JP5035522B2

JP5035522B2 - ビニルポリマー、ブロッキング剤、およびこれを用いたプローブ結合粒子の製造方法

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Publication number: JP5035522B2
Application number: JP2007084467A
Authority: JP
Inventors: 功二田守; 英司高本
Original assignee: JSR Corp
Current assignee: JSR Corp
Priority date: 2007-03-28
Filing date: 2007-03-28
Publication date: 2012-09-26
Anticipated expiration: 2027-03-28
Also published as: JP2008239874A

Description

本発明は、新規なビニルポリマー、例えば免疫診断用粒子の表面に適用可能なブロッキング剤、ならびにプローブ結合粒子およびその製造方法に関する。

近年、疾病の早期発見等の目的のため、検査の高感度化が求められており、診断薬の感度向上は大きな課題となっている。磁性粒子などの固相を用いた診断薬においても、感度向上のため、検出方式として酵素発色を用いる方式から、より高い感度が得られる蛍光や化学発光を用いる方式へと切り替わりつつある。これらの検出技術の発展により、理論上は一分子の検査対象物質の存在まで検出できるレベルに達しているといわれているが、実際には十分な感度が得られていない。その原因としては、血清などの生体分子混在下で特定の物質を検出する診断では、共存する生体分子や２次抗体、発光基質などが固相へ非特異的に吸着し、その結果、ノイズが増加して高感度化の妨げとなっている。そのため、免疫診断測定においては、特異的に結合する物質以外の物質が免疫反応に使用する固相表面に非特異的に吸着することによる感度の低下を軽減するため、通常、アルブミン、カゼイン、ゼラチン等の生物由来物質をブロッキング剤として用いることにより、非特異吸着を抑制して、ノイズを低減させている。

しかしながら、従来法によるブロッキング操作を施しても、なお、非特異的な吸着が残り、さらに、生体由来のブロッキング剤を用いる場合、ＢＳＥに代表される生物汚染の問題があることなどから、化学合成による高性能のブロッキング剤の開発が望まれている。

化学合成によるブロッキング剤としては、特開平１１−２８７８０２号公報や特許第３４０７３９７号にポリオキシエチレンを有するポリマーが提案されているが、これらのブロッキング剤によるノイズ低減効果は不十分であった。さらに、ポリオキシエチレン／ペンタエチレンヘキサミンブロック共重合体がブロッキング剤として提案されているが（特開２００６−２２６９８２号公報、再公表特許第ＷＯ２００５／０１０５２９号明細書）、工業的に入手できるポリオキシエチレンは２９０ｎｍ付近に吸収を有する不純物が含まれることが多く、煩雑な精製が必要であった。
特開平１１−２８７８０２号公報特許第３４０７３９７号特開２００６−２２６９８２号公報再公表特許第ＷＯ２００５／０１０５２９号明細書

本発明の目的は、製造が容易であり、免疫診断などで十分なノイズ低減効果とシグナル増強効果を有する新規な化学合成のビニルポリマー、およびブロッキング剤、これを用いたプローブ結合粒子の製造方法を提供することである。

本発明者らは、この課題を解決するために、特定の基を有するビニルポリマーおよびブロッキング剤を見いだし、さらには、本ブロッキング剤を用いて、免疫診断用粒子を処理することにより、該粒子がシグナル増強効果を発現することを見いだし、本発明を完成した。

本発明の一態様に係るビニルポリマーは、下記一般式（１）で表される基を有する。

・・・・・（１）
［式中、Ｒ^１およびＲ^２は独立に、水素原子、または、アミノ基およびイミノ基あるいはいずれか一方を１〜１１個有する基を表す（ただし、Ｒ^１およびＲ^２に含まれるアミノ基およびイミノ基の合計は２〜１１個である。）］
上記ビニルポリマーでは、上記一般式（１）において、Ｒ^１およびＲ^２がそれぞれ下記一般式（２ａ）および（２ｂ）で表される基であることができる。

・・・・・（２ａ）

・・・・・（２ｂ）
［式中、ｘ１およびｘ２はそれぞれ１〜４で表される数であり、ｙ１およびｙ２はそれぞれ０〜１１で表される数である（ただし、ｙ１＋ｙ２は２〜１１を満たす。）］
上記ビニルポリマーは水溶性であることができる。

