JPS6170989A - 組み換えｄｎａおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規な組み換えＤＮＡおよびその用途に関する
。

従来の技術 Ｂ型肝炎は、特に熱帯アフリカ、東南アジアおよび極東
において多発するフィルス性疾患であり、慢性肝炎や肝
硬変、さらには原発性肝ガンの原因にもなることが疫学
的に示唆されている。病因は、ＤＮＡクイルスの１種で
あるＢ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉ
ｒｕｓ　：以下、ＨＢＶと略称する）で、それは直径＋
２ｎｍ　の球状粒子で発見者の名金冠してデン（Ｄａｎ
ｅ　）粒子と呼ばれる。その外層には。

ＨＢＶ表面抗原（以下、ＨＢｓＡｇと略称する）がらり
、その抗原性の違いによってａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｒ、
ａｙｗなどのサブタイプに分けられているが、日本で見
いだされるのはａｄｗ型およびａｄｒ型である。

Ｂ型肝炎患者の血中には、デン粒子のほかに小型粒子や
管状粒子が検出され、これらの粒子にはデン粒子と同じ
型のＨＢｓＡｇが認められている。

フィルスの表在性抗ぶに対する抗体がそのフィルスの感
染を防御することは他のフィルスでも知られておシ、Ｈ
ＢＶの場合にもＨＢｓＡｇ全もとにＢ型肝炎に対するワ
クチンの製造が考えられる。ところが、ＨＢｖはヒトや
チンパンジーにしか感染せず、培養細胞への感染の試み
は成功していない。

そのためＨＢｓＡｇはヒト感染者血中からの入手に限定
されており、得られた小型粒子などは診断用試薬の材料
としての需要を満たすだけで、ワクチン製造にまわすこ
とは不可能な状態である。

分子生物学の最近の進歩により異種の蛋白質をコードす
るＤＮＡを微生物に導入し、形質転換させることか可能
になってきた。この遺伝子組み換えの技＃ｒを応用し、
ＨＢｓＡｇ構造遺伝子（以下、ＨＢＳＡｇ遺伝子と略称
する）を微生物内で発現させることができれば、ＨＢＶ
感染の危険性のないＨＢｓＡｇを大量に潤製することが
可能になり、Ｂ型肝炎ワクチンの実用化への道が開かれ
る。

現在知られている４種のサブタイプ、　ａｄｗ、ａｄｒ
。

ａ　ｙｗ　、　ａ　ｙ　ｒのうち、欧米に多いａｙｗ型
についてはＨＢｓＡｇ遺伝子の存在部位およびその塩基
配列が決定され（Ｇａ１ｉｂｅｒｔ　、　Ｆ、ら、　Ｎ
ａｔｕｒｅｌ　２Ｂ１，６４６（１９７９）ｉ　Ｃｈａ
ｒｎａｙ、Ｐ、ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅｓ、、　７　。

３３５（１９７９））、雑種蛋白質として大腸菌内での
発現が報告されているＣ　Ｃｈａｒｎａｙ　、　Ｆ、ら
、　Ｎａｔｕｒｅ、　２８６゜８９３（１９８０）ｉＥ
ｄｍａｎ、　Ｊ−ｃ、ら、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９１．
５０３（１９８１））。また、日本で多く見いだされて
いるａｄｗおよびａｄｒ　ｐについては、本発明者らの
一部はａｄｗ型ＨＢｓＡｇ遺伝子を含むＤＮＡの創製に
成功し、当該遺伝子のＤＮＡ塩基配列ならびにゲノム上
の位置を決定し、さらにこの組み換えＤＮＡで形質転換
させた形質転換体を培養してＨＢｓＡｇ全大量生産する
途全開いた（特開昭５８−１９４８９７号公報；特開昭
５８−２０１７９６Ｊｉ＋公報；特開昭５９−７４９８
５号公報）。

最近、宿主として酵母を用いる発現系、が注目されてい
るが、酵母形質転換体を用いてＨＢｓＡｇを生産させる
最初の試みは、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ、　Ｐ、ら〔Ｎａ
ｔｕｒｅ、　２９８．３４７（１９８２））によって行
われた。すなわち、酵母のアル；−ル脱水素酵素遺伝子
の５″−非翻訳領域にあるプロモーターの下流にａｄｗ
２型ＨＢｓＡｇ遺伝子を連結し、＃母内で該遺伝子を発
現させ、ｌｌの培養液あたり１０〜２５μ２のＨＢｓＡ
ｇ粒子の生成が報告されている。このＨＢｓＡｇ粒子が
、ヒト血清中にみられるものと同様な直径約２０ｎｍの
粒子構造を形成していることから、ＨＢｓＡｇ遺伝子を
発現させる際の宿主菌として酵母の有用性が示された。

