JP4877509B2

JP4877509B2 - ブロッキング剤ならびにプローブ結合粒子およびその製造方法

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Publication number: JP4877509B2
Application number: JP2007028900A
Authority: JP
Inventors: 功二田守; 正昭宮路
Original assignee: JSR Corp
Current assignee: JSR Corp
Priority date: 2007-02-08
Filing date: 2007-02-08
Publication date: 2012-02-15
Anticipated expiration: 2027-02-08
Also published as: JP2008191129A

Description

本発明は、例えば免疫診断用粒子の表面に適用可能なブロッキング剤ならびにプローブ結合粒子およびその製造方法に関する。

近年、疾病の早期発見等の目的のため、検査の高感度化が求められており、診断薬の感度向上は大きな課題となっている。磁性粒子などの固相を用いた診断薬においても、感度向上のため、検出方式として酵素発色を用いる方式から、より高い感度が得られる蛍光や化学発光を用いる方式へと切り替わりつつある。これらの検出技術の発展により、理論上は一分子の検査対象物質の存在まで検出できるレベルに達しているといわれているが、実際には十分な感度が得られていない。その原因としては、血清などの生体分子混在下で特定の物質を検出する診断では、共存する生体分子や２次抗体、発光基質などが固相へ非特異的に吸着し、その結果、ノイズが増加して高感度化の妨げとなっている。そのため、免疫診断測定においては、特異的に結合する物質以外の物質が免疫反応に使用する固相表面に非特異的に吸着することによる感度の低下を軽減するため、通常、アルブミン、カゼイン、ゼラチン等の生物由来物質をブロッキング剤として用いることにより、非特異吸着を抑制して、ノイズを低減させている。

しかしながら、従来法によるブロッキング操作を施しても、なお、非特異的な吸着が残り、さらに、生体由来のブロッキング剤を用いる場合、ＢＳＥに代表される生物汚染の問題があることなどから、化学合成による高性能のブロッキング剤の開発が望まれている。

化学合成によるブロッキング剤としては、特開平１１−２８７８０２号公報や特許第３４０７３９７号にポリオキシエチレンを有するポリマーが提案されているが、ノイズ低減効果は不十分であった。
特開平１１−２８７８０２号公報特許第３４０７３９７号公報

本発明の目的は、製造が容易であり、十分なノイズ低減効果を有する化学合成のブロッキング剤ならびにプローブ結合粒子およびその製造方法を供することである。

本発明者らは、この課題を解決するために、ブロッキング剤として製造が容易な合成方法を見いだし、さらには、本ブロッキング剤を用いて、免疫診断用粒子を処理することにより、該粒子がシグナル増強効果を発現することを見いだし、本発明を完成した。

本発明の一態様に係るブロッキング剤は、
下記式（１）で示される官能基を有する水溶性重合体からなる。
−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ_２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２（ＯＨ）・・・・・（１）

上記ブロッキング剤において、前記水溶性重合体は、２，３−ジヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート５０〜９９質量部と、その他のモノマー５０〜１質量部とを共重合して得ることができる。

本発明の一態様に係るプローブ結合粒子の製造方法は、
粒子の表面にプローブを結合させる工程と、
上記ブロッキング剤を用いて、前記プローブが結合された前記粒子を処理する工程と、を含む。

上記プローブ結合粒子の製造方法において、前記プローブを結合させる工程において、前記粒子は、カルボキシル基、活性エステル基、トシル基、アミノ基、およびエポキシ基から選ばれる少なくとも１種の基を有することができる。

上記プローブ結合粒子の製造方法において、前記粒子は、磁性粒子であることができる。

本発明の一態様に係るプローブ結合粒子は、下記式（１）で示される官能基を有する。
−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ_２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２（ＯＨ）・・・・・（１）

