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JP7553440B2 - 抗ｃｄ３３免疫細胞癌療法 - Google Patents

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Description

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本出願は、２０１８年１１月７日に出願された米国仮特許出願第６２／７５６，７１８号、２０１８年１１月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／７６７，３８８号、２０１８年１１月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／７６７，３９５号、２０１９年３月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／８２６，６４３号、及び２０１９年３月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／８２６，６４８号明細書の出願日の利益を主張する。前の出願の各々の全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法は、遺伝的に改変されたＴ細胞を使用して、癌細胞をより特異的に且つ効率的に標的化し且つ死滅させる。Ｔ細胞が血液から回収された後、細胞は、それらの表面上にＣＡＲを含むように操作される。ＣＡＲは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術を使用してＴ細胞に導入され得る。これらの異質遺伝子型のＣＡＲ Ｔ細胞が患者に注射されるとき、受容体は、Ｔ細胞が癌細胞を死滅させることを可能にする。
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、骨髄前駆細胞において蓄積された変異から生じる血液腫瘍であり、造血組織における骨髄芽球の蓄積をもたらす過剰増殖及び分化の遮断を引き起こす。標準的な導入化学療法に対する応答は、最初に高いが、ＡＭＬ患者の大部分に関して再発が一般的であり、予後は芳しくない（Ｔａｌａｔｉ ａｎｄ Ｓｗｅｅｔ，２０１８）。近年、ＡＭＬのための新しい治療はほとんど承認されていない。
ＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ３、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン３、ｇｐ６７、又はｐ６７としても知られる）は、ＡＭＬ及び他の白血病、例えば、Ｔ細胞白血病の治療のための魅力的な標的である。それは、症状及び再発の両方でＡＭＬ芽球及び亜集団（免疫表現型が定義された白血病幹細胞）の大部分で発現される（Ｈａｕｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。その発現は、正常な単球、顆粒球、造血前駆細胞及び免疫表現型が定義された造血性幹細胞集団中の一部の細胞に限定されると考えられる（Ｈａｕｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。マウスにおけるＣＤ３３のノックアウトは、いかなる明白な表現型ももたらさない（Ｂｒｉｋｍａｎ－Ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。さらに、抗ＣＤ３３抗体薬物コンジュゲートゲムツズマブオゾガマイシン（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇｍｉｃｉｎ）（ＧＯ）は、ＡＭＬにおけるヒトでの使用に関して承認され、許容される安全性プロファイルを有する。しかしながら、ＧＯは、全生存期間において中程度の改善のみを示す（Ｔａｌａｔｉ ａｎｄ Ｓｗｅｅｔ，２０１８）。抗ＣＤ３３ＣＡＲ－Ｔ細胞などのさらなる強力なペイロードでＣＤ３３発現細胞を標的化することは、ＧＯに対してＡＭＬにおける有効性の改善を実証し得る。さらに、抗ＣＤ３３ＣＡＲ－Ｔ細胞は、他のＣＤ３３発現悪性腫瘍のための有効な治療選択肢となる。
本開示のいくつかの態様は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む操作されたＴ細胞を提供し、ＣＡＲは、ＣＤ３３に特異的に結合する外部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞はさらに、破壊されたＴ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子を含む。例えば、ＴＲＡＣ遺伝子は、ＣＡＲをコードする核酸の挿入によって破壊され得る。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞はさらに、破壊されたベータ－２－ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞はさらに、破壊されたＣＤ３３遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたβ２Ｍ遺伝子、破壊されたＣＤ３３遺伝子、及び抗ＣＤ３３抗原結合断片を含むＣＡＲをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を含み、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子は、抗ＣＤ３３抗原結合断片を含むＣＡＲをコードする核酸、破壊されたβ２Ｍ遺伝子及び破壊されたＣＤ３３遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（ａ）抗ＣＤ３３抗原結合断片を含む外部ドメイン、（ｂ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｃ）４１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３ｚ共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする核酸を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；及び（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む。いくつかの例において、そのような操作されたＴ細胞は、野生型ＣＤ３３遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする核酸を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；及び破壊されたＣＤ３３遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、ＣＡＲをコードする核酸を含み、核酸配列が、配列番号５６と少なくとも９０％同一であり、且つ配列番号１０４のＣＡＲをコードする破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；及び（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、ＣＡＲをコードする核酸を含み、核酸配列が、配列番号５６と少なくとも９０％同一であり、且つ配列番号１０４のＣＡＲをコードする破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；及び（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ３３遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号５５の核酸配列を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；及び（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、野生型ＣＤ３３を含む。
いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号５５の核酸配列を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；及び（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ３３遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞が、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、（ａ）抗ＣＤ３３抗原結合断片を含む外部ドメイン、（ｂ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｃ）４１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３ζ共刺激ドメインを含む内部ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；並びに（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む細胞の集団を提供する。いくつかの例において、操作されたＴ細胞は、野生型ＣＤ３３を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞が、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、（ａ）抗ＣＤ３３抗原結合断片を含む外部ドメイン、（ｂ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｃ）４１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３ζ共刺激ドメインを含む内部ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；並びに（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ３３遺伝子を含む細胞の集団を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞が、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする核酸を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；及び（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む細胞の集団を提供する。いくつかの例において、操作されたＴ細胞は、野生型ＣＤ３３を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞が、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする核酸を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；及び（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ３３遺伝子を含む細胞の集団を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞が、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、ＣＡＲをコードする核酸を含み、核酸配列が、配列番号５６と少なくとも９０％同一であり、且つ配列番号１０４のＣＡＲをコードする破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；及び（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む細胞の集団を提供する。いくつかの例において、操作されたＴ細胞は、野生型ＣＤ３３を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞が、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、ＣＡＲをコードする核酸を含み、核酸配列が、配列番号５６と少なくとも９０％同一であり、且つ配列番号１０４のＣＡＲをコードする破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；及び（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ３３遺伝子を含む細胞の集団を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞が、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号５５の核酸配列を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；及び（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む細胞の集団を提供する。いくつかの例において、操作されたＴ細胞は、野生型ＣＤ３３を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞が、（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号５５の核酸配列を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；及び（ｉｉｉ）破壊されたＣＤ３３遺伝子を含む細胞の集団を提供する。
本明細書に記載される任意の操作されたＴ細胞は、ヒトＴ細胞であり得る。
ＣＡＲの外部ドメインは、いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３３抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体は、抗ＣＤ３３一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖは、いくつかの実施形態において、配列番号７３、７５、８５、８７、９７、又は９９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖは、配列番号６５、７７若しくは８９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び／又は配列番号６６、７８若しくは９０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖは、配列番号６７、配列番号６８、及び／又は配列番号６９のＣＤＲアミノ酸配列を含むＶＨを含み；且つ／又は抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖは、配列番号７０、配列番号７１、及び／又は配列番号７２のＣＤＲアミノ酸配列を含むＶＬ配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖは、配列番号７９、配列番号８０、及び／又は配列番号８１のＣＤＲアミノ酸配列を含むＶＨを含み；且つ／又は抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖは、配列番号８２、配列番号８３、及び／又は配列番号８４のＣＤＲアミノ酸配列を含むＶＬ配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖは、配列番号９１、配列番号９２、及び／又は配列番号９３のＣＤＲアミノ酸配列を含むＶＨを含み；且つ／又は抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖは、配列番号９４、配列番号９５、及び／又は配列番号９６のＣＤＲアミノ酸配列を含むＶＬ配列を含む。
ＣＡＲは、いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζ細胞質内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は４１ＢＢ共刺激ドメインを含む。特定の例において、本明細書で開示されるＣＡＲは、抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ、ＣＤ２８共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζ細胞質内シグナル伝達ドメインを含む。他の例において、本明細書で開示されるＣＡＲは、抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζ細胞質内シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子は、配列番号４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、１０９、１１２、１１５、又は１１８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、且つ／又はＣＡＲは、配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、１１０、１１３、１１６又は１１９のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、破壊されたβ２Ｍ遺伝子は、配列番号９～１４のいずれか１つから選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、野生型ＣＤ３３遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、破壊されたＣＤ３３遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、破壊されたＣＤ３３遺伝子は、ＡＧＴＴＣＡＴＧＧＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣ（配列番号１８７）、ＡＧＴＴＣＡＴＧＧＴＴＣＣ（配列番号１８８）、ＡＧＴＴＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣ（配列番号１８９）、ＡＧＴＴＣＡＴＧＧＴＴＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣ（配列番号１９０）、ＡＧＴＴＣＣ、ＡＧＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣ（配列番号１９１）、ＡＧＴＴＣＡＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣ（配列番号１９２）、ＡＧＴＴＣＡＴＧＧＴＡＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣ（配列番号１９３）、及び／又はＡＧＴＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣ（配列番号１９４）のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、破壊されたＣＤ３３遺伝子は、ＡＧＴＴＣＡＴＧＧＴＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣ（配列番号１８６）を含む断片を欠く。
いくつかの実施形態では、破壊されたＣＤ３３遺伝子は、ＡＡＡＴＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３００）、ＡＡＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３０１）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＡＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３０２）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＡＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３０４）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３０５）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３０６）、ＡＡＡＴＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３０７）、ＡＣＡＴＣＣＴＣＡＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３０８）、ＡＣＡＴＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３０９）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３１０）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＡＴＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３１１）、ＡＡＡＴＣＣＴ、ＡＡＡＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３１２）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３１３）、ＡＡＡＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３１４）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＡＣＴ（配列番号３１５）、ＡＣＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３１６）、及び／又はＡＡＡＴのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、破壊されたＣＤ３３遺伝子は、ＡＡＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号２９９）を含む断片を欠く。
いくつかの実施形態では、破壊されたＣＤ３３遺伝子は断片を欠き、その３’セグメントは、ＡＡＡＴＣＣＴＣＡＴ（配列番号３１７）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＣＴ（配列番号３１８）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＧ（配列番号３２０）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＡＴＣ（配列番号３２２）、又はＡＡＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡ（配列番号３２４）のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、破壊されたＣＤ３３遺伝子は断片を欠き、その５’セグメントは、ＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３２３）のヌクレオチド配列を含む。
本明細書では、いくつかの態様において、操作されたＴ細胞（例えば、抗ＣＤ３３ ＣＡＲをコードする核酸を含む）の集団であって、集団のうちの少なくとも２５％又は少なくとも５０％の操作されたＴ細胞がＣＡＲを発現する集団も提供される。例えば、集団のうちの少なくとも７０％の操作されたＴ細胞がＣＡＲを発現する。
いくつかの実施形態では、集団のうちの少なくとも２５％の操作されたＴ細胞は、インビトロ増殖の少なくとも７日後又は少なくとも１４日後にＣＡＲを発現する。
いくつかの実施形態では、集団のうちの少なくとも５０％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）タンパク質を発現しない。例えば、集団のうちの少なくとも９０％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＴＣＲタンパク質を発現しない場合がある。
いくつかの実施形態では、集団のうちの少なくとも５０％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのβ２Ｍタンパク質を発現しない。例えば、集団のうちの少なくとも７０％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのβ２Ｍタンパク質を発現しない場合がある。
いくつかの実施形態では、集団のうちの少なくとも２０％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＣＤ３３タンパク質を発現しない。例えば、集団のうちの少なくとも５０％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＣＤ３３タンパク質を発現しない場合がある。
いくつかの実施形態では、集団の操作されたＴ細胞は、ＣＤ３３を発現する癌細胞の集団とインビトロで共培養されるとき、集団のうちの少なくとも５０％の癌細胞の細胞溶解を誘導する。例えば、集団の操作されたＴ細胞は、集団のうちの少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の癌細胞の細胞溶解を誘導し得る。いくつかの実施形態では、集団の操作されたＴ細胞は、癌細胞の集団とインビトロで共培養されるとき、ＩＦＮγを分泌する。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞と癌細胞の比は、１：１～２：１である。癌細胞は、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）などの白血病であり得る。他の癌細胞が標的化されてもよい。
いくつかの実施形態では、集団の操作されたＴ細胞の増殖能は、対照細胞の増殖能の１０％以内である。
本開示の他の態様は、本明細書に記載されるとおりの操作されたＴ細胞の集団を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、投与の５～１０日後の対象の体重パーセントは、対象の初期の体重の１０％以内であり、対象の初期の体重は、投与時の対象の体重である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト対象である。いくつかの実施形態では、対象は、癌を有する。癌は、例えば、ＣＤ３３を発現する場合がある。癌は、例えば、ＡＬＬ、ＡＭＬ、ＣＬＬ及びＣＭＬなどの白血病であり得る。
本開示のさらなる態様は、操作されたＴ細胞を生成する方法であって、（ａ）Ｔ細胞にＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、及びＣＤ３３に特異的に結合する外部ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸を含むドナー鋳型を含むベクターを送達すること（ＣＡＲをコードする核酸は、ＴＲＡＣ遺伝子の左及び右相同性アームに隣接する）、並びに（ｂ）操作されたＴ細胞を生成することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡは、配列番号１８又は配列番号１９のヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号４０のヌクレオチド配列を標的化する。
いくつかの実施形態では、方法はさらに、Ｔ細胞にβ２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡを送達することを含む。いくつかの実施形態では、β２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡは、配列番号２０又は配列番号２１のヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号４１のヌクレオチド配列を標的化する。
いくつかの実施形態では、方法はさらに、Ｔ細胞にＣＤ３３遺伝子を標的化するｇＲＮＡを送達することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３３遺伝子を標的化するｇＲＮＡは、表１０において提供されるとおりのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、任意選択により、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。
いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、配列番号４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、１０９、１１２、１１５、又は１１８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、１１０、１１３、１１６又は１１９のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
本開示のさらなる態様は、癌、例えば、白血病を有する対象に本明細書に記載されるとおりの操作されたＴ細胞の集団を投与することを含む、対象における腫瘍の体積を減少させるための方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象における腫瘍の体積は、ベースライン対照に対して少なくとも５０％減少され、任意選択により、集団の１×１０5個の細胞～１×１０7個の細胞が投与される。
エレクトロポレーション後の２週間目に選択された抗ＣＤ３３ ＣＡＲコンストラクトで編集されたＴ細胞上の抗ＣＤ３３ ＣＡＲの表面発現を示すフローサイトメトリープロットを含む。ＣＴＸ－９６５ｂ ＣＡＲによるトランスフェクションは、高割合の抗ＣＤ３３ ＣＡＲを発現するＴ細胞をもたらした。全てのＣＡＲ Ｔ細胞は、ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－（２ＫＯ）でもある。 エレクトロポレーション後の２週間目に選択された抗ＣＤ３３ ＣＡＲコンストラクトで編集されたＴ細胞上の抗ＣＤ３３ ＣＡＲの表面発現を示すフローサイトメトリープロットを含む。ＣＴＸ－９７０ ＣＡＲ及びＣＴＸ－９６５ｂ ＣＡＲによるトランスフェクションは、高割合の抗ＣＤ３３ ＣＡＲを発現するＴ細胞をもたらした。全てのＣＡＲ Ｔ細胞は、ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－（２ＫＯ）でもある。 エレクトロポレーション後の１週間目に選択された抗ＣＤ３３ ＣＡＲコンストラクトで編集されたＴ細胞上の抗ＣＤ３３ ＣＡＲの表面発現を示すフローサイトメトリープロットを含む。ＣＴＸ－９８１ ＣＡＲ、ＣＴＸ－９８１ｂ ＣＡＲ、ＣＴＸ－９８２ ＣＡＲ、及びＣＴＸ－９８２ｂ ＣＡＲによるトランスフェクションは全て、高割合の抗ＣＤ３３ ＣＡＲを発現するＴ細胞をもたらした。全てのＣＡＲ Ｔ細胞は、ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－（２ＫＯ）でもある。 ドナーＴ細胞集団に対する遺伝子編集の効果を実証するフローサイトメトリープロットを含む。細胞表面ＴＣＲ、β２Ｍ及び抗ＣＤ３３ ＣＡＲの発現を有する編集されたＴ細胞の集団が示される。さらに、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋であるＴ細胞の集団が示される。注目すべきことに、ＣＴＸ－９６５ｂ細胞は、遺伝子編集後の少なくとも１週間高いレベルのＣＤ４／ＣＤ８の発現を保持する。 ある期間の間のＴＲＡＣ－／β２Ｍ－ Ｔ細胞においてＣＡＲを発現する細胞の％を示す。全ての抗ＣＤ３３ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、２週間かけて増殖した。 ある期間の間のＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋の編集されたＴ細胞集団内のＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の％を示す。上のパネルは、編集後の１及び２週目の７種の一次Ｔ細胞ドナーに由来するＣＴＸ－９６５ｂ ＣＡＲ Ｔ細胞中のＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞を示す。下のパネルは、編集後の１及び２週目に４種の一次Ｔ細胞ドナーに由来するＣＴＸ－９７０ ＣＡＲ Ｔ細胞中のＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞を示す。 ある期間の間のＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞集団中のＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の％を示す。特に、図は、編集後の１及び２週目の３種の一次Ｔ細胞ドナーに由来するＣＴＸ－９８２ｂ ＣＡＲ Ｔ細胞中のＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞を示す。 抗ＣＤ３３ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＴＸ－９６５ｂ）の集団、及び対照Ｔ細胞（ＲＮＰなし；ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－）の集団の細胞増殖を示すグラフを含む。 様々な血液に由来する細胞株におけるＣＤ３３の表面発現レベルを示すグラフを含む。左のパネルは、ＴＨＰ－１（ＡＭＬ）及びＰＢＭＣが、ＣＤ３３の高い表面発現を有することを示し、右のパネルは、ＡＭＬ癌細胞株：ＭＶ４－１１、ＴＨＰ－１及びＫＧ－１におけるＣＤ３３の高い表面発現を示す。右のパネルはまた、ＣＤ３３ノックアウトで操作されたＭＶ４－１１細胞（ＭＶ４－１１ ＣＤ３３ノックアウト）が、ＣＤ３３を発現しないことを示す。 ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＣＤ３３ ＣＡＲ+ Ｔ細胞（ＣＴＸ－９６５ｂ及びＣＴＸ－９７０）が、ＣＤ３３を発現するＡＭＬ細胞（ＴＨＰ－１、ＫＧ－１及びＭＶ４－１１）を死滅させることができることを実証するグラフを含む。図５Ａは、４種の異なる一次Ｔ細胞ドナーから作製されたＣＴＸ－９６５ｂ ＣＡＲ Ｔ細胞が、０．０５：１～１：１ ＣＴＸ－９６５ｂ：ＴＨＰ－１の細胞比でＴＨＰ－１細胞において細胞溶解を誘導する際に効果的であることを示す。図５Ｂは、１つのドナーから単離されたＴ細胞からそれぞれ作製されたＣＴＸ－９６５ｂ及びＣＴＸ－９７０ ＣＡＲ Ｔ細胞が、０．０５：１～１：１ ＣＡＲ－Ｔ細胞：ＴＨＰ－１の細胞比でＴＨＰ－１細胞の細胞溶解を誘導する際に効果的であることを示す。 図５Ｃは、４種の異なるドナーから単離されたＴ細胞から作製されたＣＴＸ－９６５ｂ、及び１種の一次Ｔ細胞ドナーから作製されたＣＴＸ－９７０ ＣＡＲ Ｔ細胞が、０．０５：１～１：１ ＣＡＲ－Ｔ細胞：ＫＧ－１の細胞比でＫＧ－１細胞において細胞溶解を誘導する際に効果的であることを示す。図５Ｄは、１つのドナーから単離されたＴ細胞からそれぞれ作製されたＣＴＸ－９６５ｂ及びＣＴＸ－９７０ ＣＡＲ Ｔ細胞が、０．０５：１～１：１ ＣＡＲ－Ｔ細胞：ＭＶ４－１１の細胞比でＭＶ４－１１細胞において細胞溶解を誘導する際に効果的であることを示す。 ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＣＤ３３ ＣＡＲ+ Ｔ細胞（ＣＴＸ－９６５ｂ及びＣＴＸ－９７０）が、ＣＤ３３を発現するＡＭＬ細胞（ＴＨＰ－１、ＫＧ－１及びＭＶ４－１１）の存在下でＩＦＮγを分泌できることを実証するグラフを含む。図６Ａは、４種のドナーから作製されたＣＴＸ－９６５ｂ ＣＡＲ Ｔ細胞が、０．０５：１～１：１ ＣＴＸ－９６５ｂ：ＴＨＰ－１の細胞比でＴＨＰ－１細胞の存在下でＩＦＮγを分泌する際に効果的であることを示す。図６Ｂは、ＣＴＸ－９６５ｂ及びＣＴＸ－９７０ ＣＡＲ Ｔ細胞が、０．０５：１～１：１ ＣＡＲ－Ｔ細胞：ＴＨＰ－１の細胞比でＴＨＰ－１細胞の存在下でＩＦＮγを分泌する際に効果的であることを示す。 図６Ｃは、ＣＴＸ－９６５ｂ及びＣＴＸ－９７０ ＣＡＲ Ｔ細胞が、０．０５：１～１：１ ＣＡＲ－Ｔ細胞：ＭＶ－４１１の細胞比でＭＶ－４１１細胞の存在下でＩＦＮγを分泌する際に効果的であることを示す。