その後、Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ。

Ａ、ら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ
、　ＵＳＡ　、　ｓｏ　、　１（１９８３））は、酵母
の抑制性酸性ホスファターゼ遺伝子（ＰＨ０５）の５”
−非翻訳領域にあるプロモーターを利用して、ａｄｒ型
ＨＢ　ｓ　ｋｇ遺伝子の発現を行い、１ｅの培養液あた
り３４０μ２のＨＢｓＡｇ　粒子の生成？報告している
。Ｈｉ　ｔｚｅｍａｎ、　Ｒ，Ａ、ら　ＣＮｕｃｌｅｉ
ｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１１．２７４５（１９８３）
）は、酵母の３−ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子の
５′−非翻訳領域に存在するプロモーターを用いてサブ
タイプ不明のＨＢｓＡｇを発現させ、１１の培ｇ！液あ
たり５０μ２のＨＢｓＡｇの生成ｔｉめでいる。Ｍｕｒ
ｒａｙ　、　Ｋら（Ｔｈｅ　　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ
　　３．　６４５（１９８４））　　も、ＰＨ０５プロ
モーターを用いてａｄｙｗ型ＨＢｓＡｇを発現させて、
菌体蛋白のく０１％に相当するＨＢｓＡｇが生成したこ
とを報告している。

発明が解決しようとする問題点 従来知られている方法では、まだＨＢｓＡｇの産生量が
少なく、実用化にはより一層の産生量の改善が必要であ
ると考えられている。

問題点を解決するための手段 ＷＫ生物による蛋白合成開始には、ｍＲＮＡの５゜末端
の先導＠域に１６５　’ＪポゾーマルＲＮＡの３″末端
と相補な塩基配列（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａ１ｇ８ｒｎｏ配列
；Ｎａｔｕｒｅ　２５４．３＋（１９７５））の存在が
重要な役？Ｊを果たしていることが知られている。一方
、真核生物の５′非翻訳領域には、１８Ｓリポゾーマル
ＲＮＡ（１８ｓｒＲＮＡ）の３″末端と明確に相補する
配列は認められていない。そこで、本発明者らは、酵母
形質転換体によるＨＢｓＡｇ生産量を改善するために、
１８ｓ　　ｒＲＮＡの３′末端部分と相補性の高い配列
を人為的に造成することによって、蛋白合成効率の大巾
な改善に成功した。すなわち、ＰＨ０５プロモーターの
−２１〜−８０＠戚には、１８ｓｒＲＮＡの３′末端に
相補な配列が存在しているが、この下流にさらに相補な
配列が連結されたＨＢｓＡｇ遺伝子発現用プラスミドを
作製した。その結果、新規な該プラスミドが導入された
酵母は、従来のＨＢｓＡｇ産生量を大巾に上回る著量の
ＨＢｓＡｇを産生ずることを知り、本発明を完成するに
至った。

本願明細書および図面で用いる記号の意義は第１表に示
すとおりである。

第１表 ＤＮＡ　　　デオキシリポ核酸 Ａ　　　　アデニン　　　　　　　　　　　　　　　　
　２Ｔ　　　チミン Ｇ　　　グアニン Ｃシトシン Ｕ　　　　クラシル ｍ　　　Ａ　　　Ｎ’、Ｎ６−シメチルアテ′ニンＲＮ
Ａ　　　　リポ核酸 ｒＲＮＡ　　　リポゾーマルＲＮＡ ｄＡＴＰ　　　デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ　
　　デオキシチミジン三リン酸ｄＧＴＰ　　　デオキシ
グアノシン三リン酸ｄ　ＣＴＰ　　　デオキシシチジン
三リン酸ＡＴＰ　　　アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ　　　エチレンジアミン四酢酸ＳＤＳ　　　　
ドデシル硫酸ナトリクムＧｌｙ　　　グリシン Ａｌａ　　　アラニン Ｖａｌ　　　バリン Ｌｅｕ　　　　ロイシン １１ｅ　　　インロイシン Ｓｅｒ　　　セリン Ｔｈｒ　　　スレオニン Ｃｙｓ　　　システィン Ｍｅｔ　　　メチオニン Ｇｌｕ　　　　グルタミン酸 Ａｓｐ　　　アスパラギン酸 Ｌｙｓ　　　　リジン Ａｒｇ　　　アルギニン Ｈｉｓ　　　　ヒスチジン Ｐｈｅ　　　　フェニルアラニン Ｔｙｒ　　　チロシン Ｔｒｐ　　　　トリプトファン Ｐｒｏ　　　　プロリン Ａｓｎ　　　　アスパラギン Ｇｌｎ　　　グルタミン Ａ　ｐｒ　　　　アンピシリン耐性遺伝子ａｒｓ１　　
　オートノマス・レプリグーション・シーフェンス１　
（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ　ｌ　） ＩＲインバーテツド・リピート （１ｎｖｅｒｔｅｄ　ｒｅｐｅａｔ　）本発明で用いら
れるＢ型肝炎ウイルス表面抗厚をフードするＤＮＡのう
ち、たとえばａｄｗ型Ｂ型肝炎クイりスの表面抗原をフ
ードするＤＮＡはａｄｗ型Ｂ型肝炎クイりスの表面抗原
をフードするものであればいかなる配列のものであって
もよいが、第１図で示されるＤＮＡがより好ましい。該
ＤＮＡは化学合成したものでも、ＨＢＶをコードするＤ
ＮＡから酵素的に切り出しんものであってもよく、たと
えば以下に示す方法によって調製することができる。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１．１７４
７（１９８３）に記載されてい、５３．２ＫｂＯａｄｗ
型ＨＢＶをコードするＤＮＡが組み込まれたプラスミド
ｐＨＢＶ９３３を制限酵素ＢａｍＨＩとＨｐａＩで消化
することにより）ｉＢｓＡｇ　ｆフードす６　Ｄ　Ｎ　
Ａの全塩基配列を含む９３１ｂｐＤＮＡ断片を切り出す
ことができる。該断片を制限酵素５ａｕ３Ａ　でさらに
部分分解することにより、ａｄｗ型ＨＢｓＡｇをコード
するＤＮＡの翻訳開始コドンＡＴＧの直前に存在する５
ａｕ３Ａ認識部位で切断された８０９　ｂｐ　ＤＮＡ断
片を得る。該断片にＤＮＡポリ／ラーゼＩラージ・フラ
グメントを作用させて平滑末端にし、ＢａｍＨＩリンカ
−１ｄ（ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ）を結合させた後、プラ
スミドｐＢＲ３２２のＢａｍ　Ｈ１部位にサブクローニ
ングし、プラスミドｐＨＢｓ　５１　　を得る。該プラ
スミドを制限酵素Ｈｐａｎで消化することによりａｄｗ
型ＨＢｓＡｇ　ｋフードするＤＮＡを含む８１５ｂｐ　
ＤＮＡ断片を切り出す。該断片にＤＮＡポリメラーゼｌ
ラージ・７ラグメントラ作用させて平滑末端にし、Ｘｈ
ｏ　Ｉリンカ−ｄ（ＣＣＴＣＧＡＧＧ　）を結合させた
後、制限酵素ＸｈｏＩを作用させて接着末端をもつ８２
３　ｂｐ　ＤＮＡ断片を調製すれば、１８ｓｒＲＮＡの
３′末端部分に存在する配列３′ＧＵＣＣ５′　と相補
な配列が生成する。

