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JPS6352883A - Ｈｂｖ抗原性を示すポリペプチドをコ−ドするｄｎａ配列 - Google Patents

Ｈｂｖ抗原性を示すポリペプチドをコ−ドするｄｎａ配列

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JPS6352883A
JPS6352883A JP62112628A JP11262887A JPS6352883A JP S6352883 A JPS6352883 A JP S6352883A JP 62112628 A JP62112628 A JP 62112628A JP 11262887 A JP11262887 A JP 11262887A JP S6352883 A JPS6352883 A JP S6352883A
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hbv
gene
dna sequence
fragment
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JP62112628A
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ハインツ　エルンスト　シャラー
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Biogen NV
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の要約 組換えＤＮＡ分子およびそれによシ変異されてＨＢＶ抗
原性を示すポリペプチドとそれをコード化する遺伝子と
を生産する宿主、ならびにこれらの分子、宿主、遺伝子
およびポリペプチドの製造および使用方法が開示される
。本発明の組換えＤＮＡ分子は、ＨＢＶ抗原性を示す少
なくとも７種のポリペプチドをコード化する構造遺伝子
を特徴とする。適当な宿主において、これら組換えＤＮ
Ａ分子は、ＨＢＶ抗原性を特徴とする遺伝子およびポリ
ペプチドの生産および同定と、組成物中におけるそれら
の使用と、人間におけるＨＢＶビールス感染を検出して
この感染に対する抗体の生産を刺戟する方法とを可能に
する。
本発明は、組換えＤＮＡ分子およびその製造方法に関す
るものである。さらに詳細には、本発明は、・適当な宿
主生物において表現される組換えＤＮＡ分子に関するも
のである。本明細書中に開示する組換えＤＮＡ分子は、
肝炎Ｂビールス抗原の特異性を有するポリペプチドをコ
ード化するＤＮＡが特徴である。以下の記載から了解さ
れるように、組換えＤＮＡ分子は、人間における肝炎Ｂ
ビールスの検出およびこのビールスに対する人間におけ
る抗体の刺戟のために使用することができる。
肝炎Ｂすなわち血清肝炎を引き起こすビールスは、人間
のみに感染すると思われ、人間における肝炎Ｂビールス
（ｒＨＢＶＪ　）感染は蔓延している。英国、米国およ
び西欧において、全供血者の約０．　／　％はＨＢＶの
慢性保菌者である。
ビールス性肝炎による死亡率は高くないが（英国におい
てｌり７！年には１００万八当９３人であった）、英国
における人口のよ−および米国における人口のｌよチと
いう多くが感染していると示されている。多量のアフリ
カおよびアジア諸国においては、人口の２０％までがＨ
Ｂ　、Ｖの慢性保菌者であシ、これら諸国における全成
人の５０％以上がＨＢＶに感染したかまたは感染してい
る。
肝炎の感染は、３つの一般的機作によって伝染される。
すなわち、（り輸血におけるような多量でまたは事故に
よる皮膚刺通を介するような少量で、感染された血液も
しくは体液が非経口的に接種されることによるもの、（
２）近親または性交渉によるもの、２よび（３）妊娠中
に感染した母親が新生児にビールスを啓すことによるも
のである。自然条件下では、ＨＢＶは大して感染性の高
いものでない。呼吸による伝染は、あったとしても稀で
ある。
大抵のＨＢＶ感染は準臨床的のものである。
臨床的疾病は通常３〜６週間続き、疾病塵において軟度
乃至急性電撃肝炎次いで肝硬変ｔたは死亡までの範囲に
わたる。臨床的および準臨床的なＨＢＶ感染からの回復
は通常完全である。
しかしながら、成る場合には重度の長期結果が生ずる。
（１）急性感染の約よ裂は肝炎Ｂビールス抗原の慢性保
有者でちゃ、他人に対する感染潜在力を継続して有する
と共に肝臓損傷を進行させており、また（２）　ＨＢ　
Ｖによる過去の感染は慢性型活性肝炎、肝硬変および第
−期肝臓癌というＨＢＶ−血清陰性例の相当な割合を開
始させる完全なまたは部分的な原因となシうる。
分子生物学における最近の進歩は、特異的非細菌性成熟
核蛋白質をコード化するＤＮＡ″１Ｂ菌細胞中に導入す
ることを可能にした。一般に、化学合成によりｍ造した
もの以外のＤＮＡを用いる場合、組換えＤＮＡ分子の構
成は、所童の蛋白質に対する精製メツセンジャー（ｍＲ
ＮＡ）雛型の単一鎖ＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）を生成さ
せ、このｃＤＮＡを二重鎖ＤＮＡに変換し、このＤＮＡ
を適当なりローン用ベヒクル（ｃｌｏｎｉｎｇｖｅｈｉ
ｃｌｅ　）における適当な部位に結合させそしてその組
換えＤＮＡ分子により適当な宿主を変異させる手順から
なっている。このような変異によシ、宿主は所望の蛋白
質を生産することが可能になる。さらに、少なくともオ
バルブミンＤＮＡの場合、強力な細菌促進子または表現
調節順序に対する特定ＤＮＡの適当な融合は、よシ大量
の所望オバルブミン蛋白質、すなわち大腸菌（Ｅ、　ｃ
ｏｌｉ　）細胞の全蛋白質の約Ｏよ〜１％を生成させる
ことが知られている（オー・メルセローープイジャロン
等、「組換えプラスミドを有するイー・コリに／Ｊによ
るオバルブミン状蛋白質の合成」、ネーチャー誌第−２
７３巻第ｊＯ！〜ｒｉｏ頁（／り７Ｊ’）ならびにティ
ー・エッチ・フレーザーおよびビー・ジエー・ブルース
、「雛鳥オバルブミンはイー・コリによ勺合成かつ分泌
される」、プロシーディング・ナショナルΦアカデミ−
・サイエンス、Ｕ、Ｓ、Ａ、、第７ｊ巻、第！り３６〜
Ｊ′り≠０頁（／り７♂））。
数種の非細菌性蛋白質および遺伝子が、組換えＤＮＡ技
術を用いて合成された。これらには、ラッテのプロイン
シュリン抗原決定子を示す蛋白質（エル・グイラーコマ
ロフ等、「フロインシュリンを合成する細菌クローン」
、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエ
ンス、Ｕ、　Ｓ、　Ａ１、第７ｊ巻、第３７２７〜３７
３／頁（ｌり”））％　ラッテの成長ホルモン（ビー・
エッチ・シープルク等、「細面による成長ホルモンの合
成」、ネーチャー誌、第２７６巻、第７２ｊ〜７り２頁
（ｌり７１　）　）％ねずみのジヒドロフオレートレダ
クターゼ（ニー・シー・ワイφチャング等、「ねずみの
ジヒドロフオレートレダクターゼをコード化するＤＮＡ
順序のイー・コリにおける表現型式」、ネーチャー誌、
第２７５巻、第６７７〜６２≠頁（／り７♂））、ソマ
トスタチン（ケー・イタクラ等、「ンマトスタチンホル
モンに対する化学合成された遺伝子のイー・コリにおけ
る表現」、サイエンス誌、第１９１巻、第１ＯにＡ〜１
０６３頁（ｌり７７）、ならびに英国特許第２ｏ０７ｔ
７！Ａ号、第２．００７，１．７ＡＡ号および第二００
乙／２ＪＡ号明細書およびそれらの他国出願）、および
ひとインシュリンのＡおよびＢポリペプチド鎖（ディー
・ディー・ゲデル等、「ヒとインシュリンに対する化学
合成された遺伝子のイー・・コリにおける表現」、プロ
シーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、
Ｕ、Ｓ、Ａ、、第７を巻、第ｉｏｔ〜／１０頁（ｌり７
り）および上記英国特許明細書）が包含される。
しかしながら、本発明とは異なり、上記のものはいずれ
もたとえば肝炎Ｂビールス抗原のようなビールス性蛋白
質の組換えＤ　Ｎ　Ａ合成（で向けられていない。
ＨＢＶ感染は、ビールスの抗原に対して抗体の発生を惹
起することが知られている。これらの抗体は、ＨＢＶ感
染に対する人体の防禦メカニズムである。露呈前におけ
る或いは潜在露呈の場合における急速なこの種の抗体の
発生は、ビールス繁殖を実質的に減少させかつ撲滅する
と共に患者中に広がる。
しかしながら、肝炎Ｂビールスの抗原に対する人工的刺
戟による抗体の発生の問題は、このビールスの限られた
宿主範囲に生ずる。たとえば、人間に対し極めて感染度
が高いが、肝炎Ｂビールスによる実験的感染は、その他
二三の霊長類にしか得られなかった。また、このビール
スは組織培養においては繁殖されなかった。この限られ
た宿主範囲および組織培養細胞の感染不能は、ビールス
とその感染病理学の特性化ならびに迅速検出手段と感染
抑制および予防の効果的手段の開発を著しく妨げている
。
抗体を発生させまた感染を検知するため、ＨＢＶ感染の
犠牲者から単離された真正ＨＢＶビールス抗原を使用す
る試みが幾つかなされたが、これらの処置は活性様の供
給に限度があるため一般的に利用できない。さらに、こ
れら抗原を得るため人間を原材料として使用することは
、人間の単離物を使用する際の周知された汚染問題のた
め好ましくない。
本発明は、ＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドをコード化
する構造遺伝子を特徴とする組換えＤＮＡ分子を本発明
