여과기로 여과한 다음 알긴산염으로 고정화된 균체를 회수하였다. 수득한 고정화된 균체를 직경 30mm, 길이 200mm의 자켓부 유리 칼럼속에 채우고 이 칼럼을 20℃로 가열하여 유지하였다. 이 칼럼에 40% 말토오스 용액 (pH 6.8)을 SV 0.2로 공급하여 아래로 흘러내려 트레할로오스를 건조 고형분 기준으로 약 70% 함유하는 당용액을 얻었다. 이 당용액을 정제하고 농축하여 농도가 약 70%인 시럽을 약 95%의 수율로 얻었다. 이 제품은 환원력이 비교적 낮고 온화한 감미와 적당한 보습성을 가지고 있기 때문에 실시예 A-1의 제품과 마찬가지로 각종 조성물에 사용할 수 있다.
[실시예 A-6]
33% 옥수수 전분 현탁액에 최종 농도 0.1%가 되도록 탄산 칼슘을 가한 후 pH 6.5로 조정하고, 여기에 α-아밀라아제 (덴마크국의 Novo 사 제조, 상품명 "TERMAMYL 60L")를 전분 1g당 0.2단위가 되도록 가하고 95℃에서 15분간 효소 반응시켰다. 이 반응액을 120℃에서 30분간 오토클레이브 처리를 한 후 55℃로 냉각하고, 여기에 이소아밀라아제 (일본국의 주식회사 林原 생물화학연구소 제조)를 전분 1g당 500단위와 β-아밀라아제 (일본국의 Nagase Biochemicals 사 판매)를 전분 1g당 30단위 되도록 가하고 48시간 효소 반응시킴으로써 말토오스 함량이 약 84%인 당용액을 회수하였다. 이 당용액을 100℃에서 10분간 유지한 후 15℃로 냉각하고, 여기에 실시예 A-1의 방법으로 제조한 본 발명의 말토오스-트레할로오스 전환 효소를 건조 고형분 기준으로 전분 1g당 1.5단위를 가하고 72시간 효소 반응시켰다. 수득한 반응 혼합물을 100℃에서 15분간 가열하여 잔존 효소를 실활한 다음 통상의 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고 H형 및 OH형 이온 교환 수지로 탈염하여 정제한 후 더욱 농축하여 농도 약 70%의 시럽을 건조 고형물당 약 95%의 수율로 얻었다.
이 제품은 건조 고형물당 트레할로오스를 64%함유하고 있으며, 온화하고 상품의 감미, 낮은 환원성, 적당한 보습성을 가지므로 실시예 A-1의 제품과 마찬가지로 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
[실시예 A-7]
실시예 A-5의 방법으로 제조한 시럽을 농축하여 약 82% 시럽으로 한 다음 결정화기에 넣고 종정 약 1%와 혼합하여 평평한 용기에 옮겨 20℃에서 4일동안 방치하여 결정화하였다. 수득한 결정을 커터로 분쇄하고 건조하여 매스키트형 트레할로오스 함수 결정 분말을 건조 고형분 기준으로 약 95%의 수율로 얻었다.
이 제품은 실질적으로 흡습성이 없고 취급이 용이하므로 실시예 A-1의 제품에서와 마찬가지로 각종 조성물에 사용할 수 있다.
[실시예 A-8]
실시예 A-6의 방법으로 제조한 시럽을 농축하여 약 80%의 시럽으로 한 다음 결정화기에 넣고 트레할로오스 함수 결정 약 1%를 종정으로 하여 혼합한 후 교반하면서 냉각하여 결정화하였다. 수득한 결정액을 바스켓형 원심분리기에서 원심 분리하여 결정을 얻어 이것을 소량의 냉수와 더불어 분무함으로써 고순도 트레할로오스 함수 결정을 건조 고형분 기준으로 약 20%의 수율로 얻었다.
이 제품은 실험23에서와 동일한 물리화학적 성질을 나타내는 것으로서 감미료, 맛 개선제, 품질 개선제, 안정제, 공업용 시약 및 화공 약품 등으로서 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 사용할 수 있다.
[실시예 A-9]
슈우도모나스 푸티다 H262 (FERM BP-4579)의 종배양액을 영양배지에 접종하고 실험9의 방법에 따라 통기 교반하에 약 20시간 퍼어멘터에서 발효시켰다.