次に、酵母の発現用ベクターは、Ｍ　１ｙａｎｏｈａｒ
ａ　、　Ａ。

ら（前出）の方法に準じて次のように作製する。

大腸菌−酵母シャトルベクターｐＳＨ１９（Ｈａｒａｓ
ｈｉｍａ。

Ｓ、ら；　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　４，
７７１（１９８４））のＢａｍＨｌ−５ａｌＩ部位に、
ＰＨ０５を含むプラスミドｐＪＡ１（Ｋｒａｍｅｒ、　
Ｒ，んａｎｄ　Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｎ、　；　Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、二、　６５４１（１９８０））に制
限酵素ＢａｍＨＩと５ａｌＩｉ作用させて得られる０、
６ＫｂＤＮＡ断片を挿入し、プラスミドｐＰＨＯ１２を
得る。該０６ＫｂＤＮＡ断片中にはＰＨ０５のプロモー
ターとＰＨ０５のＮ末端側アミノ酸２７個をコードして
いる領域が含まれているため、後者の領域をヌクレアー
ゼＢＡＬ−３１を作用させて除去する必要がある。

そこで、該プラスミドｐＰＨｏ１２に制限酵素Ｓａｌ■
を作用させて開環した後、該ヌクレアーゼを作用するこ
とにより、ＰＨ０５の構造遺伝子のコード領域が完全に
除かれ、かつ−２０〜−３０に存在する１８５　ｒＲＮ
Ａの３′末端部分と相補な配列（ＣＡＡＡＴＡＧＡＧＣ
）が保存された発現用ベクターｐＰＨＯ１７を作製する
ことができる。

上述の発現用ベクターｐＰＨＯ１７のＸｈｏ　Ｉ部位に
、前述のａｄｗ型ＨＢｓＡｇきフードするＤＮＡを含む
８２３　ｂｐ　ＤＮＡ断片を挿入することにより、発現
用プラスミドｐＰＨＯ１？−５８ｆ作製することができ
る。

ａｄｗ型以外のＨＢＳＡｇ（例、ａｄｒ型、ａｙｒ型、
ａｙｗ型）発現プラスミドも上記の方法に準じて調製す
ることができる。

これを用いてロイシン要求性の宿主酵母、たとえば、サ
ツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）　ＡＨ２２Ｒ’″（ａ　Ｉ
ｅｕ２　　ｈｉｓ４　　ｃａｎｌ　ｃｉｒ”ｐｈｏ　８
０　）　ＣＭｉｙａｎｏｈａｒａ　、　Ａ、ら、前出）
、に３３−７Ｂ（ｐｈｏ８０−ＡＨ２２，ｐｈｏ　８−
２　）ちるいはに３３−ｓ　ｖ　（ｐｈ。

８Ｏ−ＡＨ２２，ｐｈｏ８−２　ｔｒｐｌ）ｉ、公知の
方法（Ｈｉｎｎｅｎ、　Ａ、ら、　ＰｒｏＣ，Ｎａｔｌ
、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　。

