JPH05506994A - セルロースまたはヘミセルロース分解性酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 セルロースまたはヘミセルロース分解性酵素発明の技術分野 本発明は、セルロースまたはヘミセルロース分解性酵素、その酵素をコードする ［ｌＮＡ構成物、その酵素の生産方法およびその酵素を含んでなるセルロースま たはヘミセルロースの分解剤に関する。

発明の背景 セルロースを分解できる酵素がバイオマスを液体燃料、ガスおよび飼料タンパク 質に転化することはすでに示唆されている。しかしながら、セルロース分解酵素 によるバイオマス由来の発酵性糖の製造は、例えば、今日使用されているセルロ ース分解性酵素の効率の悪さに起因して、いまだα−アミラーゼによる殿粉から のグルコースの製造と経済的に競合できない、さらに、セルロース分解性酵素は 、β−グルカンの分解用として醸造業で、小麦粉の性質を改良するために製パン 業で、セルロースの非結晶部分を除去してバルブの結晶セルロースの割合を高め るために製紙業で、そしてグＪレカンの消化を改善するために飼料業で使用され ているようである。セルロース分解性酵素のさらに重要な用途は、例えば綿含有 織物の硬さを的で（例えば、ヨーロッパ特許第２２００１６号参照）の使用また 番よ「ストーンウォッシュ」様の外観を織物に付与するために色の局所的変化を もたらす目的で（例えば、ヨーロツノｉ特許第３０７５６４号参照）生地を処理 することにある。

セルロース分解性酵素の寞用上の検針は、既知セルラーゼ調製物が各種の単一セ ルラーゼ成分の複雑な混合物として存在し、そしてかなり比活性が低い可能性が あるなどの性質により抑制されてきた。

多酵素系で単一成分の生産の最適化は困難であるため、セルロース分解性酵素の 工業的に存効な原価での生産が困難であり、そしてそれらの実用化は、所望の効 果を達成するにはかなり多量の酵素を使用する必要があることに起因する困難性 によって妨げられてきた。

上記に指摘したセルロース分解性酵素の短所は、高比活性の単一成分の酵素を選 択使用することによって改善される可能性がある。

単一成分のセルロース分解性酵素は、例えばトリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃ ｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）から単離された（Ｔｅｅｒｉ　ら、Ｇｅｎｅ　 ５１゜１９８７、　４３〜５２ページ、　ＰＪ、＾ｂｕｊａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｗｓ。

１５６、１９８８．１８０〜１８５ページ、およびＰ、Ｊ、　Ｋｒａｕｌｉｓ＋ 　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ±Ｕ訃、　１９８９．７２４１〜７２５７ページ、参照） 、ティー・レーセイ（工。

■且旦）のセルラーゼは、セルロースへのパインディングに役立つターミナルＡ 　６ｉ域、酵素のコアーにＡｆｉｉ域を連結するＢｌ域および触媒活性ドメイン を含むコアーから構成されていることが見い出された。別のティー・レーセイの セルラーゼのＡ領域は強く保持されていることが見い出されており、そしてファ ネロシエーテ・クリソスポリウム（ＰｈａｎｅｒｏｃｈａｅＬｅ　仙ｎμ出！吐 岬）により生産されるセルラーゼとも強い相同性を有することが観察された（Ｓ ｉｓｓら、Ｇｅｎｅ旦、　１９８８．４１１〜４２２ページ）。

発明の要約 驚くべきことに、トリコデルマ・レーセイまたはファネロシエーテ・クリソスポ リウムのいずれとも近値しない他の糸状菌は、ティー・レーセイのセルラーゼの Ａ領域に相同性のある領域を含む酵素を生産しうることが見い出された。

従って、本発明は、トリコデルマ（Ｔｒ＋ｃｈｏｄｅｒ■ａ）またはファネＵシ ェーテ（ＰｈａｎｅｒｏｃｈａａＬｏ）以外の糸状菌から誘導される可能性があ り、そしてトリコデルマ・レーセイ（□ｊ＋ｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）のセ ルラーゼのターミナル八領域に相同的な謔バインディングドメインを含んでなる セルロースまたはヘミセルロース分解性酵素に関する。

この酵素では、糖パインディングドメインが、次のアミノ酸配列工 ｘａａ　Ｘａａ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　ＧＩＹ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　 Ｘａａ　Ｇｌｙ　’Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｃｆ１Ｍ　Ｘ≠■ ａａ または不溶性のセルロース性基質もしくはヘミセルロース性基質に対して酵素を パインディングしうる前記配列の副配列を含んでなる。

’Ｘａａ　Ｊは、別の酵素の糖バインディングドメインのアミノ酸配列における 変異を示すことを意図する。ハイフンは、（他の類似の酵素との比較で）アミノ 酸配列における「大きな相違点」を示すこと「ヘミセルロース」の語は、グルカ ン（１ｉ粉の一部分）類、マンナン類、キシラン類、アラビナン類、ポリグルク ロン酸またはポリガラクツロン酸を含むことを意図している。「糖パインディン グドメインＪ（ｒｃＢＤＪ）は、糖基質、特に前記のようなセルロースまたはヘ ミセルロースに対して酵素をパインディングさせうるアミノ酸配列を示すことを 意図している。「相同」の語は、本発明の酵素の糖パインディングドメインを構 成するアミノ酸配列と、ティー・レーセイのセルラーゼにみられるＡ領域（ｒＡ ｓＩ域」はティー・レーセイのセルラーゼのセルロース（すなわち、糖）パイン ディングドメインを表わすのに使用される語である）を構成するアミノ酸配列と の同一性の程度が高いことを示すことが意図されている。

現在のところ、セルロースまたはヘミセルロース分解性酵素は、固体基質（セル ロースを含む）へのパインディングを介する結果、そのような基質に対する酵素 活性を高める酵素分子中の糖パインディングドメインの機能により一定の望まし い特性をもつティー・レーセイのセルラーゼのＡｅｌ域に対するその相同性に基 づき糖パインディングドメイン（または「Ａ　Ｓｉ域」）と同一視できるアミノ 酸配列を含むものと信じられている。従って、各種微生物に由来する糖パインデ ィングドメイン含有酵素の同定および調製は相当な興味がもたれている。

本発明のセルロースまたはヘミセルロース分解性酵素は、ティー・レーセイのセ ルラーゼのＡ領域をコードする［ｌＮＡの少なくとも一部を含むプローブにより 別の糸状菌のゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによ り都合よく同定されうる０種内（すなわち、異なるティー・レーセイのセルラー ゼ）および種間で異なるセルロースまたはヘミセルロース分解性酵素の糖パイン ディングドメインとの相同性が観察されることが、前記スクリーニング方法が現 に興味のある酵素を単離する簡便な方法であると信じられる理由である。

発明の詳細な記述 本発明の酵素に含まれる糖バインディングドメイン（ＣＢＤ）は、特に、フミコ ーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）　、例えばフミコーラ・インソレンス（）Ｉｕｓｉｃ ｏｌａ　１ｎｓｏｌｅｎｓ）　、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）　、例えばフ ザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘμ且コ憇）、またはミセリ オブトーラ（勺ｙ（１）Ｉｏ吐肢■）、例えばミセリオプトーラ・サーモフィル （ｈ夏月ｍ佳眩」肋μ！旺恒−扱）の菌株より誘導可能である。

上記に示されるアミノ酸配列における変化のいくつかは、「保存的（ｃｏｎｓｅ ｒｖａｔｉｖｅ）　Ｊ　、ずなわち本発明の各１１ｃＢ［ｌ含有酵素間のこれら の位置では、一定のアミノ酸が好ましい、従って、先に示した配列の１位のアミ ノ酸はＴｒｐ又はＴｙｒが好ましい、２位のアミノ酸はＧｌｙまたはＡｌａが好 ましい、７位のアミノ酸はＧｌｎ、　ｌｉｅまたはＡｓｎが好ましい、８位のア ミノ酸はＧｌｙまたはＡｓｎが好ましい、９位のアミノ酸はＴｒｐ、　Ｉ’ｈｅ または丁ｙｒが好ましい、１０位のアミノ酸はＳｅｔ。

Ａｓｎ、　ＴｈｒまたはＧｉｎが好ましい、１２位のアミノ酸はＰｒｏ、Ａｌａ またはＣｙｓが好ましい、　１３位のアミノ酸はＴｈｒ＋＾ｒｇまたはＬｙｓが 好ましい。

１４位のアミノ酸はＴｈｒ、　Ｃｙｓまたは＾ｓｎが好ましい、１８位のアミノ 酸はＧｌｙまたはＰｒｏが好ましい、　１９位のアミノ酸（存在するとすれば） はＳｅｒ＋　Ｔｈｒ、　Ｐｈｅ＋　ＬｅｕまたはＡｌａが好ましい、２０位のア ミノ酸はＴｈｒまたは１．ｙｓが好ましい、２４位のアミノ酸はＧｉｎまたはＩ ｌｅが好ましい、２６位のアミノ酸はＧ１１．＾ｓｐまたはＡｌａが好ましい、 ２７位のアミノ酸はＴｒｐ、　ＰｈｅまたはＴｙｒが好ましい、２９位のアミノ 酸はＳｅｔ、　ＨｉｓまたはＴｙｒが好ましい、３２位のアミノ酸はＬｅｕ＋　 ｌｉｏ、　Ｇｉｎ、　ＶａｔまたはＴｈｒが好ましい。

本発明の特定のＣＢＤ含有酵素の例は、以下のアミノ酸配列の１つを含むもので ある。

Ｌａｕ； Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　工ｌ＠　ｋＳｎ　 Ａｓｐ　’ｒｒｐ　Ｔｙｒ　Ｈｌｓ　Ｇｉｎ　ｃｙｓＬ＠ｕ； Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　工１＠Ｇｌｙ　Ｐｈ＠入Ｉ ｎ　ＧＩＹ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　ｃｙｓ　ｃｙｓ　Ｇ１ｎ５ａｒ　Ｇｌｙ　Ｓｉｒ 　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　′ｒｒｐ　Ｔｙ ｒ　Ｓｉｒ　Ｇｉｎ　ＣｙｓＬａｕ； Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　 Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　ＡｌａＧｌｕ　Ｇｌｙ　− Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　 Ｓｓｒ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　ＴｈｒＰｒｏ； Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　 Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　ＳｅｒＧｌｎ　Ｇｌｙ　− Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　八ｌａ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　 Ｓｉｒ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　ＬｓｕＡｓｎ； Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　 Ｓａｒ　Ｇａｙ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　ＧｌｕＡｌａ　Ｇｌｙ　Ｓ ｅｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　入ｒｇ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｔ ｙｒ　Ｓａｒ　Ｇｉｎ　ｃｙｓ工１Ｃ２ ｒｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｃｙｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　ＧｌｙＴｆｒ　ｓ ＠ｒ　ＧｌｙＣＹ＊　Ａｒｑ入ｓｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕｓｉｒ　ｃｌｙ　Ｓｉｒ　 Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　ｘｒｇ　入１ａ　Ｇｉｎ　Ａｇｎ　ＡＪｐ　ｒｆ　Ｔｙｒ　ｓ ｓｒ　（：ｌｎ　ＣＹＩＩａｕＩ ＴｒｐＧＩＹ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｇａｙ　ＧｌｙＧｉｎ　Ａｓｒ＋　Ｔｙｒ　Ｓ ｉｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ、　’ｒｈｚ”　Ｔｈｒ　Ｃｏｇ　Ｌx！ｌ ５ａｒ　Ｐｒｏ　Ｐｈ＠　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｅ　工１ａ　Ａｇｎ　 入ｓｐ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　ｓａｒ　Ｇｉｎ　ＣｙｓＧｉｎ：または Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ入ａｎ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｔ ｈｒ　Ｇｌｙλｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓλ１ａＳａｒ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　 Ｌｙｓ　Ｃｙｍ　Ｇｌｕ　Ｌｙｅ　Ｉｌａλｇｎ　Ａｊｐ　ＴＬ？　智ｒ　７ｙ ｙ　Ｇｉｎ　劉Ｖａｎ　。

本発明のセルロースまたはヘミセルロース分解性酵素は、前記糖パインディング ドメインに隣接し、そしてそれを酵素の触媒活性ドメインに結合する連結ＢＨ域 （ティー・レーセイのセルラーゼについて確立されている命名法を使用）を特定 するアミノ酸配列をさらに含むことができる１本発明の酵素に関して確認された 前記ＢｌＩ域の配列は、このような配列が親水性で非荷電の一定のアミノ酸が優 先的であり、そして特にグリシンおよび／またはアスパラギンおよび／またはプ ロリンおよび／またはセリンおよび／またはスレオニンおよび／またはグルタミ ンに雪むごとにより特徴付けられることを示す、このＢ　ｊｌ域の特異な構造は 、特に、主としてグリシンとアスパラギンからなる短い反復単位を含む配列によ って配列に柔軟性を付与する。このような反復単位は、セリン／スレオニン型の Ｂ　９５域を含むティー・レーセイまたはビー・クリソスポリウム（！ｉ。

印互ｇガ力復）のＢ５ｆｆ域配列には見い出されていない、この柔軟構造が、不 溶性基質に対してＡ領域を介してパインディングした酵素の触媒活性ドメインの 作用を促進し、そのため本発明の酵素に有益な特性を付与するものと考えられる 。

本発明の酵素に含まれるＢｆ＋ｉ域の具体例は、次のアミノ酸配列を有する。

ｘｌａ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　 Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙｃｌｙ　Ｇｌｙ　Ａ ｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｐ ｒｏ　ＧＩＹ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｐｒ。

Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　 Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　ＧＩＹ　Ａｓｎ　ＣｙｓＳａｒ　Ｐｒｏ　Ｌ ｅｕｒ Ｐｒｏ　ＧＩＹ　ＧＡＹ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　ＡＳｎ　ＡＳｎ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　 Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｔｒｐｃｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓ ｅｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｇ ｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　ＡｓｎＡｓｎ　Ｇｒｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌ ｙ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ａｇｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｈ　Ａｓｎ　Ａｓ ｎ　Ｇｌｙ　ＧｌｙＧｌｙ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ＧＩＹ　Ｓａｒ 　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ；Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ 　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｉｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ 　ＡｓｎＰｒｏ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　 Ｐｈｅ　工１ａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｐｒ。

Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　 Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｌｙｓ；Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｌｓｕ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　 Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｇｌｒ＋　Ｇｌｙ　Ａ！Ｉｎ　Ｐｒｏ　Ａｇ ｎ　Ｇ奄■ Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　′Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ 　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｇｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ｃｙ■ Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ； Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　ＴｈｒＴ ｈｒ　Ｓａｒ　Ｓｅｒ　Ｓ＠ｒ　Ｓｉｒ　Ｔｈｒ　’ｒｈｒＳｉｒ　Ａｒｇ　Ａ ｌａ　Ｔｈｒ　Ｓｓｒ、　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓｉｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　 Ｖａｌ　Ｔｈｒ　ｓａｒ　Ｉｌｓ　Ｔｈ■ Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　工ｌｅ　 Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　入１ａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　ＴｈｒＡｌａ　Ｓａｒ　Ｔ ｙｒ　Ａｓｎ； ｃｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　 Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　ｋｓｎ　Ｐｒｏ　ＴｈｒＡｓｎ　Ｐｒｏ　Ｔ ｈｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｇｎ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇ ｌｙ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　’ｒｈｒ　Ａｓ■ Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｕｙ　 Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｒ＋　Ｃｙｓ　５ａ■ Ｐｒｏ　Ｌｅｕ；または Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ工Ｉｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｉｒ　Ｓｉｒ　Ｔ ｈｒ　Ｓａｒ　Ｓｉｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　ＧｉｎＰｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅ ｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈ ｒ　Ｓ＠ｒ　Ｓａｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒ。

Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　 Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｒｇもう一つの態様では、本発明はトリコデルマ・ レーセイのセルラーゼのターミナルＡ　８Ｎ域に相同的な糖バインディングドメ インに関する。そしてこの糖バインディングドメインは次のアミノ酸配列または 不溶性セルロース性もしくはヘミセルロース性の基質に対する一部分にパインデ ィングさせることのできるそれらの副配列を含んでなる。

具体的な塘パインディングドメインの例は、前記のアミノ酸配列を有するもので ある。

さらなる態様では、本発明はセルロースまたはヘミセルロース分解性酵素から誘 導される連結Ｂｊｌ域であって、アミノ酸類グリシンおよび／またはアスパラギ ンおよび／またはプロリンおよび／またはセリンおよび／またはスレオニンおよ び／またはグルタミンに豊んだアミノ酸配列を含んでなる領域に関する。前述の ように、これらのアミノ酸は、しばしば短い反復単位を生じる場合がある。Ｂｆ ｉＪｌ域の配列の具体例は前記に示したものである。

本発明は、異なるセルロースまたはヘミセルロース分解性酵素のいろいろな領域 を混ぜる機会を提供し、そうすることでＣＨＤ　＋　Ｂ　８ｉ域および触媒活性 ドメインの新規な組み合わせを創製することでこのタイプの酵素の新規な活性プ ロフィールをもたらす、従って、本発明の酵素は、アミノ酸配列がある天然のセ ルロースまたはヘミセルロース分解性酵素から誘導されるＣＨＤを特定するアミ ノ酸配列、アミノ酸配列が他の天然のセルロースまたはヘミセルロース分解性酵 素から誘導される連結ＢｅＪＩ域を特定するアミノ酸配列、ならびに前記ＣＯＤ もしくはＢ　Ｑｌ域のいずれかを供給する酵素または第三の酵素から誘導される 触媒活性ドメインを含んでなるものであることができる。具体的なＬ！ｉ様では 、触媒活性ドメインが天然に存在しない酵素がＣＢＤまたはＢ　ｗＩ域のいずれ かを含んでなる。この態様では、ＣＢＤおよびＢＴｉｌ域が欠失する酵素から改 善された性質をもつ酵素を構成できる。

本発明の酵素は、エンドグルカナーゼ（セルロース繊維における低結晶質の非晶 賀領域を加水分解できる）、セロビオヒドロラーゼ（またエンドグルカナーゼと しても知られている、４セロビオ一ス単位を除去することによって非還元鎖端か らセルロースを分解できる）またはβ−グルコシダーゼのようなセルラーゼであ ることが好ましい。

またさらなる態様では、本発明は前記のようなセルロースまたはヘミセルロース 分解性酵素をコードするＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ構成物に関する。

例えば、本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列は、セルロースまたはヘミセルロ ース分解性酵素を産生ずる、アミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フザリウム（Ｆ ｕｓａｒｉｕ膳）、またはミセリオブトラ（Ｍ　ｃｅｌｉｏ　ｔｈｏｒａ）の１ 菌株のような微生物のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを作製し、そして、前 記のような、酵素の全もしくは部分アミノ酸配列に基づき合成されるオリゴヌク レオチドプローブまたはティー・レーセイのセルラーゼに由来るすＡ領域の部分 もしくは全ＤＮＡ配列に基づくプローブにハイブリダイゼーションすることによ る常法、あるいは適当な酵素活性を発現するクローンの選別法、あるいは天然の セルロースまたはヘミセルロース分解性酵素に対して産生される抗体と反応性の タンパク質を生産するクローンの選別法による陽性クローンのスクリーニングに より単離できる。

また、本発明の酵素をコードする０１１＾配列は、確立された標準法、例えば、 Ｓ、Ｌ、　ＢｅａｕｃａｇｅおよびＭ、１１．　Ｃａｒｕｔｂｅｒｓ＋　Ｔｅｔ ｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ　２２．１９８１．１８５９〜１８６９ページ に記載されたホスホアミシト法またはＭａｔｔｈｅｓ　ら、Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪ 、　’４．１９８４．８０１〜８０５ページに記載された方法により合成的に調 製できる。ホスホラミド法によれば、オリゴヌクレオチド類は、例えば自動ＤＮ Ａシンセサイザーにより合成され、精製され、アニール化され、連結され、次い で適当なベクターにクローニングされる。

最後に、ＤＮＡ配列は、標準的な技法に従う、合成起源、ゲノム起源またはｃＤ ＮＡ起源のフラグメント、適する場合には、完全なりＮＡ構放物のいろいろな部 分に対応するフラグメントの連結によって調製されたゲノムと合成の混合起源、 合成とｃＤＮＡの混合起源またはゲノムとｃＤＮＡの混合起源からなることがで きる。従って、本発明の酵素ＣＢＤをコードするＤＮＡ配列は、ゲノム起源であ るが、本発明の酵素の８ｍｌ域をコードする［ｌＮＡＮＡ配列成起源であること ができ、あるいはその逆であってもよく、本発明の酵素の触媒活性ドメインをコ ードするＤＮＡ配列はゲノムまたはｃＤＮＡ起源からなることが都合よい。

ＤＮＡ構成物はまた、例えば米国特許第４，６８３，２０２号明細書または１？ 、に、　５ａｉｋｉら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３９．１９８８．４８７〜４９１ペ ージに記載されるような特定のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によ って調製することもできる。

また、本発明は前記のような挿入ＤＮＡ　ｆｌＩ成物放物持する発現ベクターに も関する。この発現ベクターは、好ましくは、特定の宿主有機体で酵素の発現を 可能にする適当なプロモーター、オペレーターおよびターミネータ−配列、なら びに問題の宿主有機体でベクターの復製を可能にする復製起源を含んでもよい。

次に、得られた発現ベクターを、糸状菌細胞のような適当な宿主細胞に形質転換 する。宿主細胞の好ましい例としては、アスペルギルス（ハとｎ１」■）の−の 種であり、最も好ましくはアスペルギルスｔ　’）　ｔ’　（ハＰ」山■■肛■ 憇）またはアスペルギルスニガー（ハフ恒ｌ扛）が挙げられる。糸状菌細胞は、 プロトプラストの形成、プロトプラストの形質転換、次いで細胞壁の再生を伴う それ自体既知の方法で形質転換できる。宿主微生物としてのアスペルギルスの使 用は、ヨーロッパ特許第２３８，０２３号（Ｎｏｖａ　Ｔｎｄｕｓｔｒｉ＾／Ｓ ）に記載されており、その内容は引用することにより本明細書の内容となる。

また、宿主細胞は細菌、特にストレプトミセス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｗ　ｃｅｓ）お よびバチルス（ＢａｃｔｌｌｕＳ）−さらにイー・コリー（旦、　ｃｏｌｉ）の 菌株であってもよい、ｓｉｉ細胞の形質転換は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａ ｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ。

１９８９、に記載されるような常法に従って実施することができる。

適当なりＮＡ配列およびベクターの構成物のスクリーニングは、標準的技法（Ｓ ａｍｂｒｏｏｋら、上記参照）により実施してもよい。

本発明はさらに、前記のようなセルロースまたはヘミセルロース分解性酵素の生 産方法であって、本発明の発現ベクターで形質転換された細胞を酵素の生産を行 う条件下で培養し、次いで培養物から酵素を回収することからなる方法に関する 。形質転換された宿主細胞の培養に使用される培地は、問題の宿主細胞を増殖す るのに適するいずれの常用されている培地であってもよい０発現された酵素は培 地中に分泌されるものが都合よく、そして培地からの遠心もしくは濾過による細 胞の分離および硫酸アンモニウムのような塩による培地のタンパク質成分の沈殿 、次いでイオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィ ーなどのクロマトグラフ操作を始めとする周知の方法で回収できる。

前記のような組換えＤＮＡ技法、ならびに当該技術分野で周知の発酵法および変 異または他の方法を使用することにより、高純度のセルロースまたはヘミセルロ ース分解性酵素を高収率で提供することができる。

さらに本発明は、セルロースまたはヘミセルロースの分解剤であって、前記のよ うにセルロースまたはヘミセルロース分解性酵素を含んでなる剤に関する。酵素 の特異性に応じて、前記用途の一つ（または一つ以上であってもよい）に使用さ れることが予期されている。特定のＢ様では、前記分解剤は本発明の２種以上の 組み合わせまたはセルロースもしくはヘミセルロース分解性活性を有する１種以 上の他の酵素と本発明の１種以上の酵素との組み合わせを含んでよい。

図面の簡単な説明 図１はプラスミドｐＳＸ２２４の構築を示し、図２はプラスミドｐ）ｌＷ４８５ の構築を示し、図３はプラスミドｐＨＷ６９７およびｐＨＷ７０４の構築を示し 、図４はプラスミドｐｌ（Ｗ７６８の構築を示し、図５はプラスミドｐｓＸ３２ ０の制限地図を示し、図６はプラスミドｐＳＸ７７７の構築を示し、図７はプラ スミドｐＣａＨｊ　１７０の構築を示し、図８はプラスミドｒＭ４の構築を示し 、図９は〜４３ｋＤのエンドグルカナーゼシグナルペプチドとＥｎｄｏ　１のＮ 末端のＳＯＥ融合を示し、 図１０はプラスミドｐＣａＦＩｊ　１８０の構築を示し、図１１はエフ・オキシ スポラム（旦、■〃１ｍ堕）のＣ−ファミリーセロビオヒドロラーゼのＤＮＡ配 列および誘導されたアミノ酸配列を示す、 図１２はエフ・オキシスポラムピーファミリー　セルラーゼのＩ）ＮＡ配列およ び誘導されたアミノ酸配列を示す、図１３はエフ・オキシスポラムのＣ−ファミ リー　エンドクルカナーゼのＤＮＡ配列および誘導されたアミノ酸配列を示す、 図１４．Ａ−Ｅはエッチ・インソレンス（旦、　１ｎｓｏｌｅｎｓ）エンドヌク レアーゼ１（ＥＧＩ）のＤＮＡ配列および誘導されたアミノ酸配列を示す、なら びに 図１５．Ａ−Ｄはビー・ロウタス（ｆｉ、　１ａｕｔｕｓ）　（ＮＣＩＭＢ４０ ２５０）ナーゼのＣＢＤおよびＢｔＩＪＩ域の融合の［ｌＮＡＮＡ配列び誘導さ れたアミノ酸配列を示す。

本発明は、以下の実施例によりさらに具体的に説明するが、いずれかの方法に特 許請求された発明の範囲を限定することを意図しない。

実１１１ エッチ・インソレンス（Ｈ，ｉｎｓ鄭遺り）由来のＡ領域含有クローン際公開第 −０８９１０９２５９号に記載されている）から、Ｋｏｐｌａｎら、ＢｉｏｃＪ ＋ｅｍ。

Ｊ、　１８３　（１９７９）１８１〜１８４ページに記載される方法に準じｍＲ Ｎ＾を調製した。　２０．０００クローン含有のｃ［ｌＮＡライブラリーを、０ ｋａｙａｓ＋ａおよびにほぼ従って得た。

ｃＤＮＡライブラリーは、４種のＺ、　ｒｅｅｓｅｉセルラーゼ遺伝子における Ａ領域のＮ末端部分の公表された配列（Ｐｅｎｔｔｉｌ’Ｍら、Ｇｅｎｅ　４５ ＋（１９８６）、　２５３〜６３　；　５ａｌｏｈｅｉｓｏら、Ｇｅｎｅ　６３ ．　（１９８Ｂ）、　１１〜２１　；Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ　ら、ＢＩｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ＋　１９８３年１０月、　６９１〜６９６ＨＴｅｅｒｉら、Ｇｅｎ ｅ　５１　（１９８７）　４３〜５２）に従って設計されたアンチセンス構造の オリゴヌクレオチドプローブを使用して、Ｇｅｒｇｅｎら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ ｄｓＲｅｓ、　７　（８）　、　１９７９．２１１５〜２１３６ページに記載さ れるようにスクリーニングされた。これらのプローブの配列は次のとおりであっ た。