上記ビニルポリマーは、カルボキシル基、アミノ基および水酸基よりなる群から選ばれる少なくとも１種の基ならびにメルカプト基を有する化合物の存在下で重合したビニルポリマーと、オリゴイミンとの反応により得られることができる。この場合、前記オリゴイミンは下記一般式（４）で表される化合物であることができる。
Ｈ_２Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ）_ｎＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２・・・・・（４）
［式中、ｎは１〜１０の数を示す。］
本発明の一態様に係るブロッキング剤は、上記ビニルポリマーからなる。

本発明の一態様に係るプローブ結合粒子の製造方法は、
粒子の表面にプローブを結合させる工程と、
上記ブロッキング剤を用いて、前記プローブが結合された前記粒子を処理する工程と、
を含む。

上記プローブ結合粒子の製造方法では、前記プローブを結合させる工程において、前記粒子は、活性エステル基、トシル基、およびエポキシ基から選ばれる少なくとも１種の基を有することができる。

上記プローブ結合粒子の製造方法において、前記粒子は、磁性粒子であることができる。

本発明の一態様に係るプローブ結合粒子の製造方法は、上記プローブ結合粒子の製造方法によって得られる。

本発明の一態様に係るプローブ結合粒子は、上記ブロッキング剤を表面に有する。

上記ビニルポリマーおよび上記ブロッキング剤は、製造が容易であり、かつ、化学合成品であることから生物汚染の可能性がないうえ、従来用いられてきたブロッキング剤に比べて、ノイズ低減効果が高い。

また、上記ブロッキング剤は、免疫診断に使用される粒子（例えば磁性粒子）に用いた場合にシグナル増強効果を発現することができる。

以下、本発明の一実施形態に係るビニルポリマー、ブロッキング剤、ならびにプローブ結合粒子およびその製造方法について説明する。

１．特定の基を有するビニルポリマーおよびブロッキング剤、ならびに、プローブ結合粒子およびその製造方法
１．１．特定の基を有するビニルポリマー（ブロッキング剤）の構成
本発明の一実施形態に係るビニルポリマー（本明細書において「修飾ビニルポリマー」ともいう。）は、下記一般式（１）で表される基を有する。例えば、本実施形態に係るビニルポリマー（末端修飾ビニルポリマー）は、下記一般式（１）で表される基を末端に有することができる。

・・・・・（１）
［式中、Ｒ^１およびＲ^２は独立に、水素原子、または、アミノ基およびイミノ基あるいはいずれか一方を１〜１１個有する基を表す（ただし、Ｒ^１およびＲ^２に含まれるアミノ基およびイミノ基の合計は２〜１１個である。）］
上記一般式（１）において、Ｒ^１およびＲ^２がそれぞれ下記一般式（２ａ）および（２ｂ）で表される基であってもよい。

・・・・・（２ａ）

・・・・・（２ｂ）
［式中、ｘ１およびｘ２はそれぞれ１〜４で表される数であり、ｙ１およびｙ２はそれぞれ０〜１１で表される数である（ただし、ｙ１＋ｙ２は２〜１１を満たす。）］
上記一般式（２ａ）および（２ｂ）において、ｘ１およびｘ２は２であるのが好ましく、ｙ１およびｙ２はそれぞれ１〜６（ただし、ｙ１＋ｙ２＝２〜１１を満たす。）であることがより好ましい。

本実施形態に係る修飾ビニルポリマーはブロッキング剤として使用することができる。本実施形態に係るブロッキング剤は例えば、粒子のシグナル増強剤として好適である。また、本実施形態に係るブロッキング剤は上記反応生成物それ自体であってもよいし、あるいは、必要に応じて溶媒を含んでいてもよい。

水系溶媒で使用するときの取り扱いやすさ、後述するブロッキング剤としての性能面から、本実施形態に係る修飾ビニルポリマーは、水分散性または水溶性であることが好ましく、水溶性であるのがより好ましい。本発明において、「水溶性である」ことは、２０℃の水に１％のポリマーを溶解した場合に、目視により透明であることをいう。

より具体的には、本実施形態に係る修飾ビニルポリマーは、ビニルポリマーにオリゴイミンが導入されており、導入部位はビニルポリマーの両末端または片末端が好ましく、より好ましくは、片末端にオリゴイミン（後で詳述する）が導入されている。

