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CN107746831A - 具有化疗药物抗性的通用型cart/tcrt细胞及其构建方法 - Google Patents

具有化疗药物抗性的通用型cart/tcrt细胞及其构建方法 Download PDF

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CN107746831A
CN107746831A CN201711082910.9A CN201711082910A CN107746831A CN 107746831 A CN107746831 A CN 107746831A CN 201711082910 A CN201711082910 A CN 201711082910A CN 107746831 A CN107746831 A CN 107746831A
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Abstract

本发明属于基因工程与合成生物学领域，具体涉及一种具有化疗药物抗性的通用型CART/TCRT细胞及其构建方法，所述通用型CART/TCRT细胞是具有嵌合抗原受体和T细胞受体的异体T细胞，所述T细胞受体α、β链和脱氧胞苷激酶分子被敲除；所述T细胞受体α、β链和脱氧胞苷激酶分子的敲除技术为CRISPR技术；所述通用型CART/TCRT细胞既保留了肿瘤特异抗原的靶向性，又排除了GvHD和排斥的问题，并减弱对化疗药物Fludarabine和Clofarabine的敏感度，可以作为一种通用型的简易，低成本，高活性CART/TCRT细胞制剂使用。

Description

具有化疗药物抗性的通用型CART/TCRT细胞及其构建方法
技术领域
本发明属于基因工程与合成生物学领域，具体涉及一种具有化疗药物抗性的通用型CART/TCRT细胞及其构建方法。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞(CART)是目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一，其基本原理主要是提取患者自身的T细胞，并通过基因和细胞工程手段使其表达特异性嵌合抗原受体，使之能够识别和结合肿瘤细胞表面抗原，从而起到靶向杀伤肿瘤细胞的作用。CAR-T在白血病和淋巴瘤治疗中取得显著的疗效，2017年8月30日，美国食品卫生安全委员会FDA宣布批准诺华CAR-T细胞疗法正式上市，用于治疗复发性或难治性儿童、青少年B-细胞急性淋巴细胞白血病(rALL)，其商品名为Kymriah(tisagenlecleucel)。急性淋巴细胞白血病在15岁以下儿童癌症确诊病例中约占25％，是美国最常见的儿童癌，在我国急性淋巴细胞性白血病占儿童急性白血病的80％，发病率为十万分之一。也可发生于成年人，占所有成年人白血病发病率的20％。
根据美国国家癌症研究所估计，每年约有3100名年龄在20岁以下的患者被诊断为这一疾病，由于我国庞大的人口基数，每年有约10000名儿童和青年罹患急性白血病。有效的治疗选择十分有限，在多次复发或难治性B-细胞急性淋巴细胞白血病儿童及青少年患者中，五年无病生存率低于10％-30％。Kymriah的安全性和有效性在多中心临床试验中得到证实，治疗三个月内的总体缓解率为83％，显示了其卓越的疗效。
除了B细胞急性淋巴细胞白血病，CAR-T在复发或难治性慢性淋巴细胞白血病(rCLL)、复发性或难治性多发性骨髓瘤(rNHL)、和非霍奇金淋巴瘤(NHL)的治疗中也取得了显著的疗效。在一项治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、转化滤泡性淋巴瘤(TFL)、以及原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBCL)这三种非霍奇金淋巴瘤，名为ZUMA-1的2期临床试验中，Kite的CAR-T疗法在客观缓解率(objective response rate)上达到了主要临床终点。在接受单次axicabtagene ciloleucel的输注后，有高达82％的患者出现了缓解。在中位数为8.7个月的随访中，有44％的患者依旧处于缓解期，且有39％的患者处于完全缓解。在BluebirdBio公司进行的一项名为b2121的治疗多发性骨髓瘤的实验中，两个剂量组中100％的患者(n＝6)实现了客观反应；两个患者呈MRD阴性；总体反应率(ORR)为78％。6和4个月随访时，两个患者达到严格意义的完全反应(CR)。
除了CART外，T细胞受体(TCR)T细胞疗法也取得了长足的进展。TCRT细胞技术最早来源于肿瘤浸润T细胞(TIL)，这类T细胞通常会“侵入”癌组织，这说明他们对癌细胞有一定的识别能力。事实发现TIL对癌细胞相关抗原(Tumor Associated Antigen,TAA)具有特异性识别能力。这类抗原包括CEA，Her-2，CD19，gp100,MART-1,MAGA-A3,NY-ESO-1,等等。这些TAA在不同的癌症中都有相对特殊性的表达，因而也成为免疫系统的攻击对象。尽管如此，这些天然TIL的识别能力通常较弱，因此不能形成对癌细胞的有利攻击。在这种情况下，可以通过外源导入TIL的特异TCR对T细胞进行定向修饰以达到攻击肿瘤的目的。2016年《自然-医学》杂志报道了数例令人振奋的TCR治疗案例，这项临床试验是由美国马里兰大学医学院，宾州大学医学院和免疫治疗公司Adaptimmune联合研发的一款名为“基因修改的TCR”的免疫治疗手段。在修改了几个关键氨基酸以后，这些基因修改的TCR大大提高了和一种常见的癌症TAA，NY-ESO-1的亲和力，进而显著提高了对NY-ESO-1过量表达的癌症，比如多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma)的治疗效果。在这次临床试验中，80％的多发性骨髓瘤患者产生了良好的临床应答，其中70％的患者达到完全或接近完全应答，平均无进展生存期达到了19个月。目前对于NY-ESO-1过量表达的其它癌症的治疗正在陆续开展。
但是由于CART/TCRT是一种高度个性化的方法，每个人的细胞和接受过的治疗都不同，许多患者在接受CART/TCRT治疗前已经接受过各种治疗方法，如骨髓移植手术、化疗、靶向治疗等，所获得的T细胞的制备和编程也会各异。这种个体化治疗方式耗费了大量的人力物力，所以价格高昂。诺华的Kymriah作为第一个FDA批准的CART细胞治疗产品，其定价为47.5万美金，这样高额的治疗费用，会使得一些病人家庭难以承受，同时也大大限制了其市场应用。