、Ｌ！、、１９２７（１９７８））またはそれに準する
方法によって形質転換する。

なお、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ　ＡＨ２２Ｒ７は財団法人発酵研究所にＩＦＯ−１
０１３４として寄託され、また昭和５９年９月４日から
通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）
にＦＥＲＭＰ−７８２４として寄託されている。

得られた酵母形質転換体は、それ自体公知の培地で培養
する。培地としては、たとえばＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最
小培地（Ｂｏｓｔｉａｎ、　Ｋ、　Ｌ、ら、　Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　、　７７、÷５０５（１９８ｏ）〕
が挙げられる。

酵母形質転換体の培養は通常１５°ｃ−４３℃、好まし
くは２４℃〜８７℃で１０〜９６時間、好ましくは２４
〜７２時間行い、必要により通気や攪拌全加えることも
できる。

培養後、公知の方法で菌体？集め、緩衝液に懸濁させた
後、ブイモリエース〔生化学工業（製）〕あるいはガラ
スピーズなどによる機械的破壊によって菌体を破砕する
。この際、トリトンＸ−１００などの界面活性剤を加え
ることによって）ｉＢｓＡｇを有利に抽出することがで
きる。遠心分離によって得られた上情液からのＨＢｓＡ
ｇの単離は、通常知られているヒト血情由米のＨＢｓＡ
ｇ粒子の精製方決にしたがえばよい。

なお、）ＩＢｓＡｇの定量は、常法に従い、たとえばオ
ースリアロー１２５（グイナボ７）社製）あるいはオー
スブイムロ（グイナボット社製）で行うことができる。

作用 本発明で提供される組み換えＤＮＡを用いてＨＢｓＡｇ
を産生する場合、従来知られている方法に比べ、ＨＢｓ
Ａｇの産生量は大幅に上昇する。また、本発明で提供さ
れるＨＢｓＡｇはＨＢＶの感染防止のためのワクチンと
して使用することができる。

実施例 以下に、参考例および実施例を示して本発明を更に具体
的に説明するが、これにより本発明は限定されるもので
はない。

参考例１．酵母抑制性酸性ホスファターゼ・プロモータ
ーを含有する発現用ベクターの作製酵母Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　５２８８Ｃ株由
来の抑制性酸性ホスファターゼ遺伝子（ＰＨ０５）と構
成性酸性ホスファターゼ遺伝子（ＰＨ０８）を含む７９
ｋｂＤＮＡ断片を含む大腸菌プラスミド（ｐＪＡＩ　）
（Ｋｒａｍｅｒ。

えんａｎｄ　Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｎ、、　Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、　７７、６５４１（１９８０））、５０μｙに
２０ユニツトの制限酵素ＢａｍＨＩ　（宝酒造（ｌ！１
製〕と２０ユニツトの制限酵素５ａｌｌＣ宝酒造■製〕
を１００μｊの反応液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（
ｐＨ８，０）、　７ｍＭ　Ｍ！’Ｃｌｔ、　１００ｍＭ
　ＮａＣｌ、　２ｍＭ　２−メルカプトエタノール〕中
で３７℃、３時間作用させた後、１．０％アガロース（
Ｓｉｇｍａ社製）・スラブゲルを用いてＭ新液〔１００
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ！！、　１００ｍＭホク酸、　２
ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，３）：）中、１４０Ｖ、２時
間電気泳動にかけた。泳動後、０．６３ｋｂＤＮＡ断片
を含むゲル片を透析チューブ内に封入し、泳動用緩衝液
内に沈め、該ＤＮＡ断片をゲルから電気的に溶出したＣ
ＤｃＤｏｎｅｌｌ、　Ｍ、　Ｗ、ら＋　　Ｊ　８Ｍｏ　
ｌ−Ｂ　ｉｏｌ、、　］　ｌ　Ｏ＋１１９（１９７７）
）。透析チューブ内液をフェノール抽出さらにエーテル
抽出した後、ＮａＣｌを０．２Ｍになるように加え、つ
づいて２倍量の冷エタノールを加えて一２０℃でＤＮＡ
を沈澱させた。

１μ２のプラスミドｐｓＨ１９に２ユニツトの制限酵素
ＢａｍＨＩと２ユニツトの制限酵素５ａｌＩをｚＯμｔ
の反応液ＣＩ　ＯｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ！（ｐＨ８，
０）　、　？ｍＭｈ１９’ｃ１２，１００ｍＭ　ＮａＣ
ｌ、２ｍＭ　　２−メルカプトエタノール〕中で３７’
Ｃ，２時間作用させた後、該反Ｅ３液を０．８％アガロ
ース・スラブゲルを用いて上述の条件下で電気泳動にか
けた。泳動後、８゜０ｋｂＤＮＡ断片を上述の方法によ
ってゲルから分収し、フエ／−ルで除蛋白し、冷エタノ
ールでＤＮＡ１−沈澱させた（第２図参照）。

