JP5184554B2 - 検出対象の検出方法及び定量方法 - Google Patents

Description

従来から、被検体中の検出対象を検出する方法として、ラテックス凝集法が行われてきた。ラテックス凝集法とは、生体試料等の流体中における抗原を検出する場合、抗原に特異的に結合する抗体もしくはそのフラグメントを担持させたラテックスと、流体とを混合して、ラテックスの凝集の程度を測定することにより、抗原を検出又は定量する方法である（例えば、特許文献１参照）。

このラテックス凝集法によれば、検体として添加された抗原が複数のラテックス結合抗体を架橋させ、ラテックスの凝集を促す。このように手順が単純であるから、簡便且つ迅速に抗原を検出できる。しかし、抗原が微量の場合、その架橋が起こりにくいため、ラテックスが十分に凝集しない。このため、微量の抗原を検出することが困難であった。また手技の測定において、測定結果のバラツキが多い等の問題もあった。

そこで、ＥＬＩＳＡ法やＣＬＥＩＡ法といった酵素基質反応を利用する方法も広く採用されている。これらの方法では、例えば、抗原に特異的に結合する一次抗体を抗原に結合させ、この一次抗体に酵素を有する二次抗体を結合させる。ここで、酵素の基質を添加し、酵素が触媒する反応の程度を測定することで、抗原を検出又は定量する。

これらの方法によれば、例えば基質として発光試薬を用いると、基質添加後の発光の検出感度が高いため、微量の抗原も検出できる。
特公昭５８−１１５７５号公報

しかし、酵素基質反応を利用する方法では、二次抗体、発光試薬、発光検出装置等の特殊な試薬、機器が必須であり、作業コストが高い。

また、図８に示すように、この方法は、試料及び各試薬をインキュベーションする工程（ＳＴ１１０、ＳＴ１３０）、系を洗浄する工程（ＳＴ１２０）、発光を測定する工程（ＳＴ１４０）等の多段階からなっており、操作が煩雑である。しかも、各段階に要する時間が極めて長く、大規模処理には適さない。

本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、検出対象を迅速、安価且つ簡便に検出、定量できる検出、定量用キット、及び高精度に検出、定量できる方法を提供することを課題とする。

発明者らは、親水性の化合物を接近させると、刺激応答性ポリマーの凝集が阻害されることを見出し、本発明を完成させるに至った。具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。

［１］検出対象を検出及び／又は定量するためのキットであって、
刺激応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、
親水性の第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、を含み、
第１の親和性物質と第２の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、同時に前記検出対象に結合できるキット。
［２］第１の物質が、微粒子状の磁性物質を含む［１］に記載のキット。
［３］第２の物質が、親水性のポリマーである［１］又は［２］に記載のキット。
［４］第２の物質が、ポリオールである［１］〜［３］のいずれか１項に記載のキット。
［５］第２の物質が、ポリオキシアルキレンを構成単位として含むポリマーである［１］〜［３］のいずれか１項に記載のキット。
［６］検体中の検出対象を検出する方法であって、
刺激応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、親水性の第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、前記検体とを混合し、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、前記刺激応答性ポリマーの分散の有無を判定する工程を含み、
第１の親和性物質と第２の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、同時に前記検出対象に結合できる方法。
［７］第１の物質が微粒子状の磁性物質を含有し、
前記方法は、磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含む［６］に記載の方法。
［８］検体中の検出対象を定量する方法であって、
刺激応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、親水性の第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、前記検体とを混合し、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する所定条件下におき、
前記混合物の濁度を測定し、前記検出対象の量と濁度との前記所定条件下における相関式に基づいて、前記検体中の検出対象の量を算出することを含む方法。
［９］第１の物質が微粒子状の磁性物質を含有し、
前記方法は、磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含む［８］に記載の方法。

本発明によれば、検出対象が存在すると、この検出対象に第１の親和性物質及び第２の親和性物質が結合するため、第１の親和性物質に結合した刺激応答性ポリマーと、第２の親和性物質に結合した第２の物質が接近する。これにより、親水性部分が刺激応答性ポリマーの近傍に配置されるため、刺激に応答した刺激応答性ポリマーの凝集が阻害される。従って、この凝集阻害の有無を観察することで、検出対象の存否を検出できる。また、凝集阻害の程度を測定することで、検出対象を定量できる。

以上の手順は、いずれも特殊な試薬、機器を特に使用することなく行うことができ、安価且つ簡便である。また、凝集阻害の程度を測定するだけであり、酵素によって触媒される反応を利用する系ではないから、迅速に行うことができる。また、第２の物質が有する親水性部分が刺激応答性ポリマーの凝集を高度に阻害するので、高感度で検出対象を検出、定量できる。

本発明の一実施形態に係る方法において使用される結合物の概略構成図である。 前記実施形態に係る結合物の使用状態を示す模式図である。 本発明の一実施例に係る方法における磁力の付加の態様を示す図である。 本発明の一実施例に係る方法のフローチャートである。 本発明の一実施例に係る方法における測定時間と濁度との関係を示すグラフである。 本発明の別の実施例に係る方法における測定時間と濁度との関係を示すグラフである。 図６の実施例に係る方法における検出対象の量と、濁度との相関式を示すグラフである。 従来例に係る方法のフローチャートである。

