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JP2017517488A - 抗ｃｄ１９キメラ抗原受容体を使用する癌の処置 - Google Patents

抗ｃｄ１９キメラ抗原受容体を使用する癌の処置 Download PDF

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Abstract

本発明は、例えば、キナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤と組み合わせてと組み合わせて、ここに記載するようなＣＤ１９ ＣＡＲを含む組み換えＴ細胞を投与することによる、ＣＤ１９の発現と関係する疾患を処置するための組成物および方法に関する。本発明はまたここに記載するキットおよび組成物も提供する。

Description

本出願は、米国出願６１／９７６,３９６号(２０１４年４月７出願)、米国出願６２／００７,３０９号(２０１４年６月３日出願)、米国出願６２／０３６,４９３号(２０１４年８月１２日出願)、米国出願６２／０７６,２３８号(２０１４年１１月６日出願)、米国出願６２／０８７,８８８号(２０１４年１２月５日出願)および米国出願６２／０９７,２７８号(２０１４年１２月２９日出願)に基づく優先権を主張し、これらの内容を、引用によりその全体を本明細書に包含させる。
配列表
本出願は配列表を含み、これはASCII形式で電子的に提供しており、ここに、その全体を包含させる。２０１５年４月６日に作成した該ASCIIコピーは名称N2067-7051WO_SL.txtであり、サイズ252,236バイトである。
発明の分野
本発明は、一般に、表面抗原分類１９タンパク質(ＣＤ１９)の発現と関係する疾患を処置するための、例えば、キナーゼ阻害剤および／またはサイトカインのような他の薬剤と、例えば組み合わせて、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように操作したＴ細胞の使用に関する。
発明の背景
Ｂ細胞悪性腫瘍を有する多くの患者は、標準的治療では不治である。さらに、伝統的処置選択肢は、しばしば重篤な副作用を有する。癌免疫療法が試みられているが、いくつかの障害が、臨床的有効性の達成を、極めて困難な目標としている。数百ものいわゆる腫瘍抗原が同定されているが、これらは一般に自己由来であり、ゆえに、免疫原性が乏しい。さらに、腫瘍は、自身を免疫攻撃の開始および伝播に適さないようにするいくつかの機構を使用する。
Ｔ細胞をＢ細胞悪性腫瘍のような癌細胞上の適当な細胞表面分子に再指向させることに依存するキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)修飾自己Ｔ細胞(ＣＡＲＴ)治療を使用する最近の開発は、免疫系の力をＢ細胞悪性腫瘍および他の癌の処置に利用する有望な結果を示す(例えば、Sadelain et al., Cancer Discovery 3:388-398 (2013)参照)。マウス由来ＣＡＲＴ１９(すなわち、“ＣＴＬ０１９”)の臨床結果は、ＣＬＬならびに小児ＡＬＬを有する患者における完全寛解の確立に見込みを示している(例えば、Kalos et al., Sci Transl Med 3:95ra73 (2011), Porter et al., NEJM 365:725-733 (2011), Grupp et al., NEJM 368:1509-1518 (2013))。遺伝子修飾したＴ細胞上のキメラ抗原受容体が標的細胞を認識し破壊する能力以外に、治療的Ｔ細胞治療の成功には、時間をかけて増殖し、持続する能力を有することおよび逃亡白血病細胞をさらにモニターすることが必要である。Ｔ細胞の可変性の品質は、アネルギー、抑制または疲弊のいずれの結果であれ、ＣＡＲ形質転換Ｔ細胞の性能に影響するが、当業者は、現時点で限られた管理しか有しない。有効とするために、ＣＡＲで形質転換した患者のＴ細胞が存続し、ＣＡＲの抗原に応答して増殖する能力を維持する必要がある。マウスｓｃＦｖを含むＣＡＲＴ１９を用いて、ＡＬＬ患者Ｔ細胞はこれを実施できることが示された(例えば、Grupp et al., NEJM 368:1509-1518 (2013)参照)。
発明の要約
本発明は、少なくとも一部、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)分子(例えば、Ｂ細胞抗原、例えば、表面抗原分類１９タンパク質(ＣＤ１９)(例えば、OMIM Acc. No. 107265、Swiss Prot. Acc No. P15391)に結合するＣＡＲを発現する、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を使用する、癌(例えば、血液癌または他のＢ細胞悪性腫瘍)のような障害を処置する組成物および方法に関する。組成物は、Ｂ細胞ターゲティングＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を、キナーゼ阻害剤(例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＭＮＫ阻害剤、デュアルＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤またはこれらの組み合わせの１以上)と組み合わせて含み、方法はその投与を含む。ある態様において、組み合わせは、いずれかの単独治療と比較して、臨床的有効性を維持するかまたは良好である。本発明は、さらに、Ｂ細胞抗原、例えば、ＣＤ１９の発現と関係する障害(例えば、癌、例えば、血液癌)を処置するための、キナーゼ阻害剤(例えば、サイクリン依存性キナーゼ４(ＣＤＫ４)阻害剤、ブルトン型チロシンキナーゼ(ＢＴＫ)阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ相互作用キナーゼ(ＭＮＫ)阻害剤、デュアルホスファチジルイノシトール３−キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)／ｍＴＯＲ阻害剤またはこれらの組み合わせから選択される１以上のキナーゼ阻害剤)と組み合わせた、Ｂ細胞抗原、例えば、ＣＤ１９と結合するＣＡＲ分子を発現するように操作した細胞、例えば、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)の使用に関する。
従って、ある面において、本発明は、Ｂ細胞抗原、例えば、ＣＤ１９の発現と関係する疾患を有する対象、例えば、哺乳動物を処置する方法に関する。方法は、哺乳動物に、キナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤と組み合わせて、Ｂ細胞抗原と結合するＣＡＲ分子を発現する細胞、例えば、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)の有効量を投与することを含む。ある態様において、ＣＡＲ分子はＣＤ１９に結合し、例えば、ＣＡＲ分子はここに記載するＣＤ１９に結合する。他の態様において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＲＯＲ１の１以上と結合する。
ある態様において、Ｂ細胞抗原の発現(例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＲＯＲ１の１以上の発現)と関係する疾患は、癌、悪性腫瘍または骨髄異形成、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態のような前癌状態のような増殖性疾患またはＢ細胞抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＲＯＲ１の１以上の発現と関係する非癌関連疾患である。ある態様において、疾患は固形または液性腫瘍である。ある態様において、癌は膵臓癌である。ある態様において、疾患は血液癌である。ある態様において、血液癌は白血病である。ある態様において、癌は、Ｂ細胞急性リンパ系白血病(ＢＡＬＬ)、Ｔ細胞急性リンパ系白血病(ＴＡＬＬ)、小リンパ球性白血病(ＳＬＬ)、急性リンパ系白血病(ＡＬＬ)を含むが、これらに限定されない１以上の急性白血病；慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)を含むが、これらに限定されない１以上の慢性白血病からなる群から選択される。さらなる血液癌または血液学的状態は、マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫(ＤＬＢＣＬ)、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞もしくは大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物およびワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症を含むが、これらに限定されない。ある態様において、Ｂ細胞抗原(例えば、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＲＯＲ１の１以上)発現と関係する疾患は、骨髄球性血液細胞の産生不全(または異形成)によりまとめられる血液学的状態の雑多なコレクションである“前白血病状態”である。ある態様において、Ｂ細胞抗原(例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＲＯＲ１の１以上)発現と関係する疾患は、Ｂ細胞抗原(例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＲＯＲ１の１以上)を発現する非定型および／または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性疾患を含むが、これらに限定されない。ここに記載するＢ細胞抗原(例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＲＯＲ１の１以上)発現と関係する疾患のあらゆる組み合わせを、ここに記載する方法および組成物により処置できる。
ある態様において、Ｂ細胞抗原(例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＲＯＲ１の１以上)の発現と関係する疾患は、リンパ腫、例えば、ＭＣＬ、ホジキンリンパ腫またはＤＬＢＣＬである。ある態様において、Ｂ細胞抗原(例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＲＯＲ１の１以上)の発現と関係する疾患は、白血病、例えば、ＳＬＬ、ＣＬＬおよび／またはＡＬＬである。ある態様において、Ｂ細胞抗原の発現と関係する疾患は多発性骨髄腫、例えば、フローサイトメトリーおよびＲＴ−ＰＣＲの両者により検出して、例えば、ＣＤ１９陰性である、例えば、新生物形質細胞の大多数(９９.９５％)がＣＤ１９陰性表現型を有する多発性骨髄腫である。
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤、例えば、ここに記載するＣＤＫ４阻害剤、例えば、６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−(５−ピペラジン−１−イル−ピリジン−２−イルアミノ)−８Ｈ−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−オン、ヒドロクロライド(パルボシクリブまたはＰＤ０３３２９９１とも呼ぶ)のような、例えば、ＣＤ４／６阻害剤である。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブのような、例えば、ここに記載するＢＴＫ阻害剤である。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシン、ラパマイシンアナログ、ＯＳＩ−０２７のような、例えば、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤である。ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤、例えば、ここに記載するｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤であり得る。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＭＮＫ阻害剤、例えば、４−アミノ−５−(４−フルオロアニリノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンのような、例えば、ここに記載するＭＮＫ阻害剤である。ＭＮＫ阻害剤は、例えば、ＭＮＫ１ａ、ＭＮＫ１ｂ、ＭＮＫ２ａおよび／またはＭＮＫ２ｂ阻害剤であり得る。ある態様において、阻害剤はデュアルＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＰＦ−０４６９５１０２であり得る。
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、アロイシンＡ；フラボピリドールまたはＨＭＲ−１２７５、２−(２−クロロフェニル)−５,７−ジヒドロキシ−８−[(３Ｓ,４Ｒ)−３−ヒドロキシ−１−メチル−４−ピペリジニル]−４−クロメノン；クリゾチニブ(ＰＦ−０２３４１０６６)；２−(２−クロロフェニル)−５,７−ジヒドロキシ−８−[(２Ｒ,３Ｓ)−２−(ヒドロキシメチル)−１−メチル−３−ピロリジニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、ヒドロクロライド(Ｐ２７６−００)；１−メチル−５−[[２−[５−(トリフルオロメチル)−１Ｈ−イミダゾール−２−イル]−４−ピリジニル]オキシ]−Ｎ−[４−(トリフルオロメチル)フェニル]−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−アミン(ＲＡＦ２６５)；インジスラム(Ｅ７０７０)；ロスコビチン(ＣＹＣ２０２)；パルボシクリブ(ＰＤ０３３２９９１)；ディナシクリブ(ＳＣＨ７２７９６５)；Ｎ−[５−[[(５−ｔｅｒｔ−ブチルオキサゾール−２−イル)メチル]チオ]チアゾール−２−イル]ピペリジン−４−カルボキサミド(ＢＭＳ３８７０３２)；４−[[９−クロロ−７−(２,６−ジフルオロフェニル)−５Ｈ−ピリミド[５,４−ｄ][２]ベンズアゼピン−２−イル]アミノ]−安息香酸(ＭＬＮ８０５４)；５−[３−(４,６−ジフルオロ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル)−１Ｈ−インダゾール−５−イル]−Ｎ−エチル−４−メチル−３−ピリジンメタンアミン(ＡＧ−０２４３２２)；４−(２,６−ジクロロベンゾイルアミノ)−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸Ｎ−(ピペリジン−４−イル)アミド(ＡＴ７５１９)；４−[２−メチル−１−(１−メチルエチル)−１Ｈ−イミダゾール−５−イル]−Ｎ−[４−(メチルスルホニル)フェニル]−２−ピリミジンアミン(ＡＺＤ５４３８)；ＸＬ２８１(ＢＭＳ９０８６６２)；およびリボシクリブからなる群から選択されるＣＤＫ４阻害剤である。
ある態様において、キナーゼ阻害剤はＤＫ４阻害剤、例えば、パルボシクリブ(ＰＤ０３３２９９１)であり、パルボシクリブを、１日約５０mg、６０mg、７０mg、７５mg、８０mg、９０mg、１００mg、１０５mg、１１０mg、１１５mg、１２０mg、１２５mg、１３０mg、１３５mg(例えば、７５mg、１００mgまたは１２５mg)の用量で一定期間、例えば、２８日サイクルの１４〜２１日連日または２１日サイクルの７〜１２日連日投与する。ある態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のサイクルのパルボシクリブを投与する。
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、イブルチニブ(ＰＣＩ−３２７６５)；ＧＤＣ−０８３４；ＲＮ−４８６；ＣＧＩ−５６０；ＣＧＩ−１７６４；ＨＭ−７１２２４；ＣＣ−２９２；ＯＮＯ−４０５９；ＣＮＸ−７７４；およびＬＦＭ−Ａ１３から選択されるＢＴＫ阻害剤である。好ましい態様において、ＢＴＫ阻害剤はインターロイキン−２誘導性キナーゼ(ＩＴＫ)のキナーゼ活性を低減または阻害せず、ＧＤＣ−０８３４；ＲＮ−４８６；ＣＧＩ−５６０；ＣＧＩ−１７６４；ＨＭ−７１２２４；ＣＣ−２９２；ＯＮＯ−４０５９；ＣＮＸ−７７４；およびＬＦＭ−Ａ１３から選択される。
ある態様において、キナーゼ阻害剤はＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブ(ＰＣＩ−３２７６５)であり、イブルチニブを、１日約２５０mg、３００mg、３５０mg、４００mg、４２０mg、４４０mg、４６０mg、４８０mg、５００mg、５２０mg、５４０mg、５６０mg、５８０mg、６００mg(例えば、２５０mg、４２０mgまたは５６０mg)の用量で一定期間、例えば、２１日サイクルで連日または２８日サイクルで連日投与する。ある態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のサイクルのイブルチニブを投与する。
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、テムシロリムス；リダフォロリムス(１Ｒ,２Ｒ,４Ｓ)−４−[(２Ｒ)−２−[(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ、２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｚ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３、２９,３５−ヘキサメチル−２,３,１０,１４,２０−ペンタオキソ−１１,３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−１２−イル]プロピル]−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート(ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としても知られる)；エベロリムス(ＲＡＤ００１)；ラパマイシン(ＡＹ２２９８９)；セマピモド；(５−{２,４−ビス[(３Ｓ)−３−メチルモルホリン−４−イル]ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−イル}−２−メトキシフェニル)メタノール(ＡＺＤ８０５５)；２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(ＰＦ０４６９１５０２)；およびＮ２−[１,４−ジオキソ−４−[[４−(４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル)モルホリニウム−４−イル]メトキシ]ブチル]−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−、分子内塩(ＳＦ１１２６)；およびＸＬ７６５から選択されるｍＴＯＲ阻害剤である。
ある態様において、キナーゼ阻害剤はｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンであり、ラパマイシンを、１日約３mg、４mg、５mg、６mg、７mg、８mg、９mg、１０mg(例えば、６mg)の用量で一定期間、例えば、２１日サイクルで連日または２８日サイクルで連日投与する。ある態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のサイクルのラパマイシンを投与する。ある態様において、キナーゼ阻害剤はｍＴＯＲ阻害剤、例えば、エベロリムスであり、エベロリムスを１日約２mg、２.５mg、３mg、４mg、５mg、６mg、７mg、８mg、９mg、１０mg、１１mg、１２mg、１３mg、１４mg、１５mg(例えば、１０mg)の用量で一定期間、例えば、２８日サイクルで連日投与する。ある態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のサイクルのエベロリムスを投与する。
ある態様において、キナーゼ阻害剤はＣＧＰ０５２０８８；４−アミノ−３−(ｐ−フルオロフェニルアミノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン(ＣＧＰ５７３８０)；セルコスポラミド；ＥＴＣ−１７８０４４５−２；および４−アミノ−５−(４−フルオロアニリノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンから選択されるＭＮＫ阻害剤である。
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(ＰＦ−０４６９１５０２)；Ｎ−[４−[[４−(ジメチルアミノ)−１−ピペリジニル]カルボニル]フェニル]−Ｎ’−[４−(４,６−ジ−４−モルホリニル−１,３,５−トリアジン−２−イル)フェニル]尿素(ＰＦ−０５２１２３８４、ＰＫＩ−５８７)；２−メチル−２−{４−[３−メチル−２−オキソ−８−(キノリン−３−イル)−２,３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−１−イル]フェニル}プロパンニトリル(ＢＥＺ−２３５)；アピトリシブ(ＧＤＣ−０９８０、ＲＧ７４２２)；２,４−ジフルオロ−Ｎ−{２−(メチルオキシ)−５−[４−(４−ピリダジニル)−６−キノリニル]−３−ピリジニル}ベンゼンスルホンアミド(ＧＳＫ２１２６４５８)；８−(６−メトキシピリジン−３−イル)−３−メチル−１−(４−(ピペラジン−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル)−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−２(３Ｈ)−オンマレイン酸(ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６)；３−[４−(４−モルホリニルピリド[３’,２’：４,５]フロ[３,２−ｄ]ピリミジン−２−イル]フェノール(ＰＩ−１０３)；５−(９−イソプロピル−８−メチル−２−モルホリノ−９Ｈ−プリン−６−イル)ピリミジン−２−アミン(ＶＳ−５５８４、ＳＢ２３４３)；およびＮ−[２−[(３,５−ジメトキシフェニル)アミノ]キノキサリン−３−イル]−４−[(４−メチル−３−メトキシフェニル)カルボニル]アミノフェニルスルホンアミド(ＸＬ７６５)から選択されるデュアルホスファチジルイノシトール３−キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)およびｍＴＯＲ阻害剤である。
ある態様において、細胞は、抗ＣＤ１９結合ドメイン(例えば、ＣＤ１９に特異的に結合するマウスまたはヒト化抗体または抗体フラグメント)、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン)を含むＣＡＲ分子を発現する。ある態様において、ＣＡＲは、ここに記載する抗ＣＤ１９結合ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ１９に特異的に結合するマウスまたはヒト化抗体または抗体フラグメント)、ここに記載する膜貫通ドメインおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含むここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン)を含む抗体または抗体フラグメントを含む。
ある態様において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９(例えば、野生型または変異体ヒトＣＤ１９)と結合できる。ある態様において、ＣＡＲ分子は、ここに記載する抗ＣＤ１９結合ドメインの軽鎖相補性決定領域１(ＬＣ ＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣ ＣＤＲ２)および軽鎖相補性決定領域３(ＬＣ ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)およびここに記載する抗ＣＤ１９結合ドメインの重鎖相補性決定領域１(ＨＣ ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ ＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣ ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)を含む抗ＣＤ１９結合ドメイン、例えば、ＬＣ ＣＤＲの１以上、例えば、全３およびＨＣ ＣＤＲの１以上、例えば、全３を含む抗ＣＤ１９結合ドメインを含む。ある態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインはここに記載する抗ＣＤ１９結合ドメインの重鎖相補性決定領域１(ＨＣ ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ ＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣ ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)を含み、例えば、抗ＣＤ１９結合ドメインは、各々、ここに記載するＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を含む２可変重鎖領域を有する。ある態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、ここに記載するマウス軽鎖可変領域(例えば、表７)および／またはここに記載するマウス重鎖可変領域(例えば、表７)を含む。ある態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、表７のアミノ酸配列のマウス軽鎖およびマウス重鎖を含むｓｃＦｖである。ある態様において、抗ＣＤ１９結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)は、表７に提供する軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３修飾(例えば、置換)を有するが、３０、２０または１０修飾(例えば、置換)を超えないアミノ酸配列または表７のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域；および／または表７に提供する重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３修飾(例えば、置換)を有するが、３０、２０または１０修飾(例えば、置換)を超えないアミノ酸配列または表７のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。ある態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号５９の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインはｓｃＦｖであり、ここに、例えば、表７に記載するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が、ここに、例えば、表７に記載するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に、リンカー、例えば、ここに記載するリンカーを介して連結している。ある態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)ｎリンカー(ここで、ｎは１、２、３、４、５または６、好ましくは３または４である)(配列番号５３)を含む。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、次の配向のいずれであってもよい：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域。
ある態様において、ＣＡＲ分子は、ここに記載するヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインの軽鎖相補性決定領域１(ＬＣ ＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣ ＣＤＲ２)および軽鎖相補性決定領域３(ＬＣ ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)およびここに記載するヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインの重鎖相補性決定領域１(ＨＣ ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ ＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣ ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)を含むヒト化抗ＣＤ１９結合ドメイン、例えば、ヒト化ＬＣ ＣＤＲの１以上、例えば、全３およびＨＣ ＣＤＲの１以上、例えば、全３を含む抗ＣＤ１９結合ドメインを含む。ある態様において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインは、少なくともＨＣ ＣＤＲ２を含む。ある態様において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインは、ここに記載するヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインの重鎖相補性決定領域１(ＨＣ ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ ＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣ ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)を含み、例えば、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインは、各々、ここに記載するＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を含む２可変重鎖領域を有する。ある態様において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインは、少なくともＨＣ ＣＤＲ２を含む。ある態様において、軽鎖可変領域はＶＫ３＿Ｌ２５生殖系列配列の１、２、３または全４フレームワーク領域を含む。ある態様において、軽鎖可変領域は、修飾(例えば、置換、例えば、配列番号５８のマウス軽鎖可変領域における対応する位置に見られる１以上のアミノ酸の置換、例えば、７１位および８７位の１箇所以上の置換)を含む。ある態様において、重鎖可変領域は、ＶＨ４＿４−５９生殖系列配列の１、２、３または全４フレームワーク領域を含む。ある態様において、重鎖可変領域は、修飾(例えば、置換、例えば、配列番号５８のマウス重鎖可変領域における対応する位置に見られる１以上のアミノ酸の置換、例えば、７１位、７３位および７８位の１箇所以上の置換)を含む。ある態様において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインは、ここに記載する軽鎖可変領域(例えば、表３)および／またはここに記載する重鎖可変領域(例えば、表３)を含む。ある態様において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインは、表３のアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖである。ある態様において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)は、表３に提供する軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３修飾(例えば、置換)を有するが、３０、２０または１０修飾(例えば、置換)を超えないアミノ酸配列または表３のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域；および／または表３に提供する重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３修飾(例えば、置換)を有するが、３０、２０または１０修飾(例えば、置換)を超えないアミノ酸配列または表３のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。ある態様において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択される配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインはｓｃＦｖであり、ここに、例えば、表３に記載するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が、ここに、例えば、表３に記載するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に、リンカー、例えば、ここに記載するリンカーを介して連結している。ある態様において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインは、(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)ｎリンカー(ここで、ｎは１、２、３、４、５または６、好ましくは３または４である)(配列番号５３)を含む。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、次の配向のいずれであってもよい：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域。
ある態様において、ＣＡＲ分子は、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。ある態様において、膜貫通ドメインは、配列番号１５の配列を含む。ある態様において、膜貫通ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３修飾(例えば、置換)を有するが、２０、１０または５修飾(例えば、置換)を超えないアミノ酸配列または配列番号１５のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
ある態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、ヒンジ領域、例えば、ここに記載するヒンジ領域により膜貫通ドメインに接続される。ある態様において、コードされるヒンジ領域は、配列番号１４または配列番号４５またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
ある態様において、ＣＡＲ分子は、さらに共刺激ドメイン、例えば、ここに記載する共刺激ドメインをコードする配列を含む。ある態様において、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)および４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、共刺激ドメインは、配列番号１６の配列を含む。ある態様において、共刺激ドメインは、配列番号５１の配列を含む。ある態様において、共刺激ドメインは、配列番号１６または配列番号５１のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３修飾(例えば、置換)を有するが、２０、１０または５修飾(例えば、置換)を超えないアミノ酸配列または配列番号１６または配列番号５１のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
ある態様において、ＣＡＲ分子は、さらに、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１６の配列および／または配列番号１７の配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１６の配列および／または配列番号４３の配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７の機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号５１の配列および／または配列番号１７の配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号５１の配列および／または配列番号４３の配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１６または配列番号５１のアミノ酸配列および／または配列番号１７または配列番号４３のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３修飾(例えば、置換)を有するが、２０、１０または５修飾(例えば、置換)を超えないアミノ酸配列または配列番号１６または配列番号５１のアミノ酸配列および／または配列番号１７または配列番号４３のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１６または配列番号５１の配列と配列番号１７の配列または配列番号４３を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は同じフレームに、かつ単一ポリペプチド鎖として発現される。
ある態様において、ＣＡＲ分子は、さらに、リーダー配列、例えば、ここに記載するリーダー配列を含む。ある態様において、リーダー配列は、配列番号１３のアミノ酸配列または配列番号１３のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
ある態様において、ＣＡＲ分子は、リーダー配列、例えば、ここに記載するリーダー配列、例えば、配列番号１３を有するまたはそれと９５〜９９％同一性を有するリーダー配列；ここに記載する抗ＣＤ１９結合ドメイン、例えば、ここに記載するＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、ＬＣ ＣＤＲ３、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を含む抗ＣＤ１９結合ドメイン、例えば、表７に記載するマウス抗ＣＤ１９結合ドメイン、表３に記載するヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインまたはそれと９５〜９９％同一性を有する配列；ヒンジ領域、例えば、ここに記載するヒンジ領域、例えば、配列番号１４を有するまたはそれと９５〜９９％同一性を有するヒンジ領域；膜貫通ドメイン、例えば、ここに記載する膜貫通ドメイン、例えば、配列番号１５の配列を有するまたはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を有する膜貫通ドメイン；細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン)を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン、例えば、ここに記載する共刺激ドメイン、例えば、配列番号１６または配列番号５１の配列を有するまたはそれと９５〜９９％同一性を有する４−１ＢＢ共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載する一次シグナル伝達ドメイン、例えば、配列番号１７または配列番号４３の配列を有するまたはそれと９５〜９９％同一性を有するＣＤ３ゼータ刺激ドメインを含む。
ある態様において、ＣＡＲ分子は、配列番号５８、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１または配列番号４２のアミノ酸配列または配列番号５８、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１または配列番号４２のアミノ酸配列の少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０または３０修飾(例えば、置換)を有するが、６０、５０または４０修飾(例えば、置換)を超えないアミノ酸配列または配列番号５８、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１または配列番号４２のアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む(例えば、からなる)。
ある態様において、ＣＡＲ分子を発現する細胞は、ＣＡＲ分子を発現する核酸配列を含むベクターを含む。ある態様において、ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択される。ある態様において、ベクターは、レンチウイルスベクターである。ある態様において、ベクターはさらにプロモーターを含む。ある態様において、プロモーターは、ＥＦ−１プロモーターである。ある態様において、ＥＦ−１プロモーターは、配列番号１００の配列を含む。ある態様において、ベクターは、インビトロ転写ベクター、例えば、ここに記載する核酸分子のＲＮＡを転写するベクターである。ある態様において、インビトロベクターにおける核酸配列は、さらにポリ(Ａ)テイル、例えば、約１５０アデノシン塩基(配列番号１０４)を含む、例えば、ここに記載するポリＡテイルである。ある態様において、インビトロベクターにおける核酸配列は、さらに３’ＵＴＲ、例えば、ヒトベータ−グロブリン由来の３’ＵＴＲの少なくとも１反復を含む、例えば、ここに記載する３’ ＵＴＲを含む。ある態様において、インビトロベクターにおける核酸配列は、さらにプロモーター、例えば、Ｔ２プロモーターを含む。
ここに開示する組成物および方法のある態様において、ＣＡＲ分子を発現する細胞(ここでは“ＣＡＲ発現細胞”とも呼ぶ)は、ここに記載する細胞または細胞の集団、例えば、ヒト免疫エフェクター細胞または細胞の集団(例えば、ヒトＴ細胞またはヒトＮＫ細胞、例えば、ここに記載するヒトＴ細胞またはここに記載するヒトＮＫ細胞)である。ある態様において、ヒトＴ細胞はＣＤ８＋ Ｔ細胞である。ある態様において、細胞は自己Ｔ細胞である。ある態様において、細胞は同種Ｔ細胞である。ある態様において、細胞はＴ細胞であり、Ｔ細胞はジアシルグリセロールキナーゼ(ＤＧＫ)欠損である。ある態様において、細胞はＴ細胞であり、Ｔ細胞はイカロス欠損である。ある態様において、細胞はＴ細胞であり、Ｔ細胞はＤＧＫおよびイカロスの両者が欠損している。用語“細胞”を引用してここに開示する組成物および方法は、１以上の細胞、例えば、細胞の集団を含む組成物および方法を包含すると解釈すべきである。
他の態様において、例えば、ここに記載するような、ＣＡＲ分子を発現する細胞は、さらに他の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を発現できる。
ある態様において、方法は、さらに、ここに記載するような、ＣＡＲ分子を発現する細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤と組み合わせて、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤と組み合わせて投与することを含む。ある態様において、薬剤はサイトカイン、例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１またはこれらの組み合わせである。ある態様において、方法は、ＩＬ−７を対象に投与することを含む。サイトカインは、ＣＡＲ発現細胞の投与と組み合わせて、例えば、同時にまたはすぐ後に送達できる。あるいは、サイトカインは、ＣＡＲ発現細胞の投与後長期間後、例えば、ＣＡＲ発現細胞に対する対象の応答の評価後送達できる。
他の態様において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、免疫阻害分子を阻害する薬剤であり得る。免疫阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータを含む。ある態様において、免疫阻害分子を阻害する薬剤は、細胞に正のシグナルを伝達する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインと結合した、第一ポリペプチド、例えば、免疫阻害分子を含む。ある態様において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４またはＴＧＦＲベータのような阻害分子またはこれらのいずれかのフラグメント(例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部)の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインである第二ポリペプチド(例えば、共刺激ドメイン(例えば、ここに記載するような、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む)を含む。ある態様において、薬剤は、ＰＤ１またはそのフラグメント(例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部)の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインの第二ポリペプチド(例えば、ここに記載するＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む。
ある態様において、リンパ球注入、例えば同種リンパ球注入が癌の処置に使用され、ここで、リンパ球注入は、ここに記載するような、Ｂ細胞抗原(例えば、ＣＤ１９)に結合する少なくとも１ＣＡＲ発現細胞(ここではＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞とも呼ぶ)を含む。ある態様において、自己リンパ球注入が癌の処置に使用され、ここで、自己リンパ球注入は少なくとも１つのＣＤ１９発現細胞を含む。
ある態様において、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、Ｔ細胞を、先に幹細胞移植、例えば、自己幹細胞移植を受けている対象に投与する。
ある態様において、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、Ｔ細胞を、先にメルファランを投与されている対象に投与する。
ある態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、ＣＡＲ分子を発現する細胞の投与と関係する１以上の副作用を軽減する薬剤、例えば、ここに記載する薬剤と組み合わせて投与する。
ある態様において、キナーゼ阻害剤を、キナーゼ阻害剤の投与と関係する１以上の副作用を軽減する薬剤、例えば、ここに記載する薬剤と組み合わせて投与する。
ある態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞およびキナーゼ阻害剤を、ＣＤ１９と関係する疾患を処置するさらなる薬剤、例えば、ここに記載するさらなる薬剤と組み合わせて投与する。
ある態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、ここに記載する用量および／または投薬スケジュールで投与する。
ある態様において、ＣＡＲ分子を、例えば、インビトロ転写を使用してＴ細胞に導入し、対象(例えば、ヒト)はＣＡＲ分子を含む細胞の最初の投与およびＣＡＲ分子を含む細胞の１以上のその後の投与を受け、ここで、１以上のその後の投与は、先の投与の後１５日、例えば、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日または２日以内に行う。ある態様において、ＣＡＲ分子を含む細胞の１以上の投与を、１週間あたりに対象に行い、例えば、１週間あたりＣＡＲ分子を含む細胞を２回、３回または４回投与する。ある態様において、対象(例えば、ヒト対象)は１週間あたりＣＡＲ分子を含む細胞の１以上の投与(例えば、１週間あたり２回、３回または４回投与)(ここではサイクルともいう)、続いて１週間ＣＡＲ分子を含む細胞を休薬し、次いでＣＡＲ分子を含む細胞の１以上のさらなる投与(例えば、ＣＡＲ分子を含む細胞の１週間あたり１以上の投与)を対象に行う。他の態様において、対象(例えば、ヒト対象)はＣＡＲ分子を含む細胞を１サイクルを超えて受け、各サイクルの間の間隔は１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日または３日未満である。ある態様において、ＣＡＲ分子を含む細胞を、隔日で週に３回投与する。ある態様において、ＣＡＲ分子を含む細胞を、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間またはそれ以上投与する。
ある態様において、キナーゼ阻害剤とＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞の組み合わせを、疾患、例えば、癌、例えば、ここに記載する癌のための第一選択処置として投与する。他の態様において、キナーゼ阻害剤とＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞の組み合わせを、疾患、例えば、癌、例えば、ここに記載する癌のための第二、第三、第四選択処置として投与する。
ある態様において、ここに記載する細胞(例えば、細胞の集団)を対象に投与する。
ある態様において、方法は細胞の集団の投与を含み、その大多数がここに記載するＣＡＲ分子を含む。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、異なるＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む。例えば、ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ここに記載する抗ＣＤ１９結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第一細胞および異なる抗ＣＤ１９結合ドメイン、例えば、第一細胞により発現されるＣＡＲにおける抗ＣＤ１９結合ドメインと異なるここに記載する抗ＣＤ１９結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。他の例として、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、ここに記載するような、抗ＣＤ１９結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第一細胞およびＣＤ１９以外の標的(例えば、ＣＤ１２３またはメソセリン)に対する抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第一細胞および二次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第二細胞を含む。
ある態様において、方法は細胞の集団の投与を含み、ここで、集団における少なくとも１個の細胞は、ここに記載する抗ＣＤ１９ドメインおよびＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を有するＣＡＲを発現し、例えば、第二細胞は、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を発現する。例えば、ある態様において、薬剤は、免疫阻害分子を阻害する薬剤であり得る。免疫阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータを含む。ある態様において、免疫阻害分子を阻害する薬剤は、細胞に正のシグナルを伝達する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインと結合した、第一ポリペプチド、例えば、阻害分子を含む。ある態様において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４またはＴＧＦＲベータのような阻害分子またはこれらのいずれかのフラグメント(例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部)の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインである第二ポリペプチド(例えば、共刺激ドメイン(例えば、ここに記載するような、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む)を含む。ある態様において、薬剤は、ＰＤ１またはそのフラグメント(例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部)の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインの第二ポリペプチド(例えば、ここに記載するＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む。
他の面において、本発明は、キナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)と組み合わせて、医薬として使用するためのここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞に関する。他の面において、本発明は、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞と組み合わせて、医薬として使用するためのここに記載するキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)に関する。
他の面において、本発明は、Ｂ細胞抗原(例えば、ＣＤ１９)を発現する疾患の処置において、キナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)と組み合わせて使用するためのここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞に関する。他の面において、本発明は、Ｂ細胞抗原(例えば、ＣＤ１９)を発現する疾患の処置において、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞と組み合わせて使用する、ここに記載するキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)に関する。疾患は、例えば、血液癌のような癌であり得る。癌は、例えば、リンパ腫、ＣＬＬ、ＭＣＬ、ＡＬＬ、ＤＬＢＣＬ、多発性骨髄腫または他のここに記載する癌であり得る。
他の面において、本発明は、サイトカイン、例えば、ここに記載するようなＩＬ−７、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１と組み合わせて、医薬として使用するためのここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞に関する。他の面において、本発明は、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞と組み合わせて、医薬として使用するための、ここに記載するサイトカインに関する。
他の面において、本発明は、ＣＤ１９を発現する疾患の処置において、サイトカイン、例えば、ここに記載するようなＩＬ−７、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１と組み合わせて使用するここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞に関する。他の面において、本発明は、ＣＤ１９を発現する疾患の処置において、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞と組み合わせて使用するここに記載するサイトカインに関する。
他の面において、本発明は、哺乳動物にＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞(例えば、複数細胞)の有効量を投与することを含む、ホジキンリンパ腫を有する哺乳動物を処置する方法に関する。
ある態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、ＣＡＲ分子を発現する細胞の有効性を高める薬剤、例えば、ここに記載する薬剤と組み合わせて投与する。
ある態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、ＣＡＲ分子を発現する細胞の投与と関係する１以上の副作用を軽減する薬剤、例えば、ここに記載する薬剤と組み合わせて投与する。
ある態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、ホジキンリンパ腫を処置する薬剤、例えば、ここに記載する薬剤と組み合わせて投与する。
ある態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する細胞を、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて投与する。理論はともかく、低い、免疫増強用量(例えば、免疫系を完全に抑制するには不十分であるが、免疫機能を改善するのには十分である用量)での処置はＰＤ−１陽性Ｔ細胞減少またはＰＤ−１陰性細胞増加を伴うと考えられる。ＰＤ−１陰性Ｔ細胞ではなく、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞が、ＰＤ−１リガンド、例えば、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を発現する細胞との結合により使い尽くされ得る。
ある態様において、この手法を使用して、対象におけるここに記載するＣＡＲ細胞の性能を最適化できる。理論はともかく、ある態様において、内在性、非修飾免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の性能が改善されると考えられる。理論はともかく、ある態様において、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞の性能が改善されると考えられる。他の態様において、ＣＡＲを発現するように操作されているまたは操作される細胞、例えば、Ｔ細胞が、エクスビボでＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の数を増加させる量またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比を増加させる量のｍＴＯＲ阻害剤との接触により処理される。
ある態様において、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒的阻害剤の投与を、ここに記載するＣＡＲ発現細胞、例えば、Ｔ細胞の投与前に開始する。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤はＲＡＤ００１またはラパマイシンである。ある態様において、ＣＡＲ細胞を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベルまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比が、少なくとも一過性に、増加するように、ｍＴＯＲ阻害剤の投与後十分な時間をおいてまたは十分な量を投与した後に投与する。
ある態様において、ＣＡＲを発現するように操作する細胞、例えば、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を、対象におけるまたは対象から採取したＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベルまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比が、少なくとも一過性に、増加するように、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与後十分な時間をおいてまたは十分な量を投与した後に採取する。
ある態様において、ここに記載する方法のいずれも、さらに、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子、例えば、ＣＤ１９と結合するＣＡＲ分子を発現する１以上の細胞の投与前に、対象にリンパ球枯渇を実施することを含む。リンパ球枯渇は、例えば、メルファラン、シトキサン、シクロホスファミドおよびフルダラビンの１以上の投与を含む。
ある態様において、投与されるＣＡＲ発現細胞は、調節可能なＣＡＲ(ＲＣＡＲ)、例えば、ここに記載するＲＣＡＲを含む。ＲＣＡＲは、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインおよび第一スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー、ＣＤ１９に結合する抗原結合ドメインを含む抗原結合メンバーおよび第二スイッチドメイン；および膜貫通ドメインを含み得る。方法は、さらに、例えば、第一スイッチドメインと第二スイッチドメインの二量体化を誘発する十分量で、二量体化分子を投与することを含み得る。
ある態様において、ＣＡＲ発現細胞およびキナーゼ阻害剤を、例えば、第一選択の治療として同時にまたは実質的に同時に投与する。ある態様において、方法は、ＢＴＫ阻害剤(例えば、イブルチニブ)とＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ１９発現細胞)の組み合わせを、対象に第一選択治療として投与する。
他の態様において、ＣＡＲ発現細胞およびキナーゼ阻害剤を逐次的に投与する。例えば、キナーゼ阻害剤をＣＡＲ発現細胞の前に投与するかまたはＣＡＲ発現細胞をキナーゼ阻害剤の前に投与する。
ある態様において、ＣＤ１９の発現と関係する疾患は血液癌(例えば、ＣＬＬ、ＭＣＬまたはＡＬＬのようなここに記載する血液癌)であり、対象は、血液癌に対する１以上の治療、例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤に対する部分応答者、非応答者または再発者であるかまたはそう診断される。ある態様において、対象は、ＢＴＫ変異を有するかまたはそれを有する認定される。変異は、例えば、点変異、挿入または欠失であり得る。変異は、例えば、ＢＴＫ阻害剤の結合部位、例えば、ＡＴＰ結合ポケットまたはその近辺の変異であり得る。変異は、ＢＴＫ阻害剤に対する応答の減少(例えば、耐性)に寄与し得る。
ここに開示する方法のいずれかのある態様において、方法はＢＴＫ阻害剤(例えば、イブルチニブ)を対象に投与し、ＢＴＫ阻害剤の量を減らし(例えば、投与を止め)、そして続いてＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ１９発現細胞)を対象に投与することを含む。
ある態様において、方法はＢＴＫ阻害剤(例えば、イブルチニブ)を対象に投与し、続いてＢＴＫ阻害剤とＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ１９発現細胞)の組み合わせを対象に投与することを含む。
ある態様において、方法はＢＴＫ阻害剤(例えば、イブルチニブ)を対象に投与し、ＢＴＫ阻害剤の量を減らし(例えば、投与を中止または中断し)、続いてＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ１９発現細胞)と第二ＢＴＫ阻害剤(例えば、第一ＢＴＫ阻害剤以外、例えば、イブルチニブ以外のＢＴＫ阻害剤)の組み合わせを対象に投与することを含む。ある態様において、第二ＢＴＫ阻害剤は、ＧＤＣ−０８３４、ＲＮ−４８６、ＣＧＩ−５６０、ＣＧＩ−１７６４、ＨＭ−７１２２４、ＣＣ−２９２、ＯＮＯ−４０５９、ＣＮＸ−７７４またはＬＦＭ−Ａ１３またはこれらの組み合わせから選択される１以上である。
ある態様において、Ｂ細胞抗原の発現と関係する疾患(例えば、ＣＤ１９)は血液癌(例えば、ここに記載する血液癌、例えば、ＣＬＬ、ＭＣＬまたはＡＬＬ)であり方法は、キナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ１９発現細胞)または両者に対する対象の耐性発生を遅延させるか耐性を低減させる。ある態様において、ＣＤ１９の発現と関係する疾患は血液癌(例えば、ここに記載する血液癌、例えば、ＣＬＬ、ＭＣＬまたはＡＬＬ)であり、ここで、方法は血液癌の寛解を延長するかまたは再発を遅延させる。例えば、キナーゼ阻害剤またはＣＡＲ発現細胞の単剤療法で処置されたときの疾患の予測される経過と比較して、寛解を延長でき、再発を遅延でき、耐性発現を遅延させまたは耐性を低減させ得る。
前記方法のいずれかにおいて使用できる代表的処置レジメンは、次の１以上を含む。
ある態様において、キナーゼ阻害剤およびＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ１９発現細胞)を、第一選択の治療として対象、例えば、哺乳動物に投与する。
他の態様において、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ１９発現細胞)を、キナーゼ阻害剤の投与後に対象、例えば、哺乳動物に投与する。
他の態様において、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ１９発現細胞)を、キナーゼ阻害剤の投与中止後に投与する。
他の態様において、キナーゼ阻害剤の投与をＣＡＲ１９発現細胞の投与前に開始し、ＣＡＲ１９発現細胞を、継続しているキナーゼ阻害剤の投与と組み合わせて投与する。
ある態様において、対象に、例えば、第一選択治療として、キナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)を投与する。予定した期間の投与後(例えば、１ヶ月または２ヶ月であるが、２週間、３週間、１ヶ月、１.５ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、１５ヶ月または１８ヶ月でもよい)、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ１９発現細胞)を、対象に単独でまたはキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与する。ある態様において、処置に対する対象の応答を、予定した間隔で、例えば、キナーゼ阻害剤および／またはＣＡＲ発現細胞での処置前または処置中に評価する。評価により対象が完全応答者であることが示されたら、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ１９発現細胞)を投与しない。評価により対象がキナーゼ阻害剤に対して部分応答者であるかまたは応答して疾患安定であることが示されたら、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ１９発現細胞)を、例えば、ここに記載のように、キナーゼ阻害剤と組み合わせて投与する。評価により対象が非応答者または再発者であることが示されたら、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ１９発現細胞)を、キナーゼ阻害剤または第二キナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載する第二キナーゼ阻害剤と組み合わせて投与する。
他の態様において、対象、例えば、哺乳動物はＢＴＫ阻害剤(例えば、イブルチニブ)に対する完全または部分応答者またはＣＡＲ１９発現細胞に対する完全または部分応答者であるか、そうであると認定される。
ある態様において、対象がキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)に対して完全応答者である(またはそうであると認定される)とき、完全応答の期間、対象にＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ１９発現細胞)を投与しない。他の態様において、対象がキナーゼ阻害剤に対して完全応答者(例えば、イブルチニブに対して完全応答者)である(またはそうであると認定される)とき、完全応答の期間、対象にＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ１９発現細胞)を投与する。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ１９発現細胞)後、対象は、応答の延長または再発の遅延を経験する(例えば、ＣＡＲ治療を伴わずに処置した疾患の予測される経過と比較して)。
ある態様において、対象がキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)に対して部分応答者である(またはそうであると認定される)とき、部分応答の期間、対象にＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ１９発現細胞)を投与しない。他の態様において、対象がキナーゼ阻害剤に対して部分応答者である(またはそうであると認定される)とき、部分応答の期間、対象にＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ１９発現細胞)(単独でまたはＢＴＫ阻害剤と組み合わせて)を投与する。ある態様において、ＣＡＲ治療後、対象は、完全応答および／または応答延長または再発遅延を経験する(例えば、ＣＡＲ治療を伴わずに処置した疾患の予測される経過と比較して)。
ある態様において、対象がキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)での処置後疾患安定である(または安定であると認定される)とき、疾患が安定な期間、対象にＣＡＲ治療を投与しない。他の態様において、対象がキナーゼ阻害剤での処置後疾患安定である(または安定であると認定される)とき、疾患が安定な期間、対象にＣＡＲ治療を投与する。ある態様において、ＣＡＲ治療後、対象は、部分応答、完全応答および／または応答延長または再発遅延を経験する(例えば、ＣＡＲ治療を伴わずに処置した疾患の予測される経過と比較して)。
ある態様において、対象がキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)での処置後疾患が進行している(または進行していると認定される)とき、疾患が進行している期間、対象にＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ１９発現細胞)を投与しない。他の態様において、対象がキナーゼ阻害剤での処置後疾患が進行している(または進行していると認定される)とき、疾患が進行している期間、対象にＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ１９発現細胞)を投与する。ある態様において、ＣＡＲ治療後、対象は疾患安定、部分応答、完全応答および／または応答延長または再発遅延を経験する(例えば、ＣＡＲ治療を伴わずに処置した疾患の予測される経過と比較して)。
他の態様において、哺乳動物がイブルチニブに対して非応答者または再発者であるかまたはそうであると認定されるとき、ＣＡＲ発現細胞を第二キナーゼ阻害剤と組み合わせて投与し、ここで、第二キナーゼ阻害剤はイブルチニブ以外である。第二キナーゼ阻害剤は、ＧＤＣ−０８３４、ＲＮ−４８６、ＣＧＩ−５６０、ＣＧＩ−１７６４、ＨＭ−７１２２４、ＣＣ−２９２、ＯＮＯ−４０５９、ＣＮＸ−７７４またはＬＦＭ−Ａ１３またはこれらの組み合わせから選択される１以上であり得る。
他の態様において、対象、例えば、哺乳動物はキナーゼ阻害剤に対する部分応答者であり(またはそうであると認定され)、該対象は、部分応答の期間、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ１９発現細胞)を、単独でまたはＢＴＫ阻害剤と組み合わせて投与される。
他の態様において、対象、例えば、哺乳動物は、イブルチニブでの処置後疾患が進行するまたは安定である非応答者であり(またはそうであると認定され)、該対象は、疾患が進行しているまたは安定である期間、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ１９発現細胞)を第二ＢＴＫ阻害剤と組み合わせて投与され、ここで、第二キナーゼ阻害剤はイブルチニブ以外である。
他の面において、Ｂ細胞抗原(例えば、ＣＤ１９)の発現と関係する疾患を有する対象、例えば、哺乳動物を処置する方法が提供される。方法は、対象にここに記載するキナーゼ阻害剤(例えば、ここに記載するＢＴＫキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブ)およびＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ１９発現細胞)の有効量を組み合わせて(例えば同時に(または実質的に同時に)または逐次的に)投与することを含む。
ある態様において、キナーゼ阻害剤およびＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ１９細胞)を、例えば、第一選択の治療として、組み合わせて投与する。
ある態様において、キナーゼ阻害剤を、最初に、例えば、単剤療法または第一選択の治療として投与し；キナーゼ阻害剤の量を減らした(例えば、投与中止または中断)後、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ１９発現細胞)を対象に投与する。
他の態様において、キナーゼ阻害剤を、最初に、例えば、単剤療法または第一選択の治療として投与し；続いてキナーゼ阻害剤とＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ１９発現細胞)の組み合わせを対象に投与する。
他の態様において、キナーゼ阻害剤を、最初に、例えば、単剤療法または第一選択の治療として投与し；キナーゼ阻害剤の量を減らした(例えば、投与中止または中断)後、第二キナーゼ阻害剤とＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ１９発現細胞)の組み合わせを対象に投与する。
ある態様において、処置に対する対象の応答を、予定した間隔で、例えば、キナーゼ阻害剤および／またはＣＡＲ発現細胞での処置前または処置中に評価する。評価により対象が完全応答者であることが示されたら、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ１９発現細胞)を投与しない。評価により対象がキナーゼ阻害剤に対して部分応答者であるかまたは応答して疾患安定であることが示されたら、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ１９発現細胞)を、例えば、ここに記載のように、キナーゼ阻害剤と組み合わせて投与する。評価により対象が非応答者または再発者であることが示されたら、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ１９発現細胞)を、キナーゼ阻害剤または第二キナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載する第二キナーゼ阻害剤と組み合わせて投与する。
ある態様において、Ｂ細胞抗原(例えば、ＣＤ１９)の発現と関係する疾患は、血液癌、白血病、リンパ腫、ＭＣＬ、ＣＬＬ、ＡＬＬ、ホジキンリンパ腫または多発性骨髄腫である。
ある態様において、キナーゼ阻害剤はイブルチニブ、ＧＤＣ−０８３４、ＲＮ−４８６、ＣＧＩ−５６０、ＣＧＩ−１７６４、ＨＭ−７１２２４、ＣＣ−２９２、ＯＮＯ−４０５９、ＣＮＸ−７７４またはＬＦＭ−Ａ１３から選択されるＢＴＫ阻害剤；パルボシクリブ、アロイシンＡ、フラボピリドール、２−(２−クロロフェニル)−５,７−ジヒドロキシ−８−[(３Ｓ,４Ｒ)−３−ヒドロキシ−１−メチル−４−ピペリジニル]−４−クロメノンから選択されるＣＤＫ４阻害剤；クリゾチニブ(ＰＦ−０２３４１０６６、Ｐ２７６−００、ＲＡＦ２６５、インジスラムロスコビチン、ジナシクリブ、ＢＭＳ３８７０３２、ＭＬＮ８０５４、ＡＧ−０２４３２２、ＡＴ７５１９、ＡＺＤ５４３８、ＢＭＳ９０８６６２；またはリボシクリブ；ラパマイシン、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、セマピモド、ＡＺＤ８０５５、ＰＦ０４６９１５０２、ＳＦ１１２６、ＸＬ７６５またはＯＳＩ−０２７のようなラパマイシンアナログから選択されるｍＴＯＲ阻害剤；またはＣＧＰ０５２０８８、ＣＧＰ５７３８０、セルコスポラミドまたはＥＴＣ−１７８０４４５−２または４−アミノ−５−(４−フルオロアニリノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンから選択されるＭＮＫ阻害剤である。
ある面において、本発明は、ホジキンリンパ腫を有する対象、例えば、哺乳動物を処置するかまたは抗腫瘍免疫を提供する方法に関する。方法は、対象に、ＣＤ１９と結合するＣＡＲ分子を発現する細胞の有効量を、単独でまたは第二治療と組み合わせて投与することを含む。
他の面において、本発明は、多発性骨髄腫(例えば、ＣＤ１９陽性多発性骨髄腫またはＣＤ１９陰性骨髄腫)を有する対象、例えば、哺乳動物を処置するかまたは抗腫瘍免疫を提供する方法に関する。ある態様において、多発性骨髄腫は、例えば、フローサイトメトリーおよびＲＴ−ＰＣＲの両者により検出して、例えば、ＣＤ１９陰性である、例えば、新生物形質細胞の大多数(９９.９５％)がＣＤ１９陰性表現型を有する。は、対象にＣＤ１９と結合するＣＡＲ分子を発現する細胞の有効量を、単独でまたは第二治療(例えば、多発性骨髄腫に対する標準治療)と組み合わせて投与することを含む。方法は、さらにここに記載するキナーゼ阻害剤の投与を含み得る。
ホジキンリンパ腫または多発性骨髄腫に関連する方法のある態様において、ＣＡＲ分子は、例えば、ここに記載するような、ヒト化ＣＡＲ分子である。ある態様において、ＣＡＲ分子はここに記載するＣＡＲ分子である。例えば、ある態様において、ＣＡＲ分子は、配列番号５のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号２６のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号２７のＬＣ ＣＤＲ３；配列番号１９のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号２０〜２３のいずれかのＬＣ ＣＤＲ２および配列番号２４のＨＣ ＣＤＲ３の１以上(例えば、２、３、４、５または全て)を含む抗ＣＤ１９結合ドメインを含む。
ホジキンリンパ腫または多発性骨髄腫に関する方法のある態様において、ＣＡＲ分子(例えば、ＣＡＲＴ１９またはＣＴＬ０１９)を単剤療法として投与する。ある態様において、方法は、さらにキナーゼ阻害剤、例えば、ＢＴＫ阻害剤(例えばイブルチニブ)、ＣＤＫ４阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤またはＭＮＫ阻害剤を投与することを含む。
多発性骨髄腫に関する方法のある態様において、ＣＡＲ分子(例えば、ＣＡＲＴ１９またはＣＴＬ０１９)を、多発性骨髄腫に対する標準治療、例えば、骨髄破壊的化学療法および／または移植自己幹細胞レスキュー(例えば、メルファラン投与(例えば、高用量メルファラン)後)と組み合わせて投与する。
他の面において、本発明は、Ｂ細胞抗原(例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＲＯＲ１の１以上)と結合するＣＡＲ分子を発現する細胞および１以上のキナーゼ阻害剤を含む組成物に関し、ここで、キナーゼ阻害剤はブルトン型チロシンキナーゼ(ＢＴＫ)阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ４(ＣＤＫ４)阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤またはマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ相互作用キナーゼ(ＭＮＫ)阻害剤から選択される。ＣＡＲ発現細胞および１以上のキナーゼ阻害剤は、単一剤形でまたは２以上の剤形で存在できる
ある態様において、ここに開示する組成物は医薬として使用するためである。
ある態様において、ここに開示する組成物を、Ｂ細胞抗原(例えば、ＣＤ１９)の発現と関係する疾患の処置に使用する。
ＣＡＲ発現細胞を産生するための方法および組成物
本発明はまた、ある面において、ＣＡＲ(例えば、ここに記載するＣＡＲ)を発現するように操作され得る免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)の集団を製造する方法も提供し、該方法は、免疫エフェクター細胞の集団を提供し；そして、免疫エフェクター細胞とキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)を、キナーゼ阻害剤の標的(例えば、ＢＴＫおよび／またはＩＴＫ)の阻害に十分な条件下で接触させることを含む。方法は、さらに、免疫エフェクター細胞とＣＡＲ分子をコードする核酸を接触させる、例えば、形質導入することを含む。
ある面において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞または細胞の集団)を産生する方法であって、細胞または細胞の集団とキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤を接触させ；そして、ＣＡＲ分子をコードする核酸を細胞または細胞の集団に、ＣＡＲ分子が発現されるような条件下で導入する(例えば、形質導入する)ことを含む。
ＣＡＲ発現細胞を産生する方法のある態様において、核酸によりコードされるＣＡＲ分子はＣＤ１９と結合するＣＡＲ分子である。ある態様において、方法は、さらに、１以上の細胞を、細胞または少なくとも細胞の亜集団がＣＡＲ分子を発現することを可能にする条件下で培養することを含む。ある態様において、細胞はＴ細胞またはＮＫ細胞であるかまたは細胞の集団はＴ細胞、ＮＫ細胞または両者を含む。ある態様において、方法は、１以上の細胞とキナーゼ阻害剤を接触させ(例えば、１０〜２０分、２０〜３０分、３０〜４０分、４０〜６０分または６０〜１２０分)、続いてキナーゼ阻害剤のほとんどまたは全てを１以上の細胞から除去することを含む。ある態様において、キナーゼ阻害剤を、１以上の細胞を回収後にまたは１以上の細胞の刺激前に添加する。ある態様において、キナーゼ阻害剤はＢＴＫ阻害剤、ＣＤＫ４阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤またはＭＮＫ阻害剤である。ある態様において、キナーゼ阻害剤はイブルチニブである。ある態様において、細胞の集団はまた癌細胞、例えば、白血病またはリンパ腫細胞も含む。癌細胞は、例えば、ＣＬＬ細胞、ＭＣＬ細胞またはＡＬＬ細胞であり得る。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、癌細胞における標的(例えば、ＢＴＫ)を阻害する、例えば、その活性を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％低下させる。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、免疫エフェクター細胞の標的(例えば、ＩＴＫ)を阻害する、例えば、その活性を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％低下させる。
ある面において、本発明はまたキナーゼ阻害剤(例えば、ＢＴＫ阻害剤)およびＣＡＲ分子またはＣＡＲ分子をコードする核酸を含む反応混合物も提供する。ある態様において、反応混合物は、さらに免疫エフェクター細胞の集団を含む。
ある態様において、免疫エフェクター細胞の１以上はＣＡＲ分子を発現するかまたはＣＡＲ分子をコードする核酸を含む。ある態様において、キナーゼ阻害剤はＢＴＫ阻害剤、ＣＤＫ４阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤またはＭＮＫ阻害剤から選択される。ある態様において、ＢＴＫ阻害剤はイブルチニブ、ＧＤＣ−０８３４、ＲＮ−４８６、ＣＧＩ−５６０、ＣＧＩ−１７６４、ＨＭ−７１２２４、ＣＣ−２９２、ＯＮＯ−４０５９、ＣＮＸ−７７４またはＬＦＭ−Ａ１３から選択される。ある態様において、反応混合物は、癌細胞、例えば、血液癌細胞を含む。癌細胞は、例えば、免疫エフェクター細胞が対象から回収されたとき、対象から回収された細胞であり得る。
ある面において、本発明は免疫エフェクター細胞の集団およびＣＡＲ分子またはＣＡＲ分子をコードする核酸を含む反応混合物を提供し、ここで、免疫エフェクター細胞は、共有結合的に不活性化されたＩＴＫを含む。ある態様において、ＩＴＫの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％が、共有結合的に不活性化される。ある態様において、反応混合物は、さらに癌細胞を含む。ある態様において、癌細胞は、共有結合的に不活性化されたＢＴＫを含む。ある態様において、ＢＴＫの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％が、共有結合的に不活性化される。ある態様において、ＢＴＫまたはＩＴＫは、そのＡＴＰ結合ドメインにまたはその近辺にイブルチニブのような小分子への共有結合を形成する。ある態様において、ＢＴＫは、そのシステイン−４８１にまたはその近辺にイブルチニブのような小分子への共有結合を形成する。
ある態様において、ここに記載するような反応混合物は、さらに緩衝液または他の試薬、例えば、ＰＢＳ含有溶液を含む。ある態様において、反応混合物は、さらに、細胞の集団を活性化および／または拡張する薬剤、例えば、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルおよび／または細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを刺激する薬剤を含む。ある態様において、薬剤は、抗ＣＤ３抗体またはそのフラグメントおよび／または抗ＣＤ２８抗体またはそのフラグメントとコンジュゲートしたビーズである。ある態様において、反応混合物は、さらに、血清(例えば、胎仔ウシまたはヒト血清)、インターロイキン−２(ＩＬ−２)、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβおよびＴＮＦ−αまたは細胞の増殖のための任意の他の添加剤を含む、増殖および／または生存能のための１以上の因子を含む。ある態様において、反応混合物は、さらにＩＬ−１５および／またはＩＬ−７を含む。ある態様において、反応混合物における複数の細胞の集団は、ＣＡＲコード化配列、例えば、ここに記載するような、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲコード化配列を含む、核酸分子、例えば、ここに記載する核酸分子を含む。ある態様において、反応混合物における複数の細胞の集団は、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクターを含む。ある態様において、ベクターは、ここに記載するベクター、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群から選択されるベクターである。ある態様において、反応混合物は、例えば、糖類、オリゴ糖類、多糖およびポリオール(例えば、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、スクロース、グルコースおよびデキストラン)、塩およびクラウンエーテルのような、凍結保護物質または安定剤をさらに含む。ある態様において、凍結保護物質はデキストランである。
ある態様において、ここに開示する製造方法は、さらに、免疫エフェクター細胞の集団とテロメラーゼサブユニットをコードする核酸、例えば、ｈＴＥＲＴを接触させることを含む。テロメラーゼサブユニットをコードする核酸はＤＮＡであり得る。
ある態様において、ここに開示する製造方法は、さらに、２％ｈＡＢ血清を含む血清中で免疫エフェクター細胞の集団を培養することを含む。
見出し、小見出しまたは番号もしくは文字が付された要素、例えば、(ａ)、(ｂ)、(ｉ)などは、単に読みやすさのために提示したものである。本明細書における見出しまたは番号もしくは文字が付された要素の使用は、これらの工程または要素がアルファベット順で行われること、またはこれらの工程または要素が互いに必ず分離されていることを必要とするものではない。
