ES2316882T3 - Enzimas de aspergillus aculeatus con una actividad xilanasa. - Google Patents
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Abstract
Enzima que presenta actividad xilanasa, dicha enzima es codificada por una secuencia de ADN: a) comprendida en o comprendiendo la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID Nº: 1, o b) una secuencia de codificación de un polipéptido que presenta una actividad xilanasa que es al menos idéntica a 70% sobre toda la longitud a una xilanasa codificada por la SEC ID Nº: 1.
Description
Enzimas de Aspergillus aculeatus con una
actividad xilanasa.
La presente invención se refiere a una enzima
con actividad xilanasa, un método para producir la enzima, una
preparación de enzima comprendiendo la enzima, y un uso de la
enzima para varios propósitos industriales.
El xilano, un componente principal de
hemicelulosa vegetal, es un polímero de D-xilosa
enlazado por enlaces
beta-1,4-xilosídicos. El xilano
puede ser degradado en xilosa y xilo-oligómeros por
hidrólisis con ácido o enzimática. La hidrólisis enzimática de
xilano produce azúcares libres sin los subproductos formados con el
ácido (por ejemplo furanos).
Unas enzimas capaces de degradar el xilano y
otros polisacáridos de la pared celular vegetal son importantes
para la industria alimentaria, esencialmente para la industria
panadera y para el tratamiento de frutas y verduras tal como la
producción de zumo de frutas o la elaboración de vinos, donde se
utiliza su capacidad para catalizar la degradación del esqueleto o
cadenas laterales del polisacárido de pared celular vegetal (Visser
et al., Xylans and Xylanases, 1991).
Otras aplicaciones para las xilanasas son la
disgregación enzimática de residuos agrícolas para la producción de
combustibles alcohólicos, el tratamiento enzimático de alimentos
para animales para una hidrólisis de pentosanas, la fabricación de
pulpas disolventes para la producción de celulosa, y el bioblanqueo
de la pulpa de madera [Detroym R.W. en: Organic Chemicals from
Biomass, (CRC Press, Boca Raton, FL, 1981) 19-41.;
Paice, M.G., and L. Jurasek., J. Wood Chem. Technol. 4:
187-198.; Pommier, J.C., J. L. Fuentes, G. Goma.,
Tappi Journal (1989): 187-191.; Senior, D. J., et
al., Biotechnol. Letters 10
(1988):907-912].
WO 92/17573 expone una xilanasa esencialmente
pura derivada de las especies fúngicas H. insolens y de ADN
recombinante de codificación de dicha xilanasa. La xilanasa es útil
como levadura artificial, aditivo alimentario, y en la preparación
de papel y pulpa.
WO 92/01793 expone una xilanasa derivada de las
especies fúngicas Aspergillus tubigensis. Se ha mencionado,
pero no se ha demostrado que las xilanasas relacionadas pueden
derivar de otros hongos filamentosos, cuyos ejemplos son
Aspergillus, Disporotrichum, Penicillium, Neurospora,
Fusarium y Trichoderma. Las xilanasas son útiles en la
preparación de pan o de alimentos para animales, la elaboración de
cerveza y la reducción de la viscosidad o para la mejora de la
filtrabilidad del almidón de cereal.
Shei et al., 1985, y Fournier et
al., 1985 describen una purificación y caracterización de
endoxilanasas aisladas de A. Niger.
WO 91/19782 y EP 463 706 exponen una xilanasa
derivada de origen Aspergillus niger y la producción
recombinante de la misma. La xilanasa es útil en la industria de
panadería, la elaboración de cerveza, la industria de fabricación
de papel, y el tratamiento de residuos agrícolas, etc.
Un objeto de la presente invención consiste en
preparar xilanasas de un solo componente.
La enzima según la invención exhibiendo
actividad xilanasa es codificada por una secuencia de ADN
- a)
- comprendida en o comprendiendo la secuencia de ADN mostrada en la SEC ID Nº: 1; o
- b)
- una secuencia de codificación de un polipéptido con una actividad xilanasa siendo al menos idéntica en un 70% sobre la longitud total a una xilanasa codificada por la SEC ID Nº: 1.
En una forma de realización, la invención se
refiere a una enzima exhibiendo una actividad xilanasa, dicha
enzima es codificada por una secuencia de ADN comprendiendo la
secuencia parcial siguiente
o una secuencia que es idéntica en
un 70% a ésta sobre la longitud total de codificación de un
polipéptido con una actividad
xilanasa.
El término "homólogo" está destinado a
indicar un polipéptido codificado por ADN que se hibridiza en la
misma sonda que el ADN codificante para la enzima xilanasa en
ciertas condiciones específicas (tales como un prerremojo en 5xSSC
y una prehibridación durante 1 h a \sim40ºC en una solución de
5xSSC, solución de Denhardt 5x, 50 mM de fosfato sódico, pH 6.8, y
50 \mug de ADN de timo de ternero ultrasonicado desnaturalizado,
seguido de una hibridación en la misma solución donde se ha añadido
una sonda marcada con 32 P-dCTP de 50 \muCi
durante 18 h a \sim40ºC seguido de un lavado tres veces en 2xSSC,
0,2% de SDS a 40ºC durante 30 minutos). Más específicamente, el
término se refiere a una secuencia de ADN que es idéntica al menos
en un 70% sobre longitud total a la xilanasa codificada por la SEC
ID Nº: 1, tal como al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un
85%, al menos un 90% o incluso idéntica al menos en un 95% sobre
longitud total a la xilanasa codificada por la SEC ID Nº: 1. El
término está previsto para incluir modificaciones de cualquiera de
las secuencias de ADN mostradas arriba, tales como sustituciones de
nucleótido que no producen otra secuencia de aminoácidos de la
xilanasa, pero que corresponden al uso de un codón del organismo
huésped en el que el constructo de ADN está introducido o
sustituciones de nucleótido que no producen una secuencia diferente
de aminoácidos y por consiguiente, posiblemente, una estructura de
proteína diferente que pueda producir una xilanasa mutante con
propiedades diferentes a las de la enzima nativa. Otros ejemplos de
modificaciones posibles son la inserción de uno o más nucleótidos
en la secuencia, la adición de uno o más nucleótidos en cada extremo
de secuencia, o la deleción de uno o más nucleótidos en cada
extremo o al interior de la secuencia.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a una preparación enzimática útil para la degradación de
componentes de la pared celular vegetal, dicha preparación siendo
enriquecida con una enzima exhibiendo una actividad xilanasa como
se ha descrito anteriormente.
En los aspectos finales, la invención se refiere
al uso de una enzima o preparación enzimática de la invención para
varias aplicaciones industriales.
En una forma de realización preferida la enzima
de la invención comprende o está comprendida en la secuencia de
aminoácidos aparente de la SEC ID Nº: 2, o una secuencia análoga de
la misma. La secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 2
ha sido deducida a partir de la secuencia de ADN mostrada en la SEC
ID Nº. 1, de codificación de xilanasa I tal como se ha definido
anteriormente.
En el presente contexto, el término "secuencia
análoga" está destinado a indicar una secuencia de aminoácidos
que difiere de la SEC ID Nº. 2 por uno o más residuos de
aminoácidos. La secuencia análoga puede ser una secuencia obtenida
por modificación de una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC
ID Nº 2, por ejemplo implicando una sustitución de uno o más
residuos de aminoácidos en uno o más sitios diferentes en la
secuencia de aminoácidos, una deleción de uno o más residuos de
aminoácidos en cada uno de o ambos extremos de la enzima o en uno o
más sitios en la secuencia de aminoácidos, o una inserción de uno o
más residuos de aminoácidos en uno o más sitios en la secuencia de
aminoácidos. La modificación de la secuencia de aminoácidos puede
ser realizada adecuadamente por medio de una modificación de la
secuencia de ADN de codificación de la enzima, por ejemplo por
mutagénesis dirigida o aleatoria o por una combinación de estas
técnicas de acuerdo con procedimientos bien conocidos. De forma
alternativa, la secuencia análoga puede ser una de una enzima
derivada de otro origen que la xilanasa correspondiente a la SEC ID
Nº 2. La secuencia análoga exhibirá generalmente un grado de
homología (en términos de identidad) de al menos 70%, tal como al
menos 75%, 80%, 85%, 90% o incluso 95% con la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 2.
La enzima de la invención puede ser aislada por
un método general consistiendo en
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
Una descripción más detallada de este método de
selección está provista en el ejemplo 1 más abajo.
La secuencia de ADN que codifica para la enzima
puede ser aislada por ejemplo mediante una selección de una
biblioteca de ADNc de Aspergillus aculeatus, por ejemplo cepa
CBS 101.43, disponible al público por el Centraalbureau voor
Schimmelcultures, Delft, NL, y una selección de clones expresando
la actividad enzimática apropiada (es decir, actividad xilanasa tal
como está definido por la capacidad de la enzima para hidrolizar
enlaces glicosídicos en xilano). La secuencia de ADN apropiada
puede ser aislada después del clon mediante unos procedimientos
estándar, por ejemplo tal y como está descrito en el ejemplo 1. Se
espera que una secuencia de ADN que codifica para una enzima
homóloga pueda ser derivada de forma similar mediante una selección
de una biblioteca de ADNc de otro microorganismo, en particular un
hongo, tal como una cepa de otra especie Aspergillus, en
particular una cepa de
A. aculeatus o A. Niger, una cepa de especie Trichoderma, en particular una cepa de T. harzianum, o T. reesie, una cepa de especie Fusarium, en particular una cepa de F. oxysporum, o una cepa de especie Humicola o una cepa de especie Scytallidium.
A. aculeatus o A. Niger, una cepa de especie Trichoderma, en particular una cepa de T. harzianum, o T. reesie, una cepa de especie Fusarium, en particular una cepa de F. oxysporum, o una cepa de especie Humicola o una cepa de especie Scytallidium.
De manera alternativa, el ADN que codifica para
una xilanasa de la invención puede, conformemente a unos
procedimientos bien conocidos, ser aislado convenientemente del ADN
de cualquiera de los organismos mencionados anteriormente mediante
el uso de sondas oligonucleótidas sintéticas preparadas en base a
una secuencia de ADN o de aminoácidos descrita aquí.
La secuencia de ADN puede ser insertada
posteriormente en un vector de expresión recombinante. Éste puede
ser cualquier vector que puede estar expuesto convenientemente a
procedimientos de ADN recombinante, y la selección del vector
dependerá a menudo de la célula huésped en la que se tiene que
introducir. Así, el vector puede ser un vector de replicación
autónoma, es decir un vector que existe como una entidad
extracromosómica, cuya replicación es independiente de la
replicación cromosómica, por ejemplo un plásmido. De manera
alternativa, el vector puede ser uno que, cuando es introducido en
una célula huésped, se integra en el genoma de célula huésped y se
replica con el(los) cromosoma(s) en el(los) que
se ha integrado.
En el vector, la secuencia de ADN que codifica
la xilanasa debería ser conectado operativamente a un promotor
adecuado y a una secuencia de terminador. El promotor puede ser
cualquier secuencia de ADN que muestre una actividad
transcripcional en la célula huésped seleccionada y puede derivar de
genes que codifican proteínas, sean homólogos o bien heterólogos a
la célula huésped. Los procedimientos usados para enlazar las
secuencias de ADN que codifica para la xilanasa, el promotor y el
terminador, respectivamente, y para insertarlas dentro de vectores
adecuados son conocidos por los expertos en la técnica (por
ejemplo, en referencia a Sambrook et al., Molecular Cloning.
