JP4974062B2 - 創薬スクリーニング方法 - Google Patents

Description

本発明は、焦点誤差信号を用いた観察光学系の自動合焦機能を有する創薬スクリーニングに関し、スクリーニング時間の短縮を図ったスクリーニング方法に関するものである。

顕微鏡の対物レンズをアクチュエータで駆動することで、自動的な合焦制御を実行する
自動焦点装置が知られている。この装置では、顕微鏡の対物レンズの焦点位置からのずれ
を検出し、そのずれの検出信号に応じて圧電素子等のアクチュエータにより対物レンズを
移動させ、合焦させている。

このような従来の自動焦点装置を有する創薬スクリーニング装置について、図４のブロック構成図を用いて説明する。
図４において、創薬スクリーニング装置１は、観察光学系１０および焦点誤差検出光学系２０からなる光学系を備えている。

観察光学系１０は、試料が載置されるウエルプレート５の近傍に配置される対物レンズ１１と、対物レンズ１１を光軸方向に移動させるアクチュエータ１６と、ウエルプレート５側からの光を観察光および焦点誤差検出光に分離する分離手段としてのダイクロイックミラー１２と、ダイクロイックミラー１２を透過した観察光が入射する顕微鏡１３と、焦点誤差検出用光源としてのレーザダイオード２１と、レーザダイオード２１から照射された焦点誤差検出光をウエルプレート５に向けて通過させるレンズ群２２と、焦点誤差検出光の一部を反射させるハーフミラー２３と、ウエルプレート５で反射されハーフミラー２３を通過した焦点誤差検出光が透過するシリンドリカルレンズ２７およびコリメータレンズ２７ａと、焦点誤差信号生成手段としての４分割フォトダイオード２５を備えている。

上述の構成において、レーザダイオード２１から照射された焦点誤差検出光は、レンズ群２２、ハーフミラー２３、フィルタ２８を通ってダイクロイックミラー１２により反射して、対物レンズ１１を介してウエルプレート５に照射される。
ウエルプレート５で反射された焦点誤差検出光は、対物レンズ１１を介してダイクロイックミラー１２に戻り、ここで分岐してハーフミラー２３を通過して、コリメータレンズ２７ａおよびシリンドリカルレンズ２７を通過し、４分割フォトダイオード２５で受光される。ダイクロイックミラー１２を透過した焦点誤差検出光は顕微鏡１３に入射し、顕微鏡１３においてウエルプレート５に載置された試料の観察像が得られる。

焦点誤差検出光学系２０に設けられたフィルタ２８は、ダイクロイックミラー１２によ
り除去されきれなかったウエルプレート５の側からの観察光を遮断する。
図４においては、フィルタ２８において観察光を遮断し、フィルタ２８を経由した焦点誤差検出光のみが４分割フォトダイオード２５に入射する。

このため、４分割フォトダイオード２５において、観察光の影響を受けない正確な焦点誤差信号を生成することができる。また、観察光の影響を排除することで、焦点誤差検出の感度を向上させることができるので、ウエルプレート５に照射する焦点誤差検出光の光量を低下させることができ、ウエルプレート５上に載置された試料が生細胞である場合などに、試料への悪影響を防止できる。

図５は、４分割フォトダイオード２５に照射される焦点誤差検出光の投影形状を示して
おり、図５（ａ）は合焦時の形状、図５（ｂ）は焦点が遠い場合の形状、図５（ｃ）は焦
点が近い場合の形状をそれぞれ示している。フォトダイオード２５の領域２５ａの出力
レベルを「Ａ」、領域２５ｂの出力レベルを「Ｂ」、領域２５ｃの出力レベルを「Ｃ」、
領域２５ｄの出力レベルを「Ｄ」とすると、「（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ）」を演算すること
で、焦点誤差（フォーカスエラー）検出信号を得ることができる。

