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JP2527438B2 - Ｂ型肝炎ウイルス抗原性を示すポリペプチドをコ−ドするｄｎａ配列 - Google Patents

Ｂ型肝炎ウイルス抗原性を示すポリペプチドをコ−ドするｄｎａ配列

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JP2527438B2
JP2527438B2 JP62112628A JP11262887A JP2527438B2 JP 2527438 B2 JP2527438 B2 JP 2527438B2 JP 62112628 A JP62112628 A JP 62112628A JP 11262887 A JP11262887 A JP 11262887A JP 2527438 B2 JP2527438 B2 JP 2527438B2
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hbv
gene
hepatitis
polypeptide
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マレー ケネス
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バイオゲン インコーポレイテッド
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Publication date
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の要約 組換えDNA分子およびそれにより変異されてHBV抗原性
を示すポリペプチドとそれをコード化する遺伝子とを生
産する宿主、ならびにこれらの分子、宿主、遺伝子およ
びポリペプチドの製造および使用方法が開示される。本
発明の組換えDNA分子は、HBV抗原性を示す少なくとも１
種のポリペプチドをコード化する構造遺伝子を特徴とす
る。適当な宿主において、これら組換えDNA分子は、HBV
抗原性を特徴とする遺伝子およびポリペプチドの生産お
よび同定と、組成物中におけるそれらの使用と、人間に
おけるHBVビールス感染を検出してこの感染に対する抗
体の生産を刺戟する方法とを可能にする。
本発明は、組換えDNA分子およびその製造方法に関す
るものである。さらに詳細には、本発明は、適当な宿主
生物において表現される組換えDNA分子に関するもので
ある。本明細書中に開示する組換えDNA分子は、肝炎Ｂ
ビールス抗原の特異性を有するポリペプチドをコード化
するDNAが特徴である。以下の記載から了解されるよう
に、組換えDNA分子は、人間における肝炎Ｂビールスの
検出およびこのビールスに対する人間における抗体の刺
戟のために使用することができる。
肝炎Ｂすなわち血清肝炎を引き起こすビールスは、人
間のみに感染すると思われ、人間における肝炎Ｂビール
ス（「HBV」）感染は蔓延している。英国、米国および
西欧において、全供血者の約0.1％はHBVの慢性保菌者で
ある。ビールス性肝炎による死亡率は高くないが（英国
において1975年には100万人当り３人であつた）、英国
における人口の５％および米国における人口の15％とい
う多くが感染していると示されている。多くのアフリカ
およびアジア諸国においては、人口の20％までがHBVの
慢性保菌者であり、これら諸国における全成人の50％以
上がHBVに感染したかまたは感染している。
肝炎の感染は、３つの一般的機作によつて伝染され
る。すなわち、（１）輸血におけるような多量でまたは
事故による皮膚刺通を介するような少量で、感染された
血液もしくは体液が非経口的に接種されることによるも
の、（２）近親または性交渉によるもの、および（３）
妊娠中に感染した母親が新生児にビールスを移すことに
よるものである。自然条件下では、HBVは大して感染性
の高いものでない。呼吸による伝染は、あつたとしても
稀である。
大抵のHBV感染は準臨床的のものである。臨床的疾病
は通常３〜６週間続き、疾病度において軟度乃至急性電
撃肝炎次いで肝硬変または死亡までの範囲にわたる。臨
床的および準臨床的なHBV感染からの回復は通常完全で
ある。しかしながら、或る場合には重度の長期結果が生
ずる。（１）急性感染の約５％は肝炎Ｂビールス抗原の
慢性保有者であり、他人に対する感染潜在力を継続して
有すると共に肝臓損傷を進行させており、また（２）HB
Vによる過去の感染は慢性型活性肝炎、肝硬変および第
一期肝臓癌というHBV−血清陰性例の相当な割合を開始
させる完全なまたは部分的な原因となりうる。
分子生物学における最近の進歩は、特異的非細菌性成
熟核蛋白質をコード化するDNAを細菌細胞中に導入する
ことを可能にした。一般に、化学合成により製造したも
の以外のDNAを用いる場合、組換えDNA分子の構成は、所
望の蛋白質に対する精製メツセンジヤー（mRNA）雛型の
単一鎖DNAコピー（cDNA）を生成させ、このcDNAを二重
鎖DNAに変換し、このDNAを適当なクローン用ベヒクル
（cloning vehicle）における適当な部位に結合させそ
してその組換えDNA分子により適当な宿主を変異させる
手順からなつている。このような変異により、宿主は所
望の蛋白質を生産することが可能になる。さらに、少な
くともオバルブミンDNAの場合、強力な細菌促進子また
は表現調節順序に対する特定DNAの適当な融合は、より
大量の所望オバルブミン蛋白質、すなわち大腸菌（E.co
li）細胞の全蛋白質の約0.5〜１％を生成させることが
知られている（オー・メルセロー−プイジヤロン等、
「組換えプラスミドを有するイー・コリK12によるオバ
ルブミン状蛋白質の合成」、ネーチヤー誌第275巻第505
〜510頁（1978）ならびにテイー・エツチ・フレーザー
およびビー・ジエー・ブルース、「雛鳥オバルブミンは
イー・コリにより合成かつ分泌される」、プロシーデイ
ング・ナシヨナル・アカデミー・サイエンス、U.S.A.、
第75巻、第5936〜5940頁（1978））。
数種の非細菌性蛋白質および遺伝子が、組換えDNA技
術を用いて合成された。これらには、ラツテのプロイン
シユリン抗原決定子を示す蛋白質（エル・ヴイラ−コマ
ロフ等、「プロインシユリンを合成する細菌クロー
ン」、プロシーデイング・ナシヨナル・アカデミー・サ
イエンス、U.S.A.、第75巻、第3727〜3731頁（197
8））、ラツテの成長ホルモン（ピー・エツチ・シーブ
ルク等、「細菌による成長ホルモンの合成」、ネーチヤ
ー誌、第276巻、第795〜798頁（1978））、ねずみのジ
ヒドロフオレートレダクターゼ（エー・シー・ワイ・チ
ヤング等、「ねずみのジヒドロフオレートレダクターゼ
をコード化するDNA順序のイー・コリにおける表現型
式」、ネーチヤー誌、第275巻、第617〜624頁（197
8））、ソマトスタチン（ケー・イタクラ等、「ソマト
スタチンホルモンに対する化学合成された遺伝子のイー
・コリにおける表現」、サイエンス誌、第198巻、第105
6〜1063頁（1977）、ならびに英国特許第2,007,675A
号、第2,007,676A号および第2,008,123A号明細書および
それらの他国出願）、およびひとインシユリンのＡおよ
びＢポリペプチド鎖（デイー・ヴイー・ゲデル等、「ひ
とインシユリンに対する化学合成された遺伝子のイー・
コリにおける表現」、プロシーデイング・ナシヨナル・
アカデミー・サイエンス、U.S.A.、第76巻、第106〜110
頁（1979）および上記英国特許明細書）が包含される。
しかしながら、本発明とは異なり、上記のものはいず
れもたとえば肝炎Ｂビールス抗原のようなビールス性蛋
白質の組換えDNA合成に向けられていない。
HBV感染は、ビールスの抗原に対して抗体の発生を惹
起することが知られている。これらの抗体は、HBV感染
に対する人体の防禦メカニズムである。露呈前における
或いは潜在露呈の場合における急速なこの種の抗体の発
生は、ビールス繁殖を実質的に減少させかつ撲滅すると
共に患者中に広がる。
しかしながら、肝炎Ｂビールスの抗原に対する人工的
刺戟による抗体の発生の問題は、このビールスの限られ
た宿主範囲に生ずる。たとえば、人間に対し極めて感染
度が高いが、肝炎Ｂビールスによる実験的感染は、その
他二三の霊長類にしか得られなかつた。また、このビー
ルスは組織培養においては繁殖されなかつた。この限ら
れた宿主範囲および組織培養細胞の感染不能は、ビール
スとその感染病理学の特性化ならびに迅速検出手段と感
染抑制および予防の効果的手段の開発を著しく妨げてい
る。
抗体を発生させまた感染を検知するため、HBV感染の
犠牲者から単離された真正HBVビールス抗原を使用する
試みが幾つかなされたが、これらの処置は活性株の供給
に限度があるため一般的に利用できない。さらに、これ
ら抗原を得るため人間を原材料として使用することは、
人間の単離物を使用する際の周知された汚染問題のため
好ましくない。
本発明は、HBV抗原性を示すポリペプチドをコード化
する構造遺伝子を特徴とする組換えDNA分子を本発明に
より提供して上記の諸問題を解決する。
本発明によれば、ワクチン製造のためならびにビール
ス感染の検知およびその病理学と分子生物学の決定に使
用するため、HBV抗原および遺伝子を汚染されていない
かなりの量で得ることが可能となる。このような供給物
は、このビールスの狭い宿主範囲および組織培養におけ
る繁殖不能のため、従来入手できなかつた。
以下の記載から判るように、本発明の組換えDNA分子
は、適当な宿主において、HBV抗原性を示す少なくとも
１種のビールス性ポリペプチドおよびそれをコード化す
る構造遺伝子を生成させることができる。これら組換え
DNA分子と宿主とを用いて、HBV抗原性を示すポリペプチ
ドとこれらポリペプチドをコード化する構造遺伝子とを
製造することができる。これら生産物はまた同定かつ特
性化されうると共に、宿主中で生成されたままの状態で
或いは適当に誘導体化もしくは改変した後に、これら生
産物自身の製造を改善する組成物および方法に使用で
き、またHBV感染を検知し、その病理学を追跡しかつ人
間におけるHBV抗体の生産を刺戟する組成物および方法