符号の説明

１０ 第１の結合物
１１ 刺激応答性ポリマー
１３ 第１の抗体（第１の親和性物質）
１５ アビジン
１７ ビオチン
１９ 磁性物質
２０ 第２の結合物
２１ 第２の物質
２３ 第２の抗体（第２の親和性物質）
５０ 検出対象
７１ セル
７３ 永久磁石

発明を実施するための形態

以下、本発明の一実施形態について、図面を参照しながら説明する。

＜キット＞
本発明のキットは、検出対象を検出又は定量するためのキットであって、第１の結合物と、第２の結合物とを含有する。各構成について、以下詳細に説明する。

〔第１の結合物〕
第１の結合物は、刺激応答性ポリマーを含有する第１の物質と、検出対象に対する第１の親和性物質とが結合したものである。

（第１の物質）
本発明で用いられる第１の物質は刺激応答性ポリマーを含有する物質であり、この刺激応答性ポリマーは、外的な刺激に応答して構造変化を起こし、凝集及び分散を調整できるポリマーである。刺激としては、特に限定されないが、温度変化、光の照射、酸又は塩基の添加（ｐＨの変化）、電場変化等が挙げられる。

特に、本発明では、刺激応答性ポリマーは、温度変化によって凝集及び分散可能な温度応答性ポリマーであることが好ましい。なお、温度応答性ポリマーとしては、下限臨界溶液温度（以下、ＬＣＳＴとも称する）を有するポリマーや上限臨界溶液温度を有するポリマー（以下、ＵＣＳＴとも称する）が挙げられる。

本発明で用いられる下限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−メタクリロイルピロリジン、Ｎ−メタクリロイルピペリジン、Ｎ−メタクリロイルモルホリン等のＮ置換（メタ）アクリルアミド誘導体からなるポリマー；ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール部分酢化物、ポリビニルメチルエーテル、（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン）ブロックコポリマー、ポリオキシエチレンラウリルアミン等のポリオキシエチレンアルキルアミン誘導体；ポリオキシエチレンソルビタンラウレート等のポリオキシエチレンソルビタンエステル誘導体；（ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）（メタ）アクリレート類；及び（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオレイルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルエーテル）（メタ）アクリレート類等のポリオキシエチレン（メタ）アクリル酸エステル誘導体等が挙げられる。更に、これらのポリマー及びこれらの少なくとも２種のモノマーからなるコポリマーも利用できる。また、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとＮ−ｔ−ブチルアクリルアミドのコポリマーも利用できる。（メタ）アクリルアミド誘導体を含むポリマーを使用する場合、このポリマーにその他の共重合可能なモノマーを、下限臨界溶液温度を有する範囲で共重合してもよい。本発明では、なかでも、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−メタクリロイルピロリジン、Ｎ−メタクリロイルピペリジン、Ｎ−メタクリロイルモルホリンからなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマーからなるポリマー又はＮ−イソプロピルアクリルアミドとＮ−ｔ−ブチルアクリルアミドのコポリマーが好ましく利用できる。

本発明で用いられる上限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、アクリロイルグリシンアミド、アクリロイルニペコタミド、アクリロイルアスパラギンアミド及びアクリロイルグルタミンアミド等からなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマーからなるポリマーが利用できる。また、これらの少なくとも２種のモノマーからなるコポリマーであってもよい。これらのポリマーには、アクリルアミド、アセチルアクリルアミド、ビオチノールアクリレート、Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−メタクリロイルトリメチレンアミド、アクリロイルザルコシンアミド、メタクリルザルコシンアミド、アクリロイルメチルウラシル等、その他の共重合可能なモノマーを、上限臨界溶液温度を有する範囲で共重合してもよい。

また、本発明では、刺激応答性ポリマーとして、ｐＨ変化によって凝集及び分散可能なｐＨ応答性ポリマーが利用できる。ｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨは、特に限定されないが、刺激付与時における第１の結合物、第２の結合物、及び検体の変性等による検出・定量精度の低下を抑制できる点で、ｐＨ４〜１０が好ましく、ｐＨ５〜９であることが更に好ましい。

このようなｐＨ応答性ポリマーとしては、カルボキシル、リン酸、スルホニル、アミノ等の基を官能基として含有するポリマーが例示できる。より具体的には、（メタ）アクリル酸、マレイン酸、スチレンスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、ホスホリルエチル（メタ）アクリレート、アミノエチルメタクリレート、アミノプロピル（メタ）アクリルアミド、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド等の解離基を有するモノマーが重合されたものであってもよく、これら解離基を有するモノマーと、ｐＨ応答能が損なわれない程度において、他のビニルモノマー、例えばメチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル類、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類、スチレン、塩化ビニル、Ｎ−ビニルピロリドン等のビニル化合物、（メタ）アクリルアミド類等とが共重合されたものであってもよい。