図６Ｄは、ＣＴＸ－９６５ｂ及びＣＴＸ－９７０ ＣＡＲ Ｔ細胞が、０．０５：１～１：１ ＣＡＲ－Ｔ細胞：ＫＧ１の細胞比でＫＧ１細胞の存在下でＩＦＮγを分泌する際に効果的であることを示す。 図６Ｅは、ＣＴＸ－９６５ｂ ＣＡＲ Ｔ細胞増殖がサイトカイン依存的であることを示す。 ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞（ＣＴＸ－９６５ｂ ＣＡＲ Ｔ細胞）が、インビボマウスモデルで皮下ＴＨＰ－１ ＡＭＬ癌における腫瘍体積を減少させる際に効果的であることを示すグラフを含む。 ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞（ＣＴＸ－９６５ｂ ＣＡＲ Ｔ細胞）が、インビボマウスモデルで皮下ＴＨＰ－１ ＡＭＬ癌における十分に確立された腫瘍（およそ１５０ｍｍ3の開始腫瘍体積）の腫瘍体積を減少させる際に効果的であることを示すグラフを含む。 ＣＤ３３を標的化する様々なｓｇＲＮＡによる遺伝子編集の後の編集されたＣＤ８＋（左パネル）及びＣＤ４＋（右パネル）Ｔ細胞のパーセントを示す。 遺伝子編集後の７日目及び１４日目におけるＣＤ３３破壊の有り無し両方でのＴＲＡＣ－／β２Ｍ－編集されたＴ細胞における％ＣＡＲ発現細胞を示す。データは、６種の異なるコンストラクト：ＣＴＸ－９８１（９８１）、ＣＴＸ－９８１ｂ（９８１ｂ）、ＣＴＸ－９８２（９８２）、ＣＴＸ－９８２ｂ（９８２ｂ）、ＣＴＸ－９７０（９７０）、又はＣＴＸ－９６５ｂ（９６５ｂ）の１つに由来するＣＡＲを発現するＴ細胞に関して示される。 ある期間の間のＴＲＡＣ－／β２Ｍ－編集されたＴ細胞及びＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ３３－／抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋編集されたＴ細胞における％ＣＡＲ発現細胞を示す。データは、３種の異なるコンストラクト：ＣＴＸ－９６５ｂ（９６５ｂ）、ＣＴＸ－９７０（９７０）、又はＣＴＸ－９８２ｂ（９８２ｂ）の１つに由来するＣＡＲを発現するＣＡＲ＋ Ｔ細胞に関して示される。黒色のバー＝７日；灰色のバー：１４日。 ある期間の間のＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋編集されたＴ細胞及びＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ３３－／抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋編集されたＴ細胞集団におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の％を示す。左のパネルは、編集後の１及び２週目のＣＡＲ Ｔ細胞におけるＣＤ８＋細胞を示す。右のパネルは、編集後の１及び２週目のＣＡＲ Ｔ細胞におけるＣＤ４＋ ＣＤ８＋細胞を示す。 ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ３３－／抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞が、ＡＭＬ癌細胞を死滅させる能力を保持することを示す。左のパネルは、単一の一次Ｔ細胞ドナーから作製されたＣＡＲ＋ Ｔ細胞によるＡＭＬ細胞の％細胞溶解を示す。右のパネルは、異なる一次Ｔ細胞ドナーから作製されたＣＡＲ＋ Ｔ細胞によるＡＭＬ細胞の％細胞溶解を示す。 ２Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－）抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞及び３Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ３３－）抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞が、同様のレベルでＣＤ３３を発現するＡＭＬ細胞（ＭＶ４－１１；ＭＶ４－１１）においてＩＦＮγ分泌を誘導できることを実証する。２種の異なる一次Ｔ細胞ドナーから作製されたＣＡＲ Ｔ細胞は、０．０５：１～１：１ ＣＡＲ Ｔ細胞：ＭＶ４－１１の細胞比でＩＦＮγ分泌を誘導する際に効果的である。 ２Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－）抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞及び３Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ３３－）抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＣＤ３３を発現するＡＭＬ細胞（ＭＶ４－１１；ＭＶ４－１１）においてＩＬ－２分泌を誘導できることを実証する。データは、２種の異なる一次Ｔ細胞ドナーから作製されたＣＡＲ Ｔ細胞に関するものである。 １：１比（ＣＡＲ＋ Ｔ細胞：標的細胞）で播種されるときの２Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－）抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞又は３Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ３３－）抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞に応答した野生型ＭＶ４－１１細胞（左パネル）又はＣＤ３３ノックアウトＭＶ４－１１細胞（ＣＤ３３- ＭＶ４－１１）（右パネル）に関する％細胞溶解を示す。 ＣＡＲ＋ Ｔ細胞：ＣＤ３３－／ＭＶ４－１１細胞の０．２５：１、０．５：１、１：１、及び２：１比で播種されるときの２Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－）抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞又は３Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ３３－）抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞に応答したＣＤ３３ノックアウトＭＶ４－１１細胞（ＣＤ３３- ＭＶ４－１１）に関する％細胞溶解を示す。 ＣＤ３３が欠損した癌細胞（ＣＤ３３ ＫＯ、ＭＶ４－１１細胞）に応答した２Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－）抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞又は３Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ３３－）抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＩＬ－２分泌（左パネル）及びＩＦＮγ分泌（右パネル）を示す。 ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＣＤ３３ ＣＡＲ+ Ｔ細胞（ＣＴＸ－９６５ｂ及びＣＴＸ－９７０）が、ＡＭＬのＭＶ－４－１１ ＮＳＧマウスモデルにおいて治療効果をもたらしたことを実証するグラフを含む。図１９Ａは、ＣＴＸ－９６５ｂ ＣＡＲ Ｔ細胞の３種の異なる用量が、ＡＭＬのマウスモデルにおいて腫瘍量を減少させる際に効果的であったことを示す。 図１９Ｂは、ＣＴＸ－９６５ｂ ＣＡＲ Ｔ細胞の３種の異なる用量が、ＡＭＬのマウスモデルにおいて生存期間中央値を増加させる際に効果的であったことを示す。 図１９Ｃは、ＣＤ３３遺伝子のノックアウトの有り無し両方のＣＴＸ－９６５ｂ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＡＭＬのマウスモデルにおいて生存期間中央値を増加させる際に効果的であったことを示す。 図１９Ｄは、ＣＤ３３遺伝子のノックアウトの有り無し両方のＣＴＸ－９７０ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＡＭＬのマウスモデルにおいて生存期間中央値を増加させる際に効果的であったことを示す。 図１９Ｅは、ＣＤ３３ノックアウトを有するか又は有しないＣＴＸ－９６５ｂ又はＣＴＸ－９７０ ＣＡＲ Ｔ細胞によるマウスの治療の後の３３日目に生物発光イメージングによって測定された腫瘍量を示す。
本開示は、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞が、腫瘍量を減少させ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）のマウスモデルにおける生存期間中央値を増加させたという発見に少なくとも部分的に基づく。ＣＤ３３が、活性化Ｔ細胞上で高度に発現され、それにより抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞による自己反応性死滅に感受性であり得ることもまた実証された。そのような自己反応性死滅は、本明細書で提供される遺伝子編集方法を使用して抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞において内在性のＣＤ３３遺伝子を破壊することによって低減され得るか又は解消され得る。したがって、本開示は、いくつかの態様において、破壊された内在性のＣＤ３３遺伝子を有する抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞を提供する。他の態様では、本開示は、野生型の内在性のＣＤ３３遺伝子を有する抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞を提供する。
本開示の態様は、破壊されたＣＤ３３遺伝子を有するか又は有しない抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞、そのような抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞を生成する方法、及び対象における癌（例えば、ＡＭＬ）を治療するためにそのような抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞を使用する方法を提供する。本明細書で開示される抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞を作製するための成分及びプロセス（例えば、遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ手法及びそこで使用される成分）もまた、本開示の範囲内である。
ＣＤ３３癌抗原
いくつかの実施形態では、本開示のＴ細胞は、ＣＤ３３を標的化するように設計されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）により操作される。Ｓｉｇｌｅｃ３としても知られるＣＤ３３は、シアル酸に結合することが知られる骨髄系列の細胞上で発現される膜貫通受容体である。ＣＤ３３は、癌細胞（例えば、急性骨髄性白血病）において発現されるため、ＣＤ３３は、これらの悪性腫瘍を標的化するための細胞表面マーカーとなると考えられる。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示のＴ細胞は、抗ＣＤ３３抗体（例えば、抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ）を含むＣＡＲを発現するように操作される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体は、配列番号７４、７６、８６、８８、９８、又は１００のいずれか１つの配列によってコードされる抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体は、配列番号７３、７５、８５、８７、９７、又は９９のいずれか１つの配列を含む抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体は、配列番号６５、７７、又は８９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨを含む抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体は、配列番号６６、７８、又は９０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体を含むＣＡＲは、配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、１１０、１１３、１１６又は１１９のいずれか１つの配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体を含むＣＡＲは、配列番号１０１～１０８、１１１、１１４、１１７、又は１２０のいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３３抗体を含むＣＡＲは、米国特許第９，３５９，４４２号明細書、米国特許第９，５８７，０１９号明細書、又は米国特許第５，７７３，００１号明細書において記載されるとおりの抗ＣＤ３３抗体を含む。
多重遺伝子編集
本開示の操作されたＴ細胞は、いくつかの実施形態において、例えば、２つ以上の遺伝子における２つ以上の遺伝子編集を含む。例えば、操作されたＴ細胞は、破壊されたＴ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子、破壊されたベータ－２－ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子、破壊されたプログラム細胞死－１（ＰＤ－１又はＰＤＣＤ１）遺伝子、破壊されたＣＤ７０遺伝子、又は前述の破壊された遺伝子の２つ以上の任意の組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたβ２Ｍ遺伝子、及び破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたβ２Ｍ遺伝子、及び破壊されたＰＤ－１遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたβ２Ｍ遺伝子、破壊されたＣＤ７０遺伝子及び破壊されたＰＤ－１遺伝子を含む。
遺伝子破壊は、遺伝子編集（例えば、１つ以上のヌクレオチドを挿入するか又は欠失させるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集を使用する）を介する遺伝子改変を包含することが理解されるはずである。本明細書で使用する場合、用語「破壊された遺伝子」は、コードされた遺伝子産物の活性を実質的に低減するか又は完全に消失させるために野生型対応物に対して１つ以上の変異（例えば、挿入、欠失、又はヌクレオチド置換など）を含有する遺伝子を指す。１つ以上の変異は、非コード領域、例えば、プロモーター領域、転写又は翻訳を調節する調節領域；又はイントロン領域に位置してもよい。或いは、１つ以上の変異は、コード領域中（例えば、エクソン中）に位置してもよい。いくつかの場合において、破壊された遺伝子は、発現しないか又は実質的に低減されたレベルのコードされたタンパク質を発現する。他の場合において、破壊された遺伝子は、機能的ではないか又は実質的に低減された活性を有する変異形態のコードされたタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、破壊された遺伝子は、機能性タンパク質をコードしない遺伝子である。いくつかの実施形態では、破壊された遺伝子を含む細胞は、遺伝子によってコードされる検出可能なレベル（例えば、抗体によって、例えば、フローサイトメトリーによって）のタンパク質を、（例えば、細胞表面で）発現しない。検出可能なレベルのタンパク質を発現しない細胞は、ノックアウト細胞と呼ばれ得る。例えば、β２Ｍ遺伝子編集を有する細胞は、β２Ｍタンパク質が、β２Ｍタンパク質に特異的に結合する抗体を使用して細胞表面で検出できない場合、β２Ｍノックアウト細胞とみなされ得る。
いくつかの実施形態では、破壊された遺伝子は、野生型対応物に対して変異された断片を含むと記載され得る。変異された断片は、欠失、ヌクレオチド置換、付加、又はその組合せを含み得る。他の実施形態では、破壊された遺伝子は、野生型対応物において存在する断片の欠失を有すると記載され得る。いくつかの場合において、欠失された断片の５’末端は、本明細書に開示されるものなどの設計されたガイドＲＮＡによって標的化される遺伝子領域（オンターゲット配列として知られる）内に位置してもよく、且つ欠失された断片の３’末端は、標的化される領域を越えてもよい。或いは、欠失された断片の３’末端は、標的化される領域内に位置してもよく、且つ欠失された断片の５’末端は、標的化される領域を越えてもよい。
本明細書では、いくつかの実施形態において、一定のパーセンテージの細胞が編集されて（例えば、β２Ｍ遺伝子が編集される）、特定の遺伝子及び／又はタンパク質を発現しない一定のパーセンテージの細胞をもたらす細胞の集団が提供される。いくつかの実施形態では、遺伝子編集された細胞の集団のうちの少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は８５％）の細胞は、β２Ｍノックアウト細胞である。いくつかの実施形態では、集団のうちの少なくとも５０％の細胞（例えば、Ｔ細胞）が、検出可能なレベルのβ２Ｍタンパク質を発現しない。いくつかの実施形態では、遺伝子編集された細胞の集団のうちの少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の細胞は、β２Ｍノックアウト細胞であってもよい。
細胞においてゲノム欠失をもたらす（例えば、細胞において遺伝子をノックアウトする）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子編集技術を使用する方法が知られている（Ｂａｕｅｒ ＤＥ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．２０１５；９５；ｅ５２１１８）。
ＴＲＡＣ遺伝子編集
いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を含む。この破壊は、ＴＣＲの機能喪失をもたらし、且つ操作されたＴ細胞に同種移植への非アロ反応性及び適合性を与え、移植片対宿主疾患のリスクを最小化する。いくつかの実施形態では、内在性のＴＲＡＣ遺伝子の発現は、移植片対宿主反応を予防するために除去される。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣゲノム領域を標的化するｇＲＮＡは、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を破壊するＴＲＡＣ遺伝子におけるインデルをもたらす。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子発現における破壊は、ＴＲＡＣゲノム領域を標的化するｇＲＮＡによりもたらされる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子発現における破壊は、外来配列（例えば、キメラ抗原受容体をコードする核酸）をＴＲＡＣ遺伝子にノックインすることによって（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター及びドナー鋳型を使用して）もたらされる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子におけるゲノム欠失は、ｇＲＮＡ及び／又は外来配列（例えば、キメラ抗原受容体をコードする核酸）をＴＲＡＣ遺伝子にノックインすることによって（例えば、ＡＡＶベクター及びドナー鋳型を使用して）もたらされる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子発現における破壊は、ＴＲＡＣゲノム領域を標的化するｇＲＮＡ、及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をＴＲＡＣ遺伝子にノックインすることによりもたらされる。
ＴＲＡＣ遺伝子においてゲノム破壊をもたらす本明細書で提供されるとおりに使用され得る改変及び未改変のＴＲＡＣ ｇＲＮＡ配列の非限定的な例は、表４において列挙される（例えば、配列番号１８及び１９）。また、参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年５月１１日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３２３３４号明細書も参照されたい。他のｇＲＮＡ配列は、１４番染色体上に位置するＴＲＡＣ遺伝子配列を使用して設計され得る（ＧＲＣｈ３８：１４番染色体：２２，５４７，５０６～２２，５５２，１５４；．Ｅｎｓｅｍｂｌ；ＥＮＳＧ０００００２７７７３４）。
いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞の集団のうちの少なくとも５０％は、検出可能なレベルのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）表面タンパク質を発現しない。例えば、集団のうちの少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％は、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現しない場合がある。いくつかの実施形態では、集団のうちの５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％、５０％～６０％、６０％～１００％、６０％～９０％、６０％～８０％、６０％～７０％、７０％～１００％、７０％～９０％、７０％～８０％、８０％～１００％、８０％～９０％、又は９０％～１００％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＴＣＲ表面タンパク質を発現しない。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼ）を含有するリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）及びＴＲＡＣ遺伝子（又は任意の他の目的の遺伝子）を標的化するｇＲＮＡが、Ｔ細胞（例えば、一次Ｔ細胞）に送達される。他の実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡは、Ｔ細胞に別々に送達される。リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）は単に、ｇＲＮＡと予め複合体を形成した／複合体を形成したＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）である。
いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣゲノム領域を標的化するｇＲＮＡは、以下の表１における配列から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むＴＲＡＣ遺伝子においてインデルをもたらす。
Figure 0007553440000001
いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、未改変のＴ細胞と比較してＴＲＡＣ遺伝子の欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、未改変のＴ細胞と比較してＴＲＡＣ遺伝子において１５～３０塩基対の欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、未改変のＴ細胞と比較して、ＴＲＡＣ遺伝子において１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０の欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、未改変のＴ細胞と比較してＴＲＡＣ遺伝子において３０塩基対より多い欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、未改変のＴ細胞と比較してＴＲＡＣ遺伝子において２０塩基対の欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、未改変のＴ細胞と比較してＴＲＡＣ遺伝子においてＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ（配列番号３２５）の欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、未改変のＴ細胞と比較してＴＲＡＣ遺伝子においてＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ（配列番号３２５）を含む欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、未改変のＴ細胞と比較してＴＲＡＣ遺伝子において配列番号４０の欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、未改変のＴ細胞と比較してＴＲＡＣ遺伝子において配列番号４０を含む欠失を含む。
β２Ｍ遺伝子編集
いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む。β２Ｍは、ＭＨＣ Ｉ複合体の共通の（不変の）構成要素である。遺伝子編集によってその発現を破壊することは、宿主対治療用異質遺伝子型Ｔ細胞反応を予防することになり、異質遺伝子型Ｔ細胞の持続の増大をもたらす。いくつかの実施形態では、内在性のβ２Ｍ遺伝子の発現は、宿主対移植片反応を予防するために除去される。
β２Ｍ遺伝子においてゲノム破壊をもたらす本明細書で提供されるとおりに使用され得る改変及び未改変のβ２Ｍ ｇＲＮＡ配列の非限定的な例は、表４において列挙される（例えば、配列番号２０及び２１）。また、参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年５月１１日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３２３３４号明細書も参照されたい。他のｇＲＮＡ配列は、１５番染色体上に位置するβ２Ｍ遺伝子配列を使用して設計され得る（ＧＲＣｈ３８の座標：１５番染色体：４４，７１１，４７７－４４，７１８，８７７；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１６６７１０）。
いくつかの実施形態では、β２Ｍゲノム領域を標的化するｇＲＮＡは、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を破壊するβ２Ｍ遺伝子におけるインデルをもたらす。
いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞の集団のうちの少なくとも５０％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現しない。例えば、集団のうちの少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現しない場合がある。いくつかの実施形態では、集団のうちの５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％、５０％～６０％、６０％～１００％、６０％～９０％、６０％～８０％、６０％～７０％、７０％～１００％、７０％～９０％、７０％～８０％、８０％～１００％、８０％～９０％、又は９０％～１００％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのβ２Ｍ表面タンパク質を発現しない。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼ）を含有するリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）及びＢ２Ｍ遺伝子（又は任意の他の目的の遺伝子）を標的化するｇＲＮＡが、Ｔ細胞（例えば、一次Ｔ細胞）に送達される。他の実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡは、Ｔ細胞に別々に送達される。リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）は単に、ｇＲＮＡと予め複合体を形成した／複合体を形成したＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）である。
いくつかの実施形態では、編集されたβ２Ｍ遺伝子は、以下の表２における配列から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。
Figure 0007553440000002
ＣＤ３３遺伝子編集
ＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ３、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン３、ｇｐ６７、又はｐ６７としても知られる）は、骨髄系列の細胞上で発現される膜貫通受容体である。ＣＤ３３は、シアル酸に結合し、したがって、レクチンのＳＩＧＬＥＣファミリーのメンバーである。それは通常、骨髄特異的であると考えられるが、活性化Ｔ細胞を含む一部のリンパ球系細胞上でも見出され得る（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｃａｓｅｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００６）。
いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＣＤ３３遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、内在性ＣＤ３３遺伝子の発現は、本開示のＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍効果を増強し、且つ兄弟殺しを減少させるために除去される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３３ゲノム領域を標的化するｇＲＮＡは、ＣＤ３３ ｍＲＮＡ及び／又はＣＤ３３タンパク質の発現を破壊するＣＤ３３遺伝子中、その周囲、又はその近傍にインデルをもたらす。
ＣＤ３３遺伝子においてゲノム破壊をもたらす本明細書で提供されるとおりに使用され得る改変及び未改変のＣＤ３３ ｇＲＮＡ配列の非限定的な例は、表１０において列挙される、例えば、ＣＤ３３－１ ｇＲＮＡ；
Figure 0007553440000003
 。いくつかの例において、ＣＤ３３－２又はＣＤ３３－１０ガイドＲＮＡを使用して、ＣＤ３３遺伝子におけるゲノム破壊をもたらしてもよい。いくつかの例において、ＣＤ３３遺伝子を破壊するために使用されるガイドＲＮＡは、表１０において列挙されるスペーサー配列を含む。他のｇＲＮＡ配列は、１９番染色体上に位置するＣＤ３３遺伝子配列を使用して設計され得る（ＧＲＣｈ３８の座標：１９番染色体：５１，２２５，０６４－５１，２４３，８６０；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１０５３８３．１４）。
いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＣＤ３３遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞の集団のうちの少なくとも２０％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＣＤ３３表面タンパク質を発現しない。例えば、集団のうちの少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＣＤ３３表面タンパク質を発現しない場合がある。いくつかの実施形態では、集団のうちの２０％～７５％、２０～５０％、３０～５０％、３０％～７５％、５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％、５０％～６０％、６０％～１００％、６０％～９０％、６０％～８０％、６０％～７０％、７０％～１００％、７０％～９０％、７０％～８０％、８０％～１００％、８０％～９０％、又は９０％～１００％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＣＤ３３表面タンパク質を発現しない。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼ）を含有するリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）及びＣＤ３３遺伝子（又は任意の他の目的の遺伝子）を標的化するｇＲＮＡが、Ｔ細胞（例えば、一次Ｔ細胞）に送達される。他の実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡは、Ｔ細胞に別々に送達される。リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）は単に、ｇＲＮＡと予め複合体を形成した／複合体を形成したＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）である。
いくつかの実施形態では、編集されたＣＤ３３遺伝子は、変異された断片を含んでもよく、例えば、編集されたＣＤ３３遺伝子は、表１３～２２において提供される変異された断片（列「遺伝子編集された配列」）、例えば、表１４及び／又は表２２において提供されるもののうちの１つ以上を含む。例えば、ＣＤ３３遺伝子は、野生型対応物に対して欠失を有する変異された断片を含んでもよく、例えば、編集されたＣＤ３３遺伝子は、ＧＧＡＴＣＣＡＡＡ－ＴＴＣＴＧＧＣＴＧＣ（配列番号１７５）（単一のヌクレオチド欠失は、ダッシュ（－）によって表される）として記載されるヌクレオチド配列を含んでもよい。別の例において、編集されたＣＤ３３遺伝子は、野生型対応物に対して挿入を有する変異された断片、例えば、ＧＧＡＴＣＣＡＡＡＴＴＴＴＣＴＧＧＣＴＧＣ（配列番号１７６）（挿入は太字で示される）を含んでもよい。さらに別の例において、ＣＤ３３遺伝子は、野生型対応物に対して欠失及び挿入、例えば、野生型対応物配列の配列番号１７４に対して配列番号１７５に示される欠失及び配列番号１７６に示される挿入の両方を有する変異された断片を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、編集されたＣＤ３３遺伝子は、野生型（又は未編集）遺伝子から欠失される断片に関して記載され得る。
例えば、編集されたＣＤ３３遺伝子は、ＧＧＡＴＣＣＡＡＡＴＴＴＣＴＧＧＣＴＧＣ（配列番号１７４）、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、若しくはそれ以上のヌクレオチドを含み得るその部分を含む断片を欠いてもよい。
例えば、編集されたＣＤ３３遺伝子は、ＡＧＴＴＣＡＴＧＧＴＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣ（配列番号１８６）、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、若しくはそれ以上のヌクレオチドを含み得るその部分を含む断片を欠いてもよい。
例えば、編集されたＣＤ３３遺伝子は、ＡＣＴＣＣＣＣＡＧＴＴＣＡＴＧＧＴＴＡＣ（配列番号１９６）、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、若しくはそれ以上のヌクレオチドを含み得るその部分を含む断片を欠いてもよい。
例えば、編集されたＣＤ３３遺伝子は、ＡＧＣＣＡＴＴＡＴＡＴＣＣＡＧＧＧＡＣＴ（配列番号２０７）、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、若しくはそれ以上のヌクレオチドを含み得るその部分を含む断片を欠いてもよい。
例えば、編集されたＣＤ３３遺伝子は、ＴＣＡＧＴＧＡＣＧＧＴＡＣＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２２０）、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、若しくはそれ以上のヌクレオチドを含み得るその部分を含む断片を欠いてもよい。
