JP5329658B2 - 検出対象の検出方法及び定量方法 - Google Patents

Description

本発明は、検出対象の検出方法及び定量方法に関する。

従来から、被検体中の検出対象を検出する方法として、ラテックス凝集法が利用されてきた。ラテックス凝集法とは、生体試料等の流体中における抗原を検出する場合、抗原に特異的に結合する抗体もしくはそのフラグメントを担持させたラテックスと、流体とを混合して、ラテックスの凝集の程度を測定することにより、抗原を検出又は定量する方法である（例えば、特許文献１参照）。

このラテックス凝集法によれば、検体として添加された抗原が複数のラテックス結合抗体を架橋させ、ラテックスの凝集を促す。このように手順が単純であるから、簡便且つ迅速に抗原を検出できる。しかし、抗原が微量の場合、その架橋が起こりにくいため、ラテックスが十分に凝集しない。このため、微量の抗原を検出することが困難であった。

そこで、ＥＬＩＳＡ法やＣＬＥＩＡ法といった酵素基質反応を利用する方法も広く利用されている。これらの方法では、例えば、抗原に特異的に結合する一次抗体を抗原に結合させ、この一次抗体に酵素を有する二次抗体を結合させる。ここで、酵素の基質を添加し、酵素が触媒する反応の程度を測定することで、抗原を検出又は定量する。

これらの方法によれば、例えば基質として発光試薬を用いると、基質添加後の発光の検出感度が高いため、微量の抗原も検出できる。

しかし、酵素基質反応を利用する方法では、二次抗体や発光試薬等の特殊な試薬が多数必須であり、作業コストが高い。また、発光試薬の退色（ブリーチング現象）を抑制する必要から、測定工程を極めて短時間に終了せざるを得ないため、測定精度が不充分になることが懸念される。

一方、この方法は、試料及び各試薬をインキュベーションする工程、系を洗浄する工程、発光を測定する工程等の多段階からなっており、操作が煩雑である。しかも、各段階に要する時間が極めて長く、大規模処理には適さない。

特公昭５８−１１５７５号公報

そこで、本発明者らは、刺激応答性ポリマーを含有する物質と検出対象に対する親和性物質とが結合した結合物、並びに電荷を有する物質と検出対象に対する親和性物質とが結合した結合物を用いた、検出対象の検出及び定量技術を開発した（国際公開ＷＯ２００８／００１８６８号パンフレット）。この技術は、上記２種類の結合物と検体とを混合した混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する条件下においた後、濁度測定等によって刺激応答性ポリマーの凝集の程度が低下したと判定された場合には、検体中に検出対象が存在すると判別するものである。

この技術によれば、刺激応答性ポリマーを含有する物質、親和性物質及び電荷を有する物質のみを用いて達成され、特殊な試薬を特に使用することなく行われるので、安価且つ簡便である。また、凝集阻害の程度を測定するだけであり、酵素によって触媒される反応を利用する系ではないから、迅速に行うことができる。

しかし、上記技術では、検出対象の存在の判別のために、濁度測定等を行う精密機器が必要になる場合が多く、検出や定量を設備が整った実験室等の環境で行うことが望まれる。しかし、環境汚染検査、食品検査等の場合には、実験室外等の設備が整っていない場所で検出及び定量を行うことが一般的であるため、検出対象の存在の判別が困難である。

本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、種々の環境において、検出対象を迅速、安価、簡便且つ高精度に検出、定量できる検出対象の検出方法及び定量方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、２種類の結合物と検体との混合物を展開担体に展開させると、検出対象の存在の有無によって、展開担体における前記結合物の存在に起因する信号が大きく異なることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、本発明は以下の構成を有する。

［１］ 検体中の検出対象を検出する方法であって、
刺激応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、親水性を有する第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、前記検体とを混合し、
得られた混合物を前記刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、前記混合物を展開担体に展開させ、又は得られた混合物を展開担体に展開させ、前記混合物を前記刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、
前記展開担体における第１の結合物又は第２の結合物の存在に起因する信号を確認し、前記信号が、前記検出対象の非存在下と異なる場合には、前記検体中に検出対象が存在すると判別する工程を含む方法であり、
第１の親和性物質と第２の親和性物質とが、前記検出対象の異なる部位に結合できる方法。
［２］ 第１の結合物の存在に起因する信号の強度が、前記検出対象の非存在下よりも弱い場合に、前記検体中に検出対象が存在すると判別する［１］記載の方法。
［３］ 前記混合物は、第１の結合物の凝集体を除去した後に前記展開担体に展開させ、
第１の結合物の存在に起因する信号の強度が、前記検出対象の非存在下よりも強い場合に、前記検体中に検出対象が存在すると判別する［１］記載の方法。
［４］ 検体中の検出対象を定量する方法であって、
刺激応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、親水性を有する第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、前記検体とを混合し、
得られた混合物を前記刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、前記混合物を展開担体に展開させ、又は得られた混合物を展開担体に展開させ、前記混合物を前記刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、
前記展開担体における第１の結合物又は第２の結合物の存在に起因する信号の強度を測定し、前記検出対象の量と信号強度との前記所定条件下における相関式に基づいて、前記検体中の検出対象の量を算出する工程を含む方法であり、
第１の親和性物質と第２の親和性物質とが、前記検出対象の異なる部位に結合できる方法。
［５］ 第１の結合物の凝集体の存在に起因する信号を測定する［４］記載の方法。
［６］ 前記混合物は、第１の結合物の凝集体を除去した後に前記展開担体に展開させ、
第１の結合物の存在に起因する信号の強度を測定する［４］記載の方法。
［７］ 第１の結合物は有色粒子を有し、
前記信号は、前記有色粒子の存在に基づく色に依存したものである［１］から［６］いずれか記載の方法。
［８］ 第１の結合物又は第２の結合物は、前記展開担体上で発色もしくは発光する物質を有し、
前記信号は、前記発色もしくは発光する物質の存在に基づく色又は光に依存したものである［１］から［７］いずれか記載の方法。
［９］ 検出対象を検出及び／又は定量するためのキットであって、
刺激応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、親水性を有する第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、
前記結合物を展開するための展開担体と、を備えるキット。
［１０］ 第１の結合物は有色粒子を有する［９］記載のキット。
［１１］ 第１の結合物又は第２の結合物は、前記展開担体上で発色もしくは発光する物質を有する［９］又は［１０］記載のキット。

本発明によれば、検出対象が存在する場合、この結合対象に第１の親和性物質及び第２の親和性物質が結合するため、第１の親和性物質に結合した刺激応答性ポリマーと、第２の親和性物質に結合した第２の物質が接近する。これにより、電荷部分又は親水性部分が刺激応答性ポリマーの近傍に配置されるため、刺激に応答した刺激応答性ポリマーの凝集が阻害される。このため、混合物を展開担体に展開させたときの信号が、検出対象の存在量に応じて変化するので、この変化の有無や程度に基づいて、検出対象を簡便に検出又は定量することができる。

以上の手順は、いずれも特殊な試薬、機器を特に使用することなく行われるので、種々の環境において、安価且つ簡便に実施できる。また、展開後の信号を確認するだけであり、酵素によって触媒される反応を利用する系ではないから、迅速に行うことができる。

本発明の一実施形態に係る方法において使用される結合物の概略構成図である。 前記実施形態に係る結合物の使用状態を示す模式図である。 本発明の一実施形態に係る方法の手順を示す図である。 本発明の別の実施形態に係る方法の手順を示す図である。 本発明の別の実施形態に係る方法の手順を示す図である。 本発明の別の実施形態に係る方法で用いる展開担体を備える展開器具の平面図である。 図６の展開器具のＶＩＩ−ＶＩＩ線断面図である。 図６の展開担体の変化を示す図である。 本発明の一実施例に係る方法を実施した結果を示す写真である。 本発明の別の実施例に係る方法を実施した結果を示す写真である。