수득한 배양액 약 18ℓ를 원심 분리하여 습윤 균체 약 0.4㎏ 을 얻어 이것을 10mM 인산 완충액 4ℓ 중에 현탁시켜 초음파 파쇄기 "MODEL US300" (일본국의 Nippon Seiki 사제)에서 처리하여 균체를 파쇄하였다. 수득한 혼합물을 원심 분리하여 상청액을 얻은 다음 UF멤브레인으로 농축함으로써 말토오스-트레할로오스 전환 효소 3.8단위/㎖ 을 함유한 농축 효소액을 약 400㎖ 회수하였다. 10% 감자 현탁액 (pH 5.5)에다 아밀라아제 (일본국의 Nagase Biochemicals사 판매의 "SPITASE HS")를 건조 고형분 기준으로 전분 1g당 2단위 가하여 혼합하고 교반하면서 가열하여 호화 및 액화한 다음 120℃에서 20분간 오토클레이브 처리한 후 50℃로 냉각하고 pH 5.5로 조정하였다. 수득한 혼합물에다 풀룰라나아제 (일본국의 林原 Biochemical Laboratories 사 판매)를 건조 고형분 기준으로 전분 1g당 500단위와 β-아밀라아제 (일본국의 Nagase Biochemicals사 판매)를 건조 고형분 기준으로 전분 1g 당 20단위를 가하고 24시간 효소 반응시킨 다음 말토오스를 약 92% 함유하는 당용액을 회수하였다. 이 당용액을 100℃에서 20분간 가열하고 40℃ 및 pH 7.0으로 조정한 후 위에서 제조한 말토오스-트레할로오스 전환 효소 1.5단위/g 과 혼합하여 72시간 효소 반응시켰다.
이 반응 혼합물을 95℃에서 10분간 가열하고 냉각한 후 통상의 방법으로 활성탄으로 탈색, 여과한 다음 H형 및 OH형 이온 교환 수지로 탈염 및 정제하고 농축하여 농도 약 70w/v%의 시럽을 약 97%의 수율로 얻었다.
이 제품중의 트레할로오스 함량은 약 65%이고 환원력은 DE 16.2로서 비교적 낮으며 온화한 감미와 적당한 점도 및 보습성을 가지고 있어서 감미제, 맛 개선제, 안정제, 충전제, 희석제, 부형제 등으로서 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 사용할 수 있다.
[실시예 A-10]
실시예 A-9의 방법으로 제조한 말토오스-트레할로오스 전환 효소의 반응후 혼합물을 95℃에서 10분간 가열하여 잔존 효소를 실활시키고 pH 5.0 및 55℃로 조정한 후 글루코아밀라아제 (일본국의 Nagase Biochemcials 사 판매의 "GLUCOZYME")를 전분 1g당 10단위와 혼합하고 24시간 효소 반응시켰다. 이 반응 혼합물을 통상의 방법으로 가열하여 잔존 효소를 실활시키고 탈색, 탈염, 정제 및 농축하여 55% 당용액을 얻었다. 수득한 당용액을 실시예 A-2와 마찬가지로 알칼리 토금속 강산성 양이온 교환 수지인 "Dowex 99" (Ca++형, 중합도 6%) (미합중국의 Dow Chemicals 사 판매)을 사용한 칼럼 크로마토그래피처리를 한 다음 트레할로오스 고함유 획분을 회수하였다. 이들 획분을 모아 정제하고, 농축하면서 계속해서 결정화하여 매스키트를 얻었다. 이 매스키트를 배스킷형 원심 분리기로 분리한 다음 소량의 물과 더불어 결정을 분무하여 고순도 트레할로오스 함수 결정을 약 25%의 수율로 얻었다.
이 제품은 실험23의 제품과 동일한 물리화학적 성질을 나타내며, 실시예 A-8의 제품과 마찬가지로 음식물, 화장품 및 의약품 등의 각종 조성물과 공업용 시약 및 화공 약품에 유리하게 사용할 수 있다.
[실시예 A-11]
실험9의 방법과 마찬가지로 하여 슈우도모나스 푸티다 H262 (FERM BP-4579)의 종배양액을 영양배지에서 배양한 다음, 배양액을 원심 분리하여 말토오스-트레할로오스 전환 효소 활성이 약 400단위인 습윤 균체 100g을 얻어, 이것을 알긴산 나트륨 (점도 300∼400cp) 2.5%을 미리 용해하여둔 10mM 인산 완충액 100㎖와 혼합하였다. 균체를 함유한 슬러리를 용액 표면위의 약 20cm되는 높이에서 자석 교반기로 교반중인 0.1M 염화 칼슘 용액중에 계속하여 방울씩 떨어뜨려 직경이 약 2mm인 구형(球形)의 겔을 만들었다. 이들 겔을 주위 온도에서 약 2시간 동안 CaCl2용액중에 유지한 후 흡인 여과기로 여과하여 알긴산염으로 고정화된 균체를 회수하였다. 수득한 고정화된 균체를 직경 30mm, 길이 200mm 의 자켓부 유리 칼럼속에 채우고 이 칼럼을 35℃로 가열하여 유지하였다. 이 칼럼에 40% 말토오스 용액 (pH 6.8)을 SV 0.1로 공급하여 아래로 흘러내려 트레할로오스를 건조 고형분 기준으로 약 67% 함유하는 트레할로오스 용액을 얻었다. 이 트레할로오스 용액을 실시예 A-9의 방법에 따라 정제, 농축, 결정화한 후 분무 건조하여 매스키트형 트레할로오스 함수 결정 분말을 약 90%의 수율로 얻었다.