目前包括诺华、Kite制药、Juno在内的CART/TCRT第一梯队均采用的是自体移植方法制备CART/TCRT细胞，使用异体T细胞准备CART/TCRT细胞进行治疗提供了另一种思路，但是由于供体T细胞对宿主的移植物抗宿主反应(GvHD)以及宿主免疫系统对异体T细胞的排斥清除，极大地限制了其应用。
通过基因编辑的方式敲除CART细胞表面的TCR可以消除由于异体T细胞对宿主的识别而造成的GvHD，在一定程度上被用来制备通用型CART细胞。目前常用的基因编辑工具主要有TALEN和CRISPR。
TAL效应因子(TAL effector,TALE)最早在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonassp.)对植物的侵袭感染研究中被发现。由于TALE具有DNA序列的特异性结合能力，后续研究通过工程学手段将FokI DNA核酸酶与人工TALE连接起来，形成了一类具有特异性基因组编辑功能的强大工具，即TALEN。
典型的TALEN由核定位序列(Nuclear localization signal,NLS)的N端结构域、可识别特定DNA序列的串联TALE重复序列的中央结构域，具有FokI核酸内切酶功能的C端结构域组成。近年来，TALEN已广泛应用于酵母、动植物细胞，以及拟南芥、果蝇、斑马鱼及小鼠等各类模式生物的研究。
由于将单个的TALEN模块进行组装需要大量的分子克隆和测序操作，十分繁琐，而且因为TALEN的构建需要根据目标DNA序列进行繁琐和复杂的蛋白质工程设计和优化，这样就大大延长了构建TALEN元件的实验周期。同时而且由于TALEN的敲除效率受DNA序列影响较大，并且将许多这些蛋白质递送到用于同时多重遗传操作的细胞中是非常具有挑战性，因此极大得限制其应用。
除了上述技术难点，由于TALEN对DNA的剪切需要两个FokI切割结构域形成二聚体，并且需要至少一个识别结构域结合靶向DNA。DNA识别结构域虽然具有较强的序列特异性，但是由于TALEN的剪切过程并不完全依赖同源二聚体的形成，所以一旦形成异源二聚体，就很可能造成脱靶效应，并最终可能导致DNA的错配和序列改变，产生较强的细胞毒性。当这些不良影响积累过多，超过细胞修复机制承受的范围时，便会引起细胞的凋亡。以上诸多限制导致TALEN难以推广应用。
CRISPR/Cas系统作为一种最新的基因组编辑工具，能够完成RNA导向的特异DNA识别及编辑。CRISPR/Cas技术使用一段序列特异性的向导RNA分子(sequence-specificguide RNA)引导核酸内切酶到靶点处，从而完成基因组的编辑。CRISPR/Cas系统的开发为构建更高效的基因定点修饰技术提供了全新的平台。
CRISPR/Cas技术摆脱了合成并组装具有特异性DNA识别能力蛋白模块的繁琐操作，其gRNA的设计和合成工作量远远小于TALEN和ZFN技术的DNA识别模块的构建过程，且毒性远远低于ZFN技术。2013年的《科学》杂志发表了两篇分别来自MIT和哈佛的具有重要意义的CRISPR技术论文，分别独立首次使用CRISPR技术完成了对人类基因组编辑。由于CRISPR系统的简便和高效的特性，其应用得到了极大的推广。除了基因敲除，CRISPR系统被工程化应用到更加广泛的领域，包括基因抑制，基因激活，基因单点修饰，表观遗传修饰，光遗传学领域，CRISPR的使用极大得拓展了生物学的研究范围。
由于CRISPR基因编辑技术的巨大应用前景与可能的商业利益，目前国外以该技术为基础获得巨额风险投资的生物公司主要有Editas Medicine,CRISPR Therapeutics，Intellia Therapeutics等，主要计划开展相关人遗传病如视网膜退行性疾病、遗传性肌肉疾病以及血液疾病等防治领域的探索性研究。
CAR-T细胞(Chimeric antigen receptor-T)作为免疫细胞疗法治疗肿瘤是当前肿瘤免疫疗法热点研究领域之一。PD1(Programmed death 1)作为一种免疫抑制分子，已成为重要肿瘤治疗的有效靶分子，2016年有研究报道使用CRISPR技术敲除CART细胞上的PD1分子，可以显著提高CART细胞对实体瘤的治疗效果。2017年研究报道，利用CRISPR技术，成功构建小鼠TRAC基因定点插入CAR基因的CAR-T细胞，可显著延长修饰小鼠存活时间。
Cellectis公司使用TALEN技术敲除CART细胞内的TCRa和CD52分子，已经应用于临床研究，但是由于他们使用的TALEN编辑的T细胞都产生了严重的染色体位移现象，这对其临床使用造成了极大的成瘤风险，但是由于CRISPR在T细胞内的高度特异性，使用CRISPR编辑的通用型CART细胞进行肿瘤治疗，具有非常大的优势。同时由于TALEN对CART细胞的低效率编辑，会对基因编辑的CART细胞进行纯化造成困难，同时会因为TCR阳性细胞分离不干净而增加GvHD的风险。我们的发明使得CRISPR对CART细胞进行高效编辑，在很大程度上有利于通用型CART细胞的生产。
单独敲除TCRα、β链并不能生成通用型CART细胞，这是因为这种CART细胞依然具有HLA分子在细胞表面表达，从而被受体免疫系统T细胞识别而排斥，难以达到治疗的目的。同时编辑TCRα、β链和抑制分子，诸如PD1，TIM3，CTLA4也不能产生通用型CART细胞。
发明内容
本发明解决现有技术中存在的上述技术问题，提供一种具有化疗药物抗性的通用型CART/TCRT细胞及其构建方法。
为解决上述问题，本发明的技术方案如下：
具有化疗药物抗性的通用型CART/TCRT细胞，所述通用型CART/TCRT细胞是具有嵌合抗原受体和T细胞受体的异体T细胞，所述T细胞受体α、β链和脱氧胞苷激酶分子被敲除。
优选地，所述嵌合抗原受体为靶向CD19，CD20，CD22，CD30，CD33，CD38，CD123，CD138，CD171，MUC1，AFP，Alpha folate receptor，CEA，PSCA，PSMA，Her2，EGFR，IL13Rα2，GD2，NKG2D，EGFRvIII，CS1，BCMA，Mesothelin的嵌合抗原受体。
优选地，所述T细胞受体为靶向HBV，HPV E6，NY-ESO，mNY-ESO，WT1，MART-1，MAGE-A3，MAGE-A4，P53，Thyroglobulin，Tyrosinase的T细胞受体。