以下、本発明の一実施形態について、図面を参照しながら説明する。

＜検出方法＞
〔混合・凝集〕
本発明の検出方法では、まず、結合物及び検体を混合し、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におく。ここで用いる結合物は少なくとも２種であり、そのうち必須の構成要素である第１の結合物、及び第２の結合物について詳細に説明する。

［第１の結合物］
第１の結合物は、刺激応答性ポリマーを含有する第１の物質と、検出対象に対する第１の親和性物質とが結合したものである。

（第１の物質）
本発明で用いられる第１の物質は刺激応答性ポリマーを含有する物質であり、この刺激応答性ポリマーは、外的な刺激に応答して構造変化を起こし、凝集及び分散を調整できるポリマーである。刺激としては、特に限定されないが、温度変化、光の照射、酸又は塩基の添加（ｐＨの変化）、電場変化等が挙げられる。

特に、本発明では、刺激応答性ポリマーとしては、温度変化によって凝集及び分散可能な温度応答性ポリマーが利用できる。なお、温度応答性ポリマーとしては、下限臨界溶液温度（以下、ＬＣＳＴとも称する）を有するポリマーや上限臨界溶液温度を有するポリマー（以下、ＵＣＳＴとも称する）が挙げられる。例えば、ＬＣＳＴが３７℃である下限臨界溶液温度を有するポリマーは、ＬＣＳＴ未満の温度の水溶液中では完全に分散し、ＬＣＳＴ以上に水温を上昇させると直ちに凝集させることができる。また、ＵＣＳＴが５℃である上限臨界溶液温度を有するポリマーは、ＵＣＳＴを超える温度の水溶液中では完全に分散し、ＵＣＳＴ以下に水温を下降させると直ちに凝集させることができる。

本発明で用いられる下限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−メタクリロイルピロリジン、Ｎ−メタクリロイルピペリジン、Ｎ−メタクリロイルモルホリン等のＮ置換（メタ）アクリルアミド誘導体からなるポリマー；ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール部分酢化物、ポリビニルメチルエーテル、（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン）ブロックコポリマー、ポリオキシエチレンラウリルアミン等のポリオキシエチレンアルキルアミン誘導体；ポリオキシエチレンソルビタンラウレート等のポリオキシエチレンソルビタンエステル誘導体；（ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）（メタ）アクリレート類；及び（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオレイルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルエーテル）（メタ）アクリレート類等のポリオキシエチレン（メタ）アクリル酸エステル誘導体等が挙げられる。更に、これらのポリマー及びこれらの少なくとも２種のモノマーからなるコポリマーも利用できる。また、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとＮ−ｔ−ブチルアクリルアミドのコポリマーも利用できる。（メタ）アクリルアミド誘導体を含むポリマーを使用する場合、このポリマーにその他の共重合可能なモノマーを、下限臨界溶液温度を有する範囲で共重合してもよい。本発明では、なかでも、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−メタクリロイルピロリジン、Ｎ−メタクリロイルピペリジン、Ｎ−メタクリロイルモルホリンからなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマーからなるポリマー又はＮ−イソプロピルアクリルアミドとＮ−ｔ−ブチルアクリルアミドのコポリマーが好ましく利用できる。また、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙ（Ｘはプロリン以外のアミノ酸）に代表されるようなペンタポリペプチドの繰返し配列を持つエラスチン由来ポリペプチド等も利用できる。

本発明で用いられる上限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、アクリロイルグリシンアミド、アクリロイルニペコタミド、アクリロイルアスパラギンアミド及びアクリロイルグルタミンアミド等からなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマーからなるポリマーが利用できる。また、これらの少なくとも２種のモノマーからなるコポリマーであってもよい。これらのポリマーには、アクリルアミド、アセチルアクリルアミド、ビオチノールアクリレート、Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−メタクリロイルトリメチレンアミド、アクリロイルザルコシンアミド、メタクリルザルコシンアミド、アクリロイルメチルウラシル等、その他の共重合可能なモノマーを、上限臨界溶液温度を有する範囲で共重合してもよい。

また、本発明では、刺激応答性ポリマーとして、ｐＨの変化によって凝集及び分散可能なｐＨ応答性ポリマーが利用できる。ｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨは、特に限定されないが、刺激付与時における第１の結合物、後述の第２の結合物、及び検体の変性等による検出・定量精度の低下を抑制できる点で、ｐＨ４〜１０が好ましく、ｐＨ５〜９であることが更に好ましい。

このようなｐＨ応答性ポリマーとしては、カルボキシル、リン酸、スルホニル、アミノ等の基を官能基として含有するポリマーが例示できる。より具体的には、（メタ）アクリル酸、マレイン酸、スチレンスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、ホスホリルエチル（メタ）アクリレート、アミノエチルメタクリレート、アミノプロピル（メタ）アクリルアミド、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド等の解離基を有するモノマーが重合されたものであってもよく、これら解離基を有するモノマーと、ｐＨ応答能が損なわれない程度において、他のビニルモノマー、例えばメチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル類、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類、スチレン、塩化ビニル、Ｎ−ビニルピロリドン等のビニル化合物、（メタ）アクリルアミド類等とが共重合されたものであってもよい。

（微粒子）
第１の物質は、刺激応答性ポリマー及び後述の親和性物質を担持する微粒子を含有してもよい。ここで用いる微粒子は、凝集の程度に応じて展開担体上の信号が変化するように、単独では後述の展開担体の孔径よりも小さく、且つ、凝集した際には展開担体の孔径よりも大きくなるような平均粒子径を有する必要があるが、その具体的組成は刺激応答性ポリマー及び親和性物質を担持できる限りにおいて特に限定されない。

従来のラテックス凝集法では、検出対象の存在に応じてラテックスが凝集し、その凝集を検出する必要があるところ、検出感度を向上するために微粒子が大きい粒子径を有することが好ましい。対照的に、本発明の方法では、微粒子が小さい粒子径になる程、単位体積あたりの比表面積が増し、検出対象の結合の増加による刺激応答性ポリマーの凝集阻害が効率的になるので、微粒子の粒子径が小さいことが好ましい。ただし、微粒子の平均粒子径は、非凝集時には展開担体の孔径よりも小さく、凝集した際には展開担体の孔径よりも大きくなるよう設定される必要がある。このように、微粒子を用いる場合には、微粒子の平均粒子径は、凝集阻害の効率、凝集の仕方（特に径の変化）、及び展開担体の孔径等を考慮して適宜設定されてよい。一般的に、その平均粒子径の下限は、０．００１μｍであることが好ましく、より好ましくは０．０１０μｍ、最も好ましくは０．１μｍであり、上限は０．５μｍであることが好ましく、より好ましくは０．３μｍ、最も好ましくは０．２μｍである。

微粒子は、展開担体への展開時に色に依存した信号を形成し、その信号が容易に確認又は測定できる点で、有色粒子であることが好ましい。有色粒子は、特に限定されず、金属コロイド粒子（例えば金コロイド粒子）、ポリスチレンラテックス等の合成高分子、ゼラチン等の天然高分子からなる均質な球状粒子等であってよい。ただし、第１の結合物は、本発明の方法のみならず、国際公開ＷＯ２００８／００１８６８号パンフレットに記載される検出方法にも使用でき、この場合には磁力付加により凝集体を分離することで、検出精度を向上できる（詳細は国際公開ＷＯ２００８／００１８６８号パンフレット）。そこで、汎用性を向上するべく、微粒子は磁性物質を含むことが好ましく、かかる磁性物質は、多価アルコールとマグネタイトとで構成されてよい。