によシ提供して上記の諸問題を解決する。
本発明によれば、ワクチン製造のためならびにビールス
感染の検知およびその病理学と分子生物学の決定に使用
するため、ＨＢＶ抗原および遺伝子を汚染されていない
かなシの量で得ることが可能となる。このような供給物
は、このビールスの狭い宿主範囲および組織培養におけ
る繁殖不能のため、従来入手できなかった。
以下の記載から判るように、本発明の組換えＤＮＡ分子
は、適当な宿主において、ＨＢＶ抗原性を示す少なくと
も７種のビールス性ポリペプチドおよびそれをコード化
する構造遺伝子を生成させることができる。これら組換
えＤＮＡ分子と宿主とを用いて、ＨＢＶ抗原性を示すポ
リペプチドとこれらポリペプチドをコード化する構造遺
伝子とを製造することができる。これら生産物はまた同
定かつ特性化されうると共に、宿主中で生成されたまま
の状態で或いは適当に誘導体化もしくは改変した後に、
これら生産物自身の製造を改善する組成物および方法に
使用でき、またＨＢＶ感染を検知し、その病理学を追跡
しかつ人間におけるＨＢＶ抗体の生産を刺戟する組成物
および方法に使用することができる。
さらに本発明によれば、ディン粒子（Ｄａｎｅｐａｒｔ
ｉｃｌｅ　）の内生ＤＮＡから調製されたＤＮＡ順序を
ディン粒子以外の材料源から調製された他のＤＮＡ順序
に結合させることを特徴とする、組換えＤＮＡ分子の製
造方法が提供される。
本発明の方法は、上記した従来の方法とは次の点で区別
することができる。すなわち、従来法はいずれも組換え
ＤＮＡ分子を構成するための特定蛋白質を得る目的でま
たこの蛋白質もしくは遺伝子を生産する目的で天然遺伝
子またはＤＮＡを使用しない。その代シとして、従来法
は化学合成によシ作られた合成遺伝子またはｃ　Ｄ　Ｎ
　Ａ順序を作シ出すため供与体細胞から単離されたｍ　
ＲＮ　Ａを酵素的に転写することによシ作られた人工遺
伝子のいずれかを使用する。
蛋白質の組換えＤＮＡ合成において天然ＤＮＡが従来直
接に使用されなかった理由の一つは、大抵の高等生物か
らの天然ＤＮＡおよび少なくとも成る種の動物ビールス
が「イントロン（ＩｎＬｒｏｎ　）　Ｊすなわち付加的
なヌクレオチット順序を遺伝子の一部として含有するこ
とである。
これらイントロンは、遺伝子の最終的伝達体の一部を形
成しない。寧ろ、それらは高等生物において一次転写生
成物に作用する特殊処理酵素により生体内で除去されて
遺伝子の最終的メツセンジャー（ｍＲＮＡ）を与える。
細菌はこのようなイントロンを処理するのに使用できな
いと思われ、したがって天然ＤＮＡは細菌宿主において
表現することが期待されずまた所望の蛋白質はこれら宿
主により生産することが期待されないであろう。
第１図は、ディン粒子の内生ＤＮＡの構造を示す略図で
ある。これは２本の補完的ＤＮＡ鎖すなわちストランド
ａとｂとを示し、さらにストランドａにおける割目とス
トランドｂにおける間隙とを示すと共にこの間隙がＤＮ
Ａポリメラーゼ反応によシ閉鎖されることを示している
。
第２図は、本発明方法の好適具体例の略説明図であり、
ディン粒子から単離された内生ＤＮＡの断片は大腸菌（
イー・コリ）ベニシリナーゼ遺伝子に対しプラスミドｐ
ＢＲｊ　２２上のＰｓｔｌ部位に融合される。イー・コ
＋）ＨＢ１０／に変異した後、組換えＤＮＡ分子ｐＢＲ
Ｊ　２２−Ｐｓｔｌ　ｄＧ　：　ＨＢＶ−Ｋｐｎ　ｌ　
ｄＣｉｊ　ＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドの合成に同
けられる。
第３〜り図は、本発明によシ肝炎Ｂビールスゲノムの一
部について決定されたヌクレオチット順序を示している
。順序は、その上部に示された３つの読み枠における停
止コドンによシ示される。本発明で決定されたＨＢｃＡ
ｇをコード化する遺伝子については、開始コドンから任
意にナンバーが付される。ヌクレオチット−１０〜−７
はこの遺伝子に先行する主順序を示す。
ヌクレオチット／〜！ｌりは肝炎Ｂビールス核抗原をコ
ード化する遺伝子につきヌクレオチット順序を示し、こ
の抗原のアミノ酸順序（読み枠ｌ）はその順序の上部に
示される。ヌクレオチットｌ≠３７〜２／／μは肝炎Ｂ
ｇ−ルス表面抗原の遺伝子につき決定されたヌクレオチ
ット順序を示し、この抗原のアミノ酸順序（読み枠３）
はその順序の上部に示される。これら遺伝子における各
種の制限エンドヌクレアーゼ識別部位についても第３〜
り図に示される。
第１Ｏ図は、本発明方法の略説明図であシ、ここで肝炎
Ｂビールス核抗原性ヲ示すポリペプチドを生産すること
のできる組換えＤＮＡ分子は断片化され、この断片は改
善された表現制御順序、すなわち主系に付加される。
第１１図は、本発明方法の略説明図であり、ここで本発
明の組換えＤＮＡ分子は断片化されかつファージＤＮＡ
の断片に結合され、これは宿主細胞を溶菌させることに
よシその中に遺伝子コピーの数を増加させる際に使用さ
れる。
第１２図は、本発明方法の別の具体例の略説明図であシ
、ここで肝炎Ｂビールス核所性を示すポリペプチドを生
産しない本発明の組換えＤＮＡ分子は断片化されてＨＢ
ｓＡｇに対する構造遺伝子が除去され、この構造遺伝子
を使用して組換えＤＮＡ分子を生成させ、それＫより適
当な宿主においてＨＢｓＡｇを生産する。
本発明をさらに充分理解しうるよう、以下詳細に説明す
る。
以下の記載において、下記の用語を使用する。
ヌクレオチット：糖部分（ペントース）と燐酸部分と窒
素系複素環塩基とからなるＤＮＡもしくはＲＮＡの単量
体単位。この塩基はグリコシド炭素（ペントースの／′
炭素）を介して糖部分に結合され、塩基と糖との結合物
はヌクレオシドである。塩基はヌクレオチットを特性化
する。≠種のＤＮＡ塩基はアデニン（”Ａ”）、クアニ
ン（”Ｇ”）、シトシン（“Ｃ“）およびチミン（“Ｔ
”）である。≠種のＲＮＡ塩基はＡ、Ｇ、Ｃおよびウラ
シル（“Ｕ”）である。
ＤＮＡ順序：隣接するペントースの３′炭素とｊ′炭素
との間のホスホジエステル結合によシ互いに結合された
ヌクレオチットの線状系列。
コドン：　　ｍＲＮＡを介してアミノ酸、制版開始信号
または翻訳終了信号をコード化する３種のヌクレオチッ
ト（トリプレット）のＤＮＡ順序。
たとえば、ヌクレオチットトリブレットＴＴＡ。
ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ，ＣＴＡおよびＣＴＧ　はアミ
ノ酸ロイシン（“Ｌｅｕ”）をコード化し、ＴＡＧ、Ｔ
ＡＡおよびＴＧＡは翻訳停止信号であり、ＡＴＧは翻訳
開始信号である。
読み枠：ｍＲＮＡをアミノ酸順序に翻訳する際のコドン
のグループ化。翻訳の間、適正な読み枠は維持されねば
ならない。たとえば、順序ＧＣＴＧＧＴＴＧＴＡＡＧ　
　を３つの読み枠もしくは相において翻訳することがで
き、その各々は異なるアミノ酸順序を与える。すなわち
、ＧＣＴＧＧ　　ＴＴＧ　　ＴＡＡ　Ａ：　Ｔｒｐ−Ｌ
ｅｕ−（停止）ポリペプチド：隣接するアミノ酸のα−
アミン基とカルボキシ基との間のペプチド結合によシ互
いに結合されたアミノ酸の線状系列。
ゲノム：物質の全ＤＮＡ０これは特に物質のポリペプチ
ドをコード化する構造遺伝子、ならびに作動子、促進子
およびたとえばシャインータ゛ルｆ）”ルノ順序のよう
な順序を含むリボンーム結合および相互作用順序を包含
する。
構造遺伝子：雛型またはメツセンジャーＲＮＡ（”ｍＲ
ＮＡ”）を介して特定ポリペプチドに特性的なアミノ酸
の順序をコード化するＤＮＡ順序。
転　写：構造遺伝子からｍＲＮＡを生成させる過程。
翻　訳：ｍＲＮＡからポリペプチドを生成させる過程。
表　現＝ｗｔ造遺伝子によシポリペプチドを生成させる
ために受ける過程。これは転写と翻訳との組合せである
。
プラスミド：完全「レプリコン」からなる非りロモンー
ム二重鎖ＤＮＡ順序であり、これによりプラスミドは宿
主細胞内で再現される。プラスミドを単細胞生物に入れ
ると、その生物の特性がプラスミドのＤＮＡの結果とし
て変化または変異する。たとえば、テトラティクリン耐
性（Ｔｅｔ　）についての遺伝子を担持するプラスミド
は従前テトラサイクリンに敏感であった細胞をこれに対
し抵抗性の細胞に変異させる。プラスミドによシ変異さ
れた細胞を「変異体（トランスホーマント）」と呼ぶ。
ファージまたはバクテリオファージ；細胞性ビールスで
あり、その多くは蛋白質エンベロブもしくは被覆（「カ
プシド」）中にカプセル化されたＤＮＡ順序を有する。
単細胞生物において、ファージは「トランスフ、クショ
ン」と呼ばれる工程により再現する。
クローン用ベヒク／ｌ／　（ａｔｏｎｉｎｇ　ｖｅｈｉ
ｃｌｅ　）　：宿主細胞中で再現しうるプラスミド、フ
ァージＤＮＡまたはその他のＤＮＡ順序であシ、これは
１個または少数のエンドヌクレアーゼ識別部位を特徴と
し、この部位においてこのＤＮＡ順序はＤＮＡの本質的
な生物学的機能（たとえば再現性）、被覆蛋白質の生成
の喪失または促進子もしくは結合部位の喪失を伴わずに
決定可能に切断され、またこの部位は変異細胞の同定（
たとえばテトラティクリン耐性またはアンピシリン耐性
）に使用するのに適する印しを含有する。クローン用ベ
ヒクルはしばしばベクターと呼ばれる。
クローン化（ａｔｏｎｉｎｇ　）　：　　無性繁殖の過
程組換えＤＮＡ分子：少なくとも２つのヌクレオチット
順序からなる混成りＮＡ順序であり、第一の順序は天然
において第二の順序と一緒て調整するヌクレオチットの
ＤＮＡ順序。
次に、第１図を参照すれば、ディン粒子の内生ＤＮＡの
略図が示されている。ディン粒子は、肝炎Ｂビールス感
染した患者の血漿中に検出さレル（ティー・ニス・ディ
ンおよびシー・エッチ・カメロン、「オーストラリア−
