KR100787392B1

KR100787392B1 - 알칼리 α-아밀라제 활성을 가지는 폴리펩티드 및 그것을코드하는 핵산

Info

Publication number: KR100787392B1
Application number: KR1020017012588A
Authority: KR
Inventors: 아웃트루프헬레; 호에크리스베쓰헤데가아르트; 니엘젠비아르네뢴펠트; 보르체르트토로벤베델; 니엘젠비베케스코브가아르트; 비스가르트-프란트젠헨릭; 스벤드젠알란; 안데르젠카르스텐
Original assignee: 노보자임스 에이/에스
Priority date: 1999-03-31
Filing date: 2000-03-28
Publication date: 2007-12-21
Also published as: KR20020002415A; ES2532606T3; WO2000060060A3; EP2011864B1; EP1173554A2; CA2365446C; BR0009392B1; EP2011864A1; DK2011864T3; AR023229A1; BR0009392A; CN1234854C; AU781258B2; JP2002540786A; WO2000060060A2; JP4745503B2; MXPA01009706A; CA2365446A1; CN1367824A; EP2889375B1

Abstract

본 발명은 α-아밀라제 활성을 가지는 분리된 폴리펩티드 및 폴리펩티드를 코드하는 분리된 핵산 서열에 관한 것이다. 본 발명은 또한 핵산 서열을 포함하는 핵산 구조체, 벡터, 및 숙주 세포 뿐만 아니라 폴리펩티드를 생산 및 사용하는 방법에 관한 것이다.

알칼리 α-아밀라제 활성, 분리된 폴리펩티드, 분리된 핵산.

Description

알칼리 α-아밀라제 활성을 가지는 폴리펩티드 및 그것을 코드하는 핵산 {POLYPEPTIDES HAVING ALKALINE ALPHA-AMYLASE ACTIVITY AND NUCLEIC ACIDS ENCODING SAME}

본 발명은 α-아밀라제 활성을 가지는 분리된 폴리펩티드 및 폴리펩티드를 코드화하는 분리된 핵산 서열에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 본 발명의 α-아밀라제 변이체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 핵산 서열을 포함하는 핵산 구조체, 벡터, 및 숙주 세포 뿐만 아니라 폴리펩티드를 생산하고 사용하는 방법에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 세탁, 식기 세척 및/또는 경표면 클린징 조성물에 관한 것이다.

수 년동안 α-아밀라제 효소가 다양한 목적에 사용되었고, 가장 중요한 것은 전분 액화, 직물 풀빼기, 종이 및 펄프 산업에서 전분 변형, 및 양조 및 베이킹에 관한 것이다. 증가일로로 중요해지는 α-아밀라제의 더이상의 사용은 알칼린 pH 에서 세제로 세척하는 동안 전분성 얼룩을 제거하는 것이다.

상업적인 α-아밀라제 제품의 예는 Termamyl^TM, Duramyl^TM, Natalase^TM, BAN^TM 및 Fungamyl^TM 이고, 모두 덴마크 Novo Nordisk A/S 사로부터 구입가능하다. 다른 상업적 원(源)의 상기 제품 및 유사한 제품은 산성 내지 중성에서 pH 최적을 가지고, 전형적으로 pH 5 내지 pH 7.5 의 범위이고, 알칼리 pH 의 세제 용액에서 최적의 활성을 나타내지는 않는다.

WO 95/26397 은 Bacillus 균주로부터 α-아밀라제를 개시한다. WO 96/23783 은 세척시에 개선된 성능을 가지는 Bacillus 아밀라제의 변이체를 개시한다.

US 5,147,796 은 α-아밀라제 활성을 가지는 알칼리 풀루라나제를 개시한다. 본원의 도2b 는 pH 8-8.5 에서 최적의 아밀라제 활성을 도시한다.

M.Takagi et al., J. Ferment. Bioeng.,vol 81, No.6, 557-559(1996) 은 Bacillus sp. 로부터 친알칼리성 α-아밀라제-풀루라나제를 개시한다. 효소는 pH 9에서 최적의 아밀라제 활성을 가지지만, 활성은 더 높은 pH 에서 급속히 떨어지고, pH 10 에서 활성은 pH 7 보다 더 낮다.

WO 97/00324 (KAO)는 세제에 적합한 기탁번호 FERM BP-3048 의 Bacillus sp. 균주 KSM-AP1378 로부터 유래된 알칼리 액화 α-아밀라제를 코드화하는 유전자를 개시한다.

Tsukamoto et al., (1988), Biochem. Biophys. Res Commun. 151, p.25-33) 은 Bacillus sp. #707 로부터의 알칼리 α-아밀라제를 개시한다.

본 발명의 목적은 변형된 성능, 특히 알칼리 용액, 특히 pH 약 9-11 의 알칼리 세제 용액에서 개선된 성능을 가지는 신규한 α-아밀라제를 제공하는 것이다.

(발명의 개요)

본 발명은

(a) SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4 의 아미노산 1 내지 485 와 적어도 96% 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드;

(b) (i) SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 의 핵산 서열, (ii) SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 의 cDNA 서열, (iii) 적어도 100 뉴클레오티드의 (i) 또는 (ii)의 아서열, 또는 (iv) (i), (ii), (iii)에 상보적인 가닥과 중간 긴축 조건하에서 혼성화하는 핵산서열로 코드화된 폴리펩티드;

(c) (a) 또는 (b) 의 대립 변이체;

(d) α-아밀라제 활성을 가지는 (a), (b) 또는 (c) 단편;

(e) pH 8 내지 pH 9 의 범위내에서 파데바스(파데바스) 방법(37℃)을 사용하여 결정된 pH 최적을 가지는 폴리펩티드;

(f) 55 ℃ 내지 65 ℃ 의 범위내에서 파데바스 방법(37℃)을 사용하여 결정된 최적의 온도를 가지는 폴리펩티드;

(g) 등전집중으로 결정된 7-8 사이의 pI 를 가지는 폴리펩티드(Pharmacia, Ampholine, pH 3.5-9.3); 및

(i) pH 9-11 사이에서 개선된 세척 및/또는 식기세척 성능을 가지는 폴리펩티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 한 가지 이상의 특징 또는 성질 및 α-아밀라제 활성을 가지는 분리된 폴리펩티드에 관한 것이다.

본 발명의 α-아밀라제가 상기 특징의 하나 이상을 가질 수 있다는 것이 이해될 것이다.

더욱이, 본 발명은 본 발명의 α-아밀라제 변이체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열 및 핵산 서열을 포함하는 핵산 구조체, 벡터, 및 숙주 세포뿐만 아니라 폴리펩티드를 생산하고 사용하는 방법에 관한 것이다.

도 1 은 많은 Bacillus α-아밀라제의 배열을 도시한다.

도 2 는 SP722 및 SP690 α-아밀라제와 비교할 때 AA560 α-아밀라제의 pH 프로파일을 도시한다. pH 프로파일을 37 ℃ 에서 측정했다. 활성은 Abs650/mg 효소일 때 절대값으로 도시된다.

도 3 은 SP722 및 SP690 α-아밀라제와 비교할 때 AA560 α-아밀라제의 온도 프로파일을 보여준다. 온도 프로파일은 Abs650/mg 효소일 때 도시된다.

도 4 는 각각 SP722, SP690 및 Termamyl

각각과 비교할 때 AP 모델 세제 97 에서 AA560 α-아밀라제의 세척 성능을 도시한다.

도 5 는 SP722, SP690 및 Termamyl

각각과 비교하여 Omo Multi Acao 에서 AA560 의 세척 성능을 도시한다.

도 6 은 SP722, SP690 및 Termamyl

각각과 비교하여 농축된 Omo 에서 AA560 의 세척 성능을 도시한다.

도 7 은 SP722, SP690 및 Termamyl

각각과 비교하여 Ariel Futur 액체에서 AA560 의 세척 성능을 도시한다.

미생물원

본 발명의 알칼리 α-아밀라제는 균주 Bacillus 로부터 유래될 수 있다. 바람직한 균주는 Bacillus sp. DSM 12649 (AA560 α-아밀라제) 또는 Bacillus sp. DSM 12648 (AA349 α-아밀라제) 이다. 본 발명자는 균주를 특허절차에 관한 미생물 기탁에 관한 국제조약상의 부다페스트 약정에 따라서 1999 년 1 월 25 일에 Deutshe Sammlung von Microorganism und Zellkulturen GmbH(DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig DE 에 기탁했다.

각각, 플라스미드 pLiH1274 및 pTVB299 에 클론된 α-아밀라제 유전자를 포함하는 NN049467 및 NN049470 으로 명명된 2 개의 Escherichia coli 균주를 Deutshe Sammlung von Microorganism und Zellkulturen GmbH(DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig DE 에 부다페스트협정에 따라서 1999 년 4 월 7 일 기탁했고, 수탁번호는 각각 DSM12761 및 DSM12764 이었다.

α-아밀라제 활성을 가지는 폴리펩티드

α-아밀라제(α-1,4-글루칸-4-클루카노히드로라제, EC 3.2.1.1)는 전분 및 다른 선형 및 분지형 1,4-글루코시드 올리고- 및 다당의 가수분해를 촉매하는 효소군으로 구성된다. 본 발명의 목적을 위해서, α-아미라제 활성은 하기에 개시된 "물질 및 방법" 단락의 파데바스 분석법 또는 pNPG7 분석법을 사용하여 결정된다.

효소의 상동성

제 1 의 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4 (즉, 성숙한 폴리펩티드)의 아미노산 1 내지 485 에 적어도 약 96%, 바람직하게는 적어도 약 97%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 98%, 가장 바람직하게는 약 99 % 의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 가지며, α 아밀라제 활성을 가지는 분리된 폴리펩티드에 관한 것이다(이하, "상동성 폴리펩티드"). 바람직한 양태에서, 상동성 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4 의 아미노산 1 내지 485 와 5 개의 아미노산, 바람직하게는 4 개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 3 개의 아미노산, 더욱더 바람직하게는 2 개의 아미노산, 및 가장 바람직하게는 1 개의 아미노산이 다른 아미노산 서열을 가진다. SEQ ID NO:2 와 SEQ ID NO:4 가 동일하다는 것이 주목된다. 그러나, 각각 SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:4 로 제시된 본 발명의 α-아밀라제를 코드화하는 DNA 서열 즉, 각각 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:3 은 동일하지 않다.

아미노산 서열 상동성은 제 2 의 서열로부터 제 1 의 서열의 유도형을 나타내는 2 개의 서열간의 상동성의 정도로 결정될 수 있다. 상동성은 당업계에 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 적절하게 결정될 수 있다. 그러므로, GCG 버전 8 에서 제공된 GAP (Needleman, S.B. 및 Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453)는 서열의 쌍형성식 배열 및 생략값 고정을 사용하여 동일성 또는 상동성 정도의 계산에 사용될 수 있다. 갭 셋팅은 다음의 매개변수:갭 생성 패널티 5.0 및 갭 확장 패널티 3.0 일 수 있다.

공지된 Bacillus sp . α-아밀라제에 대한 상동성

공지된 서열의 상동성 연구는 상기 개시대로 결정된 아미노산 기초상에서 65-95 % 의 범위로 많은 Bacillus 아밀라제와 본 발명의 서열상에 상동성을 나타냈다.

특히, 가장 상동성을 보이는 발견된 α-아밀라제는 SP690(약 87 % 상동성인 US 특허번호 5,856,164 의 SEQ ID NO:1), SP722(약 87 % 상동성인 US 특허번호 5,856,164 의 SEQ ID NO:2), 약 86% 상동성인 WO 97/00324 의 SEQ ID NO:2 로 개시된 Bacillus sp. KSM-AP1378 로부터 얻어진 α-아밀라제의 성숙한 부분(즉, 아미노산 번호 31-516), 및 상기에 개시된 대로 결정된 SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:4 에 약 95% 상동적인 Tsukamoto et. al., (1988), Biochem. Biophys. Res Commun.151, p. 25-33)(도 1 의 배열상에서 서열 "707 amy" 로 도시)에 개시된 α-아밀라제이다.

바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4 또는 그것의 대립 변이체의 아미노산 서열; 또는 α-아밀라제 활성을 가지는 그것의 단편을 포함한다. SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:4 는 본 발명의 알칼리 α-아밀라제의 성숙한 부분을 나타낸다.

SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4 의 단편은 아미노산 및/또는 아미노산 서열의 카르복실 말단이 결실된 하나 이상의 아미노산을 가지는 폴리펩티드이다.

대립 변이체는 같은 염색체 자리를 차지하는 유전자의 어떤 둘 이상의 선택형을 표시한다. 대립 변이체는 돌연변이를 통해서 자연 발생하고, 개체군내에서 다형성을 유발할 수 있다. 유전자 돌연변이는 잠재형(코드화 폴리펩티드내의 무변화) 이거나, 변형된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코드화할 수 있다. 폴리펩티드의 대립 변이체는 유전자의 대립 변이체에 의해서 코드화된 폴리펩티드이다.

상동성 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4 의 아 미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입 또는 결실 및/또는 서로 다른 아미노산 잔기에 의한 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환에 의해 다를 수 있다. 바람직하게는, 아미노산 변화는 폴딩 및/또는 단백질 활성에 중요한 영향을 미치지 않는 보존적 아미노산 치환인 경미한 성질; 전형적으로 1 내지 약 30 아미노산의 작은 결실; 아미노-말단 메티오닌 잔기와 같은 작은 아미노- 또는 카르복실-말단 연장; 약 20-25 잔기 이하의 작은 링커 펩티드; 또는 폴리-히스티딘 트랙, 항원성 에피토프 또는 결합 도메인과 같은 순전하 또는 다른 기능을 변화시킴으로써 정제를 용이하게 하는 작은 연장이다.

보존적인 치환의 예는 염기 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(류신, 이소류신 및 발린), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌 및 메티오닌)의 군내이다. 특정 활성을 일반적으로 변형시키지 않는 아미노산 치환이 당업계에 공지되고, 예를 들어, H.Neurath 및 R.L.Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York에 개시된다. 가장 흔하게 발생하는 변화는 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, 및 Asp/Gly 뿐만 아니라 이들의 역이다.

제 2 의 양태에서, 본 발명은 중간 긴축 조건, 바람직하게는 중간-이상의 긴축 조건, 더욱 바람직하게는 고 긴축 조건, 및 가장 바람직하게는 같은 조건하에서 (i) SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 의 핵산 서열, (ii) SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 의 cDNA 서열, (iii) (i), (ii) 의 서열, 또는 (iv) (i), (ii), 또는 (iii) 의 상보 서열과 혼성화하는 핵산 프로브를 가지는 매우 높은 긴축 조건하에서 혼성화하는 핵산 서열로 코드화된 α-아밀라페 활성을 가지는 분리된 폴리펩티드에 관한 것이다(J. Sambrook,E.F.Fritsch, 및 T.Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York). SEQ ID NO:1 의 아서열은 적어도 100 뉴클레오티드 또는 바람직하게는 적어도 200 뉴클레오티드일 수 있다. 더욱이, 아서열은 α-아밀라제 활성을 가지는 폴리펩티드 단편을 코드화할 수 있다. 폴리펩티드는 또한 α-아밀라제 활성을 가지는 폴리펩티드의 대립 변이체 또는 단편일 수 있다.

SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 의 핵산 서열 또는 그것의 아서열 뿐만 아니라 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4 의 아미노산 서열 또는 그것의 단편은 당업계에 주지된 방법에 따라 서로 다른 속 또는 종의 균주로부터의 α-아밀라제 활성을 가지는 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 를 확인하고 클론하기 위한 핵산 프로브를 유전적으로 설계하는 데 사용할 수 있다. 특히, 이러한 프로브는 관심의 속 또는 종의 게놈 또는 cDNA 와 혼성화 다음에, 그것에 해당하는 유전자를 확인하고 분리하기 위한 표준 서던 블럿 과정에 사용될 수 있다. 이러한 프로브는 전체 서열보다 상당히 짧을 수 있지만, 길이면에서 적어도 15, 바람직하게는 적어도 25, 및 더욱 바람직하게는 적어도 35 뉴클레오티드이어야만 한다. 더욱 긴 프로브가 사용될 수 있다. DNA 및 RNA 프로브가 사용될 수 있다. 프로브는 해당하는 유전자를 검출하기 위해 일반적으로 표지된다. (예를 들어, ³²P, ³H, ³⁵S, 비오틴, 또는 아비딘) 이러한 프로브는 본 발명에 포함된다.

그러므로, 이런 다른 생물로부터 제조된 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리는 상기에 개시된 프로브와 혼성화하고, α-아밀라제 활성을 가지는 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 에 대해 스크리닝될 수 있다. 이러한 다른 생물의 게놈 또는 다른 DNA 는 아가로스 또는 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동, 또는 다른 분리 기법을 통해서 분리될 수 있다. 라이브러리의 DNA 또는 분리된 DNA 는 니트로셀룰로스 또는 다른 적당한 담체 물질에 옮겨져서 고정화될 수 있다. SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 또는 그것의 아서열과 상동성 있는 클론 또는 DNA 를 확인하기 위해서, 담체 물질이 서던 블럿에 사용된다.

본 발명의 목적을 달성하기 위한 혼성화는 핵산서열이 중간 내지 고 긴축 조건에서 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO:3 로 제시된 핵산 서열, 그것의 상보적인 가닥, 또는 그것의 아서열에 해당하는 핵산 프로브에 혼성화하는 것을 나타낸다. 이러한 조건하에서 핵산 프로브에 혼성화하는 분자는 X-레이 필름으로 검출된다.

다른 바람직한 구체에에서, 핵산 프로브는 각각 Escherichia coli DSM12761 또는 Escherichia coli DSM12764 에 포함되는 플라스미드 pLiH1274(AA349) 또는 pTVB299(AA560)에 함유된 핵산서열이고, 또는 여기에서 핵산 서열은 본 발명의 산성 α-아밀라제 활성을 가지고 각각 SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:4 로 제시된 폴리펩티드를 코드화한다.

길이면에서 적어도 100 뉴클레오티드의 긴 프로브의 경우에, 중간 내지 고 긴축 조건은 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 ㎍/ml 전단 및 변형된 연어 정자 DNA, 중간 및 중간-이상 긴축용 35 % 포르마마이드, 또는 높은 그리고 매우 높은 긴축용 50% 포르마마이드의 42 ℃ 에서 예비혼성화 및 혼성화, 그 다음 표준 서던블럿 과정으로서 정의된다.

길이면에서 적어도 100 뉴클레오티드의 간 프로브의 경우에, 담체 물질은 바람직하게는 적어도 55℃ 에서(중간 긴축), 바람직하게는 적어도 60 ℃(중간-이상 긴축), 더욱 바람직하게는 적어도 65 ℃(고 긴축), 및 가장 바람직하게는 적어도 70 ℃(매우 고긴축)에서 2 x SSC, 0.2% SDS 를 사용하여 15 분동안 최종적으로 각 3 번 세척한다.

길이면에서 약 15 뉴클레오티드 내지 약 70 뉴클레오티드인 짧은 프로브의 경우에, 긴축 조건은 0.9 M NaCl, 0.09 M Tris-HCl pH 7,6, 6 mM EDTA, 0.5% NP-40, 1X Denhardt 용액, 1mm 소듐 피로포스페이트, 1mM 소듐 단일염기 포스페이트, 0.1mM ATP, 및 ml 당 0.2 mg 의 효모 RNA 에서 Bolton 및 McCarthy(1962, Proceeding of the National Academy of Science USA 48:1390)에 따른 계산을 사용하여 계산된 T_m의 5 ℃ 내지 10 ℃ 이하에서 예비혼성화, 혼성화, 및 혼성화-후 세척, 다음에 표준 서던 블럿 과정으로 정의된다.

길이면에서 약 15 뉴클레오티드 내지 약 70 뉴클레오티드의 짧은 프로브의 경우에, 담체 물질을 15 분동안 6X SSC 및 0.1% SDS 에서 한 번 세척하고 계산된 T_m 의 5 ℃ 내지 10 ℃ 이하에서 6 X SSC 를 사용하여 15 분동안 각 2 번 세척한다.

제 3 의 양태에서, 본 발명은 분리된 폴리펩티드, 즉 다음의 물리화학적 성질을 가지는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4 로 제시된 폴리펩티드에 관한 것이다.