Ｎ０Ｒ−８０４５−−ｅｒｒ　ＧＣＡ　ＣＣＣＧＣＴ　ＧＴＡ　ＣＣＣＭＴ　Ｇ ＣＣＡＣＣＧＣＡ　ＣＴＧ　ＣＣＣ（−ＣＢＨｌ）　ＧＴＡ−３’ Ｎ０Ｒ−８０７５’−ＡＧＴ　ＣＧＧ　ＡＣＣＣＧＡ　ＣＣＡ　ＡＴｒ　ＣＴＧ 　ＧＣＣＡＣＣＡＣＡ　ＴＴＧ　ＧＣＣ（−ＣＢＨ２）　ＣＣＡ−３１ ＮＯＲ−８０８５’−ＣＧＴ　ＡＧＧ　ＴＣＣＧＣＴ　ＣＣＡ　ＡＣＣ入ＡＴ　 ＡＣＣＴＣＣＡＣＡ　ＣＴＧ　ＧＣＣ（−ＥＧ　コ）　ＣＣＡ−３１ スクリーニングでＡ領域のプローブによくハイブリダイズする多数の候補を得た 。制限マツピングで興味深いクローンを１７個に滅し、その中の８個を十分に配 列決定（）ｌａｌｔｉｎｅｒら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１３、１９８５．１０１５〜１０２５ページに記載されるように）し、ターミナ ルＣＢＤならびにＢｗＩ域の存在を確認した。

ＣＨＤについて得られた推定アミノ酸配列は以下のとおりである。

λ−工！　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ 　Ｔｒｐ　Ａｇｎ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｂｒ　ＣｙｓＣｙｓ　Ｇｌｕ　Ｊｕａ　 Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　ＧｌｎＡｓｎ　Ｇｉｎ　Ｔ ｒｐ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　ＧｌｎＣｙｓ　Ｌａｕ； λ−ｓ：　ｒｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　ＧｌｙＬｙｓ　Ｇｌｙ　 Ｔｒｐ　Ａｓｈ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　ＴｈｒＣｙｓ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇ ｌｙ　入１ａ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｇ　ＩＩｓ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｔ ｒｐ　Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　Ｇｌｒ{ Ｃｙｓ　Ｌ＠ｕｙ ｃＢＴｌ−２：　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　ＧｌｙＬｙｓ　Ｇ ｌｙ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　ＣｙｓＣｙｓ　Ｇｉｎ　Ｓａ ｒ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｊｓｎ　Ａｓ ｐ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｓａｒ　ＧｌｎＣｙｓ　Ｌｅｕ； λ−ａ：　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ 　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　ＴｈｒＣｙｓ　Ａｌａ　にｌｕ　 Ｇｌｙ　−Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ｃｌｎ　Ａｇｎ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ 　Ｔｙｒ　Ｓａｒ　ＧｉｎＣＹＳ　Ｔｈｒ　ｐｒｏ； に−９１Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　 Ｔｒｐ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　ＣｙｓＣｙｓ　ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｇ ＩＹ　−Ｔｈｒ　ｃｙｓ　Ａｒｇλｌａ　Ｇｌｎ、Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｔｒｐ　Ｔ ｙｒ　５ｅｒＧｌｎ（：’ｆｓ　Ｌｅｕ　ＡＳｎ； 入−１１：　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　ｃｌ ｙ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　に工Ｙ　ＣＹＧ　Ｔｈｒ　ＡｓｎＣｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ 　Ｇｌｙ　５ｅｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ａｌａ 　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎｃｙｓ　ｘｌａ； 入−！９：　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌ ｙ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　λ５ｉｌＣｙｓ　Ｇｌｕ　Ｓｉ ｒ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　’ｒｈｒ　Ｃｙ！ｉ　ｋｒｑ　ｋｌｌ！Ｌ　Ｇｉｎ　Ａｌ ！ｎ　Ａｓｐ　’ｒｒｐ　Ｔｙｒ　Ｓ■秩@Ｇｌｎ ｃｙｓシＵ；および −４３ｋＤ：　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａ、ｓｎ　 Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　５＠ｒ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　’ｒｈｒ　Ｔｈ■ Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ工 ｌｅ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　ＧｉｎＣＹＳ　Ｌａｕ Ｂ　ｐ！！域について得られた推定アミノ酸配列は次のとおりである。

Ａｓｎ　ＣＹＳ　Ｓａｒ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ：Ａ５：　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　 Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　 Ｔｈｒ　ＳｉｒＧｌｎ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇ ｌｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ＴｈｒＧｌ ｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｇｌ ｕ　Ｌｙｓ；Ａ８：　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌ ｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ＧｌｙＡｓｎ　Ａｓｎ 　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ａ、ｓｎ　Ｇｌ ｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ａｓ■ Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　 Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ；Ａｌｌ：　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ 　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ａｓｎ　Ｐｒ。

Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　 Ｔｈｒ　Ｐｈｅ工ｌｅ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｎ　Ｐｒ。

入ｓｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　 Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｌｙｓ；Ａ１９：　Ｐｒｏ　八ｌａ　Ｌｅｕ 　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ 　Ａｓｎ　Ｐｒ。

Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　 Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　ＧｌｙＧｌｙ　Ｃｙｓ　Ｔ ｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ；ＣＢＨ２：　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ 　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓｉｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ 　５ｅｒＴｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓｉｒ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　 Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ工ｌｅ　Ｔ ｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓｉｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｒｑ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ工ｌ ｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　５ａｒＴｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ 　Ｔｙｒ　Ａｓｎ；Ａ９：　Ｇｌｕ　５ｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ 　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　ＡｓｎＰｒｏ　 Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　 Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｐｒ。

Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　 Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ＡｓｎＣｙｓ　Ｓｉｒ　Ｐ ｒｏ　Ｌｅｕ；またはＰｒｏに−Ｖａｌ　Ｇｌｎ工１ａ　Ｐｒｏ　ｓａｒ　Ｓａ ｒ　５ｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｉｒ　Ｓａｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　ＧｉｎＰｒｏ 　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ｓｓｒ 　Ｔｈｒ　’Ｉ’ｈｒ　Ｓｉｒ　Ｓａｒ　Ｐｒｏ　Ｐ秩B Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　 Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｒｇｎ−例」− ＣＩＩＤクローンの１つの完全な配列は、工、胚μ咀！−由来のセロビオヒドロ ラーゼ（ＣＢＨ２）　き著しい類似性を示す。

Ａ、　ｏｒ凹で発現しそしてそれからの分泌用！＋、　１ｎｓｏｌｅ口ｓ　ＣＢ Ｈ２遺伝子を担持する発現ベクターρ５Ｘ２２４の構築を、図１に機運する。

ｐＵｃ１９レプリコンを含むベクターｐ７７７．７由来のＴＡＫＡアミラーゼプ ロモーターの調整領域およびＬ」住ｕ工由来のグルコアミラーゼクーミネーター は、ヨーロッパ特許第２３８．０２３号明細書に記載されている。　ｐｓＸ２１ ７は、１．８ｋｂフラグメント上にＨ，１ｎｓｏｌｅｎｓ　ＣＢＦ１２遺伝子を 担持するクローニングベクターｐｃＤＶ１−ｐＬｌ　（ＯｋａｙａｍａおよびＢ ｅｒｇ、上記、参照）から構成されている。ＣＢＩ１２遺伝子は、構築に際して 使用される３種の制限部位、すなわち、単一配列におけるメチオニン開始コドン におけるＲａ１１部位、このＢａｌｆ部位の下流６２ｎｂ、のＢｓｔＢ１部位お よびＢｓｔＢＩの下流８６０ｂｐの＾ｖａ１１部位を含む、Ａｖａ目部位は、ポ リＡ　Ｓｉ域の遺伝子上流の非翻訳Ｃ末端部分に位置しＣおり、そしてこれは最 終の構築に際して不必要である。クローニングベクターの遺伝子の上流にポリＧ ｊＪ域は存在しない、この領域は、切除されそしてＴＡＫＡプロモーターの末端 のＢａｍ旧部位近くに翻訳開始コドンを置くオリゴヌクレオチドリンカーによっ て置き換えられている。

発現ベクターｐｓＸ２２４で、ヨーロッパ特許第２３８．０２３号明細書に記載 されるように選択マーカーとし、ニー・ニドランス（Ａ、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ） 由来のａｍｄｓ遺伝子を使用してＬ」ＤＪ封ＩＦＯ４１７７を形質転換した。

形質転換体をＹＰＤ培地（Ｓｈｅｙｖａｎ　ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｎ　Ｙｅａ ｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ。

Ｇｏｌｄ　Ｓｐｒｊｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋　１９８１） で３〜４日間生育し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動 で上澄の新規タンパク質類について分析した。　Ｈ，１ｎｓｏｌｅｎｓ由来のＣ ＢＨ２は、相当なグリコジル化を有するタンパク質饋を示す６５ｋＤの見かけの Ｍｗを有するバンドを形成し、このタンパク質はアミノ酸成分を基準とする５１ ｋＤの一一をもつものと算出されている。この完全な酵素はセルロースによくパ インディングするが、Ａ　６３域の除去およびＢｔｕ域が除去された可能性のあ る５５ｋＤおよび４０ｋＤの酵素分解産物はパインディングしない、この酵素は 濾紙に対して一定の活性を有し、グルコースを放出する。予想されるように、カ ルボキシメチルセルロースの形態の可溶性セルロースについて測定したところで は非常に限定されたエンドグルカナーゼ活性を有している。

裏施炭主 フザリウム・オキシスボーム　Ｆｕｓａｒｔｕｍ　ｏｘ　ｓ　ｏｒｕ鋼　１ツム ＤＮ＾の蓋 フザリウム・オキシスポラムの凍結乾燥培養物、をリン酸緩衝液で元へ戻し、５ 枚のフォックス（ＦＯＸ　）培地（酵母エキス６％、　Ｋ、ＨＰＯ４１，５％、 Ｍｇ５Ｏａ・７８＊Ｏ０−７５％、グルコース２２．５％、寒天１．５％、ｐＨ ５，６）プレートの各々に５度スポットし、３７℃でインキュベーシヨンした。

インキエベーシコンの６日後、プレートからコロニーをかきとり、０．００１％ のツウイーン（Ｔｗｅｅｎ）−８０１５ｍＬに入れ、濃く曇つた懸濁液を得た。

それぞれ液体フォックス培地３００ｓＬを含む４個の１リツトルフラスコに前記 胞子懸濁液２曽りを接種し、３０℃および２４０ｒｐ−でインキュベージロンし た。インキュベーション４日目に培養物を４層の滅菌ガーゼを介して濾過し、次 いで滅菌水で洗浄した。１体をワットマン濾紙上で乾燥し、流体窒素で凍結し、 冷却乳鉢中で微粉砕し、新鮮な溶菌緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＣＩ、　ｐＨ ７，４，１％３０５．５０ｍＭ　ＨＤＴＡ。

１００μＬ　ＤＥＰＣ）７５ｍＬに加えた。十分に混合された懸濁液を１時間６ ５°Ｃの水浴中でインキュベートし、次いでベンチトップ遠心機により４０００ ｒｐｍおよび５”Ｃで１０分間遠心した。上澄をデカントしエタノール沈殿した 。氷上で１時間後、溶液を２０分間１９．０００ｒｐｉ＋にて遠心した。上澄を デカントしイソプロパツール沈殿した。１０分間１０＋　ＯＯＯｒｐｍにて遠心 した後、上澄をデカントしベレットを乾燥した。

ＴＥＲ溶液（ｌｏｄ↑ｒｉｓ−ＦＩＣｌ、　ｐＨ７，４＋　１ｍＭ　ＨＤＴＡ、 　１００μｇ　ＲＮＡ５ｅ　Ａ）１ｍＬを各チューブに加え、これらのチューブ を２日間４°Ｃで保存した。これらのチューブを集め、３０分間６５゛Ｃの水浴 に置き、不溶性のＤＮＡを浮遊させた。ｆｊＩ液を、フェノール／Ｃ）ＩＣｈ　 ／イソアミルアルコールで２度、ＣＨＣｈ　／イソアミルアルコールで２度抽出 し、次いでエタノール沈殿した。ペレットを定着させてエタノールを除去した。

７０％ＥｔＯＨを加え、ＤＮＡを一２０°Ｃで１夜保存した。デカントおよび乾 燥後、ＴＥＲｌｍＬを加え、１時間６５°Ｃでチューブをインキュベージロンす ることでＤＮＡを溶解した。ゲノムＤＮＡ　１．５ｍｇを得た。

−゛イジェネレートプライマーによる　、クローニングおよび一良臭犬ＤＮＡ　 （ｉ区列迭一定 ＰＣＲ（米国特許第４，６８３．１９５号および同４．６８３，２０２号参照） を使用するＣ−ファミリー（命名は、Ｈｅｎｒｉｓｓａｔら、Ｇｅｎｅ　８１（ １）、　１９８９゜８３〜９６ページによる）セルラーゼ由来のＤＮＡを増幅す るため、各「センス」オリゴヌクレオチドを、各「アンチセンス」オリゴヌクレ オチドと組み合わせて使用した。従うて、以下のプライマーの組み合わせが使用 された。

一工立ヱヱ：」−−１立４７−２ ＺＣ３２２０ＺＣ３２２１ ｚＱ２２Ｑ：　ＧＣＣＡＡＣＴＡＣＧＧＴ　ＡＣＣＧＧ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）　Ｔ Ａ（Ｃ／’１’）　ＴＧ（ｅ／Ｔ）ＧＡ（Ｃ／’！’）　（Ａ／Ｇ／Ｔ）　（Ｃ ／Ｇ）　（λ／Ｇ／Ｃ／Ｔ）　ＣＡ（Ｇ／Ａ）　？ＧＥユλ２λ：　ＧＣＧ　Ｔ ＴＧ　ＧＣＣ、ＴＣＴ　ＡＧ入入Ｔ（Ｇ／入）　ＴＣＣＡＴ（Ｃ／Ｔ）　ＴＣ（ λ／Ｇ／Ｃ／Ｔ）（Ｃ／Ｇ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）（Ｇ／λ）　ＧＡ（Ｇ／入）ＣＡＰ ＣＲ反応では、フザリウム・オキシスポラム（ハ旦亘憇ｏｘｙｓｇ聾艷）ゲ／ム ＤＮＡ１μｇを鋳型に使用した。１０倍（７）ＰＣＲｍ衝液は、１００ｍＭＴｒ ｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ８，３，５００ｍＭ　ＭＣＩ、　１５ｍＭ　ＭｇＣｌ、　 ０．１％ゼラチン（１’ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　ＣｅＬｕｇ）である０反応液 は以下の成分を含めた。