多価アルコールは、構成単位に水酸基を少なくとも２個有し且つ鉄イオンと結合可能なアルコール構造体である限りにおいて特に限定されず、例えば、デキストラン、ポリビニルアルコール、マンニトール、ソルビトール、シクロデキストリンが挙げられる。例えば特開２００５−８２５３８公報には、デキストランを用いた微粒子状の磁性物質の製造方法が開示されている。また、グリシジルメタクリレート重合体のようにエポキシを有し、開環後多価アルコール構造体を形成する化合物も使用できる。

（第１の親和性物質）
第１の親和性物質は、例えば、検出対象の異なる抗原決定基を認識するモノクローナル抗体であってよい。ここで用いる抗体は、いかなるタイプの免疫グロブリン分子であってもよく、Ｆａｂ等の抗原結合部位を有する免疫グロブリン分子断片であってもよい。また、抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。

［第１の結合物の作製］
第１の結合物は、第１の物質と第１の親和性物質とを結合することによって作製する。この結合方法は、特に限定されないが、例えば、第１の物質側（例えば刺激応答性ポリマー部分）及び第１の親和性物質（例えば、第１の抗体）側の双方に、互いに親和性の物質（例えば、アビジン及びビオチン、グルタチオン及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ）を結合させ、これら物質を介して第１の物質及び第１の親和性物質を結合させる。

具体的には、刺激応答性ポリマーへのビオチンの結合は、国際公開ＷＯ０１／００９１４１に記載されているように、ビオチン等をメタクリルやアクリル等の重合性官能基と結合させて付加重合性モノマーとし、他のモノマーと共重合することにより行うことができる。また、第１の親和性物質へのアビジン等の結合は常法に従って行うことができる。次に、ビオチン結合刺激応答性ポリマー及びアビジン結合第１の親和性物質を混合すると、アビジンとビオチンとの結合を介して、第１の親和性物質及び刺激応答性ポリマーが結合する。

別法として、ポリマーの製造時にカルボキシル、アミノ又はエポキシ等の官能基を持つモノマーを他のモノマーと共重合させ、この官能基を介し、当技術分野で周知の方法に従って抗体親和性物質（例えば、メロンゲル、プロテインＡ、プロテインＧ）をポリマーに結合させる方法が利用できる。このようにして得られた抗体親和性物質に第１の抗体を結合させることにより、刺激応答性ポリマーと、検出対象の抗原に対する第１の抗体との第１の結合物が作製される。

あるいは、ポリマーの製造時にカルボキシル、アミノ又はエポキシ等の官能基を有するモノマーを他のモノマーと共重合させ、これらの官能基に検出対象の抗原に対する第１の抗体を常法に従って直接結合させてもよい。

あるいは、微粒子状の磁性物質に第１の親和性物質及び刺激応答性ポリマーを結合させてもよい。

第１の物質を刺激応答性ポリマーが凝集する条件においた後、遠心分離によって分離することで、第１の結合物を精製してもよい。第１の結合物の精製は、刺激応答性ポリマーに微粒子状の磁性物質を結合させ、更に第１の親和性物質を結合させた後、刺激応答性ポリマーが凝集する条件におき、磁力を付加して磁性物質を回収する方法によって行ってもよい。

微粒子状の磁性物質と刺激応答性ポリマーとの結合は、反応性官能基を介して結合する方法や、磁性物質中の多価アルコール上の活性水素又は多価アルコールに重合性不飽和結合を導入してグラフト重合する方法等の当技術分野で周知の方法で行ってよい（例えば、ＡＤＶ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．、Ｖｏｌ．４、ｐ１１１、１９６５やＪ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ．、Ｐａｒｔ−Ａ、３、ｐ１０３１、１９６５参照）。

［第２の結合物］
本発明の方法では、第１の結合物に加えて、親水性を有する第２の物質と、検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物を用いる。これにより、検出感度を向上することができる。

（第２の物質）
親水性を有する第２の物質は、例えば電荷を有する高分子化合物であり、ポリアニオン又はポリカチオンであることが好ましい。ポリアニオンとは複数のアニオン基を有する物質を意味し、ポリカチオンとは複数のカチオン基を有する物質を意味する。ポリアニオンの例として、ＤＮＡ及びＲＮＡ等の核酸が挙げられる。これらの核酸は、核酸骨恪に沿って複数個のホスホジエステル基が存在することにより、ポリアニオンの性質を有する。また、ポリアニオンには、多数のカルボキシルを含むポリペプチド（グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸からなるポリペプチド）、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスルホン酸及びアクリル酸やメタクリル酸を重合成分として含有するポリマー、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、及びヘパリン等の多糖等も含まれる。一方、ポリカチオンの例としては、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリアルキルアミン、ポリエチレンイミンやポリプロピルエチレンイミン等が挙げられる。なお、ポリアニオン（カルボキシル）やポリカチオン（アミノ）の官能基数は、２５個以上が好ましい。また、カルボキシル基を持つラテックス粒子等も挙げられる。

また、親水性を有する第２の物質は、例えば水溶性の高分子化合物であり、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド等のエーテル結合を含有する高分子、ポリビニルアルコール等のアルコール性水酸基を含有する高分子、デキストラン、シクロデキストリン、アガロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の水溶性多糖類、中性アミノ酸を含むポリペプチド等が挙げられる。

これら親水性を有する物質は、高分子鎖の中又は末端に、第２の親和性物質を結合させるための官能基等を有していてもよい。また、親水性を有する第２の物質は、一種単独で利用しても、複数を混合して利用してもよい。

（第２の親和性物質）
第２の親和性物質は、第１の親和性物質とは異なる部位において、第１の親和性物質と同じ検出対象に結合できるものである。第１の親和性物質及び第２の親和性物質は、例えば、検出対象の異なる抗原決定基を認識するモノクローナル抗体であってよい。

［作製方法］
第２の結合物は、第２の物質と第２の親和性物質とを直接又は間接に結合することによって作製する。特に限定されないが、例えば、第２の物質側及び第２の親和性物質（例えば、第２の抗体）側の双方に、互いに親和性の物質（例えば、アビジン及びビオチン、グルタチオン及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ）を結合させ、これら物質を介して第２の物質及び第２の親和性物質を間接的に結合させる。

第２の物質と第２の親和性物質とを直接的に結合させる場合、官能基を介して結合させてもよく、例えば、官能基を用いる場合、ゴッシュらの方法（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、 １、 ７１−７６、１９９０）のマレイミド−チオールカップリングに従って結合できる。具体的には、以下の２つの方法が挙げられる。

第１の方法では、まず、核酸の５’末端にメルカプト基（別名、スルフヒドリル基）を導入する一方、抗体に６−マレイミドヘキサノイックアシッドスクシンイミドエステル（例えば、「ＥＭＣＳ（商品名）」（（株）同仁化学研究所製））を反応させてマレイミド基を導入する。次に、これら２種の物質をメルカプト基及びマレイミド基を介して結合させる。

第２の方法では、まず、第１の方法と同様にして核酸の５’末端にメルカプト基を導入し、このメルカプト基に更にホモ二官能性試薬であるＮ，Ｎ−１，２−フェニレンジマレイミドと反応させることによって核酸の５’末端にマレイミド基を導入する一方、抗体にメルカプト基を導入する。次に、これら２種の物質をメルカプト基及びマレイミド基を介して結合させる。

この他に、核酸をタンパク質に導入する方法としては、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第１５巻５２７５頁（１９８７年）及びＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第１６巻３６７１頁（１９８８年）に記載された方法が知られている。これらの技術は核酸と抗体の結合に応用できる。

Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第１６巻３６７１頁（１９８８年）によると、まず、オリゴヌクレオチドを、シスタミン、カルボジイミド及び１−メチルイミダゾールと反応させることによって、オリゴヌクレオチドの５’末端の水酸基にメルカプト基を導入する。メルカプト基を導入したオリゴヌクレオチドを精製した後、ジチオトレイトールを用いて還元し、この後に２、２’−ジピリジルジスルフィドを加えることによってオリゴヌクレオチドの５’末端にジスルフィド結合を介してピリジル基を導入する。一方、タンパク質に対しては、イミノチアレンを反応させてメルカプト基を導入しておく。これらピリジルジスルフィドを導入したオリゴヌクレオチドとメルカプト基を導入したタンパク質を混合し、ピリジル基とメルカプト基を特異的に反応させてタンパク質とオリゴヌクレオチドを結合させる。

Ｎｕｌｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｃｈ 第１５巻５２７５頁（１９８７年）によると、まず、オリゴヌクレオチドの３’末端にアミノ基を導入しておき、ホモ二官能性試薬であるジチオ−ビス−プロピオニックアシッド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（略称：ジチオ−ビス−プロピオニル−ＮＨＳ）を反応させる。反応後、ジチオトレイトールを添加することによりジチオ−ビス−プロピオニル−ＮＨＳ分子中のジスルフィド結合を還元して、オリゴヌクレオチドの３’末端にメルカプト基を導入する。タンパク質の処理については、特開平５−４８１００号公報に示すようなヘテロ二官能性架橋剤が用いられる。まず、タンパク質中の官能基（例えば、アミノ基）と反応しうる第１の反応性基（スクシンイミド）、及びメルカプト基と反応しうる第２の反応性基（例えば、マレイミド等）を有するヘテロ二官能性架橋剤と、タンパク質を反応させることにより、タンパク質に第２の反応性基を導入し、予め活性化されたタンパク試薬とする。このようにして得られたタンパク試薬をチオール化ポリヌクレオチドのメルカプト基へ共有結合させる。

核酸以外のポリアニオンやポリカチオンを使用する場合にも、これらの末端等にメルカプト基を導入することで、上記と同様の操作で第２の結合物を作製できる。

再び、検出方法の手順の説明に戻る。以上のような２種類の結合物及び検体の混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におくと、検出対象が存在する場合には、刺激応答性ポリマーが検出対象の電荷部分又は親水性部分によって凝集阻害されて分散する。一方、検出対象が存在しない場合には、刺激応答性ポリマーが凝集阻害されず凝集することになる。なお、第１の結合物、第２の結合物、及び検体は、すべてを同時に混合してもよく、１種ずつを別々に混合してもよい。

この現象を、図１〜図２を参照しながら説明する。

図１に示されるように、第１の結合物１０は刺激応答性ポリマー１１を含有し、この刺激応答性ポリマー１１はアビジン１５及びビオチン１７を介して検出対象５０に対する第１の抗体１３に結合されている。また、第１の結合物１０は微粒子状の磁性物質１９を含み、この磁性物質１９の表面に第１の物質としての刺激応答性ポリマー１１が結合されている。一方、第２の結合物２０では、検出対象５０に対する第２の抗体２３と、第２の物質２１とが結合されている。そして、第１の抗体１３及び第２の抗体２３は、検出対象５０の異なる部位に結合できることから、同じ検出対象５０に結合できる。第２の結合物２０は検出対象５０と刺激応答性ポリマー１１とを介して磁性物質１９に接近でき、このとき第２の物質２１が磁性物質１９の近傍に位置することになる。

図２に示されるように、第１の結合物１０、第２の結合物２０及び検体の混合物を所定条件下におくと、検出対象５０が存在する場合には、刺激応答性ポリマー１１が第２の結合物２０中の電荷部分又は親水性部分によって凝集阻害されて分散する。（図２（Ａ））。一方、検出対象５０が存在しない場合には刺激応答性ポリマー１１が凝集阻害されず凝集することになる（（図２（Ｂ））。なお、本実施形態では、第２の結合物２０の電荷部分又は親水性部分が磁性物質１９の近傍に位置する構成としたが、これに限られず、検出対象の電荷部分又は親水性部分が磁性物質１９の近傍に位置する構成であってもよい。

刺激応答性ポリマー１１を凝集させるためには、例えば温度応答性ポリマーを用いた場合、混合液の入った容器を温度応答性ポリマーの凝集する温度の恒温槽に移せばよい。温度応答性ポリマーには、上限臨界溶液温度（以下「ＵＣＳＴ」と略すことがある。）を有するポリマーと、下限臨界溶液温度（以下「ＬＣＳＴ」と略すことがある。）を有するポリマーの２種類がある。例えば、ＬＣＳＴが３７℃である下限臨界溶液温度を有するポリマーを用いた場合には、混合液の入った容器を３７℃以上の恒温槽に移すことで、温度応答性ポリマーを凝集させることができる。また、ＵＣＳＴが５℃である上限臨界溶液温度を有するポリマーを用いた場合には、混合液の入った容器を５℃未満の恒温槽に移すことで、温度応答性ポリマーを凝集させることができる。

また、ＬＣＳＴは、温度応答性ポリマーの周囲の塩濃度の増加に伴って低下することが知られている。このため、ある温度で温度応答性ポリマーが分散している溶液に、所定濃度の塩（例えば、ＮａＣｌ）を添加することにより、一定温度下で温度応答性ポリマーを凝集させることも可能である。

本発明で用いられる塩としては、硫酸リチウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム等の硫酸塩；塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化バリウム、等のハロゲン化物；硝酸マグネシウム、硝酸カルシウム等の硝酸塩；チオシアン化カリウム等のチオシアン酸塩；炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等の炭酸塩；ホウ酸塩；リン酸塩等が挙げられる。これらの塩は、単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。また、酢酸ナトリウム等のモノカルボン酸のナトリウム塩、アスパラギン酸ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、イミノ二酢酸ナトリウム、マレイン酸ナトリウム、マロン酸ナトリウム、シュウ酸ナトリウム、コハク酸二ナトリウム、又は、酒石酸ナトリウム等のジカルボン酸のナトリウム塩、クエン酸二ナトリウム等のトリカルボン酸のナトリウム塩、エチレンジアミン４酢酸二ナトリウム等のテトラカルボン酸のナトリウム塩等の有機酸塩等が挙げられ、これらのカリウム塩等の有機酸塩等も利用できる。これらの塩は、単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

温度応答性ポリマーを凝集させるためには、例えば、所望の塩濃度となるように塩の水溶液を添加すればよい。温度応答性ポリマーを凝集させるための塩の必要添加量は、塩の種類、水溶液の温度、温度応答性ポリマーの種類、温度応答性ポリマーの濃度によって異なるが、水溶液中終濃度で概ね５０ｍＭ〜５Ｍ、好ましくは１００〜１０００ｍＭの範囲である。

また、ｐＨ応答性ポリマーを用いた場合、混合液の入った容器に酸溶液又はアルカリ溶液を加えればよい。具体的には、ｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨ範囲の外にある分散混合液の入った容器に、酸溶液又はアルカリ溶液を加え、容器内をｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨ範囲に変更すればよい。例えば、ｐＨ５以下で凝集、ｐＨ５超で分散するｐＨ応答性ポリマーを用いた場合、ｐＨ５超で分散している混合液の入った容器に、ｐＨが５以下になるように酸溶液を加えればよい。また、ｐＨ１０以上で凝集、ｐＨ１０未満で分散するｐＨ応答性ポリマーを用いた場合、ｐＨ１０未満で分散している混合液の入った容器に、ｐＨが１０以上になるようにアルカリ溶液を加えればよい。ｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨは、特に限定されないが、ｐＨ４〜１０が好ましく、ｐＨ５〜９であることが更に好ましい。具体的には、多数のカルボキシルを含むポリペプチド（グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸からなるポリペプチド）、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、及びアクリル酸やメタクリル酸を重合成分として含有するポリマー、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、ヘパリン等の多糖類、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリアルキルアミン、ポリエチレンイミン及びポリプロピルエチレンイミン等が挙げられる。