本発明の一態様に係るプローブ結合粒子は、上記プローブ結合粒子の製造方法によって得られる。

本発明の一態様に係るプローブ結合粒子は、上記ブロッキング剤を表面に有する。

上記ブロッキング剤は、製造が容易であり、かつ、化学合成により製造できることから生物汚染の可能性がないうえ、従来用いられてきたブロッキング剤に比べて、ノイズ低減効果が高い。

また、上記ブロッキング剤は、免疫診断に使用される粒子（例えば磁性粒子）に用いた場合にシグナル増強効果を発現することができる。

以下、本発明の一実施形態に係るブロッキング剤ならびにプローブ結合粒子およびその製造方法について説明する。

１．ブロッキング剤ならびにプローブ結合粒子およびその製造方法
１．１．ブロッキング剤の構造
本発明の一実施形態に係るブロッキング剤は、下記式（１）で示される官能基を有する水溶性重合体からなる。
−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ_２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２（ＯＨ）・・・・・（１）

水溶性重合体中に含まれる上記式（１）で示される官能基の量は、好ましくは１ｍｍｏｌ／ｇ以上、さらに好ましくは２ｍｍｏｌ／ｇ以上、最も好ましくは３〜６ｍｍｏｌ／ｇである。官能基の量が１ｍｍｏｌ／ｇ未満である場合、ノイズ低減効果に劣る場合がある。

水溶性重合体は、上記式（１）で示される官能基以外に、上記式（１）で示される官能基に含まれる水酸基以外の水酸基、アルコキシアルキル基、ポリオキシエチレン基、カルボキシル基、カルボニル基、スルホン基、１級〜４級アミノ基、アミド基などの親水基；アルキル基、アリール基、カルボン酸アルキルエステル基などの疎水基を側鎖として含んでいてもよい。

水溶性重合体の分子量は、好ましくは２，０００以上、さらに好ましくは５，０００以上、最も好ましくは１万〜１０万である。

水溶性重合体は、上記式（１）で示される官能基を側鎖に有することが好ましい。この場合、水溶性重合体の主鎖としては、例えば、ポリエチレン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカーボネートなどを挙げることができ、製造が容易であることから、好ましい主鎖はポリエチレンである。

水溶性重合体としては、例えば、２，３−ジヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート（以下、「グリセロール（メタ）アクリレート」ともいう。）の重合体、グリセロール（メタ）アクリレートとその他のモノマーとの共重合体、ビニル安息香酸グリセロールの重合体、ビニル安息香酸グリセロールとその他のモノマーとの共重合体、グルタミン酸グリセロールの重合体、グルタミン酸グリセロールとその他のモノマーとの共重合体（ポリアミド）、ヒアルロン酸グリセロールエステル誘導体の重合体、ヒアルロン酸グリセロールエステル誘導体とその他のモノマーとの共重合体（ポリエーテル）などが挙げられ、好ましくは、グリセロール（メタ）アクリレートとその他のモノマーとの共重合体である。

１．２．ブロッキング剤の製造
本実施形態に係るブロッキング剤は、例えば、グリセロール（メタ）アクリレート、ビニル安息香酸グリセロール、グルタミン酸グリセロール、ヒアルロン酸グリセロールエステル誘導体などのモノマーを重合することにより製造することができる。このとき、その他のモノマーとの共重合にすることも好ましい。

中でも、本実施形態に係るブロッキング剤として好ましいグリセロール（メタ）アクリレート共重合体の重合方法としては、例えば、（１）グリセロール（メタ）アクリレートとその他のモノマーを共重合する方法、（２）グリシジル（メタ）アクリレートとその他のモノマーを共重合し、グリシジル基を加水分解する方法などが挙げられ、より好ましくは（１）の方法である。

（１）の重合方法で、好ましいモノマーの比率は、グリセロール（メタ）アクリレート５０〜９９質量部とその他のモノマー５０〜１質量部であり、さらに好ましいモノマーの比率は、グリセロール（メタ）アクリレート６０〜９８質量部とその他のモノマー４０〜２質量部である。