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
La célula huésped que está transformada con la
secuencia de ADN que codifica la enzima de la invención es
preferiblemente una célula eucariótica, en particular una célula
fúngica tal como una levadura o célula fúngica filamentosa. En
particular, la célula puede pertenecer a unas especies
Aspergillus, más preferiblemente Aspergillus oryzae o
Aspergillus niger. Las células fúngicas pueden ser
transformadas por un proceso incluyendo la formación de
protoplastos y transformación de los protoplastos seguido de la
regeneración de la pared celular de una manera conocida per
se. El uso de Aspergillus como microorganismo huésped
está descrito en EP 238 023 (de Novo Nordisk NS), cuyos contenidos
están incorporados en la presente como referencia. La célula
huésped también puede ser una célula de levadura, por ejemplo una
cepa de Saccharomyces cerevisiae, en particular de
Saccharomyces cerevisiae.
En un aspecto ulterior, la presente invención se
refiere a un método de producción de una enzima según la invención,
donde una célula huésped adecuada transformada con una secuencia de
ADN que codifica la enzima es cultivada bajo unas condiciones que
permiten la producción de la enzima, y la enzima resultante es
recuperada del cultivo.
El medio empleado para cultivar las células
huéspedes transformadas puede ser cualquier medio convencional
adecuado para el crecimiento de las células huéspedes en cuestión.
La xilanasa expresada puede ser segregada convenientemente en el
medio de cultivo y puede ser recuperada del mismo mediante unos
procedimientos bien conocidos incluyendo la separación de las
células del medio por centrifugado o filtración, la precipitación de
componentes proteínicos del medio mediante una sal tal como el
sulfato de amonio, seguido de unos procedimientos cromatográficos
como la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de
afinidad, o similar.
La xilanasa purificada puede ser empleada para
la inmunización de animales para la producción de anticuerpos. Más
específicamente, el antisuero contra la xilanasa de la invención
puede aumentar mediante la inmunización de conejos (u otros
roedores) según el procedimiento descrito por N. Axelsen et
al. en: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis,
Blackwell Scientific Publications, 1973, Capítulo 23, o A.
Johnstone y R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell
Scientific Publications, 1982 (más específicamente páginas
27-31). Unas inmunoglobulinas purificadas pueden ser
obtenidas a partir de los antisueros, por ejemplo mediante la
precipitación de sal ((NH_{4})_{2}SO_{4}), seguido de
una diálisis y cromatografía por intercambio iónico, por ejemplo en
DEAE-Sephadex. Una caracterización inmunoquímica de
proteínas puede realizarse sea por análisis de doble difusión de
Ouchterlony (O. Ouchterlony en: Handbook of Experimental Immunology
(D.M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific Publications, 1967, páginas
655-706), por inmunoelectroforesis cruzada (N.
Axelsen et al., supra, capítulos 3 y 4), o por
inmunoelectroforesis en cohete (N. Axelsen et al., capítulo
2).
En otro aspecto ulterior, la presente invención
se refiere a una preparación enzimática útil para la degradación de
componentes de la pared celular vegetal, dicha preparación siendo
enriquecida con una enzima exhibiendo actividad xilanasa como se ha
descrito anteriormente. De esta manera, un refuerzo de la capacidad
de degradación de la pared celular de la preparación enzimática
puede ser obtenido.
La preparación enzimática habiendo sido
enriquecida con una enzima de la invención puede por ejemplo ser
una preparación enzimática comprendiendo actividades enzimáticas
múltiples, en particular una preparación enzimática comprendiendo
enzimas múltiple que degradan la pared celular vegetal tales como
Pectinex®, Pectinex Ultra SP®, Celluclast o Celluzyme (todas
disponibles con Novo Nordisk NS). En el presente contexto, el
término "enriquecido" indica que se ha aumentado la actividad
xilanasa de la preparación enzimática, por ejemplo con un factor de
enriquecimiento de 1.1, convenientemente debido a la adición de una
enzima de la invención preparada según el método descrito
anteriormente.
De forma alternativa, la preparación enzimática
enriquecida con una enzima exhibiendo una actividad xilanasa puede
ser una preparación que comprende una enzima de la invención como el
componente enzimático principal, por ejemplo una preparación
enzimática monocomponente.
La preparación enzimática puede ser preparada
según unos métodos conocidos en la técnica y puede estar en forma
de líquido o preparación seca. Por ejemplo, la preparación
enzimática puede tener la forma de un granulado o de un
microgranulado. La enzima que debe ser incluida en la preparación
puede ser estabilizada conforme a unos métodos conocidos en la
técnica.
La preparación enzimática de la invención puede,
además de una xilanasa de la invención, contiene una o varias
enzimas que degradan otras paredes celulares vegetales, por ejemplo
aquellas con actividades celulíticas, xilanolíticas o
pectinolíticas como la \alpha-arabinosidasa,
\alpha-glucoronisidasa,
\beta-xilosidasa, acetil xilano esterasa,
arabinanasa, ramnogalacturonasa, pectina acetilesterasa,
galactanasa, poligalacturonasa, pectina liasa, pectato liasa,
glucanasa o pectina metilesterasa. La(s) enzima(s)
adicional(es) puede(n) ser producible(s) por
medio de un microorganismo del género Aspergillus,
preferiblemente Aspergillus niger, Aspergillus aculeatus,
Aspergillus awamori or Aspergillus oryzae, o
Trichoderma.
La preparación enzimática según la invención es
usada preferiblemente como un agente para la degradación o
modificación de paredes celulares vegetales o de cualquier material
conteniendo xilano originado a partir de paredes de células
vegetales debido a la alta actividad degradante de la pared celular
vegetal de la xilanasa de la invención.
Se dan unos ejemplos más abajo de usos
preferidos de la preparación enzimática de la invención. La
dosificación de la preparación enzimática de la invención y otras
condiciones en las que se usa la preparación pueden ser
determinadas con base en métodos conocidos en la técnica.
Las xilanasas de la invención hidrolizan enlaces
(\beta-1,4 en xilanos. Los xilanos son
polisacáridos que poseen un esqueleto compuesto por xilosa con
enlaces \beta-1,4. El esqueleto puede tener
diferentes ramas laterales, como la arabinosa, acetilo, ácido
glucurónico, ramas laterales de ácido
4-metilglucurónico. La composición y número de ramas
laterales varia según la fuente del xilano. Las ramas laterales de
arabinosa dominan en xilanos de endospermo de cereal, mientras que
los xilanos de madera dura contienen relativamente más
sustituyentes de acetilo y de ácido glucurónico (Michael P. Coughlan
y Geoffrey P.Hazlewood. Biotechnol. Appl. Biochem. 17:
259-289 (1993). El xilano producido a partir de
algas rojas contiene una mezcla de xilosa con enlaces
\beta-1,4 y \beta-1,3 en el
esqueleto, este tipo de xilano es degradable por xilanasas para
variar la extensión debido a los enlaces 1,4 en el esqueleto.
La degradación de xilano por xilanasas es
facilitada mediante la eliminación completa o parcial de las ramas
laterales. Los grupos acetilo pueden ser eliminados por alcali, o
por acetil xilano esterasas, los grupos laterales de arabinosa
pueden ser eliminados mediante un tratamiento de ácido suave o por
alfa-arabinosidasas y las ramas laterales de ácido
glucurónico pueden ser eliminadas por
alfa-glucuronisidasas. Los oligómeros que son
liberados por las xilanasas, o por una combinación de xilanasas y de
enzimas de hidrolización en ramas laterales como se ha mencionado
anteriormente pueden ser degradadas después para liberar xilosa
mediante las beta-xilosidasas.
Las xilanasas de la presente invención pueden
ser usadas sin otras enzimas xilanolíticas o con una actividad
limitada de otras enzimas xilanolíticas para degradar xilanos para
la producción de oligosacáridos. Los oligosacáridos pueden ser
empleados como agentes de estabilización, tales como oligosacáridos
de arabinoxilano liberados a partir de un material de pared celular
de cereal, o de arabinoxilanas más o menos purificadas de
cereales.
Las xilanasas de la presente invención pueden
ser empleadas en combinación con otras enzimas xilanolíticas para
degradar xilanos en xilosa y otros monosacáridos. La xilosa
liberada puede convertirse en otros compuestos como unos sabores de
furanona.
Las xilanasas de la presente invención pueden
ser empleadas solas o junto con otras enzimas como las glucanasas
para mejorar la extracción de aceite de un material vegetal rico en
aceite, como el aceite de maíz extraído de los embriones de
maíz.
Las xilanasas de la presente invención pueden
ser empleadas en la industria panadera para mejorar el desarrollo,
la elasticidad y/o la estabilidad de la masa y/o el volumen, la
estructura de la miga y/o las propiedades que impiden la formación
del gusto rancio del producto horneado. Aunque las xilanasas puedan
ser usadas para la preparación de masas o productos cocidos al horno
obtenidos a partir de cualquier tipo de harinas (por ejemplo a base
de centeno, cebada, avena, o maíz) las xilanasas de la invención han
demostrado ser particularmente útiles en la preparación de masas o
productos cocidos al horno hechos a base de trigo o comprendiendo
cantidades esenciales de trigo. Los productos cocidos al horno
producidos con una xilanasa de la invención incluyen pan,
panecillos, baguettes y similares. Para los propósitos de la
industria panadera, la xilanasa de la invención puede ser usada
como la actividad enzimática única o principal, o puede ser usada en
combinación con otras enzimas como una lipasa, amilasa, oxidasa
(por ejemplo glucosa-oxidasa, peroxidasa), lacasa
y/o proteasa.
Las xilanasas de la presente invención pueden
ser usadas para modificar los alimentos para animales y pueden
ejercer su efecto, sea in vitro (por modificación de los
componentes del producto alimentario) o in vivo. Las
xilanasas son particularmente apropiadas para una adición a
composiciones de alimentos para animales incluyendo cantidades
elevadas de arabinoxilanos y glucuronoxilanos, por ejemplo un
producto alimentario incluyendo cereales como la cebada, el trigo,
el centeno o la avena o el maíz. Cuando se añade a un alimento, la
xilanasa mejora significativamente la rotura in vivo de la
materia de pared celular vegetal en parte debido a una reducción de
la viscosidad intestinal (Bedford et al., 1993), por lo que
se consigue un mejor uso de los nutrientes vegetales por parte del
animal. De ese modo, la proporción del índice de crecimiento y/o de
conversión del alimentario (es decir, el peso del alimentario
ingerido con respecto al aumento de peso) del animal es mejorada.
El uso de una xilanasa de la invención en la preparación de alimento
para animales está ilustrado en el Ejemplo 8.
Las xilanasas de la presente invención pueden
ser usadas en la industria de fabricación de papel y de pulpa,
entre otras cosas en el proceso de blanqueo para aumentar el brillo
de las pulpas blanqueadas en el cual la cantidad de clorina usada
en las fases de blanqueo pueden ser reducidas, y aumentar el
refinado de las pulpas en el proceso de papel reciclado (Eriksson,
K.E.L., Wood Science and Technology 24 (1990):
79-101; Paice, et al., Biotechnol. and
Bioeng. 32 (1988): 235-239 and Pommier et
al., Tappi Journal (1989): 187-191). Además,
las xilanasas pueden ser usadas para el tratamiento de pulpa
lignocelulósica para mejorar la aptitud al blanqueo de la misma. De
este modo, se puede reducir la cantidad de clorina necesaria para
obtener un blanqueo satisfactorio de la pulpa. El tratamiento de
pulpa lignocelulósica puede, por ejemplo, ser realizado tal y como
está descrito en WO 93/08275, WO 91/02839 y WO 92/03608.