に使用することができる。
さらに本発明によれば、デイン粒子（Daneparticle）
の内生DNAから調製されたDNA順序をデイン粒子以外の材
料源から調製された他のDNA順序に結合させることを特
徴とする、組換えDNA分子の製造方法が提供される。
本発明の方法は、上記した従来の方法とは次の点で区
別することができる。すなわち、従来法はいずれも組換
えDNA分子を構成するための特定蛋白質を得る目的でま
たこの蛋白質もしくは遺伝子を生産する目的で天然遺伝
子またはDNAを使用しない。その代りとして、従来法は
化学合成により作られた合成遺伝子またはcDNA順序を作
り出すため供与体細胞から単離されたmRNAを酵素的に転
写することにより作られた人工遺伝子のいずれかを使用
する。
蛋白質の組換えDNA合成において天然DNAが従来直接に
使用されなかつた理由の一つは、大抵の高等生物からの
天然DNAおよび少なくとも或る種の動物ビールスが「イ
ントロン（Intron）」すなわち付加的なヌクレオチツド
順序を遺伝子の一部として含有することである。これら
イントロンは、遺伝子の最終的伝達体の一部を形成しな
い。寧ろ、それらは高等生物において一次転写生成物に
作用する特殊処理酵素により生体内で除去されて遺伝子
の最終的メツセンジヤー（mRNA）を与える。細菌はこの
ようなイントロンを処理するのに使用できないと思わ
れ、したがつて天然DNAは細菌宿主において表現するこ
とが期待されずまた所望の蛋白質はこれら宿主により生
産することが期待されないであろう。
第１図は、デイン粒子の内生DNAの構造を示す略図で
ある。これは２本の補完的DNA鎖すなわちストランドａ
とｂとを示し、さらにストランドａにおける刻目とスト
ランドｂにおける間隙とを示すと共にこの間隙がDNAポ
リメラーゼ反応により閉鎖されることを示している。
第２図は、本発明方法の好適具体例の略説明図であ
り、デイン粒子から単離された内生DNAの断片は大腸菌
（イー・コリ）ペニシリナーゼ遺伝子に対しプラズミド
pBR322上のPst I部位に融合される。イー・コリHB101に
変異した後、組換えDNA分子pBR322−Pst I dG:HBV−Kpn
I dCはHBV抗原性を示すポリペプチドの合成に向けられ
る。
第３〜９図は、本発明により肝炎Ｂビールスゲノムの
一部について決定されたヌクレオチツド順序を示してい
る。順序は、その上部に示された３つの読み枠における
停止コドンにより示される。本発明で決定されたHBcAg
をコード化する遺伝子については、開始コドンから任意
にナンバーが付される。ヌクレオチツド−80〜−１はこ
の遺伝子に先行する主順序を示す。ヌクレオチツド１〜
549は肝炎Ｂビールス核抗原をコード化する遺伝子につ
きヌクレオチツド順序を示し、この抗原のアミノ酸順序
（読み枠１）はその順序の上部に示される。ヌクレオチ
ツド1437〜2114は肝炎Ｂビールス表面抗原の遺伝子につ
き決定されたヌクレオチツド順序を示し、この抗原のア
ミノ酸順序（読み枠３）はその順序の上部に示される。
これら遺伝子における各種の制限エンドヌクレアーゼ識
別部位についても第３〜９図に示される。
第10図は、本発明方法の略説明図であり、ここで肝炎
Ｂビールス核抗原性を示すポリペプチドを生産すること
のできる組換えDNA分子は断片化され、この断片は改善
された表現制御順序、すなわちlac系に付加される。
第11図は、本発明方法の略説明図であり、ここで本発
明の組換えDNA分子は断片化されかつフアージDNAの断片
に結合され、これは宿主細胞を溶菌させることによりそ
の中に遺伝子コピーの数を増加させる際に使用される。
第12図は、本発明方法の別の具体例の略説明図であ
り、ここで肝炎Ｂビールス核抗原性を示すポリペプチド
を生産しない本発明の組換えDNA分子は断片化されてHBs
Agに対する構造遺伝子が除去され、この構造遺伝子を使
用して組換えDNA分子を生成させ、それにより適当な宿
主においてHBsAgを生産する。
本発明をさらに充分理解しうるよう、以下詳細に説明
する。
以下の記載において、下記の用語を使用する。
ヌクレオチツド：糖部分（ペントース）と燐酸部分と窒
素系複素環塩基とからなるDNAもしくはRNAの単量体単
位。この塩基はグリコシド炭素（ペントースの１′炭
素）を介して糖部分に結合され、塩基と糖との結合物は
ヌクレオシドである。塩基はヌクレオチツドを特性化す
る。４種のDNA塩基はアデニン（“A"）、グアニン
（“G"）、シトシン（“C"）およびチミン（“T"）であ
る。４種のRNA塩基はＡ、Ｇ、Ｃおよびウラシル
（“U"）である。
DNA順序：隣接するペントースの３′炭素と５′炭素と
の間のホスホジエステル結合により互いに結合されたヌ
クレオチツドの線状系列。
コドン:mRNAを介してアミノ酸、翻訳開始信号または翻
訳終了信号をコード化する３種のヌクレオチツド（トリ
プレツト）のDNA順序。たとえば、ヌクレオチツドトリ
プレツトTTA、TTG、CTT、CTC、CTAおよびCTGはアミノ酸
ロイシン（“Leu"）をコード化し、TAG、TAAおよびTGA
は翻訳停止信号であり、ATGは翻訳開始信号である。
読み枠:mRNAをアミノ酸順序に翻訳する際のコドンのグ
ループ化。翻訳の間、適正な読み枠は維持されねばなら
ない。たとえば、順序GCTGGTTGTAAGを３つの読み枠もし
くは相において翻訳することができ、その各々は異なる
アミノ酸順序を与える。すなわち、GCT GGT TGT AAG:Ala−Gly−Cys−Lys G CTG GTT GTA AG:Leu−Val−Val GC TGG TTG TAA A:Trp−Leu（停止） ポリペプチド：隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカル
ボキシ基との間のペプチド結合により互いに結合された
アミノ酸の線状系列。
ゲノム：物質の全DNA。これは特に物質のポリペプチド
をコード化する構造遺伝子、ならびに作動子、促進子お
よびたとえばシヤイン−ダルガルノ順序のような順序を
含むリボソーム結合および相互作用順序を包含する。
構造遺伝子：雛型またはメツセンジヤーRNA（“mRNA"）
を介して特定ポリペプチドに特性的なアミノ酸の順序を
コード化するDNA順序。
転写：構造遺伝子からmRNAを生成させる過程。
翻訳:mRNAからポリペプチドを生成させる過程。
表現：構造遺伝子によりポリペプチドを生成させるため
に受ける過程。これは転写と翻訳との組合せである。
プラスミド：完全「レプリコン」からなる非クロモソー
ム二重鎖DNA順序であり、これによりプラスミドは宿主
細胞内で再現される。プラスミドを単細胞生物に入れる
と、その生物の特性がプラスミドのDNAの結果として変
化または変異する。たとえば、テトラサイクリン耐性
（TetR）についての遺伝子を担持するプラスミドは従前
テトラサイクリンに敏感であつた細胞をこれに対し抵抗
性の細胞に変異させる。プラスミドにより変異された細
胞を「変異体（トランスホーマント）」と呼ぶ。
フアージまたはバクテリオフアージ：細胞性ビールスで
あり、その多くは蛋白質エンベロプもしくは被覆（「カ
プシド」）中にカプセル化されたDNA順序を有する。単
細胞生物において、フアージは「トランスフェクシヨ
ン」と呼ばれる工程により再現する。
クローン用ベヒクル（cloning vehicle）：宿主細胞中
で再現しうるプラスミド、フアージDNAまたはその他のD
NA順序であり、これは１個または少数のエンドヌクレア
ーゼ識別部位を特徴とし、この部位においてこのDNA順
序はDNAの本質的な生物学的機能（たとえば再現性）、
被覆蛋白質の生成の喪失または促進子もしくは結合部位
の喪失を伴わずに決定可能に切断され、またこの部位は
変異細胞の同定（たとえばテトラサイクリン耐性または
アンピシリン耐性）に使用するのに適する印しを含有す
る。クローン用ベヒクルはしばしばベクターと呼ばれ
る。
クローン化（cloning）：無性繁殖の過程 組換えDNA分子：少なくとも２つのヌクレオチツド順序
からなる混成DNA順序であり、第一の順序は天然におい
て第二の順序と一緒には通常見出されない。
表現制御順序：構造遺伝子に連携結合したときこれらの
遺伝子の表現を制御かつ調整するヌクレオチツドのDNA
順序。
次に、第１図を参照すれば、デイン粒子の内生DNAの
略図が示されている。デイン粒子は、肝炎Ｂビールス感
染した患者の血漿中に検出される（デイー・エス・デイ
ンおよびシー・エツチ・カメロン、「オーストラリア−
抗原に関する肝炎を持つた患者の血清中におけるビール
ス状粒子」、ランセツト誌、第１巻、第695〜698号（19
70））。この粒子は、肝炎Ｂの感染性ビールス単位（vi
rion）と同一または密接に関連すると考えられる。その
大きさは知られているが（直径42ナノメータ）、その構
造は充分には理解されていない。一般に、デイン粒子は
外層と内核とからなると信じられる。粒子の外層は一般
に、肝炎Ｂ表面抗原（“HBsAg"）として知られるポリペ
プチドを含有する。内核（直径27ナノメータ）は第二の
ポリペプチドすなわち肝炎Ｂ核抗原（“HBcAg"）ならび
に2.1×106ダルトンの内生二重鎖の円形DNA分子を含有
し、これは種々な長さの単一ストランド間隙を有する。
第三のポリペプチド、すなわち“e"抗原（“HBeAg"）も
デイン粒子に関係する。さらに、デイン粒子は内生DNA
依存性のDNAポリメラーゼを含むと信じられ、これはそ
のDNAをプライマ／雛型として用いるポリメラーゼ反応
により内生DNA中の単一ストランド間隙を閉鎖する。デ
イン粒子、さらに詳しくはそのDNAの構造および性質は
幾つかの分析の主題である（たとえばダブリユー・エス
・ロビンソン、「肝炎Ｂビールスのゲノム」、アニユア
ル・レビユー・オブ・マイクロバイオロジー、第31巻第
357〜377頁（1977））。しかしながら、各種の抗原また
はその遺伝子の実際の構造はまだ決定されていない。
デイン粒子の内生DNAは、抽出によりデイン粒子から
単離されている。これは、小さな刻目すなわちその中の
開口部を有する一定長さの１本のヌクレオチツド鎖（第
１図、ストランドａ、〜3000ヌクレオチツド）と或る程
度変化しうる長さの第二のヌクレオチツド鎖（第１図、
ストランドｂ、〜2000ヌクレオチツド）とからなつてい