파데바스 방법(37 ℃)을 사용하여 결정된 pH 최적은(도 2 참조) pH 8 내지 9 의 범위내, 더욱 정확하게는 약 8.5 로 발견되었다.

Phasebas 방법(pH 9.0)을 사용하여 결정된 최적의 온도(도 3 참조)는 55 내지 65 ℃ 의 범위내, 더욱 정확하게는 약 60 ℃에서 발견되었다.

7-8 의 pI (실시예 6 의 표 1 참조)를 등전집중(Pharmacia, Ampholine, pH 3.5-9.3)으로 결정했다.

35,000 NU/mg 의 비활성도(실시예 6 의 도 1 참조)가 파데바스 방법을 사용하여 결정되었고, 6,000 NU/mg 이 pNPG7 방법을 사용하여 결정되었다.

본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:4 로 제시된 성숙한 폴리펩티드의 α-아밀라제 활성의 적어도 20 %, 바람직하게는 적어도 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 60 %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 80 %, 더욱 더 바람직하게는 90 %, 및 가장 바람직하게는 적어도 100 % 를 가진다.

본 발명의 폴리펩티드는 어떤 속의 미생물로부터 얻어질 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서, 허여된 원과 연관되어 본원에 사용된 용어 "로부터 획득"은 핵산 서열로 코드화된 폴리펩티드는 원 또는 원의 핵산 서열이 삽입된 세포에 의해 생산된다.

본 발명의 폴리펩티드는 박테리아 폴리펩티드이다. 예를 들어, 폴리펩티드는 Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtils, 또는 Bacillus thuringiensis 폴리펩티드와 같은 그람 양성 박테리아 폴리펩티드 ; 또는 예를 들어, Streptomyces lividans 또는 Streptomyces murinus 폴리펩티드와 같은 Streptomyces 폴리펩티드; 또는 E. coli 또는 Pseudomonas sp. 폴리펩티드와 같은 그람 음성 박테리아 폴리펩티드일 수 있다.

다른 바람직한 구체예에서, 폴리펩티드는 Bacillus sp. 폴리펩티드, 더욱 바라직한 구체예에서, 폴리펩티드는 예를들어, 각각 SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:4 의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드와 같은 Bacillus sp. DSM 12648 또는 Bacillus sp. DSM 12649 폴리펩티드이다.

상기 언급된 종과 관련하여 본 발명은 완전 및 불완전 단계, 및 알려진 종 이름과 무관하게 예를 들어, 무정형과 같은 분류상의 등가물을 포함한다. 당업자는 적당한 등가물의 동일성을 쉽게 인식할 것이다.

이러한 종의 균주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC), Deutsch Sammlung von Mikroorganism und Zellkulturen GmbH(DSM) , Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS) , 및 Agricultural Research Service Patent Cluture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) 과 같은 많은 배양 기탁 공공기간으로부터 쉽게 이용할 수 있다.

더욱이, 이러한 폴리펩티드는 상기 언급된 프로브를 사용하여 천연(예를 들 어, 토양, 퇴적물, 물등)에서 분리된 미생물을 포함하는 다른 원으로부터 확인하여얻을 수 있다. 천연 서식지로부터 미생물을 분리하는 기법이 당업계에 주지된다. 그다음 핵산 서열은 다른 미생물의 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 유사한 방식으로 유도될 수 있다. 일단 폴리펩티드 코드화 핵산 서열이 프로브로 검출되면, 서열은 당업자에게 공지된 기법을 사용하여 분리되거나 클론화 될 수 있다(예를 들어, Sambrook et al., 1989, 상기참조)

본원에 정의된 대로, "분리된" 폴리펩티드는 SDS-PAGE 로 결정될 때, 예를 들어, 적어도 약 20 % 순도, 바람직하게는 적어도 약 40 % 순도, 더욱 바람직하게는 약 60 % 순도, 더욱 더 바람직하게는 약 80 % 순도, 가장 바람직하게는 약 90 % 순도, 최상으로 바람직하게는 약 95% 순도로 본질적으로 다른 비-α-아밀라제 폴리펩티드가 없는 폴리펩티드이다.

본 발명의 핵산 서열로 코드화된 폴리펩티드는 또한 융합형 폴리펩티드 또는 절단가능한 융합형 폴리펩티드를 포함하고, 여기에서 다른 폴리펩티드는 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단 또는 그것의 단편에 융합된다. 융합형 폴리펩티드는 본 발명의 핵산 서열(또는 그것의 부분)과 다른 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열(또는 그것의 부분)을 융합함으로써 생성된다. 융합 폴리펩티드를 생산하는 기법은 당업계에 공지되고, 폴리펩티드를 코드화하는 코드 서열의 연결을 포함하여 서열이 프레임내에 존재하고 융합형 폴리펩티드의 발현이 같은 프로모터 및 터미네이터의 조절하에 있게 한다.

본원에서 용어 "개선된 세척 성능" 은 본원의 실시예 8 에 개시된 세척 조 건, 또는 비치환 α-아밀라제 골격과 같은 비돌연변이화형 모 α-아밀라제에 비교하여 본 발명의 돌연변이체/변이체의 경우에 결정된 성능을 의미하고, 세척성능은 예를 들어, SP690, SP722 및 Termamyl

과 같은 세척에 사용된 다른 α-아밀라제보다 높다.

돌연변이형 α-아밀라제

AA560 변이체의 변형된 성질

하기의 논의는 본 발명의 AA560 또는 A349 α-아밀라제에 도입될 수 있는 돌연변이, 특히 치환 및 결실간의 상관관계, 및 모 α-아밀라제의 성질과 비교하여 성질면에서의 바람직한 변형에 관한 것이다.

발명은 또한 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4 로 제시된 α-아밀라제의 돌연변이(즉, α-아밀라제 변이체)에 관한 것이다. 본 발명의 돌연변이체 α-아밀라제는 하나 이상의 메티오닌 아미노산 잔기가 Cys 및 Met 을 제외한 어떤 아미노산 잔기로 치환된다는 사실을 특징으로 한다. 그러므로, 본 발명에 따라서, 메티오닌 아미노산 잔기를 치환하기 위한 아미노산 잔기는 다음과 같다: Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly,His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 및 Val.

본 발명의 돌연변이체 α-아밀라제의 바람직한 구체예는 하나 이상의 메티오닌 아미노산 잔기는 Leu, Thr, Ala, Gly, Ser, Ile, 또는 Val 아미노산 잔기, 바람직하게는 Leu, Thr, Ala, 또는 Gly 아미노산 잔기로의 치환을 특징으로 한다. 구체예에서, 산화제의 존재하에서 매우 만족스러운 활성 수준 및 안정성을 얻는다. 구체적으로 이것은 하기의 위치에서 하나 이상의 메티오닌이 특히 부위 특이적 돌연 변이유발 및 유전자 셔플링을 포함하는 당업계에 공지된 적당한 기법을 사용하여 치환 또는 결실될 수 있다는 것을 의미한다. SEQ ID NO:2 넘버링을 사용한 기대되는 위치는: 9,10, 105, 116, 202, 208, 261, 309, 323, 382, 430, 440 이다.

본 발명의 돌연변이체 α-아밀라제의 바람직한 구체예는 위치 202 에서 메티오닌 아미노산 잔기는 Cys 및 Met 을 제외한 어떤 아미노산 잔기, 바람직하게는 Leu, Thr, Ala, Gly, Ser, Ile, 또는 Asp 로 치환된다는 것을 특징으로 한다.

다른 기대되는 바람직한 돌연변이는 1, 2 이상의 아미노산 잔기 R181, G182, D183 또는 G184, K185, G186 의 결실 또는 하나 이상의 이들 잔기의 치환을 포함한다. 바람직한 돌연변이는 D183-G184 의 결실이다. 구체적으로 관련 돌연변이는 G186 을 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 및 Val 으로 치환하는 것이다. 특히 바람직한 치환은 G186R 이다.

또한 기대되는 것은 N195 를 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met,Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 및 Val 으로 치환하는 것이다.특히 관심대상인 치환은 N195F 이다.

상기 언급된 돌연변이의 하기의 조합은: (D183-G184)+N195F 의 결실; (D183-G184) +G186R 의 결실; (D183-G184)+G186R+N195F, 및 G186R+N195F 의 결실을 포함한다.

증가된 열안정성

예를 들어, 증가된 열안정성, 특히 산성 pH 및/또는 저 Ca²⁺ 농도를 가지는 본 발명의 변이체를 유발하는 돌연변이는 하기의 위치(AA560 α-아밀라제 SEQ ID NO:2 넘버링 사용)에서 돌연변이를 포함한다:

R158, N174, G186, N195, N197, H210, E212, V214, V215, E216, K269, N270.

본원에서, 용어 "산성 pH" 는 7.0 이하의 pH, 특히, 공업상 전분 액화 과정이 일반적으로 수행되는 pH 5.5 내지 6.2 사이의 pH 범위 이하를 의미한다.

본 원에서 용어 "저 칼슘 농도"는 공업상 전분 액화에 사용된 일반적인 수준 이하의 농도를 의미한다. 일반적인 농도는 옥수수내의 무 Ca²⁺의 농도에 따라서 다르다. 1 mM (40 ppm)에 해당하는 일반적인 투여량은 옥수수가 40 내지 60 ppm 무 Ca² ⁺ 를 방출하는 수준으로 함께 첨가된다.

본 원에서, 용어 "고 온도" 는 95 ℃ 내지 160 ℃ 사이의 온도, 특히 공업상 전분 액화 과정이 일반적으로 수행되는 95 ℃ 내지 105 ℃ 사이의 온도 범위를 의미한다.

본 발명자는 열안정성, 특히 산성 pH 및/또는 저 Ca²⁺농도가 상기 언급된 돌연변이 및/또는 I206 을 포함하는 다른 돌연변이와 서로를 조합시킴으로써 더욱 더 증가될 수 있다는 것을 발견했다.

상기 "다른" 돌연변이는 하기의 것이다(AA560 α-아밀라제, SEQ ID NO: 2와 비교):

N195, E212, E216, K269 및 I206.

상기 돌연변이는 WO 96/23873 (즉, 본원의 SEQ ID NO:2 의 위치 R181, G182, D183, G184)에 개시된 1, 바람직하게는 2 또는 적어도 3 개의 위치에서의 결실과 조합될 수 있다.

본 발명에 따른 α-아밀라제 활성을 가지는 모 AA560 α-아밀라제의 변이체는 상기의 기대되는 위치의 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 의 돌연변이를 포함한다.

언급된 AA560 α-아밀라제만이 기대되는 것이 아니라는 것이 강조되어야만 한다. 하기에 정의된 상동성(동일)을 가진 α-아밀라제가 본 발명의 범위내로 기대된다.

SEQ ID NO:2 의 각각 N195, I206, E212 및 E216 에 해당하는 위치에서 각각의 아미노산 잔기는 많은 터마밀-α-아밀라제, 즉, Termamyl

(B.licheniformis α-아밀라제)의 보존적인 아미노산 잔기로 구성된다는 것이 언급될 수 있다. 그러므로, 예를 들어, AA560 및 터마밀 잔기의 해당하는 위치는 하기의 도 1 및 표 1 및 표 2 의 배열에서 보여질 수 있다.

이러한 보존적인 아미노산 잔기의 돌연변이는 성질 변형에 매우 중요하다.

넘버링으로 SEQ ID NO:2 를 사용하는 경우에, 본 발명에 따라서 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 개의 돌연변이가 성질, 특히 (본원의 SEQ ID NO:2에 대한 것) 산성 pH 및/또는 저 Ca²⁺농도에서 열안정성을 증가시키기 위해서 다음의 위치에서 만들어질 수 있다 :

1: R181*, G182*, D183*, G184*;

2: N195A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

3: I206A, R, D, N, C, E, Q, G, H, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

4: E212A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

5: E216A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

6: K269A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;

7: R181A, N, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V.

본 발명에 따라 기대되는 것은 3, 4, 5, 6 또는 7 개의 돌연변이와 조합되는 것이다.

특이적 이중 돌연변이는 발명에 따른다(넘버링을 위해서 SEQ ID NO:2 사용):

-R181*/G182*/N195A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

-G182*/D183*/N195A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

-D183*/G184*/N195A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

-D183*/G184*/R181A, N, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

-R181*/G182*/I206A, R, D, N, C, E, Q, G, H, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

-G182*/D183*/I206A, R, D, N, C, E, Q, G, H, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

-D183*/G184*/I206A, R, D, N, C, E, Q, G, H, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

-R181*/G182*/E212A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

-G182*/D183*/E212A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

-D183*/G184*/E212A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V:

-R181*/G182*/E216A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

-G182*/D183*/E216A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

-D183*/G184*/E216A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

-R181*/G182*/K269A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;

-G182*/D183*/K269A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;

-D183*/G184*/K269A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;

-N195A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V

/I206A, R, D, N, C, E, Q, G, H, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

-N195A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V

/E212A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

-N195A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V

/E216A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

-N195A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V

/K269A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;

-I206A, R, D, N, C, E, Q, G, H, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V

/E212A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

-I206A, R, D, N, C, E, Q, G, H, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V

/E216A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

-I206A, R, D, N, C, E, Q, G, H, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V

/K269A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;

-E212A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V

/E216A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

E212A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V

/K269A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;

-E216A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V

/K269A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V.

바람직한 구체예에서, 변이체는 다음의 돌연변이를 포함한다: SEQ ID NO:2 또는 본원에서 정의된 96% 상동성 α-아밀라제에 해당하는 위치에서 N195F/K264S. 다른 구체예에서, 본 발명의 변이체는 다음의 돌연변이를 포함한다: SEQ ID NO:2 또는 다른 상동성 α-아밀라제의 해당하는 위치에서 R181*/G182*/N195F. 상기 변이체는 위치 E216Q 에서 치환을 더 포함할 수 있다.

pH 8-10.5 에서 AA560 변이체의 개선된 Ca ²⁺ 안정성

개선된 Ca²⁺안전성은 Ca²⁺결실하에서 효소의 안정성이 개선된 것을 의미한다. 본원에서, 높은 pH 에서 개선된 Ca²⁺안정성을 획득하는 것과 관련된 중요한 돌연변이(아미노산 치환 및 결실 포함)는 상기 단락 "증가된 열안정성"에 개시된 돌연변이 및/또는 결실을 포함한다.

본 발명의 일반적인 돌연변이

본 발명의 변이체는 하나 이상의 변형뿐만 아니라 상기에 개시된 것을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 변형된 α-아밀라제 변이체 부분에 존재하는 하나 이상의 프롤린 잔기는 가능한, 자연발생 비-프롤린 잔기의 어떤 것일 수 있는 바람직하게는 알라닌, 글리신, 세린, 트레오닌, 발린 또는 류신인 비-프롤린 잔기로 치환되는 것이 유리할 수 있다.

유사하게, 변형된 모 α-아밀라제를 가지는 아미노산 중에 존재하는 하나 이상의 시스테인 잔기는 세린, 알라닌, 트레오닌, 글리신, 발린 또는 류신과 같은 비-시스테인 잔기로 치환되는 것이 바람직할 수 있다.

더욱이, 본 발명의 변이체는-변형만이거나 상기 개시된 어떤 변형과 조합으로-변형되어서 SEQ ID NO:2 의 아미노산 단편 190-214 에 해당하는 아미노산 단편 에 존재하는 하나 이상의 Asp 및/또는 Glu 가 각각 Asn 및/또는 Gln 으로 치환될 수 있다. 또한 α-아밀라제에서 SEQ ID NO:2 의 아미노산 단편 190-214 에 해당하는 아미노산 단편에 존재하는 하나 이상의 Lys 잔기를 Arg 로 치환하는 것이 관심 대상이다.

본 발명은 둘 이상의 상기 개시된 변형이 삽입된 변이체를 포함한다는 것이 이해될 것이다.

더욱이, 본원에 개시된 변이체의 어떤 것에 점-돌연변이를 도입하는 것이 유리할 수 있다.

돌연변이는 다음의 위치:Y133, L17, M202, V214 에서 돌연변이를 적절히 포함할 수 있다.

α-아밀라제 코드화 DNA 서열의 클로닝

모 α-아밀라제 코드화 DNA 서열은 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 문제의 α-아밀라제를 생산하는 어떤 세포 또는 미생물로부터 분리될 수 있다. 첫번째로, 게놈 DNA 및/또는 cDNA 라이브러리를 염색체 DNA 또는 메신저 RNA 를 사용하여 연구될 α-아밀라제를 생산하는 유기물로부터 제조해야만 한다. 그 다음, α-아밀라제의 아미노산 서열이 공지된 경우에, 상동성, 표지 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성할 수 있고, 문제의 유기물로부터 제조된 게놈 라이브러리의 α-아밀라제 코드화 클론을 확인하는 데 사용될 수 있다. 택일적으로, 공지된 α-아밀라제 유전자에 상동적인 서열을 포함하는 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브가 저긴축의 혼성화 및 세척조건을 사용하여 α-아밀라제-코드화 클론 확인에 프로브로 사용될 수 있다.

그러나, α-아밀라제-코드화 클론을 확인하는 다른 방법은 게놈 DNA 단편을 플라스미드와 같은 발현 벡터에 삽입하는 단계, 결과적인 게놈 DNA 라이브러리로 α-아밀라제-음성 박테리아를 형질전환시키는 단계, 그 다음, α-아밀라제에 대한 기질을 포함하는 한천상에 형질전환된 세균을 플레이팅함으로써 클론이 확인 대상인 α-아밀라제를 발현하도록 허용하는 단계를 포함할 것이다.

택일적으로, 효소를 코드화하는 DNA 서열은 예를 들어, S.L.Beaucage 및 M.H. Caruthers(1981) 에 개시된 포스포로아미다이트 방법 또는 Matthes et al.(1984)에 개시된 방법과 같은 확립된 표준방법으로 합성될 수 있다. 포스포로아미다이트 방법에서, 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 자동 DNA 합성기에서 합성되고, 정제되고, 어닐링되고, 연결되어 적당한 벡터에 클론된다.

최종적으로, DNA 서열은 표준 기법에 따라서, 합성, 게놈 또는 cDNA 기원의 단편(바람직하게, 전체 DNA 서열의 다양한 부분에 해당하는 단편)을 연결하여 제조된 혼합된 게놈 및 합성 기원, 혼합된 합성 및 cDNA 기원 또는 혼합된 게놈 및 cDNA 기원일 수 있다. DNA 서열은 또한 예를 들어, US 4,683,202 또는 R.K.Saiki et al.(1988)에 개시된대로 특정 프라이머를 사용하여 폴리머라제 사슬 반응(PCR)으로 제조될 수 있다.

부위-특이적 돌연변이유발

일단 α-아밀라제-코드화 DNA 서열이 분리되고, 돌연변이에 바람직한 부위가 확인되면, 돌연변이는 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 도입될 수 있다. 올리 고뉴클레오티드는 바람직한 돌연변이 부위의 양측면에 위치한 뉴클레오티드 서열을 포함한다; 돌연변이체 뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 합성동안 삽입된다. 구체적인 방법에서, α-아밀라제-코드화 서열을 연결하는 DNA 의 단일-가닥 갭이 α-아밀라제 유전자를 운반하는 벡터에 생성된다. 그 다음, 바람직한 돌연변이를 포함하는 합성 뉴클레오티드가 단일-가닥 DNA 의 상동적 부분에 어닐링된다. 그 다음 잔여 갭이 DNA 폴리머라제 I(클루노우 단편)로 채워지고, 구조체는 T4 리가제를 사용하여 연결된다. 본 방법의 구체적 예는 Morinaga et al.(1984)에 개시된다. US 4,760,025 는 카세트의 경미한 변형을 수행함으로써 다중 돌연변이를 코드화하는 올리고뉴클레오티드의 도입을 개시한다. 그러나, 다양한 길이의 많은 올리고뉴클레오티드가 도입될 수 있기 때문에 더욱 다양한 돌연변이조차도 Morinaga 방법에 의해서 한번에 어떤 위치에라도 도입될 수 있다.