이 제품은 환원력이 비교적 낮고 온화한 감미와 적당한 보습성을 가지고 있기 때문에 실시예 A-9의 제품과 마찬가지로 각종 조성물에 사용할 수 있다.
[실시예 A-12]
테르무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923)의 종배양액을 영양 배지에 접종하고 실험15의 방법에 따라 통기 교반하에 약 20시간 배양하였다. 이 배양액은 말토오스-트레할로오스 전환 효소 약 0.32단위/㎖의 활성을 가지고 있었다.
수득한 배양액 약 18ℓ를 원심 분리하여 습윤 균체 약 0.18㎏을 얻어 이것을 10mM 인산 완충액 (pH 7.0)중에 현탁시키고, 이 균체 현탁액 약 1.5ℓ를 초음파 파쇄기에서 처리하여 균체를 파쇄하였다. 수득한 균체 파쇄물을 원심 분리하여 상청액을 얻은 다음 UF멤브레인으로 농축함으로써 말토오스-트레할로오스 전환 효소 10단위/㎖의 활성을 가진 농축 효소액을 약 500㎖ 회수하였다. 15% 옥수수 전분 현탁액 (pH 5.5)에다 α-아밀라아제 (일본국의 Nagase Biochmicals사 판매의 "SPITASE HS")를 건조 고형분 기준으로 전분 1g당 2단위 가하여 혼합하고 교반하면서 가열하여 호화 및 액화한 즉시 120℃에서 20분간 오토클레이브 처리한 후 55℃로 냉각하고 pH 5.0으로 조정하였다. 수득한 혼합물에다 이소아밀라아제 (일본국의 林原 Biochemical Laboratories사 판매)를 전분 1g당 300단위와 β-아밀라아제 (일본국의 Nagase Biochmicals사 판매)를 전분 1g당 20단위를 가하고 24시간 효소 반응시켜 말토오스를 약 92% 함유하는 당용액을 회수하였다. 이 당용액을 100℃에서 20분간 가열하고 50℃ 및 pH 7.0으로 조정한 후 위에서 제조한 말토오스-트레할로오스 전환 효소 1.5단위/g 건조 중량과 혼합하여 72시간 효소 반응시켰다. 이어서, 이 반응 혼합물을 95℃에서 10분간 가열하고 냉각한 후 통상의 방법으로 활성탄으로 탈색, 여과한 다음 H형 및 OH형 이온 교환 수지로 탈염 및 정제하고 농축하여 농도 약 70%의 시럽을 건조 고형분 기준으로 약 95%의 수율로 얻었다.
이 제품중의 트레할로오스 함량은 건조 고형분 기준으로 약 64%로서 환원력을 DE 18.0로서 낮으며 온화한 감미와 적당한 점도 및 만족스러운 보습성을 가지고 있어서 감미제, 맛 개선제, 안정제, 충전제, 희석제, 부형제 등으로서 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 사용할 수 있다.
[실시예 A-13]
실시예 A-12의 방법으로 제조한 시럽을 농축하여 약 80% 농도의 시럽을 얻은 다음 이것을 결정화기에 넣고 실시예 A-8에서와 마찬가지로 결정화하고 분리하여 고순도 트레할로오스 함수 결정을 약 20%의 수율로 얻었다.
이 제품은 실험23의 제품과 동일한 물리화학적 성질을 나타내며, 실시예 A-8의 제품과 마찬가지로 공업용 시약, 공업 원료, 화공 원료 등으로서 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 사용할 수 있다.
[실시예 A-14]
테르무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923)의 종배양액을 영양 배지에 접종하여 실험15의 방법과 마찬가지로 배양한 다음 배양액을 원심 분리하여 말토오스-트레할로오스 전환 효소 활성이 약 1500단위인 습윤 균체 50g을 얻었다.
이 균체를 점도가 300∼400 cp 인 2.5% 알긴산 나트륨 (일본국의 和光純藥 주식회사 판매) 100㎖ 중에 현탁하였다. 수득한 슬러리를 자석 교반기로 교반중인 0.1M 염화 칼슘 용액중으로 용액 표면위의 약 20cm 되는 높이에서 방울씩 계속해서 적하하여 직경이 약 2mm되는 구형(球形)의 겔을 생성시켰다. 이 겔을 용액중에서 주위온도에서 약 2시간 방치한 후 흡인 여과기로 여과하여 알긴산염으로 고정된 균체를 얻었다. 고정화된 균체를 직경 30mm, 길이 200mm되는 자켓부 유리 칼럼에 충전하고 60℃로 가열하였다. 이 칼럼에 40% 말토오스 용액 (pH 6.5)을 SV 0.2로 가하여 흘러내려 약 66% 트레할로오스 용액을 얻어 이것을 통상의 방법으로 정제, 농축 및 분무 건조하여 트레할로오스 분말을 약 90%의 수율로 얻었다.
이 분말은 환원력이 비교적 낮고 감미가 온화하여 실시예 A-12의 제품과 마찬가지로 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 사용할 수 있다.