修飾ビニルポリマー中のオリゴイミンは、通常、２個以上有する一級アミノ基の１個がビニルポリマーと結合しているが、複数の一級アミノ基がビニルポリマーと結合している修飾ビニルポリマーを含有していても良い。

本実施形態に係る修飾ビニルポリマーは、
（ｉ）リビングイオン重合により得られた末端反応性のビニルポリマーをオリゴイミンと反応させる方法、
（ｉｉ）オリゴイミンにアゾ基などのラジカル開始性の官能基を導入し、これを用いてビニルポリマーをラジカル重合する方法、
（ｉｉｉ）オリゴイミンにメルカプト基などの連鎖移動性の官能基を導入し、これを用いてビニルポリマーをラジカル重合する方法、
（ｉｖ）官能基を有するラジカル開始剤を用いてビニルモノマーをラジカル重合して得られたビニルポリマーと、オリゴイミンとを反応させる方法、
（ｖ）ラジカルテロメリゼーションにより末端官能基が導入されたビニルポリマーと、オリゴイミンとを反応させる方法、
などによって製造することができ、反応時間、分子量制御、製造の容易さなどから、好ましくは（ｖ）の方法によって製造される。

１．２．修飾ビニルポリマー（ブロッキング剤）の製造
本実施形態に係る修飾ビニルポリマーは、カルボキシル基、アミノ基および水酸基よりなる群から選ばれる少なくとも１種の基ならびにメルカプト基を有する化合物の存在下で重合したビニルポリマーと、オリゴイミンとの反応により得ることができる。

より具体的には、本実施形態に係る修飾ビニルポリマーは、ラジカルテロメリゼーションにより末端官能基が導入されたビニルポリマーとオリゴイミンとの反応により得ることができる。得られた修飾ビニルポリマーは、透析、再沈、クロマトグラフなどの方法で精製することが好ましい。

１．２．１．オリゴイミン
オリゴイミンはオリゴマー主鎖にイミノ基とアルキレン基とを有し、２個以上の末端に１級アミノ基を有する分岐または直鎖のオリゴマーであり、その分子量は１０００以下（好ましくは分子量５００以下）であり、具体的には、ジメチレントリミン、トリメチレンテトラミン、テトラメチレンペンタミン、ペンタメチレンヘキサミン、ヘキサメチレンヘプタミン、ヘプタメチレンオクタミン、オクタメチレンノナミン、ノナメチレンデカミン、デカメチレンウンデカミン、ウンデカメチレンドデカミンなどのオリゴメチレンイミン；ジエチレントリミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、ヘキサエチレンヘプタミン、ヘプタエチレンオクタミン、オクタエチレンノナミン、ノナエチレンデカミン、デカエチレンウンデカミン、ウンデカエチレンドデカミン、商品名でエポミンＳＰ−００３（日本触媒社製）などのオリゴエチレンイミン；スペルミン、スペルミジンなどのプロピレン−ブチレン系イミン類などを挙げることができ、これらは単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。

ブロッキング剤としての水への溶解性およびノイズ低減効果などを考慮すると、オリゴイミンは下記一般式（４）で表される直鎖オリゴエチレンイミンであることが好ましい。
Ｈ_２Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ）_ｎＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２・・・・・（４）
［式中、ｎは１〜１０の数を示す。］
上記一般式（４）において、ｎは好ましくは２〜６の整数であり、より好ましくは４である。

１．２．２．末端官能基が導入されたビニルポリマー
本実施形態に係る修飾ビニルポリマーの製造に使用されるビニルポリマーは、ラジカルテロメリゼーションにより末端官能基が導入されていることが好ましい。

ラジカルテロメリゼーションとは、特定の官能基をポリマー末端に導入するために、テロゲンすなわち官能基を有する連鎖移動剤をラジカル重合時に使用する重合法である。

テロゲンとしては、具体的には、メルカプト酢酸、３−メルカプトプロピオン酸、２−メルカプトプロピオン酸などのカルボキシル基を導入するもの；２−メルカプトエチルアミン、３−メルカプトプロピルアミン、２−メルカプトプロピルアミンなどのアミノ基を導入するもの；２−メルカプトエタノール、３−メルカプト−１−プロパノール、１−メルカプト−２−プロパノール、４−メルカプト−１−ブタノールなどの水酸基を導入するものが挙げられる。