脱イオン水　３５．７５μし １ＯｘＰＣＲｔｌｋ街液　５　μＬ 鋳型　ロＮ＾　５　μ　Ｌ プライマー１　２　ＩＬ（４０ピコモル）プライマー２　２　ＩＬ（４０ピコモ ル）Ｔａｑポリメラーゼ　０．２５μＬ　（ｆ、２５Ｕ）ＰＣＲ反応は次の条件 で４０サイクル行った。

７２℃　２．０分 各反応液５μＬをアガロースゲル電気泳動で分析した。　ＤＮＡフラグメントの 大きさは、［ｌＮＡ分子量マーカーから推定した０反応をＺＣ３２２０およびＺ Ｃ３２２１でプライムし、Ｃ−ファミリー　セルラーゼのフラグメントに対する 候補である適当なサイズの２種の１）ＮＡフラグメントを生成した。これらの２ つのフラグメントを含むアガロース区分を切り取り、［ｌＮＡを熔離し、制限酵 素にｐｎｌおよびＺｂａｌにより消化した。これらのフラグメントを、前記２種 の制限酵素で切断したベクターｐＵｃ１Ｂに連結した。μ０．ｃ９ＬＬを連結体 で形質転換し、得られたコロニーからミニプレツブ（ｍｉｎｉ　ｐｒｅｐ）ＤＮ Ａを調製した。これらのインサートのＤＮＡ配列を測定し、２つの新規なＣ−フ ァミリーセルラーゼ（１つが新規なセロビオヒドロラーゼでもう１つが新規なエ ンドクルカナーゼ）が同定されたことが明らかにされた。

Ｃ−ファミリー　セルラーゼに対して、前記のようなＩ’ＣＲクローニング手順 を、既知のＦ−ファミリー　セルラーゼ内に保存されたセルラーゼ配列をコード する他のプライマーを使用して利用した（Ｉ（ｅｎｒｉｓｓａｔら、上記、参照 ）、以下のプライマーの組み合わせをフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕ＊）ゲノムＤ Ｎ＾の増幅に使用した。

プライマーｌ　−プライマー２ ＺＣ３２２６ＺＣ３２２７ Ｌコ石匝＝　ＴＣＣＴＧＡ　ＣＧＣＣＡＡ　ＧＣＴ　Ｔｒ（Ａ／Ｇ／Ｔ）　（Ｃ ／Ｔ）　（Ａ／Ｔ）　（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｃ／Ｔ）ＡＡ　（Ｃ／Ｔ）ＧＡ　（Ｃ／ Ｔ）ＴＡ　（Ｃ／Ｔ’）ＡＡＬコＬＵ：　ＣＡＣＣＧＧ　ＣＡＣＣＡＴ　ＣＧＡ 　Ｔ（Ｇ／Ａ／）Ｔ　Ｃ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）Ａ（Ｇ／入）（Ｃ／Ｔ）Ｔ　Ｃ（八 ／Ｇ／Ｃ／Ｔ）Ｇ　Ｔ（Ａ／Ｇ／Ｔ）Ａ　ＴＰＣＲ反応は、次のように４０サイ クル行った。

９４℃　１．５分 ５０℃　２．０分 ７２℃　２．０分 １８０ｂｐのバンドを、アガロースゲルフラグメントから溶離し、制限酵素をＨ ｒｎｄｌＨおよびＣ１ａｌで消化し、次いで）Ｉｉｎｄｌ　Ｉ　ＩおよびＡｃｃ ｌで消化したｐＨｃ１９に連結した。連結されたＤＮＡでＥ、　ｃｏｌｉを形質 転換し、単離されたコロニーからミニブレプＤＮＡを調製した。クローニングさ れた［ｌＮＡの［ｌＮＡ配列を決定した。このフラグメントは、Ｆ−ノア４ミリ −セルラーゼの新たな構成員に相当する配列をコー二曵盈策 フザリウム・オキシスポラムを発酵によって生育し、いろいろな時間に試料を採 取してＲＮＡを抽出し、セルラーゼ活性を分析した。活性の分析は、総セルラー ゼ活性のアッセイと色澄明化のアッセイを含む、最高の色澄明化を示すフザリウ ム・オキシスポラム試料は、ポリ（Ａ）　＋ＲＮ＾が単離された全１１Ｎ＾から 抽出された。

フザリウム・オキシスポラムのｃＤＮＡライブラリーを構築するために、第一１ １ｃＤＮＡを２種の反応液（一つは放射能標識したｄＡＴＰで、他の一つは放射 能標識しないｄＡＴＰ　）で合成した。２．５Ｘ反応混合物を、以下の試薬を次 の順序で混合することにより室温で調製した。５Ｘの逆転写酵素緩衝液（ＧＪｂ ｃｏ−ＢＲＬ、　Ｇａｊｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）１０μＬ。

２００ｍＭのジチオスレイトール（−７０″Ｃで保蔵された原液由来または新た に調製）２．５μＬおよび各オリゴヌクレオチドミリン酸（ｄＡＴＰ。

ｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰおよび５−メチルｄｃＴＰ＋　Ｐｈａｒｗａｃｆａ　［、 ＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＋＾１ａ翔ａｄａ、　ＣＡ、から得た）　１ ０ｍＭを含む混合物２．５ＩＬ０反応混合物を２つのチューブに７．５μＬずつ 分注した。１０μＣ１／μＬのｓｔｐα−ｄＡＴＰ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ＋　Ａ ｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、　ＩＬ）　１．３μＬを一つのチューブに 加え、もう一方のチューブには水１．３μＬを加えた。各混合物の７μＬを最終 反応チューブに移した。それぞれのチューブで、５−ルのＴｒｉトＨＣＩ　（ｐ Ｈ７，４）および５０μＭのＨＤＴＡ　１４ｕ　Ｌ中フザリウム・オキシスポラ ムのポリ（Ａ）　＋ＲＮ＾５μｇを、ｌａｇ／μＬの第−鎖ブライ？　（ＺＣ２ ９３８：　ＧＡＣＡＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＴ（：ＡＣＴＡＧＴＧＡＧＣＴＣＴ ＋ｓ）　２１１　Ｌと混合した。このＲＮＡプライマー混合物を４分間６５℃に 加熱し、氷水で冷却し、次いで微量遠心管で短時間遠心した。　ＲＮＡプライマ ー混合物８μＬを最終反応チューブに加えた。　２００Ｕ／μＬの５ｕｐｅｒｓ ｃｒｉｐｔ（商標）逆転写酵素（Ｇｔｂｃｏ−ＢＲＬ）　５　ｕ　Ｌを各チュー ブに加えた。ゆるやかに攪拌した後、チューブを３０分間４５℃でインキュベー ションした。　１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐ）１７．４）　、　１　ｍＭ のＥＤＴＡ８０＃Ｌを各チューブに加え、試料を回転させて、闇単に遠心した。

各チューブから３μＬを採取し、ＴＣＡ沈殿により取り込まれたカウントと反応 液中の総カウントを測定した。各チューブからの試料２μＬをゲル電気泳動で分 析した。各試料の残りを、オイスターグリコーゲンの存在下でエタノール沈殿処 理た。核酸を遠心によりペレット化し、次いでこれらのベレットを８０％エタノ ールで洗浄した。エタノール洗浄後、試料を１０分間通気乾燥した。第−鎖の合 成は、ポリ（Ａ）＋　ＲＮＡからＤＮＡの転換率３３％に相当するフザリウム・ オキシスポラムｃＤＮＡ　１．６μｇを与えた。

第二鎖ｃＤＮＡの合成は、ヘアピンＤＮＡをもたらす第二鎖合成の第−鎖ブライ ミングを促進する条件下で第−鎖反応液由来のＲＮＡ　−ＤＮＡハイブリダイゼ ーションによって行った。２つの第−鎖反応液のそれぞれに由来する第−鎖生放 物を、水７１ｕｌ−に再懸濁した０次の試薬、５Ｘ第二鎖緩衝液（１００ｍＭ　 Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，４，４５０＋ａＭ　ＫＣＩ、　２３ｍＭ　Ｉ’１ｇＣｂお よび５０ｍＭ（Ｎ）Ｉｎ）ｚｓＯａ）２０μＬ、５ａＭ　β−ＮＡＤ３μＬおよ び各１０ｍＭのデオキシヌクレオチド三リン酸混合物３μＬを、室温で上記反応 チューブに添加した。α−”　Ｐ　ｄＡＴＰ　１μＬを、第−鎖合成用の未標１ ！ｇｌｄＡＴＰを含む反応混合物に加え、一方、第−鎮合成用の標識ｄＡＴＰを 含むチューブには水１ｕＬを含めた０次に、各チューブに、７Ｕ／μＬのＥ、　 ｃｏｌｉ　ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｆｍ、　ｆｎ ｄｉａｎａｐｏｌｌｓ。

ＩＮ）　０．６ａ　Ｌ、８　Ｕ／　ＩＩ　ＬのＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラー ゼＩ　（Ａｇｅｅｒｓｈａｓ）３．１μＬおよび２Ｕ／ｕＬのＲＮａｓｅ　［１ （Ｇｌｂｃｏ−ＢＲＬ）を加えた０反応液を２時間１６℃でインキュベーション した。インキュベーシッン後、各反応液由来の２μＬを使用してＴＣＡ沈殿性カ ウントと反応液の総カウントを測定し、次いで各反応液由来の２μＬをゲル電気 泳動により分析した。各試料の残りに、２．５Ｍｇ／μＬのオイスターグリコー ゲン２μＬ、０．５のＨＤＴＡ　５ｕ　ＬおよびＬｏｗ−のＴｒｉｓ−４ＣＩ　 （ｐＨ７，４）　＋１−一のＥＤＴＡ２００ｔｌＬを加えた。試料をフェノール −クロロホルムで抽出し、次いでイソプロパツール沈殿させた。遠心後、ペレッ トを８０％エタノール１００ｕＬで洗浄し、通気乾燥した０反応の各々によって 得られた二本鎖ｃＤＮ＾は、約２．５μｇであった。

ムングビーン（■ｕｎｇ　ｂｅｅｎ）ヌクレアーゼ処理によりヘアピンの一本鎖 ＤＮＡを切り取った。各ｃＤＮＡＤＮＡペレット５μＬに再懸濁し、次いで各チ ューブにＩＯＸムングビーン緩衝液（０，３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，，６， ３Ｍ　ＮａＣ１および１ｈＭ　Ｚｎ５Ｏｎ）２．５μＬ、　１０−のＤＴＴ　２ ．５ａ　Ｌ５０％のグリセロール２．５μＬおよびＩＯＵ／ｌ！Ｌのムングビー ンヌクレアーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｔｏｌａｂｓ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ 　ＭＡ）　２．５／７　Ｌを加えた０反応液を３０分間３０’Ｃでインキュベー ションし、各チューブに１０−ＭのＴｒｔｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，４）および１ 　ａ＋Ｍ　ＥＤＴＡ　７５　ｕ　Ｌを加えた。２ｕＬのアリコートをアルカリ性 アガロースゲル分析により分析した。ＬＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ρ１１７．４ ）　ｔｏｏμＬを各チューブに加え、試料をフェノール−クロロホルムで２度抽 出した。　ＤＮＡをイソプロパツールで沈殿させ、次いで遠心によりペレット化 した。遠心後、ＤＮＡのベレットを８０％エタノールで洗浄し、通気乾燥した。

２つの反応のそれぞれからのＤＮＡの収量は、約２μｇであった。

このＤＮＡの末端をＴ４０ＮＡポリメラーゼで処理して平滑にした。水２４μＬ の合計容量で２つの試料に由来するＤＮＡを再懸濁した後、合わせた。このＤＮ Ａに、１０ＸＴ４ｔＩｋ衝液（３３０＋ｍＭ　Ｔｒｉｓ−酢酸塩、ＰＩＩ７．９ ．６７０＠Ｍ　ＫＡｃ、　１００５Ｍ　ＭｇＡｃおよび１　ｍｇ／ｓＬのゼラチ ン）４μＬ、ｔａｎのｄＮＴＰ　４μＬ、　５０ｍＭのＤＴＴ　４μＬおよびＩ Ｕ／μＬのＴＡ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｊｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉ ＋ｇ）　４　ｇ　Ｌを加えた。これらの試料を１時間１５°Ｃでインキュベーシ ョンした。インキュベーシッン後、１０ｍ１１のＴｒｉｃ−ＨＣＩ　（ｐＨ７， ４）および１ｍｌ’ｌのＥＤＴＡ　１６０μＬを加え、次いで試料をフェノール −クロロホルムで抽出した。　ＤＮＡをイソプロパツールで沈殿させ、次いで遠 心によりペレット化した。遠心後、ＤＮＡを８０％エタノールで洗浄し、次いで 通気乾燥した。

このＤＮＡを水６．５μＬで再懸後、Ｅｃｏ　Ｒｒアダプターを平滑化されたＤ ＮＡに付加した。このＤＮＡに、１μｇ／μＬのＥｃｏ　Ｒ１アダプター（ｔｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡカタログ＄４０９−２０）　 １　ｕ　Ｌ、　ＩＯＸ　リガーゼ緩衝液（０，５Ｍ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，８お よび５０＠Ｍ　ＭｇＣｈ）　Ｉ　ＩＩ　Ｌ、　１０ｍＭのＡＴＰ　Ｏ，５μＬ　 、　１００ｍＭのＤＴＴ　Ｏ，５μＬおよびＩＵ／μＬのＴＡ　１１ＮＡリガー ゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　１　ｇ　Ｌを加えた。この試 料を室温で１夜インイキユベーシヨンした後、リガーゼを１５分間６５℃で変性 した。