また、光応答性ポリマーを用いた場合、混合液の入った容器にポリマーを凝集できる波長の光を照射すればよい。凝集させるための好ましい光は、光応答性ポリマーに含まれる光応答性官能基の種類及び構造により異なるが、一般に波長１９０〜８００ｎｍの紫外光又は可視光が好適に使用できる。このとき、強度は０．１〜１０００ｍＷ／ｃｍ^２が好ましい。なお、光応答性ポリマーは、測定精度を向上できる点で、濁度の測定に用いられる光が照射された際、分散を生じにくいもの、換言すれば凝集するものであることが好ましい。光応答性ポリマーとして、濁度の測定に用いられる光が照射された際に分散を生じるものを用いる場合、照射時間を短縮することで測定精度を向上できる。具体的には、アゾベンゼン、スピロベンゾピラン及びスピロベンゾチオピラン等の光応答性の官能基を含有するポリマー等が挙げられる。

かかる条件下に第１の結合物１０、第２の結合物２０及び検体の混合物をおくと、検出対象５０が存在する場合には、刺激応答性ポリマー１１が第２の結合物２０中の電荷部分又は親水性部分によって凝集阻害されて分散する（図２（Ａ））。一方、検出対象５０が存在しない場合には刺激応答性ポリマー１１が凝集阻害されず凝集することになる（（図２（Ｂ））。

なお、温度応答性ポリマーの凝集は、第１の結合物及び第２の結合物と検出対象との結合後に行ってもよいし、同時並行的に行ってもよいが、処理時間を短縮できる点で後者が好ましい。

ここで、下限臨界溶液温度は、次のように決定する。まず、試料を吸光光度計のセルに入れ、１℃／分の速度で試料を昇温する。この間、５５０ｎｍにおける透過率変化を記録する。ここで、ポリマーが透明に溶解しているときの透過率を１００％、完全に凝集したときの透過率を０％としたとき、透過率が５０％になるときの温度をＬＣＳＴとして求める。

また、上限臨界溶液温度は、次のように決定する。１℃／分の速度で試料を冷却し、下限臨界溶液温度の場合と同様に５５０ｎｍにおける透過率変化を記録する。ここで、ポリマーが透明に溶解しているときの透過率を１００％、完全に凝集したときの透過率を０％としたとき、透過率が５０％になるときの温度をＵＣＳＴとして求める。

〔判別〕
検体と結合物との混合物を展開担体に展開させ、この展開担体における結合物の存在に起因する信号を確認し、この信号が、検出対象の非存在下と異なる場合には、検体中に検出対象が存在すると判別する。つまり、図２に示したように、検出対象の有無に応じて、各混合物中の凝集の状態が異なるため、各混合物の展開態様も異なることになる。そこで、検出対象の非存在下と異なる信号が確認された場合には、検体中に検出対象が存在したと判別できるのである。このように、判別が、展開担体上の信号を確認するだけで、特殊な試薬、機器を特に使用することなく行われるので、種々の環境において、安価且つ簡便に検出を実施できる。

なお、後述するように、混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におくタイミングは、展開よりも前であってもよい（混合物を凝集条件においた後に展開させる）し、展開と同時並行であってもよい（展開中に凝集条件におく）。

（展開担体）
本発明の方法で用いられる展開担体は、水溶液中で微粒子を展開できるものであれば特に限定されず、従来公知のクロマトグラフィー用担体であってよい。具体的には、有孔の三次元構造膜、例えばナイロン膜、ニトロセルロース膜等が挙げられ、合成又は天然高分子膜のいずれであってもよい。ただし、展開担体は、前述した微粒子の平均粒子径よりも大きく且つ凝集体の凝集径よりも小さい孔径を有する必要があるところ、種々の微粒子に対応でき汎用性に優れる点で、０．０１μｍ〜０．５μｍ程度の孔径を有することが好ましい。

展開及び判別の具体的手順は、特に限定されず、任意であってよい。好ましい手順を以下に説明する。

図３は、本発明の一実施形態に係る方法の手順を示す図である。この実施形態では、検体及び第１の結合物を前述の条件で混合してインキュベートし、更に第２の結合物を前述の条件で混合してインキュベートする。本実施形態では、この時点で既に、刺激応答性ポリマーが凝集する条件が成立している。

その後、展開担体を、その下端から所定高さの位置まで混合物に浸し、この状態で混合物を展開させる。すると、検体中に検出対象が存在しない場合には、多量の凝集体が混合物中に形成されているところ、凝集体径が孔径よりも大きいため、メニスカスに集中して、凝集体中の結合物（通常は微粒子）の存在に起因する有色のバンド（信号の一例）が確認される。これに対して、検体中に検出対象が存在する場合には、検出対象の存在量に応じて凝集体の量が顕著に低下し、孔径よりも小さい非凝集体が展開担体上を移動していくため、凝集体の存在に起因する有色のバンドは確認されず又は薄くなるとともに、広範囲に非凝集体中の結合物（通常は微粒子）の存在に起因する有色域（信号の一例）が確認される。

従って、凝集体の存在に起因する強度（信号有色域の濃さ）が、検出対象の非存在下よりも弱い場合に、検体中に検出対象が存在すると判別することができる。また、本実施形態では、信号有色域の位置が検出対象の非存在下の場合と異なることによっても、検体中に検出対象が存在すると判別することができる。

図４は、本発明の別の実施形態に係る方法の手順を示す図である。本実施形態では、図４（ａ）に示されるように、展開担体の下端から離れた位置（便宜上図示しているが、実際には視認不能であってよい）に、室温で刺激応答性ポリマー（特にＬＣＳＴを有するポリマー）を凝集させる有効量の塩（例えばＮａＣｌ）が配置されている。そして、混合物を凝集条件下にはおかず（例えば、刺激応答性ポリマーのＬＣＳＴよりも低い温度におく）に展開を開始する。

すると、検体中に検出対象が存在しない場合、混合物は、塩が配置された位置まで移動するものの、この位置で凝集して移動不能になるために集中する。これに対して、検体中に検出対象が存在する場合、混合物は、塩が配置された位置まで移動しても凝集阻害されるので、この位置を通過して更に移動していく。このため、凝集体の存在に起因する有色のバンドは確認されず又は薄くなるとともに、広範囲に非凝集体中の結合物（通常は微粒子）の存在に起因する有色域（信号の一例）が確認される。

従って、凝集体の存在に起因する強度（信号有色域の濃さ）が、検出対象の非存在下よりも弱い場合に、検体中に検出対象が存在すると判別することができる。また、本実施形態においては、非凝集体中の結合物（通常は微粒子）の存在に起因する有色域の範囲が非存在下の場合と異なることによっても、検体中に検出対象が存在すると判別することができる。

前記実施形態では、有色バンドがメニスカスに確認されるため、液面を一定に保つのが困難な環境下では、有色バンドが不鮮明になるおそれがあるが、本実施形態では、塩が配置された位置に有色バンドが確認されるため、液面にかかわらず、有色バンドを鮮明化することができる。この効果は、実験室外等の環境下で検出を行う場合にとりわけ重要である。