ラジカルテロメリゼーションにおけるラジカル重合は、上記テロゲンおよびビニルモノマーを使用し、公知の溶媒、開始剤などと共に攪拌・加熱することにより実施される。重合時間は、通常３０分〜２４時間、重合温度は、０〜１２０℃程度である。

末端官能基が導入されるビニルポリマー（以下、「原料ポリマー」という。）は、１分子中に少なくとも１つ以上の不飽和二重結合を有するビニルモノマーを重合して得られるものであり、その分子量は、通常１，０００〜１，０００，０００、好ましくは２，０００〜１００，０００、さらに好ましくは３，０００〜５０，０００である。

原料ポリマーを製造するために使用可能なビニルモノマーとしては、親水性モノマーおよび疎水性モノマーを挙げることができ、好ましくは、親水性モノマーである。

親水性モノマーとしては、アクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロプルアクリルアミド、アクリロイルモルホリン、グリセロールアクリレート、グリセロールメタクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリルエステル、ダイアセトンアクリルアミド、アクロレイン、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−ビニルアセトアミド、Ｎ−ビニル−２−ピロリドンなどの非イオン性親水性モノマー；アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、無類マレイン酸、クロトン酸、スチレンスルホン酸、イソプレンスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸などのアニオン性モノマー；アリルアミン、アミノスチレン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドのメチルクロライド４級塩などのカチオン性モノマーが挙げられる。

疎水性モノマーとしては、（メタ）アクリル酸メトキシエチル、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ラウリル、（メタ）アクリル酸シクロヘキシル、（メタ）アクリル酸イソボニル、（メタ）アクリル酸ベンジル、スチレンを挙げることができる。

原料ポリマーは好ましくは、これらのモノマーのホモポリマーおよび２種以上のモノマーを重合して得られるコポリマーである。原料ポリマーは、５０重量％以上の非イオン性親水性モノマーから構成されることが好ましく、８０重量％以上の非イオン性親水性モノマーから構成されることがさらに好ましく、９５重量％以上の非イオン性親水性モノマーから構成されることが最も好ましい。非イオン性親水性モノマーとしては、アクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミドが特に好ましく、アクリルアミドが最も好ましい。また、原料ポリマーは、１〜１０重量％のアニオン性モノマー、特に、スチレンスルホン酸、イソプレンスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸などを共重合することにより、高いシグナルが得られる。

１．２．３．ラジカルテロメリゼーションにより末端官能基が導入されたビニルポリマーと、オリゴイミンとの反応
ラジカルテロメリゼーションにより末端官能基が導入されたビニルポリマーと、オリゴイミンとの反応としては、例えば、カルボキシル基末端のビニルポリマーを水溶性カルボジイミドやＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどで活性エステル化し、これをオリゴイミンと反応させる方法；アミノ基末端のビニルポリマーを１，３−ブタジエンジエポキシドや１，２，７，８−ジエポキシオクタンなどでエポキシ化し、これをオリゴイミンと反応させる方法；水酸基末端のビニルポリマーをｐ−トルエンスルホン酸クロライドなどでトシル化し、これをオリゴイミンと反応させる方法などが挙げられる。好ましくは、カルボキシル基末端のビニルポリマーを活性エステル化して、オリゴイミンと結合させる反応である。

１．３．修飾ビニルポリマーの用途
本実施形態に係る修飾ビニルポリマーは、従来の免疫診断測定において用いられたアルブミン、カゼイン、ゼラチン等を代替することにより、非特異吸着を効果的に抑制してノイズを低減するとともに、さらには、シグナルを増強するブロッキング剤として使用することができる。

例えば、プレート法において、プレートへ抗体などのプローブを結合した後、本実施形態に係るブロッキング剤を添加して、プレート表面を処理することができる。

また、本実施形態に係るブロッキング剤は例えば、プローブ結合粒子の製造に好適に使用することができる。

１．４．プローブ結合粒子およびその製造
本実施形態に係るプローブ結合粒子の製造方法は、粒子の表面にプローブを結合させる工程と、本実施形態に係るブロッキング剤を用いて、プローブが結合された粒子を処理する工程とを含む。