第−鎖プライマーによってコードされたＳｓｌ　クローニング部位を、Ｓｓｌエ ンドヌクレアーゼで消化することにより露出させた。このＤＮＡに水３３ｕ　Ｌ 、　ＩＯＸ　Ｓｓｌ　Ｂ衝液（０，５Ｍ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，０，０，１Ｍ　 ＭｇＣｌ＊および０．５Ｍ　ＮａＣＩ）　５　ｕ　Ｌおよび５Ｕ／ｕＬの５ｓ１ ２μＬを加え、この試料を２時間３７゛Ｃでインキュベーションした。　１０ｍ ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，４）およびＬｓＭのＥｌ）ＴＡ　１５０μＬ を加え、試料をフェノール−クロロホルムで抽出し、次いでＤＮＡをイソプロパ ツールで沈殿させた。

ｃＤＮＡをセファロースＣＬ２Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＩＪＢ　Ｂｉｏｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ）カラムでクロマト処理してｃＤＮへのサイズを選択し、そし てアダプターを含まないものを除去した。セファロースＣＬ２Ｂカラム１．ｌ■ Ｌを１ｕＬのプラスチンクス使い捨てピペットに流し込み、そのカラムを５０倍 カラム容量の緩衝液（１ＯｎＭ　Ｔｒｔｓ、　ｐＨ１，４および１　ｄ　ＥＤＴ Ａ）で洗浄した。

試料をのせ、１滴ずつ画分を集め、ボイド容積中のＤＮＡを集めた。

分画したＤＮＡをイソプロパツールで沈殿させた。遠心後、ＤＮＡを８０％エタ ノールで洗浄し、次いで通気乾燥した。

フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕ■！腸）のｃＤＮＡライブラリー を、Ｅｃｏ　Ｒ１および５ｓｔｌで消化したベクターｐＹｃＤＥＩ３’　（国際 公開第Ｗ０９０／１０６９８号参照）にそのｃＤＮＡを連結することにより樹立 した。１０Ｘリガーゼ緩衝液８μＬ、１０醜りのＡＴＰ　４μＬ、２００閣−の ［ｌＴＴ　。

４μＬおよび１単位のＴＡ　ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎ ｈｅｉｍ）を含むリゲーシタン反応溶液８０ａＬ中、ｃＤＮＡ　４００ｎＨに３ ９０ｎｇのベクターを連結した。室温で１夜インキユベージ町ン後、オイスター グリコーゲン５ｕｇおよび１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩおよび１閣阿のＥ［ｌＴ Ａ　１２０μｇを加え、試料をフェノール−クロロホルムで抽出した。　Ｄｌｌ ｌ＾をエタノールで沈殿させ、［ｌＮ＾ベレットを８０％エタノールで洗浄した ０通気乾燥後、ＤＮＡを水３μＬに再懸濁した。電気穿孔性成分ＤＨＩＯＢ細胞 （Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、）３７　ｐ　Ｌを上記ＤＮＡに加え、Ｂｉｏ−Ｒａｄ　 Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ（Ｍｏｄｅ１１１６５２０７６）およびＢｉｏ−Ｒａｄ 　ｐｕｌｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（Ｍｏｄｅｌ　１１６５２０９Ｂ）エレク トロポレーションユニット（Ｂｔｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｔｅｓ＋　Ｒ ｉｃｂｍｏｎｄ、　Ｃ＾）により電気穿孔法を完了だ、　ＳＯＣ（Ｈａｎａｈａ ｎ、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１６６（１９８３）、　５５７〜５８０）の ４ｕＬを電気穿孔法で処理した細胞に加え、次いで細胞懸濁液４００μＬを１０ 枚の１５０ｍ５　ＬＢチアンシリンプレートの各々に広げた。１′＆インキユベ ーシヨン後、ＬＢ　ａｓｐ培地培地１０奢Ｌプレートに加え、細胞を培地から採 取しこ、グリセロール原液とプラスミド調製物を各プレートから作製した。ライ ブラリーのバッフグランド（インサートを含まないベクター）を、インサートを 含まないベクターの連結と電気穿孔性後の数個のクローンの力価測定により約１ ％において確認した。

ｃＤＮＡ−イブ−１−のスクリーニング完全鎖長のセルラーゼｃＤＮＡクローン を、ＰＣＲで生成したゲノムオリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイゼー シヨンによりフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘ　ｓ　ｏｒ ｕｍ）　ｃＤＮＡライブラリーから単離した。

ＰＣｌｌで生成したオリゴヌクレオチド！ｌ：　ＺＣ３３０９，Ｃ−ファミリー セロビオヒドロラーゼの一部分をコードする４０ｍｅｒ　ＡＴＴ　ＡＣｃＡＡＣ ＡＣＣＡＧＣＧＴＴ　ＧＡＣＡＴＣＡＣＴ　ＧＴＣＡＧＡ　ＧＧＧ　ＣＴＴ　Ｃ ；　ＺＣ３３１０Ｃ−ファミリー　エンドグルカナーゼをコードする２８婿ｅｒ 、　ＡＡＣＴＣＣＧＴＴ　ＧＡＴＧＡＡ　ＡＧＧ　ＡＧＴ　ＧＡＣＧＴＡ　Ｇ； およびＺＣ３３１１，Ｆ−ファミリー　セルラーゼをコードする４０ｒｚｅｒ、 　ＣＧＧ　ＡＧＡ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＧＧＡ　ＡＣＡ　ＣＣＡ　ＧＡＧ　ＧＣＡ Ｇ［；Ｇ　ＴＴＣＣＡＧ　ＣＣＡ　Ｃ＠Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで”Ｐｙ ＡＴＰを使用して末端標識した。キナーゼ反応では、各オリゴヌクレオチド１７ ピコモルを脱イオン水で１２．５μＬに調整した。これらに、ＩＯＸキナーゼ緩 衝液（Ｉ　Ｘ　：　１０！ＩＩＭ塩化マグネシウム、Ｏ，ｂ＋Ｍ　ＨＯＴ＾、５ ０■門Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，８）　２　ｐ　Ｌ、　２００ｍＭのジチオスレイト ール０．５．Ｌ。

”Ｐ　ｙＡＴＰ（１５０ｍ（：ｉ／ｍＬ、　Ａｍｅｒｓｈａｍ）　Ｉ　ＩＩ　Ｌ 、Ｔａポリヌクレオチドキナーゼ（ＩＯＵ／μＬ、ＢＩＩＬ）２μＬを加えた０ 次に、これらの試料を混合し、３７°Ｃで３０分間インキュベーションした。オ リゴヌクレオチド類を、岨み込みが起っていないヌクレオチド類よりＴＥ　（Ｉ ＯＩＩＭＴｒｉｓ、　ｐＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）　１８０μＬ、　７．５ Ｍ酢酸アンモニウム１００μＬ、イガイのグリコーゲ７　（２０ｍｇ／ｗＬ、　 Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）　２　ｐ　Ｌおよび１００％エタノール７５０μＬを使用 する沈殿によって分離した。ベレットを蒸留水２００μＬに溶解した。これらの オリゴヌクレオチドに取り込まれた放射能量を測定するために、ｌ　：　１００ ０希釈のオリゴヌクレオチド１０μＬをＢｅｃｋｍａｎ　ＬＳ１８００液体シン チレーシッンシステムで読み取った。活性は、ＺＣ３３０９について１１５Ｘ１ ０’　ｃｐｓ、　ＺＣ３３１０について８６ｘｌＯ’　Ｃｐ−およびＺＣ３３１ １について７９Ｘ１０”　ｃｐｓであった。

Ｉ初に、　２０，０ＯＯｃＤＮＡクローンを、Ｃ−ファミリー　セロビオヒドロ ラーゼ、Ｃ−ファミリー　エンドグルカナーゼおよびＦ−ファミリー　セルラー ゼのクローンに相当する３種のオリゴヌクレオチドのそれぞれの混合物で探査し た。−７０℃で保存された力価測定済みのグリセロール原液からｃＤＮＡライブ ラリーをとり出した。　１５０ｍ５のＬＢチアンシリン（ＩＯ００μｇ／■し） プレート５枚に、それぞれ４０００クローンをまいた。　Ｂｊｏｔｒａｎｓ　Ｏ ，２μｍ１３７■■フイルターを使用して標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　リμ区１＋　１９８９）によりリフト（ＩＨｔ）を複写し た。これらのフィルターを減圧下にて２時間８０″Ｃで焼き、次いで８０ｍＬの 予備ハイブリダイゼーション溶液Ｃ３ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　（Ｉ　Ｘ　：　 ０．０２％Ｆｉｃｏ１１．０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血 清アルブミンＰｅｎｔａｘ　Ｆｒａｃｔｉｏｎ　５　（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　 Ｌｏｕｔｓ。

ＭＯ）、　５ＸＳＳＣ（Ｉ　Ｘ　：　Ｏ，１５Ｍ塩化ナトリウム、０．１５Ｍク エン酸ナトリウム、　ｐＨ７，３））、１００　ｕ　ｇ　／閤り変性超音波処理 サケの精液［ＩＮＡ　、５０１リン酸ナトリウム（２日６．８）、１請ｈビロリ ン酸ナトリウム、１００１１Ｍ＾ＴＰ、　２０％ホルムアミド、１％ドデシル硫 酸ナトリウム）中、３７℃にて結晶北国（Ｐｈａｒｖａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＋　Ａｌａｍｅｄａ、　Ｃ＾）で−夜処理した（Ｕｌｒｔ ｃｈら、ＥＭＢＯＪ、　３　（１９８４）３６１〜３６４ページ）。

予備ハイブリダイゼーシヨンされたフィルターの１つを、８０　ｘ　１０’ｃｐ ｎａ　ＺＣ３３０９，８６ｘｌＯ’　Ｃａ１ｐ　ＺＣ３３１０および７９Ｘ１０ ’　ｃａｐ　ＺＣ３３１１を含む予備ハイブリダイゼーション溶液８０ｍＬを入 れた結晶他国に入れ、次いで３７°Ｃに一夜放置しプローブ処理した０次に、フ ィルターを高緊縮まで洗浄した。これらのプローブ処理されたフィルターを、結 晶化血中室温で低１ｇ！縮洗液（２ＸＳＳＣ，０，１％５ＤＳ）　４００ＷＬで ３度洗液した。

このとき、４個の１リツトル容積のプラスチック箱を使用した。塩化テトラメチ ルアンモニウム洗浄（ＴＭＭＣｌ、：３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム、５０ ５Ｍ　Ｔｒｉｓ−）１（：１．　ｐＨ８，０，２ｓＭ　！１ＤＴＡ、１　ｇ　／ 　Ｌ　５ＤＳ）で６８℃にて２０分間さらに洗浄し、その塩基組成１５８５〜１ ５８８と無関係に２８ｍｅｒ　ＺＣ３３１０について高緊縮洗浄を行った（Ｗｏ ｏｄら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ目。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８２　（１９８５）　）　、次に、これらのフィルター を乾式プロットし、ワットマン３問紙に固定し、オートラジオグラフィー用プラ スチックラップで被覆した。これらを増感紙とＫｏｄａｋ　ＸＡＲ−５フイルム を使用して一７０°Ｃで一夜さらした。

複写フィルター上に２つの推定上の陽性物が現われた。コロニーを有するプレー ト上の対応する領域を採取し、１χポリメラ一ゼ連鎖反応（ＰＣｌｌ）　１１衝 液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＦＩＣＩ、　ｐ［１８，３，５００ｍＭ　ＭＣ１， １５＋ｗＭＭｇＣ１，０，１％ゼラチン、Ｐｅｒｋｔｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕ ｓ）に入れ、７０μｇ／ｍＬアンピシリンを含む１００＋ｕ＋　ＬＢプレート上 に１０倍希釈物５個をのせた。これらのプレートを一夜３７℃で生育した。各推 定クローンの希釈物２つを上述のように再スクリーニングして選択した。単離さ れたクローンの１つからｐＺＦ［１１９６が見い出された。これを、２ＸＹＴブ ロス（１リットル当り：１６ｇバタトートリブトン、Ｌｏｇバクトー酵母エキス 、１０　ｇ　ＮａＣｌ　）中で一夜生育した。迅速沸騰法（Ｈｏｌｓｅｓおよび Ｑｕｉｇｌｅｙ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１１４（１９８１）、　１ ９３〜１９７）により２３μｇの［ＩＮＡが精製された。制限酵素分析により、 このクローンの鎖長は約２　、０００塩対であることがわかった。配列分析は、 それがＰＣＲによってＣ−ファミリー　セロビオヒドロラーゼフラグメントに相 同的なフラグメントを含むことを示した。

追加のセルラーゼｃＤＮＡクローンを単離する試みに際し、２Ｘ１０’クローン のｃＤＮ＾ライブラリーを、約ＬＯ０，０００ｃＤＮ＾クローンを含む２０枚の １５０ｍｍ　ＬＢプレート（１００μｇ／ｍＬアンピシリン）上にまいた。

第一スクリーニング法と同様にリフトを複写した。ハイブリダイゼーションを予 備ハイブリダイゼーシリン緩衝液中３０℃の温度にてホルムアミドにより実施し たことを除き、上記と同様に３種のセルラーゼに相当するオリゴヌクレオチドで 前記ライブラリーをスクリーニングした。　ＴＭＡＣＬにより洗浄を６７℃で２ ０分間２度行った。８と２０との間のシグナルが２０枚のプレートの各複写フィ ルター上に見い出された。パステルピペットの大きい方の端で第一のプレートか ら１５個のプラークを採取し、ＩＸＰＣＩ？　＠＠液（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅ ｒ　Ｃｅｔｕｓ）　１ｗＬに入れた。３種のオリゴヌクレオチド混合物を使用し 、前記ＩＩＩ薗プラークに対してＰＣＲを行った。各混合物には、ベクター特異 的オリゴヌクレオチドＺＣ２８４７と、さらに各混合物中には異なる特異的オリ ゴヌクレオチド（ＺＣ３３０９，ＺＣ３３１０またはＺＣ３３１１）を含めた。

Ｐｈａｒｖａｃｉａ　１ＩＩＬｒａｐｕｒｅ　ｄＮＴＰと共にＡｍｐｌｉｔａｑ ポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｔｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）を使用し、そしてＰｅ ｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ法に従った。

