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CN104350149A - 具有蛋白酶活性的多肽在动物饲料和洗涤剂中的用途 - Google Patents

具有蛋白酶活性的多肽在动物饲料和洗涤剂中的用途 Download PDF

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CN104350149A CN201380006499.0A CN201380006499A CN104350149A CN 104350149 A CN104350149 A CN 104350149A CN 201380006499 A CN201380006499 A CN 201380006499A CN 104350149 A CN104350149 A CN 104350149A
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T·霍夫
P·R·厄斯特高
C·舍霍尔姆
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Abstract

本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽以及编码这些多肽的分离的多核苷酸在动物饲料和洗涤剂中的用途。本发明还涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞，连同生产这些多肽以及在例如动物饲料和洗涤剂中使用这些多肽的方法。

Description

具有蛋白酶活性的多肽在动物饲料和洗涤剂中的用途
对序列表的引用
本申请包含一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
发明背景
发明领域
本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽在动物饲料和洗涤剂中的用途。本发明还涉及编码这些蛋白酶的分离的核酸序列在具有蛋白酶活性的分离的多肽的重组产生中的用途以及编码这些蛋白酶的分离的核酸序列。本发明还涉及包含这些核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞(包含植物和动物细胞)，以及生产和使用(尤其在动物饲料和洗涤剂中使用这些蛋白酶)这些蛋白酶的方法。
相关技术说明
S1组以及分离自糖多孢菌的蛋白酶在本领域中是已知的。一种来自红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythrea)的蛋白酶由奥林利克(Oliynyk)等人于2007年披露于‘产生红霉素的细菌红色糖多孢菌NRRL23338的全基因组序列(Complete genome sequence of the erythromycin-producing bacteriumSaccharopolyspora erythraea NRRL23338)’，自然生物技术(Nat.Biotechnol.)25:447-453中。该全基因组序列在登录号AM420293下被提交至EMBL/GenBank。该氨基酸序列(uniprot：A4FNQ0)与SEQ ID NO:2(在此)的序列相同并且成熟的氨基酸序列被披露于SEQ ID NO:5中。
其他S1蛋白酶被披露于现有技术中，例如由帕蒂(Pati)等人于2009年，‘绿色糖单孢菌型菌株(P101T)的全基因组序列(Complete genomesequence of Saccharomonospora viridis type strain(P101T))’，基因组科学标准(Stand.Genomic Sci.)，1:141-149描述的与SEQ ID NO:5具有80.7％的序列一致性的蛋白酶(Uniprot：C7MV18，SEQ ID NO:9)。鑫(Yum)等人已经在‘来自嗜碱链霉菌属的碱性丝氨酸蛋白酶的纯化及表征(Purificationand characterization of alkaline serine protease from an alkalophilic Streptomycessp.)’，生物科学，生物技术以及生物化学(Biosci.Biotechnol.Biochem.)，58:470-474(1994)中描述了一种与SEQ ID NO:5具有70.4％的序列一致性的蛋白酶(Uniprot：Q55353，SEQ ID NO:10)。
卢卡斯(Lucas)等人已经向EMBL/GenBank提交了一种来自新疆糖单孢菌(Saccharomonospora xinjiangensis)XJ-54的与SEQ ID NO:5具有79.6％序列一致性的蛋白酶(Uniprot：I0V8H8，SEQ ID NO:11)并且向向EMBL/GenBank提交了另一种来自深蓝糖单孢菌(Saccharomonosporacyanea)NA-134的与SEQ ID NO:5具有79.0％序列一致性的蛋白酶(Uniprot：H5XEH4，SEQ ID NO:12)。已经向EMBL/GenBank提交了一种来自弱代谢糖单孢菌(Saccharomonospora paurometabolica)YIM90007的与SEQ ID NO:5具有76.1％序列一致性的另外的蛋白酶(Uniprot：G4J6Q2，SEQ ID NO:13)。
在专利文献中，一种来自链霉菌属的与Uniprot：Q55353(在此的SEQ IDNO:10)相同的蛋白酶披露于WO 2005/052146(SEQ ID NO:649，Geneseqp：AEA48820)中并且另一种蛋白酶披露于WO 2005/052161(SEQID NO:649，Geneseqp:AEA80317)中，两者与SEQ ID NO:5均具有70.4％的序列一致性，用于在动物饲料和洗涤剂组合物中使用。其他已知的蛋白酶具有约70％或低于70％的序列一致性。
在动物饲料中使用蛋白酶以改善饲料中蛋白的消化是已知的。涉及一种来自链霉菌属的与SEQ ID NO:2当前指示的蛋白酶具有66％一致性的蛋白酶(链霉菌属1AG3蛋白酶)的WO 2009/058679和US 2009/0111161提及这些蛋白酶在动物饲料中的用途。WO 95/28850披露了一种肌醇六磷酸酶与一种或多种微生物蛋白水解酶组合以改善植物性蛋白的溶解度。WO 01/58275披露了枯草杆菌蛋白酶家族的酸稳定性蛋白酶在动物饲料中的用途。WO 01/58276披露了与以下蛋白酶相关的酸稳定性蛋白在动物饲料中的用途：衍生自拟诺卡菌NRRL 18262(10R蛋白酶)的蛋白酶，连同衍生自白拟诺卡氏菌DSM 14010的一种蛋白酶。WO 04/072221、WO 04/111220、WO 04/111223、WO05/035747、和WO 05/123911披露了与10R蛋白酶相关的蛋白酶及其在动物饲料中的用途。另外，WO 04/072279披露了其他蛋白酶在动物饲料中的用途。
WO 04/034776披露了一种枯草杆菌蛋白酶/角蛋白酶，来自地衣芽孢杆菌的PWD-1，在家禽饲料中的用途。WO 04/077960披露了一种通过采用一种细菌或真菌蛋白酶增加草料或谷物在反刍动物中的消化率的方法。
包含一种蛋白酶的并且销售以用于在动物饲料中使用的商业产品包含ProAct(DSM NP/诺维信公司(Novozymes))、(丹尼斯克公司(Danisco))、(丹尼斯克公司)、(丹尼斯克公司)、AllzymeTM(奥特奇公司(Alltech))、(生物资源有限公司(BioResources,Int.)、PoultrygrowTM(杰夫公司(Jefo))和(诺伟思公司(Novus))。
发明概述
发明背景
在动物饲料中使用蛋白酶(体内)，和/或这类的蛋白酶用于处理植物性蛋白(体外)的用途中，注意的是蛋白对于动物和人类是必需营养因子。大部分家畜和许多人从植物性蛋白来源获得这些必需蛋白。重要的植物性蛋白来源是例如油籽作物、豆类和谷类。
当例如大豆粉包含在单胃动物如猪和家禽的饲料中时，相当比例的大豆饼粉固体未被有效地消化(在小猪、生长猪和家禽如肉仔鸡、蛋鸡和公鸡中的表观回肠蛋白消化率仅是80％左右)。
动物的胃肠道是由一系列各自呈现不同pH环境的段组成。在单胃动物如猪和家禽以及许多鱼中，胃展现了低至pH1-2的强酸性pH，而肠展现了在pH6-7范围内的一个更中性的pH。除了胃和肠之外在胃之前家禽还具有一个嗉囊，该嗉囊中的pH主要取决于咽下的饲料并因此典型地处于pH4-6的范围内。通过一种蛋白酶消化蛋白可发生在整个消化道中，假如该蛋白酶是有活性的并存活于该消化道的条件下的话。因此，以下这样的蛋白酶是特别令人希望的：它是高度地酸稳定的以在胃环境中存活，并且同时在靶动物的宽的生理pH下是有效地有活性的。
另外，动物饲料常常是以丸形式配制的，其中在该造丸过程中采用蒸汽。因此以下也是令人希望的，在动物饲料中使用的蛋白酶能在暴露于蒸汽处理之后保持活性。
多年以来，蛋白酶也被用在洗涤剂组合物中用于水解纺织品、硬质表面和其他表面(例如皮肤等)上的朊材料。这类洗涤剂组合物可通过粉末、片或肥皂条以手洗或自动化机器的方式用于纺织品的清洁中，以及作为粉末和片通过手工或机器的方式用在餐具洗涤中。
本发明的新颖的S1蛋白酶变体对于这些目的也是有用的。
为了生产用于工业使用的蛋白酶，重要的是生产高产量的蛋白酶，使得可获得足够量的该产品以能够以有利的价格提供该蛋白酶。
本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽在动物饲料和洗涤剂中的用途，这些分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:5具有至少80％序列一致性的多肽；
(b)由在高严谨度条件或非常高严谨度条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码的多肽：
(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；
(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列；
(iii)(i)或(ii)的全长互补链；
(c)由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少80％序列一致性的多核苷酸编码的多肽；
(d)包含SEQ ID NO:5的一个或多个(若干个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体；以及
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。
本发明还涉及具有蛋白酶活性并且与SEQ ID NO:5具有至少85％序列一致性的、包含SEQ ID NO:5或同源序列的至少一个或多个(若干个)氨基酸的至少一个取代、缺失和/或插入的变体多肽。
本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸、包含这些多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体、以及重组宿主细胞，并且涉及重组地产生这些多肽的方法。
本发明还涉及用于制备一种用于在动物饲料中使用的组合物以提高动物饲料的营养价值的方法，以及处理蛋白以在动物饲料组合物中使用的方法。
此外，本发明还涉及包含这些蛋白酶的洗涤剂组合物。
附图简要说明
在附图中：
图1示出了与10R蛋白酶相比，来自红色糖单孢菌(Saccharomonosporaerythraea)的S1蛋白酶1对Suc-AAPF-pNA底物的pH-活性曲线，
图2示出了与10R蛋白酶相比，来自红色糖单孢菌的S1蛋白酶1在37℃下2小时之后的pH稳定性曲线(残余活性)，
图3示出了与10R蛋白酶相比，来自红色糖单孢菌的S1蛋白酶1在pH7.0下对Protazyme AK的温度活性曲线，
图4示出了与10R蛋白酶相比，来自红色糖单孢菌的S1蛋白酶1在pH9.0下对10种Suc-AAPF-pNA底物的P1-特异性，
图5示出了与10R蛋白酶相比，来自红色糖单孢菌的S1蛋白酶1在pH3.0、4.0、5.0、6.0以及7.0(40℃)下对大豆-玉米粉的pH活性。
序列表综述
SEQ ID NO:1是如从自红色糖多孢菌分离的DNA序列。
SEQ ID NO:2是如从SEQ ID NO:1演绎的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是用于重组产生来自红色糖多孢菌的S1蛋白酶1的合成DNA序列。
SEQ ID NO:4是如从SEQ ID NO:3演绎的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是来自红色糖多孢菌的成熟S1蛋白酶1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6是迟缓芽孢杆菌分泌信号。
SEQ ID NO:7是10R蛋白酶(WO 05/035747，SEQ ID NO:1)的DNA序列。
SEQ ID NO:8是10R蛋白酶(WO 05/035747，SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9是来自绿色糖单孢菌(UNIPROT：C7MV18)的丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10是来自链霉菌属(UNIPROT：Q55353)的丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11是来自新疆糖单孢菌XJ-54(UNIPROT：I0V8H8)的丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12是来自深蓝糖单孢菌NA-134(UNIPROT：H5XEH4)的丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13是来自弱代谢糖单孢菌YIM90007(UNIPROT：G4J6Q2)的丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列。
序列的一致性矩阵
定义
具有蛋白酶活性的多肽：具有蛋白酶活性的多肽、或蛋白酶有时还被指定为肽酶、朊酶、肽水解酶或蛋白水解酶。蛋白酶可以是在其任一端开始水解肽的外切型蛋白酶或在多肽链内部发挥作用的内切型蛋白酶(内肽酶)。内肽酶对N-和C-末端被封闭的肽底物显示出活性，该底物与所讨论的蛋白酶的特异性有关。
本文将术语“蛋白酶”定义为水解肽键的酶。蛋白酶的定义也适用于如此处使用的术语“母体蛋白酶”和“蛋白酶变体”的蛋白酶部分。术语“蛋白酶”包含属于EC3.4酶组(包含其13个亚类中的每一个)的任何酶。该EC编号指的是酶命名法(Enzyme Nomenclature)，1992来自NC-IUBMB，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥，加利福尼亚，包含增刊1-5，各自发表于欧洲生物化学杂志(Eur.J.Bio-chem.)1994,223,1-5；欧洲生物化学杂志1995,232,1-6；欧洲生物化学杂志1996,237,1-5；欧洲生物化学杂志1997,250,1-6；以及欧洲生物化学杂志1999,264,610-650。命名定期得以增补和更新；参见例如万维网(WWW)于http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。
本发明提供了具有蛋白酶活性的多肽在动物饲料和洗涤剂组合物中的用途。本发明还提供了具有蛋白酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明的蛋白酶是S1肽酶家族的丝氨酸蛋白酶。本发明的蛋白酶展现了出人意料的pH特性，尤其是pH稳定性特性，这使得它们成为用于在动物饲料中使用的感兴趣的候选物。本发明的蛋白酶因此在从pH4-11的广范围内对Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA具有活性并且在范围pH6-11中展现尤其高的活性，在从pH3-7的广生理pH范围内对饲料相关的大豆粉-玉米粉底物具有活性并且经受低至2的pH2小时后仍保留多于80％活性。
本发明的和根据本发明使用的蛋白酶选自下组，该组由以下各项组成：
(a)属于EC3.4.21酶组的蛋白酶；和/或
(b)S1肽酶家族的丝氨酸蛋白酶；
如在生物化学杂志(Biochem.J.)290:205-218(1993)和在MEROPS蛋白酶数据库，发行9.4(2011年1月31日)(www.merops.ac.uk)中所述的。该数据库描述于罗林斯(Rawlings)，N.D.,巴雷特(Barrett)，A.J.&贝特曼(Bateman)，A.(2010)‘MEROPS：肽酶数据库(MEROPS:thepeptidase database)’，核酸研究(Nucleic Acids Res)38，D227-D233中。
本发明的蛋白酶是内肽酶(EC3.4.21)。存在若干蛋白酶活性类型：三种主要的活性类型是：胰蛋白酶样，其中存在P1处Arg或Lys后酰胺底物的切割；糜蛋白酶样，其中切割发生在P1处疏水性氨基酸中的一个之后；以及弹性蛋白酶样，在P1处Ala之后切割。
本发明的这些多肽具有SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、以及至少100％的蛋白酶活性。
更确切地说，在本发明中使用的这些蛋白酶是在位置P1处优选疏水性芳香族氨基酸残基的那些。
为了测定给定蛋白酶是否为丝氨酸蛋白酶和S1家族的蛋白酶，可参考上述手册和其中述及的原理。可对所有蛋白酶类型进行确定，而不论其是天然或野生型蛋白酶，还是经基因工程改造或合成的蛋白酶。
S1家族的肽酶以该顺序含有催化三联体His、Asp和Ser。该催化三联体的任意氨基酸的突变将导致酶活性的变化或损失。如从红色糖多孢菌(SEQ IDNO:5)分离的S1蛋白酶1的催化三联体的氨基酸可能是位置His-35、Asp-63和Ser-144。
可使用任何测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包含与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。pH测定和温度测定同样适用于所讨论的蛋白酶。pH值测定的实例是pH2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12。测定温度的实例是15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃、90℃或95℃。普通蛋白酶底物的实例是酪蛋白、牛血清白蛋白以及血红蛋白。在经典的安森(Anson)和米尔斯基(Mirsky)方法中，将变性的血红蛋白用作底物并且在用所讨论的蛋白酶孵育测定后，确定三氯乙酸可溶的血红蛋白的量用作蛋白酶活性的量度(安森(Anson)，M.L.和米尔斯基(Mirsky)，A.E.,1932，普通生理学杂志(J.Gen.Physiol.)16:59以及安森(Anson)，M.L.,1938，普通生理学杂志(J.Gen.Physiol.)22:79)。
用于本发明的目的，使用描述于“材料与方法”中的测定确定蛋白酶活性，如动力学Suc-AAPF-pNA测定、Protazyme AK测定、动力学Suc-AAPX-pNA测定以及邻苯二甲醛(OPA)。对于Protazyme AK测定，当用该蛋白酶孵育时，不可溶Protazyme AK(天青精-交联的酪蛋白)底物释放蓝色并且确定该颜色作为蛋白酶活性的量度。对于Suc-AAPF-pNA测定，当用该蛋白酶孵育时，无色的Suc-AAPF-pNA底物释放黄色的对硝基苯胺并且确定该黄色作为蛋白酶活性的量度。
等位基因变体：术语“等位基因变体”意思指占据同一染色体基因座的一个基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽中无改变)，或可以编码出具有改变的氨基酸序列的多肽。一种多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的一种多肽。
cDNA：术语“cDNA”意思指可以通过得自真核细胞的，从成熟的、剪接的mRNA分子的反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏内含子序列，这些序列可以存在于相应的基因组DNA中。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
编码序列：术语“编码序列”是指多核苷酸，其直接明确多肽的氨基酸序列。编码序列的边界通常由一个开放阅读框确定，通常始于ATG起始密码子或替代起始密码子如GTG和TTG，并以终止密码子如TAA、TAG、和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成或重组多核苷酸。
控制序列：术语“控制序列”意指表达编码本发明的多肽的多核苷酸所需的所有元件。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸而言可以是天然的或外来的，或对于彼此而言是天然的或外来的。这类控制序列包含但不限于一个前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，该控制序列包含一个启动子，以及转录和翻译终止信号。该控制序列可配备有接头，目的是引入特异性限制性位点，促进这些控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区域的连接。
表达：术语“表达”包括在多肽的产生中涉及的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”是指包括编码多肽的多核苷酸并且可操作地与提供了其表达的额外的核苷酸相连接的线性或环状DNA分子。
片段：术语“片段”意指使一个或多个(若干个)氨基酸从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失的多肽，其中该片段具有蛋白酶活性。在一个方面，一个片段含有至少169个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸10至178)或至少179个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸5至183)；或相应地，对于SEQ ID NO:4而言，一个片段含有至少169个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:4的氨基酸10至178)或至少179个氨基酸残基(例如，SEQID NO:4的氨基酸5至183)；或相应地，对于SEQ ID NO:5而言，一个片段含有至少169个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:5的氨基酸10至178)或至少179个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:5的氨基酸5至183)。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指容易被包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”包含母体细胞的与其不完全相同的任何子代，这种不同归因于发生在复制期间的突变。
分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”意指被人工修饰的多核苷酸，相对于在自然中发现的多核苷酸。在一个方面，该分离的多核苷酸是至少1％纯的，例如至少5％纯的，更多至少10％纯的，至少20％纯的，至少40％纯的，至少60％纯的，至少80％纯的，至少90％纯的，以及至少95％纯的，如通过琼脂糖电泳所确定的。该多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或其任意组合。
分离的多肽：术语“分离的多肽”意思指相对于在自然界中发现的那一多肽通过人工修饰的与其他组分如其他多肽、次级代谢产物、盐等掺合的多肽。在一个方面，该多肽是至少1％纯的，例如至少5％纯的，至少10％纯的，至少20％纯的，至少40％纯的，至少60％纯的，至少80％纯的，以及至少90％纯的，如通过SDS-PAGE所确定的。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意思指在翻译和任何翻译后修饰(如N-端加工、C-端截短、糖基化、磷酸化等)之后处于其最终形式的多肽。在一个方面，基于还预测SEQ ID NO:2的-183至-157是一个信号肽的SignalP(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程(Protein Engineering)10:1-6)预测程序，该成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至190。在另一方面，基于使用埃德曼(Edman)降解和整体分子量分析的测序，该成熟多肽是SEQ ID NO:4的氨基酸1至190。SEQ ID NO:4的氨基酸-184至-157是Savinase信号肽。本领域已知，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽的混合物(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达一种多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生一种不同的成熟多肽(例如，具有一个不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。