ここで、本実施形態に係るブロッキング剤を用いて、プローブが結合された粒子を処理する工程は、例えば、本実施形態に係るブロッキング剤を粒子の表面に所定時間接触させることにより行うことができる。これにより、粒子表面における非特異吸着を抑制し、ノイズを低減することができる。また、この工程は例えば、本実施形態に係るブロッキング剤の溶液中に粒子を分散させた状態で行うことができる。

この場合、プローブを結合させる粒子は、活性エステル基、トシル基およびエポキシ基から選ばれる少なくとも１種の基を少なくとも表面に有することが好ましい（その理由については後述する）。また、この場合、粒子は磁性粒子であることが好ましい。

より具体的には、例えば、イムノクロマト法において、着色粒子に抗体などのプローブを結合させた後、本実施形態に係るブロッキング剤を添加して、着色粒子の表面を処理することにより、プローブ結合粒子を得ることができる。また、例えば、ＥＩＡ、ＣＬＩＡ、ＣＬＥＩＡなどのアッセイ法において、磁性粒子の表面に抗体などのプローブを結合させた後、本実施形態に係るブロッキング剤を添加して、該磁性粒子の表面を処理することにより、プローブ結合粒子を得ることができる。

以上に説明したように、本実施形態に係るブロッキング剤は、上記一般式（１）で表される基を有することにより、非特異吸着を抑制して、ノイズを低減し、免疫診断測定における擬陽性の出現率を低下することができる。

本実施形態に係るブロッキング剤を用いて、特に活性エステル基、トシル基、エポキシ基などの活性基を少なくとも表面に有する粒子（例えば磁性粒子）を処理する場合、ブロッキング剤中のアミノ基と粒子表面の活性基とが共有結合を形成し、免疫診断用抗体の配向性を向上させることから、シグナルを増強する効果が発現する。また、ブロッキング剤の脱離を抑制することができるため、界面活性剤などを含むバッファー類に対して、極めて安定性に富んだ検査試薬となる。

本実施形態に係るブロッキング剤が特に良好な効果を発現する担体は、活性エステル基を有する粒子（例えば磁性粒子）である。その好ましい処理方法としては、カルボキシル基を有する粒子を水溶性カルボジイミド単独系、または、水溶性カルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの併用系などで活性エステル基とし、免疫診断プローブを結合した後、本実施形態に係るブロッキング剤（シグナル増強剤）で処理する方法が挙げられる。

本実施形態に係るプローブ結合粒子は、上記プローブ結合粒子の製造方法によって得ることができる。例えば、本実施形態に係るプローブ結合粒子は、上記ブロッキング剤を表面に有することができる。

本発明の修飾ビニルポリマーは、上記ブロッキング剤の他に、ドラッグデリバリーシステム用分散剤、タンパク・ＤＮＡなどに対する非特異吸着を低減するための各種デバイスへのコート剤、タンパク導入および遺伝子導入に使用されるトランスフェクション試薬としても有用である。

２．実施例
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。

２．１．実施例１
水９００ｇ、アクリルアミド９８ｇ、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸２ｇ、およびテロゲンとして３−メルカプトプロピオン酸２ｇを攪拌機付きセパラブルフラスコに入れ、攪拌しながら８０℃まで昇温した後、開始剤として４，４’−アゾビスシアノ吉草酸１ｇを投入し、３時間攪拌を続けて重合した。得られたポリマー水溶液は、無色透明の液体であり、測定の結果、固形分は１０．５％（重合転換率１００％）であった。このポリマー水溶液を分画分子量３，５００の透析チューブを用いて、水を交換しながら４８時間透析した後、凍結乾燥して、原料ポリマーであるビニルポリマー（Ａ−１）を得た。