各プライマ−１６ピコモルを反応容量４０μして使用した。　ＩＸＰＣＲ＠衝液 中２０μＬを、ＤＮ＾を除きＰＣＨに必要なすべての試薬類を含むマスター混合 物２０μＬに加えた。最初に９４℃で１分４５秒変性後、９４℃４５秒、４５℃ １分および７２“Ｃ１０分の最終伸長を伴う７２℃２分の２８サイクＪしを、パ ーキンエｌレマー（Ｐｅｒｋｆｎ　ＥＬｗｅｒンサーモサークラーで行った。１ ５プラークのうち１０個が、Ｃ−ファミリー特異的オリゴヌクレオチドＺＣ３３ ０９およびＺＣ２８４７でプライムしたとき１つのバンドを得た。

他の混合物は、特異的な生成物を与えなかった。従って、ＰＣｌｌによヮて最大 のバンドを生成された５個のプラーク（すなわち、完全鎖長Ｃファミリー　セロ ビオヒドロラーゼである可能性がある）とＰＣＲバンドを生成しない５個のプラ ークとを、７０μｇ／■Ｌアンピシリンを含む１００ｍｍ　ＬＢプレート上に５ つの１０倍希釈物としてまいて、ｌ夜生育した。複写リフトを各１０倍希釈物２ つのとった。３種のオリゴヌクレオチド混合物を使用し前記のように予備ハイブ リダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを行った。単離されたクローン が接種した１０個すべてに見られた。これらをつまようじで希釈プレートから採 取し、７０Ｍｇ／ｓＬアンピシリンを含む１００■ａ＋ＬＢプレート上で単一コ ロニーを単離した。Ｃ−ファミリー　セロビオヒドロラーゼに対して特異的な２ 種のオリゴヌクレオチド（ＺＣ３４０９（ＣＣＧ　ＴＴＣＴＧＧ　ＡＣＧ　ＴＡ ＣＡＧＡ）　オよびＺＣ３４１１（ＴＧＡ　Ｔｌ、Ｔ　ＣＡＡ　ＧＴＴ　ＣＡＴ 　ＣＡＡ））を使用し単離された細菌コロニーについてＰＣ［ｌを行った０条件 は、２５μＬ反応容積で各プライマー１０ピコモルを使用すること以外前記条件 と同じにした。マスター混合物２５μＬを含むＰＣＲチューブにつまようじでコ ロニーを加えた後、サイクルを行った。１０個のうち５個が、Ｃ−ファミリー　 セロビオヒドロラーゼと予想されるサイズの強いバンドを与えた０次に、単離さ れたコロニーをＴｅｒｒｉｆｔｃブロス（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、Ａ２）　 ２０抛Ｌで生育し、迅速沸騰法でＤＮＡを単離した。これらのクローンを、サン ガージデオキシシーケンシングにより部分的に配列決定を行った。配列分析から 、ＰＣＲによりＣ−ファミリー　セロビオヒドロラーゼに特異的なバンドを与え ない５個のクローンは、Ｆ−ファミリー　セルラーゼクローンであることを示し た。

Ｃ−ファミリー　エンドグルカナーゼのクローニングのため、２×ｌＯ′クロー ンをＺＣ３３１０のみで再スクリーニングした。予備ハイブリダイゼーションお よびハイブリダイゼーションの条件は先に使用したものと同様であった。ホルム アミドを含まない予備ハイブリダイゼーシッン溶液１ｍＬ当りＩ　ＸＩＯ’　Ｃ ＰＨの末端標識ＺＣ３３１０で３０°Ｃにて１０時間フィルターをハイブリダイ ゼーションした。６０°Ｃで２分間のＴＭＡＣＬ洗浄を２回行った。複写フィル ター上に７個の弱いシダナルが見られた。プラークをピペットの大きい端で採取 し、ＬＢブロス１■し中に入れた。これらを、７０Ｍｇ／■Ｌアンピシリンを含 む１００ｍ５＋ＬＢプレート上に５つの１０倍希釈物としてそれぞれまいた。複 写リフトを各２つの希釈物から採取し、前記のように処理した。予備ハイブリダ イゼーション、ハイブリダイゼーションおよび洗浄を第一水準のスクリーニング として行った。単一コロニーハイブリダイゼーションの目的で単離された３つの コロニーを同定しそして画線培養した。単離されたものを、Ｔｅｒｒｉｆｔｃブ ロス（１リットル当り２１２ｇトリプトン、２４ｇ酵母エキス、４■Ｌグリセロ ール、オートクレーブおよび０．１７Ｍ　ＫＨｘＰＯ４，０，７２Ｍ　ＫＪＰＯ ａの１０抛Ｌ）　（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、Ａ　２　）　５０抛Ｌで一夜生 育し、標準的な方法によるアルカリ溶菌およびＰＥＧ沈殿（Ｍａｎｉａｔｉｓ　 １９Ｂ９．１．３８〜１．４１）でＤＮＡを単離した。制限酵素分析から、一つ のクローン（ｐＺＦＨ２２３）は他のものより長かったので完全配列決定用に選 んだ、配列分析は、初めてクローニングされたＰＣＲフラグメントを含むことを 示した。

聾］圀折 これらのｃＤＮ＾を酵母発現ベクターｐＹｃＩＩＥ８　’において配列決定した 。

Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒからの３５−３ｄＡＴＰ　（Ｍ、Ｄ、 　Ｂｉｇｇｉｎ　ら、ナル−Ｎａｔ１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０ ．１９８３．３９６３〜３９６５ページ参照）を使用するジデオキシチェインタ ーミネーシロン法（Ｆ、　Ｓａｎｇｅｒら、ｈμ−Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ　７４．１９７７、５４６３〜５４６７ページ）を、すべての配 列決定反応に使用した。これらの反応は、Ｐｈａｒｍａｃｉａからの変性ｔ７　 ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓ、　ＴａｂｏｒおよびＣ，Ｃ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、 　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｕｓＡ　８４．１９８７．４７６７〜４７７ １ページ、参照）で触媒され、そしてＡＤ旧プロモーター（ＺＣ９９６：　ＡＴ Ｔ　ＧＴＴ　ＣＴＣＧＴＴ　ＣＣＣ↑ＴＴ　ＣＴＴ）に相補的なオリゴヌクレオ チド、ＣＹＣＩターミネータ−（ＺＣ３６３５：　ＴＧＴ　ＡＣＧ　ＣＡＴ　Ｇ ＴＡ　ＡＣＡ　ＴＴＡ）ニ相補的なオリゴヌクレオチドまたは目的のＤＮＡに相 補的なオリゴヌクレオチドによりプライムされた。二本鎖鋳型は、Ｎ　ａ　ＯＩ Ｉで変性（Ｅ、Ｙ、　ＣｈｅｎおよびＰ、Ｈ，Ｓｅｅｂｕｒｇ＋那４　１９８５ ．１６５〜１７０ページ）した後、配列決定用オリゴヌクレオチドとハイブリダ イゼーションさせた。オリゴヌクレオチド類は、八ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ ｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　３８０八ＤＮＡ　シンセサイザーにより合成した。配列 決定反応に使用したオリゴヌクレオチド類を下記シーゲンシングオリゴヌクレオ チド表に列挙する。

Ｃ−ファミリー　セロビオヒト町九二九１Ａ迭Ｘ、訂とＺｌｊ４１１　ＴＧＡ　 ＴＧＴ　ＣＡＡ　ＧＴＴ　ＣＡＴ　ＣＡＡＺＣ３４０８ＴＣＴ　ＧＴＡ　ＣＧＴ 　ＣＣＡ　ＣＡＡ　ＣＧＧＺＣ３４０１ＡＴＧ　ＡＣＴ　ＴＣＴ　ＣＴＡ　ＡＧ Ａ　ＡＧＧＺＣ３４０６ＴＣＣＭＣＡＴＣＡＡＧ　ＴＴＣＧＧＴＺ（ｊ４１０　 ．１１ｉＧＧ　ＣＣＡ　ＡＣＴ　ＣＣＡ　ＴＣＴ　ＧＡＡＺＣ３３０９ＡＴＴ　 ＡＣＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣＧＴＴ　ＧＡＣＡＴＣＡＣＴ　ＧＴＣＡＧＡ　ＧＧＧ 　ＣＴＣＺＣ）４０９　ＣＣＧ　ＴＴＣＴＧＧ　ＡＣＧ　ＴＡＣＡＧＡｌニスＬ えリー　セルー−ゼ　蝮にＡ広亙月１ライマーＺＣ３４１３ＣＣＡ　ＴＣＧ　Ａ ＣＧ　ＧＴＡ　ＴＴＧ　Ｇ）ｉＴＺＣ１３１１ＣＧＧ　ＡＧＡ　ＧＣＡ　ＧＣＡ 　ＧＧＡ　ＡＣＡ　ＣＣＡ　ＧＡＧ　ＧＣＡ　ＧＧＧ　ＴＴＣＣＡＧ　ＣＣＡＺ Ｃ３４Ｌ２　ＧＡＧ　ＧＧＴ　ＡＧＡ　ＧＣＧ　ＡＴＣＧＴＴＺＣ３７３９Ｔ（ １，Ａ　ＴＣＴ　ＣＡＴ　ＣＧＡ　ＧＣＴ　ＧＣＡ　ＣＣＺＣ３６８４ＧＴＧ　 ＡＴＧ　ＣＴＣＡＧＴ　ＧＣＴ　ＡＣＧ　ＴＣＺＣ］３１０　ＡＡＣＴＣＣＧＴ ｒ　ＧＡＴ　ＧＭ　ＡＧＧ　ＡＧＴ　ＧＡＣＧＴＡ　ＧＺＣ３７５０ＴＣＣＡＡ Ｔ　ＡＧＣＴＴＣＣＣＡ　ＧＣＡ　ＡＧＺＣ：１６８３　ＴＧＴ　ＣＣＣＴＴＧ 　ＡＴＧ　ＴＴＧ　ＣＣＡ　ＡＣ完全鎖長ｃＤＮ＾クローンのＤＮＡ配列ならび に誘導されるアミノ酸配列を、添付図１１（Ｃ−ファミリー　セロビオヒドロラ ーゼ）　、同１２（Ｆ−ファミリー　セルラーゼ）および同１３（Ｃ−ファミリ ーエンドグルカナーゼ）に示す。

１隻五土 実施例１に記載したｃＤＮＡライブラリーを、配列；Ｎ０Ｒ−７７０：　ｓ’　 ＧＣＴＴＣＧＣＣＣＡＴＧＣＣＴＴＧＧＧＴＧＧＣＧＣＣＧＡＧＴＴＣＣＡＴ　 ３’のアンチセンス構造の３５ｂＰオリゴヌクレオチドプローブでもスクリーニ ングした。

この配列は、旦、　１ｎｓａｌｅｎｓにおける本発明者らのコドンの偏りの知見 を利用し、その微生物から精製されたＥＧＩアルカラーゼフラグメントのアミノ 酸配列から誘導した。　１．６ｋｂの完全なりローンは、図１４Ａ−Ｈに示され るように１．３ｋｂの完全なコーディング配列を含んでいた。このプローグ配列 Ｎ０Ｒ−７７０は、Ｍｅｔｓａａ　Ａｌａｓｓｓに位置していた。

′ｒＡ２に機運されるように、ポリメラーゼをさらに含むＥＧＩ遺伝子をニー・ オリーゼ（Ａ、　ｏｒ■観）発現プラスミドに挿入した。　ＥＧＩのコーディン グ領域を、開始Ｍｅｔコドン中のＮｃｏ１部位からｐＨ１１４８０由来の１４５ ０ｂｐフラグメントのようなポリＡｗｉ域のＢａ５ａ１部位下流まで切除した。

これを、ＴＡＫＡプロモーターとｐＵｃ１９の大部分を含むｐＳＸ２２４由来の ３．６ｋｂ　Ｎｃｏｌ−Ｎａｒｌフラグメント、およびＡＭＧターミネータ−と 共に残余部を含む９６０ｂｐのＮａｒｌ−Ｂａ−）夏フラグメントに連結した。

この９６ｂρフラグメントは、挿入された遺伝子以外はｐ７７７　（ヨ−ロフパ 特許第２３８．０２３号明細書に記載）と等価である９９ｆ；０から採取した。

こうして得られた発現ベクターをｐ［ＩＷ４８５と命名した。

ポリＡテールをもたない完全鎖長ＥＧＩ遺伝子による発現プラスミドｐＨ１４７ ０４は図３に示す、　Ｂｓｔ［！１１部位から下流のＭｅａ１部位の１３００ｂ ｐが、ンカー（２６４５／２６４６　）に挿入された。このリンカ−は、末端と ＣＢＤおよびＢｓＩ域の付加に使用するＣ末端に近いＰｖｕＩ部位に２つの停止 コドンを有するＢｓｔ［！１１部位の下流コーディング領域を含む。

短１１ＥＧＩ　’遺伝子を有する発現プラスミドｐＨＷ６９７は、６９ｂｐのＢ ｓｔＥＴＩ−Ｂａ−旧リンカー（２４９２／２４９３　）を使用して同様に構築 された。

このリンカ−では、本発明者らはＶａ１４ｍ＋をＬｅｕ４□に代えたＰｓｔ１部 位を挿入し、そして少なくとも１３個のアミノ酸のコーディング領域：Ｋａｚｓ ＰＫＰＫＰＧＨＧＰＲ５Ｄａｓｓを除去した。むしろあまり有用でない配列を、 有する短いテールは、ＡＳＷ域およびＢＳＪＩ域のわずかに上流の？、−ｒｅｅ ｓｅｉで見られるものに対応するＣ末端を切除して［ＥＧＩ　’を提供した。