Las xilanasas de la presente invención pueden
ser usadas en la elaboración de cerveza, en particular para mejorar
la filtrabilidad del mosto por ejemplo conteniendo cebada y/o malta
de sorgo. Las xilanasas pueden ser usadas de la misma manera que
las pentosanasas usadas convencionalmente para la elaboración de
cerveza, por ejemplo tal y como está descrito por Viétor et
al., 1993 y en EP 227 159. Además, las xilanasas pueden ser
usadas para el tratamiento de bagazo, es decir de los residuos de
la producción del mosto de cerveza conteniendo cebada o cebada
malteada u otros cereales, para mejorar la utilización de los
residuos para, por ejemplo, alimentos para animales.
Las xilanasas de la presente invención pueden
ser usadas para separar los componentes de los materiales de célula
vegetal, en particular, los componentes de cereal como los
componentes de trigo. La separación del trigo en gluten y almidón
presenta un interés particular, es decir, componentes de interés
comercial considerable. El proceso de separación puede ser realizado
usando métodos conocidos en el estado de la técnica, de manera
conveniente un proceso llamado de golpeo (o proceso de molienda
húmeda) realizado en forma de proceso con hidroclón o decantador.
En el proceso de golpeo, la materia prima es una dispersión
bombeable diluida del material vegetal tal como el trigo expuesto a
una separación. En un proceso de separación del trigo, la
dispersión se realiza normalmente a partir de harina de trigo y
agua.
Las xilanasas de la invención pueden ser usadas
también en la preparación de zumos de fruta o de vegetales para
aumentar el rendimiento, y en la hidrólisis enzimática de varios
materiales derivados de la pared de la célula vegetal o de
materiales residuales por ejemplo de la producción de papel, o
residuos agrícolas tales como pajas de trigo, zuros de maíz, plantas
de maíz enteras, cáscaras de nueces, pasto, cáscaras vegetales,
cáscaras de soja, bagazos, pulpa de remolacha azucarera, y
similares.
El material vegetal puede ser degradado con el
fin de mejorar diferentes tipos de tratamiento, facilitar la
purificación o extracción de otro componente aparte de los xilanos
tal como la purificación de beta-glucano u
oligómeros de beta-glucano procedentes de cereales,
mejorar el valor del producto alimentario, reducir la capacidad de
retención de agua, mejorar la degradabilidad en plantas de aguas
residuales, mejorar la conversión por ejemplo del pasto y maíz para
el ensilado, etc.
Finalmente, las xilanasas de la invención pueden
ser usadas para la modificación de la viscosidad de material
derivado de una pared celular vegetal. Por ejemplo, las xilanasas
pueden ser usadas para reducir la viscosidad de un producto
alimentario conteniendo xilano, para promover el tratamiento de
xilano viscoso conteniendo un material como en la separación de
trigo, y para reducir la viscosidad en el proceso de elaboración de
cerveza.
La invención está descrita también en los
dibujos anexos en los que
la Fig. 1 es un mapa de restricción de plásmido
pYHD17,
la Fig. 2 una mapa de restricción de plásmido
pHD 414,
la Fig. 3 representa los pH óptimos para Xyl I,
Xyl II y Xyl III,
la Fig. 4 es la temperatura óptima para Xyl I,
Xyl II y Xyl III,
la Fig. 5 es el cromatograma de filtración en
gel para una degradación de 1% de arabinoxilano de trigo degradado
Xyl I,
la Fig. 6 es el cromatograma de filtración en
gel para una degradación del 5% WIP por Xyl I,
la Fig. 7 es el cromatograma de filtración en
gel para una degradación del 1% de arabinoxilano de trigo por Xyl
II,
la Fig. 8 es el cromatograma de filtración en
gel para una degradación del 5% de WIP por Xyl II,
la Fig. 9 es el cromatograma de filtración en
gel para una degradación del 1% de arabinoxilano de trigo por Xyl
III,
la Fig. 10 es el cromatograma de filtración en
gel para una degradación del 5% de WIP por Xyl III.
La invención está descrita con más detalle en
los ejemplos siguientes los cuales, no están en ningún modo
destinados a limitar el campo de la invención tal y como está
reivindicado.
Organismo donante: el ARNm fue aislado
del Aspergillus aculeatus, CBS 101.43, cultivado en un medio
de fermentación conteniendo soja bajo agitación para asegurar una
aireación suficiente. Unos micelios fueron recogidos después de
3-5 días de cultivo, congelados inmediatamente en
nitrógeno líquido y almacenados a -80ºC.
Cepas de levadura: la cepa de
Saccharomyces cerevisiae usada fue yNG231 (MAT alpha, leu2,
ura3-52, his4-539,
pep4-delta 1, cir+) o JG169 (MAT\alpha; ura
3-52; leu 2-3, 112; his
3-D200; pep 4-113; prc1::HIS3;
prb1:: LEU2; cir+).
Construcción de un plásmido de expresión:
el plásmido disponible comercialmente pYES II (Invitrogen) fue
cortado con Spel, llenado con ADN polimerasa Klenow + dNTP y
cortado con ClaI. El ADN era fraccionado por tamaño en un gel de
agarosa, y un fragmento de aproximadamente 2000 pares de bases era
purificado por electroelución. El mismo plásmido fue cortado con
ClaI/PvuII, y un fragmento de aproximadamente 3400 pares de bases
fue purificado por electroelución. Los dos fragmentos fueron
ligados en un fragmento SphI/EcoRI de extremidades redondeadas
conteniendo el promotor TPI de levadura. Este fragmento fue aislado
de un plásmido donde el promotor TPI de S. cerevisiae (cf.
T. Albers y G. Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1, 1, 1982, páginas
419-434) fue modificado ligeramente: un sitio SphI
interno fue suprimido mediante eliminación de los cuatro pares de
bases constituyendo el núcleo de este sitio. Además, unas
secuencias redundantes hacia arriba del promotor fueron eliminadas
por un tratamiento con exonucleasa BaII seguido de la adición de un
enlazador SphI. Finalmente, un enlazador EcoRI fue añadido en la
posición -10. Después de estas modificaciones, el promotor está
incluido en un fragmento SphI-EcoRI. Su eficiencia
en comparación con el promotor original no se ve afectada por las
modificaciones. El plásmido resultante pYHD17 está mostrado en la
Fig. 1.
Preparación de vidrio de laboratorio,
boquillas y soluciones sin ribonucleasa: Todo vidrio de
laboratorio utilizado en aislamientos de ARN fue horneado a + 220ºC
durante al menos 12 h. Tubos Eppendorf, boquillas de pipeta y
columnas de plástico fueron tratados en un 0,1% de
dietilpirocarbonato (DEPC) en EtOH durante 12 h, y autoclaveados.
Todos los tampones y el agua (excepto tampones conteniendo Tris)
fueron tratados con el 0,1% de DEPC durante 12 h a 37ºC, y
autoclaveados.
Extracción de ARN total: el ARN total fue
preparado por extracción con tiocianato de guanidino seguido de un
ultracentrifugado a través de un tampón de 5,7 M de CsCl (Chirgwin
et al., 1979) usando las modificaciones siguientes. Los
micelios congelados fueron triturados en N_{2} líquido hasta un
polvo fino con un mortero y un triturador, seguido de una molienda
en un molinillo de café preenfriado, y se suspendieron
inmediatamente en 5 volúmenes de tampón de extracción de ARN (4 M
de GuSCN, 0,5% de Na-laurilsarcosina, 25 mM de
Nacitrato, pH 7.0, 0,1 M de
(\beta-mercaptoetanol). La mezcla fue agitada
durante 30 min. a temperatura ambiente y centrifugada (30 min., a
5000 rpm, temperatura ambiente, Heraeus Megafuge 1.0 R) para
triturar los residuos de células. El sobrenadante fue recogido,
estratificado cuidadosamente sobre un tampón de 5,7 M de CsCl (5,7
M de CsCl, 0,1 M de EDTA, pH 7.5, 0,1% de DEPC; autoclaveado antes
del uso) usando 26,5 ml de sobrenadante por 12,0 ml de tampón de
CsCl, y centrifugado para obtener el ARN total (Beckman, SW 28
rotor, 25000 rpm, temperatura ambiente, 24 h). Después del
centrifugado, el sobrenadante fue eliminado cuidadosamente y el
fondo del tubo conteniendo el ARN granulado fue cortado y enjuagado
con 70% de EtOH. Todo el granulado de ARN fue transferido al
interior de un tubo Eppendorf, suspendido en 500 \mul de TE, pH
7.6 (en caso de dificultad, ocasionalmente calentado durante 5 min a
65ºC), el fenol fue extraído y precipitado con etanol durante 12 h
a - 200ºC (2.5 volúmenes de EtOH, 0.1 volumen de 3M de NaAc, pH
5.2). El ARN fue recogido por centrifugado, lavado en un 70% de
EtOH, y resuspendido en un volumen mínimo de
DEPC-DIW. La concentración de ARN fue determinada
por medición de OD_{260/280}.
Aislamiento de ARN
poli(A)^{+}: los ARNs
poli(A)^{+} fueron aislados por cromatografía de
afinidad en oligo(dT)-celulosa (Aviv &
Leder, 1972). Típicamente, 0,2 g de oligo(dT) celulosa
(Boehringer Mannheim) fue preaumentada en 10 ml de tampón de carga
en columna 1 x (20 mM de Tris-Cl, pH 7.6, 0,5 M de
NaCl, 1 mM de EDTA, 0,1% de SDS), cargado sobre una columna de
plástico tapada tratada con DEPC (Poly Prep Chromatography Column,
Bio Rad), y equilibrada con 20 ml de tampón de carga 1 x. El ARN
total fue calentado a 65ºC durante 8 min., enfriado en hielo durante
5 min., y después de la adición de 1 volumen de tampón de carga en
columna 2 x a la muestra de ARN cargada sobre la columna. El eluato
fue recogido y de nuevo cargado 2-3 veces mediante
un calentamiento de la muestra tal y como se ha mencionado más
arriba y un enfriamiento rápido en hielo antes de cada carga. La
columna oligo (dT) fue lavada con 10 volúmenes de tampón de carga 1
x, luego con 3 volúmenes de tampón de medio salino (20 mM de
Tris-Cl, pH 7.6, 0,1 M de NaCl, 1 mM de EDTA, 0,1%
de SDS), seguido de una elución del ARN poli(A)+ con 3
volúmenes de tampón de elución (10 mM de Tris-Cl, pH
7.6, 1 mM de EDTA, 0,05% de SDS) precalentados a + 65ºC, mediante
la recogida de fracciones de 500 \mul. El OD260 fue leído para
cada fracción recogida, y las fracciones conteniendo el ARNm fueron
agrupadas y el etanol precipitado a -20ºC durante 12 h. El ARN
poli(A)^{+} fue recogido por centrifugado,
resuspendido en DEPC-DIW y almacenado en partes
alícuotas de 5-10 \mug a - 80ºC.