（微粒子状の磁性物質）
ここで用いる微粒子状の磁性物質は、多価アルコールとマグネタイトとで構成されてよい。この多価アルコールは、構成単位に水酸基を少なくとも２個有し且つ鉄イオンと結合可能なアルコール構造体である限りにおいて特に限定されず、例えば、デキストラン、ポリビニルアルコール、マンニトール、ソルビトール、シクロデキストリンが挙げられる。例えば特開２００５−８２５３８公報には、デキストランを用いた微粒子状の磁性物質の製造方法が開示されている。また、グリシジルメタクリレート重合体のようにエポキシを有し、開環後多価アルコール構造体を形成する化合物も使用できる。このような多価アルコールを用いて調製された微粒子状の磁性物質（磁性微粒子）は、良好な分散性を有するように、その平均粒径が０．９ｎｍ以上１０００ｎｍ未満であることが好ましい。平均粒径は、特に目的とする検出対象の検出感度を高めるためには、２．９ｎｍ以上２００ｎｍ未満であることが好ましい。

〔第２の結合物〕
第２の結合物は、親水性の第２の物質と、検出対象に対する第２の親和性物質とが結合したものである。

（第２の物質）
親水性の第２の物質は、例えば水溶性のポリマーであり、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド等のポリオキシアルキレンを構成単位として含有するポリマー、ポリビニルアルコール等のアルコール性水酸基を含有するポリマー、デキストラン、シクロデキストリン、アガロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の水溶性多糖類等のポリオールが挙げられる。これら親水性の物質は、ポリマー鎖の中又は末端に、第２の親和性物質を結合させるための官能基等を有していてもよい。

（第１の親和性物質、第２の親和性物質）
第１の結合物の第１の親和性物質、及び第２の結合物の第２の親和性物質は、検出対象の異なる部位において、同時に検出対象に結合できるものである。第１の親和性物質及び第２の親和性物質は、例えば、検出対象の異なる抗原決定基を認識するモノクローナル抗体であってよい。

ここで用いる抗体は、いかなるタイプの免疫グロブリン分子であってもよく、Ｆａｂ等の抗原結合部位を有する免疫グロブリン分子断片であってもよい。また、抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、異なる抗原認識部位を有する２種類のモノクローナル抗体であることが好ましい。

〔作製方法〕
以上のキットの作成方法を説明する。

［第１の結合物の作製］
第１の結合物は、第１の物質と第１の親和性物質とを結合することによって作製する。この結合方法は、特に限定されないが、例えば、第１の物質側（例えば刺激応答性ポリマー部分）及び第１の親和性物質（例えば、第１の抗体）側の双方に、互いに親和性の物質（例えば、アビジン及びビオチン、グルタチオン及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ）を結合させ、これら物質を介して第１の物質及び第１の親和性物質を結合させる。

具体的には、刺激応答性ポリマーへのビオチンの結合は、国際公開ＷＯ０１／０９１４１号パンフレットに記載されているように、ビオチン等をメタクリルやアクリル等の重合性官能基と結合させて付加重合性モノマーとし、他のモノマーと共重合することにより行うことができる。また、第１の親和性物質へのアビジン等の結合は常法に従って行うことができる。次に、ビオチン結合刺激応答性ポリマー及びアビジン結合第１の親和性物質を混合すると、アビジンとビオチンとの結合を介して、第１の親和性物質及び刺激応答性ポリマーが結合する。

別法として、ポリマーの重合時にカルボキシル、アミノ又はエポキシ等の官能基を持つモノマーを他のモノマーと共重合させ、この官能基を介し、当技術分野で周知の方法に従って抗体親和性物質（例えば、メロンゲル、プロテインＡ、プロテインＧ）をポリマーに結合させる方法が利用できる。このようにして得られた抗体親和性物質に第１の抗体を結合させることにより、刺激応答性ポリマーと、検出対象の抗原に対する第１の抗体との第１の結合物が作製される。

あるいは、ポリマーの重合時にカルボキシル、アミノ又はエポキシ等の官能基を有するモノマーを他のモノマーと共重合させ、これらの官能基に検出対象の抗原に対する第１の抗体を常法に従って直接結合させてもよい。

あるいは、微粒子状の磁性物質に第１の親和性物質及び刺激応答性ポリマーを結合させてもよい。

第１の物質を刺激応答性ポリマーが凝集する条件においた後、遠心分離によって分離することで、第１の結合物を精製してもよい。第１の結合物の精製は、刺激応答性ポリマーに微粒子状の磁性物質を結合させ、更に第１の親和性物質を結合させた後、磁力を付加して磁性物質を回収する方法によって行ってもよい。

微粒子状の磁性物質と刺激応答性ポリマーとの結合は、反応性官能基を介して結合する方法や、磁性物質中の多価アルコール上の活性水素又は多価アルコールに重合性不飽和結合を導入してグラフト重合する方法等の当技術分野で周知の方法で行ってよい（例えば、ＡＤＶ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．、Ｖｏｌ．４、ｐ１１１、１９６５やＪ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ．、Ｐａｒｔ−Ａ、３、ｐ１０３１、１９６５参照）。