具有化疗药物抗性的通用型CART/TCRT细胞的构建方法，利用CRISPR技术在异体T细胞内特异性敲除T细胞表面的T细胞受体α、β链和脱氧胞苷激酶(dCK)分子。
优选地，采用CRISPR技术所使用的sgRNA和crRNA序列如下：
sgRNA-TCRα选自以下序列：
sgRNA-TCRα-1:GAGAATCAAAATCGGTGAAT(SEQ ID NO.1)
sgRNA-TCRα-2:GCTGGTACACGGCAGGGTCA(SEQ ID NO.2)
sgRNA-TCRα-3:GTCAGGGTTCTGGATATCTG(SEQ ID NO.3)
sgRNA-TCRα-4:ACAAAACTGTGCTAGACATG(SEQ ID NO.4)
sgRNA-TCRα-5:CTTCAAGAGCAACAGTGCTG(SEQ ID NO.5)
sgRNA-TCRα-6:TGGAATAATGCTGTTGTTGA(SEQ ID NO.6)
sgRNA-TCRα-7:TAGGCAGACAGACTTGTCAC(SEQ ID NO.7)
sgRNA-TCRα-8:TGGATTTAGAGTCTCTCAGC(SEQ ID NO.8)
sgRNA-TCRα-9:TCTCTCAGCTGGTACACGGC(SEQ ID NO.9)
sgRNA-TCRα-10:AGAGTCTCTCAGCTGGTACA(SEQ ID NO.10)
sgRNA-TCRβ选自以下序列：
sgRNA-TCRβ-1:GAGCAGCCGCCTGAGGGTCT(SEQ ID NO.11)
sgRNA-TCRβ-2:GAGCTGGTGGGTGAATGGGA(SEQ ID NO.12)
sgRNA-TCRβ-3:GCTGTCAAGTCCAGTTCTAC(SEQ ID NO.13)
sgRNA-TCRβ-4:GGCTCTCGGAGAATGACGAG(SEQ ID NO.14)
sgRNA-TCRβ-5:GGAGAATGACGAGTGGACCC(SEQ ID NO.15)
sgRNA-TCRβ-6:GGCGCTGACGATCTGGGTGA(SEQ ID NO.16)
sgRNA-TCRβ-7:GTTGCGGGGGTTCTGCCAGA(SEQ ID NO.17)
sgRNA-TCRβ-8:GCAGTATCTGGAGTCATTGA(SEQ ID NO.18)
sgRNA-TCRβ-9:GGCACACCAGTGTGGCCTTT(SEQ ID NO.19)
sgRNA-TCRβ-10:GGCTCAAACACAGCGACCTC(SEQ ID NO.20)
sgRNA-dCK选自以下序列：
sgRNA-dCK-1:GAACATCGGTAAGGAGCCTC(SEQ ID NO.21)
sgRNA-dCK-2:TTAAACAATTGTGTGAAGAT(SEQ ID NO.22)
sgRNA-dCK-3:ATTGTGTGAAGATTGGGAAG(SEQ ID NO.23)
sgRNA-dCK-4:ATCAAGAAAATCTCCATCGA(SEQ ID NO.24)
sgRNA-dCK-5:GTCTTTCTCAGCCAGCTCTG(SEQ ID NO.25)
sgRNA-dCK-6:TTCCTGAACCTGTTGCCAGA(SEQ ID NO.26)
sgRNA-dCK-7:GTAAGGAGCCTCCGGAAATG(SEQ ID NO.27)
crRNA-TCRα选自以下序列：
crRNA-TCRα-1:GAGTCTCTCAGCTGGTACACGGC(SEQ ID NO.28)
crRNA-TCRα-2:CATGTGCAAACGCCTTCAACAAC(SEQ ID NO.29)
crRNA-TCRα-3:CACATGCAAAGTCAGATTTGTTG(SEQ ID NO.30)
crRNA-TCRα-4:TTGCTCCAGGCCACAGCACTGTT(SEQ ID NO.31)
crRNA-TCRα-5:TCTGTGATATACACATCAGAATC(SEQ ID NO.32)
crRNA-TCRα-6:TGACACATTTGTTTGAGAATCAA(SEQ ID NO.33)
crRNA-TCRα-7:TTTGAGAATCAAAATCGGTGAAT(SEQ ID NO.34)
crRNA-TCRα-8:AGAATCAAAATCGGTGAATAGGC(SEQ ID NO.35)
crRNA-TCRα-9:ATTCTCAAACAAATGTGTCACAA(SEQ ID NO.36)
crRNA-TCRβ选自以下序列：
crRNA-TCRβ-1:GGTGTGGGAGATCTCTGCTTCTG(SEQ ID NO.37)
crRNA-TCRβ-2:CCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGG(SEQ ID NO.38)
crRNA-TCRβ-3:GCCCTATCCTGGGTCCACTCGTC(SEQ ID NO.39)
crRNA-TCRβ-4:AGCCATCAGAAGCAGAGATCTCC(SEQ ID NO.40)
crRNA-dCK-1选自以下序列：
crRNA-dCK-1:AACATTGCACCATCTGGCAACA(SEQ ID NO.41)
crRNA-dCK-2:TCAGCCAGCTCTGAGGGGACCCG(SEQ ID NO.42)
crRNA-dCK-3:AACATTGCACCATCTGGCAACAG(SEQ ID NO.43)
crRNA-dCK-4:TTGATGCGGGTCCCCTCAGAGCT(SEQ ID NO.44)
crRNA-dCK-5:CGGAGGCTCCTTACCGATGTTCC(SEQ ID NO.45)
crRNA-dCK-6:AGGATATTCACAAATGTTGACT(SEQ ID NO.46)
crRNA-dCK-7:TGAATATCCTTAAACAATTGTGTG(SEQ ID NO.47)
优选地，采用CRISPR技术所使用的sgRNA和crRNA序列为：
sgRNA-TCRα:AGAGTCTCTCAGCTGGTACA(SEQ ID NO.10)
sgRNA-TCRβ:GCTGTCAAGTCCAGTTCTAC(SEQ ID NO.13)
sgRNA-dCK:TTCCTGAACCTGTTGCCAGA(SEQ ID NO.26)
crRNA-TCRα:ATTCTCAAACAAATGTGTCACAA(SEQ ID NO.36)
crRNA-TCRβ:AGCCATCAGAAGCAGAGATCTCC(SEQ ID NO.40)
crRNA-dCK:TGAATATCCTTAAACAATTGTGTG(SEQ ID NO.47)。