その他のモノマーとしては、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、アリルアルコールなどの水酸基を有するモノマー；メトキシエチル（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールエチルエーテル（メタ）アクリレートなどのアルコキシアルキル基を有するモノマー；ポリエチレングリコール（メタ）アクリルエステル、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリルエステルなどのポリオキシエチレン基を有するモノマー；アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、無類マレイン酸、クロトン酸などのカルボキシル基を有するモノマー；ダイアセトンアクリルアミド、アクロレイン、ホルミルスチロールなどのカルボニル基を有するモノマー；スチレンスルホン酸、イソプレンスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸などのスルホン基を有するモノマー；アリルアミン、アミノスチレン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドのメチルクロライド４級塩などの１級〜４級アミノ基を有するモノマー；（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミドなどのアミド基を有するモノマー；（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ラウリル、（メタ）アクリル酸シクロヘキシル、（メタ）アクリル酸イソボニル、（メタ）アクリル酸ベンジル、スチレンなどの疎水性モノマーを挙げることができる。

これらのモノマーのうち、アミノ基を有するモノマーを共重合することにより、アニオン性の固相表面とクーロン結合することが可能となり、ブロッキング効果を高めることが可能である。また、疎水性モノマーを共重合することにより、疎水性の固相表面と疎水結合することが可能となり、ブロッキング効果を高めることが可能である。

本実施形態に係るブロッキング剤は、これらのモノマーと、必要に応じて副原料である重合開始剤、界面活性剤、電解質、分子量調節剤などを必要に応じて添加し、水、アルコール、ＴＨＦ、ＤＭＦあるいはこれらの混合液などの溶媒中で重合を行うことにより得ることができる。重合時間は好ましくは１〜２４時間、重合温度は好ましく０〜１２０℃である。

なお、重合開始剤として、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）ジハイドロクロライド（和光純薬工業社製「Ｖ−５０」）、２，２’−アゾビス（１−イミノ−１−ピロリジノ−２−エチルプロパン）ジハイドロクロライド（和光純薬工業社製「ＶＡ−０６７」）などのカチオン性重合開始剤を使用することにより、ブロッキング剤がアニオン性の固相表面とクーロン結合することが可能となり、ブロッキング効果を高めることが可能である。このような重合開始剤の使用量は、モノマーの総量１００質量部に対して好ましくは０．０２〜５質量部である。

１．３．ブロッキング剤の用途ならびにプローブ結合粒子およびその製造
本実施形態に係るブロッキング剤は、従来の免疫診断測定において用いられたアルブミン、カゼイン、ゼラチン等を代替することにより、さらに非特異吸着を抑制して、ノイズを低減することができる。

例えば、プレート法において、プレートへ抗体などのプローブを結合した後、本実施形態に係るブロッキング剤を添加して、プレート表面を処理することができる。

また、本実施形態に係るブロッキング剤は例えば、プローブ結合粒子の製造に好適に使用することができる。本実施形態に係るプローブ結合粒子の製造方法は、粒子の表面にプローブを結合させる工程と、本実施形態に係るブロッキング剤を用いて、プローブが結合された粒子を処理する工程とを含む。

ここで、本実施形態に係るブロッキング剤を用いて、プローブが結合された粒子を処理する工程は、例えば、本実施形態に係るブロッキング剤を粒子の表面に所定時間接触させることにより行うことができる。これにより、粒子表面における非特異吸着を抑制し、ノイズを低減することができる。また、この工程は例えば、本実施形態に係るブロッキング剤の溶液中に粒子を分散させた状態で行うことができる。

この場合、プローブを結合させる粒子は、カルボキシル基、活性エステル基、トシル基、アミノ基、およびエポキシ基から選ばれる少なくとも１種の基を少なくとも表面に有することが好ましい（その理由については後述する）。また、この場合、粒子は磁性粒子であることが好ましい。