α-아밀라제-코드화 DNA 서열에 돌연변이를 도입하는 다른 방법은 Nelson 및 Long(1989)에 개시된다. 그것은 PCR 반응에서 하나의 프라이머로서 화학적으로 합성된 DNA 가닥을 사용함으로써 도입된 바람직한 돌연변이를 포함하는 PCR 단편의 3-단계 생산을 포함한다. PCR-생산 단편으로부터, 돌연변이를 운반하는 DNA 단편은 제한 엔도뉴클레아제로 절단 분리되어, 발현 플라스미드에 재삽입될 수 있다.

무작위 돌연변이유발

무작위 돌연변이유발은 관심대상으로 제시된 아미노산 서열로 번역되는 유전자의 적어도 3 부분 또는 전 유전자내에서 국부화 또는 영역-특이적 무작위 돌연변유발로 적절하게 수행된다.

모 α-아밀라제를 코드화하는 DNA 서열의 무작위 돌연변이유발은 당업계에 공지된 어떤 방법을 사용하여 용이하게 수행될 수 있다.

상기와 관련하여, 본 발명의 더 이상의 양태는 예를 들어, 변이체가 모체에 비하여 변형 또는 증가된 열안정성을 타나내는 모 α-아밀라제의 변이체를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 방법은:

(a) 모 α-아밀라제를 코드화하는 DNA 서열에 무작위 돌연변이유발을 일으키는 단계,

(b) 숙주세포에서 단계(a)에서 얻은 돌연변이화 DNA 서열을 발현하는 단계, 및

(c) 모 α-아밀라제에 비하여 변형된 성질(예를 들어, 열안정성)을 가지는 α-아밀라제를 발현하는 숙주 세포를 스크리닝하는 단계를 포함한다.

본 발명의 상기 단계 (a) 는 바람직하게는 도핑 프라이머를 사용하여 수행된다.

예를 들어, 무작위 돌연변이유발은 적당한 물리적 또는 화학적 돌연변이화제를 사용하거나, 적당한 올리고뉴클레오티드를 사용하거나, DNA 서열을 PCR 생성 돌연변이유발 과정에 놓음으로써 수행될 수 있다. 더욱이, 무작위 돌연변이유발은 이러한 돌연변이화제의 어떤 조합을 사용하여 수행될 수 있다. 돌연변이화제는 예를 들어, 트란지션, 트랜스버전, 인버전, 스크램블링, 결실 및/또는 삽입을 유발하는 어떤 것일 수 있다.

본 목적에 적합한 물리적 또는 화학적 돌연변이화제의 예는 자외선(UV) 조 사, 히드록실아민, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(MNNG), O-메틸 히드록실아민, 니트로산, 에틸 메탄 술포네이트(EMS), 소듐 바이술파이트, 포름산, 및 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 이러한 약제가 사용될 때, 돌연변이유발은 전형적으로 돌연변이유발이 발생하는 적당한 조건하에서 돌연변이약제의 선택으로 돌연변이화될 모 효소를 코드화하는 DNA 서열을 인큐베이션하고, 원하는 성질을 가지는 돌연변이화된 DNA 를 선택함으로써 수행된다.

돌연변이유발이 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행되는 경우에, 올리고뉴클레오티드는 변형될 위치에서 올리고뉴클레오티드의 합성동안 3 개의 비-모체 뉴클레오티드로 도핑되거나 스파이킹된다. 도핑 또는 스파이킹은 원하지 않는 아미노산을 피하기 위해서 코돈에 수행될 수 있다. 도핑 도는 스파이킹 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, PCR, LCR 또는 적절하다고 여겨지는 어떤 DNA 폴리머라제 및 리가제를 사용하여 어떤 공개된 기법에 의해서 α-아밀라제 효소를 코드화하는 DNA 에 결합될 수 있다.

바람직하게는, 도핑은 "항상 무작위 도핑"을 사용하여 수행되고, 여기에서 각 위치에서 야생형 및 돌연변이의 비율이 미리 한정된다. 더욱이, 도핑은 어떤 뉴클레오티드의 도입 선호에 특이적일 수 있고, 이에 의해서 하나 이상의 특정 아미노산 잔기의 도입이 선호된다. 도핑은 각 위치에서 예를 들어, 90 % 야생형 및 10 % 돌연변이의 도입을 허용하기 위해서 만들어질 수 있다. 도핑 계획의 선택에서 추가적인 고려는 유전자 뿐만 아니라 단백질-구조 압력에 기초한다. 도핑 계획은 그 자체로 정지 코돈의 도입의 예방을 보장하는 DOPE 프로그램을 사용하여 이루어질 수 있다.

PCR-발생 돌연변이유발이 사용되는 경우에, 모 α-아밀라제를 코드화하는 화학적 처리 또는 비-처리 유전자가 뉴클레오티드의 미스-결합을 증가시키는 조건하에서 PCR 에 놓인다(Deshler 1992; Leung et al., Technique, Vol.1, 1989, pp.11-15).

E.coli 의 돌연변이 유발인자 균주(Fowler et al., Molec. Gen. Genet.,133,1974,pp. 179-191), S.cereviseae 또는 어떤 다른 미생물은 예를 들어, 모 글리코실라제를 포함하는 플라스미드로 돌연변이 유발인자 균주를 형질전환시키고, 플라스미드를 가지는 돌연변이 유발인자 균주를 배양하고, 돌연변이 유발인자 균주로부터 돌연변이화 플라스미드를 분리함으로써 α-아밀라제를 코드화하는 DNA 의 무작위 돌연변이유발에 사용될 수 있다. 돌연변화 플라스미드는 연이어서, 발현 유기물을 형질전환시킬 수 있다.

돌연변이 대상이 되는 DNA 서열은 모 α-아밀라제를 발현하는 유기물로부터 제조된 게놈 또는 cDNA 라이브러리에 용이하게 존재할 수 있다. 택일적으로, DNA 서열은 플라스미드 또는 박테리오파지와 같은 적당한 벡터상에서 존재할 수 있고, 이것은 그 자체로 함께 인큐베이션되거나 그렇지 않으면, 돌연변이화제에 노출될 수 있다. 돌연변이대상이 되는 DNA 는 또한 상기 세포의 게놈에 삽입되거나 세포에 함유된 벡터상에 존재함으로써 숙주세포에 존재할 수 있다. 최종적으로, 돌연변이 대상이 되는 DNA 는 분리된 것 일 수 있다. 무작위 돌연변이 대상이 되는 DNA 서열은 바람직하게는 cDNA 또는 게놈 DNA 서열일 수 있다는 것이 이해될 것이다.

어떤 경우에, 발현 단계 b) 또는 스크리닝 단계 c)를 수행하기 전에 돌연변이화 DNA 서열을 증폭시키는 것이 편리할 수 있다. 이러한 증폭은 당업계에 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고, 현재에 DNA 또는 모 효소의 아미노산 서열에 기초하여 제조된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 PCR-발생 증폭이 바람직한 방법이다.

돌연변이화제와 함께 또는 이에 노출하여 인큐베이션한 다음에, 돌연변이화 DNA 는 유전자가 발현되는 조건하에서 DNA 서열을 운반하는 적당한 숙주 세포를 배양함으로써 발현된다. 본 목적에 사용된 숙주 세포는 선택적으로, 돌연변이유발 처리동안 모 효소를 코드화하는 DNA 서열을 운반하는 벡터상에 존재하는 돌연변이화 DNA 서열로 형질전환된 것일 수 있다. 적당한 숙주 세포의 예는: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis , Streptomyces lividans 또는 Streptomyces murinus 와 같은 그람 양성 박테리아; 및 E.coli 와 같은 그람-음성 박테리아이다.

돌연변이화 DNA 서열은 돌연변이화 DNA 서열의 발현을 허용하는 기능을 코드화하는 DNA 서열을 더 포함할 수 있다.

국부화 무작위 돌연변이유발

무작위 돌연변이유발은 문제의 모 α-아밀라제의 부분에 유리하게 국부화될 수 있다. 이것은 예를 들어, 효소의 어떤 영역이 효소의 허여된 성질에 특히 중요 한 것으로 확인되는 경우, 및 변형이 개선된 성질을 가지는 변이체를 유발하는 것으로 여겨지는 경우에 유리할 수 있다. 이러한 영역은 일반적으로 모 효소의 3 차원 구조가 도시되는 경우에 확인될 수 있고, 효소의 기능과 관련된다.

국부화, 또는 영역-특이적, 무작위 돌연변이유발은 상기에 개시된 PCR 발생 돌연변이유발 기법 또는 당업계에 공지된 다른 적당한 기법을 사용하여 용이하게 수행된다. 택일적으로, 변형될 DNA 서열의 일부분을 코드화하는 DNA 서열은 예를 들어, 적당한 벡터에의 삽입에 의해서 분리될 수 있고 이어서, 상기 부분은 상기에 개시된 어떤 돌연변이유발 방법을 사용하여 돌연변이유발에 놓일 수 있다.

α-아밀라제 변이체를 제공하는 대안적인 방법

본 발명의 변이체를 제공하는 대안적인 방법은 예를 들어, WO 95/22625 (Affymax Tcehnologies N.V.) 및 WO 96/00343 (Novo Nordisk A/S) 에 개시된 방법을 포함하여 당업계에 공지된 유전자-서플링 방법을 포함한다.

α 아밀라제 변이체의 발현

본 발명에 따라서, 상기에 개시된 방법, 또는 당업계에 공지된 어떤 대안적인 방법으로 생산된 변이체를 코드화하는 DNA 서열은 전형적으로 프로모터, 오퍼레이터, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 신호, 및 선택적으로, 억제 유전자 또는 다양한 액티베이터 유전자를 코드화하는 조절 서열을 포함하는 발현 벡터를 사용하여 효소 형태로 발현될 수 있다.

본 발명의 α-아밀라제 변이체를 코드화하는 DNA 서열을 운반하는 재조합 발현 벡터는 용이하게 재조합 DNA 과정에 놓일 수 있는 어떤 벡터일 수 있고, 벡터의 선택은 종종 도입될 숙주세포에 따라서 결정된다. 따라서, 벡터는 독립적으로 복제 가능한 벡터, 즉, 염색체외 전체로서 존재하는 벡터일 수 있고, 그것의 복제는 예를 들어, 플라스미드, 박테리오파지 또는 염색체외 요소, 미니염색체 또는 인공 염색체와 같이 염색체 복제에 독립적이다. 택일적으로, 벡터가 숙주 세포에 도입되는 경우에 숙주 세포 게놈에 삽입되어 통합된 염색체와 함께 복제될 수 있다.

벡터에서, DNA 서열은 적절한 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되어야만 한다. 프로모터는 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 어떤 DNA 서열일 수 있고, 숙주 세포와 상동 또는 비상동의 단백질을 코드화하는 유전자로부터 유도될 수 있다. 특히 숙주 박테리아 숙주에서 본 발명의 α-아밀라제 변이체를 코드화하는 DNA 서열의 전사를 지시적인 적당한 프로모터의 예는 E.coli 오페론의 lac 프로모터, Streptomyces coelicolor 아가로스 유전자 dagA 프로모터, Bacillus licheniformis α-아밀라제 유전자(amyL)의 프로모터, Bacillus stearthermophilus 말토스생성 아밀라제 유전자(amyM)의 프로모터, Bacillus amyloliquefaciens α-아밀라제(amyQ) 의 프로모터, Bacillus subtilis xylA 및 xylB 유전자등의 프로모터이다. 군류 숙주 전사의 경우에, 유용한 프로모터의 예는 A. orzae TAKA 아밀라제, Rhizomucor miehei 아스파르트산 프로테인아제, A.niger 중성 α-아밀라제, A.niger 산 안정성 α-아밀라제, A.niger 글루코아밀라제, Rhizomucor miehei 리파제, A.oryzae 알칼리 프로테아제, A.orzae 트리오스 포스페이트 이소머라제 또는 A.nidulans 아세타미다제를 코드화하는 유전자로부터 유도된 것이다.

본 발명의 발현 벡터는 또한 적당한 전사 종결자, 및 진핵생물에서 본 발명 의 α-아밀라제 변이체를 코드화하는 DNA 서열에 작동가능하게 연결된 폴리-아데닐화 서열을 포함한다. 종결서열 및 폴리아데닐화 서열은 프로모터와 같은 원으로부터 적절하게 유도될 수 있다.

벡터는 문제의 숙주 세포에서 벡터를 복제가능하게 하는 DNA 서열을 더 포함할 수 있다. 이러한 서열의 예는 플라스미드 pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 및 pIJ702 의 복제 기점이다.

벡터는 또한 예를 들어, B.subtilis 또는 B.licheniformis 로부터의 dal 유전자와 같은 숙주 세포의 결핍을 보충하는 유전자, 또는 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜 또는 테트라사이클린 내성과 같은 항생제 내성을 부여하는 선택 마커를 더 포함할 수 있다. 더욱이, 벡터는 히그로마이신 내성을 유발하는 amdS, argB, niaD 및 sC 와 같은 Aspergillus 선택 마터를 포함할 수 있거나, 선택은 예를 들어, WO 91/17243 에 개시된 것과 같은 공-형질전환으로 달성될 수 있다.

세포내 발현이 예를 들어, 숙주 세포로서 어떤 박테리아를 사용하는 경우와 같이 어떤 측면에서는 유리할 수 있지만, 발현은 세포외인 것이 일반적으로 바람직하다. 일반적으로, 본원에 언급된 Bacillus α-아밀라제는 발현된 프로테아제를 배지로 분비하도록 하는 예비-영역을 포함한다. 바람직한 경우에, 예비-영역은 서로 다른 예비 영역 또는 신호 서열로 대체될 수 있고, 각각의 예비영역을 코드화하는 DNA 서열의 치환에 의해 용이하게 달성될 수 있다.

각각 α-아밀라제 변이체, 프로모터, 터미네이터 및 다른 요소를 코드화하는 본 발명의 DNA 구조체 연결에 사용된 과정, 및 그것을 복제에 필요한 정보를 포함 하는 적당한 벡터에 삽입하는 과정은 당업자(참고로, 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 nd Ed.,Cold Spring Harbor, 1989)에게 공지된다.

상기에 개시된 본원의 DNA 구조체 또는 발현 벡터를 포함하는 본 발명의 세포는 본 발명의 α-아밀라제 변이체의 재조합 생산에서 숙주 세포로서 유리하게 사용된다. 세포는 숙주 염색체에 DNA 구조체(하나 이상의 카피로)를 통합시킴으로써 용이하게 변이체를 코드화하는 본 발명의 DNA 구조체로 형질전환될 수 있다. 통합은 일반적으로 DNA 서열이 세포에 더욱 안정하게 유지될때 유리한 것으로 여겨진다. DNA 구조체의 숙주 염색체로의 통합은 예를 들어, 상동성 또는 비상동성 재조합과 같은 종래의 방법에 따라 수행될 수 있다. 대안적으로, 세포는 숙주 세포의 다른 형태와 연관되어 상기에 개시된 발현 벡터로 형질전환될 수 있다.

본 발명의 세포는 포유동물 또는 곤충과 같은 고등 생물의 세포일 수 있으나, 바람직하게는 예를 들어, 박테리아 또는 균류(효모 포함)세포와 같은 미생물 세포이다.

적당한 박테리아의 예는 Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Baciillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Baciillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, 또는 Streptomyces lividans 또는 Streptomyces murinus 와 같은 그람-양성 벡테리아, 또는 E. coli 와 같은 그람 음성 박테리아이다. 벡테리아의 형질전환은 예를 들어, 원형질체 형질전환 또는 그자체로 공지된 방법으로 수용성 세포를 사용하여 수행될 수 있다.

효모 유기물은 예를 들어, Saccharomyces cerevisiae 와 같은 Saccharomyces 또는 Schizosaccharomyces 종으로부터 선택되는 것이 유리할 수 있다. 사상균은 예를 들어, Aspergillus orzae 또는 Aspergillus niger 과 같은 Aspergillus 종에 속하는 것이 유리할 수 있다. 균류 세포는 그 자체로 공지된 방법으로 원형질체 형성 및 원형질체의 형질전환 다음에 세포벽의 재생성을 포함하는 과정에 의해 형질전환될 수 있다. Asperillus 숙주 세포의 형질전환의 적당한 과정이 EP 238 023 에 개시된다.

더 나은 양태에서, 본 발명은 발명의 α-아밀라제 변이체를 생산하는 방법에 관한 것이고, 그 방법은 변이체의 생산에 기여하는 조건으로 상기에 개시된 숙주 세포를 배양하는 단계 및 세포 및/또는 배지로부터 변이체를 회수하는 단계를 포함한다.

세포 배양에 사용된 배지는 문제의 숙주 세포를 배양하고, 본 발명의 발현된 α-아밀라제 변이체를 얻기에 적합한 종래의 어떤 배지일 수 있다. 적당한 배지는 상업적 공급자로부터 이용가능하거나, 공개된 방법에 따라서 준비될 수 있다 (예를 들어, American Type Cluture Collection 의 카탈로그에 개시).

숙주 세포로부터 분비된 α-아밀라제 변이체는 원심분리 또는 여과에 의해서 세포를 배지로부터 세포를 분리하는 단계, 및 암모늄 설페이트와 같은 염 다음에, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피등과 같은 크로마토그래피 과정 의 사용에 의해서 배지의 단백질성 성분을 침전시키는 단계를 포함하는 주지된 방법으로 배지로부터 용이하게 회수될 수 있다.

핵산 서열

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 코드화하는 분리형 핵산 서열에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 핵산 서열은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 로 제시된다. 다른 더욱 바람직한 구체예에서, 핵산 서열은 각각 Escherichia coli DSM12761 및 Escherichia coli DSM12764 에 포함된 플라스미드 pLiH1274 또는 플라스미드 pTVB299 에 포함된 서열이다. 다른 바람직한 구체예에서, 핵산 서열은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 의 영역을 코드화하는 성숙한 폴리펩티드이다. 본 발명은 또한 유전자 코드의 축퇴성의 관점에서 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 와 다른 SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 각각, α-아밀라제 활성을 가지는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4 의 단편을 코드화하는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 의 서열에 관한 것이다.

SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 의 아서열은 5' 및/또는 3' 말단의 하나 이상의 뉴클레오티드가 결실되었다는 것을 제외하고는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 에 포함된 핵산 서열이다.

본 발명은 또한 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 의 서열을 코드화하는 성숙한 폴리펩티드의 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 핵산 서열에 관한 것이고, 여기에서 돌연변이체 핵산 서열은 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4 의 아미노 산 1 내지 485 로 구성되는 폴리펩티드를 코드화한다.

폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열을 분리 또는 클로닝하는데 사용되는 기법은 당업계에 공지되고, 게놈 DNA 로부터의 분리, cDNA 로부터의 준비, 또는 그것의 조합을 포함한다. 이러한 게놈 DNA 로부터 본 발명의 핵산 서열의 클로닝이 예를 들어, 주지의 폴리머라제 사슬 반응(PCR), 또는 구조적 특징을 공유하는 클론화 DNA 단편을 검출하기 위한 발현 라이브러리의 항체 스크리닝으로 수행될 수 있다. 예를 들어, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methdos and Application, Academic Press,New York 참조. 리가제 사슬 반응(LCR)과 같은 다른 핵산 증폭 과정, 연결된 활성화 전사(LAT) 및 핵산 서열-기초 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다. 핵산 서열은 Bacillus 균주, 또는 다른 관련 유기물로부터 클론될 수 있어서, 예를 들어, 핵산 서열 영역을 코드화하는 폴리펩티드의 대립 또는 종 변이체일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "분리형 핵산 서열"은 아가로스 전기영동으로 결정될 때, 예를 들어, 적어도 약 20 % 순도, 바람직하게는 적어도 약 40 % 순도, 더욱 바람직하게는 약 60 % 순도, 더욱 더 바람직하게는 약 80 % 순도, 가장 바람직하게는 약 90 % 순도로서, 필수적으로 다른 핵산 서열이 없는 핵산 서열을 말한다. 예를 들어, 분리형 핵산 서열은 재생산 될 다른 위치에서 그것의 천연 위치로부터의 핵산 서열을 재배치하는 유전적 설계에 사용된 표준 클로닝 과정으로 얻을 수 있다. 클로닝 과정은 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 바람직한 핵산 단편의 절단 및 분리, 단편의 벡터 분자에의 삽입, 및 다중 카피 또는 핵산 서열의 클론이 복제될 숙주 세포에 재조합 벡터의 통합을 포함할 수 있다. 핵산 서열은 게 놈, cDNA, RNA, 세미합성, 합성 기원, 또는 그것의 어떤 조합일 수 있다.