る。第二のストランドは第一のストランドに対し補完的
であり、その刻目を重ね合せて補完的塩基間における水
素結合により標準的ワトソン−クリツク方式で円状構造
を完成する。この重複部が第１図に見られる。デイン粒
子のDNAポリメラーゼは、内生DNAの第二ストランドをプ
ライマとして使用すると共に第一ストランドを雛型とし
て使用することにより種々の間隙を、第一ストランドの
ヌクレオチツドに対し補完的であるヌクレオチツドで埋
めて約3000ヌクレオチツド対の二重鎖DNAを与えると思
われる。
肝炎ＢビールスDNAの調製方法 単一のHBsAg陽性かつHBeAgの供血者（血清型adym）か
らのひと血清を等容量のpH7.4の緩衝液（0.1Mトリス−H
Cl、0.1M塩水（NaCl）、0.1％の２−メルカプトエタノ
ール、0.1％子牛血清アルブミン、ただし％は本明細書
中全てW/V％とする、および0.001MのEDTA）で希釈し
た。これを４℃にて35,000rpmで２時間遠心分離した。
かく得られたペレツトを200μｌの同じ緩衝液に再懸濁
させ、20％の蔗糖を含有する遠沈管の頂部に層化させ
た。懸濁物を４℃にて40,000rpmで２時間遠心分離し
た。かく得られたペレツトを再び100μｌのpH7.5の緩衝
液（0.1Mトリス−HCl、0.1M塩水）に再懸濁させた。
次いで、得られたDNA含有のペレツトを3Hまたは32Pで
ラベルし（ピー・エム・カプラン等、「ひと肝炎Ｂ抗原
に関係するDNAポリメラーゼ」、ジヤーナル・ヴイロロ
ジー、第12巻第995〜1005頁（1973））て、後の過程に
おける追跡を容易にした。このラベル化は、濃厚デイン
粒子と3H-もしくは32P-ラベルされたデオキシヌクレオ
シドトリホスフエート（dNTP）との37℃における４時間
の反応により得られる。このDNAポリメラーゼ反応の
後、DNA中の単一ストランド間隙は部分的に閉鎖され
（第１図参照）、ラベル化された材料を蔗糖30％含有の
遠沈管の頂部に層化させ、４℃にて42,000rpmで3.5時間
遠心分離した。
次いで、DNAを得られたペレツトからフエノールによ
り抽出した（エル・アイ・ルトウイツクおよびダブリユ
ー・エス・ロビンソン、「肝炎Ｂデイン粒子DNAポリメ
ラーゼ反応で合成されるDNA」、ジヤーナル・ヴイロロ
ジー、第21巻第96〜104頁（1977）の手順を使用）。次
いで、抽出されたDNAを0.01Mトリス−HCl、0.001MのEDT
Aの溶液（pH8.0）で透析してフエノール溶媒を除去し
た。かくして単離されたDNAは制限酵素消化に対して準
備できた。これは〜108cpm/μｇの比放射活性を示し
た。上記した方法を概略第２図に示す。
肝炎ＢビールスDNAのクローン化 上記のように単離した二重鎖DNAを無性増殖させるの
に、多種類の宿主−クローン用ベヒクル組合せ物を有効
に使用することができる。たとえば、有用なクローン用
ベヒクルはクロモソーム系、非クロモソーム系および合
成のDNA順序たとえば各種の公知細菌性プラスミド（た
とえばpBR322、その他イー・コリのプラスミドおよびそ
れらの誘導体）、および広宿主範囲のプラスミド（たと
えばRP4）、フアージDNAたとえば多種のフアージλの誘
導体（たとえばNM899）、およびプラスミドとフアージD
NAとの組合せ物から誘導されたベクター、たとえばフア
ージDNA表現制御順序を使用するよう改変したプラスミ
ドを包含する。有用な宿主は細菌宿主たとえばイー・コ
リX1776、イー・コリX2282、イー・コリHB101およびイ
ー・コリMRC1およびシユードモナス、バチルス・ズブチ
リスおよびその他細菌の菌株、酵母菌およびその他菌
類、動物または植物宿主（たとえば培養動物もしくは植
物細胞）、およびその他宿主を包含する。勿論、全ての
宿主が同等の効果をもつものではない。宿主−クローン
用ベヒクル組合せ物の特定の選択は、本発明の範囲から
逸脱することなく上記の原理を正当に考慮して当業者が
行なうことができる。
さらに、各特定ベクター中には、単離された二重鎖DN
Aを挿入するため種々な部位を選択することができる。
通常これらの部位は、これらを切断する制限酵素すなわ
ちエンドヌクレアーゼにより指定される。たとえば、pB
R322においては、Pst 1部位はペニシリナーゼ遺伝子中
におけるペニシリナーゼ蛋白のアミノ酸181および182を
コード化するヌクレオチツドトリプレツトの間に位置す
る。この部位は、ラツテプロインシユリン決定子を示す
蛋白質の合成の際上記のビラ−コマロフ等により用いら
れた。Hind IIエンドヌクレアーゼ識別部位は、アミノ
酸101および102をコード化するトリプレツトの間に存在
し、Tag部位はpBR322におけるその蛋白のアミノ酸45を
コード化するトリプレツトに存在する。同様に、このプ
ラスミドに対するEco RIエンドヌクレアーゼ識別部位
は、それぞれテトラサイクリンおよびアンピシリンに対
する耐性をコード化する遺伝子の間に位置する。この部
位は、イタクラ等およびゲデル等により、上記した組換
えDNA合成法において使用された。第２図および第11図
は、例示の目的でプラスミドpBR322およびフアージλNM
989における幾つかの制限部位を示している。
選択DNA断片をクローン用ベヒクル中に挿入して組換
えDNA分子を生成させるため選択される特定部位は種々
の因子により決定される。これらは表現すべきポリペプ
チドの寸法および構造、宿主細胞成分による内生酵素分
解に対する所望ポリペプチドの感受性およびその蛋白に
よる汚染、たとえば開止および停止コドンの配置のよう
な表現特性、ならびに当業者に知られたその他因子を包
含する。表現過程は充分には理解されていないので、こ
れら因子はいずれも単独では特定ポリペプチドに関する
挿入部位の選択を絶対に制御しない。寧ろ、選択された
部位はこれら因子をバランスさせる効果を有し、或る蛋
白に対し必らずしも全ての部位が同等の効果を示すもの
ではない。
外来DNAをクローン用ベヒクル中に挿入して組換えDNA
分子を生成させるには幾つかの方法が当分野で知られて
いるが、本発明において好適な方法を第２図に示す。こ
れは、デイン粒子DNAを制限エンドヌクレアーゼにより
開裂させ、開裂DNAの３′末端（DNA糖骨格のデオキシリ
ボース炭素から便宜上名付けられる）にポリ−デオキシ
Ｃ順序を付加させ、そして伸長したDNAをクローン用ベ
ヒクルに結合させることを特徴とし、ただしクローン用
ベヒクルは制限エンドヌクレアーゼにより特定部位で切
断されて、その切断の３′末端に開裂DNAのポリ−dC順
序に対し補完的なポリデオキシＧ順序を伸長させたもの
を使用する。DNAおよびクローン用ベヒクルの３′末端
の補完的性質はこれら末端の結合を可能にする。
本発明の方法において有用であるためには、HBV・DNA
を開裂させるのに選択される制限酵素は、HBV抗原性を
示すポリペプチドをコード化する遺伝子の必須部分内に
おいてHBV・DNAを開裂してはならず、特に好適には制限
された数の部位にてDNAを開裂すべきである。本発明で
使用された制限酵素はKpn・Ｉ、Bgl・II、Bam・HI、Ava
・ＩおよびEco・RIを包含する。その他の制限エンドヌ
クレアーゼも同様に本発明において使用することができ
る。これらの選択は、本発明の範囲を逸脱することな
く、上記した諸因子を考慮して当業者が行なうことがで
きる。第３〜９図は、HBVゲノムの一部における制限エ
ンドヌクレアーゼ識別部位の幾つかを示している。
勿論、DNA順序をクローン用ベヒクル中に挿入して組
換えDNA分子を生成させるその他公知の方法も同等に本
発明において使用される。これらには、たとえば同一の
制限エンドヌクレアーゼを使用してHBV・DNAとクローン
用ベヒクルとを開裂させるような直接結紮法が包含され
る。この方法は本質的に補完的端部を結合に供する。
勿論、クローン用ベヒクルの選択制限部位に挿入され
たヌクレオチツド順序または遺伝子断片は所望蛋白質に
対する実際の構造遺伝子の一部でないヌクレオチツドを
包含し或いはその構造遺伝子の断片のみを包含すること
もできると了解すべきである。どのDNA配列を挿入して
も変異された宿主はHBV抗原性を示すポリペプチドを生
産することのみが必要である。
混成遺伝子を含有する組換えDNA分子を使用して宿主
を変異させ、この宿主（変異体）が構造遺伝子またはそ
の断片を表現しかつ混成DNAのコード化するポリペプチ
ドまたはその一部を生産するようにさせることもでき
る。また組換えDNA分子を使用して宿主を変異させ、こ
の宿主が再現性をもつて付加的な組換えDNA分子をHBV構
造遺伝子およびその断片の源泉として生産するようにさ
せることもできる。これらいずれかの使用に対する適当
な宿主の選択は、当分野で知られた多くの因子により管
理される。これらの因子には、たとえば選択ベクターと
の適合性、共生産物の毒性、所望ポリペプチドの回収容
易性、表現特性、生物学的安全性および価格が包含され
る。また、表現のメカニズムは充分には理解されていな
いので、宿主の絶対的選択をこれら因子のいずれか単独
により特定の組換えDNA分子またはポリペプチドについ
て行なうことはできないであろう。寧ろ、特定の組換え
DNA分子の表現に対し全ての宿主が同等の効果を示しえ
ないという現実に鑑みてこれら因子をバランスさせねば
ならない。
本発明の合成において、好適なクローン用ベヒクルは
細菌性プラスミドpBR322であり、そこの好適な制限エン
ドヌクレアーゼ部位はPst 1部位である（第２図）。こ
のプラスミドは、抗生物質アンピシリン（Amp）および
テトラサイクリン（Tet）に対する耐性遺伝子を担持す
る小さい（分子量約2.6メガダルトン）プラスミドであ
る。プラスミドは充分に特性化されている（エフ・ボリ
ヴアール等、「新規なクローン用ベヒクルIIの構成およ
び特性化。多目的クローン系」、ジーン、第95〜113頁
（1977））。本発明による好適な宿主はイー・コリHB10
1である。
1.dC−伸長化したデイン粒子DNAの調製 本発明の好適具体例の実際的実施において、デイン粒
子から上記のように単離したDNAを制限エンドヌクレア
ーゼKpn I（10mMのトリス−HCl（pH7.5）、10mMのMgC
l2、10mMの２−メルカプトエタノール、40mMのNaCl、0.