Análisis por transferencia de Northern:
los ARNs poli(A)^{+} (muestra de 5 \mug) de
varios micelios fueron curados por electroforesis en geles de 1.2
agarosa -2.2 M formaldehido (Sambrook et al., 1989) y
transferidos en membranas de nilón (Hybond-N,
Amersham) con 10 x SSC (Sambrook et al., 1989) en forma de
tampón de transferencia. Tres sondas de ADNc marcadas en ^{32}P
cebadas aleatoriamente (Feinberg & Vogelstein, 1983) fueron
usadas en hibridaciones individuales: 1) un fragmento Not
I-Spe I de 1.3 kb para la poligalacturonasa I de
A. aculeatus (descrito en la solicitud de patente danesa DK
1545/92), 2) un fragmento Not I-Spe I de 1.3 kb de
codificación de endoglucanasa I de A. aculeatus (descrito en
DK 0419/92) y 3) un fragmento Eag I de 1.2 kb para la galactanasa I
de A. aculeatus (descrito en WO 92/13945). Hibridaciones de
Northern fueron realizadas en 5 x SSC (Sambrook et al.,
1989), solución de Denhardt 5 x (Sambrook et al., 1989), 0,5%
de SDS (p/v) y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón
desnaturalizado con una concentración de sonda de aproximadamente 2
ng/ml durante 16 horas a 65ºC seguido de lavados en 5 x SSC a 65ºC
(2 x 15 min.), 2 x SSC, 0.5% de SDS (1 x 30 min.), 0.2 x SSC, 0.5%
de SDS (1 x 30 min.), y 5 x SSC (2 x 15 min.). Después de una
autorradiografia a - 80ºC durante 12 horas, la sonda # 1 fue
eliminada del filtro según las instrucciones del fabricante y
rehibridada con una sonda #2, y finalmente con una sonda #3. La
escala de ARN de Bethesda Research Laboratories fue usada en forma
de marcador de tamaño.
Síntesis de la primera cadena: El ADNc
bicatenario fue sintetizado a partir de 5 \mug de ARN
poli(A)^{+} de A. aculeatus por el método con
RNasa H (Gubler & Hoffman 1983, Sambrook et al., 1989)
usando la modificación en horquilla. El ARN
poli(A)^{+} (5 \mug en 5 \mul de
DEPC-tratado en agua) fue calentado a 70ºC durante
8 min., enfriado en hielo, y combinado en un volumen final de 50
\mul con un tampón de transcriptasa inversa (50 mM de
Tris-Cl, pH 8.3, 75 mM de KCI, 3 mM de MgCl_{2},
10 mM de DTT, Bethesda Research Laboratories) conteniendo 1 mM de
cada dNTP (Pharmacia), 40 unidades de inhibidor de ribonucleasa de
placenta humana (RNasin, Promega), 10 pg de cebador (Pharmacia)
oligo(dT)_{12-18} y 1000 unidades de
transcriptasa inversa RNasa H SuperScript II (Bethesda Research
Laboratories). El ADNc de la primera cadena fue sintetizado por
incubación de la mezcla reactiva a 45ºC durante 1 hora.
Síntesis de la segunda cadena: Después de
la síntesis de 30 \mul de 10 mM de Tris-Cl, pH
7.5, 1 mM de EDTA fue añadido, y el ARNm: los híbridos de ADNc eran
precipitados en etanol durante 12 horas a -20ºC por adición de 40
\mug de portador de glicógeno (Boehringer Mannheim) 0,2 volúmenes
de 10 M de NH_{4}Ac y 2,5 volúmenes de EtOH al 96%. Los híbridos
fueron recuperados por centrifugado, lavados en un 70% de EtOH,
secados al aire y resuspendidos en 250 \mul de tampón de la
segunda cadena (20 mM de Tris-Cl, pH 7.4, 90 mM de
KCI, 4,6 mM de MgCl_{2}, 10 mM de (NH_{4})_{2}SO_{4},
16 \muM \betaNAD^{+}) conteniendo 100 \muM por cada dNTP,
44 unidades de ADN polimerasa I de E. coli (Amersham), 6,25
unidades de RNasa H (Bethesda Research Laboratories) y 10,5 unidades
de ADN ligasa de E. coli (New England Biolabs). La síntesis
de ADNc de la segunda cadena fue realizada mediante la incubación
del tubo de reacción a 16ºC durante 3 horas, y la reacción fue
detenida por la adición de EDTA en una concentración final de 20 mM
seguido de una extracción de fenol.
Tratamiento de la nucleasa de judía Mung:
el ADNc bicatenario (ds) fue precipitado con etanol a -20ºC durante
12 horas por adición de 2 volúmenes de EtOH al 96%, 0,1 volumen de
3 M de NaAc, pH 5.2, recuperado por centrifugado, lavado en un 70%
de EtOH, secado (Speedvac), y resuspendido en 30 \mul de tampón
de nucleasa de judía Mung (30 mM de NaAc, pH 4.6, 300 mM de NaCl, 1
mM de ZnSO_{4}, 0.35 mM de DTT, 2% de glicerol) conteniendo 36
unidades de nucleasa de judía Mung (Bethesda Research
Laboratories). El ADN monocatenario en horquilla fue recortado por
incubación de la reacción a 30ºC durante 30 min., seguido de la
adición de 70 \mul de 10 mM de Tris-Cl, pH 7.5, 1
mM de EDTA, extracción de fenol, y precipitación de etanol con 2
volúmenes de EtOH al 96% y 0,1 volumen de NaAc 3M, pH 5.2 a -20ºC
durante 12 horas.
Extremidad redondeada con ADN polimerasa
T4: el ADNc ds fue terminado en forma redondeada con ADN
polimerasa T4 en 50 \mul de tampón de ADN polimerasa T4 (20 mM de
Tris-acetato, pH 7.9, 10 mM de MgAc, 50 mM de KAc,
1 mM de DTT) conteniendo 0,5 mM cada dNTP y 7,5 unidades de ADN
polimerasa T4 (Invitrogen) por incubación de la mezcla reactiva a
+37ºC durante 15 min. La reacción fue detenida por adición de EDTA
a 20 mM de concentración final, seguido de una extracción de fenol
y una precipitación de etanol.
Ligadura de adaptadores y selección de
tamaño: Después de la reacción de relleno, el ADNc fue ligado a
unos adaptadores BstX I no palindrómicos (1 \mug/\mul,
Invitrogen) en 30 \mul de tampón de ligadura (50 mM de
Tris-Cl, pH 7.8, 10 mM de MgCl_{2}, 10 mM de DTT,
1 mM de ATP, 25 \mug/ml de albúmina de suero bovino) conteniendo
600 pmol de adaptadores BstX I y 5 unidades de ligasa T4
(Invitrogen) por incubación de la mezcla de reacción a +16ºC
durante 12 h. La reacción fue detenida por un calentamiento a +70ºC
durante 5 min., y el ADNc adaptado fue fraccionado por tamaños
mediante una electroforesis en gel de agarosa (0,8% de
HSB-agarosa, FMC) para separar los adaptadores no
ligados y ADNcs pequeños. El ADNc fue seleccionado por tamaños con
un corte a 0,7 kb, y el ADNc fue electropurificado a partir del gel
de agarosa en 10 mM de Tris-Cl, pH 7.5, 1 mM de EDTA
durante 1 hora a 100 voltios, el fenol fue extraído y el etanol
precipitado a -20ºC durante 12 horas según se ha mencionado más
arriba.
Construcción de bibliotecas de ADNc: el
ADNc ds adaptado fue recuperado por centrifugado, lavado en un 70%
de EtOH y resuspendido en 25 ml de DIW. Antes de la ligadura de
bibliotecas a gran escala, cuatro ligaduras de prueba fueron
realizadas en 10 \mul de tampón de ligadura (el mismo que el
susodicho) cada uno conteniendo 1 \mul de ADNc ds (tubos de
reacción #1-#3), 2 unidades de ligasa T4 (Invitrogen) y 50 ng (tubo
#1), 100 ng (tubo #2) y 200 ng (tubos #3 y #4) de vector de
expresión de levadura dividido con Bst XI (vector pYES 2.0
Invitrogen o bien yHD13). Las reacciones de ligadura fueron
realizadas por incubación a +16ºC durante 12 horas, calentadas a
70ºC durante 5 min, y 1 \mul de cada ligadura sometida a una
electroporación (200 \Omega, 2.5 kV, 25 \muF) para 40 \mul
del 1061 células E. coli competentes (OD600 = 0.9 en 1 litro
de caldo LB, lavado dos veces en DIW frío, una vez en 20 ml de 10%
de glicerol, resuspendido en 2 ml de glicerol al 10%). Después de
una adición de 1 ml de SOC en cada mezcla de transformación, las
células fueron cultivadas a 37ºC durante 1 hora, 50 \mul chapadas
en placas de ampicilina LB + (100 \mug/ml) y cultivadas a 37ºC
durante 12 h.
En condiciones óptimas, una ligadura a gran
escala fue configurada en 40 \mul de tampón de ligadura
conteniendo 9 unidades de ligasa T4, y la reacción fue incubada a
16ºC durante 12 horas. La reacción de ligadura fue detenida por
calentamiento a 70ºC durante 5 min, el etanol precipitado a -20ºC
durante 12 horas, recuperado por centrifugado y resuspendido en 10
\mul de DIW. Partes alícuotas de un \mul fueron transformadas
en 1061 células de E. coli electrocompetentes mediante el
uso de las mismas condiciones de electroporación mencionadas
anteriormente, y las células transformadas fueron tituladas y la
biblioteca colocada en placas en LB + ampicilina con
5000-7000 c.f.u./placa. A cada placa se añadieron 3
ml del medio. Las bacterias fueron raspadas, 1 ml de glicerol fue
añadido y almacenado a -80ºC en forma de depósitos. Los 2 ml
restantes fueron usados para el aislamiento del ADN. Si la cantidad
de ADN era insuficiente para proporcionar el número requerido de
levaduras transformantes, el ADN a gran escala se obtuvo a partir de
500 ml de medio (TB) inoculado con 50 \mul de materia prima
bacteriana a -80ºC propagada durante toda la noche.
Construcción de bibliotecas de levadura:
para asegurarse de que todos los clones bacterianos eran probados
en levadura, un número de transformantes de levadura 5 veces
superior al número de clones bacterianos en los depósitos
originales estuvo fijado como el límite.
Partes alícuotas de un \mul de ADN plásmido
purificado (100 ng/\mul) de depósitos individuales fueron
electroporadas (200 \Omega, 1.5 kV, 25 \muF) en 40 \mul de
células competentes de S. cerevisiae JG 169 (OD600 = 1.5 en
500 ml de YPD, lavadas dos veces en DIW frío, una vez en 1 M de
sorbitol frío, resuspendido en 0,5 ml de sorbitol 1 M, Becker &
Guarante, 1991). Después de la adición de 1 ml de sorbitol frío 1
M, 80 \mul de partes alícuotas fueron colocadas en placas en SC +
glucosa - uracilo para proporcionar 250-400
c.f.u./placa e incubadas a 30ºC durante 3-5
días.
Construcción de un vector de expresión Aspergillus : el vector pHD414 es un derivado del
plásmido p775 (descrito en EP 238 023). A diferencia de este
plásmido, el pHD 414 tiene una serie de sitios de restricción
únicos entre el promotor y el terminador. El plásmido fue construido
por eliminación de un fragmento largo de aproximadamente 200 pares
de bases (incluyendo sitios de RE indeseables) en el extremo 3' del
terminador, y una eliminación posterior de un fragmento largo de
aproximadamente 250 pares de bases en el extremo 5' del promotor,
incluyendo también sitios indeseables. La región de 200 pares de
bases fue eliminada por división con Narl (situado en el vector
pUC) y XbaI (precisamente 3' en el terminador), un relleno posterior
en los extremos generados con ADN polimerasa Klenow + dNTP,
purificación del fragmento de vector en gel y religadura del
fragmento de vector. Este plásmido era llamado pHD413. El pHD413
fue cortado con Stul (situado en el extremo 5' del promotor) y
PvuII (en el vector pUC), fraccionado en gel y religado. El
plásmido pHD 414 está mostrado en la Fig. 2.