相对于现有技术，本发明的优点如下，
本发明的具有化疗药物抗性的通用型CART/TCRT细胞实现了TCR和dCK基因进行双敲除，保留了肿瘤特异抗原的靶向性，TCR的敲除消除了GvHD；同时dCK的化疗药物Fludarabine和Clofarabine的使用清除了宿主体内的T细胞，从而防止了异体T细胞被排斥，而dCK分子敲除的异体T细胞因为对Fludarabine和Clofarabine具有抗性可以长时期存活发挥肿瘤杀伤活性；可以作为一种通用型的简易，低成本，高活性CART/TCRT细胞制剂使用。
本发明具有化疗药物抗性的通用型CART/TCRT细胞的构建方法，使用Cas9和Cpf1技术对CART/TCRT细胞里的TCR和dCK基因进行双敲除，产生的双阴性细胞群，TCR阴性细胞达到90％，dCK基因敲除水平达到70％；此细胞群同时失去GvHD活性并减弱对化疗药物Fludarabine和Clofarabine的敏感度；通过单次TCR/CD3阴性分选，TCR阴性细胞群达到99％。
附图说明
图1.Cas9和Cpf1介导的原代T细胞表面TCR/CD3复合物敲除；1a为CRISPR/Cas9介导的TCR/CD3复合物敲除，1b为CRISPR/Cpf1介导的TCR/CD3复合物敲除。
图2.Cas9和Cpf1介导的CART细胞TCR/dCK分子双敲除；2a为TCR/dCK分子双敲除细胞表面的TCR/CD3的复合物表达，2b为Cas9介导的TCR/dCK分子双敲除细胞内dCK基因的敲除检测，2c为Cpf1介导的TCR/dCK分子双敲除细胞内dCK基因的敲除检测。
图3.TCR/dCK双敲除CART/TCRT基因表达检测；3a为TCR/dCK双敲除CART基因表达，3b为TCR/dCK双敲除TCRT基因表达。
图4.TCR/dCK双敲除CART/TCRT细胞细胞因子分泌；4a为TCR/dCK双敲除CART细胞细胞因子分泌，4b为TCR/dCK双敲除TCRT细胞细胞因子分泌。
图5.TCR/dCK双敲除CART/TCRT细胞肿瘤杀伤活性检测；5a为TCR/dCK双敲除CART细胞的肿瘤杀伤活性检测，5b为TCR/dCK双敲除TCRT细胞的肿瘤杀伤活性检测。
图6.使用不同sgRNA和crRNA对T细胞TCRα，TCRβ和dCK分子的编辑效率。
具体实施方式
实施例1：
原代T细胞扩增。将原代人T细胞在含有10％FBS，100U/ml青霉素，100μg/ml硫酸链霉素，10mM Hepes的RPMI 1640中培养，并使用偶联CD3/CD28抗体的磁珠按照1：3的比例进行激活刺激。对细胞进行计数，每2天添加培养基，按细胞大小及生长参数在恰当时机收集T细胞，进行功能测定或冷冻保存。
CRISPR的设计与实施
sgRNA和crRNA靶向TCRα恒定区外显子1内的序列，TCRβ恒定区1和2外显子1的共有序列,dCK的外显子1序列，并克隆到含有T7启动子的载体中。这些质粒用限制性内切酶线性化。使用MEGAscript T7Transcription试剂盒(Life Technologies，Carlsbad，CA)转录sgRNA/crRNA，将RNA储存在-80℃。
本发明筛选使用的sgRNA和crRNA序列如下：
sgRNA-TCRα选自以下序列：
sgRNA-TCRα-1:GAGAATCAAAATCGGTGAAT(SEQ ID NO.1)
sgRNA-TCRα-2:GCTGGTACACGGCAGGGTCA(SEQ ID NO.2)
sgRNA-TCRα-3:GTCAGGGTTCTGGATATCTG(SEQ ID NO.3)
sgRNA-TCRα-4:ACAAAACTGTGCTAGACATG(SEQ ID NO.4)
sgRNA-TCRα-5:CTTCAAGAGCAACAGTGCTG(SEQ ID NO.5)
sgRNA-TCRα-6:TGGAATAATGCTGTTGTTGA(SEQ ID NO.6)
sgRNA-TCRα-7:TAGGCAGACAGACTTGTCAC(SEQ ID NO.7)
sgRNA-TCRα-8:TGGATTTAGAGTCTCTCAGC(SEQ ID NO.8)
sgRNA-TCRα-9:TCTCTCAGCTGGTACACGGC(SEQ ID NO.9)
sgRNA-TCRα-10:AGAGTCTCTCAGCTGGTACA(SEQ ID NO.10)
sgRNA-TCRβ选自以下序列：
sgRNA-TCRβ-1:GAGCAGCCGCCTGAGGGTCT(SEQ ID NO.11)
sgRNA-TCRβ-2:GAGCTGGTGGGTGAATGGGA(SEQ ID NO.12)
sgRNA-TCRβ-3:GCTGTCAAGTCCAGTTCTAC(SEQ ID NO.13)
sgRNA-TCRβ-4:GGCTCTCGGAGAATGACGAG(SEQ ID NO.14)
sgRNA-TCRβ-5:GGAGAATGACGAGTGGACCC(SEQ ID NO.15)
sgRNA-TCRβ-6:GGCGCTGACGATCTGGGTGA(SEQ ID NO.16)
sgRNA-TCRβ-7:GTTGCGGGGGTTCTGCCAGA(SEQ ID NO.17)
sgRNA-TCRβ-8:GCAGTATCTGGAGTCATTGA(SEQ ID NO.18)
sgRNA-TCRβ-9:GGCACACCAGTGTGGCCTTT(SEQ ID NO.19)
sgRNA-TCRβ-10:GGCTCAAACACAGCGACCTC(SEQ ID NO.20)
sgRNA-dCK选自以下序列：
sgRNA-dCK-1:GAACATCGGTAAGGAGCCTC(SEQ ID NO.21)
sgRNA-dCK-2:TTAAACAATTGTGTGAAGAT(SEQ ID NO.22)
sgRNA-dCK-3:ATTGTGTGAAGATTGGGAAG(SEQ ID NO.23)
sgRNA-dCK-4:ATCAAGAAAATCTCCATCGA(SEQ ID NO.24)
sgRNA-dCK-5:GTCTTTCTCAGCCAGCTCTG(SEQ ID NO.25)
sgRNA-dCK-6:TTCCTGAACCTGTTGCCAGA(SEQ ID NO.26)
sgRNA-dCK-7:GTAAGGAGCCTCCGGAAATG(SEQ ID NO.27)
crRNA-TCRα选自以下序列：
crRNA-TCRα-1:GAGTCTCTCAGCTGGTACACGGC(SEQ ID NO.28)