このような自動焦点装置を用いてハイ・コンテンツ・スクリーニング（ＨＣＳ）を行う場合、スクリーニングの過程において、予め培養した細胞（試料）を培養液と一緒にウェルプレートにあるウェルに適切な数で分注し、ウェル毎に異なる濃度、または異なる量、または異なる種類の試薬を滴下して、テスト試料を用意しておく。

そしてこれらの試料に光を用いて励起し、励起された試料から出る蛍光像を、顕微鏡を介してカメラ４０で取り込む。全てのウェルから蛍光画像を取得するため、ＸＹステージでウェルプレートを移動する。カメラで取得した画像に対して画像処理をし、その結果を元に薬の候補になる試料を見出す。画像の画質を高めるため、顕微鏡１３とカメラ４０の間に共焦点スキャナ４０ａを設置する。

ウェルプレートには観察試料を収納するウェル穴が格子状に多数形成されているが、ウェルプレートには本質的なたわみがあるため、基本的には一つ一つのウェル穴において以上のような動作を行って合焦を行っている。

図６（ａ〜ｃ）は焦点位置調整の具体的な合焦の方法を示す図である。
図６（ａ）において、まず１番目のウェル穴で従来技術と同様に、対物レンズ１１をＺ軸方向にスキャンさせ、Ｓ字状の焦点誤差信号を検出し、合焦位置に合わせる。

図６（ｂ）において、合焦したウェル穴から、ＸＹ軸方向にウェルプレート５を移動させ次のウェル穴に移す。移動させるとウェル底面たわみによるＺ方向のずれにより、焦点誤差信号が変位する。
図６（ｃ）において、焦点誤差信号の変位量より、ウェル底面の変位量を計算し、その変位量の分だけ、対物レンズを駆動させ、合焦とする。
このような創薬スクリーニング装置としては下記の特許文献が知られている。

特開２００５−０９５０１２
特開２００５−１０２６２９

本発明のような焦点誤差検出方法を用いた場合、図６に示したとおり、焦点誤差信号はＳ字のものとなる。このＳ字の内側の山と谷の間の部分を引込範囲と呼ぶ。
隣接する観察点のウェルプレートのたわみによるＺ方向位置の差が、この引込範囲より大きい場合、この方式では、合焦が出来ない。

また、これを解決するために、隣接する観察点まで、ＸＹステージ駆動→自動合焦という過程を複数回繰り返すという方法があるが、これを行うと、駆動時間が長くなり、ウェルプレートあたりのスクリーニング時間が大幅に長くなってしまう。

本発明は、上述の課題を解決するためになされたもので、一つ一つのウェル穴において、焦点探索動作をすることなく、ＨＣＳにおける観察時間を短縮することが可能な創薬スクリーニング装置を提供することを目的としている。

本発明の創薬スクリーニング方法は、請求項１においては、
焦点誤差検出光学系により得られる焦点誤差信号を用いて観察光学系の合焦を行う顕微鏡を備えた創薬スクリーニング方法において、
観察対象に対向して配置された対物レンズと、
該対物レンズをＺ軸方向に駆動するアクチュエータと、
前記対物レンズと前記観察対象が配置されたウェルプレートの底面との間に生じる焦点誤差信号を検出する焦点誤差検出器と、
前記焦点誤差信号を入力するサーボアンプと、
前記アクチュエータからの駆動量情報と前記焦点誤差信号を入力し、前記ウェルプレートの駆動部に対して駆動指令を発する情報処理部と、
前記情報処理部から出力される任意駆動信号と前記サーボアンプから出力されるサーボ駆動信号を前記報処理部からの切換指令により切換える切換スイッチと、
を備え、下記の工程を含むことを特徴とする創薬スクリーニング方法
記
１）ウェルプレートの底部の一点にアクチュエータに固定された対物レンズを近づけて該対物レンズの焦点をＳ字状の焦点誤差信号を得られる範囲に配置する工程、
２）前記Ｓ字状の焦点誤差信号を得られる範囲内で、サーボ駆動により前記対物レンズを焦点誤差信号がゼロになる位置に移動する工程、
３）前記焦点誤差信号がゼロになるアクチュエータの位置を記憶して任意駆動に切替える工程、
４）アクチュエータを任意駆動して予め定めた撮影位置まで対物レンズを移動させて観察対象の撮影を行う工程、
５）撮影後、前記記憶した焦点誤差信号がゼロになる位置までアクチュエータを戻す工程、
６）焦点誤差信号がゼロになった位置でサーボ駆動に切り替える工程。
７）次に撮影する観察対象が配置されたウェルプレートの底部までサーボ駆動により焦点誤差信号のゼロ位置に追従して移動する工程、
８）前記３）〜７）を繰り返す。