例えば、編集されたＣＤ３３遺伝子は、ＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＣＴＧＧＡＧＣＴ（配列番号２４３）、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、若しくはそれ以上のヌクレオチドを含み得るその部分を含む断片を欠いてもよい。
例えば、編集されたＣＤ３３遺伝子は、ＡＧＴＴＣＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＴＧ（配列番号２６３）、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、若しくはそれ以上のヌクレオチドを含み得るその部分を含む断片を欠いてもよい。
例えば、編集されたＣＤ３３遺伝子は、ＡＣＴＡＣＴＣＡＣＴＣＣＴＣＧＧＴＧＣＴ（配列番号２６８）、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、若しくはそれ以上のヌクレオチドを含み得るその部分を含む断片を欠いてもよい。
例えば、編集されたＣＤ３３遺伝子は、ＣＣＣＧＡＴＣＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＴＧＴ（配列番号２８５）、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、若しくはそれ以上のヌクレオチドを含み得るその部分を含む断片を欠いてもよい。
例えば、編集されたＣＤ３３遺伝子は、ＡＡＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号２９９）、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、若しくはそれ以上のヌクレオチドを含み得るその部分を含む断片を欠いてもよい。
いくつかの実施形態では、編集されたＣＤ３３遺伝子は、以下の特徴のうちの１つ以上を有し得る：
（ａ）ＧＧＡＴＣＣＡＡＡＴＴＣＴＧＧＣＴＧＣ（配列番号１７５）、ＧＧＡＴＣＣＡＡＡＴＴＴＴＣＴＧＧＣＴＧＣ（配列番号１７６）、ＧＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＧＣ（配列番号１７７）、ＧＧＡＴＣＣＡＡＴＴＣＴＧＧＣＴＧＣ（配列番号１７８）、ＴＣＣＴＧＧＣＴＧＣ（配列番号１７９）、ＧＧＡＴＣＴＧＧＣＴＧＣ（配列番号１８０）、ＧＧＡＴＣＣ、及び／又はＧＧＡＴＣＣＡＴＴＣＴＧＧＣＴＧＣ（配列番号１８１）のヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）ＧＧＡＴＣＣＡＡＡＴＴＴＣＴＧＧＣＴＧＣ（配列番号１７４）を含む断片を欠く；並びに
（ｃ）断片を欠き、その３’セグメントは、ＧＧＡＴＣＣＡＡＡＴＴＴＣ（配列番号１８２）、ＧＧＡＴＣＣＡＡＡＴＴ（配列番号１８３）、又はＧＧＡＴＣＣＡＡＡＴＴＴ（配列番号１８５）のヌクレオチド配列を含む。
そのような編集されたＣＤ３３遺伝子は、配列番号１６４（例えば、配列番号１４２のｇＲＮＡ）のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを使用して作製され得る。
いくつかの実施形態では、編集されたＣＤ３３遺伝子は、以下の特徴のうちの１つ以上を有し得る：
（ａ）ＡＧＴＴＣＡＴＧＧＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣ（配列番号１８７）、ＡＧＴＴＣＡＴＧＧＴＴＣＣ（配列番号１８８）、ＡＧＴＴＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣ（配列番号１８９）、ＡＧＴＴＣＡＴＧＧＴＴＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣ（配列番号１９０）、ＡＧＴＴＣＣ、ＡＧＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣ（配列番号１９１）、ＡＧＴＴＣＡＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣ（配列番号１９２）、ＡＧＴＴＣＡＴＧＧＴＡＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣ（配列番号１９３）、及び／又はＡＧＴＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣ（配列番号１９４）のヌクレオチド配列を含む；並びに
（ｂ）ＡＧＴＴＣＡＴＧＧＴＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣ（配列番号１８６）を含む断片を欠く。
そのような編集されたＣＤ３３遺伝子は、配列番号１６５（例えば、配列番号１４３のｇＲＮＡ）のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを使用して作製され得る。
いくつかの実施形態では、編集されたＣＤ３３遺伝子は、以下の特徴のうちの１つ以上を有し得る：
（ａ）ＡＣＴＣＣＣＣＡＧＴＴＴＣＡＴＧＧＴＴＡＣ（配列番号１９７）、ＡＣＴＣＣＣＣＡＧＴＣＡＴＧＧＴＴＡＣ（配列番号１９８）、ＡＣＴＣＣＣＣＡＴＧＧＴＴＡＣ（配列番号１９９）、ＡＣＴＣＣＣＣＡＧＴＴＡＣ（配列番号２００）、ＡＣＴＣＡＴＧＧＴＴＡＣ（配列番号２０１）、ＡＣＴＣＣＣＣＡＴＣＡＴＧＧＴＴＡＣ（配列番号２０２）、ＡＣＴＣＣＣＣＡＴＴＣＡＴＧＧＴＴＡＣ（配列番号２０３）、ＡＣＴＣＣＣＣＡＧＴＧＴＣＡＴＧＧＴＴＡＣ（配列番号２０４）、及び／又はＡＣＴＣＣＣＣＡＧＴＣＴＣＡＴＧＧＴＴＡＣ（配列番号２０５）のヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）ＡＣＴＣＣＣＣＡＧＴＴＣＡＴＧＧＴＴＡＣ（配列番号１９６）を含む断片を欠く；並びに
（ｃ）断片を欠き、その３’セグメントは、ＡＣＴＣＣＣＣＡＧＴＴＣＡＴＧＧＴＴ（配列番号２０６）のヌクレオチド配列を含む。
そのような編集されたＣＤ３３遺伝子は、配列番号１６６（例えば、配列番号１４４のｇＲＮＡ）のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを使用して作製され得る。
いくつかの実施形態では、編集されたＣＤ３３遺伝子は、以下の特徴のうちの１つ以上を有し得る：
（ａ）ＡＧＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＧＧＧＡＣＴ（配列番号２０８）、ＡＧＣＣＡＧＧＧＡＣＴ（配列番号２０９）、ＡＧＣＣＡＴＴＡＴＴＣＣＡＧＧＧＡＣＴ（配列番号２１０）、ＡＧＴＣＣＡＧＧＧＡＣＴ（配列番号２１１）、ＡＧＣＣＡＴＴＡＴＡＡＴＣＣＡＧＧＧＡＣＴ（配列番号２１２）、ＡＧＣＣＡＴＴＡＴＣＣＧＧＧＧＡＣＴ（配列番号２１３）、ＡＧＣＣＡＴＴＡＴＡＣＡＧＧＧＡＣＴ（配列番号２１４）、ＡＧＣＣＡＴＴＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＣＴ（配列番号２１６）、及び／又はＡＧＣＣＡＴＴＡＴＡＡＴＣＣＧＧＧＧＡＣＴ（配列番号２１７）のヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）ＡＧＣＣＡＴＴＡＴＡＴＣＣＡＧＧＧＡＣＴ（配列番号２０７）を含む断片を欠く；並びに
（ｃ）断片を欠き、その３’セグメントは、ＡＧＣＣＡＴＴＡＴＡＴＣＣＡ（配列番号２１８）又はＡＧＣＣＡＴＴＡＴＡ（配列番号２１９）のヌクレオチド配列を含む。
そのような編集されたＣＤ３３遺伝子は、配列番号１６７（例えば、配列番号１４５のｇＲＮＡ）のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを使用して作製され得る。
いくつかの実施形態では、編集されたＣＤ３３遺伝子は、以下の特徴のうちの１つ以上を有し得る：
（ａ）ＴＣＡＧＴＧＡＣＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２２１）、ＴＣＡＧＴＧＡＣＧＴＡＣＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２２２）、ＴＣＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２２３）、ＴＣＡＧＴＧＡＣＧＧＡＧＧＧ（配列番号２２４）、ＴＣＡＧＴＧＡＣＧＧＧＡＧＧＧ（配列番号２２６）、ＴＣＡＧＴＧＡＣＧＧＴＴＡＣＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２２７）、ＴＣＡＧＴＧＡＣＧＧＡＣＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２２８）、ＴＣＡＧＴＧＡＣＧＧＧＴＡＣＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２２９）、ＴＣＡＧＴＡＣＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２３０）、ＴＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２３１）、ＴＣＡＧＴＧＡＣＧＧＧ（配列番号２３２）、ＴＣＡＧＴＧＡＣＧＧ（配列番号２３３）、ＴＣＡＧＴＧＡＣＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２３４）、ＴＣＡＧＴＧＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２３５）、ＴＣＡＧＴＧＡＴＡＣＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２３６）、ＴＣＡＧＴＧＴＡＣＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２３７）、及び／又はＴＣＡＴＡＣＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２３８）のヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）ＴＣＡＧＴＧＡＣＧＧＴＡＣＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２２０）を含む断片を欠く；
（ｃ）断片を欠き、その３’セグメントは、ＴＣＡＧＴＧＡＣＧＧＴＡ（配列番号２３９）又はＴＣＡＧＴＧＡＣＧのヌクレオチド配列を含む；並びに
（ｄ）断片を欠き、その５’セグメントは、ＧＴＧＡＣＧＧＴＡＣＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２４２）のヌクレオチド配列を含む。
そのような編集されたＣＤ３３遺伝子は、配列番号１６８（例えば、配列番号１４６のｇＲＮＡ）のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを使用して作製され得る。
いくつかの実施形態では、編集されたＣＤ３３遺伝子は、以下の特徴のうちの１つ以上を有し得る：
（ａ）ＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴ（配列番号２４４）、ＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴ（配列番号２４５）、ＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴ（配列番号２４６）、ＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴ（配列番号２４７）、ＡＧＧＴＧＡＡＧＴＣＧＣＴＧＧＡＧＣＴ（配列番号２４８）、ＡＧＧＴＧＧＡＧＣＴ（配列番号２４９）、ＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＣＴＧＧＡＧＣＴ（配列番号２５０）、ＡＧＧＴＧＡＣＧＣＴＧＧＡＧＣＴ（配列番号２５２）、及び／又はＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＴＣＧＣＴＧＧＡＧＣＴ（配列番号２５３）のヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）ＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＣＴＧＧＡＧＣＴ（配列番号２４３）を含む断片を欠く；
（ｃ）断片を欠き、その３’セグメントは、ＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧ（配列番号２５６）、ＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＣＴＧＧＡＧ（配列番号２５９）、ＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＣＴＧＧ（配列番号２６０）、又はＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴ（配列番号２６１）のヌクレオチド配列を含む；並びに
（ｄ）断片を欠き、その５’セグメントは、ＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＣＴＧＧＡＧＣＴ（配列番号２６２）のヌクレオチド配列を含む。
そのような編集されたＣＤ３３遺伝子は、配列番号１６９（例えば、配列番号１４７のｇＲＮＡ）のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを使用して作製され得る。
いくつかの実施形態では、編集されたＣＤ３３遺伝子は、以下の特徴のうちの１つ以上を有し得る：
（ａ）ＡＧＴＴＣＧＣＴＧＧＴＧＴＧ（配列番号２６４）及び／又はＡＧＴＴＣＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＴＧ（配列番号２６６）のヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）ＡＧＴＴＣＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＴＧ（配列番号２６３）を含む断片を欠く；並びに
（ｃ）断片を欠き、その３’セグメントは、ＡＧＴＴＣＧＣＴＧＧ（配列番号２６７）のヌクレオチド配列を含む。
そのような編集されたＣＤ３３遺伝子は、配列番号１７０（例えば、配列番号１４８のｇＲＮＡ）のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを使用して作製され得る。
いくつかの実施形態では、編集されたＣＤ３３遺伝子は、以下の特徴のうちの１つ以上を有し得る：
（ａ）ＡＣＴＡＣＴＣＡＣＴＴＣＣＴＣＧＧＴＧＣＴ（配列番号２６９）、ＡＣＴＡＣＴＣＧＧＴＧＣＴ（配列番号２７０）、ＡＣＴＡＣＴＣＡＴＣＣＴＣＧＧＴＧＣＴ（配列番号２７１）、ＡＣＴＡＣＴ、ＡＣＴＡＣＴＣＡＣＣＣＴＣＧＧＴＧＣＴ（配列番号２７２）、ＡＣＴＡＣＴＣＣＴＣＧＧＴＧＣＴ（配列番号２７３）、ＡＣＴＡＣＴＣＡＣＣＴＣＧＧＴＧＣＴ（配列番号２７５）、ＡＣＴＡＣＴＣＡＣＴＣＧＧＴＧＣＴ（配列番号２７６）、ＡＣＴＡＣＴＣＴＣＣＴＣＧＧＴＧＣＴ（配列番号２７７）、ＡＣＴＡＣＴＴＣＣＴＣＧＧＴＧＣＴ（配列番号２７８）、ＡＣＴＡＣＴＣＡＣＴＴＣＧＧＴＧＣＴ（配列番号２７９）、及び／又はＡＣＴＡＴＣＣＴＣＧＧＴＧＣＴ（配列番号２８０）のヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）ＡＣＴＡＣＴＣＡＣＴＣＣＴＣＧＧＴＧＣＴ（配列番号２６８）を含む断片を欠く；並びに
（ｃ）断片を欠き、その３’セグメントは、ＡＣＴＡＣＴＣＡＣＴ（配列番号２８２）、ＡＣＴＡＣＴＣＡＣＴＣＣＴＣ（配列番号２８３）、又はＡＣＴＡＣＴＣＡＣＴＣＣＴＣＧＧＴ（配列番号２８４）のヌクレオチド配列を含む。
そのような編集されたＣＤ３３遺伝子は、配列番号１７１（例えば、配列番号１４９のｇＲＮＡ）のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを使用して作製され得る。
いくつかの実施形態では、編集されたＣＤ３３遺伝子は、以下の特徴のうちの１つ以上を有し得る：
（ａ）ＣＣＣＧＡＴＣＴＴＣＣＴＧＧＴＴＧＴ（配列番号２８６）、ＣＣＣＧＡＴＣＣＴＧＧＴＴＧＴ（配列番号２８７）、ＣＣＣＧＡＴＣＴＧＧＴＴＧＴ（配列番号２８８）、ＣＣＣＴＧＧＴＴＧＴ（配列番号２８９）、ＣＣＣＧＡＴＣＴＴＣＴＧＧＴＴＧＴ（配列番号２９０）、ＣＣＣＧＡＴＣＴＴＧＧＴＴＧＴ（配列番号２９１）、ＣＣＣＧＡＴＣＴＣＣＴＧＧＴＴＧＴ（配列番号２９２）、ＣＣＣＧＡＴＣＴＴＣＣＣＴＧＧＴＴＧＴ（配列番号２９３）、及び／又はＣＣＣＧＡＴのヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）ＣＣＣＧＡＴＣＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＴＧＴ（配列番号２８５）を含む断片を欠く；
（ｃ）断片を欠き、その３’セグメントは、ＣＣＣＧＡＴＣＴＴＣＴ（配列番号２９５）のヌクレオチド配列を含む；並びに
（ｄ）断片を欠き、その５’セグメントは、ＴＣＣＴＧＧＴＴＧＴ（配列番号２９８）のヌクレオチド配列を含む。
そのような編集されたＣＤ３３遺伝子は、配列番号１７２（例えば、配列番号１５０のｇＲＮＡ）のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを使用して作製され得る。
いくつかの実施形態では、編集されたＣＤ３３遺伝子は、以下の特徴のうちの１つ以上を有し得る：
（ａ）ＡＡＡＴＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３００）、ＡＡＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３０１）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＡＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３０２）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＡＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３０４）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３０５）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３０６）、ＡＡＡＴＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３０７）、ＡＣＡＴＣＣＴＣＡＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３０８）、ＡＣＡＴＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３０９）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３１０）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＡＴＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３１１）、ＡＡＡＴＣＣＴ、ＡＡＡＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３１２）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３１３）、ＡＡＡＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３１４）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＡＣＴ（配列番号３１５）、ＡＣＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３１６）、及び／又はＡＡＡＴのヌクレオチド配列を含む；
（ｂ）ＡＡＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号２９９）を含む断片を欠く；
（ｃ）断片を欠き、その３’セグメントは、ＡＡＡＴＣＣＴＣＡＴ（配列番号３１７）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＣＴ（配列番号３１８）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＧ（配列番号３２０）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＡＴＣ（配列番号３２２）、又はＡＡＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡ（配列番号３２４）のヌクレオチド配列を含む；並びに
（ｄ）断片を欠き、その５’セグメントは、ＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３２３）のヌクレオチド配列を含む。
そのような編集されたＣＤ３３遺伝子は、配列番号１７３（例えば、配列番号１５１のｇＲＮＡ）のスペーサー配列を含むガイドＲＮＡを使用して作製され得る。
ＰＤ－１遺伝子編集
ＰＤ－１は、活性化Ｔ細胞において下方制御される免疫チェックポイント分子であり、Ｔ細胞の応答を弱めるか又は止める働きをする。遺伝子編集によってＰＤ－１を破壊すれば、より多くの持続的且つ／又は強力な治療的Ｔ細胞応答をもたらし、且つ／又は対象における免疫抑制を低減できるであろう。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＰＤ－１遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、内在性のＰＤ－１遺伝子の発現は、本開示のＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍効果を増強するめに除去される。
ＰＤ－１遺伝子においてゲノム欠失をもたらす本明細書で提供されるとおりに使用され得る改変及び未改変のＰＤ－１ ｇＲＮＡ配列の非限定的な例は、表４において列挙される（例えば、配列番号２２及び２３）。また、参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年５月１１日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３２３３４号明細書も参照されたい。他のｇＲＮＡ配列は、２番染色体上に位置するＰＤ－１遺伝子配列を使用して設計され得る（ＧＲＣｈ３８の座標：２番染色体：２４１，８４９，８８１～２４１，８５８，９０８；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１８８３８９）。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ゲノム領域を標的化するｇＲＮＡは、ＰＤ－１ ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を破壊するＰＤ－１遺伝子におけるインデルをもたらす。
いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＰＤ－１遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞の集団のうちの少なくとも５０％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＰＤ－１表面タンパク質を発現しない。例えば、集団のうちの少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＰＤ－１表面タンパク質を発現しない場合がある。いくつかの実施形態では、集団のうちの５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％、５０％～６０％、６０％～１００％、６０％～９０％、６０％～８０％、６０％～７０％、７０％～１００％、７０％～９０％、７０％～８０％、８０％～１００％、８０％～９０％、又は９０％～１００％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＰＤ－１表面タンパク質を発現しない。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼ）を含有するリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）及びＰＤ－１遺伝子（又は任意の他の目的の遺伝子）を標的化するｇＲＮＡが、Ｔ細胞（例えば、一次Ｔ細胞）に送達される。他の実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡは、Ｔ細胞に別々に送達される。リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）は単に、ｇＲＮＡと予め複合体を形成した／複合体を形成したＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）である。
ＣＤ７０遺伝子編集
表面抗原分類７０（ＣＤ７０）は、腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバーであり、且つその発現は、活性化Ｔ及びＢリンパ球及び成熟樹状細胞に限定される。ＣＤ７０はまた、血液腫瘍及び癌腫上で検出されてきた。ＣＤ７０は、そのリガンドであるＣＤ２７との相互作用を通して、腫瘍細胞及び制御性Ｔ細胞の生存に関係づけられる。遺伝子編集によってＣＤ７０を破壊することによって、細胞増殖を増加させ、且つ細胞枯渇を減少させる。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、内在性のＣＤ７０遺伝子の発現は、本開示のＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍効果を増強するために除去される。いくつかの実施形態では、ＣＤ７０ゲノム領域を標的化するｇＲＮＡは、ＣＤ７０ ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現を破壊するＣＤ７０遺伝子中、又はその周囲にインデルをもたらす。
ＣＤ７０遺伝子においてゲノム破壊をもたらす本明細書で提供されるとおりに使用され得る改変及び未改変のＣＤ７０ ｇＲＮＡ配列の非限定的な例は、表４において列挙される（例えば、配列番号２４～２７）。また、参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年５月１０日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＩＢ２０１９／０００５００号も参照されたい。他のｇＲＮＡ配列は、１９番染色体上に位置するＣＤ７０遺伝子配列を使用して設計され得る（ＧＲＣｈ３８の座標：１９番染色体：６，５８３，１８３－６，６０４，１０３；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１２５７２６）。
いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、破壊されたＣＤ７０遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞の集団のうちの少なくとも５０％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＣＤ７０表面タンパク質を発現しない。例えば、集団のうちの少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＣＤ７０表面タンパク質を発現しない場合がある。いくつかの実施形態では、集団のうちの５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％、５０％～６０％、６０％～１００％、６０％～９０％、６０％～８０％、６０％～７０％、７０％～１００％、７０％～９０％、７０％～８０％、８０％～１００％、８０％～９０％、又は９０％～１００％の操作されたＴ細胞は、検出可能なレベルのＣＤ７０表面タンパク質を発現しない。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼ）を含有するリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）及びＣＤ７０遺伝子（又は任意の他の目的の遺伝子）を標的化するｇＲＮＡが、Ｔ細胞（例えば、一次Ｔ細胞）に送達される。他の実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡは、Ｔ細胞に別々に送達される。リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）は単に、ｇＲＮＡと予め複合体を形成した／複合体を形成したＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）である。
細胞表現型
いくつかの実施形態では、細胞の集団内の１つ以上の遺伝子編集は、細胞の増殖能、細胞の枯渇、細胞の生存能、細胞溶解能（例えば、サイトカイン産生及び／又は放出を増加させる）、又はこれらの任意の組合せにおける変化と関連する表現型をもたらす。
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたＴ細胞は、対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも２０％高い細胞増殖能を示す。例えば、操作されたＴ細胞は、対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％高い細胞増殖能を示し得る。いくつかの実施形態では、本開示の操作されたＴ細胞は、対照Ｔ細胞と比較して、２０％～１００％、２０％～９０％、２０％～８０％、２０％～７０％、２０％～６０％、２０％～５０％、３０％～１００％、３０％～９０％、３０％～８０％、３０％～７０％、３０％～６０％、３０％～５０％、４０％～１００％、４０％～９０％、４０％～８０％、４０％～７０％、４０％～６０％、４０％～５０％、５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％、又は５０％～６０％高い細胞増殖能を示す。
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたＴ細胞は、対照細胞と比較して、細胞生存能において少なくとも２０％の増大を示す。例えば、本開示の操作されたＴ細胞は、対照細胞と比較して、細胞生存能において少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の増大を示し得る。いくつかの実施形態では、本開示の操作されたＴ細胞は、対照細胞と比較して、細胞生存能において２０％～１００％、２０％～９０％、２０％～８０％、２０％～７０％、２０％～６０％、２０％～５０％、３０％～１００％、３０％～９０％、３０％～８０％、３０％～７０％、３０％～６０％、３０％～５０％、４０％～１００％、４０％～９０％、４０％～８０％、４０％～７０％、４０％～６０％、４０％～５０％、５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％、又は５０％～６０％の増大を示す。
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたＴ細胞は、対照細胞と比較して、細胞溶解能において少なくとも２０％の増大（少なくとも２０％多く標的細胞を死滅させる）を示す。例えば、本開示の操作されたＴ細胞は、対照細胞と比較して、細胞溶解能において少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の増大を示し得る。いくつかの実施形態では、本開示の操作されたＴ細胞は、対照細胞と比較して、細胞溶解能において２０％～１００％、２０％～９０％、２０％～８０％、２０％～７０％、２０％～６０％、２０％～５０％、３０％～１００％、３０％～９０％、３０％～８０％、３０％～７０％、３０％～６０％、３０％～５０％、４０％～１００％、４０％～９０％、４０％～８０％、４０％～７０％、４０％～６０％、４０％～５０％、５０％～１００％、５０％～９０％、５０％～８０％、５０％～７０％、又は５０％～６０％の増大を示す。例えば、操作されたＴ細胞によって分泌されるサイトカイン（例えば、ＩＬ－２及び／又はＩＦＮ－ガンマ）のレベルは、対照Ｔ細胞によって分泌されるサイトカインのレベルより少なくとも２倍（例えば、少なくとも３倍、少なくとも４倍、又は少なくとも５倍）高くあり得る。
対照Ｔ細胞は、いくつかの実施形態において、操作されたＴ細胞（例えば、遺伝子編集されたＴ細胞）である。いくつかの実施形態では、対照Ｔ細胞は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、ＴＲＡＣ遺伝子に挿入されたＣＡＲ（例えば、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ）をコードする核酸、及び／又は破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む操作されたＴ細胞である。いくつかの実施形態では、対照Ｔ細胞は、未編集のＴ細胞である。
遺伝子編集方法
遺伝子編集（ゲノム編集を含む）は、ヌクレオチド／核酸が、標的化された細胞のゲノム中などのＤＮＡ配列中に挿入され、欠失され、且つ／又は置換される一種の遺伝子操作である。標的化された遺伝子編集により、標的化された細胞のゲノム中（例えば、標的化された遺伝子又は標的化されたＤＮＡ配列中）の予め選択された部位での挿入、欠失、及び／又は置換が可能になる。内在性の遺伝子の配列が、例えば、ヌクレオチド／核酸の欠失、挿入又は置換によって編集されるとき、影響を受けた配列を含む内在性の遺伝子は、配列改変のためにノックアウト又はノックダウンされ得る。したがって、標的化された編集は、内在性の遺伝子発現を破壊するために使用され得る。「標的化された組込み」は、挿入部位での内在性の配列の欠失の有無にかかわらず、１つ以上の外来性の配列の挿入を含むプロセスを指す。標的化された組込みは、外来性の配列を含有するドナー鋳型が存在する場合、標的化された遺伝子編集から生じ得る。
標的化された編集は、ヌクレアーゼ非依存的な手法、又はヌクレアーゼ依存的な手法のいずれかを介して達成され得る。ヌクレアーゼ非依存的な標的化された編集手法において、相同組換えは、宿主細胞の酵素機構を介して内在性の配列に導入されることになる外来性のポリヌクレオチドに隣接する相同配列によって誘導される。外来性のポリヌクレオチドは、内在性の配列中においてヌクレオチドの欠失、挿入又は置換を導入し得る。
或いは、ヌクレアーゼ依存的な手法は、特異的なレアカッティングヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）による二重鎖切断（ＤＳＢ）の特異的な導入を介して比較的高い頻度を有して標的化された編集を達成できる。このようなヌクレアーゼ依存的な標的化された編集はまた、ＤＮＡ修復機構、例えば、ＤＳＢに応答して生じる非相同末端連結（ＮＨＥＪ）を利用する。ＮＨＥＪによるＤＮＡ修復は、少数の内在性のヌクレオチドのランダムな挿入又は欠失（インデル）を引き起こす場合が多い。ＮＨＥＪに媒介される修復とは反対に、修復はまた、相同組換え修復（ＨＤＲ）によって生じる場合がある。一対の相同性アームに隣接する外来性の遺伝子材料を含有するドナー鋳型が存在するとき、外来性の遺伝子材料は、外来性の遺伝子材料の標的化された組込みをもたらすＨＤＲによってゲノムに導入され得る。
特異的且つ標的化されたＤＳＢを導入できる利用可能なエンドヌクレアーゼとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９；クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連９）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ｐｈｉＣ３１及びＢｘｂ１インテグラーゼを利用するＤＩＣＥ（二重インテグラーゼカセット交換）システムも、標的化された組込みのために使用され得る。