crRNA-TCRα-2:CATGTGCAAACGCCTTCAACAAC(SEQ ID NO.29)
crRNA-TCRα-3:CACATGCAAAGTCAGATTTGTTG(SEQ ID NO.30)
crRNA-TCRα-4:TTGCTCCAGGCCACAGCACTGTT(SEQ ID NO.31)
crRNA-TCRα-5:TCTGTGATATACACATCAGAATC(SEQ ID NO.32)
crRNA-TCRα-6:TGACACATTTGTTTGAGAATCAA(SEQ ID NO.33)
crRNA-TCRα-7:TTTGAGAATCAAAATCGGTGAAT(SEQ ID NO.34)
crRNA-TCRα-8:AGAATCAAAATCGGTGAATAGGC(SEQ ID NO.35)
crRNA-TCRα-9:ATTCTCAAACAAATGTGTCACAA(SEQ ID NO.36)
crRNA-TCRβ选自以下序列：
crRNA-TCRβ-1:GGTGTGGGAGATCTCTGCTTCTG(SEQ ID NO.37)
crRNA-TCRβ-2:CCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGG(SEQ ID NO.38)
crRNA-TCRβ-3:GCCCTATCCTGGGTCCACTCGTC(SEQ ID NO.39)
crRNA-TCRβ-4:AGCCATCAGAAGCAGAGATCTCC(SEQ ID NO.40)
crRNA-dCK-1选自以下序列：
crRNA-dCK-1:AACATTGCACCATCTGGCAACA(SEQ ID NO.41)
crRNA-dCK-2:TCAGCCAGCTCTGAGGGGACCCG(SEQ ID NO.42)
crRNA-dCK-3:AACATTGCACCATCTGGCAACAG(SEQ ID NO.43)
crRNA-dCK-4:TTGATGCGGGTCCCCTCAGAGCT(SEQ ID NO.44)
crRNA-dCK-5:CGGAGGCTCCTTACCGATGTTCC(SEQ ID NO.45)
crRNA-dCK-6:AGGATATTCACAAATGTTGACT(SEQ ID NO.46)
crRNA-dCK-7:TGAATATCCTTAAACAATTGTGTG(SEQ ID NO.47)
优选地，根据基因编辑效率，采用CRISPR技术优选使用的sgRNA和crRNA序列为：
sgRNA-TCRα:AGAGTCTCTCAGCTGGTACA(SEQ ID NO.10)
sgRNA-TCRβ:GCTGTCAAGTCCAGTTCTAC(SEQ ID NO.13)
sgRNA-dCK:TTCCTGAACCTGTTGCCAGA(SEQ ID NO.26)
crRNA-TCRα:ATTCTCAAACAAATGTGTCACAA(SEQ ID NO.36)
crRNA-TCRβ:AGCCATCAGAAGCAGAGATCTCC(SEQ ID NO.40)
crRNA-dCK:TGAATATCCTTAAACAATTGTGTG(SEQ ID NO.47)。
使用电穿孔的方法实现T细胞内的基因编辑
使用电穿孔的手段实现T细胞内基因编辑：首先，T细胞在第0天，通过偶联CD3/CD28抗体的磁珠进行激活，在第2～5天进行CRISPR的转染，在第9到第11天收集基因编辑的T细胞；
对于CART/TCRT细胞的基因编辑，除第1天加病毒对T细胞进行CAR/TCR转染外，其他步骤同上。
电穿孔方法的操作步骤大致如下：
1.使用Opti-MEM清洗T细胞3次，每次300g，离心10分钟去除上清；
2.重悬T细胞于Opti-MEM，使其终浓度为10^6～10^8细胞/mL；
3.将20～100ug Cas9/Cpf1蛋白与20～100ug sgRNA/crRNA室温混合孵育10分钟；
4.将蛋白与sgRNA/crRNA混合物与100ul细胞悬液混合
5.使用电转仪进行电转。BTX-ECM830的参数为200～500V，100us～3ms。(电转仪包括BTX，Biorad，Lonza等)
6.电穿孔后，将细胞立即置于2mL预温培养基中，并在37℃，5％CO2培养或32℃，5％CO2下培养1天，然后放回37℃，5％CO2培养。
通过CRISPR实现原代T细胞里的基因敲除
由于异体T细胞上的TCR会引起GvHD反应，同时异体T细胞会被宿主T细胞识别而清除，本发明采用了同时敲除T细胞表面的TCR和dCK分子来制备通用型异体T细胞。TCR的敲除消除了GvHD；同时dCK的化疗药物Fludarabine和Clofarabine的使用清除了宿主体内的T细胞，从而防止了异体T细胞被排斥，而dCK分子敲除的异体T细胞因为对Fludarabine和Clofarabine具有抗性可以长时期存活发挥肿瘤杀伤活性。
首先我们使用CRISPR/Cas9对异体T细胞上的TCRα，β链进行基因敲除，发现TCRα，β链的敲除破坏了T细胞表面的TCR/CD3复合体的形成，TCRα，β链的编辑效率分别达到了94.1％和73.5％(图1)。CRISPR/Cpf1是一种新型的基因编辑系统，其识别模块(PAM)不同于Cas9的NGG，而为TTTN，扩大了基因编辑的分析工具箱，为操作AT富集DNA片段提供了可能。为实现在原代T细胞里的基因编辑，我们使用Cpf1对TCRα，β链进行切割，其敲除效率分别达到了93％和69.3％(图1)。
通过CRISPR基因敲除构建通用型异体CART/TCRT细胞
为了生产对化疗药物Fludarabine和Clofarabine具有抗性的T细胞，本发明同时对异体T细胞进行基因编辑破坏其放疗或者化疗的响应分子以生成抗性T细胞，以此实现通用型T细胞的生产。
本发明同时通过结合病毒转染外源CAR/TCR基因和使用Cas9/Cpf1同时对CART细胞里的TCR和dCK基因进行操作，实现了构建通用型异体CART/TCRT细胞目的。
使用Cas9和Cpf1对CART/TCRT细胞里的TCR和dCK基因进行双敲除，产生的双阴性细胞群，TCR阴性细胞达到90％，dCK基因敲除水平达到70％(图2)。此细胞群同时失去GvHD活性并减弱对化疗药物Fludarabine和Clofarabine的敏感度。通过单次TCR/CD3阴性分选，TCR阴性细胞群达到99％。可以作为通用型CART/TCRT细胞。
使用流式细胞仪检测T细胞表面基因表达水平