成熟多肽编码序列：术语“成熟肽编码序列”意指编码一种具有蛋白酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，基于还预测SEQ ID NO:1的核苷酸1至84编码信号肽的SignalP(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程(Protein Engineering)10:1-6)预测程序，该成熟多肽编码序列是SEQ IDNO:1的核苷酸553至1122。在另一方面，基于使用该成熟多肽的埃德曼降解和整体分子量分析的测序，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:3的核苷酸550至1119。SEQ ID NO:3的核苷酸1至81编码Savinase信号肽。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意思指从天然存在的基因中分离的、或以自然界中不会另外出现的方式被修饰成包含核酸区段的、或合成的单链或双链的核酸分子。当核酸构建体包含表达本发明的编码序列所需的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构造，其中控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置处，这样使得控制序列指导编码序列的表达。
序列一致性：用参数“序列一致性”来描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性的程度，如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的。所使用的这些任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(尼德曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性的程度，如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，见上文)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的。使用的任选参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的脱氧核糖核酸×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
严谨度条件：不同的严谨度条件定义如下。
术语“非常低严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹(Southern blotting)程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在45℃使用2X SSC，0.2％SDS将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
术语“低严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在50℃使用2X SSC，0.2％SDS将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
术语“中严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在55℃使用2X SSC，0.2％SDS将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
术语“中-高严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在60℃使用2X SSC，0.2％SDS将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
术语“高严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在65℃使用2X SSC，0.2％SDS将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
术语“非常高严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在70℃使用2X SSC，0.2％SDS将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸，其中该子序列编码具有蛋白酶活性的一个片段。在一个方面，一个子序列含有至少507个核苷酸(例如SEQ IDNO:1的核苷酸580至1086)，或至少537个核苷酸(例如SEQ ID NO:1的核苷酸565至1101)。在另一个方面，一个子序列含有至少507个核苷酸(例如SEQ ID NO:3的核苷酸577至1083)，或至少537个核苷酸(例如SEQ ID NO:3的核苷酸562至1098)。
基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”意指不含其他外部或不想要的核苷酸并且处在适用于基因工程化多肽生产系统内部的形式下的多核苷酸制剂。因而，基本上纯的多核苷酸包含按重量计最多10％、最多8％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％、最多1％和最多0.5％与该多核苷酸天然或重组结合的其他多核苷酸物质。然而，基本上纯的多核苷酸可以包含天然存在的5'和3'非翻译区，如启动子和终止子。优选地，该多核苷酸是按重量计至少90％纯的，例如至少92％纯的、至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、以及至少99.5％纯的。本发明的多核苷酸优选地处于基本上纯的形式。
基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”意指按重量计包含最多10％、最多8％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％、最多1％和最多0.5％与该多肽天然或重组结合的其他多肽物质的制剂。优选地，按在该制剂中存在的总多肽物质的重量计，该多肽是至少92％纯的，例如至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％、至少99.5％纯的、和100％纯的。本发明的多肽优选地处于基本上纯的形式。这可以例如通过熟知的重组方法或通过经典纯化方法制备该多肽来实现。
变体：术语“变体”意思指具有蛋白酶活性并且与SEQ ID NO:5具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性，在一个或多个(若干个)位置处包含一个或多个(若干个)氨基酸残基的改变(即取代、插入和/或缺失)的多肽。取代意指将占据某个位置的氨基酸替换为不同的氨基酸；缺失意指去除占据1-5个位置的例如1-5个氨基酸残基；并且插入意指邻近占据某个位置的氨基酸添加例如1-5个氨基酸。本发明的这些变体具有SEQ ID NO:5的多肽的至少20％、例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的蛋白酶活性。变体还可以是一种与SEQ ID NO:5具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性的天然存在的蛋白酶。
发明详细说明
具有蛋白酶活性的多肽
本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽在动物饲料或洗涤剂中的用途，这些分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)与SEQ ID NO:5具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多肽；
(b)由在高严谨度条件、或非常高严谨度条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码的多肽：
(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；
(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列；
(iii)(i)或(ii)的全长互补链；
(c)由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸编码的多肽；和/或
(d)包含SEQ ID NO:5的一个或多个(若干个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体；以及
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。
本发明涉及分离的多肽在动物饲料或洗涤剂中的用途，这些分离的多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性，这些分离的多肽具有蛋白酶活性。在一个方面，这些多肽与SEQ IDNO:2的成熟多肽相差不多于三十六个氨基酸，例如相差三十个氨基酸、相差二十五个氨基酸、相差二十个氨基酸、相差十五个氨基酸、相差十个氨基酸、相差九个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七个氨基酸、相差六个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
本发明还涉及分离的多肽在动物饲料或洗涤剂中的用途，这些分离的多肽与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性，这些分离的多肽具有蛋白酶活性。在一个方面，这些多肽与SEQ IDNO:4的成熟多肽相差不多于三十六个氨基酸，例如相差三十个氨基酸、相差二十五个氨基酸、相差二十个氨基酸、相差十五个氨基酸、相差十个氨基酸、相差九个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七个氨基酸、相差六个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
本发明进一步涉及分离的多肽在动物饲料或洗涤剂中的用途，这些分离的多肽与SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性，这些分离的多肽具有蛋白酶活性。在一个方面，这些多肽与SEQ ID NO:5的成熟多肽相差不多于三十六个氨基酸，例如相差三十个氨基酸、相差二十五个氨基酸、相差二十个氨基酸、相差十五个氨基酸、相差十个氨基酸、相差九个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七个氨基酸、相差六个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
本发明的一个实施例是用于在动物饲料或洗涤剂中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少80％序列一致性。
本发明的一个实施例是用于在动物饲料或洗涤剂中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少82％序列一致性。
本发明的一个实施例是用于在动物饲料或洗涤剂中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少84％序列一致性。
本发明的一个实施例是用于在动物饲料或洗涤剂中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少85％序列一致性。
本发明的一个实施例是用于在动物饲料或洗涤剂中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少86％序列一致性。
本发明的一个实施例是用于在动物饲料或洗涤剂中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少87％序列一致性。
本发明的一个实施例是用于在动物饲料或洗涤剂中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少88％序列一致性。
本发明的一个实施例是用于在动物饲料或洗涤剂中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少89％序列一致性。
本发明的一个实施例是用于在动物饲料或洗涤剂中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少90％序列一致性。
本发明的一个实施例是用于在动物饲料或洗涤剂中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少91％序列一致性。
本发明的一个实施例是用于在动物饲料或洗涤剂中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少92％序列一致性。
本发明的一个实施例是用于在动物饲料或洗涤剂中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少93％序列一致性。
本发明的一个实施例是用于在动物饲料或洗涤剂中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少94％序列一致性。
本发明的一个实施例是用于在动物饲料或洗涤剂中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少95％序列一致性。
本发明的一个实施例是用于在动物饲料或洗涤剂中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少96％序列一致性。
本发明的一个实施例是用于在动物饲料或洗涤剂中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少97％序列一致性。
本发明的一个实施例是用于在动物饲料或洗涤剂中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少98％序列一致性。
本发明的一个实施例是用于在动物饲料或洗涤剂中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有至少99％序列一致性。
本发明的一个实施例是用于在动物饲料或洗涤剂中使用的一种多肽或一种由多核苷酸编码的多肽，该多肽与SEQ ID NO:5的多肽具有100％序列一致性。
有待在本发明中使用的多肽优选地包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是从N端和/或C端缺失例如30、25、20、15、10或5个氨基酸并具有蛋白酶活性的片段。在另一个方面，该多肽包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5或由其组成。在另一个优选的方面，该多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至190、SEQ ID NO:4的氨基酸1至190和/或SEQ ID NO:5的氨基酸1至190或由其组成。
本发明还涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽，这些分离的多肽由多核苷酸编码，该多核苷酸在高严谨度条件或非常高严谨度条件下与(i)SEQ IDNO:1的成熟多肽编码序列、(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补链杂交(J.萨姆布鲁克(Sambrook)，E.F.弗里奇(Fritsch)和T.马尼亚蒂斯(Maniatis)，1989，分子克隆实验手册(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港，纽约)。
SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:3的多核苷酸或其子序列以及SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其片段可以用于设计核酸探针，用以根据本领域中众所周知的方法从不同属或种的菌株中鉴定并且克隆出编码具有蛋白酶活性的多肽的DNA。具体而言，这类探针可以用于按照标准DNA印迹程序与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以便鉴定并分离其中的相应基因。这类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少14，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针二者均可使用。典型地将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白)，以检测相对应的基因。这类探针涵盖于本发明中。
可以筛选从这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库的与上述探针杂交并编码具有蛋白酶活性的多肽的DNA。来自这类其他菌株的基因组或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3同源的克隆或DNA或其子序列，优选地在DNA印迹中使用载体材料。
出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸在高至非常高严谨度条件下与标记的核酸探针杂交，该标记的核酸探针对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列；其全长互补链；或其子序列。在这些条件下，核酸探针杂交的分子可以使用例如X射线胶片而进行检测。
在一个方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列。在另一个方面，该核酸探针是其片段。在另一个方面，该核酸探针是编码SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5的多肽或其片段的多核苷酸。在另一个优选的方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针而言，高至非常高严谨度条件定义为最佳地按照标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA中，以及对于非常低和低严谨度在25％甲酰胺中，对于中和中-高严谨度在35％甲酰胺中，或对于高和非常高严谨度在50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。在65℃(高严谨度)和在70℃(非常高严谨度)使用2X SSC，0.2％SDS将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短的探针而言，严谨度条件被定义为最佳地按照标准DNA印迹程序，在比使用根据博尔顿(Bolton)和麦卡锡(McCarthy)(1962，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)48:1390)的计算计算的Tm低约5℃至约10℃下，在0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl(pH7.6)、6mM EDTA、0.5％NP-40、1X登哈特氏溶液(Denhardt's solution)、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mM ATP、以及每ml 0.2mg的酵母RNA中预杂交和杂交12至24小时。最后将载体材料在计算的Tm以下5℃至10℃，在6X SCC加0.1％SDS中洗涤1次持续15分钟并且使用6X SSC洗涤2次，每次15分钟。
本发明还涉及分离的多肽在动物饲料或洗涤剂中的用途，这些分离的多肽具有蛋白酶活性，由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸编码。
本发明进一步涉及分离的多肽在动物饲料或洗涤剂中的用途，这些分离的多肽具有蛋白酶活性，由与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性的多核苷酸编码。
在具体实施例中，本发明和根据本发明使用的母体蛋白酶和/或蛋白酶变体选自下组，该组由以下各项组成：
(a)属于EC3.4.21.酶组的蛋白酶；以及
(b)S1肽酶家族的丝氨酸蛋白酶；如在生物化学杂志(Biochem.J.)290:205-218(1993)和在MEROPS蛋白酶数据库，发行9.5(www.merops.ac.uk)中所述的。该数据库描述于罗林斯(Rawlings)，N.D.,巴雷特(Barrett)，A.J.&贝特曼(Bateman)，A.(2010)MEROPS：肽酶数据库(MEROPS:the peptidase database).核酸研究(Nucleic Acids Res)38,D227-D233中。
为了测定给定蛋白酶是否为丝氨酸蛋白酶和S1家族的蛋白酶，可参考上述手册和其中述及的原理。可对所有蛋白酶类型进行确定，而不论其是天然或野生型蛋白酶，还是经基因工程改造或合成的蛋白酶。
本发明还涉及具有蛋白酶活性并且与SEQ ID NO:5具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性、包含SEQ ID NO:5或其同源序列的至少一个或多个(若干个)氨基酸的至少一个取代、缺失和/或插入的变体多肽。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少86％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少87％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少88％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少89％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少90％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少91％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少92％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少93％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少94％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少95％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少96％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少97％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少98％序列一致性。
在一个实施例中，本发明的变体多肽可以与SEQ ID NO:5具有至少99％序列一致性。
在另一实施例中，具有氨基酸取代、缺失和/或插入的本发明的变体多肽(SEQ ID NO:5)的位置总数不多于27，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27。氨基酸变化可以是一种次要性质的变化，即并不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地具有一个到约30个氨基酸的小缺失；小氨基-或羧基-末端延伸，如一种氨基-末端蛋氨酸残基；具有至多约20-25个残基的一种小连接肽；或通过改变净电荷促进纯化或另一种功能的一种小延伸，如一种聚组氨酸段、一种抗原表位或一种结合域。