なお、塩を配置する箇所は、特に限定されず、展開担体の下端より上端側の任意の箇所であってよい。ただし、展開担体をいずれの方向で用いても（つまり、両端部が上下いずれの方向に向いていても）、同様の信号が得られる点で、展開担体の中央近傍に塩を配置することが好ましい。この効果も、実験室外等の環境下で検出を行う場合にとりわけ重要である。また、展開担体の方向を示す目印等を展開担体に設けてもよく、これにより塩を配置する箇所の自由度を増すことができる。

本実施形態では、展開担体に塩を配置したが、刺激応答性ポリマーの凝集可能な条件であれば、特に限定されない。具体的には、展開担体の所定箇所のみを凝集可能な温度に設定してもよく、凝集ｐＨにする酸又は塩基を配置してもよく、あるいは光を照射してもよい。

図５は、本発明の別の実施形態に係る方法の手順を示す図である。本実施形態では、図５（ａ）に示されるように、展開担体の下端から離れた位置（便宜上図示しているが、実際には視認不能であってよい）に、結合物と併存すると展開担体上で発色もしくは発光する物質が配置されている。かかる展開担体を用いて図３と同様の手順で展開を行うと、図５（ｂ）に示されるように、検体中に検出対象が存在する場合には、孔径よりも小さい非凝集体が展開担体上を、発色もしくは発光する物質の位置へと移動するため、この位置で発色又は発光（信号の一例）が確認される。これに対して、検体中に検出対象が存在しない場合には、多量の凝集体が混合物中に形成されているため、発色又は発光は確認され難い。この態様によれば、発色又は発光の強度を適宜選択することで、検出の感度及び精度をより向上することができる。本態様では、発色又は発光が信号に相当する。

発色又は発光する物質は、従来周知のものから適宜選択されてよい。発色物質としては、トリアジン、１，１０−フェナンスロリン等の可視領域に吸収帯を有するものが挙げられる。発光物質としては、ルミノール、ルシフェラーゼ等の蛍光、化学発光する物質が挙げられる。肉眼で確認できて光照射機器等が不要である点では、発色物質が好ましいが、これに限られない。また、磁性物質を用いる場合には、磁気量を測定してもよく、この場合には磁気量が信号に相当する。

なお、図５の態様において、結合物を有色に構成すれば、検体中に検出対象が存在しない場合に、凝集体の存在に起因する有色域がメニスカスに対応する位置に確認することもできる。このように、信号は１種でも複数種でもよく、適宜選択されてよい。

図６は本発明の別の実施形態に係る方法で用いる展開担体３０を備える展開器具４０の平面図であり、図７は図６の展開器具４０のＶＩＩ−ＶＩＩ線断面図である。

図７に示されるように、展開器具４０において、水平に配置される展開担体３０の一端（図６では下端、図７では左端）上にフィルタ４７が配置されるとともに、この一端から離れた位置３１に、結合物と併存すると展開担体３０上で発色もしくは発光する物質が配置されている。また、展開担体３０の他端には吸液体４９が当接している。

フィルタ４７は、展開担体３０と同じ又は異なる素材で構成されてよいが、凝集体を透過させず且つ非凝集体を透過させる、つまり前述した微粒子の平均粒子径よりも大きく且つ凝集体の凝集径よりも小さい孔径を有する必要がある。また、吸液体４９は、混合物中の溶媒を吸収できるものであれば、特に限定されない。

この状態の展開担体３０、フィルタ４７及び吸液体４９が上保持具４１及び下保持具４２によって保持され、フィルタ４７は供給口部４３を通して露出し、位置３１は窓部４４を通して外部から視認可能である。なお、保持の方式は特に限定されないが、上保持具４１及び下保持具４２を再利用可能な点では、上保持具４１及び下保持具４２が着脱自在であることが好ましい。

かかる展開器具４０を用い、図３と同様の手順で調製した混合物をフィルタ４７にロードする。これにより、混合物は、凝集体がフィルタ４７で除去された後に展開担体に展開されることになる。このため、検体中に検出対象が存在する場合には、多量の非凝集体がフィルタ４７を透過し、展開担体３０上を位置３１へと移動し、位置３１において発色又は発光が確認される。これに対して、検体中に検出対象が存在しない場合には、混合物中に形成された多量の凝集体がフィルタ４７上に残留する一方、フィルタ４７を透過できる非凝集体が極めて少ない又は存在しないため、位置３１に発色又は発光が確認され難い。

従って、凝集体の存在に起因する信号（ここでは発色又は発光）の強度が、検出対象の非存在下よりも強い場合に、検体中に検出対象が存在すると判別することができる。この実施形態は、前述した実施形態とは異なり、展開の間、混合物に展開担体を同じ姿勢で支持し続けなければならないという制約が小さいため、実験室外等の支持台が存在しなかったり、風等で外気が流動したりする環境にも対応できる点で好ましい。

＜定量方法＞
本発明の定量方法によれば、まず、第１の結合物、第２の結合物及び検体を混合し、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する所定条件下におく。次に、混合物を展開担体に展開させ、この展開担体における結合物の存在に起因する信号の強度を測定し、検出対象の量と信号強度との所定条件下における相関式に基づいて、検体中の検出対象の量を算出する。展開までの手順は前述した検出方法と共通するので、説明を省略する。

（測定）
測定は、測定すべき信号の種類に応じ、従来公知の手順に従って行えばよく、肉眼で又は測定機器を用いて行ってよい。また、次に説明する相関式で用いる信号強度は、測定値そのものであってもよいし、信号強度の範囲に応じて分類された群のスコア値であってもよい。スコア値とは、例えば、以下のようなものである。
スコア０：信号が確認されず。
スコア１：信号が微弱である。
スコア２：信号が明確に確認される。

（相関式）
上記所定条件と同一の条件における、検出対象の量と信号強度との相関式を作成する。この相関式を構成する検出対象の量と信号強度との測定は、データが多い程に信頼性の高い相関式が得られる。そこでデータは、２点以上の検出対象の量に関するものであればよく、３点以上の検出対象の量に関するものであることが好ましい。

ここで、検出対象の量と信号強度との相関式は、検出対象の量と信号強度との直接的な相関を示す式のみならず、検出対象の量と、信号強度を反映するパラメータ又は前述のスコア値との相関式であってもよい。

（算出）
混合物を展開したときの信号強度値を、作成した相関式に代入することによって、検体中の検出対象の量を算出できる。

（検出対象）
以上の検出方法で検出できる対象としては、環境汚染物質、飲食品汚染物質、臨床診断に利用される物質が挙げられ、具体的には、ダイオキシン、環境ホルモン、農薬、ＰＣＢ、有機水銀等、プリオン、カビ毒、フグ毒、抗生物質、防カビ剤等、体液、尿、喀痰、糞便中等に含まれるヒトイムノグロブリンＧ、ヒトイムノグロブリンＭ、ヒトイムノグロブリンＡ、ヒトイムノグロブリンＥ、ヒトアルブミン、ヒトフィブリノーゲン（フィブリン及びそれらの分解産物）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ミオグロビン、ガン胎児性抗原、肝炎ウイルス抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヒト胎盤性ラクトーゲン（ＨＰＬ）、ＨＩＶウイルス抗原、アレルゲン、細菌毒素、細菌抗原、酵素、ホルモン（例えば、ヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、インスリン等）、薬剤等が挙げられる。

＜キット＞
本発明は、検出対象を検出及び／又は定量するためのキットも包含する。このキットは、刺激応答性ポリマーを含有する凝集性物質を持つ第１の物質と検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、親水性を有する第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、この結合物を展開するための展開担体と、を備える。第１の物質又は第２の物質は有色粒子を有することが好ましい。また、第１の結合物又は第２の結合物は、前記展開担体上で発色もしくは発光する物質を有することが好ましい。各構成要素の詳細は前述の通りであるので、省略する。