本発明の創薬スクリーニング装置によれば、
対物レンズとウェルプレートの底面のたわみに起因して生じる焦点誤差信号を検出する焦点誤差検出器、焦点誤差信号を入力するサーボアンプ、アクチュエータからの駆動量情報と焦点誤差信号を入力し、ウェルプレートの駆動部に対して駆動指令を発する情報処理部、情報処理部から出力される任意駆動信号とサーボアンプから出力されるサーボ駆動信号を報処理部からの切換指令により切換える信号切替え器を備えており、

対物レンズの焦点をＳ字状の焦点誤差信号を得られる範囲に配置し、サーボ駆動により対物レンズを焦点誤差信号がゼロになる位置に移動させ、その位置を記憶して任意駆動に切替え、予め定めた撮影位置で観察対象の撮影を行い、撮影後、記憶した焦点誤差信号がゼロになる位置までアクチュエータを戻し、その位置でサーボ駆動に切り替えて、次に撮影する観察対象が配置されたウェルプレートの底部までサーボ駆動により焦点誤差信号のゼロ位置に追従して移動するようにしたので、

各々の測定ウェルについて探索動作を行う必要が無い。また、焦点誤差信号の引込範囲を狭くすることが出来るため、焦点誤差信号のＺ−Ｖの傾きが大きくなるので、合焦の精度が向上すると共に、スクリーニング動作時間の短縮が期待できる。

図１（ａ）は本発明の創薬スクリーニング装置の要部のシステムを示すブロック構成図、図１（ｂ，ｃ）は合焦状態と非合焦状態の説明図である。
図１（ａ）において、１１は対物レンズ、１６はアクチュエータ、２０は焦点誤差検出器、３３は情報処理部、３４はサーボアンプ、３６は切換スイッチである。

ここで、焦点誤差検出器２０はレーザをウェルプレート５の底面に照射し、その反射光を検出することにより、現在の対物レンズ１１の位置が合焦点からどの程度はなれているのかを測定する。

アクチュエータ１６は電動機もしくは圧電素子（図示省略）を用いて、対物レンズ１１をＺ方向に駆動させるもので、駆動量の絶対値（対物レンズのＺ絶対値）を出力するものである。

サーボアンプ３４は焦点誤差検出器２０より出力される焦点誤差信号を読み取って、焦点誤差信号が一定となるような、すなわち、対物レンズ１１がウェルプレート５の底面のたわみに追従するような駆動信号を発生する制御装置として機能する。

情報処理部３３はこの自動焦点動作を管理する部分であり、アクチュエータ１６の位置情報や焦点誤差信号を記憶したり、任意の駆動信号を出力することが出来る。また、切換スイッチ３６へ信号切換指令を発してアクチュエータ１６への駆動信号の切り替えをすることが出来、ＸＹステージ３２の駆動を間接的、又は直接的に指令するものである。

図１（ｂ）は対物レンズ１１がウェルプレートの底面５ａに対して合焦状態となっている状態を示し、焦点誤差信号のＺ−Ｖで示すＳ字カーブにおける出力が０となっている。
図１（ｃ）は対物レンズ１１がウェルプレートの底面５ａに対して非合焦状態となってΔＺずれている状態を示し、焦点誤差信号のＺ−Ｖで示すＳ字カーブにおける出力がＶ_１となっている。