〜４３ｋＤエンドグルカ　−ゼ　のＣＢＤおよびＢ；　がＣに・れたＥＧＩ　’ の　−１立ヌ］」シλ匪系デンマーク特許出願第７３６／９１号明細書に記載さ れるエイチ・イソレンス（＋（、１ｓｏｌｅｎｓ）の〜４３ｋ１１エンドグルカ ナーゼは、良好な洗浄特性を示した。触媒ドメインのほかに、４３ｋ［ｌセルラ ーゼはＣ−末端ＣＢＤとＢＳｉ域を有するので、この領域をＥＧＩ’（それ自体 ＣＢ［ｌまたはＢ領域をもたない）に移した。この構築は、図４に機運されるよ うに２工程で行った。　４３ｋＤセルラーゼのＢｆｉｌ域にＥＧ４　’のＣ末端 を結合することが意図されているＰｓｔｒ−旧ｎｃｒｌリンカ−（０２８１０３ ０Ｍ　）を、ｐｓχ３２０中の４３ｋＤセルラーゼ遺伝子由来のＣ末端旧ｎｃ２ −ＥｃｏＲｒｉｏｏｂｐフラグメントと共にＰｓ　ｔ　Ｉ　−ＢｃｏＲｒでｐＵ ｃ１９にサブクローニングした（図５　；　ＤＫ７３６／９１の記載に従う）、 サブクローンｐｌ’１ｉ７６７からＣＢＤオヨびＥＧＩ域を、２ＳＯｂｐ（７） Ｐｓｔｌ−８ｇｌｌ１７　ラグメントトシテ切す取り、５．７ｋｂのｐＨＷ４ｅ ｓ　（図２）のＢｓｔＥＩＩ−８ｇｌｌｌフラグメントとｐｏｗ６９７　（図３ ）由来の残在するＢｓｔＥＩＩ−Ｐｓｔｌフラグメント５５ｂｐに連結した。得 られた発現プラスミドｐＨＷ７６８は、ＥＧＩ　’のＧｌｎｎｚｘに付加された 〜４３ｋＤエンドグルカナーゼのＣＢＤおよびＢａ域を有する。

〜４３ｋｌｌエンドグルカ　−ゼ　のＣＢ１１およびＢｈ　＜Ｃに・れたＥｌｄ の　ブースミドの　。

このプラスミドは、このケースではＣ末端リンカ−がＥＧＩの完全配列を提供す ること以外は、ｐＨＷ７６８と同様に構築された０図３に３段階の工程を示す、 　ＰｖｕＴ−１（ｉｎｃ１１リンカ−（０４０Ｍ１０４１Ｍ）をｐＵｃ１８にサ ブクローニングしてｐＨ１４７７５を得た。　ｐ！ＩＷ７５５中に、ｐｓｘ３２ ０　（図５）由来の旧ｎｃｒｌ−ＥｃｏＲｒの１０００ｂｐフラグメントを挿入 してｐＦ［１１７７６を得た。

これからＣＢ［１およびＢＳＪｉ域を、２５０ｂｐのＰｖｕｌ−８ｇｌｌｌフラ グメントとして切り取り、次いでｐＨＷ４８！５　（図２）由来の５．７ｋｂの ＢｓｔＥＩＩ−８ｇｌｌｌフラグメントと９８ｗ７ｏ４（図３）由来の９ｏｂｐ のＢｓｔＥＩＩ−Ｐｖｕｌフラグメントに連結した。得られた発現プラスミドｐ ）ＩＷ７７７は、完全なＥＧＩ配列中の八３９＊３ｓに付加された〜４３ｋ［ｌ エンドグルカナーゼのＣＢＤおよびＢ領域を含む。

実施例２に記載したように、発現プラスミドｐ）！Ｗ４Ｅ＋５．　ｐＦＩＷ７０ ４゜ｐＨＷ６９７．　ｐ）ＩＷ７６ＢおよびｐＨＷ７７７で紅肛ｕ憇ＩＦＯ４１ ７７を形質転換した。

前記のようにＹＰＤ培地で生育させた形質転換体に由来する上澄を、５Ｏ５−Ｐ ＡＧＥで分析した（もとのＥＧｒは見かけＭｗ５３ｋＤを示す）、ＥＧｆ’は予 想されるようにわずかに小さな分子量を示し、そしてＣＢＤとＢ領域が付加され た種は、一定の糖の付加と共にＣＢＤおよびＢＦ４域の大きさに対応して分子量 が増大する。〜４３ｋＤのエンドグルカナーゼに対して産生されるポリクローナ ル抗体ＡＳ１６９は、〜４３ｋｌ］のＣＢＤおよびＢ領域が付加されたＥＧＩ　 とＥＧＩ’だけを認識した。一方、Ｌｉｎ５ｏｌｅｎｓ由来のセルラーゼ調製物 に対して産生されたポリクローナル抗体ＡＳ７８は、４種のすべてを認識した。

カルポキンメチルセノ日」−ス形態の可溶性セルロースについて測定したところ 、４種すべてがエンドグルカナーゼ活性を示した。

リンカ− Ｂ云ム区ｎ：　Ｂｓ　ｔ　Ｅ　２−　Ｐｓセ１−ＢａｒＩ）！１５　’　ＧＴＣ ＡＣＣＴＡＣＡＣＣＭＣＣＴＣＣＧＣＴＧＧＧＧＣＧＡＧ３　’　−ＧＡＴＧＴ ＧＧＴＴＧＧＡＣＧＣ（、ＡＣＣＣＣＧＣＴＣＬμｊ註任：　””Ｅ２−Ｘｍａ 　１−ＰＩ／ｕニーＢａｍＨ１ｗ：　ｐｓｔ、ニーＨｉｎｃエエ スｍ なるＣＢＤおよびＢｈ　〜４３ｋＤのエン゛グルカ　−ゼＡＩ域クローン由来の 各種ＣＢ［ｌおよびＢ領域の〜４３ｋＤエンドグルカナーゼに対する影響を試験 するために、本発明者らは〜４３ｋＤエンドグルカナーゼのオリジナルＣＢＤお よびＢ’ｌ域を他のＣ−末端ＣＢＩ）類およびＢ領域類、すなわちＡ−１，Ａ− ８，Ａ−９，Ａ−１１およびおよびＡ−１９（実施例１、参照）で置き換えた。

また、作用を試験するために、本発明者らは４３ｋＯエンドグルカナーゼのＢＩ ＪｉＲを削除した構成物も創製した。

フラグメント： すべてのフラグメントは、製造元の指示に従い、（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｉｓｅｒ／ Ｃｅｔｕｓ）パーキン・エルマー／シータスＤＮＡアンプリフィケーシジンシス テム（Ａｓｐｌｉｆｆｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ）を使用するＰＣＲ増幅によ って作製した。

１　）　ＰＣＲフラグメントは、ｐｓ！３２０　（図５）のＢａａ＋　［１１部 位の上流５６ｂｐから〜４３ｋＤエンドグルカナーゼ遺伝子のコーディング領域 内の７１７ｂｐまでのＤＮＡをカバーし、そして同時に、Ｂａ域の非常に初期の コーディング領域の７０８位にＫｐｎ１部位と７０２位にＳ■ａ１部位を導入す るように作製された。このＰＣＩ！フラグメントは、プライマーＮ０Ｒ１５４２ とＮ０Ｒ３０１０（下記オリゴヌクレオチドの一覧を参照）で作製した。

２　）　ＰＣＲフラグメントは、１）で導入されたＩ［ｐｎ１部位と共にフレー ム中の８ｗｔ域の非常に初期ににｐｎ１部位が導入されているＡ−１のＣＢ［ｌ およびＢｆＪ域を含み、そして遺伝子のコーディング領域の下流にＸｈｏ１部位 を導入するように作製された。使用したプライマー二Ｎ０Ｒ３０１２上流および Ｎ０１１３０１１下流。

３　）　ＰＣＲフラグメントがＡ−８由来のＣＯＤおよびＢｔｉｌ域をカバーし 、そして発現ベクターのＸｈｏ１部位が遺伝子の下流にあることを除き、２）と 同様、プライマーｊ　Ｎ０Ｒ３０１７およびＮ０Ｒ２５１６。

４）プライマーがＡ−９由来のＣＨＤおよびＢａ域をカバーするＮ０Ｒ３０１６ およびＮＯ費３０１５であること以外、２）と同様。

５）プライマーがＡ−１１由来のＣＨＤおよびＢａ域をカバーするＮ０Ｒ３０２ １およびＮ０１１２５１６であること以外、３）と同様。

６）プライマーがＡ−１９由来のＣＢＤおよびＢａ域をカバーするＮ０Ｒ３０３ ２およびＮ０Ｒ３０２２であること以外、２）と同様。

７）〜４３ｋＤエンドグルカナーゼ由来のＣＢＤを含み、モしてｐｓＸ３２０上 の遺伝子に由来るすＸｈｏ１部位の下流がＢｗＩ域の非常に後期にＰｖｕｆＩ部 位を導入しているＰＣＲフラグメント。

プライマー：　Ｎ０Ｒ３０２３およびＮＯ［１２５１６。

■止金並立上 １）＋２）は、ｐＴｏＣ６８（ＤＫ７３６／９１に記載されている）のＢａｗｌ （Ｉ　−Ｘｈｏｌ中にＢａｍＨＩ−Ｋｐｎｌおよび１ｐｎＩ−Ｘｈｏｌとして挿 入されているので、４３ｋＤのコアー酵素をＡ−１由来のＣＢＤおよびＢｊｌ域 と共にコードする。

１　）　＋　３　）　：　Ａ　−８ＣＢＤ　／Ｂｊｌ域と共ニ４３ｋＤ酵素を提 供すルコト以外、前記と同様。

１　）　＋４　）　：　Ａ−９ＣＨＤ　オＪ：ヒＢＳ！域ヲ’＆ムコト以外、ａ 記と同様。

１　）　＋　５　）　：　Ａ−１１ＣＨＤおよびＢ領域を含むこと以外、前記と 同様。

１　）　＋　６　）　：　Ａ−１９ＣＢＩ］およびＢｊＪｌ域を含むこと以外前 記と同様。

１）＋７）は、ｐＴｏＣ６８のＢａｍＨＩ−Ｘｈｏｌに、ＢａｍＨＩ−３ｏａｒ およびＰｖｕｌｌ−Ｘｈｏｌとして挿入されているので、ＢｅＪｌ域を含まない ４３ｋＤ酵素をコードする。

第１ゴヌクレオチド　： ＮＯＲ１５４２：　５’　−ＣＧＡＣＡＡＣＡＴＣＡＣＡＴＣＡＡＧＣＴＣＴＣ Ｃ−３１ＮＯＲ２５１６：　５’　−ＣＣＡＴＣＣＴｌ’ｒＡＡＣＴｊｌｉＴＡ ＧＣＧＡ　−３１叉施班旦 、ＣＢＤへの　、巴ξ（とΔ社丘 バチルス・ロータス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ＩａｕＬｕすＮＣＩＭＢ４０２５０　 （ＰＣＴ／［１Ｋ９１１０００１３に記載）によって生産されるエンドグルヵナ ーゼハ白」は、触媒ドメイン（コア）　（Ａｌａ　（３２）　Ｖａｌ　（５５５ ））とビー・ズブチリス（Ｂ、　５ｕｂｔｉｔｉｓ）　ｘンドグルカナーゼ（Ｒ ，Ｍ、　Ｍａｃｋａｙら、１９８６゜Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ！ｄｓ　Ｒｅｓ、　 １４．９１５９〜７０）のＣＢＤに相同的なＣ末端セルロースパインディングド メイン（ＣＢＤ）　（Ｇ　Ｉｎ５５６−　Ｐｒｏ７００）からなる。

酵素が、ＣＭＣ分解性コア酵を産生ずる！１．５ｕｂｔｉｌｌｉｓまたは■但で 発現される場合には、前記ＣＢＤはタンパク質分解的に開裂される。

この例では、このコアタンパク質は、フミコーラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌ ａ　１ｎｓｏｌｅｎｓ）　（０に７３６／９１に記載）由来の〜４３ｋＤエンド グルカナーゼのＢｆｉｌ域とＣＢＤと融合された。

散丘宜■Ｊ築 〜４３ｋＤエンドグルカナーゼをコードするｃＤＮ＾遺伝子を含むプラスミドｐ ｃａＨｊ　１７０は、図７に示すように構築した。　ｐｃａＨｊ１７０をＸｈｏ ｌｒおよび５ａｉｌで消化した。　２２３ｂ９のＸｈｏｒｌ　５ａｉｌフラグメ ントを弔離し、次いでＢａｍＨおよび５ａｌｚで消化したｐｌＪｃ１９　（Ｙａ ｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　ら、１９８５、　Ｇｅｎｅ　３３．１０３〜１１９ ）に連結した。このＸｈｏｌｌ−Ｂａｇ旧連結によりＲａ＠旧部位を再生した。

得られたプラスミド（Ｉｔ’１２）を、ＥｃｏＲｌおよびＢａｍＨ［で消化し、 次のリンカ−１１０Ｒ３０４５−Ｎ０Ｒ３０４６と連結した。

こうして得られたプラスミド（１Ｍ３）は、ＥｃｏＲＶおよびＳａｃ［Ｉで消化 し、４４５ｂｐ旧ｎｃ［ｌ−５ａｃｌｌのｐＰＬ５１７フラグメン］・に連結し た。

ｐＰＬ５１７は、完全なバチルス（４ａｃｉｌｌｕｓ）　［１ｎｄｏ　Ｉ遺伝子 を含む（ＰＣＴ／ＤＸ９１１０００１３）、この連結生成物を、１Ｍ４と命名し た。　４３ｋｄａｌエンドグルカナーゼ由来の糸状菌シグナルペプチドでバチル スのＥｎｄｏ　１シグナルペプチドを置き換えるために、４種のＰＣＲプライマ ーを、１スプライシングバイオバーラツプエキステンシコン（Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ　０ｖｅｒｌａｐ　Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）”　（ＳＯε）融合用に設計した （Ｒ，Ｍ、　Ｈｏｒｔｏｎら、（ｆ９８９）　：　Ｇｅｎｅ、　７７、６１〜６ ８）　、５　’プライマーＮＯ１？３２７０および３′プライマーＮ０Ｒ３２７ ５を使用し、プラスミドｐｃａｔｌｊ１０９　（ＤＸ　７３６／９１）由来の４ ３ｋ［＋シグナル配列を増幅し、５′末端のＢｃｌｒ部位にそしてバチル入梗包 」遺伝子と２１ｂｐ相同体を３′末端に導入した。