ＺＦＮは、１つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的な様式でＤＮＡに結合するポリペプチドドメインであるジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦＢＤ）に融合されたヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。ジンクフィンガーは、構造が亜鉛イオンの配位を介して安定化されるジンクフィンガー結合ドメイン内の約３０アミノ酸のドメインである。ジンクフィンガーの例としては、Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガー、Ｃ３Ｈジンクフィンガー、及びＣ４ジンクフィンガーが挙げられるが、これらに限定されない。設計されたジンクフィンガードメインは、設計／組成物が主に、合理的な基準、例えば、既存のＺＦＰ設計及び結合データの情報を保管するデータベース中の情報を処理するための置換規則及びコンピューター処理されたアルゴリズムの適用からもたらされる、天然には存在しないドメインである。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号明細書；同第６，４５３，２４２号明細書；及び同第６，５３４，２６１号明細書を参照されたい；国際公開第９８／５３０５８号パンフレット；国際公開第９８／５３０５９号パンフレット；国際公開第９８／５３０６０号パンフレット；国際公開第０２／０１６５３６号パンフレット及び国際公開第０３／０１６４９６号パンフレットも参照されたい。選択されたジンクフィンガードメインは、生成が主に、ファージディスプレイ、相互作用トラップ又はハイブリッド選択などの実験的なプロセスからもたらされる、天然には存在しないドメインである。ＺＦＮは、米国特許第７，８８８，１２１号明細書及び米国特許第７，９７２，８５４号明細書においてより詳細に記載される。ＺＦＮの最も認知されている例は、ＦｏｋＩヌクレアーゼとジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの融合物である。
ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインに融合されたヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。「転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、「ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン」、又は「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」は、ＴＡＬエフェクタータンパク質のＤＮＡへの結合に関与するＴＡＬエフェクタータンパク質のポリペプチドドメインである。ＴＡＬエフェクタータンパク質は、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の植物病原体によって感染中に分泌される。これらのタンパク質は、植物細胞の核に入り、それらのＤＮＡ結合ドメインを介してエフェクター特異的なＤＮＡ配列に結合し、且つそれらの転写活性化ドメインを介してこれらの配列で遺伝子転写を活性化する。ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインの特異性は、２アミノ酸残基からなる可変領域（ＲＶＤ）と呼ばれる選択された反復位置で多型を含むエフェクターにより可変の数の不完全な３４アミノ酸反復に依存する。ＴＡＬＥＮは、米国特許出願公開第２０１１／０１４５９４０号明細書においてより詳細に記載される。当該技術分野におけるＴＡＬＥＮの最も認知された例は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインに対するＦｏｋＩヌクレアーゼの融合ポリペプチドである。
本明細書に提供されるとおりの使用に好適な標的化ヌクレアーゼのさらなる例としては、個別に使用されようと、組み合わせて使用されようと、Ｂｘｂ１、ｐｈｉＣ３１、Ｒ４、ＰｈｉＢＴ１、及びＷβ／ＳＰＢｃ／ＴＰ９０１－１が挙げられるが、これらに限定されない。
標的化ヌクレアーゼの他の非限定的な例としては、天然に存在するヌクレアーゼ及び組換えヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、制限エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼホーミングエンドヌクレアーゼなどが挙げられる。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、遺伝子編集のために使用されるＲＮＡ誘導型ＤＮＡ標的化プラットフォームとして転用されてきた原核生物において天然に存在する防御機構である。それは、ＤＮＡの切断を標的化するＤＮＡヌクレアーゼＣａｓ９、並びに２つの非コードＲＮＡであるｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）に依拠する。
ｃｒＲＮＡは、通常標的ＤＮＡ中の２０ヌクレオチド（ｎｔ）配列とワトソン－クリック塩基対を介してＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体の配列認識及び特異性を促進する。ｃｒＲＮＡ中の５’ ２０ｎｔの配列の変化は、特定の座位へのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体の標的化を可能にする。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体は単に、標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる特定の短いＤＮＡモチーフ（配列ＮＧＧを有する）に続いている場合、ｃｒＲＮＡ、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の最初の２０ｎｔに一致する配列を含有するＤＮＡ配列に結合する。
ＴｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの３’末端とハイブリダイズしてＲＮＡ二重鎖構造を形成し、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼによって結合されて触媒活性のあるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体を形成し、続いてこれにより標的ＤＮＡを切断できる。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が標的部位でＤＮＡに結合すると、Ｃａｓ９酵素内の２つの独立したヌクレアーゼドメインがそれぞれＰＡＭ部位の上流のＤＮＡ鎖の一方を切断し、ＤＮＡの両鎖が塩基対（平滑末端）で終結する二本鎖切断（ＤＳＢ）を残す。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が特定の標的部位でＤＮＡに結合し、部位特異的なＤＳＢが形成された後、次の鍵となるステップはＤＳＢの修復である。細胞は、ＤＳＢを修復するために２つの主要なＤＮＡ修復経路を使用する：非相同末端連結（ＮＨＥＪ）及び相同組換え修復（ＨＤＲ）。
ＮＨＥＪは、非分裂細胞を含む大多数の細胞型において高度に活性であるように見える堅固な修復機構である。ＮＨＥＪは誤りがちであり、多くの場合、ＤＳＢの部位にて１～数百のヌクレオチド間で除去又は付加をもたらす場合があるが、そのような改変は通常＜２０ｎｔである。得られた挿入及び欠失（インデル）は、遺伝子のコード又は非コード領域を破壊する場合がある。代わりに、ＨＤＲは、内在的又は外因的に提供される長い一続きの相同性ドナーＤＮＡを使用して、高い忠実度を有してＤＳＢを修復する。ＨＤＲは、分裂細胞においてのみ活性であり、大部分の細胞型において相対的に低い頻度で生じる。本開示の多くの実施形態では、ＮＨＥＪが、修復オペラントとして利用される。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）エンドヌクレアーゼは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するが、他のＣａｓ９ホモログが使用されてもよい。本明細書に提供されるとおり、野生型Ｃａｓ９が使用されてもよいし、Ｃａｓ９の改変されたバージョンが使用されてもよい（例えば、Ｃａｓ９の発展させたバージョン、又はＣａｓ９オルソログ若しくは変異体）ことが理解されるはずである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｃｐｆ１（クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）などの別のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと置き換えられてもよい。
ガイドＲＮＡ
本開示は、会合したポリペプチド（例えば、部位特異的ポリペプチド）の標的核酸内の特定の標的配列に対する活性を誘導できるゲノム標的化核酸を提供する。ゲノム標的化核酸は、ＲＮＡであり得る。ゲノム標的化ＲＮＡは、本明細書で「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」と呼ばれる。ガイドＲＮＡは、目的の標的核酸配列、及びＣＲＩＳＰＲ反復配列にハイブリダイズする少なくとも１つのスペーサー配列を含む。ＩＩ型システムにおいて、ｇＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡを含む。ＩＩ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）において、ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、互いにハイブリダイズして、二重鎖を形成する。Ｖ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）において、ｃｒＲＮＡが、二重鎖を形成する。両方のシステムにおいて、二重鎖は、部位特異的ポリペプチドに結合し、その結果、ガイドＲＮＡ及び部位特異的ポリペプチドは、複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、その部位特異的ポリペプチドとの会合により、複合体に標的特異性をもたらす。したがって、ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を誘導する。
当業者によって理解されるとおり、各ガイドＲＮＡは、そのゲノム標的配列に相補的なスペーサー配列を含むように設計される。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７，８１６－８２１（２０１２）及びＤｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７１，６０２－６０７（２０１１）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、二重分子ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、単一分子ガイドＲＮＡである。
二重分子ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの二本鎖を含む。第１の鎖は、５’から３’方向において、任意選択のスペーサー延長配列、スペーサー配列及び最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列を含む。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列に相補的）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含む。
ＩＩ型システムにおける単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’方向において、任意選択のスペーサー延長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列、単一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含む。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長は、ガイドＲＮＡに対する追加の機能性（例えば、安定性）に寄与する要素を含み得る。単一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を連結して、ヘアピン構造を形成する。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ延長は、１つ以上のヘアピンを含む。
Ｖ型システムにおける単一分子ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」と呼ばれる）は、５’から３’方向において、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びスペーサー配列を含む。
ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端で２０ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端で２０ヌクレオチド未満のスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端で２０ヌクレオチドより長いスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端で１７～３０ヌクレオチドを有する可変長スペーサー配列を含み得る（表３を参照のこと）。
ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端にウラシルを含まない場合がある。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１つ以上のウラシルを含み得る。例えば、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１個のウラシル（Ｕ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に２個のウラシル（ＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に３個のウラシル（ＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に４個のウラシル（ＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に５個のウラシル（ＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に６個のウラシル（ＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に７個のウラシル（ＵＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に８個のウラシル（ＵＵＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。
ｓｇＲＮＡは、改変されない場合もあるし、改変される場合もある。例えば、改変されたｓｇＲＮＡは、１つ以上の２’－Ｏ－メチルホスホロチオエートヌクレオチドを含み得る。
Figure 0007553440000004
実例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ／Ｃｐｆ１システムにおいて使用されるガイドＲＮＡ、又は他のより小さいＲＮＡは、下に説明され且つ当該技術分野において記載されるとおり、化学的手段によって容易に合成され得る。化学合成法が拡大し続けている一方で、ポリヌクレオチドの長さが百数十ヌクレオチドを超えて大幅に長くなると、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、ＰＡＧＥなどのゲルの使用を回避する）などの方法によるそのようなＲＮＡの精製は、より難しくなる傾向がある。比較的長いＲＮＡを生成するために使用される１つの手法は、ともに連結される２つ以上の分子を生成することである。Ｃａｓ９又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするものなどのはるかに長いＲＮＡは、より容易に酵素的に生成される。当該技術分野において記載されるとおり、様々な種類のＲＮＡ修飾、例えば、安定性を増強し、自然免疫応答の可能性若しくは程度を低減し、且つ／又は他の特質を増強する修飾が、ＲＮＡの化学合成及び／若しくは酵素的生成の間又は後に導入され得る。
スペーサー配列
ｇＲＮＡは、スペーサー配列を含む。スペーサー配列は、目的の標的核酸の標的配列（例えば、ゲノム標的配列などのＤＮＡ標的配列）を定義する配列（例えば、２０個のヌクレオチド配列）である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、１５～３０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、１５、１６、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、２０個のヌクレオチドである。
「標的配列」は、ＰＡＭ配列に隣接し、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）によって改変される配列である。「標的核酸」は、二重鎖分子である：一方の鎖は、標的配列を含み、「ＰＡＭ鎖」と呼ばれ、また他方の相補鎖は、「非ＰＡＭ鎖」と呼ばれる。当業者は、ｇＲＮＡスペーサー配列が、目的の標的核酸の非ＰＡＭ鎖において位置する標的配列の逆相補鎖にハイブリダイズすることを認識している。したがって、ｇＲＮＡスペーサー配列は、標的配列のＲＮＡ等価物である。例えば、標的配列が、５’－ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ－３’（配列番号３２５）である場合、ｇＲＮＡスペーサー配列は、５’－ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＵＧＣＵＧＵＧＧＣＣ－３’（配列番号１９）である。ｇＲＮＡのスペーサーは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対形成）を介して配列特異的な様式で目的の標的核酸と相互作用する。したがって、スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の標的配列に依存して変化する。
本明細書のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて、スペーサー配列は、システムにおいて使用されるＣａｓ９酵素のＰＡＭの５’に位置する標的核酸の領域にハイブリダイズするように設計される。スペーサーは、標的配列と完全に一致してもよいし、ミスマッチを有してもよい。各Ｃａｓ９酵素は、それが標的ＤＮＡ中で認識する特定のＰＡＭ配列を有する。例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）は、標的核酸において配列５’－ＮＲＧ－３’（ここで、Ｒは、Ａ又はＧのいずれかを含み、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、スペーサー配列によって標的化される標的核酸配列の３’のすぐ近くにある）を含むＰＡＭを認識する。
いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、２０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、２０個未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、２０個より多いヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、少なくとも：５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、最大で：５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、ＰＡＭの最初のヌクレオチドの５’のすぐ近くに２０個の塩基を含む。例えば、
Figure 0007553440000005
 を含む配列において、標的核酸は、Ｎ（複数）（ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、下線のＮＲＧ配列は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＰＡＭである）に対応する配列を含む。
本明細書に提供されるとおりに使用され得るｇＲＮＡの非限定的な例は、表４、表１０及び２０１８年５月１１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３２３３４号において提供される。
Figure 0007553440000006
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞
キメラ抗原受容体は、腫瘍細胞によって発現される抗原を認識し、それに結合するように操作された人工の免疫細胞受容体を指す。一般に、ＣＡＲは、Ｔ細胞のために設計され、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体のシグナル伝達ドメイン及び抗原認識ドメイン（例えば、抗体の一本鎖断片（ｓｃＦｖ）又は他の抗体断片）のキメラである（Ｅｎｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１５；２６（８）：４９８－５０５）。ＣＡＲを発現するＴ細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞と呼ばれる。ＣＡＲは、ＭＨＣに制限されない様式で選択された標的に対するＴ細胞の特異性及び反応性を再指示する能力を有する。ＭＨＣに制限されない抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に抗原プロセシングに非依存的な抗原を認識する能力を与え、それにより腫瘍エスケープの主要な機構をバイパスする。さらに、Ｔ細胞において発現されるとき、ＣＡＲは、内在性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及びベータ鎖と有利に二量体化しない。
４つの世代のＣＡＲが存在し、その各々は異なる構成要素を含有する。第一世代のＣＡＲは、抗体に由来するｓｃＦｖをヒンジ及び膜貫通ドメインを介してＴ細胞受容体のＣＤ３ゼータ（ζ又はｚ）細胞内シグナル伝達ドメインに連結する。第二世代のＣＡＲは、追加のドメイン、例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（４１ＢＢ）、又はＩＣＯＳを組み込んで、共刺激シグナルを供給する。第三世代のＣＡＲは、ＴＣＲ ＣＤ３ζ鎖に融合した２つの共刺激ドメインを含有する。第三世代の共刺激ドメインは、例えば、ＣＤ３ζ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、又はＯＸ４０の組合せを含み得る。ＣＡＲは、いくつかの実施形態において、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に一般に由来する外部ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）、ヒンジ、膜貫通ドメイン、並びにＣＤ３Ｚ及び／若しくは共刺激分子に由来する１つ（第一世代）、２つ（第二世代）、又は３つ（第三世代）のシグナル伝達ドメインを有する内部ドメインを含有する（Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１５；１２５（２６）：４０１７－４０２３；Ｋａｋａｒｌａ ａｎｄ Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．２０１４；２０（２）：１５１－１５５）。
ＣＡＲは通常、それらの機能特性が異なる。Ｔ細胞受容体のＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、結合される場合、Ｔ細胞の増殖を活性化し、且つ誘導することになるが、アネルギーを引き起こし得る（身体の防御機構による反応の欠如、末梢リンパ球寛容の直接的な誘導をもたらす）。リンパ球は、それらが特定の抗原に応答できない場合、アネルギー性であるとみなされる。第二世代のＣＡＲにおける共刺激ドメインの付加は、改変Ｔ細胞の複製能及び持続を向上させた。同様の抗腫瘍効果は、ＣＤ２８又は４－１ＢＢ ＣＡＲによりインビトロで観察されるが、前臨床インビボ研究は、４－１ＢＢ ＣＡＲが、優れた増殖及び／又は持続をもたらし得ることを示唆する。臨床試験は、これらの第二世代のＣＡＲの両方が、インビボで実質的なＴ細胞増殖を誘導できることを示唆するが、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含有するＣＡＲは、より長く持続するように見える。第三世代のＣＡＲは、効力を増強する複数のシグナル伝達ドメイン（共刺激）を組み合わせる。
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、第一世代のＣＡＲである。他の実施形態では、キメラ抗原受容体は、第二世代のＣＡＲである。さらに他の実施形態では、キメラ抗原受容体は、第三世代のＣＡＲである。
ＣＡＲは、いくつかの実施形態において、抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖなどの抗体）、膜貫通ドメイン、及び細胞質（内）ドメインを含む細胞外（外部）ドメインを含む。
外部ドメイン
外部ドメインは、細胞外の体液に曝されるＣＡＲの領域であり、且ついくつかの実施形態において、抗原結合ドメイン、並びに任意選択によりシグナルペプチド、スペーサードメイン、及び／又はヒンジドメインを含む。いくつかの場合において、抗原結合ドメインは、抗体の断片である。下の議論を参照されたい。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、短いリンカーペプチドと連結した免疫グロブリンのＶＬ及びＶＨを含む一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。リンカーは、いくつかの実施形態において、可動性のための一続きのグリシン及びセリン並びに可溶性を加えるための一続きのグルタミン酸及びリジンとともに親水性残基を含む。一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、実際には抗体の断片ではないが、代わりに１０～約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドと連結した免疫グロブリンの重（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは通常、可動性のためにグリシン、及び溶解性のためにセリン又はスレオニンを豊富に含み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に連結するか又はその逆のいずれかであり得る。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖを作製するために使用され得るＶＨ及びＶＬタンパク質配列の非限定的な例としては、配列番号６５、７７又は８９（ＶＨ）及び配列番号６６、７８又は９０（ＶＬ）のアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、本開示のｓｃＦｖは、ヒト化されている。他の実施形態では、ｓｃＦｖは、完全ヒトである。さらに他の実施形態では、ｓｃＦｖは、（例えば、マウス及びヒト配列の）キメラである。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖである（ＣＤ３３に特異的に結合する）。本明細書に提供されるとおりに使用され得る抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖタンパク質の非限定的な例は、配列番号５４、６８、７５、８２いずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。他のｓｃＦｖタンパク質が使用されてもよい。
シグナルペプチドは、ＣＡＲ結合の抗原特異性を増強し得る。シグナルペプチドは、ＣＤ８などであるがこれに限定されない抗体、及びＧＳＴ又はＦＬＡＧなどであるがこれらに限定されないエピトープタグに由来し得る。シグナルペプチドの例としては、ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号１６２）及びＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号１２１）が挙げられる。他のシグナルペプチドが使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、スペーサードメイン又はヒンジドメインは、ＣＡＲの細胞外ドメイン（抗原結合ドメインを含む）と膜貫通ドメインの間、又はＣＡＲの細胞質内ドメインと膜貫通ドメインの間に位置する。スペーサードメインは、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖中の細胞外ドメイン及び／又は細胞質内ドメインに連結するのに機能する任意のオリゴペプチド又はポリペプチドである。ヒンジドメインは、ＣＡＲ、若しくはそのドメインに可動性をもたらすか、又はＣＡＲ、若しくはそのドメインの立体障害を妨げるのに機能する任意のオリゴペプチド又はポリペプチドである。いくつかの実施形態では、スペーサードメイン又はヒンジドメインは、最大で３００個のアミノ酸（例えば、１０～１００個のアミノ酸、又は５～２０個のアミノ酸）を含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のドメインが、ＣＡＲの他の領域に含まれてもよい。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８ヒンジドメインである。他のヒンジドメインが使用されてもよい。
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜をまたがる疎水性アルファヘリックスである。膜貫通ドメインは、ＣＡＲの安定性をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるとおりのＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインである。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインである。さらに他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８及びＣＤ２８膜貫通ドメインのキメラである。他の膜貫通ドメインが、使用されてもよい。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ａ膜貫通ドメインである：
Figure 0007553440000007
 他の膜貫通ドメインが使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、アミノ酸配列：ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹ（配列番号１６３）を含むＣＤ８ａ膜貫通ドメインである。
内部ドメイン
内部ドメインは、受容体の機能的な末端である。抗原認識の後、受容体クラスター及びシグナルは、細胞に伝達される。最も一般的に使用される内部ドメインの構成要素は、ＣＤ３－ゼータであり、これは、３つの免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。これは、抗原が結合された後に活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。多くの場合、ＣＤ３－ゼータは、十分に能力のある活性化シグナルをもたらさない場合があり、したがって、共刺激シグナル伝達が使用される。例えば、ＣＤ２８及び／又は４－１ＢＢが、ＣＤ３－ゼータ（ＣＤ３ζ）とともに使用されて、増殖／生存シグナルを伝達し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるとおりのＣＡＲの共刺激分子は、ＣＤ２８共刺激分子である。他の実施形態では、共刺激分子は、４－１ＢＢ共刺激分子である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ及びＣＤ２８を含む。他の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３－ゼータ及び４－１ＢＢを含む。さらに他の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、及び４－１ＢＢを含む。表５は、本明細書で提供されるとおりに使用され得るシグナル伝達分子の例を提供する。
Figure 0007553440000008
例示的なＣＡＲ配列は、下の表２６において提供される。
Figure 0007553440000009
Figure 0007553440000010
Figure 0007553440000011
Figure 0007553440000012
Figure 0007553440000013
Figure 0007553440000014
Figure 0007553440000015
Figure 0007553440000016
Figure 0007553440000017
Figure 0007553440000018
Figure 0007553440000019
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抗体
抗体（複数の形態において互換的に使用される）は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合できる免疫グロブリン分子である。本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、インタクトな（すなわち、全長）モノクローナル抗体だけでなく、抗原結合断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体（例えば、ラクダ又はラマＶHＨ抗体）、多重特異性抗体（例えば、二重特性抗体）並びに抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント、及び共有結合的に修飾された抗体を含む、要求される特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された配置も包含する。
典型的な抗体分子は、通常、抗原結合に関与する重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。抗原結合に関与するこれらの領域／残基は、当該技術分野において知られる方法によって参照抗体（例えば、本明細書に記載されるＣＤ３３抗体）のＶＨ／ＶＬ配列のアミノ酸配列から同定され得る。ＶＨ及びＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）として知られる、より保存されている領域が挿入された、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）として知られる超可変領域にさらに細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは通常、次の順でアミノ末端からカルボキシ末端に整列した、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は、当該技術分野において知られる方法論を使用して、例えば、全てが当該技術分野においてよく知られるＫａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義、及び／又はｃｏｎｔａｃｔ定義によって、正確に同定され得る。本明細書で使用する場合、ＣＤＲは、当該技術分野において知られる任意の方法によって定義されるＣＤＲを指し得る。同じＣＤＲを有する２つの抗体は、２つの抗体が、同じ方法によって決定された当該ＣＤＲの同じアミノ酸配列を有することを意味する。例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７，Ａｌ－ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８；及びＡｌｍａｇｒｏ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１７：１３２－１４３（２００４）を参照されたい。ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ及びｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓも参照されたい。