該８．０ｋｂＤＮＡ断片４００　ｎＰと前記０．６３ｋ
ｂＤＮＡ断片２００　ｎＰとを混合し、２０μｌの反応
液（６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｒ（ｐＨ７，６）、　６
．６ｍＭ　ＭＰＣ！、。

１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ　ＡＴＰ、　　２
ユニツトの’ＩＤＮＡＩＪガーゼ（宝酒造■製）〕中、
１４°Ｃで一夜作用させてＤＮＡを結合させた。この反
応液を用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ）　２９４株（Ｉ　ＦＯ−１４１７１）を前記Ｃｏｈ
ｅｎ　　らの方法に従って形質転換した。アンピシリン
耐性を指標として選択された形質転換体の中から、プラ
スミドＤＮＡをアルカリ抽圧法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、Ｈ
，Ｃ，ａｎｄＤｏｌｙ、　Ｊ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　７．１５１３（１９７９）　）
によって単離し、分子量と制限酵素による分解パターン
１調べ、ｐｓＨ１９のＢａｍＨＥ−ＳａｌＩ部位に、ｐ
ＪＡｌから単離された０、６３ｋｂＤＮＡ断片が挿入さ
れたプラスミドｐＰＨ０１２を分離した。（第２図参照
）。

３μ２のプラスミドｐＰＨ０１２ＤＮＡＫ２ｘ二７トの
制限酵素５ａｌＩを２０μｌの反応液（ｌｏｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｒ（ｐＨ７，５）　、　７　ｍＭ　ＭＰＣＩ！
ｔ、　１７５　ｍＭＮａＣｌ、０．２Ｍ　ＥＤＴＡ、７
ｍＭ　２−メルカプトエタノール〕中で３７℃、２時間
作用させた後、フェノールで除蛋白し、冷エタノールで
ＤＮＡを沈澱させた。このＤＮＡ、３μ２に１２ユニツ
トのＢＡＬ３１ヌクレアーゼ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を５０
　μｉの反応液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ　（ｐＨ
８、１）　、　　ｌ　２　ｍＭ　ＣａＣｌ、、　１２ｍ
Ｍ　Ｍ！’Ｃ１２，１ｍＭＥＤＴＡ）中で３０℃、２分
間作用させた後、フェノールで除蛋白し、冷エタノール
でＤＮＡを沈澱させた（第２図参照）。

２００１ＦのＸｈｏ　Ｉリンカ−ｄ（ＣＣＴＣＧＡＧＧ
）ＣＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社ｆｆ）
Ｋａユニ、ｙトのＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼ〔宝
酒造■製）を５０μｌの反Ｅ３液Ｃ５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣ！！（ｐＨ７，６）。

１０ｍＭ　Ｍ？ｃ！２．１０ｍＭ　２−メルカプトエタ
ノール、１００μＭＡＴＰ）中で３７℃、１時間作用さ
せて、５′末端をリン酸化した。

４ｎＰの５′末端がリン酸化されたＸｈｏ　Ｉリンカ−
Ｃｆ−Ｐ−ｄ（ＣＣＴＣＧＡＧＧ　））と４００ｎＰの
前述のＢＡＬ−３１で処理されたｐＰＨｏ　１２　Ｄ　
Ｎ　Ａとを混合し、前述の条件下で７４ＤＮＡ！Ｊガー
ゼの作用で結合させた。この反応液を用いて大腸菌１９
４株をＣｏｈｅｎらの方法に従って形質転換した。アン
ピノリン耐性を指標として選択された形質転換体の中か
ら、プラスミドＤＮＡ１前記アルカリ抽出法によって単
離し、ＢａｍＨＩとＸｈｏ　Ｉによる２重消化物の大き
さが０．５５ｋｂであるプラスミドｐＰＨ０１７を選択
した。ＢＡＬ−３１ヌクレアーゼ処理によって、ＰＨ０
５の開始フドンＡＴＧの上流２０ｂｐが除去されたこと
が、ジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法（Ｓａｎｇｅ
ｒ、　Ｆ、ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７４．５４６３（１９７？））に
よるＤＮＡ塩基配列の分析によって明らかになった（第
２図参照）。

実施例　ａｄｗ型Ｂ型肝炎クイりス表面抗ぶ遺伝子を発
現する組み換えＤＮＡ分子の構築および該ＤＮＡ分子に
よる酵母の形質転換 ■　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１１．
１７４７　（１９８３）に記載されているプラスニドｐ
ＨＢＶ　　９３３，４００μ２に５０ユニツトの制限酵
素ＢａｍＨＩと２０ユニツトの制限酵素ＨｐａＩ（宝酒
造■製〕とを８００μｌの反ＥＸＨＣ１０ｍＭ　Ｔｒｊ
ｓ−Ｈ（Ｊ’　（ｐＨ７，５）、　７ｍＭ　ＭＰＣＩ１
　。

１００ｍＭＫＣｌ、７ｍＭ　　２−メルカプトエタノー
ル〕中３７°Ｃ１２４時間作用させた後、１２％アガロ
ース・スラブゲルを用いて参考例１に記載の条件下で電
気泳動にかけた。泳動後、９３１ｂｐＤＮＡ断片を参考
例１に記載の方法によってゲルから分取した（第３図参
照）。