次に、具体的な合焦動作手順を示す。最初、アクチュエータ１６は情報処理部３３からの任意駆動となっている。最初のウェルにおいて、対物レンズ１１をＺ方向に一定量駆動させ、Ｓ字状の焦点誤差信号を得る。取得した焦点誤差信号を元に、対物レンズ１１を引込範囲内に駆動させる。すなわち、サーボ動作がかけられる位置まで対物レンズを駆動させる。

引込範囲まで対物レンズ１１を駆動させた後、アクチュエータ１６をサーボ駆動に切換え、対物レンズ１１を焦点誤差信号が０となる位置（合焦位置）に整定させる。整定した位置における、アクチュエータ１６の絶対駆動量を記憶する。

（★１）次にアクチュエータ１６を任意駆動に切換え、予め定めた撮影位置までアクチュエータ１６を駆動させて、観察対象（試料）の撮影を行う。
ここで、予め定めた撮影位置とはウェルの底に滴下された試料の位置であり、ウェルプレートの底面５ａから所定の距離を移動させた位置である。なお、ここではウェルプレートの厚さと観察対象の位置は変わらないものとする。

撮影後、前述で記憶した絶対位置までアクチュエータを移動させ、その後サーボ動作に切換える。

サーボ動作に切換えた後、情報処理部３３から指令を発し、ウェルプレート５が載置されたＸＹステージ３２を動かして次の観察対象の底面まで移動させる。このとき、ウェルプレートのたわみにより、ウェルプレート底面のＺ位置にずれが生じるが（外乱）、サーボ動作により、焦点誤差信号が０となる位置（合焦位置）に、対物レンズ１１とウェルプレート底面の相対位置を保つように追従する。

（★２）ＸＹステージの移動が完了した後に、対物レンズが整定した後、その位置におけるアクチュエータ１６の絶対駆動量を記憶する。

以降、（★１）〜（★２）の動作を繰り返し、全てのウェルにおいて試料の撮影動作を行う。

図２（ａ，ｂ）は焦点誤差信号と引き込み範囲によるＳ字カーブのＺ−Ｖの傾きの大小関係を示すもので、図２（ａ）は引き込み範囲が広くＺ−Ｖの傾きが緩やかな状態、図２（ｂ）は引き込み範囲が狭くＺ−Ｖの傾きが急峻になっている状態を示している。

本発明では次の観察対象に移動する間は対物レンズがウェルプレートの底面を追従するので引き込み範囲を狭くすることができる。そのため、Ｚ−Ｖの傾きが急峻になる。その結果、引き込み範囲内において一定のＺ変位による焦点誤差信号の変化が大きくなるため、合焦精度を高めることができる。

図３（ａ〜ｃ）は他の実施例を示すもので、観察に先立ってウェルプレートのたわみ量を計算により求め、それをウェルプレートプロファイルとしてメモリ３５に記憶しておくものである。
図３（ａ）において、ウェルプレートの四隅と４辺の中間および中央部において、対物レンズのＺ軸方向のスキャンを行い、合焦位置におけるアクチュエータのＺ軸駆動量から、ウェルのその点におけるＺ軸座標を求める。この９点のＺ軸座標を元にウェルの曲面を求め、マッピングを行う。

図３（ｂ）は上記マッピングした値をメモリ３５に書き込み、その値をシステムブロックに組み込んだ状態を示すものである。図３（ｂ）に示すようにメモリ３５からの信号は制御回路３３から出力する駆動信号に加えられる。

図３（ｃ）は対物レンズ（アクチュエータ）の動作の流れを示すもので、イは合焦状態、ロは次のウェルプレートに移動しながらマッピングされた値に基づいたδＺ_２の補正を行っている状態、ハは、更にサーボ駆動によりΔＺ_２の補正を行ってウェル底面に合焦させた状態を示している。

上記のように、サーボ系のアクチュエータ駆動信号にウェルプレートプロファイルの予測値を追加することにより、ウェルプレート底面からの偏差ΔＺを小さく押えながら制御を行うことができる。その結果、合焦の速度と精度を向上させることができる。