효소를 코드화하는 DNA 서열의 상동성

본 발명은 SEQ ID NO:1(즉, 뉴클레오티드 1 내지 1458) 또는 SEQ ID NO:3 (즉, 뉴클레오티드 1 내지 1458) 의 서열을 코드하는 성숙한 폴리펩티드와 활성 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 수준에서 적어도 약 96 %, 바람직하게는 적어도 약 97 %, 바람직하게는 적어도 약 98 %, 더욱 바람직하게는 적어도 약 99 % 의 상동성을 가지는 핵산 서열에 관한 것이다.

DNA 서열 상동성은 제 1 의 서열과 제 2 의 서열의 유도체를 나타내는 2 개의 서열사이의 상동성으로 결정될 수 있다. 상동성은 GCG 프로그램 패키지에서 제공된 GAP 와 같은 당업계에서 알려진 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정된다(상기 개시). 그러므로, GAP GCGv8 은 다음의 생략값을 사용할 수 있다: GAP생성패널티 5.0 및 GAP 확장패널티 0.3 생략스코어링 매트릭스 GAP는 배열을 만들기 위하여 Needleman/Wunsch/Sellers 방법을 사용한다.

본 발명의 폴리펩티드를 코드화하는 핵산서열은 폴리펩티드에 실질적으로 유사한 폴리펩티드의 합성에 필요할 수 있다. 용어 폴리펩티드에 "실질적으로 유사함"은 폴리펩티드의 비자연발생형을 말한다. 이러한 폴리펩티드는 그것의 천연원으로부터 폴리펩티드를 예를 들어 비활성도, 열안정성, pH최적등에서 다른 변이체와 같이 유전자 설계된 점에서 다를 수 있다. 변이체 서열은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3 그것의 아서열의 부분을 코드화하는 폴리펩티드로서 제공된 핵산서열을 기초로 핵산서열에 의해 코드화된 폴리펩티드의 다른 아미노산 서열을 유발하지 않 는 그러나 효소의 생성을 위한 숙주세포의 코드사용에 해당하는 뉴클레오티드 도입에 의해서, 또는 서로 다른 아미노산 서열을 유발할 수 있는 뉴클레오티드 치환의 도입에 의해서 제조될 수 있다.

이러한 치환이 분자의 기능에 중요한 부분외에서 만들어 질 수 있고, 활성폴리펩티드를 초래할 수 있다는 것이 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명의 분리된 핵산코드에 의해서 코드화된 폴리펩티드의 활성에 중요한, 따라서 치환이 바람직하지 않은 아미노산잔기는 부위특이적 돌연변이 유발 또는 알라닌스캐닝 돌연변이 유발과 같은 당업계에 알려진 방법에 따라 확인될 수 있다(예를 들어, Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). 다음 기법으로 돌연변이는 분자의 모든 양으로 하전된 잔기에 도입되고 결과적인 돌연변이 분자는 분자의 활성에 중요한 아미노산잔기를 확인하기 위해 효소활성을 시험한다. 기질-효소 상호작용부위는 핵산마그네티공명분석법, 크리스탈로그래피 또는 포토어피니티 라벨링에 의해서 결정된 3차원 구조의 분석으로 결정될 수 있다(예를 들면, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64).

본 발명은 또한 중간 긴축조건, 바람직하게는 중간-이상 긴축조건, 더욱 바람직하게는 고 긴축조건, 및 가장 바람직하게는 매우 높은 긴축조건하에서 혼성화하는 본 발명의 폴리펩티드를 코드화하는 분리형 핵산 서열과 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 3 또는 그것의 상보 서열; 또는 대립변이체 및 그것의 아서열과 같은 조건하에서 혼성화하는 핵산 서열에 관한 것이다(Sambrook et al., 1989, supra).

본 발명은 또한 중간 긴축 조건, 바람직하게는 중간-이상 긴축 조건, 더욱 바람직하게는 고 긴축 조건, 및 가장 바람직하게는 매우 고 긴축 조건하에서 상기에 개시된 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 또는 그것의 상보적인 가닥; 또는 대립 변이체 및 그것의 아서열과 같은 조건으로 혼성화하는 핵산 프로브와 혼성화하는 본 발명의 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열에 관한 것이다.

본 발명은 (a) 중간, 중간-이상, 고, 또는 매우 고긴축 조건하에서 DNA 를 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3, 또는 그들의 상보적인 가닥, 또는 그것의 아서열과 혼성화하는 단계; 및 (b) 핵산서열을 분리하는 단계에 의해 생산된 분리된 핵산 서열에 관한 것이다. 아서열은 바람직하게는 알파-아밀라제 활성을 가지는 폴리펩티드 단편을 코드화하는 서열과 같은 적어도 100 뉴클레오티드의 서열이다.

돌연변이체 핵산 서열을 생산하는 방법

본 발명은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 의 서열 또는 그것의 서열을 코드하는 성숙한 폴리펩티드에 적어도 하나의 돌연변이의 도입을 포함하는 돌연변이체 핵산 서열을 생산하는 방법에 관한 것으로, 돌연변이체 핵산 서열은 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4 의 1 내지 485 또는 α-아밀라제 활성을 가지는 그것의 단편으로 구성되는 폴리펩티드를 코드화한다.

1 개의 뉴클레오티드를 다른 뉴클레오티드로 교환하는 핵산 서열에 돌연변이의 도입은 당업계에 공지된 어떤 방법을 사용하여 부위-특이적 돌연변이유발로 달성될 수 있다. 특히 유용한 과정은 관심의 삽입체 및 2 개의 합성 프라이머를 가진 원하는 돌연변이를 포함하는 초나선형, 이중 가닥 DNA 벡터를 이용하는 것이다. 벡 터의 반대 가닥에 각각 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머는 Pfu DNA 폴리머라제에 의해서 온도 순환동안 확장된다. 프라이머의 통합에 기초하여, 어긋난 닉을 함유하는 돌연변이화 플라스미드가 생성된다. 온도 순환다음에, 산물을 메틸화 및 헤미메틸화 DNA 에 특이적인 DpnI 로 처리하여 모 DNA 주형을 분해하고 돌연변이 함유 합성 DNA 를 선택한다. 당업계에 공지된 다른 과정이 또한 사용될 수 있다. 이러한 다른 과정은 예를 들어, WO 95/22625(Affymax Technologies N.V.) 및 WO 96/00343(Novo Nordisk A/S)에 개시된 유전자 셔플링을 포함한다.

핵산 구조체

본 발명은 조절 서열과 양립가능한 조건하에서 적당한 숙주 세포에서 코드 서열의 발현을 지시하는 하나 이상의 조절 서열과 작동가능하게 연결된 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 핵산 구조체에 관한 것이다. 발현은 전사, 전사후 변형, 번역, 번역후 변형, 및 분비를 제한없이 포함하는 폴리펩티드의 생산에 포함된 어떤 단계를 포함하는 것으로 이해될 것이다.

본원에서 "핵산 구조체"는 자연 발생 유전자로부터 분리되거나, 변형되어 천연상태에서 다른 상태로는 존재하지 않는 방식으로 결합 및 병렬배열된 핵산의 단편을 포함하는 단일- 또는 이중-가닥의 핵산 분자로 정의된다. 용어 핵산 구조체는 핵산 구조체가 본 발명의 코드 서열의 발현에 요구되는 모든 조절 서열을 포함하는 경우에 용어 발현 카세트와 동의어이다. 본원에서 용어 "코드 서열"은 그것의 단백질 산물의 아미노산 서열을 직접 특정하는 핵산 서열의 부분으로 정의된다. 코드 서열의 경계는 일반적으로 mRNA 의 5'말단의 오픈 리딩 프레임의 바로 업스트림에 위치한 리보솜 결합 부위(원핵생물) 또는 ATG 개시 코돈(진핵생물) 및 mRNA 의 3'말단의 오픈 리딩 프레임의 바로 다운스트림에 위치한 전사 터미네이터 서열로 결정된다. 코드 서열은 DNA, cDNA, 및 재조합 핵산 서열을 제한없이 포함할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 코드화하는 분리된 핵산 서열이 다양한 방법으로 유전적 조작되어 폴리펩티드의 발현을 제공한다. 벡터에 핵산 서열의 삽입전에 그것의 조작은 발현벡터에 의존하는 것이 바람직하거나 요구될 수 있다. 재조합 DNA 방법을 이용하는 핵산 서열을 변형하는 기법은 당업계에 공지된다.

용어 "조절 서열"은 본 발명의 폴리펩티드의 발현에 필요하거나 유리한 모든 성분을 포함하는 것으로 정의된다. 각 조절 서열은 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열에 천연 또는 외인성일 수 있다. 이러한 조절 서열은 리더, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터, 신호 펩티드 서열, 및 전사 터미네이터를 제한없이 포함한다. 최소한, 조절 서열은 프로모터, 및 전사 및 번역 종결 신호를 포함한다. 조절 서열은 조절 서열과 폴리펩티드 코드화 핵산 서열의 코드 영역의 연결을 용이하게 하는 특이적인 제한 부위 도입을 위해 링커와 함께 제공될 수 있다. 용어 "작동가능한 연결"은 본원에서, 조절 서열이 DNA 서열의 코드 서열에 관하여 적당한 위치에 놓여서, 조절 서열이 폴리펩티드의 발현을 지시도록 하는 배치로 정의된다.

프로모터 서열

조절 서열은 핵산 서열의 발현을 위해 숙주 세포에 의해 인식되는 적당한 프로모터 서열, 즉 핵산 서열일 수 있다. 프로모터 서열은 폴리펩티드의 발현을 매개 하는 전사 조절 서열을 포함한다. 프로모터는 돌연변이체, 절단형, 및 하이브리드 프로모터를 포함하는 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 어떤 핵산 서열일 수 있고, 숙주 세포와 상동 또는 비상동인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 코드하는 유전자로부터 얻을 수 있다.

특히 박테리아 숙주 세포에서 본 발명의 핵산 구조체의 전사를 지시하는 적당한 프로모터의 예는 E. coli lac 오페론, Streptomyces coelicolor 아가로스 유전자(dagA), Bacillus subtilis 레반수크라제 유전자(sacB), Bacillus licheniformis α-아밀라제 유전자 (amyL), Bacillus stearothermophilus 말토스성 아밀라제 유전자(amyM), Bacillus amyloliquefaciens α-아밀라제 유전자 (amyQ), Bacillus licheniformis 페니실리나제 유전자(penP), Bacillus subtilis xylA 및 xylB 유전자, 및 원핵생물 β-락타마제 유전자 (Villa Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731)로부터 얻은 프로모터뿐만 아니라 tac 프로모터(DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25)이다. 더이상의 프로모터가 Scientific American, 1980,242: 74-94; 및 Sambrook et al., 1989, 상기참조의 "재조합 박테리아로부터의 유용한 단백질" 에 개시된다.

터미네이터 서열

조절서열은 또한 전사를 종결하도록 숙주세포에 의해 인식되는 적당한 전사 터미네이터 서열일 수 있다. 터미네이터 서열은 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열의 3' 말단에 작동가능하게 연결된다. 선택된 숙주세포에서 기능하는 어떤 터미 네이터가 본 발명에 사용될 수 있다.

신호 펩티드

조절 서열은 폴리펩티드의 아미노 말단에 연결된 아미노산을 코드하는 신호펩티드-코드 영역일 수 있고, 코드화 폴리펩티드를 세포의 분비 경로로 지시한다. 핵산 서열의 코드 서열의 5' 말단은 분비 폴리펩티드를 코드화하는 코드 서열의 절편을 가진 번역 리딩 프레임에 본래 연결된 신호 펩티드-코드 영역을 내재적으로 함유할 수 있다. 택일적으로, 코드 서열의 5' 말단은 외래의 코드 서열인 신호 펩티드-코드 영역을 포함할 수 있다. 외래의 신호 펩티드-코드 영역은 코드 서열이 본래 신호 펩티드-코드 영역을 함유하지 않는 경우에 요구된다. 택일적으로, 폴리펩티드의 분비를 향상시키기 위해서 외래의 신호 펩티드-코드 영역이 천연 신호 펩티드-코드 영역을 대체할 수 있다. 그러나, 발현된 폴리펩티드를 선택된 숙주 세포의 분비 경로로 지시하는 어떤 신호 펩티드-코드 영역도 본 발명에 사용될 수 있다.

박테리아 숙주 세포용 영역을 코드하는 효과적인 신호 펩티드는 Bacillus NCIB 11837 말토스성 아밀라제, Bacillus stearothermophilus α-아밀라제, Bacillus licheniformis 서브틸리신, Bacillus licheniformis β-락타마제, Bacillus stearothermophilus 중성 프로테아제 (nprT, nprS, nprM), 및 Bacillus subtils prsA 이다. 또다른 신호 펩티드가 Simonen 및 Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109137 에 개시된다.

조절 시스템

숙주 세포의 배양과 관련하여 폴리펩티드의 발현 조절을 허용하는 조절 서열을 첨가하는 것이 바람직할 수 있다. 조절 시스템의 예는 조절 화합물의 존재를 포함하여 화학제 또는 물리적 자극에 반응하여 유전자의 발현의 개시 또는 종결을 유발하는 것이다. 원핵생물 시스템에서 조절 시스템은 lac, tac, 및 trp 오퍼레이터 시스템을 포함한다. 효모에서, ADH2 시스템 또는 GAL1 시스템이 사용될 수 있다. 사상균에서, TAKA α-아밀라제 프로모터, Aspergillus niger 글루코아밀라제 프로모터, 및 Aspergillus orzae 글루코아밀라제 프로모터가 조절 서열로서 사용될 수 있다. 조절 서열의 다른 예는 유전자 증폭을 허용하는 것이다. 진핵생물 시스템에서, 이것은 메토트렉세이트의 존재하에서 증폭되는 디히드로폴레이트 환원제 유전자, 및 중금속으로 증폭되는 메탈로티오나인 유전자를 포함한다. 이러한 경우에, 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열은 조절 서열에 작동가능하게 연결될 것이다.

발현 벡터

본 발명은 또한 본 발명의 핵산 서열, 프로모터, 및 전사 및 번역 종결 신호를 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 상기에 개시된 다양한 핵산 및 조절 서열은 함께 연결되어서 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열의 삽입 또는 치환을 허용하는 하나 이상의 유용한 제한 부위를 포함할 수 있는 재조합 발현 벡터를 생산한다. 택일적으로 본 발명의 핵산 서열은 핵산 또는 서열을 포함하는 핵산 구조체를 발현용의 적당한 벡터에 삽입함으로써 발현될 수 있다. 발현 벡터의 제조에서, 코드 서열은 벡터에 위치하여 코드 서열이 발현을 위한 적당한 조절 서열과 작동가능하게 연결되도록 한다.

재조합 발현 벡터는 재조합 DNA 과정에 용이하게 놓일 수 있는 어떤 벡터(예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스)일 수 있고, 핵산 서열의 발현을 유발할 수 있다. 선택 벡터는 전형적으로 벡터가 도입될 숙주 세포와 벡터의 양립가능성에 의존한다. 벡터는 선형 또는 폐쇄 원형 플라스미드일 수 있다.

벡터는 독립적으로 복제가능한 벡터, 즉, 염색체외 전체로서 존재하는 벡터일 수 있고, 그것의 복제는 염색체 복제에 독립적인 예를 들어, 플라스미드, 염색체외 요소, 미니염색체, 또는 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 자가-복제를 확보하는 수단을 포함할 수 있다. 택일적으로, 벡터는 숙주 세포에 도입되는 경우에 게놈에 통합되어 통합된 염색체와 함께 복제될 수 있다. 더욱이, 숙주 세포의 게놈에 도입될 총 DNA 를 함께 포함하는 단일 벡터 또는 플라스미드 또는 2 이상의 벡터 또는 플라스미드, 또는 트랜스포죤이 사용될 수 있다.

본 발명의 벡터는 바람직하게는 형질전환된 세포의 용이한 선택을 허용하는 하나 이상의 선택가능한 마커를 포함한다. 선택 마커는 살충제 또는 바이러스 내성, 중금속 내성, 프로토트로피 내지 보조영양제등을 제공하는 산물의 유전자이다.

박테리아 선택 마커의 예는 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜 또는 테트라사이클린 내성과 같은 항생제 내성을 부여하는 Bacillus subtils 또는 Bacillus licheniformis 또는 마커로부터의 dal 유전자이다. 효모 숙주 세포용 적당한 마커는 ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, 및 URA3 이다. 사상균에 사용하기 위한 선택마커는 amdS(아세타미다제), argB (오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제 ), bar(포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제), hygB(히그로마이신 포스포트랜스퍼라제), niaD (니트레이트 환원제), pyrG (오로티딘-5'-포스페이트 디카르복실라제 ), sC (술페이트 아데닐트랜스퍼라제), trpC (안트라닐레이트 합성효소)뿐만 아니라 그것의 등가물을 제한없이 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. Aspergillus 세포에의 사용에 바람직한 것은 Aspergillus nidulans 또는 Aspergillus oryzae 의 amdS 및 pyrG 유전자 및 Streptomyces hygroscopicus 의 bar 유전자이다.

본 발명의 벡터는 바람직하게는 숙주 세포 게놈에 벡터의 적당한 통합 또는 세포의 게놈에 독립적으로 세포에서 벡터의 독립적인 복제를 허용하는 요소를 포함한다.

숙주 세포 게놈에의 통합을 위해서, 벡터는 폴리펩티드 또는 상동 또는 비상동 재조합에 의해서 게놈내에 벡터의 적당한 통합을 위한 벡터의 어떤 다른 요소를 코드화하는 핵산 서열에 의존할 수 있다. 택일적으로, 벡터는 숙주 세포의 게놈에 상동 재조합에 의해서 통합을 지시하는 추가적인 핵산 서열을 포함할 수 있다. 추가적인 핵산 서열은 벡터가 염색체의 정확한 위치에서 숙주 세포 게놈에 통합되도록 한다. 정확한 위치에서 통합의 가능성을 증대시키기 위해서, 통합가능한 요소는바람직하게는 상동 재조합의 가능성을 향상시킬 수 있는 해당하는 표적 서열과 매우 상동성인 100 내지 1,500 염기쌍, 바람직하게는 400 내지 1,500 염기쌍, 및 가장 바람직하게는 800 내지 1,500 염기쌍의 충분히 많은 핵산을 포함해야만한다. 통합가능한 요소는 숙주 세포의 게놈에서 표적 서열과 상동적인 어떤 서열일 수 있다. 더욱이, 통합가능한 요소는 비-코드화 또는 코드화 핵산 서열일 수 있다. 한편, 벡터는 비-상동 재조합에 의해 숙주세포의 게놈에 통합될 수 있다.

독립적인 복제의 경우에, 벡터는 벡터가 문제의 숙주 세포에서 독립적으로 복제가능케 하는 복제 기점을 더 포함할 수 있다. 박테리아 복제기점의 예는 E.coli, 및 pUB110, pE184, pTA1060 에서 복제가 가능한 플라스미드 pBR322, pUC19, pACY177, 및 pACYC184 , 및 Bacillus 에서 복제가 가능한 pAMβ1 의 복제 기점이다. 효모 세포에서 사용하기 위한 복제기점의 예는 2 마이크론 복제 기점, ARS1, ATS4, ARS1 및 CEN3 의 재조합, 및 ARS4 및 CEN6 의 조합이다. 복제 기점은 숙주 세포에서 기능을 온도-감각적으로 만드는 돌연변이를 가지는 것일 수 있다(예를 들어, Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Science USA 75:1433).

본 발명의 핵산 서열의 하나 이상의 카피는 숙주 세포에 삽입되어서 유전자 산물의 생산을 증가시킬 수 있다. 핵산 서열의 카피 수의 증가는 숙주 세포 게놈에 적어도 하나의 추가적인 카피 서열을 통합시키거나 선택 마커 유전자의 증폭된 카피를 포함하는 세포에서 핵산 서열과 함께 증폭가능한 선택 마터 유전자를 포함함으로써 얻어질 수 있고, 이에 의해서 핵산 서열의 추가적인 카피는 적당한 선택약제의 존재에서 세포를 배양함으로써 선택될 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터를 제조하기 위해서 상기에 개시된 요소 연결에 사용된 과정은 당업자에게 공지이다(예를 들어, Sambrook et al., 1989, 상기참조).