YPD: 10 g de extracto de levadura, 20 g de
peptona, H_{2}O en 810 ml. Autoclaveados, 90 ml de glucosa al 20%
(filtrada estéril) añadidos.
Sal basal 10 x: 66,8 g de base nitrogenada de
levadura, 100 g de ácido succínico, 60 g de NaOH, H_{2}O hasta
1000 ml, filtrada estéril.
SC-URA: 90 ml de sal basal 10 x,
22,5 ml de 20% de casamino ácidos, 9 ml de triptófano al 1%,
H_{2}O hasta 806 ml, autoclaveados, 3,6 ml de treonina al 5% y 90
ml de glucosa al 20% o de galactosa al 20% añadidos.
Caldo SC-H: 7,5 g/I de base
nitrogenada de levadura sin aminoácidos, 11,3 g/l de ácido
succínico, 6,8 g/l de NaOH, 5,6 g/l de casamino ácidos sin
vitaminas, 0,1 g/l de triptófano. Autoclaveados durante 20 min a
121ºC. Después de la autoclave, 10 ml de una solución de galactosa
al 30%, 5 ml de una solución de glucosa al 30% y 0,4 ml de una
solución de treonina al 5% fueron añadidos por 100 ml de medio.
Agar SC-H: 7,5 g/l de base
nitrogenada de levadura sin aminoácidos, 11,3 g/l de ácido
succínico, 6,8 g/l de NaOH, 5,6 g/l de casamino ácidos sin
vitaminas, 0.1 g/l de triptófano, y 20 g/l de agar (Bacto).
Autoclaveado durante 20 min. a 121ºC. Después de la autoclave, 55
ml de una solución de galactosa al 22% y 1,8 ml de una solución de
treonina al 5% fueron añadidos por 450 ml de agar.
Agar YNB-1: 3,3 g/l de
KH_{2}PO_{4}, 16,7 g/l de agar, pH fijado a 7. Autoclaveado
durante 20 min. a 121ºC. Después de la autoclave, 25 ml de una base
nitrogenada de levadura al 13.6% sin aminoácidos, 25 ml de una
solución de glucosa al 40%, 1,5 ml de una solución de
L-leucina al 1% y 1,5 ml de una solución de
histidina al 1% fueron añadidos por 450 ml de agar.
Caldo YNB-1: composición similar
al agar YNB-1, pero sin el agar.
Xilano AZCL: xilano de madera de abedul o de
cascarilla de avena disponible en Megazyme, Australia.
4-metil-umbeliferil-\alpha-arabinopiranósido:
disponible en Sigma.
100 ml de YPD (Sherman et al., Methods in
Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) son inoculados
con esporas de A. oryzae o A. nigere incubados con
una agitación a 37ºC durante aproximadamente 2 días. El micelio es
recogido por filtración a través de miracloth y lavado con 200 ml de
MgSO_{4} 0,6 M. El micelio es suspendido en 15 ml de MgSO_{4}
1,2 M. 10 mM de NaH_{2}PO_{4}, pH = 5.8. La suspensión es
enfriada en hielo y 1 ml de tampón conteniendo 120 mg de Novozym®
234, lote 1687 es añadido. Después de 5 minutos, 1 ml de 12 mg/ml
de BSA (Sigma tipo H25) es añadido y una incubación con una
agitación suave continuó durante 1,5-2,5 horas a
37ºC hasta visualizar una gran cantidad de protoplastos en una
muestra controlada por microscopio.
La suspensión es filtrada a través de miracloth,
el filtrado transferido a un tubo estéril y recubierto con 5 ml de
sorbitol 0,6 M, 100 mM de tris-HCl, pH = 7.0. El
centrifugado es realizado durante 15 minutos en 100 g y los
protoplastos son recogidos desde la parte superior del tampón de
MgSO_{4}. 2 volúmenes de STC (1,2 M de sorbitol, 10 mM de
tris-HCl, pH = 7.5. 10 mM de CaCl_{2}) son
añadidos a la suspensión de protoplastos y la mezcla es centrifugada
durante 5 minutos en 1000 g. El granulado de protoplastos es
resuspendido en 3 ml de STC y regranulado. Esto se repite.
Finalmente los protoplastos son resuspendidos en
0,2-1 ml de STC.
100 \mul de suspensión de protoplastos son
mezclados con 5-25 \mug del ADN apropiado en 10
\mul de STC. Los protoplastos son mezclados con p3SR2 (un
plásmido portador del gen amdS de A. nidulans). La mezcla es
dejada a temperatura ambiente durante 25 minutos. 0,2 ml de PEG
4000 al 60% (BDH 29576). 10 mM de CaCl_{2} y 10 mM de
tris-HCl, pH = 7.5 son añadidos y mezclados
cuidadosamente (dos veces) y finalmente 0,85 ml de la misma
solución es añadido y mezclado cuidadosamente. La mezcla es dejada a
temperatura ambiente durante 25 minutos, centrifugada en 2500 g
durante 15 minutos y el granulado es resuspendido en 2 ml de
sorbitol 1,2 M. Después de una sedimentación adicional, los
protoplastos son extendidos en placas apropiadas. Los protoplastos
son extendidos en placas mínimas (Cove Biochem.Biophys.Acta 113
(1966) 51-56) conteniendo 1,0 M de sacarosa, pH =
7.0, 10 mM de acetamida como fuente de nitrógeno y 20 mM de CsCl
para inhibir el crecimiento residual. Después de la incubación
durante 4-7 días a 37ºC unas esporas son
seleccionadas y extendidas en colonias individuales. Este
procedimiento se repite y las esporas de una colonia individual
después del segundo reaislamiento son almacenadas en forma de
transformante definido.
La fermentación con flujo discontinuo se realizó
en un medio comprendiendo maltodextrina en forma de fuente de
carbono, la urea en forma de fuente de nitrógeno y extracto de
levadura. La fermentación con flujo discontinuo se realizó por
inoculación de un cultivo en un frasco de agitación de las células
huéspedes en cuestión de A. oryzae en un medio comprendiendo
el 3,5% de fuente de carbono y el 0.5% de fuente de nitrógeno.
Después de 24 horas de cultivo con un pH 5.0 y a 34ºC, los
suministros continuos de fuentes de nitrógeno y de carbono
adicionales fueron iniciados. La fuente de carbono fue mantenida
como el factor de limitación y se garantizaba la presencia del
oxígeno en exceso. El cultivo en flujo discontinuo continuó durante
4 días, después de los cuales las enzimas podían ser recuperadas por
centrifugado, ultrafiltración, filtración clara y filtración de
germen. Para los experimentos de la aplicación, la actividad
amilasa se redujo hasta un nivel insignificante por métodos de
purificación conocidos en la técnica. Para una caracterización, las
enzimas fueron purificadas completamente por métodos cromatográficos
de intercambio aniónico conocidos en la técnica.
Electroforesis en
SDS-PAGE: La electroforesis en
SDS-PAGE se realizó en una unidad de electroforesis
4 Mini-Leak
(Kem-En-Tec, Copenhagen) como una
versión modificada del procedimiento de Laemli (Laemmli, 1970;
Christgau, 1991). En resumen, el gel de separación fue vertido con
12% de acrilamida; 0,2% de acrilamida BIS; 0,1% de SDS; 0,375 M de
Tris pH 8.8. 0,04% de APS (persulfato de amonio) & 0,04% de
TEMED. Después de 6-15 horas de polimerización, el
gel de apilamiento fue añadido con 4,5% en p/p de acrilamida;
0,075% de acrilamida BIS; 0,1% de SDS; 66,5 mM de Tris pH 6.8. 0,4%
en p/p de APS (persulfato de amonio) & 0,4% de TEMED. Las
cámaras de electrodo son rellenadas con un tampón formado: 25 mM de
Tris-base; 0,192 M de glicina & 0,05% de SDS,
donde después las muestras conteniendo un tampón de muestra son
cargadas, y el gel es formado en 2-4 mA/gel para
una formación toda la noche y 10-30 mA/gel para una
formación rápida. El gel es posteriormente eliminado y teñido con
tinte commassie o de plata.
\newpage
Isoelectroenfoque: El isoelectroenfoque
es realizado en placas de placas PAG de Ampholine pH
3.5-9.5 (Pharmacia, Upsala) en una unidad de
electroforesis Multiphor según las instrucciones de fabricación.
Después de la electroforesis, el gel es sea teñido con commassie o
bien con plata.
Tinción con commassie y plata: el gel es
eliminado cuidadosamente de las placas de vidrio e incubado en una
mesa de agitación de rotación lenta en aproximadamente 100 ml de
las soluciones siguientes:
- 1)
- 30 min en 40% de etanol en v/v; 5% de ácido acético en v/v
- 2)
- 30 min en 40% de etanol en v/v; 5% de ácido acético en v/v + 0,1% de commassie R250
- 3)
- Decoloración en 30 min en 40% de etanol en v/v; 5% de ácido acético en v/v hasta que el fondo se haya reducido suficientemente.
- 4)
- Finalmente el gel es incubado en una solución de conservación. 5% de ácido acético en v/v; 10% de etanol en v/v; 5% de glicerol en v/v y secado al aire entre dos placas de membrana de celofán.
1) 30 min en 40% de etanol en v/v; 5% de ácido
acético en v/v
2) 20 min en 10% de etanol en v/v; 5% de ácido
acético en v/v
3) 20 min en 0.0057% en p/v de APS (0.25 mM)
4) 60 min en 0.1% en p/v de AgNO_{3}
5) Para su desarrollo, el gel es sumergido en un
revelador: 0,015% de formaldehído; 2% de Na_{2}CO_{3} en p/v
durante 30-60 seg.
El gel es incubado después en una segunda vuelta
de revelador hasta obtener una tinción satisfactoria de las
proteínas (5-15 min.). Finalmente el gel es
incubado en una solución conservadora: 5% de ácido acético en v/v;
10% de etanol en v/v; 5% de glicerol en v/v y secado al aire entre
dos placas de membrana de celofán.
Las actividades de las enzimas son
medidas sea mediante la liberación de azúcares de reducción de
xilano de abedul (disponibles en Roth, Karlsruhe, Alemania) o
mediante la liberación de un color azul de xilano de abedul AZCL de
MegaZyme.
0,5 ml de una suspensión de
sustrato-AZCL al 0,4% se mezcla con 0,5 ml de 0,1 M
de tampón de citrato/fosfato de pH óptimo y 10 \mul de una
solución enzimática diluida adecuadamente son añadidos. Las
incubaciones son realizadas en termomezcladores Eppendorf durante
15 minutos a 30°C (si no se especifica lo contrario) antes de una
inactivación por calentamiento durante 20 minutos a 95ºC. Unas
incubaciones enzimáticas son realizadas por triplicado. Un blanco
es producido donde la enzima es añadida pero inactivada
inmediatamente. Después del centrifugado, la absorbencia del
sobrenadante es medida en placas de microtitulación a 620 nm y el
blanco es sustraído.