次に、親水性の第２の物質と、検出対象の抗原に対する第２の抗体とを結合させ第２の結合物を作製する方法について記述する。

［第２の結合物の作製］
第２の結合物は、第２の物質と第２の親和性物質とを直接又は間接に結合することによって作製する。特に限定されないが、例えば、第２の物質側及び第２の親和性物質（例えば、第２の抗体）側の双方に、互いに親和性の物質（例えば、アビジン及びビオチン、グルタチオン及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ）を結合させ、これら物質を介して第２の物質及び第２の親和性物質を間接的に結合させる。

第２の物質と第２の親和性物質とを直接的に結合させる場合、官能基を介して結合させてもよく、例えば、官能基を用いる場合、ゴッシュらの方法（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、 １、 ７１−７６、１９９０）のマレイミド−チオールカップリングに従って結合できる。

このようにして製造されるキットは、例えば以下のような方法で、検出対象を検出又は定量するために使用できる。

＜検出方法＞
本発明の検出方法は、まず第１の結合物、第２の結合物及び検体を混合し、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する条件下において、刺激応答性ポリマーの分散の有無を判定する工程を含む。手順の詳細を以下に説明する。

（混合・凝集）
まず、第１の結合物と第２の結合物とを容器内で混合し、更に検体を添加して混合物を得る。続いて、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におく。すると、検出対象が存在する場合には、刺激応答性ポリマーが第２の結合物中の親水性部分によって凝集阻害されて分散する。一方、検出対象が存在しない場合には、刺激応答性ポリマーが凝集阻害されず凝集することになる。

この現象を、図１〜図２を参照しながら説明する。

図１に示されるように、第１の結合物１０は刺激応答性ポリマー１１を含有し、この刺激応答性ポリマー１１はアビジン１５及びビオチン１７を介して検出対象５０に対する第１の抗体１３に結合されている。また、第１の結合物１０は微粒子状の磁性物質１９を含み、この磁性物質１９の表面に刺激応答性ポリマー１１が結合されている。一方、第２の結合物２０は親水性の第２の物質２１を含み、この第２の物質２１は検出対象５０に対する第２の抗体２３に結合されている。そして、第１の抗体１３及び第２の抗体２３は、検出対象５０の異なる部位において、同時に検出対象５０に結合できる。

図２に示されるように、第１の結合物１０、第２の結合物２０及び検体の混合物を所定条件下におくと、検出対象５０が存在する場合には、刺激応答性ポリマー１１が第２の結合物２０中の親水性部分によって凝集阻害されて分散する（図２（Ａ））。一方、検出対象５０が存在しない場合には刺激応答性ポリマー１１が凝集阻害されず凝集することになる（図２（Ｂ））。

刺激応答性ポリマー１１を凝集させるためには、例えば温度応答性ポリマーを用いた場合、混合液の入った容器を温度応答性ポリマーの凝集する温度の恒温槽に移せばよい。温度応答性ポリマーには、上限臨界溶液温度（以下「ＵＣＳＴ」と略すことがある。）を有するポリマーと、下限臨界溶液温度（以下「ＬＣＳＴ」と略すことがある。）を有するポリマーの２種類がある。例えば、ＬＣＳＴが３７℃である下限臨界溶液温度を有するポリマーを用いた場合には、混合液の入った容器を３７℃以上の恒温槽に移すことで、温度応答性ポリマーを凝集させることができる。また、ＵＣＳＴが５℃である上限臨界溶液温度を有するポリマーを用いた場合には、混合液の入った容器を５℃未満の恒温槽に移すことで、温度応答性ポリマーを凝集させることができる。

また、ｐＨ応答性ポリマーを用いた場合、混合液の入った容器に酸溶液又はアルカリ溶液を加えればよい。具体的には、ｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨ範囲の外にある分散混合液の入った容器に、酸溶液又はアルカリ溶液を加え、容器内をｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨ範囲に変更すればよい。例えば、ｐＨ５以下で凝集、ｐＨ５超で分散するｐＨ応答性ポリマーを用いた場合、ｐＨ５超で分散している混合液の入った容器に、ｐＨが５以下になるように酸溶液を加えればよい。また、ｐＨ１０以上で凝集、ｐＨ１０未満で分散するｐＨ応答性ポリマーを用いた場合、ｐＨ１０未満で分散している混合液の入った容器に、ｐＨが１０以上になるようにアルカリ溶液を加えればよい。ｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨは、特に限定されないが、ｐＨ４〜１０が好ましく、ｐＨ５〜９であることが更に好ましい。

また、光応答性ポリマーを用いた場合、混合液の入った容器にポリマーを凝集できる波長の光を照射すればよい。凝集させるための好ましい光は、光応答性ポリマーに含まれる光応答性官能基の種類及び構造により異なるが、一般に波長１９０〜８００ｎｍの紫外光又は可視光が好適に使用できる。このとき、強度は０．１〜１０００ｍＷ／ｃｍ^２が好ましい。なお、光応答性ポリマーは、測定精度を向上できる点で、濁度の測定に用いられる光が照射された際、分散を生じにくいもの、換言すれば凝集するものであることが好ましい。光応答性ポリマーとして、濁度の測定に用いられる光が照射された際に分散を生じるものを用いる場合、照射時間を短縮することで測定精度を向上できる。