숙주 세포

본 발명은 유리하게 폴리펩티드의 재조합 생산에 사용된 본 발명의 핵산 서 열을 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 벡터는 숙주 세포에 도입되어 벡터는 염색체 통합체 또는 상기에 개시된 자가-복제하는 염색체외 벡터로서 유지된다. 용어 "숙주 세포"는 복제동안 발생하는 어떤 돌연변이 때문에 모 세포에 동일하지 않은 모 세포의 어떤 자손을 포함한다. 숙주 세포의 선택은 폴리펩티드 및 그것의 원을 코드하는 유전자에 상당히 의존할 것이다.

숙주 세포는 예를 들어, 원핵생물과 같은 단세포 미생물, 또는 예를 들어, 진핵생물과 같은 비-단세포 미생물일 수 있다.

유용한 단일세포는 Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtils, 및 Bacillus thuringiensis 와 같은 Bacillus 세포; 또는 예를 들어, Streptomyces lividans 또는 Streptomyces murinus 와 같은 Streptomyces 세포, 또는 E. coli 및 Pseudomonas sp. 와 같은 그람 음성 박테리아를 제한없이 포함한다. 바람직한 구체예에서, 박테리아 숙주 세포는 Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus 또는 Bacillus subtilis 세포이다. 다른 바람직한 구체예에서, Bacillus 세포는 알칼리친화성 Bacillus 이다.

박테리아 숙주 세포에 벡터의 도입은 예를 들어, 수용성 세포(예를 들어, Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, 또는 Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221 참조), 일렉트로포레이션 (예를 들어, Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751참조), 또는 컨쥬게이션 (예를 들어, Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278 참조)을 사용하여 원형질체 형질전환(예를 들어, Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115 참조)에 의해서 수행될 수 있다.

생산 방법

본 발명은 또한 (a) 폴리펩티드를 생산할 수 있는 야생형 균주를 배양하여 폴리펩티드를 포함하는 상청액을 얻는 단계; 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 균주는 속 Bacillus sp 이다.

본 발명은 또한 (a) 폴리펩티드 생산에 기여하는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (a) 폴리펩티드 생산에 기여하는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계(여기에서, 숙주 세포는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:3 의 성숙한 폴리펩티드 코드 영역내에 적어도 하나의 돌연변이를 가지는 돌연변이체 핵산 서열을 포함하고, 돌연변이체 핵산 서열은 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4 의 아미노산 1 내지 485 로 구성되는 폴리펩티드를 코드화한다.), 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 방법에 관한 것이다.

조성물

더 나은 양태에서, 본 발명은 α-아밀라제 또는 그것의 변이체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 조성물은 본 발명의 α-아밀라제 또는 그것의 변이체로 강화된다. 본원에서, 용어, "강화"는 예를 들어, 강화 인자 1.1 로 조성물의 α-아밀라제 활성이 증가된 것을 나타낸다.

조성물은 예를 들어, 단일-성분 조성물과 같은 주 효소 성분으로 본 발명의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 택일적으로, 조성물은 아미노펩티다제, 아밀라제, 카르보히드라제, 카르복시펩티다제, 카탈라제, 셀룰라제, 키티나제, 큐티나제, 시클로덱스트린 글리코실트랜스퍼라제, 데옥시리보뉴클레아제, 에스테르아제, α-갈락토시다제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, α-글루코시다제, β-글루코시다제, 할로퍼옥시다제, 인버타제, 락카제, 리파제, 만노시다제, 옥시다제, 펙틴분해 효소, 펩티도글루타미나제, 퍼옥시다제, 피타제, 폴리페놀옥시다제, 단백질분해 효소, 리보뉴클레아제, 트랜스글루타미나제, 또는 크실라나제와 같은 다중 효소 활성을 포함할 수 있다. 추가적인 효소는 속 Aspergillus, 바람직하게는 Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus niger, 또는 Aspergillus orzae, 또는 Trichoderma, Humicola, 바람직하게는 Humicola insolens, 또는 Fusarium, 바람직하게는 Fusarium bactridiodes, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium toruloseum, Fusarium trichthecioides, 또는 Fusarium veneatum 에 속하는 미생물에 의해서 생산될 수 있다.

폴리펩티드 조성물은 당업계에 공지된 방법에 따라서 제조될 수 있고, 액체 또는 건조 조성물 형태일 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 조성물은 과립 또는 미세-과립일 수 있다. 조성물에 포함되는 폴리펩티드는 당업계에 공지된 방법에 따라서 안정화될 수 있다.

실시예는 본 발명의 폴리펩티드 조성물의 바람직한 사용 하기에 제시된다. 본 발명의 폴리펩티드 조성물의 투여량 및 조성물이 사용되는 다른 조건은 당업계에 공지된 방법에 기초하여 결정될 수 있다.

산업상 이용분야

알칼리 pH 값에서의 α-아밀라제의 활성때문에, 본 발명의 α-아밀라제는 다양한 공업상 공정에의 이용에 적합하고, 특히 효소는 예를 들어, 세탁, 식기세척 및 경표면 클린징 세제 조성물과 같은 세제 성분의 성분으로서 잠재적인 이용가능성을 가질 뿐만 아니라 직물, 섬유 및 의복의 풀빼기, 맥주 제조 또는 양조, 펄프 및 페이퍼 제조, 및 전분 또는 전 곡물로부터 연료, 드링킹 및 산업상 에탄올과 같은 감미료 및 에탄올의 제조에도 유용할 수 있다.

전분 전환

액화 및 당화 과정과 같은 종래의 전분-전환 과정은 예를 들어, US 특허번호 3,912,590 및 EP 특허공개번호 252,730 및 63,909 에 개시되고 본원에 참고문헌으로 수록된다.

펄프 및 종이 제조

본 발명의 알칼리 α-아밀라제는 전분 강화 폐기 종이 및 카드보드로부터 특히, 7 이상의 pH 에서 재-펄핑이 발생하는 경우 및 아밀라제가 강화 전분의 분해를 통해서 폐기 재료의 분해를 촉매하는 경우에 펄프, 종이 및 카드보드와 같은 리그노셀룰로스 재료의 제조에 사용될 수 있다. 본 발명의 α-아밀라제는 전분-코팅 프린트화-종이로부터 종이제조 펄프를 생산하는 방법에 특히 유용하다. 과정은 다음의 단계:

a) 페이퍼를 펄프로 분해하는 단계,

b) 단계 a) 전, 그 동안 또는 그 후에 전분-분해 효소로 처리하는 단계, 및

c) 단계 a) 및 b) 후에 펄프로부터 잉크 입자를 분리하는 단계를 포함하여 WO 95/14807 에 개시된대로 수행될 수 있다.

본 발명의 α-아밀라제는 효소적으로 분해된 전분이 탄산칼슘, 카오린 및 클레이와 같은 알칼리 충전재와 함께 종이제조에 사용되는 경우에 있어서 전분 변형에 매우 유용할 수 있다. 본 발명의 알칼리 α-아밀라제와 함께, 충전재의 존재하에서 전분을 변형시킴으로써 더욱 간단한 통합 과정을 허용하게 될 것이다.

직물, 섬유 및 의복의 풀빼기

본 발명의 α-아밀라제는 직물, 섬유 및 의복 풀빼기에 매우 유용하다. 직물 프로세싱 산업에서, α-아밀라제는 종래에 풀빼기 공정에서 보조제로서 사용되어 전분-함유 풀의 제거를 용이하게 하고, 이것은 제직동안에 직물 얀상의 보호 코팅으로 작용한다. 제직후에 풀 코팅의 완전한 제거가 직물이 정련, 표백 및 염색되는 일련의 과정에서 최적의 상태를 보장하는 데 중요하다. 효소적 전분 분해는 직물 재료상에 어떤 해로운 효과를 포함하지 않기 때문에 바람직하다. 공정 비용을 감소시키고 제제 산출량을 증가시키기 위해서, 풀빼기 공정은 때때로 정련 및 표백 단계와 결합된다. 이러한 경우에, 종래의 α-아밀라제가 높은 pH 수준 및 표백제와 양립할 수 없기 때문에 알칼리 또는 산화제와 같은 비 효소 보조제가 전분을 분해하기 위해서 일반적으로 사용된다. 전분 풀의 비효소적 분해는 다소 공격적인 화학제가 사용되기 때문에 어떤 직물의 손상을 초래한다. 따라서, 알칼리 용액에서 개선된 성능을 가지는 경우에 본 발명의 α-아밀라제를 사용하는 것이 바람직할 것이다. 셀룰라제-함유 섬유 또는 직물의 풀빼기의 경우에 α-아밀라제가 단독으로 또는 셀룰라제와 양립하여 사용될 수 있다.

풀빼기 및 표백 과정은 당업계에 공지된다. 예를 들어, 참고문헌으로 본원에 수록된 WO 95/21247, US 특허 4,643,763, EP 119,920 에 개시된 과정과 같다.

풀빼기 제품으로 상업적으로 이용가능한 것은 Novo Nordisk A/S 로부터 Aquazyme

및 Aquazyme

Ultra 를 포함한다.

맥주 제조

본 발명의 α-아밀라제는 맥주 제조 과정에 매우 유용할 수 있다; α-아밀라제는 전형적으로 매싱 과정동안 첨가될 것이다.

세제 조성물

본 발명의 효소가 첨가되어 세제 조성물의 성분이 될 수 있다.

본 발명의 세제 조성물은 예를 들어, 얼룩진 직물의 선처리에 적합한 세탁 부가 조성물 및 린스 첨가 직물 연화 조성물을 포함하는 손세탁 또는 기계 세탁 세 제 조성물로서 조제되거나, 일반적인 가전제품 경표면 클린징 제품에 사용하기 위한 세제 조성물로서 조제되거나, 수동 또는 기계식 식기세척 제품에 대한 조성물로조제될 수 있다.

특정 양태에서, 본 발명은 본 발명의 효소를 포함하는 세제 첨가제를 제공한다. 세제 첨가제 뿐만 아니라 세제 조성물은 프로테아제, 리파제, 큐티나제, 아밀라제, 카르보히드라제, 셀룰라제, 펙티나제, 만나나제, 아라비나제, 갈락타나제, 크실라나제, 예를 들어, 락카제, 및/또는 과산화효소와 같은 산화효소와 같은 하나 이상의 다른 효소를 포함할 수 있다.

선택된 효소의 일반적인 성질은 선택된 세제와 양립가능해야만 하고(즉, pH 최적, 다른 효소 및 비효소 성분과의 양립가능성등), 효소는 유효량으로 존재해야만 한다.

프로테아제: 적당한 프로테아제는 동물, 식물 또는 미생물원의 프로테아제를 포함한다. 미생물원이 바람직하다. 화학적으로 변형 또는 단백질 유전적 변형 돌연변이체가 포함된다. 프로테아제는 세린 프로테아제 또는 메탈로 프로테아제, 바람직하게는 알칼리 미생물 프로테아제 또는 트립신-유사 프로테아제일 수 있다. 알칼리 프로테아제의 예는 subtilisins, 특히 예를 들어, subtilisin Novo, subtilisin Carlsberg, subtilisin 309, subtilisin 147 및 subtilisin 168 (WO 89/06279 에 개시)과 같은 Bacillus 로부터 유도된 것이다. 트립신-유사 프로테아제의 예는 WO 89/06270 및 WO 94/25583 에 개시된 트립신(예를 들어, 돼지 또는 소 기원) 및 퓨사리움 프로테아제이다.

유용한 프로테아제의 예는 WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116, 및 WO 98/34946 에 개시된 변이체, 특히 하기의 위치의 하나 이상에서 치환을 가지는 변이체이다: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 및 274.

바람직한 상업적으로 구입가능한 프로테아제 효소는 Alcalase

, Savinase

;, Primase

; Duralase

; Esperase

; 및 Kannase

(Novo Nordisk A/S), Maxatase

, Maxacal, Maxapem

, Properase

, Purafect

, Purafect OxP

, FN2

, 및 FN3

(Genencor International Inc.)이다.

리파제: 적당한 리파제는 박테리아 또는 균류원의 리파제를 포함한다. 화학적으로 변형되거나 단백질 유전적 변형 돌연변이체가 포함된다. 유용한 리파제의 예는 EP 258 068 및 EP 305 216 에 개시된 H. lanuginosa (T. lanuginosus) 기원과 같은 Humicola (synonym Thermomyces)의 리파제, 예를 들어, P. alcaligenes 또는 P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 376), P. stutzeri (GB 1,372,034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. 균주 SD 705 (WO 95/06720 및 WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012)와 같은 슈도모나스 리파제, 예를 들어, B. subtilis (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131,253-360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) 또는 B. pumilus (WO 91/16422)와 같은 Bacillus 리파제를 포함한다.

다른 예는 WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 및 WO 97/07202 에 개시된 것과 같은 리파제 변이체이다.

바람직한 상업적 구입가능한 리파제 효소는 Lipolase^TM 및 Lipolase Ultra^TM (Novo Nordisk A/S)이다.

아밀라제: 적당한 아밀라제(α 및/또는 β)는 박테리아 또는 균류 기원의 것을 포함한다. 화학적으로 변형 또는 단백질 유전자 변형 돌연변이체가 포함된다. 아밀라제는 예를 들어, GB 1,296,839 에 더욱 상세히 개시된 구체적인 균주 B. licheniformis 와 같은 Bacillus 로부터 얻은 α-아밀라제를 포함한다. 유용한 α-아밀라제의 실시예는 WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873, and WO 97/43424 에 개시된 변이체이고, 특히 하기 위치의 하나 이상에서 치환된 변이체이다: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408, 및 444.

상업적으로 구입가능한 아밀라제는 Duramyl^TM, Termamyl^TM , Fungamyl^TM 및 BAN^TM (Novo Nordisk A/S), Rapidase^TM 및 Purastar^TM (Genencor International Inc.)이다.

셀룰라제: 적당한 셀룰라제는 박테리아 또는 균류 기원의 셀룰라제을 포함한다. 상업적으로 변형 또는 단백질 유전자 변형된 돌연변이체가 포함된다. 적당한 셀룰라제는 예를 들어, US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 및 WO 89/09259 에 개시된 humicola insolens, Myceliophthora thermophila 및 Fusarium oxysporum 으로부터 생산된 균류 셀룰라제와 같이 속 Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium 를 포함한다.

특히 적당한 셀룰라제는 색상 보호 잇점을 가지는 알칼리 또는 중성 셀룰라제이다. 이러한 셀룰라제의 예는 EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940 에 개시된다. 다른 예는 WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 및 PCT/DK98/00299 에 개시된 것과 같은 셀룰라제 변이체이다.

상업적으로 이용가능한 셀룰라제는 Celluzyme

;및 Carezyme

(Novo Nordisk A/S), Clazinase

, 및 Puradax HA

(Genencor International Inc.), 및 KAC-500 (B) (Kao Corporation)을 포함한다.

과산화효소/산화효소: 적당한 과산화효소/산화효소는 식물, 박테리아 또는 균류 기원의 것을 포함한다. 화학적으로 변형 또는 단백질 유전자 변형 돌연변이체가 포함된다. 유용한 과산화효소의 예는 예를 들어, C.cinereus 기원과 같은 Coprinus 의 과산화효소, 및 WO 93/24618, WO 95/10602, 및 WO 98/15257 에 개시된 것과 같은 그것의 변이체를 포함한다.

상업적으로 이용가능한 과산화효소는 Guardzyme

(Novo Nordisk A/S)를 포함한다.

세제 효소는 하나 이상의 효소를 포함하는 별도의 첨가제를 첨가하거나 모든 이러한 효소를 포함하는 조합된 첨가제를 첨가함으로써 세제 조성물에 포함될 수 있다. 본 발명의 세제 첨가제, 즉, 각각의 첨가제 또는 조합된 첨가제는 예를 들어, 과립형, 액체, 슬러리등으로 조제될 수 있다. 바람직한 세제 첨가 조성물은 과립형, 특히 비-더스팅 과립형, 액체, 특히 안정화 액체, 또는 슬러리이다.

비-더스팅 과립은 예를 들어, US 4,106,991 및 4,661,452 에 개시된대로 생산될 수 있고, 선택적으로 당업계에 공지된 방법으로 코팅될 수 있다. 재료를 코팅하는 왁스의 예는 1000 내지 20000 의 소량의 몰분자량을 가진 폴리(에틸렌 옥사이드)산물(폴리에틸렌글리콜, PEG); 16 내지 50 에틸렌 옥사이드 단위를 가지는 에톡실화 노닐-페놀; 에톡실화 지방 알콜(여기에서, 알콜은 12 내지 20 탄소원자를 포함하고 15 내지 80 에틸렌 옥사이드 단위가 존재한다); 지방 알콜; 지방산; 및 모노- 및 디- 및 트리글리세라이드 지방산이다. 유동층 기법으로 이용에 적합한 필름 형성 코팅 재료의 예는 GB 1483591 에 제시된다. 액체 효소 준비는 예를 들어, 확립된 방법에 따른 프로필렌 글리콜, 당 또는 당 알콜, 유산 또는 붕산과 같은 폴리올을 첨가하여 안정화될 수 있다. 보호 효소는 EP 238,216 에 개시된 방법에 따라서 제조될 수 있다.

본 발명의 세제 조성물은 예를 들어, 바, 정제, 분말, 과립, 페이스트 또는 액체와 같은 어떤 종래의 형태일 수 있다. 액체 세제는 수성, 전형적으로 70 % 이하의 물 및 0-30 % 유기용매, 또는 비수성을 포함하는 수성일 수 있다.

세제 조성물은 세미-극성 및/또는 음이온 및/또는 양이온 및/또는 쌍성이온을 포함하는 비이온일 가능성이 있는 하나 이상의 계면활성제를 포함한다. 계면활성제는 전형적으로 0.1중량 % 내지 60 중량 % 수준에서 존재한다.

세제 조성물에 포함되는 경우에, 세제는 일반적으로 선형 알킬벤젠술포네이트, α-올레핀술포네이트, 알킬-술포네이트(지방 알콜 술포네이트), 알콜 에톡시술페이트, 제 2 차 알칸술포네이트, α-술포 지방산 메틸 에스테르, 알킬- 또는 알케닐숙신산 또는 비누거품과 같은 약 1% 내지 약 40 % 의 음이온 계면활성제를 포함할 것이다.

세제 조성물에 포함되는 경우에, 세제는 일반적으로 알콜 에톡실레이트, 노닐-페놀 에톡실레이트, 알킬폴리글리코시드, 알킬디메틸아민-옥사이드, 에톡실화 지방산 모노에탄올-아미드, 지방산 모노에탄올아미드, 폴리히드록시 알킬 지방산 아미드, 또는 글루코사민의 N-아실 N-알킬 유도체("글푸카마이드")와 같은 약 0.2 % 내지 약 40% 의 비이온 계면활성제를 포함할 것이다.

세제는 지오라이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 포스포네이트, 카르보네이트, 시트레이트, 니트릴로트리아세트산, 에틸렌디아민테트라아세트산, 디에틸렌트리아민펜타아세트산, 알킬 또는 알케닐숙신산, 수용성 실리케이트 또는 층화 실리케이트(예를 들어, Hoechst 로부터 SKS-6)와 같은 0-65% 의 세제 빌더 또는 복합제를 포함할 수 있다.

세제는 하나 이상의 폴리머를 포함할 수 있다. 카르복시메틸셀루로스, 폴리(비닐-피롤리돈), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(비닐 알콜), 폴리 (비닐피리딘-N-옥사이드), 폴리(비닐이미다졸), 폴리아크릴레이트와 같은 폴리카르복실레이트, 말레/아크릴 산 코폴리머, 및 라우릴 메타크릴레이트/아크릴 산 코폴리머가 그 예이다.

세제는 테트라아세틸에틸렌디아민 또는 노나노일옥시벤-제네술-포네이트와 같은 과산-형성 표백 활성제와 조합될 수 있는 과붕산염 또는 과탄산염과 같은 H₂O₂ 원을 포함할 수 있는 표백 시스템을 포함한다.