より具体的には、例えば、イムノクロマト法において、着色粒子に抗体などのプローブを結合させた後、本実施形態に係るブロッキング剤を添加して、着色粒子の表面を処理することにより、プローブ結合粒子を得ることができる。また、例えば、ＥＩＡ、ＣＬＩＡ、ＣＬＥＩＡなどのアッセイ法において、磁性粒子の表面に抗体などのプローブを結合させた後、本実施形態に係るブロッキング剤を添加して、該磁性粒子の表面を処理することにより、プローブ結合粒子を得ることができる。

以上に説明したように、本実施形態に係るブロッキング剤は、上記式（１）で示される官能基を有する水溶性重合体からなることにより、非特異吸着を抑制して、ノイズを低減することができる。

本実施形態に係るブロッキング剤を用いて、特にトシル基、エポキシ基などの活性基を少なくとも表面に有する粒子（例えば磁性粒子）を処理する場合、ブロッキング剤中の水酸基と粒子表面の活性基とが共有結合を形成し、免疫診断用抗体の配向性を向上させることから、シグナルを増強する効果が発現する。同様に、カルボキシル基、活性エステル基などの活性基を少なくとも表面に有する粒子に対して、アミノ基を有するブロッキング剤を共有結合させる方法や、アミノ基などの活性基を少なくとも表面に有する粒子に対して、活性エステル基を有するブロッキング剤を共有結合させる方法もシグナルを増強する方法として有効である。また、ブロッキング剤の脱離を抑制することができるため、界面活性剤などを含むバッファー類に対して、極めて安定性に富んだ検査試薬となる。

本実施形態に係るブロッキング剤が特に良好な効果を発現する担体は、カルボキシル基を有する粒子（例えば磁性粒子）である。その好ましい処理方法としては、カルボキシル基を有する粒子を水溶性カルボジイミドなどで活性エステルとし、免疫診断プローブを結合した後、本実施形態に係るブロッキング剤（シグナル増強剤）で処理する方法が挙げられる。

本実施形態に係るプローブ結合粒子は、上述のプローブ結合粒子の製造方法によって得ることができる。例えば、本実施形態に係るプローブ結合粒子は、上述のブロッキング剤を表面に有することができる。すなわち、本実施形態に係るプローブ結合粒子は、上記式（１）で示される官能基を有する。

２．実施例
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。

２．１．実施例１
グリセロールメタクリレート９５ｇおよびメチルメタクリレート５ｇを水１６７ｇ、イソプロパノール３３３ｇの混合溶媒に溶解して攪拌機付きセパラブルフラスコに入れた。これに窒素を吹き込みながら、７０℃まで昇温し、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）ジハイドロクロライド０．２ｇを添加した後、４時間重合を続け、さらに８０℃に昇温して２時間エージングした後、室温まで冷却した。得られた共重合体溶液を透析により精製し、さらに凍結乾燥することにより、本実施例のブロッキング剤（Ａ−１）８２ｇを得た。Ａ−１に含まれる式（１）の官能基の濃度は、５．９ｍｍｏｌ／ｇに相当する。液体クロマトグラフィーによる分子量分布は、分子量１２，０００をメインピークとするブロードなピークであった。