４３ｋｄａ　１遺伝子に２ｆｂｐあ相同性を導入する５′プライマーＮ０Ｒ３２ ７６および５ｏａｒ１部位をカバーする３′プライマーＮ０１１３２７１を使用 して、特有の５ａｃｌｌ部位までのＥｎｄｏｌ遺伝子５′部分を増幅した。これ らの２つのＰＣＩ？フラグメントを混合し、溶融し、アニール化し次いでｔａｑ ポリメラーゼで埋めたく図９）、得られたハイブリッドを、プライマーＮ０Ｒ３ ２７０およびＮ０Ｒ３２７Ｌを使用して増幅した。ハイブリッドフラグメントを 、ＢＣ工および５ａｃＴＩで消化し、ＴＦ４４に由来する６７６ｂｐの５ａｃｌ ｒ−Ｓａ１１フラグメントに連結し、アスペルギルス（７）発現ベクターｐＴｏ ｃ６８（Ｄに７３６／９１　）をＢａｍＨＩで消化した。この連結生成物、ｐｃ ａＨｊ１８０　（図１０）、は４３ｋＤシグナルペプチドをコードする読み取り 枠を含め、そして成熟〜４３ｋＯエンドグルカナーゼの最初の４つのＮ末端アミ ノ酸（ＭｅＬ（１）−＾ｒｇ　（２５）　）をハ並」のコア（Ｓｅｔ　（３４） −Ｖａｌ（５４９））に融合し、次いで４３ｋＤのＢｆｉＪＩ域およびＣＨＤ　 （Ｉｌｅ　（２３３）　−Ｌｅｕ　（２８５））にペプチドｌ１ｅ−５ｅｒ　− Ｇｌｕ（リンカ−によってコードされている）を融合した。　ｐｃａｌｌｊ１８ ０は、ヨーロッパ特許出願公開筒２３８，０２３号明細書に記載されるようにｐ 丁ｏｃ９０との。

同時形質転換によるアセトアミド上の選択を１吏用してアスペルギルスオリーゼ （ハと四区■■虹■憇）の形質転換に使用した。

Ｅｎｄｏ　１コアならびに〜４３ｋＤのＣＢＤおよびＢｌ域の配列は、添付の図 １５Ａ−Ｄに示す。

Ｆｉｇ・２Ｎｃａｌ １８３　Ｎｄｅｌ ２３５　ＢｂｅＩ Ｓｔｕ　Ｉ　３２２０ ｏｍＨＩ Ｆｉｇ、　７ ＮＮＯＲ３２７ ６Ｆｉ、　１０ ａｇａｃｃｑｇａ　ａ　ｔｔｃｇｃｇｇｃｃｇｃｃａｔｃｔ　ａ　ｔｃｃａ　ａ 　ｃｑｇｔｃ　ｔａ　９　ｃｔｔｃａｃ　ｔ　ｔｃａ　ｃａ@ａ　ｔｇｔａ　ｔ ｃｇｃ ＹＲ ｔｔｑａｔｑｔｑｑｑａｑｑａｃ　Ｆｉｇ、　１１ｑａ　ａｔｔｃｇｃｑｑｃ　 ｃｑｃｃｔｑｃ　ｔ　ｔｃｑａ　ａｑｃａ　ｔｃａｇｃｔｃａ　ｔｔ　ｑａｑ　 ａ　ｔｃ　ａｇｔ　ｃａ　ａ　＝@ａｔｇｃａ　ｔａｃｃ ＭＨＴ ｑａ　ａ　ｔｔｃｑｃｑｑｃｃ　ｑｃｃｔａｑａ　ｔａ　ａ　ｑｔｃａｃｔａｃ ｃｔｑ　ａ　ｔｃ　ｔｃｔｇａ　ａ　ｔａ　ａｔ＝ｃ　ｔｔ@ｔｃａｔｃａ　ｔ ｑａ　ａ　ｑ Ｅ ＴＧＴＣＧＧＧＧＣ入入入入λ入入ＴＣＴＣＴ’ＩＴＣＴ八ＧＧＡＴＡＧＧへＧ 人入Ｃ八Ｔ入ＴＴＧＧＧへＧＴＴＴＧＧ入ＣＴＴＧＴ入ＴＡＴ入入入ＴＧＡＴＡ ＣＡｆｆｒＴｒＣＡＴＡＴ’ｒＡＴＡＴＴ入Ｔ’ｒＴｒＣＡＡＣＡＴ入ＴＴｒＴ 入Ｔ？ｒＣ入ＣＧ入入入入入ＡＡＴｈｒ八１ａＬａｕＬｅｕＧｌｙＬｅｕＴｈｒ Ａ１ａＬｅｕＬｅｕＬａｕＧｌｙＬｅｕＶａＩＡｓｎＧ１ｙＧｌｎＬＹＳＰｒｏ ＧｌｙＧ　１　ｕＴｈｒ　ＬｙｓＧ　１　ｕＶａ　ｌ　Ｈｉ　ｓ　ＰｒｏＧ　１ 　ｎ　ＬａｕＴｈｒＴｈ　ｒＰｈａＡ　ｒｇＣｙ　ｓＴｈｒＬｙｓ`ｒｇＧ　ｌ ｙＧ　１ｙＣｙｓ Ｆｉｇ、１４Ａ コ１０　コ２０　ココ０　３４０　コ５０　コロ０Ｇ　ｌ　ｙ　ＬａｕＧ　１　 ｙ　ＰｒｏＧｌｙＧ　１ｙｃｙｓＧｌ　ｙＡｓｐＴｒｐＧ　ｌ　ｙＡｓｎ　Ｐｒ ｏＰｒｏ　ＰｒｏＬｙｓＡｓｐuａ　ｌ　Ｃｙｓ　Ｐｒ。

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補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成４年１１月１日

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）またはファネロシェーテ（Ｐｈａ ｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）以外の糸状菌から誘導されうるセルロースまたはヘミセ ルロース分解性酵素であって、トリコデルマレーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ 　ｒｅｅｓｅｉ）セルラーゼのターミナルＡ領域に相同的である糖バインディン グドメインを含んでなり、そして糖バインデイングドメインが下記のアミノ酸配 列 【配列があります】 または不溶性セルロース性基質もしくはヘミセルロース性基質に当該酵素をバイ ンディングしうる前記配列の副配列を含んでなる酵素。
2. ２．フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）または ミセリオプトーラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｔｈｏｒａ）の−菌株から誘導されうる請 求の範囲第１項の酵素。
3. ３．請求の範囲第１項に示されるアミノ酸配列における変化が次のものから選ば れる請求の範囲第１項の酵素：１位におけるアミノ酸がＴｒｐまたはＴｙｒであ り、２位におけるアミノ酸がＧｌｙまたはＡｌａであり、７位におけるアミノ酸 がＧｌｎ，ＩｌｅまたはＡｓｎであり、８位におけるアミノ酸がＧｌｙまたはＡ ｓｎであり、９位におけるアミノ酸がＴｒｐ，ＰｈｅまたはＴｙｒであり、１０ 位におけるアミノ酸がＳｅｒ，Ａｓｎ，ＴｈｒまたはＧｌｎであり、１２位にお けるアミノ酸がＰｒｏ，ＡｌａまたはＣｙｓであり、１３位におけるアミノ酸が Ｔｈｒ，ＡｒｇまたはＩｙｓであり、１４位におけるアミノ酸がＴｈｒ，Ｃｙｓ またはＡｓｎであり、１８位におけるアミノ酸がＧｌｙまたはＰｒｏであり、１ ９位におけるアミノ酸が（存在するなら）Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｐｈｅ，Ｌｅｕまた はＡｌａであり、 ２０位におけるアミノ酸がＴｈｒまたはＬｙｓであり、２４位におけるアミノ酸 がＧｌｎまたはＩｌｅであり、２６位におけるアミノ酸がＧｌｎ，Ａｓｐまたは Ａｌａであり、２７位におけるアミノ酸がＴｒｐ，ＰｈｅまたはＴｙｒであり、 ２９位におけるアミノ酸がＳｅｒ，ＨｉｓまたはＡｌａであり、そして／あるい は ３２位におけるアミノ酸がＬｅｕ，Ｉｌｅ，Ｇｌｎ，ＶａｌまたはＴｈｒである 。
4. ４．糖バインディングドメインが下記アミノ酸配列から構成された請求の範囲第 ３項の酵素： 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】；または 【配列があります】。
5. ５．前記酵素の触媒活性ドメインに前記糖バインディングドメインを結合する連 結Ｂ領域を特定するアミノ酸配列を、さらに含んでなる請求の範囲第１〜４項の いずれかの酵素。
6. ６．前記連結Ｂ領域がアミノ酸類グリシンおよび／またはアスパラギンおよび／ またはプロリンおよび／またはセリンおよび／またはスレオニンおよび／または グルタミンに富んだものである請求の範囲第５項の酵素。
7. ７．前記アミノ酸の１種以上が短い反復性単位を表す請求の範囲第６項の酵素。
8. ８．一の天然のセルラーゼまたはヘミセルラーゼ分解性酵素から誘導される糖バ インディングドメイン、もう一つの天然のセルラーゼまたはヘミセルラーゼ分解 性酵素から誘導されるアミノ酸配列であって、連結Ｂ領域を特定するアミノ酸配 列、ならびに前記糖バインディングドメインもくしは前記Ｂ領域のいずれかを提 供する酵素または第三の酵素から誘導される触媒活性ドメインを含んでなる請求 の範囲第１〜７項のいずれかの酵素。
9. ９．前記触媒活性ドメインが、事実上、糖バインディングドメインまたはＢ領域 を含まない酵素から誘導される請求の範囲第８項の酵素。
10. １０．セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼまたはβ −グルコシダーゼである請求の範囲第１〜９項のいずれかの酵素。
11. １１．請求の範囲第１〜１０項のいずれかの酵素をコードするＤＮＡ配列を含ん でなるＤＮＡ構成物。
12. １２．請求の範囲第１１項の押入されたＤＮＡ構成物を担持する発現ベクター。
13. １３．請求の範囲第１１項のＤＮＡ構成物または請求の範囲第１２項の発現ベク ターで形質転換された細胞。
14. １４．糸状菌、例えば、アスペルギルス（ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の−菌株に 属する、例えばアスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ） もしくはアスペルギルスオリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）、 あるいは、例えばサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のようなサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ） の−菌株に属する酵母細胞である請求の範囲第１３項の細胞。
15. １５．請求の範囲第１〜１０項のいずれかの酵素の生産方法であって、請求の範 囲第１３項または第１４項の細胞を前記酵素の生産を行うことのできる条件下で 培養し、次いで培養物から前記酵素を回収する方法。
16. １６．セルロースまたはヘミセルロースの分解剤であって、請求の範囲第１〜１ ０項のいずれかの酵素を含んでなる分解剤。
17. １７．請求の範囲第１〜１０項のいずれかの酸素２種以上の組み合わせ、または 請求の範囲第１〜１０項のいずれかの酵素１種以上とセルロースもしくはヘミセ ルロース分解活性を有する他の酵素１種以上との組み合わせを含んでなる請求の 範囲第１６項の分解剤。
18. １８．トリコデルマレーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｌ）セルラ ーゼのターミナルＡ領域に相同的な糖バインディングドメインであって、アミノ 酸配列 【配列があります】 または不溶性のセルロース性基質もしくはヘミセルロース性基質にタンパク質を バインディングさせうる前記配列の副配列を含んでなる糖バインディングドメイ ン。
19. １９．請求の範囲第１８項に示されるアミノ酸配列の変化が次のものから選ばれ る請求の範囲第１８項の糖バインディングドメイン：１位におけるアミノ酸がＴ ｒｐまたはＴｙｒであり、２位におけるアミノ酸がＧｌｙまたはＡｌａであり、 ７位におけるアミノ酸がＧｌｎ，ＩｌｅまたはＡｓｎであり、８位におけるアミ ノ酸がＧｌｙまたはＡｓｎであり、９位におけるアミノ酸がＴｒｐ，Ｐｈｅまた はＴｒｙであり、１０位におけるアミノ酸がＳｅｒ，Ａｓｎ，ＴｈｒまたはＧｌ ｎであり、１２位におけるアミノ酸がＰｒｏ，ＡｌａまたはＣｙｓであり、１３ 位におけるアミノ酸がＴｈｒ，ＡｒｇまたはＬｙｓであり、１４位におけるアミ ノ酸がＴｈｒ，ＣｙｓまたはＡｓｎであり、１８位におけるアミノ酸がＧｌｙま たはＰｒｏであり、１９位におけるアミノ酸（存在するとしたら）かＳｅｒ，Ｔ ｈｒ，Ｐｈｅ，ＬｅｕまたはＡｌａであり、 ２０位におけるアミノ酸がＴｈｒまたはＬｙｓであり、２４位におけるアミノ酸 がＧｌｎまたはＩｌｅであり、２６位におけるアミノ酸がＧｌｎ，Ａｓｐまたは Ａｌａであり、２７位におけるアミノ酸がＴｒｐ，ＰｈｅまたはＴｙｒであり、 ２９位におけるアミノ酸がＳｅｒ，ＨｉｓまたはＡｙｒであり、そして／または ３２位におけるアミノ酸がＬｅｕ，Ｉｌｅ，Ｇｌｎ，ＶａｌまたはＴｈｒである 。
20. ２０．糖バインディングドメインが下記アミノ酸配列から構成された請求の範囲 第１９項の糖バインディングドメイン：【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】；または 【配列があります】。
21. ２１．セルロースまたはヘミセルロース分解性酵素から誘導される連結Ｂ領域で あって、アミノ酸類グリシンおよび／またはアスパラギンおよび／またはプロリ ンおよび／またはセリンおよび／またはスレオニンおよび／またはグルタミンに 富んだアミノ酸配列を含んでなる前記領域。
22. ２２．前記アミノ酸類の１種以上が短い反復単位を表す請求の範囲第２１項のＢ 領域。
23. ２３．下記アミノ酸配列を含んでなる請求の範囲第２１項または第２２項のＢ領 域： 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】； 【配列があります】；または 【配列があります】。