본 발명의 세제 조성물은 예를 들어, 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤과 같은 폴리올, 당 또는 당 알콜, 유산, 붕산, 또는 방향족 붕산염 에스테르와 같은 붕산 유도체, 4-포르밀페닐 붕소산과 같은 페닐 붕소산 유도체와 같은 종래의 안정제를 사용하여 안정화될 수 있고, 조성물은 예를 들어, WO 92/19709 및 WO 92/19708 에 개시된 대로 조제될 수 있다.

세제는 예를 들어, 클레이, 거품 촉진제, 비누거품 억제제, 항-부식제, 얼룩 현탁제, 항-얼룩 재침전제, 염료, 살충제, 광 증백제, 굴수성 유발물질, 변색 억제제, 또는 퍼퓸과 같은 다른 종래의 세제 성분을 포함할 수 있다.

세제 조성물에서 어떤 효소, 특히 본 발명의 효소는 세척액의 리터당 0.01-100 mg 의 효소 단백질, 바람직하게는 세척액의 리터당 0.05-5 mg 의 효소 단백질, 특히 세척액의 리터당 0.1-1 mg 의 효소단백질에 해당하는 양으로 첨가될 수 있다.

본 발명의 효소는 본원에 참고문헌으로 수록된 WO 97/07202 에 개시된 세제 조성물에 추가적으로 포함될 수 있다.

식기 세척 세제 조성물

본 발명의 효소는 하기의 것을 포함하여 식기 세척 조성물에 사용될 수 있다.

1) 분말 자동 식기세척 조성물

비이온 계면활성제	0.4 - 2.5%
나트륨 메타실리케이트	0 - 20%
나트륨 디실리케이트	3 - 20%
3인산나트륨	20 - 40%
탄산나트륨	0 - 20%
과붕산나트륨	2 - 9%
테트라아세틸 에틸렌 디아민 (TAED)	1 - 4%
황산나트륨	5 - 33%
효소	0.0001 - 0.1%

2) 분말 자동 식기세척 조성물

비이온계면활성제 (예로서 알콜에톡실레이트)	1 - 2%
나트륨 디실리케이트	2 - 30%
탄산나트륨	10 - 50%
인산나트륨	0 - 5%
3나트륨 시트레이트 디히드레이트	9 - 30%
니트릴로3나트륨 아세테이트 (NTA)	0 - 20%
과붕산나트륨 모노히드레이트	5 - 10%
테트라아세틸 에틸렌 디아민 (TAED)	1 - 2%
폴리아크릴레이트 폴리머 (예로서, 말레산/아크릴산코폴리머)	6 - 25%
효소	0.0001 - 01%
퍼퓸	0.1 - 0.5%
물	5 - 10

3) 분말 자동 식기세척 조성물

비이온 계면활성제	0.5 - 2.0%
나트륨 디실리케이트	25 - 40%
나트륨 시트레이트	30 - 55%
탄산나트륨	0 - 29%
중탄산나트륨	0 - 20%
과붕산나트륨 모노히드레이트	0 - 15%
테트라아세틸 에틸렌 디아민 (TAED)	0 - 6%
알레산/아크릴산 코폴리머	0 - 5%
클레이	1 - 3%
폴리아미노산	0 - 20%
나트륨 폴리아크릴레이트	0 - 8%
효소	0.00001 - 0.1%

4) 분말 자동 식기세척 조성물

비이온 계면활성제	1 - 2%
지오라이트 MAP	15 - 42%
나트륨 디실리케이트	30 - 34%
나트륨 시트레이트	0 - 12%
탄산나트륨	0 - 20%
과붕산나트륨 모노히드레이트	7 - 15%
테트라아세틸 에틸렌 디아민 (TAED)	0 - 3%
폴리머	0 - 4%
말레산/아크릴산 코폴리머	0 - 5%
유기 포스포네이트	0 - 4%
클레이	1 - 2%
효소	0.0001 - 0.1%
황산나트륨	잔부

5) 분말 자동 식기세척 조성물

비이온 계면활성제	1 - 7%
나트륨 디실리케이트	18 - 30%
3나트륨 시트레이트	10 - 24%
탄산나트륨	12 - 20%
모노과붕산염 (2 KHSO₅.KHSO₄.K₂SO₄)	15 - 21%
표백 안정제	0.1 - 2%
말레산/아크릴산 코폴리머	0 - 6%
디에틸렌 트리아민 펜타아세테이트, 펜타나트륨염	0 - 2.5%
효소	0.0001 - 0.1%
황산나트륨, 물	잔부

6) 클린징 계면활성시스템을 가진 분말 및 액체 식기세척 조성물

비이온성 계면활성제	0 - 1.5%
옥타데실 디메틸아민 N-옥사이드 디히드레이트	0 - 5%
옥타데실 디메틸아민 N-옥사이드 히드레이트 및 헥사데실디메틸아민 N-옥사이드 디히드레이트의 80:20 wt. C18/16 혼합물	0 - 4%
옥사데실 비스(히드록시에틸)아민 N-옥사이드 무수물 및 헥사데실 비스(히드록시에틸)아민 N-옥사이드 무수물의 70:30 wt. C18/C16 혼합물	0 - 5%
평균 3의 에톡실화를 가지는 C₁₃-C₁₅ 알킬 에톡시술페이트	0 - 10%
평균 3의 에톡실화를 가지는 C₁₃-C₁₅ 알킬 에톡시술페이트	0 - 5%
평균 12의 에톡실화를 가지는 C₁₃-C₁₅ 알킬 에톡시화 알콜	0 - 5%
평균 9의 에톡실화를 가지는 C₁₂-C₁₅ 알킬 에톡시화 알콜의 혼합물	0 - 6.5%
평균 30의 에톡실화를 가지는 C₁₂-C₁₅ 알킬 에톡시화 알콜의 혼합물	0 - 4%
나트륨 디실리케이트	0 - 33%
트리폴리인산염 나트륨	0 - 46%
나트륨 시트레이트	0 - 28%
시트르산	0 - 29%
탄산나트륨	0 - 20%
과붕산나트륨 모노히드레이트	0 - 11.5%
테트라아세틸 에틸렌 디아민 (TAED)	0 - 4%
말레산/아크릴산 코폴리머	0 - 7.5%
황산나트륨	0 - 12.5%
효소	0.0001- 0.1%

7) 비수성 액체 자동 식기세척 조성물

액체비이온 계명활성제 (예로서, 알콜 에톡실레이트)	2.0 - 10.0%
알칼리 금속 실리케이트	3.0 - 15.0%
알칼리 금속 포스페이트	20.0 - 40.0%
고급 글리콜, 폴리글리콜, 폴리옥사이드, 글리콜에테르로부터 선택된 액체 담체	25.0 - 45.0%
안정제(예를들어, 인산 및 C₁₆-C₁₈ 알칸올의 부분적인 에스테르)	0.5 - 7.0%
거품 억제제(예로서 실리콘)	0 - 1.5%
효소	0.0001 - 0.1%

8) 비수성 액체 자동 식기세척 조성물

액체비이온 계명활성제 (예로서, 알콜 에톡실레이트)	2.0 - 10.0%
나트륨 실리케이트	3.0 - 15.0%
알칼리금속 탄산염	7.0 - 20.0%
나트륨 시트레이트	0.0 - 1.5%
안정화 시스템(예를 들어, 미세하게 분해된 실리콘 및 저분자량 디알킬폴리글리콜 에테르의 혼합물)	0.5 - 7.0%
저분자량 폴리아크릴레이트 폴리머	5.0 - 15.0%
클레이 겔 농축제(예로서, 벤토나이트)	0.0 - 10.0%
히드록시프로필 셀룰로스 폴리머	0.0 - 0.6%
효소	0.0001 - 0.1%
고급 리콜, 폴리글리콜, 폴리옥사이드 및 글리콜 에테르로부터 선택된 액체 담체	잔부

9) 틱소트로피 액체 자동 식기세척 조성물

C₁₂-C₁₄ 지방산	0 - 0.5%
코폴리머 계면활성제 차단	1.5 - 15.0%
나트륨 시트레이트	0 - 12%
나트륨 트리폴리포스페이트	0 - 15%
탄산나트륨	0 - 8%
트리스테아르산알루미늄	0 - 0.1%
나트륨 큐멘 술포네이트	0 - 1.7%
폴리아크릴레이트 농축제	1.32 - 2.5%
나트륨 폴리아크릴레이트	2.4 - 6.0%
붕산	0 - 4.0%
나트륨 포메이트	0 - 0.45%
칼슘 포메이트	0 - 0.2%
나트륨 n-데시디페닐 옥사이드 디술포네이트	0 - 4.0%
모노에탄올 아민 (MEA)	0 - 1.86%
수산화나트륨 (50%)	1.9 - 9.3%
1,2-프로판디올	0 - 9.4%
효소	0.0001 - 0.1%
비누거품억제제, 염료, 퍼퓸, 물	잔부

10) 액체 자동 식기세척 조성물

알콜 에톡실레이트	0 - 20%
지방산 에스테르 술포네이트	0 - 30%
나트륨 도데실 술포네이트	0 - 20%
알킬 폴리글리코사이드	0 - 21%
올레산	0 - 10%
나트륨 디실리케이트 모노히드레이트	18 - 33%
나트륨 시트레이트 디히드레이트	18 - 33%
스테아르산 나트륨	0 - 2.5%
과붕산나트륨 모노히드레이트	0 - 13%
테트라아세틸 에틸렌 디아민 (TAED)	0 - 8%
말레산/아크릴산 코폴리머	4 - 8%
효소	0.0001 - 0.1%

11) 보호 표백 입자를 포함하는 액체 자동 식기세척 조성물

나트륨 실리케이트	5 - 10%
피로인산4칼륨	15 - 25%
3인산나트륨	0 - 2%
탄산카륨	4 - 8%
예를 들어 염소와 같은 보호 표백 입자	5 - 10%
폴리머 농축제	0.7 - 1.5%
수산화 칼륨	0 - 2%
효소	0.0001 - 0.1%
물	잔부

11) 1),2),3),4),5),6) 및 10) 에 개시된 자동 식기세척 조성물에서 과붕산염은 과탄산염으로 교체된다.

12) 망간 촉매를 추가적으로 포함하는 1)-6) 에 개시된 자동 식기세척 조성물. 망간 촉매는 예를 들어, "저온도 표백용의 효과적인 망간 촉매" Natrue 369,1994, pp.637-639 에 개시된 화합물의 일종일 수 있다.

용도

본 발명은 세제에서, 특히 상기에 개시된 세탁 세제 조성물 및 식기세척 조성물, 경표면 클린징 조성물, 및 직물, 섬유 또는 의복의 풀빼기용 조성물, 펄프 및 페이퍼 제조의 조성물, 맥주 제조, 및 전분 전환 과정에서 본 발명의 α-아밀라제 활성을 가지는 폴리펩티드를 사용하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 다음의 실시예를 더 개시하며, 이것은 본 발명의 범위를 제한하지는 않는 것으로 해석된다.

물질 및 방법

완충제 및 기질로서 사용된 화학제는 적어도 시약 등급의 상업적 제품이다.

물질

효소

SP690 : US 특허번호 5,856,164 의 SEQ ID NO:1 에 개시된 α-아밀라제

SP722: US 특허번호 5,856,164 의 SEQ ID NO:2 로 개시된 α-아밀라제

Termamyl

: US 특허번호 5,830,837 의 SEQ ID NO:1 에 개시된 Bacillus licheniformis 의 α-아밀라제

AA560 : SEQ ID NO:2 로 제시된 본 발명의 α-아밀라제

BAN: Bacillus amyloliquefaciens 로부터 유도되고 Novo Nordisk A/S 로부터 이용가능한 α-아밀라제

BSG: Bacillus stearothermophilus 로부터 유도되고, Novo Nordisk A/S 로부터 이용가능한 α-아밀라제

모델 세제:

A/P (Asia/Pacific) 모델 세제는 다음의 조성물을 가진다: 20 % STPP(소듐 트리폴리포스페이트), 25% Na₂SO₄, 15% Na₂CO₃, 20% LAS(선형 알킬벤젠 술포네이트, Nansa 80S), 5% C₁₂-C₁₅ 알콜 에톡실레이트(Dobanol 25-7), 5% Na₂Si₂O_{5 ,}0.3% NaCl.

Omo 멀티 Acao (Brazil)

Omo 농축분말(EU)(Unilever)

Ariel Futur 액체(EU)(Procter and Gemble)

생물학적 재료의 기탁

다음의 생물학적 재료를 Deutsch Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig DE 에 부다 페스트 협약에 기초하여 기탁했고, 하기의 수탁번호를 부여받았다:

기탁 기탁 번호 기탁일

NN017557 DSM 12648 1999.1.25

NN017560 DSM 12649 1999.1.25

NN049467 DSM 12761 1999.4.7

NN049470 DSM 12764 1999.4.7

균주는 37 C.F.R. §1.14 및 35 U.S.C §122 에 기초하여 자격을 부여받은 특허 및 상표청장에 의해 결정에 따라 특허출원의 계류중에 배양물의 이용이 가능하다는 것을 보장하는 조건으로 기탁되어야만 한다. 기탁은 기탁된 균주의 상당히 순수한 배양물을 나타낸다. 기탁물은 본 출원에 상응하는 출원, 또는 그것의 후속출원이 제출된 국가의 특허법에서 요구하는 바에 따라서 이용가능하다. 그러나, 기탁물의 이용가능성이 정부에 의해 부여받은 특허권의 훼손하는 경우에까지 본 발명을 실행할 수 있는 권리로 구성되는 것이 아니라는 것이 이해되어야만 한다.

숙주 유기물

Bacillus subtilis 균주 SHa273 은 WO 95/10603 E. coli 균주 SJ2(Diderichsen et al.(1990), J. Bacteriol., vol.172, pp. 4315-4321 에 개시된다.

플라스미드:

유전자 은행 벡터 pSJ1678 은 본원에 참고문헌으로 수록된 WO 94/19454 에 더 개시된다.

pTVB110 은 pUB110(Grycazan, T.J.(1978) J.Bact.134:318-329)의 복제 기점을 사용하여 Bacillus subtilis 에서 복제하는 플라스미드이다. 플라스미드는 플라스미드 pC194 (Horinouchi, S. and Weisblum, B. (1982), J.Bact.150:815-825) 로부터 얻은 클로람페니콜 내성을 부여하는 cat 유전자를 더 코드한다. 플라스미드는 Bacillus licheniformis α-아밀라제 유전자, amyL 의 절단된 형태를 포함하여 amyL 프로모터, 신호 서열 및 전사 터미네이터가 존재하지만, 플라스미드는 amy+ 표현형(한천을 포함하는 전분상의 할로 조성물)을 제공하지는 않는다.

pTVB299: 실시예 10 의 제조 참조

방법

일반적인 분자 생물학 방법

달리 언급된 바가 없으면, DNA 조작 및 형질전환은 표준 분자 생물학 방법을 사용하여 수행했다(Sambrook et al.(1989); Ausubel et al.(1995); Harwood and Cutting(1990).

α-아밀라제 및 변이체의 발효

발효는 당업계에 주지된 방법 또는 하기와 같이 수행될 수 있다.

관련 발현 플라스미드를 포함하는 B.subtilis 균주를 -80 ℃ 스톡의 10 ㎍/ml 카나마이신으로 LB-한천상에 스트레이킹하여, 37 ℃ 에서 하룻밤동안 배양했다. 콜로니를 500 ml 진탕 플라스크에서 10 ㎍/ml 카나마이신으로 보충된 100ml BPX 배지에 옮겼다.

BPX 배지의 조성물:

감자 전분 100 g/l

보리 가루 50 g/l

BAN 5000 SKB 0.1 g/l

나트륨 카제인네이트 10 g/l

콩가루 20 g/l

Na₂HPO₄, 12H₂O 9g/l

Pluronic^TM 0.1 g/l

배양물을 5 일동안 270 rpm 으로 37 ℃ 에서 진탕한다.

세포 및 세포 부스러기를 4500 rpm 으로 20-25 분동안 원심분리하여 발효 육즙으로부터 제거한다. 그 후에, 상청액을 여과하여 완전한 투명 용액을 얻었다. 여과액을 농축하여 UF-여과기(10000 컷오프 멤브레인)상에서 세척하고, 완충액을 20 mM 아세테이트 pH 5.5 로 교환했다. UF-여과액을 S-세파로스 F.F 에 놓았고, 같은 완충액에서의 0.2 M NaCl 로 용리 단계에 의해서 용리했다. 용리액을 10 mM Tirs, pH 9.0 에 대해 전개했고, Q-세파로스 F.F.에 놓았고, 6 컬럼 부피상에 0-0.3 M NaCl 로부터 선형 구배로 용리했다. 활성(파데바스 분석법으로 측정)을 포함하는 분획을 모아서, pH 를 pH 7.5 로 조정했고, 잔여 색상을 5 분동안 0.5% W/부피 활성 석탄으로 처리하여 제거했다.

α-아밀라제 활성 분석법

1. 파데바스 분석법

α-아밀라제 활성은 기질로서 파데바스

정제를 사용하는 방법으로 결정된다. 파데바스 정제(Pharmacia Diagnostic에 의해 제공된 파데바스

아밀라제 시험)는 소 혈청 알부민과 완충액 물질로 혼합되어 정제된 교차-결합 불용성 블루-색상 전분 폴리머를 포함한다.

매 단일 측정의 경우에, 1 정제를 5 ml 50 mM 브리톤-로빈손 완충액(50 mM 아세트산, 50 mM 포스포르산, 50 mM 붕산, 0.1 mM CaCl₂ , NaOH 로 관심의 값까지 조정된 pH)을 포함하는 튜브에서 현탁한다. 시험은 관심의 온도에서 물욕에서 수행했다. 시험 대상 α-아밀라제를 x ml 의 50 mM 브리톤-로빈손 완충액에 희석한다. 1 ml 의 α-아밀라제 용액을 5 ml 50 mM 브리톤-로빈손 완충액에 첨가한다. 전분을 α-아밀라제로 가수분해하여 수용성 블루 단편을 생성한다. 620 nm 에서 분광광도계적으로 측정된 결과적인 블루 용액의 흡광도는 α-아밀라제 활성 함수이다.

10 분 또는 15 분의 인큐베이션(시험 시간)후에 측정된 620 nm 흡광도는 620 nm 에서 0.2 내지 2.0 흡광도 단위의 범위라는 것이 중요하다. 이 흡광도 범위에서, 활성 및 흡광도 사이에 상관관계가 있다(Lambert-Beer 법칙). 그러므로, 효소의 희석은 이 기준에 적합하게 조정되어야만 한다. 조건의 특정화된 고정하에서(온도, pH, 반응시간, 완충액 조건) 1mg의 허여된 α-아밀라제는 어떤 양의 기질을 가수분해할 것이고, 블루 색상을 나타낼 것이다. 색상 강도는 620 nm 에서 측정된다. 측정된 흡광도는 허여된 고정 조건하에서 문제의 α-아밀라제의 비활성도(순수한 α-아밀라제 단백질의 활성/mg)에 직접 비례한다.

2. 대안적인 방법(PNP-G7 분석법)

α-아밀라제 활성은 PNP-G7 기질을 사용하는 방법으로 결정한다. PNP-G7 은 p-니트로페닐-α,D-말토헵타오사이드의 약자이고, 엔도-아밀라제로 절단가능한 차단된 올리고당이다. 절단 후에, 키트에 포함된 α-글루코시다제는 기질을 분해하여 옐로우 색상의 유리된 PNP 분자를 방출하여 λ=405 nm (400-420 nm) 에서 가시적인 분광광도계로 측정될 수 있다. PNP-G7 기질 및 α-글루코시다제를 포함하는 키트는 Boehringer-Mannheim 으로 제조된다(cat.No.1054635).

기질을 준비하기 위해서, 1 병의 기질(BM 1442309)을 5 ml 완충액(BM1442309)에 첨가한다. α-글루코시다제를 준비하기 위해서, 1 병의 α-글루코시다제(BM 1462309)를 45 ml 완충액(BM1442309)에 첨가한다. 작용 용액을 5 ml α-글루코시다제 용액과 0.5 ml 기질을 혼합함으로써 만든다.