次いで、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド０．４６ｇを１００ｃｃ容器に入れ、ここにビニルポリマー（Ａ−１）の４％水溶液２５ｇを加えて混合し、さらに１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩０．７６ｇを加えて溶解した（活性エステル化ポリマー液）。別の容器にペンタエチレンヘキサミン０．９３ｇおよび水１０ｇを入れて溶解させ、ここへ前記活性エステル化ポリマー液を加えて１６時間攪拌を続け、末端修飾を実施した。得られた溶液に１０ｇの水を加え、これを分画分子量３，５００の透析チューブを用いて、水を交換しながら４８時間透析して、修飾ビニルポリマー水溶液を得た。以下これをブロッキング剤（Ｂ−１）とする。得られたブロッキング剤（Ｂ−１）水溶液の固形分は１．６％、ＧＰＣにより数平均分子量７８００、重量平均分子量１４７００と測定された。ブロッキング剤（Ｂ−１）水溶液を凍結乾燥後、重水へ５％に溶解し、ＨＤＯ＝４．２４ｐｐｍを標準としたＮＭＲ測定を行ったところ、ポリアクリルアミドに特徴的な４本のピーク（１．８５ｐｐｍ、１．７０ｐｐｍ、１．２９ｐｐｍ、１．１７ｐｐｍ）及びペンタエチレンヘキサミンに特徴的なピーク（最大ピーク２．９３ｐｐｍを中心に約７本に分裂）が得られ、これらのピーク面積比とＧＰＣで求めた数平均分子量から、ビニルポリマー（Ａ−１）の６１％がペンタエチレンヘキサミンと反応していることが確認された。

次いで、カルボキシル基を有する磁性粒子（ＪＳＲ社製ＭＡＧ２３０３）１ｍｇを分散させた固形分濃度１％の水分散体に、１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩水溶液を添加して室温で２時間回転攪拌することにより、カルボキシル基を活性エステル化した。これを磁気分離して上清を捨てた後、腫瘍マーカーであるヒトαフェトプロテイン（以下、「ＡＦＰ」という。）に対する抗体（以下、「抗ＡＦＰ抗体」という。コスモ・バイオ（株）製）１０μｇを加え３時間室温で反応させた。反応後、ブロッキング剤（Ｂ−１）の０．４％水溶液に、上記粒子の水分散体１２５μＬ加え、さらに１５時間室温で反応させた。これを磁気分離し、洗浄液（２５ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有）で繰り返し洗浄した後、粒子濃度０．５％になるように洗浄液で希釈し、一次プローブとして抗ＡＦＰ抗体を結合したプローブ結合粒子（免疫検査用粒子）を得た。得られたプローブ結合粒子の分散液１０μｌ（粒子５０μｇ相当）をテストチューブに取り、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で５００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡＦＰ抗原（日本バイオテスト社製）の標準検体５０μｌと混合し、３７℃で１０分間反応させた。磁気分離して粒子を分離し上清を除いた後、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ（以下、「ＡＬＰ」という。）で標識した抗ＡＦＰ抗体（富士レビオ株式会社製、ルミパルスＡＦＰ−Ｎに付属の試薬を使用）４０μｌを添加し、３７℃で１０分間反応させた。次いで、磁気分離し上清を除いた後、ＰＢＳで３回洗浄を繰り返して得られた粒子を５０μｌの０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０に分散させ、新しいチューブに移し替えた。ＡＬＰの基質液（ルミパルス基質液：富士レビオ株式会社製）１００μｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、化学発光量を測定した。

化学発光の測定には、ベルトールジャパン株式会社製の化学発光測定装置（商品名：ＬｕｍａｔＬＢ９５０７）を用いた。その結果、シグナル強度は２５２４９７ＲＩＵであった。また、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡＦＰ抗原の標準検体５０μｌの代わりに、ＡＦＰ抗原を含まないＦＣＳ５０μｌを用いた以外は、上記と同様にしてノイズ強度を測定したところ、２７２ＲＩＵであった。

２．２．実施例２
実施例１において、アクリルアミドの代わりにＮ−ヒドロキシエチルアクリルアミドを用いた以外は、実施例１と同様の方法にて、ブロッキング剤（Ｂ−２）を得た。

また、ブロッキング剤（Ｂ−１）の代わりにブロッキング剤（Ｂ−２）を使用した以外は、実施例１と同様の方法にて磁性粒子を処理して、シグナル強度およびノイズ強度を求めた。その結果、シグナル強度は２２９６６１ＲＩＵであり、ノイズ強度は２５６ＲＩＵであった。

２．３．実施例３
実施例１において、アクリルアミド９８ｇ、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸２ｇの代わりにアクリロイルモルホリン５０ｇとポリエチレングリコールメタクリレート５０ｇとの混合モノマーを用いた以外は、実施例１と同様の方法にて、ブロッキング剤（Ｂ−３）を得た。