使用的单克隆抗体和试剂。BD Biosciences(San Jose，CA)：APC-anti-CD3(555335)，FITC-anti-CD8(555366)，PE-anti-CD8(555635)，PE-anti-CD107(555801)，PE-anti-B2m(551337)，FITC-anti-HLA(555552)；Beckman Coulter(Pasadena，CA)：PE-anti-Vb13.1(IM2021U)。数据使用BD LSR2获得，并通过FlowJo版本7.6.1(Tree Star，Inc.Ashland，OR)分析。
流式分析显示，TCR和dCK基因双敲除的T细胞CAR和TCR表达水平分别达到84％和91％(图3)。
通用型CAR/TCRT细胞的功能学研究
为了验证通用型CAR/TCRT细胞的功能，本发明分别对其靶向肿瘤细胞毒性，以及细胞因子分泌方面进行了实验。
TCR和dCK双敲除的CAR/TCRT细胞具有与野生型CAR/TCRT同等的肿瘤杀伤活性；并且分泌同等水平的细胞因子IL2和IFNr(图4，5)。
CD107a染色步骤大致如下：在96孔板的RPMI培养基中，以效应细胞：T细胞比例为1：1(1×10^5个效应细胞:1×10^5个靶标)的细胞铺板。加入CD107抗体，并将板在37℃下孵育1小时，然后加入Golgi stop，并将板另外孵育2.5～3小时。然后加入CD8和CD3抗体，并在37℃温育30分钟。孵育结束后，用FACS缓冲液洗涤细胞，通过流式分析。
细胞因子的ELISA测定大致如下：在含有10％胎牛血清的RPMI 1640的完全培养基中洗涤靶肿瘤细胞，并以1×10^6个细胞/ml悬浮。将100μl每种靶细胞类型一式两份加入到96孔圆底板中。洗涤效应性T细胞，并在完全培养基中以1×10^6个细胞/ml悬浮，然后将100ul T细胞与指定孔中的靶细胞组合。将板在37℃下孵育18至20小时。
孵育结束后，收集上清液并进行ELISA测定。
基于荧光素酶的细胞毒性T细胞杀伤活性检测。将靶向表达荧光素酶的肿瘤细胞在完全培养基中洗涤，并以1×10^5个细胞/ml重悬，然后将100ul肿瘤细胞与不同比例的T细胞(例如30:1,15:1等)一起孵育，在37℃培养18至20小时。孵育结束后，将底物加入到细胞中并立即测定发光，并计算结果。
需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范围，在上述基础上做出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 南京北恒生物科技有限公司
<120> 具有化疗药物抗性的通用型CART/TCRT细胞及其构建方法
<160> 47
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagaatcaaa atcggtgaat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctggtacac ggcagggtca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcagggttc tggatatctg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acaaaactgt gctagacatg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cttcaagagc aacagtgctg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tggaataatg ctgttgttga 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
taggcagaca gacttgtcac 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tggatttaga gtctctcagc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tctctcagct ggtacacggc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agagtctctc agctggtaca 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gagcagccgc ctgagggtct 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gagctggtgg gtgaatggga 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gctgtcaagt ccagttctac 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggctctcgga gaatgacgag 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggagaatgac gagtggaccc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggcgctgacg atctgggtga 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gttgcggggg ttctgccaga 20
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gcagtatctg gagtcattga 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggcacaccag tgtggccttt 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggctcaaaca cagcgacctc 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gaacatcggt aaggagcctc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ttaaacaatt gtgtgaagat 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