Unas soluciones del 0,5% de xilano de abedul
(Roth) han sido producidas en 0,1 M de citrato/fosfato del pH
óptimo, (si no se especifica lo contrario) 10 \mul de soluciones
enzimáticas diluidas adecuadamente son añadidos a 1 ml de sustrato,
las incubaciones son realizadas a 30ºC durante 15 minutos antes de
una inactivación por calentamiento tal y como se ha mencionado
anteriormente. Unos azúcares de reducción son determinados por
reacción, en placas de microtitulación, con un agente reactivo PHBAH
comprendiendo 0,15 g de hidracida de ácido para hidroxi benzoico
(Sigma H-9882), 0,50 g de tartrato de sodio y
potasio (Merck 8087) y 2% de solución de NaOH hasta 10,0 ml. Los
resultados de los blancos son sustraídos. La xilosa es empleada
como un estándar.
Un pH y temperatura óptimos son medidos
en los sustratos mencionados anteriormente. 0,1 M de tampones de
citrato/fosfato de pH variable son empleados para una determinación
del pH óptimo. Tampones de citrato/fosfato 0,1 M del pH óptimo son
utilizados para una reacción a temperaturas diferentes durante 15
min. con el fin de determinar la temperatura óptima.
La Km y actividad específica son medidas
mediante la realización de incubaciones en concentraciones de
sustrato (S) que varían del 0,025 al 1,5% (xilano de abedul),
medida del ritmo de reacción (v), imagen S/v como función de S,
realización del análisis de regresión lineal, determinación de la
inclinación (=1/Vmax) y de la interceptación (Km/Vmax) y cálculo de
Km y de la actividad específica (=Vmax/E), donde E es la cantidad
de enzima añadida.
Para una cromatografía por filtración en
gel, un 1% de soluciones de arabinoxilano de trigo (Megazyme) o
un 5% de suspensiones de pentosano insoluble procedentes del trigo
(WIP, producido tal y como está descrito más abajo),
respectivamente, están hechos en 0,1 M de tampón acetato pH 5.5.
Para 1,5 ml de estos sustratos 30 pl de las
siguientes soluciones enzimáticas (concentración final) son
añadidos: xilanasa I (0,1 mg/ml), xilanasa II (0,1 mg/ml) y
xilanasa III (0,07 mg/ml).
Unas incubaciones son realizadas a 30ºC durante
0, 10, 30, 60 y 120 minutos antes de la inactivación por
calentamiento a 95ºC durante 20 min. El centrifugado es realizado y
los sobrenadantes son analizados por inyección en tres columnas TSK
en fila (PW G4000, PW G3000, PW G2500) y unos sacáridos son eluidos
con 0,4 M de tampón acetato pH 3.0 a 0,8 ml/min. Los sacáridos de
elución son determinados por un detector Shimadzu RI y los datos
son recogidos y procesados mediante el software Dionex. Los
dextranos (de Serva) son usados como estándares de peso molecular.
La recogida de datos es iniciada 15 minutos después de la
inyección.
150 kg de harina de trigo común fueron
suspendidos en 450 kg de agua fría. La suspensión fue calentada a
60ºC y 600 g de Termamyl 120L® fueron añadidos. Después del
calentamiento a 95ºC produciendo una gelatinización de la fracción
de almidón, la suspensión fue enfriada a 60ºC con una hidrólisis
continua durante 180 min. Después de un ajuste del pH a 8.0 usando
NaOH, 300 g de Alcalase 2.4L® fueron añadidos. Durante la
hidrólisis de proteína en agitación constante, el pH fue mantenido
entre 7.5 y 8.0 de titulación con NaOH. La hidrólisis continuó
durante 120 min. El precipitado fue recuperado después del
centrifugado, lavado con agua una vez y lavado también después en
una criba de 35 pm con agua fría para eliminar todo el material
soluble residual. Al material insoluble resultante fueron añadidos
hasta 20 l de agua, se calentó a 60ºC y después de un ajuste del pH
a 8.0 con NaOH se añadieron 100 g de Alcalase 2.4L®. La hidrólisis
y la titulación con NaOH continuaron hasta que no se observó
ninguna caída más del pH. El material fue lavado después de nuevo
en una criba de 35 p.m hasta eliminar todo el material soluble y,
finalmente, liofilizarlo.
La actividad endoxilanasa es determinada por un
ensayo, en el que la muestra de xilanasa es incubada con un
sustrato de remazol-xilano
(4-0-metil-D-glucurono-D-xilano
teñido con azul brillante de Remazol R, Fluka), pH 6.0. La
incubación es realizada a 50ºC durante 30 min. El fondo de sustrato
teñido no degradado es precipitado por etanol. El color azul
restante en el sobrenadante es determinado espectrofotométricamente
a 585 nm y es proporcional a la actividad endoxilanasa. La
actividad endoxilanasa de la muestra es determinada con respecto a
un estándar de enzima. El ensayo está descrito también en la
publicación AF 293.6/1-GB, disponible bajo pedido en
Novo Nordisk NS, Dinamarca.
Una biblioteca de A. aculeatus
consistiendo en aprox. 1,5 X 10^{6} clones individuales en 150
depósitos fue construida. El ADN fue aislado de 20 clones
individuales de la biblioteca y expuesto a un análisis para la
inserción de ADNc. La frecuencia de inserción resultó ser >90% y
el tamaño de inserto medio fue de aproximadamente 1400 bp.
El ADN de algunos de los depósitos se transformó
en levadura, y 50-100 placas conteniendo
200-500 colonias de levadura fueron obtenidas a
partir de cada depósito. Después de 3-5 días de
crecimiento, las placas de agar fueron replicadas en placas sobre
varios grupos de placas de agar. Un grupo de placas conteniendo
0,1% de xilano AZCL (Megazyme, Australia) fue incubado después
durante 3-5 días a 30ºC para detectar la actividad
xilanasa. Unas colonias positivas fueron identificadas como
colonias rodeadas por un halo azul. De forma alternativa, un grupo
de placas fue incubado después durante 3-5 días a
30ºC antes del revestimiento con un gel de revestimiento de xilano
conteniendo 0,1% de xilano AZCL y 1% de agarosa en un tampón con un
pH apropiado. Tras la incubación durante 1-2 días a
30ºC, unas colonias positivas fueron identificadas como colonias
rodeadas por un halo azul. De manera inesperada, se descubrió que
las colonias de levadura en xilanasa II degradaban
4-metilumbelliferil-\alpha-arabinopiranoside
en una sobrecapa con 0,1 M de tampón de citrato, pH 5.0, y 1% de
agarosa produciendo una zona fluorescente. Este es el primer
informe de una xilanasa que posee una actividad
\alpha-arabinopiranosidasa.
Las células de colonias positivas enzimáticas
fueron expandidas para un aislamiento de colonia individual en
agar, y una colonia individual de producción de enzimas fue
seleccionada para cada una de las colonias de producción de
xilanasa identificadas.
Caracterización de clones positivos: los
clones positivos fueron obtenidos en forma de colonias
individuales, los insertos de ADNc fueron amplificados directamente
desde la colonia de levadura usando cebadores de polienlazadores
biotinilados, purificados por un sistema de perlas magnéticas
(Dynabead M-280, Dynal) y caracterizados
individualmente por secuenciación del extremo 5' de cada clon de
ADNc usando el método de terminación de cadena (Sanger et
al., 1977) y el sistema Sequenasa (United States Biochemical).
Las secuencias de ADN de los genes de enzima están mostradas en las
SEC ID Nº 1, 5 y 8, respectivamente.
Aislamiento de un gen de ADNc para la
expresión en Aspergillus: para evitar errores de la PCR en el
gen que debe ser clonado, el ADNc fue aislado de los plásmidos de
levadura por procedimientos estándar tal y como está descrito más
abajo.
\newpage
Una o más de las colonias de producción de
xilanasa fueron inoculadas en 20 ml de caldo YNB-1
en un tubo de ensayo de vidrio de 50 ml. El tubo fue agitado
durante 2 días a 30ºC. Las células fueron recogidas por centrifugado
durante 10 min. a 3000 rpm.
Las células fueron resuspendidas en 1 ml de
sorbitol 0,9 M, 0.1 M de EDTA, pH 7.5. El granulado fue transferido
a un tubo Eppendorf, y centrifugado durante 30 segundos a máxima
velocidad. Las células fueron resuspendidas en 0.4 ml de sorbitol
0,9 M, 0.1 M de EDTA, 14 mM de
(\beta-mercaptoetanol. 100 \mul por 2 mg/ml de
Zimolasa fueron añadidos, y la suspensión fue incubada a 37ºC
durante 30 minutos y centrifugada durante 30 segundos. El granulado
(esferoplastos) fue resuspendido en 0,4 ml de TE. 90 \mul de (1,5
ml de EDTA 0,5 M pH 8.0, 0,6 ml de Tris-Cl 2 M, pH
8.0, 0,6 ml de SDS al 10%) fueron añadidos, y la suspensión fue
incubada a 65ºC durante 30 minutos. 80 \mul de 5 M de KOAc fueron
añadidos, y la suspensión fue incubada en hielo durante al menos 60
minutos y centrifugada durante 15 minutos a máxima velocidad. El
sobrenadante fue transferido a un tubo fresco que fue llenado con
EtOH (a temperatura ambiente) seguido de una mezcla rigurosa pero
suave y una rotación durante 30 segundos. El granulado fue lavado
con ETON al 70% frío, centrifugado durante 30 segundos y secado a
temperatura ambiente. El granulado fue resuspendido en 50 \mul de
TE y centrifugado durante 15 minutos. El sobrenadante fue
transferido a un tubo fresco. 2,5 \mul por 10 mg/ml de
ribonucleasa fueron añadidos, seguido de una incubación a 37ºC
durante 30 minutos y de la adición de 500 \mul de isopropanol con
una mezcla suave. La mezcla fue centrifugada durante 30 segundos, y
el sobrenadante fue eliminado. El granulado fue enjuagado con EtOH
al 96% frío y secado a temperatura ambiente. El ADN fue disuelto en
50 \mul de agua hasta una concentración final de
aproximadamente
100 \mul/ml.
100 \mul/ml.
El ADN fue transformado en E. coli.
mediante unos procedimientos estándar. Dos colonias de E.
coli fueron aisladas de cada una de las transformaciones y
analizadas con las enzimas de restricción HindIII y XbaI que
cortaban el inserto de ADN. El ADN de uno de estos clones fue
retransformado en una cepa de levadura JG169.
Las secuencias de ADN de diferentes clones
positivos fueron determinadas parcialmente. Las secuencias de ADN
de tres xilanasas diferentes (xyl I, xyl II y xyl III) están
mostradas en las SEC ID Nº. 1, 5 y 8 respectivamente. Las
secuencias mostradas en esta identificación de secuencia comprenden
una cola poli-A, la posición de posibles codones de
parada está indicada en las secuencias de aminoácidos respectivas
mostradas en las SEC ID nº. 2, 6 y 9.
Para expresar los genes en Aspergillus,
el ADNc es aislado a partir de uno o más representantes de cada
familia por digestión con HindIII/XbaI u otras enzimas de
restricción apropiadas, fraccionamiento de tamaño en un gel y
purificación y posteriormente ligados a pHD414, produciendo los
plásmidos pXY-I, pXY-II y
pXY-III. Después de una amplificación en E.
coli, los plásmidos son transformados en A. oryzae o
A. niger según el procedimiento general descrito en la
sección Materiales y Métodos más arriba.