５０μ２の該９３１ｂｐＤＮＡ断片に、５０ユニツトの
制限酵素Ｓａｕ　３Ａ　Ｃ宝酒造■製〕を１００μｌの
反応液ＣＩ　ＯｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ！（ｐＨ７、ｓ
）、７ｍＭＭＰＣＩ、、１００ｍＭ　ＮａＣ！”：Ｊ中
で３７℃、１５分間作用させた後、直ちにフェノールで
除蛋白した。

該反応液を１．２％アガロース・スラグゲルを用いて参
考例１に記載の条件下で電気泳動にかけた。

泳動後、８０９ｂｐＤＮＡ断片を参考例１に記載の方法
によってゲルから分取した（第３図参照）。

該８０９ｂｐＤＮＡ、１μ２に５ユニツトのＤＮＡポリ
メラーゼＩ　ラージ・フラグメント（Ｎｅｗ　Ｅｎｇ−
１ａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製）　全３０　μｌの反応
ｉｃ４０ｍＭリン酸カリクムＢ衝ｇｊｌ（ｐＨ７，５）
、６．６ｍＭ　ＭｙＣ４゜］　ｍ　Ｍ　２−メルカプト
エタノール、３３μＭｄＡＴＰ、３３μＭ　　ｄＧＴＰ
、３３μＭｄＴＴＰ、３３μＭ　　ｄＣＴＰ）中で１２
℃、３０分間作用させて、接着末端を平滑末端にした後
、フェノールでＤＮＡ全完澱させた。該ＤＮＡ断片５０
０ｎｙを、参考例ＩＫ記載された条件下でリン酸化され
たＢａｍＨＩ　リンカ−（５’　−ｐ−ｄ　（ＣＣＧＧ
ＡＴＣＣＧＧ）、宝酒造Ｎ製〕、５０ｎ２とを混合し、
参考例１に記載の条件下で７４ＤＮＡリガーゼの作用で
詰合させた。該反応液ＫＩＯユニットの制限酵素Ｂａｍ
ＨＩを添加し、３７℃、３時間作用させて接着末端？生
成させた。反応後、フェノールで除蛋白し、試料をＴＥ
Ｎ緩衝液（ｌ　ＯｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ！（ｐＨ８，
０）　、　２００ｍＭＮａＣ？、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ）
で平衡化したセファｏ−ス４　Ｂ　（Ｐｈａｒｒｎａｃ
ｉａ社′！Ｊ）・力２ム（０，２５Ｘ２５６ｍ＋）にか
けてｖｏｉｄ　ｖｏｌｕｍｅ付近に溶呂される８１９ｂ
ｐ　ＤＮＡ断片を集め、冷エタノールで該ＤＮＡｔ沈ｆ
＋させた。

■　１μ２のプラスミドｐＢＲ３２２に２二二ｙ）の制
限酵素ＢａｍＨＩ　ｆ　２０μｅ　　の反応液Ｃｌ　Ｏ
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ（ｐＨ８，０）、７ｍＭＭ１’
Ｃ１ｍ、１００ｍＭ　ＮａＣ！、２ｍＭ２−メルカプト
エタノール〕中で３’７’Ｃ１２時間作用させた。反応
後、フェノールで除蛋白し、冷り／−ルを加えてＤＮＡ
を沈澱させた（ＢａｍＨ■消化ｐＢＲ３２２）。２ｏｏ
ｎｐ’の、３ＢａｍＨＩ消化ｐＢＲ３２２と２ＱＱｎｙ
の前記８１９ｂｐＤＮＡ断片とを、参考例１に記載の条
件下でＴ４ＤＮＡリガーゼの作用により結合させた。該
反応液音用いて大腸菌２９÷株？形質転換させ、参考例
１の方法に従って８１９ｂｐ　　ＤＮＡ断片がプラスミ
ドｐＢＲ３２２のＢａｍＨ１部位に挿入されたプラスミ
ドｐＨＢｓ５１全分離した（第３図参照）口 該プラスミド１）ＨＢＳ５１．５０μ２に２０ユニツト
の制限酵素ＨｐａｌｌＣ宝酒造■製〕を１００μｌの反
応液ＣＩ　ＯｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ！（ｐＨ７，４）
、　６ｍＭ　ＫＣ！！、　１０ｍＭ　ＭＰＣＩ、、　１
．ｏｍＭジチオスレイトール〕中で３７℃、３時間作用
させた後、反応液を１．５％アガロース・スラグゲルを
用いて参考例１に記載の条件下で電気泳動にかけた。泳
動後、８１５ｂｐＤＮＡ断片を参考例１に記載の方法で
ゲルから分取した（第３図参照）。

２μ２の該８１５ｂｐ　ＤＮＡＦｒ片に、ＤＮＡポリメ
ラーゼＩラージ・フラグメント’を上述に記載の条件下
で作用させて接着末端を平滑末端にした後、参考例１に
記載したようにリン酸化Ｘｈｏｌリンカ−を結合させ、
Ｘｈｏ　Ｉ処理によって接着末端を生成させた。前述の
条件下でセファローズ４Ｂカラムを用いて８２３ｂｐ　
ＤＮＡ断片を含む両分を集め、冷エタノールで該ＤＮＡ
を沈澱させた。