분석법은 96 웰 마이크로티터 평판에 20 μl 효소용액을 형질전환시키고, 25 ℃ 에서 인큐베이션하여 수행한다. 200 μl 작용 용액을 25 ℃ 에서 첨가한다. 용액을 혼합하고, 1 분동안 예비-인큐베이션하고 OD 405 nm 에서 3 분이상 매 15 초마다 흡광도를 측정한다.

흡광도-커브 의존적 시간 기울기는 허여된 조건셋하에서 문제의 α-아밀라제의 비활성도(mg 효소당 활성)에 직접 비례한다.

칼슘 및 pH 의존 안정성의 측정

일반적으로 공업상 액화 과정은 90℃-105 ℃ 에서 안정성을 개선하기 위해서 액화 pH 로 pH 6.0-6.2 를 사용하고, 40 ppm 해리된 칼슘을 첨가하여 전개한다.

1. pH 6.2 이하의 pH 및/또는

2. 40 ppm 해리 칼슘이하의 해리 칼슘 수준에서 안정성을 개선하기 위해서 본원에서 제시된 어떤 치환을 행했다.

2 개의 서로 다른 방법이 AA560 α-아밀라제의 서로 다른 치환으로 얻어진 안정성의 변형을 측정하기 위해서 사용될 수 있다.

방법1 5 ppm 해리 칼슘으로 감소된 pH, pH 5.0 에서 안정성을 측정하는 한 분석법.

10 ㎍ 의 변이체를 다음의 조건으로 인큐베이션했다: 0.1 M 아세테이트 용액, pH 5.0 으로 조정된 pH, 5ppm 칼슘 및 5% w/w 통상의 옥수수 전분(무칼슘) 포함. 인큐베이션을 30 분동안 95 ℃ 의 물욕에서 함.

방법2

해리 칼슘의 부재 및 pH 6.0 에서 안정성을 측정하는 한 분석법. 칼슘 감도의 감소를 측정한다: 10 ㎍ 의 변이체를 다음의 조건으로 인큐베이션했다: 0.1 M 아세테이트 용액, pH 6.0 으로 조정된 pH, 5ppm 칼슘 및 5% w/w 통상의 옥수수 전분(무칼슘) 포함. 인큐베이션을 30 분동안 95 ℃ 의 물욕에서 함.

안정성 결정

모든 안정성 실험을 같은 셋업을 사용하여 행했다. 방법은:

효소를 상대 조건(1-4)에서 인큐베이션한다. 샘플을 0,5,10,15 및 30 분에서 취하여 분석 완충액(0.1M 50 mM 브리톤 완충액 pH 7.3)에서 25 배 희석(모든 취해진 샘플에 대하여 같은 희석)하고, 활성을 표준조건 pH 7.3, 37 ℃ 에서 파데바스 분석법(Pharmacia)을 사용하여 측정한다.

인큐베이션 전에 측정된 활성을(0 분) 기준으로(100%) 사용한다. 비율의 감소를 인큐베이션 시간 함수로 계산한다.

비활성도 결정

비활성도를 활성/mg 효소로서 파데바스 분석법(Pharmacia)을 사용하여 결정한다.

AA560 및 변이체로 제트 쿠킹 및 액화

액화 실험을 모 α-아밀라제의 그것과 조제된 α-아밀라제 변이체의 성능을 비교하기 위한, Ca⁺⁺첨가된 5 ppm 을 가진 pH 5.5 의 50 NU/g DS 의 투여량을 사용하여 미니-제트 시스템상에서 행한다. 반응을 시간 함수로서 DE 증가(Neocuproine 방법)를 측정함으로써 모니터한다.

옥수수전분 슬러리를 탈이온수에서 약 11.8 kg Cerestar C*Pharm GL 03406(89% 전분)을 현탁하고 30 kg 이하로 만들어서 준비한다. pH 를 0.55 g CaCl_2.2H₂O 를 첨가하여 대기중온도에서 5.5 로 조정한다.

50 NU/g DS 에 해당하는 효소의 양을 첨가하고, 전도성을 NaCl 을 사용하여 300 mS 로 조정한다. 표준 조건은 하기와 같다:

기질 농도 35% w/w(초기)

31.6031.9 % w/w (최종)

온도 105 ℃, 5 분(제 1 의 액화)

95℃, 90 분(제 2 의 액화)

pH (초기) 5.5

제팅 후에, 액화 전분을 수거하여 파이럿 식물에서 제 2 의 액화가 95 ℃ 에서 계속되는 실험실의 봉인된 보온병-플라스크로 옮긴다.

10 ml 의 샘플을 15-90 분의 간격으로 15 분에서 채취한다. 2 드롭의 1N NaCl 을 첨가하여 효소를 불활성화한다. 샘플로부터, 0.3-0.1 g(기대된 DE 에 따름)를 무게를 달아서 나누고 100 ml 로 희석했다. 그 다음 환원되는 당을 Neocuproine 방법(개선된 정밀도로 환원 당의 결정. Dygert, Li, Florida and Thomas(1965). Anal. Biochem 13, 368)에 따라 결정했고, DE 값을 결정했다. 시간 함수로서 DE 발생을 비교한다.

풀빼기 재료:

표준 직물: TS526, 능직 직조, 100% 코튼.

주입: 55 ℃, 60 ppm CaCl₂, pH 6.5

효소 용액: 모 AA560 (1g/l)

투여량: 주입액내의 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 및 2.0 g/l 의 효소 용액

인큐베이션: 55 또는 65 ℃ 에서 2 시간

30 ℃ 에서 22 시간

세척: 물에서 10 분

염색: 실내온도

과정: 풀빼기 결과의 평가- 바이올렛 스케일(TEGEWA).

DOPE 프로그램의 사용에 의한 무작위 돌연변이유발의 일반적인 방법.

무작위 돌연변이유발은 다음의 단계로 수행될 수 있다:

1. 모효소에 변형을 위한 관심의 영역의 선택,

2. 선택 영역에서 돌연변이 부위 및 비-돌연변이화 부위 결정,

3. 예를 들어, 원하는 안정성 및/또는 제조될 변이체의 성능과 관련하여 어떤 종류의 돌연변이가 수행될지를 결정,

4. 구조적으로 합리적인 돌연변이의 선택,

5. 단계 4 와 관련하여 단계 3 에 의해 선택된 잔기의 조정,

6. 적당한 도핑 알고리즘을 사용하여 뉴클레오티드의 분배를 분석.

7. 필요한 경우, 예를 들어, 정지 코돈의 도입을 피하기 위해서 예를 들어, 유전자 코드에 기인한 압력을 고려하는 것과 같이 실제 유전자 코드에 원하는 잔기를 삽입; 당업자는 어떤 코돈 조합은 실제로 사용될 수 없고, 수정이 필요할 것이라는 것을 인식할 것이다.

8. 프라이머 제작

9. 프라이머를 사용하여 무작위 돌연변이유발의 수행

10. 원하는 개선된 성질에 대해 스크리닝함으로써 결과적인 글루코아밀라제 변이체의 선택.

도핑 알고리즘

단계 6 에 사용하기 위해 적당한 도핑 알고리즘이 당업계에 공지된다. 이러 한 알고리즘은 Tomandl, D. et al., 1997, Journal of Computer-Aided Molecular Design 11: 29-38 에 개시된다. 다른 알고리즘은 DOPE (Jensen, LJ, Andersen, KV, Svendsen, A, and Kretzschmar, T (1998) Nucleic Acids Research 26: 697-702)이다.

필터 스크리닝 분석법

분석법은 모 효소와 비교하여 높은 pH 에서 개선된 안정성을 가지는 AA560 변이체를 스크리닝하는 데 사용될 수 있고, 높은 pH 및 중간 온도에서 개선된 안정성을 가지는 AA560 α-아밀라제 변이체를 스크리닝 온도 셋팅에 따라 모 효소와 비교했다.

고 pH 필터 분석법

Bacillus 라이브러리를 10 ㎍/ml 카나마이신을 가지는 TY 한천 평판상의 셀룰로스 아세테이트 (OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) 및 니트로셀룰로스 필터(Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany)의 샌드위치상에 적어도 21 시간동안 37 ℃ 에 플레이팅한다. 셀룰로스 아세테이트 층을 TY 한천 평판상에 놓는다.

각 필터 샌드위치는 인큐베이션 전, 플레이팅 후에 니들로 구별되게 표시하여 필터상에 양성 변이체가 위치할 수 있도록 하고 결합 변이체를 가지는 니트로셀룰로스 필터를 글리신-NaOH 완충액, pH 8.6-10.6 을 가지는 컨테이너에 옮기고 15 분동안 실내온도(10℃-60℃에서 변경 가능)에서 인큐베이션한다. 콜로니를 가지는 셀룰로스 아세테이트 필터를 사용전까지 실내온도에서 TY-평판상에서 저장한다. 인 큐베이션 후에, 잔기 활성을 글리신-NaOH 완충액, pH 8.6-10.6 의 1% 아가로스, 0.2% 전분을 포함하는 평판상에서 검출한다. 니트로셀룰로스 필터를 가지는 분석 평판을 필터 샌드위치와 같은 방식으로 표지하고 2 시간동안 실내온도에서 인큐베이션한다. 필터를 제거한 후에, 분석 평판을 10% Lugol 용액으로 염색한다. 전분 분해 변이체를 짙은 청색 배경상의 하얀 점으로 검출한 다음에 저장 평판상에서 확인한다. 양성 변이체를 제 1 의 스크린과 같은 조건하에서 2 번 재스크리닝한다.

저 칼슘 필터 분석법

각 필터 샌드위치는 인큐베이션 전, 플레이팅 후에 니들로 구별되게 표시하여 필터상에 양성 변이체가 위치할 수 있도록 하고 결합 변이체를 가지는 니트로셀룰로스 필터를 탄산염/중탄산염 완충액, pH 8.5-10 및 다른 EDTA 농도(0.001 mM-100mM)를 가지는 컨테이너에 옮긴다. 필터럴 1 시간동안 실내온도에서 인큐베이션한다. 콜로니를 가지는 셀룰로스 아세테이트 필터를 사용전까지 실내온도에서 TY-평판상에서 저장한다. 인큐베이션 후에, 잔기 활성을 탄산염/중탄산염 완충액, pH 8.5-10 의 1% 아가로스, 0.2% 전분을 포함하는 평판상에서 검출한다. 니트로셀룰로스 필터를 가지는 분석 평판을 필터 샌드위치와 같은 방식으로 표지하고 2 시간동 안 실내온도에서 인큐베이션한다. 필터를 제거한 후에, 분석 평판을 10% Lugol 용액으로 염색한다. 전분 분해 변이체를 짙은 청색 배경상의 하얀 점으로 검출한 다음에 저장 평판상에서 확인한다. 양성 변이체를 제 1 의 스크린과 같은 조건하에서 2 번 재스크리닝한다.

실시예1

DSM 12648 및 DSM 12649 로부터 게놈 DNA 의 분리

균주 Bacillus sp. DSM 12649 (AA560 α-아밀라제) 및 Bacillus sp. DSM 12648 (AA349 α-아밀라제)를 액체 TY 배지에서 증식했다(Ausubel et al.(1995) 에 개시). 37 ℃ 및 300 rpm 에서 16 시간 인큐베이션한 후에, 세포를 회수하여 게놈 DNA 를 Pitcher et al.(1989) 에 개시된 방법으로 분리했다.

게놈 라이브러리 제조

균주 DSM 12649 의 게놈 DNA 를 제한 효소 Sau3A로 부분적으로 분해하여, 0.7% 아가로스 겔상에서 전기영동으로 크기-분획했다. 2 내지 10 kb 크기의 단편을 DEAE-셀룰로스 페이퍼상에서 전기영동으로 분리했다(Dretzen et al.(1981).

분리된 DNA 단편을 BamHI 절단 pSJ1678 플라스미드 DNA 에 연결하고 연결 혼합물을 E.coli SJ2 를 형질전환하는데 사용했다.

형질전환

E.coli SJ 숙주 세포를 준비하고, 공급자가 개시한대로 BIO-RAD 의 유전자 PULSER^TM 일렉트로포레이터를 사용하여 일렉트로포레이션으로 형질전환했다.

양성 형질전환체의 확인

상기에 개시된대로 제조된 E.coli SJ2 의 DNA 라이브러리를 0.5% AZCL-아밀로스(Megazyme) 및 10 ㎍/ml 클로람페니콜을 포함하는 LB 한천 플레이트상에서 스크리닝했고(Ausbel et al. (1995)), 37 ℃ 에서 하룻밤동안 인큐베이션했다. 아밀라제 활성을 나타내는 클론은 블루 확산 할로를 나타냈다. 이러한 클론을 LiH1274 라 했다. DNA 는 클론 Sau3A DNA 단편 부분의 DNA 서열을 더이상의 특징으로 한다.

실시예 2

균주 DSM 12648(AA349)로부터 α-아밀라제 코드화 유전자의 DNA 서열 결정

플라스미드 pSJ1678, pLiH1274 에 삽입된 아밀라제 가수분해 활성을 코드화하는 유전자를 포함하는 거대 염색체 단편으로 구성되는 클론을 Bacillus α-아밀라제로 알려진 보존 영역에 특이적인 축퇴성 프라이머를 사용하여 유전자를 코드화하는 α-아밀라제의 내부 DNA 단편을 특이적으로 PCR 증폭하기 위해서 주형으로 사용했다.

축퇴성 프라이머는 다음의 영역/아미노산 서열에 특이적이었다:

For36 : GITA (L/V/I) W (I/L) (SEQ ID NO: 5)

For97: VY (G/A) D (V/F/L) V (M/L/I/F) NH (SEQ ID NO: 6)

For227: DG (F/I) R (F/L/I/V) DA (A/V) KH (SEQ ID NO: 7)

Rev235: DG (F/I) R (F/L/I/V) DA (A/V) KH (SEQ ID NO: 8)

Rev328: VTFV (D/E) NHD (SEQ ID NO: 9)

Rev410: GWTREG (SEQ ID NO: 10)

포워드(For) 및 역(Rev) 프라이머의 다양한 조합이 PCR 에 사용되고, 내부 DNA 단편이 증폭될 수 있다.

DNA 단편을 QIAquick 스핀 컬럼(QUIGEN)으로 정제했고, 같은 축퇴성 프라이머를 사용하여 서열결정했다.

서열로부터 성숙한 AA349 α-아밀라제(SEQ ID NO:2)를 코드화하는 완전한 코드 영역의 DNA 서열(SEQ ID NO:1)을 표준 프라이머-워킹 접근법으로 결정했다.

실시예 3

균주 DSM 12649(AA560)으로부터 α-아밀라제를 코드화하는 유전자의 DNA 서열 결정

균주 DSM 12649 (실시예 1)로부터 염색체 DNA 의 제조를 실시예 2 에 개시된 것에 유사한 실험의 주형으로 사용하여 AA560 α-아밀라제(SEQ ID NO:4)의 DNA 서열을 결정했다.

실시예 4

AA560 α-아밀라제의 pTVB110 으로의 서브클로닝

pTVB110 은 pUB110(Gryczan, T. J.(1978) J. Bact. 134: 318-329)의 복제 기점을 사용하여 Bacillus subtilis 에서 복제되는 플라스미드이다. 플라스미드는 플라스미드 pC194 로부터 얻어진 클로람페니콜에 내성을 부여하는 cat 유전자를 더 암호화한다(Horinouchi, S. and Weisblum, B.(1982), J. Bact. 150: 815-825). 플 라스미드는 Bacillus licheniformis α-아밀라제 유전자, amyL 의 절단된 버전을 포함하여 amyL 프로모터, 신호 서열 및 전사 터미네이터가 존재하지만, 플라스미드는 amy+ 표현형을 제공하지는 않는다(한천을 포함하는 전분상에 할로 형성).

AA349 α-아밀라제의 많은 양을 발현하기 위해서, 성숙한 유전자를 amyL 신호 서열에 정확하게 연결하고, 전사는 amyL 프로모터에서 개시하고, 전위는 amyL 신호 서열로 지시된다.

PstI 부위는 성숙한 AA349 α-아밀라제내에서 발견되었다. pTVB110 으로의 유전자 클로닝은 pTVB110 내의 PstI 부위를 이용하기 때문에, AA349 α-아밀라제 유전자내에 위치한 PstI 부위는 클로닝동안 파괴된다(아미노산 알라닌 88에 잠재성 돌연변이 도입에 의함((GCA 를 GCG로).

프라이머 188클로닝N 및 188 (Pst-)를 제조자(Boehringer Mannheim)의 추천에 따른 조건하에서 Pwo 폴리머라제를 사용하여 플라스미드 pLiH1274 상에서 PCR 로 약 280 bp 단편을 증폭하는 데 사용했다. 단편을 아가로스 겔로부터 정제했고, 프라이머 188클로닝C 와 함께 메가프라이머로서 사용하여(G. Sarkar and S. S. Sommer (1990) Biotechniques 8: 404-407), 제 2 의 PCR 에서 성숙한 아밀라제를 코드화하는 전길이 유전자를 증폭했다.

결과적인 약 1480 bp 단편을 제한 엔도뉴클레아제 PstI 및 SfiI 로 절단하고, 같은 효소로 절단된 플라스미드 pTVB110 과 연결했다.

프로테아제 및 아밀라제 결실 Bacillus subtilis 균주 SHa273(WO 95/10603)를 연결 혼합물과 형질전환했고, amy+ 형질전환체의 DNA 서열을 확인했다. 플라스 미드는 pTVB231 로 지정했다.

올리고뉴클레오티드:

188 (Pst-):

5'GGC GTT AAC CGC AGC TTG TAA C (SEQ ID NO: 11)

188클로닝C:

5'CCG AGC TCG GCC GGC TGG GCC GTC

GAC TTA TTT GTT TAC CCA AAT AGA AAC (SEQ ID NO: 12)

188클로닝N:

5'CAT TCT GCA GCA GCG GCG CAC CAT AAT GGT ACG AAC G (SEQ ID NO: 13)

실시예 5

AA560 α-아밀라제의 pTVB110 으로의 서브클로닝

DNA 서열결정은 균주 DSM12648 (AA349) 및 DSM 12649 (AA560)의 α-아밀라제 사이의 높은 DNA 동일성을 나타냈다. 결과적으로, 같은 올리고뉴클레오티드 및 전략을 발현 벡터 pTVB110 에 AA560 α-아밀라제를 클로닝하는 데 사용하여 플라스미드 pTVB232 를 생산하고, 그 다음 표준기법으로 발효했다.

실시예 6

모 AA560 α-아밀라제의 정제

배양 육즙을 0.01 ml 50% (w/w) CaCl₂,2H₂0, 0.0125 ml 12% (w/w) 나트륨 알루미네이트, 0.025 ml 10% C521 및 0.075 ml 0.1% A130 pr. ml 배양육즙을 첨가함 으로써 뭉쳤다. 원심분리후에 투명 용액을 얻었다. 효소 용액을 암모니움 설페이트에 첨가하여 최종 농도 1.2 M 이 되게 하고, 1.2 M 암모늄 설페이트, 10 mM TrisHC1, pH 7.0 으로 평형화 되기 전에 Butyl Toyo Pearl 컬럼(100 ml)상에 전개했다. 아밀라제를 5 mM Tris-HCl, pH 7.0 을 사용하여 용리했고, 용리액을 하룻밤동안 5mM Tris-HCl 에서 투석했다. 그 다음, 20 mM Tris-HCl, pH 9.0 으로 평형화되기 이전에 Q-세파로스 컬럼(200ml)을 사용하는 이온 교환 크로마토그래피에 놓았다. 비결합 물질을 평형 완충액으로 세척하고, 아밀라제를 선형 구배 0-1 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 9.0 을 사용하여 용리했다. 아밀라제 침전의 순도는 SDS-PAGE 로 측정시 95% 이상이었다.

실시예 7

모 α-아밀라제의 특징

α-아밀라제 활성을 상기에 개시된 Phaebas 분석(37 ℃, pH 7.3) 및 택일적인 pNPG7 분석(25 ℃, pH 7.1)을 사용하여 측정했다. pH 및 온도 프로파일을 선택 pH 및 온도값에서 행했다. pH 프로파일을 37 ℃ 에서 행했고, 온도 프로파일을 pH 9.0 에서 측정했다.

등전위 포인트를 등전집중(Pharmacia, Ampholine, pH 3.5-9.3)을 사용하여 결정했다. .

pH 최적 결정 및 온도 최적 결정의 결과는 각각 도 2 및 도 3 에 나타난다.