なお、温度応答性ポリマーの凝集は、第１の結合物及び第２の結合物の検出対象への結合の後に行ってもよいし、同時並行的に行ってもよいが、処理時間を短縮できる点で後者が好ましい。ただし、温度応答性ポリマーが凝集する条件が、第１の結合物及び第２の結合物が検出対象に結合する条件と大幅に異なる場合、前者が好ましい。

ここで、下限臨界溶液温度は、次のように決定する。まず、試料を吸光光度計のセルに入れ、１℃／分の速度で試料を昇温する。この間、５５０ｎｍにおける透過率変化を記録する。ここで、ポリマーが透明に溶解しているときの透過率を１００％、完全に凝集したときの透過率を０％としたとき、透過率が５０％になるときの温度をＬＣＳＴとして求める。

また、上限臨界溶液温度の場合は、次のように決定する。１℃／分の速度で試料を冷却し、同様に５５０ｎｍにおける透過率変化を記録する。ここで、ポリマーが透明に溶解しているときの透過率を１００％、完全に凝集したときの透過率を０％としたとき、透過率が５０％になるときの温度をＵＣＳＴとして求める。

（判定）
分散の有無の判定は、例えば目視又は濁度測定で行うことができる。濁度は光散乱装置での光透過率から算出でき、濁度が低ければ刺激応答性ポリマーの凝集が阻害されており、検出物質の存在が示唆される。ここで、使用する光の波長は、磁性物質の粒径等に応じ所望の検出感度が得られるよう適宜設定されてよい。光の波長は、従来汎用の装置を利用できる点で、可視光の範囲内（例えば、５５０ｎｍ）であることが好ましい。

目視又は濁度測定は、一定の時点で断続的に行ってもよいし、経時的に連続して行ってもよい。また、ある時点における濁度測定値と、他の時点における濁度測定値との差に基づいて判定を行ってもよい。

＜定量方法＞
本発明の定量方法によれば、まず、第１の結合物、第２の結合物及び検体を混合し、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する所定条件下におく、次に、混合物の濁度を測定し、検出対象の量と濁度との所定条件下における相関式に基づいて、検体中の検出対象の量を算出する。前半部分の手順は前述した検出方法と類似するので、説明を省略する。

（相関式）
上記所定条件と同一の条件における、検出対象の量と濁度との相関式を作成する。この相関式を構成する検出対象の量と濁度との測定は、データが多い程に信頼性の高い相関式が得られる。そこでデータは、２点以上の検出対象の量に関するものであればよく、３点以上の検出対象の量に関するものであることが好ましい。

ここで、検出対象の量と濁度との相関式は、検出対象の量と濁度との直接的な相関を示す式のみならず、検出対象の量と濁度を反映するパラメータとの相関式であってもよい。

（算出）
混合物の濁度測定値を、作成した相関式に代入することによって、検体中の検出対象の量を算出できる。

（分離）
第１の物質が微粒子状の磁性物質を含有する場合、本発明の検出方法又は定量方法は、磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含むことが好ましい。これによって、凝集した磁性物質が、非凝集状態の磁性物質を含む夾雑物から分離される。このため、分離した磁性物質の量、溶媒に分散した際の光透過率等の測定値は、夾雑物の影響が除外され、検出物質の存在をより忠実に反映したものとなる。

磁力の付加は磁性物質に磁石を接近させて行うことができる。この磁石の磁力は、用いる磁性物質が有する磁力の大きさによって異なる。磁石としては、例えばマグナ社製ネオジ磁石が挙げられる。

また、磁力の付加は、判定の前又は判定と同時並行して行ってよいが、工程に費やされる時間を短縮化できる点で同時並行が好ましい。なお、磁力を付加すると、凝集した磁性物質は夾雑物を巻き込んで分離されるため、分離後における混合物の濁度は、夾雑物が存在していた場合の方がむしろ小さくなるものと推測される。

なお、検出方法又は定量方法における「濁度測定」には、濁度を直接的に測定することのみならず、濁度を反映するパラメータを測定することも包含される。かかるパラメータとしては、複数時点での濁度測定値の差異、分離された凝集物量、分離後の非凝集物の濁度等が挙げられる。ここで、複数時点のうちの１点は、例えば、検出対象が非存在である陰性対照に磁力を付加した際、濁度が最大値となる時点近傍であることが好ましい。これにより、別の時点での濁度測定値との差異が大きくなり、検出対象の量をより正確に定量できることになる。

（検出対象）
検体中の検出対象としては、臨床診断に利用される物質が挙げられ、具体的には、体液、尿、喀痰、糞便中等に含まれるヒトイムノグロブリンＧ、ヒトイムノグロブリンＭ、ヒトイムノグロブリンＡ、ヒトイムノグロブリンＥ、ヒトアルブミン、ヒトフィブリノーゲン（フィブリン及びそれらの分解産物）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ミオグロビン、ガン胎児性抗原、肝炎ウイルス抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヒト胎盤性ラクトーゲン（ＨＰＬ）、ＨＩＶウイルス抗原、アレルゲン、細菌毒素、細菌抗原、酵素、ホルモン（例えば、ヒト甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、インスリン等）、薬剤等が挙げられる。