■　参考例１に記載された発現用ベクターｐＰＨ０１７
に２ユニツトの制限酵素Ｘｈｏ　Ｉを２０μｌの反応液
（ｌ　ＯｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ　（ｐＨ７，５）、　
７ｍＭ　Ｍ９Ｃ１２゜１００ｍＭＮａＣ１，７ｍＭ　２
−／／Ｌ／カプトエｐ　／　−ｚしｌ中で３７℃、２時
間作用させた後、フェノールで除蛋白し、冷エタノール
を加えてＤＮＡを沈澱させた（　Ｘｈｏ　Ｉ消化ｐＰＨ
Ｏ１？）。

２００　ｎ９の該Ｘｈｏｌ消化ｐＰＨＯ１７と２００ｎ
ｙの前記８２３ｂｐＤＮＡ断片とを参考例１に記載の条
件下で’ｌＤＮＡリガーゼの作用により結合させた。該
反Ｅ３液分用いて大腸菌２９４株？形質転換させ、参考
例１に記載の方法に従って８２３ｂｐＤＮＡ断片中のＨ
ＢｓＡｇａ伝子がＰＨ転子５プロモーターと順方向に挿
入されたプラスミドｐＰＨＯ１７−５８を分離した（第
３図参照）。

該プラスミドを用いて酵母宿主Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＡＨ２２Ｒ−ｆ形質転換し
、酵母形質転換体（ＡＨ２２Ｒ−／１）ＰＨ０１７−５
８）　　全取得した。

なお、当該菌株（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ　ＡＨ２２Ｒ／ｐＰＨｏ　ｌ　？−５８
）は財団法人発酵研究所にＩＦＯ−１０１３７として寄
託され、また、昭和５９年９月４日から通商産業省工業
技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に受託番ｅＦＥ
ＲＭ　Ｐ−７８２７として寄託されている。

発明の効果 第４図は本発明の組み換えＤＮＡＣ第４図（その１）〕
、ＰＨ０５プロモーターの下流にＨＢｓＡｇをフードす
るＤＮＡｆ：挿入した組み換えＤＮＡ　ＣＴｈｅ　ＥＭ
ＢＯＪｏｕｒｎａｌ　３．６４５（１９８４））　Ｃ第
４図（その２）〕およびＰＨ０５プロモーター領域に存
在する１８ＳｒＲＮＡの３′末端部分と相補な配列が欠
けた組み換（Ｄ　Ｎ　Ａ　ＣＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ。

５ｃｉ、　ＵＳＡ、　　皿、１（１９８３））（第４図
（その３）〕の、プロモーター頭域とＨＢｓＡｇ　ｋフ
ードするＤＮＡの連結部位の配列を示す。第４図から明
らかなように、本発明の組み換えＤＮＡは１８ｓｒＲＮ
Ａの３′末端部分の配列との相補性が従来のものに比べ
、著しく上昇していることがわかる。

本発明によるＨＢｓＡｇの産生量を、以下に製造例を示
して説明する。

製造例　ａｄｗ型ＨＢｓＡｇ遺伝子の酵母における発現 実施例で得られたａｄｗ型ＨＢＳＡｇ遺伝子発現プラス
ミドを保持する＃母形質転換体（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＡＨ２２Ｒ−／ｐＰＨｏ
　１？−５８）を、　Ｂｕｒｋ−ｈｏｌｄｅｒおよびそ
の低リン酸培地で、３０°Ｃ，２日間培養した後、菌体
全集め、生理食塩水で洗浄した。　Ｍｉｙａｎｏｈａｒ
ａ、　Ａ、らの方法〔前出〕に従って、菌体をＺＹｍｏ
ｌｙａｓｅ　（生化学工業■製〕によってスフェロプラ
ストにした後、スフェロプラストに０゜１％トリトンＸ
−１００を添加してＨＢｓＡｇ全抽出した。溶菌液を室
温で１５．０００ｒｐｍ、　１５５′＋間遠心分離にか
けて上清液を得た。この上清液のＨＢｓＡｇ活性ｔオー
スザイムｎ〔グイナボ７ト■製〕を用いて測定した。そ
の結果、ａｄｗ型ＨＢｓＡｇの生成金はプロス１１あた
り１．８４ｆｆ１ｇであった。