在另一个实施例中，本发明还涉及用于在动物饲料或洗涤剂中使用的变体，这些变体包含SEQ ID NO:2或其同源序列的一个或多个(或若干个)氨基酸取代、缺失和/或插入。在SEQ ID NO:2中具有氨基酸取代、缺失和/或插入的位置总数不多于36，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36。氨基酸变化可以是一种次要性质的变化，即并不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地具有一个到约30个氨基酸的小缺失；小氨基-或羧基-末端延伸，如一种氨基-末端蛋氨酸残基；具有至多约20-25个残基的一种小连接肽；或通过改变净电荷促进纯化或另一种功能的一种小延伸，如一种聚组氨酸段、一种抗原表位或一种结合域。
在另一个实施例中，本发明还涉及用于在动物饲料或洗涤剂中使用的变体，这些变体包含SEQ ID NO:4或其同源序列的一个或多个(或若干个)氨基酸取代、缺失和/或插入。在SEQ ID NO:4中具有氨基酸取代、缺失和/或插入的位置总数不多于36，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36。氨基酸变化可以是一种次要性质的变化，即并不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地具有一个到约30个氨基酸的小缺失；小氨基-或羧基-末端延伸，如一种氨基-末端蛋氨酸残基；具有至多约20-25个残基的一种小连接肽；或通过改变净电荷促进纯化或另一种功能的一种小延伸，如一种聚组氨酸段、一种抗原表位或一种结合域。
在另一个实施例中，本发明还涉及用于在动物饲料或洗涤剂中使用的变体，这些变体包含SEQ ID NO:5或其同源序列的一个或多个(或若干个)氨基酸取代、缺失和/或插入。在SEQ ID NO:5中具有氨基酸取代、缺失和/或插入的位置总数不多于36，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36。氨基酸变化可以是一种次要性质的变化，即并不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地具有一个到约30个氨基酸的小缺失；小氨基-或羧基-末端延伸，如一种氨基-末端蛋氨酸残基；具有至多约20-25个残基的一种小连接肽；或通过改变净电荷促进纯化或另一种功能的一种小延伸，如一种聚组氨酸段、一种抗原表位或一种结合域。
保守取代的实例是在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)的组内。一般不改变比活性的氨基酸取代是本领域中已知的，并且(例如)由H.纽拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979年在蛋白(The Proteins)(学术出版社(Academic Press)，纽约(New York))中描述。最常发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。
可替代地，氨基酸改变具有改变多肽的物理化学特性的这样一种性质。例如，氨基酸改变可以改善多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变pH最佳值等。一种母体多肽中的必需氨基酸可以根据本领域中已知的程序来识别，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁安(Cunningham)和韦尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)。在后一种技术中，将单个丙氨酸突变在分子中的每个残基处引入，并且对所产生的突变体分子测试蛋白酶活性以鉴定对该分子活性至关重要的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。酶的活性位点或其他生物学相互作用也可以通过对结构进行物理学分析来确定，如通过此类技术如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记，与假定接触位点氨基酸的突变相结合所确定的。参见，例如，德弗斯(de Vos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.)309:59-64。还可以从与母体多肽相关的多肽的一致性分析推断必需氨基酸的一致性。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625披露的那些。其他可以使用的方法包含易错PCR、噬菌体展示(例如洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量、自动筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆、诱变的多肽的活性(内丝(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)l7:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的一部分在另一种多肽的一部分的N-末端或-C末端处融合。
该多肽还可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明的多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明多核苷酸融合而产生融合多肽。产生融合多肽的技术是本领域中已知的，并且包含连接编码多肽的编码序列，以使得它们同框，并且融合多肽的表达受到相同的一种或多种启动子和终止子的控制。融合蛋白还可以使用内蛋白技术构建，其中融合在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学266:776-779)。
融合多肽可以进一步包含两个多肽之间的一个切割位点。在融合蛋白分泌之后，该位点被切割，从而释放出这两个多肽。切割位点的实例包含但不限于在以下披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物学与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯韦蒂娜(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；罗斯默森-威尔森(Rasmussen-Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯-雷西(Collins-Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白：结构、功能与遗传学(Proteins:Structure,Function,and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，世界药物发现(Drug Discovery World)4:35-48。
实施方式
在本发明的某些实施例中，本发明的蛋白酶展现了有益的热特性如热稳定性、蒸汽稳定性等，和/或有益的pH特性如酸稳定性、pH最佳值等。
本发明的一个实施例是与蛋白酶10R相比在25℃下，在pH6与9之间，例如在pH6下、例如在pH8下、例如在pH9下，具有改善的蛋白酶活性的用于在动物饲料和洗涤剂中使用的分离的多肽。
本发明的另一实施例是与蛋白酶10R相比在37℃下，在pH2下或在pH11下，具有改善的稳定性的用于在动物饲料和洗涤剂中使用的分离的多肽。
本发明的另一个实施例是与蛋白酶10R相比在40℃下，在pH3.0与7.0之间，例如在pH5.0与pH7.0之间，例如在pH5.0、6.0或7.0下，对大豆-玉米粉具有改善的蛋白酶活性的用于在动物饲料和洗涤剂中使用的分离的多肽。
本发明的另一实施例是当与空白相比时，在3小时后具有改善的被表示为作物中伯胺的水平的肉仔鸡消化物的蛋白水解活性的用于在动物饲料和洗涤剂中使用的分离的多肽。
酸度/碱度特性
在本发明的某些实施例中，本发明的蛋白酶展现了关于pH的有益的特性，如酸稳定性、pH最佳值等。该蛋白酶在一个低的pH下的稳定性是有益的，这样一来该蛋白酶可以在穿越胃之后在肠中具有活性。在本发明的一个实施例中，该蛋白酶在pH2下2小时之后保持了>95％的活性，如使用实例3中所述的方法确定的。
pH-活性特性
可以如在实例3中所述的确定该蛋白酶的pH-活性曲线。在pH6-8下的活性对于蛋白质在动物的肠中的消化可以是有利的。
在一个实施例中，本发明包含在25℃下，当与蛋白酶在pH10下的活性相比时，具有在pH8下的相对活性为0.7或更高的pH-活性曲线的用于在动物饲料中使用的蛋白酶(比较实例3)。
热稳定性
可如在实例6中所述的确定热稳定性，即使用DSC测量来确定经纯化的蛋白酶蛋白的变性温度(Td)。Td指示了该蛋白的热稳定性：Td越高，热稳定性越高。因此，在一个优选的实施例中，本发明的蛋白酶具有一个Td，该Td高于参照蛋白酶的Td，其中该Td是在经纯化的蛋白酶样品(优选地具有至少90％或95％的纯度，如通过SDS-PAGE确定的)上确定的。
在优选实施例中，如通过残余活性，变性温度Td所提供的这些热特性(例如加热稳定性、温度稳定性、热稳定性、蒸汽稳定性和/或造丸稳定性)，或本发明的蛋白酶的其他参数高于SEQ ID NO:5的蛋白酶的相应的值(如残余活性或Td)，更优选地是它的至少101％，或者它的至少102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、或至少110％。甚至更优选地，本发明的蛋白酶的参数(如残余活性或Td)的值是SEQ ID NO:5的蛋白酶的值的至少120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、或至少190％。
在仍另外的具体实施例中，本发明的热稳定蛋白酶具有至少50℃的熔化温度Tm(或变性温度Td)，如使用实例10(即在20mM乙酸钠，pH值4.0)中所述的差示扫描量热法(DSC)所确定的。在仍另外的具体实施例中，该Tm是至少51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或至少100℃。
蒸汽稳定性
蒸汽稳定性可以如在实例7中所述的通过确定在85℃或90℃下蒸汽处理一个短的时间之后蛋白酶分子的残余活性来确定。
造丸稳定性
造丸稳定性可如在实例8中所述的通过使用与饲料预混合的酶颗粒来确定。由该混合器用蒸汽将该饲料调节至95℃。在调节之后，将该饲料加压成丸并确定残余活性。
具有蛋白酶活性的多肽的来源
可以从任何属的微生物获得具有蛋白酶活性且有待根据本发明而使用的多肽。为了本发明的目标，结合给定来源，如在此使用，术语“获得自”应指由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的株系产生的多核苷酸编码的多肽。在一个方面中，获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。
该多肽可以是细菌多肽。例如，该多肽可以是具有蛋白酶活性的来自例如放线菌门内的一种革兰氏阳性细菌或来自例如变形菌门内的一种革兰氏阴性细菌的多肽。
在一个方面，该多肽是来自放线菌纲，例如来自放线菌目，或来自假诺卡氏菌亚目(Pseudonocardineae)，或来自假诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)，或来自糖多孢菌属，或来自红色糖多孢菌种的细菌的蛋白酶。
将理解的是，对于以上提到的物种而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态(perfect and imperfect states)二者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而不管它们已知的物种名称是什么。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。
这些分类单元的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。
可以使用上述探针，鉴定多肽并从其他来源包含从自然界(例如，土壤、堆肥、水，等等)分离的微生物获得该多肽。用于从自然生境分离微生物的技术是本领域熟知的。随后可以通过类似地筛选另一种微生物的基因组或cDNA文库或混合DNA样品获得编码该多肽的多核苷酸。一旦用这种或这些探针检测到编码一种多肽的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员众所周知的的技术分离或克隆该多核苷酸(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的多肽且用于重组产生该多肽的分离的多核苷酸。
用来分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域已知的，并且包含从基因组DNA分离、从cDNA制备或其组合。可以例如通过使用熟知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从这样的基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如，伊尼斯(Innis)等人，1990，PCR：方法和应用指南(PCR:A Guide to Methods andApplication)，学术出版社，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。可以从糖多孢菌属菌株或来自放线菌目的另一种或相关生物中克隆多核苷酸，并且因此，例如可以是多核苷酸的多肽编码区的等位基因变体或物种变体。
本发明还涉及包含与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列一致性程度(其条件是它与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列不100％相同)并且编码具有蛋白酶活性的多肽的多核苷酸或由其组成的分离的多核苷酸。
本发明进一步涉及与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性程度的多核苷酸或由其组成的分离的多核苷酸，这些分离的多核苷酸编码具有蛋白酶活性的多肽。
修饰编码本发明多肽的多核苷酸对于合成与该多肽基本上相似的多肽可能是必需的。术语“基本上类似”于该多肽是指该多肽的非天然发生的形式。这些多肽可能以某种工程化方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如在比活性、热稳定性、pH最佳值等方面不同的变体。该变体可以基于以SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列(例如其子序列)形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预定用于产生该酶的宿主有机体的密码子用法的核苷酸取代，或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如福德(Ford)等人，1991，蛋白表达与纯化(Protein Expression andPurification)2:95-107。
本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，这些分离的多核苷酸在高严谨度条件或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列、(iii)包含SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列、(iv)包含SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列、或(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)的全长互补链杂交；或如在此所定义的其等位基因变体和子序列(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。
在一个方面，该多核苷酸包含SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，编码具有蛋白酶活性的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5的片段的SEQ ID NO:1的子序列，或编码具有蛋白酶活性的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的片段的SEQ ID NO:3的子序列，例如SEQID NO:3的核苷酸550至1119的多核苷酸，或由其组成。
核酸构建体
本发明还涉及包含与一个或多个(若干个)控制序列可操作地连接的本发明多核苷酸的核酸构建体，其中该控制序列指导编码序列在适合的宿主细胞中在与该控制序列相容的条件下的表达。
多核苷酸可以按各种方式操纵以提供该多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可以是启动子序列，由宿主细胞识别的多核苷酸，用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸。启动子序列包含介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在选择的宿主细胞中示出转录活性的任何多核苷酸，包含突变的、截短的和杂交的启动子，并且可以获得自编码细胞外或细胞内多肽的基因，对于宿主细胞而言，是同源的亦或异源的。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的适合启动子的实例是从以下获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、大肠杆菌lac操纵子、天蓝链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-科马罗夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)，以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)80:21-25)。另外的启动子描述于吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)242:74-94中的“来自重组细菌的有用蛋白”(“Useful proteins from recombinantbacteria”)、以及萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文。
用于在丝状真菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的适合启动子的实例是从以下基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶、以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，包含曲霉中一种编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导子由来自曲霉中一种编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导子替代；非限制性实例包含修饰的启动子，包含来自黑曲霉中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导子由来自构巢曲霉或米曲霉中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导子替代)；及其突变的、截短的、以及杂合的启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子获得自以下各项的基因：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇去氢酶/甘油醛-3磷酸去氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的启动子由罗马努斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述。
控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的适合的转录终止子序列。该终止子序列可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的3’-末端。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子可以用于本发明中。
丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。
酵母宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸去氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马努斯等人，1992，见上文描述。
控制序列还可以是一个适合的前导序列，当被转录时是对于通过宿主细胞来翻译而言重要的mRNA的一个非翻译区。该前导序列可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的5’-末端。可以使用在选择的宿主细胞中具有功能的任何前导序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子从以下基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
酵母宿主细胞的适合的前导子是从以下各项的基因中获得的：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子、和酿酒酵母醇去氢酶/甘油醛-3-磷酸去氢酶(ADH2/GAP)。
控制序列还可以是一种多腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将多腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在选择的宿主细胞中具有功能的任何多腺苷酸化序列。
丝状真菌宿主细胞的优选的多腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶、和黑曲霉α-葡糖苷酶。
用于酵母宿主细胞的有用的聚腺苷酸化序列由郭(Guo)和舍曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990描述。
控制序列还可以是编码连接至多肽的N-末端的信号肽并指导该多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区域。该多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包含在翻译读码框内与编码该多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’-端可以包含对编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外来信号肽编码序列。可替代地，外来信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导表达的多肽进入选择的宿主细胞的分泌途径中的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、以及枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由西蒙(Simonen)和帕夫拉(Palva)，1993，微生物学综述(Microbiological Reviews)57:109-137描述。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶、以及曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的有用的信号肽是从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由罗马努斯等人，1992，见上文描述。
控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端的前肽的前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶或多肽原(或者在一些情况下被称为酶原)。多肽原一般是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α因子。
在多肽的N-末端处信号肽序列和前肽序列都存在的情况下，前肽序列定位成紧邻多肽的N-末端并且信号肽序列定位成紧邻前肽序列的N-末端。