抗原に関する肝炎を持った患者の血清中におけるビール
ス状粒子」、ランセット誌、第１巻、第６り！〜６りを
号（／り７０））。　この粒子は、肝炎Ｂの感染性ビー
ルス単位（ｖｉｒｉｏｎ　）と同一または密接に関連す
ると考えられる。その大きさは知られているが（直径弘
２ナノメータ）、その構造は充分には理解されていない
。一般に、ゲイン粒子は外層と内核とからなると信じら
れる。粒子の外層は一般（／ｌ：、肝炎３表面抗原（”
ＨＢｓＡｇ”）として知られるポリペプチドを含有する
。内核（直径２７ナノメータ）は第二のポリペプチドす
なわち肝炎Ｂ核抗原（”ＨＢ　ｃ　Ａ　ｇ”）ならびに
２／ＸＩＯダルトンの内生二重鎖の円形ＤＮＡ分子を含
有し、これは種々な長さの単一ストランド間隙を有する
。第三のポリペプチド、すなわち“ｅ”抗原じＨＢｅＡ
ｇ”）もディン粒子に関係する。さらに、ディン粒子は
内生Ｄ　Ｎ　Ａ依存性のＤＮＡポリメラーゼを含むと信
じられ、これはそのＤＮＡをプライマ／雛型として用い
るポリメラーゼ反応によシ内生ＤＮＡ中の単一ストラン
ド間隙を閉鎖する。ゲイン粒子、さらに詳しくはそのＤ
ＮＡの構造および性質は幾つかの分析の主題である（た
とえばダブりニー・ニス・ロビンソン、「肝炎Ｂビール
スのゲノム」、アニュアル・レビュー−オブ・マイクロ
バイオロジー、第３７巻第３！７〜３７７頁（／り７７
））。
しかしながら、各種の抗原またはその遺伝子の実際の構
造はまだ決定されていない。
ディン粒子の内生ＤＮＡは、抽出によシブイン粒子から
単離されている。これは、小さな割目すなわちその中の
開口部を有する一定長さの１本のヌクレオチット鎖（第
１図、ストランドａ１〜３０００ヌクレオチット）と成
る程度変化しうる長さの第二のヌクレオチット鎖（第１
図、ストランドｂ１〜２０００ヌクレオチット）とから
なっている。第二のストランドは第一のストランドに対
し補完的であり、その割目を重ね合せて補完的塩基間に
おける水素結合によシ標準的ワトソンークリック方式で
円状構造を完成する。この重複部が第１図に見られる。
ディン粒子のＤＮＡポリメラーゼは、内生ＤＮＡの第二
ストランドをプライマとして使用すると共に第一ストラ
ンドを雛型として使用することによシ種々の間隙を、第
一ストランドのヌクレオチットに対し補完的であるヌク
レオチットで埋めて約３０００ヌクレオチツト対の二重
鎖ＤＮＡを与えると思われる。
肝炎ＢビールスＤＮＡの調製方法 単一のＨＢｓＡｇ陽性かっＨＢｅＡｇ陽性の供血者（血
清型ａｄｙｍ　）　　からのひと血清を等容量のＰＨ７
，ｐ　ｃｒ）緩衝液（Ｏ，／Ｍ）＋７スーＨＣＩ、　　
０．１Ｍ塩水（ＮａＣ１）　、０．　／％のコーメルカ
ブトエタノール、０．１％子牛血清アルブミン、ただし
チは本明細書中全てＷ／Ｖ％とする、および０．００／
ＭのＥＤＴＡ）で希釈した。これを弘℃にて３ｉ０００
ｒｐｍで２時間遠心分離した。かく得られたベレットを
２００μｌの同じ緩衝液に再悲濁させ１．２０％の蔗糖
を含有する遠沈管の頂部に層化させた。懸濁物を≠℃に
て≠Ｑ、０００ｒｐｍで２時間遠心分離した。かく得ら
れたベレットを再び１００ＡＩのＰＨ７ｓの緩衝液（０
，／　Ｍ　）リス−ＨＣｌ、Ｏ，１Ｍ塩水）に再葱濁さ
せた。
次いで、得られたＤＮＡ含有のベレットを３Ｈまたは５
２ｐでラベルしくビー・エム・カブラン等、「ひと肝炎
Ｂ抗原に関係するＤＮＡポリメラーゼ」、ジャーナル・
グイロロジー、第１コ巻第タタｊ〜１００！頁（ｌり７
３））て、後の過程における追跡を容易にした。このラ
ベル化は、濃厚ディン粒子と　Ｈ−もしくは　Ｐ−ラベ
ルされたデオキシヌクレオシドトリホスフェ−）（ｄＮ
ＴＰ）との３７℃におけるｊ時間の反応によシ得られる
。このＤＮＡポリメラーゼ反応の後、ＤＮＡ中の単一ス
トランド間隙は部分的に閉鎖され（第７図参照）、ラベ
ル化された材料を蔗糖３０％含有の遠沈管の頂部に層化
させ、グ℃にて≠、２．００Ｏｒｐｍで３，５時間遠心
分離した。
次いで、ＤＮＡを得られたベレットからフェノールによ
シ抽出した（エル・アイ・ルトウイツクオヨヒダプリュ
ー尋ニス・ロピンソン、「肝炎Ｂディン粒子ＤＮＡポリ
メラーゼ反応で合成されるＤＮＡＪ、ジャーナル・グイ
ロロジー、第２１巻第２６〜ｉｏ弘頁（ｌり７７）の手
順を使用）。次いで、抽出されたＤＮＡをｏ、ｏｉＭ　
トリス−ＨＣｌ　％０．００／　ＭＯＥＤＴＡ＋７）溶
液（ｐＨｒ、Ｑ）で透析してフェノール溶媒を除去した
。かくして単離されたＤ　Ｎ　Ａは制限酵素消化に対し
て準備できた。これは〜／　０８ｃｐｍ／μ９の比放射
活性を示した。上記した方法を概略第２図に示す。
上記のように単離した二重鎖ＤＮＡを無性増殖させるの
に、多種類の宿主−クローン用ベヒクル組合せ物を有効
に使用することができる。
たとえば、有用なりローン用ベヒクルはクロモンーム系
、非りロモンーム系および合成のＤＮＡ順序たとえば各
種の公知細菌性プラスミド（たとえばｐＢＲｊ　２２、
その他イー・コリのプラスミドおよびそれらの誘導体）
、および広宿主範囲のプラスミド（たとえばＲＰμ）、
ファージＤＮＡたとえば多種のファージλの誘導体（た
とえばＮＭｒタタ）、およびプラスミドとファージＤＮ
Ａとの組合せ物から誘導されたベクター、たとえばファ
ージＤＮＡ表現制御項序を使用するよう改変したプラス
ミドを包含する。有用な宿主は細菌宿主たとえばイー・
コ１．ＩＸ／７７６、イー・コリＸ２２ｇ’２、イー　
、　：　１７　ＨＢ　／　０　／　オよびイー・コリＭ
ＲＣ／およびシュードモナス、バチルス・ズブチリスお
よびその他細菌の菌株、酵母菌およびその他菌類、動物
または植物宿主（たとえば培養動物もしくは植物細胞）
、およびその他宿主を包含する。勿論、全ての宿主が同
等の効果をもつものではない。宿主−クローン用ベヒク
ル組合せ物の特定の選択は、本発明の範囲から逸脱する
ことなく上記の原理を正当に考慮して当業者が行なうこ
とができる。
さらに、各特定ベクター中には、単離された二重鎖ＤＮ
Ａを挿入するため種々な部位を選択することができる。
通常これらの部位は、これらを切断する制限酵素すなわ
ちエンドヌクレアーゼによシ指定される。たとえば、ｐ
ＢＲ３２λにおいては、Ｐｓｔ　／部位はベニシリナー
ゼ遺伝子中におけるペニシリナーゼ蛋白のアミノ酸／Ｊ
’／およびｌ♂２をコード化する。ヌクレオチッドトリ
プレソトの間に位置する。この部位は、ラッテプロイン
シュリン決定子を示す蛋白質の合成の際上記のピラーコ
マロフ等にょシ用いられた。Ｈｉｎｄ　１１工ンドヌク
レアーゼ識別部位は、アミノ酸１０／および１０２をコ
ード化するトリプレットの間に存在し、　Ｔａｇ部位は
ｐＢＲＪ２２におけるその蛋白のアミノ酸弘！をコード
化するトリプレットに存在する。同様に、このプラスミ
ドに対するＥｃｏ　ＲＩエンドヌクレアーゼ識別部位は
、それぞれテトラサイクリンおよびアンピシリンに対す
る耐性をコード化する遺伝子の間に位置する。この部位
は、イタクラ等およびゲデル等によシ、上記した組換え
ＤＮＡ合成法において使用された。第２図および第１Ｉ
・１、図は、例示の目的でプラスミドｐＢＲＪ２２およ
びファージλＮＭり♂りにおける幾つかの制限部位を示
している。
選択ＤＮＡ断片をクローン用ベヒクル中ば挿入して組換
えＤＮＡ分子を生成させるため選択される特定部位は種
々の因子によシ決定される。
これらは表現すべきポリペプチドの寸法および構造、宿
主細胞成分による内生酵素分解に対する所望ポリペプチ
ドの感受性およびその蛋白による汚染、たとえば聞出お
よび停止コドンの配置のような表現特性、ならびに当業
者に知られたその他因子を包含する。表現過程は充分に
は理解されていないので、これら因子はいずれも単独で
は特定ポリペプチドに関する挿入部位の選択を絶対に制
御しない。寧ろ、選択された部位はこれら因子をバラン
スさせる効果を有し、成る蛋白に対し必らずしも全ての
部位が同等の効果を示すものではない。
外来ＤＮＡをクローン用ベヒクル中に挿入して組換えＤ
ＮＡ分子を生成させるには幾つかの方法が当分野で知ら
れているが、本発明において好適な方法を第２図に示す
。これは、ディン粒子ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ
にょシ開裂させ、開裂ＤＮＡの３′末端（ＤＮＡ糖骨格
のデオキシリボース炭素から便宜上名付けられる）にポ
リープオキシＣＪ［序を付加させ、そして伸長したＤＮ
Ａをクローン用ベヒクルに結合させることを特徴とし、
ただしクローン用ベヒクルは制限エンドヌクレアーゼに
ょシ特定部位で切断されて、その切断の３′末端に開裂
Ｄ　Ｎ　ＡのポＩＪ−ｄ（ｌｌｉｉ序に対し補完的なポ
リデオキシＧ順序を伸長させたものを使用する。ＤＮＡ
およびクローン用ベヒクルの３′末端の補完的性質はこ
れら末端の結合を可能にする。
本発明の方法において有用であるためには、ＨＢＶ、Ｄ
ＮＡを開裂させるのく選択される制限酵素は、ＨＢＶ抗
原性を示すポリペプチドをコード化する遺伝子の必須部
分内においてＨＢＶ・ＤＮＡを開裂してはならず、特に
好適には制限された数の部位にてＤＮＡを開裂すべきで
ある。本発明で使用された制限酵素はＫｐｎ”１％Ｂｇ
＋−［、Ｂａｍ　＊ＨＩ、Ａｖａ　引およびＥｃｏ−Ｒ
１を包含する。その他の制限エンドヌクレアーゼも同様
に本発明において使用することができる。
これらの選択は、本発明の範囲を逸脱することなく、上
記した諸因子を考慮して当業者が行なうことができる。
第３〜り図は、ＨＢＶゲノムの一部における制限エンド
ヌクレアーゼ識別部位の幾つかを示している。
勿論、ＤＮＡｊ＠序をクローン用ベヒクル中（で挿入し
て組換えＤＮＡ分子を生成させるその他公知の方法も同