5μｌの酵素調製物10μｌ中のDNA約20ng）により37℃に
て90分間消化させ、制限酵素を70℃、５分間の加熱によ
り不活性化させた。ポリ−デオキシＣ順序（例示の目的
で第２図にはCCCとして示す）を、フエノールおよびク
ロロホルム（各20μｌ）での抽出により残留蛋白質を除
去した後、ポリヌクレオチド末端トランスフエラーゼと
の標準的反応により消化生成物の３′末端に付加させ
た。エーテルでの抽出によりフエノールを水相から除去
し、3Mの酢酸ナトリウム、pH6.5（５μｌ）と冷エタノ
ール0.1mlとの添加によりDNAを沈殿させた。−70℃に１
時間保つた後、沈殿DNAを10,000rpmで20分間遠心分離し
て回収し、このペレツトを10mMのトリス−HCl、pH7.5
（10μｌ）中に溶解させた。これに３μｌの400mMカコ
ジル酸カリウム（pH7.0）と4mMの塩化コバルトと4mMの
デオキシシトシントリホスフエート（dCTP）と200μg/m
lの子牛血清アルブミンとを加え、混合物を0.5μｌのポ
リヌクレオチツド末端トランスフエラーゼ（6000u/ml）
と共に27℃にて10分間培養しそして50mMのEDTA（１μ
ｌ）を添加して反応を停止させた。
2.Pst I開裂され、dG−伸長されたpBR322の調製 プラスミドpBR322を制限エンドヌクレアーゼPst I
（これに対しプラスミドは１つの目標を有する）により
消化し、この生成物をHBV・DNAについて上記したように
フエノール抽出およびエタノール沈殿により精製した。
ポリ−dG順序（例示の目的で第２図にGGGとして示す）
を、HBVに対するポリ−dC順序の付加について上記した
ように、末端トランスフエラーゼにより線状pBR322の
３′末端に付加させ、ただしこの場合反応は37℃にて行
なつた。
3.G−伸長したpBR322とＣ−伸長したHBV・DNAとの結合 次いで、等モル量のpBR322−ポリ−dGとHBV・DNA−ポ
リ−dCとを混合し、補完的順序を100mMのNaCl、50mMの
トリス−HCl（pH7.5）、5mMのEDTA（TNE）（50μｌ）中
にて65℃で１時間、次いで47℃で１時間、37℃で１時間
および20℃で１時間培養することにより結合させ、そし
て等容量のTNEと20μｌの100mMのMgCl2、100mMのCaC
l2、100mMのトリス−HCl（pH7.5）とを加えた。
4.イー・コリHB101の変異 変異に適したイー・コリHB101の培養物を、イー・エ
ム・レーダーベルクおよびエス・エツチ・コーヘンによ
り「プラスミドデオキシリボ核酸によるサルモネラ・チ
フイムリウムの変異」、ジヤーナル・バクテリオロジ
ー、第119巻、第1072〜1074頁（1974）に記載されてい
るように調製した。細胞の0.1ml部をアニールされたDNA
調製物25μｌと混合し、０℃で20分間培養し、次いで20
℃にて10分間培養した後、テトラサイクリン（50μg/m
l）を含有するＬ−寒天板上に塗沫して37℃で一晩培養
した。プラスミドpBR322はテトラサイクリン耐性につい
ての遺伝子を有するので、このプラスミドにより変異さ
れたイー・コリ集落は、このように変異されなかつたイ
ー・コリ集落を除いて、この抗生物質を含有する培養物
中で増殖するであろう。したがつて、テトラサイクリン
含有の培養物における増殖は適切に変異された宿主の選
択を可能にする。
5.交雑化によるイー・コリ集落のスクリーニング 培養されたテトラサイクリン含有Ｌ−寒天板上に増殖
した細菌集落をアンピシリンに対する感度について試験
した。プラスミドpBR322はアンピシリン耐性についての
遺伝子を有する。この遺伝子は混成遺伝子挿入の提案部
位である。したがつて、選定識別部位に挿入されたDNA
を有するプラスミドにより変異された集落はアンピシリ
ンに対し感受性であるが、テトラサイクリンに対する耐
性を保持するであろう。アンピシリンに対し感受性であ
るがテトラサイクリンに対し耐性であつたイー・コリ集
落を、テトラサイクリンを含有するＬ−寒天板上に支持
されたミリポア硝酸セルロースフイルターの円板の上に
載置した。37℃で一晩増殖させた後、このミリポアフイ
ルターをテトラサイクリンとクロラムフエニコール（15
0μg/ml）とを含有する新たなＬ−寒天板に移し、37℃
にてさらに数時間培養して細胞内のプラスミドのコピー
数を増加させた（第２図）。次いで、エム・グルンスタ
インおよびデイー・エス・ホグネスにより「集落交雑
化：特異遺伝子を含有するクローン化DNAの単離方
法」、プロシーデイング・ナシヨナル・アカデミー・サ
イエンス、U.S.A.第72巻第3961〜3965頁（1975）に記載
されているように、集落交雑化のため、前記で調製した
32P−ラベルされたHBV・DNAを試料としてミリポアフイ
ルターを使用した。フイルターのラジオオートグラフ
は、標準HBV・DNAに対し補完的なDNA順序を含有する集
落の存在を示した。
6.HBV抗原性を有するポリペプチドを合成する集落の検
出 テトラサイクリンに耐性であり、アンピシリンに感受
性でありかつ標準HBV・DNAで交雑化した集落を、HBV抗
原特異性すなわち抗原性を示す少なくとも１種のポリペ
プチドを生産する能力について試験した。ここでも集落
を、テトラサイクリン含有のＬ−寒天板上に支持された
ミリポアフイルターの上に載置し、37℃で一晩培養し
た。バクテリオフアージユλヴイルの発病株を感染させ
た（感染度約１の倍率）イー・コリC600の培養物（軟質
寒天2ml中0.1ml）を有する第二のＬ−寒天板で覆い、37
℃で一晩培養し、その際細菌叢は総合的にフアージ（λ
ヴイル）により溶菌された（すなわち、実質的に全ての
宿主細胞壁が破裂した）。本発明により変異された細胞
を含有するミリポアフイルターを板から釣り上げ、集落
を下面としてλヴイルで溶菌されたイー・コリC600のＬ
−寒天板の表面に接触させた。この接触を約10分間続け
て、ミリポアフイルター上に存在する細胞のλヴイルに
よる感染を行なわせた。次いで、ミリポアフイルターを
Ｌ−寒天の新たな板に移し、37℃でさらに５時間培養し
た。その間、エス・ブルームおよびダブリユー・ギルバ
ートにより「特異的翻訳生成物を検出する免疫学的スク
リーニング方法」、プロシーデイング・ナシヨナル・ア
カデミー・サイエンス、U.S.A.第75巻第2746〜2749頁
（1978）に記載されているように、HBV抗体でポリビニ
ル円板を被覆した。変異した細菌集落が明白に溶菌した
ミリポアフイルターをその集落につき被覆ポリビニル円
板と接触させ、４℃に３時間保つた。この接触の結果、
ミリポアフイルター上の細胞から溶出したHBV抗原は全