【図面の簡単な説明】

′＠１図はａｄｗ型Ｂ型肝炎クイりス表面抗ぷをコード
するＤＮＡ（下段）およびそのアミノ酸配列（上段）を
示す。 第２図はプラスミドｐＰＨＯ１７の構築図を示し、記号
Ｅ、Ｓ、Ｂ、Ｈおよ°びＸはそれぞ７′ＬＥｃｏＲＩ。 Ｓａｌ　Ｉ、　ＢａｍＨＩ、　ＨｉｎｄＩ［ｌおよびＸ
ｈｏｌ’ｚ表わす。 第３図はプラスミドｐＰＨＯ１？−５８の構築図ヲ示し
、記号Ｅ、Ｂ、ＸおよびＨはそれぞれＥｃｏＲＩ。 ＢａｍＨＩ、ＸｈｏｒおよびＨｉｎｄ［を示す。 第４図（その１）、（その２）および（その３）はプロ
モーター領域とＨＢｓＡｇをコードするＤＮＡの連結部
位の配列（上段）および１８　Ｓ　ｒＲＮＡの３′末端
部分の配列（下段）全示す。第４図（そのｌ）は本発明
の配列を、第４図（その２）および（その３）は従来技
術の配列？示す。 ”Ｊｌ；＋ ｅｔ ＴＧ 二Ｃ（ ハス− ＡＴＴ　ＴＡＡ ：ＣＡ　ＡＣＣＴＣＣＡＡＴ　ＣＡＣＴＣＡ　ＣＣＡ　
ＡＣＣ−丁　ＴＴＣ丁丁Ｔ　　ＴＧＴ　　ＣＴＣＴＧＧ
　　ＧＴＡ　　７Ａに竿２図 Ｅ　　ＯＡ２ α５５°　” ０．３５ 手＠￥、補　正置（自発） 昭和６０年９月ス殉 １、　事件の表示 昭和５９年特許願第１９３７６５号 ２　　発明の名称 組み換えＤＮＡおよびその用途 ３　　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　　大阪市東区道修町２丁目２７番地名称　　（２
９３）　　武田薬品工業株式会社代表者　倉林育四部 ４　　代理人 住所　大阪市此用区十三本町２丁目１７番８５号東京連
絡先（特許法規課）電話２７８−２２１８・２２１９５
、ｈｌｉ正の対象 明細書の発明の詳１（ｌＪな説明の欄 ６　補正の内容 （１）明細間第１３頁第１．１行の「寄託さイｔでいる
。」を「寄託され、該寄託Ｄ・ブタベスト条約に基つく
寄託に切り換えらＡｔて、受託昌号Ｆ　Ｅ　Ｒ〜ｌ［３
Ｐ−８０４として同研究所に保管されて（する。Ｊに訂
正する。 （２）明細書第２４頁第１３行の「寄託されている。」
をＶ寄託され、該寄託かブタベスト条約１こ塙つ（寄託
に切り換えられて、受託番号ＦＥＲルＩ　　ＢＰ−８５
４として同研究所に作Ｗ　されて（する。ヨ（ニ訂正す
る。 以上 受託番号変更届 昭和６０年９月２舶 １、　事件の表示 昭和５９年特許願第１９３７６５号 ２　　発明の名称 組み換えＤＮＡおよびその用途 ３　　手続をした者 事件との関係　　特許出願人 住　所　　　大阪市東区道修町２丁目２７呑地名　称　
　　（２９３）　　武田薬品工業株式会社代表者　倉林
育四部 ・１１代理人 住　所　大阪市淀用区十三本町２丁目１７番８５号ＳＩ
日寄託機関の名称 ６．１０受託番号 別紙のとおり ７　析寄託機関の名称 工業技術院微生物工業技術研究所 ８　新受託番号 別紙のとおり ９、添（寸書類の目録 （１）新受託番号を証明する書面　　　　　　　　　２
　通（２）別紙　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１　通以上

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）酵母抑制性酸性ホスファターゼ遺伝子の５′−非
   翻訳領域中に存在する１８ＳリポゾーマルＲＮＡの３′
   末端部分と相補な配列の直後に、Ｂ型肝炎ウイルスの表
   面抗原をコードするＤＮＡの上流に１８Ｓリポゾーマル
   ＲＮＡの３′末端部分に相補な配列が付加されたＤＮＡ
   が結合してなる組み換えＤＮＡ。
2. （２）酵母抑制性酸性ホスファターゼ遺伝子の５′−非
   翻訳領域中に存在する１８ＳリポゾーマルＲＮＡの３′
   末端部分と相補な配列の直後に、Ｂ型肝炎ウイルスの表
   面抗原をコードするＤＮＡの上流に１８Ｓリポゾーマル
   ＲＮＡの３′末端部分に相補な配列が付加されたＤＮＡ
   が結合してなる組み換えＤＮＡを含有する酵母。
3. （３）酵母抑制性酸性ホスファターゼ遺伝子の５′−非
   翻訳領域中に存在する１８ＳリポゾーマルＲＮＡの３′
   末端部分と相補な配列の直後に、Ｂ型肝炎ウイルスの表
   面抗原をコードするＤＮＡの上流に１８Ｓリポゾーマル
   ＲＮＡの３′末端部分に相補な配列が付加されたＤＮＡ
   が結合してなる組み換えＤＮＡを含有する酵母を培養し
   、培養物中にＢ型肝炎ウイルスの表面抗原を生成蓄積さ
   せ、それを採取することを特徴とするＢ型肝炎ウイルス
   の表面抗原の製造法。