실시예 8

모 AA560 α-아밀라제로 세척 시험

세척 성능을 본 발명의 AA560 α-아밀라제를 가지는 세제 용액에서 각각 25 ℃ 및 40 ℃ 에서 15 분 및 30 분동안 오염된 시험 견본을 세척함으로써 평가했다.

사용된 세제는 하기의 표 2 에 개시된다. A/P 모델 세제는 상기의 물질 단락에 개시된다. 다른 세제는 상업적으로 구입가능한 세제이다. α-아밀라제를 포함하는 상업상 세제는 세척전에 마이크로웨이브로 불활성화된다.

실시예 6 의 정제된 재조합 AA560 α-아밀라제를 하기에 나타난 농도에서 세제 용액에 첨가했다. 시험 견본을 오렌지 라이스 전분으로 오염시켰다(CFT 로부터 이용가능한 CS-28 견본, Center for Test Material, Holland).

세척후에, 견본을 Elrepho Remission 분광광도계를 사용하여 460 nm 에서 경감을 측정함으로써 평가했다. 결과를 △R=α-아밀라제를 가지고 세척된 견본의 경 감-무α-아밀라제로 같은 조건에서 세척된 견본의 경감으로 나타낸다.

결과는 도 4-7 에서 보여진다. 결과는 본 발명의 α-아밀라제가 높은 알칼리 pH 의 모든 세제에서 효과적이고, AA560 α-아밀라제가 각각 SP690 및 SP722 에 비교하여 개선된 세척 성능을 가진다는 것을 보여준다.

실시예 9

AA560 α-아밀라제로 풀빼기 시험

모 AA560 α-아밀라제를 TEGEWA 방법 (Verband TEGEWA, Karlstrasse 21, Frankfurt a. M., Germany 로부터 얻을 수 있는 방법 및 표준 스케일)을 사용하여 섬유의 풀빼기에 사용했다. 조건은 "물질&방법"단락에 개시된다.

AA560 α-아밀라제를 30 및 55 ℃ 에서 수행된 풀빼기 시험에서 사용했다. 효소를 주입용액에서 0.05 내지 2 g/l 로 투여했다. 세척후에 과정을 일반적인 더운 소다 세척대신에 물에서 직물을 세척함으로써 수행했다.

결과를 바이올렛 스케일(TEGEWA)을 사용하여 측정했다.

TEGEWA 스케일: 1-9.

등급 1 = 풀빠짐 없슴, 등급 9 = 완전한 풀빠짐

실시예 10

기탁된 재료 pTVB299 의 제조

성숙한 유전자를 pzero-2 에 서브클론했다(Invitrogen, Groningen, The Nederlands). AA560 (pTVB232 에서 얻음)의 완전한 성숙한 영역을 포함하는 약 1.5 kb PstI-SacI 단편을 벡터 pZero-2 에 연결하고, 같은 제한 엔도뉴클레아제로 분했했다. 연결 혼합물로 수용성 E. coli 세포를 형질전환시켰다. 형질전환체를 삽입된 단편의 존재를 증명하기 위해서 PCR 로 분석했고, 성숙한 α-아밀라제를 코드화하는 단편 부분을 서열결정했다. pTVB299 로 표시되는 결과적인 플라스미드를 DSM12764 로서 DSMZ 에 기탁한다.

실시예 11

AA560 α-아밀라제 변이체 제조

SEQ ID NO:2 로 제시된 AA560 α-아밀라제를 코드화하는 유전자는 플라스미드 pTVB223 에 위치한다. 아밀라제는 Bacillus subtilis 의 구조체에서 amyL 프로모터로부터 발현된다.

델타(D183-G184) 돌연변이를 가지는 발명의 변이체를 Sarkar 및 Sommer, (1990), BioTechnique 8: 404-407 에 개시된 메가-프라이머 방법으로 제조했다.

유전자 특이적 프라이머 B1 및 돌연변이성 프라이머 101458 은 SEQ ID NO:12 로 제시된 AA560 코드화 pTVB223 플라스미드의 약 645 bp DNA 단편을 PCR 로 증폭시키는 데 사용되었다.

아가로스 겔로부터 645 bp 단편을 정제하여, 같은 주형상에서 2 번째 PCR 에서 프라이머 Y2 와 함께 메가-프라이머로서 사용했다.

결과적인 약 1080 bp 단편을 제한 효소 BstEII 및 AflIII 로 절단하고, 결과적인 약 510 bp 단편을 정제하고 같은 효소로 절단된 pTVB223 플라스미드와 연결했다. 수용성 Bacillus subtilis SHA273 (저 아밀라제 및 프로테아제) 세포는 연결 및 클로람페니콜 내성 형질전환체로 형질전환되었고 플라스미드상의 올바른 돌연변이의 존재를 증명하기 위해 DNA 서열결정으로 확인했다.

프라이머 B1:

5'CGA TTG CTG ACG CTG TTA TTT GCG 3' (SEQ ID NO: 14)

프라이머 Y2:

5'CTT GTT CCC TTG TCA GAA CCA ATG 3' (SEQ ID NO: 15)

프라이머 101458:

5'GT CAT AGT TGC CGA AAT CTG TAT CGA CTT C 3'(SEQ ID NO:16)

델타(D183-G184)+N195F 를 가진 AA560 α-아밀라제를 코드하는 결과적인 플라스미드를 pTVB232 라 한다.

본 발명의 변이체 제조를 유사한 방식으로 수행할 수 있다.

실시예 12

AA560 변이체의 세척 성능 시험

본 발명의 AA560 변이체의 세척 성능은 실시예 8 에 개시된 대로 시험한다.

실시예 13

AA560 변이체의 비활성도 시험

AA560 변이체의 비활성도를 실시예 7 에 개시된 대로 결정한다.

실시예 14

AA560 변이체의 칼슘 안정성의 시험

AA560 변이체의 칼슘 안정성을 "물질 및 방법"단락에 개시된 분석법을 사용하여 시험한다.

구체예는 본 발명의 몇 가지 구체예의 예시로서 의도된 것이므로 본원에 개시되고 청구된 발명은 본원에 개시된 특정 구체예에 국한되지 않는다. 어떤 등가의 구체예가 본 발명의 범위내로 의도된다. 게다가, 본 발명의 다양한 변형 뿐만 아니라 본원에 나타나고 개시된 것은 전술한 개시로부터 당업자에게 자명할 것이다. 어러한 변형은 또한 첨부된 청구항의 범위내에 속한다. 분쟁의 경우에, 정의를 포함하는 본 개시가 조절될 것이다.

본원에 언급된 다양한 참고문헌, 참고문헌에 수록된 개시가 전체로서 수록된다.

참고문헌

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Ausubel, F. M. et al. (eds.); Current protocols in Molecular Biology; 1995; John Wiley and Sons.

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Diderichsen B., Wedsted U., Hedegaard L., Jensen B. R., Sjmholm C.; Cloning of aldB, which encodes alpha-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis; J.

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SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk A/S <120> <130> <160> 16 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1458 <212> DNA <213> Bacillus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(1458) <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(1458) <400> 1 cac cat aat ggt acg aac ggc aca atg atg cag tac ttt gaa tgg tat 48 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr 1 5 10 15 cta cca aat gac gga aac cat tgg aat aga tta agg tct gat gca agt 96 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser 20 25 30 aac cta aaa gat aaa ggg atc tca gcg gtt tgg att cct cct gca tgg 144 Asn Leu Lys Asp Lys Gly Ile Ser Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 aag ggt gcc tct caa aat gat gtg ggg tat ggt gct tat gat ctg tat 192 Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 gat tta gga gaa ttc aat caa aaa gga acc att cgt aca aaa tat gga 240 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 acg cgc aat cag tta caa gct gca gtt aac gcc ttg aaa agt aat gga 288 Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Asn Ala Leu Lys Ser Asn Gly 85 90 95 att caa gtg tat ggc gat gtt gta atg aat cat aaa ggg gga gca gac 336 Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 gct acc gaa atg gtt agg gca gtt gaa gta aac ccg aat aat aga aat 384 Ala Thr Glu Met Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn 115 120 125 caa gaa gtg tcc ggt gaa tat aca att gag gct tgg aca aag ttt gac 432 Gln Glu Val Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 ttt cca gga cga ggt aat act cat tca aac ttc aaa tgg aga tgg tat 480 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 cac ttt gat gga gta gat tgg gat cag tca cgt aag ctg aac aat cga 528 His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Lys Leu Asn Asn Arg 165 170 175 att tat aaa ttt aga ggt gat gga aaa ggg tgg gat tgg gaa gtc gat 576 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp 180 185 190 aca gaa aac ggt aac tat gat tac cta atg tat gca gat att gac atg 624 Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met 195 200 205 gat cac cca gag gta gtg aat gag cta aga aat tgg ggt gtt tgg tat 672 Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr 210 215 220 acg aat aca tta ggc ctt gat ggt ttt aga ata gat gca gta aaa cat 720 Thr Asn Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His 225 230 235 240 ata aaa tac agc ttt act cgt gat tgg att aat cat gtt aga agt gca 768 Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala 245 250 255 act ggc aaa aat atg ttt gcg gtt gcg gaa ttt tgg aaa aat gat tta 816 Thr Gly Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu 260 265 270 ggt gct att gaa aac tat tta aac aaa aca aac tgg aac cat tca gtc 864 Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val 275 280 285 ttt gat gtt ccg ctg cac tat aac ctc tat aat gct tca aaa agc gga 912 Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly 290 295 300 ggg aat tat gat atg agg caa ata ttt aat ggt aca gtc gtg caa aga 960 Gly Asn Tyr Asp Met Arg Gln Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg 305 310 315 320 cat cca atg cat gct gtt aca ttt gtt gat aat cat gat tcg caa cct 1008 His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro 325 330 335 gaa gaa gct tta gag tct ttt gtt gaa gaa tgg ttc aaa cca tta gcg 1056 Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala 340 345 350 tat gct ttg aca tta aca cgt gaa caa ggc tac cct tct gta ttt tat 1104 Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr 355 360 365 gga gat tat tat ggc att cca acg cat ggt gta cca gcg atg aaa tcg 1152 Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser 370 375 380 aaa att gac ccg att cta gaa gcg cgt caa aag tat gca tat gga aga 1200 Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Arg 385 390 395 400 caa aat gac tac tta gac cat cat aat atc atc ggt tgg aca cgt gaa 1248 Gln Asn Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu 405 410 415 ggg aat aca gca cac ccc aac tcc ggt tta gct act atc atg tcc gat 1296 Gly Asn Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp 420 425 430 ggg gca gga gga aat aag tgg atg ttt gtt ggg cgt aat aaa gct ggt 1344 Gly Ala Gly Gly Asn Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly 435 440 445 caa gtt tgg acc gat atc act gga aat cgt gca ggt act gtt acg att 1392 Gln Val Trp Thr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ala Gly Thr Val Thr Ile 450 455 460 aat gct gat gga tgg ggt aat ttt tct gta aat gga gga tca gtt tct 1440 Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser 465 470 475 480 att tgg gta aac aaa taa 1458 Ile Trp Val Asn Lys 485 <210> 2 <211> 485 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 2 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser 20 25 30 Asn Leu Lys Asp Lys Gly Ile Ser Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Asn Ala Leu Lys Ser Asn Gly 85 90 95 Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Ala Thr Glu Met Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Val Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Lys Leu Asn Asn Arg 165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp 180 185 190 Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met 195 200 205 Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr 210 215 220 Thr Asn Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His 225 230 235 240 Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala 245 250 255 Thr Gly Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu 260 265 270 Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val 275 280 285 Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly 290 295 300 Gly Asn Tyr Asp Met Arg Gln Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg 305 310 315 320 His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro 325 330 335 Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala 340 345 350 Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr 355 360 365 Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser 370 375 380 Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Arg 385 390 395 400 Gln Asn Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu 405 410 415 Gly Asn Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp 420 425 430 Gly Ala Gly Gly Asn Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly 435 440 445 Gln Val Trp Thr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ala Gly Thr Val Thr Ile 450 455 460 Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser 465 470 475 480 Ile Trp Val Asn Lys 485 <210> 3 <211> 1458 <212> DNA 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ggg gga gca gac 336 Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 gct acc gaa atg gtt agg gcg gtt gaa gta aac ccg aat aat aga aat 384 Ala Thr Glu Met Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn 115 120 125 caa gaa gtg tcc ggt gaa tat aca att gag gct tgg aca aag ttt gac 432 Gln Glu Val Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 ttt cct gga cga ggt aat acc cat tca aac ttc aaa tgg aga tgg tat 480 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 cac ttt gat gga gta gat tgg gat cag tca cgt aag ctg aac aat cga 528 His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Lys Leu Asn Asn Arg 165 170 175 att tat aaa ttt aga ggt gat gga aaa ggg tgg gat tgg gaa gtc gat 576 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp 180 185 190 aca gaa aac ggt aac tat gat tac cta atg tat gca gat att gac atg 624 Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met 195 200 205 gat cac cca gag gta gtg aat gag cta aga aat tgg ggt gtt tgg tat 672 Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr 210 215 220 acg aat aca tta ggc ctt gat ggt ttt aga ata gat gca gta aaa cat 720 Thr Asn Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His 225 230 235 240 ata aaa tac agc ttt act cgt gat tgg atc aat cat gtt aga agt gca 768 Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala 245 250 255 act ggc aaa aat atg ttt gcg gtt gcg gaa ttt tgg aaa aat gat tta 816 Thr Gly Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu 260 265 270 ggt gct att gaa aac tat tta aac aaa aca aac tgg aac cat tca gtc 864 Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val 275 280 285 ttt gat gtt ccg ctg cac tat aac ctc tat aat gct tca aaa agc gga 912 Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly 290 295 300 ggg aat tat gat atg agg caa ata ttt aat ggt aca gtc gtg caa aga 960 Gly Asn Tyr Asp Met Arg Gln Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg 305 310 315 320 cat cca atg cat gct gtt aca ttt gtt gat aat cat gat tcg caa cct 1008 His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro 325 330 335 gaa gaa gct tta gag tct ttt gtt gaa gaa tgg ttc aaa cca tta gcg 1056 Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala 340 345 350 tat gct ttg aca tta aca cgt gaa caa ggc tac cct tct gta ttt tat 1104 Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr 355 360 365 gga gat tat tat ggc att cca acg cat ggt gta cca gcg atg aaa tcg 1152 Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser 370 375 380 aaa att gac ccg att cta gaa gcg cgt caa aag tat gca tat gga aga 1200 Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Arg 385 390 395 400 caa aat gac tac tta gac cat cat aat atc att ggt tgg aca cgt gaa 1248 Gln Asn Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu 405 410 415 ggg aat aca gca cac ccc aac tct ggt tta gct act atc atg tcc gat 1296 Gly Asn Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp 420 425 430 gga gca gga gga aat aag tgg atg ttt gtt ggg cgt aat aaa gct ggt 1344 Gly Ala Gly Gly Asn Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly 435 440 445 caa gtt tgg acc gat atc act gga aat cgt gca ggt act gtt acg att 1392 Gln Val Trp Thr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ala Gly Thr Val Thr Ile 450 455 460 aat gct gat gga tgg ggt aat ttt tct gta aat gga gga tca gtt tct 1440 Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser 465 470 475 480 att tgg gta aac aaa taa 1458 Ile Trp Val Asn Lys 485 <210> 4 <211> 485 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 4 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr 1 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser 20 25 30 Asn Leu Lys Asp Lys Gly Ile Ser Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Asn Ala Leu Lys Ser Asn Gly 85 90 95 Ile Gln Val 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degenerated Primer region <400> 5 Gly Ile Thr Ala Xaa Trp Xaa 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <220> <223> Description of Artificial Sequence: degenerated Primer region <400> 6 Val Tyr Xaa Asp Xaa Val Xaa Asn His 1 5 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: degenerated primer region <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <400> 7 Asp Gly Xaa Arg Xaa Asp Ala Xaa Lys His 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: degenerated primer region <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <400> 8 Asp Gly Xaa Arg Xaa Asp Ala Xaa Lys His 1 5 10 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: degenerated Primer region <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(8) <400> 9 Val Thr Phe Val Xaa Asn His Asp 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: degenerated Primer region <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(6) <400> 10 Gly Trp Thr Arg Glu Gly 1 5 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer 188(Pst-) <400> 11 ggcgttaacc gcagcttgta ac 22 <210> 12 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer 188cloningC <400> 12 ccgagctcgg ccggctgggc cgtcgactta tttgtttacc caaatagaaa c 51 <210> 13 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer 188cloningN <400> 13 cattctgcag cagcggcgca ccataatggt acgaacg 37 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer B1 <400> 14 cgattgctga cgctgttatt tgcg 24 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer Y2 <400> 15 cttgttccct tgtcagaacc aatg 24 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer 101458 <400> 16 gtcatagttg ccgaaatctg tatcgacttc 30

Claims

α-아밀라제 활성을 갖고, SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 1 내지 485의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
삭제
제 1 항에 따른 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 서열.
제 3 항의 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터.
제 3 항의 핵산 서열을 포함하는 재조합 숙주 세포.
α-아밀라제 활성을 갖고, SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 1 내지 485의 아미노산 서열을 갖는 모 폴리펩티드의 변이체의 제조 방법으로서,

(a) 모 폴리펩티드를 코드화하는 DNA 서열에 하기:

- R181*/G182*/N195A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- G182*/D183*/N195A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- D183*/G184*/R181A, N, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- D183*/G184*/N195A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- R181*/G182*/I206A, R, D, N, C, E, Q, G, H, V, L, K, M, F, P, S, T, W, Y;

- G182*/D183*/I206A, R, D, N, C, E, Q, G, H, V, L, K, M, F, P, S, T, W, Y;

- D183*/G184*/I206A, R, D, N, C, E, Q, G, H, V, L, K, M, F, P, S, T, W, Y;

- R181*/G182*/E212A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- G182*/D183*/E212A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- D183*/G184*/E212A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V:

- R181*/G182*/E216A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- G182*/D183*/E216A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- D183*/G184*/E216A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- R181*/G182*/K269A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- G182*/D183*/K269A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- D183*/G184*/K269A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- N195A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V

/I206A, R, D, N, C, E, Q, G, H, V, L, K, M, F, P, S, T, W, Y;

- N195A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V

/E212A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V ;

- N195A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V

/E216A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- N195A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V

/K269A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- I206A, R, D, N, C, E, Q, G, H, V, L, K, M, F, P, S, T, W, Y

/E212A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- I206A, R, D, N, C, E, Q, G, H, V, L, K, M, F, P, S, T, W, Y

/E216A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- I206A, R, D, N, C, E, Q, G, H, V, L, K, M, F, P, S, T, W, Y

/K269A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- E212A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V

/E216A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V;

- E212A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V

/K269A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V; 및

- E216A, R, D, N, C, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V

/K269A, R, D, N, C, E, Q, G, H, I, L, M, F, P, S, T, W, Y, V로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 치환 또는 결실을 도입하는 단계;

(b) 단계 (a)에서 얻어진 상기 치환 또는 결실이 도입된 DNA 서열을 숙주 세포에서 발현시키는 단계; 및

(c) 모 폴리펩티드와 비교하여 개선된 세탁 또는 식기 세척 성능을 갖는 변이체 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포를 스크리닝하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 변이체의 제조 방법.
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(a) 폴리펩티드를 코드화하는 제 6 항의 방법에 의해서 제조된 돌연변이체 핵산 서열을 포함하는 균주를 배양하여 폴리펩티드를 포함하는 상청액을 얻는 단계; 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 생산 방법.
(a) 균주를 배양하여 제 1 항의 폴리펩티드를 포함하는 상청액을 얻는 단계; 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제 1 항의 폴리펩티드를 생산하는 방법.
(a) 제 1 항의 폴리펩티드 생산에 적합한 조건하에서, 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구조체를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제 1 항의 폴리펩티드 생산 방법.
제 1 항의 폴리펩티드를 포함하는 세탁 세제 조성물 또는 식기세척 세제 조성물.
제 1 항의 폴리펩티드를 포함하는 풀빼기 조성물.
제 1 항의 폴리펩티드를 사용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 전분의 액화 방법.
제 1 항의 폴리펩티드를 사용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 에탄올 생산 방법.
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