等に本発明において使用される。
これらには、たとえば同一の制限エンドヌクレアーゼを
使用してＨＢＶ、ＤＮＡとクローン用ベヒクルとを開裂
させるような直接結紮云が包含される。この方法は本質
的に補完的端部を結合に供する。
勿論、クローン用ベヒクルの選択制限部位に挿入された
ヌクレオチット屓序または遺伝子断片は所望蛋白質に対
する実際の構造遺伝子の一部でないヌクレオチットを包
含し或いはその構造遺伝子の断片のみを包含することも
できると了解すべきである。と’ｃＯＮＡ西己ダリを壬
申ｘｔ／でも変異された宿主はＨＢＶＫ原性を示すポリ
ペプチドを生産することのｐｙｔｓｔｌである。。
混成遺伝子を含有する組換えＤ　Ｎ　Ａ分子を使用して
宿主を変異させ、この宿主（変異体）が構造遺伝子また
はその断片を表現しかつ混成ＤＮＡ（７）コード化する
ポリペプチドまたはその一部を生産するようにさせるこ
ともできる。また組換えＤＮＡ分子を使用して宿主を変
異させ、この宿主が再現性をもって付加的な組換えＤＮ
Ａ分子をＨＢＶ構造遺伝子およびその断片の源泉として
生産するようにさせることもできる。これらいずれかの
使用に対する適当な宿主の選択は、当分野で知られた多
くの因子によシ管理される。これらの因子には、たとえ
ば選択ベクターとの適合性、共生産物の毒性、所望ポリ
ペプチドの回収容易性、表現特性、生物学的安全性およ
び価格が包含される。また、表現のメカニズムは充分に
は理解されていないので、宿主の絶対的選択をこれら因
子のいずれか単独により特定の組換えＤＮＡ分子または
ポリペプチドについて行なうことはできないであろう。
寧ろ、特定の組換えＤＮＡ分子の表現に対・し全ての宿
主が同等の効果を示しえないという現実に鑑みてこれら
因子をバランスさせねばならない。
本発明の合成において、好適なりローン用ベヒクルは細
菌性プラスミドｐＢＲｊ、２２であり、そこの好適な制
限エンドヌクレアーゼ部位はＰｓｔ　／部位である（第
２図）。このプラスミドは、抗生物質アンピシリン（Ａ
ｍｐ）およびテトラサイクリン（Ｔｅｔ）に対する耐性
遺伝子を担持する小さい（分子量約２６メガダルトン）
プラスミドである。プラスミドは充分に特性化されてい
る（エフ・ポリヴアール等、「新規なりローン用ベヒク
ル■の構成および特性化。多目的クローン系」、ジーン
、第りよ〜／／３頁（ｌり７７））。本発明による好適
な宿主はイー・コリＨＢ　／　０　／である。
１、　　ｄＣ−伸長化したディン粒子ＤＮＡの調製本発
明の好適具体例の実際的実施において、ディン粒子から
上記のように単離したＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ
Ｋｐｎ　ｌ　（／　ＯｍＭのトリス−ＭＣＩ　（ｐＨ７
！　）　、　／　Ｏ’ｍＭのＭｇＣｌ２．１０ｍＭの２
−メルカプトエタノール、≠ＯｍＭのＮａＣ１，０，！
ｐｉ：の酵素調製物１０’）ｔｌ中のＤＮＡ約２０ｎｊ
ｌ）により３７°Ｃにてり０分間消化させ、制限酵素を
７０’（：、、６分間の加熱によシネ活性化させた。ポ
リープオキシＣ順序（例示の目的で第２図にはＣＣＣと
して示ス）を、フェノールおよびクロロホルム（各２０
μｌ）での抽出により残留蛋白質を除去した後、ポリヌ
クレオチド末端トランスフェラーゼとの標準的反応によ
り消化生成物の３′末端に付加させた。エーテルでの抽
出によジフェノールを水相から除去し、ＪＭの酢酸ナト
リウム、ｐＨ４，ｊ（ｒｎｌりト冷エタノールｏ、　ｉ
　ｒｎｌとの添加によりＤＮＡを沈殿させた。−７０℃
に７時間保った後、沈殿ＤＮＡを／　Ｑ、０００　ｒｐ
ｍで２０分間遠心分離して回収し、このペレットを１０
ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，ｊ（１０μｌり中に溶
解させた。
これに３μｌのｌｔ００ｍＭカコジル酸カリウム（ｐＨ
７０）と≠ｍＭの塩化コバル・トド弘ｍＭのデオキシシ
トシントリホスフェート （ｄＣＴＰ）とｉ　ｏ　ｏ　ｐｆ／　／ｍｅの子午面（
青アルブミンとを加え、混合物をｏ、　ｒｎｌのポリヌ
クレオチツド末端トランスフェラーゼ（＋０００ｕ／ｍ
６）　　と共に２７℃にて７０分間培養しそして６０ｍ
ＭのＥＤＴＡ（ｌμｌりを添加して反応を停止させた。
３２２の調製 プラスミドｐＢＲｊ−コを制限エンドヌクレアーゼＰｓ
ｔ　ｌ　（これに対しプラスミドはｌっの目標を有する
）によシ消化し、この生成物をＨＢＶ・ＤＮＡについて
上記したようにフェノール抽出およびエタノール沈殿に
より精製した。ボ１７−ｄＧ順序（例示の目的で第２図
にＧＧＧとして示す）を、ＨＢＶＫ対するボＩＪ−ｄＣ
順序の付加について上記したように、末端トランスフェ
ラーゼによシ線状ｐＢＲ３２２の３′末端に付加させ、
ただしこの場合反応は３７℃にて行なった。
次いで、等モル量のｐＢＲｊ　２．２−ポリ−ｄＧとＨ
ＢＶ、ＤＮＡ−ポリ−ｄＣとを混合し、補完的頭序を１
００ｍＭのＮａＣ１，６０ｍＭのトリｘ　−ＭＣＩ　（
ｐＨ７，ｊ　）、ｊｍＭのＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ（ＴＮＥ）（
！０μｌ）中にて乙！℃で１時間、次いでグア℃で７時
間、３７℃で７時間および２０℃で７時間培養すること
により結合させ、そして等容量のＴＮＥと２０μＥの１
００ｍＭのＭｇＣｌ　２．１００ｍＭのＣａＣｌ２．１
００ｍ　Ｍ　（７）　）リス−ＨＣ！！（ｐＨ７ｔ）と
を加えた。
４、　イー・コリＨＢ　／　０　／の変異変異に適した
イー・コ＋）ＨＢ１０／の培養物ヲ、イー・エム・レー
ダーペルクおよびニス、・−エッチ・コーヘンによシ「
プラスミドデオキシリボ核酸によるサルモネラ・チフィ
ムリウムの変異」、ジャーナル・バクテリオロジー、第
１／り巻、第１０７２〜１０７’Ａ頁（ｌり７≠）に記
載されているよつに調製した。
細胞の０．　／　ｍ６部をアニールされたＤＮＡ調製物
λ！μｌと混合し、０℃で２０分間培養し、次いで２０
℃にて７０分間培養した後、テトラサイクリン（ｊ（７
μｔ／ｍｅ）を含有するＬ−寒天板上に塗床して３７℃
で一晩培養した。
プラスミドｐＢＲＪ２２はテトラサイクリン耐性につい
ての遺伝子を有するので、このプラスミドにより変異さ
れたイー・コリ集落は、このように変異されなかったイ
ー・コリ集落を除いて、こ、の抗生物質を含有する培養
物中で増殖するであろう。したがって、テトラサイクリ
ン含有の培養物における増殖は適切に変異された宿主の
選択を可能にする。
５、交雑化によるイー・コリ集落のスクリーニング 培養されたテトラサイクリン含有し一寒天板上に増殖し
た細菌集落をアンピシリンに対する感度について試験し
た。プラスミドｐＢＲ１２２はアンピシリン耐性につい
ての遺伝子を有する。この遺伝子は混成゛遺伝子挿入の
提案部位である。したがって、選定識別部位に挿入され
たＤＮＡを有するプラスミドにより変異された集落はア
ンピシリンに対し感受性であるが、テトラサイクリンに
対する耐性を保持するであろう。アンピシリンＫＨし感
受性であるがテトラサイクリンに対し耐性テアッたイー
・コリ集落を、テトラサイクリンを含有するＬ−５％天
板上に支持されたミリボア硝酸セルロースフィルターの
円板の上に＆置した。３７℃で一晩増殖させた後、この
ミリポアフィルタ−をテトラサイクリンとクロラムフェ
ニコール（／ｊ０μ／　／ｍｌ　）とを含有する新たな
Ｌ−寒天板に移し、３７℃にてさらに数時間培養して細
胞内のプラスミドのコピー数を増加させた（第２図）。
次いで、エム・グルンスタインおよびディー・ニス拳ホ
グネスによシ「集落交雑化：特異遺伝子を含有するクロ
ーン化ＤＮＡの単離方法」、プロシーディング・ナショ
ナル・アカデミ−・サイエンス、Ｕ、Ｓ、Ａ、第７２巻
第、３り乙／〜３り６ｔ頁（／り７ｊ）に記載されてい
るように、集落交雑化のため、前記で調製した３２ｐ−
ラベルされたＨＢＶ−ＤＮＡを試料とじてミリポアフイ
ルタ−を使用した。フィルターのラジオオートグラフは
、標準ＨＢＶ・ＤＮＡに対し補完的なりＮＡ順序を含有
する集落の存在を示した。
テトラサイクリンに耐性であり、アンピシリンに感受性
であシかつ標準ＨＢＶ、ＤＮＡで交雑化した集落を、Ｈ
ＢＶ抗原特異性すなわち抗原性を示す少なくとも１種の
ポリペプチドを生産する能力について試験した。ここで
も集落を、テトラサイクリン含有のＬ−寒天板上に支持
されたミリポアフィルタ−の上に載置し、３７℃で一晩
培養した。バクテリオファーシュλヴイルの発病法を感
染させた（感染度的ｌの倍率）イー・コＩＪ　Ｃ４００
の培養物（軟質寒天２Ｍ中０．　／　ｍｌ　）−を有す
る第二のし一寒天板で覆い、３７℃で一晩培養し、その
際細菌叢は総合的にファージ（λラベル）によシ溶菌さ
れた（すなわち、実質的に全ての宿主細胞壁が破裂した
）。本発明によシ変異された細胞を含有するミリポアフ
ィルタ−を板から釣り上げ、集落を下面としてλラベル
で溶菌されたイー・コ＋）ｃｔｏｏのＬ−寒天板の表面
に接触させた。この接触を約７０分間続けて、ミリポア
フィルタ−上に存在する細胞のλラベルによる感染を行
なわせた。
次いで、ミリポアフィルタ−をＬ−寒天の新たな板に移
し、３７℃でさらに３時間培養した。その間、ニス・プ
ルームおよびダブリュー・ギルバートによシ「特異的翻
訳生成物を検出する免疫学的スクリーニング方法Ｊ１プ
ロシーディング・ナショナル・アカデ汁１サイエンス、
　Ｕ、Ｓ、Ａ、第７よ巻筒２７弘２〜２７グタ頁（／り
７Ｆ）に記載されているように、ＨＢＶ抗体でポリビニ
ル円板を被覆した。
変異した細菌集落が明白に溶菌し・たミリポアフィルタ
−をその集落につき被覆ポリビニル円板と接触させ、弘