也可能令人希望的是添加调节序列，该调节序列允许相对于宿主细胞的生长而调节多肽的表达。调节系统的实例是引起将响应于化学或物理刺激(包含调节性化合物的存在)而开启或关闭的基因表达的那些系统。原核系统中的调节序列包含lac、tac、以及trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包含在氨甲蝶呤的存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因、以及以重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包含一个或多个(若干个)合宜的限制性位点以允许在这样的位点插入或置换编码多肽的多核苷酸。可替代地，通过将该多核苷酸或者包含该序列的核酸构建体插入到用于表达的适当载体中可以表达该多核苷酸。在产生表达载体时，该编码序列是位于该载体中，由此使该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于载体与该载体待引入其中的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒、或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含了有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)、或转座子。
载体优选地包含允许便于选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等的一个或多个(若干个)选择性标记。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性等。
细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、或四环素抗性)的标记。酵母宿主细胞的适合的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在一个丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包含但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)及其等效物。优选用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌的bar基因。
载体优选包含其允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或者通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。作为替代方案，该载体可以包含引导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，通过非同源重组可以将该载体整合到该宿主细胞的基因组内。
对于自主复制，该载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞内进行自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞内起作用的介导自主复制的任何质粒复制因子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、以及ARS4和CEN6的组合。
适用于丝状真菌细胞的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO 00/24883)。根据WO 00/24883中披露的方法可以实现AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个额外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个可扩增的选择性标记基因与该多核苷酸可以获得增加的多核苷酸拷贝数目，其中通过在适当选择性试剂存在下培养细胞可以选择包含扩增的选择性标记基因拷贝和由此额外的多核苷酸拷贝的细胞。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克等人，1989，见上文)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含与指导本发明多肽产生的一个或多个(若干个)控制序列可操作地连接的本发明多核苷酸。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
该宿主细胞可以是适用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包含但不限于：芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、梭菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、类芽孢杆菌属、以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包含但不限于大肠杆菌和假单胞菌属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌目细胞，包含但不限于解淀粉芽孢杆菌、短短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪土芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。特别优选的宿主细胞是迟缓芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包含但不限于产色链霉菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌以及变铅青链霉菌细胞。
可以例如通过原生质体转化(参见，例如常(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、通过使用感受态细胞(参见，例如杨(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829，或杜博楠(Dubnau)和大卫多夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、通过电穿孔(参见，例如茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)或通过接合(参见，例如克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志(J.Bacteriol.)169:5271-5278)实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞之中。可以例如通过原生质体转化(参见，例如哈那汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(见，例如道尔等人，1988，核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:6127-6145))实现将DNA引入到大肠杆菌细胞之中。可以例如通过原生质体转化和电穿孔(参见，例如贡(Gong)等人，2004，微生物学报(Folia Microbiol.)(布拉格(Praha))49:399-405)、通过接合(参见，例如马卓德(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)或通过转导(参见，例如伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)实现将DNA引入到链霉菌属细胞之中。可以例如通过电穿孔(参见，例如崔(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或通过结合(参见，例如皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)实现将DNA引入到假单胞菌属细胞之中。可以例如通过天然感受态(参见，例如佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，传染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、通过原生质体转化(参见，例如卡特(Catt)和约里克(Jollick)，1991，微生物(Microbios)68:189-207)、通过电穿孔(参见，例如布克莱(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)或通过接合(参见，例如克莱怀尔(Clewell)，1981，微生物学综述(Microbiol.Rev.)45:409-436)实现向链球菌属细胞中引入DNA。然而，可以使用在本领域已知的任何方法将DNA引入到宿主细胞中。
该宿主细胞还可以是真核细胞，例如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。
该宿主细胞可以是真菌细胞。如在此所用的“真菌”包含子囊菌门、担子菌门、壶菌门和接合菌门(如霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安-倍氏菌物辞典(Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际CAB，大学出版社，剑桥(Cambridge)，英国中所定义的)以及卵菌门(Oomycota)(如在霍克斯沃思(Hawksworth)等人，1995，见上文，第171页中所引用的)和所有有丝分裂孢子真菌(霍克斯沃思(Hawksworth)等人，1995，见上文)。
该真菌宿主细胞可以是一个酵母细胞。如在此所使用的“酵母”包含产子囊酵母(ascosporogenousyeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)、以及属于不完全真菌(Fungi Imperfecti)(芽生菌目(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在将来可能改变，用于本发明的目的，酵母应如在酵母生物学与活性(Biology and Activities ofYeast)(斯金纳(Skinner)，F.A.,帕斯莫尔(Passmore)，S.M.和达文波特(Davenport)，R.R.编著，应用细菌学研讨会系列第9期(Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9)，1980)中所述进行定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或者亚罗酵母属(Yarrowia)细胞，例如一种乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克鲁维氏酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)、或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
该真菌宿主细胞可以是一个丝状真菌细胞。“丝状真菌”包含真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢属(Acremonium)、曲霉菌属、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、网孢菌属(Filibasidium)、镰刀菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、稻瘟病菌属(Magnaporthe)、毛霉菌(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、白腐菌属(Phlebia)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)、或木霉属(Trichoderma)细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟腊菌(Ceriporiopsis subvermispora)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢(Fusariumbactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusariumroseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、福射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP 238023和约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474中描述。用于转化镰孢属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156、以及WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法(Guide toYeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志(J.Bacteriol.)153:163；以及哈尼恩(Hinnen)等人，1978，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:1920。
产生方法
本发明还涉及产生本发明多肽的方法，该方法包含：(a)在有益于产生该多肽的条件下培养一种细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且(b)回收该多肽。在一个方面，该细胞属于糖多孢菌属。在一个更优选的方面，该细胞是红色糖多孢菌细胞。
红色糖多孢菌的染色体DNA可以如奥林利克(Oliynyk)等人，产生红霉素的细菌红色糖多孢菌NRRL23338的全基因组序列(Complete genomesequence of the erythromycin-producing bacterium Saccharopolyspora erythraeaNRRL23338)，自然生物技术(Nat Biotechnol)，25:447-453(2007)中所指示的分离。这一DNA可以用于重组产生有待根据本发明而使用的蛋白酶。
本发明还涉及产生本发明多肽的方法，该方法包含：(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；并且(b)回收该多肽。
使用本领域熟知的方法，在适合产生该多肽的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下，在实验室或工业发酵罐中，进行摇瓶培养、以及小规模或大规模发酵(包含连续，分批，补料分批，或固态发酵)来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中直接回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。
在上面的部分以及以下关于“核酸构建体、表达载体、重组宿主细胞和用于生产蛋白酶的方法”的部分中提供了更多的细节。
该多肽可以使用本领域中已知的特定用于这些多肽的方法进行检测。这些检测方法可以包含使用特异抗体、形成酶产物、或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可以通过常规程序，包含，但不局限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀，从营养培养基中回收该多肽。
可以通过本领域已知的多种方法纯化该多肽，该方法包含但不限于色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法和大小排阻色谱法)、电泳方法(例如，制备性等电聚焦)、差异性溶解(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，蛋白纯化(ProteinPurification)，编者J.-C.詹森(Janson)和拉尔斯赖登(Lars Ryden)，VCH出版公司，纽约，1989)，以便获得基本上纯的多肽。
在替代性方面，不回收多肽，而是使用表达多肽的本发明宿主细胞作为多肽的来源。
植物
本发明还涉及植物，例如，转基因植物、植物部分、或植物细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸，以便以可回收的量表达和产生该多肽。该多肽可以从植物或植物部分回收。可替代地，可以按原样将包含该多肽的植物或植物部分用于改善食品或饲料的质量，例如，改善营养价值、适口性、以及流变性质，或用以破坏抗营养因子。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(bluegrass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)，如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草(temperate grass)，如翦股颖属(Agrostis)；以及谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、以及玉蜀黍(玉米)。
双子叶植物的实例是烟草、豆类(如羽扇豆(lupins)、马铃薯、糖甜菜(sugar beet)、豌豆、豆(bean)和大豆(soybean))、以及十字花科植物(十字花科(family Brassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及紧密相关的模式生物拟南芥)。
植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、以及块茎、以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮、叶肉、薄壁组织(parenchyme)、维管组织、分生组织。特定植物细胞区室，如叶绿体、质外体(apoplast)、线粒体、液泡、过氧化物酶体以及细胞质也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论是何种组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以促进本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉层和种皮。
同样包含于本发明范围内的是这些植物、植物部分和植物细胞的后代。
表达多肽的转基因植物或植物细胞可以根据本领域已知的方法构建。简而言之，通过如下方法构建该植物或植物细胞：将编码多肽的一个或多个(若干个)表达构建体并入到植物宿主基因组或叶绿体基因组中，并且使所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。
表达构建体宜为包含编码多肽的多核苷酸的核酸构建体，该多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定植物细胞有用的选择性标记，在这些宿主细胞中整合了表达构建体和将该构建体引入所讨论的植物中所必需的DNA序列(后者取决于使用的DNA引入方法)。
调节序列(如启动子和终止子序列以及任选地信号或转运序列)的选择(例如)基于期望何时、何处以及如何表达多肽而确定。例如，编码多肽的基因的表达可以是组成性的或可诱导的，或可以为发育、阶段或组织特异性的，并且可以使基因产物靶向特定组织或植物部分，例如种子或叶。调节序列由例如塔格(Tague)等人，1988，植物生理学(Plant Physiology)86:506描述。
对于组成型表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1、和稻肌动蛋白1启动子(弗兰克(Franck)等人，1980，细胞(Cell)21:285-294；克里斯滕森(Christensen)等人，1992，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)18:675-689；张(Zhang)等人，1991，植物细胞(Plant Cell)3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如：来自贮藏库组织(storage sink tissue)(如种子、马铃薯块茎、以及果实)(爱德华兹(Edwards)和科鲁兹(Coruzzi)，1990，遗传学年度综述(Ann.Rev.Genet.)24:275-303)、或代谢库组织(metabolic sink tissue)(如分生组织)的启动子(伊托(Ito)等人，1994，植物分子生物学24:863-878)；种子特异性启动子，如来自稻的谷蛋白、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)、或白蛋白启动子(吴(Wu)等人，1998，植物细胞生理学(Plant Cell Physiol.)39:885-889)；来自豆球蛋白B4和来自蚕豆的未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(康拉德(Conrad)等人，1998，植物生理学杂志(J.Plant Physiol.)152:708-711)；来自种子油体蛋白的启动子(陈(Chen)等人，1998，植物细胞生理学39:935-941)；来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子、或本技术领域已知的任何其他种子特异性启动子，例如，如在WO 91/14772中所描述。此外，启动子可以是叶特异性启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(京冢(Kyozuka)等人，1993，植物生理学(Plant Physiol.)102:991-1000)、小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(麦卓(Mitra)和希金斯(Higgins)，1994，植物分子生物学26:85-93)、来自稻的aldP基因启动子(加贺屋(Kagaya)等人，1995，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)248:668-674)、或伤口诱导型启动子(如马铃薯pin2启动子)(许(Xu)等人，1993，植物分子生物学22:573-588)。同样地，该启动子可以通过非生物处理来诱导，如温度、干旱、或盐度变化，或通过外源施加的激活该启动子的物质来诱导，例如乙醇、雌激素、植物激素(如乙烯、脱落酸和赤霉酸)、以及重金属。
启动子增强子元件也可以用于实现多肽在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是置于启动子与编码多肽的多核苷酸之间的内含子。例如，许等人，1993，见上文，披露了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。
该选择性标记基因及该表达构建体的任何其他部分可以选自本领域中可用的那些。
核酸构建体是根据本领域已知的常规技术并入到植物基因组中，这些常规技术包含：农杆菌介导的转化、病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、生物射弹转化、以及电穿孔(盖瑟(Gasser)等人，1990，科学244:1293；波特里库斯(Potrykus)，1990，生物/技术(Bio/Technology)8:535；岛本(Shimamoto)等人，1989，自然(Nature)338:274)。
目前，根癌农杆菌介导的基因转移是用于产生转基因双子叶植物的所选方法(关于综述，请参见霍伊卡(Hooykas)和施尔伯鲁特(Schilperoort)，1992，植物分子生物学19:15-38)，并且还可被用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物常常使用其他的转化方法。目前，用于产生转基因单子叶植物的所选方法是粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织或发育中的胚(克里斯托(Christou)，1992，植物杂志(Plant J.)2:275-281；岛本，1994，生物技术当前述评(Curr.Opin.Biotechnol.)5:158-162；瓦西尔(Vasil)等人，1992，生物/技术10:667-674)。用于转化单子叶植物的替代方法是基于原生质体转化，如由欧米璐(Omirulleh)等人，1993，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)21:415-428所描述。根据本披露使用的额外的转化方法包含美国专利号6,395,966和7,151,204中所述的那些(这二者都通过引用以其全文结合在此)。