いくつかの実施形態では、抗体は、抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖなどのｓｃＦｖである。抗体は、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＭ（又はそのサブクラス）などの任意のクラスの抗体を含み、且つ抗体は、いずれかの特定のクラスのものである必要はない。重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、各種クラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンには５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかはさらに、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分けられ得る。免疫グロブリンの各種クラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと呼ばれる。免疫グロブリンの各種クラスのサブユニット構造及び三次元配置は、よく知られている。
本明細書に提供されるとおりに使用されることになる抗体は、マウス、ラット、ヒト、又は任意の他の起源（キメラ抗体又はヒト化抗体を含む）であり得る。いくつかの例において、抗体は、免疫学的に不活性である、例えば、補体に媒介される溶解を誘発しないか、又は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激しない定常領域などの改変された定常領域を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又はその抗原結合断片である非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を指す。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、又はウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基により置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見出されないが、抗体性能をさらに洗練させ、且つ最適化するために含まれる残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は、全て又は実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全て又は実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを実質的に全て含むことになる。最適なヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域又はドメイン（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域又はドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部も含むことになる。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体からの１つ以上のＣＤＲに「由来する」１つ以上のＣＤＲとも呼ばれる、元の抗体に関して改変された１つ以上のＣＤＲ（１、２、３、４、５、６つ）を有する。ヒト化抗体はまた、親和性成熟を伴う場合がある。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ヒト抗体由来の重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を含み得るキメラ抗体である。キメラ抗体は、第１の種に由来する可変領域又は可変領域の部分及び第２の種に由来する定常領域を有する抗体を指す。通常、これらのキメラ抗体において、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、及びラットなどの非ヒト哺乳動物）の１つの種に由来する抗体の可変領域を模倣するが、定常部分は、ヒトなどの別の哺乳動物に由来する抗体における配列と相同である。いくつかの実施形態では、アミノ酸改変は、可変領域及び／又は定常領域においてなされ得る。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ヒトＣＤ３３などの標的抗原に特異的に結合する。標的又はエピトープに「特異的に結合する」（本明細書で互換的に使用される）抗体は、当該技術分野でよく理解される用語であり、そのような特異的な結合を決定する方法もまた、当該技術分野でよく知られている。分子は、それが、代替の標的よりも、特定の標的抗原とより頻繁に、より迅速に、より長い持続時間で、且つ／又はより高い親和性で反応又は会合する場合、「特異的な結合」を示すと言われる。抗体は、それが、他の基質に結合するよりも、より高い親和性、結合活性で、より迅速に、且つ／又はより長い持続時間で結合する場合、標的抗原に「特異的に結合する」。例えば、ＣＤ３３エピトープに特異的に（又は優先的に）結合する抗体は、それが、他のＣＤ３３エピトープ又は非ＣＤ３３エピトープに結合するよりも、より高い親和性、結合活性で、より迅速に、且つ／又はより長い持続時間でこのＣＤ３３エピトープに結合する抗体である。それはまた、例えば、第１の標的抗原に特異的に結合する抗体が、第２の標的抗原に特異的に又は優先的に結合する場合もあるし、結合しない場合もあるというこの定義を読むことによっても理解される。そのため、「特異的な結合」又は「優先的な結合」は、必ずしも排他的結合を（含むことはできるが）必要とするものではない。一般に、必ずしもそうではないが、結合への参照は、優先的な結合を意味する。
いくつかの実施形態では、抗体とＣＤ３３の間の平衡解離定数（ＫD）は、１００ｐＭ～１μＭである。いくつかの実施形態では、抗体とＣＤ３３の間のＫDは、１ｎＭ～１００ｎＭである。
本明細書に開示されるとおりの例示的な抗ＣＤ３３抗体のいずれかの機能的バリアントもまた本開示の範囲内である。機能的バリアントは、参照抗体を基準としてＶＨ及び／若しくはＶＬ、又はＨＣ ＣＤＲの１つ以上及び／若しくはＶＬ ＣＤＲの１つ以上において１つ以上のアミノ酸残基の変異を含有し得るが、参照抗体と実質的に同様の結合活性及び生物学的活性（例えば、実質的に同様の結合親和性、結合特異性、阻害活性、抗腫瘍活性、又はこれらの組合せ）を保持している。
いくつかの例において、本明細書で開示される抗ＣＤ３３抗体は、抗体Ａ（ＶＨ：配列番号６５；ＶＬ：配列番号６６）などの参照抗体のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３と比較して、１０個以下のアミノ酸変異（例えば、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を合わせて含有するＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む。「合わせて」は、３つのＶＨ ＣＤＲの全てにおけるアミノ酸変異の総数が、既定の範囲内であることを意味する。或いは又は加えて、抗ＣＤ３３抗体は、参照抗体のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３と比較して、１０個以下のアミノ酸変異（例えば、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個以下のアミノ酸変異）を合わせて含有するＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含み得る。
いくつかの例において、本明細書で開示される抗ＣＤ３３抗体は、少なくとも１つが、抗体Ａ（ＶＨ：配列番号６５；ＶＬ：配列番号６６）などの参照抗体の対応物のＶＨ ＣＤＲと同程度に、５個以下のアミノ酸変異（例えば、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を含有するＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含み得る。特定の例において、抗体は、抗体Ａ（ＶＨ：配列番号６５；ＶＬ：配列番号６６）などの参照抗体のＶＨ ＣＤＲ３と同程度に、５個以下のアミノ酸変異（例えば、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を含有するＶＨ ＣＤＲ３を含む。或いは又は加えて、抗ＣＤ３３抗体は、少なくとも１つが、参照抗体の対応物のＶＬ ＣＤＲと同程度に、５個以下のアミノ酸変異（例えば、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を含有するＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含み得る。特定の例において、抗体は、参照抗体のＶＬ ＣＤＲ３と同程度に、５個以下のアミノ酸変異（例えば、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を含有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。
いくつかの例において、本明細書で開示される抗ＣＤ３３抗体は、抗体Ｂ（ＶＨ：配列番号７７；ＶＬ：配列番号７８）などの参照抗体のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３と比較して、１０個以下のアミノ酸変異（例えば、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を合わせて含有するＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む。いくつかの例において、本明細書で開示される抗ＣＤ３３抗体は、少なくとも１つが、抗体Ｂ（ＶＨ：配列番号７７；ＶＬ：配列番号７８）などの参照抗体の対応物ＶＨ ＣＤＲと同程度に、５個以下のアミノ酸変異（例えば、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を含有するＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含み得る。特定の例において、抗体は、抗体Ｂ（ＶＨ：配列番号７７；ＶＬ：配列番号７８）などの参照抗体のＶＨ ＣＤＲ３と同程度に、５個以下のアミノ酸変異（例えば、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を含有するＶＨ ＣＤＲ３を含む。
いくつかの例において、本明細書で開示される抗ＣＤ３３抗体は、抗体Ｃ（ＶＨ：配列番号８９；ＶＬ：配列番号９０）などの参照抗体のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３と比較して、１０個以下のアミノ酸変異（例えば、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個以下のアミノ酸変異）を合わせて含有するＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む。いくつかの例において、本明細書で開示される抗ＣＤ３３抗体は、少なくとも１つが、抗体Ｃ（ＶＨ：配列番号８９；ＶＬ：配列番号９０）などの参照抗体の対応物ＶＨ ＣＤＲと同程度に、５個以下のアミノ酸変異（例えば、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を含有するＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含み得る。特定の例において、抗体は、抗体Ｃ（ＶＨ：配列番号８９；ＶＬ：配列番号９０）などの参照抗体のＶＨ ＣＤＲ３と同程度に、５個以下のアミノ酸変異（例えば、４、３、２、又は１個以下のアミノ酸変異）を含有するＶＨ ＣＤＲ３を含む。
場合によっては、アミノ酸残基の変異は、保存的なアミノ酸残基置換であり得る。本明細書で使用する場合、「保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸置換がなされるタンパク質の相対的な電荷又はサイズの特徴を変えないアミノ酸置換を指す。バリアントは、そのような方法をまとめた参考文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９，又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見出されるような、当業者に知られるポリペプチド配列を改変するための方法に従って作製され得る。アミノ酸の保存的置換は、以下の群内のアミノ酸の中でなされる置換を含む：（ａ）Ａ→Ｇ、Ｓ；（ｂ）Ｒ→Ｋ、Ｈ；（ｃ）Ｎ→Ｑ、Ｈ；（ｄ）Ｄ→Ｅ、Ｎ；（ｅ）Ｃ→Ｓ、Ａ；（ｆ）Ｑ→Ｎ；（ｇ）Ｅ→Ｄ、Ｑ；（ｈ）Ｇ→Ａ；（ｉ）Ｈ→Ｎ、Ｑ；（ｊ）Ｉ→Ｌ、Ｖ；（ｋ）Ｌ→Ｉ、Ｖ；（ｌ）Ｋ→Ｒ、Ｈ；（ｍ）Ｍ→Ｌ、Ｉ、Ｙ；（ｎ）Ｆ→Ｙ、Ｍ、Ｌ；（ｏ）Ｐ→Ａ；（ｐ）Ｓ→Ｔ；（ｑ）Ｔ→Ｓ；（ｒ）Ｗ→Ｙ、Ｆ；（ｓ）Ｙ→Ｗ、Ｆ；及び（ｔ）Ｖ→Ｉ、Ｌ。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される抗体は、抗体Ａ（ＶＨ：配列番号６５；ＶＬ：配列番号６６）などの参照抗体のＶＨ ＣＤＲと合わせて少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）同一のＶＨ ＣＤＲを含み得る。或いは又は加えて、抗体は、参照抗体のＶＬ ＣＤＲと合わせて少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）同一のＶＬ ＣＤＲを含み得る。いくつかの実施形態では、抗体は、抗体Ａ（ＶＨ：配列番号６５；ＶＬ：配列番号６６）などの参照抗体のＶＨと少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）同一のＶＨ及び／又は参照抗体のＶＬ可変領域と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、又は９８％）同一のＶＬを含み得る。
ドナー鋳型
ＣＡＲをコードする核酸は、ドナー鋳型と本明細書で呼ばれる（ドナーポリヌクレオチドとも呼ばれる）ものを含むＴ細胞にベクターを使用して（例えばＡＡＶベクター）送達され得る。ドナー鋳型は、目的のゲノム位置で効率的なＨＤＲを可能にする２つの相同な領域に隣接したＣＡＲをコードする核酸などの非相同配列を含有し得る。或いは、ドナー鋳型は、ＤＮＡ中の標的化された位置と相同な領域を有しない場合があり、標的部位での切断後のＮＨＥＪ依存的末端連結によって組み込まれ得る。
ドナー鋳型は、一本鎖及び／又は二重鎖のＤＮＡ又はＲＮＡであってもよく、直鎖状又は環状形態で細胞に導入され得る。直鎖状形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に知られる方法によって（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護され得る。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基が、直鎖状分子の３’末端に付加され、且つ／又は自己相補的オリゴヌクレオチドが、一方又は両方の末端に連結される。例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４９５９－４９６３；Ｎｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８８６－８８９を参照されたい。外来性のポリヌクレオチドを分解から保護するための追加の方法としては、末端アミノ基の付加、並びに、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミダート、及びＯ－メチルリボース又はデオキシリボース残基などの修飾されたヌクレオチド間結合の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
ドナー鋳型は、例えば、複製開始点、プロモーター及び抗生物質耐性をコードする遺伝子などの追加の配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入され得る。さらに、ドナー鋳型は、裸の核酸として、リポソーム又はポロクサマーなどの薬剤と複合体を形成した核酸として導入され得るか、又はウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス及びインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））によって送達され得る。
ドナー鋳型は、いくつかの実施形態において、その発現が、組込み部位の内在性プロモーター、すなわち、ドナーが挿入される内在性遺伝子の発現を駆動するプロモーターによって駆動されるように挿入される。しかしながら、いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、外来性プロモーター及び／又はエンハンサー、例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、又は組織特異的プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、内在性プロモーターは、配列番号１２９の配列を含むＥＦ１αプロモーターである。他のプロモーターが使用されてもよい。
さらに、外来性配列はまた、転写又は翻訳制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列及び／又はポリアデニル化シグナルを含み得る。
送達方法及びコンストラクト
ヌクレアーゼ及び／又はドナー鋳型は、プラスミドベクター、ＤＮＡ小環、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクター及びアデノ関連ウイルスベクター、及びその組合せを含むが、これらに限定されないベクター系を使用して送達され得る。
従来のウイルス及び非ウイルス系遺伝子導入方法を使用して、細胞（例えば、Ｔ細胞）においてヌクレアーゼをコードする核酸及びドナー鋳型を導入することができる。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、ＤＮＡ小環、裸の核酸、及びリポソーム又はポロクサマーなどの送達媒体と複合体を形成した核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、細胞に送達された後にエピソーム又は組込みゲノムのいずれかを有するＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが挙げられる。
核酸の非ウイルス送達の方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、キャップ付きＲＮＡ、人工ビリオン、及び薬剤で増強されたＤＮＡの取込みが挙げられる。例えば、ソニトロン ２０００システム（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を使用するソノポレーションもまた、核酸の送達のために使用され得る。
アデノ随伴ウイルス送達
ＣＡＲコンストラクトをコードするドナー核酸は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して細胞に送達され得る。ＡＡＶは、宿主ゲノムに部位特異的に組込み、したがって、ＣＡＲなどの導入遺伝子を送達できる小型のウイルスである。逆位末端配列（ＩＴＲ）は、ＡＡＶゲノム及び／又は目的の導入遺伝子に隣接して存在し、複製開始点として機能する。また、ＡＡＶゲノムには、転写されたときにＡＡＶゲノムをカプセル化して標的細胞に送達するためのカプシドを形成するｒｅｐタンパク質及びｃａｐタンパク質も存在する。これらのカプシド上の表面受容体は、ＡＡＶの血清型を付与し、カプシドが主にどの標的臓器に結合するかを決定し、したがって、ＡＡＶが最も効率的に感染することになる細胞を決定する。現在知られているヒトＡＡＶの血清型は１２種類である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）である。
アデノ随伴ウイルスは、いくつかの理由のために遺伝子療法に最も頻繁に使用されるウイルスの１つである。第一に、ＡＡＶは、ヒトを含む哺乳動物への投与時に免疫応答を誘発しない。第二に、ＡＡＶは、特に適切なＡＡＶ血清型を選択することを考慮するとき、標的細胞に効率的に送達される。最後に、ＡＡＶは、ゲノムが組込みを伴わずに宿主細胞において存続できるため、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染する能力を有する。この形質により、それらが遺伝子療法の理想的な候補となる。
相同組換え修復（ＨＤＲ）
ＣＡＲをコードするドナー核酸は、相同組換え修復（ＨＤＲ）によって標的遺伝子座位に挿入される。標的部位でのＤＮＡの両方の鎖が、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９酵素によって切断される。次に、ＨＤＲが発生して、二重鎖切断（ＤＳＢ）を修復し、ドナーＤＮＡを挿入する。これが正しく発生するために、ドナー配列は、標的遺伝子のＤＳＢ部位を取り囲む配列に相補的な隣接している残基（以下、「相同性アーム」）を有するように設計される。これらの相同性アームは、ＤＳＢ修復のための鋳型として機能し、本質的に誤りのない機構であるＨＤＲを可能にする。相同組換え修復（ＨＤＲ）の割合は、変異部位と切断部位の間の距離の関数であり、そのため、重複している配列又は近くの標的を選択することが重要である。鋳型は、相同領域に隣接した余分な配列を含んでもよいし、ゲノム配列と異なる配列を含有してもよく、したがって、配列編集が可能になる。
標的遺伝子は、対象において免疫応答と関連する場合があり、ここで、標的遺伝子の少なくとも一部を持続的に欠失させることが、免疫応答を調節することになる。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞を生成するために、標的遺伝子は、ＴＣＲα定常領域（ＴＲＡＣ）であり得る。ＴＲＡＣの破壊は、内在性ＴＣＲの機能の喪失をもたらす。
いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、セーフハーバー座位にある。
操作されたＴ細胞
本開示の操作された（遺伝子編集された）ＣＡＲ Ｔ細胞は、自己由来（「自己」）の又は非自己由来（「非自己」、例えば、異質遺伝子型、同一遺伝子又は異種間）であり得る。「自己由来」は、同じ対象からの細胞を指す。「異質遺伝子型」は、対象と同じ種であるが、対象中の細胞と遺伝的に異なる細胞を指す。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、哺乳動物から得られる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ヒトから得られる。
Ｔ細胞は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺排出、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含むが、これらに限定されないいくつかの供給源から得ることができる。ある種の実施形態では、Ｔ細胞は、遠心沈降、例えば、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離などの当業者に知られる任意の数の技術を使用して対象から回収される血液の単位から得ることができる。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の単離された集団が使用される。いくつかの実施形態では、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の単離の後、細胞傷害性及びヘルパーＴリンパ球の両方が、活性化、増殖、及び／又は遺伝的改変の前又は後のいずれかでナイーブ、メモリー、及びエフェクターＴ細胞亜集団に分別され得る。
以下の細胞表面マーカー：ＴＣＲａｂ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７ ＣＤ２８、ＣＤ３８ ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１２２、ＣＤ９５、ＣＤ１９７、ＣＣＲ７、ＫＬＲＧ１、ＭＣＨ－Ｉタンパク質及び／又はＭＣＨ－ＩＩタンパク質の１つ以上を発現するＴ細胞の特定の亜集団がさらに、陽性又は陰性選択手法によって単離され得る。いくつかの実施形態では、ＴＣＲａｂ、ＣＤ４及び／又はＣＤ８からなる群から選択されるマーカーの１つ以上を発現するＴ細胞の特定の亜集団はさらに、陽性又は陰性選択手法によって単離され得る。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞集団は、以下のマーカー：ＣＤ７０、ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、ＨΜ３、及びＬＡＧ３の１つ以上を発現しないか又は実質的に発現しない。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の亜集団は、遺伝子操作の前及び／又は遺伝子操作の後に陽性又は陰性選択によって単離され得る。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の単離された集団は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、又はその組合せを含むが、これらに限定されないマーカーの１つ以上を発現する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ドナー、又は対象から単離され、遺伝子編集を受ける前に、最初に活性化され、インビトロで増殖するように刺激される。
Ｔ細胞組成物の十分な治療用量を実現するために、Ｔ細胞は、１回以上の刺激、活性化及び／又は増殖にかけられる場合が多い。Ｔ細胞は、一般に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号明細書；同第６，５３４，０５５号明細書；同第６，９０５，６８０号明細書；同第６，６９２，９６４号明細書；同第５，８５８，３５８号明細書；同第６，８８７，４６６号明細書；同第６，９０５，６８１号明細書；同第７，１４４，５７５号明細書；同第７，０６７，３１８号明細書；同第７，１７２，８６９号明細書；同第７，２３２，５６６号明細書；同第７，１７５，８４３号明細書；同第５，８８３，２２３号明細書；同第６，９０５，８７４号明細書；同第６，７９７，５１４号明細書；及び同第６，８６７，０４１号明細書において記載されるとおりの方法を使用して、活性化及び増殖され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ゲノム編集組成物のＴ細胞への導入の前に約１日～約４日、約１日～約３日、約１日～約２日、約２日～約３日、約２日～約４日、約３日～約４日、又は約１日、約２日、約３日、若しくは約４日間活性化及び増殖される。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ゲノム編集組成物のＴ細胞への導入の前に約４時間、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間、又は約７２時間活性化及び増殖される。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、遺伝子編集組成物がＴ細胞に導入されるのと同時に活性化される。
治療方法及び組成物
本明細書では、いくつかの実施形態において、癌（例えば、白血病、例えば、急性骨髄性白血病）を治療するための方法が提供される。本明細書で提供されるとおりに治療され得る白血病の非限定的な例としては、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、方法は、本開示のＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞）を、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む癌（例えば、白血病）を有する対象に送達することを含む。
投与する工程は、所望の効果がもたらされるように、腫瘍などの所望の部位での導入細胞の少なくとも部分的な局在をもたらす方法又は経路による、対象への細胞、例えば、操作されたＴ細胞の配置（例えば、移植）を含み得る。操作されたＴ細胞は、移植された細胞又は細胞の構成要素の少なくとも一部が生存したままである対象における所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与され得る。対象への投与後の細胞の生存期間は、数時間、例えば、２４時間という短い期間、数日、数年もの間、或いは対象の寿命、すなわち、長期の生着であり得る。例えば、本明細書に記載されるいくつかの態様において、有効量の操作されたＴ細胞は、腹腔内又は静脈内経路などの全身性の投与経路を介して投与される。
対象は、診断、治療、又は療法が望まれる任意の対象であり得る。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
ドナーは、治療されている対象ではない個体である。ドナーは、患者ではない個体である。いくつかの実施形態では、ドナーは、治療されている癌を有しないか又は有すると疑われていない個体である。いくつかの実施形態では、複数のドナー、例えば、２以上のドナーが使用される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従って投与されている操作されたＴ細胞集団は、１つ以上のドナーから得られた異質遺伝子型のＴ細胞を含む。異質遺伝子型は、１つ以上の座位での遺伝子がレシピエント（例えば、対象）と同一ではない細胞、細胞集団、又は同じ種の１つ以上の異なるドナーから得られた細胞を含む生体試料を指す。例えば、対象に投与されている操作されたＴ細胞集団は、１以上の血縁ではないドナー、又は１以上の同一ではない同胞に由来し得る。いくつかの実施形態では、遺伝的に同一のドナー（例えば、同一の双子）から得られたものなど、同一遺伝子の細胞集団が使用され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、自己細胞である；すなわち、操作されたＴ細胞は、対象から得られるか又は単離され、同じ対象に投与される、すなわち、ドナー及びレシピエントが同じである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従って投与されている操作されたＴ細胞集団は、対象において毒性を誘導しない、例えば、操作されたＴ細胞は、非癌細胞において毒性を誘導しない。いくつかの実施形態では、投与されている操作されたＴ細胞集団は、補体に媒介される溶解を誘発しないか、又は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激しない。
有効量は、医学的状態（例えば、癌）の少なくとも１つ以上の徴候又は症状を予防するか又は軽減するのに必要な操作されたＴ細胞の集団の量を指し、所望の効果をもたらす、例えば、医学的状態を有する対象を治療する組成物の十分な量に関する。有効量はまた、疾患の症状の発症を予防するか若しくは遅らせるか、疾患の症状の経過を変えるか（例えば、疾患の症状の進行を遅くすることに限定されない）、又は疾患の症状を逆転させるのに十分な量を含む。任意の所与の場合に関して、適切な有効量は、当業者によって通常の実験を用いて決定され得ることが理解される。
本明細書に記載される様々な態様における使用に関して、有効量の細胞（例えば、操作されたＴ細胞）は、少なくとも１０2細胞、少なくとも５×１０2細胞、少なくとも１０3細胞、少なくとも５×１０3細胞、少なくとも１０4細胞、少なくとも５×１０4細胞、少なくとも１０5細胞、少なくとも２×１０5細胞、少なくとも３×１０5細胞、少なくとも４×１０5細胞、少なくとも５×１０5細胞、少なくとも６×１０5細胞、少なくとも７×１０5細胞、少なくとも８×１０5細胞、少なくとも９×１０5細胞、少なくとも１×１０6細胞、少なくとも２×１０6細胞、少なくとも３×１０6細胞、少なくとも４×１０6細胞、少なくとも５×１０6細胞、少なくとも６×１０6細胞、少なくとも７×１０6細胞、少なくとも８×１０6細胞、少なくとも９×１０6細胞、又はその複合を含む。細胞は、１つ以上のドナーに由来するか、又は自己の供給源から得られる。本明細書に記載されるいくつかの例において、細胞は、必要とする対象への投与の前に培養において増殖される。
投与の様式は、注射、注入、点眼、又は経口摂取を含む。注射としては、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節腔内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、及び胸骨内注射及び注入が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、経路は、静脈内である。
いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、全身的に投与され、これは、標的部位、組織、又は臓器に直接的ではなく、対象の循環系に入り、それにより代謝及び他の同様の過程にかけられるような細胞の集団の投与を指す。
医学的状態の治療のための組成物を含む治療の有効性は、熟達した臨床医によって判定され得る。治療は、一例ではあるが、任意の１つ又は全ての徴候又は症状の機能的標的のレベルが有利な様式で変えられる（例えば、少なくとも１０％増加する）、又は疾患（例えば、癌）の他の臨床的に認められている症状又はマーカーが改善又は緩和される場合、「有効な治療」とみなされる。有効性はまた、入院又は医学的介入の必要性によって評価されるとおり、対象が悪化しないことによって測定され得る（例えば、疾患の進行が止まるか、又は少なくとも遅くなる）。これらの指標を測定する方法は、当業者に知られており、且つ／又は本明細書に記載される。治療は、対象における疾患の任意の治療を含み、且つ（１）疾患を阻害すること、例えば、症状の進行を止めるか、又は遅くすること；又は（２）疾患を軽減すること、例えば、症状の退行をもたらすこと；及び（３）症状の発症の可能性を予防するか又は減少させることを含む。
他の実施形態
本開示は、以下の実施形態に関する。この節全体にわたって、実施形態という用語は、順序の前の「Ｅ」として省略される。例えば、Ｅ１は、実施形態１に等しい。
Ｅ１．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む操作されたＴ細胞であって、ＣＡＲが、ＣＤ３３に特異的に結合する外部ドメインを含む操作されたＴ細胞。
Ｅ２．破壊されたＴ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子をさらに含む、実施形態１の操作されたＴ細胞。
Ｅ３．ＣＡＲをコードする核酸が、ＴＲＡＣ遺伝子に挿入される、実施形態２の操作されたＴ細胞。
Ｅ４．破壊されたベータ－２－ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子をさらに含む、実施形態１～３のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ５．ＣＡＲの外部ドメインが、抗ＣＤ３３抗体を含む、実施例１～４のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ６．抗ＣＤ３３抗体が、抗ＣＤ３３一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、実施形態５の操作されたＴ細胞。
Ｅ７．抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖが、参照抗体と同じ重鎖可変ドメイン（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）及び同じ軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲを含み、参照抗体が、