本発明の実施例で用いた代表的な試薬は次の通りである。
ＰＢＳバッファー：１０倍濃度の市販のＰＢＳ（８１ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１４．７ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、２６．８ｍＭ ＫＣｌ、１３７０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、ニッポンジーン（株）製）を精製水で１／１０（Ｖ／Ｖ）に希釈して用いた。
精製水：ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製「Ｄｉｒｅｃｔ−Ｑ」（商品名）で精製した水。

＜実施例１＞
本実施例では、第１の結合物として抗ＴＳＨβ抗体結合−温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子を、第２の結合物として抗ＴＳＨα抗体結合ポリアクリル酸ナトリウムを用いて、ヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を検出する例を示す。

（第１の結合物の調製）
Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．製の抗ヒトＴＳＨβ抗体（Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｂｅｔａ、クローン：１９５マウス、クラス：マウスＩｇＧ）をｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎを用いて旭テクノグラス社がビオチン化し、ビオチン化抗ヒトＴＳＨβ抗体を調製した。

ストレプトアビジン結合−温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子として、マグナビート（株）製のＴｈｅｒｍａ−Ｍａｘ（登録商標） ＬＳＡ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（０．４質量％）２５０μＬを１．５ｍＬのマイクロチューブに取り、更にＰＢＳバッファーに溶解したビオチン化抗ヒトＴＳＨβ抗体５０μＬ（０．７５ｍｇ／ｍＬ）を加え、４℃で１５分間転倒混和した。前記マイクロチューブを３７℃に加熱した後、前記磁性粒子を磁石で回収し、上清部分を除去した。ここにＰＢＳバッファー２５０μＬを加え、冷却して、前記磁性粒子を分散させた。更に、過剰量のビオチンをチューブ内に添加してストレプトアビジンのビオチン結合部位をマスクした。再度マイクロチューブを３７℃に加熱した後、前記磁性粒子を磁石で回収し、上清部分を除去することで、抗ヒトＴＳＨβ抗体化温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子を調製した。

この抗ヒトＴＳＨβ抗体化温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子を含むチューブに、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（シグマ社製）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）５００μＬを加え、冷却することで分散させ、第１の結合物の分散溶液を調製した。

（第２の結合物の調製）
まず、検出対象としてのヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）に対する第２の親和性物質としての抗ヒトＴＳＨα抗体（Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ Ｔｈｙｒｏｉｄ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ａｌｐｈａ、クローン：１７６マウス、マウスＩｇＧ、Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．製、１ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬに２−メルカプトエタノール６ｍｇを加え、３７℃で１２０分間反応させた。反応後、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（商品名） 透析カセット、１０Ｋ ＭＷＣＯ（Ｐｉｅｒｃｅ）により、ＰＢＳバッファー５００ｍＬに対して透析を行って、過剰の２−メルカプトエタノールを除き、限界排除分子量１００００の限外濾過膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製［Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４ Ｕｌｔｒａｃｅｌ １０ｋ］）を用いて０．５ｍＬに濃縮し、マウス抗ヒトＴＳＨα抗体の還元抗体を得た。この還元抗体０．５ｍＬと、１００μＬマレイミド化ポリアクリル酸ナトリウムとを４℃で１晩反応させ、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００ １０／３００ＧＬ（ＧＥヘルスケア社製）を用いてゲル濾過することで、標識抗体を調製した。この標識抗体（この抗体は、ポリアクリル酸ナトリウム−抗ヒトＴＳＨα抗体結合物ともいう。）を、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（シグマ社製）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）でタンパク質濃度４μｇ／ｍＬになるように希釈することで、第２の結合物を調製した。

なお、上記マレイミド化ポリアクリル酸ナトリウムは、次のように調製した。まず、窒素ガス導入管、温度計、及び撹拌装置を付した１００ｍＬの三口フラスコ内で、アクリル酸（和光純薬工業社製）２ｇ、２−アミノエタンチオール（和光純薬工業社製）０．０２１ｇ、及びアゾビスイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．０２３ｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド５０ｍＬに溶解し、１時間に亘り窒素置換を行った。その後、７０℃で７時間に亘り重合反応を行った。得られた反応液を１０ｍＬまで減圧濃縮し、粘稠状の物が粉状になるまでジエチルエーテルで再沈殿を行った。白色沈殿をろ別し、更に真空乾燥機で１晩乾燥することで、アミノ基末端ポリアクリル酸を得た（収量１．５ｇ）。このアミノ基末端ポリアクリル酸０．５ｇ及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１０ｍＬを、窒素ガス導入管、及び撹拌装置を付した５０ｍＬのナスフラスコに入れ、溶解した。そこにＥＭＣＳ（Ｎ−（６−マレイミドカプロイロキシ）スクシンイミド）（同仁化学研究所社製）３ｍｇを加え、一晩反応した。得られた反応液を１ｍＬまで減圧濃縮し、粘稠な物が粉状になるまでジエチルエーテルで再沈殿を行った。白色沈殿をろ別し、更に真空乾燥機で、１晩乾燥しマレイミド基末端ポリアクリル酸を得た。このマレイミド基末端ポリアクリル酸の数平均分子量は約１３００００（ＧＰＣシステム：島津製作所製、カラム：東ソー社製、ＴＳＫｇｅｌ Ｓｕｐｅｒ ＡＷ３０００、６ｍｍ ＩＤ．×１５０ｍｍ、移動相：０．１Ｍ 硝酸ナトリウム）であり、収量は０．４ｇであった。

（検体の調製）
ＴＳＨ；Ａｓｐｅｎ Ｂｉｏ Ｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．製ヒト甲状腺刺激ホルモン（活性８．５ＩＵ／ｍｇ、ＷＨＯ８０／５５８）の溶液（濃度３０μｇ／ｍＬ）を、オーソ・クリニカル・ダイアグノスティクス社製「ビトロス（登録商標） ＴＳＨ キャリブレータ１」で、０．０６ｍＩＵ／Ｌ、０．００１２ｍＩＵ／Ｌとなるよう希釈したものを、それぞれ検体２、３とした。なお、ヒト甲状腺刺激ホルモン活性を含有しないことを除き、同様の手順で調製したものを検体１とした。

（展開）
第１の結合物の分散溶液１５０μＬ及び第２の結合物の分散溶液２００μＬをマイクロチューブ内に注ぎ、ボルテックスミキサーで１秒間撹拌した後、検体１〜３各々を５０μＬ注ぎ、ボルテックスミキサーで撹拌した後、室温（２１℃）で５分間インキュベートした。チューブから反応液全量を採り、予め３７℃に保温してある反応管（図３参照）に注ぎ、３７℃で５分間に亘り保温した。

その後、反応管内の反応液に、寸法５ｍｍ×５０ｍｍ、０．１μｍ以下の孔径を有する展開担体としてのＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製メンブレンフィルタ「Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ＃ＳＮＨＦ０４００」（商品名）を、その下端から約１０ｍｍの位置まで浸し、１分間に亘り静置した。その後、メンブレンフィルタを静かに引き上げ、メンブレンフィルタ上の様子を観察した。この結果を図９に示す。

（判別）
図９に示されるように、検出対象を含有しない検体１では、メニスカスに対応する位置（下端から約１０ｍｍ）に、凝集体中の結合物（磁性粒子）の存在に起因する茶色のバンドが確認された。これに対して、検出対象を含有する検体２、３では、メニスカスに対応する位置での茶色のバンドは確認されず、広範囲に茶色域が確認された。従って、メニスカスに対応する位置の茶色バンドの濃さが、検出対象の非存在下よりも弱い場合に、検体中に検出対象が存在すると判別できることが分かった。また、茶色域の位置がメニスカス位置に集中せず、広範囲に亘ることによっても、検体中に検出対象が存在すると判別できることが分かった。