[실시예 B-1 : 감미료]
실시예 A-8의 방법으로 제조한 트레할로오스 함수 결정 분말 1중량부에 α-글리코실 스테비오시드 (일본국의 東洋精糖 (주) 판매, 상품명 "αG Sweet") 0.01 중량부와 L-아스파르틸-L-페닐알라닌 메틸 에스테르 [일본국의 Ajinomoto (주) 판매, 상품명 "ASPARTAME") 0.01 중량부를 균일히 혼합하여 과립 성형기에서 과립상 감미료를 제조하였다. 이 제품은 감미의 질이 우수하여 수크로오스의 약 2.5배의 감미도를 가지며 감미도당 칼로리는 수크로오스의 약 2/5로 저하되어 있다.
이 감미료는 여기에 배합된 고감미도 감미물의 분해도 없고 안정성이 우수하여 저칼로리 감미료로서 칼로리 섭취를 제한하고 있는 비만자, 당뇨병자 등을 위한 저칼로리 음식물 등에 대한 감미 부여에 적당하다.
또한, 이 감미료는 충치 유발균에의한 산의 생성이 작고 불용성 글루칸의 생성도 적으므로 충치를 억제하는 음식물 등에 대한 감미 부여에도 적당하다.
[실시예 B-2 : 하아드 캔디]
농도 55% 수크로오스 용액 100중량부에 실시예 A-1의 방법으로 제조한 트레할로오스 함유 시럽 30중량부를 가열 혼합한 다음 감압하에 수분 2% 이하가 될 때까지 가열 농축하고, 여기에 시트르산 1중량부와 레몬향료 적당량과 착색료를 혼화하여 통상의 방법에 따라 성형하여 표제의 제품을 얻었다.
이 제품은 깨물기와 맛이 양호하고 수크로오스의 결정화도 일으키지 않는 고품질의 하아드 캔디이다.
[실시예 B-3 : 츄잉 검]
검 베이스 3중량부를 유연하게 될 정도로 가열 용융하고, 여기에 결정질 말티톨 3중량부와 실시예 A-3의 방법으로 제조한 트레할로오스 함수 결정 분말 4중량부를 가하고, 적당량의 향료와 착색료를 혼합한 후 통상의 방법에 따라 로울에서 반죽하여 성형, 포장함으로써 제품을 얻었다.
이 제품은 텍스쳐와 풍미가 모두 양호한 츄잉 검이고, 충치 유발성이 비교적 적거나 전혀 없는 츄잉 검으로 적절히 사용된다.
[실시예 B-4 : 분말 주우스]
분무 건조에 의해 제조한 오렌지 과즙 분말 33중량부에 대하여 실시예 A-7의 방법으로 제조한 매스키트형 트레할로오스 고함유 분말 50중량부, 수크로오스 10중량부, 무수 시트르산 0.65중량부, 말산 0.1중량부, L-아스코르브산 0.1중량부, 시트르산 나트륨 0.1중량부, 풀룰란 0.5중량부 및 분말 향료 적당량을 잘 혼합, 교반하고 분쇄하여 미분말로 한 후, 이것을 유동층 조립기(造粒機)에서 배풍 온도 40℃ 및 유속 150㎥ 로 하여 여기에 실시예 A-6의 방법으로 제조한 트레할로오스 함유 시럽을 바인더로 하여 분무해서 30분간 조립(造粒)하고 계량, 포장해서 제품을 얻었다.
이 제품은 과즙 함유율이 약 30%인 분말 쥬우스이고 만족하지 못한 맛과 냄새가 없으며 장기간 안정하였다.
[실시예 B-5 : 유산균 음료]
탈지 분유 175중량부, 실시예 A-9의 방법으로 제조한 트레할로오스 함유 시럽 130중량부 및 일본국 특허 공개 제 281,795/92호 공보에 개시되어 있는 락토수크로오스 고함유 분말 50중량부를 물 1,150중량부에 용해하고, 65℃에서 30분간 살균하여 40℃로 냉각한 후 여기에 통상의 방법에 따라 유산균의 스타아터 (starter)를 30중량부 식균(植菌)하고 37℃에서 8시간 배양하여 유산균 음료를 제조하였다.
이 제품은 풍미가 양호한 유산규 음료이고, 또한 이 제품은 올리고당을 함유하여 유산균을 안정하게 유지할 뿐만 아니라 비피도스균 증식 촉진 작용을 가지고 있다.
[실시예 B-6 : 커스타드 크리임]
옥수수 전분 100중량부, 실시예 A-6의 방법으로 제조한 트레할로오스 함유 시럽 100중량부, 말토오스 80중량부, 수크로오스 20중량부 및 식염 1중량부를 충분히 혼합하고 계란 280중량부를 가하여 교반하였다. 여기에 끓인 우유 1000중량부를 서서히 가한 후 교반하면서 계속 가열하여 옥수수 전분이 완전히 호화하여 전체가 반투명하게 되었을 때 가열을 중지하고 냉각하여 적당량의 바닐라 향료를 가하고 계량, 충전, 포장하여 제품을 얻었다.