℃に３時間保った。この接触の結果、ミリポアフィルタ
−上の細胞から溶出したＨＢＶ抗原は全て円板のＨＢＶ
抗体と結合する。被覆円板をミリポアフィルタ−から分
離し、次いで洗浄して　ニーラベルされたＨＢＶ抗体と
共に培養した。この培養の結果、ミリポアフィルタ−か
らのＨＢＶ抗原が円板のＨＢＶ抗体によシ事前に結合さ
れてしまった円板上の個所が放射活性となる。
洗浄後、上記プルームおよびギルバートによシ記載され
ているようにラジオオートグラフィーにかけると、ＨＢ
Ｖ抗原特異性を有するポリペプチドを生成した集落はラ
ジオオートグラフによシ位置確認された。
ＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドとそれをコード化する
構造遺伝子および断片と・を、人間におけるＨＢＶ抗体
の存在を検知ししたがってこのビールスにより感染され
た人間および血液試料を識別するよう、設計した方法お
よび装置に使用することができる。
たとえば、本発明の組換えＤＮＡ分子により変異された
宿主により生産されるＨＢｃＡｇを、肝炎Ｂビールス検
知のため現在利用しうる免疫学的診断試験、すなわち放
射性免疫分析法またはエリザ（ＥＬＩＳＡ、酵素結合免
疫吸着分析法）、に使用することができる。放射性免疫
分析法の一型弐においては、実験動物中に成育させた抗
−核抗原抗体を固体相、たとえば試験管の内側に付着さ
せる。次いで、この試験管にＨＢｃＡｇを加えて抗体と
結合させる。抗原−抗体複合物によシ被覆されたこの試
験管に、患者血清の試料と共にたとえば放射性沃素のよ
うな放射性同位元素でラベルしたＨＢＶ抗−核抗体の既
知士を添加する。患者血清中のＨＢＶ抗体は、抗原−抗
体複合物の遊離結合部位に対しラベル化抗体と競合する
であろう。血清を作用させた後、過剰の液体を除去し、
試験管を洗浄しそして放射活性の量を測定する。陽性の
結果、すなわち患者血清がＨＢＶ抗体を含有するという
結果ぼ、低放射計数によって示される。エリサ試験法の
一型式においては、マイクロ滴定板をＨＢｃＡｇで被覆
し、これに患者血清の試料を加える。抗体と抗原とを反
応させる培養期間の後、板体を洗浄しそして実験動物で
成育させかつ酵素ラベルに結合させた抗−ひと抗体の調
製物を加え、培養して反応を生ぜしめ、次いで板体を再
洗浄する。その後、酵素基質をマイクロ滴定板に加え、
酵素を基質に作用させる期間培養しそして最終調製物の
吸着率を測定する。吸着率における大きな変化は陽性結
果を示す。
本発明のイー・コリにおける組換えＤＮＡ分子から翻訳
された抗原性ポリペプチドの生物学的活性を試験するた
め、ＨＢｅＡｇを表現するために示した細菌細胞の無菌
抽出物を・、等容重のフインド補助液と混合した後、兎
に注射した。
２匹の動物には粗製の細菌抽出物を与え、また２匹の動
物；では同じ抽出物の試料をセファデックスＡｊＯカラ
ムでの分画の後に加えた。さらに、凍結および貯蔵した
（充分な抗原活性を保持する）同じ試料の注射を、最初
の注射から２週間後および！週間後に与えた。これら動
物を、最初の注射から数週間後、時間間隔を置いて出血
させた。
オー・オウチタロニーにより「免疫拡散および免疫電気
泳動」、ハンドブック・オプ・エキスペリメンタル・イ
ミュノロジー（ディー・ダブりニー・ウェア編、ブラッ
クウェル・サイエンティフィック出版社、オツクスフオ
ート・およびニシンバラ）、第１り章（／り６７）に記
載された方法を用いて免疫拡散実験を行ない、兎血清（
抗体）をひと肝臓から得られたＨＢｃＡｇを使用してひ
と肝炎Ｂビールス核抗体（”ＨＢｃＡｂ”）と比較した
（ビー・ジエー・コーヘンおよびワイ・イー・コサルト
、「肝炎Ｂ核痙原に対する抗体のスクリーニング試験の
応用」、ジャーナルφクリニカル争パソロジー、第３０
巻第７０９〜７／３頁（ｌり７７））。≠匹の兎の血清
全ては、人間から得られたＨＢｃＡｇとＨＢｃＡｂとの
間に形成されたものと同一の、ＨＢａＡｇを有する沈降
素ラインを与えた。したがって、本発明の徂換えＤＮＡ
分子を用いてイー・コリ中で合成した核抗原は生体内に
おいて血清学的に活性である。この活性は、微生物細胞
中で合成されたビールス抗原を用いる組成物および方法
を入間における抗体形成の刺戟のために使用しうること
を確立した。この種の組成物および方法は、本発明で製
造された組換えＤＮＡ分子によう変異された宿主が生産
するポリペプチドを特徴とする。これらのポリペプチド
は、単独に或いは人間におけるビールス感染の処置およ
び予防のための組成物および方法Ｃで使用される当分野
で認められているたとえば食塩溶液または他の添加剤の
如き周知の医薬上許容しうる担体と共に、使用されるで
あろう。
前記したように、本発明の組換えＤＮＡ分子を製造する
には、上記Ｋｐｎｌ／Ｐｓｔｌ　組合せ物思外の制限酵
素も有効に使用することができる。プラスミドｐＢＲＪ
ｊλおよびＨＢＶゲノムの一部における他の制限部位を
それぞれ第２図および第３図に示す。これらの代案とな
るが余り好適でない具体例を説明するため、以下に実施
例を示す。
Ｂａｍ−ＨＩ、Ｅｃｏ　−ＩＲＩ、　Ｂｇｌ　ｌｌ１−
Ｐｓｔ　［組合せＫｐｎｌによシ生成されたものとは異
なシ、Ｂａｍ・Ｈｌ、且ユ・Ｒ１およびシ已・ｎの使用
によシ生成されたＨＢＶ−ＤＮＡ断片は、短かい！′−
単一クーストランド突出部在するため、直接に末端結合
させることが便利にできなかった。したがって、これら
は、３′末端にポリーｄＣ順序を付加させる前に、λエ
キソヌクレアーゼテ処理して上記突出部を除去した。こ
れは、制限されたＤＮＡ　（前記したようＫＩＱμｌの
溶液）を／！μｌの／　００　ｍＭグリシン酸ナトリウ
ム（ｐＨ９：ｊ）、１０ｍＭのＭｇＣ’１２　声”　／
　０．０　μｇ　／ｉｔの子牛血清アルブミン、！μｌ
のλエキ７ヌクレアーゼと共に０℃にて／、５時間培養
することによシ行なった。次いで、混合物をフェノール
とクロロホルムとで抽出し、工程を続けた。１３ａｍ・
ＨＩを使用した調製物の場合、後の放射免疫分析法によ
りＨＢＶ抗原特異性を有するポリペプチドの生成を確認
した。
上記したようにＤＮＡ断片を末端結合させる代シに、本
発明の方法において遺伝子断片の直接的結紮を用いるこ
とができる。たとえば、別の２種の調製物においては、
ＨＢＶ−ＤＮＡ（２０ｎｇ）を１０ｍＭのトリス−ＨＣ
ｌ　（ｐＨ７！　）、１０ｍＭのＭｇＣ＋２　、／　Ｏ
ｍＭの２−メルカプトエタノール１．ｒ　ＯｍＭのＮａ
Ｃ１（／　Ｏｌｉｔ　）中において制限エンドヌクレア
ーゼＥｃｏ−ＲＩｉたはカニ・ＨＩによシ３７°Ｃにて
／、５時間制限化処理し、同一条件下で同一酵素と共に
培養された過剰のｐＢＲＪ２．２と混合した。濃厚緩衝
溶液１ｊＡ（７ｍＭのトリス−ＭＣＩ（ｐＨ７３）、／
　００　ｍＭのＭｇ　ＣＩ　２．１０ｍＭのＥＤＴＡ、
７００ｍＭの２−メルカプトエタノール、弘００　ｍＭ
のＮａＣｌ、／ｍＭのＡＴＰ）（ｌμＩりを加え、と（
７）混合物をＴ≠・ＤＮＡリガーゼ（ｏ、ｓμ！りと共
に１０℃で３時間、次いで０℃で少なくとも２弘時間培
養した。この溶液を１０ｍＭのトリス−ＨＣＩ（、ＨＩ
よ）によｌ）　０．　／　ｍｅに希釈し、前記したよう
にイー・コリＨＢ１０／の適当な培養物を変異させるの
に使用した。と、ＨＩ調製した組換えＤＮＡ分子の場合
、交雑化に対するスクリーニングの前に、集落をアンピ
シリンに対してでなくテトラサイクリンに対する感度に
ついて試験した。
何故なら、ｐＢＲＪ２２中のＢａｍ・ＨＩの目標はテト
ラサイクリン耐性をコード化する遺伝子内にアリ、シた
がってこの識別部位において上手に挿入すれば二上■部
位における挿入の場合と同様にアンピシリン耐性でなく
テトラサイクリン耐性の喪失が生ずるからである。
旦二・ＲＩ部位を介して調製された組換えＤＮＡ分子の
場合には、交雑化についてのスクリーニングの前に、集
落をアンピシリンとテトラサイクリンとの両者に対する
耐性につき試験した。
何故なら、ｐＢＲＪ２２中の、４江・ＲＩの目標はテト
ラサイクリンとアンピシリンとの耐性をコード化する遺
伝子間に存在し、したがってアンピシリンまたはテトラ
サイクリンの耐性に関する遺伝子の不活性化はこの部位
における混成りＮＡ挿入の除虫じないからである。
本明細書中に記載した方法で調製された微生物は、１７
７ｇ年１２月りｊ日にボートンダウン在ノカルチャー・
コレクションＵオブ・ザ・マイクロバイオロジカル・リ
サーチ・エスタプリツシュメントに寄託されかつｐＢＲ
Ｊ　２２−ＨＢＶ　−Ａ、Ｆとして同定された培養物に
より例示される。
詳細には、これら培養物の特徴は次の通シである。
ＴｅｔＲＡｍｐ５ＨＢＶ” これらと同一の培養物の一部を、／９７り年／２月／り
日にスコツトランド、アバディーン在ノカルチャー・コ
レクション・オブ・ザ・ナショナルＯコレクション・オ
ブ・インダストリアル・バクテリアにもを託した。
培養物に対する上記命名は、次のような培養物の記載で
ある。宿主／クローン用ベヒクル−クローン用ベヒクル
中の制限部位であって、伸長ヌクレオチット（もし存在
すれば）を示す：肝炎Ｂビールス中の肝炎Ｂビールス制
限部位であって、伸長（もしあれば）を示すニーテトラ
サイクリン（Ｔｅｔ）およびアンピシリン（Ａｍρ）に
対する耐性（Ｒ）ｊたは感受性（Ｓ）：上記の集落交雑
化試験におけるＨＢＶ・ＤＮＡに対する１１．１カカ、
７９、／　（Ｊ　Ｄ　、、＋、ｊ　ｂ　ｖ、−１−へｆ
？　！’ｌ　？ｒ　ｕ　＋ｚ＋、＋ を示すポリペプチドの生産（ＶＡ　　）。この命名ヲ用
イレハ、培養物ｐＢＲ３，２２−ＩＢＭ−Ａは、プラス
ミドとして組換えＤＮＡ分子を含有するイー・コＩ）Ｈ
Ｂ１０／培萎物を示し、この組換えＤＮＡ分子はシ止１