［キットの構成とその使用方法の例］
以下に、本発明の方法を利用するためのキットの構成とその使用方法の例を、検出対象が抗原の場合について説明する。

試薬キットは、例えば、下記の試薬から構成される。
抗原検出用試薬キット：
試薬Ａ：検出対象の抗原に特異的に結合する第１の抗体及び温度応答性ポリマーが結合した微粒子状の磁性物質
試薬Ｂ：第１の抗体とは異なる部位を認識し、検出対象の抗原に同時に結合しうる第２の抗体が結合した、親水性の物質
試薬Ｃ：被測定物質の標準品（具体例として、精製抗原が挙げられる。）。
試薬Ｄ：希釈用バッファー（上記試薬の希釈用、並びに被測定試料の希釈用に使用可能なバッファーであって、トリス塩酸バッファー、リン酸バッファー等が挙げられる。）

また、濁度を測定する装置としては、容器内をポリマーが凝集する温度に保温でき、２００ｎｍ〜９００ｎｍの透過光を照射できる従来周知の装置が使用できる。

上記した試薬からなるキットは、例えば、以下の方法で使用できる。

まず、試薬Ａ ５〜１０００μＬと試薬Ｂ ５〜１０００μＬとを混合する。試薬Ａと試薬Ｂの入った溶液中に（１）被測定物質の標準品を添加した陽性対照、（２）何も添加しない陰性対照、（３）被検液の５〜１０００μＬを添加したサンプル、を準備し、一定時間ポリマーが分散する温度（例えば約０〜３０℃）で反応させる。温度応答性ポリマーを用いた場合、反応後、そのポリマーの凝集温度（例えば４２℃）に保温された容器に反応液を入れ、５５０ｎｍの透過光を照射して濁度を測定し、抗原の有無の判定又は抗原の定量を行う。

上記とは別の使用方法として、試薬Ａと上記（１）、（２）、及び（３）を一定時間ポリマーが分散する温度で反応させた後、試薬Ｂを添加するか、又は試薬Ｂと上記（１）、（２）、及び（３）とを反応させた後、ポリマーが分散する温度で試薬Ａを添加し、一定時間反応後、凝集温度に保温された容器に反応液を入れ、５５０ｎｍの透過光を照射して濁度を測定し、抗原の有無の判定又は抗原の定量を行ってもよい。

本発明の実施例で用いた代表的な試薬は次のとおりである。
ＰＢＳバッファー：１０倍濃度の市販のＰＢＳ（８．１ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１．５ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、ニッポンジーン（株）製）を精製水で１／１０（Ｖ／Ｖ）に希釈して用いた。
ホウ酸緩衝液：ポリサイエンス社製Ｂｏｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ、１００ｍＭ ホウ酸、ｐＨ８．５。
精製水：ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製「Ｄｉｒｅｃｔ−Ｑ」（商品名）で精製した水。

＜実施例１＞
本実施例では、第１の結合物としてビオチン結合−温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子を、第２の結合物としてビオチン結合ポリビニルアルコールを用いて、ストレプトアビジンを検出、定量する例を示す。

（第１の結合物の調製）
ビオチン結合−温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子として、マグナビート（社）製のＴｈｅｒｍａ−Ｍａｘ ＬＢ Ｂｉｏｔｉｎ（０．４質量％）を用いた。Ｔｈｅｒｍａ−Ｍａｘ ＬＢ Ｂｉｏｔｉｎ５００μＬを１．５ｍＬマイクロチューブにとり、このマイクロチューブを４２℃に加熱することで、Ｔｈｅｒｍａ−Ｍａｘ ＬＢ Ｂｉｏｔｉｎを凝集させ、磁石で回収した後、上清を除去した。除去後のマイクロチューブに０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（シグマ社製）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）５００μＬを加え、冷却することで分散させ、第１の結合物の分散溶液を調製した。

（第２の結合物の調製）
［製造例１］ビオチン結合ポリビニルアルコールの調製方法
１％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール（クラレ社製、Ｍ２０５、片末端にチオール基含有）水溶液１ｍＬ及び１％（ｗ／ｖ）Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＡＣ５−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（同仁化学研究所社製）水溶液１０μＬを混合し、３７℃で１時間静置した。この反応液をスピンカラム（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−１０）２本を用いて精製し、全量を精製水で１ｍＬとした。このうち１００μｌと、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（シグマ社製）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）９００μｌを混合することで、第２の結合物の分散溶液を調製した。

（ビオチン結合−温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子及びビオチン結合ポリビニルアルコールを用いたストレプトアビジンの定量）
［試料の調製］
ストレプトアビジン（和光純薬工業社製）を精製水で１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した。この溶液を０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（シグマ社製）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で１３．３μｇ／ｍＬ、６．７μｇ／ｍＬ、及び０μｇ／ｍＬとなるよう希釈したものを、それぞれ試料とした。

［定量］
図３に示されるように、汎用の分光光度計用セミミクロセル７１の光路外に、寸法５ｍｍ×９ｍｍ×２ｍｍのネオジム永久磁石７３（西興産業社製）を取り付けた。このセル７１を、セル温度制御機が設けられた紫外可視分光光度計Ｖ−６６０ＤＳ（日本分光社製）内に設置し、３７℃のもと１０分間以上保持した。