カルボキシル基を有する磁性粒子（商品名「ＭＡＧ１１０１」、ＪＳＲ社製）１ｍｇを分散させた固形分濃度１％の水分散体に、１−エチル−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（同仁化学社製）水溶液を添加して室温で２時間回転攪拌することにより、カルボキシル基を活性化した。これを磁気分離して上清を捨てた後、腫瘍マーカーであるヒトαフェトプロテイン（以下、「ＡＦＰ」という。）に対する抗体（以下、「抗ＡＦＰ抗体」という。コスモ・バイオ株式会社製）１０μｇを加え１５時間室温で反応した。反応後、ブロッキング剤（Ａ−１）の０．４％水溶液１２５μＬを加え、さらに１時間室温で攪拌した。これを磁気分離し、洗浄液（２５ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有）で繰り返し洗浄した後、粒子濃度０．５％になるように洗浄液で希釈し、一次プローブとして抗ＡＦＰ抗体を結合したタンパク結合粒子（免疫検査用粒子）を得た。得られた免疫検査用粒子の分散液１０μｌ（粒子５０μｇ相当）をテストチューブに取り、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡＦＰ抗原（日本バイオテスト社製）の標準検体５０μｌと混合し、３７℃で１０分間反応させた。磁気分離して粒子を分離し上清を除いた後、２次抗体としてアルカリフォスファターゼ（以下、「ＡＬＰ」という。）で標識した抗ＡＦＰ抗体（富士レビオ株式会社製、ルミパルスＡＦＰ−Ｎに付属の試薬を使用）４０μｌを添加し、３７℃で１０分間反応させた。次いで、磁気分離し上清を除いた後、ＰＢＳで３回洗浄を繰り返して得られた粒子を５０μｌの０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０に分散させ、新しいチューブに移し替えた。ＡＬＰの基質液（ルミパルス基質液：富士レビオ株式会社製）１００μｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、化学発光量を測定することによりシグナル強度を得た。化学発光量の測定には、ベルトールジャパン株式会社製の化学発光測定装置（商品名「ＬｕｍａｔＬＢ９５０７」）を用いた。その結果、シグナル強度は１２６，３７７ＲＩＵであった。

また、上記ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡＦＰ抗原の標準検体５０μｌの代わりに、ＡＦＰ抗原を含まないＦＣＳ５０μｌを用いた以外は、上記と同様にして化学発光量を測定することにより得られたノイズ強度は、６５ＲＩＵであった。

２．２．比較例１
実施例１において、グリセロールメタクリレートの代わりにポリエチレングリコールメタクリレートを使用した以外は、実施例１と同様にして、上記式（１）で示される官能基を有さないブロッキング剤を得た。本比較例で得られたブロッキング剤の液体クロマトグラフィーによる分子量分布は、分子量２４，０００をメインピークとするブロードなピークであった。また、本比較例で得られたブロッキング剤を用いて、実施例１と同様の方法にて磁性粒子を処理して、シグナル強度およびノイズ強度を求めた。その結果、シグナル強度は、１０９，０３３ＲＩＵであり、ノイズ強度は、１０３ＲＩＵであった。

２．３．比較例２
実施例１において、ブロッキング剤（Ａ−１）の代わりに牛血清アルブミンを使用した以外は、実施例１と同様の方法にて磁性粒子を処理して、シグナル強度およびノイズ強度を求めた。その結果、シグナル強度は、９７，６２５ＲＩＵであり、ノイズ強度は、８５ＲＩＵであった。

２．４．比較例３
実施例１において、ブロッキング剤（Ａ−１）を使用しなかった以外は、実施例１と同様の方法にて磁性粒子を処理して、シグナル強度およびノイズ強度を求めた。その結果、シグナル強度は、９４，７５３ＲＩＵであり、ノイズ強度は、１２１ＲＩＵであった。

Claims

下記式（１）で示される官能基を有する水溶性重合体からなるブロッキング剤。
−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ_２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２（ＯＨ）・・・・・（１）
請求項１において、
前記水溶性共重合体は、２，３−ジヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート５０〜９９質量部と、その他のモノマー５０〜１質量部とを共重合して得られる、ブロッキング剤。
粒子の表面にプローブを結合させる工程と、
前記プローブが結合された前記粒子を、請求項１または２に記載のブロッキング剤を用いて処理する工程と、
を含む、プローブ粒子の製造方法。
請求項３において、
前記プローブを結合させる工程において、前記粒子は、カルボキシル基、活性エステル基、トシル基、アミノ基およびエポキシ基から選ばれる少なくとも１種の基を有する、プローブ結合粒子の製造方法。
請求項３または４において、
前記粒子は、磁性粒子である、プローブ結合粒子の製造方法。
請求項３ないし５のいずれかに記載のプローブ結合粒子の製造方法によって得られるプローブ結合粒子。
請求項１または２に記載のブロッキング剤を表面に有する、プローブ結合粒子。