部位で開裂されかつ３′末端にポ１７−　ｄＧ端部が伸
長化されたｐＢＲＪ２Ｚかラナシ、さらにＨＢＶ、ＤＮ
ＡはＫｐｎ、　ｌによシ開裂されかつ３′末端にポリー
ｄＣ端部が伸長化されており、また培養物はテトラサイ
クリン耐性とアンピシリン感受性と陽性のＨＢ　Ｖ　、
　ＤＮＡ交雑化試験とを示すと共にＨＢＶ抗原性を示す
ポリペプチドを生産する。
勿論、混成微生物、組換えＤＮＡ分子およびポリペプチ
ドならびにこれらに応用しうる本発明の方法は、上記の
好適具体例のみに限定されるものでないことを了解すべ
きである。寧ろ、混成生物、組換えＤＮＡ分子および゛
ポリペプチドは生産の途上でまたはその後に公知方法に
より有利シて改変することができる。たとえば、よシ効
果的な表現制御順序を利用してＨＢＶ遺伝子または混成
遺伝子の転写を得ることができ、また望ましくない遺伝
子生成物の合成を減少させるよう突然変異を導入するこ
とができ、また宿主細胞中のプロテアーゼレベルを減少
すせることもでき、さらにＨＢＶ遺伝子を含有する熱誘
導性リゾゲンを宿主クロモソーム中に一体化させること
ができ、或いはその他の改変および手順を行なって細胞
中の遺伝子コピーの数を増加させたシ所望ポリペプチド
を生産する細胞の生産性を増大させたシすることもでき
る。
ＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドを生産させるためのそ
れらの使用の他、本発明の混成微生物は、肝炎Ｂビール
スに対するゲノムの全部または一部を含有する大量のＤ
ＮＡを生産するのにも有用である。たとえば、細胞濃度
が適当なレベルに達した時成育培地にクロラムフェニコ
ールを添加することによる増殖、或−いは突然変異を用
いてＨＢＶ順序を含むバクテリオファージヒプリドにお
ける溶薗柚防止することは、従来得られなかった量のＨ
ＢＶ−ＤＮｋの製造を可能にする。
このように製造されたＨＢＶ−ＤＮＡを使用して、ゲノ
ムのヌクレオチド順序を決定することができ、これから
遺伝子ならびにＨＢＶ抗原および構造遺伝子自体のアミ
ノ酸順序を決定することができる。これら順序の知見は
、肝炎Ｂビールスの生物学を理群する上で役立ち、また
上記した改変を最も有利に用いることを可能にする。
上記の方法により製造された、固相放射免疫分析法によ
シ検出されるようなＨＢｃＡｇの合成能力を宿主細胞に
付与する一連の組換えＤＮＡ分子を順序分析のために使
用した。断片を適当な制限酵素での消化によ・シこれら
組換えＤＮＡ分子から調製し、この断片をそのよ′末端
に〔α−３２Ｐ’）ＡＴＰとＴ＋　ポリヌクレオチドキ
ナーゼとでラベルした。次いで各断片のヌクレオテッド
順序を周知の化学的分解法によシ決定した（ニー・エム
・マキサムおよびダブりニー・ギルバート、「ＤＮＡの
新規な順序決定方法」、プロシーディング・ナショナル
・アカデミー−サイエンス、　Ｕ、Ｓ、Ａ。
第７４’巻Ｘ！ＡＯ５−ｊＡ４頁（１５’７７）”）。
得られたヌクレオチット順序を第３〜り図に示す。参考
のため、順序には核遺伝子のＡＴＧ翻訳開始コドンのＡ
からナンバーを付する。
ＨＢ　ｃ　Ａ　ｇに関する遺伝子のヌクレオチド順序お
よびこの遺伝子から引出されるポリペプチドのアミノ酸
順序（読み枠ｌ）を第３〜り図においてヌクレオチット
ｌ〜よ≠りの間に示す。この遺伝子によシコード化され
るポリペプチドの寸法は、ディン粒子からの核抗原につ
いて観察された分子量／り０００に近いものである。し
かしながら、この構造決定は、若干のアミノ酸が標準抗
原の生成の際生体内でこのポリペプチドのアミン末端か
ら切除されうる可能性を排除しない。さらに、この構造
は、他のひと酵素たとえば蛋白質をクリコンル化（ｇｌ
ｙｃｏｓｏｌａｔｅ　）するような酵素との相互作用に
よシもたらされるポリペプチドへのその他または追加的
改変をも考慮に入れない。
したがって、ここで決定されたポリペプチド構造は生体
内に見出されるＨＢｃＡｇとは同一でないが、免疫反応
については同一でないにしろ極めて類似するであろう。
検査した組換えＤ　Ｎ　Ａ分子の全ては挿入されたＨＢ
Ｖ、ＤＮＡを有したので、核抗原遺伝子はｐＢＲＪ２Ｊ
のペニシリン耐性に関する遺伝子と同じ翻訳相に維持さ
れた。さらに、各種の組換え物において、ＨＢＶ、ＤＮ
Ａ挿入物はＨＢＶＪＩＩ序における同じ位置の７個もし
くは２個の（クレオチツド内で始まった。これら組換え
ＤＮＡ分子は各種の制限酵素（たとえば−シ！、・Ｉ（
ＩおよびＫｐｎ・工）で消化されたＨＢＶ・ＤＮＡから
生じたので、この独特な付加は驚異的でありかつナイン
粒子の内生Ｄ　Ｎ　Ａにおける割目でのＨＢＶ、ＤＮＡ
の偶発［ＭＩｆｒまたはポリヌクレオチド末端結合から
生じたのであろう（第１図）。異なる翻訳相中に１（Ｂ
Ｖ、ＤＮＡ挿入物を有する組換えＤＮＡ分子はＨＢｃＡ
ｇ遺伝子を表現せず、またこの種の組換えＤＮＡ分子に
より変異された宿主にはＨＢＶ抗原性を示すポリペプチ
ドが検出されなかった。勿論、この種の非遺伝子表現宿
主および組換えＤＮＡ分子も本発明によりＨＢＶ−ＤＮ
Ａを生産するのに有用である。
ＨＢＶ、ＤＮＡ挿入物の表現を介して生成されたＨＢｃ
Ａｇまたはその断片は少数のグリシン残基を介してペニ
シリナーゼ耐性に関する遺伝子の生成物（β−ラクタマ
ーゼ）に融合するであろうことが予測されたが、実際に
はそうで逓かった。寧ろ、各場合にβ−ラクタマーゼは
５〜２個のグリシンを介して同一のペプチド順序に融合
されたが、この順序は２を個のアミノ酸の後に終端した
。この読み枠（枠ｌ、第３図）において、停止コドン（
ＴＡＧ）に次いで３個のヌクレオチットが続き、その後
に開始コドンが続キ、そこから翻訳が妨げられずに続い
てペプチドに／♂３個のアミノ酸の長さを与える（第３
〜ｌｒ図）。
したがって、核抗原活性は、組換えＤＮＡ分子から転写
されたｍＲＮＡ内のＨＢＶ順序によシ初めから翻訳され
た約２　／、　０００ダルトンのポリペプチド中に存在
する。このポリペプチドは宿主細胞内に残存しない。何
故なら、これはＨＢＶ−ＤＮＡ挿入物の停止コドンおよ
び開始コドンの配置によシ分泌ペニシリナーゼ担体蛋白
質に結合されないからである。
２、肝炎３表面抗原 ＨＢｓＡｇに対する遺伝子のヌクレオチット順序および
この遺伝子から生ずるポリペプチドに対するアミノ酸順
序（読み枠３）も、第６〜ｇ図においてヌクレオチット
／４４３７〜２／／４１間に示される。このポリペプチ
ドのアミノ酸順序はＮ末端から始まって順序ｍｅｔ−ｇ
ｌｕ　−ａｓｎ−ｉｌｅ　−１ｈｒ−ｓｅｒを有する。
この最初のアミノ酸順序は、ディー・エル・ビーターソ
ン等、「肝炎３表面抗原の２つの主成分ポリペプチドの
部分的アミノ酸順序」、プロン−ディング−ナショナル
・アカデミー−サイエンヌ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、第７＋Ｌ巻
第１ｊ３０〜／！３４を頁（／り７７）によシ、標準ひ
とＨＢｓＡｇから決定された。この蛋白質のアミノ酸順
序は第６〜？図において停止コドンまで２−２６個のア
ミノ酸を続ける。この２２乙ポリペプチド順序は２よ弘
００ダルトンの蛋白質に相当する。
ＨＢｓＡｇのアミノ酸および長さは、ビー・バレンツエ
ラ等、「肝炎Ｂビールス表面抗原の主要蛋白質をコード
化する遺伝子のヌクレオチット順序」、ネーチャー誌、
第２１０巻、第１Ｉ！；〜ＩＩり頁（ｌり７り）により
、適当な組換えＤＮＡ分子を順序決定することによシ単
独に確認された。
本発明の組換えＤＮＡ分子について決定されたヌクレオ
チット順序は、ＨＢｃＡｇに対する遺伝子を表現した検
査されたもの全てが適当な宿主細胞内に表現されること
を期待する位置にＨＢｓＡｇＫ対する遺伝子を持ち得な
いことを示す。事実ｓ　ＨＢ　ｃ　Ａ　ｇに対する遺伝
子を表現することが見出されたプラスミドにより変異さ
せた細胞の抽出物には、ＨＢｓＡｇは検出されなかった
。しかしながら、上記したように、これら遺伝子のヌク
レオチット順序の知見は、表現過程の改変が収率と効果
とを向上させかつ遺伝子の表現と従来表現もしくは検出
されなかったポリペプチドの生産とを容易化するのを可
能にする。
これら抗原の遺伝子およびアミノ酸順序は、細菌細胞当
シの抗原または遺伝子の生産レベルを高める方法を設計
する際有用である。
蛋白質の生産レベルはλつの主要因子により支配される
。すなわち、細胞内の遺伝子のコピー数とこれら遺伝子
コピーを転写かつ翻訳する効率とである。転写および翻
訳（これは表現をも含む）の効率は、通常所望のコード
化用順序の前方（で位置するヌクレオチット順序に依存
する。これらのヌクレオチット順序または表現制御順序
は、特にＲＮＡポリメラーゼが相互反応して転写（促進
子順序）を開始しかつリポソームがｍＲＮＡ（転写の生
成物）と結合かつ相互反応して翻訳を開始する位置を規
定する。この種の表現制御順序全てが同等の効率をもっ
て機能するものではない。したがって、隣接するヌクレ
オチット順序から所望蛋白質に対する特異的コード化順
序を分離し、これらを公知の表現制御順序に融合させて
よシ高度の表現レベルを得ることが有利である。これは
達成されておシ、新たに処理されたＤＮＡ断片を多コピ
ープラスミドまたはバクテリオファージ誘導体中に導入
して、細胞内の遺伝子コピーの数を増加させそれによシ
表現蛋白質の収率をさらに・改善することができる。
例示の目的で、ＨＢｃＡｇの遺伝子について決定した順
序をこのようにして用いて、イー・コリにおけるＨＢｃ
Ａｇの生産を改善した。その一つの過程を第１０図に示
す。
第３図（ておけるＨＢｃＡｇについてのＤＮＡ順序を点
検すると、この遺伝子はヌクレオチット−２ｔにΔ凰・