ここに記載する全ての刊行物、特許出願、特許および他の引用文献は、引用によりその全体を本明細書に包含させる。
本発明の他の特質、目的および利点は、明細書および図面ならびに特許請求の範囲から明らかである。
図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、本発明のマウス抗ＣＤ１９ ＣＡＲまたはヒト化抗ＣＤ１９ ＣＡＲを形質導入し、図１Ａに示すようにＣＤ１９を発現しない対照Ｋ５６２細胞(Ｋ５６２ｃｃ)、図１Ｂに示すようにＣＤ１９で形質転換したＫ５６２細胞(Ｋ５６２.ＣＤ１９)または図１Ｃに示すようにＣＬＬ患者から単離した悪性Ｂ細胞(Ｐｔ１４ Ｂ細胞単離体)と培養したＮＤ３１７(正常ドナー)Ｔ細胞でアッセイした細胞毒性のグラフ表示である。
図２Ａおよび２Ｂは、ヒト化およびマウス抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞のＣＤ１９＋細胞に対する増殖性応答を示すグラフであり、ここで、高い生存可能ＣＡＲ＋ Ｔ細胞数は、初代ＣＬＬ細胞に対する最大ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖を示す集団に対応する。
図３は、本発明のｓｃＦｖのデコンボリューションしたＨＰＬＣマススペクトルのグラフ表示であり、ここで、上列は未処置ｓｃＦｖを記載し、下列は、同族脱グリコシル化ｓｃＦｖを記載する。
図４は、示差走査蛍光定量法により測定した立体構造安定性のグラフ表示である。マウスｓｃＦｖのＴｍは５７℃であった(太線)。全ヒト化ｓｃＦｖバリアントは、親マウスｓｃＦｖと比較して、高い約７０℃のＴｍを示した。ヒト化により導入された残基は、Ｔｍを１０℃以上改善した。
図５は、ＣＤ１９ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞増殖のグラフ表示であり、ここで、ＣＡＲＴ１９細胞は、(ａ)ＣＤ１９の発現について陰性であり、それゆえに、陰性対照として使用した慢性骨髄性白血病(“ＣＭＬ”)細胞株；(ｂ) ＣＤ１９の発現について陽性であり、それゆえに、陽性対照として使用した組み換えＫ５６２細胞；または(ｃ)ＣＬＬ患者から単離され、細胞表面にＣＤ１９を発現するＰｔ１４ Ｂ細胞を指向する。
図６Ａおよび６Ｂは、代表的ＣＡＲの概略図である。
図７は、ＮＳＧマウスにおけるＣＤ１９形質導入ＣＡＲ Ｔ細胞処置後のＨＡＬＬＸ５４４７原発性ＡＬＬ疾患進行を記載する。ＣＤ１９に特異的なＣＡＲ Ｔ細胞で処置後のＮＳＧマウスにおける原発性ヒトＡＬＬ細胞は、疾患進行の制御を示した。ＣＤ１９＋ ヒトＡＬＬ細胞の平均パーセンテージは、腫瘍インプラント６５日後までのＮＳＧマウスにおける末梢血の疾患負荷の指標である。黒丸：尾静脈からの１００μlのＰＢＳで処置されたマウス；赤色四角：偽形質導入Ｔ細胞で処置されたマウス；青色三角：マウスＣＤ１９ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞で処置されたマウス；および紫色逆三角：ヒト化ＣＤ１９ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞で処置されたマウス。ＡＮＯＶＡにより計算した有意；＊はＰ＜０.０１を意味する。
図８は、患者の腫瘍細胞におけるＣＤ１９発現を示す。ＣＤ１３８＋ ＣＤ４５ｄｉｍ腫瘍細胞をＣＤ１９(ｘ軸)およびＣＤ３８(ｙ軸)について染色した。腫瘍細胞の約１〜２％がＣＤ１９抗原を発現した。
図９は、漸増濃度のイブルチニブ(１０nM、１００nMおよび１０００nM)で処置したときのＣＡＲＴ１９細胞の細胞増殖および細胞サイズを示す２つのグラフである。
図１０Ａおよび１０Ｂは、イブルチニブの存在下または非存在下、ＭＣＬ細胞株で刺激したＣＡＲＴ１９細胞の増殖を示す。図１０Ａは、漸増濃度のイブルチニブ(１０nM、１００nMおよび１０００nM)の存在下または非存在下、腫瘍細胞株ＭＯＬＭ１４、ＪＥＫＯ−１およびＲＬで刺激したＣＡＲＴ１９細胞の増殖を示す一連のヒストグラムである。細胞をＣＦＳＥで染色し、各ヒストグラムにおいて棒により指定される、増殖細胞のパーセンテージを決定するためにフローサイトメトリーで分析した。図１０Ｂは、図１０Ａにおける代表的ヒストグラムの定量化である。
図１１Ａおよび１１Ｂは、イブルチニブの存在下または非存在下、ＭＣＬ細胞株で刺激したＣＡＲＴ１９細胞のＣＤ１０７ａ脱顆粒を示す。図１１Ａは、漸増濃度のイブルチニブ(１０nM、１００nMおよび１０００nM)の存在下または非存在下、腫瘍細胞株(ＭＯＬＭ１４、ＪＥＫＯ−１およびＲＬ)で刺激したＣＡＲＴ１９細胞のＣＤ１０７ａ脱顆粒を示す一連のフローサイトメトリープロファイルである。ＣＤ１０７ａ発現をｙ軸の尺度とする。図１１Ｂは、図１１Ａからの結果の定量化である。
図１２は、漸増濃度のイブルチニブ(１０nM、１００nMおよび１０００nM)の存在下または非存在下、腫瘍細胞株(ＭＯＬＭ１４、ＪＥＫＯ−１およびＲＬ)で刺激したＣＡＲＴ１９細胞による細胞質内ＩＬ−２産生を示す一連のフローサイトメトリープロファイルである。ｙ軸はＩＬ−２発現を表す。
図１３は、漸増濃度のイブルチニブ(１０nM、１００nMおよび１０００nM)の存在下または非存在下、腫瘍細胞株(ＭＯＬＭ１４、ＪＥＫＯ−１およびＲＬ)で刺激したＣＡＲＴ１９細胞による細胞質内ＴＮＦ−ａ産生を示す一連のフローサイトメトリープロファイルである。ｙ軸はＴＮＦ−ａ発現を表す。
図１４は、漸増濃度のイブルチニブ(１０nM、１００nMおよび１０００nM)の存在下または非存在下、腫瘍細胞株(ＭＯＬＭ１４、ＪＥＫＯ−１およびＲＬ)で刺激したＣＡＲＴ１９細胞による、細胞質内ＩＦＮ−ｇ産生を示す一連のフローサイトメトリープロファイルである。ｙ軸はＩＦＮ−ｇ発現を表す。
図１５は、漸増濃度のイブルチニブ(１０nM、１００nMおよび１０００nM)の存在下または非存在下、腫瘍細胞株(ＭＯＬＭ１４、ＪＥＫＯ−１およびＲＬ)で刺激したＣＡＲＴ１９細胞からのサイトカイン分泌を示す一連のグラフである。
図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、１６Ｄ、１６Ｅおよび１６Ｆは、単独でまたは漸増濃度のイブルチニブの存在下、ＣＡＲＴ１９の腫瘍細胞、ＭＯＬＭ１４(図１６Ａおよび１６Ｄ)、ＪＥＫＯ(図１６Ｂおよび１６Ｅ)およびＲＬ(図１６Ｃおよび１６Ｆ)死滅を示すグラフである。未処置(ＵＴＤ)またはＣＡＲＴ１９細胞を種々の比率で腫瘍細胞とインキュベートし、細胞の総流動(図１６Ａ、１６Ｂおよび１６Ｃ)および死滅細胞のパーセンテージを評価した(１６Ｄ、１６Ｅおよび１６Ｆ)。
図１７Ａ、１７Ｂおよび１７Ｃは、総細胞数を計測するためにフローサイトメトリーにより測定して、２４時間後のＣＡＲＴ１９による腫瘍細胞死滅のグラフィック表示である。腫瘍細胞株ＭＯＬＭ１４(図１７Ａ)、ＪＥＫＯ(図１７Ｂ)およびＲＬ(図１７Ｃ)を未処置(ＵＴＤ)またはＣＡＲＴ１９細胞単独(単独)または種々の濃度のイブルチニブと組み合わせてインキュベートした。
図１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃおよび１８Ｄは、ＲＬ ＭＣＬマウスモデルにおけるＣＡＲＴ１９用量設定のグラフ表示である。腫瘍負荷を、経時的に生物発光造影(ＢＬＩ)によりモニターした(図１８Ａおよび１８Ｂ)。全生存を経時的にモニターした(図１８Ｃ)。
図１９Ａおよび１９Ｂは、ＪＥＫＯ−１ ＭＣＬマウスモデルにおけるＣＡＲＴ１９用量設定のグラフ表示である。腫瘍サイズを、経時的に生物発光造影(ＢＬＩ)によりモニターし(図１９Ａ)、全生存も経時的にモニターした(図１９Ｂ)。
図２０は、インビボマウスモデルにおけるＣＡＲＴ１９およびイブルチニブ組み合わせ治療を投与および評価するためのプロトコールを示す概略図である。
図２１Ａ、２１Ｂ、２１Ｃおよび２１Ｄは、細胞を形質導入前にイブルチニブで処置したとき、ＣＡＲＴ１９ Ｔ細胞を産生するＰＢＭＣの遺伝子導入効率を示すグラフ表示である。未処置ＰＢＭＣを、ＣＡＲ１９発現について形質導入前(図２１Ａ)および形質導入後(図２１Ｃ)に評価した。イブルチニブ処置ＰＢＭＣを、ＣＡＲ１９発現について形質導入前(図２１Ｂ)および形質導入後(図２１Ｄ)に評価した。
図２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃ、２２Ｄおよび２２Ｅは、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激Ｔ細胞増殖に対するイブルチニブ処置の効果のグラフ表示である。漸増濃度のイブルチニブを評価した：未処置(図２２Ａ)；０.１μM イブルチニブ(図２２Ｂ)；０.５μM イブルチニブ(図２２Ｃ)、１μM イブルチニブ(図２２Ｄ)および５μM イブルチニブ(図２２Ｅ)。
図２３は、イブルチニブがＣＡＲＴ１９細胞毒性に影響しないことを示す、グラフ表示である。
図２４は、イブルチニブ処置が、ＣＡＲＴ１９細胞におけるＴＨ１／ＴＨ２サイトカインの歪みを促進しないことを示す、一連のグラフ表示である。
図２５Ａおよび２５Ｂは、イブルチニブの連続的投与が、インビボでの腫瘍細胞排除におけるＣＡＲＴ１９機能に影響しないことを示す、グラフ表示である。図２５Ａは、各処置レジメン中の末梢血で検出されたＮａｌｍ／６細胞を示す。図２５Ｂは、イブルチニブ投薬と共にまたは伴わずにＣＡＲＴ１９を受けたマウスの生存を比較したカプラン・マイヤー生存曲線を示す。
図２６Ａ、２６Ｂ、２６Ｃ、２６Ｄ、２６Ｅおよび２６Ｆは、イブルチニブ処置間の指定した時点でＣＬＬ患者細胞におけるＣＡＲ１９形質導入の効率を示すグラフ表示である。細胞は、形質導入せず(図２６Ａ、２６Ｂおよび２６Ｃ)またはＣＡＲ１９を形質導入した(図２６Ｄ、２６Ｅおよび２６Ｆ)。ＧＡＭで染色した細胞はＣＡＲ１９を発現し、各プロファイルの四角内に示す。
図２７は、一団の患者からの、イブルチニブ処置間の指定した時点でＣＡＲ１９を形質導入した細胞と比較した、非形質導入細胞の増殖率を記載する、一連のグラフ表示である。
図２８Ａ、２８Ｂおよび２８Ｃは、ＣＬＬ患者におけるイブルチニブ処置がリンパ球増加を誘発することを示す、グラフ表示である。患者からの細胞を指定した時点で単離した：ベースライン(図２８Ａ)；サイクル２、１日目(図２８Ｂ)；およびサイクル１２、１日目(図２８Ｃ)。
図２９Ａ、２９Ｂおよび２９Ｃは、３ＣＬＬ患者におけるイブルチニブ処置が、ＣＬＬにおける腫瘍細胞上のＣＤ２００発現を経時的に減少させることを示す、グラフ表示である。各プロファイルは、指定した時点で単離した細胞からのＣＤ２００発現ヒストグラムの重層を含む：ベースライン(スクリーン)；サイクル２、１日目；およびサイクル１２、１日目。
図３０Ａ、３０Ｂおよび３０Ｃは、ＣＬＬ患者におけるイブルチニブ処置が、ＰＤ１＋ Ｔ細胞の頻度を経時的に減少させることを示す、グラフ表示である。患者からの細胞を指定した時点で単離した：ベースライン(図３０Ａ)；サイクル２、１日目(図３０Ｂ)；およびサイクル１２、１日目(図３０Ｃ)。
図３１Ａおよび３１Ｂは、イブルチニブ処置に対するＭＣＬ細胞株ＲＬ(図３１Ａ)およびＪＥＫＯ−１(図３１Ｂ)の感受性を示すグラフ表示である。
図３２は、ＭＣＬのインビボモデルにおけるイブルチニブ処置の効果を示すグラフ表示である。
図３３ＡおよびＢは、腫瘍におけるＣＤ１９発現細胞存在を示す、ホジキンリンパ腫の免疫組織化学的分析の画像である。図３３Ａは倍率１倍であり、図３３Ｂは倍率２０倍である。
図３４は、ホジキンリンパ腫を有する患者におけるＣＡＲＴ１９処置の治療効率を評価する試験のための、実験手順の模式図を示す。
図３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃおよび３５Ｄは、Ｔ細胞におけるＰＤ１およびＣＡＲ１９発現のフローサイトメトリー分析を示す。図３５Ａおよび３５Ｂは、ＣＡＲＴ治療に対する完全応答者(ＣＲ)または非応答者(ＮＲ)である対象からのＣＤ４＋ Ｔ細胞におけるＰＤ−１およびＣＡＲ１９発現の分布を示す代表的フローサイトメトリープロファイルである。図３５Ｃは、ＣＡＲＴ治療に対して種々の応答を有する複数対象群からのＣＤ４＋ Ｔ細胞集団におけるＰＤ１細胞のパーセントを示すグラフである。図３５Ｄは、ＣＡＲＴ治療に対して種々の応答を有する複数対象群からのＣＤ８＋ Ｔ細胞集団におけるＰＤ１細胞のパーセントを示すグラフである。
図３６Ａおよび３６Ｂは、ＣＡＲＴ治療に対して種々の応答を有する複数対象群からのＣＤ４およびＣＡＲ１９発現細胞(図３６Ａ)またはＣＤ８およびＣＡＲ１９発現細胞(図３６Ｂ)におけるＰＤ１発現の分布を示す。
図３７は、ＣＡＲＴ治療に対する完全応答者(ＣＲ)または非応答者(ＮＲ)である対象からのＴ細胞におけるＰＤ１、ＣＡＲ １９、ＬＡＧ３およびＴＩＭ３発現のフローサイトメトリー分析を示す。
図３８Ａおよび３８Ｂは、ＣＡＲＴ治療に対して種々の応答を有する複数対象群からのＰＤ１およびＬＡＧ３発現(図３８Ａ)またはＰＤ１およびＴＩＭ３発現(図３８Ｂ)の分布を示す。
図３９は、ＣＡＲＴ１９治療に対する応答を示す、ＣＡＲＴ１９を受けた骨髄腫患者からの形質細胞ＩｇＡ免疫表現型を示す。
図４０Ａおよび４０Ｂは、プラセボと比較してインフルエンザワクチン株に対する力価の増加を示す、グラフである。図４０Ａにおいて、ワクチン接種４週間後、プラセボコホートにおける増加に対して、３インフルエンザワクチン株(Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９、Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８)の各々に対するインフルエンザ幾何平均力価におけるベースラインを超える増加が、治療企図集団におけるＲＡＤ００１投薬コホートの各々で示される。黒太線は、プラセボに対する力価の１.２倍増加を示し、これは、治験の主要評価項目に合うための、３インフルエンザワクチン株中、２つで満たすことが必要である。星印“＊”は、プラセボに対するＧＭＴ力価の増加が、１を超え、少なくとも８０％の事後確率を有することを示す。図４０Ｂは、ベースラインインフルエンザ力価≦１：４０を有する対象サブセットについて、図４０Ａにおけるのと同じデータのグラフである。
図４１は、ワクチン接種４週間後ＲＡＤ００１濃度対各インフルエンザワクチン株に対する幾何平均力価の増加倍率の散布図である。ＲＡＤ００１濃度(１時間後投与)を、対象が４週間投薬された後に測定した。薬物動態測定を受けた全対象を本分析セットに含めた。ベースラインに対するワクチン接種４週間後の幾何平均力価の増加倍率をｙ軸に示す。
図４２は、プラセボと比較して異種インフルエンザ株に対する力価の増加を示すグラフ表示である。ワクチン接種４週間後のプラセボコホートにおける増加と比較した、インフルエンザワクチンに含まれない２異種インフルエンザ株(Ａ／Ｈ１Ｎ１株Ａ／Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ／８／７６およびＡ／Ｈ３Ｎ２株Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／１１)に対するインフルエンザ幾何平均力価におけるベースラインを超える増加が、治療企図集団におけるＲＡＤ００１投薬コホートの各々で示される。＊は、プラセボに対する力価の増加が、１を超え、少なくとも８０％の事後確率を有することを示す。
図４３Ａおよび４３Ｂは、インフルエンザワクチン接種前後のＩｇＧおよびＩｇＭレベルのグラフ表示である。抗Ａ／Ｈ１Ｎ１／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９インフルエンザＩｇＧおよびＩｇＭのレベルを、インフルエンザワクチン接種前および４週間後に対象から得た血清で測定した。ベースラインからワクチン接種４週間後の抗Ｈ１Ｎ１インフルエンザＩｇＧおよびＩｇＭレベルにおける有意差は、ＲＡＤ００１コホートとプラセボコホートの間で検出されなかった(クラスカル・ウォリス順位和検定により全ｐ値＞０.０５)。
図４４Ａ、４４Ｂおよび４４Ｃは、ＲＡＤ００１処置後の、ＰＤ−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８のパーセントの減少およびＰＤ−１陰性ＣＤ４ Ｔ細胞の増加のグラフ表示である。ＰＤ−１陽性ＣＤ４、ＣＤ８およびＰＤ−１陰性ＣＤ４ Ｔ細胞のパーセントは、ベースライン、治験薬処置６週間後(６週目)および治験薬中止６週間後かつインフルエンザワクチン接種４週間後(１２週目)のＰＢＭＣサンプルのＦＡＣＳ分析により決定した。図４４Ａは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、１２週目に用量レベル０.５mg／日(ｎ＝２５)、５mg／週(ｎ＝２９)および２０mg／週(ｎ＝３０)でＲＡＤ００１を受けたコホートにおいて、それぞれｐ＝０.００２(０.０２)、ｐ＝０.００３(ｑ＝０.０３)およびｐ＝０.０１(ｑ＝０.０５)でＰＤ−１陽性ＣＤ４ Ｔ細胞の有意な減少(−３７.１〜−２８.５％)があったことを示す。図４４Ｂは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、１２週目に用量レベル０.５mg／日(ｎ＝２５)、５mg／週(ｎ＝２９)および２０mg／週(ｎ＝３０)でＲＡＤ００１(ｎ＝１０９)を受けたコホートにおいて、それぞれｐ＝０.０１(０.０５)、ｐ＝０.００７(ｑ＝０.０４)およびｐ＝０.０１(ｑ＝０.０５)でＰＤ−１陽性ＣＤ８ Ｔ細胞の有意な減少(−４３.３〜−３８.５％)があったことを示す。図４４Ｃは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、１２週目に用量レベル０.５mg／日(ｎ＝２５)、５mg／週(ｎ＝２９)および２０mg／週(ｎ＝３０)でＲＡＤ００１(ｎ＝１０９)を受けたコホートにおいて、それぞれｐ＝０.０００７(０.０２)、ｐ＝０.０３(ｑ＝０.０７)およびｐ＝０.０３(ｑ＝０.０８)でＰＤ−１陰性ＣＤ４ Ｔ細胞の有意な増加(３.０〜４.９％)があったことを示す。
図４５Ａおよび４５Ｂは、ベースラインＰＤ−１発現の差異について調節したＲＡＤ００１処置後の、ＰＤ−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８のパーセントの減少およびＰＤ−１陰性ＣＤ４ Ｔ細胞の増加のグラフ表示である。ＰＤ−１陽性ＣＤ４、ＣＤ８およびＰＤ−１陰性ＣＤ４ Ｔ細胞のパーセントは、ベースライン、治験薬処置６週間後(６週目)および治験薬中止６週間後かつインフルエンザワクチン接種４週間後(１２週目)のＰＢＭＣサンプルのＦＡＣＳ分析により決定した。図４５Ａは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、プールしたＲＡＤコホート(ｎ＝８４)における、６週目のＰＤ−１＋ ＣＤ４ Ｔ細胞のｐ＝０.０３(ｑ＝０.１３)の３０.２％の有意な減少を示す。プラセボコホートと比較した、プールしたＲＡＤにおける１２週目のＰＤ−１陽性ＣＤ４ Ｔ細胞減少は、３２.７％でｐ＝０.０５(ｑ＝０.１９)であった。図４５Ｂは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、プールしたＲＡＤコホート(ｎ＝８４)における、６週目のＰＤ−１陽性ＣＤ８ Ｔ細胞のｐ＝０.００８(ｑ＝０.０７)の３７.４％の有意な減少を示す。プラセボコホートと比較した、プールしたＲＡＤにおける１２週目のＰＤ−１陽性ＣＤ８ Ｔ細胞減少は、４１.４％でｐ＝０.０６６(ｑ＝０.２１)であった。図４５Ａおよび４５Ｂは、図４４Ａ、４４Ｂおよび４４Ｃにおけるデータを表すが、図４５Ａおよび４５Ｂにおいて図４４Ａ、４４Ｂおよび４４Ｃの異なるＲＡＤ００１用量群を単一ＲＡＤ００１処置群にプールした。
図４６は、ＲＡＤ００１に応答した高齢対象における運動およびエネルギーの増加を示す。
図４７Ａおよび４７Ｂは、細胞におけるＰ７０ Ｓ６Ｋ活性に対するＲＡＤ００１の予測効果を記載する。図４７Ａは、ＲＡＤ００１の毎週および毎日の高用量でのＰ７０ Ｓ６キナーゼ阻害を記載し、図４７Ｂは、ＲＡＤ００１の毎週の低用量でのＰ７０ Ｓ６キナーゼ阻害を記載する。
図４８Ａおよび４８Ｂは、癌細胞株およびＣＡＲＴ細胞におけるＩＬ−７受容体(ＣＤ１２７)発現を示す。ＣＤ１２７の発現は、３癌細胞株におけるフローサイトメトリー分析により測定した：ＲＬ(マントル細胞リンパ腫)、ＪＥＫＯ(別名Ｊｅｋｏ−１、マントル細胞リンパ腫)およびＮａｌｍ−６(Ｂ−ＡＬＬ)(図４８Ａ)。ＣＤ１２７発現は、ＮＳＧマウスに注入し、循環しているＣＤ３陽性(ＣＡＲＴ)細胞でフローサイトメトリー分析により測定した(図４８Ｂ)。
図４９Ａ、４９Ｂおよび４９Ｃは、ＣＡＲＴ１９処置および続くＩＬ−７処置後の抗腫瘍応答を示す。０日目にルシフェラーゼ発現マントルリンパ腫細胞株(ＲＬ−ｌｕｃ)を移植したＮＳＧマウスを、種々の用量のＣＡＲＴ１９細胞で６日目に処置し、腫瘍負荷をモニターした。マウスを、ＣＡＲＴ１９細胞投与なし、０.５×１０６ ＣＡＲＴ１９細胞(ＣＡＲＴ１９ ０.５Ｅ６)、１×１０６ ＣＡＲＴ１９細胞(ＣＡＲＴ１９ １Ｅ６)または２×１０６ ＣＡＲＴ１９細胞(ＣＡＲＴ１９ ２Ｅ６)を受ける４群に分けた。ＣＡＲＴ処置後の腫瘍負荷を、生物発光(平均ＢＬＩ)の検出によりモニターした(図４９Ａ)０.５×１０６ ＣＡＲＴ１９細胞(ＣＡＲＴ１９ ０.５Ｅ６)または１×１０６ ＣＡＲＴ１９細胞(ＣＡＲＴ１９ １Ｅ６)を受けたマウスを、組み換えヒトＩＬ−７(ｒｈＩＬ−７)を受けるまたは受けないものに無作為化した。ここで平均生物発光(ＢＬＩ)により表す腫瘍負荷を、８５日目から開始するＩＬ−７で処置された、図４９Ａからの３マウス(＃３８２７、＃３８２９および＃３８１５、記載した初期ＣＡＲＴ１９用量を受けた)でモニターした(図４９Ｂ)。ＩＬ−７を、週３回、ＩＰ注射により投与した。８５日前(ＰＲＥ)および１１５日後(ＰＯＳＴ)の、ここで、平均生物発光(ＢＬＩ)により表す腫瘍負荷を、ＩＬ−７を受けなかったマウス(ＣＴＲＬ)とＩＬ−７処置を受けたマウス(ＩＬ−７)で比較した(図４９Ｃ)。
図５０Ａおよび５０Ｂは、ＩＬ−７処置後のＴ細胞動態を示す。血中に検出されるヒトＴ細胞のレベルを、ＩＬ−７を受けたマウスまたは対照マウスの各々でモニターした(図５０Ａ)。血中に検出されるＣＡＲＴ１９細胞(ＣＤ３＋細胞)のレベルを、ＩＬ−７処置前(ＰＲＥ)および１４日後(１４日目)に測定した(図５０Ｂ)。
図５１は、２つの代表的ＲＣＡＲ立体配置の構造を示す。抗原結合メンバーは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよびスイッチドメインを含む。細胞内結合メンバーは、スイッチドメイン、共刺激シグナル伝達ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを示す。２つの立体配置は、ここに記載する第一および第二スイッチドメインが、抗原結合メンバーおよび細胞内結合メンバーに対して異なる配向であり得ることを示す。他のＲＣＡＲ立体配置をさらにここに記載する。
図５２ＡはＲＬ細胞株の画像である。図５２Ｂは、ＲＬ初代およびＲＬ細胞株におけるＣＤ１９およびＣＤ５の発現を示す一連のフローサイトメトリー散布図である。図５２Ｃは、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)によるｔ(１１；１４)転座を示す画像である。図５２Ｄは、種々の細胞株におけるイブルチニブ阻害のＩＣ５０(パーセンテージＭＴＴ変換による)を示すグラフである。図５２Ｅは、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ガンマ鎖ノックアウト(ＮＳＧ)マウスにおけるＲＬ細胞の生着および得られた腫瘍負荷を示す、一連の画像およびグラフである。図５２Ｆは、マウスにおける種々の臓器へのＭＣＬ細胞の局在化を示す一連の組織学的画像である。図５２Ｇは、ＭＣＬ−ＲＬ細胞を注射されたマウスの一連の組織学的画像である。
図５３Ａは、種々のＭＣＬ細胞株に曝したときの、ＣＤ１０７ａ＋ ＣＡＲＴ１９細胞の数を示す一連のグラフである。図５３Ｂは、種々のＭＣＬ細胞株に曝したときの、ＣＡＲＴ１９細胞により産生されるＩＬ−２およびＴＮＦ−アルファの量を示す一連のグラフである。図５３Ｃは、種々のエフェクター：標的細胞比での、ＣＡＲＴ１９細胞による種々のＭＣＬ細胞株の死滅パーセントを示すグラフである。図５３Ｄは、種々のＭＣＬ細胞株に曝したＣＡＲＴ１９細胞における、増殖の指標である、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(ＣＦＳＥ)の量を示すグラフである。図５３Ｅは、増殖前後のＴ細胞のパーセンテージを示す一連のグラフである。図５３Ｆは、種々の生体分子(例えば、サイトカイン)を発現または産生する非形質導入またはＣＡＲ−１９形質導入Ｔ細胞のパーセンテージを示す一連のグラフである。
図５４Ａは、ＣＡＲＴ１９細胞を特異的にまたは非特異的に刺激したときの、インターロイキン−２誘導性Ｔ細胞キナーゼ(ＩＴＫ)の活性化を示す一連の画像である。図５４Ｂは、種々の濃度のイブルチニブ存在下ＣＡＲＴ１９細胞によるＣＤ１０７ａ表面発現(脱顆粒の指標)、ＩＬ−２産生およびＴＮＦ−アルファ産生を示す一連のグラフである。図５４Ｃは、種々の濃度のイブルチニブ存在下、種々のＭＣＬ細胞株に曝された、ＣＡＲＴ１９細胞におけるＣＦＳＥの量を示す一連のヒストグラムである。図５４Ｄは、種々の濃度のイブルチニブと組み合わせたときの、ＣＡＲＴ１９細胞のＴｈ１またはＴｈ２状態の指標としての種々のサイトカインおよびバイオマーカーの発現または産生を示す一連のグラフである。図５４Ｅは、種々の濃度のイブルチニブと組み合わせたときの、種々のＭＣＬ細胞株の、ＣＡＲＴ１９細胞による死滅パーセンテージを示す一連のグラフである。図５４Ｆは、種々の濃度のイブルチニブと組み合わせたときの、ＣＡＲＴ１９細胞の内因性細胞毒性機能の種々のマーカーの発現を示す棒グラフである。
図５５は、ＭＣＬ−ＲＬ注射マウスに対するＣＡＲＴ１９および／またはイブルチニブの効果を試験するためのインビボマウスモデル実験手順の概略図であり、読み出し情報は発光(腫瘍細胞数の指標)である。
図５６は、ＭＣＬ−ＲＬ注射マウスに対するＣＡＲＴ１９および／またはイブルチニブの効果を試験するためのインビボマウスモデル実験手順の概略図であり、読み出し情報は発光(腫瘍細胞数の指標)である。
図５７は、種々の濃度のイブルチニブで処置した後のマウスにおける発光(腫瘍細胞数の指標)および処置後の全生存を示す、一連のグラフである。
図５８は、イブルチニブまたはＣＡＲＴ１９細胞で処置したマウスにおける発光(腫瘍細胞数の指標)ならびに処置後の全生存を示す一連のグラフである。
図５９は、イブルチニブ、未処置Ｔ細胞、イブルチニブと未処置Ｔ細胞、ＣＡＲＴ１９細胞およびＣＡＲＴ１９細胞とイブルチニブで処置後のマウスにおける発光(腫瘍細胞数の指標)を示すグラフである。
図６０は、イブルチニブ単独、ＣＡＲＴ１９細胞単独またはイブルチニブとＣＡＲＴ１９細胞の組み合わせで処置後のマウスにおける発光(腫瘍細胞数の指標)を示すグラフである。
図６１Ａは、イブルチニブおよび／またはＣＡＲＴ１９細胞で処置したマウスにおいて産生されたＴｈ１サイトカインのレベルを示す一連のグラフである。図６１Ｂは、イブルチニブおよび／またはＣＡＲＴ１９細胞で処置したマウスにおいて産生されたＴｈ２サイトカインのレベルを示す一連のグラフである。図６１Ｃは、ＣＡＲＴ１９細胞またはＣＡＲＴ１９細胞＋イブルチニブで処置したマウスにおける増殖マーカーＫｉ６７を発現する細胞のパーセンテージを示すグラフである。図６１Ｄは、ＣＡＲＴ１９細胞またはＣＡＲＴ１９細胞＋イブルチニブで処置したマウスにおける抗アポトーシスマーカーＢＣＬ−２を発現する細胞のパーセンテージを示すグラフである。
詳細な記載
定義
他に定義しない限り、ここで使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。
単数表現は、１または１超(すなわち、少なくとも１)を意味する。例として、単数表現の“要素”は１の要素または１を超える要素を意味する。
用語“約”は、量、時間などのような測定可能な値に言及するとき、特定した値からの±２０％またはある場合±１０％またはある場合±５％またはある場合±１％またはある場合±０.１％の逸脱を、このような変動が開示した当該方法の実行に適するならば、包含することを意味する。
用語“キメラ抗原受容体”または代替的に“ＣＡＲ”は、免疫エフェクター細胞にあるとき、標的細胞、一般に癌細胞に対する特異性および細胞内シグナル産生を細胞に提供する、一連の、一般に最も単純な態様で２ポリペプチドをいう。ある態様において、ＣＡＲは、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび下に定義する刺激分子および／または共刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン(ここでは“細胞内シグナル伝達ドメイン”とも呼ぶ)を含む。ある面において、一連のポリペプチドは互いに隣接し、例えば、同じポリペプチド鎖にある(例えば、キメラ融合タンパク質を含む)。ある態様において、一連のポリペプチドは互いに隣接しておらず、例えば、異なるポリペプチド鎖にある。ある態様において、一連のポリペプチドは、二量体化分子の存在により、ポリペプチドを互いに連結できる、例えば、抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに連結できる、二量体化スイッチを含む。ある面において、刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体と関係するゼータ鎖である。ある面において、細胞質シグナル伝達ドメインは、さらに、下に定義する少なくとも１つの共刺激分子由来の１種以上の機能的シグナル伝達ドメインをさらに含む。ある面において、共刺激分子は、ここに記載する共刺激分子、例えば、４−１ＢＢ(すなわち、ＣＤ１３７)、ＣＤ２７および／またはＣＤ２８から選択される。ある面において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある面において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ融合タンパク質を含む。ある面において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび１以上の共刺激分子由来の２つの機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ融合タンパク質を含む。ある面において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび少なくとも１以上の共刺激分子由来の２つの機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ融合タンパク質である。ある面において、ＣＡＲはＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端(Ｎ−ｔｅｒ)に任意のリーダー配列を含む。ある面において、ＣＡＲは、さらに、細胞外抗原結合ドメインのＮ末端にリーダー配列を含み、ここで、リーダー配列は、所望により細胞プロセシングおよびＣＡＲの細胞膜への局在化の間に、抗原結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)から開裂される。
用語“シグナル伝達ドメイン”は、第二メッセンジャーを産生することによりまたはこのようなメッセンジャーに応答することによりエフェクターとして機能することにより、定義されたシグナル伝達経路を介して細胞活性を制御するために、細胞の中で情報を伝達することにより作用する、タンパク質の機能的部分をいう。
ここで使用する用語“ＣＤ１９”は、白血病前駆体細胞で検出可能な抗原決定基である表面抗原分類１９タンパク質をいう。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列が、GenBank、UniProtおよびSwiss-Protのような公的データベースで見られ得る。例えば、ヒトＣＤ１９のアミノ酸配列は、UniProt/Swiss-Prot Accession No. P15391として見ることができ、ヒトＣＤ１９をコードするヌクレオチド配列はAccession No. NM_001178098に見ることができる。ここで使用する“ＣＤ１９”は、完全長野生型ＣＤ１９の変異、例えば、点変異、フラグメント、挿入、欠失およびスプライスバリアントを含む、タンパク質を含む。ＣＤ１９は、例えば、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病および非ホジキンリンパ腫を含む、大部分のＢ細胞系譜癌に発現される。ＣＤ１９を発現する他の細胞は、下の“ＣＤ１９の発現と関係する疾患”の定義に提供する。これはまた、Ｂ細胞前駆細胞の初期マーカーである。例えば、Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)参照。ある面において、ＣＡＲＴの抗原結合部分は、ＣＤ１９タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。ある面において、ＣＤ１９タンパク質は、癌細胞に発現される。
ここで使用する用語“ＣＤ２０”は、Ｂ細胞で検出可能であることが知られる抗原決定基をいう。ヒトＣＤ２０はまた膜貫通４−ドメイン、サブファミリーＡ、メンバー１(ＭＳ４Ａ１)とも呼ばれる。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、GenBank、UniProtおよびSwiss-Protのような公的データベースで入手できる。例えば、ヒトＣＤ２０のアミノ酸配列はAccession Nos. NP_690605.1およびNP_068769.2に見ることができ、ヒトＣＤ２０のトランスクリプトバリアント１および３をコードするヌクレオチド配列は、それぞれAccession No. NM_152866.2およびNM_021950.3で入手できることができる。ある面において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＣＤ２０タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。ある面において、ＣＤ２０タンパク質は、癌細胞に発現される。
ここで使用する用語“ＣＤ２２”は、白血病前駆体細胞で検出可能であることが知られる抗原決定基をいう。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、GenBank、UniProtおよびSwiss-Protのような公的データベースで入手できる。例えば、アイソフォーム１〜５ ヒトＣＤ２２のアミノ酸配列はそれぞれAccession Nos. NP 001762.2、NP 001172028.1、NP 001172029.1、NP 001172030.1およびNP 001265346.1で入手でき、ヒトＣＤ２２のバリアント１〜５をコードするヌクレオチド配列は、それぞれAccession No. NM 001771.3、NM 001185099.1、NM 001185100.1、NM 001185101.1およびNM 001278417.1で入手できる。ある面において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＣＤ２２タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。ある面において、ＣＤ２２タンパク質は、癌細胞に発現される。
ここで使用する用語“ＲＯＲ１”は、白血病前駆体細胞で検出可能であることが知られる抗原決定基をいう。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、GenBank、UniProtおよびSwiss-Protのような公的データベースに見ることができる。例えば、ヒトＲＯＲ１のアイソフォーム１および２前駆体のアミノ酸配列はそれぞれAccession Nos. NP_005003.2およびNP_001077061.1で入手でき、それらをコードするｍＲＮＡ配列は、それぞれAccession Nos. NM_005012.3およびNM_001083592.1で入手できる。ある面において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＲＯＲ１タンパク質の細胞外ドメイン内の抗原を認識し、結合する。ある面において、ＲＯＲ１タンパク質は、癌細胞に発現される。
ここで使用する用語“抗体”は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子由来のタンパク質またはポリペプチド配列をいう。抗体は、ポリクローナルでもモノクローナルでも、多鎖でも一本鎖でも、または完全免疫グロブリンであってもよく、天然源由来でも組み換え源由来でもよい。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であり得る。
用語“抗体フラグメント”は、抗原のエピトープと(例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布により)特異的に相互作用する能力を保持する、抗体の少なくとも一部をいう。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、ジスルフィド架橋Ｆｖ(ｓｄＦｖ)、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、直鎖状抗体、ｓｄＡｂ(ＶＬまたはＶＨのいずれか)のような単一ドメイン抗体、ラクダ類ＶＨＨドメイン、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントのような抗体フラグメントから形成される多特異的抗体および単離されたＣＤＲまたは抗体の他のエピトープ結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。抗原結合フラグメントはまた単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、二重特異性抗体、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖにも取り込まれ得る(例えば、Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005参照)。抗原結合フラグメントはまたフィブロネクチンIII型(Ｆｎ３)のようなポリペプチドに基づくスキャフォールドにも移植できる(フィブロネクチンポリペプチドミニボディを記載する米国特許６,７０３,１９９号参照)。
用語“ｓｃＦｖ”は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも一つの抗体フラグメントおよび重鎖の可変領域を含む少なくとも一つの抗体フラグメントを含む融合タンパク質をいい、ここで、軽鎖および重鎖可変領域は、例えば、合成リンカー、例えば、短可動性ポリペプチドリンカーにより、隣接して連結し、一本鎖ポリペプチドとして発現されることが可能であり、ここで、ｓｃＦｖは、それが由来する完全抗体の特異性を保持する。特定しない限り、ここで使用するｓｃＦｖは、ＶＬおよびＶＨ可変領域を、例えば、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に関していずれの配向で有してもよく、ｓｃＦｖはＶＬ−リンカー−ＶＨを含み得るかまたはＶＨ−リンカー−ＶＬを含み得る。
抗体またはその抗体フラグメントを含む本発明のＣＡＲの部分は、抗原結合ドメインが、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント(ｓｄＡｂ)、一本鎖抗体(ｓｃＦｖ)、ヒト化抗体または二特異性抗体を含む、隣接ポリペプチド鎖の一部として発現される、多様な形態で存在できる(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426)。ある面において、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。さらなる面において、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。あるＣＤＲの厳密なアミノ酸配列境界は、Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(“Kabat”番号付けスキーム)、Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (“Chothia”番号付けスキーム)またはこれらの組み合わせに記載のものを含む、周知のスキームをいくつでも使用して決定できる。
ここで使用する用語“結合ドメイン”または“抗体分子”は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質、例えば、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメントをいう。用語“結合ドメイン”または“抗体分子”は、抗体および抗体フラグメントを包含する。ある態様において、抗体分子は、多特異的抗体分子であり、例えば、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、複数の中の第一の免疫グロブリン可変ドメイン配列が第一エピトープに対する結合特異性を有し、複数の中の第二の免疫グロブリン可変ドメイン配列が第二エピトープに対する結合特異性を有する。ある態様において、多特異的抗体分子は、二特異性抗体分子である。二特異性抗体は、２つを超えない抗原に特異性を有する。二特異性抗体分子は、第一エピトープに対する結合特異性を有する第一免疫グロブリン可変ドメイン配列および第二エピトープに対する結合特異性を有する第二免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。
本発明のＣＡＲの抗体または抗体そのフラグメントを含む部分は、抗原結合ドメインが、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント(ｓｄＡｂ)、一本鎖抗体(ｓｃＦｖ)、ヒト化抗体または二特異性抗体を含む、隣接ポリペプチド鎖の一部として発現される、多様な形態で存在できる(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426)。ある面において、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。さらなる面において、ＣＡＲはｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。
用語“抗体重鎖”は、天然に存在する立体構造で抗体分子に存在する２タイプのポリペプチド鎖の大きいほうをいい、通常抗体が属するクラスを決定する。
用語“抗体軽鎖”は、天然に存在する立体構造で抗体分子に存在する２タイプのポリペプチド鎖の小さいほうをいう。カッパ(κ)およびラムダ(λ)軽鎖は、２つの主用な抗体軽鎖アイソタイプをいう。
用語“組み換え抗体”は、例えば、バクテリオファージまたは酵母発現系により発現された抗体のような、組み換えＤＮＡテクノロジーを使用して産生される抗体をいう。本用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成により産生され、そのＤＮＡ分子が抗体を特定する抗体タンパク質またはアミノ酸配列を発現し、ここで、ＤＮＡまたはアミノ酸配列が、当分野で利用可能であり、周知の組み換えＤＮＡまたはアミノ酸配列テクノロジーを使用して産生されている、抗体も意味すると解釈すべきである。
用語“抗原”または“Ａｇ”は、免疫応答を惹起する分子をいう。この免疫応答は、抗体産生または特異的免疫学的コンピテント細胞の活性化または両者に関与し得る。当業者は、実質的に全てのタンパク質またはペプチドを含むあらゆる巨大分子が抗原として作用し得ることを理解する。さらに、抗原は組み換えまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。当業者は、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含むあらゆるＤＮＡが、それゆえに、ここで使用される用語“抗原”を、コードする。さらに、当業者は、抗原が必ずしも遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要がないことを理解する。本発明は、１を超える遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むが、これらに限定されない、これらのヌクレオチド配列は、所望の免疫応答を誘発するポリペプチドをコードするように種々の組み合わせで配置されることが容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が全く“遺伝子”によってコードされる必要がないことを理解する。抗原が、合成により産生でき、または生物学的サンプルに由来でき、またはポリペプチド以外の巨大分子であり得ることは直ちに明らかである。このような生物学的サンプルは、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞または他の生物学的成分を伴う液体を含み得るが、これらに限定されない。
用語“抗癌効果”は、例えば、腫瘍体積減少、癌細胞数減少、転移数減少、平均余命延長、癌細胞増殖減少、癌細胞生存減少または癌状態と関係する種々の生理学的症状の改善を含むが、これらに限定されない、種々の手段により示され得る生物学的効果をいう。“抗癌効果”はまた、癌の発生の予防におけるペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によっても本来示すことができる。用語“抗腫瘍効果”は、例えば、腫瘍体積減少、腫瘍細胞数減少、腫瘍細胞増殖減少または腫瘍細胞生存減少を含むが、これらに限定されない、種々の手段により示され得る生物学的効果をいう。
用語“自己”は、後に再導入される個体と同じ個体由来のあらゆる物質をいう。
用語“同種”は、物質を導入するのと同じ種の異なる動物由来のあらゆる物質をいう。２つ以上の個体は、一箇所以上の座位における遺伝子が同一ではない場合、互いに同種という。ある面において、同じ種の個体からの同種物質は、抗原的に相互作用するために遺伝的に十分に異なり得る。
用語“異種”は、異なる種の動物由来の移植片をいう。
用語“癌”は、異常細胞の無制御な増殖により特徴付けられる疾患をいう。癌細胞は、局所的にまたは血流およびリンパ系により体内の他の部分に拡散し得る。多様な癌の例は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌などを含むが、これらに限定されない。用語“腫瘍”および“癌”はここでは相互交換可能に使用し、例えば、両方の用語は固形および液性の、例えば、汎発性または循環性の、腫瘍を含む。ここで使用する用語“癌”または“腫瘍”は前悪性ならびに悪性癌および腫瘍を含む。
用語“ＣＤ１９の発現と関係する疾患”は、ＣＤ１９の発現と関係する疾患またはＣＤ１９を発現するまたは任意の時点で発現された細胞と関係する状態を含み、例えば、癌または悪性腫瘍または骨髄異形成、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態のような前癌状態のような増殖性疾患；またはＣＤ１９を発現する細胞と関係する非癌関連徴候を含む。疑いを避けるために、ＣＤ１９の発現と関係する疾患は、例えば、ＣＤ１９発現が、例えば、ＣＤ１９を標的とする分子、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲでの処置により、下方制御されているために、現在ＣＤ１９を発現しないが、かつてＣＤ１９を発現していた細胞と関係する状態を含み得る。ある面において、ＣＤ１９の発現と関係する癌は、血液癌である。ある面において、血液癌は白血病またはリンパ腫である。ある面において、ＣＤ１９の発現と関係する癌は、例えば、例えば、Ｂ細胞急性リンパ系白血病(ＢＡＬＬ)、Ｔ細胞急性リンパ系白血病(ＴＡＬＬ)、急性リンパ系白血病(ＡＬＬ)を含むが、これらに限定されない１以上の急性白血病；例えば、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、慢性リンパ系白血病(ＣＬＬ)を含み、これらに限定されない１以上の慢性白血病を含み、これらに限定されない癌および悪性腫瘍を含む。ＣＤ１９の発現と関係するさらなる癌または血液学的状態は、例えば、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞−または大細胞−濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症および骨髄球性血液細胞の産生不全(または異形成)によりまとめられる血液学的状態の多様な集合である“前白血病状態”などを含むが、これらに限定されない。さらにＣＤ１９の発現と関係する疾患は、例えば、ＣＤ１９の発現と関係する非定型および／または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性疾患を含むが、これらに限定されない。ＣＤ１９の発現と関係する非癌関連徴候は、例えば、自己免疫性疾患、(例えば、狼瘡)、炎症性障害(アレルギーおよび喘息)および移植を含むが、これらに限定されない。ある態様において、腫瘍抗原発現細胞は、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡを発現するまたは任意の時点で発現した。ある態様において、腫瘍抗原発現細胞は腫瘍抗原タンパク質(例えば、野生型または変異体)を産生し、腫瘍抗原タンパク質は正常レベルまたは低レベルで存在し得る。ある態様において、腫瘍抗原発現細胞は、ある時点で腫瘍抗原タンパク質を検出可能なレベル産生し、続いて実質的に検出可能な腫瘍抗原タンパク質を産生しない。
用語“Ｂ細胞抗原の発現と関係する疾患”は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＲＯＲ１の１以上の発現と関係する疾患またはＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＲＯＲ１の１以上を発現するまたは任意の時点で発現した細胞と関係する状態を含むが、これらに限定されず、例えば、癌または悪性腫瘍または骨髄異形成、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態のような前癌状態のような増殖性疾患；またはＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＲＯＲ１の１以上を発現する細胞と関係する非癌関連徴候を含む。疑いを避けるために、Ｂ細胞抗原の発現と関係する疾患は、例えば、抗原発現が、例えば、Ｂ細胞抗原を標的とする分子、例えば、Ｂ細胞ターゲティングＣＡＲでの処置により、下方制御されているために、現在Ｂ細胞抗原を発現しないが、かつて該抗原を発現していた細胞と関係する状態を含み得る。用語“Ｂ細胞抗原の発現と関係する疾患”は、ここに記載するような、ＣＤ１９の発現と関係する疾患を含む。
用語“保存的配列修飾”は、アミノ酸配列を含む抗体または抗体フラグメントの結合特徴に顕著に影響しないかまたは変えない、アミノ酸修飾をいう。このような保存的修飾は、アミノ酸置換、付加および欠失を含む。修飾を、本発明の抗体または抗体フラグメントに、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在変異誘発のような、当分野で知られる標準法により導入できる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられるものである。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で規定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。それゆえに、本発明のＣＡＲ内の１個以上のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基と置き換えることができ、改変したＣＡＲを、ここに記載する機能的アッセイを使用して試験できる。
用語“刺激”は、刺激分子(例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＡＲ)のその同族リガンド(またはＣＡＲの場合腫瘍抗原)への結合により誘導される一次応答をいい、それにより、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体によるシグナル伝達またはＣＡＲの適切なＮＫ受容体またはシグナル伝達ドメインを介するシグナル伝達のような、しかしこれに限定されないシグナル伝達事象に介在する。刺激は、ある分子の発現の改変に介在できる。
用語“刺激分子”は、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくともある面について、刺激性の方法で免疫細胞の活性化を制御する細胞質シグナル伝達配列を提供する、免疫細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞)により発現される分子をいう。ある面において、シグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体と、ペプチドと共に充填されたＭＨＣ分子の結合により開始され、増殖、活性化、分化などを含むが、これらに限定されないＴ細胞応答への介在に至る、一次シグナルである。刺激性の方法で作用する一次細胞質シグナル伝達配列(“一次シグナル伝達ドメイン”とも呼ぶ)は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含む。本発明において特に有用であるＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達配列の例は、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ(ＦＣＥＲ１Ｇ)、ＦｃガンマＲIIａ、ＦｃＲベータ(ＦｃイプシロンＲ１ｂ)、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２由来のものを含むが、これらに限定されない。本発明の具体的なＣＡＲにおいて、本発明の任意の１以上のＣＡＲにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達配列、例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列を含む。本発明の具体的なＣＡＲにおいて、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号１７として提供される配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの相当する残基である。本発明の具体的なＣＡＲにおいて、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達配列は配列番号４３に提供される配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの相当する残基である。
用語“抗原提示細胞”または“ＡＰＣ”は、表面上に主要組織適合複合体(ＭＨＣ)と複合体化した外来性抗原を表示する、アクセサリー細胞(例えば、Ｂ細胞、樹状細胞など)のような免疫系細胞をいう。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)を使用してこれらの複合体を認識する。ＡＰＣは、抗原を処理し、Ｔ細胞に提示させる。
“細胞内シグナル伝達ドメイン”は、ここで使用する用語として、分子の細胞内部分をいう。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ含有細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを産生する。例えば、ＣＡＲＴ細胞における、免疫エフェクター機能の例は、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解性活性およびヘルパー活性を含む。
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。代表的一次細胞内シグナル伝達ドメインは、一次刺激または抗原依存的刺激を担う分子由来のものを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは共刺激細胞内ドメインを含み得る。代表的共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナルまたは抗原非依存的刺激を担う分子由来のものを含む。例えば、ＣＡＲＴの場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインはＴ細胞受容体の細胞質配列を含んでよく、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは共受容体または共刺激分子からの細胞質配列を含んでよい。
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。ＩＴＡＭ含有一次細胞質シグナル伝達配列の例は、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ(ＦＣＥＲ１Ｇ)、ＦｃガンマＲIIａ、ＦｃＲベータ(ＦｃイプシロンＲ１ｂ)、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２由来のものを含むが、これらに限定されない。
用語“ゼータ”または代替的に“ゼータ鎖”、“ＣＤ３ゼータ”または“ＴＣＲゼータ”は、GenBan Acc. No. BAG36664.1として提供されるタンパク質として規定されるかまたは非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの相当する残基であり、“ゼータ刺激ドメイン”または代替的に“ＣＤ３ゼータ刺激ドメイン”または“ＴＣＲ−ゼータ刺激ドメイン”は、Ｔ細胞活性化に必要な初期シグナルの機能的伝達に十分である、ゼータ鎖の細胞質ドメインからのアミノ酸残基またはその機能的誘導体として定義される。ある面において、ゼータの細胞質ドメインは、GenBank Acc. No. BAG36664.1の残基５２〜１６４またはその機能的オルソログである非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの相当する残基を含む。ある面において、“ゼータ刺激ドメイン”または“ＣＤ３ゼータ刺激ドメイン”は配列番号１７として提供される配列である。ある面において、“ゼータ刺激ドメイン”または“ＣＤ３ゼータ刺激ドメイン”は配列番号４３として提供される配列である。
用語“共刺激分子”は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、増殖のような、しかし、これに限定されないＴ細胞による共刺激応答に介在する、Ｔ細胞上の同族結合パートナーをいう。共刺激分子は、効率的な免疫応答に寄与する抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌリガンド受容体、ならびにＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)および４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)を含むが、これらに限定されない。このような共刺激分子のさらなる例は、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含む。
共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であり得る。共刺激分子は、次のタンパク質ファミリーにより表すことができる：ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ性活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)および活性化ＮＫ細胞受容体。このような分子の例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ−１、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどを含む。
細胞内シグナル伝達ドメインは、由来する分子またはその機能的フラグメントもしくは誘導体の全細胞内部分または全天然細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。
用語“４−１ＢＢ”は、GenBank Acc. No. AAA62478.2として提供されるアミノ酸配列を有するＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーまたは非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの相当する残基であり、“４−１ＢＢ共刺激ドメイン”は、GenBank accno. AAA62478.2のアミノ酸残基２１４〜２５５として規定されるかまたは非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの相当する残基である。ある面において、“４−１ＢＢ共刺激ドメイン”は、配列番号１６として提供される配列または非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などからの相当する残基である。
“免疫エフェクター細胞”は、該用語がここで使用される限り、免疫応答、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞をいう。免疫エフェクター細胞の例は、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、ナチュラルキラーＴ(ＮＫＴ)細胞、肥満細胞および骨髄由来貪食細胞を含む。
ここで使用されている用語、“免疫エフェクター機能または免疫エフェクター応答”は、標的細胞の免疫攻撃を増強または促進する、例えば、免疫エフェクター細胞の機能または応答をいう。例えば、免疫エフェクター機能または応答は、標的細胞の死滅を促進するまたは成長または増殖を阻止する、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の特性をいう。Ｔ細胞の場合、一次刺激および共刺激は免疫エフェクター機能または応答の例である。
用語“コードする”は、特定のヌクレオチド配列(例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ)または特定のアミノ酸配列およびそれに由来する生物学的特性を有する、生物学的過程における他のポリマーおよび巨大分子の合成のための鋳型として働くための、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡのようなポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特定の配列の固有の特性をいう。それゆえに、遺伝子、ｃＤＮＡまたはＲＮＡは、該遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生物学的系においてタンパク質を産生するならば、タンパク質をコードする。遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される、ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表に提供されるコード鎖および非コード鎖の両者を、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードするということができる。
特に断らない限り、“アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列”は、互いに縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする全ヌクレオチド配列を含む。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列なる用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、あるバージョンでイントロンを含み得る限り、イントロンも含み得る。
用語“有効量”または“治療有効量”はここでは相互交換可能に使用し、特定の生物学的結果を達成するのに有効な、ここに記載する化合物、製剤、物質または組成物の量をいう。
用語“内在性”は、生物、細胞、組織または系の内部由来または内部で産生されるあらゆる物質をいう。
用語“外来性”は、生物、細胞、組織または系に導入されたまたはその外で産生されたあらゆる物質をいう。
用語“発現”は、プロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳をいう。
用語“導入ベクター”は、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用できる、組成物をいう。多数のベクターが当分野で知られ、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含む。それゆえに、用語“導入ベクター”は、自己複製プラスミドまたはウイルスを含む。本用語は、例えば、ポリリシン化合物、リポソームなどのような、核酸の細胞への伝達を促進する、非プラスミドおよび非ウイルス化合物をさらに含むとも解釈すべきである。ウイルス導入ベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されない。
用語“発現ベクター”は、発現すべきヌクレオチド配列と操作可能に連結した発現制御配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含む、ベクターをいう。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用領域を含み、他の発現のための要素は、宿主細胞によりまたはインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターは、組み換えポリヌクレオチドを取り込む、コスミド、プラスミド(例えば、ネイキッドまたはリポソームに含まれた)およびウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)を含む、当分野で知られる全てのものを含む。
用語“レンチウイルス”は、レトロウイルス科ファミリーの属をいう。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染可能な点で、レトロウイルスの中で独特であり、それらは相当量の遺伝情報を、宿主細胞のＤＮＡに送達でき、それゆえに、それらは、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の一つである。ＨＩＶ、ＳＩＶおよびＦＩＶは、全てレンチウイルスの例である。
用語“レンチウイルスベクター”は、特にMilone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)に提供されるような、自己不活性化レンチウイルスベクターを含む、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部由来のベクターである。臨床施設で使用し得るレンチウイルスベクターの他の例は、例えば、Oxford BioMedicaのLENTIVECTOR(登録商標)遺伝子送達テクノロジー、LentigenのLENTIMAXTMベクター系などを含むが、これらに限定されない。非臨床型のレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者に知られている。
用語“相同”または“同一性”は、２重合体分子間、例えば、２ＤＮＡ分子または２ＲＮＡ分子のような、２核酸分子間または２ポリペプチド分子間の、サブユニット配列同一性をいう。２分子の両者における該サブユニット位置が、同じ単量体サブユニットにより占拠されているとき；例えば、２ＤＮＡ分子におけるある位置がアデニンにより占拠されているならば、それらは、その位置で相同である。２配列間の相同性は、整合または相同位置の数の一次関数である；例えば、２配列における位置の半分(例えば、１０サブユニット長のポリマーにおける５位置)が相同であるならば、２配列は、５０％相同であり、位置の９０％(例えば、１０中９)が整合しているかまたは相同であるならば、２配列は、９０％相同である。
非ヒト(例えば、マウス)抗体の“ヒト化”形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２または抗体の他の抗原結合部分配列)である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体およびその抗体フラグメントは、レシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)からの残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲからの残基で置き換えられている、ヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体または抗体フラグメント)である。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基で置き換えられる。さらに、ヒト化抗体／抗体フラグメントは、レシピエント抗体にも移入したＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体または抗体フラグメントの性能をさらに精密かつ最適化するために行う。一般に、ヒト化抗体またはその抗体フラグメントは、全てのまたは実質的に全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは相当な部分がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１および一般に２の、可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体または抗体フラグメントはまた免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、一般にヒト免疫グロブリンのものも含み得る。さらなる詳細については、Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992を参照のこと。
用語“完全ヒト”は、全分子がヒト起源のものである抗体または免疫グロブリンのヒト形態と同一のアミノ酸配列からなる抗体または抗体フラグメントのような、免疫グロブリンをいう。
用語“単離された”は、天然状態から変えられたまたは取り出されたものを意味する。例えば、生存動物に天然に存在する核酸またはペプチドは“単離”されていないが、その天然状態で共存する物質から一部または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは“単離”されている。単離核酸またはタンパク質は、実質的に精製形態で存在でき、または、例えば、宿主細胞のような、非天然環境で存在できる。
本発明の状況において、一般的に生じる核酸塩基について、次の略語を使用する。“Ａ”はアデノシンを、“Ｃ”はシトシンを、“Ｇ”はグアノシンを、“Ｔ”はチミジンを、“Ｕ”はウリジンを、それぞれ意味する。
用語“操作可能に連結”または“転写制御”は、制御配列と異種核酸配列の、後者の発現をもたらす機能的結合をいう。例えば、第一核酸配列が第二核酸配列と機能的に関係して配置されているとき、第一核酸配列は、第二核酸配列と操作可能に連結している。例えば、プロモーターは、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響するならば、該コード配列と操作可能に連結している。操作可能に連結したＤＮＡ配列は互いに隣接していてよく、２タンパク質コード領域を連結するために必要ならば、同じリーディングフレーム内にある。
免疫原性組成物の“非経腸”投与なる用語は、例えば、皮下(ｓ.ｃ.)、静脈内(ｉ.ｖ.)、筋肉内(ｉ.ｍ.)または胸骨内、腫瘍内注射または点滴法を含む。
用語“核酸”または“ポリヌクレオチド”は、一本鎖または二本鎖形態いずれかのデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)またはリボ核酸(ＲＮＡ)およびそれらのポリマーをいう。特に限定しない限り、本用語は、対照核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似の方法で代謝される天然ヌクレオチドの既知アナログを含む核酸を包含する。特に断らない限り、特定の核酸配列はまたその保存的に修飾された変異体(例えば、縮重コドン置換)、アレル、オルソログ、ＳＮＰおよび相補性配列ならびに明確に記載された配列も包含することを含意する。具体的に、縮重コドン置換は、１以上の選択した(または全ての)コドンの第三の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列の産生により達成され得る(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。
用語“ペプチド”、“ポリペプチド”、および“タンパク質”は相互交換可能に使用し、ペプチド結合により共有結合したアミノ酸残基を含む化合物をいう。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２アミノ酸を含まなければならず、タンパク質またはペプチドの配列に含まれ得るアミノ酸の数に上限はない。ポリペプチドは、ペプチド結合により互いに連結した２以上のアミノ酸を含む、あらゆるペプチドまたはタンパク質をいう。ここで使用する用語は、当分野で、一般に、例えば、ペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも呼ばれる短鎖および多くのタイプが存在する当分野で一般にタンパク質と呼ばれる長鎖の両者を含む。“ポリペプチド”は、中でも、例えば、生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同のポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは、天然ペプチド、組み換えペプチドまたはこれらの組み合わせを含む。
用語“プロモーター”は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写の開始に必要な、細胞の合成機構により認識されるかまたは合成機構に導入されるＤＮＡ配列をいう。
用語“プロモーター／制御配列”は、プロモーター／制御配列に操作可能に連結した遺伝子産物の発現に必要な核酸配列をいう。いくつかの例において、この配列はコアプロモーター配列であってよく、他の例において、この配列はまたエンハンサー配列および遺伝子産物の発現に必要な他の制御要素も含み得る。プロモーター／制御配列は、例えば、遺伝子産物を組織特異的方法で発現させるものであり得る。
用語“構成的”プロモーターは、遺伝子産物をコードするまたは特定化するポリヌクレオチドと操作可能に連結したとき、細胞の大部分のまたは全ての生理学的条件下で、細胞に遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列をいう。
用語“誘導性”プロモーターは、遺伝子産物をコードするまたは特定化するポリヌクレオチドと操作可能に連結したとき、実質的に細胞にプロモーターに対応するインデューサーが存在するときのみ、細胞に遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列をいう。
用語“組織特異的”プロモーターは、遺伝子をコードするまたはそれにより特定化されるポリヌクレオチドと操作可能に連結したとき、実質的に細胞がプロモーターに対応する組織タイプの細胞であるときのみ、細胞に遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列をいう。
ｓｃＦｖの文脈で使用する用語“可動性ポリペプチドリンカー”または“リンカー”は、可変重鎖および可変軽鎖領域を連結するために、単独でまたは組み合わせで使用される、グリシンおよび／またはセリン残基のようなアミノ酸からなるペプチドリンカーをいう。ある態様において、可動性ポリペプチドリンカーはＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列(Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ)ｎ(ここで、ｎは１以上の正の整数である)を含む。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３。ｎ＝４、ｎ＝５およびｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９およびｎ＝１０(配列番号１０５)。ある態様において、可動性ポリペプチドリンカーは、(Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ)４(配列番号１０６)または(Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ)３(配列番号１０７)を含むが、これらに限定されない。他の態様において、リンカーは(Ｇｌｙ２Ｓｅｒ)、(ＧｌｙＳｅｒ)または(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)(配列番号１０８)の複数反復を含む。また本発明の範囲内に含まれるのは、引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１２／１３８４７５号に記載するリンカーである。
ここで使用する５’キャップ(ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ ７−メチルグアノシンキャップまたはＲＮＡ ｍ７Ｇキャップとも呼ぶ)は、転写開始直後に、真核メッセンジャーＲＮＡの“前面”または５’末端に付加されている、修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、第一転写ヌクレオチドに連結した末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識およびＲＮａｓｅからの保護に重要である。キャップ付加は、転写と共役し、一方が他方に影響するように、共転写的に生じる。転写開始直後、合成されているｍＲＮＡの５’末端は、ＲＮＡポリメラーゼと関係するキャップ合成複合体により結合される。この酵素複合体は、ｍＲＮＡキャッピングに必要な化学反応を触媒する。合成は、多工程生化学反応として進行する。キャッピング部分を修飾して、安定性または翻訳効率のようなｍＲＮＡの機能を調節し得る。
ここで使用する“インビトロ転写ＲＮＡ”は、インビトロで合成されているＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡをいう。一般に、インビトロ転写ＲＮＡはインビトロ転写ベクターから産生される。インビトロ転写ベクターは、インビトロ転写ＲＮＡの産生に使用する鋳型を含む。
ここで使用する“ポリ(Ａ)”は、ポリアデニル化によりｍＲＮＡに結合した一連のアデノシンである。一過性発現用構築物の好ましい態様において、ポリＡは５０〜５０００(配列番号１０９)、好ましくは６４超、より好ましくは１００超、最も好ましくは３００または４００超である。ポリ(Ａ)配列は、局在化、安定性または翻訳効率のようなｍＲＮＡの機能を調節するために、化学的または酵素的に修飾され得る。
ここで使用する“ポリアデニル化”は、ポリアデニリル部分またはその修飾変異体の、メッセンジャーＲＮＡ分子への共有結合をいう。真核生物において、大部分のメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)分子は、３’末端でポリアデニル化される。３’ポリ(Ａ)テイルは、酵素、ポリアデニル化ポリメラーゼの作用により、プレｍＲＮＡに付加されるアデニンヌクレオチドの長い配列(しばしば数百)である。高等真核生物において、ポリ(Ａ)テイルは、特異的配列、ポリアデニル化シグナルを含む転写物に付加される。ポリ(Ａ)テイルおよびそれに結合したタンパク質は、エキソヌクレアーゼによる分解からｍＲＮＡを保護することを助ける。ポリアデニル化はまた転写終結、核からのｍＲＮＡの搬出および翻訳に重要である。ポリアデニル化は、ＤＮＡからＲＮＡへの転写直後に核で生じるが、さらにまた細胞質で後に生じ得る。転写が終結した後、ｍＲＮＡ鎖を、ＲＮＡポリメラーゼと結合したエンドヌクレアーゼ複合体の作用により開裂する。開裂部位は、通常開裂部位近くの塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在により特徴付けられる。ｍＲＮＡが開裂された後、アデノシン残基が、開裂部位の遊離３’末端に付加される。
ここで使用する“一過性”は、非統合導入遺伝子の数時間、数日または数週の期間の発現をいい、ここで、該発現の期間は、遺伝子がゲノムに統合されているかまたは宿主細胞における安定なプラスミドレプリコンに含まれている場合の発現の期間より短い。
用語“シグナル伝達経路”は、細胞のある部分から細胞の他の部分へのシグナル伝達に役割を有する、多様なシグナル伝達分子間の生化学的関係をいう。用語“細胞表面受容体”は、シグナルを受け、細胞膜を通過してシグナルを伝達できる分子および分子の複合体を含む。
用語“対象”は、免疫応答が惹起できる生存生物(例えば、哺乳動物、ヒト)を含むことを意図する。
用語“実質的に精製された”細胞は、他の細胞型が本質的にない細胞をいう。実質的に精製された細胞はまた天然に存在する状態では通常関係している、他の細胞型から離されている細胞をいう。いくつかの例において、実質的に精製された細胞の集団は、細胞の同種集団をいう。他の例において、この用語は、単に、天然状態では天然に関係している細胞から離されている細胞をいう。ある面において、細胞はインビトロで培養される。他の面において、細胞はインビトロで培養されない。
ここで使用する用語“治療”は処置を意味する。治療効果は、疾患状態の軽減、抑制、寛解または根絶により得られる。
ここで使用する用語“予防”は、疾患または疾患状態の予防的または保護的処置を意味する。
本発明の文脈において、“腫瘍抗原”または“過増殖性障害抗原”または“過増殖性障害と関係する抗原”は、特異的過増殖性障害に共通する抗原をいう。ある面において、本発明の過増殖性障害抗原は、原発性または転移性黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌および乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などのような腺癌を含むが、これらに限定されない癌に由来する。
用語“トランスフェクト”または“形質転換”または“形質導入”は、外来性核酸が宿主細胞に伝達または導入される過程をいう。“トランスフェクト”または“形質転換”または“形質導入”細胞は、外来性核酸でトランスフェクト、形質転換または形質導入されているものである。細胞は、初代対象細胞およびその子孫を含む。
用語“特異的に結合”は、サンプルに存在する結合パートナー(例えば、刺激腫瘍抗原)タンパク質を認識し、結合する抗体またはリガンドをいうが、この抗体またはリガンドは、サンプル内の他の分子を実質的に認識または結合しない。
“調節可能なキメラ抗原受容体(ＲＣＡＲ)”は、該用語がここで使用される限り、ＲＣＡＲＸ細胞にあるとき、ＲＣＡＲＸ細胞に、ＲＣＡＲＸ細胞の免疫エフェクター特性を最適化できる標的細胞、一般に癌細胞に対する特異性および調節可能な細胞内シグナル産生または増殖を提供する一連の、一般に最も単純な態様で２ポリペプチドをいう。ＲＣＡＲＸ細胞は、少なくとも一部、抗原結合ドメインにより結合される抗原を含む標的細胞への特異性を提供するために、抗原結合ドメインに頼る。ある態様において、ＲＣＡＲは、二量体化分子の存在下、細胞内シグナル伝達ドメインを抗原結合ドメインに連結できる、二量体化スイッチを含む。
“膜アンカー”または“膜繋留ドメイン”は、該用語がここで使用される限り、細胞外または細胞内ドメインを原形質膜に繋留するのに十分なポリペプチドまたは部分、例えば、ミリストイル基をいう。
用語“スイッチドメイン”は、該用語がここで使用される限り、例えば、ＲＣＡＲをいうとき、二量体化分子の存在下、他のスイッチドメインと結合するもの、一般にポリペプチドベースのものをいう。結合は、第一スイッチドメインに連結した、例えば、融合した第一のものと、第二スイッチドメインに連結した、例えば、融合した第二のものの機能的カップリングをもたらす。第一および第二スイッチドメインは、集合的に二量体化スイッチと呼ぶ。ある態様において、第一および第二スイッチドメインは、互いに同じである、例えば、同じ一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、集合的にホモ二量体化スイッチと呼ぶ。ある態様において、第一および第二スイッチドメインは互いに異なり、例えば、異なる一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、集合的にヘテロ二量体化スイッチと呼ぶ。ある態様において、スイッチは細胞内である。ある態様において、スイッチは細胞外である。ある態様において、スイッチドメインはポリペプチドベースのもの、例えば、ＦＫＢＰまたはＦＲＢベースのものであり、二量体化分子は小分子、例えば、ラパログである。ある態様において、スイッチドメインはポリペプチドベースのもの、例えば、ｍｙｃペプチドと結合するｓｃＦｖであり、二量体化分子はポリペプチド、そのフラグメントまたはポリペプチドの多量体、例えば、１以上のｍｙｃ ｓｃＦｖｓと結合するｍｙｃリガンドまたはｍｙｃリガンドの多量体である。ある態様において、スイッチドメインはポリペプチドベースのもの、例えば、ｍｙｃ受容体であり、二量体化分子は抗体またはそのフラグメント、例えば、ｍｙｃ抗体である。
ここで使用する用語“二量体化分子”は、例えば、ＲＣＡＲに言及するとき、第一スイッチドメインと第二スイッチドメインの結合を促進する分子をいう。ある態様において、二量体化分子は対象内に天然で存在せず、または顕著な二量体化をもたらす濃度で存在しない。ある態様において、二量体化分子は、小分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１である。
用語“生物学的に同等”は、対照化合物(例えば、ＲＡＤ００１)の対照用量または対照量により産生される効果と同等な効果を産生するのに必要な対照化合物(例えば、ＲＡＤ００１)以外の薬剤の量をいう。ある態様において、効果は、例えば、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ阻害により測定して、例えば、インビボまたはインビトロアッセイにおいて評価して、例えば、ここに記載するアッセイ、例えば、Boulayアッセイにより測定してまたはウェスタンブロットによるリン酸化Ｓ６レベルの測定により測定して、ｍＴＯＲ阻害のレベルである。ある態様において、効果は、セルソーティングにより測定して、ＰＤ−１陽性／ＰＤ−１陰性Ｔ細胞の比の変更である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的に同等な量または用量は、対照化合物の対照用量または対照量と同じレベルのＰ７０ Ｓ６キナーゼ阻害を達成する量または用量である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的に同等な量または用量は、対照化合物の対照用量または対照量と同じレベルのＰＤ−１陽性／ＰＤ−１陰性Ｔ細胞の比の変更を達成する量または用量である。
用語“低い、免疫増強用量”は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシンまたは触媒的ｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて使用するとき、例えば、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ活性の阻害により測定して、ｍＴＯＲ活性を、一部、しかし、完全にではなく、阻害するｍＴＯＲ阻害剤の用量をいう。例えば、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼの阻害によりｍＴＯＲ活性を評価する方法はここに記載する。用量は、完全免疫抑制を生じるには不十分であるが、免疫応答の増強に十分な用量である。ある態様において、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤は、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞数の減少および／またはＰＤ−１陰性Ｔ細胞数の増加またはＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞比の増加をもたらす。ある態様において、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤は、ナイーブＴ細胞数の増加をもたらす。ある態様において、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤は、次の１以上をもたらす：