attgtgtgaa gattgggaag 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atcaagaaaa tctccatcga 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gtctttctca gccagctctg 20
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 26
ttcctgaacc tgttgccaga 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gtaaggagcc tccggaaatg 20
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gagtctctca gctggtacac ggc 23
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
catgtgcaaa cgccttcaac aac 23
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cacatgcaaa gtcagatttg ttg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ttgctccagg ccacagcact gtt 23
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tctgtgatat acacatcaga atc 23
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tgacacattt gtttgagaat caa 23
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tttgagaatc aaaatcggtg aat 23
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
agaatcaaaa tcggtgaata ggc 23
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
attctcaaac aaatgtgtca caa 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggtgtgggag atctctgctt ctg 23
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cctcggtgtc ctaccagcaa ggg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gccctatcct gggtccactc gtc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agccatcaga agcagagatc tcc 23
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<212> DNA
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aacattgcac catctggcaa ca 22
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<212> DNA
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tcagccagct ctgaggggac ccg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aacattgcac catctggcaa cag 23
<210> 44
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<212> DNA
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<400> 44
ttgatgcggg tcccctcaga gct 23
<210> 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
cggaggctcc ttaccgatgt tcc 23
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
aggatattca caaatgttga ct 22
<210> 47
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
tgaatatcct taaacaattg tgtg 24

Claims (6)

1.具有化疗药物抗性的通用型CART/TCRT细胞，其特征在于，所述通用型CART/TCRT细胞是具有嵌合抗原受体和T细胞受体的异体T细胞，所述T细胞受体α、β链和脱氧胞苷激酶分子被敲除。
2.如权利要求1所述的通用型CART/TCRT细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体为靶向CD19，CD20，CD22，CD30，CD33，CD38，CD123，CD138，CD171，MUC1，AFP，Alpha folatereceptor，CEA，PSCA，PSMA，Her2，EGFR，IL13Rα2，GD2，NKG2D，EGFRvIII，CS1，BCMA，Mesothelin的嵌合抗原受体。
3.如权利要求1所述的通用型CART/TCRT细胞，其特征在于，所述T细胞受体为靶向HBV，HPV E6，NY-ESO，mNY-ESO，WT1，MART-1，MAGE-A3，MAGE-A4，P53，Thyroglobulin，Tyrosinase的T细胞受体。
4.如权利要求1-3所述具有化疗药物抗性的通用型CART/TCRT细胞的构建方法，其特征在于，所述T细胞受体α、β链和脱氧胞苷激酶分子的敲除技术为CRISPR技术。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，采用CRISPR技术所使用的sgRNA和crRNA序列为：
sgRNA-TCRα选自以下序列：
sgRNA-TCRα-1:GAGAATCAAAATCGGTGAAT(SEQ ID NO.1)