在转化之后，根据本领域中众所周知的方法对并入了该表达构建体的转化株进行选择并且使其再生成为完整植物。通常转化程序被设计成通过使用例如用两种分开的T-DNA构建体共转化或通过特异性重组酶进行的选择基因的位点特异性切除，在再生期间或在后代中选择性清除选择基因。
除用根据本发明制备的构建体直接转化具体植物基因型之外，还可以通过将具有构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物杂交来制备转基因植物。例如，可以将编码多肽的构建体通过杂交引入具体植物品种，而根本无需直接转化那个给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖了从根据本发明已经转化的细胞直接再生的植物，而且还涵盖了这类植物的后代。如在此使用的，后代可以是指根据本发明制备的亲本植物的任何代的后代。这种后代可以包含根据本发明制备的DNA构建体或根据本发明制备的DNA构建体的一部分。杂交导致转基因通过将起始种系与供体植物种系交叉授粉而引入植物种系。这类步骤的非限制性实例进一步在美国专利号7,151,204中明确地表达。
植物可以通过回交转化方法生成。例如，植物包含被称为回交转化的基因型、种系、近交体、或杂交体的植物。
可以使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景渗入到另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可以用于避免由表型变异导致的错误。另外，遗传标记可以在具体杂交的个别后代中提供有关良种种质相对程度的数据。例如，当具有所希望性状并且另外具有非农艺学所希望的遗传背景的植物与良种亲本杂交时，可以使用遗传标记来选择不仅具有感兴趣的性状，还具有相对较大比例所希望种质的后代。以此方式，使一种或多种性状渗入特定遗传背景所需的世代数得以最小化。
本发明还涉及产生本发明多肽的方法，该方法包含：(a)在有益于产生多肽的条件下，培养包含编码该多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞，并且(b)回收该多肽。
组合物
本发明还涉及包含本发明的蛋白酶的组合物。优选地，这些组合物富集了这样一种蛋白酶。术语“富集”指示该组合物的蛋白酶活性已经增加，例如，以至少1.1的一个富集因子。
该组合物可以包含本发明的蛋白酶作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，该组合物可以包含多种酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。可以例如通过微生物(如细菌或真菌)或通过植物或通过动物产生另外的一种或多种酶。这些组合物可以根据本领域中已知的方法制备，并且可以呈液体或干组合物的形式。例如，组合物可以处于颗粒或微颗粒的形式。该蛋白酶可以根据本领域中已知的方法稳定化。
应用
本发明针对用于使用具有蛋白酶活性的多肽或其组合物的方法。
动物饲料
本发明针对在动物饲料中使用具有蛋白酶活性的蛋白酶的方法，以及包含本发明的蛋白酶的饲料组合物和饲料添加剂。
术语动物包含所有动物，包含人类。动物的实例为非反刍动物，和反刍动物。反刍动物包含，例如，动物，如绵羊、山羊、和牛，例如，肉牛、奶牛和牛犊。在具体实施例中，动物为非反刍动物。非-反当动物包含单胃动物，如猪(pig或swine)(包含但不限于小猪、生长中的猪和大母猪)；家禽，如火鸡，鸭和鸡(包含但不限于肉仔鸡、蛋鸡)；马(包含但不限于热血动物、冷血动物和温血动物)，小牛；和鱼(包含但不限于鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼)；和甲壳类动物(包含但不限于河虾和对虾)。
术语饲料或饲料组合物意思指适于或者意在由动物摄入的任意化合物、制剂、混合物或组合物。
在根据本发明的用途中，可在饮食之前，之后或同时给动物饲喂蛋白酶。优选后者。
在具体实施例中，明确限定了往饲料中添加的蛋白酶或包括在饲料添加剂中的蛋白酶。明确限定指的是如经大小排阻色谱法(参见WO 01/58275的实例12)测定的，蛋白酶制品至少为50％纯。在其他具体实施例中，如经此方法测定的，蛋白酶制品至少为60％、70％、80％、85％、88％、90％、92％、94％、或至少为95％纯。
明确限定的蛋白酶制剂是有利的。例如，对于实质上不受其他蛋白酶干扰或污染的蛋白酶而言，更容易确定它在饲料中的正确剂量。术语正确剂量具体指得到一致和恒定的结果的目标，和基于所希望的效果能够优化剂量。
然而，为了在动物饲料中使用，蛋白酶不必那么纯；它可以例如包含其他酶，此时可将其称为蛋白酶制品。
该蛋白酶制剂可以(a)直接加入饲料(或者直接用于蛋白处理过程)，或者(b)它可以用于一种或多种随后加入饲料(或者用于处理过程中)的中间组合物，如饲料添加剂或者预混合物的生产。不论是否根据上述(a)或(b)来使用，上文所述的纯度指的都是原始蛋白酶制品的纯度。
具体地说，使用重组生产方法即可获得纯度为上述数量级的蛋白酶制品，然而，当通过传统的发酵方法生产蛋白酶时，要想获得这些蛋白酶制品却并非易事，而且，批次与批次之间会有较高的差异。
这类蛋白酶制品当然可以与其他酶混合。
该蛋白可以是一种动物性蛋白，如肉和骨粉、羽毛粉、和/或鱼粉；或者他可以是一种植物性蛋白。
本文所用术语植物性蛋白指的是包含至少一种衍生自或源自植物的蛋白，包含修饰的蛋白和蛋白衍生物的任何化合物，组合物，制品或混合物。在具体实施例中，这些植物性蛋白的蛋白含量至少为10、20、30、40、50或60％(w/w)。
植物性蛋白可以衍生自植物性蛋白来源，如豆类和谷类，例如得自蝶形花科(豆科)，十字花科，藜科和早熟禾科植物的材料，如大豆粉，羽扇豆粉和油菜籽粉。
在具体实施例中，植物性蛋白来源是得自蝶形花科的一种或多种植物，如大豆，羽扇豆，豌豆或蚕豆的材料。
在另一个具体实施例中，植物性蛋白来源是得自藜科的一种或多种植物，如甜菜，糖甜菜，菠菜或奎奴亚藜的材料。
植物性蛋白来源的其他实例为油菜籽、向日蔡籽、棉籽和卷心菜。
大豆为优选的植物性蛋白来源。
植物性蛋白来源的其他实例为谷类，如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉蜀黍(玉米)、稻、黑小麦和高粱。
在处理过程的具体实施例中，所讨论的这种或这些种蛋白酶影响这些蛋白如植物性蛋白或蛋白来源(或对其发挥作用或施加水解或降解影响)。为了达到此目的，一般将蛋白或蛋白来源悬浮于溶剂，例如含水溶剂，如水中，并适当关注所讨论的酶的特征，以调节pH和温度值。例如，可在能使实际蛋白酶的活性至少为5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或至少为90％的pH值下进行处理。类似地，例如，可在能使实际蛋白酶的活性至少为5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或至少为90％的温度下进行处理。上述活性百分比指示是相对于最大活性而言的。持续进行酶促反应直至获得所需结果，然后可以通过例如热-处理步骤灭活酶来终止反应，或者也可以不终止反应。
在本发明处理过程的另一个具体实施例中，蛋白酶作用被维持，这意味着例如将蛋白酶加入这些蛋白，但其水解影响可以说尚未开启，直到后来当有此需求时，一旦建立了适当的水解条件，或一旦灭活了任何酶抑制剂，或不论使用何种其他方式延迟了酶的作用，才会开启其水解影响。
在一个实施例中，处理是预-处理动物饲料或用于动物饲料的蛋白，即这些蛋白是在摄入之前被水解的。
术语改善动物饲料的营养价值指的是提高饲料中的营养的可利用性。在本发明中，改善营养价值具体指的是改善饲料的蛋白部分的可利用性，从而导致蛋白提取的增加，较高的蛋白产量，和/或蛋白利用的改善。当饲料的营养价值增加时，蛋白和/或氨基酸消化率增加，并且该动物的生长速率和/或体重增加量和/或饲料转化(即相对于体重增加的饲料摄取量)可被改善。
能以任何形式将蛋白酶添加至饲料中，如它是相对纯的蛋白酶，或与欲添加至动物饲料的其他组分的混合物，即以动物饲料添加剂的形式，例如所谓的动物饲料预混物。
在另一方面，本发明涉及用于动物饲料的组合物，如动物饲料和动物饲料添加剂，如预混合物。
除本发明的蛋白酶以外，本发明的动物饲料添加剂还包含至少一种脂溶性维生素、和/或至少一种水溶性维生素、和/或至少一种微量矿物质、和/或至少一种大量矿物质。
另外，可任选的，饲料添加成分是着色剂例如类胡萝卜素如β-胡萝卜素、虾青素、和叶黄素；稳定剂；生长改善添加剂和芳香化合物/调味品，例如甲氧甲酚，茴香脑，十-、十一-和/或十二-内酯，紫罗酮、鸢尾酮、姜辣素、哌啶、亚丙基苯酞、亚丁基苯酞、辣椒素和/或丹宁酸；抗微生物肽；多不饱和脂肪酸(PUFA)；产活性氧种类；另外，可以使用一种支持物，其可包含例如按重量计40％-50％的木质纤维、按重量计8％-10％的硬脂酸、按重量计4％-5％的姜黄粉、按重量计4％-58％的迷迭香粉、按重量计22％-28％的石灰岩、按重量计1％-3％的树胶如阿拉伯树胶、按重量计5％-50％的糖和/或淀粉以及按重量计5％-15％的水。
本发明的一种饲料或饲料添加剂还可包含选自以下各项之中的至少一种其他的酶：肌醇六磷酸酶(EC3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)；另外的蛋白酶(EC3.4)，磷脂酶A1(EC3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC3.1.4.4)；淀粉酶如，例如α-淀粉酶(EC3.2.1.1)；和/或β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4或EC3.2.1.6)。
在具体实施例中，这些其他酶被明确定义(如上对蛋白酶制剂定义的)。
抗微生物肽(AMP)的实例是CAP18、Leucocin(林可霉素)A、Tritrpticin、Protegrin-1、Thanatin(死亡素)、防卫肽、乳铁蛋白、乳铁蛋白肽、和Ovispirin如Novispirin(Robert Lehrer(罗伯特·莱勒)，2000)、Plectasins(菌丝霉素)以及他汀类，包含在WO 03/044049和WO 03/048148中所披露的化合物和多肽，以及以上的保留了抗微生物活性的变体或片段。
抗真菌多肽(AFP)的实例是巨大曲霉(Aspergillus giganteus)和黑曲霉的肽，连同其保留了抗真菌活性的变体和片段，如在WO 94/01459和WO02/090384中披露的。
多不饱和脂肪酸的实例为C18、C20和C22多不饱和脂肪酸，如花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和γ-亚麻酸。
产生活性氧的种类的实例为化学品，如过硼酸盐、过硫酸盐或过碳酸盐；和酶，如氧化酶、加氧酶或合成酶。
通常，脂-和水-溶性维生素，以及微量矿物质形成意在添加至饲料的所谓的预混物的一部分，而大量矿物质通常单独添加至饲料中。这些组合物的任一个类型，当富含于本发明的蛋白酶时，都是本发明的动物饲料添加剂。
在具体实施例中，本发明的动物饲料添加剂以0.01％至10.0％，更具体0.05％至5.0％或0.2％至1.0％(％指g添加剂/100g饲料)的水平包含(或规定为必须包含)在动物饮食或饲料中。具体地说，对预混物也是如此。
下文列出了这些组分的非-排他性实例：
脂溶性维生素的实例是维生素A、维生素D3、维生素E和维生素K，例如维生素K3。
水溶性维生素的实例是维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸酯，例如Ca-D-泛酸酯。
微量矿物质的实例为锰、锌、铁、铜、碘、硒和钴。
大量矿物质的实例为钙、磷和钠。
这些组分的营养需求(以家禽和小猪/猪举例)列于WO 01/58275中的表A中。营养需求指的是应在饮食中以所示浓度提供这些组分。
在可替代的实施例中，本发明的动物饲料添加剂包含WO 01/58275中的表A所详细说明的单个组分中的至少一种。至少一种指的是一种或两种或三种或四种等直至所有十三种，或直至所有15种单个组分中的任一种，一种或多种。更具体地，本发明的添加剂包含该至少一种单个组分，其含量能使其在饲料中的浓度落入表A第4或第5或第6栏所示的范围。
在仍另外的实施例中，本发明的动物饲料添加剂包含以下维生素中的至少一种，优选地以在以下的表1中所详细说明的饲料内浓度范围提供(分别对于小猪饮食和肉仔鸡饮食)。
表1：一般的维生素建议
维生素 小猪饮食 肉仔鸡饮食
维生素A 10,000-15,000IU/kg饲料 8-12,500IU/kg饲料
维生素D3 1800-2000IU/kg饲料 3000-5000IU/kg饲料
维生素E 60-100mg/kg饲料 150-240mg/kg饲料
维生素K3 2-4mg/kg饲料 2-4mg/kg饲料
维生素B1 2-4mg/kg饲料 2-3mg/kg饲料
维生素B2 6-10mg/kg饲料 7-9mg/kg饲料
维生素B6 4-8mg/kg饲料 3-6mg/kg饲料
维生素B12 0.03-0.05mg/kg饲料 0.015-0.04mg/kg饲料
烟酸(维生素B3) 30-50mg/kg饲料 50-80mg/kg饲料
泛酸 20-40mg/kg饲料 10-18mg/kg饲料
叶酸 1-2mg/kg饲料 1-2mg/kg饲料
生物素 0.15-0.4mg/kg饲料 0.15-0.3mg/kg饲料
氯化胆碱 200-400mg/kg饲料 300-600mg/kg饲料
本发明还涉及动物饲料组合物。动物饲料组合物或饮食具有相对高的蛋白含量。家禽和猪饮食的特征如WO 01/58275，表B第2-3栏所示。鱼食可被表征为该表B第4栏中所示的。另外，这类鱼食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。
WO 01/58275相当于US 09/779334，被列入本文作为参考。
根据本发明的动物饲料组合物具有的粗蛋白含量为50-800g/kg，此外还包含至少一种本文所要求的蛋白酶。
此外，或替代地(对于以上所示的粗蛋白含量)，本发明的动物饲料组合物具有10-30MJ/kg的可代谢能量含量；和/或0.1-200g/kg的钙含量；和/或0.1-200g/kg的有效磷含量；和/或0.1-100g/kg的甲硫氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的赖氨酸含量。
在具体实施例中，可代谢能量、粗蛋白、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸、和/或赖氨酸的含量落入WO 01/58275，表B，范围2、3、4或5中的任何一个中(R.2-5)。
粗蛋白以氮(N)乘以系数6.25计算，即粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)×6.25。通过凯氏定氮法(Kjeldahl method)测定氮含量(A.O.A.C.,1984，官方分析方法(Official Methods of Analysis)第14版，官方分析化学家集(Association of Official Analytical Chemists)，华盛顿特区)。
可代谢能量可根据NRC出版物猪的营养需求(Nutrient requirements inswine)，第九次再版1988，国家研究委员会农业部动物营养协会猪营养分会，美国国家科学院出版社，华盛顿特区，第2-6页和欧洲家禽饲养材料能量值表(European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs)，斯克得霍特(Spelderholt)家禽研究与推广中心，7361DA贝克贝亨，荷兰，Grafischbedrijf Ponsen&looijen公司，瓦赫宁恩.ISBN90-71463-12-5计算。
完整的动物食料中钙、有效磷和氨基酸的饮食含量根据如Veevoedertable1997，gegevens over chemische samenstelling,verteerbaarheid en voederwaardewan voedermiddelen,Central Veevoederbureau,Runderweg6,8219pk Lelystad.ISBN90-72839-13-7计算。
在具体实施例中，本发明的动物饲料组合物包含如上定义的至少一种植物性蛋白。
本发明的动物饲料组合物还可以包含动物性蛋白，如肉和骨粉、羽毛粉、和/或鱼粉，通常量为0-25％。本发明的动物饲料组合物还可以包含具有可溶物的干酒糟(Dried Distillers Grains)，通常量为0-30％。
在另一具体实施例中，本发明的动物饲料组合物包含0-80％的玉米；和/或0-80％的高粱；和/或0-70％小麦；和/或0-70％的大麦；和/或0-30％的燕麦；和/或0-40％的大豆粉；和/或0-25％的鱼粉；和/或0-25％的肉和骨粉；和/或0-20％的乳清。
可将动物饮食制备成例如糊状饲料(非丸状)或丸状饲料。通常，混合研磨的饲料并根据所讨论的这些种类的说明加入必需维生素和矿物质的足够量。以固体或液体酶配制品的形式加入酶。例如，对于糊状饲料，在成分混合步骤前或期间可加入固体或液体酶配制品。对于丸状饲料，在饲料成分步骤前或期间还可加入该(固体或液体)蛋白酶/酶制剂。典型地，在造丸步骤之后加入一种液体蛋白酶/酶制剂。也可以将酶掺入饲料添加剂或预混物。
饮食中最终的酶浓度范围为0.01-200mg酶蛋白/kg饮食，例如在0.5-25mg酶蛋白/kg动物饮食的范围内。
当然，应该以有效量，即足以改善饲料的水解、消化性和/或改善营养价值的量使用蛋白酶。目前期望以下述量(剂量范围)中的一种或多种施用酶：0.01-200；0.01-100；0.5-100；1-50；5-100；10-100；0.05-50或0.10-10-所有这些范围都是每kg饲料中蛋白酶蛋白的mg数(ppm)。
为了测定每kg饲料中蛋白酶蛋白的mg数，从饲料组合物中纯化蛋白酶，并且使用相关试验(参见蛋白酶活性，底物和试验)测定经纯化的蛋白酶的比活性。使用相同试验测定该饲料组合物的蛋白酶活性，并且在这两次测定的基础上计算出以每kg饲料中蛋白酶蛋白的mg数计的剂量。
使用相同的原理测定饲料添加剂中的蛋白酶蛋白mg数。当然，如果可获得制备饲料添加剂或饲料所用蛋白酶的样品，可由该样品测定比活性(无需从饲料组合物或添加剂中纯化蛋白酶)。
洗涤剂组合物
在一个实施例中，本发明针对洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含结合一种或多种额外的清洁组合物组分的本发明的酶。额外的组分的选择在普通技术人员技术内并且包括常规成分，包括以下列出的示例性、非限制性组分。
对于纺织品保养，组分的选择可以包括以下考虑：有待清洁的纺织品的类型、污物的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制。尽管根据一种具体的功能性将以下提及的组分通过一般标题进行了分类，但是由于该组分可能具有熟练的业内人士将领会的一种或多种另外的功能，因此不应该将这理解为限制。
洗涤剂组合物可以适于洗涤纺织品，例如像织物、衣服或亚麻布，或用于清洁硬表面，例如像地板、桌子、或洗碗盘。
洗涤剂洗涤剂中的酶量
在本发明的一个实施例中，可以将本发明的多肽以对应于以下的量添加至一种洗涤剂组合物中：每升的洗涤液0.0001-200mg的酶蛋白，例如0.0005-100mg的酶蛋白，优选0.001-30mg的酶蛋白，更优选0.005-8mg的酶蛋白，甚至更优选0.01-2mg的酶蛋白。
用于在自动洗碗机(ADW)中使用的组合物例如可以包含按该组合物的重量计0.0001％-50％，例如0.001％-20％，例如0.01％-10％，例如0.05％-5％的酶蛋白。
用于在洗衣造粒(laundry granulation)中使用的组合物例如可以包含按该组合物的重量计0.0001％-50％，例如0.001％-20％，例如0.01％-10％，例如0.05％-5％的酶蛋白。
用于在洗衣液中使用的组合物例如可以包含按该组合物的重量计0.0001％-10％，例如0.001％-7％，例如0.1％-5％的酶蛋白。
可以使用常规稳定剂稳定本发明的洗涤剂组合物的一种或多种酶，这些常规稳定剂例如是多元醇，例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物，例如4-甲酰苯基硼酸，并且可以如在例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制该组合物。
在某些市场中，不同洗涤条件并且就其本身而言，使用不同类型的洗涤剂。这披露于例如EP 1 025 240中。例如，在亚洲(日本)使用低的洗涤剂浓度体系，而美国使用中等洗涤剂浓度体系，并且欧洲使用高的洗涤剂浓度体系。
低的洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在少于约800ppm的洗涤剂组分。日本洗涤剂典型地被认为是低的洗涤剂浓度体系，因为它们具有存在于洗涤水中的大约667ppm的洗涤剂组分。
中等洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在约800ppm与约2000ppm之间的洗涤剂组分。北美洗涤剂通常被认为是中等洗涤剂浓度体系，因为它们具有存在于洗涤水中的大约975ppm的洗涤剂组分。
高的洗涤剂浓度体系包含以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在多于约2000ppm的洗涤剂组分。欧洲洗涤剂通常被认为是高的洗涤剂浓度体系，因为在洗涤水中它们具有大约4500-5000ppm的洗涤剂组分。
拉丁美洲洗涤剂通常是高泡沫磷酸盐助洗剂洗涤剂并且在拉丁美洲使用的洗涤剂的范围可以落入中等和高的洗涤剂浓度两者中，因为在洗涤水中它们的洗涤剂组分的范围从1500ppm至6000ppm。此类洗涤剂组合物都是本发明的实施例。
本发明的多肽还可以结合到WO 97/07202中所披露的洗涤剂配制品中，通过引用将其结合在此。
表面活性剂
洗涤剂组合物可以包含一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子的和/或阳离子的和/或非离子的和/或半极性的和/或兼性离子的，或其混合物。在一个具体实施例中，洗涤剂组合物包括一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的混合物。这种或这些表面活性剂典型地以按重量计从约0.1％至60％的水平存在，例如约1％至约40％、或约3％至约20％、或约3％至约10％。基于所希望的清洁应用来选择这种或这些表面活性剂，并且这种或这些表面活性剂包括本领域中已知的任何一种或多种常规表面活性剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何表面活性剂。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％，例如从约5％至约30％(包括从约5％至约15％)、或从约20％至约25％的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地，直链烷基苯磺酸盐(LAS)，LAS的异构体，支链烷基苯磺酸盐(BABS)，苯基链烷磺酸盐，α-烯烃磺酸盐(AOS)，烯烃磺酸盐，链烯烃磺酸盐，链烷-2,3-二基双(硫酸盐)，羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐，烷基硫酸盐(AS)(例如十二烷基硫酸钠(SDS))，脂肪醇硫酸盐(FAS)，伯醇硫酸盐(PAS)，醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)，仲链烷磺酸盐(SAS)，石蜡烃磺酸盐(PS)，酯磺酸盐，磺化的脂肪酸甘油酯，α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))，烷基琥珀酸或烯基琥珀酸，十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)，氨基酸的脂肪酸衍生物，磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯，及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0％至约10％的阳离子表面活性剂。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)化合物、及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，例如从约0.5％至约30％，特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％，例如从约3％至约5％、或从约8％至约12％。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)，烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)，烷基酚乙氧基化物(APE)，壬基酚乙氧基化物(NPE)，烷基多糖苷(APG)，烷氧基化胺，脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)，脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)，乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)，丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)，多羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)，或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))，连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品，及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0％至约10％的半极化表面活性剂。半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)，例如烷基二甲胺氧化物、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲胺氧化物和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)胺氧化物、脂肪酸链烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸链烷醇酰胺，及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0％至约10％的兼性离子表面活性剂。兼性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱、磺基甜菜碱、及其组合。