（ｉ）配列番号６５に記載されるＶＨ及び配列番号６６に記載されるＶＬ、
（ｉｉ）配列番号７７に記載されるＶＨ及び配列番号７８に記載されるＶＬ、又は
（ｉｉｉ）配列番号８９に記載されるＶＨ及び配列番号９０に記載されるＶＬ
を含む、実施形態６の操作されたＴ細胞。
Ｅ８．抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖが、参照抗体と同じＶＨ及びＶＬ鎖を含む、実施形態７の操作されたＴ細胞。
Ｅ９．抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖが、配列番号７３、７５、８５、８７、９７、又は９９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態７の操作されたＴ細胞。
Ｅ１０．ＣＡＲがさらに、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は４１ＢＢ共刺激ドメインを含む、実施形態１～９のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ１１．ＣＡＲがさらに、ＣＤ３ζ細胞質内シグナル伝達ドメインを含む、実施形態１０の操作されたＴ細胞。
Ｅ１２．ＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、１０９、１１２、１１５、又は１１８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、且つ／又はＣＡＲが、配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、１１０、１１３、１１６又は１１９のいずれか１つのヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態３～１１のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ１３．破壊されたβ２Ｍ遺伝子が、配列番号９～１４のいずれか１つから選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、実施形態４～１４のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ１４．Ｔ細胞が、野生型ＣＤ３３遺伝子を含む、実施形態１～１５のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ１５．Ｔ細胞がさらに、破壊されたＣＤ３３遺伝子を含む、実施形態１～１５のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ１６．破壊されたＣＤ３３遺伝子が、ＡＧＴＴＣＡＴＧＧＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣ（配列番号１８７）、ＡＧＴＴＣＡＴＧＧＴＴＣＣ（配列番号１８８）、ＡＧＴＴＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣ（配列番号１８９）、ＡＧＴＴＣＡＴＧＧＴＴＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣ（配列番号１９０）、ＡＧＴＴＣＣ、ＡＧＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣ（配列番号１９１）、ＡＧＴＴＣＡＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣ（配列番号１９２）、ＡＧＴＴＣＡＴＧＧＴＡＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣ（配列番号１９３）、及び／又はＡＧＴＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣ（配列番号１９４）のヌクレオチド配列を含む、実施形態１７の操作されたＴ細胞。
Ｅ１７．破壊されたＣＤ３３遺伝子が、ＡＧＴＴＣＡＴＧＧＴＴＡＣＴＧＧＴＴＣＣ（配列番号１８６）を含む断片を欠く、実施形態１７又は実施形態１８の操作されたＴ細胞。
Ｅ１８．破壊されたＣＤ３３遺伝子が、ＡＡＡＴＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３００）、ＡＡＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３０１）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＡＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３０２）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＡＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３０４）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３０５）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３０６）、ＡＡＡＴＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３０７）、ＡＣＡＴＣＣＴＣＡＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３０８）、ＡＣＡＴＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３０９）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３１０）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＡＴＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３１１）、ＡＡＡＴＣＣＴ、ＡＡＡＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３１２）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３１３）、ＡＡＡＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３１４）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＡＣＴ（配列番号３１５）、ＡＣＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３１６）、及び／又はＡＡＡＴのヌクレオチド配列を含む、実施形態１７の操作されたＴ細胞。
Ｅ１９．破壊されたＣＤ３３遺伝子が、ＡＡＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号２９９）を含む断片を欠く、実施形態２０の操作されたＴ細胞。
Ｅ２０．破壊されたＣＤ３３遺伝子が断片を欠き、その３’セグメントが、ＡＡＡＴＣＣＴＣＡＴ（配列番号３１７）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＣＴ（配列番号３１８）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＧ（配列番号３２０）、ＡＡＡＴＣＣＴＣＡＴＣ（配列番号３２２）、又はＡＡＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡ（配列番号３２４）のヌクレオチド配列を含む、実施形態２０又は実施形態２１の操作されたＴ細胞。
Ｅ２１．破壊されたＣＤ３３遺伝子が断片を欠き、その５’セグメントが、ＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＴ（配列番号３２３）のヌクレオチド配列を含む、実施形態２０～２２のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ２２．実施形態１～２１のいずれか１つの操作されたＴ細胞を含む操作されたＴ細胞の集団であって、集団のうちの少なくとも２５％又は少なくとも５０％の操作されたＴ細胞が、ＣＡＲを発現する、操作されたＴ細胞の集団。
Ｅ２３．集団のうちの少なくとも７０％の操作されたＴ細胞が、ＣＡＲを発現する、実施形態２２の集団。
Ｅ２４．集団のうちの少なくとも２５％の操作されたＴ細胞が、インビトロ増殖の少なくとも７日後又は少なくとも１４日後にＣＡＲを発現する、実施形態２２の集団。
Ｅ２５．集団のうちの少なくとも５０％の操作されたＴ細胞が、検出可能なレベルのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）タンパク質を発現しない、実施形態２２～２４のいずれか１つの集団。
Ｅ２６．集団のうちの少なくとも９０％の操作されたＴ細胞が、検出可能なレベルのＴＣＲタンパク質を発現しない、実施形態２５の集団。
Ｅ２７．集団のうちの少なくとも５０％の操作されたＴ細胞が、検出可能なレベルのβ２Ｍタンパク質を発現しない、実施形態２２～２６のいずれか１つの集団。
Ｅ２８．集団のうちの少なくとも７０％の操作されたＴ細胞が、検出可能なレベルのβ２Ｍタンパク質を発現しない、実施形態２７の集団。
Ｅ２９．集団のうちの少なくとも２０％の操作されたＴ細胞が、検出可能なレベルのＣＤ３３タンパク質を発現しない、実施形態２２～２８のいずれか１つの集団。
Ｅ３０．集団のうちの少なくとも５０％の操作されたＴ細胞が、検出可能なレベルのＣＤ３３タンパク質を発現しない、実施形態２９の集団。
Ｅ３１．集団の操作されたＴ細胞が、ＣＤ３３を発現する癌細胞の集団とインビトロで共培養されるとき、集団のうちの少なくとも１０％、少なくとも２５％、又は少なくとも５０％の癌細胞の細胞溶解を誘導する、実施形態２２～３０のいずれか１つの集団。
Ｅ３２．集団の操作されたＴ細胞が、ＣＤ３３を発現する癌細胞の集団とインビトロで共培養されるとき、集団のうちの少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の癌細胞の細胞溶解を誘導する、実施形態３１の集団。
Ｅ３３．集団の操作されたＴ細胞が、癌細胞の集団とインビトロで共培養されるとき、ＩＦＮγを分泌する、実施形態３１又は実施形態３２の集団。
Ｅ３４．操作されたＴ細胞と癌細胞の比が、１：１～２：１である、実施形態３１～３３のいずれか１つの集団。
Ｅ３５．癌細胞が、白血病を含む、実施形態３１～３４のいずれか１つの集団。
Ｅ３６．癌細胞が、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む、実施形態３１～３４のいずれか１つの集団。
Ｅ３７．実施形態２２～３６のいずれか１つの操作されたＴ細胞の集団を対象に投与することを含む方法。
Ｅ３８．対象が、ヒト対象である、実施形態３７の方法。
Ｅ３９．対象が、癌を有する、実施形態３７又は３８の方法。
Ｅ４０．癌が、白血病、任意選択により、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である、実施形態３９の方法。
Ｅ４１．癌が、ＣＤ３３を発現する癌細胞を含む、実施形態３９又は実施形態４０の方法。
Ｅ４２．操作されたＴ細胞の集団を対象に投与することが、ベースライン対照に対して癌性の腫瘍体積の減少をもたらす、実施形態３９～４１のいずれか１つの方法。
Ｅ４３．操作されたＴ細胞を生成するための方法であって、
（ａ）Ｔ細胞に
（ｉ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、
（ｉｉ）ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、及び
（ｉｉｉ）ＣＤ３３に特異的に結合する外部ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸を含むドナー鋳型を含むベクターを送達すること；並びに
（ｂ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子を有し且つＣＡＲを発現する操作されたＴ細胞を生成することを含む方法。
Ｅ４４．ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡが、配列番号１８又は配列番号１９のヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号４０のヌクレオチド配列を標的化する、実施形態４３の方法。
Ｅ４５．ＣＡＲをコードする核酸が、ＴＲＡＣ遺伝子に対する左及び右の相同性アームと隣接する、実施形態４３又は４４の方法。
Ｅ４６．Ｔ細胞にβ２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡを送達することをさらに含む、実施形態４３～４５のいずれか１つの方法。
Ｅ４７．β２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡが、配列番号２０又は配列番号２１のヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号４１のヌクレオチド配列を標的化する、実施形態４６の方法。
Ｅ４８．ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、任意選択によりＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、実施形態４３～４７のいずれか１つの方法。
Ｅ４９．Ｔ細胞にＣＤ３３遺伝子を標的化するｇＲＮＡを送達することをさらに含む、実施形態４３～４８のいずれか１つの方法。
Ｅ５０．ＣＤ３３遺伝子を標的化するｇＲＮＡが、表１０において提供されるとおりのヌクレオチド配列を含む、実施形態４９の方法。
Ｅ５１．ＣＡＲの外部ドメインが、抗ＣＤ３３抗体である、実施例４３～５０のいずれか１つの方法。
Ｅ５２．抗ＣＤ３３抗体が、抗ＣＤ３３一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、実施形態５１の方法。
Ｅ５３．抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖが、参照抗体と同じ重鎖可変ドメイン（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）及び同じ軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲを含み、参照抗体が、（ｉ）配列番号６５に記載されるＶＨ及び配列番号６６に記載されるＶＬ、（ｉｉ）配列番号７７に記載されるＶＨ及び配列番号７８に記載されるＶＬ、又は（ｉｉｉ）配列番号８９に記載されるＶＨ及び配列番号９０に記載されるＶＬを含む、実施形態５２の方法。
Ｅ５４．抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖが、参照抗体と同じＶＨ及びＶＬ鎖を含む、実施形態５２の方法。
Ｅ５５．抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖが、配列番号７３、７５、８５、８７、９７、又は９９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態５４の方法。
Ｅ５６．ＣＡＲが、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は４１ＢＢ共刺激ドメインを含む、実施形態４３～５５のいずれか１つの方法。
Ｅ５７．ＣＡＲがさらに、ＣＤ３ζ細胞質内シグナル伝達ドメインを含む、実施形態５６の方法。
Ｅ５８．ドナー鋳型が、配列番号４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、１０９、１１２、１１５、又は１１８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、実施形態４３～５７のいずれか１つの方法。
Ｅ５９．ＣＡＲが、配列番号５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、１１０、１１３、１１６、又は１１９のいずれか１つのヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態４３～５８のいずれか１つの方法。
Ｅ６０．癌を有する対象において腫瘍の体積を減少させるための方法であって、実施形態２２～３６のいずれか１つの操作されたＴ細胞の集団を対象に投与することを含む方法。
Ｅ６１．対象における腫瘍の体積が、ベースライン対照に対して少なくとも５０％減少され、任意選択により、集団の１×１０5個の細胞～１×１０7個の細胞が投与される、実施形態６０の方法。
Ｅ６２．操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞が、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；及び
（ｉｉｉ）抗ＣＤ３３抗原結合断片を含むＣＡＲをコードする核酸を含む細胞の集団。
Ｅ６３．ＣＡＲが、（ａ）抗ＣＤ３３抗原結合断片を含む外部ドメイン、（ｂ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｃ）４１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３ζ共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む、実施形態６２の細胞の集団。
Ｅ６４．破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、ＣＡＲをコードする核酸を含む、実施形態６２又は実施形態６３の細胞の集団。
Ｅ６５．破壊されたＣＤ３３遺伝子をさらに含む、実施形態６２～６４のいずれか１つの細胞の集団。
Ｅ６６．操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞が、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、（ａ）抗ＣＤ３３抗原結合断片を含む外部ドメイン、（ｂ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｃ）４１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３ζ共刺激ドメインを含む内部ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；並びに
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む細胞の集団。
Ｅ６７．破壊されたＣＤ３３遺伝子をさらに含む、実施形態６３の細胞の集団。
Ｅ６８．操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞が、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする核酸を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；及び
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む細胞の集団。
Ｅ６９．破壊されたＣＤ３３遺伝子をさらに含む、実施形態６８の細胞の集団。
Ｅ７０．操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞が、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、ＣＡＲをコードする核酸を含み、核酸配列が、配列番号５６と少なくとも９０％同一であり、且つ配列番号１０４のＣＡＲをコードする破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；及び
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む細胞の集団。
Ｅ７１．破壊されたＣＤ３３遺伝子をさらに含む、実施形態７０の細胞の集団。
Ｅ７２．操作されたＴ細胞を含む細胞の集団であって、操作されたＴ細胞が、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号５５の核酸配列を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；及び
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む細胞の集団。
Ｅ７３．破壊されたＣＤ３３遺伝子をさらに含む、実施形態７２の細胞の集団。
Ｅ７４．操作されたＴ細胞であって、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子；及び
（ｉｉｉ）抗ＣＤ３３抗原結合断片を含むＣＡＲをコードする核酸を含む操作されたＴ細胞。
Ｅ７５．ＣＡＲが、（ａ）抗ＣＤ３３抗原結合断片を含む外部ドメイン、（ｂ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｃ）４１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３ζ共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む、実施形態７４の操作されたＴ細胞。
Ｅ７６．破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、ＣＡＲをコードする核酸を含む、実施形態７４又は実施形態７５の操作されたＴ細胞。
Ｅ７７．破壊されたＣＤ３３遺伝子をさらに含む、実施形態７４～７６のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ７８．操作されたＴ細胞であって、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、（ａ）抗ＣＤ３３抗原結合断片を含む外部ドメイン、（ｂ）ＣＤ８膜貫通ドメイン、並びに（ｃ）４１ＢＢ共刺激ドメイン及びＣＤ３ζ共刺激ドメインを含む内部ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；並びに
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む操作されたＴ細胞。
Ｅ７９．破壊されたＣＤ３３遺伝子をさらに含む、実施形態７５の操作されたＴ細胞。
Ｅ８０．操作されたＴ細胞であって、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする核酸を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；並びに
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む操作されたＴ細胞。
Ｅ８１．破壊されたＣＤ３３遺伝子をさらに含む、実施形態７７の操作されたＴ細胞。
Ｅ８２．操作されたＴ細胞であって、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、ＣＡＲをコードする核酸を含み、核酸配列が、配列番号５６と少なくとも９０％同一であり、且つ配列番号１０４のＣＡＲをコードする破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；及び
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む操作されたＴ細胞。
Ｅ８３．破壊されたＣＤ３３遺伝子をさらに含む、実施形態８２の操作されたＴ細胞。
Ｅ８４．操作されたＴ細胞であって、
（ｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子であって、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号５５の核酸配列を含む破壊されたＴＲＡＣ遺伝子；及び
（ｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む操作されたＴ細胞。
Ｅ８５．破壊されたＣＤ３３遺伝子をさらに含む、実施形態８４の操作されたＴ細胞。
Ｅ８６．Ｔ細胞が、ヒトＴ細胞である、実施形態１～２１及び７４～８５のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ８７．実施形態６２～７３のいずれか１つの細胞の集団を対象に投与することを含む、対象において癌を治療する方法。
Ｅ８８．癌が、白血病、任意選択により、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である、実施形態８７の方法。
Ｅ８９．癌が、ＣＤ３３を発現する細胞を含む、実施形態８７又は実施形態８８の方法。
Ｅ９０．実施形態４３～５９の方法のいずれか１つによって生成される操作されたＴ細胞。
Ｅ９１．実施形態項４３～５９の方法のいずれか１つによって生成される細胞の集団。
Ｅ９２．ＣＡＲが、配列番号１０４、１０５、１０７、１１１、１１４、１１７、又は１２０のアミノ酸配列を含む、１～２１の実施形態のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ９３．ＣＡＲが、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む、１～２１の実施形態のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ９４．編集されたＣＤ３３遺伝子が、ＧＧＡＴＣＣＡＡＡＴＴＣＴＧＧＣＴＧＣ（配列番号１７５）、ＧＧＡＴＣＣＡＡＡＴＴＴＴＣＴＧＧＣＴＧＣ（配列番号１７６）、ＧＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＧＣ（配列番号１７７）、ＧＧＡＴＣＣＡＡＴＴＣＴＧＧＣＴＧＣ（配列番号１７８）、ＴＣＣＴＧＧＣＴＧＣ（配列番号１７９）、ＧＧＡＴＣＴＧＧＣＴＧＣ（配列番号１８０）、ＧＧＡＴＣＣ、及び／又はＧＧＡＴＣＣＡＴＴＣＴＧＧＣＴＧＣ（配列番号１８１）のヌクレオチド配列を含む、１～２１の実施形態のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ９５．編集されたＣＤ３３遺伝子が、ＧＧＡＴＣＣＡＡＡＴＴＴＣＴＧＧＣＴＧＣ（配列番号１７４）を含む断片を欠く、１～２１の実施形態のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ９６．編集されたＣＤ３３遺伝子が断片を欠き、その３’セグメントが、ＧＧＡＴＣＣＡＡＡＴＴＴＣ（配列番号１８２）、ＧＧＡＴＣＣＡＡＡＴＴ（配列番号１８３）、又はＧＧＡＴＣＣＡＡＡＴＴＴ（配列番号１８５）のヌクレオチド配列を含む、１～２１の実施形態のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ９７．編集されたＣＤ３３遺伝子が、ＡＣＴＣＣＣＣＡＧＴＴＴＣＡＴＧＧＴＴＡＣ（配列番号１９７）、ＡＣＴＣＣＣＣＡＧＴＣＡＴＧＧＴＴＡＣ（配列番号１９８）、ＡＣＴＣＣＣＣＡＴＧＧＴＴＡＣ（配列番号１９９）、ＡＣＴＣＣＣＣＡＧＴＴＡＣ（配列番号２００）、ＡＣＴＣＡＴＧＧＴＴＡＣ（配列番号２０１）、ＡＣＴＣＣＣＣＡＴＣＡＴＧＧＴＴＡＣ（配列番号２０２）、ＡＣＴＣＣＣＣＡＴＴＣＡＴＧＧＴＴＡＣ（配列番号２０３）、ＡＣＴＣＣＣＣＡＧＴＧＴＣＡＴＧＧＴＴＡＣ（配列番号２０４）、及び／又はＡＣＴＣＣＣＣＡＧＴＣＴＣＡＴＧＧＴＴＡＣ（配列番号２０５）のヌクレオチド配列を含む、１～２１の実施形態のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ９８．編集されたＣＤ３３遺伝子が、ＡＣＴＣＣＣＣＡＧＴＴＣＡＴＧＧＴＴＡＣ（配列番号１９６）を含む断片を欠く、１～２１の実施形態のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ９９．編集されたＣＤ３３遺伝子が断片を欠き、その３’セグメントが、ＡＣＴＣＣＣＣＡＧＴＴＣＡＴＧＧＴＴ（配列番号２０６）のヌクレオチド配列を含む、１～２１の実施形態のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ１００．編集されたＣＤ３３遺伝子が、ＡＧＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＧＧＧＡＣＴ（配列番号２０８）、ＡＧＣＣＡＧＧＧＡＣＴ（配列番号２０９）、ＡＧＣＣＡＴＴＡＴＴＣＣＡＧＧＧＡＣＴ（配列番号２１０）、ＡＧＴＣＣＡＧＧＧＡＣＴ（配列番号２１１）、ＡＧＣＣＡＴＴＡＴＡＡＴＣＣＡＧＧＧＡＣＴ（配列番号２１２）、ＡＧＣＣＡＴＴＡＴＣＣＧＧＧＧＡＣＴ（配列番号２１３）、ＡＧＣＣＡＴＴＡＴＡＣＡＧＧＧＡＣＴ（配列番号２１４）、ＡＧＣＣＡＴＴＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＣＴ（配列番号２１６）、及び／又はＡＧＣＣＡＴＴＡＴＡＡＴＣＣＧＧＧＧＡＣＴ（配列番号２１７）のヌクレオチド配列を含む、１～２１の実施形態のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ１０１．編集されたＣＤ３３遺伝子が、ＡＧＣＣＡＴＴＡＴＡＴＣＣＡＧＧＧＡＣＴ（配列番号２０７）を含む断片を欠く、１～２１の実施形態のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ１０２．編集されたＣＤ３３遺伝子が断片を欠き、その３’セグメントが、ＡＧＣＣＡＴＴＡＴＡＴＣＣＡ（配列番号２１８）又はＡＧＣＣＡＴＴＡＴＡ（配列番号２１９）のヌクレオチド配列を含む、１～２１の実施形態のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ１０３．編集されたＣＤ３３遺伝子が、ＴＣＡＧＴＧＡＣＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２２１）、ＴＣＡＧＴＧＡＣＧＴＡＣＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２２２）、ＴＣＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２２３）、ＴＣＡＧＴＧＡＣＧＧＡＧＧＧ（配列番号２２４）、ＴＣＡＧＴＧＡＣＧＧＧＡＧＧＧ（配列番号２２６）、ＴＣＡＧＴＧＡＣＧＧＴＴＡＣＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２２７）、ＴＣＡＧＴＧＡＣＧＧＡＣＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２２８）、ＴＣＡＧＴＧＡＣＧＧＧＴＡＣＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２２９）、ＴＣＡＧＴＡＣＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２３０）、ＴＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２３１）、ＴＣＡＧＴＧＡＣＧＧＧ（配列番号２３２）、ＴＣＡＧＴＧＡＣＧＧ（配列番号２３３）、ＴＣＡＧＴＧＡＣＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２３４）、ＴＣＡＧＴＧＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２３５）、ＴＣＡＧＴＧＡＴＡＣＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２３６）、ＴＣＡＧＴＧＴＡＣＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２３７）、及び／又はＴＣＡＴＡＣＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２３８）のヌクレオチド配列を含む、１～２１の実施形態のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ１０４．編集されたＣＤ３３遺伝子が、ＴＣＡＧＴＧＡＣＧＧＴＡＣＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２２０）を含む断片を欠く、１～２１の実施形態のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ１０５．編集されたＣＤ３３遺伝子が断片を欠き、その３’セグメントが、ＴＣＡＧＴＧＡＣＧＧＴＡ（配列番号２３９）又はＴＣＡＧＴＧＡＣＧのヌクレオチド配列を含む、１～２１の実施形態のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ１０６．編集されたＣＤ３３遺伝子が断片を欠き、その５’セグメントが、ＧＴＧＡＣＧＧＴＡＣＡＧＧＡＧＧＧ（配列番号２４２）のヌクレオチド配列を含む、１～２１の実施形態のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ１０７．編集されたＣＤ３３遺伝子が、ＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴ（配列番号２４４）、ＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴ（配列番号２４５）、ＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴ（配列番号２４６）、ＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴ（配列番号２４７）、ＡＧＧＴＧＡＡＧＴＣＧＣＴＧＧＡＧＣＴ（配列番号２４８）、ＡＧＧＴＧＧＡＧＣＴ（配列番号２４９）、ＡＧＧＴＧＡＡＧＣＧＣＴＧＧＡＧＣＴ（配列番号２５０）、ＡＧＧＴＧＡＣＧＣＴＧＧＡＧＣＴ（配列番号２５２）、及び／又はＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＴＣＧＣＴＧＧＡＧＣＴ（配列番号２５３）のヌクレオチド配列を含む、１～２１の実施形態のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ１０８．編集されたＣＤ３３遺伝子が、ＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＣＴＧＧＡＧＣＴ（配列番号２４３）を含む断片を欠く、１～２１の実施形態のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ１０９．編集されたＣＤ３３遺伝子が断片を欠き、その３’セグメントが、ＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧ（配列番号２５６）、ＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＣＴＧＧＡＧ（配列番号２５９）、ＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＣＴＧＧ（配列番号２６０）、又はＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴ（配列番号２６１）のヌクレオチド配列を含む、１～２１の実施形態のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ１１０．編集されたＣＤ３３遺伝子が断片を欠き、その５’セグメントが、ＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＣＴＧＧＡＧＣＴ（配列番号２６２）のヌクレオチド配列を含む、１～２１の実施形態のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ１１１．編集されたＣＤ３３遺伝子が、ＡＧＴＴＣＧＣＴＧＧＴＧＴＧ（配列番号２６４）及び／又はＡＧＴＴＣＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＴＧ（配列番号２６６）のヌクレオチド配列を含む、１～２１の実施形態のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ１１２．編集されたＣＤ３３遺伝子が、ＡＧＴＴＣＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＴＧ（配列番号２６３）を含む断片を欠く、１～２１の実施形態のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ１１３．編集されたＣＤ３３遺伝子が断片を欠き、その３’セグメントが、ＡＧＴＴＣＧＣＴＧＧ（配列番号２６７）のヌクレオチド配列を含む、１～２１の実施形態のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ１１４．編集されたＣＤ３３遺伝子が、ＡＣＴＡＣＴＣＡＣＴＴＣＣＴＣＧＧＴＧＣＴ（配列番号２６９）、ＡＣＴＡＣＴＣＧＧＴＧＣＴ（配列番号２７０）、ＡＣＴＡＣＴＣＡＴＣＣＴＣＧＧＴＧＣＴ（配列番号２７１）、ＡＣＴＡＣＴ、ＡＣＴＡＣＴＣＡＣＣＣＴＣＧＧＴＧＣＴ（配列番号２７２）、ＡＣＴＡＣＴＣＣＴＣＧＧＴＧＣＴ（配列番号２７３）、ＡＣＴＡＣＴＣＡＣＣＴＣＧＧＴＧＣＴ（配列番号２７５）、ＡＣＴＡＣＴＣＡＣＴＣＧＧＴＧＣＴ（配列番号２７６）、ＡＣＴＡＣＴＣＴＣＣＴＣＧＧＴＧＣＴ（配列番号２７７）、ＡＣＴＡＣＴＴＣＣＴＣＧＧＴＧＣＴ（配列番号２７８）、ＡＣＴＡＣＴＣＡＣＴＴＣＧＧＴＧＣＴ（配列番号２７９）、及び／又はＡＣＴＡＴＣＣＴＣＧＧＴＧＣＴ（配列番号２８０）のヌクレオチド配列を含む、１～２１の実施形態のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ１１５．編集されたＣＤ３３遺伝子が、ＡＣＴＡＣＴＣＡＣＴＣＣＴＣＧＧＴＧＣＴ（配列番号２６８）を含む断片を欠く、１～２１の実施形態のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ１１６．編集されたＣＤ３３遺伝子が断片を欠き、その３’セグメントが、ＡＣＴＡＣＴＣＡＣＴ（配列番号２８２）、ＡＣＴＡＣＴＣＡＣＴＣＣＴＣ（配列番号２８３）、又はＡＣＴＡＣＴＣＡＣＴＣＣＴＣＧＧＴ（配列番号２８４）のヌクレオチド配列を含む、１～２１の実施形態のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ１１７．編集されたＣＤ３３遺伝子が、ＣＣＣＧＡＴＣＴＴＣＣＴＧＧＴＴＧＴ（配列番号２８６）、ＣＣＣＧＡＴＣＣＴＧＧＴＴＧＴ（配列番号２８７）、ＣＣＣＧＡＴＣＴＧＧＴＴＧＴ（配列番号２８８）、ＣＣＣＴＧＧＴＴＧＴ（配列番号２８９）、ＣＣＣＧＡＴＣＴＴＣＴＧＧＴＴＧＴ（配列番号２９０）、ＣＣＣＧＡＴＣＴＴＧＧＴＴＧＴ（配列番号２９１）、ＣＣＣＧＡＴＣＴＣＣＴＧＧＴＴＧＴ（配列番号２９２）、ＣＣＣＧＡＴＣＴＴＣＣＣＴＧＧＴＴＧＴ（配列番号２９３）、及び／又はＣＣＣＧＡＴのヌクレオチド配列を含む、１～２１の実施形態のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ１１８．編集されたＣＤ３３遺伝子が、ＣＣＣＧＡＴＣＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＴＧＴ（配列番号２８５）を含む断片を欠く、１～２１の実施形態のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ１１９．編集されたＣＤ３３遺伝子が断片を欠き、その３’セグメントが、ＣＣＣＧＡＴＣＴＴＣＴ（配列番号２９５）のヌクレオチド配列を含む、１～２１の実施形態のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