sgRNA-TCRα-2:GCTGGTACACGGCAGGGTCA(SEQ ID NO.2)
sgRNA-TCRα-3:GTCAGGGTTCTGGATATCTG(SEQ ID NO.3)
sgRNA-TCRα-4:ACAAAACTGTGCTAGACATG(SEQ ID NO.4)
sgRNA-TCRα-5:CTTCAAGAGCAACAGTGCTG(SEQ ID NO.5)
sgRNA-TCRα-6:TGGAATAATGCTGTTGTTGA(SEQ ID NO.6)
sgRNA-TCRα-7:TAGGCAGACAGACTTGTCAC(SEQ ID NO.7)
sgRNA-TCRα-8:TGGATTTAGAGTCTCTCAGC(SEQ ID NO.8)
sgRNA-TCRα-9:TCTCTCAGCTGGTACACGGC(SEQ ID NO.9)
sgRNA-TCRα-10:AGAGTCTCTCAGCTGGTACA(SEQ ID NO.10)；
sgRNA-TCRβ选自以下序列：
sgRNA-TCRβ-1:GAGCAGCCGCCTGAGGGTCT(SEQ ID NO.11)
sgRNA-TCRβ-2:GAGCTGGTGGGTGAATGGGA(SEQ ID NO.12)
sgRNA-TCRβ-3:GCTGTCAAGTCCAGTTCTAC(SEQ ID NO.13)
sgRNA-TCRβ-4:GGCTCTCGGAGAATGACGAG(SEQ ID NO.14)
sgRNA-TCRβ-5:GGAGAATGACGAGTGGACCC(SEQ ID NO.15)
sgRNA-TCRβ-6:GGCGCTGACGATCTGGGTGA(SEQ ID NO.16)
sgRNA-TCRβ-7:GTTGCGGGGGTTCTGCCAGA(SEQ ID NO.17)
sgRNA-TCRβ-8:GCAGTATCTGGAGTCATTGA(SEQ ID NO.18)
sgRNA-TCRβ-9:GGCACACCAGTGTGGCCTTT(SEQ ID NO.19)
sgRNA-TCRβ-10:GGCTCAAACACAGCGACCTC(SEQ ID NO.20)；
sgRNA-dCK选自以下序列：
sgRNA-dCK-1:GAACATCGGTAAGGAGCCTC(SEQ ID NO.21)
sgRNA-dCK-2:TTAAACAATTGTGTGAAGAT(SEQ ID NO.22)
sgRNA-dCK-3:ATTGTGTGAAGATTGGGAAG(SEQ ID NO.23)
sgRNA-dCK-4:ATCAAGAAAATCTCCATCGA(SEQ ID NO.24)
sgRNA-dCK-5:GTCTTTCTCAGCCAGCTCTG(SEQ ID NO.25)
sgRNA-dCK-6:TTCCTGAACCTGTTGCCAGA(SEQ ID NO.26)
sgRNA-dCK-7:GTAAGGAGCCTCCGGAAATG(SEQ ID NO.27)；
crRNA-TCRα选自以下序列：
crRNA-TCRα-1:GAGTCTCTCAGCTGGTACACGGC(SEQ ID NO.28)
crRNA-TCRα-2:CATGTGCAAACGCCTTCAACAAC(SEQ ID NO.29)
crRNA-TCRα-3:CACATGCAAAGTCAGATTTGTTG(SEQ ID NO.30)
crRNA-TCRα-4:TTGCTCCAGGCCACAGCACTGTT(SEQ ID NO.31)
crRNA-TCRα-5:TCTGTGATATACACATCAGAATC(SEQ ID NO.32)
crRNA-TCRα-6:TGACACATTTGTTTGAGAATCAA(SEQ ID NO.33)
crRNA-TCRα-7:TTTGAGAATCAAAATCGGTGAAT(SEQ ID NO.34)
crRNA-TCRα-8:AGAATCAAAATCGGTGAATAGGC(SEQ ID NO.35)
crRNA-TCRα-9:ATTCTCAAACAAATGTGTCACAA(SEQ ID NO.36)；
crRNA-TCRβ选自以下序列：
crRNA-TCRβ-1:GGTGTGGGAGATCTCTGCTTCTG(SEQ ID NO.37)
crRNA-TCRβ-2:CCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGG(SEQ ID NO.38)
crRNA-TCRβ-3:GCCCTATCCTGGGTCCACTCGTC(SEQ ID NO.39)
crRNA-TCRβ-4:AGCCATCAGAAGCAGAGATCTCC(SEQ ID NO.40)；
crRNA-dCK-1选自以下序列：
crRNA-dCK-1:AACATTGCACCATCTGGCAACA(SEQ ID NO.41)
crRNA-dCK-2:TCAGCCAGCTCTGAGGGGACCCG(SEQ ID NO.42)
crRNA-dCK-3:AACATTGCACCATCTGGCAACAG(SEQ ID NO.43)
crRNA-dCK-4:TTGATGCGGGTCCCCTCAGAGCT(SEQ ID NO.44)
crRNA-dCK-5:CGGAGGCTCCTTACCGATGTTCC(SEQ ID NO.45)
crRNA-dCK-6:AGGATATTCACAAATGTTGACT(SEQ ID NO.46)
crRNA-dCK-7:TGAATATCCTTAAACAATTGTGTG(SEQ ID NO.47)。
6.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，采用CRISPR技术所使用的sgRNA和crRNA序列为：
sgRNA-TCRα:AGAGTCTCTCAGCTGGTACA(SEQ ID NO.10)
sgRNA-TCRβ:GCTGTCAAGTCCAGTTCTAC(SEQ ID NO.13)
sgRNA-dCK:TTCCTGAACCTGTTGCCAGA(SEQ ID NO.26)
crRNA-TCRα:ATTCTCAAACAAATGTGTCACAA(SEQ ID NO.36)
crRNA-TCRβ:AGCCATCAGAAGCAGAGATCTCC(SEQ ID NO.40)
crRNA-dCK:TGAATATCCTTAAACAATTGTGTG(SEQ ID NO.47)。
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