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体における、次のマーカーの１以上の発現の増加：ＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２；
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体における、ＫＬＲＧ１発現の減少；および
記憶Ｔ細胞前駆体数、例えば、次の特徴の任意の１つまたは組み合わせを有する細胞数の増加：ＣＤ６２Ｌ高増加、ＣＤ１２７高増加、ＣＤ２７＋増加、ＫＬＲＧ１減少およびＢＣＬ２増加；
ここで、上記変化は、例えば、未処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる。
ここで使用する“難治性”は、処置に応答しない疾患、例えば、癌をいう。ある態様において、難治性癌は、処置前または開始時に処置に耐性であり得る。他の態様において、難治性癌は、処置中に難治性になり始め得る。
ここで使用する“完全応答者”は、処置に対する完全応答、例えば、完全寛解を示す、疾患、例えば、癌を有する対象をいう。完全応答は、例えば、ここに記載するCheson基準を使用して、同定し得る。
ここで使用する“部分応答者”は、処置に対して部分応答、例えば、部分寛解を示す、疾患、例えば、癌を有する対象をいう。部分応答は、例えば、Cheson基準を使用して、同定し得る。
ここで使用する“非応答者”は、処置に対して応答を示さない疾患、例えば、癌を有する対象をいい、例えば、患者は、疾患が安定であるかまたは疾患進行を示す。非応答者は、例えば、ここに記載するCheson基準を使用して、同定し得る。
ここで使用する用語“再発”は、応答性の最初の期間(例えば、完全応答または部分応答)後の、疾患(例えば、癌)の再出現をいう。応答性の最初の期間は、ある閾値以下、例えば、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％以下への癌細胞レベルの低下を含み得る。再出現は、ある閾値以上、例えば、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％以上の癌細胞レベルの上昇を含み得る。再発は、例えば、ここに記載するCheson基準を使用して、同定し得る。
範囲：本明細書をとおして、本発明の多様な面を範囲の形式で示すことができる。範囲の形式での記載は単に便宜および簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する確固たる制限として解釈すべきではないと理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、全ての可能な部分範囲ならびに該範囲内の個々の数値が具体的に開示されていると解釈すべきである。例えば、１〜６のような範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などのような部分範囲ならびに該範囲内の個々の数、例えば、１、２、２.７、３、４、５、５.３および６が具体的に開示されていると解釈すべきである。他の例として、９５〜９９％同一性のような範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性と同一性を有する何かを含み、９６〜９９％、９６〜９８％、９６〜９７％、９７〜９９％、９７〜９８％および９８〜９９％同一性のような部分範囲を含む。これは、範囲の広さに関わらず、適用される。
概要
キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)(例えば、ＣＤ１９のようなＢ細胞マーカーを標的とするＣＡＲ)を発現する免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を使用する、癌のような疾患(例えば、血液癌または他のＢ細胞悪性腫瘍)の処置に使用するための組成物および方法をここに提供する。方法は、とりわけ、ここに記載するＢ細胞ターゲティングＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を、キナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤のような他の薬剤と組み合わせて投与することを含む。
本発明は、少なくとも一部、ＣＡＲ治療(例えば、Ｂ細胞ターゲティングＣＡＲ治療)とキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤の組み合わせの高い有効性を支持する実験を提供する。キナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤とＣＡＲ治療の組み合わせは、キナーゼ阻害剤単剤療法またはＣＡＲ発現細胞単剤療法または両者に対して組み合わせ治療の有効性を増加できる。これらの有利な効果は、例えば、有効性を維持しながら、キナーゼ阻害剤またはＣＡＲ発現細胞または両者を低用量とすることを可能とする。ここでの結果は、広範な癌、例えば、血液癌および他のＢ細胞悪性腫瘍に適用可能である。例えば、イブルチニブは、大部分のリンパ腫で上昇しているＢＴＫを阻害する。ＣＡＲ１９を発現する免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)は、大部分のＢ細胞悪性腫瘍で発現されるＣＤ１９表面発現を有する癌を標的とする。ＣＡＲ１９の代わりにまたはそれと組み合わせて、あらゆる他のＢ細胞ターゲティングＣＡＲ(例えば、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＲＯＲ１の１以上をターゲティングするＣＡＲ)を、ここに記載する組み合わせ治療で使用できる。それゆえに、ＣＡＲ治療(例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＣＤ２０ ＣＡＲ、ＣＤ２２ ＣＡＲまたはＲＯＲ１ ＣＡＲ治療の１以上)とＢＴＫ阻害剤(例えば、イブルチニブ)の組み合わせは、リンパ腫(例えば、ホジキンリンパ腫)、ＭＣＬ、ＣＬＬ、ＤＬＢＣＬおよび多発性骨髄腫を含む、Ｂ細胞の過増殖が関与する広範な癌の処置に適する。
本発明によって、イブルチニブは、腫瘍塊を減らし、新生物Ｂ細胞を末梢血に移動させ得る(例えば、ここでの実施例８参照)。理論に拘束されるものではないが、ＭＣＬのようなあるリンパ腫は、リンパ節における増殖中心の癌性細胞の塊を特徴とする。ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、高密度に充填された塊への浸透が困難であることがある。それゆえに、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤は、腫瘍塊を減らし、新生物Ｂ細胞を末梢血に移動させ、リンパ腫細胞を、ＣＡＲ発現細胞により攻撃されやすくする。
これに代えてまたはこれと組み合わせて、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤は、またＣＡＲ発現細胞に影響する。本発明は、イブルチニブ処置が循環ＣＡＲＴ１９細胞レベルを増加させることを示す(例えば、実施例８に示すデータ参照)。理論に拘束されるものではないが、循環ＣＡＲＴ１９細胞レベルの増加は、例えば、増殖の増加、Ｔ細胞表現型の改変または他の因子の結果であり得る。例えば、イブルチニブは、ＢＴＫに相同性を有するキナーゼであるＩＴＫを阻害できる。ＩＴＫはＴ細胞に発現され、その阻害はＴ細胞表現型を変え得る。イブルチニブのようなキナーゼ阻害剤での処置は、Ｔ細胞表現型をＴｈ２表現型からＴｈ１表現型に代え、そうしてＴ細胞増殖能を増加させ得る。対象のＢＴＫ阻害剤での前処置または共投与は、対象におけるＴ細胞増殖能を増加し、そうして、循環ＣＡＲ発現細胞レベルを増加させ得る。さらに、ＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブで前処置した対象は、ＣＡＲ製造のためのそのアフェレシスにおける高い増殖能を備えたＴ細胞集団を有し得る。
ある面において、本発明は、Ｂ細胞抗原(例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＲＯＲ１の１以上タンパク質から選択される)に特異的に結合するように操作された抗体または抗体フラグメントを含む、多数のキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を提供する。ある面において、本発明は、ＣＡＲを発現するように操作した細胞(例えば、Ｔ細胞)を提供し、ここで、ＣＡＲ Ｔ細胞(“ＣＡＲＴ”)は抗癌特性を示す。ある面において、細胞はＣＡＲで形質転換され、ＣＡＲは細胞表面上に発現される。ある態様において、細胞(例えば、Ｔ細胞)ＣＡＲをコードするウイルスベクターで形質導入される。ある態様において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。ある態様において、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。あるこのような態様において、細胞は、ＣＡＲを安定に発現し得る。他の態様において、細胞(例えば、Ｔ細胞)は、ＣＡＲをコードする核酸、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡでトランスフェクトされる。あるこのような態様において、細胞は、ＣＡＲを一過性に発現し得る。
ある面において、ＣＡＲの抗ＣＤ１９タンパク質結合部分はｓｃＦｖ抗体フラグメントである。ある面において、このような抗体フラグメントは、同等な結合親和性を保持している点で機能的であり、例えば、それらは、由来したＩｇＧ抗体と同等の親和性で同じ抗原に結合する。ある面において、このような抗体フラグメントは、当業者に理解されるように、免疫応答の活性化、標的抗原から起こるシグナル伝達の阻害、キナーゼ活性の阻害などを含むが、これらに限定されない生物学的応答を提供する点で、機能的である。ある面において、ＣＡＲの抗ＣＤ１９抗原結合ドメインは、由来したｓｃＦｖのマウス配列と比較して、ヒト化されているｓｃＦｖ抗体フラグメントでる。ある面において、親マウスｓｃＦｖ配列は、ＰＣＴ公報ＷＯ２０１２／０７９０００号(引用により本明細書に包含させる)に提供され、ここに配列番号５９として提供されるＣＡＲ１９構築物である。ある態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、ＷＯ２０１２／０７９０００号に記載され、配列番号５９に提供されるｓｃＦｖである。
ある面において、本発明の抗体は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)に取り込まれる。ある面において、ＣＡＲは、ＰＣＴ公報ＷＯ２０１２／０７９０００号に配列番号１２として提供され、ここに配列番号５８として提供されるポリペプチド配列を含み、ここで、ｓｃＦｖドメインは、配列番号１〜１２から選択される１以上の配列により置換されている。ある面において、配列番号１〜１２のｓｃＦｖドメインは、ヒトＣＤ１９に特異的に結合するマウス起源のｓｃＦｖフラグメントである、配列番号５９のｓｃＦｖドメインのヒト化バリアントである。このマウスｓｃＦｖのヒト化は、マウス特異的残基が、ＣＡＲＴ１９処置、例えば、ＣＡＲ１９構築物を形質導入したＴ細胞での処置を受けている患者でヒト抗マウス抗原(ＨＡＭＡ)応答を誘発し得る、臨床の現場で望ましいことがある。
ある面において、本発明のＣＡＲの抗ＣＤ１９結合ドメイン部分、例えば、ヒト化ｓｃＦｖ部分は、配列が哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている、導入遺伝子によりコードされる。ある面において、本発明のＣＡＲ構築物全体が、配列全体が哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている、導入遺伝子によりコードされる。コドン最適化は、コードＤＮＡにおける同義コドン(すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン)の出現頻度が、異なる種で偏っているとの発見をいう。このようなコドン縮重は、多様なヌクレオチド配列により同一ポリペプチドがコードされることを可能とする。多様なコドン最適化法が当分野で知られ、例えば、少なくとも米国特許５,７８６,４６４号および６,１１４,１４８号に開示される方法を含む。
ある面において、ヒト化ＣＡＲ１９は、配列番号１に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。ある面において、ヒト化ＣＡＲ１９は、配列番号２に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。ある面において、ヒト化ＣＡＲ１９は、配列番号３に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。ある面において、ヒト化ＣＡＲ１９は、配列番号４に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。ある面において、ヒト化ＣＡＲ１９は、配列番号５に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。ある面において、ヒト化ＣＡＲ１９は、配列番号６に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。ある面において、ヒト化ＣＡＲ１９は、配列番号７に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。ある面において、ヒト化ＣＡＲ１９は、配列番号８に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。ある面において、ヒト化ＣＡＲ１９は、配列番号９に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。ある面において、ヒト化ＣＡＲ１９は、配列番号１０に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。ある面において、ヒト化ＣＡＲ１９は、配列番号１１に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。ある面において、ヒト化ＣＡＲ１９は、配列番号１２に提供されるｓｃＦｖ部分を含む。
ある面において、本発明のＣＡＲは、特異的抗体の抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達分子を合わせる。例えば、ある面において、細胞内シグナル伝達分子は、ＣＤ３ゼータ鎖、４−１ＢＢおよびＣＤ２８シグナル伝達モジュールおよびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。ある面において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号３１〜４２の１種以上に提供される配列から選択されるＣＡＲを含む。ある面において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号３１に提供される配列を含む。ある面において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号３２に提供される配列を含む。ある面において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号３３に提供される配列を含む。ある面において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号３４に提供される配列を含む。ある面において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号３５に提供される配列を含む。ある面において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号３６に提供される配列を含む。ある面において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号３７に提供される配列を含む。ある面において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号３８に提供される配列を含む。ある面において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号３９に提供される配列を含む。ある面において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号４０に提供される配列を含む。ある面において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号４１に提供される配列を含む。ある面において、ＣＤ１９ ＣＡＲは、配列番号４２に提供される配列を含む。
さらに、本発明は、ＣＤ１９ ＣＡＲ組成物および数ある疾患の中で、癌またはＣＤ１９を発現する細胞または組織が関与するあらゆる悪性腫瘍または自己免疫性疾患を処置するための、医薬または方法におけるそれらの利用を提供する。
ある面において、本発明のＣＡＲをＣＤ１９発現正常細胞の根絶に使用でき、それにより細胞移植前の細胞コンディショニング治療としての使用が適用可能である。ある面において、ＣＤ１９発現正常細胞は、ＣＤ１９発現正常幹細胞であり、細胞移植は幹細胞移植である。
ある面において、本発明は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように操作した細胞(例えば、Ｔ細胞)を提供し、ここで、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞(“ＣＡＲＴ”)は抗癌特性を示す。好ましい抗原はＣＤ１９である。ある面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、部分的にヒト化された抗ＣＤ１９抗体フラグメントを含む。ある面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む部分的にヒト化された抗ＣＤ１９抗体フラグメントを含む。従って、本発明は、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインを含み、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に設計されたＣＤ１９−ＣＡＲおよび養子治療のためのその使用方法を提供する。
ある面において、ＣＤ１９−ＣＡＲは、ＣＤ１３７(４−１ＢＢ)シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータシグナルドメインおよびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも一つの細胞内ドメインを含む。ある面において、ＣＤ１９−ＣＡＲは、ＣＤ１３７(４−１ＢＢ)またはＣＤ２８以外の１以上の共刺激分子からの少なくとも一つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)
本発明は、ＣＡＲをコードする配列を含む組み換えＤＮＡ構築物を包含し、ここで、ＣＡＲＢ細胞抗原(例えば、ＣＤ１９、例えば、ヒトＣＤ１９)に特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを含み、ここで、抗体フラグメントの配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と連続しており、同じリーディングフレーム内にある。細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ゼータ鎖を含み得る。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインの少なくとも一部を含む、ＣＡＲの部分をいう。ある態様において、抗原結合ドメインは、ここに記載するマウス抗体または抗体フラグメントである。ある態様において、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体または抗体フラグメントである。
具体的な面において、本発明のＣＡＲ構築物は、配列番号１〜１２からなる群から選択されるｓｃＦｖドメインまたは配列番号５９のｓｃＦＶドメインを含み、ここで、ｓｃＦｖの前に配列番号１３に提供するような任意のリーダー配列および後ろに配列番号１４または配列番号４５または配列番号４７または配列番号４９に提供するような任意のヒンジ配列、配列番号１５に提供するような膜貫通領域、配列番号１６または配列番号５１を含む細胞内シグナル伝達ドメインおよび配列番号１７または配列番号４３を含むＣＤ３ゼータ配列があってよく、ここで、ドメインは、連続しており、同じリーディングフレーム内にあり、単一融合タンパク質を形成する。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号５９からなる群から選択されるｓｃＦｖフラグメントの各々のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も本発明に包含される。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号５９からなる群から選択されるｓｃＦｖフラグメントの各々のポリペプチドおよび配列番号１３〜１７のドメインの各々をコードするヌクレオチド配列と、コードされた本発明のＣＤ１９ＣＡＲ融合タンパク質も本発明に包含される。ある面において、代表的ＣＤ１９ＣＡＲ構築物は、任意のリーダー配列、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメインおよび細胞内刺激ドメインを含む。ある面において、代表的ＣＤ１９ＣＡＲ構築物は任意のリーダー配列、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメインおよび細胞内刺激ドメインを含む。本発明のヒト化ｓｃＦｖドメインを含む特異的ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物は、配列番号３１〜４２として提供され、または配列番号５９として提供されるマウスｓｃＦｖドメインである。
完全長ＣＡＲ配列も、表７および表３に示すように、配列番号３１〜４２および５８としてここに提供する。
代表的リーダー配列は配列番号１３として提供する。代表的ヒンジ／スペーサー配列は配列番号１４または配列番号４５または配列番号４７または配列番号４９として提供する。代表的膜貫通ドメイン配列は配列番号１５として提供する。４−１ＢＢタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの代表的配列は配列番号１６として提供する。ＣＤ２７の細胞内シグナル伝達ドメインの代表的配列は配列番号５１として提供する。代表的ＣＤ３ゼータドメイン配列は配列番号１７または配列番号４３として提供する。
ある面において、本発明は、ＣＡＲをコードする核酸分子を含む組み換え核酸構築物を包含し、ここで、核酸分子は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と連続しており、同じリーディングフレーム内にある、例えば、ここに記載の、抗ＣＤ１９結合ドメインをコードする核酸配列を含む。ある面において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号１〜１２および５８から選択される１以上である。ある面において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号６１〜７２および５９の１以上に提供される配列のヌクレオチド残基６４〜８１３によりコードされる。ある面において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号６１のヌクレオチド残基６４〜８１３によりコードされる。ある面において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号６２のヌクレオチド残基６４〜８１３によりコードされる。ある面において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号６３のヌクレオチド残基６４〜８１３によりコードされる。ある面において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号６４のヌクレオチド残基６４〜８１３によりコードされる。ある面において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号６５のヌクレオチド残基６４〜８１３によりコードされる。ある面において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号６６のヌクレオチド残基６４〜８１３によりコードされる。ある面において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号６７のヌクレオチド残基６４〜８１３によりコードされる。ある面において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号６８のヌクレオチド残基６４〜８１３によりコードされる。ある面において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号６９のヌクレオチド残基６４〜８１３によりコードされる。ある面において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号７０のヌクレオチド残基６４〜８１３によりコードされる。ある面において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号７１のヌクレオチド残基６４〜８１３によりコードされる。ある面において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号７２のヌクレオチド残基６４〜８１３によりコードされる。
ある面において、本発明は、ＣＡＲをコードする導入遺伝子を含む組み換え核酸構築物を包含し、ここで、核酸分子は、配列番号６１〜７２から選択される１以上の抗ＣＤ１９結合ドメインをコードする核酸配列を含み、ここで、配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と連続しており、同じリーディングフレーム内にある。ＣＡＲにおいて使用できる代表的細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、４−１ＢＢなどの１以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含むが、これらに限定されない。ある例において、ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、４−１ＢＢなどの任意の組み合わせを含み得る。ある面において、本発明のＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号８５〜９６から選択される１以上である。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号８５である。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号８６である。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号８７である。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号８８である。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号８９である。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号９０である。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号９１である。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号９２である。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号９３である。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号９４である。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号９５である。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号９６である。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号９７である。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号９８である。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号９９である。
所望の分子をコードする核酸配列は、標準技術を使用する、例えば該遺伝子を発現する細胞からのライブラリーのスクリーニング、それを含むことが知られるベクターからの遺伝子の誘導またはそれを含む細胞および組織からの直接の単離のような、当分野で知られる組み換え法を使用して得ることができる。あるいは、目的の核酸を、クローン化ではなく、合成により産生できる。
本発明は、細胞に直接形質導入できる、ＣＡＲを発現するレトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物を含む。
本発明はまた、細胞に直接トランスフェクトできるＲＮＡ構築物も含む。トランスフェクションに使用するためのｍＲＮＡを産生する方法は、特別に設計されたプライマーを用いる鋳型のインビトロ転写(ＩＶＴ)、続くポリＡ付加を含み、一般に５０〜２０００塩基長の、３’および５’非翻訳配列(“ＵＴＲ”)、５’キャップおよび／または配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)、発現させる遺伝子およびポリＡテイルを含む構築物を産生する(配列番号１１８)。このように産生したＲＮＡは、異なる種の細胞を効率的にトランスフェクトする。ある態様において、鋳型は、ＣＡＲの配列を含む。ある態様において、ＲＮＡ ＣＡＲベクターを、エレクトロポレーションによりＴ細胞に形質導入する。
抗原結合ドメイン
ある面において、本発明のＣＡＲは、別に抗原結合ドメインと呼ばれる標的特異的結合要素を含む。部分の選択は、標的細胞の表面を規定するリガンドのタイプおよび数による。例えば、抗原結合ドメインは、特定の疾患状態と関係する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択し得る。そうして、本発明のＣＡＲにおける抗原結合ドメインのためのリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例は、ウイルス、細菌および寄生虫感染、自己免疫疾患および癌細胞と関係するものを含む。
ある面において、ＣＡＲ介在Ｔ細胞応答は、所望の抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインを、ＣＡＲに設計することにより、目的の抗原に方向付けできる。
ある面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインを含む部分は、ＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメインを含む。ある面において、抗原結合ドメインはヒトＣＤ１９を標的とする。ある面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)に記載されているＦＭＣ６３ ｓｃＦｖフラグメントと同じまたは類似する結合特異性を有する。ある態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)に記載のｓｃＦｖフラグメントを含む。
抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体および重鎖可変ドメイン(ＶＨ)、軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)およびラクダ類由来ナノボディの可変ドメイン(ＶＨＨ)のような単一ドメイン抗体を含むが、これらに限定されないその機能的フラグメントを含むが、これらに限定されない抗原に結合するあらゆるドメインおよび組み換えフィブロネクチンドメインなどのような抗原結合ドメインとして機能することが知られる代替スキャフォールドであり得る。
ある態様において、ＣＡＲ分子は、ここに記載する抗ＣＤ１９結合ドメインの軽鎖相補性決定領域１(ＬＣ ＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣ ＣＤＲ２)および軽鎖相補性決定領域３(ＬＣ ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)およびここに記載する抗ＣＤ１９結合ドメインの重鎖相補性決定領域１(ＨＣ ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ ＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣ ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)を含む抗ＣＤ１９結合ドメイン、例えば、ＬＣ ＣＤＲの１以上、例えば、全３およびＨＣ ＣＤＲの１以上、例えば、全３を含む抗ＣＤ１９結合ドメインを含む。ある態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、ここに記載する抗ＣＤ１９結合ドメインの重鎖相補性決定領域１(ＨＣ ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ ＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣ ＣＤＲ３)の１以上 (例えば、全３)を含み、例えば、抗ＣＤ１９結合ドメインは、各々、ここに記載するＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を含む２可変重鎖領域を有する。ある態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、ここに記載するマウス軽鎖可変領域(例えば、表７)および／またはここに記載するマウス重鎖可変領域(例えば、表７)を含む。ある態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、表７のアミノ酸配列のマウス軽鎖およびマウス重鎖を含むｓｃＦｖである。ある態様において、抗ＣＤ１９結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)は、表７に提供する軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３修飾(例えば、置換)を有するが、３０、２０または１０修飾(例えば、置換)を超えないアミノ酸配列または表７のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域；および／または表７に提供する重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３修飾(例えば、置換)を有するが、３０、２０または１０修飾(例えば、置換)を超えないアミノ酸配列または表７のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。ある態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号５９の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインはｓｃＦｖであり、ここに、例えば、表７に記載するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が、ここに、例えば、表７に記載するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に、リンカー、例えば、ここに記載するリンカーを介して結合する。ある態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)ｎリンカー(ここで、ｎは１、２、３、４、５または６、好ましくは３または４である)(配列番号５３)を含む。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、次の配向のいずれであってもよい：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域。
いくつかの例において、抗原結合ドメインが、ＣＡＲが最終的に使用されるのと同じ種由来であることが有利である。例えば、ヒトにおける使用のために、ＣＡＲの抗原結合ドメインが、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインについてヒトまたはヒト化残基を有することが有利であり得る。
それゆえに、ある面において、抗原結合ドメインはヒト化抗体または抗体フラグメントを含む。ある態様において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインは、ここに記載するマウスまたはヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインの軽鎖相補性決定領域１(ＬＣ ＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣ ＣＤＲ２)および軽鎖相補性決定領域３(ＬＣ ＣＤＲ３)の１以上 (例えば、全３)および／またはここに記載するマウスまたはヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインの重鎖相補性決定領域１(ＨＣ ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ ＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣ ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)、例えば、ヒト化ＬＣ ＣＤＲの１以上、例えば、全３およびＨＣ ＣＤＲの１以上、例えば、全３を含む抗ＣＤ１９結合ドメインを含む。ある態様において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインｃはここに記載するマウスまたはヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインの重鎖相補性決定領域１(ＨＣ ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ ＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣ ＣＤＲ３)の１以上 (例えば、全３)を含み、例えば、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインは、各々、ここに記載するＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３を含む２可変重鎖領域を有する。ある態様において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインは、ここに記載するヒト化軽鎖可変領域(例えば、表３)および／またはここに記載するヒト化重鎖可変領域(例えば、表３)を含む。ある態様において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインは、ここに記載するヒト化重鎖可変領域(例えば、表３)、例えば、少なくとも２のここに記載するヒト化重鎖可変領域(例えば、表３)を含む。ある態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、表３のアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖである。ある態様において、抗ＣＤ１９結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)は、表３に提供する軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３修飾(例えば、置換)を有するが、３０、２０または１０修飾(例えば、置換)を超えないアミノ酸配列または表３のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域；および／または表３に提供する重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２または３修飾(例えば、置換)を有するが、３０、２０または１０修飾(例えば、置換)を超えないアミノ酸配列または表３のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。ある態様において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択される配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインをコードする核酸配列は、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１および配列番号７２またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列からなる群から選択される配列を含む。ある態様において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインはｓｃＦｖであり、ここに、例えば、表３に記載するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が、ここに、例えば、表３に記載するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に、リンカー、例えば、ここに記載するリンカーを介して結合する。ある態様において、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインは、(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)ｎリンカー(ここで、ｎは１、２、３、４、５または６、好ましくは３または４である)(配列番号５３)を含む。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、次の配向のいずれであってもよい：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域。
ある面において、抗原結合ドメイン部分は、配列番号１〜１２から選択される１以上の配列を含む。ある面において、ヒト化ＣＡＲは、配列番号３１〜４２から選択される１以上の配列から選択される。ある面において、非ヒト抗体は、抗体の特定の配列または領域が、ヒトで天然に産生される抗体またはそのフラグメントとの類似性を高めるように修飾されている、ヒト化されている。
ヒト化抗体は、ＣＤＲ移植(例えば、引用によりその全体を本明細書に包含させる欧州特許番号ＥＰ２３９,４００号；国際公開ＷＯ９１／０９９６７号；および米国特許５,２２５,５３９号、５,５３０,１０１号および５,５８５,０８９号参照)、ベニアリングまたはリサーフェシング(例えば、引用によりその全体を本明細書に包含させる欧州特許ＥＰ５９２,１０６号およびＥＰ５１９,５９６号；Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814；およびRoguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973参照)、鎖シャッフリング(例えば、引用によりその全体を本明細書に包含させる米国特許５,５６５,３３２号参照)および例えば、各々、引用によりその全体を本明細書に包含させる米国特許出願公開ＵＳ２００５／００４２６６４号、米国特許出願公開ＵＳ２００５／００４８６１７号、米国特許６,４０７,２１３号、米国特許５,７６６,８８６号、国際公開ＷＯ９３１７１０５号、Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994)およびPedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994)に開示された技術を含むが、これらに限定されない、当分野で知られる多様な技術を使用して産生できる。しばしば、フレームワーク領域におけるフレームワーク残基を、抗原結合を変える、例えば、改善するために、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基と置き換える。これらのフレームワーク置換は、当分野で周知の方法により、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用のモデリングおよび特定の位置の異常フレームワーク残基を同定するための配列比較により、道程される(例えば、引用によりその全体を本明細書に包含させるQueen et al.、米国特許５,５８５,０８９号；およびRiechmann et al., 1988, Nature, 332:323参照)。
ヒト化抗体または抗体フラグメントは、非ヒトである起源由来の１以上のアミノ酸残基をその中に残す。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば“移入”残基と呼ばれ、これは、一般に“移入”可変ドメインから取られる。ここに提供するように、ヒト化抗体または抗体フラグメントは、非ヒト免疫グロブリン分子およびフレームワーク領域からの１以上のＣＤＲを含み、ここで、フレームワークを構成するアミノ酸残基は、完全にまたは大部分ヒト生殖系列に由来する。抗体または抗体フラグメントのヒト化のための複数の技術が当分野で周知であり、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に変えて、すなわち、ＣＤＲ移植(内容を、引用によりその全体を本明細書に包含させる、ＥＰ２３９,４００号；ＰＣＴ公報ＷＯ９１／０９９６７号；および米国特許４,８１６,５６７号；６,３３１,４１５号；５,２２５,５３９号；５,５３０,１０１号；５,５８５,０８９号；６,５４８,６４０号)により、Winterら(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))に従い実質的に実施できる。このようなヒト化抗体および抗体フラグメントにおいて、実質的に完全未満のヒト可変ドメインが、非ヒト種からの対応する配列で置換されている。ヒト化抗体は、しばしば、あるＣＤＲ残基および恐らくあるフレームワーク(ＦＲ)残基が、齧歯類抗体の類似部位からの残基で置換されている、ヒト抗体である。抗体および抗体フラグメントのヒト化はまたベニアリングまたはリサーフェシング(ＥＰ５９２,１０６号；ＥＰ５１９,５９６号；Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994);およびRoguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994))または鎖シャッフリング(米国特許５,５６５,３３２号)により達成でき、これらの内容を、その全体を引用により本明細書に包含させる。
ヒト化抗体を製造するための、ヒト可変ドメイン、軽および重両者の選択は、抗原性を減少するためである。いわゆる“最良適合”法により、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を、既知ヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次いで、齧歯類のものに最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク(ＦＲ)として認める(内容を引用によりその全体を本明細書に包含させる、Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987))。他の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、数種の異なるヒト化抗体のために使用し得る(例えば、内容を、引用することによりその全体を本明細書に包含させるNicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)参照)。ある態様において、重鎖可変領域のフレームワーク領域、例えば、全４フレームワーク領域はＶＨ４＿４−５９生殖系列配列由来である。ある態様において、フレームワーク領域は、例えば、対応するマウス配列(例えば、配列番号５９)のアミノ酸から、１、２、３、４または５修飾、例えば、置換を含み得る。ある態様において、フレームワーク領域、例えば、軽鎖可変領域の全４フレームワーク領域はＶＫ３＿１.２５生殖系列配列由来である。ある態様において、フレームワーク領域は、例えば、対応するマウス配列(例えば、配列番号５９)のアミノ酸から、１、２、３、４または５修飾、例えば、置換を含み得る。
ある面において、抗体フラグメントを含む本発明のＣＡＲ組成物の部分を、標的抗原への高親和性および他の都合よい生物学的特性を残して、ヒト化する。本発明のある面によって、ヒト化抗体および抗体フラグメントを、親およびヒト化配列の三次元モデルを使用する、親配列および種々の概念的ヒト化産物の分析の過程により製造する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者に馴染み深い。選択した候補免疫グロブリン配列の可能性の高い立体配座構造を模式化し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の検査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、例えば、候補免疫グロブリンが標的抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析が可能となる。このように、標的抗原への親和性増加のような、所望の抗体または抗体フラグメント特性が達成されるように、レシピエントおよび移入配列からＦＲ残基を選択し、組み合わせできる。一般に、ＣＤＲ残基は、直接的におよび最も実質的に抗原結合への影響に関与する。
ヒト化抗体または抗体フラグメントは、元の抗体と類似の抗原性特異性、例えば、本発明において、ヒトＣＤ１９と結合する能力を維持し得る。ある態様において、ヒト化抗体または抗体フラグメントは、ヒトＣＤ１９への結合の親和性および／または特異性が改善され得る。
ある面において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、抗体または抗体フラグメントの特定の機能的特質または特性により特徴付けられる。例えば、ある面において、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインを含む部分は、ヒトＣＤ１９と特異的に結合する。ある面において、抗原結合ドメインは、ヒトＣＤ１９に対してNicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)に記載のＦＭＣ６３ ｓｃＦｖと同じまたは類似する結合特異性を有する。ある面において、本発明は、抗体または抗体フラグメントを含む抗原結合ドメインに関し、ここで、抗体結合ドメインはＣＤ１９タンパク質またはそのフラグメントと特異的に結合し、ここで、抗体または抗体フラグメントは、配列番号１〜１２または配列番号５９のアミノ酸配列を含む可変軽鎖および／または可変重鎖を含む。ある面において、抗原結合ドメインは、配列番号１〜１２または配列番号５９から選択されるｓｃＦｖのアミノ酸配列を含む。ある面において、ｓｃＦｖは、リーダー配列に隣接しており、同じリーディングフレーム内にある。ある面において、リーダー配列は、配列番号１３として提供するポリペプチド配列である。
ある面において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、フラグメント、例えば、一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)である。ある面において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、(Ｆａｂ’)２または二官能的(例えば二特異性)ハイブリッド抗体である(例えば、Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987))。ある面において、本発明の抗体およびそのフラグメントは、野生型のまたは増強された親和性で、ＣＤ１９タンパク質と結合する。
ある例において、ｓｃＦｖを、当分野で知られる方法に従い製造できる(例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426 and Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883参照)。ＳｃＦｖ分子を、最適化された長さおよび／またはアミノ酸組成を有する、可動性ポリペプチドリンカーを使用して、ＶＨ領域とＶＬ領域を一緒に連結することにより製造できる(例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー)。リンカー長は、ｓｃＦｖの可変領域がどのように折りたたまれ、相互作用するかに大きく影響し得る。実際、短ポリペプチドリンカー(例えば、５〜１０アミノ酸)を用いるならば、鎖内折りたたみは阻止される。鎖間折りたたみも、２可変領域を一緒にして機能的エピトープ結合部位を形成させるために必要である。リンカー配向およびサイズの例について、例えば、引用により本明細書に包含させる、Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448、米国特許出願公開２００５／０１００５４３号、２００５／０１７５６０６号、２００７／００１４７９４号およびＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０２０２５８号およびＷＯ２００７／０２４７１５号参照。
ｓｃＦｖは、ＶＬ領域とＶＨ領域の間に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上のアミノ酸残基のリンカーを含み得る。リンカー配列は、あらゆる天然に存在するアミノ酸を含み得る。ある態様において、リンカー配列は、アミノ酸グリシンおよびセリンを含む。他の態様において、リンカー配列は、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎ(ここで、ｎは１以上の正の整数である)(配列番号１８)のようなグリシンおよびセリン反復のセットを含む。ある態様において、リンカーは(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)４(配列番号１０６)または(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３(配列番号１０７)であり得る。リンカー長の変動は、活性試験で優れた有効性を生じるか、活性を保持するかまたは増強させ得る。
ある態様において、抗原結合ドメイン(または他の部分またはＣＡＲ全体)のアミノ酸配列を修飾でき、例えば、ここに記載するアミノ酸配列を、例えば、保存的置換により修飾できる。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で規定されており、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。
２以上の核酸またはポリペプチド配列における同一性パーセントは、同じである２以上の配列をいう。２配列は、次の配列比較アルゴリズムの一つまたは手動アラインメントおよび目視を使用して測定して、比較ウィンドウまたは指定領域を通して最大対応のために比較および整列したとき、２配列が、同じである特定したパーセンテージのアミノ酸残基またはヌクレオチドを有するならば、“実質的に同一”である(すなわち、特定した領域、または、特定していないとき、配列全体にわたり、６０％同一、所望により７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％,８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一)。所望により、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド(または１０アミノ酸)長またはそれ以上の領域、好ましくは１００〜５００または１０００またはそれ以上のヌクレオチド(または２０、５０、２００またはそれ以上のアミノ酸)長の領域に存在する。
配列比較のために、一般に一方の配列が対照配列として働き、それに対して、試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用したとき、試験配列および対照配列をコンピューターに入力し、必要であれば、部分配列調和を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用でき、または代替パラメータを指定できる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づき、対照配列に対する試験配列の配列同一パーセントを計算する。比較のための配列のアラインメント法は、当分野で周知である。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cの局地的相同性アルゴリズムにより、Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性検索方法により、これらのアルゴリズムのコンピューター制御履行(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ)または手動アラインメントおよび目視検査により(例えば、Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology参照)、実施できる。
配列同一性パーセントおよび配列類似性の決定に適するアルゴリズムの二つの例はＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ ２.０アルゴリズムであり、これはそれぞれAltschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402；およびAltschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationから公的に利用可能である。
２アミノ酸配列間の同一性パーセントはまた、ＡＬＩＧＮプログラム(version 2.0)に組み込まれているE. Meyers and W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０加重残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用しても決定できる。さらに、２アミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ(www.gcg.comから利用可能)におけるＧＡＰプログラムに取り込まれているNeedleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453アルゴリズムを使用して、Blossom 62マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスおよびギャップ加重１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さ加重１、２、３、４、５または６を使用しても決定できる。
ある面において、本発明は、機能的に等価な分子を産生する、出発抗体またはフラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)アミノ酸配列の修飾を意図する。例えば、ＣＡＲに含まれる抗ＣＤ１９結合ドメインのＶＨまたはＶＬ、例えば、ｓｃＦｖを、抗ＣＤ１９結合ドメイン、例えば、出発ＶＨまたはＶＬフレームワーク領域のｓｃＦｖと少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％,８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性を保持するように修飾できる。本発明は、機能的に等価な分子を産生するための、ＣＡＲ構築物全体の修飾、例えば、ＣＡＲ構築物の種々のドメインの１以上のアミノ酸配列の修飾を意図する。ＣＡＲ構築物は、出発ＣＡＲ構築物と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％,８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性を維持するように修飾できる。
二特異性ＣＡＲ
ある態様において、多特異的抗体分子は、二特異性抗体分子である。二特異性抗体は、２を超えない抗原に特異性を有する。二特異性抗体分子は、第一エピトープに対する結合特異性を有する第一免疫グロブリン可変ドメイン配列および第二エピトープに対する結合特異性を有する第二免疫グロブリン可変ドメイン配列により特徴付けられる。ある態様において、第一および第二エピトープは、同じ抗原、例えば、同じタンパク質(または多量体タンパク質のサブユニット)にある。ある態様において、第一および第二エピトープは重複する。ある態様において、第一および第二エピトープは重複しない。ある態様において、第一および第二エピトープは異なる抗原、例えば、異なるタンパク質(または多量体タンパク質の異なるサブユニット)にある。ある態様において、二特異性抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列および第二エピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列を含む。ある態様において、二重特異性抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する半抗体および第二エピトープに結合特異性を有する半抗体を含む。ある態様において、二重特異性抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有する半抗体またはそのフラグメントおよび第二エピトープに結合特異性を有する半抗体またはそのフラグメントを含む。ある態様において、二重特異性抗体分子は、第一エピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖまたはそのフラグメントおよび第二エピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖまたはそのフラグメントを含む。
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、多様な態様において、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに結合する膜貫通ドメインを含むように設計できる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接する１以上のさらなるアミノ酸、例えば、膜貫通ドメインが由来したタンパク質の細胞外領域と結合する１以上のアミノ酸(細胞外領域の例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１５アミノ酸)および／または膜貫通型タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域と結合する１以上のさらなるアミノ酸(例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１５アミノ酸)を含むことができる。ある面において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの他のドメインと結合しているもの、例えば、ある態様において、膜貫通ドメインは、シグナル伝達ドメイン、共刺激ドメインまたはヒンジドメインが由来したのと同じタンパク質に由来し得る。他の面において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの他のいずれかのドメインが由来するのと同じタンパク質に由来しない。ある例において、膜貫通ドメインは、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するため、このようなドメインの同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を避けるため、選択できまたはアミノ酸置換により修飾できる。ある面において、膜貫通ドメイン膜貫通ドメインは、ＣＡＲ発現細胞の細胞表面上の他のＣＡＲとホモ二量体化できる。異なる面において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じＣＡＲ発現細胞に存在する天然の結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小化するために、修飾または置換され得る。
膜貫通ドメインは、天然由来でも、組み換え供給源由来でもよい。供給源が天然であるとき、ドメインは、あらゆる膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。ある面において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲが標的に結合するときは、細胞内ドメインにシグナル伝達できる。本発明で特に有用な膜貫通ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の少なくとも膜貫通領域を含み得る。ある態様において、膜貫通ドメインは、例えば、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃの少なくとも膜貫通領域を含み得る。
ある例において、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質からのヒンジを介して、ＣＡＲの細胞外領域、例えば、ＣＡＲの抗原結合ドメインに結合され得る。例えば、ある態様において、ヒンジは、ヒトＩｇ(免疫グロブリン)ヒンジ、例えば、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＤヒンジ)、ＧＳリンカー(例えば、ＧＳここに記載するリンカー)、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジまたはＣＤ８ａヒンジであり得る。ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む(例えば、からなる)。ある面において、膜貫通ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む(例えば、からなる)。
一つの面において、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＧ４ヒンジを含む。例えば、ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、アミノ酸配列
のヒンジを含む。ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、
のヌクレオチド配列によりコードされるヒンジを含む。
ある面において、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＤヒンジを含む。例えば、ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、アミノ酸配列
のヒンジを含む。ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、
のヌクレオチド配列によりコードされるヒンジを含む。
ある面において、膜貫通ドメインは組み換えであってよく、この場合、主としてロイシンおよびバリンのような疎水性残基を含む。一つの面においてフェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンの三つ組が、組み換え膜貫通ドメインの各端に見られ得る。
所望により、２〜１０アミノ酸長の短オリゴまたはポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質領域の間の結合を形成し得る。グリシン−セリンダブレットは、特に適当なリンカーを提供する。例えば、一つの面において、リンカーは、
のアミノ酸配列を含む。ある態様において、リンカーは、
のヌクレオチド配列によりコードされる。
ある面において、ヒンジまたはスペーサーはＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジを含む。
細胞質ドメイン
ＣＡＲの細胞質ドメインまたは領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが導入される免疫細胞の正常エフェクター機能の少なくともの一つの活性化を一般に担う。用語“エフェクター機能”は、細胞の専門化された機能をいう。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解性活性またはヘルパー活性であり得る。用語“細胞内シグナル伝達ドメイン”は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊化された機能の実施を指示する、タンパク質の部分をいう。通常細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断された部分を使用する点において、このような切断された部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、完全鎖の変わりに使用し得る。用語細胞内シグナル伝達ドメインは、このように、エフェクター機能シグナルの伝達に十分な細胞内シグナル伝達ドメインのあらゆる切断された部分を含むことを意味する。
本発明のＣＡＲで使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの例は、抗原受容体結合後にシグナル伝達の開始のために協力して働くＴ細胞受容体(ＴＣＲ)および共受容体の細胞質配列、ならびに同じ機能的能力を有するこれらの配列のあらゆる誘導体または変異体およびあらゆる組み換え配列を含む。
ＴＣＲのみを介して産生されたシグナルがＴ細胞の完全活性化に不十分であり、二次的および／または共刺激シグナルも必要であることが知られる。それゆえに、Ｔ細胞活性化は、ＴＣＲ(一次細胞内シグナル伝達ドメイン)を介する抗原依存性一次活性化を開始するものおよび二次的または共刺激シグナル(二次細胞質ドメイン、例えば、共刺激ドメイン)を提供するために抗原非依存的様式で作用するものの、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列により介在されるということができる。
一次シグナル伝達ドメインは、刺激方向または阻害方向のいずれかで、ＴＣＲ複合体の一次活性化を制御する。刺激様式で作用する一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。
本発明で特に有用な一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むＩＴＡＭの例は、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ(ＦＣＥＲ１Ｇ)、ＦｃガンマＲIIａ、ＦｃＲベータ(ＦｃイプシロンＲ１ｂ)、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２のものを含む。ある態様において、本発明のＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達ドメインを含む。
ある態様において、一次シグナル伝達ドメインは、天然のＩＴＡＭドメインと比較して活性が改変(例えば、増加または低下)された修飾ＩＴＡＭドメイン、例えば、変異ＩＴＡＭドメインを含む。ある態様において、一次シグナル伝達ドメインは、修飾ＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、最適化および／または切断したＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、一次シグナル伝達ドメインは、１、２、３、４またはそれ以上のＩＴＡＭモチーフを含む。
本発明において特に有用な一次細胞内シグナル伝達ドメイン含有分子のさらなる例は、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２およびＣＤ３２のものを含む。
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを単独で含んでも、それを本発明の文脈においてのＣＡＲに有用な任意の他の所望の細胞内シグナル伝達ドメインと組み合わせてもよい。例えば、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分および共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲの共刺激分子の細胞内ドメインを含む部分をいう。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的応答に必要な抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。このような分子の例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどを含む。例えば、ＣＤ２７共刺激は、インビトロでヒトＣＡＲＴ細胞の増殖、エフェクター機能および生存を増強し、インビボでヒトＴ細胞持続および抗腫瘍活性を増強することが示されている(Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706)。このような共刺激分子のさらなる例は、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／ＣｂｐおよびＣＤ１９ａを含む。
本発明のＣＡＲの細胞質部分内の細胞内シグナル伝達配列は、無作為にまたは特定の順番で互いに連結され得る。所望により、例えば、２〜１０アミノ酸(例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸)長の、短オリゴまたはポリペプチドリンカーは、細胞内シグナル伝達配列間の結合を形成し得る。ある態様において、グリシン−セリンダブレットを適当なリンカーとして使用できる。ある態様において、単アミノ酸、例えば、アラニン、グリシンを適当なリンカーとして使用できる。
一つの面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２以上の、例えば、２、３、４、５またはそれ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある態様において、２以上の、例えば、２、３、４、５またはそれ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、リンカー分子、例えば、ここに記載するリンカー分子により離される。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、リンカー分子はグリシン残基である。ある態様において、リンカーはアラニン残基である。
一つの面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一つの面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一つの面において、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号１６のシグナル伝達ドメインである。一つの面において、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号１７のシグナル伝達ドメインである。
一つの面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２７のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一つの面において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、
のアミノ酸配列を含む。一つの面において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、
の核酸配列によりコードされる。
ある面において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、さらに、第二ＣＡＲ、例えば、同じ標的(ＣＤ１９)へのまたは異なる標的(例えば、ＣＤ１２３またはメソセリン)への異なる抗原結合ドメインを含む、例えば、第二ＣＡＲを含み得る。ある態様において、ある態様において、ＣＡＲ発現細胞が２以上の異なるＣＡＲを含むとき、異なるＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインが互いに相互作用しないようなものであり得る。例えば、第一および第二ＣＡＲを発現する細胞は、第一ＣＡＲの抗原結合ドメインを、例えば、フラグメント、例えば、ｓｃＦｖとして有してよく、これは、第二ＣＡＲの抗原結合ドメイン、例えば、ＶＨＨである第二ＣＡＲの抗原結合ドメインと結合を形成しない。
他の面において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞他の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤をさらに発現できる。例えば、ある態様において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る。阻害分子、例えば、ＰＤ１は、ある態様において、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低下させ得る。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータを含む。ある態様において、阻害分子を阻害する薬剤は、例えば、細胞に正のシグナルを提供する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインと結合した、第一ポリペプチド、例えば、阻害分子を含む。ある態様において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４またはＴＧＦＲベータまたはこれらのいずれかのフラグメント(例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部)のような阻害分子の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメイン(例えば、ここに記載するように、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８を含む)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)である第二ポリペプチドを含む。ある態様において、薬剤は、ＰＤ１またはそのフラグメントの第一ポリペプチド(例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部)およびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)の第二ポリペプチドを含む。ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも含む受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害メンバーである。ＰＤ−１は、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄球性細胞に発現される(Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75)。ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２に対する２リガンドが、ＰＤ１への結合によりＴ細胞活性化を下方制御することが示されている(Freeman et a. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43)。ＰＤ−Ｌ１は、ヒト癌で豊富である(Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ−Ｌ１の局所相互作用の阻害により逆転され得る。
ある態様において、阻害分子、例えば、プログラム細胞死１(ＰＤ１)の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)を含む薬剤は、４１ＢＢおよびＣＤ３ゼータのような膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに融合できる(ここではＰＤ１ ＣＡＲとも呼ぶ)。ある態様において、ＰＤ１ ＣＡＲは、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲと組み合わせて使用したとき、Ｔ細胞の持続を改善する。ある態様において、ＣＡＲは、配列番号１２１おいて下線で示すＰＤ１の細胞外ドメインを含む、ＰＤ１ ＣＡＲである。ある態様において、ＰＤ１ ＣＡＲは、配列番号１２１のアミノ酸配列を含む。
ある態様において、ＰＤ１ ＣＡＲは下に提供するアミノ酸配列を含む(配列番号１１９)。
ある態様において、薬剤は、ＰＤ１ ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＰＤ１ ＣＡＲをコードする核酸配列を含む。ある態様において、ＰＤ１ ＣＡＲのための核酸配列を下に示し、ＰＤ１ ＥＣＤは、下の配列番号１２０で下線を引いている。
他の面において、本発明は、ＣＡＲ発現細胞の集団、例えば、ＣＡＲＴ細胞を提供する。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、異なるＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む。例えば、ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ここに記載する抗ＣＤ１９結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第一細胞および異なる抗ＣＤ１９結合ドメイン、例えば、第一細胞により発現されるＣＡＲにおける抗ＣＤ１９結合ドメインと異なるここに記載する抗ＣＤ１９結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。他の例として、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、ここに記載するような、抗ＣＤ１９結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第一細胞およびＣＤ１９以外(例えば、ＣＤ１２３)を標的とする抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現する第二細胞を含み得る。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第一細胞および二次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現する第二細胞を含む。
他の面において、本発明は、細胞の集団を提供し、ここで、集団における少なくとも１細胞がここに記載する抗ＣＤ１９結合ドメインを有するＣＡＲを発現し、第二細胞が他の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を発現する。例えば、ある態様において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る。阻害分子は、例えば、ある態様において、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始するのを阻害できる。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４またはＴＧＦＲベータを含む。ある態様において、阻害分子を阻害する薬剤は、細胞に正のシグナルを伝達する第二ポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインと結合した、第一ポリペプチド、例えば、阻害分子を含む。ある態様において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４またはＴＧＦＲベータのような阻害分子またはこれらのいずれかのフラグメント(例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部)の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインである第二ポリペプチド(例えば、共刺激ドメイン(例えば、ここに記載するような、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む)を含む。ある態様において、薬剤は、ＰＤ１またはそのフラグメント(例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部)の第一ポリペプチドおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインの第二ポリペプチド(例えば、ここに記載するＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む。
調節可能なキメラ抗原受容体
ある態様において、ＣＡＲ活性が制御できる調節可能なＣＡＲ(ＲＣＡＲ)が、ＣＡＲ治療の安全性および有効性を最適化するために望まれる。ＣＡＲ活性を制御できる多くの方法がある。例えば、二量体化ドメインに融合したカスパーゼを使用する、例えば、誘導性アポトーシス(例えば、Di Stasa et al., N Engl. J. Med. 2011 Nov. 3; 365(18):1673-1683参照)を、本発明のＣＡＲ治療における安全スイッチとして使用できる。ある態様において、本発明のＣＡＲを発現する細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)は、さらに誘導性アポトーシススイッチを含むことができ、ここで、ヒトカスパーゼ(例えば、カスパーゼ９)または修飾バージョンがヒトＦＫＢタンパク質の修飾体に融合し、これは条件付二量体化を可能とする。ラパログ(例えば、ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７)のような小分子存在下、誘導性カスパーゼ(例えば、カスパーゼ９)は活性化されて、本発明のＣＡＲを発現する細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)の急速なアポトーシスおよび死に至る。カスパーゼベースの誘導性アポトーシススイッチ(またはこのようなスイッチの１以上の面)の例は、例えば、全て、引用により本明細書に包含させるＵＳ２００４０４００４７号；ＵＳ２０１１０２８６９８０号；ＵＳ２０１４０２５５３６０号；ＷＯ１９９７０３１８９９号；ＷＯ２０１４１５１９６０号；ＷＯ２０１４１６４３４８号；ＷＯ２０１４１９７６３８号；ＷＯ２０１４１９７６３８号に記載されている。
ある面において、ＲＣＡＲは、ここに記載する標準的ＣＡＲの成分、例えば、抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインが別々のポリペプチドまたはメンバーに配置されている、一般に最も単純な態様において２つの、一連のポリペプチドを含む。ある態様において、一連のポリペプチドは、二量体化分子の存在下、ポリペプチドを互いに連結できる、例えば、抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを連結できる、二量体化スイッチを含む。ある態様において、本発明のＣＡＲは、引用により本明細書に包含する、例えば、ＷＯ２０１４１２７２６１号に記載のもののような、二量体化スイッチを利用する。