Cada uno de los transformantes fue inoculado en
agar FG-4 en el centro de un plato Petri. Después
de 5 días de incubación a 30ºC, tapones de 4 mm de diámetro fueron
eliminados por medio de un sacacorchos. Los tapones fueron
sumergidos en un gel de sobrecapa de xilano, conteniendo un 0,1% de
xilano AZCL y un 1% de agarosa en un tampón con un pH apropiado, e
incubados durante toda la noche a 40ºC. La actividad de xilanasa fue
identificada como se ha descrito anteriormente. Algunos de los
transformantes tuvieron halos que eran significativamente más
grandes que aquellos de origen Aspergillus oryzae. Esto
demuestra una expresión eficaz de la xilanasa en Aspergillus
oryzae. Los 8 transformantes con la mayor actividad de xilanasa
fueron seleccionados, inoculados y mantenidos en
agar YPG.
agar YPG.
Cada uno de los 8 transformantes seleccionados
fueron inoculados de las inclinaciones de agar YPG en un frasco de
agitación de 500 ml con medios FG-4 y
MDU-2. Después de 3-5 días de
fermentación con una agitación suficiente para asegurar una buena
aireación, los caldos de cultivo fueron centrifugados durante 10
minutos en 2000 g y los sobrenadantes fueron analizados.
Un volumen de 15 \mul de cada sobrenadante fue
aplicado en agujeros de 4 mm de diámetro fijados en 0,1% de gel de
sobrecapa de xilano AZCL (25 ml en un plato Petri de 13 cm de
diámetro). La actividad de xilanasa fue identificada por la
formación de un halo azul en incubación.
Posteriormente, Xyl I, Xyl II y Xyl III,
respectivamente, fueron producidos por fermentación con flujo
discontinuo de A. oryzae expresando las enzimas tal y como
se ha descrito anteriormente en Materiales y métodos.
El sobrenadante de cultivo de la fermentación de
Aspergillus oryzae expresando la enzima recombinante es
centrifugado y filtrado a través de un filtro de 0,2 \mum para
eliminar los micelios. 35-50 ml del sobrenadante
filtrado (30-60 mg de xilanasa I) es ultrafiltrado
en un Filtron ultracette o dispositivo de ultrafiltración Amicon
con una membrana de 10 kDa para conseguir una concentración de 10
pliegues. Este concentrado es diluido 100 veces en 25 mM de tris pH
8.0 en dos ciclos sucesivos de ultrafiltración en el mismo
dispositivo. Esta muestra ultrafiltrada es cargada en 1,5 ml/min
sobre un intercambiador aniónico de Pharmacia HR16/20 Fast Flow Q
Sepharose equilibrado en 25 mM de Tris pH 8.0. Después de aplicar
la muestra, la columna es lavada con dos volúmenes de columna de 25
mM de Tris pH 8.0, y las proteínas enlazadas son eluidas con un
gradiente de NaCl de aumento lineal de 0 a 0,5 M de NaCl en 25 mM
de Tris pH 8.0. La xilanasa I no está enlazada a la columna y por
consiguiente está presente en la fracción de lavado. La mayoría de
todas las impurezas son enlazadas a la columna, de esta manera la
xilanasa I de la fracción de producto filtrado/lavado tiene una
pureza superior al 95%.
El sobrenadante del cultivo de la fermentación
de Aspergillus oryzae expresando la enzima recombinante es
centrifugado y filtrado a través de un filtro de 0,2 \mum para
eliminar los micelios. 35-50 ml del sobrenadante
filtrado (30-60 mg de xilanasa II) es ultrafiltrado
en un Filtron ultracette o dispositivo de ultrafiltración Amicon con
una membrana de 10 kDa para conseguir una concentración de 10
pliegues. Este concentrado es diluido 100 veces en 20 mM de Tris pH
8.0 en dos ciclos de ultrafiltración sucesivos en el mismo
dispositivo. Esta muestra ultrafiltrada es cargada en 1,5 ml/min en
un intercambiador aniónico Pharmacia HR16/20 Fast Flow Q Sepharose
equilibrado en 20 mM de Tris pH 8.0. Después de haber aplicado la
muestra, la columna es lavada con dos volúmenes de columna de 20 mM
de tris pH 8.0, y las proteínas enlazadas son eluidas con un
gradiente de NaCl de aumento lineal de 0 a 0,6 M de NaCl en 20 mM
de tris pH 8.0. La xilanasa II se eluye en dos valores picos
diferentes en aproximadamente 0,2 & 0,3 M de NaCl. La enzima en
estas dos fracciones tiene puntos isoeléctricos ligeramente
diferentes (respectivamente pl 4.65 y pl 4.5 para el primero y el
último valor pico eluido), pero ninguna diferencia de las
propiedades enzimáticas fue observada entre las dos fracciones de
xilanasa II.
El sobrenadante del cultivo de la fermentación
de Aspergillus oryzae expresando la enzima recombinante es
centrifugado y filtrado a través de un filtro de 0,2 pm para
eliminar los micelios. 35-50 ml del sobrenadante
filtrado (30-60 mg de xilanasa III) son
ultrafiltrados en un Filtron ultracette o dispositivo de
ultrafiltración Amicon con una membrana de 10 kDa para conseguir una
concentración de 10 pliegues. Este concentrado es diluido 100 veces
en 25 mM de Tris pH 8.0 en dos ciclos de ultrafiltración sucesivos
en el mismo dispositivo. Esta muestra ultrafiltrada es cargada en
1,5 ml/min en un intercambiador aniónico de Pharmacia HR16/20 Fast
Flow Q Sepharose equilibrado en 25 mM de Tris pH 8.0. Después de
aplicar la muestra, la columna es lavada con dos volúmenes de
columna de 25 mM de tris pH 8.0, y las proteínas enlazadas son
eluidas con un gradiente de NaCl de aumento lineal de 0 a 0,6 M de
NaCl en 25 mM de Tris pH 8.0. La xilanasa III en esta fracción no
es completamente pura. De esta manera, la xilanasa III conteniendo
fracciones fue concentrada por ultrafiltración en un dispositivo de
ultrafiltración Amicon con una membrana de 10 kDa hasta un volumen
de 4,5 ml y aplicada a una columna de filtración en gel HR 26/60
Sefacril S200 en 0,25 M de acetato amónico pH 5.5 en un flujo
constante de 1 ml/min. La xilanasa III es eluida como un valor pico
diferente con una pureza superior al 95%.
Las xilanasas fueron caracterizadas tal y como
están descritas en Materiales y métodos y los resultados
principales son aparentes en la tabla siguiente:
Los pH óptimos de las diferentes enzimas pueden
ser vistos en las Fig. 3 y 4, respectivamente. Se puede observar
que todas las xilanasas tienen un pH óptimo en la gama de pH
4-6, la xilanasa II siendo la más acídica y la
xilanasa I la más alcalina. La xilanasa II está caracterizada por el
hecho de tener una temperatura óptima elevada (70ºC) en comparación
con las otras enzimas.
La Km y actividad específica de xilanasa
I, II y III fueron determinadas tal y como está descrito en la
sección Materiales y métodos más arriba. Las desviaciones estándar
en 1/Vmax y Km/Vmax obtenidas a partir del análisis de regresión
lineal fueron utilizadas para calcular los intervalos para las
enzimas aparentes de la tabla anterior.
Es evidente que las xilanasas presentan
actividades específicas en la gama de 50-250
\mumol/min/mg de proteína enzimática, la xilanasa II presentando
la mayor actividad.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cromatogramas de la filtración en gel
obtenidos para las xilanasas I, II y III, respectivamente, (usando
el método descrito en la sección Materiales y métodos más arriba)
están mostrados en las Figs. 5-11.
Si los perfiles de degradación son ordenados
después de reducir la extensión de degradación de arabinoxilano
soluble después de 10 minutos de incubación, se obtiene el orden
siguiente: xilanasa II, xilanasa I y xilanasa III.
En cambio, si la cantidad de arabinoxilano
insoluble solubilizado (considerada a partir del área de los
cromatogramas) es considerada después de 10 minutos el orden es:
xilanasa I, xilanasa III, xilanasa II.
Además, las enzimas pueden ser divididas en
enzimas que continúan la degradación de xilano y las enzimas que
detienen su degradación después de cierto tiempo. La xilanasa II
detiene la degradación en arabinoxilano soluble, mientras que las
xilanasas II y III la continúan (la xilanasa I creando grandes
cantidades de monómero y dímero y la xilanasa III siendo más
restringida en su modelo de degradación).
En arabinoxilano soluble, la xilanasa I no
detiene la degradación, mientras que las xilanasa II y xilanasa III
lo hacen. La xilanasa II es especial en la medida en que es muy
lenta respecto al ataque al sustrato insoluble.
Según los resultados se sugiere que las enzimas
están divididas en diferentes clases. La Xyl2 actúa muy rápidamente
sobre el arabinoxilano soluble y muy lentamente sobre el
arabinoxilano insoluble y la degradación se detiene después de un
tiempo. La Xyl3 es rápida con respecto a la degradación de
arabinoxilano insoluble, pero no degrada el material liberado de
manera extensiva. La Xyl1 se caracteriza por una degradación
extensiva de ambos arabinoxilanos soluble e insoluble en
oligómeros.
\vskip1.000000\baselineskip
Las diferentes xilanasas fueron probadas para
determinar su capacidad de reducción de la viscosidad en la harina
de trigo denominada harina Fakta ("Luksus hvedemel",
una harina comercial de tipo no especifico, disponible en
Dagligvaregruppen, DK-7100 Vejle, Dinamarca). La
harina tiene la composición siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Las xilanasas probadas fueron
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
La reducción de la viscosidad fue medida por el
método siguiente:
100 g de harina son pesados con precisión. A 120
ml de agua desionizada mantenida a 35ºC, fueron añadidas las
enzimas mencionadas anteriormente. Las enzimas son dosificadas como
a continuación:
- Spezyme CP:
- 8.5 FXU (correspondientes a 3.4 mg de proteína)
- Xilanasa I:
- 28.3 FXU (correspondientes a 0.236 mg de proteína enzimática y 4.2 mg de proteína)
- Xilanasa II:
- 7.5 FXU (correspondientes a 0.19 mg de proteína enzimática y 0.25 mg de proteína)
- Xilanasa de H. insolens:
- 82.2 FXU (correspondientes a 2.2 mg de proteína enzimática y 22.3 mg de proteína).
\vskip1.000000\baselineskip
Una muestra blanca es usada como control
(ninguna enzima añadida). La harina y el agua son agitadas durante
30 segundos y luego mezcladas durante 30 segundos precisamente en
una mezcladora (Warring, Commercial laboratory blender, Struers,
Adjustments OFF 1-7, rotor en fondo (4 cuchillas))
a 7 (máxima velocidad). Se tarda 30 segundos en verter el líquido en
el tubo de medición en el viscosímetro (reómetro programable,
modelo DV-111, Brookfield, Spindel 25, el tubo de
medición siendo termostatado a 38ºC). La viscosidad a 40 rpm es
medida cada 15 seg durante 4 minutos. La viscosidad específica
expresada como viscosidad media de la viscosidad de la
muestra/media del blanco en porcentajes es usada en forma de medida
de la reducción de viscosidad. La viscosidad media es una media del
nivel alcanzado después de 60 segundos y hasta el final de las
mediciones.
La viscosidad relativa mínima fue determinada
mediante el uso de xilanasa II. Se descubrió que otras xilanasas
reducían la viscosidad relativa (xilanasa I, Spezyme CP) aunque en
una extensión menor. Se descubrió que la xilanasa de H.
insolens aumentaba la viscosidad en esa dosificación. Como
ejemplo, las dosificaciones mencionadas anteriormente obtenidas en
una viscosidad específica de la "harina Fakta" del 69% para la
xilanasa II, del 78% para la xilanasa I, del 87% para Spezyme CP y
del 107% para la xilanasa de H. insolens en porcentaje de
viscosidad del blanco.