이 제품은 평활한 표면과 광택을 가지며 온화한 감미를 가지고 있다.
[실시예 B-7 : 우이로-노-모토 (단맛의 쌀 젤리 프리믹스)]
쌀가루 90중량부에 옥수수 전분 20중량부, 수크로오스 40중량부, 실시예 A-11의 방법으로 제조한 매스키트형 트레할로오스 함수 결정 분말 80중량부 및 풀룰란 4중량부를 균일히 혼합하여 우이로-노-모토를 제조하였다. 이것을 적당량의 분말차 및 물과 혼련하고 용기에 넣어 60분간 증기찜하여 우이로를 제조하였다.
이 제품은 광택과 깨물기가 양호하고 풍미도 양호하다. 또한, 전분의 노화도 억제되어 비교적 장기간 보존할 수 있다.
[실시예 B-8 : 분말 펩티드]
40% 식품용 대두 펩티드 용액 (일본국의 不二製油 (주) 제조, 상품명 " Hinute S") 1중량부에 실시예 A-10의 방법으로 제조한 트레할로오스 함수 결정 분말 2중량부를 혼합하고 플라스틱제 용기에 넣어 50℃에서 감압 건조하고 분쇄하여 분말 펩티드를 제조하였다.
이 제품은 풍미가 양호하여 프리믹스, 냉과 등의 제과용 재료로서 뿐만아니라 경구 유동식, 경관 유동식 등의 이유식, 치료용 영양제 등으로서도 유리하게 이용할 수 있다.
[실시예 B-9 : 분말 된장]
적색 된장 1중량부에 실시예 A-4의 방법으로 제조한 결정성 무수 트레할로오스 분말 3중량부를 혼합하고 다수의 반구상 凹부를 가진 금속판에 부어 넣어 이것을 실온하에서 하룻밤 정치하여 고화한 후 이형하여 1개당 약 4g되는 고형 된장을 얻어 이것을 분쇄기에서 분쇄하여 분말 된장을 얻었다.
이 제품은 즉석 라면, 즉석 수우프 등의 조미료로서 유리하게 이용할 수 있다. 또한, 고형 된장은 고형 조미료로서 뿐만아니라 된장 과자 등으로서도 이용할 수 있다.
[실시예 B-10 : 분말 난황]
생란(生卵)으로부터 제조한 난황을 플레이트 히이터식 가열 살균기에서 60∼64℃에서 살균하여 얻은 액상 난황 1중량부에 대하여 실시예 A-4의 방법으로 제조한 무수 결정 트레할로오스 분말 4중량부의 비율로 혼합한 후 용기에 옮겨 하룻밤 방치하여 트레할로오스 함수 결정으로 변환시켜 블록을 제조하였다. 이 블록을 절삭기에서 분말화하여 분말 난황을 얻었다.
이 제품은 프리믹스, 냉과, 유화제 등의 제과용 재료로서 뿐만아니라 경구 유동식, 경관 유동식 등의 이유식, 치료용 영양제 등으로서도 유리하게 이용할 수 있으며, 또한 피부 정화제, 육모제 등으로서도 유리하게 이용할 수 있다.
[실시예 B-11 : 안 (An : 팥 페이스트)]
원료인 아즈키(adzuki) 팥 10중량부에 통상의 방법에 따라 물을 가하여 끓인 다음 팥의 고유한 불만족스런 냄새와 맛을 제거하고 수용성 협잡물을 제거하여 "아즈키-쯔부-나마-안(adzuki-tsubu-nama-an)" 약 21중량부를 얻었다.
여기에 수크로오스 14중량부와 실시예 A-12의 방법으로 제조한 트레할로오스 함유 시럽 5중량부 및 물 5중량부를 가하고 끓인 다음, 여기에 소량의 샐러드 오일을 가하고 조심스럽게 반죽하여 제품인 안 (an : 팥 페이스트) 약 35중량부를 얻었다.
이 제품은 끓일 때 생기는 탈색도 없고 맛과 풍미가 양호하여 팥잼 만두, 팥빵, 빙과, 셔어벳 등의 재료로서 적당하다.
[실시예 B-12 : 빵]
밀가루 100중량부, 효모 2중량부, 설탕 5중량부, 실시예 A-14의 방법으로 제조한 트레할로오스 함유 분말 1중량부와 무기 이스트 푸우드 0.1중량부를 통상의 방법에 따라 물과 반죽하여 26℃에서 2시간 동안 발효시킨 다음 다시 30분 숙성한 후 불에 구웠다.
이 제품은 색상도 좋고 양호하게 부풀어 올라 있어 적당한 탄력, 온화한 감미를 가진 고품질의 빵이다.