１に対する目標（ＡＧＣＴ　）を有し、ヌクレオチット
２２および／！夕０に肪・ＲＩ　　に対する目標を有し
、２０りに旦二・Ｒ［Ｋ　対ｆ　ル目’Ｒ（ＯＣＴ　Ｇ
　Ｇ　）、２１０にＨａｅ−［１に対する目標（ＧＧＣ
Ｃ）また２弘６および４ＺＡ／にΔ２弓に対する目標（
ＧＧＡＣＣ，ＧＧＴＣＣ）を有することが判る。この複
雑性が与えられると、核抗原コード化順序をよシ効果的
な表現制御順序に２段階で移行させるのが便利である。
たとえば、本発明によシ製造されて約２３よＯ塩基対（
ヌクレオチット）、すなわち第３図のヌクレオチット−
１０〜約２２７０のＨＢＶ・ＤＮＡ挿入物を有する組換
えＤＮＡ分子をΔ堕・ＩおよびＥｃｏＲＩ　で消化する
と、特にヌクレオチット−２乙と２２との間に断片（断
片Ａ）を与える一方、旦輩声１　の単独消化はヌクレオ
チット２３〜ｌよ♂りに断片（断片Ｂ）を与えかつヌク
レオチット２３〜！７６における断片（断片Ｂ／）の収
率を低くする。これらの断片は第３〜弘図を参照して容
易に確認することができ、第１Ｏ図に図示する。断片Ａ
およびＢはゲル電気泳動によシ分別精製され、それらの
Ｅｃｏ・Ｒ１“を介して端部結合し、合体断片（断片Ｃ
）を与える。次いで、必要に応じ断片Ｃを直接結紮によ
シ新たな表現制御順序に付加させ、前記したようなＢ′
端部結合法を介しまたは合成的オリゴ−ヌクレオチット
結合を介して正しい翻訳相を維持する。この付加はよ）
良好な表現制御項′序を使用して蛋白質生産を改善させ
るだけでな（、ＨＢｃＡｇをコード化する遺伝子断片を
表現制御順序自身により近接して付加させそれによシそ
の遺伝子断片の表現の制御を向上させることも可能にす
る。同様にして、断片ＡおよびＢ′を合体させ、または
多くの他の調製断片を合体させ、得られた断片を上記の
ように使用することができる。この方法は、特定ポリペ
プチドをコード化する構造遺伝子の７部のみを本発明の
組換えＤＮＡ分子（ｐＨＢＶ／／≠）に使用する需要が
あることを示している。
選択された遺伝子断片の特定表現制御順序と開始コドン
との間の距離をさらに短縮するため、特定断片をその末
端でまたは末端近くで特異的に作用するヌクレアーゼの
組合せ物によシ軽く処理するかまたはエキソヌクレアー
ゼおよびポリメラーゼ結合修復反応に使用して、断片の
開始コドンに先行する断片のヌクレオチットの全てまた
は幾つかを除去することができる。或いは、ヌクレオチ
ット、２４および３０で開裂して生ずるたとえばΔ曳・
■断片のような断片を同様にエキソヌクレアーゼ処理ま
たはポリメラーゼ結合修復反応によシ短縮させ、次いで
ＥｃｏＲＩ　　で開裂させてヌクレオチット−２６およ
びｌとヌクレオチット２−２との間から断片をもたらし
、断片ＢＫ融合させた後に表現制御順序に付加させるこ
とができる。別の経路は断片Ｂまたは同等の断片の交雑
化を包含し、これはＤＮＡポリメラーゼおよび限られた
数のヌクレオシドトリホスフェートとの一連の反応にお
いて伸長の念め元の組換えＤＮＡ分子から適当な単一ス
トランド雛型に対して行なわれ、したがって断片ストラ
ンドはコード化順序の初めに再構成することができるで
あろう。次いで雛型ストランドを伸長断片ストランドに
関連する位置においてエンドヌクレアーゼＳ／によＩ）
開裂させ、そして得られた断片を表現制御ｊ順序に付加
させる。
幾つかの表現制御順序は、上記したように使用すること
ができる。これらは、イー・コリの乳糖オペロン（睡五
系」）の作動子、促進子およびリポソーム結合および作
用順序（たとえばシャインーダルガＶ順序のような順序
を含む）、イー・コリのトリプトファン合成酵素系（「
、！二基」）の対応するＪｌｉ序、２アージλの主要作
動子および促進予成（０ＬＰＬおよび０ａＰｎ”）なら
びにファージｒｄ被覆蛋白質の制御域を包含する。、こ
れら順序金含有するＤＮＡ＠片は、二もしくはｔｒｐオ
ペロンを担持する変換用ファージから単離されたＤＮＡ
からまたはファージλもしくはｆｄのＤＮＡから制限酵
素での開裂ンこよりαり出される。次いで、これら断片
をＨＢＶ抗原順序ニアｉ：ついて記載したように処理し
て限られた数の分子を得、重要な制御順序を断片Ｃにつ
いて上記したよって所望抗原に対するコード化順序の開
始コドンに極めて近接してまたはこれば並列させて結合
させることができる。
次いで、融合生成物を上記のようにクローン用ベヒクル
中に挿入して適当な宿主を変異させ、抗原生産レベルを
細胞の溶解の後に放射免疫分析により測定する。最も効
果的な表現を与える細胞はこのように選択することがで
きる。或いは、開始コドンに付加されたＩａｃ、　　ｔ
ｒｐもしくはλＰＬ制御系を担持するクローン用ベヒク
ルを使用して、これをＨＢＶ抗原性を示すポリペプチド
をコード化する順序を持った断片に融合させ、構造遺伝
子断片をクローン用ベヒクルの開始コドンから正確に翻
訳する。
これらの実、験を特にＨＢＶ核抗原の生産に関連させた
が、これらはたとえばＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇ遺伝
子ならびにその断片のような他の遺伝子の表現を改良す
るのにも使用することができる。
これら特定抗原の細胞収率における増加は、細胞中に使
用しうる遺伝子の数の増加に依存する。これは、例示の
目的であるが、上記したように得られた組換えＤＮＡ分
子を雛型バクテリオファージλ（ＮＭ９１り）中に挿入
することによシ達成され、最も簡単にはプラスミドを制
限酵素、たとえば旦認・Ｒ１または一旦旦迭・■で消化
して線状分子を与え、次いでこれを制限ファージスクロ
ーン用ベヒクル〔たとえばニヌ・イー・ムレ−等、「組
換え体の試験管内シておける回収を簡易化するラムダ型
ファージ」、モレキュラー・ジーン・ゲネティック、第
７６０巻第！３〜Ｊ／頁（／り７７）およびエヌ・イー
・ムレ−等、「バクテリオファージＴμからのＤＮＡリ
ガーゼ遺伝子の分子無性増殖」、ジャーナル・モレキュ
ラー−バイオロジー、第１３２巻第Ｖり３〜！Ｏ！頁（
／り７り）に記載された種類〕と混合し、そして組換え
ＤＮＡ分子をＤＮＡＩＪガーゼとの培養によシ生成させ
る。このような手順を第１／図に示す。次いで、所望の
組換えファージを、特定抗原に対する放射免疫分析によ
シまたは放射ラベルしたＨＢＶ、ＤＮＡ順序との交雑化
によシ選択して、イー・コリの宿主株を溶菌化するのに
使用した。
特に有用なλクローン用ベヒクルは抑圧遺伝子ＣＩにお
ける感温性突然変異株および遺伝子旦における抑圧側突
然変異株を含み、その生成物は宿主細胞の溶解に必要で
あシ、さらに遺伝子Ｅに関するものも含みその生成物は
ビールスの主要なカプシド蛋白質である。この方式によ
れば、溶解性細胞をＪ、！”ＣＫて成育せしめ、次いで
弘！℃に加熱してグロファージの刃出を誘発させる。３
７℃〈で長期成育させると高レベルの抗原生産をもたら
し、これが細胞内に保持される。何故なら、これらはフ
ァージ遺伝子生成物により通常のようには溶解されない
からであシ、またファージ遺伝子挿入物はカプセル化さ
れないので、それは転写用として使用可能に留まるから
である。次いで、細胞の人工的溶解は抗原を高収率で遊
離させる（第１／図）。
これら実施例が原理的に関係するイー・コリ系に加え、
同じ型の処理を行なって、たとえば、バチルス・ズブチ
リス、すなわち耐熱性細菌または酵母およびカビのよう
な他の微生物細胞或いは培養動物または植物細胞におい
て抗原生産レベルを増大させることができる。バチルス
・ズブチリスの場合、バチルス・リヒエニホルミスから
単離されたベニシリナーゼの決定子を担持するプラスミ
ドはこれら目的に有用な表現制御順序を提供する。
ＨＢｓＡｇについて決定した遺伝子およびアミノ酸順序
は、本発明の方法によりＨＢｓＡｇに対する遺伝子の表
現を可能にする方法を設計する際に有用である。このよ
うな表現は、ＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドを生成し
た組換えＤＮＡ分子によシ変異させた宿主において従来
観察されなかった。
第２−に図のヌクレオチット順序は、ヌクレオチット／
≠３７と２／／弘との間のＨＢｓＡｇをコード化する遺
伝子を示す。この遺伝子は、第３〜り図のＨＢ　Ｖゲノ
ムにおけるＨＢｃＡｇをコード化する遺伝子（読み枠／
）とは異なる翻訳相（読み枠３）にある。したがって、
適当な宿主を変異させるために使用された時ＨＢｃＡｇ
を生成しなかったが、約２３６０個のヌクレオチット（
第３〜ｒ図の順序のヌクレオチット−♂Ｑ、２２７０に
ほぼ相通する）のＨＢＶ、ＤＮＡ挿入物を含有する組換
えＤＮＡ分子をＨＢ　ｓ　Ａｇ生産に使用するため選択
した。
選択された組換えＤＮＡ分子は、特ＫＨＢｓＡｇをコー
ド化する全遺伝子を含有した。この組換えＤＮＡ分子の
ＨＢＶ、ＤＮＡ挿入物のヌクレオチット順序を検査する
と、ＨＢＳＡｇをコード化する遺伝子を含有する断片の
％＋１出を可能にする幾つかの制限エンドヌクレアーゼ
目標が示される。たとえば、ヌクレオチット／弘Ｏり（
Ｘｈｏ）、ヌクレオチット／　ＩＡ／　０　（Ｔａｇ　
）、ヌクレオチント／ｌＡＯり（ＡｖａｌＬ　およびヌ
クレオチット／≠２ｇ（Ｈｈａ　ｌ　）　（第６図）。
これらのうち最後のもの（Ｈｈａｌ）は特に有用である
。何故なら、ＨＢＶ・ＤＮＡ挿入物の開裂はヌクレオチ
ット／弘３０と／≠３７との間で起こシ、ＨＢｓＡｇ゛
自身に対する遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の前方
に僅か６個のヌクレオチットが存在するからである。弘
種の場合全てにおいて、創出された断片は、選択された