ある面において、ＲＣＡＲは、１)細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載する一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび第一スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー；２)ここに記載するような、例えば、ここに記載するＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメインおよび第二スイッチドメインを含む抗原結合メンバーの２つのポリペプチドまたはメンバーを含む。所望により、ＲＣＡＲは、ここに記載する膜貫通ドメインを含む。ある態様において、膜貫通ドメインは、細胞内シグナル伝達メンバー上、抗原結合メンバー上または両者の上に配置できる。(特に断らない限り、ＲＣＡＲのメンバーまたは要素がここに記載されているとき、順番は示されるとおりであってよいが、他の順番も同様に含まれる。換言すると、ある態様において、順番は本文に記載したとおりであるが、他の態様において、順番は異なり得る。例えば、膜貫通領域の一方の要素の順番は例と異なってよく、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインに対するスイッチドメインの位置は、異なる、例えば、逆でよい)。
ある態様において、第一および第二スイッチドメインは、細胞内または細胞外二量体化スイッチを形成できる。ある態様において、二量体化スイッチは、例えば、第一および第二スイッチドメインが同じであるときホモ二量体化スイッチであってよく、または、例えば、第一および第二スイッチドメインが互いに異なるとき、ヘテロ二量体化スイッチであってよい。
ある態様において、ＲＣＡＲは、“多スイッチ”を含み得る。多スイッチはヘテロ二量体化スイッチドメインまたはホモ二量体化スイッチドメインを含み得る。多スイッチは、複数の、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のスイッチドメインを、第一メンバー、例えば、抗原結合メンバーおよび第二メンバー、例えば、細胞内シグナル伝達メンバーと独立して含む。ある態様において、第一メンバーは、複数の第一スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインを含んでよく、第二メンバーは、複数の第二スイッチドメイン、例えば、ＦＲＢベースのスイッチドメインを含んでよい。ある態様において、第一メンバーは、第一および第二スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含んでよく、第二メンバーは、第一および第二スイッチドメイン、例えば、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含み得る。
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、１以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび１以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
ある態様において、抗原結合メンバーは、１以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、１以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。ある態様において、抗原結合メンバーは、複数の、例えば、２または３の、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよびＯＸ４０から選択される、ここに記載する共刺激シグナル伝達ドメインを含み、ある態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインがない。ある態様において、抗原結合メンバーは、細胞外から細胞内方向で、次の共刺激シグナル伝達ドメインを含む：４１ＢＢ−ＣＤ２７；４１ＢＢ−ＣＤ２７；ＣＤ２７−４１ＢＢ；４１ＢＢ−ＣＤ２８；ＣＤ２８−４１ＢＢ；ＯＸ４０−ＣＤ２８；ＣＤ２８−ＯＸ４０；ＣＤ２８−４１ＢＢ；または４１ＢＢ−ＣＤ２８。このような態様において、細胞内結合メンバーは、ＣＤ３ゼータドメインを含む。このような態様の一つにおいて、ＲＣＡＲは、(１)抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび２共刺激ドメインおよび第一スイッチドメインを含む抗原結合メンバー；および(２)膜貫通ドメインまたは膜繋留ドメインおよび少なくとも１つの一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび第二スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
ある態様は、抗原結合メンバーがＣＡＲ細胞の表面に繋留されていない、ＲＣＡＲを提供する。これは、細胞内シグナル伝達メンバーを有する細胞を、該細胞を抗原結合メンバーをコードする配列で形質転換することなく、１以上の抗原結合ドメインと好都合に対形成させる。このような態様において、ＲＣＡＲは、１)第一スイッチドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび第一スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー；および２)抗原結合ドメインおよび第二スイッチドメインを含む抗原結合メンバーを含み、ここで、抗原結合メンバーは膜貫通ドメインまたは膜繋留ドメインを含まず、そして、所望により、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。ある態様において、ＲＣＡＲは、さらに、３)抗原結合ドメインが結合するのと異なる抗原に結合する第二抗原結合ドメイン、例えば、第二抗原結合ドメイン；および第二スイッチドメインを含む第二抗原結合メンバーを含み得る。
抗原結合メンバーが二特異性活性化および標的化能を含むＲＣＡＲも提供される。この態様において、抗原結合メンバーは、複数の、例えば、２、３、４または５の抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖを含んでよく、ここで、各抗原結合ドメインは、標的抗原、例えば異なる抗原または同じ抗原、例えば、同じ抗原上の同じまたは異なるエピトープに結合する。ある態様において、複数の抗原結合ドメインは直列であり、所望により、リンカーまたはヒンジ領域が抗原結合ドメインの各々の間に配置される。適当なリンカーおよびヒンジ領域はここに記載する。
ある態様は、増殖のスイッチングを可能にする配置を有するＲＣＡＲを提供する。この態様において、ＲＣＡＲは、１)所望により、膜貫通ドメインまたは膜繋留ドメイン；例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよびＯＸ４０から選択される１以上の共刺激シグナル伝達ドメインおよびスイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー；および２)抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータドメインを含む抗原結合メンバーを含み、ここで、抗原結合メンバーは、スイッチドメインを含まないかまたは細胞内シグナル伝達メンバー上のスイッチドメインと二量体化するスイッチドメインを含まない。ある態様において、抗原結合メンバーは共刺激シグナル伝達ドメインを含まない。ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、ホモ二量体化スイッチからのスイッチドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、ヘテロ二量体化スイッチの第一スイッチドメインを含み、ＲＣＡＲは、ヘテロ二量体化スイッチの第二スイッチドメインを含む第二細胞内シグナル伝達メンバーを含む。このような態様において、第二細胞内シグナル伝達メンバーは、細胞内シグナル伝達メンバーと同じ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、二量体化スイッチは細胞内である。ある態様において、二量体化スイッチは細胞外である。
ここに記載するＲＣＡＲ配置のいずれにおいても、第一および第二スイッチドメインは、ここに記載するＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチを含む。
ここに記載するＲＣＡＲを含む細胞もここで提供される。ＲＣＡＲを発現するように操作したあらゆる細胞を、ＲＣＡＲＸ細胞として使用できる。ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞はＴ細胞であり、ＲＣＡＲＴ細胞と呼ぶ。ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞はＮＫ細胞であり、ＲＣＡＲＮ細胞と呼ぶ。
ＲＣＡＲコード化配列を含む核酸およびベクターもここで提供される。ＲＣＡＲの種々の要素をコードする配列は、同じ核酸分子、例えば、同じプラスミドまたはベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターに配置できる。ある態様において、(ｉ)抗原結合メンバーをコードする配列および(ii)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は、同じ核酸、例えば、ベクター上に存在できる。対応するタンパク質の産生は、例えば、別のプロモーターの使用によりまたはバイシストロニック転写産物(これは、単一翻訳産物の開裂によりまたは２つの別々のタンパク質産物の翻訳により、２タンパク質の産生をもたらし得る)の使用により達成できる。ある態様において、開裂可能ペプチドをコードする配列、例えば、Ｐ２ＡまたはＦ２Ａ配列を(ｉ)と(ii)の間に配置する。ある態様において、ＩＲＥＳをコードする配列、例えば、ＥＭＣＶまたはＥＶ７１ ＩＲＥＳを(ｉ)と(ii)の間に配置する。これらの態様において、(ｉ)および(ii)は単一ＲＮＡとして転写される。ある態様において、(ｉ)および(ii)が別のｍＲＮＡとして転写されるように、第一プロモーターは(ｉ)に操作可能に連結し、第二プロモーターは(ii)に操作可能に連結する。
あるいは、ＲＣＡＲの種々の要素をコードする配列を、異なる核酸分子、例えば、異なるプラスミドまたはベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターに配置できる。例えば、(ｉ)抗原結合メンバーをコードする配列は第一核酸、例えば、第一ベクター上に存在でき、そして(ii)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は第二核酸、例えば、第二ベクター上に存在できる。
二量体化スイッチ
二量体化スイッチは、非共有結合でも共有結合でもよい。非共有結合二量体化スイッチにおいて、二量体化分子は、スイッチドメイン間の非共有結合相互作用を促進する。共有結合二量体化スイッチにおいて、二量体化分子は、スイッチドメイン間の共有結合相互作用を促進する。
ある態様において、ＲＣＡＲは、ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰまたはＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチを含む。ＦＫＢＰ１２(ＦＫＢＰまたはＦＫ５０６結合タンパク質)は、天然産物免疫抑制剤、ラパマイシンの初期細胞内標的として働く、豊富な細胞質タンパク質である。ラパマイシンはＦＫＢＰおよび大型ＰＩ３ＫホモログＦＲＡＰ(ＲＡＦＴ、ｍＴＯＲ)に結合する。ＦＲＢは、ＦＫＢＰ−ラパマイシン複合体の結合に十分な、ＦＲＡＰの９３アミノ酸部分である(Chen, J., Zheng, X. F., Brown, E. J. & Schreiber, S. L. (1995) Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a critical serine residue. Proc Natl Acad Sci U S A 92: 4947-51)。
ある態様において、ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰ、例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースのスイッチは、二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパマイシンアナログとして使用できる。
ＦＫＢＰのアミノ酸配列は次のとおりである。
ある態様において、ＦＫＢＰスイッチドメインは、ラパマイシンまたはラパログの存在下、ＦＲＢまたはそのフラグメントもしくはアナログと結合する能力を有するＦＫＢＰのフラグメント、例えば、次の配列番号３７の下線部分を含み得る。
ＦＲＢのアミノ酸配列は次のとおりである。
“ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰ、例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースのスイッチ”は、その用語をここで使用する限り、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１の存在下、ＦＲＢまたはそのフラグメントもしくはアナログと結合する能力を有し、配列番号１２２または１２３のＦＫＢＰ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するかまたは３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１のアミノ酸残基を超えて異ならない、ＦＫＢＰそのフラグメントもしくはアナログを含む第一スイッチドメイン；およびラパマイシンまたはラパログの存在下、ＦＲＢまたはそのフラグメントもしくはアナログと結合する能力を有し、配列番号１２４のＦＲＢ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するかまたは３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１のアミノ酸残基を超えて異ならない、ＦＲＢそのフラグメントもしくはアナログを含む、第二スイッチドメインを含む、二量体化スイッチをいう。ある態様において、ここに記載するＲＣＡＲは、配列番号１２２(または配列番号１２３)に開示するアミノ酸残基を含む１つのスイッチドメインおよび配列番号１２４に開示するアミノ酸残基を含む１つのスイッチドメインを含む。
ある態様において、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ二量体化スイッチは、ＦＲＢベースのスイッチドメイン、例えば、修飾ＦＲＢスイッチドメイン、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインと、二量体化分子、例えば、ラパマイシンまたはラパログ、例えば、ＲＡＤ００１の複合体形成が変えられた、例えば、増強された、修飾ＦＲＢスイッチドメインを含む。ある態様において、修飾ＦＲＢスイッチドメインは、野生型アミノ酸が、その他の天然に存在するアミノ酸に変異している、アミノ酸位置Ｌ２０３１、Ｅ２０３２、Ｓ２０３５、Ｒ２０３６、Ｆ２０３９、Ｇ２０４０、Ｔ２０９８、Ｗ２１０１、Ｄ２１０２、Ｙ２１０５およびＦ２１０８での変異から選択される、１以上の、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の変異を含む。ある態様において、変異体ＦＲＢは、Ｅ２０３２に変異を含み、ここで、Ｅ２０３２はフェニルアラニン(Ｅ２０３２Ｆ)、メチオニン(Ｅ２０３２Ｍ)、アルギニン(Ｅ２０３２Ｒ)、バリン(Ｅ２０３２Ｖ)、チロシン(Ｅ２０３２Ｙ)、イソロイシン(Ｅ２０３２Ｉ)、例えば、配列番号１２５またはロイシン(Ｅ２０３２Ｌ)、例えば、配列番号１２６に変異されている。ある態様において、変異体ＦＲＢは、Ｔ２０９８に変異を含み、ここで、Ｔ２０９８はフェニルアラニン(Ｔ２０９８Ｆ)またはロイシン(Ｔ２０９８Ｌ)、例えば、配列番号１２７に変異されている。ある態様において、変異体ＦＲＢは、Ｅ２０３２およびＴ２０９８に変異を含み、ここで、Ｅ２０３２は任意のアミノ酸に変異され、Ｔ２０９８は任意のアミノ酸に変異され、例えば、配列番号１２８である。ある態様において、変異体ＦＲＢは、Ｅ２０３２ＩおよびＴ２０９８Ｌ変異を含み、例えば、配列番号１２９である。ある態様において、変異体ＦＲＢはＥ２０３２ＬおよびＴ２０９８Ｌ変異を含み、例えば、配列番号１３０である。
他の適当な二量体化スイッチは、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースの二量体化スイッチ、ジベレリンベースの二量体化スイッチ、タグ／バインダー二量体化スイッチおよびハロタグ／ｓｎａｐタグ二量体化スイッチを含む。ここに提供する指針に従い、このようなスイッチおよび関連する二量体化分子は、当業者に明らかである。
二量体化分子
スイッチドメイン間の結合は二量体化分子により促進される。二量体化分子存在下、スイッチドメイン間の相互作用または結合は、第一スイッチドメインに結合、例えば融合したポリペプチドと第二スイッチドメインに結合、例えば融合したポリペプチド間のシグナル伝達を可能にする。非律速レベルの二量体化分子の存在下、シグナル伝達は、例えば、ここに記載する系で測定して、１.１倍、１.２倍、１.３倍、１.４倍、１.５倍、１.６倍、１.７倍、１.８倍、１.９倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍増加する。
ラパマイシンおよびラパマイシンアナログ(ラパログと呼ぶこともある)、例えば、ＲＡＤ００１を、ここに記載するＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチにおける二量体化分子として使用できる。ある態様において、二量体化分子は、ラパマイシン(シロリムス)、ＲＡＤ００１(エベロリムス)、ゾタロリムス、テムシロリムス、ＡＰ−２３５７３(リダフォロリムス)、バイオリムスおよびＡＰ２１９６７から選択できる。ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチと使用するのに適するさらなるラパマイシンアナログは、さらに“組み合わせ治療”なる表題の部分または表題“代表的ｍＴＯＲ阻害剤”の部分に記載する。
分裂ＣＡＲ
ある態様において、ＣＡＲ発現細胞は、分裂ＣＡＲを使用する。分裂ＣＡＲ手法は、公開ＷＯ２０１４／０５５４４２号およびＷＯ２０１４／０５５６５７号にさらに詳細に記載される。簡潔には、分裂ＣＡＲ系は第一抗原結合ドメインおよび共刺激ドメイン(例えば、４１ＢＢ)を有する第一ＣＡＲを発現する細胞を含み、細胞はまた第二抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ＣＤ３ゼータ)を有する第二ＣＡＲを発現する。細胞が第一抗原と遭遇したとき、共刺激ドメインは活性化され、細胞が増殖する。細胞が第二抗原に遭遇したとき、細胞内シグナル伝達ドメインは活性化され、細胞死滅活性が開始する。それゆえに、ＣＡＲ発現細胞は、両抗原の存在下でのみ完全活性化される。
ＲＮＡトランスフェクション
インビトロ転写ＲＮＡ ＣＡＲを産生する方法がここに開示される。本発明はまた、細胞に直接トランスフェクトできるＲＮＡ構築物をコードするＣＡＲも含む。トランスフェクションに使用するためのｍＲＮＡを産生する方法は、一般に５０〜２０００塩基長(配列番号１１８)の、３’および５’非翻訳配列(“ＵＴＲ”)、５’キャップおよび／または配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)、発現させるべき核酸およびポリＡテイルを含む構築物を産生するための特別に設計されたプライマーを用いる鋳型のインビトロ転写(ＩＶＴ)、続くポリＡ付加を含む。このように産生されたＲＮＡは、異なる種の細胞を効率的にトランスフェクトできる。一つの面において、鋳型はＣＡＲのための配列を含む。
ある面において、抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)によりコードされる。一つの面において、抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするｍＲＮＡを、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ ＮＫ細胞の産生のために免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に導入する。
ある態様において、インビトロ転写ＲＮＡ ＣＡＲを、一過性トランスフェクションの形で細胞に導入できる。ＲＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により産生した鋳型を使用してインビトロ転写により産生する。任意の供給源からの目的のＤＮＡを、適切なプライマーおよびＲＮＡポリメラーゼを使用して、ＰＣＲによりインビトロｍＲＮＡ合成のための鋳型に直接変換できる。ＤＮＡの供給源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列またはＤＮＡのあらゆる他の適切な供給源であり得る。インビトロ転写のための所望の鋳型は、本発明のＣＡＲである。例えば、ＲＮＡ ＣＡＲのための鋳型は、抗腫瘍抗体の一本鎖可変ドメイン；ヒンジ領域、膜貫通ドメイン(例えば、ＣＤ８ａの膜貫通ドメイン)；および例えば、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質領域を含む細胞外領域を含む。
ある態様において、ＰＣＲに使用するＤＮＡは、オープンリーディングフレームを含む。ＤＮＡは、生物のゲノムからの天然に存在するＤＮＡ配列由来であり得る。ある態様において、核酸は、５’および／または３’非翻訳領域(ＵＴＲ)の一部または全てを含み得る。核酸はエクソンおよびイントロンを含み得る。ある態様において、ＰＣＲに使用するＤＮＡはヒト核酸配列である。他の態様において、ＰＣＲに使用するＤＮＡは５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含むヒト核酸配列である。ＤＮＡは、あるいは天然に存在する生物で通常発現されない人工ＤＮＡ配列であり得る。代表的人工ＤＮＡ配列は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームをコードするために一緒にライゲートされた遺伝子の部分を含むものである。一緒にライゲートされたＤＮＡの部分は、単一生物由来でも、１種を超える生物由来でもよい。
ＰＣＲを使用して、トランスフェクションに使用するｍＲＮＡのインビトロ転写のための鋳型を産生する。ＰＣＲを実施する方法は、当分野で周知である。ＰＣＲにおいて使用するためのプライマーは、ＰＣＲで鋳型として使用するＤＮＡの領域に実質的に相補的である領域を有するように設計する。ここで使用する“実質的に相補的”は、プライマー配列における塩基の大部分または全てが相補的であるかまたは１以上の塩基が非相補的またはミスマッチである、ヌクレオチド配列をいう。実質的に相補的な配列は、ＰＣＲに使用するアニーリング条件下、意図するＤＮＡ標的とアニールまたはハイブリダイズできる。プライマーは、ＤＮＡ鋳型の任意の部分と実質的に相補的であるように設計できる。例えば、プライマーは、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含む、細胞において通常転写される(オープンリーディングフレーム)核酸の部分を増幅するように設計できる。プライマーはまた目的の特定のドメインをコードする核酸の部分を増幅するようにも設計できる。ある態様において、プライマーは、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲの全てまたは一部を含む、ヒトｃＤＮＡのコード領域を増幅するように設計される。ＰＣＲに有用なプライマーは、当分野で周知である合成方法により産生できる。“順方向プライマー”は、増幅すべきＤＮＡ配列の上流にある、ＤＮＡ鋳型上のヌクレオチドに実質的に相補的であるヌクレオチドの領域を含むプライマーである。“上流”は、コード鎖に対して増幅すべきＤＮＡ配列に対する５’位置をいう。“逆方向プライマー”は、増幅すべきＤＮＡ配列の下流である、二本鎖ＤＮＡ鋳型に実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。“下流”は、コード鎖に対して増幅すべきＤＮＡ配列に対する３’位置をいう。
ＰＣＲのために有用なあらゆるＤＮＡポリメラーゼを、ここに開示する方法に使用できる。試薬およびポリメラーゼは、多数の業者から入手可能である。
安定性および／または翻訳効率を促進する能力を有する化学構造も使用し得る。ＲＮＡは、好ましくは５’および３’ ＵＴＲを有する。ある態様において、５’ ＵＴＲは１〜３０００ヌクレオチド長である。コード領域に付加すべき５’および３’ ＵＴＲ配列の長さは、ＵＴＲの異なる領域にアニールするＰＣＲのためのプライマーの設計を含む、がこれに限定されない、異なる方法毎に変わり得る。この方法を使用して、当業者は、転写ＲＮＡのトランスフェクト後の最適翻訳効率を達成するのに必要な５’および３’ ＵＴＲ長を修飾できる。
５’および３’ ＵＴＲは、天然に存在する、目的の核酸のための内因性５’および３’ ＵＴＲであり得る。あるいは、目的の核酸に内在性ではないＵＴＲ配列を、順方向および逆方向プライマーへのＵＴＲ配列の取り込みまたは鋳型のその他の修飾により付加できる。目的の核酸に内在性ではないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率の修飾のために有用であり得る。例えば、３’ ＵＴＲ配列におけるＡＵリッチ要素がｍＲＮＡの安定性を低下させ得ることが知られる。それゆえに、３’ ＵＴＲを、当分野で周知である、ＵＴＲの特性に基づく転写ＲＮＡの安定性の増加のために選択または設計できる。
ある態様において、５’ ＵＴＲは、内在性核酸のコザック配列を含み得る。あるいは、目的の核酸に内在性ではない５’ ＵＴＲを上記のようにＰＣＲで付加するとき、コンセンサスコザック配列を、５’ ＵＴＲ配列の付加により再設計できる。コザック配列は、あるＲＮＡ転写物の翻訳効率を高め得るが、効率的翻訳を可能とするために全ＲＮＡで必要であるとは考えられない。多くのｍＲＮＡについてのコザック配列の必要性は当分野で知られる。他の態様において、５’ ＵＴＲは、ＲＮＡゲノムが細胞において安定であるＲＮＡウイルスの５’ ＵＴＲであり得る。他の態様において、種々のヌクレオチドアナログを、ｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨害するように３’または５’ ＵＴＲで使用できる。
遺伝子クローニングの必要性なしにＤＮＡ鋳型からＲＮＡの合成を可能とするために、転写のプロモーターを、転写される配列の上流でＤＮＡ鋳型に結合しなければならない。ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーターとして機能する配列を順方向プライマーの５’末端に添加したとき、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、転写されるオープンリーディングフレームの上流でＰＣＲ産物に取り込まれるようになる。ある好ましい態様において、プロモーターは、本明細書の他の箇所に記載するような、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターは、Ｔ３およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むが、これらに限定されない。Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６プロモーターのためのコンセンサスヌクレオチド配列は、当分野で知られる。
好ましい態様において、ｍＲＮＡは、リボソーム結合、翻訳開始および細胞における安定性を決定する、５’末端および３’ポリ(Ａ)テイルの両者にキャップを有する。環状ＤＮＡ鋳型、例えば、プラスミドＤＮＡにおいて、ＲＮＡポリメラーゼは、真核細胞での発現に不適な長い鎖状産物を産生する。３’ ＵＴＲの末端で直線化したプラスミドＤＮＡの転写は、転写後にポリアデニル化されても真核トランスフェクトに有効ではない、通常サイズのｍＲＮＡをもたらす。
直鎖状ＤＮＡ鋳型において、ファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、転写物の３’末端を、鋳型の最後の塩基を越えて伸長できる(Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13 :6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270: 1485-65 (2003))。
ＤＮＡ鋳型へのポリＡ／Ｔストレッチの組込みの従来の方法は分子クローニングである。しかしながら、プラスミドＤＮＡへのポリＡ／Ｔ配列の統合はプラスミドを不安定にする可能性があり、これが、細菌細胞から得たプラスミドＤＮＡ鋳型がしばしば欠失および他の異常により高度に汚染されているかの理由である。これは、クローニング法を面倒で時間がかかるものとするだけでなく、しばしば信頼できないものとする。これは、クローニングなしでポリＡ／Ｔ ３’ストレッチを伴うＤＮＡ鋳型の構築を可能とする方法が非常に望まれるかの理由である。
ポリＡ／Ｔストレッチは、分子クローニングによりＤＮＡ鋳型(例えば、プラスミド)に統合できる。あるいは、転写性ＤＮＡ鋳型のポリＡ／Ｔセグメントを、１００Ｔテイル(配列番号１１０)(サイズは５０〜５０００Ｔ(配列番号１１１)であり得る)のようなポリＴテイルを含む逆方向プライマーを使用してＰＣＲ中にまたは、ＤＮＡライゲーションまたはインビトロ組換えを含むが、これらに限定されないその他の方法により、ＰＣＲ後に産生できる。ポリ(Ａ)テイルはまたＲＮＡに安定性を与え、その分解を減らす。一般に、ポリ(Ａ)テイルの長さは、転写ＲＮＡの安定性と正に相関する。ある態様において、ポリ(Ａ)テイルは１００〜５０００アデノシンである(配列番号１１２)。
ＲＮＡのポリ(Ａ)テイルは、大腸菌ポリＡポリメラーゼ(Ｅ−ＰＡＰ)のようなポリ(Ａ)ポリメラーゼの使用により、インビトロ転写後にさらに伸長できる。ある態様において、ポリ(Ａ)テイルの長さの１００ヌクレオチドから３００〜４００ヌクレオチド(配列番号１１３)への延長は、ＲＮＡの翻訳効率の約２倍増加をもたらす。さらに、３’末端への異なる化学基の結合は、ｍＲＮＡ安定性を増加できる。このような結合は、修飾／人工ヌクレオチド、アプタマーおよび他の化合物を含み得る。例えば、ＡＴＰアナログを、ポリ(Ａ)ポリメラーゼを使用して、ポリ(Ａ)テイルに統合できる。ＡＴＰアナログは、さらに、ＲＮＡの安定性を増加できる。
５’キャップもまたＲＮＡ分子に安定性を提供する。好ましい態様において、ここに開示の方法により産生したＲＮＡは５’キャップを含む。５’キャップは当分野で知られ、ここに記載する技術を使用して提供される(Cougot, et al, Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al, RNA, 7: 1468-95 (2001); Elango, et al, Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005))。
ここに開示の方法により産生されたＲＮＡはまた配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)配列も含み得る。ＩＲＥＳ配列は、ｍＲＮＡへのキャップ非依存的リボソーム結合を開始し、翻訳の開始を促進する、あらゆるウイルス配列、染色体配列または人工的に設計した配列であり得る。糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤および界面活性剤のような、細胞透過性および生存能を促進する因子を含むことができる、細胞エレクトロポレーションに適するあらゆる溶質が含まれ得る。
ＲＮＡを、多数の異なる方法、例えば、エレクトロポレーション(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems, Cologne, Germany))、(ECM 830 (BTX)(Harvard Instruments, Boston, Mass.)またはGene Pulser II(Biorad, Denver, Colo.)、Multiporator(Eppendort, Hamburg Germany)、リポフェクションを使用するカチオン性リポソーム介在トランスフェクト、ポリマー封入、ペプチド介在トランスフェクトまたは“遺伝子銃”のような微粒子銃粒子送達系を含むが、これらに限定されない、商業的に入手可能な方法のいずれかを使用して、標的細胞に統合できる(例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)参照)。
非ウイルス性送達法
ある面において、非ウイルス性の方法を使用して、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸を細胞または組織または対象に送達できる。
ある態様において、非ウイルス性の方法は、トランスポゾン(転位因子とも呼ばれる)の使用を含む。ある態様において、トランスポゾンは、ゲノムにおけるある場所にそれ自体挿入できる一片のＤＮＡ、例えば、自己複製し、そのコピーをゲノムに挿入できる一片のＤＮＡまたは長い核酸から切り出され、ゲノムの他の場所に挿入され得る一片のＤＮＡである。例えば、トランスポゾンは、転位のための遺伝子に隣接した逆方向反復からなるＤＮＡ配列である。
トランスポゾンを使用する核酸送達の代表的方法は、Sleeping Beauty トランスポゾン系(ＳＢＴＳ)およびpiggyBac(ＰＢ)トランスポゾン系を含む。例えば、全てを引用により本明細書に包含させる、Aronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20; Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971; Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580-589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):1200-1209; Kebriaei et al. Blood. 122.21(2013):166; Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16; Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65; and Ding et al. Cell. 122.3(2005):473-83参照。
ＳＢＴＳは、１)導入遺伝子を含むトランスポゾンおよび２)トランスポサーゼ酵素の供給源の２成分を含む。トランスポサーゼは、担体プラスミド(または他のドナーＤＮＡ)からのトランスポゾンを、宿主細胞染色体／ゲノムのような標的ＤＮＡに転置できる。例えば、トランスポサーゼは担体プラスミド／ドナーＤＮＡに結合し、トランスポゾン(導入遺伝子を含む)をプラスミドから切り出し、それを宿主細胞のゲノムに導入する。例えば、Aronovich et al. supra参照。
代表的トランスポゾンは、ｐＴ２ベースのトランスポゾンを含む。例えば、全てを引用により本明細書に包含させる、Grabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41.3(2013):1829-47；およびSingh et al. Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971参照。代表的トランスポサーゼは、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒタイプトランスポサーゼ、例えば、ＳＢ１０トランスポサーゼまたはＳＢ１１トランスポサーゼ(例えば、サイトメガロウイルスプロモーターから発現され得る、高活性トランスポサーゼ)を含む。例えば、全てを引用により本明細書に包含させる、Aronovich et al.; Kebriaei et al.；およびGrabundzija et al.参照。
ＳＢＴＳの使用は、導入遺伝子、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸の効率的組込みおよび発現を可能にする。例えば、ＳＢＴＳのようなトランスポゾン系を使用する、ここに記載するＣＡＲを安定に発現する細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を産生する方法をここに提供する。
ここに記載する方法によって、ある態様において、ＳＢＴＳ要素を含む１以上の核酸、例えば、プラスミドを、細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)に送達する。例えば、核酸は、核酸(例えば、プラスミドＤＮＡ)送達の標準法、例えば、ここに記載する方法、例えば、エレクトロポレーション、トランスフェクションまたはリポフェクションにより送達される。ある態様において、核酸は、導入遺伝子、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸を含むトランスポゾンを含む。ある態様において、核酸は、導入遺伝子(例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸)を含むトランスポゾンならびにトランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列を含む。他の態様において、２核酸を伴う系、例えば、第一プラスミドが導入遺伝子を含むトランスポゾンを含み、第二プラスミドがトランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列を含む、例えば、デュアル−プラスミド系を提供する。例えば、第一および第二核酸は、宿主細胞に共送達される。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、ＳＢＴＳを使用する遺伝子挿入と、ヌクレアーゼ(例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ＺＦＮ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系または操作メガヌクレアーゼ再設計ホーミングエンドヌクレアーゼ)を使用する遺伝子エディティングの組み合わせを使用することにより、産生される。
ある態様において、非ウイルス性の送達法の使用は、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の再プログラムおよび対象への細胞の直接注入を可能にする。非ウイルスベクターの利点は、容易性および比較的低コストでの患者集団に見合う十分量の産生、貯蔵中の安定性および免疫原性欠如を含むが、これらに限定されない。
ＣＡＲをコードする核酸構築物
本発明はまた、１以上のここに記載するＣＡＲ構築物をコードする核酸分子を提供する。一つの面において、核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。一つの面において、核酸分子はＤＮＡ構築物として提供される。
従って、ある面において、本発明は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)をコードする単離された核酸分子に関し、ここで、ＣＡＲは、抗ＣＤ１９結合ドメイン(例えば、ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメイン)、膜貫通ドメインおよび刺激ドメイン、例えば、共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ゼータ鎖を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、ここに記載する抗ＣＤ１９結合ドメイン、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号５９からなる群から選択される配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む抗ＣＤ１９結合ドメインである。ある態様において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインである。ある態様において、膜貫通ドメインは、配列番号１５の配列を含むまたはそれと９５〜９９％同一性を有する配列である。ある態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、ヒンジ領域、例えば、ここに記載するヒンジにより膜貫通ドメインに接続する。ある態様において、ヒンジ領域は、配列番号１４または配列番号４５または配列番号４７または配列番号４９またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、単離された核酸分子は、さらに共刺激ドメインをコードする配列を含む。ある態様において、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)および４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインである。ある態様において、共刺激ドメインは、配列番号１６の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１６または配列番号５１の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列および配列番号１７の配列または配列番号４３またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は同じフレームに、かつ単一ポリペプチド鎖として発現される。
他の面において、本発明は、配列番号１３のリーダー配列、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号５９からなる群から選択される配列(またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)を有するｓｃＦｖドメイン、配列番号１４または配列番号４５または配列番号４７または配列番号４９(またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)のヒンジ領域、配列番号１５の配列(またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)を有する膜貫通ドメイン、配列番号１６の配列を有する４−１ＢＢ共刺激ドメインまたは配列番号５１の配列(またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)を有するＣＤ２７共刺激ドメインおよび配列番号１７または配列番号４３の配列(またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)を有するＣＤ３ゼータ刺激ドメインを含む、単離されたＣＡＲをコードする核酸分子構築物に関する。
他の面において、本発明は、核酸分子によりコードされる、単離されたポリペプチド分子に関する。ある態様において、単離されたポリペプチド分子は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号５９からなる群から選択される配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
他の面において、本発明は、抗ＣＤ１９結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)分子によりコードされる核酸分子に関し、該抗ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号５９からなる群から選択される配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
ある態様において、コードされるＣＡＲ分子は、さらに共刺激ドメインをコードする配列を含む。ある態様において、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)および４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)からなる群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインである。ある態様において、共刺激ドメインは配列番号１６の配列を含む。ある態様において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインである。ある態様において、膜貫通ドメインは、配列番号１５の配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよびゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１６の配列および配列番号１７の配列を含み、ここで、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は同じフレームに、かつ単一ポリペプチド鎖として発現される。ある態様において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、ヒンジ領域により膜貫通ドメインに連結される。ある態様において、ヒンジ領域は配列番号１４を含む。ある態様において、ヒンジ領域は配列番号４５または配列番号４７または配列番号４９を含む。
他の面において、本発明は、配列番号１３のリーダー配列、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号５９からなる群から選択される配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を有するｓｃＦｖドメイン、配列番号１４または配列番号４５または配列番号４７または配列番号４９のヒンジ領域、配列番号１５の配列を有する膜貫通ドメイン、配列番号１６の配列を有する４−１ＢＢ共刺激ドメインまたは配列番号５１の配列を有するＣＤ２７共刺激ドメインおよび配列番号１７または配列番号４３の配列を有するＣＤ３ゼータ刺激ドメインを含む、コードされるＣＡＲ分子に関する。ある態様において、コードされるＣＡＲ分子は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２および配列番号５９からなる群から選択される配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
所望の分子をコードする核酸配列は、標準技術を使用する、例えば核酸分子を発現する細胞からのライブラリーのスクリーニング、それを含むことが知られるベクターからの核酸分子の導出またはそれを含む細胞および組織から直接の単離のような、当分野で知られる組み換え方法を使用して得ることができる。あるいは、目的の遺伝子を、クローン化ではなくむしろ合成的に製造できる。
本発明はまた本発明のＤＮＡが導入されている、ベクターも提供する。レンチウイルスのようなレトロウイルス由来のベクターは、導入遺伝子の長期の安定な組込みおよび娘細胞へのその伝播を可能にするため、長期遺伝子移入の達成に適当なツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞のような非増殖細胞に形質導入できるため、マウス白血病ウイルスのようなオンコレトロウイルス由来のベクターを超えるさらなる利点を有する。それらはまた低免疫原性のさらなる利点も有する。レトロウイルスベクターは、例えば、ガンマレトロウイルスベクターであり得る。ガンマレトロウイルスベクターは、例えば、プロモーター、パッケージングシグナル(ψ)、プライマー結合部位(ＰＢＳ)、１以上(例えば、２)の末端反復配列(ＬＴＲ)および目的の導入遺伝子、例えば、ＣＡＲをコードする遺伝子を含み得る。ガンマレトロウイルスベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖのようなウイルス構造的遺伝子を欠き得る。代表的ガンマレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス(ＭＬＶ)、脾フォーカス形成ウイルス(ＳＦＦＶ)および骨髄増殖性肉腫ウイルス(ＭＰＳＶ)およびそれ由来のベクターを含む。他のガンマレトロウイルスベクターは、例えば、Tobias Maetzig et al., “Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application” Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713に記載される。
他の態様において、所望の本発明のＣＡＲをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター(Ａ５／３５)である。他の態様において、ＣＡＲをコードする核酸の発現は、sleeping beautyのようなトランスポゾン、crisper、ＣＡＳ９および亜鉛フィンガーヌクレアーゼを使用して達成できる。June et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716参照。引用により、これを本明細書に包含させる。
概要において、天然または合成ＣＡＲをコードする核酸の発現は、一般にＣＡＲポリペプチドまたはその一部をコードする核酸をプロモーターに操作可能に連結させ、該構築物を発現ベクターに取り込むことにより、達成される。ベクターは、真核生物での複製および組込みに適し得る。典型的クローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の制御に有用な転写および翻訳ターミネーター、開始配列およびプロモーターを含む。
本発明の発現構築物はまた、標準遺伝子送達プロトコールを使用する核酸免疫化および遺伝子治療のためにも使用できる。遺伝子送達のための方法は当分野で知られる。例えば、引用によりその全体を本明細書に包含させる、米国特許５,３９９,３４６号、５,５８０,８５９号、５,５８９,４６６号参照。他の態様において、本発明は、遺伝子治療ベクターを提供する。
核酸を、多数のタイプのベクターにクローン化できる。例えば、核酸を、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルスおよびコスミドを含むが、これらに限定されないベクターにクローン化できる。特に興味深いベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ産生ベクターおよびシークエンシングベクターを含む。
さらに、発現ベクターを、ウイルスベクターの形で細胞に提供してよい。ウイルスベクターテクノロジーは当分野で周知であり、例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NYおよび他のウイルス学および分子生物学手引き書に記載されている。ベクターとして有用なウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスを含むが、これらに限定されない。一般に、適当なベクターは、少なくとも１つの生物で機能的な複製起点、プロモーター配列、簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位および１以上の選択可能マーカーを含む(例えば、ＷＯ０１／９６５８４号；ＷＯ０１／２９０５８号；および米国特許６,３２６,１９３号)。
多数のウイルスベースの系が、哺乳動物細胞のトランスフェクトのために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための簡便なプラットフォームを提供する。選択した遺伝子を、当分野で知られる技術を使用して、ベクターに挿入し、レトロウイルス粒子に充填できる。次いで、組み換えウイルスを単離し、インビボまたはエクスビボで対象の細胞に送達できる。多数のレトロウイルス系が、当分野で知られる。ある態様において、アデノウイルスベクターを使用する。多数のアデノウイルスベクターが、当分野で知られる。ある態様において、レンチウイルスベクターを使用する。
さらなるプロモーター要素、例えば、エンハンサーが、転写開始の頻度を制御する。一般に、これらは、開始部位の領域３０〜１１０bp上流に位置するが、多数のプロモーターが、開始部位の下流に同様に機能的要素を含むことが示されている。プロモーター要素間の間隙はしばしば可動性であり、そうして、要素が互いに倒置したときまたは入れ替わったときに、プロモーター機能が保持される。チミジンキナーゼ(ｔｋ)プロモーターにおいて、プロモーター要素間の間隙は、活性が低下し始める前に５０bp離れるまで増加し得る。プロモーターによって、個々の要素が、転写を活性化するために協調的にまたは独立して機能できる。代表的プロモーターは、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣまたはホスホグリセロキナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターを含む。
哺乳動物Ｔ細胞においてＣＡＲ導入遺伝子の発現が可能なプロモーターの例は、ＥＦ１ａプロモーターである。天然のＥＦ１ａプロモーターは、アミノアシルｔＲＮＡのリボソームへの酵素送達を担う伸長因子−１複合体のアルファサブユニットの発現である。ＥＦ１ａプロモーターは、哺乳動物発現プラスミドで広く使用されており、レンチウイルスベクターにクローン化された導入遺伝子からのＣＡＲ発現の駆動に有効であることが示されている。例えば、Milone et al., Mol. Ther. 17 (8): 1453-1464 (2009)参照。一つの面において、ＥＦ１ａプロモーターは、配列番号１００として提供する配列を含む。
プロモーターの他の例は、最初期サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それと操作可能に連結したあらゆるポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動できる強い構成的プロモーター配列である。しかしながら、サルウイルス４０(ＳＶ４０)初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス(ＭＭＴＶ)、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)末端反復配列(ＬＴＲ)プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターならびにアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子−１αプロモーター、ヘモグロビンプロモーターおよびクレアチンキナーゼプロモーターを含むが、これらに限定されないヒト遺伝子プロモーターを含むが、これらに限定されない他の構成的プロモーター配列も使用し得る。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に制限されるべきではない。誘導性プロモーターも、本発明の一部として意図される。誘導性プロモーターの使用は、操作可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現を、その発現が望まれるとき、オンにでき、または発現が望まれないとき、その発現をオフにできる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例は、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターおよびテトラサイクリンプロモーターを含むが、これらに限定されない。
ベクターはまた、例えば、分泌を促進するためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナルおよび転写ターミネーター(例えば、ウシ成長ホルモン(ＢＧＨ)遺伝子から)、エピソーム複製および原核生物における複製を可能にする要素(例えばＳＶ４０起源およびＣｏｌＥ１または当分野で知られるその他)および／または選択を可能にする要素(例えば、アンピシリン耐性遺伝子および／またはゼオシンマーカー)も含み得る。
ＣＡＲポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入すべき発現ベクターはまた、ウイルスベクターによるトランスフェクトまたは感染が求められる細胞の集団からの、発現細胞の同定および選択を容易にするために、選択可能マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子または両者も含み得る。他の面において、選択可能マーカーは、ＤＮＡの別々の断片上で実施でき、共トランスフェクション過程において使用し得る。選択可能マーカーおよびレポーター遺伝子の両者は、宿主細胞における発現を可能とするために適切な制御性配列が隣接し得る。有用な選択可能マーカーは、例えば、ｎｅｏのような抗生物質耐性遺伝子などを含む。
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞の同定および制御性配列の機能性の評価のために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織に存在しないかまたはそれにより発現されず、発現がある容易に検出可能な特性により、例えば、酵素活性により顕在化されるポリペプチドをコードする、遺伝子をいう。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後適当な時点でアッセイする。適当なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼまたは緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含み得る(例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82)。適当な発現系は周知であり、既知技術を使用して製造しても、商業的に得てもよい。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小５’フランキング領域を伴う構築物を、プロモーターとして同定する。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結され、プロモーター駆動転写を調節する能力について薬剤の評価のために使用し得る。
細胞に遺伝子を導入し、発現させる方法は当分野で知られる。発現ベクターの状況において、ベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母または昆虫細胞に、当分野の任意の方法により容易に導入できる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的または生物学的手段により、宿主細胞に移入される。
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、微量注入、エレクトロポレーションなどを含む。ベクターおよび／または外来性核酸を含む細胞を産生する方法は、当分野で周知である。例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NY参照。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入に好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
宿主細胞に目的のポリヌクレオチドを導入するための生物学的方法は、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えば、ヒト細胞への遺伝子挿入に最も広く使用される方法となってきている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許５,３５０,６７４号および５,５８５,３６２号参照。
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段は、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズおよび水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質ベースの系のようなコロイド分散体系を含む。インビトロおよびインビボで送達媒体として使用するための代表的コロイド系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。標的化ナノ粒子または他の適当なサブミクロンサイズの送達系を用いるポリヌクレオチドの送達のような、最新式の核酸の標的化送達の他の方法が利用可能である。
非ウイルス送達系を利用する場合、代表的送達媒体はリポソームである。脂質製剤の使用は、宿主細胞への核酸の導入のために意図される(インビトロ、エクスビボまたはインビボ)。他の面において、核酸は、脂質と結合され得る。脂質と結合した核酸は、リポソームの水性内部への被包、リポソームの脂質二重層内への分散、リポソームとオリゴヌクレオチドの両者と結合する連結分子を介するリポソームへの結合、リポソームへの封入、リポソームとの複合体化、脂質含有溶液への分散、脂質との混合、脂質との組み合わせ、脂質中の懸濁液としての包含、ミセル内への包含または複合体化または他の方法で脂質と結合する。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター結合組成物は、溶液中の何らかの特定の構造に限定されない。例えば、それらは、二重層構造において、ミセルとしてまたは“崩壊”構造を有して存在し得る。それらはまた単に溶液に分散され、恐らく、サイズまたは形が均一ではない凝集体を形成し得る。脂質は、天然に存在するまたは合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質は、細胞質に天然に生じる脂肪滴ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドのような長鎖脂肪族炭化水素を含む化合物群およびその誘導体を含む。
使用するのに適する脂質は、業者から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン(“ＤＭＰＣ”)は、Sigma, St. Louis, MOから得ることができ、リン酸ジセチル(“ＤＣＰ”)はK & K Laboratories(Plainview, NY)から得ることができ、コレステロール(“Choi”)はCalbiochem-Behringから得ることができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール(“ＤＭＰＧ”)および他の脂質は、Avanti Polar Lipids, Inc.(Birmingham, AL)から得ることができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール内の脂質の原液を、約−２０℃で保存できる。クロロホルムを、メタノールよりも容易に揮発するために、唯一の溶媒として使用する。“リポソーム”は、封入された脂質二重層または凝集体の産生により形成される、多様な単および多重層脂質媒体を包含する一般的用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部水性媒体を備えた小胞構造を有するとして特徴付けできる。多重層リポソームは、水性媒体により分離される複数脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁されたときに、自然に形成される。脂質要素は、閉構造の形成前に自己再構成し、水を封入し、脂質二重層間に溶質を溶解する(Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10)。しかしながら、通常の小胞構造と異なる構造を溶液中で有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造と仮定してよく、または脂質分子の不均一性の凝集体として存在する。また考慮されるのは、リポフェクタミン−核酸複合体である。
外来性核酸を宿主細胞に導入するまたはそうでなければ細胞を本発明の阻害剤に曝す方法に関係なく、宿主細胞における組み換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、多様なアッセイを行い得る。このようなアッセイは、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲのような当業者に周知の“分子生物学的”アッセイ、例えば、免疫学的手段(ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット)によりまたは本発明の範囲内に入る薬剤を同定するためのここに記載するアッセイにより、特定のペプチドの存在または不在を検出するような“生化学的”アッセイを含む。
本発明は、さらにＣＡＲコード化核酸分子を含むベクターを提供する。一つの面において、ＣＡＲベクターは、細胞、例えば、Ｔ細胞に直接形質導入できる。一つの面において、ベクターは、クローニングまたは発現ベクター、例えば、１以上のプラスミド(例えば、発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、二重分染色体)、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物を含むが、これらに限定されない、ベクターである。一つの面において、ベクターは、哺乳動物Ｔ細胞におけるＣＡＲ構築物の発現が可能である。一つの面において、哺乳動物Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。
細胞の供給源
増殖および遺伝子修飾または他の修飾前に、細胞、例えば、Ｔ細胞またはナチュラルキラー(ＮＫ)細胞の供給を対象から得ることができる。用語“対象”は、免疫応答が惹起され得る、生存生物(例えば、哺乳動物)を含むと意図される。対象の例は、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、マウス、ラットおよびそのトランスジェニック種を含む。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織および腫瘍を含む、多くの供給源から得られる。
本開示のある面において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞は、FicollTM分離のような、当業者に知られる任意の数の技術を使用して、対象から採取された血液のユニットから得ることができる。ある好ましい面において、個体の循環血からの細胞を、アフェレシスにより得る。アフェレシス産物は、一般に、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球および血小板を含む、リンパ球を含む。ある面において、アフェレシスにより収集した細胞を、血漿フラクションを除去するために、および、所望により、続く処理段階のために、細胞を適切な緩衝液または媒体に加え、洗浄してよい。ある態様において、細胞をリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)で洗浄する。別の態様において、洗浄溶液はカルシウムを欠き、マグネシウムを欠いてよくまたは全てではないにしても多くの二価カチオンを欠いてよい。
カルシウム非存在下の初期活性化段階は、活性化を増大させ得る。当業者には容易に認識されるように、洗浄工程は、製造者の指示に従い、半自動化“フロースルー”遠心(例えば、Cobe 2991 cell processor、Baxter CytoMateまたはHaemonetics Cell Saver 5)を使用するような、当業者に知られる方法により達成し得る。洗浄後、細胞を、例えば、無Ｃａ、無ＭｇＰＢＳ、PlasmaLyte Aまたは緩衝剤を用いるまたは用いない他の食塩水溶液のような、多様な生体適合性緩衝液に再懸濁できる。あるいは、アフェレシスサンプルの望ましくない要素を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁してよい。
ある面において、赤血球を溶解し、例えば、PERCOLLＴＭ勾配を介する遠心または対向流遠心溶出法により単球を枯渇させることにより、末梢血リンパ球からＴ細胞を単離する。
ここに記載する方法は、例えば、ここに記載する、例えば、負の選択手法を使用する、Ｔ制御細胞枯渇集団、ＣＤ２５＋枯渇細胞である、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の特異的亜集団の、例えば、セレクションである。好ましくは、Ｔ制御枯渇細胞の集団は、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含む。
ある態様において、Ｔ制御細胞、例えば、ＣＤ２５＋ Ｔ細胞を、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド、ＩＬ−２を使用して集団から除去する。ある態様において、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドを基質、例えば、ビーズに結合するかまたは他に基質、例えば、ビーズに被覆させる。ある態様において、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントを、ここに記載するように基質に結合する。
ある態様において、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋ Ｔ細胞を、MiltenyiＴＭからのＣＤ２５枯渇剤を使用して集団から除去する。ある態様において、細胞対ＣＤ２５枯渇剤の比は１ｅ７細胞対２０μLまたは１ｅ７細胞対１５μLまたは１ｅ７細胞対１０μLまたは１ｅ７細胞対５μLまたは１ｅ７細胞対２.５μLまたは１ｅ７細胞対１.２５μLである。ある態様において、例えば、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋枯渇のために、５億細胞／mlを使用する。さらなる面において、６億、７億、８億または９億細胞／mlの細胞濃度を使用する。
ある態様において、枯渇する免疫エフェクター細胞の集団は、約６×１０９ ＣＤ２５＋ Ｔ細胞を含む。他の面において、枯渇する免疫エフェクター細胞の集団は、約１×１０９〜１×１０１０およびその間の任意の整数値のＣＤ２５＋ Ｔ細胞を含む。ある態様において、得られた集団Ｔ制御枯渇細胞は、２×１０９ Ｔ制御細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞またはそれ未満(例えば、１×１０９、５×１０８、１×１０８、５×１０７、１×１０７またはそれ未満のＣＤ２５＋細胞)を有する。
ある態様において、Ｔ制御細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞を、例えば、チュービング１６２−０１のような、枯渇チュービングを備えたCliniMAC系を使用して、集団から除去する。ある態様において、CliniMAC系を、例えば、DEPLETION2.1のような、枯渇設定で使用する。
特定の理論に拘束されないが、アフェレシス前またはＣＡＲ発現細胞産物の製造中の対象における免疫細胞の負のレギュレーターのレベルの減少(例えば、望まない免疫細胞、例えば、Ｔｒｅｇ細胞の数の減少)は、対象が再発するリスクを減らし得る。例えば、Ｔｒｅｇ細胞を枯渇する方法は当分野で知られる。Ｔｒｅｇ細胞を減少させる方法は、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体(ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体)、ＣＤ２５枯渇およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
ある態様において、製造法は、ＣＡＲ発現細胞製造前のＴｒｅｇ細胞の数の減少(例えば、枯渇)を含む。例えば、製造法は、例えば、サンプル、例えば、アフェレシスサンプルと抗ＧＩＴＲ抗体および／または抗ＣＤ２５抗体(またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド)を接触させ、ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)産物の製造前にＴｒｅｇ細胞を枯渇させることを含む。
ある態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞産物製造のための細胞採取前にＴｒｅｇ細胞を減らす１以上の治療で前処置されており、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置中に再発するリスクを低減する。ある態様において、Ｔｒｅｇ細胞を低減する方法は、対象へのシクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇またはこれらの組み合わせの１以上の投与を含むが、これらに限定されない。シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇またはこれらの組み合わせの１以上の投与は、ＣＡＲ発現細胞産物注入前、間または後に行い得る。
ある態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞産物製造のための細胞の採取前にシクロホスファミドで前処置され、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置を再発するリスクを軽減する。ある態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞産物製造のための細胞の採取前に抗ＧＩＴＲ抗体で前処置され、それにより対象がＣＡＲ発現細胞処置を再発するリスクを軽減する。
ある態様において、除去すべき細胞の集団は、制御性Ｔ細胞または腫瘍細胞ではなく、ＣＡＲＴ細胞の増殖および／または機能に他に負に影響する細胞、例えばＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ１５または潜在的免疫抑制性細胞により発現される他のマーカーを発現する細胞である。ある態様において、このような細胞は、制御性Ｔ細胞および／または腫瘍細胞と同時にまたは該枯渇後にまたは他の順番で除去することが意図される。
ここに記載する方法は、１を超える選択工程、例えば、１を超超える枯渇工程を含み得る。負の選択によるＴ細胞集団の富化は、例えば、負に選択される細胞に独特な表面マーカーに対する抗体の組み合わせにより、達成できる。一つの方法は、負に選択される細胞に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用する、負の磁性免疫粘着またはフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択である。例えば、負の選択によりＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を含み得る。
ここに記載する方法は、さらに、集団から腫瘍抗原、例えば、ＣＤ２５を含まない腫瘍抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂを発現する細胞を除去し、それにより、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲの発現に適するＴ制御枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇および腫瘍抗原枯渇細胞の集団を提供することを含む。ある態様において、腫瘍抗原発現細胞は、Ｔ制御、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗腫瘍抗原抗体またはそのフラグメントを、細胞の除去に使用できる同じ基質、例えば、ビーズに結合してよく、または抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたは抗腫瘍抗原抗体またはそのフラグメントを別々のビーズに結合でき、それらの混合物は、細胞の除去に使用できる。他の態様において、Ｔ制御細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去および腫瘍抗原発現細胞の除去は連続的であり、例えば、いずれの順番でも生じ得る。
チェックポイント阻害剤、例えば、ここに記載するチェックポイント阻害剤を発現する細胞、例えば、ＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞およびＴＩＭ３＋細胞の１以上を集団から除去し、それにより、Ｔ制御枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇細胞およびチェックポイント阻害剤枯渇細胞、例えば、ＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋および／またはＴＩＭ３＋枯渇細胞の集団を提供する方法も提供する。代表的チェックポイント阻害剤は、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−１、ＣＤ１６０、Ｐ１Ｈ、２Ｂ４、ＰＤ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡおよびＬＡＩＲ１を含む。ある態様において、チェックポイント阻害剤発現細胞は、Ｔ制御、例えば、ＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗チェックポイント阻害剤抗体またはそのフラグメントを、細胞または抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントの除去に使用できるのと同じビーズに使用でき、そして、抗チェックポイント阻害剤抗体またはそのフラグメントを別のビーズに結合でき、その混合物を細胞の除去に使用できる。他の態様において、Ｔ制御細胞、例えば、ＣＤ２５＋細胞の除去およびチェックポイント阻害剤発現細胞の除去は連続的であり、例えば、いずれの順番でも生じ得る。
ここに記載する方法は、正の選択工程を含み得る。例えば、Ｔ細胞は、所望のＴ細胞の正の選択に十分な時間、DYNABEADS(登録商標)M-450 CD3/CD28 Tのような抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８(例えば、３ｘ２８)結合ビーズとインキュベーションすることにより単離できる。ある態様において、時間は約３０分である。さらなる態様において、時間は３０分〜３６時間またはそれより長い範囲およびその間の任意の整数値である。さらなる態様において、時間は少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間または６時間である。さらに他の態様において、時間は１０〜２４時間、例えば、２４時間である。腫瘍組織または免疫無防備状態個体から腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ)を単離するような、他の細胞型と比較してＴ細胞が少ないあらゆる状況において、Ｔ細胞を単離するために長いインキュベーション時間が使用され得る。さらに、長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の捕獲効率を高め得る。そうして、Ｔ細胞がＣＤ３／ＣＤ２８ ビーズと結合できる時間を単に短くまたは長くするおよび／またはビーズ対Ｔ細胞の比を増加または減少することにより(さらにここに記載するとおり)、Ｔ細胞の亜集団は、培養開始時または工程中の他の時点で優先的に選択または抑制される。さらに、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体の比を増加または減少させることにより、Ｔ細胞の亜集団は、培養開始時または工程中の他の時点で優先的に選択または抑制される。
ある態様において、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、グランザイムＢおよびパーフォリンまたは他の適切な分子、例えば、他のサイトカインの１以上を発現するＴ細胞集団を選択できる。細胞発現をスクリーニングする方法は、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１３／１２６７１２号に記載の方法により決定できる。
正のまたは負の選択により細胞の所望の集団を単離するために、細胞の濃度および表面(例えば、ビーズのような粒子)は変わり得る。ある面において、細胞とビーズの最大接触を確実にするために、ビーズと細胞を一緒に混合する体積を顕著に低下させる(例えば、細胞濃度を増加させる)ことが望まれ得る。例えば、ある面において、１００億細胞／ml、９０億／ml、８０億／ml、７０億／ml、６０億／mlまたは５０億／mlの濃度が使用される。ある面において、１０億細胞／mlの濃度が使用される。さらにある面において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万または１億細胞／mlの細胞濃度が使用される。さらなる面において、１億２５００万または１億５千万細胞／mlの濃度が使用され得る。
高濃度の使用は、細胞収量、細胞活性化および細胞増殖を増加させ得る。さらに、高細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞のような目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞または多くの腫瘍細胞が存在するサンプル(例えば、白血病血液、腫瘍組織など)からのより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞集団は、治療的価値を有し得て、得ることが望まれる。例えば、高濃度の細胞の使用は、通常弱いＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋ Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
関連する面において、低濃度の細胞の使用が望まれることがある。Ｔ細胞と表面(例えば、ビーズのような粒子)の混合物を顕著に希釈することにより、粒子と細胞の相互作用が最小化される。これは、粒子に結合させる所望の抗原を高い量で発現する細胞のために選択される。例えば、ＣＤ４よりも効率的に捕獲される。ある面において、使用する細胞の濃度は５×１０６／mlである。他の面において、使用する濃度は約１×１０５／ml〜１×１０６／mlおよびその間の任意の整数値であり得る。
他の面において、細胞を、２〜１０℃または室温で、種々の時間、種々の速度で、回転子上でインキュベートし得る。
刺激のためのＴ細胞を、洗浄工程後も凍結できる。理論に拘束されないが、凍結と続く解凍工程は、細胞集団における顆粒球およびある程度の単球の除去により、より均一な産物を提供する。血漿および血小板を除く洗浄工程後、細胞を凍結溶液に懸濁し得る。多くの凍結溶液およびパラメータが当分野で知られ、この状況において有用であるが、一つの方法は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミンを含むＰＢＳまたは１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７.５％ＤＭＳＯまたは３１.２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、３１.２５％デキストロース５％、０.４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７.５％ＤＭＳＯを含む培養培地または例えば、ＨｅｓｐａｎおよびＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含む他の適当な細胞凍結媒体の使用を含み、次いで、細胞を、−８０℃で１°／分の速度で凍結させ、液体窒素貯蔵タンクの気相中に保存する。制御凍結の他の方法ならびに即時に−２０℃または液体窒素中の未制御凍結を使用し得る。
ある面において、本発明の方法を使用する活性化前に、ここに記載するように凍結保存細胞を解凍し、洗浄し、１時間、室温で休息させる。
本発明の状況においてまた意図されるのは、ここに記載する増殖させた細胞が必要となる前の時点での、対象からの血液サンプルまたはアフェレシス産物の採取である。したがって、ここに記載するような免疫エフェクター細胞治療により利益を得るいくつもの疾患または状態の免疫エフェクター細胞治療における後の使用のために、増殖させるべき細胞の供給源を、必要な任意の時点で採取し、Ｔ細胞のような所望の細胞を単離し、凍結しておくことができる。ある面において、血液サンプルまたはアフェレシスは、一般に健常対象から採取される。ある面において、血液サンプルまたはアフェレシスは、疾患を発症するリスクがあるが、まだ疾患を発症していない健常対象から採取され、目的の細胞は、その後の使用のために単離および凍結される。ある面において、Ｔ細胞を、増殖し、凍結し、後の時点で使用し得る。ある面において、サンプルを、ここに記載する特定の疾患の診断直後に、しかし、何らかの処置前に患者から採取する。さらなる面において、細胞を、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびＦＫ５０６のような免疫抑制剤、キャンパス、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８および照射のような抗体または他の免疫除去因子のような因子での処置を含むが、これらに限定されない、多くの関連する処置法の前に、対象からの血液サンプルまたはアフェレシスから単離する。
本発明のさらなる面において、Ｔ細胞を、対象に機能的Ｔ細胞を残す処置後、直接患者から得る。これについて、ある癌処置、特に免疫系を損傷させる薬物での処置後、患者が通常該処置から回復するであろう期間のすぐ後、得られるＴ細胞の品質は、エクスビボで増殖する能力について、最適であるかまたは改善されている可能性がある。同様に、ここに記載する方法を使用するエクスビボ操作後、これらの細胞は、増強された移植生着およびインビボ増殖のために好ましい状態であり得る。そうして、この回復相間の、Ｔ細胞、樹状細胞または造血細胞系譜の他の細胞を含む血液細胞の採取が、本発明の状況において意図される。さらに、ある面において、可動化(例えば、ＧＭ−ＣＳＦでの可動化)および条件づけレジメンを使用して、特に、治療後規定された時間枠の間、特定の細胞型の再増殖、再循環、再分化および／または増殖が支持される状態を作ることができる。細胞型の説明的例は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞および免疫系の他の細胞を含む。
ある態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する免疫エフェクター細胞を、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤を受けている対象から得る。ある態様において、ＣＡＲを発現するように操作した免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の集団を、対象におけるまたは対象から採取したＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞のレベルまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比が、少なくとも一過性に、増加しているように、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤の投与から十分な時間経過後または十分な用量の投与後に、採取する。
他の態様において、ＣＡＲを発現するように操作したまたは操作する免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の集団を、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の数を増加させるかまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の比を増加させる量のｍＴＯＲ阻害剤と接触させることにより、エクスビボで処置できる。
ある態様において、Ｔ細胞集団は、ジアシルグリセロールキナーゼ(ＤＧＫ)欠損である。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫ ＲＮＡもしくはタンパク質を発現しない、またはＤＧＫ活性が低下もしくは阻止されている細胞を含む。ＤＧＫ欠損細胞は、遺伝学的方法で、例えば、ＤＧＫ発現を低下または阻止するための、ＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの投与により産生できる。あるいは、ＤＧＫ欠損細胞は、ここに記載するＤＧＫ阻害剤での処理により産生できる。