[실시예 B-13 : 햄]
돼지 넓적다리 고기 1000중량부에 식염 15중량부와 질산 칼륨 3중량부를 가하고 균일히 갈아 냉장실에서 하룻밤 퇴적하여 방치한 후 물 500중량부, 식염 100중량부, 질산 칼륨 3중량부, 실시예 A-3의 방법으로 제조한 트레할로오스 함수 결정 분말 40중량부 및 페퍼민트 적당량으로 된 염지액에 냉장실에서 7일간 침지한 다음 통상의 방법에 따라 냉수로 세척하고 끈으로 말아 훈연하여 쿠킹해서 냉각 포장하여 제품을 얻었다.
이 제품은 색상, 맛, 풍미가 양호가 고품질의 햄이다.
[실시예 B-14 : 가당 연유]
원유 100중량부에 실시예 A-5의 방법으로 제조한 트레할로오스 함유 시럽 3중량부와 수크로오스 1중량부를 용해하고 플레이트 히이터에서 가열 살균한 다음 농도 70%의 시럽으로 농축하고 무균 상태에서 통조림하여 제품을 얻었다.
이 제품은 온화한 감미로서 풍미도 좋아서 유아 식품, 과실, 커피, 코코아, 홍차 등의 조미용으로 유리하게 이용할 수 있다.
[실시예 B-15 : 화장용 크리임]
폴리옥시에틸렌 글리콜 모노스테아레이트 2중량부, 자기 유화형 글리세릴 모노스테아레이트 5중량부, 실시예 A-7의 방법으로 제조한 매스키트형 트레할로오스 고함유 분말 2중량부, α-글리코실루틴 1중량부, 유동 파라핀 1중량부, 글리세릴트리-2-에틸헥사노에이트 10중량부 및 적당량의 방부제를 통상의 방법에 따라 가열 용해하였다. 여기에 L-락트산 2중량부, 1,3-부틸렌 글리콜 5중량부 및 정제수 66중량부를 가하여 오모게나이저로 유화하고, 향료를 적당량 가하여 교반 혼합하여 크리임을 제조하였다.
이 제품은 항산화성을 가지며 안정성이 높아 고품질의 햇빛 그을음 방지제, 피부 정화제, 색백제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.
[실시예 B-16 : 분말 약용 인삼 엑스]
약용 인삼 엑스 0.5중량부에 실시예 A-4의 방법으로 제조한 무수 결정 트레할로오스 분말 1.5중량부를 혼합한 후 용기에 옮겨 2일간 방치하여 트레할로오스 함수 결정으로 변환시켜 블록을 제조하였다. 이 블록을 절삭기에서 분말화하고 분급하여 분말 약용 인삼 엑스를 제조하였다. 이 제품을 적당량의 비타민 B1 및 비타민 B2와 함께 과립 성형기에서 비타민 함유 과립상 약용 인삼 엑스로 하였다.
이 제품은 피로회복제, 강장, 강정제 등으로 유리하게 이용할 수 있다.
또한, 육모제 등으로서도 이용할 수 있다.
[실시예 B-17 : 고체 제제]
인간의 천연형 인터페론-α 제품 (일본국의 (주) 林原생물화학연구소 제조, Cosmo Bio (주) 판매)을 통상의 방법에 따라 고정화 항인터페론-α 항체 칼럼에다 가하여 이 제품에 함유된 인간의 천연형 인터페론-α를 흡착시키고, 안정제인 소혈청 알부민을 함유한 완충액을 가한 다음 과잉량의 알부민을 제거한 후, 인간의 천연형 인터페론-α을 실시예 A-2의 방법으로 제조한 트레할로오스 고함유 분말을 5% 함유하는 생리 식염수를 사용하여 생리 식염수의 pH를 변화시키면서 용출하였다. 이 용출액을 정밀 여과하고 여액을 약 20배량의 무수 결정 말토오스 분말 (일본국의 (주) 林原상사 판매, 상품명 "FINETOSE")에 가하여 탈수, 분말화한 다음, 이것을 타정기에서 타정하여 1정 (약 200㎎)당 인간의 천연형 인터페론-α를 약 150단위 함유하는 정제를 제조하였다.
이 제품은 설하정 등으로 하여 하루에 성인 1∼10정 정도를 경구 투여하여 바이러스성 질환, 알레르기성 질환, 류머티즘, 당뇨병, 악성 종양 등의 치료에 유리하게 이용할 수 있다. 특히, 근년에 와서 환자수가 급증하고 있는 에이즈, 간염 등의 치료제로서 유리하게 이용할 수 있다. 이 제품은 본 발명의 트레할로오스와 말토오스가 함께 인간의 천연형 인터페론-α의 안정제로서 작용하여 실온에서 방치하더라도 그 활성을 장기간 잘 유지한다.
[실시예 B-18 : 당의정]
중량 150㎎의 소정(素錠)을 심제(core)로 하고, 여기에 실시예 A-3의 방법으로 제조한 트레할로오스 함수 결정 분말 40중량부, 풀룰란 (평균 분자량 200,000) 2중량부, 물 30중량부, 탈크 25중량부 및 산화 티탄 3중량부로된 용액을 코우팅하여 정제 중량이 약 230㎎될 때까지 당의(糖衣)한 다음 동일한 트레할로오스 함수 결정 분말 65중량부, 풀룰란 1중량부 및 물 34중량부로 된 용액을 사용하여 당의한 후 왁스액으로 광택을 나게 해서 외관이 우수한 당의정을 제조하였다.