助水溶剂
助水溶剂是一种化合物，该化合物在水溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中的极性物质)。典型地，助水溶剂同时具有亲水的和疏水的特征(如从表面活性剂已知的所谓两亲特性)；然而助水溶剂的分子结构一般并不有利于自发自聚集，参见例如霍奇登(Hodgdon)和卡勒(Kaler)的综述(2007)，胶体&界面科学新见(Current Opinion in Colloid&Interface Science)，12:121-128。助水溶剂并不显示一个临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。很多助水溶剂反而示出一个连续型聚集过程，其中聚集体的大小随着浓度增加而增长。然而，很多助水溶剂改变了包含极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相状态、稳定性、和胶体特性。经典地从制药、个人护理、食品跨行业至技术应用使用助水溶剂。洗涤剂组合物中助水溶剂的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过除去水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，例如相分离或高黏度。
洗涤剂可以包含按重量计0-5％，例如约0.5％至约5％、或约3％至约5％的助水溶剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶剂。助水溶剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠、及其组合。
助洗剂和共助洗剂
洗涤剂组合物可以包含按重量计约0-65％，例如约5％至约45％的洗涤剂助洗剂或共助洗剂、或其混合物。在洗涤餐具洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40％-65％，特别是50％-65％。助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性复合物的螫合剂。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、二乙醇胺(DEA，也称为亚氨基二乙醇)、三乙醇胺(TEA，也称为2,2’,2”-次氨基三乙醇)、以及羧甲基菊粉(CMI)、及其组合。
洗涤剂组合物还可以包含按重量计0-20％，例如约5％至约10％的洗涤剂共助洗剂、或其混合物。洗涤剂组合物可以单独地包括一种共助洗剂，或与一种助洗剂，例如沸石助洗剂组合。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐，螯合剂，例如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和膦酸盐，以及烷基-或链烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDS)、乙二胺-N,N’-二丁二酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二膦酸(HEDP)、乙二胺四-(亚甲基膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMPA或DTMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinic acid)(IDA)、N-(2-磺甲基)-天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)-天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)-谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)-谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)以及磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(2-羟乙基)-亚乙基二胺-N,N’,N’-三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)、及其组合和盐。另外的示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO 09/102854、US 5977053中。
漂白系统
该洗涤剂可以包含按重量计0-50％，例如约0.1％至约25％的漂白系统。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何漂白系统。适合的漂白系统组分包括漂白催化剂、光漂白剂(photobleach)、漂白活化剂、过氧化氢源(例如过碳酸钠和过硼酸钠)、预成型的过酸及其混合物。适合的预成型过酸包括，但不限于：过氧羧酸及盐，过碳酸及盐，过白啶酸(perimidic acid)及盐，过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(Oxone(R))，及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括基于过氧化物的漂白系统，该系统可以包括例如一种与过酸形成漂白活化剂组合的无机盐，包括碱金属盐，例如过硼酸盐(通常是单水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐。术语漂白活化剂在此意指一种与过氧化物漂白剂(像过氧化氢)反应以形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。有待在此使用的适合的漂白活化剂包括属于酯类、酰胺类、酰亚胺类或酸酐类的那些。适合的实例是四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰)氧基]苯磺酸钠(ISONOBS)、二过氧月桂酸、4-(十二酰基氧基)苯磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS)、4-(壬酰基氧基)-苯磺酸盐(NOBS)、和/或披露于WO 98/17767中的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP 624154中，并且在那个家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像三醋汀)具有以下优点，它是环境友好的，因为它最终降解为柠檬酸和醇。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋汀在存储时在产品中具有良好的水解稳定性，并且它是一种有效的漂白活化剂。最后，ATC为洗衣添加剂提供一种良好的助洗能力。可替代地，漂白系统可以包括例如酰胺、亚胺、或砜型的过氧酸。漂白系统还可以包括过酸，例如6-(苯二甲酰亚氨基)过己酸(PAP)。漂白系统还可以包括一种漂白催化剂。在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由以下各项组成：具有下式的有机催化剂：
(iii)及其混合物；其中每个R1独立地是包含从9至24个碳的支链烷基基团或包含从11至24个碳的直链烷基基团，优选地，每个R1独立地是包含从9至18个碳的支链烷基基团或包含从11至18个碳的直链烷基基团，更优选地，每个R1独立地选自下组，该组由以下各项组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正-十二烷基、正-十四烷基、正-十六烷基、正-十八烷基、异-壬基、异-癸基、异-十三烷基和异-十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO 2007/087258、WO 2007/087244、WO 2007/087259以及WO2007/087242中。适合的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌。
聚合物
该洗涤剂可以包含按重量计0-10％，例如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何聚合物。聚合物的功能可以是如以上提到的共助洗剂，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污物释放、染料转移抑制、油污清洁和/或抗发泡特性。一些聚合物可以具有多于一种的上述特性和/或多于一种的下述基元(motif)。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(亚乙基亚胺)、羧甲基菊粉(CMI)、和聚羧化物，例如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水改性CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚(氧乙烯对苯二甲酸乙二酯)的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基磺酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO 2006/130575中。也考虑了上述聚合物的盐。
织物调色剂
本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂，例如染料或色素，当配制在洗涤剂组合物中时，当所述织物与一种洗液接触时织物调色剂可以沉积在织物上，该洗液包括所述洗涤剂组合物，并且因此通过可见光的吸收/反射改变所述织物的色彩。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，因为它们吸收至少一部分可见光光谱，所以织物调色剂改变表面的色彩。适合的织物调色剂包括染料和染料-黏土轭合物，并且还可以包括色素。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(Colour Index)(C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红、或其混合物，例如描述于WO 2005/03274、WO 2005/03275、WO 2005/03276和EP1876226中(将其通过引用结合在此)。洗涤剂组合物优选包括从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。该组合物可以包括从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是尤其优选的。适合的调色剂还披露于例如WO 2007/087257和WO2007/087243中。
另外的酶
洗涤剂添加剂连同洗涤剂组合物可以包括一种或多种另外的酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、碳水化合物分解酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶、和/或过氧化物酶。
一般而言，一种或多种所选酶的性质应与选定的洗涤剂相容(即，最优pH，与其他酶和非酶成分的相容性，等等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。
纤维素酶：适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包含化学修饰的或蛋白工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如，从在US4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中披露的特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢产生的真菌纤维素酶。
特别适合的纤维素酶是具有颜色保护益处的碱性或中性纤维素酶。这类纤维素酶的实例为在EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO96/29397、WO 98/08940中描述的纤维素酶。其他实例为纤维素酶变体，如在WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及PCT/DK98/00299中描述的那些。
展现内切-β-1,4-葡聚糖酶活性的纤维素酶(EC 3.2.1.4)的实例是已经描述于WO 02/099091中的那些。
纤维素酶的其他实例包括描述于WO 96/29397中的家族45纤维素酶，并且特别是在对应于WO 02/099091的SEQ ID NO:8中的以下位置的一个或多个位置处具有取代、插入和/或缺失的其变体：2、4、7、8、10、13、15、19、20、21、25、26、29、32、33、34、35、37、40、42、42a、43、44、48、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、70、72、76、79、80、82、84、86、88、90、91、93、95、95d、95h、95j、97、100、101、102、103、113、114、117、119、121、133、136、137、138、139、140a、141、143a、145、146、147、150e、150j、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160c、160e、160k、161、162、164、165、168、170、171、172、173、175、176、178、181、183、184、185、186、188、191、192、195、196、200、和/或20，优选选自P19A、G20K、Q44K、N48E、Q119H或Q146R。
可商购的纤维素酶包括CelluzymeTM、和CarezymeTM(诺维信公司)、ClazinaseTM、和Puradax HATM(杰能科国际有限公司(Genencor InternationalInc.))、以及KAC-500(B)TM(花王株式会社(Kao Corporation))。
蛋白酶：另外的酶可以是另一种蛋白酶或蛋白酶变体。该蛋白酶可以是动物、植物或微生物来源的，包括化学或基因修饰的突变体。优选微生物来源。它可以是一种碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族的(例如胰蛋白酶)或S8家族的(例如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶蛋白酶可以例如是一种来自例如家族M4、M5、M7或M8的嗜热菌蛋白酶。
根据司爱森(Siezen)等人，蛋白质工程(Protein Engng.)4(1991)719-737和司爱森(Siezen)等人，蛋白质科学(Protein Science)6(1997)501-523，术语“枯草杆菌酶”是指丝氨酸蛋白酶的一个亚类。丝氨酸蛋白酶是特征为在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的一个亚类。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(Thermitase)家族、蛋白酶K家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶(Lantibioticpeptidase)家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。在本发明的一个方面，该蛋白酶可以是一种枯草杆菌酶，例如枯草杆菌蛋白酶或其变体。另外，枯草杆菌酶(以及丝氨酸蛋白酶)的特征为除了丝氨酸以外，还具有两个活性位点氨基酸残基，即一个组氨酸和一个天冬氨酸残基。
枯草杆菌蛋白酶的实例是来源于芽孢杆菌属的那些，例如描述于WO89/06279中的枯草杆菌蛋白酶迟缓(lentus)、迟缓芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及蛋白酶PD138(WO 93/18140)。另外的丝氨酸蛋白酶实例是描述于WO 98/020115、WO 01/44452、WO 01/58275、WO 01/58276、WO 03/006602以及WO04/099401中。枯草杆菌酶变体的实例可以是在以下任意位置中具有突变的那些：3、4、9、15、27、36、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、217、218、222、232、235、236、245、248、252以及274，使用BPN’编号。更优选地，这些枯草杆菌酶变体可以包含以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,R S103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN’编号)。进一步优选的蛋白酶是如描述于例如WO 95/23221中的来自迟缓芽孢杆菌DSM5483的碱性蛋白酶以及描述于WO 92/21760、WO 95/23221、EP 1921147以及EP 1921148中的其变体。
胰蛋白酶样蛋白酶的实例为胰蛋白酶(例如来自猪或牛的)和如WO89/06270和WO 94/25583中所公开的镰孢霉属的蛋白酶。有用的蛋白酶的实例是如WO 92/19729，WO 98/20115，WO 98/20116和WO 98/34946所描述的变体，特别是在一个或多个下述位置发生取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、以及274。
金属蛋白酶的实例是如描述于WO 07/044993中的中性金属蛋白酶。
优选的可商购的蛋白酶酶类包括AlcalaseTM、CoronaseTM、DuralaseTM、DurazymTM、EsperaseTM、EverlaseTM、KannaseTM、LiquanaseTM、LiquanaseUltraTM、OvozymeTM、PolarzymeTM、PrimaseTM、RelaseTM、SavinaseTM和Savinase UltraTM(诺维信公司)，AxapemTM(吉斯特-博克斯公司(Gist-Brocases N.V.))，BLAP和BLAP X(汉高公司(Henkel AG&Co.KGaA))，ExcellaseTM、FN2TM、FN3TM、FN4TM、MaxacaTM、MaxapemTM、MaxataseTM、ProperaseTM、PurafastTM、PurafectTM、PurafectOxPTM、Purafect PrimeTM和PuramaxTM(杰能科有限公司)。
脂肪酶和角质酶：适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体酶。实例包括来自嗜热真菌属的脂肪酶，例如如描述于EP 258068和EP 305216中的来自疏绵状嗜热丝孢菌(早先命名为疏棉状腐质霉)；来自腐质霉属的角质酶，例如特异腐质霉(WO96/13580)；来自假单胞菌属的菌株的脂肪酶(这些中的一些现在改名为伯克霍尔氏菌属)，例如产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP 218272)、洋葱假单胞菌(EP 331376)、假单胞菌属菌株SD705(WO 95/06720 & WO96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012)；GDSL-型链霉菌属脂肪酶(WO 10/065455)；来自稻瘟病菌的角质酶(WO 10/107560)；来自门多萨假单胞菌的角质酶(US 5,389,536)；来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifidafusca)的脂肪酶(WO 11/084412)；嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO11/084417)；来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO 11/084599)；以及来自灰色链霉菌(WO 11/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)的脂肪酶(WO12/137147)。
另外的实例是有时被称为酰基转移酶或过水解酶(perhydrolase)的脂肪酶，例如与南极假丝酵母脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO10/111143)、来自耻垢分枝杆菌的酰基转移酶(WO 05/56782)、来自CE 7家族的过水解酶(WO 09/67279)、以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体，特别是用于在来自亨斯迈纺织染化私人有限公司(Huntsman Textile Effects PteLtd)的商业化产品Gentle Power Bleach(柔和漂白剂)中使用的S54V变体(WO 10/100028)。
其他实例是脂肪酶变体，例如描述于EP 407225、WO 92/05249、WO94/01541、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/30744、WO 95/35381、WO95/22615、WO 96/00292、WO 97/04079、WO 97/07202、WO 00/34450、WO00/60063、WO 01/92502、WO 07/87508以及WO 09/109500中的那些。
优选的商业化脂肪酶产品包括LipolaseTM、LipexTM；LipolexTM和LipocleanTM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特-博克德斯公司(Gist-Brocades))。
淀粉酶：淀粉酶可以是一种α-淀粉酶、β-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以是细菌或真菌来源的。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体。淀粉酶包括例如获得自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，例如GB 1,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌具体株系的α-淀粉酶。
淀粉酶的实例是具有WO 95/10603中的SEQ ID NO:3的那些或与SEQ IDNO:3具有90％序列一致性的其变体。优选的变体描述于WO 94/02597、WO94/18314、WO 97/43424以及WO 99/019467的SEQ ID NO:4中，例如在WO95/10603中的SEQ ID NO:3的一个或多个以下位置处具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。