また、ブロッキング剤（Ｂ−１）の代わりにブロッキング剤（Ｂ−３）を使用した以外は、実施例１と同様の方法にて磁性粒子を処理して、シグナル強度およびノイズ強度を求めた。その結果、シグナル強度は２１５９７４ＲＩＵであり、ノイズ強度は２４９ＲＩＵであった。

２．４．比較例１
実施例１において、ペンタエチレンヘキサミンの代わりにエチレンジアミンを使用した以外は、実施例1と同様の方法にて、比較例１のブロッキング剤（Ｂ−４）を得た。

また、ブロッキング剤（Ｂ−１）の代わりにブロッキング剤（Ｂ−４）を使用した以外は、実施例１と同様の方法にて磁性粒子を処理して、シグナル強度およびノイズ強度を求めた。その結果、シグナル強度は、２０４６５６ＲＩＵであり、ノイズ強度は、２５２ＲＩＵであった。

２．５．比較例２
実施例１において、ブロッキング剤（Ｂ−１）の代わりに牛血清アルブミンを使用した以外は、実施例１と同様の方法にて磁性粒子を処理して、シグナル強度およびノイズ強度を求めた。その結果、シグナル強度は、２１４０８２ＲＩＵであり、ノイズ強度は、３１５ＲＩＵであった。

２．６．比較例３
実施例１において、ブロッキング剤（Ｂ−１）を使用しなかった以外は、実施例１と同様の方法にて磁性粒子を処理して、シグナル強度およびノイズ強度を求めた。シグナル強度は、１９３５６９ＲＩＵであり、ノイズ強度は、３２１ＲＩＵであった。

Claims

下記一般式（１）で表される基を有する水溶性ビニルポリマーであって、カルボキシル基、アミノ基および水酸基よりなる群から選ばれる少なくとも１種の基ならびにメルカプト基を有する化合物の存在下で重合したビニルポリマーと、オリゴイミンとの反応により得られる、水溶性ビニルポリマー。

・・・・・（１）
［式中、Ｒ^１およびＲ^２は独立に、水素原子、または、アミノ基およびイミノ基あるいはいずれか一方を１〜１１個有する基を表す（ただし、Ｒ^１およびＲ^２に含まれるアミノ基およびイミノ基の合計は２〜１１個である。）］
上記一般式（１）において、Ｒ^１およびＲ^２がそれぞれ下記一般式（２ａ）および（２ｂ）で表される基である、請求項１に記載の水溶性ビニルポリマー。

・・・・・（２ａ）

・・・・・（２ｂ）
［式中、ｘ１およびｘ２はそれぞれ１〜４で表される数であり、ｙ１およびｙ２はそれぞれ０〜１１で表される数である（ただし、ｙ１＋ｙ２は２〜１１を満たす。）］
前記オリゴイミンは下記一般式（４）で表される化合物である、請求項１または２に記載の水溶性ビニルポリマー。
Ｈ_２Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ）_ｎＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２・・・・・（４）
［式中、ｎは１〜１０の数を示す。］
下記一般式（１）で表される基を有する水溶性ビニルポリマーからなるブロッキング剤。

・・・・・（１）
［式中、Ｒ ^１およびＲ ^２は独立に、水素原子、または、アミノ基およびイミノ基あるいはいずれか一方を１〜１１個有する基を表す（ただし、Ｒ ^１およびＲ ^２に含まれるアミノ基およびイミノ基の合計は２〜１１個である。）］
粒子の表面にプローブを結合させる工程と、
請求項４に記載のブロッキング剤を用いて、前記プローブが結合された前記粒子を処理する工程と、
を含む、プローブ結合粒子の製造方法。
前記プローブを結合させる工程において、前記粒子は、活性エステル基、トシル基、およびエポキシ基から選ばれる少なくとも１種の基を有する、請求項５に記載のプローブ結合粒子の製造方法。
前記粒子は、磁性粒子である、請求項５または６に記載のプローブ結合粒子の製造方法。
請求項５〜７のいずれかに記載のプローブ結合粒子の製造方法によって得られるプローブ結合粒子。
請求項４に記載のブロッキング剤を表面に有する、プローブ結合粒子。