이 제품은 내충격성도 우수하며 고품질을 장기간 유지한다.
[실시예 B-19 : 치약]
아래의 재료를 통상의 방법에 따라 혼합하여 치약을 제조하였다.
제 2 인산 칼슘 45.0%
풀룰란 2.95%
라우릴 황산 나트륨 1.5%
글리세린 20.0%
폴리옥시에틸렌 소르비탄 라우레이트 0.5%
방부제 0.05%
실시예 A-14의 방법으로 제조한
트레할로오스 함수 결정 분말 12.0 %
말티톨 5.0%
물 13.0%
이 제품은 적당한 감미를 가지고 있어 특히 어린이용 치약으로 적당하다.
[실시예 B-20 : 유동식용 고체 제제]
실시예 A-8의 방법으로 제조한 트레할로오스 함수 결정 분말 500중량부, 분말 난황 270중량부, 탈지 분유 209중량부, 염화 나트륨 4.4중량부, 염화 칼륨 1.8중량부, 황산 마그네슘 4중량부, 티아민 0.01중량부, 아스코르브산 나트륨 0.1중량부, 비타민 E아세테이트 0.6중량부 및 니코틴산 아미드 0.04중량부로 된 조성물을 제조하고, 이 조성물 25g씩을 방습성 라미네이트 소형봉지에 충전하고 히이트 시일하여 제품을 얻었다.
이 제품은 봉지 하나를 약 150∼300㎖의 물에 용해하여 유동식으로 해서 경구적 또는 비강(鼻腔), 위, 장 등에 경관적 사용 방법에 따라 이용되며 생체에의 에너지 보급용으로 유리하게 이용할 수 있다.
[실시예 B-21 : 수액제(輸液劑)]
실시예 A-10의 방법으로 제조한 고순도 트레할로오스 함수 결정을 물에 농도 약 10w/v%되게 용해한 다음 통상의 방법에 따라 정밀 여과하여 파이로젠 (pyrogen)을 제거한 후 플라스틱제 병에 무균적으로 충전하여 마개로 밀봉함으로써 제품을 얻었다.
이 제품은 방치하여도 변화가 없는 안정한 수액제로서 정맥내, 복강내 등에 투여하는데 적합하다. 이 제품은 농도 10w/v%에서 혈액과 등장(等張) 이어서 글루코오스의 경우의 2배 농도에서 에너지를 보급할 수 있다.
[실시예 B-22 : 수액제]
실시예 A-13의 방법으로 제조한 고순도 트레할로오스 함수 결정과 아래의 조성의 아미노산 조성물이 각각 5w/v% 및 30w/v% 되도록 물에 혼합 용해한 다음 실시예 B-10과 마찬가지로 정제하여 파이로젠이 제거된 용액을 얻고, 이것을 플라스틱제 병에 충전하고 마개로 밀봉하여 제품을 얻었다.
이 제품은 트레할로오스와 아미노산의 복합 수액제임에도 불구하고 트레할로오스가 환원성을 나타내지 않으므로 방치하여도 변화하지 않는 안정한 수액제이어서 정맥내, 복강내 등에 투여하는데 적당하다. 이 제품은 생체에의 에너지 보급 뿐만아니라 아미노산 보급을 하기 위해서도 유리하게 이용할 수 있다.
[실시예 B-23 : 외상 치료용 연고]
실시예 A-2의 방법으로 제조한 트레할로오스 고함유 분말 200중량부와 말토오스 300중량부에 요오드 3중량부를 용해한 메탄올 50중량부를 가하여 혼합하고, 여기에 10w/v% 풀룰란 수용액 200중량부를 가하여 혼합해서 적당한 확포성과 부착성을 가진 외상 치료용 연고를 제조하였다.
이 제품은 요오드에 의한 살균 작용 뿐만아니라 트레할로오스에 의한 세포에의 에너지 보급제로서도 작용하기 때문에 치유 기간이 단축되고 상처난 곳도 깨끗이 아문다.
이상에서 명백한 바와 같이 본 발명의 신규 말토오스-트레할로오스 전환 효소는 말토오스를 트레할로오스로 고수율로 전환시킨다. 이 트레할로오스의 분리, 본 발명의 효소 반응에 의해 생성된 트레할로오스 및 이것을 함유한 당질 조성물은 안정성이 우수하고 양질의 고품위 감미를 가지고 있다. 그리고, 이들은 경구 섭취에 의하여 소화 흡수되어 칼로리원으로 된다. 트레할로오스 및 이것을 함유한 당질 조성물은 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 안정제, 부형제, 희석제 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등 각종 조성물의 제조에 유리하게 이용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 확립은 값싸고 무한한 천연자원인 전분에서 유래하는 말토오스로부터, 트레할로오스의 신규 제조 방법 및 이 트레할로오스를 함유한 당질 조성물을 공업적으로 대량으로 값싸게 공급할 수 있는 아주 새로운 길을 개척하게 되어, 이것이 미치는 영향의 크기는 전분 과학, 효소 과학, 생화학 등의 학문분야에는 말할 것도 없고, 산업계 특히 식품, 화장품, 의약품 분야는 물론이고 농수축산업, 화학 공업에도 미쳐 이들 산업계에 미치는 공업적 의의는 헤아릴 수 없다 하겠다.