て円板のHBV抗体と結合する。被覆円板をミリポアフイ
ルターから分離し、次いで洗浄して125I−ラベルされた
HBV抗体と共に培養した。この培養の結果、ミリポアフ
イルターからのHBV抗原が円板のHBV抗体により事前に結
合されてしまつた円板上の個所が放射活性となる。洗浄
後、上記ブルームおよびギルバートにより記載されてい
るようにラジオオートグラフイーにかけると、HBV抗原
特異性を有するポリペプチドを生成した集落はラジオオ
ートグラフにより位置確認された。
人間におけるHBV抗体の存在を検知するための組換えDNA
分子から生産されたポリペプチドおよび遺伝子の使用 HBV抗原性を示すポリペプチドとそれをコード化する
構造遺伝子および断片とを、人間におけるHBV抗体の存
在を検知ししたがつてこのビールスにより感染された人
間および血液試料を識別するよう設計した方法および装
置に使用することができる。
たとえば、本発明の組換えDNA分子により変異された
宿主により生産されるHBcAgを、肝炎Ｂビールス検知の
ため現在利用しうる免疫学的診断試験、すなわち放射性
免疫分析法またはエリサ（ELISA、酵素結合免疫吸着分
析法）、に使用することができる。放射性免疫分析法の
一型式においては、実験動物中に成育させた抗−核抗原
抗体を固体相、たとえば試験管の内側に付着させる。次
いで、この試験管にHBcAgを加えて抗体と結合させる。
抗原−抗体複合物により被覆されたこの試験管に、患者
血清の試料と共にたとえば放射性沃素のような放射性同
位元素でラベルしたHBV抗−核抗体の既知量を添加す
る。患者血清中のHBV抗体は、抗原−抗体複合物の遊離
結合部位に対しラベル化抗体と競合するであろう。血清
を作用させた後、過剰の液体を除去し、試験管を洗浄し
そして放射活性の量を測定する。陽性の結果、すなわち
患者血清がHBV抗体を含有するという結果は、低放射計
数によつて示される。エリサ試験法の一型式において
は、マイクロ滴定板をHBcAgで被覆し、これに患者血清
の試料を加える。抗体と抗原とを反応させる培養期間の
後、抗体を洗浄しそして実験動物で成育させかつ酵素ラ
ベルに結合させた抗−ひと抗体の調製物を加え、培養し
て反応を生ぜしめ、次いで板体を再洗浄する。その後、
酵素基質をマイクロ滴定板に加え、酵素を基質に作用さ
せる期間培養しそして最終調製物の吸着率を測定する。
吸着率における大きな変化は陽性結果を示す。
組換えDNA分子から生産されたポリペプチドの生体内活
性 本発明のイー・コリにおける組換えDNA分子から翻訳
された抗原性ポリペプチドの生物学的活性を試験するた
め、HBcAgを表現するために示した細菌細胞の無菌抽出
物を、等容量のフインド補助液と混合した後、兎に注射
した。２匹の動物には粗製の細菌抽出物を与え、また２
匹の動物には同じ抽出物の試料をセフアデツクス650カ
ラムでの分画の後に加えた。さらに、凍結および貯蔵し
た（充分な抗原活性を保持する）同じ試料の注射を、最
初の注射から２週間後および５週間後に与えた。これら
動物を、最初の注射から数週間後、時間間隔を置いて出
血させた。
オー・オウチタロニーにより「免疫拡散および免疫電
気泳動」、ハンドブツク・オブ・エキスペリメンタル・
イミユノロジー（デイー・ダブリユー・ウエア編、ブラ
ツクウエル・サイエンテイフイツク出版社、オツクスフ
オードおよびエジンバラ）、第19章（1967）に記載され
た方法を用いて免疫拡散実験を行ない、兎血清（抗体）
をひと肝臓から得られたHBcAgを使用してひと肝炎Ｂビ
ールス核抗体（“HBcAb"）と比較した（ビー・ジエー・
コーヘンおよびワイ・イー・コサルト、「肝炎Ｂ核抗原
に対する抗体のスクリーニング試験の応用」、ジヤーナ
ル・クリニカル・パソロジー、第30巻第709〜713頁（19
77））。４匹の兎の血清全ては、人間から得られたHBcA
gとHBcAbとの間に形成されたものと同一の、HBcAgを有
する沈降素ラインを与えた。したがつて、本発明の組換
えDNA分子を用いてイー・コリ中で合成した核抗原は生
体内において血清学的に活性である。この活性は、微生
物細胞中で合成されたビールス抗原を用いる組成物およ
び方法を人間における抗体形成の刺戟のために使用しう
ることを確立した。この種の組成物および方法は、本発
明で製造された組換えDNA分子により変異された宿主が
生産するポリペプチドを特徴とする。これらのポリペプ
チドは、単独に或いは人間におけるビールス感染の処置
および予防のための組成物および方法に使用される当分
野で認められているたとえば食塩溶液または他の添加剤
の如き周知の医薬上許容しうる担体と共に、使用される
であろう。
前記したように、本発明の組換えDNA分子を製造する
には、上記Kpn I/Pst I組合せ物以外の制限酵素も有効
に使用することができる。プラスミドpBR322およびHBV
ゲノムの一部における他の制限部位をそれぞれ第２図お
よび第３図に示す。これらの代案となるが余り好適でな
い具体例を説明するため、以下に実施例を示す。
Bam・HI、Eco・RI、Bgl・II−Pst I組合せ Kpn Iにより生成されたものとは異なり、Bam・HI、Ec
o・RIおよびBgl・IIの使用により生成されたHBV・DNA断
片は、短い５′−単一ストランド突出部が存在するた
め、直接に末端結合させることが便利にできなかつた。
したがつて、これらは、３′末端にポリ−dC順序を付加
させる前に、λエキソヌクレアーゼで処理して上記突出
部を除去した。これは、制限されたDNA（前記したよう
に10μｌの溶液）を15μｌの100mMグリシン酸ナトリウ
ム（pH9.5）、10mMのMgCl2、100μg/mlの子牛血清アル
ブミン、５μｌのλエキソヌクレアーゼと共に０℃にて
1.5時間培養することにより行なつた。次いで、混合物
をフエノールとクロロホルムとで抽出し、工程を続け
た。Bam・HIを使用した調製物の場合、後の放射免疫分
析法によりHBV抗原特異性を有するポリペプチドの生成
を確認した。
直接的結紮:Eco・RI−Eco・RIおよびBam・HI−Bam・HI 上記したようにDNA断片を末端結合させる代りに、本
発明の方法において遺伝子断片の直接的結紮を用いるこ
とができる。たとえば、別の２種の調製物においては、
HBV・DNA（20ng）を10mMのトリス−HCl（pH7.5）、10mM
のMgCl2、10mMの２−メルカプトエタノール、50mMのNaC
l（10μｌ）中において制限エンドヌクレアーゼEco・RI
またはBam・HIにより37℃にて1.5時間制限化処理し、同
一条件下で同一酵素と共に培養された過剰のpBR322と混
合した。濃厚緩衝溶液〔660mMのトリス−HCl（pH7.