La capacidad de separación del trigo de las
enzimas mencionadas en el Ejemplo 5 fue determinada por una prueba
de centrifugado. La prueba se realizó con la harina mencionada en
el Ejemplo 5.
La harina y el agua fueron mezcladas según el
procedimiento descrito en el Ejemplo 5. Después de la mezcla 10 ml
de suspensión fueron centrifugados (Megafuge 1.0 Heraeus Sepatech)
a 4332 g durante 5 minutos. El almidón fue encontrado en la capa de
fondo, seguido del gluten, de residuos y de la capa efluente en la
parte superior. La separación es expresada como un porcentaje
efluente. Cuanto más elevado es el porcentaje mejor es la
separación.
Se confirmó que la xilanasa II funcionaba mejor.
Como ejemplo, el efluente de "Harina Fakta" era del 14% para
una muestra blanca, del 21% para Spezyme CP, del 22% para la
xilanasa I y del 23% para la xilanasa II.
Lipasa A: La lipasa de Humicola
lanuginosa descrita en EP 305 216 y producida por técnicas de
ADN recombinante en Aspergillus oryzae como se describe en
EP 305 216. La lipasa tiene una actividad específica de 4.452.000
LU/g y de una FAU/g inferior a 0,6.
Xilanasa A: una xilanasa producida por la
cepa de Humicola insolens DSM 1800 disponible en Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH y también
descrita en EP 507 723.
Fungamyl: una preparación fúngica de
a-amilasa comercialmente disponible en Novo Nordisk
NS; Dinamarca.
Pentopan: una preparación de xilanasa
comercialmente disponible en Novo Nordisk NS, Dinamarca.
LU/g (Unidades/g de lipasa), FAU/g (Unidades/g
de alfa-amilasa fúngica) y FXU (unidades/g de
xilanasa) fueron determinadas por los ensayos siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad de lipasa fue probada usando
tributirato de glicerina como un sustrato y una goma arábiga como
emulsionante. 1 LU (unidad de lipasa) es la cantidad de enzima que
libera 1 \mumol de ácido butírico titulable por minuto a 30ºC, pH
7.0. La actividad lipasa fue probada por un pH-stat
usando un radiómetro titulador Radiometer VIT90, Copenhage. Otros
detalles del ensayo son proporcionados en un método analítico Novo
AF 95/5, disponible bajo pedido.
\vskip1.000000\baselineskip
1 Unidad FA (FAU) es la cantidad de enzima que,
a 37ºC y pH 4.7, rompe 5260 mg de almidón sólido por hora. Otros
detalles del ensayo son proporcionados en el método analítico Novo
AF 9.1/3, disponible bajo pedido.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó tal y como se ha descrito
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
El pan blanco fue preparado a partir de la
siguiente receta básica:
La harina de trigo era del tipo denominado
"Manitoba" provista por "Valsemøllerne", Dinamarca,
octubre 1993.
1. Mezcla de masa (mezclador Spiral)
2 min. a 700 rpm
7 min. a 1400 rpm
el tiempo de mezcla fue determinado y ajustado
por unos panaderos profesionales para obtener una consistencia de
masa óptima en las condiciones usadas de la prueba.
2. Primera prueba: 30ºC - 80% RH, 16 min.
3. Puesta en escala y conformación;
4. Prueba final: 32ºC - 80% RH, 35 min.;
5. Cocción: 225ºC, 20 min. para panecillos y 30
min. para una barra de pan.
\vskip1.000000\baselineskip
Las propiedades de la masa y de los productos
cocidos al horno fueron determinadas tal y como se indica a
continuación:
Volumen específico de panecillo: el
volumen de 20 panecillos es medido usando el método de semilla de
colza tradicional. El volumen específico es calculado como volumen
en ml por g de pan. El volumen específico del control (sin enzima)
es definido como 100. El índice de volumen específico relativo es
calculado como:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Volumen específico de barra de pan: el
valor medio de 4 volúmenes de barras de pan es medido usando los
mismos métodos tal y como se han descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
La pegajosidad de la masa y la estructura de la
miga son determinadas visualmente según la escala siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La blandura de la miga de pan es medida por un
analizador de textura SMS. Un palpador con un diámetro de 20 mm es
prensado en el centro de una rebanada de pan de 20 mm de grosor, la
fuerza necesaria para que el palpador aplaste la miga de 5 mm con
una velocidad de 2,0 mm/s es registrada y es expresada como la
firmeza de miga. Cuanto más bajo es el valor, más blanda es la
miga. Cuatro rebanadas de cada pan son medidas y el valor medio
es
usado.
usado.
\newpage
La enzima usada fue la xilanasa I, una xilanasa
recombinante de A. aculeatus producida en A. oryzae
tal y como se describe en los Ejemplos 2 y 3 más arriba. El efecto
de esta xilanasa fue comparado con la xilanasa A de H.
insolens y una pentosanasa disponible comercialmente, Pentopan.
Las enzimas fueron añadidas directamente a la mezcla de
ingredientes de la industria panadera o bien dispersadas en agua
antes de ser añadidas a la mezcla. Todas las pruebas fueron
realizadas al menos por duplicado y los resultados promedio fueron
usados. Los resultados obtenidos están mostrados en la tabla 5.
Es aparente según la tabla 5 que la adición de
xilanasa I aumenta significativamente el volumen de los panecillos
y/o barras de pan y el efecto es mayor al obtenido con la xilanasa
A y Pentopan de la técnica anterior. En la dosificación óptima, es
decir la dosificación que proporciona el aumento de volumen
específico máximo sin obtener una masa demasiado pegajosa, de la
pentosanasa (Pentopan) y xilanasa conocidas (xilanasa A), el aumento
de volumen máximo es de aproximadamente 10-16%. En
la dosificación óptima de xilanasa I (aproximadamente
350-750 FXU por kg de harina) un volumen en aumento
del 29-41% puede ser obtenido sin producir
una masa demasiado pegajosa. Con un tiempo de impermeabilización
más largo al 80% de RH y 32ºC, puede ser obtenido un volumen aún
mayor. Además, la estructura de la miga y la blandura de la miga
durante el almacenamiento son también mejoradas.
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siguiente)
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solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector. No forma parte del documento de patente europea. La
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\vskip1.000000\baselineskip
En las SEQ ID Nº 4-6, "*"
indica la posición correspondiente a un codón de parada.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Novozymes A/S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Enzima con actividad xilanasa de
Aspergillus aculeatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 3954.215-EP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Versión de patente 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1273
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus aculeatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (68)..(1273)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>1
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 327
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus aculeatus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400>2
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus aculeatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus aculeatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1327
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus aculeatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(1326)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 406
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus aculeatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus aculeatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 927
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus aculeatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)..(927)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 231
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus aculeatus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus aculeatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus aculeatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus aculeatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 405
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus aculeatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características varias
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (193)..(193)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
producido naturalmente
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400>13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 451
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus aculeatus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 303
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aspergillus aculeatus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
Claims (31)
1. Enzima que presenta actividad xilanasa, dicha
enzima es codificada por una secuencia de ADN:
a) comprendida en o comprendiendo la secuencia
de ADN mostrada en la SEC ID Nº: 1, o
b) una secuencia de codificación de un
polipéptido que presenta una actividad xilanasa que es al menos
idéntica a 70% sobre toda la longitud a una xilanasa codificada por
la SEC ID Nº: 1.
2. Enzima según las reivindicaciones 1, dicha
enzima es codificada por una secuencia de ADN comprendiendo la
secuencia parcial siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
o una secuencia idéntica al 70% a
ésta sobre toda la longitud de codificación de un polipéptido con
actividad
xilanasa.
3. Enzima según cualquiera de las
reivindicaciones 1 o 2, que posee una masa molecular de
aproximadamente 32,3 kDa.
4. Enzima según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, que posee un punto isoeléctrico de
aproximadamente 8,8.
5. Enzima según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, que posee una Km comprendida en la gama
situada entre aproximadamente 0,32 a 0,48.
6. Enzima según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, que puede ser derivada de un
microorganismo.
7. Enzima según las reivindicaciones 6, que
puede ser derivada de un hongo filamentoso o de una levadura.
8. Enzima según la reivindicación 7, que puede
ser derivada de una cepa de Aspergillus, Trichoderma,
Penicillium, Fusarium o de Humicola.
9. Enzima según las reivindicaciones 8, dicha
enzima puede ser derivada de una cepa de Aspergillus.
10. Enzima según la reivindicación 9, dicha
enzima puede ser derivada de una cepa de Aspergillus
aculeatus, Aspergillus Níger o de Aspergillus
oryzae.
11. Enzima según la reivindicación 9, que es
codificada por la secuencia de ADN aislada de una biblioteca de ADN
preparada a partir de Aspergillus aculeatus, CBS 101.43.
12. Constructo de ADN comprendiendo una
secuencia de ADN de codificación de una enzima según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 11.
13. Vector de expresión recombinante
comprendiendo una secuencia de ADN de codificación de una enzima
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
14. Célula comprendiendo un vector de expresión
recombinante según la reivindicación 13, teniendo en cuenta que la
célula no forma parte de un animal o de un humano.
15. Célula según la reivindicación 14, que es
una célula eucariota.
16. Célula según la reivindicación 15, en la
que la eucariota es una célula fúngica, una célula de levadura o
una célula fúngica filamentoso.
17. Célula según la reivindicación 16, en la
que la célula pertenece a una cepa de Aspergillus.
18. Célula según la reivindicación 17, en la
que la célula pertenece a una cepa de Aspergillus niger o de
Aspergillus oryzae.
\newpage
19. Método de producción de una enzima que
presenta actividad xilanasa, este método consistiendo en poner en
cultivo una célula según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18
en condiciones permitiendo la producción de la enzima, y la
recuperación de la enzima del cultivo.
20. Preparación enzimática, dicha preparación
siendo enriquecida con una enzima según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11.
21. Preparación enzimática según la
reivindicación 20, que incluye una o varias actividades
celulolíticas, xilanolíticas o pectolíticas.
22. Preparación según la reivindicación 21, que
comprende además una pectina liasa, una pectato liasa, una
glucanasa, una xilosidasa, una arabinosidasa, una acetil xilano
esterasa o una pectina metilesterasa.
23. Uso de una enzima según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 o de una preparación enzimática según las
reivindicaciones 20 a 22 en la producción de masas o de productos
cocidos al horno.
24. Uso de una enzima según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 o de una preparación enzimática según las
reivindicaciones 20 a 22 en la preparación de piensos o
alimentos.
25. Uso de una enzima según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 o de una preparación enzimática según las
reivindicaciones 20 a 22 en la preparación de pulpa o de papel.
26. Uso de una enzima según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 o de una preparación enzimática según las
reivindicaciones 20 a 22 para la separación de componentes de
cereales.
27. Uso según la reivindicación 26, donde el
cereal es trigo.
28. Uso según las reivindicaciones 26 o 27,
donde el componente de cereales es trigo, que debe ser separado en
gluten y en almidón.
29. Uso de una enzima según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 o de una preparación enzimática según las
reivindicaciones 20 a 22 para reducir la viscosidad de un material
derivado de una pared celular vegetal.
30. Uso de una enzima según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 o de una preparación enzimática según las
reivindicaciones 20 a 22 para la producción de cerveza o la
modificación de subproductos procedentes de un proceso de
elaboración de cerveza.
31. Uso de una enzima según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 o de una preparación enzimática según las
reivindicaciones 20 a 22 para la producción de vino o de zumo.
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