＜実施例２＞
本実施例では、第１の結合物として抗ＨＢｓ抗体結合−温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子を、第２の結合物として抗ＨＢｓ抗体結合ポリエチレングリコールを用いて、ＨＢｓ抗原を検出する例を示す。

（第１の結合物の調製）
（株）特殊免疫研究所製の抗ＨＢｓモノクローナル抗体（抗原決定基：ａ、クローン番号Ｈｙｂ−８２４）を、ＰＩＥＲＣＥ社製ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｋｉｔ，Ｐｒｏｄｕｃｔ＃２１４２０（商品名）を用い、キットに添付のビオチン化方法に従ってビオチン化し、ビオチン化抗ＨＢｓモノクローナル抗体を調製した。

温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子であるマグナビート（株）製のＴｈｅｒｍａ−Ｍａｘ（登録商標） ＬＳＡ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（３０）（０．２質量％）５００μｌを１．５ｍＬのマイクロチューブに取り、更にＰＢＳバッファーに溶解したビオチン化抗ＨＢｓモノクローナル抗体５０μｌ（０．７５ｍｇ／ｍＬ）を加え、４℃で１５分間に亘り転倒混和した。前記マイクロチューブを３７℃に加熱した後、前記磁性粒子を磁石で回収し、上清部分を除去し、抗ＨＢｓモノクローナル抗体化温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子を調製した。

この抗ＨＢｓモノクローナル抗体化温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子を含むチューブに、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（シグマ社製）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）５００μＬを加え、冷却することで、前記磁性粒子を分散させ、第１の結合物の分散溶液を調製した。

（第２の結合物の調製）
抗ヒトＴＳＨα抗体の代わりに、（株）特殊免疫研究所製の抗ＨＢｓモノクローナル抗体（抗原決定基：ｄ、クローン番号Ｈｙｂ−３４２３）及び抗ＨＢｓモノクローナル抗体（抗原決定基：ｙ、クローン番号Ｈｙｂ−３４５７）を用いた点、及び２−メルカプトエタノールの代わりに２−メルカプトエチルアミン塩酸塩を用いた点を除き、実施例１と同様の手順で、２種類の抗ＨＢｓモノクローナル抗体の還元抗体を得た。これらの還元抗体から、マレイミド化ポリアクリル酸ナトリウムの代わりにマレイミド化ポリエチレングリコールを用いた点を除き、実施例１と同様の手順で２種類の標識抗体を得て、第２の結合物を調製した。なお、用いたマレイミド化ポリエチレングリコールは、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥ−４００ＭＡ（商品名）日油（株）製 重量平均分子量４０，０００である。

（検体の調製）
（株）特殊免疫研究所製の精製ＨＢｓ抗原を、０．５％ＢＳＡ（シグマ社製）及びＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で、１０００ｎｇ／ｍＬの濃度へと希釈した。この希釈物を、オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社製「ビトロス（登録商標） ＨＢｓ抗原（ロット番号２３３０）キットで陰性と判断されたヒト血清で、１０ｎｇ／ｍＬの濃度へと希釈したものを陽性検体（検体２）とした。また、このヒト血清を陰性検体（検体１）とした。

（展開）
第１の結合物の分散溶液１００μＬ、第２の結合物の分散溶液１００μＬ及び検体５μＬを用いた点を除き、実施例１と同様の手順でメンブレンフィルタへの展開を行い、メンブレンフィルタ上の様子を観察した。この結果を図１０に示す。

（判別）
図１０に示されるように、検出対象を含有しない検体１では、メニスカスに対応する位置（図中の矢印で示す位置）に、凝集体中の結合物（磁性粒子）の存在に起因する茶色のバンドが確認された。これに対して、検出対象を含有する検体２では、メニスカスに対応する位置での茶色のバンドは確認されず、広範囲に茶色域が確認された。従って、メニスカスに対応する位置の茶色バンドの濃さが、検出対象の非存在下よりも弱い場合に、検体中に検出対象が存在すると判別できることが分かった。また、茶色域の位置がメニスカス位置に集中せず、広範囲に亘ることによっても、検体中に検出対象が存在すると判別できることが分かった。

１０ 第１の結合物
１１ 刺激応答性ポリマー
１３ 第１の抗体（第１の親和性物質）
１５ アビジン
１７ ビオチン
１９ 磁性物質
２０ 第２の結合物
２１ 第２の物質
２３ 第２の抗体（第２の親和性物質）
３０ 展開担体
４０ 展開器具
４１ 上保持具
４２ 下保持具
４３ 供給口部
４４ 窓部
４７ フィルタ
５０ 検出対象

Claims (11)

1. 検体中の検出対象を検出する方法であって、
   刺激応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、親水性を有する第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、前記検体とを混合し、
   得られた混合物を前記刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、前記混合物を展開担体に展開させ、又は得られた混合物を展開担体に展開させ、展開中の前記混合物を前記刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、
   前記展開担体における第１の結合物又は第２の結合物の存在に起因する信号を確認し、前記信号が、前記検出対象の非存在下と異なる場合には、前記検体中に検出対象が存在すると判別する工程を含む方法であり、
   第１の親和性物質と第２の親和性物質とが、前記検出対象の異なる部位に結合できる方法。
2. 第１の結合物の存在に起因する信号の強度が、前記検出対象の非存在下よりも弱い場合に、前記検体中に検出対象が存在すると判別する請求項１記載の方法。
3. 前記混合物は、第１の結合物の凝集体を除去した後に前記展開担体に展開させ、
   第１の結合物の存在に起因する信号の強度が、前記検出対象の非存在下よりも強い場合に、前記検体中に検出対象が存在すると判別する請求項１記載の方法。
4. 検体中の検出対象を定量する方法であって、
   刺激応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、親水性を有する第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、前記検体とを混合し、
   得られた混合物を前記刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、前記混合物を展開担体に展開させ、又は得られた混合物を展開担体に展開させ、展開中の前記混合物を前記刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、
   前記展開担体における第１の結合物又は第２の結合物の存在に起因する信号の強度を測定し、前記検出対象の量と信号強度との前記所定条件下における相関式に基づいて、前記検体中の検出対象の量を算出する工程を含む方法であり、
   第１の親和性物質と第２の親和性物質とが、前記検出対象の異なる部位に結合できる方法。
5. 第１の結合物の凝集体の存在に起因する信号を測定する請求項４記載の方法。
6. 前記混合物は、第１の結合物の凝集体を除去した後に前記展開担体に展開させ、
   第１の結合物の存在に起因する信号の強度を測定する請求項４記載の方法。
7. 第１の結合物は有色粒子を有し、
   前記信号は、前記有色粒子の存在に基づく色に依存したものである請求項１から６いずれか記載の方法。
8. 第１の結合物又は第２の結合物は、前記展開担体上で発色もしくは発光する物質を有し、
   前記信号は、前記発色もしくは発光する物質の存在に基づく色又は光に依存したものである請求項１から７いずれか記載の方法。
9. 検出対象を検出及び／又は定量するためのキットであって、
   刺激応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、親水性を有する第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、
   前記結合物を展開するための展開担体と、を備えるキット。
10. 第１の結合物は有色粒子を有する請求項９記載のキット。
11. 第１の結合物又は第２の結合物は、前記展開担体上で発色もしくは発光する物質を有する請求項９又は１０記載のキット。