図４は、実施例に係る定量方法の手順を示すフローチャートである。定量方法は、上記の第１の結合物、第２の結合物及び試料を混合する工程（ＳＴ１０）と、混合物の濁度を測定する工程（ＳＴ２０）とを含む。

（混合）
第１の結合物の分散溶液１５０μＬ、第２の結合物の分散溶液１２０μＬ、及び各試料７５０μＬをマイクロチューブ内に注ぎ、ピペッティングで混合した後、ボルテックスミキサーで５分間撹拌した。

（濁度の測定）
この撹拌液をセル７１内に分注し、分光光度計に添付の使用説明書に従ってゼロ補正し、波長４２０ｎｍの光を用いて、直ちにバンド幅２．０ｎｍで１０００秒間にわたって連続して測定した。この結果を図５に示す。

図５に示されるように、測定開始約２６０秒後までは、ストレプトアビジンの量が多い程、濁度が低かった。これは、温度応答性ポリマーがストレプトアビジンを介して親水性のポリビニルアルコールに近接することによって凝集阻害を受けて分散したためである。一方、測定開始約２６０秒後付近から、ストレプトアビジンの量と濁度との関係が反転し始め、時間の経過とともに濁度が初期値よりも低下した。これは、凝集した磁性物質が磁石に吸着されて分離されたことによるものと推測される。

次に、各試料について、測定開始２６０秒後及び１０００秒後の２点での測定値の差異を表した。この結果を表１に示す。

表１に示されるように、測定開始２６０秒後及び１０００秒後の２点間の測定値の差は、ストレプトアビジンの量に依存するものであった。すなわちストレプトアビジン濃度が上がるにつれ、測定開始２６０秒後及び１０００秒後の２点間の測定値の差は小さくなった。これにより、測定開始２６０秒後及び１０００秒後の２点間の測定値の差を測定することで、検出物質を検出又は定量できることがわかった。

更に１０００秒以内という検出時間は、インキュベーション時間を含め約９０分間費やす従来技術（図８参照）に比べて、格段に短いものである。また、ＳＴ１０及びＳＴ２０という操作（図４参照）を、実際の検体について行うだけで検出物質を検出又は定量できるので、手順が簡便である。

以上の結果により、ストレプトアビジンの濃度に応じて濁度が変化すること、換言すれば、濁度を測定することでストレプトアビジンの濃度を定量できることが示された。つまり、本発明に係る方法は、二次抗体、発光試薬、発光検出装置等の特殊な試薬、機器を必要とせず、検出対象を迅速、安価且つ簡便に検出、定量できる新規な方法であることが確認された。

＜実施例２＞
本実施例では、第１の結合物として保護チオール基を含む温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子（以後、ＴＭ−ＬＰＤＰとも称する）を用い、第２の結合物としてＮ−ヒドロキシスクシンイミドが結合したポリエチレングリコール（以後、ＮＨＳ−ＰＥＧとも称する）「ＳＵＮ ＢＲＩＧＨＴ ＭＥ−４００ＣＳ」（日油社製、重量平均分子量４００００）を用いて、グルタチオン（ＧＳＨ）を検出、定量する例を示す。

（第１の結合物の調製）
アミノ基結合−温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子として、マグナビート（社）製のＴｈｅｒｍａ−Ｍａｘ ＬＡｍ Ａｍｉｎｅ（以後、ＴＭ−ＬＡｍと称する）０．４質量％を用いた。ＴＭ−ＬＡｍ ２ｍＬを２ｍＬマイクロチューブにとり、このマイクロチューブを４２℃に加熱することで、ＴＭ−ＬＡｍを凝集させ、磁石で回収した後、上清を除去した。除去後のマイクロチューブにホウ酸緩衝液２ｍＬを加えて溶媒を置換し、ＴＭ−ＬＡｍを充分に分散させることで、磁性微粒子含有ホウ酸緩衝液を得た。

続いて、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（同仁化学研究所社製、ＳＰＤＰ）２ｍｇをジメチルスルホキシド１００μＬに溶解した溶液と、上記の磁性微粒子含有ホウ酸緩衝液とを混合し、２０℃で一晩に亘り撹拌した。撹拌された液を４２℃に加熱し、凝集体を磁石で回収した後、上清を除去した。その後、凝集体にＰＢＳバッファー ２ｍＬを加え、充分に分散させた。以上の洗浄を２回行い、未反応のＳＰＤＰを除去した。分散液を４２℃に再加熱し、凝集体を磁石で回収し、上清を除去した後、保護チオール基を含む温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子をＰＢＳバッファーに分散させることで、第１の結合物を調製した（粒子の含有量０．３質量％）。

（保護チオール基を含む温度応答性ポリマー表面修飾磁性粒子及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド結合ポリエチレングリコールを用いたグルタチオンの定量）
［試料の調製］
還元型グルタチオン（和光純薬工業社製）を、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳバッファー１ｍＬに溶解し、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳバッファーで、１２μｇ／ｍＬ、６μｇ／ｍＬ、及び３μｇ／ｍＬとなるよう希釈したもの、及びグルタチオンを含まないものをそれぞれ作製し、試料とした。