ある態様において、Ｔ細胞集団はイカロス欠損である。イカロス欠損細胞は、イカロスＲＮＡもしくはタンパク質を発現しないまたはイカロス活性が低下もしくは阻止されている細胞を含み、イカロス欠損細胞は、遺伝学的方法で、例えば、イカロス発現を低下または阻止するための、ＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの投与により産生できる。あるいは、イカロス欠損細胞は、イカロス阻害剤、例えば、レナリドマイドでの処理により産生できる。
ある態様において、Ｔ細胞集団はＤＧＫ欠損およびイカロス欠損であり、例えば、ＤＧＫおよびイカロスを発現しないかまたはＤＧＫおよびイカロス活性が低下または阻止されている。このようなＤＧＫおよびイカロス欠損細胞は、ここに記載する方法のいずれかにより産生できる。
ある態様において、ＮＫ細胞は、対象から得られる。他の態様において、ＮＫ細胞はＮＫ細胞株、例えば、ＮＫ−９２細胞株(Conkwest)である。
同種ＣＡＲ
ここに記載する態様において、免疫エフェクター細胞は同種免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞であり得る。例えば、細胞は、同種Ｔ細胞、例えば、機能的Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)および／またはヒト白血球抗原(ＨＬＡ)、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIの発現を欠く同種Ｔ細胞であり得る。
機能的ＴＣＲを欠くＴ細胞は、例えば、その表面に機能的ＴＣＲを何も発現しないように操作されるか、機能的ＴＣＲを含む１以上のサブユニットを発現しないように操作されるかまたはその表面にごくわずかな機能的ＴＣＲしか産生しないように操作され得る。あるいは、Ｔ細胞は、例えば、ＴＣＲのサブユニットの１以上の変異型または切断型の発現により、実質的に障害されたＴＣＲを発現できる。用語“実質的に障害されたＴＣＲ”は、このＴＣＲが、宿主に有害免疫反応を誘発しないことを意味する。
ここに記載するＴ細胞は、例えば、その表面に機能的ＨＬＡを発現しないように操作できる。例えば、ここに記載するＴ細胞は、細胞表面発現ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIが下方制御されるように操作される。
ある態様において、Ｔ細胞は、機能的ＴＣＲおよび機能的ＨＬＡ、例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIを欠き得る。
機能的ＴＣＲおよび／またはＨＬＡの発現を欠く修飾Ｔ細胞は、ＴＣＲまたはＨＬＡの１以上のサブユニットのノックアウトまたはノックダウンを含む、あらゆる適当な手段により得ることができる。例えば、Ｔ細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(ＣＲＩＳＰＲ)転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用する、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡのノックダウンを含み得る。
ある態様において、同種細胞は、例えばここに記載するいずれかの方法により、阻害分子を発現しないまたは低レベルで発現する細胞である。例えば、細胞は、例えば、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始する能力を低下させ得る、阻害分子を発現しないまたは低レベルで発現する細胞である。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータを含む。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害による阻害分子の阻害は、ＣＡＲ発現細胞性能を最適化できる。いくつかの態様において、例えば、ここに記載する、阻害核酸、例えば、阻害核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(palindromic repeat)(ＣＲＩＳＰＲ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用できる。
ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するためのｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ
ある態様において、ＴＣＲ発現および／またはＨＬＡ発現を、Ｔ細胞におけるＴＣＲおよび／またはＨＬＡをコードする核酸を標的とするｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを使用して阻害できる。
Ｔ細胞におけるｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの発現は、例えば、レンチウイルス発現系のような、任意の慣用発現系を使用して達成できる。
ＴＣＲの成分の発現を下方制御する代表的ｓｈＲＮＡは、例えば、米国公開公報２０１２／０３２１６６７号に記載されている。ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスII遺伝子の発現を下方制御する代表的ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、例えば、米国公開公報２００７／００３６７７３号に記載されている。
ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ
ここで使用する“ＣＲＩＳＰＲ”または“ＴＣＲおよび／またはＨＬＡに対するＣＲＩＳＰＲ”または“ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害するためのＣＲＩＳＰＲ”は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートのセットまたはこのようなセットの反復を含む系をいう。ここで使用する“Ｃａｓ”は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をいう。“ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ”系は、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ遺伝子の発現抑制または変異に使用できるＣＲＩＳＰＲおよびＣａｓ由来の系である。
天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、配列決定された真正細菌ゲノムの約４０％および配列決定された古細菌の９０％で見られる。Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8:172。この系は、プラスミドおよびファージのような外来性遺伝成分に対する抵抗性を付与し、獲得免疫の一形態を提供する、原核生物免疫系の一タイプである。Barrangou et al. (2007) Science 315:1709-1712; Marragini et al. (2008) Science 322:1843-1845。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、マウスまたは霊長類のような真核生物における遺伝子編集(特異的遺伝子のサイレンシング、促進または変更)に使用するために修飾されている。Wiedenheft et al. (2012) Nature 482:331-8。これは、真核細胞に、特別に設計されたＣＲＩＳＰＲおよび１以上の適切なＣａｓを含むプラスミドを導入することにより達成される。
ＣＲＩＳＰＲ座位と呼ばれることもあるＣＲＩＳＰＲ配列は、交互の反復およびスペーサーを含む。天然に存在するＣＲＩＳＰＲにおいて、スペーサーは、通常プラスミドまたはファージ配列のような細菌に外来性の配列を含み、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系において、スペーサーはＴＣＲまたはＨＬＡ遺伝子配列に由来する。
ＣＲＩＳＰＲ座位からのＲＮＡは、構成的に発現され、Ｃａｓタンパク質により小ＲＮＡに加工される。これらは、反復配列が隣接したスペーサーを含む。ＲＮＡは、他のＣａｓタンパク質が、ＲＮＡまたはＤＮＡレベルで外来性遺伝成分を発現抑制するよう導く。Horvath et al. (2010) Science 327:167-170; Makarova et al. (2006) Biology Direct 1:7。スペーサーは、それゆえに、ｓｉＲＮＡと類似して、ＲＮＡ分子の鋳型として働く。Pennisi (2013) Science 341:833-836。
これらが多くの異なるタイプの細菌で天然に存在するため、ＣＲＩＳＰＲの正確な配置ならびにＣａｓ遺伝子およびその産物の構造、機能および数は種毎にいくぶん異なる。Haft et al. (2005) PLoS Comput. Biol. 1: e60; Kunin et al. (2007) Genome Biol. 8: R61; Mojica et al. (2005) J. Mol. Evol. 60: 174-182; Bolotin et al. (2005) Microbiol. 151: 2551-2561; Pourcel et al. (2005) Microbiol. 151: 653-663；およびStern et al. (2010) Trends. Genet. 28: 335-340。例えば、Ｃｓｅ(Ｃａｓサブタイプ、大腸菌)タンパク質(例えば、ＣａｓＡ)は機能的複合体であるＣａｓｃａｄｅを形成し、これは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ転写物を、Ｃａｓｃａｄｅを保持するスペーサー反復単位に加工する。Brouns et al. (2008) Science 321:960-964。他の原核生物において、Ｃａｓ６はＣＲＩＳＰＲ転写物を処理する。大腸菌におけるＣＲＩＳＰＲベースのファージ不活性化はＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓ３を必要とするが、Ｃａｓ１またはＣａｓ２は必要としない。パイロコッカス・フリオサスおよび他の原核生物におけるＣｍｒ(Cas RAMPモジュール)タンパク質は、小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと機能的複合体を形成し、これは相補的標的ＲＮＡを認識し、切断する。より単純なＣＲＩＳＰＲ系はタンパク質Ｃａｓ９に依存し、これは、二重らせんの各鎖それぞれに対する２の活性切断部位を有するヌクレアーゼである。Ｃａｓ９と修飾ＣＲＩＳＰＲ座位ＲＮＡの組み合わせは、遺伝子編集のための系において使用できる。Pennisi (2013) Science 341:833-836。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、それゆえに、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡ遺伝子の編集(塩基対の付加または除去)または未成熟終止の導入に使用でき、こうしてＴＣＲおよび／またはＨＬＡの発現を減少させる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、あるいはＲＮＡ干渉のように使用でき、可逆性様式でＴＣＲおよび／またはＨＬＡ遺伝子を遮断する。哺乳動物細胞において、例えば、ＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質をＴＣＲおよび／またはＨＬプロモーターに誘導し、ＲＮＡポリメラーゼを立体的に遮断できる。
当分野で知られるテクノロジー、例えば、米国公開２０１４００６８７９７号およびCong (2013) Science 339: 819-823に記載のものを使用して、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害する人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を産生できる。例えば、Tsai (2014) Nature Biotechnol., 32:6 569-576、米国特許８,８７１,４４５号；８,８６５,４０６号；８,７９５,９６５号；８,７７１,９４５号；および８,６９７,３５９号に記載されるもののような、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害する当分野で知られる他の人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系も産生できる。
ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害するためのＴＡＬＥＮ
“ＴＡＬＥＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲに対するＴＡＬＥＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するためのＴＡＬＥＮ”は、ＨＬＡ遺伝子および／またはＴＣＲ遺伝子の編集に使用できる人工ヌクレアーゼである転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼをいう。
ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ切断ドメインへの融合により人為的に産生される。転写アクティベーター様効果(ＴＡＬＥ)は、ＨＬＡ遺伝子またはＴＣＲ遺伝子の一部を含む任意の所望のＤＮＡ配列と結合するよう操作できる。操作したＴＡＬＥとＤＮＡ切断ドメインを合わせることにより、ＨＬＡまたはＴＣＲ配列を含む、任意の所望のＤＮＡ配列に特異的な制限酵素が産生できる。次いで、これらを細胞に導入でき、ここで、それらをゲノム編集のために使用できる。Boch (2011) Nature Biotech. 29:135-6;およびBoch et al. (2009) Science 326:1509-12; Moscou et al. (2009) Science 326:3501。
ＴＡＬＥは、キサントモナス細菌により分泌されるタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは、反復した、１２番目および１３番目のアミノ酸以外、高度に保存された３３〜３４アミノ酸配列を含む。これらの２箇所は高度に可変であり、特定のヌクレオチド認識と強い相関を示す。こうして、これらを所望のＤＮＡ配列と結合するように操作できる。
ＴＡＬＥＮを産生するために、ＴＡＬＥタンパク質を、野生型または変異ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼであるヌクレアーゼ(Ｎ)と融合させる。ＦｏｋＩの数変異がＴＡＬＥＮにおけるその使用のために行われており、これらは、例えば、切断特異性または活性を改善する。Cermak et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39: e82; Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8; Hockemeyer et al. (2011) Nature Biotech. 29: 731-734; Wood et al. (2011) Science 333: 307; Doyon et al. (2010) Nature Methods 8: 74-79; Szczepek et al. (2007) Nature Biotech. 25: 786-793；およびGuo et al. (2010) J. Mol. Biol. 200: 96。
ＦｏｋＩドメインは二量体として機能し、正確な配向および間隔を有する標的ゲノム内の部位のための独特のＤＮＡ結合ドメインを有する２の構築物を必要とする。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ切断ドメインの間のアミノ酸残基数および２の個々のＴＡＬＥＮ結合部位間の塩基数の両者が、高レベルの活性を達成するための重要なパラメータであると考えられる。Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29:143-8。
ＨＬＡまたはＴＣＲ ＴＡＬＥＮは、二本鎖切断(ＤＳＢ)を産生するために細胞内で使用できる。修復機構が、非相同末端連結により切断を不適切に修復するならば、切断部位に変異を導入できる。例えば、不適当な修復は、フレームシフト変異を導入し得る。あるいは、外来ＤＮＡを、ＴＡＬＥＮと共に細胞に導入でき、外来ＤＮＡの配列および染色体配列によって、この過程を、ＨＬＡ遺伝子またはＴＣＲ遺伝子における欠損を矯正するかまたはｗｔ ＨＬＡ遺伝子またはＴＣＲ遺伝子へこのような欠損を導入し、そうしてＨＬＡまたはＴＣＲの発現を減少させるのに使用できる。
ＨＬＡまたはＴＣＲにおける配列に特異的なＴＡＬＥＮを、モジュラー成分を使用する多様なスキームを含む、当分野で知られる任意の方法を使用して構築できる。Zhang et al. (2011) Nature Biotech. 29:149-53; Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6:e19509。
ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するための亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
“ＺＦＮ”または“亜鉛フィンガーヌクレアーゼ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲに対するＺＦＮ”または“ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するためのＺＦＮ”は、ＨＬＡ遺伝子および／またはＴＣＲ遺伝子の編集に使用できる人工ヌクレアーゼである亜鉛フィンガーヌクレアーゼである。
ＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインに融合したＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン(またはその誘導体)を含む。ＺＦＮの場合、ＤＮＡ結合ドメインは、１以上の亜鉛フィンガーを含む。Carroll et al. (2011) Genetics Society of America 188: 773-782；およびKim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160。
亜鉛フィンガーは、１以上の亜鉛イオンにより安定化された小タンパク質構造モチーフである。亜鉛フィンガーは、例えば、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２を含み、約３bp配列を認識できる。既知特異性の多様な亜鉛フィンガーを組み合わせて、約６bp、９bp、１２bp、１５bpまたは１８bp配列を認識する多フィンガーポリペプチドを産生できる。ファージディスプレイ、酵母ワンハイブリッド系、細菌ワンハイブリッドおよびツーハイブリッド系および哺乳動物細胞を含む、特異的配列を認識する亜鉛フィンガー(およびこれらの組み合わせ)を産生する多様な選択およびモジュラー組立技術が入手可能である。
ＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮは、ＤＮＡを切断するために二量体化しなければならない。それゆえに、非パリンドロームＤＮＡ部位を標的とするためにＺＦＮの対が必要である。２の個々のＺＦＮは、適切な間隔のそれらのヌクレアーゼにより、ＤＮＡの逆鎖に結合するはずである。Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10570-5。
またＴＡＬＥＮと同様、ＺＦＮはＤＮＡに二本鎖切断を作ることができ、これは、不適切に修復されたならばフレームシフト変異を作り、細胞におけるＨＬＡおよび／またはＴＣＲの発現および量を減少させる。ＺＦＮはまたＨＬＡ遺伝子またはＴＣＲ遺伝子を変異するための相同組換えと共に使用できる。
ＨＬＡおよび／またはＴＣＲにおける配列に特異的なＺＦＮは、当分野で知られる任意の方法を使用して構築できる。例えば、Provasi (2011) Nature Med. 18: 807-815; Torikai (2013) Blood 122: 1341-1349; Cathomen et al. (2008) Mol. Ther. 16: 1200-7; Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 400: 96；米国特許公開２０１１／０１５８９５７号；および米国特許公開２０１２／００６０２３０号参照。
テロメラーゼ発現
何らかの特定の理論に拘束されないが、ある態様において、治療的Ｔ細胞は、Ｔ細胞における短縮されたテロメアのために、患者における残留性が短く、したがって、テロメラーゼ遺伝子を用いるトランスフェクションは、Ｔ細胞のテロメアを延長し、患者におけるＴ細胞の残留性を改善し得る。Carl June, “Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic”, Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007)参照。それゆえに、ある態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、異所性にテロメラーゼサブユニットを、例えば、テロメラーゼの触媒的サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴ発現する。ある面において、本開示は、細胞とテロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒的サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を接触させることを含む、ＣＡＲ発現細胞を産生する方法を提供する。細胞を、ＣＡＲをコードする構築物と接触させる前に、同時にまたは後に核酸と接触させ得る。
一つの面において、本開示は、免疫エフェクター細胞の集団(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を製造する方法に関する。ある態様において、本方法は、免疫エフェクター細胞の集団(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を提供し、免疫エフェクター細胞の集団とＣＡＲをコードする核酸を接触させ、そして、免疫エフェクター細胞の集団とテロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸を、ＣＡＲおよびテロメラーゼ発現を可能とする条件下に接触させることを含む。
ある態様において、テロメラーゼサブユニットをコードする核酸はＤＮＡである。ある態様において、テロメラーゼサブユニットをコードする核酸は、テロメラーゼサブユニットの発現を駆動できるプロモーターを含む。
ある態様において、ｈＴＥＲＴは、GenBank Protein ID AAC51724.1のアミノ酸配列を有し(Meyerson et al., “hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization” Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795)、次のとおりである。
ある態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号１３１の配列と配列少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を有する。ある態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号１３１の配列を有する。ある態様において、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端または両方に欠失(例えば、５、１０、１５、２０または３０アミノ酸を超えない)を含む。ある態様において、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端または両方にトランスジェニックアミノ酸配列(例えば、５、１０、１５、２０または３０アミノ酸を超えない)を含む。
ある態様において、ｈＴＥＲＴは、GenBank Accession No. AF018167の核酸配列によりコードされる(Meyerson et al., “hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization” Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795)。
ある態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号６４の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６、９７％、９８％または９９％同一である配列を有する核酸によりコードされる。ある態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号６４の核酸によりコードされる。
免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞)の活性化および増殖
Ｔ細胞のような免疫エフェクター細胞は、例えば、米国特許６,３５２,６９４号；６,５３４,０５５号；６,９０５,６８０号；６,６９２,９６４号；５,８５８,３５８号；６,８８７,４６６号；６,９０５,６８１号；７,１４４,５７５号；７,０６７,３１８号；７,１７２,８６９号；７,２３２,５６６号；７,１７５,８４３号；５,８８３,２２３号；６,９０５,８７４号；６,７９７,５１４号；６,８６７,０４１号；および米国特許出願公開２００６０１２１００５号に記載する方法を使用して、一般的に活性化および増殖できる。
造血幹および前駆細胞のエクスビボ増殖は、引用により本明細書に包含させる米国特許５,１９９,９４２号に記載され、本発明の細胞に適用できる。他の適当な方法は当分野で知られ、それゆえに本発明は、細胞のエクスビボ増殖なんらかの特定の方法に限定されない。簡潔には、Ｔ細胞のエクスビボ培養および増殖は、(１)哺乳動物の採取した末梢血または骨髄外植片からＣＤ３４＋造血幹および前駆細胞を採取し；そして(２)このような細胞をエクスビボで増殖することを含む。米国特許５,１９９,９４２号に記載の細胞増殖因子に加えて、ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−３およびｃ−ｋｉｔリガンドのような他の因子を細胞の培養および増殖に使用し得る。
一般に、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ制御性細胞枯渇細胞の集団、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤が結合した表面と、Ｔ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを接触させることにより増殖させ得る。特に、Ｔ細胞集団は、表面上に固定化した抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントまたは抗ＣＤ２抗体と接触させるかまたはカルシウムイオノフォアと共にタンパク質キナーゼＣアクティベーター(例えば、ブリオスタチン)と接触させることによるような、ここに記載するように刺激させ得る。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子と結合するリガンドを使用する。例えば、Ｔ細胞の集団を、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適当な条件下、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させ得る。ＣＤ４＋ Ｔ細胞またはＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を使用できる。抗ＣＤ２８抗体の例は９.３、Ｂ−Ｔ３を含み、ＸＲ−ＣＤ２８(Diaclone, Besancon, France)を、当分野で一般に知られる他の方法と同様にに使用できる(Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999)。
ある面において、Ｔ細胞のための一次刺激性シグナルおよび共刺激シグナルは、異なるプロトコールにより提供され得る。例えば、各シグナルを提供する薬剤は溶液中でも、表面に結合していてもよい。表面に結合しているとき、薬剤は同じ表面に結合していても(すなわち、“ｃｉｓ”形式)、別の表面に結合していても(すなわち、“ｔｒａｎｓ”形式)よい。あるいは、一方の薬剤が表面に結合し、他方の薬剤が溶液にあってもよい。ある面において、共刺激シグナルを提供する薬剤は細胞表面に結合し、一次活性化シグナルを提供する薬剤は溶液中にあるかまたは表面に結合する。ある面において、両薬剤は溶液中にある。ある面において、薬剤は可溶性形態であり、そうして、Ｆｃ受容体または抗体または薬剤と結合する他の結合剤を発現する細胞のような、表面に架橋する。これについて、例えば、本発明におけるＴ細胞の活性化および増殖における使用が意図される人工抗原提示細胞(ａＡＰＣ)に関する米国特許出願公開２００４０１０１５１９号および２００６００３４８１０号を参照のこと。
ある面において、二剤をビーズに、同じビーズ上に、すなわち、“ｃｉｓ”で、または異なるビーズに、すなわち、“ｔｒａｎｓ”で固定化する。例として、一次活性化シグナルを提供する薬剤は抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメントであり、共刺激シグナルを提供する薬剤は抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合フラグメントであり、両剤を、等価な分子量で同じビーズに共固定化する。ある面において、ＣＤ４＋ Ｔ細胞増殖およびＴ細胞増殖のために、ビーズに結合した各抗体の１：１比が使用される。本発明のある面において、１：１比を使用して観察される増殖と比較して、Ｔ細胞増殖が増加するように、ビーズに結合した抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体比を使用する。ある特定の面において、１：１比を使用して観察される増殖と比較して、約１〜約３倍の増加が観察される。ある面において、ビーズに結合したＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は１００：１〜１：１００の範囲およびその間の任意の整数値である。ある面において、抗ＣＤ３抗体より多い抗ＣＤ２８抗体が粒子に結合し、すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８の比は１未満である。ある面において、ビーズに結合した抗ＣＤ２８抗体：抗ＣＤ３抗体の比は２：１より大きい。ある特定の面において、ビーズに結合した１：１００ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体が使用される。ある面において、ビーズに結合した１：７５ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体が使用される。さらなる面において、ビーズに結合した１：５０ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体が使用される。ある面において、ビーズに結合した１：３０ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体が使用される。ある好ましい面において、ビーズに結合した１：１０ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体が使用される。ある面において、ビーズに結合した１：３ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体が使用される。さらにある面において、ビーズに結合した３：１ ＣＤ３：ＣＤ２８比の抗体が使用される。
１：５００〜５００：１およびその間の任意の整数値の粒子対細胞の比を、Ｔ細胞または他の標的細胞の刺激に使用し得る。当業者には容易に認識できるとおり、粒子対細胞比は、標的細胞に対する粒子径に依存し得る。例えば、小さいサイズのビーズは少ない数の細胞しか結合できず、一方大きなビーズはたくさん結合できる。ある面において、粒子対細胞比は、１：１００〜１００：１およびその間の任意の整数値の範囲であり、さらなる面において、比は１：９〜９：１およびその間の任意の整数値を含み、これをまたＴ細胞の刺激に使用できる。Ｔ細胞刺激をもたらす抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８結合粒子対Ｔ細胞比は上記のとおり変わり得るが、しかしながらある好ましい値は、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１および１５：１を含み、一つの好ましい比は、少なくとも１：１粒子対Ｔ細胞である。ある面において、１：１またはそれ未満の粒子対細胞比が使用される。ある特定の面において、好ましい粒子：細胞比は１：５である。さらなる面において、粒子対細胞比は、刺激の日により異なり得る。例えば、ある面において、粒子対細胞比は、第一日目は１：１〜１０：１であり、その後１０日目まで連日または隔日でさらなる粒子を細胞に添加し、最終比は１：１〜１：１０である(添加日の細胞数に基づく)。ある特定の面において、粒子対細胞比は、刺激第一日目は１：１であり、刺激の３日目および５日目に１：５に調節する。ある面において、第一日の最終比１：１および刺激の３日目および５日目の１：５を基に、連日または隔日で粒子を添加する。ある面において、粒子対細胞比は、刺激の第一日目は２：１であり、刺激の３日目および５日目に１：１０に調節する。ある面において、第一日の最終比１：１および刺激の３日目および５日目の１：１０を基に、連日または隔日で粒子を添加する。多様な他の比が本発明で使用するのに適し得ることは当業者には認識される。特に、比は、粒子径および細胞サイズおよびタイプにより変わる。ある面において、使用するための最も典型的比は、第一日目の１：１、２：１および３：１付近である。
さらなる面において、Ｔ細胞のような細胞を薬剤被覆ビーズと組み合わせ、ビーズおよび細胞をその後分離し、次いで細胞を培養する。別の面において、培養前に、薬剤被覆ビーズおよび細胞を分離せず、一緒に培養する。さらなる面において、ビーズおよび細胞を、磁力のような力の適用によりまず濃縮し、細胞表面マーカーのライゲーションを増加させ、それにより細胞刺激を誘導する。
例として、細胞表面タンパク質を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が結合した常磁性ビーズ(３ｘ２８ビーズ)とＴ細胞を接触させることにより、ライゲートし得る。一つの面において、細胞(例えば、１０４〜１０９ Ｔ細胞)およびビーズ(例えば、DYNABEADS(登録商標)M-450 CD3/CD28 T常磁性ビーズを１：１比)を、緩衝液、例えばＰＢＳ(カルシウムおよびマグネシウムのような二価カチオン不含)中で合わせる。再び、任意の細胞濃度を使用し得ることは当業者には容易に認識され得る。例えば、標的細胞は、サンプル中に極めて稀であり、サンプルの０.０１％しか含まれないかまたはサンプル全体(すなわち、１００％)が目的の標的細胞で構成され得る。したがって、あらゆる細胞数が本発明の文脈と一体となる。ある面において、細胞と粒子の最大接触を確実にするために、粒子および細胞を混合する体積を顕著に減少させる(すなわち、細胞の濃度を高める)ことが望ましいことがある。例えば、一つの面において、約１００億細胞／ml、９０億／ml、８０億／ml、７０億／ml、６０億／ml、５０億／mlまたは２０億細胞／mlの濃度を使用する。一つの面において、１億細胞／ml超を使用する。さらなる面において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万または５０００万細胞／mlの細胞濃度を使用する。さらなる面において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万または１億細胞／mlの細胞濃度を使用する。さらなる面において、１億２５００万または１億５０００万細胞／mlをの濃度使用できる。高濃度を使用して、細胞収率、細胞活性化および細胞増殖を増加できる。さらに、高細胞濃度の使用はＣＤ２８陰性Ｔ細胞のような目的の標的抗原を弱く発現し得る細胞のより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞の集団は、治療的価値を有し得て、得ることが望まれる。例えば、高濃度の細胞の使用は、通常ＣＤ２８発現が弱いＣＤ８＋ Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
ある態様において、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸が形質導入された細胞は、例えば、ここに記載する方法により増幅される。ある態様において、細胞は、複数時間(例えば、約２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、１８時間、２１時間)〜約１４日までの期間(例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日または１４日)の培養により増殖される。ある態様において、細胞は４〜９日の期間増殖される。ある態様において、細胞は８日またはそれ未満の期間、例えば、７日、６日または５日増殖される。ある態様において、細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲ細胞は、５日の培養で増殖され、得られた細胞は、同じ培養条件下で９日培養により増殖された同じ細胞よりも強力である。効力は、例えば、種々のＴ細胞機能、例えば増殖、標的細胞死滅、サイトカイン産生、活性化、遊走またはこれらの組み合わせにより規定される。ある態様において、５日増殖された細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下で９日培養により増殖された細胞と比較して、抗原刺激による細胞倍加の少なくとも１倍、２倍、３倍または４倍増加がある。ある態様において、細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲを発現する細胞は５日の培養で増殖され、同じ培養条件下で９日培養により増殖された細胞と比較して、得られた細胞は、高い炎症誘発性サイトカイン産生、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルを有する。ある態様において、５日増殖された細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲ細胞は、同じ培養条件下で９日培養により増殖された細胞と比較して、炎症誘発性サイトカイン産生は、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルで、pg／mlにおいて少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍またはそれ以上の増加がある。
Ｔ細胞の培養時間が６０日またはそれ以上であり得るように、数サイクルの刺激も望まれ得る。Ｔ細胞培養のための適切な条件は、血清(例えば、ウシ胎児またはヒト血清)、インターロイキン−２(ＩＬ−２)、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβおよびＴＮＦ−αまたは当業者に知られる細胞の増殖用のその他の添加剤を含む、増殖および生存能のために必要な因子を含み得る、適切な媒体(例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ−ｖｉｖｏ １５(Lonza))を含む。細胞の増殖のための他の添加剤は、界面活性剤、プラスマネートならびにＮ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノールのような還元剤を含むが、これらに限定されない。培地は、無血清または適切な量の血清(または血漿)が添加されたまたは規定されたセットのホルモンおよび／またはＴ細胞の増殖および拡大に十分な量のサイトカインが添加された、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンが添加されたＲＰＭＩ １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ １５およびＸ−Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを含み得る。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは実験的培養においてのみ包含され、対象に注入すべき細胞の培養には含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件、例えば、適切な温度(例えば、３７℃)および雰囲気(例えば、空気＋５％ＣＯ２)で維持される。
ある態様において、細胞は、例えば、フローサイトメトリーのようなここに記載する方法により測定して、１４日の増殖期間にわたり、細胞の少なくとも２００倍(例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍)増加をもたらす１以上のインターロイキンを含む、適切な培地(例えば、ここに記載する培地)で増殖させる。ある態様において、細胞は、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７(例えば、ＩＬ−１５およびＩＬ−７)の存在下増殖させる。
複数の態様において、ここに記載する方法、例えば、ＣＡＲ発現細胞製造法は、Ｔ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋ Ｔ細胞を、例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド、ＩＬ−２を使用して、細胞集団から除去することを含む。細胞集団からＴ制御性細胞、例えば、ＣＤ２５＋ Ｔ細胞を除去する方法は、ここに記載される。複数の態様において、方法、例えば、製造法は、さらに細胞集団(例えば、ＣＤ２５＋ Ｔ細胞のようなＴ制御性細胞が枯渇されている細胞集団；または抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドと前に接触された細胞集団)とＩＬ−１５および／またはＩＬ−７の接触を含む。例えば、細胞集団(例えば、抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドと先に接触されている)を、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７の存在下で増殖させる。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、インターロイキン−１５(ＩＬ−１５)ポリペプチド、インターロイキン−１５受容体アルファ(ＩＬ−１５Ｒａ)ポリペプチドまたはＩＬ−１５ポリペプチドとＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの組み合わせ、例えば、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物を、ＣＡＲ発現細胞の製造中、例えば、エクスビボで接触させる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造中、例えば、エクスビボで、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造中、例えば、エクスビボで、ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５ Ｒａポリペプチドの両者の組合せを含む組成物と接触させる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造中、例えば、エクスビボで、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と接触させる。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、エクスビボ増殖中、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と接触させる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、エクスビボ増殖中、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、エクスビボ増殖中、ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両者を含む組成物と接触させる。ある態様において、接触は、リンパ球亜集団、例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の生存および増殖をもたらす。
種々の刺激時間に曝されているＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。例えば、典型的な血液またはアフェレシスした末梢血単核細胞産物は、細胞毒性またはサプレッサーＴ細胞集団(ＴＣ、ＣＤ８＋)より大きいヘルパーＴ細胞集団(ＴＨ、ＣＤ４＋)を有する。ＣＤ３およびＣＤ２８受容体での刺激によるＴ細胞のエクスビボ増殖は、約８〜９日目前まで主にＴＨ細胞からなるＴ細胞の集団を産生するが、約８〜９日目後、Ｔ細胞の集団は、徐々に大きくなるＴＣ細胞の集団を含む。したがって、処置の目的によって、対象に、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を注入することは有利であり得る。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離されているならば、このサブセットを大きな程度まで増殖させることが有利であり得る。
さらに、ＣＤ４およびＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーは、細胞増殖過程の経過中に、顕著に、しかし大部分、再現性よく変化する。そうして、このような再現性は、特異的な目的のために活性化Ｔ細胞産物をあつらえる能力を可能とする。
他の態様において、ここに開示する製造方法は、さらに免疫エフェクター細胞の集団とテロメラーゼサブユニットをコードする核酸、例えば、ｈＴＥＲＴを接触させることを含む。テロメラーゼサブユニットをコードする核酸はＤＮＡであり得る。
ある態様において、キナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)を、ＣＡＲ細胞製造過程中に添加する。ここでの非限定的理論に従い、キナーゼ阻害剤は、産生される細胞の集団の品質を改善できる。例えば、ＣＡＲ発現細胞は、しばしば、癌患者自身の血漿アフェレシスサンプルから産生され、これは、癌細胞を含み、キナーゼ阻害剤がこれらの癌細胞(例えば、ＣＬＬまたはＭＣＬのようなＢＴＫ発現癌)におけるシグナル伝達を変えることができ、例えば、増殖を減少させまたはアポトーシスのレベルを増加する。他の例として、キナーゼ阻害剤は、ＣＡＲ発現細胞(またはＣＡＲ発現前の免疫エフェクター細胞)におけるシグナル伝達を、例えば、Ｔ細胞におけるＩＴＫの阻害により変え得る。キナーゼ阻害剤は、Ｔ細胞のバランスをＴＨ２細胞からＴＨ１細胞側にシフトさせ得る。
キナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)を、標的、例えば、ＢＴＫを阻害するのに十分なレベルで反応混合物に添加できる。ある態様において、キナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)を、約０.１〜０.２μM、０.２〜０.５μM、０.５〜１μM、１〜２μM、２〜５μMまたは５〜１０μMの濃度で添加する。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、共有結合性阻害剤(例えばイブルチニブ)であり、非特異的毒性を避けながら標的を非可逆的に阻害するために短パルスが十分である。結果として、キナーゼ阻害剤を、例えば、１０〜２０分、２０〜３０分、３０〜４０分、４０〜６０分または６０〜１２０分添加し得る。キナーゼ阻害剤をまた、例えば、キナーゼ阻害剤が非共有結合性作用機序を有するならば、長い時間添加もし得る。それゆえに、キナーゼ阻害剤を、例えば、２〜４時間、４〜６時間、６〜８時間、８〜１２時間、１２〜１８時間または１８〜２４時間または１〜２日、２〜３日、３〜４日、４〜６日、６〜８日、８〜１０日または細胞が培養されている全期間添加し得る。キナーゼ阻害剤を、製造過程の種々の時点で、例えば、細胞回収後、ビーズで刺激前、ビーズで刺激後、形質導入前、形質導入後または患者への細胞の投与前に添加し得る。ある態様において、キナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)を、細胞回収後または例えば、ビーズで刺激前に添加する。この文脈での前および後は、例えば、約１分、５分、１５分、３０分、４５分または６０分前または後または１時間、２時間、３時間、４時間、５時間または６時間前または後をいう。
ＣＤ１９ ＣＡＲが構築されたら、適切なインビトロおよび動物モデルにおける抗原刺激後にＴ細胞を増殖させる能力、再刺激の非存在下でのＴ細胞増殖の持続および抗癌活性のような、しかしこれらに限定されない分子の活性を評価するために、種々のアッセイが使用され得る。ＣＤ１９ ＣＡＲの効果を評価するためのアッセイは、下にさらに詳細に記載する。
初代Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現のウェスタンブロット分析を、単量体および二量体の存在を検出するために使用できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。極めて簡潔には、ＣＡＲを発現するＴ細胞(ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の１：１混合物)をインビトロで１０日超増殖させ、続いて溶解および還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。完全長ＴＣＲ−ζ細胞質ドメインおよび内因性ＴＣＲ−ζ鎖を含むＣＡＲを、ＴＣＲ−ζ鎖に対する抗体を使用するウェスタンブロッティングにより検出する。同じＴ細胞サブセットを、共有結合性二量体形成の評価を可能とするために非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に使用する。
抗原刺激後のＣＡＲ＋ Ｔ細胞のインビトロ増殖を、フローサイトメトリーにより測定できる。例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の混合物をαＣＤ３／αＣＤ２８ビーズで刺激し、続いて分析すべきプロモーターの制御下に、ＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターで形質導入する。代表的プロモーターは、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣまたはホスホグリセロキナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターを含む。ＧＦＰ蛍光を、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞サブセットの培養６日目に、フローサイトメトリーにより評価する。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。あるいは、ＣＤ４＋とＣＤ８＋ Ｔ細胞の混合物を、０日目にαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズで刺激し、２Ａリボソームスキッピング配列を使用するＣＡＲとｅＧＦＰを発現するバイシストロニックレンチウイルスベクターを使用して、１日目にＣＡＲを形質導入する。培養物を、洗浄後、ＣＤ１９＋ Ｋ５６２細胞(Ｋ５６２−ＣＤ１９)、野生型Ｋ５６２細胞(Ｋ５６２野生型)またはＨＣＤ３２および４−１ＢＢＬを発現するＫ５６２細胞で、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体(Ｋ５６２−ＢＢＬ−３／２８)の存在下刺激する。外来性ＩＬ−２を、１００IU／mlを隔日で培養物に添加する。ＧＦＰ＋ Ｔ細胞を、ビーズベースの計数を使用するフローサイトメトリーにより数える。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。
再刺激非存在下の持続するＣＡＲ＋ Ｔ細胞増殖も測定できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。簡潔には、平均Ｔ細胞体積(ｆｌ)を、０日目のαＣＤ３／αＣＤ２８被覆磁気ビーズでの刺激および１日目の記載するＣＡＲの形質導入後、培養８日目にCoulter Multisizer III粒子カウンター、Nexcelom Cellometer VisionまたはMillipore Scepterを使用して測定する。
動物モデルも、ＣＡＲＴ活性の測定に使用できる。例えば、免疫欠損マウスにおける初代ヒトプレＢ ＡＬＬを処置するための、ヒトＣＤ１９特異的ＣＡＲ＋ Ｔ細胞を使用する異種移植モデルを使用できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。極めて簡潔には、ＡＬＬ確立後、マウスを処置群に無作為化する。。異なる数のαＣＤ１９−ζおよびαＣＤ１９−ＢＢ−ζを操作されたＴ細胞を、１：１比でＢ−ＡＬＬを担持するＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γ-/-マウスに共注射する。マウスからの脾臓ＤＮＡにおけるαＣＤ１９−ζおよびαＣＤ１９−ＢＢ−ζベクターコピー数を、Ｔ細胞注射後、種々の時点で評価する。動物を、１週間間隔で白血病について評価する。末梢血ＣＤ１９＋ Ｂ−ＡＬＬ芽細胞数を、αＣＤ１９−ζ ＣＡＲ＋ Ｔ細胞または偽形質導入Ｔ細胞を注射されたマウスにおいて計測する。ログランク検定を使用して、群の生存曲線を比較する。さらに、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γ-/-マウスへのＴ細胞注射４週間後の絶対的末梢血ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞数も分析する。マウスに、白血病性細胞を注射し、３週間後、ｅＧＦＰに連結したＣＡＲをコードするバイシストロニックレンチウイルスベクターによりＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞を注射する。Ｔ細胞を、注入ＧＦＰ＋ Ｔ細胞の４５〜５０％に、注射前に偽形質導入細胞と混合することにより標準化し、フローサイトメトリーにより確認する。動物を、１週間間隔で白血病について評価する。ＣＡＲ＋ Ｔ細胞群の生存曲線を、ログランク検定を使用して比較する。
用量依存的ＣＡＲ処置応答を評価できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。例えば、２１日目にＣＡＲ Ｔ細胞、等しい数の偽形質導入Ｔ細胞で処置したまたはＴ細胞処置なしの、マウスにおいて白血病が確立した後３５〜７０日後に後、末梢血を得る。各群からのマウスを、末梢血ＣＤ１９＋ ＡＬＬ芽細胞数の決定のために無作為に採血し、３５日目および４９日目に殺す。残りの動物を５７日目および７０日目に評価する。
細胞増殖およびサイトカイン産生の評価は、先に、例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)に記載されている。簡潔には、ＣＡＲ介在増殖の評価を、洗浄したＴ細胞と、ＣＤ１９(Ｋ１９)またはＣＤ３２およびＣＤ１３７(ＫＴ３２−ＢＢＬ)を発現するＫ５６２細胞と、最終Ｔ細胞：Ｋ５６２比２：１で混合することによりマイクロタイタープレートにおいて実施する。Ｋ５６２細胞を、使用前にガンマ線で照射する。抗ＣＤ３(クローンＯＫＴ３)および抗ＣＤ２８(クローン９.３)モノクローナル抗体を、これらのシグナルがエクスビボでの長期ＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖を支持するため、刺激Ｔ細胞増殖について陽性対照として役立つＫＴ３２−ＢＢＬ細胞の培養物に添加する。Ｔ細胞を、製造者により記載のとおり、CountBrightTM蛍光ビーズ(Invitrogen, Carlsbad, CA)およびフローサイトメトリーを使用して、培養において数える。ＣＡＲ＋ Ｔ細胞を、ｅＧＦＰ−２Ａ連結ＣＡＲ発現レンチウイルスベクターで操作されたＴ細胞を使用するＧＦＰ発現により同定する。ＧＦＰを発現しないＣＡＲ＋ Ｔ細胞について、ＣＡＲ＋ Ｔ細胞を、ビオチニル化組み換えＣＤ１９タンパク質および二次アビジン−ＰＥコンジュゲートにより検出する。Ｔ細胞のＣＤ４＋およびＣＤ８＋発現も、特異的モノクローナル抗体(BD Biosciences)を使用して同時に検出する。サイトカイン測定を、製造業者の指示に従いヒトＴＨ１／ＴＨ２サイトカイン細胞数測定ビーズアレイキット(BD Biosciences, San Diego, CA)を使用して再刺激２４時間後に回収した上清で実施する。蛍光を、FACScaliburフローサイトメーターを使用して評価し、データを製造業者の指示に従い分析する。
細胞毒性を、標準的５１Ｃｒ放出アッセイにより評価できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)参照。簡潔には、標的細胞(Ｋ５６２株および初代プロＢ−ＡＬＬ細胞)に、５１Ｃｒ(ＮａＣｒＯ４として、New England Nuclear, Boston, MA)を、３７℃で２時間、頻繁に撹拌しながら充填し、完全ＲＰＭＩで２回洗浄し、マイクロタイタープレートに播種する。エフェクターＴ細胞を、ウェル中で完全ＲＰＭＩ中、標的細胞と種々のエフェクター細胞：標的細胞(Ｅ：Ｔ)比で混合する。さらなる培地のみ(自発的放出、ＳＲ)またはｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００洗剤１％溶液(全放出、ＴＲ)を含むウェルも調製する。３７℃で４時間のインキュベーション後、各ウェルから上清を回収する。放出された５１Ｃｒを、次いでガンマ粒子カウンター(Packard Instrument Co., Waltham, MA)を使用して測定する。各条件を少なくとも３回行い、溶解のパーセントを式：溶解％＝(ＥＲ−ＳＲ)／(ＴＲ−ＳＲ)(式中、ＥＲは各実験条件で放出された平均５１Ｃｒを示す)を使用して計算する。
造影テクノロジーを使用して、腫瘍担持動物モデルにおけるＣＡＲの特異的輸送および増殖を評価できる。このようなアッセイは、例えば、Barrett et al., Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011)に記載されている。簡潔には、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ−／−(ＮＳＧ)マウスに、Ｎａｌｍ−６細胞をＩＶ注射し、７日後ＣＡＲ構築物でエレクトロポレーション４時間後Ｔ細胞を注射する。Ｔ細胞は、ホタルルシフェラーゼを発現するようにレンチウイルス構築物で安定にトランスフェクトされ、マウスをバイオルミネセンスについて造影する。あるいは、Ｎａｌｍ−６異種移植モデルにおけるＣＡＲ＋ Ｔ細胞の単回注射の治療有効性および特異性を、次のように測定できる。ＮＳＧマウスに、ホタルルシフェラーゼを安定に発現するように形質導入したＮａｌｍ−６を注射し、続いて７日後にＣＤ１９ ＣＡＲで電気穿孔したＴ細胞を１回尾静脈注射する。動物を、注射後種々の時点で造影する。例えば、５日目(処置２日前)および８日目(ＣＡＲ＋ ＰＢＬ後２４時間)に、代表的マウスにおけるホタルルシフェラーゼ陽性白血病の光子密度ヒートマップを作成できる。
ここでの実施例の部分に記載するものならびに当分野で知られるものを含む他のアッセイも、本発明のＣＤ１９ ＣＡＲ構築物の評価に使用できる。
キナーゼ阻害剤
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤、例えば、ここに記載するＣＤＫ４阻害剤、例えば、６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−(５−ピペラジン−１−イル−ピリジン−２−イルアミノ)−８Ｈ−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−オン、ヒドロクロライド(パルボシクリブまたはＰＤ０３３２９９１とも呼ぶ)のような、例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤である。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤、例えば、例えば、イブルチニブのような、ここに記載するＢＴＫ阻害剤である。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシン、ラパマイシンアナログ、ＯＳＩ−０２７のような、例えば、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤である。ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤、例えば、ここに記載するｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤であり得る。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＭＮＫ阻害剤、例えば、４−アミノ−５−(４−フルオロアニリノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンのような、例えば、ここに記載するＭＮＫ阻害剤である。ＭＮＫ阻害剤は、例えば、ＭＮＫ１ａ、ＭＮＫ１ｂ、ＭＮＫ２ａおよび／またはＭＮＫ２ｂ阻害剤であり得る。
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、アロイシンＡ；フラボピリドールまたはＨＭＲ−１２７５、２−(２−クロロフェニル)−５,７−ジヒドロキシ−８−[(３Ｓ,４Ｒ)−３−ヒドロキシ−１−メチル−４−ピペリジニル]−４−クロメノン；クリゾチニブ(ＰＦ−０２３４１０６６；２−(２−クロロフェニル)−５,７−ジヒドロキシ−８−[(２Ｒ,３Ｓ)−２−(ヒドロキシメチル)−１−メチル−３−ピロリジニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、ヒドロクロライド(Ｐ２７６−００)；１−メチル−５−[[２−[５−(トリフルオロメチル)−１Ｈ−イミダゾール−２−イル]−４−ピリジニル]オキシ]−Ｎ−[４−(トリフルオロメチル)フェニル]−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−アミン(ＲＡＦ２６５)；インジスラム(Ｅ７０７０)；ロスコビチン(ＣＹＣ２０２)；パルボシクリブ(ＰＤ０３３２９９１)；ディナシクリブ(ＳＣＨ７２７９６５)；Ｎ−[５−[[(５−ｔｅｒｔ−ブチルオキサゾール−２−イル)メチル]チオ]チアゾール−２−イル]ピペリジン−４−カルボキサミド(ＢＭＳ３８７０３２)；４−[[９−クロロ−７−(２,６−ジフルオロフェニル)−５Ｈ−ピリミド[５,４−ｄ][２]ベンズアゼピン−２−イル]アミノ]−安息香酸(ＭＬＮ８０５４)；５−[３−(４,６−ジフルオロ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル)−１Ｈ−インダゾール−５−イル]−Ｎ−エチル−４−メチル−３−ピリジンメタンアミン(ＡＧ−０２４３２２)；４−(２,６−ジクロロベンゾイルアミノ)−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸Ｎ−(ピペリジン−４−イル)アミド(ＡＴ７５１９)；４−[２−メチル−１−(１−メチルエチル)−１Ｈ−イミダゾール−５−イル]−Ｎ−[４−(メチルスルホニル)フェニル]−２−ピリミジンアミン(ＡＺＤ５４３８)；およびＸＬ２８１(ＢＭＳ９０８６６２)から選択されるＣＤＫ４阻害剤である。
ある態様において、キナーゼ阻害剤はＤＫ４阻害剤、例えば、パルボシクリブ(ＰＤ０３３２９９１)であり、パルボシクリブを、１日約５０mg、６０mg、７０mg、７５mg、８０mg、９０mg、１００mg、１０５mg、１１０mg、１１５mg、１２０mg、１２５mg、１３０mg、１３５mg(例えば、７５mg、１００mgまたは１２５mg)の用量で一定期間、例えば、２８日サイクルの１４〜２１日連日または２１日サイクルの７〜１２日連日投与する。ある態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のサイクルのパルボシクリブを投与する。
代表的ＣＤＫ４／６阻害剤はＬＥＥ０１１(別名リボシクリブ)であり、その構造式を下に示す。
理論に縛られないが、ここに記載するＣＡＲ発現細胞とＣＤＫ４／６阻害剤(例えば、ＬＥＥ０１１または他のここに記載するＣＤＫ４／６阻害剤)の投与は、例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤と比較して、高い応答性、例えば、高い寛解率および／または低い再発率を達成できると考えられる。
理論に拘束されないが、ある態様において、ＣＤＫ４／６阻害剤は、癌細胞、例えば、ＭＣＬ細胞におけるサイクリンＤ１活性を低下させるよう働く。ある癌細胞は、転座によるサイクリンＤ１レベル上昇を特徴とする。ＣＤＫ４は、サイクリンＤと複合体化して、細胞周期進行を促進する。従って、ある態様において、ＣＫ４／６阻害剤の投与は、癌細胞増殖を減らす。例えば、Marzec et al., “Mantle cell lymphoma cells express predominantly cyclin D1a isoform and are highly sensitive to selective inhibition of CDK4 kinase activity.” Blood. 2006 Sep 1;108(5):1744-50. Epub 2006 May 11参照。
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、イブルチニブ(ＰＣＩ−３２７６５)；ＧＤＣ−０８３４；ＲＮ−４８６；ＣＧＩ−５６０；ＣＧＩ−１７６４；ＨＭ−７１２２４；ＣＣ−２９２；ＯＮＯ−４０５９；ＣＮＸ−７７４；およびＬＦＭ−Ａ１３から選択されるＢＴＫ阻害剤である。ある態様において、ＢＴＫ阻害剤はインターロイキン−２誘導性キナーゼ(ＩＴＫ)のキナーゼ活性を低減または阻害せず、ＧＤＣ−０８３４；ＲＮ−４８６；ＣＧＩ−５６０；ＣＧＩ−１７６４；ＨＭ−７１２２４；ＣＣ−２９２；ＯＮＯ−４０５９；ＣＮＸ−７７４；およびＬＦＭ−Ａ１３から選択される。
ある態様において、キナーゼ阻害剤はＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブ(ＰＣＩ−３２７６５)であり、イブルチニブを、１日約２５０mg、３００mg、３５０mg、４００mg、４２０mg、４４０mg、４６０mg、４８０mg、５００mg、５２０mg、５４０mg、５６０mg、５８０mg、６００mg(例えば、２５０mg、４２０mgまたは５６０mg)の用量で一定期間、例えば、２１日サイクルで連日または２８日サイクルで連日投与する。ある態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のサイクルのイブルチニブを投与する。
ある態様において、ＢＴＫ阻害剤(例えば、イブルチニブ)を、ＣＬＬ、マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)または小リンパ球性リンパ腫(ＳＬＬ)を有する対象に投与する。例えば、ＢＴＫ阻害剤を投与する対象は、染色体１７の短腕における欠失(ｄｅｌ(１７ｐ)、例えば、白血病性細胞において)を有する。他の例において、ＢＴＫ阻害剤を投与する対象はｄｅｌ(１７ｐ)を有しない。ある態様において、ＢＴＫ阻害剤を投与する対象は、再発したＣＬＬまたはＳＬＬを有し、例えば、対象は、先に癌治療を投与されている(例えば、前に、１、２、３または４癌治療を前に投与されている)。ある態様において、ＢＴＫ阻害剤を投与する対象は難治性ＣＬＬまたはＳＬＬを有する。他の態様において、ＢＴＫ阻害剤を投与する対象は濾胞性リンパ腫、例えば、再発または難治性濾胞性リンパ腫を有する。
イブルチニブ(１−[(３Ｒ)−３−[４−アミノ−３−(４−フェノキシフェニル)−１Ｈ−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−１−イル]ピペリジン−１−イル]プロプ−２−エン−１−オン)の構造を、下に示す。
約４００nMを超える濃度のイブルチニブは、臨床的に適切ではない。Advani et al.(J Clin Oncol 2012;31:88)による研究において、イブルチニブの平均ピーク血清濃度は約１３０ng／mlであり、これは２９５nMに等しい(イブルチニブの分子量４４０.５に基づく)。それゆえに、１μM濃度のイブルチニブでＴ細胞への効果を示すデータは、インビボで臨床的に適切な濃度を相当超える。
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、テムシロリムス；リダフォロリムス(１Ｒ,２Ｒ,４Ｓ)−４−[(２Ｒ)−２−[(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ、２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｚ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３、２９,３５−ヘキサメチル−２,３,１０,１４,２０−ペンタオキソ−１１,３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−１２−イル]プロピル]−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィナート、別名ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９；エベロリムス(ＲＡＤ００１)；ラパマイシン(ＡＹ２２９８９)；セマピモド；(５−{２,４−ビス[(３Ｓ)−３−メチルモルホリン−４−イル]ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−イル}−２−メトキシフェニル)メタノール(ＡＺＤ８０５５)；２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(ＰＦ０４６９１５０２)；およびＮ２−[１,４−ジオキソ−４−[[４−(４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル)モルホリニウム−４−イル]メトキシ]ブチル]−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−、分子内塩(ＳＦ１１２６)；およびＸＬ７６５から選択されるｍＴＯＲ阻害剤である。
ある態様において、キナーゼ阻害剤はｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンであり、ラパマイシンを、１日約３mg、４mg、５mg、６mg、７mg、８mg、９mg、１０mg(例えば、６mg)の用量で一定期間、例えば、２１日サイクルで連日または２８日サイクルで連日投与する。ある態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のサイクルのラパマイシンを投与する。ある態様において、キナーゼ阻害剤はｍＴＯＲ阻害剤、例えば、エベロリムスであり、エベロリムスを１日約２mg、２.５mg、３mg、４mg、５mg、６mg、７mg、８mg、９mg、１０mg、１１mg、１２mg、１３mg、１４mg、１５mg(例えば、１０mg)の用量で一定期間、例えば、２８日サイクルで連日投与する。ある態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のサイクルのエベロリムスを投与する。
ある態様において、キナーゼ阻害剤はＣＧＰ０５２０８８；４−アミノ−３−(ｐ−フルオロフェニルアミノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン(ＣＧＰ５７３８０)；セルコスポラミド；ＥＴＣ−１７８０４４５−２；および４−アミノ−５−(４−フルオロアニリノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンから選択されるＭＮＫ阻害剤である。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤と組み合わせて、対象に、ホスホイノシチド３−キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)阻害剤(例えば、ここに記載するＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば、イデラリシブまたはドゥベリシブ)および／またはリツキシマブと組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にイデラリシブおよびリツキシマブと組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にドゥベリシブおよびリツキシマブと組み合わせて投与する。イデラリシブ(別名GS-1101またはCAL-101; Gilead)は、ＰＩ３Ｋのデルタアイソフォームを遮断する小分子である。イデラリシブ(５−フルオロ−３−フェニル−２−[(１Ｓ)−１−(７Ｈ−プリン−６−イルアミノ)プロピル]−４(３Ｈ)−キナゾリノン)の構造を下に示す。
ドゥベリシブは、ＰＩ３Ｋ−δ,γを遮断する小分子である。ドゥベリシブ(８−クロロ−２−フェニル−３−[(１Ｓ)−１−(９Ｈ−プリン−６−イルアミノ)エチル]−１(２Ｈ)−イソキノリノン)の構造を下に示す。
ある態様において、対象はＣＬＬを有する。ある態様において、対象は再発したＣＬＬを有し、例えば、対象は、先に癌治療剤を投与されている(例えば、先に抗ＣＤ２０抗体を投与されているまたは先にイブルチニブを投与されている)。例えば、対象は、例えば、白血病性細胞において染色体１７の短腕の欠損(ｄｅｌ(１７ｐ))を有する。他の例において、対象はｄｅｌ(１７ｐ)を有しない。ある態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)遺伝子に変異を含む白血病性細胞を含む。他の態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)遺伝子に変異を含む白血病性細胞を含まない。ある態様において、対象は、染色体１１の長腕の欠損(ｄｅｌ(１１ｑ))を有する。他の態様において、対象は、ｄｅｌ(１１ｑ)を有しない。ある態様において、イデラリシブを、約１００〜４００mg(例えばmg、１００〜１２５mg、１２５〜１５０mg、１５０〜１７５mg、１７５〜２００mg、２００〜２２５mg、２２５〜２５０mg、２５０〜２７５mg、２７５〜３００mg、３２５〜３５０mg、３５０〜３７５mgまたは３７５〜４００mg)の用量で、例えば、ＢＩＤで投与する。ある態様において、ドゥベリシブを、約１５〜１００mg(例えば、約１５〜２５mg、２５〜５０mg、５０〜７５mgまたは７５〜１００mg)の用量で、例えば、１日２回投与する。ある態様において、リツキシマブを、約３５０〜５５０mg／ｍ２(例えば、３５０〜３７５mg／ｍ２、３７５〜４００mg／ｍ２、４００〜４２５mg／ｍ２、４２５〜４５０mg／ｍ２、４５０〜４７５mg／ｍ２または４７５〜５００mg／ｍ２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(ＰＦ−０４６９１５０２)；Ｎ−[４−[[４−(ジメチルアミノ)−１−ピペリジニル]カルボニル]フェニル]−Ｎ’−[４−(４,６−ジ−４−モルホリニル−１,３,５−トリアジン−２−イル)フェニル]尿素(ＰＦ−０５２１２３８４、ＰＫＩ−５８７)；２−メチル−２−{４−[３−メチル−２−オキソ−８−(キノリン−３−イル)−２,３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−１−イル]フェニル}プロパンニトリル(ＢＥＺ−２３５)；アピトリシブ(ＧＤＣ−０９８０、ＲＧ７４２２)；２,４−ジフルオロ−Ｎ−{２−(メチルオキシ)−５−[４−(４−ピリダジニル)−６−キノリニル]−３−ピリジニル}ベンゼンスルホンアミド(ＧＳＫ２１２６４５８)；８−(６−メトキシピリジン−３−イル)−３−メチル−１−(４−(ピペラジン−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル)−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−２(３Ｈ)−オンマレイン酸(ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６)；３−[４−(４−モルホリニルピリド[３’,２’：４,５]フロ[３,２−ｄ]ピリミジン−２−イル]フェノール(ＰＩ−１０３)；５−(９−イソプロピル−８−メチル−２−モルホリノ−９Ｈ−プリン−６−イル)ピリミジン−２−アミン(ＶＳ−５５８４、ＳＢ２３４３)；およびＮ−[２−[(３,５−ジメトキシフェニル)アミノ]キノキサリン−３−イル]−４−[(４−メチル−３−メトキシフェニル)カルボニル]アミノフェニルスルホンアミド(ＸＬ７６５)から選択されるデュアルホスファチジルイノシトール３−キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)およびｍＴＯＲ阻害剤である。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤と組み合わせて、対象に、未分化リンパ腫キナーゼ(ＡＬＫ)阻害剤と組み合わせて投与する。代表的ＡＬＫキナーゼ阻害剤は、クリゾチニブ(Pfizer)、セリチニブ(Novartis)、アレクチニブ(中外)、ブリガチニブ(別名ＡＰ２６１１３; Ariad)、エントレクチニブ(Ignyta)、PF-06463922(Pfizer)、ＴＳＲ−０１１(Tesaro)(例えば、治験番号NCT02048488参照)、ＣＥＰ−３７４４０(Teva)およびＸ−３９６(Xcovery)を含むが、これらに限定されない。ある態様において、対象は固形癌、例えば、ここに記載する固形癌、例えば、肺癌を有する。
クリゾチニブの化学名は、３−[(１Ｒ)−１−(２,６−ジクロロ−３−フルオロフェニル)エトキシ]−５−(１−ピペリジン−４−イルピラゾール−４−イル)ピリジン−２−アミンである。セリチニブの化学名は、５−クロロ−Ｎ２−[２−イソプロポキシ−５−メチル−４−(４−ピペリジニル)フェニル]−Ｎ４−[２−(イソプロピルスルホニル)フェニル]−２,４−ピリミジンジアミンである。アレクチニブの化学名は、９−エチル−６,６−ジメチル−８−(４−モルホリノピペリジン−１−イル)−１１−オキソ−６,１１−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ[ｂ]カルバゾール−３−カルボニトリルである。ブリガチニブの化学名は、５−クロロ−Ｎ２−{４−[４−(ジメチルアミノ)−１−ピペリジニル]−２−メトキシフェニル}−Ｎ４−[２−(ジメチルホスホリル)フェニル]−２,４−ピリミジンジアミンである。エントレクチニブの化学名は、Ｎ−(５−(３,５−ジフルオロベンジル)−１Ｈ−インダゾール−３−イル)−４−(４−メチルピペラジン−１−イル)−２−((テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル)アミノ)ベンズアミドである。ＰＦ−０６４６３９２２の化学名は、(１０Ｒ)−７−アミノ−１２−フルオロ−２,１０,１６−トリメチル−１５−オキソ−１０,１５,１６,１７−テトラヒドロ−２Ｈ−８,４−(メテノ)ピラゾロ[４,３−ｈ][２,５,１１]−ベンズオキサジアザシクロテトラデシン−３−カルボニトリルである。ＣＥＰ−３７４４０の化学的構造は、(Ｓ)−２−((５−クロロ−２−((６−(４−(２−ヒドロキシエチル)ピペラジン−１−イル)−１−メトキシ−６,７,８,９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾ[７]アヌレン−２−イル)アミノ)ピリミジン−４−イル)アミノ)−Ｎ−メチルベンズアミドである。Ｘ−３９６の化学名は、(Ｒ)−６−アミノ−５−(１−(２,６−ジクロロ−３−フルオロフェニル)エトキシ)−Ｎ−(４−(４−メチルピペラジン−１−カルボニル)フェニル)ピリダジン−３−カルボキサミドである。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤と組み合わせて、対象に、インドールアミン２,３−ジオキシゲナーゼ(ＩＤＯ)阻害剤と共に投与する。ＩＤＯは、アミノ酸、Ｌ−トリプトファンのキヌレニンへの分解を触媒する酵素である。多くの癌、例えば、前立腺、結腸直腸、膵臓、子宮頸部、胃、卵巣、頭部および肺の癌がＩＤＯを過発現する。ｐＤＣ、マクロファージおよび樹状細胞(ＤＣ)はＩＤＯを発現できる。理論に縛られないが、Ｌ−トリプトファン(例えば、ＩＤＯによる触媒)の減少が、Ｔ細胞アネルギーおよびアポトーシスの誘導により免疫抑制性環境をもたらすと考えられる。それゆえに、理論に縛られないが、ＩＤＯ阻害剤は、例えば、ＣＡＲ発現免疫細胞の抑制または死滅を減少させることにより、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の有効性を高め得る。ある態様において、対象は、固形腫瘍、例えば、ここに記載する固形腫瘍、例えば、前立腺、結腸直腸、膵臓、子宮頸部、胃、卵巣、頭部または肺の癌を有する。ＩＤＯの代表的阻害剤は、１−メチル−トリプトファン、インドキシモド(NewLink Genetics)(例えば、治験番号NCT01191216; NCT01792050参照)およびＩＮＣＢ０２４３６０(Incyte Corp.)(例えば、治験番号NCT01604889; NCT01685255参照)を含むが、これらに限定されない
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤と組み合わせて、対象に、骨髄由来サプレッサー細胞(ＭＤＳＣ)のモジュレーターと組み合わせて投与する。ＭＤＳＣは、多くの固形腫瘍の周辺および腫瘍部位に蓄積される。これらの細胞はＴ細胞応答を抑制し、それによりＣＡＲ発現細胞治療の有効性を邪魔する。理論に縛られないが、ＭＤＳＣモジュレーターの投与は、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の有効性を増強すると考えられる。ある態様において、対象は固形腫瘍、例えば、ここに記載する固形腫瘍、例えば、神経膠芽腫を有する。ＭＤＳＣの代表的モジュレーターは、ＭＣＳ１１０およびＢＬＺ９４５を含むが、これらに限定されない。ＭＣＳ１１０は、マクロファージコロニー刺激因子(Ｍ−ＣＳＦ)に対するモノクローナル抗体(ｍＡｂ)である。例えば、治験番号ＮＣＴ００７５７７５７参照。ＢＬＺ９４５は、コロニー刺激因子１受容体(ＣＳＦ１Ｒ)の小分子阻害剤である。例えば、Pyonteck et al. Nat. Med. 19 (2013):1264-72参照。ＢＬＺ９４５の構造を下に示す。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤と組み合わせて、対象に、インターロイキン−１５(ＩＬ−１５)ポリペプチド、インターロイキン−１５受容体アルファ(ＩＬ−１５Ｒａ)ポリペプチドまたはＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチド両者の組み合わせ、例えば、ｈｅｔＩＬ−１５(Admune Therapeutics, LLC)と組み合わせて投与する。ｈｅｔＩＬ−１５は、ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒａのヘテロ二量体非共有結合性複合体である。ｈｅｔＩＬ−１５は、例えば、本明細書に引用により包含させる米国８,１２４,０８４号、米国２０１２／０１７７５９８号、米国２００９／００８２２９９号、米国２０１２／０１４１４１３および米国２０１１／００８１３１１号に記載される。ある態様において、ｈｅｔ−ＩＬ−１５を皮下に投与する。ある態様において、対象は癌、例えば、固形癌、例えば、黒色腫または結腸癌を有する。ある態様において、対象は転移癌を有する。
治療適用
ＣＤ１９関連疾患および／または障害
ある面において、本発明は、ＣＤ１９発現と関係する疾患を処置する方法を提供する。ある面において、本発明は、腫瘍の一部がＣＤ１９に陰性であり、腫瘍の一部がＣＤ１９に陽性である、疾患を処置するための方法を提供する。例えば、本発明のＣＡＲは、ＣＤ１９の発現上昇と関係する疾患のための処置を受けている対象の処置に有用であり、ここで、ＣＤ１９のレベル上昇について処置を受けている対象は、ＣＤ１９のレベル上昇と関係する疾患を示す。
ここに記載する治療は、例えば、イブルチニブのようなキナーゼ阻害剤に応答する対象(例えば、部分応答または完全応答)または応答しない対象(例えば、非応答者または再発者)の処置に使用できる。理論に拘束されないが、キナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)で処置を受けている患者の多くが、処置に対する応答が低下し得る(例えば、処置に対する部分応答者または非応答者または処置中の再発)。よって、ここに開示するＣＡＲ治療のキナーゼ阻害剤と組み合わせた投与は、有利な効果をもたらし得る。
これらの対象のための代表的治療的レジメンを下に記載する。
ある場合、対象がナーゼ阻害剤(例えばイブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)に対する非応答者または再発者であるとき、キナーゼ阻害剤を中止し、ＣＡＲ治療を投与する。他の場合、対象がキナーゼ阻害剤(例えばイブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)に応答しないとき、キナーゼ阻害剤治療を継続し、ＣＡＲ治療をレジメンに追加する。この使用は、例えば、ＣＡＲ治療が、イブルチニブ耐性細胞における単剤療法として有効であることを示す、ここでの実施例８における実験により、支持される。理論に拘束されないが、キナーゼ阻害剤治療継続は、例えば、血流におけるＣＡＲ発現細胞の数の増加により、ＣＡＲ治療の有効性を改善できる(ここでの実施例８参照)。
理論に縛られないが、キナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)に非応答者または再発者である対象は、少なくとも２つの理由により非応答であり得る：対象は、薬物標的に標的阻害を阻止する変異(例えば、ＢＴＫ、例えば、Ｃ４８１Ｓ変異)を有し得るかまたは標的が適切に阻害されても、増殖を駆動できる他の経路への変更を有し得る(例えば、構成的ＢＴＫ非依存的細胞シグナル伝達を生じる、ＰＬＣγにおける活性化変異のような、ＰＬＣγにおける変異)。処置を、非応答性の理由により変えることができる。例えば、最初の状況で(ある態様において)、対象が、キナーゼ阻害剤が標的を阻害することを妨げる変異を有する(または有すると同定される)ならば、第二キナーゼ阻害剤(例えば、同じ標的を指向)を、キナーゼ阻害剤と置き換え得る(または組み合わせて投与)。より具体的に、ある態様において、患者が、イブルチニブがＢＴＫを阻害することを阻止する変異を有する(または有すると同定される)とき、第二ＢＴＫ阻害剤、例えば、ＧＤＣ−０８３４、ＲＮ−４８６、ＣＧＩ−５６０、ＣＧＩ−１７６４、ＨＭ−７１２２４、ＣＣ−２９２、ＯＮＯ−４０５９、ＣＮＸ−７７４またはＬＦＭ−Ａ１３のような、ここに記載するＢＴＫ阻害剤を、イブルチニブと置き換え得る。理論に拘束されないが、第二キナーゼ阻害剤は、変異により妨害されない標的の領域に作用し得て、それゆえに対象は、第二キナーゼ阻害剤に対して感受性である。他の態様において、元のキナーゼ阻害剤(例えばイブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)を維持する。ここでの非限定的理論によると、元のキナーゼ阻害剤は、例えば、ＴＨ１表現型促進、増殖促進または他の点で細胞のレベルまたは活性の増加に、ＣＡＲ発現細胞に有益な活性を有し得る。