ＨＢＶ・ＤＮＡ挿入物を越えて、組換えＤＮＡ分子のｐ
ＢＲ３，２２部分のヌクレオチット順序内に位置する特
定制限エンドヌクレアーゼに対する目標まで延在する。
したがって、これら制限エンドヌクレアーゼおよびその
他面様に有用なものを単独または組合せて使用すると、
開始コドンの近辺であるかその前方と翻訳終末コドンの
後とにおいてＨＢｓＡｇをコード化する遺伝子の割出が
可能となる。勿論、ＨＢｃＡｇに対する遺伝子の場合に
示したように、全遺伝子の断片のみを組換えＤＮＡ分子
中に実際使用し、適当な宿主においてＨＢｓＡｇ抗原性
を示すポリヌクレオチットを生成させうることか了解さ
れよう。
このような消化物から生ずるＨＢＶ・ＤＮＡの断片を、
核抗原をコード化する遺伝子および遺伝子断片について
記載したものに類似した一連の反応で処理した。たとえ
ば、遺伝子断片をｐＢＲＪｕ２のペニシリン耐性をコー
ド化する遺伝子（たとえばＬ■１ｍ別部位、第２図）中
に挿入してＨＢｓＡｇ抗原性を示すポリペプチドをβ−
ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ遺伝子の生成物）と融合
させて生成させることができ、遺伝子断片をｐＢＲ３２
２におけるペニシリン耐性をコード化する遺伝子とテト
ラサブ、タリン耐性をコード化する遺伝子との間（Ｅｃ
ｏ・Ｒ１またはＨｉｎｄ　［１識別部位、第２図）に挿
入して、これをそこでまたは挿入前に一堕二系表現制御
順序て結合することによ５ＨＢｓＡｇ抗原性を示すポリ
ペプチドを生成させてｌａｃ系のβ−ガラクトシダーゼ
蛋白質に融合させることができ、遺伝子断片を、ＨＢｃ
Ａｇをコード化する遺伝子について前記したと同様に、
選択された表現側［Ｒ順序自身にできるだけ近接してク
ローン用ベヒクル中に挿入することができ、或いは遺伝
子断片を本発明によシ記載したと同様に無性増殖させる
ことができる。
例示の目的で、一つのこの種の方法を第１２図に示す。
ここで、はぼヌクレオチット−♂Ｏと２２７０（第３〜
ｒ図）との間に延在したＨＢＶ−ＤＮＡ挿入物を有する
選択組換えＤＮＡ分子をＨｈａ・Ｉでの消化によシ断片
化させた。
得られた断片を、前記した３′末端結合法によｐ　ｐＢ
Ｆｔ！２２のヱ隻１部位に挿入した。この組換えＤＮＡ
分子により変異させた宿主は、ＨＢｓＡｇ抗原性を示す
ポリペプチドを生成した。
他の断片（たとえば臼１、二、ＸｈｏまたはＰｓｔｌ（
部分消化））をもｐＢＲＪ２２におけるＰｓｔ　ｌ識別
部位または他の部位に挿入して、ＨＢｓＡｇ抗原性を示
すポリペプチドまたはＨＢｓＡｇをコード化する遺伝子
断片の生産に有用な組換えＤＮＡ分子を生成させた。
さらに、この種の遺伝子断片をＰｓｔ　ｌによシ開裂さ
れたρＢＲ３２２に挿入し、次いで得られたベニシリナ
ーゼをコード化する遺伝子の断片ヲ、ヘニシリナーゼま
たはβ−ラクタマーゼのアミノ酸ｌ♂λをコード化する
コドンから成る場合Ｋｆｄアミノ酸３λをコード化する
コドンへとまた他の場合にはそのポリペプチドのアミノ
酸／３をコード化するコドンへと切シ離す。またｐＢＲ
Ｊ　２２−Ｐｓｔ−１’のこれら誘導化プラスミドをヌ
クレオチットｌ≠≠７から１７り乙まで延在するＨＢｓ
Ａｇ遺伝子断片（第３〜７図）と共に使用してＨＢｓＡ
ｇ抗原性を示すポリペプチドを生成させた。
ＨＢｓＡｇをコード化する構造遺伝子の直前におけるヌ
クレオチット２≠ｌ〜／弘３７間のヌクレオチット順序
を使用断片中に含ませて、ＨＢｓＡｇ抗原性を示すポリ
ペプチドおよびＨＢｓＡｇに対する構造遺伝子の遺伝子
断片を生産するのに有用な組換えＤＮＡ分子を生成させ
ることもできる。このヌクレオチット順序は、遺伝子の
先駆本１１＠序と呼ばれる。この先駆体順序とＨＢｓＡ
ｇに対する構造遺伝子との両者を含む遺伝子断片をＡｌ
ｕ−１（ヌクレオチツドタ３り）、Ｈｈａ−■（ヌクレ
オチツドタ００）または旦狂・■（ヌクレオチットｒタ
タ）によシ創出することができる。Ａｌｕ−１およびＨ
ｈａ・Ｉの場合、部分消化と得られた断片のたとえばゲ
ル電気泳動による分離とが必要である。何故なら、これ
ら酵素に対する識別部位は、先駆体順序内において、Ａ
ｌｕ・■についてはヌクレオチット１０り／［また旦匣
・■についてはヌクレオチット／１１．！１にも生ずる
からである。
以上、本発明の多くの具体９１１について記載したが、
この基本構成を変化させて、本発明方法を使用する他の
具体例を与えることもできることが明白である。したが
って、本発明の範囲は例示した特定実施例によシ規定さ
るべきでなく、特許請求の範囲の記載によシ規定さるべ
きであることが了解されよう。
不明細書中ｔＣ記載した方法によシ調製した微生物は、
／り７り年／２月／り日にスコツトランド、アバディー
ン在のザ・カルチャー・コレクション・オブ・ザ・ナシ
ョナル・；レクション命オブ・インダストリアル・バク
テリア　（ＴｈｅＣｕＨｕｒｅ　Ｃｏ１１Ｃｃｔｉｏｎ
　ｏｒ　Ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉ
ｏｎｏｒ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｂａｃ’ｔｅｒｉａ
　）　　に寄託されかつｐＢＲＪコｕ−ＨＢＶ−Ｇ−Ｌ
と同定された培養物はよシ例示され、次のような特性を
有する。
Ｇ：イー・コリＩＩＢＩＯＩ　／　ｐＢＲ３２２−Ｐｓ
ｔ　Ｉ　ｄＧ　：）ＩＢＶ−Ｋｐｎ　Ｉ　ｄＣ（以下、
＠ｐＨＢＶ１１４　”　）：　　Ｔｅｔ’Ａａ＋ｐ’Ｈ
ＢＶ士 Ｈ：イー・コリＨＢＩＯＩ　／　ｐＢＲ３２２−カ±ビ
ｄＧ：ｐＨＢＶ１１４−Ｐｓｔ　Ｉ　：　Ｔｅｔ”Ａｍ
ｐ’１ｉＢＶ”ＶＡ”■：イー・コリＩ（８１０１／　
（（ｐＢＲ３２２−亜１？Ｉ。
と旧ニーり匹−プロモータ配列） ４ｉｎｄ　Ｈｌリンカー：　ＨＢＶ１１４−）１ｈａ　
ＩＲａｍ　Ｈ（：　Ｔｅｔ’ＡｍｐＨＥＩＶ”ＶＡ士Ｊ
：イー・コリＨＢＩＯＩ　／１）ＩＪＲ２ＥＣＱ　Ｒ１
：　ＨＢＶ１１４−Ｈｈａ　Ｉ　Ｅｃｏ　ＲＩ　　リン
カー：　ＴｅＬ’Ａｍｐ”）ＩＢＶ”ＶＡ十 に：イー・コリ８８１０１　／ｐＢＲ３２２−ＰｓＬ　
ｒ　ｄＧ　：ｐ）ＩＢＶ１１４−Ａｖａ　Ｉ　ｄＣＴｅ
ｔ”Ａｍｐ’ＨＢｌ／”ＶＡ”Ｌ：イー・コリＨＢＩＯ
Ｉ　／　ｐＢＲ３２２垣１ｄＧ：ｐ）ｌＢＶ１１４−Ｔ
ａｑ　ｄＣＴｅＬ”Ａｃｐ’）ＩＢＶ’ＶＡ”※　：テ
トラテイクリン耐性についてのポリペプチドをコード化
する遺伝子を含む ＤＮＡ順序を持ったｐＢＲＪ２２の誘導体を、イー・コ
リＩａｃ系を含むよシ小さいＤＮＡ順序で置き換えた。
【図面の簡単な説明】
第１図はディン粒子の内生ＤＮＡの構造を示す略図であ
シ、第２図は本発明方法の好適具体例の略説明図であ）
、第３〜り図は本発明により　肝炎Ｂビールスゲノムの
一部について決定したヌクレオチット順序の説明図であ
シ、第１Ｑ図は肝炎Ｂビールス核抗原を示すポリペプチ
ドを生産することのできる組換えＤＮＡ分子を断片化し
、その断片を改善表現制御頭圧に結合させる本発明方法
の略説明図であり、第１／図は本発明方法の略説明図で
あり、第７２図は本発明方法の他の具体例の略説明図で
ある。 特許量９人　パイオゲン　ナームローズ　ベンノットシ
ャツ２　　　　　　　　　　■ 石ｊ　　　　　　　　　　　　　　甲 手続？ｉｌｌ　　　ｊ”’Ｉ＝　　　’ｔＪｔＦ　　に
Ｉ’Ｄい昭和６２年　９月Ｚ２日

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原をコードするＤＮＡ配
    列もしくはその断片、Ｂ型肝炎ウィルス核抗原をコード
    するＤＮＡ配列もしくはその断片、および前記ＤＮＡ配
    列もしくは断片をその１部として有するＤＮＡ配列より
    なる群から選択させたＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分
    子によつて形質転換された宿主により産生されるＨＢＶ
    抗原性を示す少なくとも１種のポリペプチドをコードす
    るＤＮＡ配列からなり、前記ＤＮＡ配列は前記組換えＤ
    ＮＡ分子における発現制御配列に作用結合されかつ発現
    して、前記組換えＤＮＡ分子で形質転換された単細胞宿
    主を培養した際にＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドを産
    生することを特徴とするＤＮＡ配列。
  2. （２）式： 【遺伝子配列があります】 のＤＮＡ配列およびＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドを
    コードするその断片よりなる群から選択される特許請求
    の範囲第１項記載のＤＮＡ配列。
  3. （３）式： 【遺伝子配列があります】 のＤＮＡ配列およびＨＢＶ抗原性を示すポリペプチドを
    コードするその断片よりなる群から選択される特許請求
    の範囲第１項記載のＤＮＡ配列。
  4. （４）特許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記
    載の少なくとも１種のＤＮＡ配列を特徴とする血清にお
    けるＨＢＶ感染を検出する装置。
  5. （５）特許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記
    載のＤＮＡ配列を用いることを特徴とするヒトにおける
    Ｂ型肝炎ウィルス感染の存在を検出する方法。
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