Ｅ１２０．編集されたＣＤ３３遺伝子が断片を欠き、その５’セグメントが、ＴＣＣＴＧＧＴＴＧＴ（配列番号２９８）のヌクレオチド配列を含む、１～２１の実施形態のいずれか１つの操作されたＴ細胞。
実施例１：ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の作製。
この実施例は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子（ＴＣＲアルファ定常（ＴＲＡＣ）領域において遺伝子編集された）、β２－ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子の発現を欠き、ＣＤ３３及びＣＤ３３+癌を標的化するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する異質遺伝子型のヒトＴ細胞の生成を記載する。ＣＤ２８共刺激ドメインを含む４種の固有の抗ＣＤ３３ ＣＡＲ（ＣＴＸ－９６５、ＣＴＸ－９６４、ＣＴＸ－９６９及びＣＴＸ－９７０）は、実験及び評価に関してＴＲＡＣ-／β２Ｍ- Ｔ細胞において別々に発現された。追加の抗ＣＤ３３ ＣＡＲ（ＣＴＸ－９６５ｂ、ＣＴＸ－９６４ｂ、ＣＴＸ－９６９ｂ、及びＣＴＸ－９７０ｂ）もまた、ＣＤ２８の代わりに４－１ＢＢ共刺激ドメインとともに作製された。追加のＣＡＲは、表６において示されるとおりに作製され得る。
Figure 0007553440000045
活性化一次ヒトＴ細胞を、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体で電気穿孔し、ＴＲＡＣ座位と相同性を有する抗ＣＤ３３ ＣＡＲドナー鋳型を含有するアデノ随伴アデノウイルスベクター（ＡＡＶ）で感染させて、ＴＲＡＣ-／β２Ｍ-／抗ＣＤ３３ ＣＡＲ+ Ｔ細胞を作製した。ＣＡＲドナー鋳型（配列番号４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、１０９、１１２、１１５、又は１１８）を含む組換えＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）が、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ（１μＭ Ｃａｓ９、５μＭ ｇＲＮＡ）とともに活性化ヒトＴ細胞に送達された。以下のｓｇＲＮＡが使用された：ＴＲＡＣ（配列番号２８）及びβ２Ｍ（配列番号３０）。ｇＲＮＡの未改変のバージョン（又は他の改変バージョン）もまた使用され得る（例えば、配列番号１８又は配列番号２０）。表４を参照されたい。
エレクトロポレーションの約１週間後、遺伝子編集されたＴ細胞を、抗ＣＤ３３ ＣＡＲを発現した細胞集団のパーセンテージを評価するためにフローサイトメトリーによって分析した。細胞表面の抗ＣＤ３３ ＣＡＲの標識は、ビオチン及びストレプトアビジン－ＡＰＣ二次試薬にコンジュゲートされたＣＤ３３タンパク質（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の組合せによりなされた（図１Ａ、図１Ｂ及び図１Ｃ）。ＲＮＰを伴わずに処理されたＴ細胞（例えば、「ＲＮＰなし」）及びＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ遺伝子破壊を有するがＣＡＲの挿入を有しないＴ細胞（例えば、ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－又は「ＴＢ－」）を含む対照細胞は、予想されるとおり抗ＣＤ３３ ＣＡＲ表面タンパク質の発現を示さなかった。対照的に、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ遺伝子破壊並びにＣＡＲコンストラクトにより作製されたある種のＴ細胞は、抗ＣＤ３３ ＣＡＲを発現した高いパーセンテージの集団をもたらした。これは、ＣＴＸ－９６５ｂ、ＣＴＸ－９６９、又はＣＴＸ－９７０ ＣＡＲコンストラクトで作製されたＴ細胞にも当てはまった。しかしながら、ＣＡＲコンストラクトで作製された全てのＴ細胞がＣＡＲ発現を有したというわけではなかった。例えば、ＣＴＸ－９６４、ＣＴＸ－９６４ｂ、ＣＴＸ－９６５、ＣＴＸ ９７０ｂ、又はＣＴＸ－９６９ｂ ＣＡＲコンストラクトで作製されたＴ細胞は、対照と比較してＣＡＲ発現Ｔ細胞の増加を実証しなかった（表８；図１Ａ及び図１Ｂ）。驚くべきことに、所与のｓｃＦｖを有するＣＡＲ Ｔ細胞に関して、使用される共刺激ドメイン（例えば、４１ＢＢに対してＣＤ２８）は、ＣＡＲ発現について陽性であったＴ細胞のパーセンテージに影響を及ぼした。例えば、ＣＴＸ－９６５ｂ及びＣＴＸ－９６５ ＣＡＲコンストラクトは同じｓｃＦｖを有したが、４－１ＢＢ共刺激ドメインを有したＣＴＸ－９６５ｂコンストラクトは、ＣＤ２８共刺激ドメインを有したＣＴＸ－９６５コンストラクトより著しく多いＣＡＲ陽性細胞をもたらした（図１Ａ）。さらに、ｓｃＦｖの方向づけは、ＣＡＲ発現細胞の相対的な量に影響を及ぼした。例えば、ＣＴＸ－９６４は、ＣＴＸ－９６５と同じＶＨ及びＶＬドメインで構成されているにもかかわらず、基本的にはＣＡＲ発現を有する細胞をもたらさなかった。実際に、この結果は、ＣＡＲ共刺激ドメインを切り替えることによって変わらなかった（例えば、ＣＴＸ－９６４ｂと比較してＣＴＸ－９６４）。
追加のＴＲＡＣ-／β２Ｍ-／抗ＣＤ３３ ＣＡＲ+ Ｔ細胞は、ＣＴＸ－９８１、ＣＴＸ－９８１ｂ、ＣＴＸ－９８２及びＣＴＸ－９８２ｂにより作製された。ＣＡＲのこのセットに関して、発現は、使用される重鎖及び軽鎖又は共刺激ドメインの方向づけによって影響されるように見えなかった。代わりに、ＣＡＲコンストラクトのこのセットで作製されたＴ細胞集団の各々は、細胞表面でのＣＡＲ発現について陽性であった高い比率の集団をもたらした（図１Ｃ）。
ＣＡＲ発現について評価された１２種のＣＡＲコンストラクトのうちの３種が、下の実施例における追加の分析のために選択された。
Figure 0007553440000046
遺伝子編集されたＴ細胞を作製するために使用されたヒトドナーにかかわらずＣＡＲ発現が達成されることを実証するため、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、（ＣＴＸ－９６５ｂ ＣＡＲ Ｔ細胞と呼ばれるＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞を作製するための）上の遺伝子編集プロトコルに従って、２つの追加の一次Ｔ細胞ドナーに由来するＣＴＸ－９６５ｂ ＣＡＲコンストラクトを使用して作製された。エレクトロポレーションの約１週間後、細胞を、編集された細胞集団の細胞表面でのＴＲＡＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡからのＰＥ－抗ヒトＴＣＲαβ、クローンＢＷ２４２／４１２を使用して）、β２Ｍ（ＢｉｏｌｅｇｅｎｄからのＰＥ－Ｃｙ７－抗ヒトβ２Ｍ、クローン２Ｍ２を使用して）、ＣＤ４（ＢｉｏｌｅｇｅｎｄからのＡＰＣ－Ｃｙ７－抗ヒトＣＤ４、クローンＲＰＡ－Ｔ４を使用して）、ＣＤ８（ＢｉｏｌｅｇｅｎｄからのＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ－抗ヒトＣＤ８、クローンＳＫ１を使用して）及び抗ＣＤ３３ ＣＡＲ（ビオチン（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びストレプトアビジン－ＡＰＣにコンジュゲートされたＣＤ３３タンパク質を使用して）の発現レベルを評価するためにフローサイトメトリーによって分析した（図２Ａ）。ＣＴＸ－９６５ｂで編集された細胞に関して、集団の高い比率が、抗ＣＤ３３ ＣＡＲの発現の陽性を有し、且つＴＣＲ及びβ２Ｍの発現の枯渇を有した。同等のＣＡＲ発現は、ドナー供給源の両方について見られ、これはＴ細胞が由来するドナー供給源が異なる場合でさえ効率的な遺伝子編集が達成されることを示している。さらに、ＴＲＡＣ-／β２Ｍ-／ＣＡＲ+細胞の細胞表面上でのＣＤ４及びＣＤ８のレベルが、対照細胞（ＴＲＡＣ+ Ｔ細胞及びＴＲＡＣ-／β２Ｍ- Ｔ細胞）上でのものと同等であることが見出され、これは、ＣＡＲの挿入がこれらの重要な表現型マーカーの発現を変えていないことを示している（図２Ａ）。
以下の抗体がフローサイトメトリーのために使用された（表７）。
Figure 0007553440000047
ＣＴＸ－９６５ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、合計で７種のＴ細胞ドナーから生成された。加えて、ＣＴＸ－９７０ ＣＡＲ及びＣＴＸ－９８２ｂ ＣＡＲを使用して、４種のＴ細胞ドナーからＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞（ＣＴＸ－９７０ ＣＡＲ Ｔ細胞及びＣＴＸ－９８２ｂ ＣＡＲ Ｔ細胞とも呼ばれる）を作製した。
ＣＡＲ発現に加えて、編集されたＴ細胞集団は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による遺伝子破壊に起因するＴＣＲαβ及びβ２Ｍの表面発現の枯渇を有する細胞のパーセンテージについて分析された（表８）。上記のとおり、エレクトロポレーションの約１週間後、細胞を、編集された細胞集団の細胞表面上での抗ＣＤ３３ ＣＡＲ発現レベルを評価するフローサイトメトリーのために処理した。ＴＣＲαβ及びβ２Ｍ発現もまた、上記のとおりの抗体で細胞を染色することによって評価された。高いパーセンテージの編集された細胞が、ＴＣＲαβ及びβ２Ｍの両方の表面発現の枯渇を実証した（表８）。さらに、使用されたＣＡＲコンストラクトに応じて、高いパーセンテージの編集された細胞が、抗ＣＤ３３ ＣＡＲの発現に関して陽性であった。これらのデータは、健常ドナーからのＴ細胞がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により編集されて、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ破壊並びに抗ＣＤ３３ ＣＡＲの発現をもたらす遺伝子挿入を生成できることを示す。
Figure 0007553440000048
驚くべきことに、且つ予想外にも、抗ＣＤ３３－ＣＡＲを発現する細胞の集団は、エレクトロポレーション／ｒＡＡＶ感染後の１週目に分析された細胞に対して、培養の２週目に増加した。この傾向は、異なるドナーから得られ且つ異なるＣＡＲコンストラクト：ＣＴＸ－９６５ｂ（６個のドナー）、ＣＴＸ－９７０（４個のドナー）又はＣＴＸ－９８２ｂ（３個のドナー）でトランスフェクトされたＴ細胞の集団に関して一致した（図２Ｂ）。
Ｔ細胞比率アッセイ。ＣＤ４＋ Ｔ細胞又はＣＤ８＋ Ｔ細胞であった遺伝子編集されたＴ細胞の比率は、表７において列挙されるＣＤ４+及びＣＤ８+標識抗体を使用して、編集後の１及び２週目（すなわち、７日目及び１４日目）のフローサイトメトリーによって評価された。驚くべきことに、編集された細胞集団中のＣＤ４+細胞のパーセンテージは、編集後の１週目に対して編集後の２週目に減少した。ＣＤ４ Ｔ細胞のこの枯渇は、抗ＣＤ３３ ＣＡＲの発現を欠いた対照Ｔ細胞において観察されなかった（例えば：ＲＮＰなし）（図２Ｃ）。しかしながら、ＣＡＲ発現Ｔ細胞に関して、経時的なＣＤ４ Ｔ細胞のこの枯渇は、異なるＣＡＲコンストラクトで編集され、且つ異なるドナー：ＣＴＸ－９６５ｂ（図２Ｃ）、ＣＴＸ－９７０（図２Ｃ）、又はＣＴＸ－９８２ｂ（図２Ｄ）から得られたＴ細胞に関して観察された。
ＣＤ３３は、活性化培養Ｔ細胞上で発現された（図４、左パネル）。さらに、より高い比率のＣＤ４+ Ｔ細胞が、ＣＤ８+ Ｔ細胞と比較してＣＤ３３発現について陽性である（それぞれ５８％対３１％）。
抗ＣＤ３３ ＣＡＲ－Ｔ培養物中のＣＡＲ+細胞の増殖及びＣＤ４+細胞の減少は、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、同じ培養物中においてＣＤ３３発現Ｔ細胞に対して反応している可能性があることを示唆する。実際に、表面ＣＤ３３発現の完全な消失が、対照に対して抗ＣＤ３３ ＣＡＲ－Ｔ（例えば、ＣＴＸ－９６５ｂ）において観察され（３６％の細胞が、ＲＮＰなしでトランスフェクトされたＴ細胞においてＣＤ３３を発現し、ＴＲＡＣ－Ｂ２Ｍ－培養物中で３０％、ＣＴＸ－９６５ｂ培養物中ではほんの０．２１％である）、ＣＤ３３発現Ｔ細胞が抗ＣＤ３３ ＣＡＲ発現Ｔ細胞によって除去されることを示唆している。さらに、ＣＤ４+ Ｔ細胞がより高いレベルのＣＤ３３を発現するとすれば、それらは、ＣＡＲ発現Ｔ細胞による自己反応性死滅により感受性であり得る。この自己反応性は、Ｔ細胞培養物中で経時的に観察されるＣＤ４+ Ｔ細胞のパーセンテージの減少を説明し得る（図２Ｃ）。自己反応性死滅はまた、ＣＡＲ＋ Ｔ細胞を刺激し、活性化するために機能して、経時的に観察されるＣＡＲ＋ Ｔ細胞の増殖をもたらし得る（図２Ｂ）。このデータに基づいて、Ｔ細胞培養物中のＣＤ３３の遺伝子破壊は、自己反応性死滅を妨げ、且つ均整のとれたＣＤ４／ＣＤ８ ＣＡＲ－Ｔ比率の維持を可能にし得る。Ｔ細胞中のＣＤ３３の遺伝子破壊は、下に示されるとおり、ｓｇＲＮＡ配列を使用して実施され得る。
次に、ＣＴＸ－９６５ｂで遺伝子編集されたＴ細胞はインビトロで２週間増殖されて、遺伝子編集されたＴ細胞が対照細胞（ＴＲＡＣ+ Ｔ細胞及びＴＲＡＣ-／β２Ｍ- Ｔ細胞）と同程度に成長し、増殖できることを実証した。ＣＴＸ－９６５ｂ細胞は、対照細胞と同様に約１００倍増殖した（図３）。
実施例２：抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の機能的性能。
ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞（例えば：ＣＴＸ－９６５ｂ ＣＡＲ Ｔ細胞又はＣＴＸ－９７０ ＣＡＲ Ｔ細胞）は、実施例１において記載されるとおりに作製された。遺伝子編集されたＣＡＲ Ｔ細胞集団は、複数のＴ細胞ドナーから作製された。ＴＣＲ＋ Ｔ細胞及びＴＲＡＣ－／β２Ｍ－ Ｔ細胞の集団は、対照としての使用のために同様に作製された。
トランスフェクションによる編集されたＴ細胞の作製の後、ＣＡＲ Ｔ細胞の機能活性を、フローサイトメトリーに基づく細胞障害性アッセイを使用して検証した。ＣＡＲ Ｔ細胞又は対照Ｔ細胞（ＴＣＲ＋ Ｔ細胞及びＴＣＲ－Ｂ２Ｍ－ Ｔ細胞）は、ＣＤ３３発現癌細胞株と共培養された。３種の異なるヒトＡＭＬ由来細胞株（「標的細胞」と呼ばれる）が試験された：ＴＨＰ－１（ＡＴＣＣ ＴＩＢ－２０２）、ＫＧ－１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２４６）、又はＭＶ４－１１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－９５９１）。標的細胞は、５μＭ ｅｆｌｕｏｒ６７０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識され、洗浄され、様々な比（０．０５：１～１：１ Ｔ細胞：標的細胞）でのＣＴＸ－９６５ｂ ＣＡＲ Ｔ細胞（ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋）又はＣＴＸ－９７０ ＣＡＲ Ｔ細胞（ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋）との共培養物中においてインキュベートされた。標的細胞は、９６ウェル、Ｕ底プレートにおいてウェル当たり５０，０００細胞で播種された。共培養物は、一晩インキュベートされた。翌日、ウェルは洗浄され、培地は、５ｍｇ／ｍＬ ＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の１：５００希釈物を含有する２００μＬの培地で置き換えられた。次に、２５μＬのＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が、各ウェルに加えられ、細胞培養物が、フローサイトメトリーによって細胞生存率について分析された（すなわち、生存細胞はＤＡＰＩ染色について陰性である）。
次に、標的細胞（例えば、ＴＨＰ－１、ＫＧ－１又はＭＶ４－１１）の細胞溶解パーセントが、以下の式を使用して決定された：
細胞溶解パーセント＝（１－（（試験試料における標的細胞の総数）÷（対照試料における標的細胞の総数））Ｘ１００；
式中、試験試料は、１）ＣＴＸ－９６５ｂ ＣＡＲ Ｔ細胞；２）ＣＴＸ－９７０ ＣＡＲ Ｔ細胞；３）ＴＲＡＣ+ Ｔ細胞；又は４）ＴＲＡＣ-／β２Ｍ- Ｔ細胞と共培養された標的細胞（例えば、ＴＨＰ－１細胞）であり、
対照試料は、共培養されていない単独の標的細胞であった。
ＣＴＸ－９６５ｂ ＣＡＲ Ｔ細胞は、試験されたＣＴＸ－９６５ｂ Ｔ細胞とＴＨＰ－１細胞の全て比でＴＨＰ－１細胞を死滅させる（すなわち、細胞傷害性を誘導する）際に効果的であった（図５Ａ）。ＣＴＸ－９６５ｂ ＣＡＲ Ｔ細胞はまた、他のＡＭＬ癌細胞（ＫＧ－１及びＭＶ４－１１）を死滅させる際に効果的であった（図５Ｃ及び図５Ｄ）。加えて、交互の抗ＣＤ３３ ＣＡＲ、ＣＴＸ－９７０もまた、試験されたＡＭＬ癌細胞株の全てを死滅させる際に効果的であった（図５Ｂ～図５Ｄ）。これらのデータは、本明細書に記載されるとおりの抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＣＤ３３発現ＡＭＬ細胞株の強力な細胞溶解を誘導することを実証する。これらの結果は、異質遺伝子型のＣＡＲ－Ｔ細胞集団が異なるドナー供給源から生成されるときでさえ再現性がある（図５Ａ）。
サイトカイン放出アッセイ。ＴＨＰ－１、ＫＧ－１又はＭＶ４－１１標的細胞の存在下でサイトカイン分泌／放出を誘導するＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞（例えば、ＣＴＸ－９６５ｂ ＣＡＲ Ｔ細胞及びＣＴＸ－９７０ ＣＡＲ Ｔ細胞）の機能的な能力は、対照Ｔ細胞（例えば、ＴＣＲ+ Ｔ細胞及びＴＲＡＣ-／β２Ｍ- Ｔ細胞）と比較して試験された。サイトカイン放出を測定するために、Ｔ細胞を標的細胞と２４時間共培養した。上清培地が、製造業者の指示書（ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に従うＥＬＩＳＡに基づくアッセイ（ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によるＩＦＮγ又はＩＬ－２サイトカインの測定のために回収された。ＣＴＸ－９６５ｂ ＣＡＲ Ｔ細胞及びＣＴＸ－９７０ ＣＡＲ Ｔ細胞は、標的細胞に対するＣＡＲ Ｔ細胞の低い比でさえ、ＴＨＰ－１細胞に応答して対照に対してはるかに高いレベルのＩＦＮγを産生した（図６Ａ～図６Ｄ）。これらの結果は、ＣＴＸ－９６５ｂ又はＣＴＸ－９７０ ＣＡＲコンストラクトのいずれかを使用して導入された抗ＣＤ３３ ＣＡＲの発現が、ＣＤ３３発現標的細胞の存在下でＴ細胞に対するエフェクター機能を与えることを示す。
サイトカイン依存性。遺伝子編集が、制御されない細胞増殖などの有害な特性を有する細胞を生成し得る望まれないオフターゲット編集をもたらしたかどうかを判定するため、サイトカイン及び／又は血清の非存在下で増殖するＴＲＡＣ-／β２Ｍ-／抗ＣＤ３３ ＣＡＲ+細胞の能力が評価された。１×１０6個のＴＲＡＣ-／β２Ｍ-／抗ＣＤ３３ ＣＡＲ+ Ｔ細胞は、遺伝子編集のおよそ２週間後の０日目に蒔かれた。生存細胞の数は、完全培地、サイトカイン（ＩＬ－２及びＩＬ－７）を伴わない５％ヒト血清、又は血清及びサイトカインを欠く基本培地のいずれかにおいて蒔いた７日、１４日及び２１日後に数え上げられた。２種のドナーから作製されたＴＲＡＣ-／β２Ｍ-／抗ＣＤ３３ ＣＡＲ+ Ｔ細胞が試験された。サイトカインを欠いた培地において蒔かれたとき、細胞増殖は１４日目又は２１日目に検出されなかったが、これは、ゲノム編集によるいずれかの潜在的なオフターゲット作用が、細胞に対して増殖因子非依存性の増殖活性を誘導しなかったことを示唆している。細胞は、図６Ｅにおいて示されるとおり、サイトカインの存在下（サイトカインを含有する完全培地）でのみ増殖し、血清単独の存在下では増殖しなかった。したがって、インビボでは、サイトカイン、増殖因子又は抗原刺激の非存在下では、任意のオフターゲットゲノム編集のために、ＴＲＡＣ-／β２Ｍ-／抗ＣＤ３３ ＣＡＲ+細胞は増殖することが期待されない。
実施例３：ＮＯＧマウスのＡＭＬ異種移植モデルにおけるＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の有効性。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びＡＡＶ６を、上のとおりに使用して（例えば、実施例１を参照のこと）、ＴＲＡＣ座位に挿入されたＣＤ３３を標的化するＣＡＲコンストラクト（ＣＴＸ－９６５ｂ；配列番号５６（核酸）；配列番号１０４（アミノ酸））の同時の発現を伴ってＴＣＲ及びβ２Ｍの発現を欠いたヒトＴ細胞を作製した。活性化Ｔ細胞はまず、ＴＲＡＣを標的化するｓｇＲＮＡ（配列番号２８）を含有する一方及びβ２Ｍを標的化するｓｇＲＮＡ（配列番号３０）を含有する他方の２種の異なるＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体により電気穿孔された。ＴＲＡＣ座位でのＤＮＡ二重鎖切断は、キメラ抗原受容体カセット（遺伝子発現に関する－／＋調節エレメント）に隣接するＴＲＡＣ座位に対して右及び左の相同性アームを含有するＡＡＶ６で送達されるＤＮＡ鋳型（配列番号５５）（配列番号１０４のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３３ ＣＡＲ ＣＴＸ－９６５ｂをコードする）による相同組換え修復によって修復された。得られた改変Ｔ細胞は、２Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－）、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞（ＣＴＸ－９６５ｂ Ｔ細胞）である。
小型腫瘍モデルにおける治療
ＣＤ３３＋癌細胞株によって引き起こされる疾患を回復させる改変された抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞（２Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－）、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞）の能力は、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＬＬＣ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ，ＡＺ）によって利用される方法を使用して、ＮＯＧマウスにおいて評価された。簡潔には、１２頭の５～８週齢雌、ＣＩＥＡ ＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃscidＩ１２ｒｇtm1Sug／ＪｉｃＴａｃ）マウスは、換気されたマイクロアイソレーターケージにおいて個別に飼育され、試験の開始前の５～７日間病原体を含まない条件下で維持された。マウスは、右後側腹部において５×１０6個のＴＨＰ－１、ヒトＡＭＬ由来細胞／マウスの皮下接種を受けた。平均腫瘍サイズが、２５～７５ｍｍ3（約５０ｍｍ3の標的）に達した後、マウスはさらに、表９に示されるとおりの３つの治療群に分けられた。１日目、治療群２及び３は、表９に従って、単回の２００μｌの静注投与量の抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞（ＣＴＸ－９６５ｂ Ｔ細胞）を受容した。
Figure 0007553440000049
腫瘍体積は、治療開始日から始めて週に３回測定された。５日目までに、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞で治療された全ての動物（治療群２及び３）が、腫瘍体積の減少を示し始めた。６～８日目までに、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞で治療された動物（治療群２及び３）は、治療されなかった動物（治療群１）と比較して腫瘍成長の有意な低減を実証した（図７）。これらのデータは、異質遺伝子型の抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞が、インビボでＣＤ３３＋ ＡＭＬの成長及び増殖を迅速且つ効率的に低減できることを実証している。異質遺伝子型の抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞による治療に起因するＣＤ３３＋ ＡＭＬ腫瘍の完全な退縮が、試験の期間中に達成され、持続された。群２に関して、全てのマウスは２２日目に、群３に関しては２４日目に０ｍｍ３の腫瘍を有した。
大型腫瘍モデルにおける治療
ＣＤ３３＋癌細胞株によって引き起こされる大型腫瘍を縮小する改変された抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞（２Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－）、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞）の能力は、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＬＬＣ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ，ＡＺ）によって利用される方法を使用して、ＮＯＧマウスにおいて評価された。簡潔には、１２頭の５～８週齢雌マウス、ＣＩＥＡ ＮＯＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃscidＩ１２ｒｇtm1Sug／ＪｉｃＴａｃ）は、換気されたマイクロアイソレーターケージにおいて個別に飼育され、試験の開始前の５～７日間病原体を含まない条件下で維持された。マウスは、５ｘ１０6個のＴＨＰ－１、ヒトＡＭＬ由来細胞／マウスの皮下接種を受けた。平均腫瘍サイズが、１２５～１７５ｍｍ3（約１５０ｍｍ3の標的）に達した後、マウスはさらに、表９に示されるとおりの３つの治療群に分けられた。
１日目、治療群２及び３は、表９に従って、単回の静注投与量の抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞を受容した。腫瘍体積は、治療開始日から始めて週に３回測定された。５日目までに、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞で治療された全てのマウス（治療群２及び３）が、腫瘍体積の最初の減少を示し始めた（図８）。この減少は、試験の３０日目までの間、中程度の用量のＣＡＲ－Ｔ細胞を受容する動物の大部分において持続された。腫瘍成長は、高用量の抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞を受容した群３において実質的に遅延された。実際に、高用量の抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞を受容した５頭の動物のうちの２頭が、ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の投与から観察期間の最後（７３日目）までほとんど又は全く腫瘍成長を示さなかった。特に、ある動物は、７３日目に１５７ｍｍ3の低い腫瘍体積を有し、別の動物は、４３日目までに腫瘍の完全な消失を示し、これは観察期間の最後（７３日目）まで続いた。これらのデータは、異質遺伝子型の抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞が、インビボでの大型のＣＤ３３＋ ＡＭＬ腫瘍の成長及び増殖を著しく阻害できるか又は低減できることを実証している。
実施例４：ＣＤ３３遺伝子編集のためのｇＲＮＡの設計。
この実施例は、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞において自己反応性のリスクを排除するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を使用したエクスビボでの一次ヒトＴ細胞におけるＣＤ３３遺伝子の効率的な編集を記載する。ＣＤ３３遺伝子の最初の２つのタンパク質コードエクソン（エクソン２及び３）を含有するＣＤ３３遺伝子のゲノムセグメントが、ｇＲＮＡ設計ソフトウェアへの入力として使用された。所望のｇＲＮＡは、コード配列における挿入又は欠失を導入し、それにより遺伝子発現を損なうアウト・オブ・フレーム変異又は未成熟終止コドンを生成することになる（すなわち、「ＣＤ３３ノックアウト」と呼ばれるアウト・オブ・フレーム／機能喪失型アレルを与える）ものであった。ＣＤ３３遺伝子を標的化する１０個のインシリコで同定されたｇＲＮＡスペーサー配列は、予測された低リスクのオフターゲット遺伝子編集に基づいて選択された（配列番号１３２～１４１）。ｇＲＮＡは、表１０において示されるとおりに合成され、特異的に修飾された。表１０におけるｇＲＮＡは２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート修飾で修飾されたが、未修飾ｇＲＮＡ、又は他の修飾を有するｇＲＮＡが使用されてもよい。
Figure 0007553440000050
Figure 0007553440000051
Figure 0007553440000052
一次ヒトＴ細胞は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びＣＤ３３遺伝子を標的化する合成的に修飾されたｓｇＲＮＡ（表１０の配列）を含有するリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）又は対照（Ｃａｓ９なし、ｇＲＮＡなし）でトランスフェクト（電気穿孔）された。トランスフェクションの４～６日後、細胞は、細胞表面でのＣＤ３３発現レベルを評価するためにフローサイトメトリー（一次抗体：抗ヒトＣＤ３３抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ｃａｔ＃３６６６０８）によって処理された。試験されたｇＲＮＡの一部に関して、Ｔ細胞のほとんど全てが、遺伝子破壊を意味する表面ＣＤ３３発現の消失を有した（すなわち、ＣＤ３３陰性）（例えば、図９に示されるとおりのＣＴＸ３３－２、ＣＴＸ３３－５、及びＣＴＸ３３－１０）。
３種のｇＲＮＡはさらに、表１１に示されるとおり、ＴＩＤＥ分析によって試験された。これらのうちの２種のｇＲＮＡは、高い効率の編集を達成し、９７％を超える編集頻度を有した。
Figure 0007553440000053
最初の実験は、最高の％インデル及びタンパク質発現の％ノックダウンを示すガイドを使用して実施された。
Ｔ細胞におけるオフターゲット及びオンターゲットプロファイルの分析。
表１２のＣＤ３３ ｇＲＮＡの相同性依存的評価は、ＣＤ３３－２（配列番号１６５）が、８８％の平均オンターゲットインデル頻度を有し、０．２％より高いインデル頻度を有するオフターゲット部位を有しないことを示した。対照的に、９０％を超える高い平均オンターゲットインデル頻度を有する他のＣＤ３３ ｇＲＮＡ（例えば、ＣＤ３３－５、ＣＤ３３－８及びＣＤ３３－１０）は、＞１％の複数のオフターゲットインデルを生成し、優先順位が下げられた。分析は、次世代シークエンシングと合わせたハイブリッドキャプチャにより履行され、表１２に列挙される１０種のガイドの各々で編集されたＴ細胞遺伝子を起点とした。編集された細胞の２つの細胞集団は、２つの異なるドナーＴ細胞（１及び２と呼ばれる）から作製され、このアッセイのために使用された。オフターゲットデータは、さらなる分析のための特定のＣＤ３３ ｇＲＮＡ（ＣＤ３３－２）の選択を導いた。
Figure 0007553440000054
Ｔ細胞におけるオンターゲットインデルプロファイルの分析。
オフターゲット編集を定量化するために使用されるデータは、表１２に列挙される全てのＣＤ３３ガイドに関して最も多いオンターゲットインデルを定量化し、要約するためにも使用された。このデータは、２種のドナー（１及び２と呼ばれる）における次世代シークエンシングと合わせたＣＤ３３座位のハイブリッドキャプチャから作成された。
遺伝子編集に続いて、ＣＤ３３- Ｔ細胞を生成するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集後のＴ細胞の集団におけるＣＤ３３座位のハイブリッドキャプチャ分析は、特定のインデル頻度をもたらし、ＣＤ３３座位で編集された遺伝子配列をもたらす（表１３～２２；ダッシュが欠失及び太字が挿入）。
ハイブリッドキャプチャデータから個々の配列を定量化するために、切断部位の２０ｂｐ上流及び下流のＣＤ３３オンターゲット部位にわたって整列する配列リードが、インデル配列定量化のために選択され、検討された。選択されたリードから、各推定上の切断部位の１０ｂｐ上流及び下流以内にある配列（ＰＡＭの約３ｂｐ上流（Ｊｉｎｅｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２）は、オンターゲット非相同末端連結（ＮＨＥＪ）編集の代表的な領域として定量化された。これらのオンターゲット遺伝子編集された配列のデータは、下の表において提示され、これらの配列の頻度は、各切断部位の２０ｂｐ上流及び下流以内のオンターゲット部位に及ぶ全ての配列のパーセントを表す。各ガイドのインデルは、表１３～２２におけるオンターゲット参照配列に対して示される。参照配列は、いずれかの方向において１０ｂｐを伴い、ＰＡＭの３’の４ｂｐで終わる切断部位の中央に置かれる。