［定量］
（混合）
１．５ｍＬチューブに、上述した第１の結合物のＰＢＳバッファー分散液５００μＬをとり、０．５Ｍ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８、ニッポンジーン社製）１０μＬを添加し、混合することで溶液を作製した。この溶液に上記の試料２００μＬを加え、４℃で６時間に亘り撹拌した。その後、チューブに、ＮＨＳ−ＰＥＧを７００μＬ（２００μＭ）加え、４℃で１２時間に亘り撹拌した。この撹拌物４００μＬにＰＢＳ８００μＬを加え、混合物を得た。

（相関式の作成）
この混合物を実施例１で用いたセル７１内に分注し、実施例１と同様の条件で濁度を測定した。この結果を図６に示す。

図６に示されるように、測定開始約５０秒後から既に、各試料の濁度の差異が大きかった。これにより、検体中の検出対象の検出及び定量を、極めて迅速に行うことができることが分かった。また、各試料の濁度の差異は測定開始約４５０秒後に最大値になることから、測定開始時から４５０秒後を測定時点として選択することが好ましいことが確認された。

上記の第１の結合物、第２の結合物及び試料を４℃の暗所内で保存し、１日１回ずつ３日間、同様の手順で濁度の測定を行った。この結果を表２に示す。なお、表２における数値は、測定開始時における各試料の濁度から、測定開始時から４５０秒後における各試料の濁度を差し引いた値（Δ０−４５０）の平均値を指す。

表２に示されるように、３日間に亘るいずれの時点間でも、ＣＶ（変動係数）は３．３以下という低い値であった。よって、本実施例の系によれば高い再現性が得られることが確認された。ここで、ＣＶ（％）は、ＣＶ＝標準偏差（ＳＴＤＥＶＡ）／平均値×１００の式に基づいて算出した。

また、グルタチオン０μｇ／ｍｌの測定開始時における各試料の濁度から、測定開始時から４５０秒後における各試料の濁度を差し引いた値（ＧＳＨ ０μｇ／ｍｌ、Δ０−４５０）の平均値、並びに各試料の測定開始時における濁度から、測定開始時から４５０秒後における各試料の濁度を差し引いた値（ＧＳＨ ３μｇ／ｍｌ，６μｇ／ｍｌ，１２μｇ／ｍｌ、Δ０−４５０）の平均値を差し引いた値と、グルタチオンの量との相関式を示すグラフを図７に示す。

図７に示されるように相関式は、ｙ＝０．０９３７ｘ−０．０１３３（式中、ｘはグルタチオンの量、ｙは濁度である）と求められた。また、相関係数Ｒ^２は０．９７と極めて高く、この相関式を用いることで、グルタチオン量を高精度に定量できることが分かった。これにより、本実施例のように、第２の物質としてポリエチレングリコールのように、粒子表面に接近させることで立体反発を示し、生体成分への非特異的な吸着をしにくいポリオキシアルキレンを用いることで、検体中の検出対象量を極めて高精度に定量できることが分かった。また、ポリオールについても同様の作用が考えられる。

本発明は前記実施形態に限定されるものではなく、本発明の目的を達成できる範囲での変形、改良等は本発明に含まれるものである。また、本発明では刺激応答性ポリマーを必須に用いるが、ポリマーに限られず、刺激応答性の低分子を用いてもよい。かかる低分子としては、例えば、特許第３６９３９７９号公報、特許第３９１６３３０号公報、特開２００２−８５９５７号公報、特許第４０７１７３８号公報、特許第２８６９６８４号公報、特許第２９２７６０１号公報、特許第３８４５２４９号公報、特開２００６−２４２５９７号公報等に開示される低分子が挙げられる。

Claims (9)

1. 検出対象を検出及び／又は定量するためのキットであって、
   刺激応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、
   親水性の第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、を含み、
   第１の親和性物質と第２の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、同時に前記検出対象に結合できるキット。
2. 第１の物質が、微粒子状の磁性物質を含む請求項１に記載のキット。
3. 第２の物質が、親水性のポリマーである請求項１又は２に記載のキット。
4. 第２の物質が、ポリオールである請求項１〜３のいずれか１項に記載のキット。
5. 第２の物質が、ポリオキシアルキレンを構成単位として含むポリマーである請求項１〜３のいずれか１項に記載のキット。
6. 検体中の検出対象を検出する方法であって、
   刺激応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、親水性の第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、前記検体とを混合し、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におき、前記刺激応答性ポリマーの分散の有無を判定する工程を含み、
   第１の親和性物質と第２の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、同時に前記検出対象に結合できる方法。
7. 第１の物質が微粒子状の磁性物質を含有し、
   前記方法は、磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含む請求項６に記載の方法。
8. 検体中の検出対象を定量する方法であって、
   刺激応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、親水性の第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、前記検体とを混合し、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する所定条件下におき、
   前記混合物の濁度を測定し、前記検出対象の量と濁度との前記所定条件下における相関式に基づいて、前記検体中の検出対象の量を算出することを含む方法。
9. 第１の物質が微粒子状の磁性物質を含有し、
   前記方法は、磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含む請求項８に記載の方法。

Images