上記のように、ある場合、対象は、標的が適切に阻害されても、増殖を駆動できる他の経路への変更(例えば、変異)を有し得るために、非応答である。従って、対象がキナーゼ阻害剤の活性を無効とする経路における変更を有する(または有すると同定される)とき、キナーゼ阻害剤治療を維持できる。理論に拘束されないが、キナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)活性は、キナーゼ阻害剤単独が増殖遅延に有効でない場合でも、癌細胞における有用な生物学的変化を促進できる。例えば、キナーゼ阻害剤は、癌細胞をリンパ節外に移動させるのに十分である可能性があり、ＣＡＲ治療に対してより攻撃されやすくする。
次にキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)に応答である対象について、種々の治療的レジメンをここに記載する。ある態様において、対象がキナーゼ阻害剤に対して完全応答者である(またはそうであると同定される)とき、対象に、完全応答の期間ＣＡＲ治療を投与しない。他の態様において、対象がキナーゼ阻害剤に対して完全応答者である(またはそうであると同定される)とき、対象に、完全応答の期間ＣＡＲ治療を投与する。ある態様において、ＣＡＲ治療後、対象は、応答の延長または再発の遅延を経験する(例えば、ＣＡＲ治療を伴わずに処置した疾患の予測される経過と比較して)。例えば、イブルチニブ単剤療法で処置したＭＣＬは、約１７.５ヶ月の中央応答期間を有する。
ある態様において、対象がキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)に対して部分応答者である(またはそうであるとして同定される)とき、対象に、部分応答の期間ＣＡＲ治療を投与しない。他の態様において、対象がキナーゼ阻害剤に対して部分応答者である(またはそうであるとして同定される)とき、対象に、部分応答の期間ＣＡＲ治療を投与する。ある態様において、ＣＡＲ治療後、対象は、完全応答および／または応答延長または再発遅延を経験する(例えば、ＣＡＲ治療を伴わずに処置した疾患の予測される経過と比較して)。
ある態様において、対象が、キナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)での処置開始後に疾患安定である(またはそうであると同定される)とき、疾患が安定な期間、対象にＣＡＲ治療を投与しない。他の態様において、対象が、キナーゼ阻害剤での処置開始後に疾患安定である(またはそうであると同定される)とき、疾患が安定な期間、対象にＣＡＲ治療を投与する。ある態様において、ＣＡＲ治療後、対象は、部分応答、完全応答および／または応答延長または再発遅延を経験する(例えば、ＣＡＲ治療を伴わずに処置した疾患の予測される経過と比較して)。
ある態様において、対象が、キナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)での処置開始後疾患が進行した(またはそうであると同定される)とき、対象に、疾患進行期間中、ＣＡＲ治療を投与しない。他の態様において、対象が、キナーゼ阻害剤での処置開始後疾患が進行した(またはそうであると同定される)とき、対象に、疾患進行期間中、ＣＡＲ治療を投与する。ある態様において、ＣＡＲ治療後、対象は疾患安定、部分応答、完全応答および／または応答延長または再発遅延を経験する(例えば、ＣＡＲ治療を伴わずに処置した疾患の予測される経過と比較して)。
それゆえに、ある患者にどの処置コースが適するか決定するために、処置前または処置中に１以上の疾患評価肯定を実施できる。例えば、対象は、第一選択治療としてキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)を投与され得る。次いで、一定期間(例えば、１ヶ月または２ヶ月であるが、また２週間、３週間、１ヶ月、１.５ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、１５ヶ月または１８ヶ月)後、患者の応答を評価できる。評価により対象が完全応答者であることが示されたら、ある態様において、ＣＡＲ治療を、例えば、上記のように、投与しない。評価により対象が部分応答者であるかまたは疾患が安定であると示されたら、ある態様において、ＣＡＲ治療を、例えば、上記のように、キナーゼ阻害剤と組み合わせて投与する。評価により対象が非応答者または再発者であることが示されたら、ある態様において、ＣＡＲ治療を、例えば、上記のように、キナーゼ阻害剤または第二キナーゼ阻害剤と組み合わせて投与する。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＣＡＲ発現細胞を製造しながら、例えば、患者自身のＴ細胞が、ＣＡＲおよび／または他の因子を発現するように操作されながら、疾患を制御する。
患者の応答者状態または再発者状態を分類するための臨床標準が当分野で知られる。例として、悪性リンパ腫について、標準化された応答基準がCheson et al, J Clin Oncol 17:1244 (1999)およびCheson et al., “Revised Response Criteria for Malignant Lymphoma”, J Clin Oncol 25:579-586 (2007)(両者とも、その全体を引用により本明細書に包含させる)に記載されている。従って、ある態様において、対象を、Cheson基準または修飾Cheson基準に従って完全応答者、部分応答者、疾患安定、非応答者または再発者と分類できる。他の血液系腫瘍を分類するための基準は当分野で知られる。
Cheson 2007の表２における基準によると、完全応答者は、疾患の証拠が全て消失する；部分応答者は、測定可能な疾患の退行があり、新規部位がない；疾患が安定した患者は、ＣＲ／ＰＲまたはＰＤの達成に失敗する；そして、疾患が再発したまたは疾患が進行した患者は、何らかの新規病変または先に関与した部位の最下点からの５０％以上の増加を有する。評価は、疾患がＦＤＧ貪欲であるか、ＰＥＴ陽性であるか陰性であるか、小結節が存在するか、例えば、肝臓または脾臓で触知できるかおよび骨髄が無傷であるかまたは関与を示すかの決定を含み得る。
ＣＡＲ治療およびキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)を、例えば、同時にまたは逐次的に投与できる。ある態様において、ＣＡＲ治療を、キナーゼ阻害剤治療開始と実質的に同じときに開始する。ある態様において、ＣＡＲ治療を、キナーゼ阻害剤治療開始の前に開始する。ある態様において、ＣＡＲ治療を、キナーゼ阻害剤治療開始の後に開始する。例えば、ＣＡＲ治療を、キナーゼ阻害剤治療開始、例えば、少なくとも１週間、２週間、３週間または４週間または１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、１５ヶ月、１８ヶ月または２４ヶ月後に開始できる。ある態様において、ＣＡＲ治療を、患者の体内に生理学的に適切なレベルのキナーゼ阻害剤が存在している間に開始する。
組み合わせで投与するとき、ＣＡＲ治療およびキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)または両者を、各薬剤を、例えば、単剤療法として、個々に使用する量または用量より高い、低いまたは同じ量または用量で投与できる。ある態様において、ＣＡＲ治療、キナーゼ阻害剤または両者の投与する量または用量は、例えば、単剤療法として、各々の薬剤を個々に使用する量または用量より、低い(例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％)。他の態様において、所望の効果(例えば、癌の処置)をもたらすＣＡＲ治療、キナーゼ阻害剤または両者の量または用量は、同じ治療的効果の達成に必要な、例えば、単剤療法として、各々の薬剤を個々に使用する量または用量より低い(例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％低い)。
組み合わせて投与するとき、ＣＡＲ治療およびキナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)または両者を、例えば、単剤療法として、各々の薬剤を個々に使用する期間より長い、短いまたは同じ期間投与できる。ある態様において、ＣＡＲ治療、キナーゼ阻害剤または両者の投与期間は、例えば、単剤療法として、各々の薬剤を個々に使用する期間より短い(例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％)。他の態様において、所望の効果(例えば、癌の処置)をもたらすＣＡＲ治療、キナーゼ阻害剤または両者の投与期間は、同じ治療的効果を達成するのに必要な、例えば、単剤療法として、各々の薬剤を個々に使用する期間より短い(例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％短い)。ある態様において、患者に、キナーゼ阻害剤(例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤)を短縮コースで投与する。例えば、キナーゼ阻害剤の短縮コースは、計約０〜２ヶ月、２〜４ヶ月、４〜６ヶ月、６〜８ヶ月、８〜１０ヶ月、１０〜１２ヶ月、１２〜１５ヶ月、１５〜１８ヶ月、１８〜２１ヶ月または２１〜２４ヶ月継続し得るか、またはＣＡＲ治療投与後約０〜２ヶ月、２〜４ヶ月、４〜６ヶ月、６〜８ヶ月、８〜１０ヶ月、１０〜１２ヶ月、１２〜１５ヶ月、１５〜１８ヶ月、１８〜２１ヶ月または２１〜２４ヶ月継続し得る。ある態様において、キナーゼ阻害剤の短縮コースは、再発前に終了する。ある態様において、キナーゼ阻害剤を、短縮コースの間、常用(例えば、単剤療法)レベルで使用する。
ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の単一用量は、約５×１０８ ＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞を含む。ＣＡＲ発現細胞の用量は、また約５×１０６、１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９または５×１０９細胞、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ細胞、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞も含み得る。
ある面において、本発明は、哺乳動物細胞、例えば、Ｔ細胞における発現のためのプロモーターと操作可能に連結したＣＤ１９ ＣＡＲを含むベクターに関する。ある面において、本発明は、ＣＤ１９発現腫瘍の処置に使用するための、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する組み換え細胞、例えば、Ｔ細胞を提供し、ここで、ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する組み換えＴ細胞を、ＣＤ１９ ＣＡＲＴと名付ける。ある面において、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲＴは、腫瘍細胞と、その表面に発現している少なくとも一つのＣＤ１９ ＣＡＲを、ＣＡＲＴが腫瘍細胞を標的とし、腫瘍の増殖が阻止されるように、接触させることができる。
ある面において、本発明は、腫瘍細胞とＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞を、ＣＡＲＴが抗原に応答して活性化され、癌細胞を標的とし、腫瘍の増殖が阻止されるように、接触させることを含む、ＣＤ１９発現腫瘍細胞の増殖を阻止する方法に関する。ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞、例えば、Ｔ細胞を、キナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与する。
ここで使用する“組み合わせて”投与するは２(またはそれ以上)の異なる処置を、対象が障害を有する過程の間に対象に送達することを意味し、例えば、２以上の処置を、対象が障害と診断された後にかつ障害が治癒または撲滅される前にまたは処置が他の理由で中止される前に送達される。ある態様において、投与期間の重複があるように、一方の処置の送達は、第二の処置の送達開始時にまだ行われている。これは、ここでは“同時の”または“一緒の送達”ということがある。他の態様において、一方の処置の送達は、他の処置の送達が始まる前に終わる。いずれかの場合のある態様において、処置は、組み合わせ投与のためにより有効である。例えば、第二処置はより有効である、例えば、等しい効果が少ない第二処置で見られるまたは第二処置が、第二処置を第一処置非存在下で投与したときに見られるよりも大きな程度で症状を軽減するかまたは第一処置で同様な状況が見られる。ある態様において、送達は、障害と関係する症状または他のパラメータの減少が、他方の処置の非存在下で一方の処置の送達で観察されるされるより大きい。２処置の効果は一部相加的、完全相加的または相加的より大きいものであり得る。送達は、送達した第一処置の効果が、第二剤の送達時になお検出可能であるようなものであり得る。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞をここに記載する用量および／または投薬スケジュールで投与し、キナーゼ阻害剤またはＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤をここに記載する用量および／または投薬スケジュールで投与する。
本発明は、Ｔ細胞がキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように遺伝子修飾され、ＣＡＲ Ｔ細胞がそれを必要とするレシピエントに注入される、ある種の細胞治療を含む。注入された細胞は、レシピエントにおける腫瘍細胞を殺すことができる。抗体治療と異なり、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞は、インビボで複製でき、持続した腫瘍制御に至り得る長期持続をもたらす。多様な面において、患者に投与されたＴ細胞またはその子孫は、患者で、患者にＴ細胞投与後少なくとも４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２年、３年、４年または５年持続する。
本発明はまた、Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を一過性に発現するように、例えば、インビトロ転写ＲＮＡにより修飾し、ＣＡＲ Ｔ細胞を、それを必要とするレシピエントに注入する、ある種の細胞治療を含む。注入した細胞は、レシピエントにおける腫瘍細胞を殺すことができる。それゆえに、多様な面において、患者に投与したＴ細胞は、患者にＴ細胞投与後、１ヶ月、例えば、３週間、２週間、１週間未満持続する。
何らかの特定の理論に拘束されないが、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞により惹起される抗腫瘍免疫応答は、能動的または受動的免疫応答であり得るかまたはあるいは直接的対間接的免疫応答によるものであり得る。一つの面において、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞は、ＣＤ１９を発現するヒト癌細胞に応答して特定の炎症誘発性サイトカイン分泌および強力な細胞溶解性活性を示し、可可溶性ＣＤ１９阻害に抵抗性とし、バイスタンダー死滅に介在し、確立されたヒト腫瘍の退縮に介在する。例えば、ＣＤ１９発現腫瘍の不均一な場内の低抗原腫瘍細胞は、隣接する抗原陽性癌細胞に対して先に反応しているＣＤ１９再指向Ｔ細胞による間接的破壊に感受性であり得る。
一つの面において、本発明の完全ヒトＣＡＲ修飾Ｔ細胞は、哺乳動物におけるエクスビボ免疫化および／またはインビボ治療のための１種のワクチンである。一つの面において、哺乳動物はヒトである。
ある態様において、エクスビボ免疫化に関し、哺乳動物に細胞を投与する前に、インビトロで次のｉ)細胞の増殖、ii)ＣＡＲをコードする核酸の細胞への導入またはiii)細胞の凍結保存の少なくとも１つが起こる。
エクスビボ手順は当分野で周知であり、下により完全に考察する。簡潔には、細胞を哺乳動物(例えば、ヒト)から単離し、ここに開示するＣＡＲを発現するベクターで遺伝子修飾する(すなわち、インビトロでの形質導入またはトランスフェクト)。ＣＡＲ修飾細胞を、治療利益を提供するために哺乳動物レシピエントに投与できる。哺乳動物レシピエントはヒトであってよく、ＣＡＲ修飾細胞はレシピエントに対して自己であり得る。あるいは、細胞は、レシピエントに対して同種、同系または異種であり得る。エクスビボ免疫化の観点での細胞ベースのワクチンの使用に加えて、患者における抗原に対する免疫応答を惹起させるインビボ免疫化のための組成物および方法もここに記載する方法に包含される。
一般に、ここに記載のように活性化および増殖された細胞は、免疫無防備状態である個体で生じる疾患の処置および予防に利用し得る。特に、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＣＤ１９の発現と関係する疾患、障害および状態の処置に使用する。ある面において、細胞を、ＣＤ１９の発現と関係する疾患、障害および状態を発症するリスクのある患者の処置に使用する。それゆえに、本発明は、処置を必要とする対象に、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の有効量を、キナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与することを含む、ＣＤ１９の発現と関係する疾患、障害および状態を処置または予防する方法を提供する。
本発明はまた、ＣＤ１９発現細胞集団の増殖を阻止するまたは減少させる方法も提供し、該方法は、ＣＤ１９発現細胞を含む細胞の集団とＣＤ１９発現細胞と結合するここに記載する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞を接触させ、ＣＤ１９発現細胞の集団とキナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤を接触させることを含む。具体的な面において、本発明は、ＣＤ１９を発現する癌細胞の集団の増殖を阻止するまたは減少させる方法を提供し、該方法は、ＣＤ１９発現癌細胞集団とＣＤ１９発現細胞と結合するここに記載する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞を接触させ、ＣＤ１９発現細胞とキナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤を接触させることを含む。ある面において、本発明は、ＣＤ１９を発現する癌細胞の集団の増殖を阻止するまたは減少させる方法を禎子油し、該方法は、ＣＤ１９発現癌細胞集団とＣＤ１９発現細胞と結合するここに記載する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞を接触させ、ＣＤ１９発現細胞とキナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤を接触させることを含む。ある面において、ここに記載する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞およびキナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤の組み合わせは、血液癌またはＣＤ１９発現細胞と関係する他の癌を有する対象または動物モデルにおいて、陰性対照と比較して、細胞および／または癌細胞の数量、数、量またはパーセンテージを少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％または少なくとも９９％現象させる。ある面において、対象はヒトである。
本発明はまたＣＤ１９発現と関係する疾患細胞(例えば、ＣＤ１９を発現する血液癌または非定型癌)を予防、処置および／または管理する方法を提供し、該方法は、処置を必要とする対象にＣＤ１９発現細胞に結合する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞を投与し、キナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤を投与することを含む。ある面において、対象はヒトである。ＣＤ１９発現細胞と関係する障害の非限定的例は、自己免疫性障害(例えば狼瘡)、炎症性障害(例えばアレルギーおよび喘息)および癌(例えばＣＤ１９を発現する血液癌または非定型癌)を含む。
本発明はまたＣＤ１９発現と関係する疾患細胞を予防、処置および／または管理する方法も提供し、該方法は、処置を必要とする対象にＣＤ１９発現細胞と結合する本発明の抗ＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞を投与することを含む。ある面において、対象はヒトである。
本発明は、ＣＤ１９発現細胞と関係する癌の再発を予防する方法を提供し、該方法は、処置を必要とする対象にＣＤ１９発現細胞と結合する本発明の抗ＣＤ１９発現細胞(例えば抗ＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞)を投与することを含む。ある面において、方法は、処置を必要とする対象に、ＣＤ１９発現細胞と結合するここに記載の抗ＣＤ１９発現細胞(例えば抗ＣＤ１９ ＣＡＲＴ細胞)の有効量を、他の治療剤の有効量と組み合わせて投与することを含む。
ある面において、本発明は、対象における癌を処置する方法に関する。方法は、対象にＢ細胞ターゲティングＣＡＲを発現する細胞(例えば、免疫エフェクター細胞)、例えば、ここに記載のＴ細胞またはＮＫ細胞を、キナーゼ阻害剤、例えば、ここに記載するキナーゼ阻害剤と組み合わせて、癌が対象において処置されるように投与することを含む。ここに記載する方法により処置可能な癌の例は、Ｂ細胞抗原、例えば、ＣＤ１９の発現と関係する癌である。ある態様において、疾患は固形または液性腫瘍である。ある態様において、疾患は血液癌である。ある態様において、血液癌は白血病である。ある態様において、血液癌は、例えば、ＷＨＯ分類によると、成熟Ｂ細胞新生物である。ある態様において、血液癌は、ＣＤ１９＋ Ｂリンパ球由来悪性腫瘍である。ある態様において、癌は、Ｂ細胞急性リンパ系白血病(ＢＡＬＬ)、Ｔ細胞急性リンパ系白血病(ＴＡＬＬ)、小リンパ球性白血病(ＳＬＬ)、急性リンパ系白血病(ＡＬＬ)を含むが、これらに限定されない１以上の急性白血病；慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)を含むが、これらに限定されない１以上の慢性白血病；マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫(ＤＬＢＣＬ)(例えば、Ｔ細胞／組織球富大Ｂ細胞リンパ腫、ＣＮＳの原発性ＤＬＣＢＬ、高齢者の皮膚原発ＤＬＢＣＬ足型またはＥＢＶ＋ ＤＬＢＣＬ)、慢性炎症と関係するＤＬＢＣＬ、濾胞性リンパ腫、小児濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫(粘膜関連リンパ組織型節外性辺縁帯リンパ腫)、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、脾臓辺縁帯リンパ腫、脾臓リンパ腫／白血病(例えば、分類不可能)、脾臓汎発性赤色髄小Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病異型、リンパ形質細胞性リンパ腫、重鎖疾患(例えば、アルファ重鎖疾患、ガンマ重鎖疾患またはミュー重鎖疾患)、形質細胞骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、骨外形質細胞腫、結節性辺縁帯リンパ腫、小児結節性辺縁帯リンパ腫、皮膚原発濾胞中心リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、縦隔原発(胸腺)大Ｂ細胞リンパ腫、血管内大Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ＋ 大Ｂ細胞リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性キャッスルマン病で生じる大Ｂ細胞リンパ腫、原発浸出リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、分類不可能(例えば、ＤＬＢＣＬとバーキットリンパ腫の中間またはＤＬＢＣＬと古典的ホジキンリンパ腫の中間の特性を有する)および骨髄球性血液細胞の産生不全(または異形成)によりまとめられる血液学的状態の多様なコレクションである“前白血病状態”およびＢ細胞抗原(例えば、ＣＤ１９)を発現する非定型および／または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性疾患を含むが、これらに限定されないＢ細胞抗原(例えば、ＣＤ１９)発現と関係する疾患を含むが、これらに限定されないさらなる血液癌または血液学的状態；およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
ある態様において、癌はホジキンリンパ腫であり、患者は、ＣＡＲ発現細胞で、例えば、単剤療法としてまたは他の１以上の治療と組み合わせて処置される。ある態様において、ホジキンリンパ腫は、ステージＩ、II、IIIまたはIVである。さらなる治療は、例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤のようなキナーゼ阻害剤を含み得る。さらなる治療は、ホジキンリンパ腫の処置を含み得る。さらなる治療は、例えば、放射線療法、ＭＯＰＰ(マスタージェン、オンコビン、プレドニゾンおよびプロカルバジン)、ＡＢＶＤ(アドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチンおよびダカルバジン)、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｖ(化学療法および放射線処置を用いるレジメン)またはＢＥＡＣＯＰＰ(ブレオマイシン、エトポシド、アドリアマイシン、シクロホスファミド、オンコビン、プロカルバジン、プレドニゾン)を含み得る。ある態様において、対象は、予め放射線療法、ＭＯＰＰ、Ｓｔａｎｆｏｒｄ ＶまたはＢＥＡＣＯＰＰの１以上で処置されているかまたはこれに耐性であるもしくは難治性である。
Ｂ細胞抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＲＯＲ１の１以上の発現と関係する非癌関連徴候は、例えば、自己免疫性疾患(例えば、狼瘡)、炎症性障害(アレルギーおよび喘息)および移植を含むが、これらに限定されない。
ある態様において、ここに記載する組み合わせで処置できる癌は多発性骨髄腫である。多発性骨髄腫は、骨髄への形質細胞クローンの蓄積を特徴とする血液の癌である。多発性骨髄腫の現在の治療は、サリドマイドのアナログであるレナリドマイドでの処置を含むが、これに限定されない。レナリドマイドは、抗腫瘍活性、血管形成阻害および免疫調節を含む活性を有する。ある態様において、例えば、ここに記載するような、ＣＤ１９ ＣＡＲを骨髄腫細胞を標的とするために使用し得る。ある態様において、ここに記載する組み合わせを、１以上のさらなる治療、例えば、レナリドマイド処置と組み合わせて使用し得る。
ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、単独でまたは希釈剤および／またはＩＬ−２または他のサイトカインまたは細胞集団のような他の成分と組み合わせて医薬組成物として投与し得る。
ある態様において、白血球枯渇化学療法を、ＣＡＲ細胞、例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の投与(例えば、注入)前に、同時にまたは後に対象に投与する。例として、白血球枯渇化学療法を、ＣＡＲ細胞投与前に対象に投与する。例えば、白血球枯渇化学療法は、ＣＡＲ細胞注入の１〜４日(例えば、１日、２日、３日または４日)前に終わる。ある態様において、ＣＡＲ細胞の複数用量を、例えば、ここに記載のように投与する。例えば、単一用量は、約５×１０８ ＣＡＲ細胞を含む。ある態様において、白血球枯渇化学療法を、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の投与(例えば、注入)前に、同時にまたは後に対象に投与する。
血液癌
血液癌状態は、血液、骨髄およびリンパ系に影響する白血病、リンパ腫および悪性リンパ増殖性状態のようなタイプの癌である。
白血病は急性白血病および慢性白血病に分類できる。急性白血病はさらに急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)および急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)として分類され得る。慢性白血病は慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)および慢性リンパ系白血病(ＣＬＬ)を含む。他の関連する状態は、骨髄球性血液細胞の産生不良(または異形成)によりまとめられる血液学的状態の多様なコレクションであり、ＡＭＬに癌化するリスクがある、骨髄異形成症候群(ＭＤＳ、以前は“前白血病状態”として知られた)である。
リンパ腫は、リンパ球から生じる血液細胞腫瘍の群である。代表的リンパ腫は非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫を含む。
組み合わせ治療
ここに記載するＣＡＲ発現細胞(例えば、およびここに記載するキナーゼ阻害剤)の組み合わせを、他の既知薬剤および治療と組み合わせて使用し得る。
ここに記載するＣＡＲ発現細胞、キナーゼ阻害剤および／または少なくとも１つのさらなる治療剤を同時に、同じまたは別の組成物でまたは逐次的に投与できる。逐次投与について、ここに記載するＣＡＲ発現細胞をまず投与し、さらなる薬剤を次に投与するかまたは投与の順番を逆にできる。
ＣＡＲ治療および／または他の治療剤、方法またはモダリティーを、活動性障害の期間または寛解または低活動性疾患の期間に投与できる。ＣＡＲ治療を、他の処置の処置前、処置と同時、処置後または障害の寛解中に投与できる。
組み合わせて投与するとき、ＣＡＲ治療およびさらなる薬剤(例えば、キナーゼ阻害剤および／または第三薬剤)または全てを、個々に、例えば、単剤療法として使用する各薬剤の量または投与より高い、低いまたは同じ量または用量で投与できる。ある態様において、ＣＡＲ治療、さらなる薬剤(例えば、キナーゼ阻害剤および／または第三薬剤)または全ての投与される量または用量は、個々に、例えば、単剤療法として使用する各薬剤の量または用量より低い(例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％)。他の態様において、所望の効果(例えば、癌の処置)を生じるＣＡＲ治療、さらなる薬剤(例えば、キナーゼ阻害剤および／または第三薬剤)または全ての投与される量または用量は、同じ治療効果を達成するのに必要な、個々に、例えば、単剤療法として使用する各薬剤の量または用量より低い(例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％低い)。
さらなる面において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞(例えば、およびキナーゼ阻害剤)の組合せを、手術、化学療法剤、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびＦＫ５０６のような免疫抑制剤、抗体またはＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体または他の抗体治療のような他の免疫除去剤、サイトキシン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカインおよび照射、Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971に記載されるようなペプチドワクチンと組み合わせる処置レジメンにおいて使用し得る。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞(例えばおよびここに記載するキナーゼ阻害剤)の組み合わせを、他の化学療法剤と組み合わせて使用できる。代表的化学療法剤は、アントラサイクリン(例えば、ドキソルビシン(例えば、リポソームドキソルビシン))、ビンカアルカロイド(例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン)、アルキル化剤(例えば、シクロホスファミド、ダカルバジン、メルファラン、イホスファミド、テモゾロミド)、免疫細胞抗体(例えば、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、トシツモマブ、ブレンツキシマブ)、代謝拮抗剤(例えば、葉酸アンタゴニスト、ピリミジンアナログ、プリンアナログおよびアデノシンデアミナーゼ阻害剤(例えば、フルダラビン)を含む)、ＴＮＦＲグルココルチコイド誘発ＴＮＦＲ関連タンパク質(ＧＩＴＲ)アゴニスト、プロテアソーム阻害剤(例えば、アクラシノマイシンＡ、グリオトキシンまたはボルテゾミブ)、サリドマイドまたはサリドマイド誘導体(例えば、レナリドマイド)のような免疫調節剤を含む。
組み合わせ治療における使用に考慮される一般的化学療法剤は、アナストロゾール(アリミデックス(登録商標))、ビカルタミド(カソデックス(登録商標))、硫酸ブレオマイシン(ブレノキサン(登録商標))、ブスルファン(マイレラン(登録商標))、ブスルファン注(ブスルフェクス(登録商標))、カペシタビン(ゼローダ(登録商標))、Ｎ４−ペントキシカルボニル−５−デオキシ−５−フルオロシチジン、カルボプラチン(パラプラチン(登録商標))、カルムスチン(ＢｉＣＮＵ(登録商標))、クロラムブシル(リューケラン(登録商標))、シスプラチン(プラチノール(登録商標))、クラドリビン(ロイスタチン(登録商標))、シクロホスファミド(シトキサン(登録商標)またはＮｅｏｓａｒ(登録商標))、シタラビン、シトシンアラビノシド(Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ(登録商標))、シタラビンリポソーム注射(ＤｅｐｏＣｙｔ(登録商標))、ダカルバジン(ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ(登録商標))、ダクチノマイシン(アクチノマイシンＤ、Ｃｏｓｍｅｇａｎ)、塩酸ダウノルビシン(Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ(登録商標))、クエン酸ダウノルビシンリポソーム注射(ＤａｕｎｏＸｏｍｅ(登録商標))、デキサメサゾン、ドセタキセル(タキソテール(登録商標))、塩酸ドキソルビシン(アドリアマイシン(登録商標)、ルベックス(登録商標))、エトポシド(ベプシド(登録商標))、リン酸フルダラビン(フルダラ(登録商標))、５−フルオロウラシル(アドルシル(登録商標)、エフデックス(登録商標))、フルタミド(Ｅｕｌｅｘｉｎ(登録商標))、テザシチビン、ゲムシタビン(ジフルオロデオキシシチジン)、ヒドロキシ尿素(ハイドレア(登録商標))、イダルビシン(イダマイシン(登録商標))、イホスファミド(ＩＦＥＸ(登録商標))、イリノテカン(Ｃａｍｐｔｏｓａｒ(登録商標))、Ｌ−アスパラギナーゼ(ＥＬＳＰＡＲ(登録商標))、ロイコボリンカルシウム、メルファラン(アルケラン(登録商標))、６−メルカプトプリン(ピュリネソール(登録商標))、メトトレキサート(Ｆｏｌｅｘ(登録商標))、ミトキサントロン(ノバントロン(登録商標))、マイロターグ、パクリタキセル(タキソール(登録商標))、ｐｈｏｅｎｉｘ(イットリウム９０／ＭＸ−ＤＴＰＡ)、ペントスタチン、ポリフェプロザン２０とカルムスチンインプラント(グリアデル(登録商標))、クエン酸タモキシフェン(Ｎｏｌｖａｄｅｘ(登録商標))、テニポシド(Ｖｕｍｏｎ(登録商標))、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン(Ｔｉｒａｚｏｎｅ(登録商標))、注射用塩酸トポテカン(ハイカムチン(登録商標))、ビンブラスチン(Ｖｅｌｂａｎ(登録商標))、ビンクリスチン(オンコビン(登録商標))およびビノレルビン(ナベルビン(登録商標))を含む。
代表的アルキル化剤は、窒素マスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソウレア類およびトリアゼン)：ウラシルマスタード(アミノウラシルマスタード(登録商標)、Ｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎａｃｉｌ(登録商標)、Ｄｅｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ(登録商標)、Ｄｅｓｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ(登録商標)、Ｈａｅｍａｎｔｈａｍｉｎｅ(登録商標)、Ｎｏｒｄｏｐａｎ(登録商標)、Ｕｒａｃｉｌ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ(登録商標)、Ｕｒａｃｉｌｌｏｓｔ(登録商標)、Ｕｒａｃｉｌｍｏｓｔａｚａ(登録商標)、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎ(登録商標)、ウラムスチン(登録商標))、クロルメチン(Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ(登録商標))、シクロホスファミド(シトキサン(登録商標)、Ｎｅｏｓａｒ(登録商標)、Ｃｌａｆｅｎ(登録商標)、エンドキサン(登録商標)、プロシトックス(登録商標)、ＲｅｖｉｍｍｕｎｅＴＭ)、イホスファミド(プロシトックス(登録商標))、メルファラン(アルケラン(登録商標))、クロラムブシル(リューケラン(登録商標))、ピポブロマン(Ａｍｅｄｅｌ(登録商標)、Ｖｅｒｃｙｔｅ(登録商標))、トリエチレンメラミン(Ｈｅｍｅｌ(登録商標)、Ｈｅｘａｌｅｎ(登録商標)、Ｈｅｘａｓｔａｔ(登録商標))、トリエチレンチオホスホロアミン、テモゾロミド(テモダール(登録商標))、チオテパ(テモダール(登録商標))、ブスルファン(Ｂｕｓｉｌｖｅｘ(登録商標)、マイレラン(登録商標))、カルムスチン(ＢｉＣＮＵ(登録商標))、ロムスチン(ＣｅｅＮＵ(登録商標))、ストレプトゾシン(ザノサー(登録商標))およびダカルバジン(ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ(登録商標))を含むが、これらに限定されない。さらなる代表的アルキル化剤は、オキサリプラチン(エロキサチン(登録商標))；テモゾロミド(テモダール(登録商標)およびＴｅｍｏｄａｌ(登録商標))；ダクチノマイシン(別名アクチノマイシン−Ｄ、Ｃｏｓｍｅｇｅｎ(登録商標))；メルファラン(別名Ｌ−ＰＡＭ、Ｌ−サルコリシンおよびフェニルアラニンマスタード、アルケラン(登録商標))；アルトレタミン(別名ヘキサメチルメラミン(ＨＭＭ)、Ｈｅｘａｌｅｎ(登録商標))；カルムスチン(ＢｉＣＮＵ(登録商標))；ベンダムスチン(Ｔｒｅａｎｄａ(登録商標))；ブスルファン(ブスルフェクス(登録商標)およびマイレラン(登録商標))；カルボプラチン(パラプラチン(登録商標))；ロムスチン(別名ＣＣＮＵ、ＣｅｅＮＵ(登録商標))；シスプラチン(別名ＣＤＤＰ、プラチノール(登録商標)およびプラチノール(登録商標)−ＡＱ)；クロラムブシル(リューケラン(登録商標))；シクロホスファミド(シトキサン(登録商標)およびＮｅｏｓａｒ(登録商標))；ダカルバジン(別名ＤＴＩＣ、ＤＩＣおよびイミダゾールカルボキサミド、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ(登録商標))；アルトレタミン(別名ヘキサメチルメラミン(ＨＭＭ)、Ｈｅｘａｌｅｎ(登録商標))；イホスファミド(Ｉｆｅｘ(登録商標))；Ｐｒｅｄｎｕｍｕｓｔｉｎｅ；プロカルバジン(Ｍａｔｕｌａｎｅ(登録商標))；メクロレタミン(別名窒素マスタード、ムスチンおよび塩酸メクロロエタミン、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ(登録商標))；ストレプトゾシン(ザノサー(登録商標))；チオテパ(別名チオホスホアミド、ＴＥＳＰＡおよびＴＳＰＡ、テモダール(登録商標))；シクロホスファミド(エンドキサン(登録商標)、シトキサン(登録商標)、Ｎｅｏｓａｒ(登録商標)、プロシトックス(登録商標)、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ(登録商標))；およびベンダムスチンＨＣｌ(Ｔｒｅａｎｄａ(登録商標))を含むが、これらに限定されない。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤と組み合わせて、対象にフルダラビン、シクロホスファミドおよび／またはリツキシマブと組み合わせて投与し得る。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にフルダラビン、シクロホスファミドおよびリツキシマブ(ＦＣＲ)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象はＣＬＬを有する。例えば、対象は、例えば、白血病性細胞において染色体１７の短腕の欠損(ｄｅｌ(１７ｐ))を有する。他の例において、対象はｄｅｌ(１７ｐ)を有しない。ある態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)遺伝子に変異を含む白血病性細胞を含む。他の態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)遺伝子に変異を含む白血病性細胞を含まない。ある態様において、フルダラビンを、約１０〜５０mg／ｍ２(例えば、約１０〜１５mg／ｍ２、１５〜２０mg／ｍ２、２０〜２５mg／ｍ２、２５〜３０mg／ｍ２、３０〜３５mg／ｍ２、３５〜４０mg／ｍ２、４０〜４５mg／ｍ２または４５〜５０mg／ｍ２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。ある態様において、シクロホスファミドを、約２００〜３００mg／ｍ２(例えば、約２００〜２２５mg／ｍ２、２２５〜２５０mg／ｍ２、２５０〜２７５mg／ｍ２または２７５〜３００mg／ｍ２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。ある態様において、リツキシマブを、約４００〜６００mg／ｍ２(例えば、４００〜４５０mg／ｍ２、４５０〜５００mg／ｍ２、５００〜５５０mg／ｍ２または５５０〜６００mg／ｍ２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤と組み合わせて、対象に、ベンダムスチンおよびリツキシマブと組み合わせて投与する。ある態様において、対象はＣＬＬを有する。例えば、対象は、例えば、白血病性細胞において染色体１７の短腕の欠損(ｄｅｌ(１７ｐ))を有する。他の例において、対象はｄｅｌ(１７ｐ)を有しない。ある態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)遺伝子に変異を含む白血病性細胞を含む。他の態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)遺伝子に変異を含む白血病性細胞を含まない。ある態様において、ベンダムスチンを、約７０〜１１０mg／ｍ２(例えば、７０〜８０mg／ｍ２、８０〜９０mg／ｍ２、９０〜１００mg／ｍ２または１００〜１１０mg／ｍ２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。ある態様において、リツキシマブを、約４００〜６００mg／ｍ２(例えば、４００〜４５０mg／ｍ２、４５０〜５００mg／ｍ２、５００〜５５０mg／ｍ２または５５０〜６００mg／ｍ２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤と組み合わせて、対象にリツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよび／またはコルチコステロイド(例えば、プレドニゾン)と組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にリツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾン(Ｒ−ＣＨＯＰ)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象は、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫(ＤＬＢＣＬ)を有する。ある態様において、対象は、大きくない限定病期ＤＬＢＣＬ(例えば、７cm未満のサイズ／直径を有する腫瘍を含む)を有する。ある態様において、対象を、Ｒ−ＣＨＯＰと組み合わせた放射線で処置する。例えば、対象に、Ｒ−ＣＨＯＰ(例えば、１〜６サイクル、例えば、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクルまたは６サイクルのＲ−ＣＨＯＰ)、続いて放射線を投与する。ある場合、対象に、放射線後にＲ−ＣＨＯＰ(例えば、１〜６サイクル、例えば、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクルまたは６サイクルのＲ−ＣＨＯＰ)を投与する。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤と組み合わせて、対象にエトポシド、プレドニゾン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシンおよび／またはリツキシマブと組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にエトポシド、プレドニゾン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシンおよびリツキシマブ(ＥＰＯＣＨ−Ｒ)と組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象に用量調節ＥＰＯＣＨ−Ｒ(ＤＡ−ＥＰＯＣＨ−Ｒ)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象は、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、Ｍｙｃ再構成侵襲性Ｂ細胞リンパ腫を有する。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤と組み合わせて、対象にリツキシマブおよび／またはレナリドマイドと組み合わせて投与する。レナリドマイド((ＲＳ)−３−(４−アミノ−１−オキソ−１,３−ジヒドロ−２Ｈ−イソインドール−２−イル)ピペリジン−２,６−ジオン)は免疫調節剤である。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にリツキシマブおよびレナリドマイドと組み合わせて投与する。ある態様において、対象は、濾胞性リンパ腫(ＦＬ)またはマントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)を有する。ある態様において、対象はＦＬを有し、先に癌治療剤での処置を受けていない。ある態様において、レナリドマイドを、約１０〜２０mg(例えば、１０〜１５mgまたは１５〜２０mg)の用量で、例えば、連日投与する。ある態様において、リツキシマブを、約３５０〜５５０mg／ｍ２(例えば、３５０〜３７５mg／ｍ２、３７５〜４００mg／ｍ２、４００〜４２５mg／ｍ２、４２５〜４５０mg／ｍ２、４５０〜４７５mg／ｍ２または４７５〜５００mg／ｍ２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。
代表的免疫調節剤は、例えば、アフツズマブ(Roche(登録商標)から入手可能)；ペグフィルグラスチム(ニューラスタ(登録商標))；レナリドマイド(ＣＣ−５０１３、レブリミド(登録商標))；サリドマイド(サロミド(登録商標))、ポマリドミド、ａｃｔｉｍｉｄ(ＣＣ４０４７)；およびＩＲＸ−２(インターロイキン１、インターロイキン２およびインターフェロンγを含むヒトサイトカイン混合物、CAS 951209-71-5、IRX Therapeuticsから入手可能)を含む。
代表的アントラサイクリンは、例えば、ドキソルビシン(アドリアマイシン(登録商標)およびルベックス(登録商標))；ブレオマイシン(ｌｅｎｏｘａｎｅ(登録商標))；ダウノルビシン(塩酸ダウノルビシン、ダウノマイシンおよび塩酸ルビドマイシン、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ(登録商標))；ダウノルビシンリポソーム(クエン酸ダウノルビシンリポソーム、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ(登録商標))；ミトキサントロン(ＤＨＡＤ、ノバントロン(登録商標))；エピルビシン(ＥｌｌｅｎｃｅＴＭ)；イダルビシン(イダマイシン(登録商標)、イダマイシンＰＦＳ(登録商標))；マイトマイシンＣ(ムタマイシン(登録商標))；ゲルダナマイシン；ハービマイシン；ラビドマイシン；およびデスアセチルラビドマイシンを含む。
代表的ビンカアルカロイドは、例えば、酒石酸ビノレルビン(ナベルビン(登録商標))、ビンクリスチン(オンコビン(登録商標))およびビンデシン(Ｅｌｄｉｓｉｎｅ(登録商標)))；ビンブラスチン(別名硫酸ビンブラスチン、ビンカロイコブラスチンおよびＶＬＢ、Ａｌｋａｂａｎ−ＡＱ(登録商標)およびＶｅｌｂａｎ(登録商標))；およびビノレルビン(ナベルビン(登録商標))を含む。
代表的プロテオソーム阻害剤は、ボルテゾミブ(ベルケイド(登録商標))；カーフィルゾミブ(ＰＸ−１７１−００７、(Ｓ)−４−メチル−Ｎ−((Ｓ)−１−(((Ｓ)−４−メチル−１−((Ｒ)−２−メチルオキシラン−２−イル)−１−オキソペンタン−２−イル)アミノ)−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル)−２−((Ｓ)−２−(２−モルホリノアセトアミド)−４−フェニルブタンアミド)−ペンタンアミド)；マリゾミブ(ＮＰＩ−００５２)；イキサゾミブクエン酸エステル(ＭＬＮ−９７０８)；デランゾミブ(ＣＥＰ−１８７７０)；およびＯ−メチル−Ｎ−［(２−メチル−５−チアゾリル)カルボニル］−Ｌ−セリル−Ｏ−メチル−Ｎ−［(１Ｓ)−２−［(２Ｒ)−２−メチル−２−オキシラニル］−２−オキソ−１−(フェニルメチル)エチル］−Ｌ−セリンアミド(ＯＮＸ−０９１２)を含む。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤と組み合わせて、対象にブレンツキシマブと組み合わせて投与する。ブレンツキシマブは、抗ＣＤ３０抗体およびモノメチルオーリスタチンＥの抗体−薬物コンジュゲートである。ある態様において、対象は、ホジキンリンパ腫(ＨＬ)、例えば、再発したまたは難治性ＨＬを有する。ある態様において、対象は、ＣＤ３０＋ ＨＬを含む。ある態様において、対象は、自己幹細胞移植(ＡＳＣＴ)を受けている。ある態様において、対象は、ＡＳＣＴを受けていない。ある態様において、ブレンツキシマブを、約１〜３mg／kg(例えば、約１〜１.５mg／kg、１.５〜２mg／kg、２〜２.５mg／kgまたは２.５〜３mg／kg)の用量で、例えば、静脈内に、例えば、３週間毎に投与する。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤と組み合わせて、対象にブレンツキシマブおよびダカルバジンと組み合わせてまたはブレンツキシマブおよびベンダムスチンと組み合わせて投与する。ダカルバジンは、化学名５−(３,３−ジメチル−１−トリアゼニル)イミダゾール−４−カルボキサミドを有するアルキル化剤である。ベンダムスチンは、化学名４−[５−[ビス(２−クロロエチル)アミノ]−１−メチルベンズイミダゾール−２−イル]ブタン酸を有するアルキル化剤である。ある態様において、対象は、ホジキンリンパ腫(ＨＬ)を有する。ある態様において、対象は、先に癌治療剤での処置を受けていない。ある態様において、対象は少なくとも６０歳、例えば、６０歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳、８５歳またはそれ以上である。ある態様において、ダカルバジンを、約３００〜４５０mg／ｍ２(例えば、約３００〜３２５mg／ｍ２、３２５〜３５０mg／ｍ２、３５０〜３７５mg／ｍ２、３７５〜４００mg／ｍ２、４００〜４２５mg／ｍ２または４２５〜４５０mg／ｍ２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。ある態様において、ベンダムスチンを、約７５〜１２５mg／ｍ２(例えば、７５〜１００mg／ｍ２または１００〜１２５mg／ｍ２、例えば、約９０mg／ｍ２)の用量で、例えば、静脈内に投与する。ある態様において、ブレンツキシマブを、約１〜３mg／kg(例えば、約１〜１.５mg／kg、１.５〜２mg／kg、２〜２.５mg／kgまたは２.５〜３mg／kg)の用量で、例えば、静脈内に、例えば、３週間毎に投与する。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にＣＤ２０阻害剤、例えば、抗ＣＤ２０抗体(例えば、抗ＣＤ２０単−または二重特異的抗体)またはそのフラグメントと組み合わせて投与する。代表的抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ、オビヌツズマブ、ＴＲＵ−０１５(Trubion Pharmaceuticals)、オカラツズマブおよびＰｒｏ１３１９２１(Genentech)を含むが、これらに限定されない。例えば、Lim et al. Haematologica. 95.1(2010):135-43参照。
ある態様において、抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブを含む。リツキシマブは、例えば、www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdfに記載のように、ＣＤ２０に結合し、ＣＤ２０発現細胞の細胞溶解を引き起こすキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体ＩｇＧ１カッパである。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にリツキシマブと組み合わせて投与する。ある態様において、対象は、ＣＬＬまたはＳＬＬを有する。
ある態様において、リツキシマブを、静脈内に、例えば、静脈内点滴として投与する。例えば、各注入は、約５００〜２０００mg(例えば、約５００〜５５０、５５０〜６００、６００〜６５０、６５０〜７００、７００〜７５０、７５０〜８００mg、８００〜８５０mg、８５０〜９００mg、９００〜９５０mg、９５０〜１０００mg、１０００〜１１００mg、１１００〜１２００mg、１２００〜１３００mg、１３００〜１４００mg、１４００〜１５００mg、１５００〜１６００mg、１６００〜１７００mg、１７００〜１８００mg、１８００〜１９００mgまたは１９００〜２０００mg)のリツキシマブを提供する。ある態様において、リツキシマブを、１５０mg／ｍ２〜７５０mg／ｍ２、例えば、約１５０〜１７５mg／ｍ２、１７５〜２００mg／ｍ２、２００〜２２５mg／ｍ２、２２５〜２５０mg／ｍ２、２５０〜３００mg／ｍ２、３００〜３２５mg／ｍ２、３２５〜３５０mg／ｍ２、３５０〜３７５mg／ｍ２、３７５〜４００mg／ｍ２、４００〜４２５mg／ｍ２、４２５〜４５０mg／ｍ２、４５０〜４７５mg／ｍ２、４７５〜５００mg／ｍ２、５００〜５２５mg／ｍ２、５２５〜５５０mg／ｍ２、５５０〜５７５mg／ｍ２、５７５〜６００mg／ｍ２、６００〜６２５mg／ｍ２、６２５〜６５０mg／ｍ２、６５０〜６７５mg／ｍ２または６７５〜７００mg／ｍ２の用量で投与し、ここで、ｍ２は対象の体表面積を示す。ある態様において、リツキシマブを、少なくとも４日、例えば、４日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日またはそれ以上の投薬間隔を開けて投与する。例えば、リツキシマブを、少なくとも０.５週間、例えば、０.５週間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間またはそれ以上の投薬間隔を開けて投与する。ある態様において、リツキシマブを、ここに記載する用量および投薬間隔で、一定期間、例えば、少なくとも２週間、例えば、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間またはそれ以上投与する。例えば、リツキシマブを、ここに記載する用量および投薬間隔で、処置サイクルあたり合計少なくとも４回投与で投与する(例えば、処置サイクルあたり少なくとも４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回またはそれ以上投与)。
ある態様において、抗ＣＤ２０抗体は、オファツムマブを含む。オファツムマブは、分子量約１４９kDaの抗ＣＤ２０ ＩｇＧ１κヒトモノクローナル抗体である。例えば、オファツムマブは、トランスジェニックマウスおよびハイブリドーマテクノロジーを使用して産生し、組み換えマウス細胞株(ＮＳ０)で発現され、精製される。例えば、www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf；および治験番号NCT01363128、NCT01515176、NCT01626352およびNCT01397591参照。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にオファツムマブと組み合わせて投与する。ある態様において、対象は、ＣＬＬまたはＳＬＬを有する。
ある態様において、オファツムマブを静脈内点滴として投与する。例えば、各注入は、約１５０〜３０００mg(例えば、約１５０〜２００mg、２００〜２５０mg、２５０〜３００mg、３００〜３５０mg、３５０〜４００mg、４００〜４５０mg、４５０〜５００mg、５００〜５５０mg、５５０〜６００mg、６００〜６５０mg、６５０〜７００mg、７００〜７５０mg、７５０〜８００mg、８００〜８５０mg、８５０〜９００mg、９００〜９５０mg、９５０〜１０００mg、１０００〜１２００mg、１２００〜１４００mg、１４００〜１６００mg、１６００〜１８００mg、１８００〜２０００mg、２０００〜２２００mg、２２００〜２４００mg、２４００〜２６００mg、２６００〜２８００mgまたは２８００〜３０００mg)のオファツムマブを提供する。ある態様において、オファツムマブを約３００mgの出発用量で開始し、続いて２０００mgで、例えば、約１１回投与、例えば、２４週間投与する。ある態様において、オファツムマブを、少なくとも４日、例えば、４日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日またはそれ以上の投薬間隔を開けて投与する。例えば、オファツムマブを、少なくとも１週間、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、２４週間、２６週間、２８週間、２０週間、２２週間、２４週間、２６週間、２８週間、３０週間またはそれ以上の投薬間隔で投与する。ある態様において、オファツムマブを、ここに記載する用量および投薬間隔で、一定期間、例えば、少なくとも１週間、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２２週間、２４週間、２６週間、２８週間、３０週間、４０週間、５０週間、６０週間またはそれ以上または１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月またはそれ以上または１年、２年、３年、４年、５年またはそれ以上投与する。例えば、オファツムマブを、ここに記載する用量および投薬間隔で、処置サイクルあたり合計少なくとも２回投与で投与する(例えば、処置サイクルあたり少なくとも２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１８回、２０回またはそれ以上投与)。
ある場合、抗ＣＤ２０抗体はオクレリズマブを含む。オクレリズマブは、例えば、治験番号NCT00077870、NCT01412333、NCT00779220、NCT00673920、NCT01194570およびKappos et al. Lancet. 19.378 (2011):1779-87に記載される、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。
ある場合、抗ＣＤ２０抗体はベルツズマブを含む。ベルツズマブはＣＤ２０に対するヒト化モノクローナル抗体である。例えば、治験番号NCT00547066、NCT00546793、NCT01101581およびGoldenberg et al. Leuk Lymphoma. 51(5)(2010):747-55参照。
ある場合、抗ＣＤ２０抗体はＧＡ１０１を含む。ＧＡ１０１(別名オビヌツズマブまたはRO5072759)は、ヒト化および糖操作された抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。例えば、Robak. Curr. Opin. Investig. Drugs. 10.6(2009):588-96; 治験番号NCT01995669、NCT01889797、NCT02229422およびNCT01414205;およびwww.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf参照。
ある場合、抗ＣＤ２０抗体はＡＭＥ-１３３ｖを含む。ＡＭＥ-１３３ｖ(別名LY2469298またはオカラツズマブ)は、リツキシマブと比較して、ＦｃγＲIIIａ受容体に対する親和性が増加され、抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)活性が増強されたＣＤ２０に対するヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25;およびForero-Torres et al. Clin Cancer Res. 18.5(2012):1395-403参照。
ある場合、抗ＣＤ２０抗体は、ＰＲＯ１３１９２１を含む。ＰＲＯ１３１９２１は、リツキシマブと比較して、ＦｃγＲIIIａへの結合が良好であり、ＡＤＣＣが増強されるように操作されたヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25;およびCasulo et al. Clin Immunol. 154.1(2014):37-46；および治験番号NCT00452127参照。
ある場合、抗ＣＤ２０抗体はＴＲＵ-０１５を含む。ＴＲＵ-０１５は、ＣＤ２０に対する抗体のドメイン由来の抗ＣＤ２０融合タンパク質である。ＴＲＵ-０１５はモノクローナル抗体より小さいが、Ｆｃ介在エフェクター機能を維持する。例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25参照。ＴＲＵ-０１５は、ヒトＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインと連結した抗ＣＤ２０一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)を含むが、ＣＨ１およびＣＬドメインを欠く。
ある態様において、抗ＣＤ２０ここに記載する抗体は、ここに記載する治療剤、例えば、化学療法剤(例えば、シトキサン、フルダラビン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、デメチル化剤、ペプチドワクチン、抗腫瘍抗生物質、チロシンキナーゼ阻害剤、アルキル化剤、抗微小管または抗有糸分裂剤)、抗アレルギー剤、抗悪心剤(または鎮吐剤)、鎮痛剤または細胞保護剤とコンジュゲートしているかまたは他に結合している。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にＢ細胞リンパ腫２(ＢＣＬ-２)阻害剤(例えば、ベネトクラックス、別名ＡＢＴ-１９９またはＧＤＣ-０１９９)および／またはリツキシマブと組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象にベネトクラックスおよびリツキシマブと組み合わせて投与する。ベネトクラックスは、抗アポトーシスタンパク質、ＢＣＬ-２を阻害する小分子である。ベネトクラックス(４-(４-{[２-(４-クロロフェニル)-４,４-ジメチルシクロヘキシ-１-エン-１-イル]メチル}ピペラジン-１-イル)-Ｎ-({３-ニトロ-４-[(テトラヒドロ-２Ｈ-ピラン-４-イルメチル)アミノ]フェニル}スルホニル)-２-(１Ｈ-ピロロ[２,３-ｂ]ピリジン-５-イルオキシ)ベンズアミド)の構造を下に示す。
ある態様において、対象はＣＬＬを有する。ある態様において、対象は、再発したＣＬＬを有し、例えば、対象は、先に癌治療剤を投与されている。ある態様において、ベネトクラックスを、約１５〜６００mg(例えば、１５〜２０mg、２０〜５０mg、５０〜７５mg、７５〜１００mg、１００〜２００mg、２００〜３００mg、３００〜４００mg、４００〜５００mgまたは５００〜６００mg)の用量で、例えば、連日投与する。ある態様において、リツキシマブを、約３５０〜５５０mg／ｍ２(例えば、３５０〜３７５mg／ｍ２、３７５〜４００mg／ｍ２、４００〜４２５mg／ｍ２、４２５〜４５０mg／ｍ２、４５０〜４７５mg／ｍ２または４７５〜５００mg／ｍ２)の用量で、静脈内に、例えば、月１回投与する。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤と組み合わせて、対象にＴｒｅｇ細胞集団を減少させる分子と組み合わせて投与する。Ｔｒｅｇ細胞の数を減らす(例えば、枯渇させる)方法は当分野で知られ、例えば、ＣＤ２５枯渇、シクロホスファミド投与、ＧＩＴＲ機能調節を含む。理論に拘束されないが、アフェレシス前またはここに記載するＣＡＲ発現細胞の投与に対象におけるＴｒｅｇ細胞の数を減らすことは、腫瘍微小環境における望まない免疫細胞(例えば、Ｔｒｅｇ)の数を減らし、対象の再発リスクを減らすと考えられる。ある態様において、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤と組み合わせて、対象に、制御性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)を枯渇させるＧＩＴＲアゴニストおよび／またはＧＩＴＲ抗体のようなＧＩＴＲを標的とするおよび／またはＧＩＴＲ機能を調節する分子と組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤と組み合わせて、対象にシクロホスファミドと組み合わせて投与する。ある態様において、ＧＩＴＲ結合分子および／またはＧＩＴＲ機能を調節する分子(例えば、ＧＩＴＲアゴニストおよび／またはＴｒｅｇ枯渇ＧＩＴＲ抗体)を、ＣＡＲ発現細胞の投与前に投与する。例えば、ある態様において、ＧＩＴＲアゴニストを、細胞のアフェレシス前に投与できる。ある態様において、シクロホスファミドを、対象にＣＡＲ発現細胞の投与(例えば、注入または再注入)前または細胞のアフェレシス前に投与する。ある態様において、シクロホスファミドおよび抗ＧＩＴＲ抗体を、対象にＣＡＲ発現細胞の投与(例えば、注入または再注入)前または細胞のアフェレシス前に投与する。ある態様において、対象は癌(例えば、固形癌またはＡＬＬまたはＣＬＬのような血液癌)を有する。ある態様において、対象はＣＬＬを有する。ある態様において、対象はＡＬＬを有する。ある態様において、対象は固形癌、例えば、ここに記載する固形癌を有する。
代表的ＧＩＴＲアゴニストは、例えば、米国特許６,１１１,０９０号、欧州特許０９０５０５Ｂ１号、米国特許８,５８６,０２３号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／００３１１８号および２０１１／０９０７５４号に記載のＧＩＴＲ融合タンパク質または例えば、米国特許７,０２５,９６２号、欧州特許１９４７１８３Ｂ１号、米国特許７,８１２,１３５号、米国特許８,３８８,９６７号、米国特許８,５９１,８８６号、欧州特許ＥＰ１８６６３３９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０２８６８３号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／０３９９５４号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／００７１９０号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００７／１３３８２２号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／０５５８０８号、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／４０１９６号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００１／０３７２０号、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／２０７５８号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０８３２８９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／１１５４５１号、米国特許７,６１８,６３２号およびＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０５１７２６号に記載の抗ＧＩＴＲ抗体のような、例えば、ＧＩＴＲ融合タンパク質および抗ＧＩＴＲ抗体(例えば、二価抗ＧＩＴＲ抗体)を含む。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞とここに記載するキナーゼ阻害剤の組み合わせを、対象にＧＩＴＲアゴニスト、例えば、ここに記載するＧＩＴＲアゴニストと組み合わせて投与する。ある態様において、ＧＩＴＲアゴニストを、ＣＡＲ発現細胞の前に投与する。例えば、ある態様において、ＧＩＴＲアゴニストを、細胞のアフェレシス前に投与できる。ある態様において、対象はＣＬＬを有する。
カルシウム依存的ホスファターゼカルシニューリンを阻害する(シクロスポリンおよびＦＫ５０６)または増殖因子誘発シグナル伝達に重要であるｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する薬物(ラパマイシン)(Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993)も使用できる。さらなる面において、本発明の細胞組成物を、患者に骨髄移植、フルダラビンのような化学療法剤、体外照射療法(ＸＲＴ)、シクロホスファミドおよび／またはＯＫＴ３またはＣＡＭＰＡＴＨのような抗体を使用するＴ細胞除去療法と組み合わせて(例えば、前に、同時にまたは後に)投与し得る。一つの面において、本発明の細胞組成物を、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサンのようなＢ細胞除去療法後に投与する。例えば、ある態様において、対象を、高用量化学療法剤と続く末梢血幹細胞移植の標準的処置に付す。ある態様において、移植後、対象は、本発明の増殖した免疫細胞の注入を受ける。さらなる態様において、増殖細胞を手術の前または後に投与する。
ある態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞の投与と関係する副作用を軽減または改善する薬剤を投与され得る。ＣＡＲ発現細胞の投与と関係する副作用は、ＣＲＳおよびマクロファージ活性化症候群(ＭＡＳ)とも呼ぶ血球貪食性リンパ組織球症(ＨＬＨ)を含むが、これらに限定されない。ＣＲＳの症状は、高熱、悪心、一過性低血圧、低酸素症などを含む。従って、ここに記載する方法は、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の対象への投与およびさらにＣＡＲ発現細胞の処置に起因する可溶性因子のレベル上昇を管理する薬剤の投与を含み得る。ある態様において、対象で上昇する可溶性因子は、ＩＦＮ-γ、ＴＮＦα、ＩＬ-２受容体およびＩＬ-６の１以上である。それゆえに、この副作用を処置するために投与する薬剤は、これらの可溶性因子の１以上を中和する薬剤であり得る。このような薬剤の例は、ステロイド(例えば、コルチコステロイド)、ＴＮＦαの阻害剤およびＩＬ-６の阻害剤を含むが、これらに限定されない。ＴＮＦα阻害剤の例は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴールおよびゴリムマブのような、抗ＴＮＦα抗体分子である。ＴＮＦα阻害剤の他の例は、エタネルセプトのような融合タンパク質である。小分子ＴＮＦαの阻害剤は、キサンチン誘導体(例えばペントキシフィリン)およびブプロピオンを含むが、これらに限定されない。ＩＬ-６阻害剤の例は、トシリズマブ(ｔｏｃ)、サリルマブ、エルシリモマブ、ＣＮＴＯ３２８、ＡＬＤ５１８／ＢＭＳ-９４５４２９、ＣＮＴＯ１３６、ＣＰＳＩ-２３６４、ＣＤＰ６０３８、ＶＸ３０、ＡＲＧＸ-１０９、ＦＥ３０１およびＦＭ１０１のような抗ＩＬ-６抗体分子または抗ＩＬ-６受容体抗体分子である。ある態様において、抗ＩＬ-６受容体抗体分子は、トシリズマブである。ＩＬ-１Ｒベースの阻害剤の例は、アナキンラである。
ある態様において、対象に、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を投与できる。例えば、ある態様において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であり得る。阻害分子、例えば、プログラム死１(ＰＤ１)は、ある態様において、ＣＡＲ発現細胞が免疫エフェクター応答を開始させる能力を低下できる。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ-Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ-１、ＣＥＡＣＡＭ-３および／またはＣＥＡＣＡＭ-５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータを含む。阻害分子の、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害による阻害は、ＣＡＲ発現細胞性能を最適化できる。ある態様において、阻害性核酸、例えば、阻害性核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、群生性等間隔短回文反復配列(ＣＲＩＳＰＲ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)または亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)は、ＣＡＲ発現細胞における阻害分子の発現阻害に使用できる。ある態様において、阻害剤はｓｈＲＮＡである。ある態様において、阻害分子はＣＡＲ発現細胞内で阻害される。これらの態様において、阻害分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子は、ＣＡＲの要素、例えば、全ての要素をコードする核酸と連結する。ある態様において、阻害性シグナルの阻害剤は、例えば、阻害分子と結合する抗体または抗体フラグメントであり得る。例えば、薬剤は、ＰＤ１、ＰＤ-Ｌ１、ＰＤ-Ｌ２またはＣＴＬＡ４と結合する抗体または抗体フラグメント(例えば、イピリムマブ(ＭＤＸ-０１０およびＭＤＸ-１０１とも呼ばれ、ヤーボイ(登録商標)として市販；Bristol-Myers Squibb；トレメリムマブ(Pfizerから入手可能なＩｇＧ２モノクローナル抗体、以前はチシリムマブ、ＣＰ-６７５,２０６として知られる))である。ある態様において、薬剤は、ＴＩＭ３と結合する抗体または抗体フラグメントである。ある態様において、薬剤は、ＬＡＧ３と結合する抗体または抗体フラグメントである。ある態様において、薬剤は、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ-１、ＣＥＡＣＡＭ-３および／またはＣＥＡＣＡＭ-５)と結合する抗体または抗体フラグメントである。
ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ-４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも含む、受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害メンバーである。ＰＤ-１は活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄球性細胞上に発現される(Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75)。ＰＤ１に対する２個のリガンド、ＰＤ-Ｌ１およびＰＤ-Ｌ２は、ＰＤ１への結合によりＴ細胞活性化を下方制御することが示されている(Freeman et al. 2000 J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. 2001 Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. 2002 Eur J Immunol 32:634-43)。ＰＤ-Ｌ１はヒト癌で豊富である(Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7; Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314; Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ-Ｌ１の局所相互作用の阻害により反転させ得る。ＰＤ１、ＰＤ-Ｌ１およびＰＤ-Ｌ２の抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤が知られ、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲと組み合わせて使用し得る。例えば、ニボルマブ(BMS-936558またはMDX1106とも呼ばれる；Bristol-Myers Squibb)は、ＰＤ１と特異的に遮断する完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ＰＤ１と特異的に結合するニボルマブ(クローン５Ｃ４)および他のヒトモノクローナル抗体が、ＵＳ８,００８,４４９号およびＷＯ２００６／１２１１６８号に開示される。ピディリズマブ(ＣＴ-０１１；Cure Tech)は、ＰＤ１と結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体である。ピディリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ１モノクローナル抗体は、ＷＯ２００９／１０１６１１号に開示される。ペンブロリズマブ(以前はランブロリズマブとして知られ、Ｋｅｙｔｒｕｄａ、ＭＫ０３４７５とも称される；Merck)は、ＰＤ１に結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ペンブロリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ１抗体は、ＵＳ８,３５４,５０９号およびＷＯ２００９／１１４３３５号に開示される。ＭＥＤＩ４７３６(Medimmune)は、ＰＤＬ１に結合し、リガンドとＰＤ１の反応を阻害するヒトモノクローナル抗体である。ＭＤＰＬ３２８０Ａ(Genentech/Roche)は、ＰＤ-Ｌ１に結合するヒトＦｃ最適化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ＭＤＰＬ３２８０ＡおよびＰＤ-Ｌ１に対する他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許７,９４３,７４３号および米国公開２０１２００３９９０６号に開示されている。他の抗ＰＤ-Ｌ１結合剤は、ＹＷ２４３.５５.Ｓ７０(ＷＯ２０１０／０７７６３４号における配列番号２０および２１に示す重鎖および軽鎖可変領域)およびＭＤＸ-１１０５(ＢＭＳ-９３６５５９とも呼ばれ、例えば、ＷＯ２００７／００５８７４号に開示の抗ＰＤ-Ｌ１結合剤)である。ＡＭＰ-２２４(Ｂ７-ＤＣＩｇ；Amplimmune；例えば、ＷＯ２０１０／０２７８２７号およびＷＯ２０１１／０６６３４２号に開示)は、ＰＤ１とＢ７-Ｈ１の相互作用を遮断するＰＤ-Ｌ２ Ｆｃ融合可溶性受容体である。他の抗ＰＤ１抗体は、ＡＭＰ５１４(Amplimmune)、数ある中で、例えば、ＵＳ８,６０９,０８９号、ＵＳ２０１００２８３３０号および／またはＵＳ２０１２０１１４６４９号に開示の抗ＰＤ１抗体を含む。
ＴＩＭ-３(Ｔ細胞免疫グロブリン-３)も、特にＩＦＮ-ｇ分泌ＣＤ４＋ Ｔヘルパー１およびＣＤ８＋ Ｔ細胞毒性１細胞において、Ｔ細胞機能を負に制御し、Ｔ細胞疲弊に重要な役割を有する。ＴＩＭ３とそのリガンド、例えば、ガレクチン-９(Ｇａｌ９)、ホスファチジルセリン(ＰＳ)およびＨＭＧＢ１の相互作用の阻害は免疫応答を高め得る。ＴＩＭ３およびそのリガンドの抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤は当分野で利用可能であり、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲと組み合わせて使用し得る。例えば、ＴＩＭ３を標的とする抗体、抗体フラグメント、小分子またはペプチド阻害剤は、そのリガンドとの相互作用を阻害するためにＴＩＭ３のＩｇＶドメインに結合する。ＴＩＭ３を阻害する抗体およびペプチドは、ＷＯ２０１３／００６４９０号およびＵＳ２０１００２４７５２１号に開示されている。他の抗ＴＩＭ３抗体は、ＲＭＴ３-２３のヒト化バージョン(Ngiow et al., 2011, Cancer Res, 71:3540-3551に開示)およびクローン８Ｂ.２Ｃ１２(Monney et al., 2002, Nature, 415:536-541に開示)を含む。ＴＩＭ３およびＰＤ-１を阻害する二特異性抗体はＵＳ２０１３０１５６７７４号に開示されている。
他の態様において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、ＣＥＡＣＡＭ阻害剤(例えば、ＣＥＡＣＡＭ-１、ＣＥＡＣＡＭ-３および／またはＣＥＡＣＡＭ-５阻害剤)である。ある態様において、ＣＥＡＣＡＭの阻害剤は、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体分子である。代表的抗ＣＥＡＣＡＭ-１抗体は、ＷＯ２０１０／１２５５７１号、ＷＯ２０１３／０８２３６６号、ＷＯ２０１４／０５９２５１およびＷＯ２０１４／０２２３３２号に開示され、例えば、モノクローナル抗体３４Ｂ１、２６Ｈ７および５Ｆ４；または例えば、ＵＳ２００４／００４７８５８号、ＵＳ７,１３２,２５５号およびＷＯ９９／０５２５５２号に開示のようなその組み換え形態である。他の態様において、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体は、例えば、Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529 (DOI:10:1371/journal.pone.0021146)に記載のようにＣＥＡＣＡＭ-５と結合するかまたは例えば、ＷＯ２０１３／０５４３３１号およびＵＳ２０１４／０２７１６１８号に記載のようにＣＥＡＣＡＭ-１およびＣＥＡＣＡＭ-５と交差反応する。
理論に拘束されないが、ＣＥＡＣＡＭ-１およびＣＥＡＣＡＭ-５のような癌胎児性抗原細胞接着分子(ＣＥＡＣＡＭ)は、少なくとも一部、抗腫瘍免疫応答の阻害に介在すると考えられる(例えば、Markel et al. J Immunol. 2002 Mar 15;168(6):2803-10; Markel et al. J Immunol. 2006 Nov 1;177(9):6062-71; Markel et al. Immunology. 2009 Feb;126(2):186-200; Markel et al. Cancer Immunol Immunother. 2010 Feb;59(2):215-30; Ortenberg et al. Mol Cancer Ther. 2012 Jun;11(6):1300-10; Stern et al. J Immunol. 2005 Jun 1;174(11):6692-701; Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529参照)。例えば、ＣＥＡＣＡＭ-１は、ＴＩＭ-３のヘテロ親和性リガンドとして、そしてＴＩＭ-３介在Ｔ細胞耐容性および疲弊に役割を有するとして記載されている(例えば、ＷＯ２０１４／０２２３３２号；Huang, et al. (2014) Nature doi:10.1038/nature13848三種)。ある態様において、ＣＥＡＣＡＭ-１およびＴＩＭ-３の共遮断が、異種移植結腸直腸癌モデルにおいて抗腫瘍免疫応答を増強することが示されている(例えば、ＷＯ２０１４／０２２３３２号；Huang, et al. (2014), supra参照)。他の態様において、ＣＥＡＣＡＭ-１およびＰＤ-１の共遮断は、例えば、ＷＯ２０１４／０５９２５１号に記載されるようにＴ細胞耐容性を減少させる。それゆえに、ＣＥＡＣＡＭ阻害剤を、ここに記載する他の免疫調節剤(例えば、抗ＰＤ-１および／または抗ＴＩＭ-３阻害剤)と使用して、癌、例えば、黒色腫、肺癌(例えば、ＮＳＣＬＣ)、膀胱癌、結腸癌、卵巣癌およびここに記載の他の癌に対する免疫応答を増強させ得る。
ＬＡＧ-３(リンパ球活性化遺伝子-３またはＣＤ２２３)は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞疲弊に役割を有することが示されている、活性化Ｔ細胞およびＢ細胞に発現される細胞表面分子である。ＬＡＧ-３およびそのリガンドの抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤は当分野で入手可能であり、ここに記載するＣＤ１９ ＣＡＲと組み合わせて使用し得る。例えば、ＢＭＳ-９８６０１６(Bristol-Myers Squib)は、ＬＡＧ３を標的とするモノクローナル抗体である。ＩＭＰ７０１(Immutep)は、アンタゴニストＬＡＧ-３抗体であり、IMP731(ImmutepおよびGlaxoSmithKline)は枯渇性ＬＡＧ-３抗体である。他のＬＡＧ-３阻害剤は、ＬＡＧ３の可溶性部分とＭＨＣクラスII分子のＩｇの組み換え融合タンパク質であり、抗原提示細胞(ＡＰＣ)を活性化するＩＭＰ３２１(Immutep)である。他の抗体は、例えば、ＷＯ２０１０／０１９５７０号に開示されている。
ある態様において、ＣＡＲ治療およびキナーゼ阻害剤を、ｔｏｌｌ様受容体(ＴＬＲ)アゴニストと組み合わせて投与する。ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ９アゴニストであり得る。ある態様において、ＴＬＲアゴニストは、オリゴデオキシヌクレオチド、例えば、ＣＧ富化オリゴデオキシヌクレオチド、例えば、非メチル化ＣＧ富化オリゴデオキシヌクレオチドである。例えば、引用によりその全体を本明細書に包含させるSagiv-Barfi et al., “Ibrutinib enhances the antitumor immune response induced by intratumoral injection of a TLR9 ligand in syngeneic mouse lymphoma model.” Blood. 2015 Feb 6. pii: blood-2014-08-593137参照。ある態様において、ＴＬＲアゴニストを、ＣＡＲ発現ＮＫ細胞と組み合わせて投与する。理論に拘束されないが、ＴＬＲアゴニストは、ＣＡＲ発現ＮＫ細胞のようなＮＫ細胞の活性化を促進し得る。ある態様において、ＴＬＲアゴニストを注射、例えば、腫瘍内注射により投与する。
ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、例えば、第一ドメインおよび第二ドメインを含む融合タンパク質であってよく、ここで、第一ドメインは阻害分子またはそのフラグメントであり、第二ドメインは陽性シグナルと関係するポリペプチド、例えば、ここに記載の細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである。ある態様において、陽性シグナルと結合するポリペプチドは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳの共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ２７および／またはＩＣＯＳの細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または例えば、ここに記載する、例えば、ＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達ドメインを含み得る。ある態様において、融合タンパク質は、ＣＡＲを発現するのと同じ細胞により発現される。他の態様において、融合タンパク質は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現しない細胞、例えば、Ｔ細胞により発現される。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤はｍｉＲ-１７-９２である。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲの活性を増強する薬剤はサイトカインである。サイトカインは、Ｔ細胞増殖、分化、生存および恒常性に関連する重要な機能を有する。ここに記載するＣＡＲ発現細胞を受ける対象に投与できるサイトカインは、ＩＬ-２、ＩＬ-４、ＩＬ-７、ＩＬ-９、ＩＬ-１５、ＩＬ-１８およびＩＬ-２１またはこれらの組み合わせを含む。好ましい態様において、投与するサイトカインはＩＬ-７、ＩＬ-１５またはＩＬ-２１またはこれらの組み合わせである。サイトカインを、１日１回または１日１回以上、例えば、１日２回、１日３回または１日４回投与できる。サイトカインを、１日以上投与でき、例えば、サイトカインを２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間または４週間投与する。例えば、サイトカインを１日１回、７日間投与する。
ある態様において、サイトカインをＣＡＲ発現細胞と組み合わせて投与する。サイトカインを、ＣＡＲ発現細胞と同時にまたは一緒に投与でき、例えば、同じ日に投与する。サイトカインをＣＡＲ発現Ｔ細胞と同じ医薬組成物に製剤しても、別の医薬組成物に製剤してもよい。あるいは、サイトカインを、ＣＡＲＴ発現細胞の投与後間もなく、例えば、ＣＡＲ発現細胞投与１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日後に投与してよい。サイトカインを１日を超える投薬レジメンで投与する態様において、サイトカイン投薬レジメンの１日目はＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与と同じ日でよく、またはサイトカイン投薬レジメンの１日目は、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日後であってよい。ある態様において、１日目に、ＣＡＲ発現細胞を対象に投与し、２日目に、サイトカインを１日１回、翌７日間投与する。好ましい態様において、ＣＡＲ発現細胞と組み合わせて投与するサイトカインはＩＬ-７、ＩＬ-１５および／またはＩＬ-２１である。
他の態様において、サイトカインを、ＣＡＲ発現細胞の投与から十分な期間後、例えば、ＣＡＲ発現細胞の投与から少なくとも２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、１０週間、１２週間、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月または１年またはそれ以上の後に投与する。ある態様において、サイトカインを、ＣＡＲ発現細胞に対する対象の応答の評価後に投与する。例えば、対象にここに記載する用量およびレジメンに従い、ＣＡＲ発現細胞を投与する。ＣＡＲＴ治療に対する対象の応答を、腫瘍増殖阻止、循環腫瘍細胞減少または腫瘍退縮を含む、ここに記載する方法のいずれかを使用して、ＣＡＲ発現細胞の投与２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、１０週間、１２週間、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月または１年またはそれ以上後に評価する。ＣＡＲＴ治療に対して十分な応答を示さない対象にサイトカインを投与し得る。ＣＡＲＴ治療に対して応答が最適以下である対象へのサイトカインの投与は、ＣＡＲＴ有効性または抗腫瘍活性を改善する。好ましい態様において、ＣＡＲ発現細胞の投与後に投与するサイトカインはＩＬ-７である。
低用量のｍＴＯＲ阻害剤との組み合わせ
ある態様において、ＣＡＲ分子を発現する細胞、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子は、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて投与される。
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％、しかし９０％を超えない、少なくとも１０％、しかし９０％を超えない、少なくとも１５％、しかし９０％を超えない、少なくとも２０％、しかし９０％を超えない、少なくとも３０％、しかし９０％を超えない、少なくとも４０％、しかし９０％を超えない、少なくとも５０％、しかし９０％を超えない、少なくとも６０％、しかし９０％を超えないまたは少なくとも７０％、しかし９０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたは提供するものである。
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％、しかし８０％を超えない、少なくとも１０％、しかし８０％を超えない、少なくとも１５％、しかし８０％を超えない、少なくとも２０％、しかし８０％を超えない、少なくとも３０％、しかし８０％を超えない、少なくとも４０％、しかし８０％を超えない、少なくとも５０％、しかし８０％を超えないまたは少なくとも６０％、しかし８０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたは提供するものである。
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％、しかし７０％を超えない、少なくとも１０％、しかし７０％を超えない、少なくとも１５％、しかし７０％を超えない、少なくとも２０％、しかし７０％を超えない、少なくとも３０％、しかし７０％を超えない、少なくとも４０％、しかし７０％を超えないまたは少なくとも５０％、しかし７０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたは提供するものである。
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％、しかし６０％を超えない、少なくとも１０％、しかし６０％を超えない、少なくとも１５％、しかし６０％を超えない、少なくとも２０％、しかし６０％を超えない、少なくとも３０％、しかし６０％を超えないまたは少なくとも４０％、しかし６０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたは提供するものである。
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％、しかし５０％を超えない、少なくとも１０％、しかし５０％を超えない、少なくとも１５％、しかし５０％を超えない、少なくとも２０％、しかし５０％を超えない、少なくとも３０％、しかし５０％を超えないまたは少なくとも４０％、しかし５０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたは提供するものである。
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％、しかし４０％を超えない、少なくとも１０％、しかし４０％を超えない、少なくとも１５％、しかし４０％を超えない、少なくとも２０％、しかし４０％を超えない、少なくとも３０％、しかし４０％を超えないまたは少なくとも３５％、しかし４０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたは提供するものである。
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％、しかし３０％を超えない、少なくとも１０％、しかし３０％を超えない、少なくとも１５％、しかし３０％を超えない、少なくとも２０％、しかし３０％を超えないまたは少なくとも２５％、しかし３０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたは提供するものである。
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％、しかし２０％を超えない、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％、しかし３０％を超えない、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％、しかし３５％を超えない、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％、しかし４０％を超えないまたは少なくとも１％、２％、３％、４％または５％、しかし４５％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたは提供するものである。
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも１％、２％、３％、４％または５％、しかし９０％を超えないｍＴＯＲ阻害と関係するまたは提供するものである。
ここに記載するように、ｍＴＯＲ阻害の程度は、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ阻害の程度として表すことができ、例えば、ｍＴＯＲ阻害の程度を、例えば、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ基質のリン酸化の減少による、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ活性のレベルの減少により決定できる。ｍＴＯＲ阻害レベルは、ここに記載する方法により、例えばＢｏｕｌａｙアッセイまたはウェスタンブロットによるリン酸化Ｓ６レベルの測定により評価できる。
代表的ＭＴＯＲ阻害剤
ここで使用する用語“ｍＴＯＲ阻害剤”は、細胞におけるｍＴＯＲキナーゼを阻害する化合物またはリガンドまたはその薬学的に許容される塩をいう。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤はアロステリック阻害剤である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は触媒的阻害剤である。
アロステリックｍＴＯＲ阻害剤は、中性三環式化合物ラパマイシン(シロリムス)、例えば、ラパマイシン誘導体、ラパマイシン類似体(ラパログとも呼ぶ)およびｍＴＯＲ活性を阻害する他のマクロライド化合物を含む、ラパマイシンに構造的および機能的類似性を有する化合物であるラパマイシン関連化合物を含む。
ラパマイシンは、式Ａに示す構造を有する、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカスにより産生される既知マクロライド抗生物質である。
例えば、McAlpine, J.B., et al., J. Antibiotics (1991) 44: 688; Schreiber, S.L., et al., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113: 7433；米国特許３,９２９,９９２号参照。ラパマイシンについて多様な番号付けスキームが提唱されている。混乱を避けるために、特定のラパマイシン類似体をここで名づけるとき、式Ａの番号付けスキームを使用したラパマイシンを参照して名付ける。
本発明において有用なラパマイシン類似体は、例えば、ラパマイシンのシクロヘキシル環におけるヒドロキシル基がＯＲ１(ここで、Ｒ１はヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、アシルアミノアルキルまたはアミノアルキルである)で置換されているＯ置換類似体であり、例えばその内容を引用して本明細書に包含させるＵＳ５,６６５,７７２号およびＷＯ９４／０９０１０号に記載された、エベロリムスとしても知られるＲＡＤ００１である。他の適当なラパマイシン類似体は、２６位または２８位が置換されているものを含む。ラパマイシン類似体は、上記類似体のエピマーであってよく、特に、例えば、その内容を引用して本明細書に包含させるＵＳ６,０１５,８１５号、ＷＯ９５／１４０２３号およびＷＯ９９／１５５３０号に記載のとおり、４０位、２８位または２６位が置換され、所望によりさらに水素化されていてよい類似体のエピマー、例えばゾタロリムスとして知られるＡＢＴ５７８またはその内容を引用して本明細書に包含させるＵＳ７,０９１,２１３号、ＷＯ９８／０２４４１号およびＷＯ０１／１４３８７号に記載のラパマイシン類似体、例えばリダフォロリムスとしても知られるＡＰ２３５７３を含む。
ＵＳ５,６６５,７７２号の本発明における使用に適当なラパマイシン類似体の例は、４０-Ｏ-ベンジル-ラパマイシン、４０-Ｏ-(４’-ヒドロキシメチル)ベンジル-ラパマイシン、４０-Ｏ-[４’-(１,２-ジヒドロキシエチル)]ベンジル-ラパマイシン、４０-Ｏ-アリル-ラパマイシン、４０-Ｏ-[３’-(２,２-ジメチル-１,３-ジオキソラン-４(Ｓ)-イル)-プロプ-２’-エン-１’-イル]-ラパマイシン、(２’Ｅ,４’Ｓ)-４０-Ｏ-(４’,５’-ジヒドロキシペント-２’-エン-１’-イル)-ラパマイシン、４０-Ｏ-(２-ヒドロキシ)エトキシカルボニルメチル-ラパマイシン、４０-Ｏ-(２-ヒドロキシ)エチル-ラパマイシン、４０-Ｏ-(３-ヒドロキシ)プロピル-ラパマイシン、４０-Ｏ-(６-ヒドロキシ)ヘキシル-ラパマイシン、４０-Ｏ-[２-(２-ヒドロキシ)エトキシ]エチル-ラパマイシン、４０-Ｏ-[(３Ｓ)-２,２-ジメチルジオキソラン-３-イル]メチル-ラパマイシン、４０-Ｏ-[(２Ｓ)-２,３-ジヒドロキシプロプ-１-イル]-ラパマイシン、４０-Ｏ-(２-アセトキシ)エチル-ラパマイシン、４０-Ｏ-(２-ニコチノイルオキシ)エチル-ラパマイシン、４０-Ｏ-[２-(Ｎ-モルホリノ)アセトキシ]エチル-ラパマイシン、４０-Ｏ-(２-Ｎ-イミダゾリルアセトキシ)エチル-ラパマイシン、４０-Ｏ-[２-(Ｎ-メチル-Ｎ’-ピペラジニル)アセトキシ]エチル-ラパマイシン、３９-Ｏ-デスメチル-３９,４０-Ｏ,Ｏ-エチレン-ラパマイシン、(２６Ｒ)-２６-ジヒドロ-４０-Ｏ-(２-ヒドロキシ)エチル-ラパマイシン、４０-Ｏ-(２-アミノエチル)-ラパマイシン、４０-Ｏ-(２-アセトアミノエチル)-ラパマイシン、４０-Ｏ-(２-ニコチンアミドエチル)-ラパマイシン、４０-Ｏ-(２-(Ｎ-メチル-イミダゾ-２’-イルカルベトキサミド)エチル)-ラパマイシン、４０-Ｏ-(２-エトキシカルボニルアミノエチル)-ラパマイシン、４０-Ｏ-(２-トリルスルホンアミドエチル)-ラパマイシンおよび４０-Ｏ-[２-(４’,５’-ジカルボエトキシ-１’,２’,３’-トリアゾール-１’-イル)-エチル]-ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
本発明において有用な他のラパマイシン類似体は、ラパマイシンのシクロヘキシル環におけるヒドロキシル基および／または２８位のヒドロキシ基がヒドロキシエステル基で置換されている類似体を含み、例えば、ＵＳＲＥ４４,７６８号に記載されているラパマイシン類似体、例えばテムシロリムスが知られる。
本発明において有用な他のラパマイシン類似体は、１６位のメトキシ基が他の置換基、好ましくは(所望によりヒドロキシ置換)アルキニルオキシ、ベンジル、オルトメトキシベンジルまたはクロロベンジルで置換されているおよび／または３９位のメトキシ基が、３９番炭素と共に欠失しており、ラパマイシンのシクロヘキシル環が３９位のメトキシ基を欠くシクロペンチル環となるものを含み、例えば、引用によりその内容を本明細書に包含させるＷＯ９５／１６６９１号およびＷＯ９６／４１８０７号に記載されている。ラパマイシンの４０位のヒドロキシがアルキル化されるおよび／または３２-カルボニルが還元されるように、類似体をさらに修飾できる。
ＷＯ９５／１６６９１号からのラパマイシン類似体は、１６-デメトキシ-１６-(ペント-２-イニル)オキシ-ラパマイシン、１６-デメトキシ-１６-(ブト-２-イニル)オキシ-ラパマイシン、１６-デメトキシ-１６-(プロパルギル)オキシ-ラパマイシン、１６-デメトキシ-１６-(４-ヒドロキシ-ブト-２-イニル)オキシ-ラパマイシン、１６-デメトキシ-１６-ベンジルオキシ-４０-Ｏ-(２-ヒドロキシエチル)-ラパマイシン、１６-デメトキシ-１６-ベンジルオキシ-ラパマイシン、１６-デメトキシ-１６-オルト-メトキシベンジル-ラパマイシン、１６-デメトキシ-４０-Ｏ-(２-メトキシエチル)-１６-ペント-２-イニル)オキシ-ラパマイシン、３９-デメトキシ-４０-デスオキシ-３９-ホルミル-４２-ノル-ラパマイシン、３９-デメトキシ-４０-デスオキシ-３９-ヒドロキシメチル-４２-ノル-ラパマイシン、３９-デメトキシ-４０-デスオキシ-３９-カルボキシ-４２-ノル-ラパマイシン、３９-デメトキシ-４０-デスオキシ-３９-(４-メチル-ピペラジン-１-イル)カルボニル-４２-ノル-ラパマイシン、３９-デメトキシ-４０-デスオキシ-３９-(モルホリン-４-イル)カルボニル-４２-ノル-ラパマイシン、３９-デメトキシ-４０-デスオキシ-３９-[Ｎ-メチル、Ｎ-(２-ピリジン-２-イル-エチル)]カルバモイル-４２-ノル-ラパマイシンおよび３９-デメトキシ-４０-デスオキシ-３９-(ｐ-トルエンスルホニルヒドラゾノメチル)-４２-ノル-ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
ＷＯ９６／４１８０７号からのラパマイシン類似体は、３２-デオキソ-ラパマイシン、１６-Ｏ-ペント-２-イニル-３２-デオキソ-ラパマイシン、１６-Ｏ-ペント-２-イニル-３２-デオキソ-４０-Ｏ-(２-ヒドロキシ-エチル)-ラパマイシン、１６-Ｏ-ペント-２-イニル-３２-(Ｓ)-ジヒドロ-４０-Ｏ-(２-ヒドロキシエチル)-ラパマイシン、３２(Ｓ)-ジヒドロ-４０-Ｏ-(２-メトキシ)エチル-ラパマイシンおよび３２(Ｓ)-ジヒドロ-４０-Ｏ-(２-ヒドロキシエチル)-ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
他の適当なラパマイシン類似体は、引用によりその内容を本明細書に包含させる、ＵＳ２００５／０１０１６２４号に記載されたウミロリムスである。
エベロリムス(アフィニトール(登録商標))としても知られるＲＡＤ００１は化学名(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ,２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｅ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)-１,１８-ジヒドロキシ-１２-{(１Ｒ)-２-[(１Ｓ,３Ｒ,４Ｒ)-４-(２-ヒドロキシエトキシ)-３-メトキシシクロヘキシル]-１-メチルエチル}-１９,３０-ジメトキシ-１５,１７,２１,２３,２９,３５-ヘキサメチル-１１,３６-ジオキサ-４-アザ-トリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ-１６,２４,２６,２８-テトラエン-２,３,１０,１４,２０-ペタオンを有する。
アロステリックｍＴＯＲ阻害剤のさらなる例は、シロリムス(ラパマイシン、ＡＹ-２２９８９)、４０-[３-ヒドロキシ-２-(ヒドロキシメチル)-２-メチルプロパノエート]-ラパマイシン(テムシロリムスまたはＣＣＩ-７７９とも呼ばれる)およびリダフォロリムス(ＡＰ-２３５７３／ＭＫ-８６６９)を含む。アロステリックｍＴＯＲの他の例は、ゾタロリムス(ＡＢＴ５７８)およびウミロリムスを含む。
これとは別にまたはこれに加えて、触媒的、ＡＴＰ競合的ｍＴＯＲ阻害剤が、ｍＴＯＲキナーゼドメインを直接標的とし、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２の両者を標的とすることが知られている。これらはまた、４ＥＢＰ１-Ｔ３７／４６リン酸化およびキャップ依存性翻訳のようなラパマイシン耐性ｍＴＯＲＣ１アウトプットを調節するため、ラパマイシンのようなアロステリックｍＴＯＲ阻害剤よりも有効なｍＴＯＲＣ１阻害剤でもある。
触媒的阻害剤は、ＢＥＺ２３５または２-メチル-２-[４-(３-メチル-２-オキソ-８-キノリン-３-イル-２,３-ジヒドロ-イミダゾ[４,５-ｃ]キノリン-１-イル)-フェニル]-プロピオニトリルまたはモノトシル酸塩形態；ＢＥＺ２３５の合成はＷＯ２００６／１２２８０６号に記載される；化学名{５-[２,４-ビス-((Ｓ)-３-メチル-モルホリン-４-イル)-ピリド[２,３ｄ]ピリミジン-７-イル]-２-メトキシ-フェニル}-メタノールを有するＣＣＧ１６８(ＡＺＤ-８０５５としても知られ、Chresta, C.M., et al., Cancer Res, 2010, 70(1), 288-298)；３-[２,４-ビス[(３Ｓ)-３-メチルモルホリン-４-イル]ピリド[２,３-ｄ]ピリミジン-７-イル]-Ｎ-メチルベンズアミド(ＷＯ０９１０４０１９号)；３-(２-アミノベンゾ[ｄ]オキサゾール-５-イル)-１-イソプロピル-１Ｈ-ピラゾロ[３,４-ｄ]ピリミジン-４-アミン(ＷＯ１００５１０４３およびＷＯ２０１３０２３１８４)；Ｎ-(３-(Ｎ-(３-((３,５-ジメトキシフェニル)アミノ)キノキサリン-２-イル)スルファモイル)フェニル)-３-メトキシ-４-メチルベンズアミド(ＷＯ０７０４４７２９号およびＷＯ１２００６５５２号)；化学名１-[４-[４-(ジメチルアミノ)ピペリジン-１-カルボニル]フェニル]-３-[４-(４,６-ジモルホリノ-１,３,５-トリアジン-２-イル)フェニル]尿素を有するＰＫＩ-５８７(Venkatesan, A.M., J. Med.Chem., 2010, 53, 2636-2645)；化学名２,４-ジフルオロ-Ｎ-{２-メトキシ-５-[４-(４-ピリダジニル)-６-キノリニル]-３-ピリジニル}ベンゼンスルホンアミドを有するＧＳＫ-２１２６４５８(ACS Med. Chem. Lett., 2010, 1, 39-43)；５-(９-イソプロピル-８-メチル-２-モルホリノ-９Ｈ-プリン-６-イル)ピリミジン-２-アミン(ＷＯ１０１１４４８４号)；(Ｅ)-Ｎ-(８-(６-アミノ-５-(トリフルオロメチル)ピリジン-３-イル)-１-(６-(２-シアノプロパン-２-イル)ピリジン-３-イル)-３-メチル-１Ｈ-イミダゾ[４,５-ｃ]キノリン-２(３Ｈ)-イリデン)シアナミド(ＷＯ１２００７９２６号)を含む。
触媒的ｍＴＯＲ阻害剤のさらなる例は、８-(６-メトキシ-ピリジン-３-イル)-３-メチル-１-(４-ピペラジン-１-イル-３-トリフルオロメチル-フェニル)-１,３-ジヒドロ-イミダゾ[４,５-ｃ]キノリン-２-オン(ＷＯ２００６／１２２８０６号)およびＫｕ-００６３７９４(Garcia-Martinez JM, et al., Biochem J., 2009, 421(1), 29-42)を含む。Ｋｕ-００６３７９４は、ラパマイシンの哺乳動物標的(ｍＴＯＲ)の特異的阻害剤である。WYE-354は、触媒的ｍＴＯＲ阻害剤の他の例である(Yu K, et al. (2009). Biochemical, Cellular, and In vivo Activity of Novel ATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target of Rapamycin. Cancer Res. 69(15): 6232-6240)。
本発明に有用なｍＴＯＲ阻害剤はまた前記のいずれかのプロドラッグ、誘導体、薬学的に許容される塩または類似体を含む。
ＲＡＤ００１のようなｍＴＯＲ阻害剤は、ここに記載する特定の投与量に基づき、当分野で十分確立された方法を利用して送達用に製剤し得る。特に、ＵＳ特許６,００４,９７３号(引用により本明細書に包含させる)は、ここに記載のｍＴＯＲ阻害剤に有用な製剤の例を提供する。
ｍＴＯＲ阻害の評価
ｍＴＯＲはキナーゼＰ７０ Ｓ６をリン酸化し、それによりＰ７０ Ｓ６キナーゼを活性化し、その基質をリン酸化させる。ｍＴＯＲ阻害の程度は、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ阻害の程度により表すことができ、例えば、ｍＴＯＲ阻害の程度は、例えば、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ基質のリン酸化の減少による、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ活性レベルの減少により決定できる。阻害剤の非存在下、例えば、阻害剤投与前と、阻害剤存在下または阻害剤投与後のＰ７０ Ｓ６キナーゼ活性(Ｐ７０ Ｓ６キナーゼが基質をリン酸化する能力)を測定することにより、ｍＴＯＲ阻害のレベルを決定できる。Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ阻害レベルは、ｍＴＯＲ阻害のレベルを示す。それゆえに、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼが４０％阻害されたら、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ活性で測定して、ｍＴＯＲ活性は４０％阻害される。ここでいう阻害の程度またはレベルは、投与間隔の間の平均阻害レベルである。例えば、阻害剤を週に１回与えるとき、阻害レベルは、その間隔の間の、すなわち１週間の平均阻害レベルを示す。
引用により本明細書に包含させるBoulay et al., Cancer Res, 2004, 64:252-61は、ｍＴＯＲ阻害のレベルの評価に使用できるアッセイを教示する(ここではＢｏｕｌａｙアッセイと称す)。ある態様において、アッセイは、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１の投与前後の生物学的サンプルからのＰ７０ Ｓ６キナーゼ活性の測定に頼る。サンプルを、ｍＴＯＲ阻害剤での処置後、予め選択した時間、例えば、処置の２４時間、４８時間および７２時間後に採り得る。例えば、皮膚または末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)からの生物学的サンプルを使用できる。総タンパク質抽出物をサンプルから調製する。Ｐ７０ Ｓ６キナーゼを特異的に認識する抗体を使用した免疫沈降により、タンパク質抽出物からＰ７０ Ｓ６キナーゼを単離する。単離したＰ７０ Ｓ６キナーゼの活性を、インビトロキナーゼアッセイで測定する。単離したキナーゼを４０Ｓリボソームサブユニット基質(Ｐ７０ Ｓ６キナーゼの内在性基質である)およびガンマ-３２Ｐと、該基質のリン酸化を可能とする条件下でインキュベートできる。次いで、反応混合物をＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルで分割し、３２ＰシグナルをPhosphorImagerを使用して解析する。４０Ｓリボソームサブユニットのサイズに対応する３２Ｐシグナルが、リン酸化された基質およびＰ７０ Ｓ６キナーゼの活性を示す。キナーゼ活性の増加または減少を、リン酸化基質の３２Ｐシグナルの面積および強度を定量し(例えば、ImageQuant, Molecular Dynamicsを使用)、任意単位値を定量化シグナルに割り当て、投与後の値と投与前の値または対照値を比較することにより、計算できる。例えば、キナーゼ活性阻害パーセントを次の式で計算できる：１-(投与後に得た値／投与前に得た値)×１００。上記のとおり、阻害の程度またはレベルは、ここでは、投与の合間の阻害の平均レベルをいう。
キナーゼ活性、例えば、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ活性を評価する方法もまた、引用により本明細書に包含させるＵＳ７,７２７,９５０号に提供されている。
ｍＴＯＲ阻害のレベルはまた、ＰＤ１陰性細胞対ＰＤ１陽性Ｔ細胞の比の変化によっても評価できる。末梢血からのＴ細胞を、当分野で知られる方法によりＰＤ１陰性または陽性と同定できる。
低用量ｍＴＯＲ阻害剤
ここに記載する方法は、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１のようなラパログを含むアロステリックｍＴＯＲ阻害剤の複数用量を使用する。対照的に、ｍＴＯＲ経路を完全にまたはほぼ完全に阻害するレベルの阻害剤は免疫抑制性であり、例えば、臓器移植片拒絶の予防に使用される。さらに、ｍＴＯＲを完全に阻害する高用量のラパログも腫瘍細胞増殖を阻止し、多様な癌の処置に使用されている(例えば、Antineoplastic effects of mammalian target of rapamycine inhibitors. Salvadori M. World J Transplant. 2012 Oct 24;2(5):74-83; Current and Future Treatment Strategies for Patients with Advanced Hepatocellular Carcinoma: Role of mTOR Inhibition. Finn RS. Liver Cancer. 2012 Nov;1(3-4):247-256; Emerging Signaling Pathways in Hepatocellular Carcinoma. Moeini A, Cornella H, Villanueva A. Liver Cancer. 2012 Sep;1(2):83-93; Targeted cancer therapy - Are the days of systemic chemotherapy numbered? Joo WD, Visintin I, Mor G. Maturitas. 2013 Sep 20.; Role of natural and adaptive immunity in renal cell carcinoma response to VEGFR-TKIs and mTOR inhibitor. Santoni M, Berardi R, Amantini C, Burattini L, Santini D, Santoni G, Cascinu S. Int J Cancer. 2013 Oct 2参照)。
本発明は、少なくとも一部、現在臨床の現場で使用されるよりはるかに低用量のｍＴＯＲ阻害剤が、対象における免疫応答の増加に優れた効果を有し、ＰＤ-１陰性Ｔ細胞／ＰＤ-１陽性Ｔ細胞比を増加させるという驚くべき発見に基づく。ｍＴＯＲ活性を一部しか阻害しない低用量のｍＴＯＲ阻害剤が、ヒト対象における免疫応答を効率的に改善し、ＰＤ-１陰性Ｔ細胞／ＰＤ-１陽性Ｔ細胞比を増加できることは、驚きであった。
これとは別にまたはこれに加えて、何らかの理論に拘束されないが、低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、非処置対象と比較して、ナイーブＴ細胞数を、例えば、少なくとも一過性に増加できると考えられる。これとは別にまたはこれに加えて、再び理論に拘束されないが、十分な時間または十分な投薬後のｍＴＯＲ阻害剤での処置は、次の一個以上をもたらすと考えられる：
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体における、次のマーカーＣＤ６２Ｌ高、ＣＤ１２７高、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２の１個以上の発現の増加；
例えば、記憶Ｔ細胞、例えば、記憶Ｔ細胞前駆体における、ＫＬＲＧ１の発現の減少；および
記憶Ｔ細胞前駆体、例えば、次のＣＤ６２Ｌ高増加、ＣＤ１２７高増加、ＣＤ２７＋増加、ＫＬＲＧ１減少およびＢＣＬ２増加の特性の任意の１個または組み合わせを有する細胞の数の増加；
そして、ここで、上記のいずれかの変化は、例えば、非処置対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる(Araki, K et al. (2009) Nature 460:108-112)。記憶Ｔ細胞前駆体は、分化プログラムにおける初期にある記憶Ｔ細胞である。例えば、記憶Ｔ細胞は、次の１個以上の特性を有する：ＣＤ６２Ｌ高増加、ＣＤ１２７高増加、ＣＤ２７＋増加、ＫＬＲＧ１減少および／またはＢＣＬ２増加。
ある態様において、本発明は、選択した投与レジメン、例えば、１日１回または週に１回で投与したとき、完全なまたは顕著な免疫抑制には結びつかないが、免疫応答の増強に結びつくｍＴＯＲ阻害のレベルと関係する、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパログ、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１または触媒的ｍＴＯＲ阻害剤の組成物または投薬形態に関する。
ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパログ、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１または触媒的ｍＴＯＲ阻害剤は、徐放製剤で投与できる。ここに記載する組成物または単位投与形態のいずれも徐放製剤で提供できる。ある態様において、徐放製剤は、即時放出製剤より低いバイオアベイラビリティを有する。例えば、いくつかの態様において、即時放出製剤に類する治療効果を達成するために、徐放製剤は、即時放出製剤に提供される約２〜約５倍、約２.５〜約３.５倍または約３倍量の阻害剤を有する。
ある態様において、単位投薬形態あたり０.１〜２０mg、０.５〜１０mg、２.５〜７.５mg、３〜６mgまたは約５mgを有する、一般に週１回投与に使用される、例えば、ＲＡＤ００１の、即時放出形態が提供される。週１回投与のために、これらの即時放出製剤は、それぞれ、０.３〜６０mg、１.５〜３０mg、７.５〜２２.５mg、９〜１８mgまたは約１５mgのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を有する徐放形態に対応する。ある態様において、両方の形態を週１回投与する。
ある態様において、一般に１日１回投与に使用するための、単位剤形あたり０.００５〜１.５mg、０.０１〜１.５mg、０.１〜１.５mg、０.２〜１.５mg、０.３〜１.５mg、０.４〜１.５mg、０.５〜１.５mg、０.６〜１.５mg、０.７〜１.５mg、０.８〜１.５mg、１.０〜１.５mg、０.３〜０.６mgまたは約０.５mgを有する、例えば、ＲＡＤ００１の、即時放出形態が提供される。１日１回投与のために、これらの即時放出形態は、それぞれ、０.０１５〜４.５mg、０.０３〜４.５mg、０.３〜４.５mg、０.６〜４.５mg、０.９〜４.５mg、１.２〜４.５mg、１.５〜４.５mg、１.８〜４.５mg、２.１〜４.５mg、２.４〜４.５mg、３.０〜４.５mg、０.９〜１.８mgまたは約１.５mgのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を含む徐放性形態に対応する。１週間に１回投与のために、これらの即時放出形態は、それぞれ、０.１〜３０mg、０.２〜３０mg、２〜３０mg、４〜３０mg、６〜３０mg、８〜３０mg、１０〜３０mg、１.２〜３０mg、１４〜３０mg、１６〜３０mg、２０〜３０mg、６〜１２mgまたは約１０mgのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を含む徐放性形態に対応する。
ある態様において、一般に１日１回投与に使用するための、単位剤形あたり０.０１〜１.０mgを有する、例えば、ＲＡＤ００１の即時放出形態が提供される。１日１回投与のために、これらの即時放出形態は、それぞれ、０.０３〜３mgのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を含む徐放性形態に対応する。１週間に１回投与のために、これらの即時放出形態は、それぞれ、０.２〜２０mgのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を含む徐放性形態に対応する。
ある態様において、一般に１週間に１回投与に使用するための、単位剤形あたり０.５〜５.０mgを有する、例えば、ＲＡＤ００１の即時放出形態が提供される。１週間に１回投与のために、これらの即時放出形態は、それぞれ、１.５〜１５mgのｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を含む徐放性形態に対応する。
上記のように、ｍＴＯＲ経路の一つの標的はＰ７０ Ｓ６キナーゼである。それゆえに、ここに記載する方法および組成物において有用なｍＴＯＲ阻害剤の用量は、例えば、ここに記載するアッセイ、例えば、Ｂｏｕｌａｙアッセイにより測定して、ｍＴＯＲ阻害剤非存在下のＰ７０ Ｓ６キナーゼの活性に対して、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ活性の８０％未満の阻害を達成するのに十分なものである。さらなる面において、本発明は、ｍＴＯＲ阻害剤非存在下のＰ７０ Ｓ６キナーゼ活性に対して、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ活性の３８％未満の阻害を達成するのに十分なｍＴＯＲ阻害剤の量を提供する。
ある面において、本発明の方法および組成物において有用なｍＴＯＲ阻害剤の用量は、例えば、ヒト対象に投与したとき、例えば、ここに記載するアッセイ、例えば、Ｂｏｕｌａｙアッセイにより測定して、Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ活性の９０±５％(すなわち、８５〜９５％)、８９±５％、８８±５％、８７±５％、８６±５％、８５±５％、８４±５％、８３±５％、８２±５％、８１±５％、８０±５％、７９±５％、７８±５％、７７±５％、７６±５％、７５±５％、７４±５％、７３±５％、７２±５％、７１±５％、７０±５％、６９±５％、６８±５％、６７±５％、６６±５％、６５±５％、６４±５％、６３±５％、６２±５％、６１±５％、６０±５％、５９±５％、５８±５％、５７±５％、５６±５％、５５±５％、５４±５％、５４±５％、５３±５％、５２±５％、５１±５％、５０±５％、４９±５％、４８±５％、４７±５％、４６±５％、４５±５％、４４±５％、４３±５％、４２±５％、４１±５％、４０±５％、３９±５％、３８±５％、３７±５％、３６±５％、３５±５％、３４±５％、３３±５％、３２±５％、３１±５％、３０±５％、２９±５％、２８±５％、２７±５％、２６±５％、２５±５％、２４±５％、２３±５％、２２±５％、２１±５％、２０±５％、１９±５％、１８±５％、１７±５％、１６±５％、１５±５％、１４±５％、１３±５％、１２±５％、１１±５％または１０±５％阻害を達成するのに十分である。
対象におけるＰ７０ Ｓ６キナーゼ活性は、例えば、米国特許７,７２７,９５０号に記載する方法による、ホスホＰ７０ Ｓ６Ｋレベルおよび／またはホスホＰ７０ Ｓ６レベルの免疫ブロット解析またはインビトロキナーゼ活性アッセイのような、当分野で知られる方法を使用して測定し得る。
ｍＴＯＲ阻害剤の用量と関連してここで使用する用語“約”は、ｍＴＯＲ阻害剤の用量の最大±１０％ばらつきをいうが、記載した用量の周辺のばらつきを含まなくてよい。
ある態様において、本発明は、対象に、目標トラフレベル内の投与量で、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を投与することを含む、方法を提供する。ある態様において、トラフレベルは、臓器移植および癌患者で使用される投与レジメンに関係するトラフレベルより顕著に低い。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシンを、免疫抑制または抗癌効果を生じるトラフレベルの１／２、１／４、１／１０または１／２０未満であるトラフレベルを生じるように投与する。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシンを、免疫抑制または抗癌適応症における使用についてＦＤＡが承認した添付文書に従い提供されるトラフレベルの１／２、１／４、１／１０または１／２０未満であるトラフレベルを生じるように投与する。
ある態様において、ここに開示する方法は、対象に、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、０.１〜１０ng／ml、０.１〜０.５ng／ml、０.１〜３ng／ml、０.１〜２ng／mlまたは０.１〜１ng／mlの目標トラフレベルを提供する投与量で投与することを含む。
ある態様において、ここに開示する方法は、対象にｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、０.２〜１０ng／ml、０.２〜５ng／ml、０.２〜３ng／ml、０.２〜２ng／mlまたは０.２〜１ng／mlの目標トラフレベルを提供する投与量で投与することを含む。
ある態様において、ここに開示する方法は、対象にｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、０.３〜１０ng／ml、０.３〜５ng／ml、０.３〜３ng／ml、０.３〜２ng／mlまたは０.３〜１ng／mlの目標トラフレベルを提供する投与量で投与することを含む。
ある態様において、ここに開示する方法は、対象にｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、０.４〜１０ng／ml、０.４〜５ng／ml、０.４〜３ng／ml、０.４〜２ng／mlまたは０.４〜１ng／mlの目標トラフレベルを提供する投与量で投与することを含む。
ある態様において、ここに開示する方法は、対象にｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、０.５〜１０ng／ml、０.５〜５ng／ml、０.５〜３ng／ml、０.５〜２ng／mlまたは０.５〜１ng／mlの目標トラフレベルを提供する投与量で投与することを含む。
ある態様において、ここに開示する方法は、対象にｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１を、１〜１０ng／ml、１〜５ng／ml、１〜３ng／mlまたは１〜２ng／mlの目標トラフレベルを提供する投与量で投与することを含む。
ここで使用する用語“トラフレベル”は、次の投与直前の血漿中の薬物濃度または２回の投与の間の最少薬物濃度をいう。
ある態様において、目標トラフレベルのＲＡＤ００１は約０.１〜４.９ng／mlの範囲である。ある態様において、目標トラフレベルは３ng／ml以下、例えば、０.３ng／ml以下〜３ng／mlである。ある態様において、目標トラフレベルは３ng／ml以下、例えば、０.３ng／ml以下〜１ng／mlである。
さらなる面において、本発明は、ＲＡＤ００１の特定した目標トラフレベルと生物学的同等である目標トラフレベルと関係する量で、ＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤を使用できる。ある態様において、ＲＡＤ００１以外のｍＴＯＲ阻害剤の目標トラフレベルは、ここに記載するＲＡＤ００１のトラフレベルと同じレベルのｍＴＯＲ阻害(例えば、ここに記載する方法で測定して、例えば、Ｐ７０ Ｓ６の阻害)を示すレベルである。
医薬組成物：ｍＴＯＲ阻害剤
ある面において、本発明は、ここに記載するＣＡＲ細胞と組み合わせて使用するために製剤された、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ここに記載するｍＴＯＲ阻害剤を含む医薬組成物に関する。
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ここに記載する、さらなる薬剤と組み合わせて投与するために製剤される。
一般に、本発明の化合物は、単独でまたは１種以上の治療剤と組み合わせて、当分野で知られる通常のかつ許容される方法のいずれかにより、上記の治療有効量で投与される。
医薬製剤は、慣用の溶解および混合法を使用して製造できる。例えば、原体物質(例えば、ｍＴＯＲ阻害剤または該化合物の安定化形態(例えば、シクロデキストリン誘導体または他の既知複合化薬物との複合体))を、ここに記載する添加物の１種以上の存在下、適当な溶媒に溶解させる。ｍＴＯＲ阻害剤は、一般に薬物の投与量を容易に制御可能とし、患者に洗練され、取り扱いが容易な製品を与えるような、医薬投与形態に製剤される。
本発明の化合物は、医薬組成物として、任意の慣用の経路で、特に経腸的に、例えば、錠剤またはカプセル剤の形で、例えば、経口でまたは、例えば、注射溶液剤または懸濁液剤の形で、非経腸的に、例えば、ローション剤、ゲル剤、軟膏剤またはクリーム剤の形で、局所的にまたは経鼻または坐薬形態で投与できる。ここに記載するようにｍＴＯＲ阻害剤を他の薬剤と組み合わせて(同時にまたは別々に)投与するとき、ある面において、両方の成分を同じ経路で(例えば、非経腸的に)投与する。あるいは、他の薬剤を、ｍＴＯＲ阻害剤と異なる経路で投与し得る。例えば、ｍＴＯＲ阻害剤を経口で投与してよく、他の薬剤を非経腸的に投与してよい。
徐放
ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリックｍＴＯＲ阻害剤または触媒的ｍＴＯＲ阻害剤は、製品安定性要求を満たすおよび／または平均血漿ピーク濃度減少、薬物吸収の程度および血漿ピーク濃度の患者間および患者内ばらつき減少、Ｃｍａｘ／Ｃｍｉｎ比減少および／または食効減少のような即時放出(ＩＲ)錠剤より都合よい薬物動態特性を有する、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１を含む経口固体投与形態の形の医薬製剤として提供できる。提供された医薬製剤は、より厳密な用量調節を可能にするおよび／または有害事象の頻度を減少させ、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１での患者のより安全な処置を提供することができる。
ある態様において、本発明は、多粒子系であり、機能的層およびコーティングを有し得る、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の安定な持続放出製剤を提供する。
ここで使用する用語“持続放出、多粒子製剤”は、長時間にわたり、例えば少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間または６時間にわたり、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の放出を可能とする製剤である。持続放出製剤は、活性成分を摂取後長時間にわたり利用可能とするような方法で製剤された、例えば、ここに記載する、特別の添加物からなるマトリクスおよびコーティングを含み得る。
用語“持続放出”は用語“徐放”(ＳＲ)または“延長放出”と交換可能に使用する。用語“持続放出”は、錠剤およびカプセル剤についての欧州薬局方(第７版)モノグラフおよびＵＳＰの医薬投与形態についての一般的な章＜１１５１＞の定義に従う、活性薬物物質を、経口投与直後ではなく、長時間にわたり放出する医薬製剤をいう。ここで使用する用語“即時放出”(ＩＲ)は、Guidance for Industry: “Dissolution Testing of Immediate Release Solid Oral Dosage Forms” (FDA CDER, 1997)の定義に従い、６０分以内に活性薬物物質の８５％を放出する医薬製剤である。ある態様において、用語“即時放出”は、例えば、ここに記載する溶解アッセイで測定して、エベロリムスの錠剤からの３０分以内の放出を意味する。
ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の安定な持続放出製剤は、ここに記載する溶解アッセイのような当分野で知られるアッセイを使用してインビトロ放出プロファイルにより特徴づけできる。３７℃でドデシル硫酸ナトリウム０.２％を含む９００mLリン酸緩衝液ｐＨ６.８で魅した溶解容器で、それぞれＵＳＰ試験モノグラフ７１１および欧州薬局方試験モノグラフ２.９.３.に従い、ＵＳＰに従い、パドル法で、７５rpmで溶解を行う。
ある態様において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の安定な持続放出製剤は、インビトロ放出アッセイで、次の放出仕様に従いｍＴＯＲ阻害剤を放出する。
０.５時間：＜４５％または＜４０、例えば、＜３０％
１時間：２０〜８０％、例えば、３０〜６０％
２時間：＞５０％または＞７０％、例えば、＞７５％
３時間：＞６０％または＞６５％、例えば、＞８５％、例えば、＞９０％。
ある態様において、ここに開示するｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンまたはＲＡＤ００１の安定な持続放出製剤は、インビトロ溶解アッセイで、４５分、６０分、７５分、９０分、１０５分または１２０分より速くｍＴＯＲ阻害剤の５０％を放出しない。
バイオポリマー送達法
ある態様において、ここに開示する１以上のＣＡＲ発現細胞を、所望によりキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブのようなＢＴＫ阻害剤と組み合わせて、バイオポリマー足場、例えば、バイオポリマーインプラントにより対象に投与または送達し得る。バイオポリマー足場は、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の送達、増殖および／または分散を支持または増強できる。バイオポリマー足場は、天然に存在するまたは合成であり得る生体適合性(例えば、実質的に炎症性または免疫応答を誘発しない)および／または生分解性ポリマーを含む。
適当なバイオポリマーの例は、寒天、アガロース、アルギン酸、アルギン酸／リン酸カルシウムセメント(ＣＰＣ)、ベータ-ガラクトシダーゼ(β-ＧＡＬ)、(１,２,３,４,６-ペンタアセチルａ-Ｄ-ガラクトース)、セルロース、キチン、キトサン、コラーゲン、エラスチン、ゼラチン、ヒアルロン酸コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、ポリ(３-ヒドロキシブチレート-コ-３-ヒドロキシ-ヘキサノエート)(ＰＨＢＨＨｘ)、ポリ(ラクチド)、ポリ(カプロラクトン)(ＰＣＬ)、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)(ＰＬＧ)、ポリエチレンオキシド(ＰＥＯ)、ポリ(乳酸-コ-グリコール酸)(ＰＬＧＡ)、ポリプロピレンオキシド(ＰＰＯ)、ポリビニルアルコール)(ＰＶＡ)、絹、大豆タンパク質および大豆タンパク質単離体の、単独でまたは任意の他のポリマー組成物との、あらゆる濃度およびあらゆる比での混合物を含むが、これらに限定されない。バイオポリマーは、接着または遊走促進分子、例えば、リンパ球のコラーゲン受容体に結合するコラーゲン模倣ペプチドおよび／または送達する細胞の送達、増殖または機能、例えば、抗癌活性を増強する刺激分子で増強または修飾され得る。バイオポリマースキャフォルドは、注射可能な、例えば、ゲルまたは半固体または固体組成物であり得る。
ある態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象への送達前にバイオポリマー足場上に播種する。ある態様において、バイオポリマー足場は、例えば、足場のバイオポリマーに取り込まれたまたはコンジュゲートされた、さらにここに記載する１種以上のさらなる治療剤(例えば、他のＣＡＲ発現細胞、抗体または小分子)またはＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を含む。ある態様において、バイオポリマー足場を、例えば、腫瘍内に注射するかまたは腫瘍にまたは抗腫瘍効果に介在するのに十分に腫瘍に近位に外科的にインプラントする。バイオポリマー組成物およびその送達のための方法さらなる例は、Stephan et al., Nature Biotechnology, 2015, 33:97-101；およびＷＯ２０１４／１１０５９１号に記載される。
医薬組成物および処置
本発明の医薬組成物は、ここに記載のように、ＣＡＲ発現細胞、例えば、複数のＣＡＲ発現細胞を、１個以上の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤または添加物と組み合わせて含む。このような組成物は、中性緩衝化食塩水、リン酸緩衝化食塩水などのような緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールのような炭水化物；タンパク質；グリシンのようなポリペプチドまたはアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンのようなキレート剤；アジュバント(例えば、アルミニウムヒドロキシド)；および防腐剤を含み得る。本発明の組成物は、一つの面において静脈内投与用に製剤される。
本発明の医薬組成物を、処置する(または予防する)疾患に適する方法で投与し得る。投与の量および頻度は、患者の状態および患者の疾患のタイプおよび重症度のような因子により決定されるが、適切な用量は、臨床試験により決定され得る。
ある態様において、医薬組成物は、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、複製可能レンチウイルス(ＲＣＬ)、ｐ２４、ＶＳＶ-Ｇ核酸、ＨＩＶ ｇａｇ、残留抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ、マウス抗体、貯留ヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地要素、ベクターパッケージング細胞またはプラスミド成分、細菌および真菌からなる群から選択される汚染物が実質的にない、例えば、検出可能なレベルで存在しない。ある態様において、細菌は、アルガリゲネス・フェカリス、カンジダ・アルビカンス、エシェリキア・コリ、ヘモフィルス・インフルエンザエ、ナイセリア・メニンギティディス、シュードモナス・エルジノーサ、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエおよびストレプトコッカス・ピオゲネスＡ群からなる群から選択される少なくとも１個である。
“免疫学的有効量”、“抗腫瘍有効量”、“腫瘍阻害有効量”または“治療量”が示されるとき、投与すべき本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度および患者(対象)の状態における、個々の差異を考慮しながら、医師により決定され得る。ここに記載するＴ細胞を含む医薬組成物を、１０４〜１０９細胞／kg体重、ある場合１０５〜１０６細胞／kg体重(これらの範囲内の全ての整数を含む)の用量で投与し得ると一般に述べ得る。Ｔ細胞組成物はまたこれらの用量で複数回投与し得る。細胞を、免疫療法において一般的に知られる点滴技術を使用して、投与できる(例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988参照)。特定の患者のための最適用量および処置レジメは、疾患の徴候について患者をモニタリングし、それに応じて処置を調節することにより、医学分野の当業者により容易に決定され得る。
ある面において、活性化Ｔ細胞を対象に投与し、その後再び採血し(またはアフェレシスを実施し)、本発明に従いそこからＴ細胞を活性化し、これらの活性化され、増殖されたＴ細胞を患者に再注入することが望まれ得る。この方法を数週間毎に複数回実施できる。ある面において、Ｔ細胞を、１０cc〜４００ccの採血した血液から活性化できる。ある面において、Ｔ細胞は、２０cc、３０cc、４０cc、５０cc、６０cc、７０cc、８０cc、９０ccまたは１００ccの採血した血液から活性化できる。
対象組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、注入、植え込みまたは移植を含む、任意の簡便な方法で実施し得る。ここに記載の組成物を、患者に経動脈、皮下、皮内、腫瘍内、リンパ節内、髄内、筋肉内に、静脈内(ｉ.ｖ.)注射によりまたは腹腔内に投与し得る。ある態様において、組成物を、患者に皮内または皮下注射により投与する。ある態様において、本発明のＴ細胞組成物を、皮内または皮下注射により患者に投与する。ある面において、本発明のＴ細胞組成物を、ｉ.ｖ.注射により投与する。Ｔ細胞の組成物を、腫瘍、リンパ節または感染部位に直接注射し得る。
特定の代表的面において、対象を白血球除去法に付し、目的の細胞、例えば、Ｔ細胞を選択および／または単離するために、白血球を採取し、エクスビボで富化または枯渇させ得る。これらのＴ細胞単離体を、当分野で知られる方法により増殖させ、１個以上の本発明のＣＡＲおよびＥＴＰ構築物が導入され、それにより、本発明のＥＴＰ−ＣＡＲ Ｔ細胞、例えば、ＲＮＡ ＥＴＰ−ＣＡＲ Ｔ細胞が産生され得るように処置する。処置を必要とする対象は、その後、高用量化学療法と、続く末梢血幹細胞移植の標準的処置に付され得る。ある面において、移植の後または同時に、対象は、増殖させた本発明のＥＴＰ−ＣＡＲ Ｔ細胞、例えば、ＲＮＡ ＥＴＰ−ＣＡＲ Ｔ細胞の注入を受ける。さらなる面において、増殖させた細胞を手術前または後に投与する。
患者に投与すべき上記処置の用量は、処置する状態および処置の受け手の正確な性質により変わる。ヒト投与のための用量のスケーリングは、当分野で認められた慣例に従い実施できる。例えば、キャンパスの用量は、一般に成人患者に１〜約１００mgの範囲であり、通常、１〜３０日間連日投与する。好ましい１日用量は１〜１０mg／日であるが、ある場合最大４０mg／日までの高用量を使用し得る(米国特許６,１２０,７６６号に記載)。
ある態様において、ＣＡＲを、例えば、インビトロ転写を使用してＴ細胞に導入し、対象(例えば、ヒト)は、本発明のＣＡＲ Ｔ細胞の初期投与および本発明のＣＡＲ Ｔ細胞の１以上の続く投与を受け、ここで、１以上のその後の投与は、先の投与の後１５日、例えば、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日または２日以内に行う。ある態様において、本発明のＣＡＲ Ｔ細胞の１回を超える投与を、１週間あたりに対象(例えば、ヒト)に投与し、例えば、本発明のＣＡＲ Ｔ細胞の２、３または４投与を１週間あたりに行う。ある態様において、対象(例えば、ヒト対象)は、１週間あたりにＣＡＲ Ｔ細胞の１回を超える投与を受け(例えば、１週間あたり２、３または４投与)(ここではサイクルとも称す)、その後１週間ＣＡＲ Ｔ細胞投与をせず、その後、ＣＡＲ Ｔ細胞の１回を超えるさらなる投与(例えば、１週間あたりＣＡＲ Ｔ細胞の１回を超える投与)を対象に投与する。他の態様において、対象(例えば、ヒト対象)は、ＣＡＲ Ｔ細胞を１サイクルを超えて受け、各サイクルの間の時間は１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日または３日未満である。ある態様において、ＣＡＲ Ｔ細胞を、１週間３回、隔日で投与する。ある態様において、本発明のＣＡＲ Ｔ細胞を、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間またはそれ以上投与する。
ある面において、ＣＡＲ発現細胞を、レンチウイルスのようなレンチウイルスウイルスベクターを使用して産生する。細胞、例えば、このような方法で産生したＣＡＲＴは、安定なＣＡＲ発現を有する。
ある面において、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴを、ガンマレトロウイルスベクター、例えば、ここに記載するガンマレトロウイルスベクターのようなウイルスベクターを使用して産生する。これらのベクターを使用して産生したＣＡＲＴは、安定なＣＡＲ発現を有する。
ある面において、ＣＡＲＴは、形質導入４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日後ＣＡＲベクターを一過性に発現する。ＣＡＲの一過性発現は、ＲＮＡ ＣＡＲベクター送達によりもたらされ得る。ある面において、ＣＡＲ ＲＮＡを、エレクトロポレーションによりＴ細胞に形質導入する。
一過性に発現するＣＡＲ Ｔ細胞(特にマウスｓｃＦｖ担持ＣＡＲＴ)を使用して処置している患者で生じる可能性のある問題は、複数処置後のアナフィラキシーである。
理論に拘束されないが、このようなアナフィラキシー応答は、液性抗ＣＡＲ応答を発症する患者、すなわち、抗ＩｇＥアイソタイプを有する抗ＣＡＲ抗体で起こると考えられる。抗原への暴露に、１０〜１４日の中断があるとき、患者の抗体産生細胞がＩｇＧアイソタイプ(アナフィラキシーを生じない)からＩｇＥアイソタイプへのクラススイッチを受けると考えられる。
患者が一過性ＣＡＲ治療(例えばＲＮＡ形質導入により産生されるもの)のコースの間に抗ＣＡＲ抗体応答を生じる高リスクにあるならば、ＣＡＲＴ注入中断は、１０〜１４日を超えて持続してはならない。
本発明を、次の実験的実施例を引用してさらに詳細に記載する。これらの実施例は、説明のみを目的として提示するものであり、特に断らない限り限定を意図しない。そうして、本発明は、決して次の実施例に限定されると解釈されてはならず、むしろ、ここに提示する教示の結果として明らかとなる任意かつあらゆる変形を含むと解釈されるべきである。
さらに記載せずとも、当業者は、先の記載および次の説明的実施例を使用して、本発明の化合物を製造し、かつ利用し、請求する方法を実施できると考える。次の作業実施例は、特異的に本発明の多様な面を指摘するものであり、本開示の残りをどのような方法であれ限定すると解釈してはならない。
実施例１：マウス抗ＣＤ１９抗体のヒト化
ＣＤ１９抗体分子は、例えば、その全体を引用により本明細書に包含させるＷＯ２０１４／１５３２７０に記載する抗体分子(例えば、ヒト化抗ＣＤ１９抗体分子)であり得る。マウスＣＤ１９抗体のヒト化は、マウス特異的残基がＣＡＲＴ１９処置、すなわち、ＣＡＲ１９構築物を形質導入したＴ細胞での処置を受けている患者においてヒト−抗マウス抗原(ＨＡＭＡ)応答を誘発し得る臨床の現場で望まれる。ハイブリドーマ由来マウスＣＤ１９抗体のＶＨおよびＶＬ配列を、公開文献から抽出した(Nicholson et al, 1997, supra)。ヒト化を、マウスＣＤ１９抗体からのＣＤＲ領域を、ヒト生殖系列アクセプターフレームワークＶＨ４＿４−５９およびＶＫ３＿Ｌ２５(ｖＢＡＳＥデータベース)に移植することにより達成した。ＣＤＲ領域に加えて、ＣＤＲ領域の構造的完全性を支持すると考えられる５フレームワーク残基、すなわちＶＨ ＃７１、＃７３、＃７８およびＶＬ ＃７１、＃８７が、マウス配列から維持された。さらに、ヒトＪ要素ＪＨ４およびＪＫ２を、それぞれ重鎖および軽鎖に使用した。ヒト化抗体の得られたアミノ酸配列を、それぞれＦＭＣ６３＿ＶＬ＿ｈｚおよびＦＭＣ６３＿ＶＨ＿ｈｚ１と命名し、下の表１にも示す。残基番号付けは、Kabat(Kabat E.A. et al, 1991, supra)に従う。ＣＤＲ定義について、KabatならびにChothia(Chothia et al, 1987 supra)を使用した。ｍマウスＣＤ１９由来残基を太字／斜体で示す。囲んだ位置＃６０／６１／６２は、ＨＣＤＲ２とも呼ばれるＣＤＲ Ｈ２における潜在的翻訳後修飾(ＰＴＭ)部位である。
これらのヒト化ＣＤ１９ ＩｇＧを使用して、発現を試験するための可溶性ｓｃＦｖおよび完全ＣＡＲＴ ＣＤ１９構築のためのｓｃＦｖを産生した(下記実施例参照)。ヒト化において、ＣＤＲＨ２領域における６２位が、マウスＣＤＲＨ２に存在するアラニンよりセリン残基が優先されるのは興味深い。マウス配列は翻訳後修飾(ＰＴＭ)を欠き、ＣＤＲＨ２における６０位／６１位／６２位にそれぞれアスパラギン−セリン−アラニンを有する。これは、ヒト化の過程中の潜在的ＰＴＭモチーフ(ＣＤＲＨ２における四角で示す)を産生する。ヒト化過程中に産生されたＰＴＭ部位が実際に“真の”ＰＴＭ部位であるかまたは単なる理論上のものかを試験した。アミノ酸モチーフアスパラギンと続くセリン(ＮＳ)が翻訳後脱アミド化に恐らく感受性であろうと仮説立てられたが、容易に明らかとなるようなものではなかった。また、アスパラギンと続くプロリン以外の任意のアミノ酸およびその後のセリン(ＮｘＳ、ｘ≠Ｐ)が翻訳後Ｎ−グリコシル化に恐らく感受性であろうと仮説立てられた。この仮説を試験するために、６０位のアスパラギン(グリコシル化部位であると知られる)をセリンまたはグルタミンに置き換え、それぞれＦＭＣ６３＿ＶＨ＿ｈｚ２(Ｎ６０Ｓ)およびＦＭＣ６３＿ＶＨ＿ｈｚ２(Ｎ６０Ｑ)と命名した２種のＩｇＧバリアントを産生した。これらの構築物を、潜在的翻訳後修飾部位(ＰＴＭ)を除き、保持された活性を試験するために産生した(下記実施例２参照)。
クローニング：
マウスおよびヒト化ＶＬドメインおよびＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を得て、構築物のコドンを、ホモ・サピエンスからの細胞における発現のために最適化した。
ＶＬドメインおよびＶＨドメインをコードする配列を、クローニングベクターから哺乳動物細胞における分泌に適する発現ベクターにサブクローンした。重鎖および軽鎖を個々の発現ベクターにクローン化して、共トランスフェクションを可能とした。発現ベクターの要素はプロモーター(サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)エンハンサー−プロモーター)、分泌を促進するためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナルおよび転写ターミネーター(ウシ成長ホルモン(ＢＧＨ)遺伝子)、エピソーム複製および原核生物での複製を可能とする要素(例えばＳＶ４０起源およびＣｏｌＥ１または当分野で知られるその他)および選択を可能とする要素(アンピシリン耐性遺伝子およびゼオシンマーカー)を含む。
発現：
キメラおよびヒト化ＩｇＧ候補を、ＨＥＫ２９３Ｆ哺乳動物細胞で１ml規模で発現させた。浄化した上清をＦＡＣＳ結合試験に使用した。より厳密には、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを添加したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地で５Ｅ５細胞／mlに希釈し、１mlを２４ウェル丸底深ウェルプレートに移した。０.５μgの軽鎖および０.５μgの重鎖哺乳動物発現プラスミドを、同じ培地で４μlのＦｕＧＥＮＥ ＨＤ(Roche REF 04709705001)と共に希釈した。１５分、ＲＴでインキュベーション後、ＤＮＡ／Ｆｕｇｅｎｅ混合物を細胞に滴下し、５％ＣＯ２インキュベーターに２５０rpm、３７℃で５日置いた。上清を、遠心により細胞から分離した。ＩｇＧ含量を測定するために、２００μL量を９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに入れた。全サンプルおよび標品を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｄｉｐを使用してデュプリケートで測定し、バイオセンサー(Fortebio Cat No 18-5010)で読んだ。プレートをOctet装置(ForteBio)に入れ、恒温チャンバーで２７℃で平衡化させた。データをOctet User Software version 3.0を使用して自動的に処理し、ＩｇＧ標準曲線との比較により濃度を決定した。
ＦＡＣＳによる結合分析：
ヒト化およびキメラ抗体を、細胞株３００.１９−ｈｓＣＤ１９ＦＬを使用してフローサイトメトリー結合アッセイで評価した。この細胞株は、マウスプレＢ細胞株３００.１９を完全長ヒトＣＤ１９コード化配列および天然プロモーターならびにゼオシン耐性遺伝子をコードするベクター(ｈＣＤ１９ ＦＬ／ｐＥＦ４−ｍｙｃ−Ｈｉｓ Ａ)でトランスフェクトすることにより産生した。簡潔にいうと、３００.１９細胞を直線化プラスミドで電気穿孔し、次いで高レベルのｈｓＣＤ１９を発現する細胞をＡＰＣ結合抗ヒトＣＤ１９ Ａｂ(ＢＤ ５５５４１５からのクローンＨＩＢ１９)を使用して同定し、続いてＦＡＣＳ Ａｒｉａフローサイトメーターを使用してソートした。ソートしたｈｓＣＤ１９＋細胞培養し、高レベルのｈｓＣＤ１９を安定に発現することを確認した。
結合アッセイを、発現されたＩｇＧを含む無血清培養培地で直接実施できた。全ての評価したＩｇＧを、同じ濃度に標準化し(８５nM)、その後３倍連続希釈で１.４pMまで希釈した。次いで、９６ウェルプレートで、５×１０５細胞／ウェル量を、希釈ＩｇＧと共に３０分、４℃でインキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液(ＰＢＳ中０.５％ＢＳＡ)で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液で１：１０００に希釈した検出抗体、ＡＰＣ結合ヤギ抗ｈｕ ＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異的(Dianova #109-136-098)を添加した。細胞をさらに３０分、４℃でインキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、FACS Calibur(BD Bioscience)を使用してアッセイした。結合曲線プロッティング(蛍光強度の中央値対ＩｇＧ濃度)およびＥＣ５０決定を、非線形回帰分析、シグモイド用量応答(可変勾配)でGraphPad PrismTM 3.0ソフトウェアを用いて実施した。
ＦＡＣＳ分析は、全ての評価したＩｇＧに対する見かけの結合が広範に変わり、いくつかの構築物は、ＩｇＧ対ｓｃＦｖとして、ＥＣ５０の５〜１０倍シフトを示す。ＥＣ５０値に基づき、キメラ対照と比較して、２倍までの結合親和性を有するリード候補を選択した。
実施例２：ヒト化ＣＤ１９ ＩｇＧ抗体由来抗ＣＤ１９可溶性ｓｃＦｖフラグメントの特徴づけ
可溶性ｓｃＦｖフラグメントを、実施例１に記載するヒト化ＣＤ１９ ＩｇＧから、標準的分子生物学手法を使用して産生した。これらの可溶性ｓｃＦｖを、ｓｃＦｖの安定性、細胞表面発現および結合特性を試験する特徴づけ試験に使用した。さらに、ヒト化過程で導入された潜在的ＰＴＭの影響を試験する実験も実施した。
ｓｃＦｖ発現および精製
各ｓｃＦｖ構築物のトランスフェクションのために、約３ｅ８ ２９３Ｆ細胞を、トランスフェクション試薬としてＰＥＩを３：１比(ＰＥＩ：ＤＮＡ)で使用して、１００μgのプラスミドでトランスフェクトした。細胞を、シェーカーフラスコ中、１００ml ＥＸＰｉ２９３発現培地(Invitrogen)で３７℃、１２５rpm、８％ＣＯ２で増殖させた。培養物を６日後に採取し、タンパク質精製に使用した。
２９３Ｆ細胞を、３５００ｇで２０分遠沈させることにより採取した。上清を採取し、VacuCap90 PF Filter Unit(ｗ／０.８／０.２μm Super Membrane、PALL)で濾過した。約４００μlのＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズ(Qiagen)を上清に添加した。混合物を、４時間、４℃で回転させ、インキュベートした。精製カラムに載せ、２０mMヒスチジン含有洗浄緩衝液で洗浄した。タンパク質を、３００mMヒスチジン含有５００μl 溶出緩衝液で溶出した。サンプルを、４℃で一夜、ＰＢＳ緩衝液に対して透析した。タンパク質サンプルを、nanodrop 2000cを使用して定量した。
ｓｃＦｖ立体構造およびコロイド安定性分析
ｓｃＦｖの熱安定性をＤＳＦにより決定した：１：１０００の最終希釈の１０〜２０μlのタンパク質サンプルと色素Sypro Orange(Invitrogen Cat#S6650)を、総体積２５μlでＰＢＳ中で混合し、ＢｉｏＲａｄ ＣＦ×１０００(２５℃で２分、次いで０.５℃増分で３０秒、２５〜９５℃)で流した。
分析的ＳＥＣ実験のために、２０μl ＰＢＳ中約１５〜２０μgのｓｃＦｖタンパク質サンプルを、TSKgel Super SW2000に、Agilent 1100シリーズ上、０.３ml／分流速で注入した。
ＦＡＣＳ結合によるＥＣ５０
マウス細胞株３００.ＣＤ１９を、０.５mg／ml ゼオシン含有ＲＰＭＩ １６４０で増殖させた。約５ｅ５細胞／ウェルを、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ ９６ウェルプレートに移した。細胞を、９００rpm(Sorval Legend XT centrifuge)で３分遠沈した。上清を除いた。抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖタンパク質サンプルを、５％ＦＢＳ含有ＤＰＢＳで希釈した。サンプルをウェルに添加し、ウェルを細胞と混合し、１時間インキュベートした。細胞を、５％ＦＢＳ含有ＤＰＢＳで２回洗浄した。細胞を、高ポリＨｉｓ ＰＥ(Ｒ＆Ｄ)と１時間インキュベートし、２回洗浄して、ＦＡＣＳ分析した(BD BiosciencesのLSRII)。
Ｐｒｏｔｅｏｎによる動態分析
動態を、Bio-Rad Proteonを使用して決定した。ＧＬＣセンサーチップ上への標準アミンカップリングを使用して、固定化を実施した。ｓｃＦｖサンプルを、酢酸ｐＨ４.５で０.０３mg／mLに希釈し、流速３０μL／分で３００秒チップに適用した。ＣＤ１９リガンドをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで連続希釈し、解離時間４８０秒を用いて流速５０μL／分で１２０秒で注入した。チップ表面を、グリシンｐＨ２.５で再生した。１：１ ラングミュアモデルを使用してデータをフィットさせた。
ＣＡＲＴ１９構築物の表面発現およびＦＡＣＳによる染色
種々の抗ｈＣＤ１９ ＣＡＲＴで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｆ懸濁細胞を、トランスフェクション２日後に採取した。約１ｅ６細胞をＶ型９６ウェルプレート(Greiner Bio-One, Germany)の各ウェルに入れ、０.２ml ＦＡＣＳ緩衝液(４％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)含有１×ＰＢＳ(BSA fraction V, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)で３回洗浄した。細胞を、０.２mlのＦＣＡＳ緩衝液に、０.２μgのビオチニル化タンパク質Ｌ(GenScript, Piscataway, NJ)または１００nMのｈＣＤ１９(ＡＡ １−２９１)−ｈＩｇＧ１ Ｆｃ(ＮＩＢＲＩにより産生)と共に再懸濁し、４℃で３０分インキュベートした。細胞を０.２mlのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、タンパク質Ｌ含有サンプルについては１μl Streptavidin Alexa Fluor 488(Life Technologies, Grand Island, NY)と０.２mlのＦＡＣＳ緩衝液中またはｈＣＤ１９−ｈＩｇＧ１ Ｆｃ含有サンプルについては２μlのＰＥ抗ヒトＦｃγ(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)と０.２mlのＦＡＣＳ緩衝液中、３０分、４℃で暗所でインキュベートした。０.２mlのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄後、細胞を、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア(BD Biosciences, San Jose, CA)を使用してLSRII(BD Biosciences, San Jose, CA)機で分析した。免疫蛍光染色を、生存細胞の相対対数蛍光として分析し、Alexa Fluor 488陽性またはＰＥ陽性細胞のパーセンテージを測定した。
ヒト化過程中に産生された潜在的ＰＭＴの分析
実施例１に記載するように、ヒト化中、ＣＤＲＨ２領域における６２位が、マウスＣＤＲＨ２に存在するアラニンよりセリン残基のほうが好ましいのは興味深かった。ヒト化過程中に産生されたＰＴＭ部位が実際に“真の”ＰＴＭ部位であるかまたは単なる理論上のものかを試験した。６０位のアスパラギン(グリコシル化部位であると知られる)をセリンまたはグルタミンに置き換え、それぞれＦＭＣ６３＿ＶＨ＿ｈｚ２(Ｎ６０Ｓ)およびＦＭＣ６３＿ＶＨ＿ｈｚ２(Ｎ６０Ｑ)と命名した２種のＩｇＧバリアントを産生した。これらの構築物を、潜在的翻訳後修飾部位(ＰＴＭ)を除き、保持された活性を試験するために産生した。
結果
抗ＣＤ１９ヒト化ｓｃＦｖおよびマウスｓｃＦｖは２９３Ｆ細胞で発現され、Ｈｉｓタグにより精製された。全ヒト化ｓｃＦｖの発現および収率は、元のマウスｓｃＦｖよりはるかに高かった(データは示していない)。
同一性を確認し、完全性を評価するために、ｓｃＦＶ構築物を、Ｎ−グリカナーゼＦ(ＰＮＧａｓｅＦ)とのインキュベーションを行いまたは行わず、高速液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリー(ＨＰＬＣ−ＭＳ)(図３参照)およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ(データは示していない)の両者により分析した。ＰＮＧａｓｅＦは、コンセンサス配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ／Ｃ(ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である)からのＮ連結グリカン構造除去に特異的な酵素である。簡潔にいうと、サンプルを水で０.１μg／μLに希釈し、未処理のまままたはＰＮＧａｓｅＦと１：２(ｗ／ｗ)ＰＮＧａｓｅＦ：ｓｃＦＶ比で３時間、３７℃でインキュベートした。
NovexのNuPAGE ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行う。約２μg ｓｃＦＶを各レーンに載せ、２００Ｖ定圧で４０分電気泳動を実施する。電気泳動後、ゲルをPhastGel Blue R 250染色(Amersham Pharmacia)を使用して染色し、１０％酢酸、３０％メタノールを使用して脱染する。
ＨＰＬＣ−ＭＳ分析を、Ｘｅｖｏ−Ｔｏｆマススペクトロメーターに連結されたWater's Acquity UPLC系で行う。約１μgの各サンプルを、６０℃で流速０.５mL／分に設定したＲ １／１０ ２.１×１００mm １０μm ＰＯＲＯＳカラム(Applied Biosciences)に載せる。移動相は、０.１％ギ酸(Ａ)および０.１％ギ酸、７５％イソプロパノール、２５％アセトニトリル(Ｂ)からなる。タンパク質を、１２分で２５％〜９０％Ｂの逆相勾配を用いてカラムから溶出する。源コーン電圧勾配２０〜５０Ｖを用いて６００〜４０００Daのｍ／ｚ範囲でエレクトロスプレー陽性走査を使用して、獲得を行う。得られたスペクトルを、ＭａｘＥｎｔ１を使用してデコンボリューションする。
グリコシル化部位を、ヒト化工程中に導入した。非ＰＴＭバリアント(ＶＨ：Ｎ６０ＳまたはＮ６０Ｑ)は、このさらなる形態を用いなかった。構築物は、ＨＣ ＣＤＲ２におけるＮ連結グリコシル化のコンセンサス部位を有する唯一であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、未処理サンプルは、二重項が観察される１０３１０１−ＷＴ(Ｓ／Ｎ)以外の全構築物について、その配列の凡その分子量と一致する単バンドとして移動した。この構築物は、Ｈ−ＣＤＲ２におけるＮ連結グリコシル化のコンセンサス部位を有する唯一である。ＰＮＧａｓｅＦで処理したとき、二重項の高分子量バンドはもはや存在せず、該部位の部分的占有を示唆する。同様に、デコンボリューションしたマススペクトルから観察された分子量は、アミノ酸配列から予測されるものに一致する。しかしながら、他の構築物は、一つの主要な分子片を示したが、１０３１０１−ＷＴ(Ｓ／Ｎ)はまた配列から予測されるより１２１７ダルトン高い集団を有し、これはＰＮＧａｓｅＦ処理後はもはや存在しない。これは、質量に基づき、恐らく、オリゴマンノース５である、一つの優勢なＮ連結グリコフォームの存在と一致する。グリコシル化形態の存在を、図３に示すようにＭＳ分析により確認した。
立体構造安定性を、示差走査蛍光定量法により測定した(ＤＳＦ)。図４に示すように、マウスｓｃＦｖのＴｍは５７℃であり、ヒトバリアントは約７０℃の高いＴｍを示した。ヒト化ｓｃＦｖ全てのＴｍは、マウスｓｃＦｖよりはるかに良好であり、全てのヒト化ｓｃＦｖがマウスｓｃＦｖより安定であることを明らかに示す。この安定性は、恐らくＣＡＲＴ１９構築物に反映され、治療特性改善に至る可能性がある。
精製ｓｃＦｖの活性を、ＳＰＲベースの検出法を使用する、ｈＣＤ１９発現細胞への結合ならびにｈＣＤ１９抗原への結合により測定した。マウス細胞株３００を、ｓｃＦｖの結合の決定に使用した。ｈＣＤ１９に対するマウスｓｃＦｖのＥＣ５０は約０６〜１.６nMであった。ヒト化バリアントは、低nMまたはnM以下のＥＣ５０範囲で、同じ範囲のＥＣ５０を示した。
実施例３：ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物
最終ＣＡＲ構築物において使用するＳｃＦｖは、実施例１に記載のヒト化ＩｇＧに由来した。表２に示すように、ＶＬドメインおよびＶＨドメインがｓｃＦｖ中で現れる順番を変え(すなわち、ＶＬ−ＶＨまたはＶＨ−ＶＬ配向)、各サブユニットが配列ＧＧＧＧＳ(配列番号１８)(例えば、(Ｇ４Ｓ)３(配列番号１０７)または(Ｇ４Ｓ)４(配列番号１０６))を含む“Ｇ４Ｓ”(配列番号１８)サブユニットの３または４コピーが、可変ドメインを連結して、ｓｃＦｖドメイン全体を産生した。
ヒト化ｓｃＦｖフラグメント(配列番号１〜１２)の配列を下記表３に示す。完全ＣＡＲ構築物を、配列番号１〜１２と、下記さらなる配列、配列番号１３〜１７を使用して産生し、配列番号３１〜４２を有する完全ＣＡＲ構築物を産生した。
・ リーダー(アミノ酸配列)(配列番号１３)
・ リーダー(核酸配列)(配列番号５４)
・ ＣＤ８ヒンジ(アミノ酸配列)(配列番号１４)
・ ＣＤ８ヒンジ(核酸配列)(配列番号５５)
・ ＣＤ８膜貫通(アミノ酸配列)(配列番号１５)
・膜貫通(核酸配列)(配列番号５６)
・ ４−１ＢＢ細胞内ドメイン(アミノ酸配列)(配列番号１６)
・ ４−１ＢＢ細胞内ドメイン(核酸配列)(配列番号６０)
・ ＣＤ３ゼータドメイン(アミノ酸配列)(配列番号１７)
・ ＣＤ３ゼータ(核酸配列)(配列番号１０１)
・ ＣＤ３ゼータドメイン(アミノ酸配列；NCBI Reference Sequence NM_000734.3)(配列番号４３)
・ ＣＤ３ゼータ(核酸配列；NCBI Reference Sequence NM_000734.3)(配列番号４４)
・ ＩｇＧ４ヒンジ(アミノ酸配列)(配列番号１０２)
・ ＩｇＧ４ヒンジ(ヌクレオチド配列)(配列番号１０３)
これらのクローンは、全て４−１ＢＢ由来の共刺激ドメインのシグナルドメインにＱ／Ｋ残基変化を含んだ。
ｓｃＦｖドメインのヒト化ＣＤＲ配列の配列を、重鎖可変ドメインについて表４および軽鎖可変ドメインについて表５に示す。“ＩＤ”は、各ＣＤＲ。のそれぞれの配列番号を意味する
表６は、ＣＤ１９構築物数字の名前を、ｓｃＦｖの軽鎖および重鎖の特異的配向、重鎖と軽鎖を離すリンカーユニット数(すなわち、(Ｇ４Ｓ)３(配列番号１０７)または(Ｇ４Ｓ)４(配列番号１０６))および重鎖ＣＤＲ２における特徴的アミノ酸配列と相関させる検索表である。
ＣＡＲ ｓｃＦｖフラグメントを、次いでレンチウイルスベクターにクローン化して、単一符号化フレーム内に完全長ＣＡＲ構築物を産生し、発現のためにＥＦ１アルファプロモーター(配列番号１００)を使用した。
ＥＦ１アルファプロモーター
ヒト化ＣＡＲ構築物の分析を、実施例４に記載するように実施した。
実施例４：ＣＡＲＴにおけるヒト化ＣＤ１９構築物の分析
ＣＡＲテクノロジーによるＣＤ１９ターゲティングの実施可能性を評価するために、抗ＣＤ１９抗体の一本鎖可変フラグメントを、４種の立体配置でＣＤ３ゼータ鎖および４−１ＢＢ共刺激分子を含むレンチウイルスＣＡＲ発現ベクターにクローン化し、ＣＤ１９＋標的に応答するＣＤ１９ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞(“ＣＡＲＴ１９”または“ＣＡＲＴ１９ Ｔ細胞”)のエフェクターＴ細胞応答の量および品質に基づき、最適構築物を選択する。エフェクターＴ細胞応答は、細胞増殖、増殖、倍加、サイトカイン産生および標的細胞殺細胞または細胞溶解活性(脱顆粒)を含むが、これらに限定されない。
材料および方法
再指向ヒト化ＣＡＲＴ１９ Ｔ細胞の産生
ヒト化ＣＡＲＴ１９レンチウイルス導入ベクターを、ＶＳＶｇ偽型レンチウイルス粒子に包装されたゲノム物質を作るために使用した。レンチウイルス導入ベクターＤＮＡを、ＶＳＶｇ、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｒｅｖの３つのパッケージング成分と、リポフェクタミン試薬と組み合わせて、それらを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトするために混合する。２４時間および４８時間後、培地を回収し、濾過し、超遠心分離法により濃縮する。得られたウイルス調製物を−８０℃で保存する。形質導入ユニットの数を、ＳｕｐＴ１細胞のタイトレーションにより決定する。再指向ＣＡＲＴ１９ Ｔ細胞を、新鮮ナイーブＴ細胞をＣＤ３ｘ２８ビーズと２４時間接触させ、次いで、所望のパーセンテージの形質導入Ｔ細胞を得るための適切な数の形質導入ユニットの添加により活性化させることにより産生する。これらの修飾Ｔ細胞は、休息状態となり、サイズが小さくなり始めるまで増殖可能であり、その時点で後の分析のために凍結保存する。細胞数およびサイズを、coulter multisizer IIIを使用して測定する。凍結保存前に、形質導入された(ＣＡＲＴ１９を細胞表面に発現する)細胞のパーセンテージおよびその発現の相対的蛍光強度を、ＬＳＲIIでのフローサイトメトリー分析により決定する。ヒストグラムプロットから、ＣＡＲの相対的発現レベルを、形質導入パーセンテージとその相対的蛍光強度の比較により試験できる。
ヒト化ＣＡＲＴ１９再指向Ｔ細胞の細胞溶解活性、増殖能およびサイトカイン分泌の評価
ヒト化ＣＡＲ１９ Ｔ細胞の殺し、増殖し、そしてサイトカインを分泌する機能的能力を評価するために、細胞を解凍し、一夜回復させる。ヒト化ＣＡＲＴ１９に加えて、マウスＣＡＲＴ１９を比較目的で使用し、ＳＳ１−ＢＢｚをバックグラウンドＣＡＲ／Ｔ細胞効果のための非ターゲティング発現されるＣＡＲとして使用した。“対照”至適基準(ＧＳ)ＣＡＲＴ１９を、アッセイ変動を比較するために全アッセイで使用した。ＧＳ ＣＡＲＴ１９は、研究グレード(すなわち、臨床グレードではない)製造条件で産生される細胞であることは重要であり、増殖培養のためにＩＬ−２の添加を含む。このことは、これらの細胞の全生存期間の生存能および機能性に影響する可能性があり、他の形質導入Ｔ細胞集団の研究グレード産生の直接比較として評価してはならない。Ｔ細胞殺細胞は、ＣＤ１９を発現するまたは発現しない慢性骨髄性白血病細胞株であるＫ５６２またはＣＬＬ患者から単離されたＢ細胞であるＰｔ１４に対してであった。このフローベースの細胞毒性アッセイのために、標的細胞をＣＳＦＥで染色し、その存在を定量化する。標的細胞をＣＤ１９発現について染色して、類似の標的抗原レベルであることを確認した。ＣＡＲ１９ Ｔ細胞の細胞溶解性活性を、エフェクター：標的細胞比１０：１、３：１、１：１、０.３：１および０：１のタイトレーションで測定し、ここで、エフェクターは、抗ＣＤ１９キメラ受容体を発現するＴ細胞として定義された。アッセイを、適切な数のＴ細胞と、一定数の標的細胞の混合により開始した。１６時間後、各混合物の全液相を除去し、洗浄した各ウェルを適当にあわせた。Ｔ細胞をＣＤ２について染色し、全細胞を生存／死マーカー７ＡＡＤで染色した。最終洗浄後、ペレット化細胞を、予定した数の計数ビーズと共に特定の体積で再懸濁した。細胞染色データをＬＳＲIIフローサイトメトリーにより集め、ビーズを使用するＦｌｏＪｏソフトウェアで解析して、結果を定量化した。