可以使用的其他淀粉酶是具有WO 02/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其变体以及包含示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶。
另外的淀粉酶实例是具有WO 99/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其变体以及具有WO 96/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的淀粉酶或其变体。可以使用的其他淀粉酶是具有WO 08/153815的SEQ IDNO:2、WO 01/66712中的SEQ ID NO:10的淀粉酶或其变体。
可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 09/061380的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其变体以及具有WO 01/66712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或其变体。
可商购的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM、StainzymeTM、Stainzyme PlusTM、NatalaseTM和BANTM(诺维信公司)，RapidaseTM和PurastarTM(来自杰能科国际有限公司)。
过氧化物酶/氧化酶：适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包含化学修饰的或蛋白工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属，例如来自灰盖鬼伞的过氧化物酶，以及其变体，如在WO93/24618、WO 95/10602、以及WO 98/15257中描述的那些。
可商购的过氧化物酶包括GuardzymeTM(诺维信公司)。
这种或这些洗涤剂酶可以通过添加包含一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包含所有这些酶的一种组合添加剂而被包含于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独的添加剂或组合的添加剂，可以例如配制为颗粒、液体、浆料等。优选的洗涤剂添加剂配制品为颗粒，尤其是无尘颗粒；液体，尤其是稳定化的液体；或浆料。
无尘颗粒可以例如如在US 4,106,991和4,661,452中所披露而产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行涂覆。蜡状涂覆材料的实例为具有1000至20000的平均摩尔重量的聚环氧乙烷产物(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧化壬基苯酚；乙氧化脂肪醇，其中该醇包含12至20个碳原子，并且其中有15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜涂覆材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP 238,216中披露的方法制备。
辅料
还可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐剂、防缩剂、抗污物再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解剂(disintegration agent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC、和/或多元醇例如丙二醇)、织物整理剂包括黏土、填充剂/加工助剂、荧光剂增白剂/光增亮剂、泡沫促进剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污物助悬剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂、和芯吸剂，单独亦或组合使用。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何成分。此类成分的选择很好地在业内人士的技术内。
分散剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包含分散剂。具体地粉状洗涤剂可以包括分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中多羧酸包含至少两个羧基，这两个羧基被不超过两个碳原子彼此分开。例如适合的分散剂描述于粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列(PowderedDetergents,Surfactant science series)第71卷中，马塞尔·德克尔公司(MarcelDekker,Inc.)。
染料转移抑制剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。适合的聚合物染料转移抑制剂包括但不局限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮和聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于主题组合物中时，按组合物重量计，染料转移抑制剂可以按以下水平存在：从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％。
荧光增白剂：本发明的洗涤剂组合物将优选地还包含另外的组分，这些组分可以给正在清洁的物品着色，例如荧光增白剂或光增亮剂。其中增亮剂优选以约0.01％至约0.5％的水平存在。在本发明的组合物中可以使用适合用于在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。荧光增白剂的二氨芪-磺酸衍生物型的实例包括以下各项的钠盐：4,4'-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(N-甲基-N-2-羟基-乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐，4,4'-双-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羟基-乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐和2-(二苯乙烯基-4"-萘-1.,2':4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸盐。优选的荧光增白剂是Tinopal(天来宝)DMS和Tinopal(天来宝)CBS，从Ciba-Geigy AG(汽巴-嘉基股份有限公司)，巴塞尔，瑞士可得。Tinopal(天来宝)DMS是4,4'-双-(2-吗啉代-4苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪二磺酸盐的二钠盐。Tinopal(天来宝)CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)二磺酸盐的二钠盐。还优选的是，荧光增白剂是可商购的Parawhite KX，由ParamountMinerals and Chemicals(派拉蒙矿物和化学品公司)，孟买，印度供应。适合用于本发明的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-氨烷基香豆素。适合的荧光增白剂水平包括从约0.01、从0.05、从约0.1或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5或甚至0.75wt％的较高水平。
污物释放聚合物：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污物释放聚合物，这些污物释放聚合物有助于从织物，例如棉的或聚酯基织物上除去污物，特别是从聚酯基织物上除去疏水污物。污物释放聚合物可以例如是非离子的或阴离子的对苯二酸酯基聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列(Powdered Detergents,Surfactant science series)第71卷中，第7章，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker,Inc.)。污物释放聚合物的另一类型是两亲烷氧基化的油污清洁聚合物，该聚合物包括芯结构和多个附接至该芯结构的烷氧基化基团。芯结构可以包括聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，如详述于WO 2009/087523中(将其通过引用结合在此)。此外，随机接枝共聚物是适合的污物释放聚合物。适合的接枝共聚物更详细地描述于WO 2007/138054、WO 2006/108856和WO 2006/113314中(将其通过引用结合在此)。其他污物释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，例如改性纤维素衍生物，例如描述于EP 1867808或WO 2003/040279中的那些(将这二者都通过引用结合在此)。适合的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺及其混合物。适合的纤维素聚合物包括阴离子改性的纤维素、非离子改性的纤维素、阳离子改性的纤维素、兼性离子改性的纤维素、及其混合物。适合的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素、及其混合物。
抗再沉积剂：本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，例如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚环氧乙烷和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸和马来酸的共聚物、和乙氧基化的聚乙亚胺。以上在污物释放聚合物下描述的基于纤维素的聚合物的功能还可以是抗再沉积剂。
其他适合的辅料包括但不局限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物软化剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶剂、香料、色素、抑泡剂、溶剂、和用于液体清洁剂的结构剂和/或结构弹性剂。
洗涤剂产品的配制
本发明的洗涤剂组合物可以处于任何常规形式，例如棒、均匀的片剂、具有两个或更多个层的片剂、具有一个或多个室的袋、规则的或压缩的粉、颗粒、膏、凝胶、或规则压缩的或浓缩的液体。存在多种洗涤剂配制品形式，例如层(相同或不同相)、袋以及用于机械给料装置的形式。
袋可以被配置为单个或多个的室。它可以具有适合保存该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。袋由封装内体积的水溶性膜制成。可以将所述内体积分为袋的室。优选的膜是形成膜或片的聚合材料，优选是聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物以及，羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，在膜中的聚合物(例如PVA)的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混物组合物，该共混物组合物包含可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考M8630下，如由美国印第安纳州盖里(Gary,Ind.，US)的克里斯克拉夫特工业产品公司(Chris Craft In.Prod.)销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包括固体衣物清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在构成上可以与包含固体的室不同。参考文献：(US 2009/0011970 A1)。
可以由水可溶的袋中或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分物理地彼此分开。由此可以避免组分之间的负面的存储相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。
非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地包含按重量计至少20％并且最高达95％的水，例如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。其他类型的液体，包括但不局限于链烷醇、胺、二醇、醚和多元醇，可以包含在水性液体或凝胶中。水性液体或凝胶洗涤剂可以包含从0-30％的有机溶剂。液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。
洗衣皂条
本发明的酶可以被添加至洗衣皂条中并且用于手洗洗衣、织物和/或纺织品。术语洗衣皂条包括洗衣条、皂条、组合条(combo bar)、合成洗涤剂条以及洗涤剂条。条的类型通常区别在于它们包含的表面活性剂的类型，并且术语洗衣皂条包括包含来自脂肪酸的肥皂和/或合成皂的那些。洗衣皂条具有在室温下为固体而非液体、凝胶或粉末的物理形式。术语固体被定义为不随着时间显著变化的物理形式，即如果将一固体物体(例如洗衣皂条)放置于一个容器内部，该固体物体不发生改变来填充它被放置于其中的容器。条典型地是处于条形的固体但是可以处于其他固体形状，例如圆形或卵形。
洗衣皂条可以包含一种或多种另外的酶，蛋白酶抑制剂例如肽醛类(或次硫酸盐加合物或半缩醛加合物)，硼酸，硼酸盐，硼砂和/或苯基硼酸衍生物例如4-甲酰基苯基硼酸，一种或多种肥皂或合成表面活性剂，多元醇例如甘油，pH控制化合物例如脂肪酸、柠檬酸、乙酸和/或甲酸，和/或一价阳离子和有机阴离子的盐，其中该一价阳离子可以是例如Na+、K+或NH4 +并且该有机阴离子可以是例如甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或乳酸盐，这样使得一价阳离子和有机阴离子的盐可以是例如甲酸钠。
洗衣皂条还可以包含络合剂像EDTA和HEDP，香料和/或不同类型的填充剂，表面活性剂例如阴离子型合成表面活性剂，助洗剂，聚合的污物释放剂，洗涤剂螯合剂，稳定剂，填充剂，染料，着色剂，染料转移抑制剂，烷氧基化的聚碳酸酯，抑泡剂，结构剂，粘合剂，浸出剂，漂白活化剂，粘土去污剂，抗再沉积剂，聚合分散剂，增白剂，织物柔软剂，香料和/或本领域已知的其他化合物。
洗衣皂条可以在常规的洗衣皂条制造设备中进行加工，例如但不限制于：混合器、压条机例如双级真空压条机、挤出机、切割机、标识压模机(logo-stamper)、冷却隧道以及包装机。本发明不局限于通过任何单一方法制备洗衣皂条。可以在过程的不同阶段向肥皂中添加本发明的预混料。例如，可以制备包含肥皂、酶、任选地一种或多种另外的酶、蛋白酶抑制剂以及一价阳离子和有机阴离子的盐的预混料并且然后将该混合物压条。可以同时添加作为例如处于液态的蛋白酶抑制剂的酶以及任选的另外的酶。除了混合步骤和压条步骤以外，该工艺还可以进一步包括研磨、挤出、切割、压模、冷却和/或包装的步骤。
颗粒洗涤剂配制品
如描述于WO 09/092699、EP 1705241、EP 1382668、WO 07/001262、US6472364、WO 04/074419或WO 09/102854中的，可以配制颗粒洗涤剂。其他有用的洗涤剂配制品描述于以下各项中：WO 09/124162、WO 09/124163、WO 09/117340、WO 09/117341、WO 09/117342、WO 09/072069、WO09/063355、WO 09/132870、WO 09/121757、WO 09/112296、WO09/112298、WO 09/103822、WO 09/087033、WO 09/050026、WO09/047125、WO 09/047126、WO 09/047127、WO 09/047128、WO09/021784、WO 09/010375、WO 09/000605、WO 09/122125、WO09/095645、WO 09/040544、WO 09/040545、WO 09/024780、WO09/004295、WO 09/004294、WO 09/121725、WO 09/115391、WO09/115392、WO 09/074398、WO 09/074403、WO 09/068501、WO09/065770、WO 09/021813、WO 09/030632、以及WO 09/015951。
WO 2011025615、WO 2011016958、WO 2011005803、WO 2011005623、WO 2011005730、WO 2011005844、WO 2011005904、WO 2011005630、WO2011005830、WO 2011005912、WO 2011005905、WO 2011005910、WO2011005813、WO 2010135238、WO 2010120863、WO 2010108002、WO2010111365、WO 2010108000、WO 2010107635、WO 2010090915、WO2010033976、WO 2010033746、WO 2010033747、WO 2010033897、WO2010033979、WO 2010030540、WO 2010030541、WO 2010030539、WO2010024467、WO 2010024469、WO 2010024470、WO 2010025161、WO2010014395、WO 2010044905、
WO 2010145887、WO 2010142503、WO 2010122051、WO 2010102861、WO 2010099997、WO 2010084039、WO 2010076292、WO 2010069742、WO2010069718、WO 2010069957、WO 2010057784、WO 2010054986、WO2010018043、WO 2010003783、WO 2010003792、
WO 2011023716、WO 2010142539、WO 2010118959、WO 2010115813、WO 2010105942、WO 2010105961、WO 2010105962、WO 2010094356、WO2010084203、WO 2010078979、WO 2010072456、WO 2010069905、WO2010076165、WO 2010072603、WO 2010066486、WO 2010066631、WO2010066632、WO 2010063689、WO 2010060821、WO 2010049187、WO2010031607、WO 2010000636。
以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。
实例
材料与方法
蛋白酶测定法
1)Suc-AAPF-pNA测定法：
pNA底物：   Suc-AAPF-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1400)。
温度：      室温(25℃)
测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mMCABS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100，用HCl或NaOH调节至pH值2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、和11.0。
将20μl蛋白酶(稀释于0.01％Triton X-100中)与100μl测定缓冲液混合。通过添加100μl pNA底物(50mg溶解于1.0ml DMSO中并且用0.01％Triton X-100进一步稀释45倍)开始测定。监测OD405的增加作为蛋白酶活性的量度。
2)Protazyme AK测定法：
底物：   Protazyme AK片(交联和染色的酪蛋白；来自麦格酶公司(Megazyme))
温度：   受控的(测定温度)。
测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mMCABS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100，pH6.5或pH7.0。
通过温和搅拌，将一片Protazyme AK悬浮于中2.0ml 0.01％Triton X-100中。将500μl的这种悬液和500μl的测定缓冲液分散在艾本德离心管(Eppendorf tube)中并置于冰上。添加20μl蛋白酶样品(稀释在0.01％TritonX-100中)。通过将艾本德离心管转移至设定为测定温度的艾本德恒温混匀仪(Eppendorf thermomixer)来启动测定。将管在艾本德恒温混匀仪上在最高振摇速率(1400转/分钟)下孵育15分钟。通过转移该管返回至冰浴停止孵育。随后将管在冰冷的离心机中离心数分钟并将200μl上清液转移至微量滴定板。读取OD650作为蛋白酶活性的量度。在测定法中包含空白缓冲液(bufferblind)(代替酶)。
3)Suc-AAPX-pNA测定：
pNA底物：Suc-AAPA-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1775)
             Suc-AAPR-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1720)
             Suc-AAPD-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1835)
             Suc-AAPI-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1790)
             Suc-AAPM-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1395)
             Suc-AAPV-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1770)
             Suc-AAPL-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1390)
             Suc-AAPE-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1710)
             Suc-AAPK-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1725)
             Suc-AAPF-pNA(瑞士巴亨(Bachem)L-1400)
温度：       室温(25℃)
测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mMCABS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100，pH9.0。
将20μl蛋白酶(稀释于0.01％Triton X-100中)与100μl测定缓冲液混合。通过添加100μl pNA底物(50mg溶解于1.0ml DMSO中并且用0.01％Triton X-100进一步稀释45倍)开始测定。监测OD405的增加作为蛋白酶活性的量度。
邻苯二甲醛(OPA)测定法
这一测定检测伯胺并且因此可以将肽键由一种蛋白酶的切割测量为蛋白酶处理的样品与对照样品之间的吸光度的差异。基本上根据尼尔森(Nielsen)等人(尼尔森(Nielsen)，PM,彼得森(Petersen)，D,达姆麦妮(Dampmann)，C.用于确定食物蛋白水解程度的改进方法(Improvedmethod for determining food protein degree of hydrolysis)，2001，食品科学杂志(J Food Sci)，66:642-646)进行该测定。
将500μl样品通过100kDa微量浓缩(Microcon)离心过滤器(60min，11,000rpm，5℃)过滤。将这些样品在去离子水中稀释大约(例如10倍、50倍或100倍)，并将25μL的每份样品装载到96孔微量滴定板中(5个重复)。将200μl OPA试剂(100mM四硼酸二钠十水合物，3.5mM十二烷基硫酸钠(SDS)，5.7mM二硫苏糖醇(DDT)，6mM邻苯二甲醛)分配在所有孔中，振荡该板(10sec，750rpm)并且在340nm下测量吸光度。