5）、100mMのMgCl2、10mMのEDTA、100mMの２−メルカプ
トエタノール、400mMのNaCl、1mMのATP〕（２μｌ）を
加え、この混合物をT4・DNAリガーゼ（0.5μｌ）と共に
10℃で３時間、次いで０℃で少なくとも24時間培養し
た。この溶液を10mMのトリス−HCl（pH7.5）により0.1m
lに希釈し、前記したようにイー・コリHB101の適当な培
養物を変異させるのに使用した。Bam・HI調製した組換
えDNA分子の場合、交雑化に対するスクリーニングの前
に、集落をアンピシリンに対してでなくテトラサイクリ
ンに対する感度について試験した。何故なら、pBR322中
のBam・HIの目標はテトラサイクリン耐性をコード化す
る遺伝子内にあり、したがつてこの識別部位において上
手に挿入すればPst I部位における挿入の場合と同様に
アンピシリン耐性でなくテトラサイクリン耐性の喪失が
生ずるからである。
Eco・RI部位を介して調製された組換えDNA分子の場合
には、交雑化についてのスクリーニングの前に、集落を
アンピシリンとテトラサイクリンとの両者に対する耐性
につき試験した。何故なら、pBR322中のEco・RIの目標
はテトラサイクリンとアンピシリンとの耐性をコード化
する遺伝子間に存在し、したがつてアンピシリンまたは
テトラサイクリンの耐性に関する遺伝子の不活性化はこ
の部位における混成DNA挿入の際生じないからである。
本明細書中に記載した方法で調製された微生物は、19
78年12月15日にポートンダウン在のカルチヤー・コレク
シヨン・オブ・ザ・マイクロバイオロジカル・リサーチ
・エスタブリツシユメントに寄託されかつpBR322−HBV
−Ａ〜Ｆとして同定された培養物により例示される。
詳細には、これら培養物の特徴は次の通りである。
A:イー・コリ HB 101/pBR322−Pst I dG:HBV−Kpn I d
C:TetRAmpSHBV+VA+ B:イー・コリ HB 101/pBR322−Pst I dG:HBV−Bam HI
dC:TetRAmpSHBV+VA+ C:イー・コリ HB 101/pBR322−Pst I dG:HBV−Bgl II
dC:TetRAmpSHBV+ D:イー・コリ HB 101/pBR322−Pst I dG:HBV−Eco RI
dC:TetRAmpSHBV+ E:イー・コリ HB 101/pBR322−Bam HI:HBV−Bam HI:Te
tSAmpRHBV+ F:イー・コリ HB 101/pBR322−Eco RI:HBV−Eco RI:Te
tRAmpRHBV+ これらと同一の培養物の一部を、1979年12月19日にス
コツトランド、アバデイーン在のカルチヤー・コレクシ
ヨン・オブ・ザ・ナシヨナル・コレクシヨン・オブ・イ
ンダストリアル・バクテリアにも寄託した。
培養物に対する上記命名は、次のような培養物の記載
である。宿主／クローン用ベヒクル−クローン用ベヒク
ル中の制限部位であつて、伸長ヌクレオチツド（もし存
在すれば）を示す：肝炎Ｂビールス中の肝炎Ｂビールス
制限部位であつて、伸長（もしあれば）を示す：テトラ
サイクリン（Tet）およびアンピシリン（Amp）に対する
耐性（Ｒ）または感受性（Ｓ）：上記の集落交雑化試験
におけるHBV・DNAに対する陽性交雑化（HBV+）および上
記のHBV抗原性を示すポリペプチドの生産（VA+）。この
命名を用いれば、培養物pBR322−HBV−Ａは、プラスミ
ドとして組換えDNA分子を含有するイー・コリHB101培養
物を示し、この組換えDNA分子はPst I部位で開裂されか
つ３′末端にポリ−dG端部が伸長化されたpBR322からな
り、さらにHBV・DNAはKpn Iにより開裂されかつ３′末
端にポリ−dC端部が伸長化されており、また培養物はテ
トラサイクリン耐性とアンピシリン感受性と陽性のHBV
・DNA交雑化試験とを示すと共にHBV抗原性を示すポリペ
プチドを生産する。
勿論、混成微生物、組換えDNA分子およびポリペプチ
ドならびにこれらに応用しうる本発明の方法は、上記の
好適具体例のみに限定されるものでないことを了解すべ
きである。寧ろ、混成生物、組換えDNA分子およびポリ
ペプチドは生産の途上でまたはその後に公知方法により
有利に改変することができる。たとえば、より効果的な
表現制御順序を利用してHBV遺伝子または混成遺伝子の
転写を得ることができ、また望ましくない遺伝子生成物
の合成を減少させるよう突然変異を導入することがで
き、また宿主細胞中のプロテアーゼレベルを減少させる
こともでき、さらにHBV遺伝子を含有する熱誘導性リゾ
ゲンを宿主クロモソーム中に一体化させることができ、
或いはその他の改変および手順を行なつて細胞中の遺伝
子コピーの数を増加させたり所望ポリペプチドを生産す
る細胞の生産性を増大させたりすることもできる。
HBV抗原性を示すポリペプチドを生産させるためのそ
れらの使用の他、本発明の混成微生物は、肝炎Ｂビール
スに対するゲノムの全部または一部を含有する大量のDN
Aを生産するのにも有用である。たとえば、細胞濃度が
適当なレベルに達した時成育培地にクロラムフエニコー
ルを添加することによる増殖、或いは突然変異を用いて
HBV順序を含むバクテリオフアージヒブリドにおける溶
菌を防止することは、従来得られなかつた量のHBV・DNA
の製造を可能にする。
このように製造されたHBV・DNAを使用して、ゲノムの
ヌクレオチド順序を決定することができ、これから遺伝
子ならびにHBV抗原および構造遺伝子自体のアミノ酸順
序を決定することができる。これら順序の知見は、肝炎
Ｂビールスの生物学を理解する上で役立ち、また上記し
た改変を最も有利に用いることを可能にする。
DNA断片の地図作成およびヌクレオチツド順序決定 1.肝炎Ｂ核抗原 上記の方法により製造された、固相放射免疫分析法に
より検出されるようなHBcAgの合成能力を宿主細胞に付
与する一連の組換えDNA分子を順序分析のために使用し
た。断片を適当な制限酵素での消化によりこれら組換え
DNA分子から調製し、この断片をその５′末端に〔α−
32P〕ATPとT4ポリヌクレオチドキナーゼとでラベルし
た。次いで各断片のヌクレオチツド順序を周知の化学的
分解法により決定した（エー・エム・マキサムおよびダ
ブリユー・ギルバート、「DNAの新規な順序決定方
法」、プロシーデイング・ナシヨナル・アカデミー・サ
イエンス、U.S.A.第74巻第560〜564頁（1977））。得ら
れたヌクレオチツド順序を第３〜９図に示す。参考のた
め、順序には核遺伝子のATG翻訳開始コドンのＡからナ
ンバーを付する。HBcAgに関する遺伝子のヌクレオチツ
ド順序およびこの遺伝子から引出されるポリペプチドの
アミノ酸順序（読み枠１）を第３〜９図においてヌクレ
オチツド１〜549の間に示す。この遺伝子によりコード
化されるポリペプチドの寸法は、デイン粒子からの核抗
原について観察された分子量19000に近いものである。
しかしながら、この構造決定は、若干のアミノ酸が標準
抗原の生成の際生体内でこのポリペプチドのアミノ末端
から切除されうる可能性を排除しない。さらに、この構
造は、他のひと酵素たとえば蛋白質をグリコソル化（gl
ycosolate）するような酵素との相互作用によりもたら
されるポリペプチドへのその他または追加的改変をも考
慮に入れない。したがつて、ここで決定されたポリペプ
チド構造は生体内に見出されるHBcAgとは同一でない
が、免疫反応については同一でないにしろ極めて類似す
るであろう。
検査した組換えDNA分子の全ては挿入されたHBV・DNA
を有したので、核抗原遺伝子はpBR322のペニシリン耐性
に関する遺伝子と同じ翻訳相に維持された。さらに、各
種の組換え物において、HBV・DNA挿入物はHBV順序にお
ける同じ位置の１個もしくは２個のヌクレオチツド内で
始まつた。これら組換えDNA分子は各種の制限酵素（た
とえばBam・HIおよびKpn・Ｉ）で消化されたHBV・DNAか
ら生じたので、この独特な付加は驚異的でありかつデイ
ン粒子の内生DNAにおける刻目でのHBV・DNAの偶発的破
断またはポリヌクレオチド末端結合から生じたのであろ
う（第１図）。異なる翻訳相中にHBV・DNA挿入物を有す
る組換えDNA分子はHBcAg遺伝子を表現せず、またこの種
の組換えDNA分子により変異された宿主にはHBV抗原性を
示すポリペプチドが検出されなかつた。勿論、この種の
非遺伝子表現宿主および組換えDNA分子も本発明によりH
BV・DNAを生産するのに有用である。
HBV・DNA挿入物の表現を介して生成されたHBcAgまた
はその断片は少数のグリシン残基を介してペニシリナー
ゼ耐性に関する遺伝子の生成物（β−ラクタマーゼ）に
融合するであろうことが予測されたが、実際にはそうで
なかつた。寧ろ、各場合にβ−ラクタマーゼは５〜８個
のグリシンを介して同一のペプチド順序に融合された
が、この順序は25個のアミノ酸の後に終端した。この読
み枠（枠１、第３図）において、停止コドン（TAG）に
次いで３個のヌクレオチツドが続き、その後に開始コド
ンが続き、そこから翻訳が妨げられずに続いてペプチド
に183個のアミノ酸の長さを与える（第３〜８図）。し
たがつて、核抗原活性は、組換えDNA分子から転写され
たmRNA内のHBV順序により初めから翻訳された約21,000
ダルトンのポリペプチド中に存在する。このポリペプチ
ドは宿主細胞内に残存しない。何故なら、これはHBV・D
NA挿入物の停止コドンおよび開始コドンの配置により分
泌ペニシリナーゼ担体蛋白質に結合されないからであ
る。
2.肝炎Ｂ表面抗原 HBsAgに対する遺伝子のヌクレオチツド順序およびこ
の遺伝子から生ずるポリペプチドに対するアミノ酸順序
（読み枠３）も、第６〜８図においてヌクレオチツド14
37〜2114間に示される。このポリペプチドのアミノ酸順
序はＮ末端から始まつて順序met−glu−asn−ile−thr
−serを有する。この最初のアミノ酸順序は、デイー・
エル・ピーターソン等、「肝炎Ｂ表面抗原の２つの主成
分ポリペプチドの部分的アミノ酸順序」、プロシーデイ
ング・ナシヨナル・アカデミー・サイエンス、U.S.A.、
第74巻第1530〜1534頁（1977）により、標準ひとHBsAg
から決定された。この蛋白質のアミノ酸順序は第６〜８