Claims (18)

  1. 아래의 (가)의 물리화학적 성질 및 아래의 (나)의 부분 아미노산 서열을 가지며, 말토오스를 트레할로오스로, 그리고 트레할로오스를 말토오스로 전환시키는 효소.
    (가) 물리화학적 성질 :
    (1) 분자량 :
    소디움 도데실술페이드 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법 (SDS-PAGE)에서 57,000∼120,000 돌턴 ;
    (2) 등전점 (pI)
    양쪽성 전해질을 사용하는 등전점 전기영동법에서 3.8∼5.1 ;
    (3) 활성억제
    1mM Cu++, Hg++또는 50mM Tris-HCl 완충액에 의하여 억제됨.
    (나) 부분 아미노산 서열 :
    아래와 같이 된 군으로부터 선택되는 부분 아미노산 서열
    (1) Trp-X1-Arg-X2-Ala-X3-Phe
    (위에서 "X1" 은 "Phe" 또는 "Pro"를 뜻하고, "X2" 는 "Thr" 또는 "Pro"를 뜻하며, "X3" 는 "Val" 또는 "Ala"를 뜻함)
    (2) Ala-Val-X4-Tyr
    (위에서 "X4" 는 "Phe" 또는 "Ile"를 뜻함)
  2. 제1항에 있어서, 미생물 유래의 것인 효소.
  3. 제2항에 있어서, 상기 미생물이 피멜로박터속, 슈우도모나속 또는 테르무스속에 속하는 것인 효소.
  4. 제2항에 있어서, 상기 미생물이 피멜로박터 sp. R48 (FERM BP-4315), 슈우도모나스 푸티다 H262 (FERM BP-4579) 또는 테르무스 아쿠아티쿠스 (ATCC 33923) 인 효소.
  5. (가) 영양 배지에서 효소 생성능이 있는 미생물을 배양하여 효소를 생성시키고, (나) 수득한 배양액으로부터 효소를 회수함을 특징으로 하는 제1항의 효소의 제조 방법.
  6. 피멜로박터 sp. R48 (FERM BP-4315)와 슈우도모나스 푸티다 H262 (FERM BP-4579)로 된 군으로부터 선택되는 제1항의 효소 생성능이 있는 미생물.
  7. 제1항의 효소를 용액중에서 말토오스에 작용시키는 단계를 포함하는 말토오스의 환원력 감소 방법.
  8. (가) 제1항의 효소를 용액중에서 말토오스에 작용시켜 트레할로오스를 생성시키고, (나) 수득한 트레할로오스 함유 당질 조성물을 회수함을 특징으로 하는 트레할로오스 함유 당질 조성물의 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 말토오스는 β-아밀라아제를 전분 지절 효소 존재하 또는 부재하에 전분물질의 용액에 작용시켜 제조되는 것인 제조 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 트레할로오스는 트레할로오스 함수 결정 또는 트레할로오스 무수 결정인 제조 방법.
  11. (가) 제1항의 효소를 용액중에서 말토오스에 작용시켜 트레할로오스를 생성시키고, (나) 수득한 용액중의 트레할로오스를 정제하여, (다) 정제된 트레할로오스를 회수함을 특징으로 하는 트레할로오스의 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 (나)단계에는 용액에 글루코아밀라아제를 작용시켜 트레할로오스의 함유량을 증가시키고, 수득한 트레할로오스 용액을 강산성 양이온 교환 수지의 칼럼을 사용하는 칼럼 크로마토그래피 처리하는 단계를 포함하는 제조 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 말토오스는 β-아밀라아제를 전분 지절 효소 존재하 또는 부재하에 전분 물질의 용액에 작용시켜 제조되는 것인 제조 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 트레할로오스는 트레할로오스 함수 결정 또는 트레할로오스 무수 결정인 제조 방법.
  15. 제8항의 제조 방법으로 제조된 당질 조성물을 식품재료에 첨가하는 단계를 포함하는 음식물의 제조 방법.
  16. 제8항의 제조 방법으로 제조된 당질 조성물을 화장품 재료에 첨가하는 단계를 포함하는 화장품의 제조 방법.
  17. 제11항의 제조 방법으로 제조된 트레할로오스를 식품재료에 첨가하는 단계를 포함하는 음식물의 제조 방법.
  18. 제11항의 제조 방법으로 제조된 트로할로오스를 화장품 재료에 첨가하는 단계를 포함하는 화장품 조성물의 제조 방법.
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