以上説明したように、本発明の創薬スクリーニング装置によれば、サーボ駆動により対物レンズを焦点誤差信号がゼロになる位置に移動させるので、一つ一つのウェル穴において、対物レンズをスキャンすることなく、ＨＣＳにおける観察時間を短縮することができる。

なお、以上の説明は、本発明の説明および例示を目的として特定の好適な実施例を示したに過ぎない。本発明では創薬スクリーニング装置について説明したが他のスクリーニング装置に用いてもよい。
従って本発明は、上記実施例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形を含むものである。

本発明の実施形態の一例を示す創薬スクリーニング装置の要部のシステムを示すブロック構成図、および合焦状態と非合焦状態の説明図である。 焦点誤差信号と引き込み範囲によるＳ字カーブのＺ−Ｖの傾きの大小関係を示す図である。 他の実施例を示す図である。 従来の創薬スクリーニング装置の一例を示すブロック構成図である。 ４分割フォトダイオードに照射される焦点誤差検出光の投影形状を示す図である。 焦点位置調整の具体的な合焦の方法を示す図である。

符号の説明

３ 制御回路（合焦手段）
４ 焦点調整部（焦点調整手段）
５ ウェルプレート
１０ 観察光学系
１１ 対物レンズ
１２ ダイクロイックミラー
１６ アクチュエータ
２０ 焦点誤差検出光学系（合焦手段）
２１ レーザダイオード
２２ レンズ群
２３ ハーフミラー
２５ ４分割フォトダイオード（焦点誤差信号生成手段）
２７ シリンドリカルレンズ
２７ａ コリメータレンズ
２８ フィルタ
３０ 制御回路
３２ ＸＹステージ
３３ 情報処理部
３４ サーボアンプ
３５ メモリ
３６ 切換スイッチ
４０ カメラ
４０ａ 共焦点スキャナ

Claims (1)

1. 焦点誤差検出光学系により得られる焦点誤差信号を用いて観察光学系の合焦を行う顕微鏡を備えた創薬スクリーニング方法において、
   観察対象に対向して配置された対物レンズと、
   該対物レンズをＺ軸方向に駆動するアクチュエータと、
   前記対物レンズと前記観察対象が配置されたウェルプレートの底面との間に生じる焦点誤差信号を検出する焦点誤差検出器と、
   前記焦点誤差信号を入力するサーボアンプと、
   前記アクチュエータからの駆動量情報と前記焦点誤差信号を入力し、前記ウェルプレートの駆動部に対して駆動指令を発する情報処理部と、
   前記情報処理部から出力される任意駆動信号と前記サーボアンプから出力されるサーボ駆動信号を前記報処理部からの切換指令により切換える切換スイッチと、
   を備え、下記の工程を含むことを特徴とする創薬スクリーニング方法。
   記
   １）ウェルプレートの底部の一点にアクチュエータに固定された対物レンズを近づけて該対物レンズの焦点をＳ字状の焦点誤差信号を得られる範囲に配置する工程、
   ２）前記Ｓ字状の焦点誤差信号を得られる範囲内で、サーボ駆動により前記対物レンズを焦点誤差信号がゼロになる位置に移動する工程、
   ３）前記焦点誤差信号がゼロになるアクチュエータの位置を記憶して任意駆動に切替える工程、
   ４）アクチュエータを任意駆動して予め定めた撮影位置まで対物レンズを移動させて観察対象の撮影を行う工程、
   ５）撮影後、前記記憶した焦点誤差信号がゼロになる位置までアクチュエータを戻す工程、
   ６）焦点誤差信号がゼロになった位置でサーボ駆動に切り替える工程。
   ７）次に撮影する観察対象が配置されたウェルプレートの底部までサーボ駆動により焦点誤差信号のゼロ位置に追従して移動する工程、
   ８）前記３）〜７）を繰り返す。

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