大豆-玉米粉测定法(SMM测定法)
使用大豆-玉米粉作为底物的终点测定以获得在pH3-7时该蛋白酶的活性曲线。
底物：        将大豆粉-玉米粉以30:70比例混合物。
测定缓冲液：  制备包含100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CAPS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100的9种缓冲液并使用HCl或NaOH调节至一pH值这样使得在将大豆-玉米粉底物(1g)与测定缓冲液(10mL)混合之后给出一种浆体，该浆体的终pH是以下pH之一：3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0以及11.0。
在添加蛋白酶并在40℃下孵育(500rpm)3小时之前将底物浆体(2mL)混合30min。将蛋白酶(200mg酶蛋白/kg干物质)溶解于100μl 100mM乙酸钠(NaOAc)缓冲液(9.565g/l NaOAc，1.75g/l乙酸，5mM CaCl2，0.01％BSA，0.01％吐温20，pH6.0)中并且添加。离心(10min，4000rpm，0℃)后收集上清液并且基于基本上根据尼尔森(Nielsen)等人(尼尔森(Nielsen)，PM,彼得森(Petersen)，D,达姆麦妮(Dampmann)，C.用于确定食物蛋白水解程度的改进方法(Improved method for determining foodprotein degree of hydrolysis).食品科学杂志(J Food Sci)，2001,66:642-646)的邻苯二醛(o-phthat-dialdehyde)(OPA)方法，使用比色测定确定蛋白活性。本测定检测游离α-氨基基团，并且因此蛋白酶活性可被测量为吸光度的增加。将每份上清液的第一个500μl通过100kDa微量浓缩过滤器经由离心(60min，11,000rpm，5℃)进行过滤。将这些样品在去离子水中稀释10x，并将25μL的每份样品装载到96孔微量滴定板中(5个重复)。最后，将200μl OPA试剂分配在所有孔中，并振荡该板(10sec，750rpm)，并且在340nm下测量吸光度。蛋白酶活性水平被计算为酶处理的样品和空白样品的吸光度之间的差异，并且表示为‘OD x稀释系数’。
结果提供于以下实例4中。
菌株
编码来自红色糖多孢菌的S1蛋白酶1的核苷酸序列由奥林利克(Oliynyk)等人公布于‘产生红霉素的细菌红色糖多孢菌NRRL23338的全基因组序列(Complete genome sequence of the erythromycin-producing bacteriumSaccharopolyspora erythraea NRRL23338)’中，2007，自然生物技术(Nat.Biotechnol.)25:447-453并且将该基因在登录号EMBL：AM420293下提交至EMBL/GenBank。根据奥林利克(Oliynyk)，‘使用的菌株NRRL23338是红色糖多孢菌NRRL2338的模式菌株的原始形式，现在该菌株在NRRL数据库中被列为白色NRRL23338(NRRL23338white)’。NRRL数据库指示(在对应于白色NRRL23338的NRRL编号B-24071下)‘白色菌落变体分离自来自第二冻干的安瓿的生长’。用于NRRL2338的参考文献引用US 2,653,899，其中指出在1952年或之前从菲律宾群岛的怡朗市(Ilonio City)获得作为土壤样品的红色糖多孢菌NRRL2338的原始样品。
实例1：用于表达来自红色糖多孢菌的S1蛋白酶1的枯草芽孢杆菌菌株的构建
基于被鉴定为SEQ ID NO:1的公开的核苷酸序列，由Gene Art(基因技术生物园公司(GENEART AG BioPark)，约瑟夫-恩格特大街(Josef-Engert-Str.)11号，93053，雷根斯堡，德国)合成具有SEQ ID NO:3的合成基因。如在PCT/EP11/064585的实例1中所述，使用ClaI和MluI限制酶切位点将该合成基因亚克隆进芽孢杆菌属表达载体中。在补充有6μg氯霉素每ml的LB板上选择转化株。
选择包含整合的表达构建体的重组体枯草芽孢杆菌克隆并且将其指定为红色糖多孢菌S1-1。将其在500mL带挡板的锥形瓶(Erlenmeyer flask)中的旋转摇床上培养，每个锥形瓶包含补充有34mg/l氯霉素的100ml基于酪蛋白的培养基。将该克隆在37℃下培养3天。收获包含上清液的酶并如实施例2中所述的将该酶进行纯化。将纯化的肽酶指定为来自红色糖多孢菌的S1蛋白酶1。
实例2：来自菌株红色糖多孢菌S1-1的红色糖多孢菌的S1蛋白酶1的纯化。
将红色糖多孢菌S1-1培养液离心(20000xg，20min)并且将上清液小心地与沉淀物滗析分开。上清液通过耐洁(Nalgene)0.2μm过滤装置过滤以便除去剩余芽孢杆菌属宿主细胞。向0.2μm滤液中添加固体硫酸铵，至(NH4)2SO4的终硫酸铵浓度为1.4M。将硫酸铵调节的0.2μm滤液施加至在100mM H3BO3，10mM MES/NaOH，2mM CaCl2，1.4M(NH4)2SO4，pH6.0中平衡的苯基Toyopearl650S柱(来自东曹公司(TosoHaas))上。在用平衡缓冲液充分洗涤该柱之后，在相同的缓冲液中将蛋白酶经三个柱体积的线性(NH4)2SO4梯度(1.4-->0M)进行洗脱。分析来自该柱的部分的蛋白酶活性(使用pH9下的Suc-AAPF-pNA测定法)。合并蛋白酶峰并且将其转移至G25交联葡聚糖(G25Sephadex)柱(来自GE医疗集团)上的100mM H3BO3，10mM MES/NaOH，2mM CaCl2，pH6.0。G25交联葡聚糖转移的酶轻微混浊并且将其通过耐洁0.2μm过滤装置进行过滤。用20％CH3COOH将过滤的酶溶液的pH调节至pH4.5并且将该溶液施加至在20mM CH3COOH/NaOH，1mMCaCl2，pH4.5中平衡的SP-琼脂糖FF(SP-sepharose FF)柱(来自GE医疗集团)上。在用平衡缓冲液充分洗涤该柱之后，在相同的缓冲液中将蛋白酶经五个柱体积的线性NaCl梯度(0-->0.5M)进行洗脱。分析来自该柱的部分的蛋白酶活性(使用pH9下的Suc-AAPF-pNA测定法)。合并蛋白酶峰并且将其转移至G25交联葡聚糖柱(来自GE医疗集团)上的10mM丁二酸/NaOH，pH3.5。将G25交联葡聚糖转移的酶施加至在10mM丁二酸/NaOH，pH3.5中平衡的SOURCE S柱(来自GE医疗集团)上。在用平衡缓冲液充分洗涤该柱之后，在相同的缓冲液中将蛋白酶经三十个柱体积的线性NaCl梯度(0-->0.5M)进行洗脱。分析来自该柱的部分的蛋白酶活性(使用pH9下的Suc-AAPF-pNA测定法)，并且通过SDS-PAGE进一步分析活性部分。将在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上仅见到一条带的部分合并并且用3％NaOH将pH调节至pH5.0。来自SOURCE S柱的调节的合并物是纯化制剂并且用于进一步表征。
实例3：来自红色糖多孢菌的S1蛋白酶1的表征
将Suc-AAPF-pNA测定法用于获得pH-活性曲线和pH-稳定性曲线(在指示的pH值下2小时之后的残余活性)。对于pH-稳定性曲线，将蛋白酶在不同测定缓冲液中稀释10x以达到这些缓冲液的pH值并且然后在37℃下孵育2小时。在孵育之后，通过稀释于pH10.0测定缓冲液中，使该蛋白酶孵育物的pH转至与残余活性测定之前相同的pH值。使用Protazyme AK测定法以获得在pH7.0下的温度-活性曲线。使用Suc-AAPX-pNA测定和十种不同的Suc-AAPX-pNA底物以获得这些酶在pH9.0下的P1-特异性。
结果显示在下表2-5中。对于表2，活性是相对于酶的最佳pH而言。对于表3，活性是相对于样品的残余活性，将该样品在稳定条件(5℃，pH9.0)下保持。对于表4，活性是相对于酶在pH7.0下的最佳温度而言。对于表5，活性是相对于酶的最佳底物(Suc-AAPF-pNA)而言。
表2：在25℃下的pH-活性曲线
pH 来自红色糖多孢菌的S1蛋白酶1 蛋白酶10R
2 0.00
3 0.00 0.00
4 0.02 0.02
5 0.09 0.07
6 0.26 0.21
7 0.45 0.44
8 0.74 0.67
9 0.96 0.88
10 1.00 1.00
11 1.00 0.93
表3：pH-稳定性曲线(在37℃下2小时之后的残余活性)
表4：在pH7.0或pH6.5处的温度活性曲线
表5：在pH9.0处对10种Suc-AAPX-pNA底物的P1-特异性
Suc-AAPX-pNA 来自红色糖多孢菌的S1蛋白酶1 蛋白酶10R
Suc-AAPA-pNA 0.03 0.13
Suc-AAPR-pNA 0.08 0.09
Suc-AAPD-pNA 0.00 0.00
Suc-AAPI-pNA 0.00 0.00
Suc-AAPM-pNA 0.40 0.78
Suc-AAPV-pNA 0.01 0.01
Suc-AAPL-pNA 0.19 0.18
Suc-AAPE-pNA 0.00 0.00
Suc-AAPK-pNA 0.04 0.08
Suc-AAPF-pNA 1.00 1.00
与蛋白酶10R的数据比较的来自红色糖单孢菌的S1蛋白酶1的对Suc-AAPF-pNA底物的pH-活性、pH-稳定性曲线(在37℃下2小时之后的残余活性)、在pH7.0下对Protazyme AK的温度活性曲线以及在pH9.0下对10种Suc-AAPF-pNA底物的P1-特异性也示于图1至图4中。
来自红色糖多孢菌的S1蛋白酶1的其他特征
抑制剂：PMSF。
确定N-端序列为：YNVVGGD。
如通过SDS-PAGE确定的相对分子量是大约Mr＝20kDa。
通过完整分子量分析确定的分子量是19337.5Da。
来自MS-埃德曼(MS-EDMAN)数据的成熟序列(并且如从SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3演绎的)：
YNVVGGDAYYMGGRCSVGFSVRSSSGQAGFVTAGHCGTRGTAVSGYNQVAMGSFQGSSFPNNDYAWVSVNSNWTPQPWVNLYNGSARVVSGSSAAPVGSSICRSGSTTGWHCGSVQALNQTVRYAEGTVYGLTRTNVCAEPGDSGGSFISGNQAQGMTSGGSGNCSSGGTTYFQPVNEALSAYGLSLVRG(SEQ ID NO:5)。
来自这一成熟序列的计算的分子量是19336.9Da。
实例4：在大豆-玉米粉测定法(SMM测定法)中的蛋白酶活性
使用大豆-玉米粉测定法描述蛋白酶对与动物饲料相关的底物的活性。结果示于下表6和图5中。来自红色糖多孢菌的S1蛋白酶1对大豆-玉米粉的蛋白水解活性以从pH3至pH7的渐增的pH增加，并且在整个pH范围内的活性高于蛋白酶10R，表明来自红色糖多孢菌的S1蛋白酶1在例如猪和家禽的胃肠道中可以更有效水解蛋白质。
表6：在pH3.0、4.0、5.0、6.0、和7.0处对大豆-玉米粉的蛋白酶活性
实例5：对来自肉仔鸡的嗉囊、砂囊和回肠消化物的蛋白水解活性
收集来自喂食玉米-大豆饮食的21天大的肉仔鸡的嗉囊、砂囊和回肠消化物材料；冻干并用小型磨咖啡机进行研磨。将这些研磨的样品悬浮(47％w/v)于以下的缓冲液中并且使其在4℃与水化合过夜(不搅拌)：
嗉囊缓冲液：100mM HEPES，1mM CaCl2·2H2O，150mM KCl，0.01％Triton X-100，使用HCl调节至pH5
砂囊缓冲液：100mM琥珀酸，1mM CaCl2·2H2O，150mM KCl，0.01％Triton X-100，使用HCl调节至pH1.67
回肠缓冲液：100mM HEPES，1mM CaCl2·2H2O，150mM KCl，0.01％Triton X-100，使用HCl调节至pH7.2
所得pH是：在嗉囊样品中pH5；在砂囊样品中pH3；以及在回肠样品中pH7。将悬浮液加热至40℃并将1ml分配到多个管中，保持在40℃下。将代表空白(T0)的三个管即刻离心(3000xg，0℃，10min)并冷冻上清液。向这些管中添加在50μL 100mM乙酸钠缓冲液(9.565g/l NaOAc，1.75g/l乙酸，5mM CaCl2，0.01％BSA，0.01％吐温20，pH6.0)中的酶(200mg酶蛋白/kg底物)或用于空白样品的仅仅乙酸钠缓冲液(50μL)，并且在40℃下伴随振荡(500rpm)，将嗉囊和回肠样品孵育3小时(T3)而将砂囊样品孵育1小时(T1)。将这些样品离心(3000xg，0℃，10min)并且恢复上清液并冷冻。使用邻苯二甲醛(OPA)测定法通过分析伯胺确定蛋白水解活性。
结果示于表7中。对于这些消化物类型(嗉囊、砂囊和回肠)中的每种，在空白T0样品中的可溶性伯胺的水平之间存在显著差异，并将这些空白样品孵育1或3小时。这一差异可以归于底物中存在的以及源自饮食原料或动物的蛋白酶的溶解作用和活性。与空白样品相比，来自红色糖多孢菌的S1蛋白酶1显著地增加了嗉囊和回肠样品中的可溶性伯胺的水平。通过来自红色糖多孢菌的S1蛋白酶1观察到的增加与蛋白酶10R的增加一样高或数字上高于蛋白酶10R的增加，表明这一蛋白酶对给定的底物具有略高的蛋白水解潜力。
表7：与蛋白酶10R相比，当用肉仔鸡消化物孵育时，来自红色糖多孢菌的S1 蛋白酶1的蛋白水解活性，并表示为由OPA测定法所测量的伯胺的水平 (OD 340 ×稀释系数)
处理 嗉囊(3小时) 砂囊(1小时) 回肠(3小时)
空白(T0) 2.21±0.02c 2.95±0.02b 9.37±0.08b
空白 3.54±0.02b 3.85±0.13a 14.42±0.52a
蛋白酶10R 3.85±0.07a 3.87±0.13a 14.74±0.16a
来自红色糖多孢菌的S1蛋白酶1 3.87±0.10a 3.89±0.04a 14.84±0.14a
在一栏中的没有通过相同的上标字母连贯的a,b,c,d值是通过图基克雷默(Tukey Kramer)检验(α＝0.05)(由ANOVA程序(SAS研究所有限公司)提供)确定的统计性差异。
实例6：热稳定性
将蛋白酶的蛋白样品的等分试样(如实例2中所述的经过纯化的)脱盐或使用预装PD-10柱改变缓冲液为20mM乙酸钠，pH4.0或在4℃下以2-3h步骤针对2x500ml 20mM乙酸钠，pH4.0进行透析，随后是一个过夜步骤。将该样品进行0.45μm过滤并用缓冲液稀释至大约2 A280单位。在差示扫描量热法(DSC)中使用该透析缓冲液作为参照。使用真空吸引器对这些样品进行脱气并搅拌大约10分钟。
以1.5℃/min的连续扫描速率从20℃-90℃在MicroCal VP-DSC上进行DSC扫描。使用MicroCal起点软件(Origin software)(4.10版本)进行数据处理，并将变性温度Td(也称为熔解温度Tm)定义为温度自记曲线的峰尖端的温度。
实例7：蒸汽稳定性
使用以下测定法评价蒸汽处理后该蛋白酶的残余活性。
在这些试验中，使用修改设置从而该蒸汽是从蒸汽发生器中提供的并导入到箱中。当温度达到约93℃-94℃时，通过抽屉将放置在板上的这些样品插入到该箱中。插入这些样品后，温度即降低4℃。当温度停留在大约恒定的90℃时，孵育30秒。其后，将该板快速从该箱中移出，将这些样品放置在冰上，重悬浮并针对蛋白酶活性使用Suc-AAPF-pNA或邻苯二甲醛(OPA)测定法进行评价。将每个酶样品与未经过蒸汽处理的相似样品进行对比以计算残余活性。
实例8：造丸稳定性测试
如美国专利号4,106,991，实例1中所述的方式进行酶粒化。将获得的颗粒在流化床中干燥至含水量低于1％并过筛以获得具有250μm至850μm粒子范围的产物。最终，将该产物用棕榈油和碳酸钙以如在美国专利号4,106,991，实例22中所述的方式进行包衣。
在小型卧式搅拌器中，大致地将50g酶颗粒与10kg饲料预混合10分钟。在大型卧式搅拌器中将该预混合物与90kg饲料混合10分钟。将该饲料从该搅拌器中以大约300kg/小时的速率导至调节器(带有蒸汽注入的串联搅拌器)。该调节器通过注入蒸汽将该饲料加热至95℃(在排气口进行测量)。在该调节器中的停留时间是30秒。将该饲料从该调节器中导至配备有3.0x35mm水平冲模的西蒙黑森(Simon Heesen)压力机中并将其压缩成具有大约15mm的长度的丸。在压缩后，将这些丸放置在冷气机中并冷却15分钟。
在造丸之前使用Suc-AAPF-pNA测定法测量蛋白酶活性，并在造丸之后测量该饲料丸中的蛋白酶活性。通过将丸状饲料中的蛋白酶活性相对于非丸状饲料中的活性相对比确定造丸稳定性。
在此描述并且要求的本发明不限于在此披露的具体方面的范围，因为这些方面意图作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包含定义的本披露为准。

Claims (29)

1.一种具有蛋白酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种与SEQ ID NO:5具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽；
(b)一种由在高严谨度条件、或非常高严谨度条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码的多肽：
(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；
(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列；和/或
(iii)(i)或(ii)的全长互补链；
(c)一种由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
(d)包含SEQ ID NO:5的一个或多个(若干个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体；以及
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性；
在动物饲料和洗涤剂组合物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其中该多肽由在高严谨度条件、或非常高严谨度条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码：
(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；
(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列；和/或
(iii)(i)或(ii)的全长互补链。
3.如权利要求1-2中任一项所述的用途，其中该多肽包含SEQ ID NO:2或由其组成。
4.如权利要求1-2中任一项所述的用途，其中该多肽包含SEQ ID NO:4或由其组成。
5.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其中该多肽是SEQ ID NO:2，SEQID NO:4；和/或SEQ ID NO:5的一个片段，其中该片段具有蛋白酶活性。
6.一种具有蛋白酶活性并且与SEQ ID NO:5具有至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性的变体多肽，该变体多肽包含SEQ ID NO:5的至少一个或多个(若干个)氨基酸的至少一个取代、缺失和/或插入。
7.一种包含具有蛋白酶活性的分离的多肽的组合物，该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种与SEQ ID NO:5具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽；
(b)一种由在高严谨度条件、或非常高严谨度条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码的多肽：
(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；
(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列；和/或
(iii)(i)或(ii)的全长互补链；
(c)一种由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少80％，例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
(d)包含SEQ ID NO:5的一个或多个(若干个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体；以及
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。
8.一种编码如权利要求1-7中任一项表明的多肽的分离的多核苷酸，其条件是它与SEQ ID NO:1或其成熟多肽编码部分不100％相同。
9.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如权利要求8所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至在表达宿主细胞内指导该多肽产生的一个或多个(若干个)控制序列上。
10.一种重组表达宿主细胞，该重组表达宿主细胞包含如权利要求8所述的一种多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽产生的一个或多个控制序列上。
11.如权利要求10所述的宿主细胞，其中该宿主是一种细菌，如芽孢杆菌属；一种真菌，如曲霉属；或一种酵母菌，如假丝酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或亚罗酵母属。
12.如权利要求11所述的宿主细胞，其中该宿主是一种芽孢杆菌属细菌，例如地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽胞杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌。
13.一种产生如权利要求1-7中任一项表明的多肽的方法，该方法包含：
(a)在有益于产生该多肽的条件下培养一种细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且
(b)回收该多肽。
14.一种产生如权利要求1-7中任一项表明的多肽的方法，该方法包含：
(a)在有益于产生该多肽的条件下培养如权利要求10至12中任一项所述的一种宿主细胞；并且
(b)回收该多肽。
15.用一种多核苷酸转化的一种转基因植物、植物部分或植物细胞，该多核苷酸编码如权利要求1-7中任一项表明的多肽。
16.一种产生如权利要求1-7中任一项表明的多肽的方法，该方法包含：
(a)在有益于产生该多肽的条件下培养如权利要求15所述的一种转基因植物或植物细胞；并且
(b)回收该多肽。
17.如权利要求1-7中任一项表明的至少一种多肽在以下各项中的用途：
在动物饲料中；
在动物饲料添加剂中；
在用于在动物饲料中使用的组合物的制备中；
用于改善动物饲料的营养价值；
用于增加动物饲料中的可消化和/或可溶性蛋白；
用于增加动物饮食中的蛋白的水解程度；和/或
用于处理蛋白。
18.一种用于改善动物饲料的营养价值的方法，其中向该饲料中添加至少一种如权利要求1-7中任一项表明的多肽。
19.一种动物饲料添加剂，包含：
至少一种如权利要求1-7中任一项表明的多肽；以及
至少一种脂溶性维生素，和/或
至少一种水溶性维生素，和/或
至少一种微量矿物质。
20.如权利要求19所述的动物饲料添加剂，该动物饲料添加剂进一步包含以下各项中的一种或多种：淀粉酶；肌醇六磷酸酶；木聚糖酶；半乳聚糖酶；α-半乳糖苷酶；蛋白酶，磷脂酶，β-葡聚糖酶，或其任何混合物。
21.一种动物饲料，包含如权利要求18或19所述的动物饲料添加剂。
22.根据权利要求21所述的动物饲料，具有50至800g/kg的粗蛋白含量。
23.一种用于处理蛋白的方法，该方法包含将如权利要求1-7中任一项表明的至少一种多肽添加至至少一种蛋白或蛋白来源中的步骤。
24.如权利要求23所述的方法，其中大豆包含在该至少一种蛋白来源中。
25.如权利要求1-7中任一项所述的至少一种多肽在动物饲料或洗涤剂中的用途。
26.一种动物饲料或洗涤剂组合物，包含至少一种如权利要求1至7中任一项表明的多肽。
27.如权利要求26所述的动物饲料或洗涤剂组合物，其中该组合物包含一种或多种另外的酶。
28.如权利要求26所述的动物饲料或洗涤剂组合物，其中这些另外的酶选自下组，该组由以下各项组成：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧羟基脂肪酸羟化环氧化酶(haloperoxygenase)、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶，或其任何混合物。
29.如权利要求26至28中任一项所述的洗涤剂组合物，包含一种或多种选自下组的组分，该组包括表面活性剂、助洗剂、助水溶剂、漂白系统、聚合物、织物调色剂、辅料、分散剂、染料转移抑制剂、荧光增白剂、污物释放聚合物以及抗再沉积剂。
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