Figure 0007553440000055
Figure 0007553440000056
Figure 0007553440000057
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Figure 0007553440000062
Figure 0007553440000063
Figure 0007553440000064
Figure 0007553440000065
Figure 0007553440000066
実施例５．ＣＡＲ発現及びＣＤ３３ノックアウトを有するＣＤ４／ＣＤ８細胞集団の安定化
この実施例は、エクスビボでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集を使用して一次ヒトＴ細胞においてＣＤ３３遺伝子を編集する驚くほど有利な効果を記載する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びＡＡＶ６を、上のとおりに使用して（例えば、実施例１～３を参照のこと）、ＣＤ３３を標的化するＣＡＲコンストラクトを使用してＴＲＡＣ座位からの同時の発現を伴ってＴＣＲ、β２Ｍ及びＣＤ３３の発現を欠いたヒトＴ細胞を作製した。
活性化Ｔ細胞はまず、ＴＲＡＣ座位を標的化するｓｇＲＮＡ（配列番号２８）を含有するもの、β２Ｍ座位を標的化するｓｇＲＮＡ（配列番号３０）を含有する第２のもの及びＣＤ３３を標的化するｓｇＲＮＡ（ＣＤ３３－１０：配列番号１５１）を含有する第３のものである３種の異なるＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体により電気穿孔された。ＴＲＡＣ座位でのＤＮＡ二重鎖切断は、ＡＡＶ６で送達されるＤＮＡ鋳型（例えば、配列番号４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、１０９、１１２、１１５、又は１１８）（配列番号１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１４、１１７、１２０のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３３ ＣＡＲをコードする）による相同組換え修復によって修復された。抗ＣＤ３３ ＣＡＲコンストラクトは、キメラ抗原受容体カセット（遺伝子発現のための－／＋調節エレメント）に隣接したＴＲＡＣ座位に対応する右及び左相同性アームで構成された。得られた改変Ｔ細胞は、３Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ３３－）、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞である。３Ｘ ＫＯ抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、上記のとおりに作製された２Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－）、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞に対して比較された。
抗ＣＤ３３ ＣＡＲ発現及びＣＤ４／ＣＤ８細胞集団は、実施例２において記載されるとおりに評価された。
実施例１において記載されるとおり、ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＣＡＲ＋（２Ｘ ＫＯ、ＣＡＲ＋）編集されたＴ細胞は、ＣＡＲ＋であった細胞の経時的なパーセンテージの増加を実証した（図２Ｂ）。ＣＤ３３をノックアウトすることがＣＡＲ＋ Ｔ細胞集団を安定化することになるかどうかを評価するため、Ｔ細胞は、６種の異なるＣＡＲコンストラクト（ＣＴＸ－９８１、ＣＴＸ－９８１ｂ、ＣＴＸ－９８２、ＣＴＸ－９８２ｂ、ＣＴＸ－９７０、ＣＴＸ－９６５ｂ）で編集され、ＣＡＲ発現を安定化するＣＤ３３ ＫＯの能力について評価された。図１０は、ＣＡＲ発現に関して陽性である細胞のパーセンテージが、２Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－）及び抗ＣＤ３３ ＣＡＲで編集されたＴ細胞について７～１４日の間に増加した。しかしながら、３Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ３３－）及び抗ＣＤ３３ ＣＡＲで編集されたＴ細胞に関して、ＣＡＲ発現細胞のパーセンテージにおけるそのような増加は、７～１４日の間に観察されなかった。
試験は、３種の異なる一次Ｔ細胞ドナーから作製された抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞で繰り返された。２Ｘ ＫＯ、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞（ＣＴＸ－９６５ｂ、ＣＴＸ－９７０及びＣＴＸ－９８２ｂ）は、３Ｘ ＫＯ、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ３３－／ＣＡＲ＋）Ｔ細胞において観察されなかった７日～１４日の間にＣＡＲ＋である細胞の比率において増加を再び示した（図１１）。代わりに、３ＫＯ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞は、７日目及び１４日目に同様のレベルのＣＡＲ発現細胞を維持した。
これらの結果は、抗ＣＤ３３ ＣＡＲを発現するように編集されたＴ細胞においてＣＤ３３遺伝子をノックアウトすることが、ＣＡＲ＋である編集された細胞の部分の拡大を妨げることを実証している。編集されたＴ細胞集団におけるＣＡＲ発現細胞のこの安定化は、再現性のあるＣＡＲ Ｔ細胞製品の作製を可能にする。
ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の比率はＣＤ３３ノックアウトで安定化される。
以前に、２Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－）及び抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋になるように編集されたＴ細胞は、７～１４日の間にＣＤ４＋ Ｔ細胞の比率の減少及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の比率の増加を示した（図２Ｃ）。ＣＤ４及びＣＤ８細胞の比に対する経時的なＣＤ３３ノックアウトの効果を判定するため、３Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ３３－）、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞が、７日目及び１４日目にフローサイトメトリーによって評価された。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の比率は、異なるＣＡＲコンストラクト（ＣＴＸ－９８１、ＣＴＸ－９８１ｂ、ＣＴＸ－９８２、ＣＴＸ－９８２ｂ、ＣＴＸ－９７０、ＣＴＸ－９６５ｂ）で編集された細胞について決定された。同じ測定が、２Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－）及び抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋になるように編集されたＴ細胞について実施された。ＣＤ４＋ Ｔ細胞の増加及びＣＤ８＋細胞の減少は、７～１４日の間に２Ｘ ＫＯ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞について再び観察されたが、そのような変化は、３Ｘ ＫＯ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞については観察されなかった（図１２）。特に、ＣＴＸ－９８２ｂ、ＣＴＸ－９７０、又はＣＴＸ－９６５ｂ ＣＡＲコンストラクトで編集された３Ｘ ＫＯ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞は、ＣＤ４＋であり、且つＣＤ８＋であった細胞の比率において変化をほとんど示さなかった。これらのデータは、ＣＤ３３をノックアウトすることが、編集されたＴ細胞集団においてＣＤ４＋ Ｔ細胞とＣＤ８＋ Ｔ細胞の比を経時的に安定化することを実証している。
３Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ３３－）、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞による標的細胞の死滅及びサイトカイン分泌
癌細胞を死滅させる２Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－）ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の能力は、上の実施例２において記載されるとおりに評価された。同様に、ＣＤ３３＋腫瘍細胞を消失させる３Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＣＤ３３－）ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の能力が判定された。これは、上記のとおりになされ、ＣＡＲ＋ Ｔ細胞は、ＣＤ３３発現ＡＭＬ細胞株ＭＶ４－１１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－９５９１）と共培養された。２Ｘ ＫＯ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞及び３Ｘ ＫＯ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の直接的な比較が実施された。それぞれの場合において、Ｔ細胞は２種の異なるヒトドナーから作製され、ＣＡＲコンストラクトＣＴＸ－９６５ｂ、ＣＴＸ－９７０又はＣＴＸ－９８２で編集された。Ｔ細胞は、０．０５：１～１：１のＣＡＲ Ｔ細胞と標的細胞の比でＭＶ４－１１細胞とともにインキュベートされ、ＭＶ４－１１細胞間の細胞溶解のパーセンテージは、上記のとおりに決定された。２Ｘ ＫＯ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞及び３Ｘ ＫＯ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の両方が、低いＣＡＲ Ｔ細胞：標的細胞比でさえＭＶ４－１１細胞の効率的な死滅を実証した（図１３）。この結果は、異なるドナーから作製されたＴ細胞に関して一致した。ドナーにかかわらず、２Ｘ ＫＯ及び３Ｘ ＫＯ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の両方は、１：１比で播種されたときにほぼ完全な標的細胞の死滅を達成した。
標的細胞の存在下でサイトカイン分泌を誘導するＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞（例えば：ＣＴＸ－９６５ｂ ＣＡＲ Ｔ細胞及びＣＴＸ－９７０ ＣＡＲ Ｔ細胞）の機能的な能力は、実施例２において記載される手順に従って評価された。サイトカイン放出を測定するため、３Ｘ ＫＯ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞は、０．０５：１～１：１の範囲の抗ＣＤ３３ ＣＡＲ－ＴとＭＶ４１１の比でＣＤ３３発現ＭＶ４－１１標的細胞とともに２４時間共培養された。上清培地が回収され、上清中に存在するサイトカイン（例えば、ＩＦＮγ及びＩＬ－２）が、製造業者の指示書（ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に従ってＩＦＮγ又はＩＬ－２ ＥＬＩＳＡアッセイ（ＲＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して定量化された。３Ｘ ＫＯ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞によるサイトカイン産生は、２Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－）、ＣＡＲ＋ Ｔ細胞及び対照Ｔ細胞（例えば、ＴＲＡＣ＋ Ｔ細胞及びＴＲＡＣ－／β２Ｍ－ Ｔ細胞）によるサイトカイン産生と比較された。ＩＦＮγ産生の定量化は、３Ｘ ＫＯ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞が、対照Ｔ細胞と比較して高いレベルのＩＦＮγを誘導し、且つ試験された各ＣＡＲコンストラクトに関して２Ｘ ＫＯ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞に対して同等のレベルのＩＦＮγ産生を誘導することを示した（図１４）。したがって、ＣＤ３３ノックアウトは、ＩＦＮγを分泌するＣＡＲ＋ Ｔ細胞の能力を変えるようには見えなかった。同様に、標的細胞刺激に応答してＩＬ－２を産生するＣＡＲ＋ Ｔ細胞の能力が評価された。ＩＬ－２産生のレベルは、Ｔ細胞を作製するために使用されるＣＡＲコンストラクトに依存した。ＣＴＸ－９６５ｂ ＣＡＲで作製された抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞は、対照Ｔ細胞に対して高いレベルのＩＬ－２を産生したが、ＣＴＸ－９７０又はＣＴＸ－９８２ｂ ＣＡＲコンストラクトを使用して作製されたものは、対照Ｔ細胞よりほんのわずかに高いレベルのＩＬ－２を産生した（図１５）。ＣＴＸ－９７０又はＣＴＸ－９８２ｂ ＣＡＲコンストラクトで作製されたＴ細胞について観察された低いＩＬ－２産生は、２Ｘ ＫＯ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞及び３Ｘ ＫＯ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の両方について観察されたが、これはＣＤ３３ノックアウトがＩＬ－２産生をレスキューしなかったことを示している。しかしながら、ＣＴＸ－９６５ｂ ＣＡＲで作製されたＴ細胞に関して、３Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－／ＣＤ３３－）を有したＴ細胞は、２Ｘ ＫＯ（ＴＲＡＣ－／β２Ｍ－）のみを有したＴ細胞より高いレベルのＩＬ－２を産生した。
実施例６．抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の選択性。
この実施例は、ＣＤ３３欠損癌細胞株の作製及びＣＤ３３発現標的細胞の選択的な死滅を達成する遺伝子編集されたＣＡＲ＋ Ｔ細胞の能力を評価するためのこの細胞株の使用を記載する。
ＣＤ３３ ＫＯ ＭＶ４－１１ ＡＭＬ細胞株の作製
ＣＤ３３欠損癌細胞株を作製するため、ＭＶ４－１１細胞は、Ｃａｓ９：ＣＤ３３を標的化するｓｇＲＮＡ（ＣＤ３３－１０；配列番号１５１）で電気穿孔された。細胞は、ウェル当たり約１細胞で蒔かれ、３週間増殖させられた。次に、いくつかのクローン株は、フローサイトメトリー及び抗ＣＤ３３抗体（ＰＥ－抗ヒトＣＤ３３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ カタログ＃３６６６０８）を使用してＣＤ３３表面発現について試験され、野生型ＭＶ４－１１（ＷＴ ＭＶ４－１１）は高いレベルの表面ＣＤ３３を有したが、１つの特定のクローン株は、バックグラウンドを超えるＣＤ３３染色を示さなかった。次に、このクローン株（ＣＤ３３ ＫＯ ＭＶ４－１１細胞と呼ばれる）を使用して、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞によるＣＤ３３選択的死滅を評価した。
抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞による選択的な死滅は、ＷＴ ＭＶ４－１１又はＣＤ３３ ＫＯ ＭＶ４－１１の存在下での標的細胞溶解及びサイトカイン産生を測定することによって評価された。選択的であると定義されたＣＡＲ＋ Ｔ細胞は、ＣＤ３３発現ＷＴ ＭＶ４－１１細胞の存在下で細胞溶解及びサイトカイン産生を誘導したが、ＣＤ３３ ＫＯ ＭＶ４－１１の存在下で応答を呈しなかったものであった。この結果は、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞が、細胞の死滅を媒介するために標的細胞の表面上のＣＤ３３抗原の認識を必要とすることを示している。選択的死滅は、実施例２において記載されるとおりに標的細胞溶解及びＣＡＲ＋ Ｔ細胞サイトカイン産生を測定することによって評価された。選択性は、３種の異なるＣＡＲコンストラクト（ＣＴＸ－９６５ｂ、ＣＴＸ－９７０、及びＣＴＸ－９８２ｂ）で作製されたＣＡＲ＋ Ｔ細胞並びに２Ｘ ＫＯ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞及び３Ｘ ＫＯ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の両方について測定された。したがって、６種のＣＡＲ＋ Ｔ細胞が、１：１のＣＡＲ＋ Ｔ細胞：標的細胞比でＷＴ ＭＶ４－１１又はＣＤ３３ ＫＯ ＭＶ４－１１細胞のいずれかとともに２４時間共培養されたときの選択的な標的細胞溶解及びサイトカイン産生について評価された。評価されたＣＡＲ＋ Ｔ細胞は、以下のとおりである：
Figure 0007553440000067
２Ｘ ＫＯ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞及び３Ｘ ＫＯ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の両方が、ＷＴ ＭＶ４－１１標的細胞のほぼ完全な死滅を達成した（図１６、左パネル）。対照的に、ＷＴ ＭＶ４－１１の死滅は、対照群（例えば、ＭＶ４－１１単独又はＲＮＰ Ｔ細胞、ＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－ Ｔ細胞、若しくはＴＲＡＣ－／Ｂ２Ｍ－／ＣＤ３３－ Ｔ細胞を伴わずに共培養されたＭＶ４－１１）に関しては見られなかった。ＣＤ３３ ＫＯ ＭＶ４－１１細胞を死滅させるＣＡＲ＋ Ｔ細胞の能力もまた評価された。ＣＴＸ－９６５ｂ ＣＡＲ又はＣＴＸ－９７０ ＣＡＲにより作製されたＣＡＲ＋ Ｔ細胞は、対照群と比較して無視できるレベル～低レベルの細胞の死滅を誘導した（図１６、右パネル）。これは、２Ｘ ＫＯ ＣＡＲ＋及び３Ｘ ＫＯ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の両方に当てはまった。対照的に、ＣＴＸ－９８２ｂ ＣＡＲにより作製された２Ｘ ＫＯ ＣＡＲ＋及び３Ｘ ＫＯ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の両方が、６０％より高いレベルでＣＤ３３ ＫＯ ＭＶ４－１１細胞の死滅を誘導した。合わせると、これらの結果は、ＣＴＸ－９６５ｂ又はＣＴＸ－９７０ ＣＡＲにより作製された２Ｘ ＫＯ又は３Ｘ ＫＯ抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞が、ＣＤ３３発現標的細胞を死滅させるのに選択的であるが、ＣＡＲ－９８２ｂにより作製されたＴ細胞は、非選択的であり、且つＣＤ３３発現において欠損のある細胞（すなわち、オフターゲット細胞）の望ましくない死滅を誘導することを示す。
ＣＴＸ－９６５ｂ ＣＡＲ又はＣＴＸ－９７０ ＣＡＲを発現するＣＡＲ＋ Ｔ細胞による選択的な死滅が、癌細胞に対するＣＡＲ＋ Ｔ細胞の高い比で維持されるかどうかを判定するため、様々な比が評価された。ＣＡＲ＋ Ｔ細胞は、０．２５：１～２：１の範囲の比でＣＤ３３ ＫＯ ＭＶ４－１１細胞とともに共培養された。ＣＴＸ－９６５ ＣＡＲ又はＣＴＸ－９７０ ＣＡＲにより作製されたＣＡＲ＋ Ｔ細胞が、試験された最も高い比でさえ低いレベル又は無視できるレベルの細胞溶解を示した一方で、ＣＴＸ－９８２ｂ ＣＡＲにより作製されたＣＡＲ＋ Ｔ細胞は、試験された全ての比で高いレベルの細胞の死滅を誘導した（図１７）。これらの結果は、ＣＴＸ－９６５又はＣＴＸ－９７０ ＣＡＲ Ｔ細胞が、癌細胞に対して高い存在比で培養されたときでさえ選択的であるが、ＣＴＸ－９８２ｂ ＣＡＲ Ｔ細胞は、試験されたいずれの播種比でも選択的ではないことを実証している。
選択性の追加の尺度を提供するために、ＣＤ３３ ＫＯ ＭＶ４－１１細胞の存在下でのＣＡＲ＋ Ｔ細胞によるサイトカイン産生が評価された。ＣＡＲ＋ Ｔ細胞が標的細胞上の抗原の認識時にサイトカインを産生するとすれば、選択的なＣＡＲ＋ Ｔ細胞は、ＣＡＲ特異的抗原を発現する標的細胞が存在するときにサイトカインを専ら産生することが予想される。ＣＴＸ－９６５ ＣＡＲ又はＣＴＸ－９７０ ＣＡＲを有するＣＡＲ＋ Ｔ細胞が、ＣＤ３３発現標的細胞の溶解を誘導するのに選択的であったとすれば（図１６）、同様に、それらはＣＤ３３欠損細胞の存在下ではなくＣＤ３３発現標的細胞の存在下でサイトカインを専ら産生することになると予想された。これがその場合であったかどうかを判定するため、ＣＡＲ＋ Ｔ細胞は、ＣＤ３３ ＫＯ ＭＶ４－１１細胞と共培養され、上清中のＩＬ－２及びＩＦＮγが、実施例２において記載されるとおりにＥＬＩＳＡによって測定された。興味深いことに、ＣＤ３３ ＫＯ ＭＶ４－１１細胞と共培養したとき、いずれのＣＡＲ＋ Ｔ細胞もＩＬ－２を産生しなかった（図１８、左パネル）。これは、上記のとおりに非選択的キラーとして同定されたＣＴＸ－９８２ｂ ＣＡＲ Ｔ細胞に関してさえ当てはまった。しかしながら、ＣＴＸ－９８２ｂ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＤ３３ ＫＯ ＭＶ４－１１細胞とインキュベートしたときに有意なレベルのＩＦＮγを誘導した（図１８、右パネル）。これは、ＣＴＸ－９８２ｂ ＣＡＲにより作製された２Ｘ ＫＯ ＣＡＲ＋及び３Ｘ ＫＯ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の両方に当てはまった。対照的に、ＣＴＸ－９６５又はＣＴＸ－９７０ ＣＡＲにより作製された２Ｘ ＫＯ ＣＡＲ＋及び３Ｘ ＫＯ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞は、ＣＤ３３ ＫＯ ＭＶ４－１１細胞とインキュベートされたときにＩＦＮγを誘導しなかった。ＣＤ３３欠損細胞の存在下でのＩＦＮγ産生のこれらの相違は、ＣＴＸ－９８２ｂ ＣＡＲにより作製されたＣＡＲ＋ Ｔ細胞が非選択的である一方で、ＣＴＸ－９６５又はＣＴＸ－９７０ ＣＡＲにより作製されたＣＡＲ＋ Ｔ細胞は、ＣＤ３３発現標的細胞又は癌細胞の存在下でのみ選択的な活性化及び死滅を達成できるという結論を実証している。
実施例７．インビボでの抗ＣＤ３３ ＣＡＲ Ｔ細胞の効果。
この実施例は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の動物モデル（ＭＶ－４－１１ ＮＳＧモデル）における抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の治療効果を評価するために実施された試験を記載する。
ＭＶ－４－１１ヒトＡＭＬ由来細胞株は、インビボイメージング試験のためにルシフェラーゼ及びｍＣｈｅｒｒｙ（ＭＶ－４－１１－Ｌｕｃ－ｍＣｈ－Ｐｕｒｏ）遺伝子の両方を発現するように作製された。生物発光イメージング（ＢＬＩ）は、腫瘍量に相関し、したがって、ＢＬＩは、腫瘍量を評価するために定量化された。ＢＬＩを測定するため、ＩＶＩＳ Ｓ５ Ｌｕｍｉｎａ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用してルシフェラーゼを測定する前にマウスにルシフェリンを注射した。０日目において、ＭＶ－４－１１－Ｌｕｃ－ｍＣｈ－Ｐｕｒｏ細胞を、５～６週齢雌ＮＳＧマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（２×１０6細胞／マウス）に注射した。抗ＣＤ３３ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＴＸ－９６５ｂ）は、ＭＶ－４－１１ ＮＳＧモデルにおいて３種の用量（１．５×１０6細胞／マウス、３．０×１０6細胞／マウス、及び６．０×１０6細胞／マウス）で試験された。抗ＣＤ３３ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＴＸ－９６５ｂ）は、５日目にマウスに注射された。臨床所見及び体重測定は、２～４日毎に実施され、ＢＬＩは、週に１回測定された。
３種全ての用量は、未治療のマウスに対して腫瘍量を減少させ（図１９Ａ）、腫瘍成長の開始を遅らせ、且つマウスの生存の増加をもたらした（図１９Ｂ及び表２３）。
Figure 0007553440000068
追加の試験を実施して、ＡＭＬのＭＶ－４－１１ ＮＳＧマウスモデルにおいてＣＤ３３遺伝子（ガイドＣＤ３３－２）のノックアウトを有するか又は有しない抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の治療効果を評価した。これらの試験において、マウスに、３×１０6細胞／マウスの用量でＣＤ３３遺伝子のノックアウトを有するか若しくは有しないＣＴＸ－９６５ｂ又はＣＴＸ－９７０を注射した。各治療群におけるマウスは、未治療の対照群におけるマウスと比較して生存の増加を示した（図１９Ｃ～１９Ｄ及び表２４）。
Figure 0007553440000069
ＣＤ３３ノックアウトを有するか又は有しないＣＴＸ－９６５ｂ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞は、ＣＴＸ－９７０群のものと比較して、ＣＴＸ－９６５ｂ群に関して３３日目に検出されたより低い発光測定値によって示されるとおり、腫瘍量制御の点でより効果的であるように見えた（図１９Ｅ及び表２５）。
Figure 0007553440000070
まとめると、これらの結果は、抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞が、ＡＭＬのマウスモデルにおいて治療効果を有することを実証している。そのような治療効果は、ＣＤ３３遺伝子のノックアウトを有するか又は有しない抗ＣＤ３３ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞によってもたらされた。
均等物
本明細書で開示される全ての参考文献、特許及び特許出願は、それぞれが引用されている主題に関して参照により組み込まれており、場合によっては文書の全体を包含する場合がある。
本明細書及び特許請求の範囲において使用される不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、反対に明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解されるべきである。
また、反対に明確に示されない限り、２つ以上の工程又は行為を含む本明細書で請求される任意の方法において、方法の工程又は行為の順序は、必ずしも方法の工程又は行為が列挙される順序に限定されないことが理解されるべきである。
特許請求の範囲及び上記明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「保有する」、「有する」、「含有する」、「関与する」、「保持する」、「構成する」などの全ての移行句は、オープンエンド、すなわち、以下を含むがこれらに限定されないことを意味するものと理解される。「からなる」及び「本質的にからなる」という移行句のみが、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ２１１１．０３に規定されるとおり、それぞれクローズド又はセミクローズド移行句となるものとする。
数値に先行する「約」及び「実質的に」という用語は、列挙された数値の±１０％を意味する。
値の範囲が提供される場合、範囲の上限と下限の間の各値は、本明細書において具体的に企図され、記載される。

Claims (24)

  1. 操作されたＴ細胞の集団であって、前記操作されたＴ細胞が、
    （ｉ）抗ＣＤ３３抗原結合断片を含む外部ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸；及び
    （ｉｉ）破壊されたＴ細胞受容体アルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子、破壊されたベータ－２－ミクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子、又はこれらの組み合わせ、
    を含み、そして、
    前記ＣＡＲが、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む、操作されたＴ細胞の集団。
  2. 前記操作されたＴ細胞が、前記ＣＡＲをコードする前記核酸が挿入されている前記破壊されたＴＲＡＣを含む、請求項１に記載の操作されたＴ細胞の集団。
  3. 前記抗ＣＤ３３抗原結合断片が、抗ＣＤ３３一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項１又は２に記載の操作されたＴ細胞の集団。
  4. 前記抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖが、参照抗体と同じ重鎖可変ドメイン（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）及び同じ軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲを含み、前記参照抗体が、
    （ｉ）配列番号６５に記載されるＶＨ及び配列番号６６に記載されるＶＬ、
    （ｉｉ）配列番号７７に記載されるＶＨ及び配列番号７８に記載されるＶＬ、又は
    （ｉｉｉ）配列番号８９に記載されるＶＨ及び配列番号９０に記載されるＶＬ
    を含む、請求項３に記載の操作されたＴ細胞の集団。
  5. 前記抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖが、前記参照抗体と同じＶＨ及びＶＬ鎖を含む、請求項３又は４に記載の操作されたＴ細胞の集団。
  6. 前記抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖが、配列番号７３、７５、８５、８７、９７、及び９９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の操作されたＴ細胞の集団。
  7. 前記ＣＡＲがさらに、
    （ｉ）ＣＤ２８共刺激ドメイン又は４１ＢＢ共刺激ドメイン；及び
    （ｉｉ）ＣＤ３ζ細胞質内シグナル伝達ドメイン
    を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞の集団。
  8. 前記ＣＡＲが、ＣＤ８膜貫通ドメインをさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞の集団。
  9. 前記ＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、１０９、１１２、１１５、及び１１８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞の集団。
  10. 前記破壊されたβ２Ｍ遺伝子が、配列番号９～１４のいずれか１つから選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞の集団。
  11. 前記Ｔ細胞が、野生型ＣＤ３３遺伝子を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞の集団。
  12. 前記Ｔ細胞がさらに、破壊されたＣＤ３３遺伝子を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞の集団。
  13. 前記操作されたＴ細胞が、（ｉ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＡＲをコードする核酸、（ｉｉ）破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、及び（ｉｉｉ）破壊されたβ２Ｍ遺伝子を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞の集団。
  14. 前記ＣＡＲをコードする核酸が、配列番号５６のヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の操作されたＴ細胞の集団。
  15. 前記破壊されたＴＲＡＣ遺伝子が、配列番号５５のヌクレオチド配列を含む、請求項１４に記載の操作されたＴ細胞の集団。
  16. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞の集団であって、
    （ａ）前記集団のうちの少なくとも５０％の操作されたＴ細胞が、検出可能なレベルのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）タンパク質を発現しないか、
    （ｂ）前記集団のうちの少なくとも５０％の操作されたＴ細胞が、検出可能なレベルのβ２Ｍタンパク質を発現しないか、
    （ｃ）前記集団のうちの少なくとも７０％の操作されたＴ細胞が、ＣＡＲを発現するか、又は
    （ｄ）前記（ａ）～（ｃ）のいずれか１つの組み合わせである、操作されたＴ細胞の集団。
  17. 前記集団のうちの少なくとも５０％の操作されたＴ細胞が、検出可能なレベルのＣＤ３３タンパク質を発現しない、請求項１～１６のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞の集団。
  18. 対象における癌の治療に使用するための、請求項１～１７のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞の集団。
  19. 前記対象が、白血病を有するヒト患者である、請求項１８に記載の操作されたＴ細胞の集団。
  20. 前記白血病が、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）又は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である、請求項１９に記載の操作されたＴ細胞の集団。
  21. 請求項１～１７のいずれか一項に記載の操作されたＴ細胞の単離された集団を生成するための方法であって、
    （ａ）単離されたＴ細胞に
    （ｉ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、
    （ｉｉ）ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、β２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、又はこれらの組み合わせ、及び
    （ｉｉｉ）ＣＤ３３に特異的に結合する前記ＣＡＲをコードする核酸を含むドナー鋳型を含むベクター、ここで、前記ＣＡＲが、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む、
    を送達すること；並びに
    （ｂ）操作されたＴ細胞の単離された集団を生成すること
    を含む方法。
  22. 前記ＴＲＡＣ遺伝子を標的化する前記ｇＲＮＡが、配列番号１８又は配列番号１９のヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号４０のヌクレオチド配列を標的化し、そして／あるいは
    前記β２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡが、配列番号２０又は配列番号２１のヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号４１のヌクレオチド配列を標的化する、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記ＣＡＲをコードする前記核酸が、前記ＴＲＡＣ遺伝子に対する左及び右の相同性アームと隣接する、請求項２１又は２２に記載の方法。
  24. 前記ドナー鋳型が、配列番号５５のヌクレオチド配列を含む、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
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