図において停止コドンまで226個のアミノ酸を続ける。
この226ポリペプチド順序は25,400ダルトンの蛋白質に
相当する。
HBsAgのアミノ酸および長さは、ピー・バレンツエラ
等、「肝炎Ｂビールス表面抗原の主要蛋白質をコード化
する遺伝子のヌクレオチツド順序」、ネーチヤー誌、第
280巻、第815〜819頁（1979）により、適当な組換えDNA
分子を順序決定することにより単独に確認された。
本発明の組換えDNA分子について決定されたヌクレオ
チツド順序は、HBcAgに対する遺伝子を表現した検査さ
れたもの全てが適当な宿主細胞内に表現されることを期
待する位置にHBsAgに対する遺伝子を持ち得ないことを
示す。事実、HBcAgに対する遺伝子を表現することが見
出されたプラスミドにより変異させた細胞の抽出物に
は、HBsAgは検出されなかつた。しかしながら、上記し
たように、これら遺伝子のヌクレオチツド順序の知見
は、表現過程の改変が収率と効果とを向上させかつ遺伝
子の表現と従来表現もしくは検出されなかつたポリペプ
チドの生産とを容易化するのを可能にする。
HBV抗原の生成に対する改良組換えDNA分子の製造 これら抗原の遺伝子およびアミノ酸順序は、細菌細胞
当りの抗原または遺伝子の生産レベルを高める方法を設
計する際有用である。
蛋白質の生産レベルは２つの主要因子により支配され
る。すなわち、細胞内の遺伝子のコピー数とこれら遺伝
子コピーを転写かつ翻訳する効率とである。転写および
翻訳（これは表現をも含む）の効率は、通常所望のコー
ド化用順序の前方に位置するヌクレオチツド順序に依存
する。これらのヌクレオチツド順序または表現制御順序
は、特にRNAポリメラーゼが相互反応して転写（促進子
順序）を開始しかつリボソームがmRNA（転写の生成物）
と結合かつ相互反応して翻訳を開始する位置を規定す
る。この種の表現制御順序全てが同等の効率をもつて機
能するものではない。したがつて、隣接するヌクレオチ
ツド順序から所望蛋白質に対する特異的コード化順序を
分離し、これらを公知の表現制御順序に融合させてより
高度の表現レベルを得ることが有利である。これは達成
されており、新たに処理されたDNA断片を多コピープラ
スミドまたはバクテリオフアージ誘導体中に導入して、
細胞内の遺伝子コピーの数を増加させそれにより表現蛋
白質の収率をさらに改善することができる。
例示の目的で、HBcAgの遺伝子について決定した順序
をこのようにして用いて、イー・コリにおけるHBcAgの
生産を改善した。その一つの過程を第10図に示す。
第３図におけるHBcAgについてのDNA順序を点検する
と、この遺伝子はヌクレオチツド−26にAlu・Ｉに対す
る目標（AGCT）を有し、ヌクレオチツド22および1590に
Eco・RI*に対する目標を有し、209にEco・RIIに対する
目標（CCTGG）、280にHae・IIIに対する目標（GGCC）ま
た246および461にAva・IIに対する目標（GGACC、GGTC
C）を有することが判る。この複雑性が与えられると、
核抗原コード化順序をより効果的な表現制御順序に２段
階で移行させるのが便利である。たとえば、本発明によ
り製造されて約2350塩基対（ヌクレオチツド）、すなわ
ち第３図のヌクレオチツド−80〜約2270のHBV・DNA挿入
物を有する組換えDNA分子をAlu・ＩおよびEco・RI*で消
化すると、特にヌクレオチツド−26と22との間に断片
（断片Ａ）を与える一方、Eco・RI*の単独消化はヌクレ
オチツド23〜1589に断片（断片Ｂ）を与えかつヌクレオ
チツド23〜576における断片（断片Ｂ′）の収率を低く
する。これらの断片は第３〜４図を参照して容易に確認
することができ、第10図に図示する。断片ＡおよびＢは
ゲル電気泳動により分別精製され、それらのEco・RI*を
介して端部結合し、合体断片（断片Ｃ）を与える。次い
で、必要に応じ断片Ｃを直接結紮により新たな表現制御
順序に付加させ、前記したような３′端部結合法を介し
または合成的オリゴーヌクレオチツド結合を介して正し
い翻訳相を維持する。この付加はより良好な表現制御順
序を使用して蛋白質生産を改善させるだけでなく、HBcA
gをコード化する遺伝子断片を表現制御順序自身により
近接して付加させそれによりその遺伝子断片の表現の制
御を向上させることも可能にする。同様にして、断片Ａ
およびＢ′を合体させ、または多くの他の調製断片を合
体させ、得られた断片を上記のように使用することがで
きる。この方法は、特定ポリペプチドをコード化する構
造遺伝子の１部のみを本発明の組換えDNA分子（pHBV11
4）に使用する需要があることを示している。
選択された遺伝子断片の特定表現制御順序と開始コド
ンとの間の距離をさらに短縮するため、特定断片をその
末端でまたは末端近くで特異的に作用するヌクレアーゼ
の組合せ物により軽く処理するかまたはエキソヌクレア
ーゼおよびポリメラーゼ結合修復反応に使用して、断片
の開始コドンに先行する断片のヌクレオチツドの全てま
たは幾つかを除去することができる。或いは、ヌクレオ
チツド−26および30で開裂して生ずるたとえばAlu・Ｉ
断片のような断片を同様にエキソヌクレアーゼ処理また
はポリメラーゼ結合修復反応により短縮させ、次いでEc
o・RI*で開裂させてヌクレオチツド−26および１とヌク
レオチツド22との間から断片をもたらし、断片Ｂに融合
させた後に表現制御順序に付加させることができる。別
の経路は断片Ｂまたは同等の断片の交雑化を包含し、こ
れはDNAポリメラーゼおよび限られた数のヌクレオシド
トリホスフエートとの一連の反応において伸長のため元
の組換えDNA分子から適当な単一ストランド雛型に対し
て行なわれ、したがつて断片ストランドはコード化順序
の初めに再構成することができるであろう。次いで雛型
ストランドを伸長断片ストランドに関連する位置におい
てエンドヌクレアーゼS1により開裂させ、そして得られ
た断片を表現制御順序に付加させる。
幾つかの表現制御順序は、上記したように使用するこ
とができる。これらは、イー・コリの乳糖オペロン
（「lac系」）の作動子、促進子およびリボソーム結合
および作用順序（たとえばシヤイン−ダルガルノ順序の
ような順序を含む）、イー・コリのトリプトフアン合成
酵素系（「trp系」）の対応する順序、フアージλの主
要作動子および促進子域（OLPLおよびORPR I）ならびに
フアージfd被覆蛋白質の制御域を包含する。これら順序
を含有するDNA断片は、lacもしくはtrpオペロンを担持
する変換用フアージから単離されたDNAからまたはフア
ージλもしくはfdのDNAから制限酵素での開裂により剔
出される。次いで、これら断片をHBV抗原順序について
記載したように処理して得られた数の分子を得、重要な
制御順序を断片Ｃについて上記したように所望抗原に対
するコード化順序の開始コドンに極めて近接してまたは
これに並列させて結合させることができる。
次いで、融合生成物を上記のようにクローン用ベヒク
ル中に挿入して適当な宿主を変異させ、抗原生産レベル
を細菌の溶解の後に放射免疫分析により測定する。最も
効果的な表現を与える細胞はこのように選択することが
できる。或いは、開始コドンに付加されたlac、trpもし
くはλPL制御系を担持するクローン用ベヒクルを使用し
て、これをHBV抗原性を示すポリペプチドをコード化す
る順序を持つた断片に融合させ、構造遺伝子断片をクロ
ーン用ベヒクルの開始コドンから正確に翻訳する。
これらの実験を特にHBV核抗原の生産に関連させた
が、これらはたとえばHBsAgおよびHBeAg遺伝子ならびに
その断片のような他の遺伝子の表現を改良するのにも使
用することができる。
これら特定抗原の細胞収率における増加は、細胞中に
使用しうる遺伝子の数の増加に依存する。これは、例示
の目的であるが、上記したように得られた組換えDNA分
子を雛型バクテリオフアージλ（NM989）中に挿入する
ことにより達成され、最も簡単にはプラスミドを制限酵
素、たとえばEco・RIまたはHind・IIIで消化して線状分
子を与え、次いでこれを制限フアージλクローン用ベヒ
クル〔たとえばエヌ・イー・ムレー等、「組換え体の試
験管内における回収を簡易化するラムダ型フアージ」、
モレキユラー・ジーン・ゲネテイツク、第150巻第53〜6
1頁（1977）およびエヌ・イー・ムレー等、「バクテリ
オフアージT4からのDNAリガーゼ遺伝子の分子無性増
殖」、ジヤーナル・モレキユラー・バイオロジー、第13
2巻第493〜505頁（1979）に記載された種類〕と混合
し、そして組換えDNA分子をDNAリガーゼとの培養により
生成させる。このような手順を第11図に示す。次いで、
所望の組換えフアージを、特定抗原に対する放射免疫分
析によりまたは放射ラベルしたHBV・DNA順序との交雑化
により選択して、イー・コリの宿主株を溶菌化するのに
使用した。
特に有用なλクローン用ベヒクルは抑圧遺伝子cIにお
ける感温性突然変異株および遺伝子Sにおける抑圧制突
然変異株を含み、その生成物は宿主細胞の溶解に必要で
あり、さらに遺伝子Eに関するものも含みその生成物は
ビールスの主要なカプシド蛋白質である。この方式によ
れば、溶解性細胞を32℃にて成育せしめ、次いで45℃に
加熱してプロフアージの剔出を誘発させる。37℃にて長
期成育させると高レベルの抗原生産をもたらし、これが
細胞内に保持される。何故なら、これらはフアージ遺伝
子生成物により通常のようには溶解されないからであ
り、またフアージ遺伝子挿入物はカプセル化されないの
で、それは転写用として使用可能に留まるからである。
次いで、細胞の人工的溶解は抗原を高収率で遊離させる
（第11図）。
これら実施例が原理的に関係するイー・コリ系に加
え、同じ型の処理を行なつて、たとえば、バチルス・ズ
ブチリス、すなわち耐熱性細菌または酵母およびカビの
ような他の微生物細胞或いは培養動物または植物細胞に
おいて抗原生産レベルを増大させることができる。バチ
ルス・ズブチリスの場合、バチルス・リヒエニホルミス
から単離されたペニシリナーゼの決定子を担持するプラ
スミドはこれら目的に有用な表現制御順序を提供する。
HBsAgをコード化する遺伝子を表現する改良組換えDNA分
子の製造 HBsAgについて決定した遺伝子およびアミノ酸順序
は、本発明の方法によりHBsAgに対する遺伝子の表現を
可能にする方法を設計する際に有用である。このような
表現は、HBV抗原性を示すポリペプチドを生成した組換
えDNA分子により変異させた宿主において従来観察され
なかつた。
第６〜８図のヌクレオチツド順序は、ヌクレオチツド
1437と2114との間のHBsAgをコード化する遺伝子を示
す。この遺伝子は、第３〜９図のHBVゲノムにおけるHBc
Agをコード化する遺伝子（読み枠１）とは異なる翻訳相
（読み枠３）にある。したがつて、適当な宿主を変異さ
せるために使用された時HBcAgを生成しなかつたが、約2
350個のヌクレオチツド（第３〜８図の順序のヌクレオ
チツド−80〜2270にほぼ相当する）のHBV・DNA挿入物を
含有する組換えDNA分子をHBsAg生産に使用するため選択
した。
選択された組換えDNA分子は、特にHBsAgをコード化す
る全遺伝子を含有した。この組換えDNA分子のHBV・DNA
挿入物のヌクレオチツド順序を検査すると、HBsAgをコ
ード化する遺伝子を含有する断片の剔出を可能にする幾
つかの制限エンドヌクレアーゼ目標が示される。たとえ
ば、ヌクレオチツド1409（Xho）、ヌクレオチツド1410
（Tag）、ヌクレオチツド1409（Ava I）、およびヌクレ
オチツド1428（Hha I）（第６図）。これらのうち最後
のもの（Hha I）は特に有用である。何故なら、HBV・DN
A挿入物の開裂はヌクレオチツド1430と1431との間で起
こり、HBsAg自身に対する遺伝子の翻訳開始コドン（AT
G）の前方に僅か６個のヌクレオチツドが存在するから
である。４種の場合全てにおいて、剔出された断片は、
選択されたHBV・DNA挿入物を越えて、組換えDNA分子のp
BR322部分のヌクレオチツド順序内に位置する特定制限
エンドヌクレアーゼに対する目標まで延在する。したが
つて、これら制限エンドヌクレアーゼおよびその他同様
に有用なものを単独または組合せて使用すると、開始コ
ドンの近辺であるかその前方と翻訳終末コドンの後とに
おいてHBsAgをコード化する遺伝子の剔出が可能とな
る。勿論、HBcAgに対する遺伝子の場合に示したよう
に、全遺伝子の断片のみを組換えDNA分子中に実際使用
し、適当な宿主においてHBsAg抗原性を示すポリヌクレ
オチツドを生成させうることが了解されよう。
このような消化物から生ずるHBV・DNAの断片を、核抗
原をコード化する遺伝子および遺伝子断片について記載
したものに類似した一連の反応で処理した。たとえば、
遺伝子断片をpBR322のペニシリン耐性をコード化する遺
伝子（たとえばPst I識別部位、第２図）中に挿入してH
BsAg抗原性を示すポリペプチドをβ−ラクタマーゼ（ペ
ニシリナーゼ遺伝子の生成物）と融合させて生成させる
ことができ、遺伝子断片をpBR322におけるペニシリン耐
性をコード化する遺伝子とテトラサイクリン耐性をコー
ド化する遺伝子との間（Eco・RIまたはHind III識別部
位、第２図）に挿入して、これをそこでまたは挿入前に
lac系表現制御順序に結合することによりHBsAg抗原性を
示すポリペプチドを生成させてlac系のβ−ガラクトシ
ダーゼ蛋白質に融合させることができ、遺伝子断片を、
HBcAgをコード化する遺伝子について前記したと同様
に、選択された表現制御順序自身にできるだけ近接して
クローン用ベヒクル中に挿入することができ、或いは遺
伝子断片を本発明により記載したと同様に無性増殖させ
ることができる。
例示の目的で、一つのこの種の方法を第12図に示す。
ここで、ほぼヌクレオチツド−80と2270（第３〜８図）
との間に延在したHBV・DNA挿入物を有する選択組換えDN
A分子をHha・Ｉでの消化により断片化させた。得られた
断片を、前記した３′末端結合法によりpBR322のPst I
部位に挿入した。この組換えDNA分子により変異させた
宿主は、HBsAg抗原性を示すポリペプチドを生成した。
他の断片（たとえばAva I、Tag、XhoまたはPst I（部
分消化））をもpBR322におけるPst I識別部位または他
の部位に挿入して、HBsAg抗原性を示すポリペプチドま
たはHBsAgをコード化する遺伝子断片の生産に有用な組
換えDNA分子を生成させた。
さらに、この種の遺伝子断片をPst Iにより開裂され
たpBR322に挿入し、次いで得られたペニシリナーゼをコ
ード化する遺伝子の断片を、ペニシリナーゼまたはβ−
ラクタマーゼのアミノ酸182をコード化するコドンから
或る場合にはアミノ酸32をコード化するコドンへとまた
他の場合にはそのポリペプチドのアミノ酸13をコード化
するコドンへと切り離す。またpBR322−Pst・I'のこれ
ら誘導化プラスミドをヌクレオチツド1447から1796まで
延在するHBsAg遺伝子断片（第６〜７図）と共に使用し
てHBsAg抗原性を示すポリペプチドを生成させた。
HBsAgをコード化する構造遺伝子の直前におけるヌク
レオチツド948〜1437間のヌクレオチツド順序を使用断
片中に含ませて、HBsAg抗原性を示すポリペプチドおよ
びHBsAgに対する構造遺伝子の遺伝子断片を生産するの
に有用な組換えDNA分子を生成させることもできる。こ
のヌクレオチツド順序は、遺伝子の先駆体順序と呼ばれ
る。この先駆体順序とHBsAgに対する構造遺伝子との両
者を含む遺伝子断片をAlu・Ｉ（ヌクレオチツド939）、
Hha・Ｉ（ヌクレオチツド900）またはHae・II（ヌクレ
オチツド899）により剔出することができる。Alu・Ｉお
よびHha・Ｉの場合、部分消化と得られた断片のたとえ
ばゲル電気泳動による分離とが必要である。何故なら、
これら酵素に対する識別部位は、先駆体順序内におい
て、Alu・Ｉについてはヌクレオチツド1091にまたHha・
IIについてはヌクレオチツド1428にも生ずるからであ
る。
以上、本発明の多くの具体例について記載したが、こ
の基本構成を変化させて、本発明方法を使用する他の具
体例を与えることもできることが明白である。したがつ
て、本発明の範囲は例示した特定実施例により規定さる
べきでなく、特許請求の範囲の記載により規定さるべき
であることが了解されよう。
本明細書中に記載した方法により調製した微生物は、
1979年12月19日にスコツトランド、アバデイーン在のザ
・カルチヤー・コレクシヨン・オブ・ザ・ナシヨナル・
コレクシヨン・オブ・インダストリアル・バクテリア
（The Culture Collection of The National Collectio
n of Industrial Bateria）に寄託されかつpBR322−H
BV−Ｇ−Ｌと同定された培養物により例示され、次のよ
うな特性を有する。
G:イー・コリHB101/pBR322−Pst I dG:HBV−Kpn I dC
（以下、“pHBV114"）：TetRAmpSHBV+ H:イー・コリHB101/pBR322−Pst I′ dG:pHBV114−Pst
I:TetRAmpSHBV+VA+ I:イー・コリHB101/〔（pBR322−Eco RI,Bam HI:lacプ
ロモータ配列）−Hind IIIリンカー:HBV114−Hha I Bam
HI:TetSAmpRHBV+VA+ J:イー・コリHB101/pUR2* Eco RI:HBV114−Hha I Eco RI
リンカー：TetSAmpRHBV+VA+ K:イー・コリHB101/pBR322−Pst I dG:pHBV114−Ava I
dC TetRAmpSHBV+VA+ L:イー・コリHB101/pBR322−Pst I dG:pHBV114−Taq dC
TetRAmpSHBV+VA+ ※：テトラサイクリン耐性についてのポリペプチドをコ
ード化する遺伝子を含むDNA順序を持つたpBR322の誘導
体を、イー・コリlac系を含むより小さいDNA順序で置き
換えた。
【図面の簡単な説明】
第１図はデイン粒子の内生DNAの構造を示す略図であ
り、第２図は本発明方法の好適具体例の略説明図であ
り、第３〜９図は本発明により肝炎Ｂビールスゲノムの
一部について決定したヌクレオチツド順序の説明図であ
り、第10図は肝炎Ｂビールス核抗原を示すポリペプチド
を生産することのできる組換えDNA分子を断片化し、そ
の断片を改善表現制御順序に結合させる本発明方法の略
説明図であり、第11図は本発明方法の略説明図であり、
第12図は本発明方法の他の具体例の略説明図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (56)参考文献 Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．280（30Ａｕ ｇｕｓｔ1979）815〜819頁 Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．281（25Ｏｃ ｔｏｂｅｒ1979）646〜650頁

Claims (4)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】Ｂ型肝炎ウィルスの抗原性を示すポリペプ
    チドをコードするDNA配列を特徴とする組換えDNA分子に
    よって形質転換された適切な宿主細胞を培養する工程に
    よって作製される、Ｂ型肝炎ウィルスの抗原性を示すポ
    リペプチドをコードするDNA配列であって、前記形質転
    換された宿主細胞は、Ｂ型肝炎ウィルスの抗原性を示す
    ポリペプチド以外にはヒトまたは霊長類起源の血清蛋白
    を全く産生しないことを特徴とする、DNA配列。
  2. 【請求項２】前記ポリペプチドがＢ型肝炎ウィルス核抗
    原の抗原性を示す、特許請求の範囲第１項に記載のDNA
    配列。
  3. 【請求項３】前記ポリペプチドがＢ型肝炎ウィルス表面
    抗原の抗原性を示す、特許請求の範囲第１項に記載のDN
    A配列。
  4. 【請求項４】特許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれ
    かに記載の少なくとも１つのDNA配列を使用することを
    特徴とする、血清においてＢ型肝炎ウィルス感染を検出
    するためのキット。
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