ヒト化ＣＡＲ１９ Ｔ細胞の細胞増殖およびサイトカイン産生を測定するために、細胞を解凍し、一夜回復させる。ヒト化ＣＡＲＴ１９に加えて、マウスＣＡＲＴ１９を比較目的で使用し、ＳＳ１−ＢＢｚをバックグラウンドＣＡＲ／Ｔ細胞効果のための非ターゲティング発現されるＣＡＲとして使用した。“対照”至適基準(ＧＳ)ＣＡＲＴ１９を、アッセイ変動を比較するために全アッセイで使用した。Ｔ細胞は、ＣＤ１９を発現するまたは発現しない慢性骨髄性白血病細胞株であるＫ５６２またはＣＬＬ患者から単離されたＢ細胞であるＰｔ１４に対してであった。さらに、ＣＤ３ｘ２８ビーズを、Ｔ細胞が内在性免疫学的シグナルに応答する可能性を評価するために使用した。増殖を分析するために、Ｔ細胞をＣＳＦＥで染色した。増殖は、親マーキングの現在の２娘細胞への分離を反映する、ＣＳＦＥ染色の希釈である。アッセイは、１：１および１：０のエフェクター：標的比でのみ試験し、ここで、エフェクターは、抗ＣＤ１９キメラ受容体を発現するＴ細胞として定義された。アッセイをデュプリケートで行い、細胞混合２４時間後、培地の５０％を、Luminex 10-plexパネルのヒトサイトカイン検出を使用するサイトカイン分析のために除去／置換する。５日後、Ｔ細胞をＣＡＲ発現について染色し、ＣＤ４またはＣＤ８細胞として表現型決定し、７ＡＡＤで生存／死について染色した。最終洗浄後、ペレット化細胞を、予定した数のＢＤ計数ビーズと共に特定の体積で再懸濁した。細胞染色データをＬＳＲIIフローサイトメトリーにより集め、ビーズを使用するＦｌｏＪｏソフトウェアで解析して、結果を定量化した。総細胞数を、特定の数のビーズに対して計数した細胞数をさらに計数すべきビーズの画分で乗じて決定した。
ヒト化ＣＡＲＴ１９細胞が、現在成功しているマウスＣＡＲＴ１９と同様に機能する可能性を評価するために、インビトロで標的細胞を殺す能力、標的抗原に応答して増殖する能力および残留性の兆候を示す能力を評価すること計画した。ヒト化ＣＡＲＴ１９レンチウイルス構築物の各々をＳｕｐＴ１細胞にパッケージングし、そこで力価測定することにより、形質導入を約５０％と標準化するウイルスの量を決定できた。これは、細胞あたり、類似の平均組込み部位で開始する活性のより直接の比較を可能にする。
治療的ＣＡＲ１９ Ｔ細胞を、正常アフェレシスドナーからの血液から出発して産生し、そのナイーブＴ細胞を、Ｔ細胞、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球の陰性選択により得る。これらの細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で１０％ＲＰＭＩ中のＣＤ３ｘ２８ビーズにより活性化する。
２４時間後、Ｔ細胞をブラスティングし、標準化した量のウィルスを添加する。Ｔ細胞は対数増殖パターンで分裂をはじめ、これをmlあたりの細胞数および細胞サイズの測定によりモニターする。Ｔ細胞が休止を始めると、対数増殖が減弱し、細胞サイズが縮む。増殖速度減速および約３００flに近づくＴ細胞サイズの組み合わせが、Ｔ細胞を凍結保存または再刺激する状態を決定する。
サイズにより見られるように、休止するＴ細胞に極めて類似する傾向がある。ヒト化ＣＡＲＴ細胞と現在のマウスＣＡＲＴ１９およびＵＴＤ集団の間のほぼ重なるパターンは、活性化後の正常Ｔ細胞増殖に対するヒト化ＣＡＲ１９に異常な効果がないことを示す。対照として、ＳＳ１−ＢＢｚを、望ましくない抗原非依存的ＣＡＲ活性を定義するために使用する。総細胞数における増殖プロファイルは、個々の増殖における実際の数の差異が恐らく主に出発細胞数の差異によることを示す。出発Ｔ細胞数の標準化により、全てのＣＡＲＴ１９細胞について密集が見られる。さらに、抗原非依存的ＣＡＲ活性化の望まない効果は、群から下にかつ離れる線により検出される。
これらのＣＡＲ１９発現細胞の各々の表面発現レベルを決定した。形質導入について標準化した力価測定を行ったウイルスは、遺伝子導入効率、形質導入細胞パーセントと相関する、同等な発現レベルを示す。あるＣＡＲは、先のパッケージングから外挿された力価を有し、形質導入パーセントは低いにも関わらず、ＭＦＩも予想通り減少する。結果は、ＵＴＤおよびマウスＣＡＲ１９ Ｔ細胞と比較したとき、ヒト化ＣＡＲ１９が、正常に増殖する細胞の能力に検出可能な陰性効果がないことを示す。
ヒト化ＣＡＲＴ１９細胞が、細胞上に発現された細胞表面特異的エピトープを選択的に区別し、破壊する能力を分析する。野生型Ｋ５６２細胞はＣＤ１９を発現しないが、ＣＤ１９を発現するように形質導入できる。これらの殺細胞曲線を比較して、エフェクター細胞の定量は、ＣＤ１９を発現する細胞が破壊されることを示す。同じドナー由来であり、ヒト化ＣＡＲＴ１９細胞または現在の臨床用マウスＣＡＲＴ１９細胞で修飾された再指向Ｔ細胞は、殺細胞力に差がないことを示す。殺細胞曲線は、患者１４からのＣＤ１９＋ ＣＬＬ細胞をターゲティングするヒト化ＣＡＲＴ１９細胞で極めて類似する殺細胞力を有することを示す。興味深いことに、全体的細胞溶解活性の減少が、特にＧＳ ＣＡＲＴ１９であり、これらの細胞が特異的阻害特性を有し得ることを示唆する。標的細胞上に発現されるＣＤ１９レベルが同様であることは、発現レベルが殺細胞能の差の原因ではないことを示す。
標的細胞と知った後にヒト化ＣＡＲＴ１９細胞が増殖するために必要な特性が、対照ＣＤ３ｘ２８ビーズおよびＣＤ１９発現標的による刺激後に、全構築物で見られる。Ｐｔ１４ ＣＬＬ細胞のターゲティングは、３ｘまたは４ｘ ＧＧＧＧＳ結合(それぞれ配列番号１０７および１０６)を有するとき、軽鎖から重鎖配向を有するｓｃＦｖでわずかに大きな増殖率を示すようであり、バイアスは見られない。増殖結果は、５日間で蓄積された総細胞数を反映し、ヒト化ＣＡＲＴ１９、２１４６、２１４４、２１３６、２１４１および２１３７が、Ｔ細胞により増殖性のシグナルを駆動することを示す。印象としては、これがＰｔ１４ ＣＬＬ細胞をターゲティングするヒト化ＣＡＲＴ１９細胞で検出された。
まとめると、ヒト化ＣＡＲＴ１９構築物は、抗原特異的標的に対する細胞溶解活性、増殖性応答およびサイトカイン分泌において、現在のマウスＣＡＲＴ１９と極めて類似する特性を示す。ヒト化ＣＡＲＴ１９細胞(２１４６、２１４４、２１３６、２１４１および２１３７)が標的活性化により、より増殖性のシグナルをＴ細胞に駆動する可能性は、潜在的に治療応答を高めるためのこれらの新規構築物の追加の利点であるように見える。
結果
脱顆粒およびサイトカイン産生アッセイの両者を使用して、操作されたＣＡＲＴ１９ Ｔ細胞がＣＤ１９＋細胞を特異的に標的とすることが示される。
本発明のヒト化ＣＤ１９ＣＡＲ構築物(別名“ｈｕＣＡＲＴ１９”)を形質導入したＮＤ３１７細胞を分析した。マウスＣＡＲＴ１９および非修飾(ＵＴＤ)Ｔ細胞と比較して、ＣＤ３ｘ２８活性化およびヒト化ＣＡＲＴ１９候補形質導入後の増殖の間、Ｔ細胞のサイズは極めて類似した。
実験で、マウスＣＡＲＴ１９および非修飾(ＵＴＤ)Ｔ細胞と比較して、ＣＤ３ｘ２８活性化および種々のヒト化ＣＡＲＴ１９候補形質導入後の増殖の間に蓄積されるＴ細胞数にほとんど差は示されなかった。
ヒト化ＣＡＲＴ１９の細胞表面発現は、マウスＣＡＲＴ１９と同等であり、発現レベルは極めて類似した。各ヒト化ＣＡＲＴ１９形質導入Ｔ細胞の細胞表面発現染色パターンおよびこれらのプロファイルから計算された平均蛍光強度(ＭＦＩ)をプロットするヒストグラムの重層は、形質導入された細胞のパーセンテージとよく相関する。
さらに、ヒト化ＣＡＲＴ１９は、ＣＤ１９発現標的細胞のターゲティングにおいて類似の特異的細胞毒活性を有し、マウスＣＡＲＴ１９と同等である。ＣＳＦＥ標識Ｋ５６２ｃｃ(図１Ａ。非発現ＣＤ１９対照)、Ｋ５６２.ＣＤ１９(図１Ｂ、ＣＤ１９を発現するように形質導入したＫ５６２細胞)またはＰｔ１４(図１Ｃ、ＣＬＬ患者からのＢ細胞)をターゲティングするエフェクターヒト化ＣＡＲＴ１９細胞でのエフェクター対標的(Ｅ：Ｔ)比の用量設定を使用する１６時間フローベースの殺細胞アッセイ。ヒト化ＣＡＲＴ１９細胞全ての細胞溶解性活性は類似し、マウスＣＡＲＴ１９と同等である。異なる標的間の細胞溶解活性の差は類似し、同等であり、マウスＣＡＲＴ１９の活性がＣＡＲＴ１９のヒト化形態で保持されることを示す。
標的細胞と混合して６日後のＣＦＳＥ有標ヒト化ＣＡＲＴ１９細胞のヒストグラム重層は、その増殖能を示す(図５)。ＣＡＲ１９から送達される増殖性応答は、正の臨床応答を生じるために、標的細胞と接触し、破壊した後の必要な応答である。親細胞株から薄められる娘細胞の分裂の指標である、ＳＳ１−ＢＢｚ ＣＳＦＥ染色の希釈は、ターゲティング非依存的機構で分裂を維持する非休止Ｔ細胞の結果である。
増殖する細胞集団全体の能力を、ＴＣＲと共刺激因子ＣＤ２８の内在性結合を模倣するＣＤ３ｘ２８ビーズで評価する。データは、各細胞集団が同等な増殖能を有することを示す。全ヒト化およびマウスＣＡＲＴ１９細胞は、ＣＤ１９を発現するＫ５６２細胞との接触により、強く、そして同等に増殖する。ヒト化ＣＡＲＴ１９細胞はまたＣＬＬ患者から得たＢ細胞に良好に応答するが、いくつかの応答はわずかに低いように見える。図２Ａおよび２Ｂに示すように、ヒト化ＣＡＲＴ１９細胞２１３６、２１３７、２１４０、２１４１、２１４４および２１４６は、ＣＳＦＥ染色の大きな希釈により示されるように、わずかにより強い増殖を有すると見ることができる。これらの構築物は、全て、軽から重への同じ可変鎖配向を有し、これが、最適な配向であることを示す。重鎖ＣＤＲ２部位のアミノ酸変化の精査(表１)は、ＹＳＳＳＬ、ＹＱＳＳＬおよびＹＮＳＳＬ(各々配列番号２８、２９および３０)のバリエーションが、標的と接触した後の、より強い増殖を有するように見える構築物に現れることを明らかにする。さらに、これらの観察された構築物は、
３コピーのサブユニットを含むＧ４Ｓリンカー(３Ｇ４Ｓ)(配列番号１０７)および４コピーのサブユニットを含むＧ４Ｓリンカー(４Ｇ４Ｓ)(配列番号１０６)の両者を含み、リンカーサイズが機能に影響しなかったことを示す。
上記増殖性拡大から、腫瘍接触５日後の総細胞数を決定する。細胞は、最初に播種したより数の減少を示し、活性化が生存維持に必要であることを示す。内在性活性化対照を分析し、６日後の総細胞数が類似することを示した。ＣＤ１９を発現するＫ５６２細胞をターゲティングするヒト化ＣＡＲＴ１９細胞は、２つのマウスＣＡＲＴ１９細胞とも高細胞数で終わり、２１４６が類似の値を有する他の構築物をわずかに超えた。総細胞数を、患者１４からのＢ細胞(ｐｔ１４)に曝した６日後にも分析し、興味深いことに先に選択した、全て、軽鎖から重鎖配向を有し、３アミノ酸変異ＹＳＳＳＬ、ＹＱＳＳＬおよびＹＮＳＳＬ(それぞれ配列番号２８、２９および３０)を有するヒト化ＣＡＲＴ１９構築物２１４６、２１４４、２１３６、２１４１および２１３７が、マウスＣＡＲＴ１９より高い、高い総細胞数をもたらすことが示される。種々のヒト化抗ＣＤ１９ＣＡＲクローンの間のこの予測外の差異は、これらの構築物を形質導入したＣＡＲＴ細胞の良好な臨床効果に反映され得る。
ＣＤ１９を発現しない対照Ｋ５６２細胞に曝した後のヒト化ＣＡＲＴ１９細胞から産生されるサイトカインの背景レベルを分析した。２４時間上清を、luminex 30-plexパネルを使用して分析した。内在性免疫系のＣＤ３ｘ２８ビーズでの刺激からの潜在的サイトカインプロファイルは、細胞集団の各々が、同等なサイトカインプロファイルを有することを示す。
ヒト化ＣＡＲＴ１９およびマウスＣＡＲＴ１９が、同じ標的に応答したとき、類似レベルの類似サイトカインプロファイルを産生することもデータは示す。サイトカインプロファイルは、Ｐｔ１４標的細胞をターゲティングしたとき、低かったが類似した。
実施例５：インビボＡＬＬモデルにおけるヒト化ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞処置
初代ヒトＡＬＬ細胞を、インビトロで培養することなく免疫無防備状態マウスで増殖させ得る。これらのマウスを、臨床で見られるであろう、患者集団を表すモデルにおけるキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)Ｔ細胞の有効性の試験に使用する。ここで使用するモデル、ＨＡＬＬＸ５４４７は、ＣＡＲ Ｔ細胞の有効性を試験する試験に使用する前に、ＮＯＤ.Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ (ＮＳＧ)マウスで２回継代した。
マウスＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、初代ヒトＡＬＬのＮＳＧマウスモデルにおいて白血病細胞を標的とし、殺すことが先に示されている。ＣＤ１９ ｓｃＦｖ(一本鎖Ｆｃ可変フラグメント)は、ヒト化されており、本実施例は、ヒト化ＣＤ１９ ＣＡＲ(ＣＡＲ ２)を発現するＴ細胞がインビボでＡＬＬ腫瘍細胞を除去する能力を、マウスＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較する。ここで、これらの細胞の有効性は、ヒトＣＤ１９＋細胞の末梢血ＦＡＣＳ分析でアッセイして、確立された初代ヒトＡＬＬを有するマウスにおいて直接比較されている。１.５×１０６初代ＡＬＬ細胞を、静脈内にインプラント後、血中の２.５〜４％ＣＤ１９＋ヒト細胞の疾患負荷が、腫瘍インプラント２週間後までに達成された。このＣＤ１９パーセンテージは、マウスの血中の総細胞のものである。ＣＡＲ Ｔ細胞での処置前のマウスにおけるヒト細胞の１００％が腫瘍細胞である。末梢血における２％を超えるＣＤ１９＋ヒト細胞のパーセンテージは、このモデルにおける確立されたヒトＡＬＬ疾患と考えられる。白血病担持マウスを、白血病がマウスで確立されたら、腫瘍インプラント約２〜３週間後にＣＡＲ Ｔ細胞で処置した。各群のマウスを、５×１０６総ヒトＴ細胞で処置した。ドナーヒトＴ細胞のＣＡＲ発現レンチウイルスでの形質導入効率は、４０〜６０％であった。Ｔ細胞での処置後、疾患進行のバイオマーカーとして血中のＣＤ１９＋ヒト細胞のパーセンテージを分析するためにマウスから毎週採血した。
材料および方法：
初代ヒトＡＬＬ細胞：初代細胞は、インプラント前にインビトロで培養しなかった。これらの細胞を、ＡＬＬの患者から回収し、確立および増殖のためにマウスに導入した。腫瘍細胞がマウスで増大した後、骨髄および脾細胞を回収し、再インプラントのために、別々のバッチで生存可能なように凍結した。細胞を、９０％ＦＢＳおよび１０％ＤＭＳＯ中、５×１０６細胞／ミリリットルの最小濃度で凍結させた。再インプラントのために、凍結ＡＬＬ細胞を解凍し、ヒト化ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞およびマウスＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍有効性の比較に使用するマウスを産生するために、ＮＳＧマウスに静脈内注射した。
マウス：６週齢ＮＳＧ(ＮＯＤ.Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ)マウスを、Jackson Laboratory(stock number 005557)から受け取った。動物を、実験の少なくとも３日前からNovartis NIBRI動物施設に気候順化させた。動物を、Novartis ACUC規則およびガイドラインに従い取り扱った。
腫瘍インプラント：インビボで連続的に継代した初代ヒトＡＬＬ細胞、モデルＨＡＬＬＸ５４４７を、３７℃水浴で解凍した。次いで細胞を１５mlコニカルチューブに移し、冷無菌ＰＢＳで２回洗浄した。次いで、初代ＡＬＬ細胞を計数し、１５×１０６細胞／ミリリットルＰＢＳの濃度で再懸濁させた。細胞を氷上に置き、直ぐ(１時間以内)にマウスにインプラントした。ＡＬＬ細胞を、尾静脈から１００μl体積で、計１.５×１０６細胞／マウスで注射した。
ＣＡＲ Ｔ細胞投薬：マウスに、腫瘍インプラント１６日後５×１０６ Ｔ細胞を投与した。細胞を３７℃水浴で一部解凍し、細胞含有チューブへの１mlの冷無菌ＰＢＳの添加により完全に解凍した。解凍細胞を１５mlファルコンチューブに移し、ＰＢＳで最終体積１０mlに調節した。細胞を、各回１０００rpmで１０分で洗浄し、次いで血球計数器で計数した。次いでＴ細胞を、５０×１０６細胞／ml冷ＰＢＳで最懸濁し、マウスに投薬するまで氷の上に維持した。マウスに、１００μlのＣＡＲ Ｔ細胞を、５×１０６ Ｔ細胞／マウスの要領で、尾静脈から静脈内注射した。群あたり５マウスを、１００μlのＰＢＳ単独(ＰＢＳ)、未処置Ｔ細胞(偽)、マウスＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞(ｍｕＣＴＬ０１９)またはヒト化ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞(ｈｕＣＴＬ０１９)のいずれかで処置した。未処置Ｔ細胞、ｍｕＣＴＬ０１９ Ｔ細胞およびｈｕＣＴＬ０１９ Ｔ細胞は、全て、並行して同じヒトドナーから調製した。
動物モニタリング：マウスの健康状態を、週２回の体重測定を含み、連日モニターした。体重の変化パーセントを(ＢＷ現在−ＢＷ初期)／(ＢＷ初期)×１００％として計算した。腫瘍負荷を、末梢血ＦＡＣＳ分析により毎週モニターした。マウスを、尾静脈から、氷上に置いたＥＤＴＡ被覆チューブに毎週採血した。１０〜２０μlの血液を、氷上の９６ウェルプレートにプレーティングした。赤血球を、ＡＣＫ赤血球溶解緩衝液(Life Technologies, catalog number A10492-01)で溶解し、冷ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を、ヒトおよびマウスＦｃブロック(Miltenyi Biotec, catalog numbers 130-059-901および130-092-575)のＦｃブロッキングミックスと３０分インキュベートし、次いで、抗ヒトＣＤ１９抗体と３０分インキュベートした。細胞を、２％パラホルムアルデヒド溶液で２０分固定し、洗浄し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳに一夜保存し、その後BD CantoまたはFortessaで分析し、続いてＦｌｏｗＪｏ ＦＡＣＳ分析ソフトウェアでさらに分析した。ヒトＨＡＬＬＸ５４４７ ＡＬＬ腫瘍担持ＮＳＧマウスの血中のヒトＣＤ１９＋細胞のパーセントを決定するために、細胞を分析した。血中のＣＤ１９パーセンテージは、平均±平均値の標準誤差(ＳＥＭ)として報告する。
パーセント処置／対照(Ｔ／Ｃ)値を、次の式を使用して計算した。
ΔＴ≧０ならば、％Ｔ／Ｃ＝１００×ΔＴ／ΔＣ；
ΔＴ＜０ならば、％退縮＝１００×ΔＴ／Ｔ初期；
式中、Ｔ＝試験最終日の薬物処置群の平均末梢血ＣＤ１９パーセンテージ；Ｔ初期＝投薬初日の薬物処置群の平均末梢血ＣＤ１９パーセンテージ；ΔＴ＝試験最終日の薬物処置群の平均末梢血ＣＤ１９パーセンテージ−投薬初日の薬物処置群の平均末梢血ＣＤ１９パーセンテージ；Ｃ＝試験最終日の対照群の平均末梢血ＣＤ１９パーセンテージ；およびΔＣ＝試験最終日の対照群の平均末梢血ＣＤ１９パーセンテージ−投薬初日の対照群の平均末梢血ＣＤ１９パーセンテージ。
１００％〜４２％の範囲のＴ／Ｃ値を、抗腫瘍活性がないまたは最小であると解釈した；≦４２％および＞１０％のＴ／Ｃ値は、抗腫瘍活性または腫瘍増殖阻害を有すると解釈する。Ｔ／Ｃ値≦１０％または退縮値≧−１０％は、腫瘍静止と解釈する。退縮値＜−１０％は、退縮として報告する。
結果：
マウスおよびヒト化ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性を、ヒトＡＬＬの初代モデルで評価し、直接比較した。０日目の腫瘍インプラント後、マウスを数処置群に無作為化し、１６日目に５×１０６ Ｔ細胞で静脈内処置した。ＡＬＬ疾患負荷および動物健康を、動物がエンドポイントに達するまでモニターした。全群のマウスを、対照群における疾患負荷が、末梢血でヒトＣＤ１９＋細胞が８０％を超えたときである腫瘍インプラント６５日後に殺した。
対照群と、マウスまたはヒト化ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかで処置された群で疾患負荷に明らかな差が見られ、腫瘍インプラント２４日後からＰ＜０.０１であり、６５日目の試験最終日まで続いた。マウスおよびヒトＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＮＳＧマウスにおけるヒトＨＡＬＬＸ５４４７ ＡＬＬ腫瘍細胞増殖の制御に類似する能力を示した。両群とも、ＨＡＬＬＸ５４４７インプラント２１日後に１２〜１５％ヒトＣＤ１９＋細胞のピーク末梢血疾患レベルを示した。腫瘍細胞インプラント４２日後、ヒトＣＤ１９＋細胞はｈｕＣＴＬ０１９で検出不可能であり、一方ｍｕＣＴＬ０１９群におけるヒトＣＤ１９＋細胞のパーセンテージは約１％まで落ちた。マウスおよびヒト化ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞の両者とも、このモデルで初代ヒトＡＬＬ細胞の増殖の制御に同等な能力をもたらした(Ｐ＞０.０５)。偽形質導入Ｔ細胞群の％Ｔ／Ｃ値は９４.４０％であり、偽形質導入Ｔ細胞が抗腫瘍活性を有しないことを示した。ｍｕＣＴＬ０１９群の退縮パーセントは−８９.７５％であり、ｈｕＣＴＬ０１９群は−９０.４６％であり、これらの処置のいずれもＨＡＬＬＸ５４４７腫瘍モデルの退縮を起こすことができることを示す。これらのマウスにおける疾患負荷の指標としての末梢血ヒトＣＤ１９＋細胞パーセンテージを図７に示す。Ｔ細胞を何も受けなかったＰＢＳ処置群は、静脈内にインプラントしたＮＳＧマウスのベースライン初代ＡＬＬ腫瘍増殖動態を示した。偽処置群は、ＣＡＲ Ｔ細胞と同じインビトロ増殖過程を経た未処置Ｔ細胞を受けた。これらの細胞は、この腫瘍モデルにおけるＴ細胞の非特異的応答を示すためのＴ細胞対照として役立つ。ＰＢＳ群および偽形質導入Ｔ細胞処置群の両者とも、試験中の腫瘍進行継続を示した。マウスおよびヒト化ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞のいずれも、５×１０６ Ｔ細胞注射１週間以内に疾患の進行を制御し、この６５日試験の間中の持続した疾患制御の類似する能力を示す。
マウスおよびヒト化ＣＤ１９ ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の抗腫瘍活性を、初代ヒトＡＬＬモデルを担持するＮＳＧマウス、ＨＡＬＬＸ５４４７における有効性試験において評価した。この試験は、マウスおよびヒト化ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞(ｍｕＣＴＬ０１９およびｈｕＣＴＬ０１９)の両者が、ヒトＡＬＬの初代モデルにおいて抗腫瘍応答を開始できることを示す。さらに、この応答は、末梢血疾患負荷によりアッセイして、ｍｕＣＴＬ０１９およびｈｕＣＴＬ０１９細胞で同じである。マウスおよびヒト化ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞のいずれも、Ｔ細胞を投与されたマウスで１週間以内に初代ＡＬＬ増殖を制御する。処置後最初は、疾患負荷は増加を続け、その後実質的に検出不可能なレベルまで減少した。マウスまたはヒト化ＣＡＲ Ｔ細胞いずれかの１処置が、対照処置マウスにおける６５日疾患進行の間、持続した抗腫瘍応答をもたらした。ヒト化ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、マウスＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞で見られるのと類似した、有効な抗ＣＤ１９腫瘍応答および対照ＡＬＬ疾患負荷を開始する能力を有することが示された。
実施例６：多発性骨髄腫の処置に使用するためのＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞
化学療法、標的化治療および自己幹細胞移植の現在レジメンでも、骨髄腫は不治の疾患と考えられている。本実施例は、キメラ抗原受容体でＣＤ１９を指向する自己Ｔ細胞(レンチウイルス／ＣＤ１９：４−１ＢＢ：ＣＤ３ゼータ；“ＣＡＲＴ１９”またはＣＴＬ０１９としても既知)での多発性骨髄腫(ＭＭ)の処置を記載する。この実施例は、ＣＤ１９指向ＣＡＲ治療が、極めて低い(ほとんどの方法では検出不可能な)レベルのＣＤ１９を発現する、骨髄腫幹細胞および／または腫瘍細胞のターゲティングに基づき、深い、長期持続性寛解を確立する能力を有することを示す。
侵襲性二次形質細胞白血病を有する患者の処置において、我々は、サルベージ自己幹細胞移植２日後に投与したＣＡＲＴ１９が、複数系統の化学療法で進行している患者における形質細胞白血病の急速な排除と、極めて良好な部分応答をもたらしたことを発見した。この患者は、処置前数ヶ月輸血に頼っており、処置２ヶ月後、彼女の血球数は回復し(正常範囲の血小板数および白血球数)、輸血の必要がなくなり、退院した。
骨髄腫細胞はＣＤ１９を天然で発現しないため、ＣＡＲＴ１９処置がこの腫瘍で急速かつ顕著な腫瘍応答を誘発することは驚きであった。特定の理論に縛られないが、(１)骨髄腫細胞は、フローサイトメトリーにより伝統的にＣＤ１９発現が陰性であると考えられていたが、骨髄腫細胞が、発現がフローサイトメトリーまたは免疫組織化学ではなくＲＮＡで検出可能であるような、極低レベルのＣＤ１９を発現し得ることを示すデータがある；および(２)多発性骨髄腫を生じ、化学療法に特に耐性である癌性幹細胞と考えられる、クローン形質Ｂ細胞をターゲティングする概念のために、ＣＡＲＴ１９が骨髄腫の処置に使用できたと考えた。Ｂ細胞と骨髄腫腫瘍細胞の間にクローン関係があるが、伝統的骨髄腫治療は、Ｂ細胞ではなく、悪性形質細胞を目標とした。骨髄腫を処置するためのＣＡＲＴ１９は、それゆえに大部分の骨髄腫治療と異なる細胞集団を標的とする。
我々の１名の患者の経験において、患者は循環形質細胞を有し、ＣＤ１９発現について彼女の腫瘍細胞を試験できた。彼女の腫瘍細胞の約１〜２％がＣＤ１９抗原を発現した(図８)。それゆえに、ＣＡＲＴ１９が、彼女の腫瘍細胞の極めて小さな集団に直接効果を有し、極めて有効な部分応答を有し得ると考えられたが、ＣＤ１９＋腫瘍細胞の極めて小さな集団のみのターゲティングに基づいては予測されなかった。
この場合、ＣＡＲＴ１９を、高用量メルファラン後の移植自己幹細胞レスキュー後に投与した。これは骨髄腫の標準的治療であるが、治癒的ではない。さらに、この患者は、先にタンデム自己幹細胞移植を受け、移植後早期に(＜６ヶ月)再発した。特定の理論に縛られることを望まないが、本実施例に記載するようなＣＡＲＴ１９細胞の使用は、サルベージ自己幹細胞移植と組み合わせたとき、骨髄腫処置の重複しない機構を有し得る。
難治性多発性骨髄腫を有する患者を、骨髄破壊的化学療法およびＡＳＣＴ後ＣＴＬ０１９で処置した。検出可能なＣＴＬ０１９の喪失および正常ＣＤ１９陽性Ｂ細胞の再構成にも関わらず、寛解は維持され、この応答が持続したＣＴＬ０１９活性を必要としなかったことを示す。さらに、この患者の応答は、新生物形質細胞の大部分(９９.９５％)がフローサイトメトリーおよびＲＴ−ＰＣＲの両者でＣＤ１９陰性であったにも関わらず実現された。
この患者の優性新生物形質細胞集団における検出可能なＣＤ１９発現の不在は、ＣＴＬ０１９の臨床的に意義のある標的が、この優性ＣＤ１９陰性集団の外にあることを示唆した。多発性骨髄腫患者における新生物形質細胞は、遺伝的、免疫表現的および機能的不均一性を示す。特定の亜集団は、抗骨髄腫治療を通してクローンの生存を必要とし得る。ここに報告する患者において、例えば、形質細胞の小ＣＤ１９発現サブセットは、相対的にメルファラン耐性であるが、ＣＴＬ０１９に感受性であるはずである。この治験は、クローンの小サブセットの治療的ターゲティングが、従来の抗骨髄腫治療と組み合わせたとき、耐久性のある臨床的有用性に至り得ることを示唆する。
あるいは、この患者におけるＣＴＬ０１９の臨床的に意義のある標的は、新生物形質細胞集団の外にあり得る。例えば、ＣＴＬ０１９は、相対的に小さいが、新生物形質細胞に至る幹細胞集団を標的とし得る。多発性骨髄腫は、それゆえに、Ｂリンパ球を標的とするＣＴＬ０１９のような治療が、直接形質細胞を標的とする治療の有用な補助剤であるように、単に最終分化した形質細胞ではなく、多数の後期Ｂ細胞系譜細胞型の疾患であり得る。
フェーズＩ治験で、さらに１０名の多発性骨髄腫患者をＣＡＲＴ１９で処置する予定であり、少なくとも３名の患者が今日まで処置されている。
用量根拠およびリスク／ベネフィット
我々は、本プロトコールで、静脈内投与経路からの一律の投薬の使用を選択した。このプロトコールの主要目的は、多発性骨髄腫を有する患者へのＣＡＲＴ−１９細胞投与の安全性および実施可能性を試験することであった。予測された一次毒性は、(１)ＣＡＲが悪性または正常Ｂ細胞上の代替ＣＤ １９抗原に遭遇したときの、サイトカイン放出；(２)リツキシマブ治療に類似する、正常Ｂ細胞の枯渇；(３)ＭＭのために増殖／共刺激自己Ｔ細胞がＡＳＣＴと組み合わされた特に以前に見られたような、移植片対宿主病に似たステロイド応答性皮膚および消化器症候群であった。理論的懸念は、ＣＡＲＴ−１９ Ｔ細胞の形質転換または未制御の増殖が、高レベルのＣＤ １９に応答して生じるか否かであった。ＣＬＬ患者の他の治験と比較して、その治験で処置された難治性ＣＬＬ患者における悪性Ｂ細胞の負荷より、ＭＭにおけるクローン形質Ｂ細胞の負荷がはるかに低いと予測されるため、本適用におけるこの懸念はほとんどなかった。
用量根拠
最初の３患者について、我々は、１.４×ｌ０７〜ｌ.ｌ×ｌ０９ ＣＡＲＴ−１９細胞の範囲の用量で臨床活性を観察した。この観察は、少なくとも最初の３名の患者処置において、明白な用量応答相関がないことを示す。完全応答は、２対数倍異なる用量が投与された患者で観察された。それゆえに、代謝される標準的薬物と異なり、ＣＡＲ Ｔ細胞は、広い用量応答範囲を有し得る。ＣＡＲ Ｔ細胞が、患者内で広範に増殖できることが最もありそうな理由である。我々は、それゆえに注入のためのｌ〜５×１０８ ＣＡＲＴ−１９細胞の用量範囲を設定した。救済使用基準で提供されるこの一患者治験において、この患者は最大５×ｌ０８ ＣＡＲＴ１９細胞を受け、用量の下限はなかった。１０名患者治験について、患者は、１〜５×１０７ ＣＡＲＴ−１９細胞を受ける予定である。
一般的設計
これは、救済使用基準で提供される一患者治験であり、ＣＡＲＴ−１９を発現するように形質導入された自己Ｔ細胞の注入が安全であることを決定したフェーズＩ治験後に設計された。本治験の主要な目的は、最初のＡＳＣＴ後の初期再発後にサルベージＡＳＣＴを受けている患者におけるＣＡＲＴ−１９ Ｔ細胞の安全性、耐容性および生着能の決定であった。プロトコールは、オープンラベルパイロット試験からなる。
エントリー対象は、骨髄生検およびＭＭについての通例の臨床検査および画像評価を受ける。適格対象は、ＣＡＲＴ−１９製造のための多数の末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を得るための、定常状態アフェレシスを受ける。Ｔ細胞をＰＢＭＣから精製し、ＴＣＲζ／４−１ＢＢレンチウイルスベクターで形質導入し、インビトロで増幅し、将来的投与のために凍結する。製造が成功したＴ細胞を有する患者の数と比較して、不適切なＴ細胞コレクション、増殖または製造を有する患者の数を記録し、産物製造の実施可能性は、この患者集団で問題であるとは予測されない。
対象は、一般にさらに２回のＡＳＣＴを実施するために、最初のＡＳＣＴの調製において実施した動員／コレクションから保存されたままになっている十分な末梢血幹細胞を有していた。そうでないものは、処置医の選択に従うレジメンにより、定常状態アフェレシスの前または後に二回目の動員／コレクションに付す。初期白血球除去約２週間後、対象は入院し、高用量メルファラン(−２日目)、続いて２日後に自己幹細胞(０日目)を受け、全対象は、１２〜１４日後にＣＡＲＴ−１９細胞注入を受ける(＋１２〜１４日目)。１０名までの患者を登録する。
全対象は、治験の４週間、一定間隔で安全性ならびにＣＡＲＴ−１９細胞の生着および残留性を評価するために血液検査をする。＋４２日目および＋１００日目に、対象は、骨髄形質細胞負荷およびＣＡＲＴ−１９細胞の骨髄への輸送を評価するための骨髄吸引／生検を受ける。公式の応答評価を、国際骨髄腫作業部会(ＩＭＷＧ)基準１３６に従い１００日目に行い、ＴＴＰを多発性骨髄腫患者の日常的診療に従いモニターする。本治験で測定された主有効性転帰は、患者の初期ＡＳＣＴのＴＴＰと、本治験のＡＳＣＴ後のＴＴＰの比較である。
本治験の主要評価項目がＡＳＣＴを伴うＣＡＲＴ−１９細胞の注入の安全性および実施可能性であるため、本治験は、初期停止規則を用いる。簡潔にいうと、最初の５対象処置において重篤な、予測されない有害事象が２を超えないならば、次いで、本治験を目標登録数１０に向けて、さらに５対象で行う。我々は、処置対象をＣＡＲＴ−１９注入４０日後(すなわち、４２日目の最初の公的応答評価まで)観察し、その後５対象が登録され、そのように観察されるまで、その後の対象を登録する。第二群の５患者の処置について、対象間で待機時間は必要ない。
集中的フォローアップの６ヶ月後、対象は、２年間、少なくとも年四回、病歴、身体検査および血液検査を評価する。この評価後、対象は、最大さらに１３年間、毎年電話および問診によるフォローアップの繰り越し試験に入り、新規悪性腫瘍の発生のような、長期健康問題の診断のための評価をする。
初期治験エンドポイント
このパイロット治験は、最初のＡＳＣＴ後早期再発後のＭＭについてサルベージＡＳＣＴを受けた患者における、ＣＤ１９ ＴＣＲζ／４−ｌＢＢを形質導入した自己Ｔ細胞の安全性および実施可能性を試験するために設計する。
初期安全性および実施可能性エンドポイントは、次のものを含む。
ＮＣＪ ＣＴＣ ２として定義される、治験薬関連有害事象の発生：注入時から２４週目までのあらゆる時点での、治験薬処置との因果関係が、可能な、疑われる、または確実であるグレード３段階の徴候／症状、臨床検査毒性および臨床的事象。これは、注入毒性およびＣＡＲＴ−１９細胞と関係する可能性のあるあらゆる毒性を含み、次のものを含むが、これらに限定されない。
ａ. 発熱
ｂ. 発疹
ｃ. 好中球減少症、血小板減少症、貧血、骨髄形成不全
ｄ. 肝機能不全
ｅ. 肺浸潤または他の肺毒性
ｆ. 消化管または皮膚に影響するＧＶＨＤ様症候群。
患者アフェレシス産物からＣＡＲＴ−１９細胞を製造する実施可能性。ベクター遺伝子導入効率、Ｔ細胞純度、生存能、無菌性および腫瘍汚染についてリリース基準に満たない製造産物の数を決定する。
ＣＡＲＴ１９での自己幹細胞移植後の応答の強度(depth)および期間を、標準的自己幹細胞移後に各患者が最初に達成した応答の強度および期間と比較する。
対象選択および除外
編入基準
対象は、ＭＭについて先のＡＳＣＴを受けていなければならず、幹細胞注入３６５日以内に進行していなければならない。計画されたタンデムＡＳＣＴ複合レジメンの一部として先に２回ののＡＳＣＴを受けた対象は適格である。進行は、疾患進行のＩＭＷＧ基準に従い定義され、または、初期ＡＳＣＴ後ＣＲまたはｓＣＲに達した患者について、ＣＲからの再発の基準に従い定義される(Durie et al. Leukemia 2006;20(9):1467-1473)。注：患者が先のＡＳＣＴから３６５日以内に登録されなければないとの条件はなく、患者は、本治験登録前に、先のＡＳＣＴ後の再発／進行後、実験的薬剤を含む他の薬剤で処置されていてよい。
対象は、インフォームドコンセント書面に署名しなければならない。
対象は、メルファラン注入の日の前１２週間以内に検査して、次の基準により規定される、高用量メルファランを受けるのに十分な重要臓器機能を有さなければならない：ａ. 血清クレアチニン≦２.５または推定クレアチニンクリアランス≧３０ml／分および透析依存ではない。ｂ. ＳＧＯＴ≦正常上限の３倍および総ビリルビン≦２.０mg／dl(高ビリルビン血症がジルベール症候群に寄与している患者を除く)。ｃ. 左心室駆出率(ＬＶＥＦ)≧４５％またはＬＶＥＦが＜４５％であるならば、臨床的に有意な心血管機能障害がないことを確認する心臓病専門医による正式な評価。ＬＶＥＦ評価は、登録の前６週間以内に行わなければならない。ｄ. 予測値の≧４０％のＦＥＶ１、ＦＶＣ、ＴＬＣ、ＤＬＣＯ(肺体積およびヘモグロビン濃度の適切な調節後)の十分な肺機能。肺機能試験は、登録の６週間以内に行っていなければならない。
対象は、高い活動指標が単に骨痛によるものでない限り、ＥＣＯＧ活動指標０〜２を有しなければならない。
除外基準
対象は
何らかの活動性で未制御の感染。
活動性Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎またはＨＩＶ感染。
概説した参加を妨げる、何らかの未制御の医学的障害
を有してはならない。
処置レジメン
再発／進行性多発性骨髄腫の治療
患者は、登録前に、処置医の選択による再発／進行性多発性骨髄腫のための治療を受けていでもよい。治療は、登録後も続けてよい。
患者は、アフェレシス２週間前および高用量メルファランの前２週間全治療を中止しなければならない。アフェレシスと高用量メルファランの間に２週間以上経過すると予測なれるならば、患者は、処置医の裁量でアフェレシス後治療を再開してよい。
高用量メルファラン(−２日目)
患者は、−３日目または−２日目に入院し、処置プロトコール開始前に、腫瘍崩壊症候群についてのパラメータのモニタリングを含む、担当医による試験および日常的臨床検査を受ける。ＭＭモニタリング臨床検査(ＳＰＥＰ、定量的免疫グロブリンおよび無血清軽鎖分析)のための血液を、これらの試験が、入院７日以内に行われていないならば、治療開始前に採血する。
高用量治療は、−２日目の約２０分にわたる２００mg／ｍ２用量のメルファランの静脈内投与からなる。メルファランの用量は、＞７０歳の患者および処置医の裁量により２００mg／ｍ２に耐容性でないと想定される全年齢の患者について１４０mg／ｍ２に減量される。全患者は、デキサメサゾンおよび標準抗生物質予防薬を含み得る、標準的制吐予防薬を投与される。
幹細胞再注入(０日目)
幹細胞注入を０日目に、高用量メルファラン投与から少なくとも１８時間後に行う。幹細胞を、標準的な施設の慣例に従う前投薬後に約２０〜６０分にわたり静脈内点滴する。少なくとも２×１０６ ＣＤ３４＋前駆細胞／kg体重を点滴しなければならない。さらに、少なくとも１×１０６ ＣＤ３４＋前駆細胞／kg体重を、生着遅延または不生着の場合に注入すべきバックアップ幹細胞産物として用意しなければならない。Ｇ−ＣＳＦを、＋５日目に開始してＳＱで投与し、用量は標準的な施設の慣例に従う。輸血その他の支援処置を、標準的施設ガイドラインに従い講ずる。
ＣＡＲＴ１９細胞注入(＋１２〜１４日目)
最大５×１０７ ＣＡＲＴ−１９細胞からなる単一用量のＣＡＲＴ−１９形質導入Ｔ細胞を、投与する。ＣＤ１９ ＴＣＲζ４−１ＢＢベクターを形質導入した細胞の最小許容注入用量は１×１０７である。ＣＡＲＴ−１９細胞の単一用量を、幹細胞注入後＋１２〜１４日目に、ｉ.ｖ.高速点滴により注入する。患者が、１２〜１４日ウィンドウにおいてここに記載する編入基準のいずれかに合わないならば、ＣＡＲＴ−１９注入を、基準そ満たすまで＋１２〜１４日目以降に遅らせてよい。
維持レナリドマイド
最初のＡＳＣＴ後に維持レナリドマイドを受け、耐容性である対象は、処置医の判断で禁忌がないと推定されれば、約＋１００日目にレナリドマイド維持治療を再開する。出発用量は、先行治験が特定の患者について別の出発用量を指示しない限り、１日１０mgである。維持治療を、疾患進行または不耐容性となるまで続ける。
治験薬の調製および投与
ＣＡＲＴ−１９ Ｔ細胞を、ＣＶＰＦで調製し、注入細胞についてのＦＤＡの使用承認基準(例えば、細胞用量、細胞純度、無菌性、ベクター／細胞の平均コピー数など)を満たすまで、ＣＶＰＦから使用に供しない。使用が許可されたら、投与のために細胞をベッドサイドに搬送する。
細胞解凍。凍結細胞を、ドライアイスに入れて対象のベッドサイドまで搬送する。細胞を、３６℃〜３８℃に維持した水浴を使用して、ベッドサイドで解凍する。細胞がすべて解凍されるまで、バッグを穏やかに揉む。容器中に、凍結した塊が残っていてはならない。ＣＡＲＴ−１９細胞産物が損傷を受けたか、バッグが漏れているか、その他の点で傷ついたように見えるならば、注入せず、ＣＶＰＦに戻さなければならない。
前投薬。Ｔ細胞注入後の副作用は、一過性の発熱、悪寒および／または悪心を含む；レビューのためにCruz et al.(Cytotherapy 2010;12(6):743-749)参照。ＣＡＲＴ−１９細胞注入前に、対象にアセトアミノフェンおよび塩酸ジフェンヒドラミンを前投薬することが推奨される。これらの投薬は、必要に応じて６時間毎に繰り返し得る。患者のアセトアミノフェンで軽減されない発熱が続くならば、非ステロイド性抗炎症剤を処方し得る。ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロンまたはデキサメサゾンのような全身コルチコステロイドはＴ細胞に有害な作用を有し得るため、生命に係わる緊急事態以外、患者にはこれらを投与しないことが奨められる。
発熱。対象がＣＡＲ Ｔ細胞注入後敗血症または全身菌血症を発症する稀な事態において、適切な培養および医学的管理を開始しなければならない。ＣＡＲＴ−１９ Ｔ細胞製剤の汚染が疑われるならば、ＣＶＰＦにおける保存サンプルを使用して、製剤の無菌性を再試験し得る。
投与。注入を、Rhoadsにおける隔離病室で、免疫抑制患者に対する注意をしながら行う。形質導入Ｔ細胞を、３方向コックを備えた１８ゲージラテックス・フリーＹ字型血液セットによる、約１０mL〜２０ml／分の流速の高速静脈内注入により行う。注入時間は、注入する総体積および推奨注入速度に依存する。各注入バッグは、“本人使用専用”と記載するラベルが付されていなければならない。さらに、ラベルは、対象のイニシャル、生年月日および治験番号のような少なくとも２種の本人識別表記を付する。注入前に、２名が、それぞれ独立して、対象の面前で全てのこれらの情報を確認し、確認された情報が被験者と正確に一致するかを確認する。
救急医療機器(すなわち、救急用トロリー)は、対象がアレルギー性応答または重篤な低血圧クライシスまたは注入に対する何らかの他の反応を有する場合、注入中利用可能としておく。バイタルサイン(体温、呼吸数、心拍および血圧)を注入前後、続いて、少なくとも１時間、これらのサインが正常かつ安定するまで、１５分毎に確認する。対象は、医師が安全と判断するまで、その場を離れないよう求められる。
包装
注入は、１〜５×１０７ ＣＡ Ｔ１９形質導入細胞の単一用量を含み、注入についての最小許容用量は１×１０７ ＣＡＲＴ−１９細胞である。各包装品は、注入可能グレード材料(％ｖ／ｖ) ３１.２５％plasmalyte-A、３１.２５％デキストロース(５％)、０.４５％ＮａＣｌ、最大７.５％ＤＭＳＯ、１％デキストラン４０および５％ヒト血清アルブミンを含む一定量(体積は用量による)の凍結保存用媒体を含む。
アフェレシス
大体積(１２〜１５リットルまたは４〜６血液量)アフェレシス法を、アフェレシス・センターで行う。ＰＢＭＣを、本方法中にＣＡＲＴ−１９のために得る。一回白血球除去について、意図は、ＣＡＲＴ−１９ Ｔ細胞の産生のための少なくとも５×１０９白血球を得ることである。ＦＤＡ追跡要求および研究用のベースライン血液白血球を得て、凍結保存する。細胞産物は、約２〜４週間後リリースの準備が整うと予測される。ＣＤ１９およびＣＤ２０ Ｂ細胞決定を含む、フローサイトメトリーリンパ球サブセット定量を行う。ベースライン評価を、ヒト抗ＶＳＶ−Ｇおよび抗マウス抗体(ＨＡＭＡ)について行う。対象が、先に現在のGood Manufacturing Practices at the Clinical Cell and Vaccine Production Facilityに従い預けられた十分なアフェレシスコレクションを有するならば、これらの細胞を、ＣＡＲＴ−１９製造用細胞源として使用し得る。預けられたアフェレシス産物の使用は、対象がさらにアフェレシス採取を受ける費用、時間およびリスクを回避する。
細胞減少化学療法
白血球枯渇化学療法は、ここに記載するような高用量メルファランである。
ＣＡＲＴ−１９注入
注入は、幹細胞再注入後＋１２〜１４日目に開始する。
＋１２〜１４日目に、最初の注入前、患者は、化学療法が、一部リンパ球減少症を誘発するために与えられるために、画分と共にＣＢＣおよびＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８計数の評価を有する。
最初の用量を、単一用量を使用して投与する。細胞を、患者のベッドサイドで解凍する。解凍細胞を、注入時間が約１０〜１５分であるように、耐えられる限り高速注入速度で与える。混合を促進するために、細胞を、Ｙ時型アダプターを使用して同時に投与する。対象に、ここに記載のように、注入および前投薬する。対象のバイタルサインを評価し、パルスオキシメトリを投薬前、注入終了時およびその後１５分毎に１時間、かつこれらが安定および正常となるまで実施する。ベースラインＣＡＲＴ−１９レベル決定用血液サンプルを、最初の注入前の任意の時間および各注入２０分〜４時間後に得る(そしてＴＣＳＬに送る)。
高用量メルファランによる毒性を経験した患者は、これらの毒性が解消するまで注入スケジュールを遅らせる。Ｔ細胞注入遅延の正当な理由である具体的毒性は、１)肺：９５％を超える飽和度を維持するための追加酸素の必要性または胸部ｘ線での、進行性の放射線学的異常の存在；２)心臓：医学的管理で制御されない新らたな心臓不整脈；３)昇圧介助を必要とする低血圧、４)活動性感染：Ｔ細胞注入４８時間以内の細菌、真菌またはウイルスについて血液培養陽性を含む。
毒性の管理
未制御のＴ細胞増殖。同種または自己Ｔ細胞注入と関係する毒性は、薬理的免疫抑制のコースで管理されている。Ｔ体関連毒性は、全身性コルチコステロイドに応答することが報告されている。未制御のＴ細胞増殖が生じたら(ＣＡＲＴ−１９細胞に関するグレード３または４毒性)、対象をコルチコステロイドで処置し得る。対象は、パルスメチルプレドニゾロン(ｑ８時間×２日に分けた２mg／kg ｉ.ｖ.)、続く急速な漸減により処置し得る。
さらに、他のプロトコールで処置している対象の観察に基づき、マクロファージ活性化症候群(ＭＡＳ)についていくぶん懸念があるが、ＣＤ １９＋腫瘍負荷は、ＣＬＬを有する患者より、骨髄腫を有する患者ではるかに低いと予測される。この毒性の処置および処置のタイミングは、主治医および治験責任者の判断による。示唆される管理は、対象が、連続２日間続く１０１°Ｆを有する発熱を有し、感染の証拠がなければ(血液培養、ＣＸＲまたは他の起源の陰性)、トシリズマブ４mg／kgを考慮し得る。コルチコステロイドおよび抗ＴＮＦ治療の追加は、医師の判断により考慮し得る。
Ｂ細胞枯渇。Ｂ細胞枯渇および低ガンマグロブリン血症が生じる可能性がある。これは、抗ＣＤ２０指向治療に共通する。臨床的に有意な低ガンマグロブリン血症(すなわち全身感染)の場合には、対象に、リツキシマブで行われているように、正常レベルの血清免疫グロブリンレベルを回復するように、確立された臨床ガイドラインにより静脈内免疫グロブリン(ＩＶＩＧ)を与える。
一次移植不全。一次移植不全(すなわち、不生着)は、最初のＡＳＣＴと比較して、２回目のＡＳＣＴでより一般的であり得る。適格基準は、一次移植不全の場合には、処置医の裁量によりレスキュー再注入のために十分な幹細胞が利用可能でなければならないことを明記する。
結果
３名の処置難治性、進行型多発性骨髄腫患者が、現在、この進行中の治験においてＣＴＬ０１９で処置されている。これらの患者の２名の結果は、３ヶ月時点での一次有効性評価に基づき、両者がＣＴＬ０１９治療から実質的抗腫瘍効果を得ていることを示す。３番目の患者はまた３ヶ月時点に到達していない。２名の患者の結果を下により詳細に記載する。
最初の骨髄腫患者は、彼女の＋１００日応答評価を完了し、彼女はＣＡＲＴ１９治療に対して極めて良好な応答を有した。次の試験を実施し、次の結果が得られた。
− ＳＰＥＰ／免疫固定法：陰性
− 尿免疫固定法：免疫固定法によりかすかな測定不可能なカッパ軽鎖バンド(３８日目にも存在したため、新規ではない)
他の点では、患者は、次の厳しい完全寛解基準を満たす。
− 無血清軽鎖比：正常
− 骨髄生検：陰性
− ＩｇＡ免疫表現型検査：ＩｇＡは検出限界未満
尿免疫固定法由来のかすかな測定不可能なカッパ軽鎖以外、患者は、“厳しい完全寛解”の全基準を満たした。３時点(−２日目、＋３８日目、＋１０３日目)での形質細胞免疫表現型検査の概要を図３９に示し、患者のＩｇＡは検出限界未満であったことを示す。概要は、−２日目の重い骨髄腫負荷および＋３８日目および＋１０３日目に何も検出可能でないことを示し、これは、患者を、フロー分析により“ＭＲＤ陰性”として分類する。＋１０３日目、概要は、正常な、ポリクローナル、ＣＤ１９＋形質細胞およびＢ細胞の回復を示す。患者は、疾患または治療の症状を有さず、健常人と同様の職務を果たしている。
二番目の患者の処置はまだ＋１００日時点に達していない。いずれにしても、この時点で、彼女の経過は良好であるが、ＣＴＬ０１９注入の効果を決定するには早すぎる。
実施例７：マントル細胞リンパ腫に対するキナーゼ阻害剤／ＣＡＲ１９ Ｔ細胞組み合わせ治療
養子Ｔ細胞治療は、リンパ系悪性腫瘍の処置にかなりの見込みを有する。ＣＴＬ１０９を使用するＢ細胞特異的ＣＤ１９抗原(ＣＡＲ１９ Ｔ細胞／ＣＡＲＴ１９細胞)に対するキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を形質導入した自己Ｔ細胞の養子移植を使用する、小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ性白血病(ＳＬＬ／ＣＬＬ)および急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)における有望な臨床応答が得られている。我々は、最近、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ(ＣＡＲ１９ Ｔ細胞／ＣＡＲＴ１９細胞)を使用するＣＤ１９陽性悪性腫瘍の処置のためのフェーズＩ治験に登録した化学療法抵抗性ＳＬＬ／ＣＬＬを有する３患者の初期データを報告した。使用した手法は、ＣＤ１３７およびＴｃＲｚ由来シグナル伝達ドメインを含む、ＣＤ１９−ターゲティングＣＡＲを発現するためのレンチウイルスを使用する患者由来バルクＴ細胞の遺伝子修飾を含む。この試験のために、細胞を我々の抗ＣＤ３および−ＣＤ２８ビーズ増殖法により増殖させ、細胞を、リンパ球枯渇後早期にサイトカイン支持を欠く条件で注入した(Kalos M, et al. (2011) Sci Transl Med. 3: 95ra73; and Porter DL, et al. (2011) N Engl J Med. 365: 725-733)。これらの初期結果は、非常に有望であった：(ｉ)単一処置コース後、２／３患者は完全寛解を達成し、処置後＋１５ヶ月の現在無疾患であり、一方、Ｔ細胞注入の直後にコルチコステロイドで処置を受けた３番目の患者は、強い部分応答を示した。(ii)これらの患者において、我々は、養子Ｔ細胞治療ベースの戦略の最終的な有効性に必要であると考えられる要素、すなわち、強いインビボＴ細胞増殖、疾患根絶、Ｔ細胞収縮および長期機能的残留を再現できた。現在まで、１０名のＳＬＬ／ＣＬＬ患者が処置されており、２名が臨床的完全寛解および分子寛解を維持しており、５名が部分寛解を経験し、３名が測定可能な応答の欠如を示す。他の試験において、Ｂ細胞ＡＬＬを有する２名の患者が完全寛解を有し、１名がＣＤ１９発現を欠く白血病細胞で再発した。
大細胞転化の前および後の両者のマントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)も、特に、ＭＣＬ細胞に直接作用するようなキナーゼ阻害剤と組み合わせたとき、ＣＡＲＴ１９ベースの養子治療により利益を受ける可能性がある。
キナーゼ阻害剤と組み合わせたＣＡＲＴ１９ベースの養子治療の組み合わせをさらに分析するために、ハイスループットスクリーニングを使用して、ＣＡＲＴ１９細胞と組み合わせて、ＭＣＬ病因に重要なキナーゼを標的とする数阻害剤ＣＤＫ４／６、ＢＴＫおよびｍＴＯＲを評価した。最も有望な組み合わせは、インビトロおよびインビボ、ＭＣＬ異種移植マウスモデルの両者において非常に詳細に評価し、これは、最終的に、ＭＣＬ患者における小分子キナーゼ阻害剤およびＣＡＲＴ細胞免疫療法の組み合わせを評価するための、臨床的プロトコールの開発の指針となり得る。
本試験において、前臨床試験を、ＣＡＲＴ１９細胞単独でまたは発現および活性がＭＣＬ細胞の生存および増殖に重要なキナーゼファミリーから選択されたタンパク質の小分子阻害剤と組み合わせて、ＭＣＬの種々のサブタイプにおけるこの手法の潜在的臨床効果を決定するためおよびＭＣＬ細胞を治療的標的とする能力を評価するために行う。
研究計画
前臨床設定において、培養および初代型細胞の両者が、ＭＣＬ細胞を治療的標的とする能力について、ＭＣＬにおける報告された病原関連性を有するキナーゼの阻害剤およびＣＡＲＴ１９細胞を使用して評価する。ハイスループットＭＴＴアッセイを使用して、潜在的最適組み合わせ、薬剤適用の用量およびタイミングを決定するために、これらの薬剤の効果を検定する。最も有望な２〜３組み合わせを、最初にインビトロおよび後にインビボでＭＣＬ異種移植モデルにおいて細胞機能、リン酸化ベースの細胞シグナル伝達および遺伝子発現に関して、詳細に評価する。
キナーゼ阻害剤／ＣＡＲＴ−１９細胞の組み合わせがＭＣＬ細胞を効率的に標的とする能力を特徴づけするためのインビトロ試験
この目的において、インビトロでＭＣＬ細胞に対する小分子キナーゼ阻害剤の影響を試験するための、ならびにＣＡＲＴ１９細胞とＭＣＬ細胞の相互作用および阻害剤の該相互作用に対する影響を試験するための、上に挙げた詳細な機能的、表現型、生化学的および分子アッセイを試験する。
この目的を達成するためのベンチマークは、次のことを目的とする、包括的データセットの作成である。
ｉ. ＣＡＲＴ１９細胞が、培養および初代ＭＣＬ細胞により活性化され、溶解することを記録する；
ii. 阻害剤対ＣＡＲＴ１９細胞投与の用量、および、ある場合は、タイミングに関して適切に適用したとき、ＣＡＲＴ１９細胞機能に負に作用することなく、選択したキナーゼ阻害剤が、互いの能力および／またはＣＡＲＴ１９細胞がＭＣＬ細胞を排除する能力を増強することを証明する；および
iii. ＮＳＧマウスで使用するインビボＭＣＬ異種移植実験において使用するためのＢＴＫ阻害剤のスケジュールおよび投薬のためのレジメンを確立する。
本試験の目的は、例えば、ＭＣＬ病理生物学に重要なキナーゼであるＣＤＫ４、ＢＴＫおよびｍＴＯＲをターゲティングする小分子阻害剤と、ＣＡＲＴ１９細胞の最適治療的組み合わせの同定でなくても評価、ＣＡＲＴ１９活性モニターおよびＭＣＬに対する治療の機能的、生化学的および分子効果の特徴付けである。
これらの試験は、インビボで目的２を評価するための、ＣＡＲＴ１９治療と組み合わせたＢＴＫ処置キナーゼ阻害剤のタイミングおよび用量のスケジュールの合理的スキームの確立であるべきである。
単独およびＢＴＫ阻害剤と組み合わせた、濾胞性リンパ腫を標的とするＣＡＲＴ１９細胞の能力を評価するためのインビボ試験
この目的において、我々は、動物モデルにおいて、確立されたおよび初代ＭＣＬ細胞の増殖に影響を与える選択した阻害剤／ＣＡＲＴ１９細胞組み合わせの能力を試験する。
この目的を達成するためのベンチマークは、次のことを目的とする、包括的データセットの作成である。
ｉ. 選択した阻害剤／ＣＡＲＴ１９細胞組み合わせが、対照(単剤および偽剤処置動物)と比較して、ＭＣＬ移植動物の生存を顕著に増加させることの証明；
ii. 将来の臨床試験の基礎として使用する、選択したキナーゼ阻害剤／ＣＡＲＴ１９組み合わせのスケジュールおよび投薬についてのレジメンの確立。
本試験の目的は、同定したキナーゼ阻害剤／ＣＡＲＴ１９＋ＢＴＫ阻害剤組み合わせについて、目的１で規定した処置および投与スケジュールの評価およびＢＴＫ処置が、培養および初代両者の、ＭＣＬ細胞を異種移植したＮＳＧマウスにおけるＭＣＬを標的とするＣＡＲＴ１９と相乗作用するかの試験である。
次の細胞型、化合物、動物および実験法を、この提案した目的を達成するために使用する。
ＭＣＬ細胞：
４種のＭＣＬ細胞株(Ｊｅｋｏ−１、Ｍｉｎｏ、ＳＰ−４９およびＳＰ−５３)および１５初代ＭＣＬ(定型１２および芽球様細胞３)からの生存できる状態で凍結したサンプル。細胞株は、自然に十分に増殖したが、初代細胞を、単独でならびにその生存能を改善するためにＨＳ５骨髄間質細胞から回収した条件培地の存在下、培養した。
ＣＡＲＴ１９細胞：
ＣＡＲ１９を発現するように操作した初代ヒトＴ細胞を、レンチウイルス形質導入を使用しおよび確立されたプロトコールを使用して産生した(Kalos M, et al. (2011) Sci Transl Med. 3: 95ra73; およびPorter DL, et al. (2011) N Engl J Med. 365: 725-733)。１回形質導入事象後、Ｔ細胞は、一般に３０％を超える頻度でＣＡＲ１９を発現する。
我々の試験は、５ＳＬＬ／ＣＬＬ患者(５０〜１００バイアル／患者、１×１０７細胞／バイアルが既に利用可能)からのＣＡＲＴ １９集団を使用する。ＣＡＲＴ１９細胞を、抗ＣＡＲ１９特異的イディオタイプ抗体(ＳＴＭ)を使用して同定する。ＣＡＲＴ１９活性を、ＣＤ１９＋ＮＡＬＭ−６、ＣＤ１９陰性Ｋ５６２およびＣＤ１９形質導入Ｋ５６２細胞株を使用する、標準化された方法で、インビトロおよびインビボのＮＳＧマウスにおいて両者で制御する。ＣＡＲＴ１９細胞機能はＭＨＣ制限的ではないが、少なくとも５ＭＣＬ患者からのＣＡＲＴ１９細胞も使用する。
キナーゼ阻害剤
次のキナーゼの阻害剤を試験する：ＣＤＫ４／６(ＰＤ０３３２９９１)、ＢＴＫ(ＰＣＩ−３２７６５)、ｍＴＯＲＣ１(ラパマイシン)、ＭＮＫ(４−アミノ−５−(４−フルオロアニリノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン(Marzec M, et al. PLoS One 6:e24849)；およびEli Lillyからの新規化合物(Gupta M, et al. (2012) Blood 119:476-487)；ｍＴＯＲ(ＯＳＩ−０２７)およびデュアルＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ(ＰＦ−０４６９１５０２)。
化合物を、最初に、最適キナーゼ阻害を確実にする、患者の血清において達成される非毒性濃度を含む、予定された有効用量のスペクトルを評価する。
動物：
インビボ実験を、Jackson Laboratory(Bar Harbor)から得た種畜を使用し、Stem Cell and Xenograft Coreで繁殖させた、入手可能なＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ＩＬ−２Ｒｇｃヌル(ＮＳＧ)マウスを使用して行う。マウスを、ＨＥＰＡ濾過マイクロアイソレーターを使用して無菌状態で使用し、照射した餌および酸性化水を与える。
移植したマウスを、実験の間、抗生物質(ネオマイシンおよびポリミキシン)で処置する。６〜８週齢動物の雄雌同数を、Institutional Animal Care and Use Committeeにより承認されたプロトコールに従い使用する。
我々は、先のＴ細胞養子移植試験において、特に、ＣＡＲＴ１９細胞の差次的活性を評価するために、ＮＳＧ動物を使用している(Witzig TE, et al. (2010) Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2010:265-270、ＭＴＴアッセイ)。ハイスループットＭＴＴアッセイは、最初に、単独でまたは種々の組み合わせで適用したキナーゼ阻害剤に応答するＭＣＬ細胞増殖を評価するために実施する。このアッセイは、同時に細胞増殖速度および生存能の測定が可能であり、ＣＡＲＴ１９細胞の存在下または非存在下の、小分子阻害剤の多数の可能性のある組み合わせの効率的な評価を可能にする。この分析の重要な面は、潜在的相乗、相加または拮抗効果に関する薬物効果の特徴付けである。さらに、ＣＡＲＴ１９細胞に対する小分子阻害剤の効果を評価する。ＢＴＫ阻害はＢ細胞特異的であるはずであるが、ｍＴＯＲおよびＣＤＫ４／６阻害はＣＡＲＴ１９細胞にも影響する。ＣＡＲＴ１９細胞に対する潜在的効果を最小化するための薬物適用の適切なタイミングの確立は、これらの実験の目的の一つである。
この試験を行うために、ＭＣＬ細胞を、９６ウェルプレートに１×１０４細胞／ウェルで、トリプリケートで播種し、培地または種々の組み合わせのキナーゼ阻害剤および種々の濃度のＣＡＲＴ−１９細胞に曝す。４８時間および７４時間後、代謝的に活性な細胞の相対的数を、ＭＴＴ減少比色アッセイ(Promega)の使用により決定する。
対照および種々の処置条件の平均値(±Ｓ.Ｄ.)の差の有意性をスチューデントｔ検定を使用して評価し、＜０.０５のＰ値を統計学的有意とする。
細胞増殖およびアポトーシスアッセイ：
最も有望な薬物組み合わせを、次に、ＭＣＬ細胞増殖阻害の、細胞増殖抑制および細胞毒性の両者をそれぞれ決定するためのＣＦＳＥ標識および末端ｄＵＴＰニック末端標識(タネル)アッセイにおいて評価する。前者のアッセイにおいて、ＭＣＬ細胞を、ＢＴＫ阻害剤および／または未標識ＣＡＲＴ−１９細胞のＣＦＳＥ付加により標識する。４８時間後、培養細胞を、ＭＣＬタイプ細胞のＣＦＳＥ標識パターンについてＦＡＣＳで分析する。タネルアッセイは、製造者のプロトコールに従い、BD BiosciencesのApoAlert DNA Fragmentation Assay Kitを使用して行う。
簡潔にいうと、ＭＣＬ細胞を、阻害剤および／またはＣＡＲＴ１９細胞と４８時間または７２時間培養する。洗浄後、細胞を標識抗ＣＤ２０抗体で染色し、透過処理し、洗浄し、ＴｄＴ緩衝液中、１時間、３７℃でインキュベートする。反応を停止させ、細胞を洗浄し、再懸濁し、CellQuest PROソフトウェアを使用するフローサイトメトリーにより分析する。
ＣＡＲＴ１９機能的アッセイ：
我々は、ＣＤ１０７脱顆粒、細胞内サイトカイン分泌(ＩＣＳ)アッセイ、増殖細胞溶解アッセイおよび多重サイトカイン検出アッセイ(３２)を使用して、ＭＣＬ細胞株に対するＣＡＲＴ１９細胞のエフェクター活性を測定する。脱顆粒およびＩＣＳアッセイに関して、確立されたプロトコールにより、エフェクター(Ｔ細胞)および標的(腫瘍細胞)を、抗ＣＤ１０７抗体存在下、４時間、Ｅ：Ｔ比０.２：１で共培養し、続いて表面(ＣＡＲ１９、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４)および細胞内サイトカインマーカーについて染色する。ＭＣＬ細胞の細胞溶解を、フローサイトメトリーベースの細胞溶解アッセイを使用して評価する。増殖アッセイについて、エフェクター細胞を、ＣＦＳＥ(カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルカルボキシ−フルオレセイン−サクシニルエステラーゼ)と前充填し、標的細胞とＥ：Ｔ比０.２：１で混合し、３７℃で４日共インキュベートし、表面マーカー(ＣＡＲ１９、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４)について染色し、フローサイトメトリーによりＣＦＳＥの希釈について分析する。
多重サイトカインアッセイ
我々は、(ＳＴＭ３２)に記載のような、Luminexベースのビーズアッセイを使用して、ＭＣＬ標的に対する応答においてＣＡＲＴ１９細胞によるサイトカインの産生を評価する。これらの分析のために、我々は、血清、血漿または組織培養上清におけるＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２(ｐ４０／ｐ７０)、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ塩基性およびＨＧＦを同時に測定するInvitrogen 30-plexキットを使用する。
ＣＡＲＴ１９Ｔ細胞の多変数フローサイトメトリー分析：
我々は、University of Pennsylvania Abramson Cancer Center Flow Cytometry Coreから入手可能な、４レーザー(青色(４８８nM)、紫色(４０５nM)、緑色(５３２nM)および赤色(６３３nM)を備えた４色フローサイトメトリーおよびカスタムBD LSR IIを使用して、腫瘍細胞と共インキュベーション後のＣＡＲＴ１９細胞に対する機能的活性化および抑制と関係する表面マーカーの調節を試験した。全フローサイトメトリーデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア(TreeStar, San Carlos, CA)を使用して分析する)。これらの分析を、本質的に(ＳＴＭ４２)に記載のように、死亡細胞および標的細胞(ＣＤ１９＋)を除外するためのダンプチャネルおよびＣＡＲＴ１９細胞(ＳＴＭ)を検出するためのＣＡＲ１９イディオタイプ特異的試薬を使用する。我々は、ＣＡＲＴ１９陽性および陰性細胞(ＣＤ３＋／ＣＤ８＋およびＣＤ３＋／ＣＤ４＋)で、腫瘍細胞との共インキュベーション後、次のマーカーを、無傷、または必要に応じて透過処理した細胞で評価する。我々は、これらのマーカーの確立された多変数パネルを有する：
− 活性化／エフェクター機能：ＣＤ２５、ＣＤ１５４、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ６９、ＣＤ５７、ＣＤ２８、Ｔ−ｂｅｔ
− 阻害：ＣＤ１５２ (ＣＴＬＡ４)、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＣＤ２００
− 抑制(Ｔｒｅｇ) ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋＋／ＣＤ１２７−、Ｆｏｘ−Ｐ３＋
同時に、ＣＤ１９およびＣＤ５染色により同定されたＭＣＬ細胞を、免疫抑制性タンパク質ＣＤ１７４(ＰＤ−Ｌ１)ＣＤ１７３(ＰＤ−Ｌ２)およびＣＤ１５２の発現について試験する。
細胞シグナル伝達に対する阻害剤の影響：
実験のこの部分は、選択した化合物にのみ焦点をあてる；上記機能的アッセイ(細胞増殖、増殖およびアポトーシス)で最も有効であることが判明したもの。効果を、各薬剤および選択した組み合わせについて別々に試験し、試験を、特定の化合物に合わせる。例えば、ｍＴＯＲＣ１とＭＮＫ阻害剤の組み合わせは、ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達、特にｅＩＦ−４Ｅリン酸化を評価し、ＢＴＫ阻害はＰＩ３Ｋ−ＡＫＴおよびＭＥＫ−ＥＲＫ経路およびＲｂリン酸化に対するＣＤＫ４／６阻害に焦点をあてる。これらの試験は、記載のようにホスホ特異的抗体を使用するウェスタンブロッティングにより行う(Marzec M, et al. (2006) Blood. 108:1744-1750; Marzec M, et al. (2008) Blood 111: 2181-2189; Zhang Q, et al. (2011) Proc Natl Acad Sci USA 108: 11977-11982)。簡潔にいうと、ＭＣＬ細胞を溶解し、タンパク質抽出物をローリー法(Bio-Rad)を使用してアッセイし、ポリアクリルアミドゲルに載せる。タンパク質リン酸化を試験するために、ブロットした膜をホスホ特異的抗体、例えばＳ６ｒｐ Ｓ２３５／２３６、ｅＩＦ４Ｅ Ｓ２０９、４Ｅ−ＢＰ１ Ｔ３７／４６、４Ｅ−ＢＰ１ Ｔ７０(Cell Signaling)に特異的なものとインキュベートし、ｍＴＯＲＣ１およびＭＮＫ活性およびその阻害を評価する。次に、膜を、適切な二次、ペルオキシダーゼ結合抗体とインキュベートする。ブロットを、AmershamのECL Plus Systemを使用して開発する。
ゲノム規模遺伝子発現分析：
細胞シグナル伝達阻害は、一般に遺伝子転写の変化を生じる。選択した阻害剤またはＭＣＬにおける遺伝子転写の数阻害剤の効果を決定するために、ゲノム規模遺伝子発現分析を、Marzec M, et al. (2008) Blood 111: 2181-2189; Zhang Q, et al. (2011) Proc Natl Acad Sci USA 108: 11977-11982に記載のように行う。簡潔にいうと、細胞を、選択した阻害剤またはその希釈物で、０時間、４時間および８時間でトリプリケート培養で処理する。総ＲＮＡをｍＲＮＡを富化するためにさらに精製し、これを逆転写し、標識し、全既知遺伝子エクソンに対するAffimetrixマイクロチップへのハイブリダイゼーションにより試験する。マイクロアレイデータを、GeneSpringおよびＭＡＳ５アルゴリズムで実行されるようにＲＭＡを使用し、標準化および要約する。得られたｐ値を、Benjamini-Hochbergステップアップ法による偽陽性率(ＦＤＲ)を使用する多重試験について補正する。差次的発現試験を、ＳＡＭおよびPartekProを含む多様なツールを使用して達成する。出現する目的の遺伝子を、次いで、発現パターンに基づきクラスター化し(GeneSpringまたはSpotfire)、クラスターを、試験ツールとしてNIH-Davidを使用する、ＫＥＧＧ、Ingenuity Pathway AnalysisおよびGene Ontologyデータベースにおける機能的群および経路について分析する。データに基づき同定された遺伝子について、定量的ＲＴＰＣＲによる非依存性発現立体構造を、種々のタイプのＭＣＬ(標準対芽球様細胞およびＳＯＸ１１陽性対ＳＯＸ１１陰性)の大きなサンプル(少なくとも２０)で行う。
全エクソームＤＮＡ配列分析：
病因、および、可能な範囲で、ここで提案される組み合わせ治療に対する応答に関してＭＣＬ症例を良好に分類するために、エクソンＤＮＡの配列を試験する。ＭＣＬおよび正常末梢血ＤＮＡサンプルの全エクソーム捕獲および次世代配列決定を、NimbleGen Sequence Capture 2.1M Human Exome ArrayおよびHiSeq 2000/1000 Illumina装置を使用して行う。
異種移植腫瘍における処置効果の評価
ＮＳＧマウスは、ＭＣＬ腫瘍(両ＭＣＬ細胞株：ＪｅｋｏおよびＭｉｎｏ由来であり、初代細胞を、組織フラグメントまたはあまり好ましくないが、細胞懸濁液としてインプラント)を担持する。腫瘍を、小腫瘍フラグメントの皮下インプラントにより増殖させる。腫瘍が直径０.２〜０.３cmに達したら、治療を開始する。キナーゼ阻害剤を、インビトロで予め選択した用量およびタイミングで胃管栄養により投与する(例えば、我々は、ＢＴＫ阻害剤を、Ｂ細胞特異性およびＣＡＲＴ１９細胞に対するあらゆる阻害性効果の予測される欠失を考慮して、ＣＡＲＴ１９細胞と同時に与える予定である)。ＣＡＲＴ−１９細胞を、１×１０７／動物の用量で、腫瘍担持マウスの尾静脈に注射し、キナーゼ阻害剤を、胃管栄養により、インビトロで予め選択した用量およびタイミングで投与する。我々が、悪性細胞を再現性よく根絶するのに十分であり、同時に、異種移植片対宿主病を誘発しないのにとして確立した用量である。エフェクター細胞の違いと関係する差異を最小とするためにＣＡＲＴ１９細胞の大マスターストック(１×１０１０)を産生し、凍結する。これらの実験からの主要尺度は生存であり、これを、カプラン／マイヤー曲線を使用して評価する。二次尺度として、我々は、Ｔ細胞注入後の動物におけるＣＡＲＴ１９細胞の差次的増殖を評価する。これは、注入したＴ細胞産物が一定比のＣＡＲＴ１９陽性および陰性細胞からなるとの事実により可能である。これらの分析のために、動物を、毎週尾静脈から採血し(各回２５マイクロリットル)、続いて赤血球溶解ならびにヒトＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＡＲＴ１９についての染色を行う。ＣＡＲＴ１９細胞の優先的増殖(ＣＡＲＴ１９＋／ＣＡＲＴ１９−比の少なくとも２倍増加は、選択的ＭＣＬ駆動ＣＡＲＴ１９細胞増殖の証拠である)。処置結果を評価するために、インプラントした皮下腫瘍の体積を測定し、式：体積＝０.４ａｂ２(式中、ａおよびｂは、それぞれ、腫瘍の長径および短径である)のように決定する。マウスの処置群と未処置群の腫瘍体積差を、標準ｔ検定を使用して統計的に分析する。マウスを、実験の終点(＞３０日)、または腫瘍が直径＞１.２cmに達したらまたは動物が苦しんでいる何らかの証拠が示されたら、殺す。マウスの処置群と未処置群の腫瘍体積差を、標準ｔ検定を使用して統計的に分析する。腫瘍ならびに内臓を採取し、処理し、組織学により分析し、選択した組織について、Ｂ細胞(ＣＤ２０、ＣＤ７９ａ、Ｐａｘ−５、ＣＤ１０、ＢＣＬ−６)およびＴ細胞(ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＴＩＡ−１)および増殖マーカーＫｉ−６７に対する一連の抗体を使用して免疫組織化学により分析する。
統計解析：
インビトロ機能的試験において、対照と種々の処置条件の平均値(±Ｓ.Ｄ.)の差異の有意性をスチューデントｔ検定を使用して評価し、＜０.０５のＰ値を、統計的有意とする。先の実験に基づき、実験的マウス群間の差は、大きいことが予測される。それゆえに、１０匹のＮＳＧマウスを各処置群で使用し、これは、予測される、処置平均および標準偏差の差異の比が少なくとも３と仮定して、両側２サンプル／−検定で第１種の過誤０.０５レベルで少なくとも９０％検出力を確実にする。データを平均±ＳＥＭとして示す。群間比較を、２サンプルｔ検定を使用して行う。ｐ＜０.０５の値を有意とする。無腫瘍生存率試験について、１０マウスの群を、生存比較のために使用し、各マウスの疾患状態(腫瘍対無腫瘍)および無腫瘍期間を記録する。カプラン・マイヤー生存曲線をプロットし、ログランク検定を行って、生存曲線を比較する。有意レベルを、０.０５で制御する。
実施例８：マントル細胞リンパ腫に対するイブルチニブ／ＣＡＲ１９ Ｔ細胞組み合わせ治療
この実施例に記載する実験は、インビトロおよびインビボでのマントル細胞リンパ腫の処置のための、イブルチニブ処置と組み合わせたＣＡＲＴ１９活性を特徴とする。イブルチニブは、ある種の血液癌の処置にしばしば使用されるＢＴＫの小分子阻害剤である。ここに記載するインビトロ実験は、増殖、サイトカイン産生、ＣＤ１０７ａ脱顆粒および細胞毒性の評価を含む。異種移植マウスモデルを、インビボでのＣＡＲＴ１９とイブルチニブ処置の有効性および最適用量の試験に使用した。イブルチニブは、ＭＣＬにおいて相当な活性を示すが、患者の約３０％は応答せず、応答者の中でも、わずか２１％〜約１／３しか完全寛解を経験しない(Wang et al. NEJM 369.6(2013):507-16)。完全寛解の達成は、無増悪生存期間の改善と関係する。さらに、治療は、薬物耐性を生じ、中央応答期間１７.５ヶ月である。いくつかの設定で、ＢＴＫ結合部位または直ぐ下流の変異がイブルチニブ治療後に観察され、ますます頻繁になり始め得る、薬物耐性機構を強調する。例えば、Woyach et al. NEJM. 370.24(2014):2286-94参照。また、ＢＴＫ機能の遮断は、Ｂ細胞受容体(ＢＣＲ)シグナル伝達の阻害を生じ、直接細胞毒性ではない。例えば、Ponader et al. Blood. 119.5(2012):1182-89参照。細胞毒性の欠如および悪性クローンの根絶失敗は、選択圧下のクローン進化に感受性である。また、ＣＬＬについてイブルチニブで処置した患者における侵襲性疾患への形質転換増加の先の発見が、懸念される。例えば、Byrd et al. NEJM. 369.1(2013):32-42; and Parikh et al. Blood. 123.11(2014):1647-57参照。
Ｂ細胞特異的ＣＤ１９抗原(ＣＴＬ０１９、ＣＡＲＴ１９)に対するキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を形質導入した自己Ｔ細胞の注入は、種々のＢ細胞新生物、最重要には急性リンパ芽球性白血病(ＡＬＬ)を有する患者の対部分で劇的な臨床応答に至る。例えば、Maude et al. NEJM. 371.16(2014):1507-17; and Ruella et al. Expert Opin. Biol. Ther. (2015):1-6参照。リンパ節腫瘤または巨大腫瘤病変の存在は、Ｔ細胞浸潤低下と、その結果としての抗腫瘍活性低下に至り得る。巨大リンパ節腫脹は、イブルチニブに対する応答を妨害するように見えない。Wang et al. NEJM. 369.6(2013):507-16。また、イブルチニブは、腫瘍質量の減少および新生物Ｂ細胞の末梢血への移動に特に有効性を示す。
方法
細胞株および初代サンプル。ＭＣＬ細胞株を、ＡＴＣＣ(Ｍｉｎｏ、Ｊｅｋｏ−１、ＳＰ−４９)から得て、ＭＣＬ−ＲＬを、ＭＣＬ患者の進行性胸水から産生した。インビトロ実験のために、細胞株を、１０％胎仔ウシ血清、ペニシリンおよびストレプトマイシン添加ＲＰＭＩ培地での培養により維持した。いくつかの実験のために、ＭＣＬ−ＲＬおよびＪｅｋｏ−１細胞を、クリックビートル緑色ルシフェラーゼ／ｅＧＦＰで形質導入し、保存して＞９９％陽性集団を得た。急性白血病細胞株ＭＯＬＭ−１４、Ｋ５６２またはＮＡＬＭ−６およびＴ−ＡＬＬ細胞株ＪＵＲＫＡＴを対照として使用した。これらの細胞株は、元々ＡＴＣＣから得た。非特定化初代ヒトＭＣＬ骨髄(ＢＭ)および末梢血(ＰＢ)検体を、University of Pennsylvaniaの診療から得た。全機能的試験について、初代細胞を、実験の少なくとも１２時間前に解凍し、３７℃で休息させた。
ＣＡＲ構築物およびＣＡＲ Ｔ細胞の産生。マウス抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体(ＣＤ８ヒンジ、４１ＢＢ共刺激ドメインおよびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含んだ)を、先に記載のように産生した。例えば、Milone et al. Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy. 17.8(2009):1453-64参照。ＣＡＲ発現Ｔ細胞の産生を、先に記載のように行った。例えば、Gill et al. Blood. 123.15(2014):2343-54参照。正常ドナーＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞またはＰＢ単核細胞(ＰＢＭＣ)を、Human Immunology Core of the University of Pennsylvaniaから得た。Ｔ細胞を、１×１０６／mlで、ＣＤ４：ＣＤ８比１：１で播種し、Ｘ−ｖｉｖｏ １５培地(Lonza、04-418Q)、ヒト血清ＡＢ５％(Gemini、100-512)、ペニシリン／ストレプトマイシン(Gibco、15070063)およびGlutamax(Gibco、35050061)で、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ Dynabeads(Life Technologies、11161D)を培養１日目に添加し、６日目に除去して、増殖させた。Ｔ細胞を、２日目にレンチウイルスで形質導入した。Ｔ細胞を、８〜１５日の培養で増殖させ、中央細胞体積が３００flを下回ったとき、回収した。Ｔ細胞を、次いで、将来の実験のためにＦＢＳ １０％ＤＭＳＯ中凍結保存した。全実験前、Ｔ細胞を解凍し、一夜、３７℃で休息させた。
イブルチニブ。イブルチニブ(PCI-32765)を、粉末またはＤＭＳＯ溶液としてMedKoo(#202171)またはSelleck Biochemicals(#S2680)から購入した。インビトロ実験のために、イブルチニブを１０nM、１００nMおよび１０００nMの濃度に希釈した。インビボ実験のために、イブルチニブ粉末を１０％ＨＰ−ベータ−シクロデキストリン溶液(１.６mg／ml)に溶解し、マウスに飲み水から投与した。
多変数フローサイトメトリー分析。抗ヒト抗体をBiolegend、eBioscienceまたはBecton Dickinsonから購入した。細胞は、インビトロ培養または動物から単離され、２％胎仔ウシ血清添加ＰＢＳで１回洗浄し、１５分、室温で染色した。細胞数定量化のために、Countbright(Invitrogen)ビーズを、製造者の指示に従い使用した。全ての分析において、目的の集団を、前方散乱光対側方散乱光特性、続いて一重項ゲーティングに基づきゲーティングし、生存細胞をLive Dead Aqua(Invitrogen)を使用してゲーティングした。時間ゲーティングを品質管理のために含んだ。ＣＡＲ１９の表面発現を、先に記載のように検出した。例えば、Kalos et al. Science Translational Medicine. 3.95(2011):95ra73参照。フローサイトメトリーを、４レーザーFortessa−ＬＳＲサイトメーター(Becton-Dickinson)で行い、ＦｌｏｗＪｏ×１０.０.７ｒ２(Tree Star)で分析した。
脱顆粒アッセイ。脱顆粒アッセイを、先に記載のように実施した。例えば、Kalos et al. Science Translational Medicine. 3.95(2011):95ra73参照。Ｔ細胞を、標的細胞と、１：５比で、Ｔ細胞培地中インキュベートした。抗CD107a-PECY7(Biolegend)、抗ＣＤ２８(BD Biosciences)、抗ＣＤ４９ｄ(BD Biosciences)抗体およびモネンシン(BD Biosciences)を共培養に添加した。４時間後、細胞を回収し、ＣＡＲ発現、ＣＤ３、ＣＤ８およびLive Dead aqua染色(Invitrogen)について染色した。細胞を固定し、透過処理し(Invitrogen Fix/Perm緩衝液)、多数のサイトカイン(ＩＦＮ、ＴＮＦａ、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ１ｂ)の検出のために細胞内染色を行った。
増殖アッセイ。Ｔ細胞を洗浄し、１×１０７／mlで１００μlのＰＢＳに再懸濁し、１００μlのＣＦＳＥ ２.５μM(Invitrogen)で５分、３７℃で染色した。冷培地で反応停止させ、細胞を３回洗浄した。標的を１００Gy線量で照射した。Ｔ細胞を、１：１比で、照射標的細胞と１２０時間インキュベートし、２４時間で培地を添加した。細胞を回収し、ＣＤ３、ＣＡＲおよびLive Dead aqua(Invitrogen)について染色し、Countbrightビーズ(Invitrogen)を添加して、絶対定量化のためのフローサイトメトリー分析をした。
細胞毒性アッセイ。ルシフェラーゼ／ｅＧＦＰ＋ＮＡＬＭ−６またはＲＬ細胞を、先に記載のように細胞毒性アッセイに使用した。例えば、Gill et al. Blood. 123.15(2014):2343-54参照。標的を示した比のエフェクターＴ細胞と４時間または１６時間インキュベートした。細胞死を、Xenogen IVIS-200 Spectrumカメラでの生物発光造影により計算した。
サイトカイン測定。エフェクターおよび標的細胞を、１：１比で、Ｔ細胞培地で２４時間共インキュベートした。上清を回収し、製造者のプロトコール(Invitrogen)に従い、30-plex Luminexアレイ(Luminex Corp, FLEXMAP 3D)で分析した。例えば、Kalos et al. Science Translational Medicine. 3.95(2011):95ra73参照。
インビボ実験。Jackson Laboratoriesから元々得たＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γ鎖−／−(ＮＳＧ)マウスを、Stem Cell and Xenograft Core of the University of Pennsylvaniaから購入した。全実験を、Institutional Animal Care and Use Committee(ＩＡＣＵＣ)により承認されたプロトコールに基づき行った。利用した異種移植モデルの概略をここに記載する。細胞(ＭＣＬ細胞株またはＴ細胞)を、２００μlのＰＢＳ中、記載する濃度でマウスの尾静脈に注射した。生物発光造影をXenogen IVIS-200 Spectrumカメラを使用して行い、LivingImageソフトウェアv. 4.3.1(Caliper LifeSciencies)で分析した。動物を、実験の最後またはＩＡＣＵＣプロトコールに従い予め特定されたエンドポイントを満たしたとき、殺した。
免疫組織化学。ホルマリン固定パラフィン包埋組織の免疫組織化学的(ＩＨＣ)染色を、Bond Polymer Refine Detection Systemを使用するLeica Bond-III装置で実施した。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｐａｘ５およびサイクリンＤ１に対する抗体を未希釈で使用した。熱誘発エピトープ修復を、２０分、ＥＲ２溶液(Leica Microsystems AR9640)で行った。画像を、Aperio ScanScopeTMを使用して、デジタルに獲得した。
統計解析。全統計を、ウィンドウズ用GraphPad Prism 6、version 6.04を使用して行った。
マントル細胞リンパ腫細胞株
既存の大部分のマントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)株は、インビトロで固定化され、多世代増殖されており、それゆえに、Ｂ細胞受容体シグナル伝達への依存性を失っている。結果として、それらはイブルチニブに低感受性である。インビトロ実験を行い、ＭＣＬ細胞株のイブルチニブ処置に対する感受性を決定した。これらの細胞株をまた使用して、本実施例でさらに記載する実験におけるイブルチニブ／ＣＡＲＴ１９組み合わせ処置の有効性を評価した。ＭＣＬ細胞を、多数回再発したＭＣＬを有する患者の胸水から回収した。元の細胞(ＲＬｐｒｉｍａｒｙ)およびそれ由来の細胞株(ＲＬ)は、典型的ＭＣＬ免疫表現型である芽球様細胞形態学を有し、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)による古典的ｔ(１１；１４)転座に陽性であった(図５２Ａ、５２Ｂ、５２Ｃ)。
ＲＬおよびＪＥＫＯ−１細胞を、種々の用量のイブルチニブ(０.１nM、１nM、１０nM、１００nM、１μMおよび１０μM)と培養し、イブルチニブに対する感受性を、生物発光(ＢＬＩ)の減少の測定により決定した。図３１Ａに示すように、ＲＬ細胞は、用量依存的様式でイブルチニブ処置に感受性であった。しかしながら、ＪＥＫＯ−１細胞は、イブルチニブ処置に耐性であった(イブルチニブ用量の増加の関数として生物発光減少を示さなかった)。
ＲＬ、Ｊｅｋｏ−１およびＭｉｎｏ細胞のイブルチニブへの感受性も、ＭＴＴアッセイを使用してアッセイした。インビトロでのＲＬの漸増濃度のイブルチニブへの暴露は、増殖および下流メディエーターリン酸化の用量依存性阻害に至り、イブルチニブの標的上効果を示し、１０nMのＩＣ５０であった。対照的に、確立されたＭＣＬ細胞株Ｊｅｋｏ−１およびＭｉｎｏは、イブルチニブに相対的に耐性であり、ＩＣ５０結果は最大１０μMであった(図５２Ｄ)。インビボ実験のための生存可能モデルとしてＲＬを確認するために、免疫欠損ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γ鎖ノックアウト(ＮＳＧ)マウスに、１×１０６ルシフェラーゼ発現ＲＬ細胞を移植した(図５２Ｅ)。その腫瘍負荷および生存を評価した。静脈内注射後、ＭＣＬは全マウスで生着し、脾臓および肝臓に局在化し、続いて骨髄、血液およびリンパ節に散在した(図５２Ｆ)。罹患脾臓および肝臓の組織学は、ＭＣＬの実質性浸潤と一致する(図５２Ｇ)。
これらの結果は、これらの種々の細胞株が、従ってイブルチニブ感受性およびイブルチニブ耐性ＭＣＬ両者のモデルとして使用できることを示した。
マントル細胞リンパ腫細胞は、ＣＡＲＴ１９による殺細胞に感受性である
ＣＡＲＴ１９の有効性を示すほとんどの前臨床研究は、イブルチニブに感受性ではないＢ−ＡＬＬ細胞株を使用して行われている。さらに、今日まで最良の臨床応答が、Ｂ−ＡＬＬを有する患者で報告されており、一方で低悪性度Ｂ細胞悪性腫瘍を有する患者では応答が低いと報告されている。
このモデルにおいてＭＣＬがＣＡＲＴ１９による殺細胞に感受性であることを示すために、健常ドナーＴ細胞を、臨床試験で使用している抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物で形質導入した。例えば、Porter, NEJM 2011参照。一連のインビトロ実験を行い、イブルチニブ感受性細胞株ＲＬおよびイブルチニブ耐性細胞株Ｊｅｋｏ−１が、等価なＣＡＲＴ−１９脱顆粒、サイトカイン産生、殺細胞および増殖を生じることを示した(図５３Ａ、５３Ｂ、５３Ｃ、５３Ｄ)。さらに、末梢血または骨髄を、白血病性期のＭＣＬを有する２患者から得て、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを有する自己Ｔ細胞の増殖および形質導入を可能とした。自己患者由来ＣＡＲＴ１９細胞はＭＣＬに反応性であったが、未処置Ｔ細胞は、その各々の自己ＭＣＬに未反応性であった(図５３Ｅ、５３Ｆ)。これらの結果は、ＭＣＬがＣＡＲＴ１９のエフェクター機能に感受性であることを示す。
インビトロでのイブルチニブ／ＣＡＲＴ１９処置の評価
Ｔ細胞に対するイブルチニブの効果は、Honigberg et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107(2010):13075-80に記載のように、短期活性アッセイに基づき以前軽視されていた。後に、Ｔ細胞キナーゼＩＴＫに対するイブルチニブの効果の分析が、Ｔｈ２タイプ極性化阻害によるＣＤ４ Ｔ細胞に対するイブルチニブの免疫調節性の役割を指示する報告した。Dubovsky et al. Blood 122.15(2013):2539-49参照。数群のＣＡＲＴ１９で処置した患者のサイトカイン分析は、ＣＡＲＴ１９治療がＴｈ１(ＩＬ２、ＩＦＮγ、ＴＮＦ)、Ｔｈ２(ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０)および他のサイトカインの両者と関係することを示す(例えば、Kalos et al. Science Translational Medicine 3.95(2011):95ra73参照)。本実施例において、ＣＡＲＴ１９機能の効果を、患者で予測されるであろうイブルチニブ濃度の、それを超えるおよびそれ未満のイブルチニブで評価した(血清中平均ピーク濃度１００〜１５０ng／ml)。Advani et al. J. Clin. Oncol. 2013;31:88参照。
ＣＡＲＴ１９細胞は、ＩＴＫを含むことが判明した。イブルチニブ存在下のＴＣＲを経るＣＡＲＴ１９細胞の非特異的刺激は、ＣＤ４＋Ｔ細胞で先に報告されたような、リン酸化ＩＴＫ(ｐＩＴＫ−Ｙ１８０)の減少に至った。Dubovsky et al. Blood 122.15(2013):2539-49参照。対照的に、ＣＡＲを経るＣＡＲＴ１９細胞の特異的刺激は、ＩＴＫ活性化の減少に到らなかった(図５４Ａ)。この観察は、ＣＡＲＴ１９機能が、イブルチニブへの暴露により不利に影響を受けていない可能性を示す。
さらに、イブルチニブ存在下のＣＡＲＴ１９細胞の短期および長期インビトロ機能を決定した。臨床的に意義のある濃度でのイブルチニブは、ＣＡＲＴ１９細胞増殖、脱顆粒またはサイトカイン産生を障害しなかったが、生理濃度超では、非特異的毒性を表す可能性のあるＣＡＲＴ１９細胞機能阻害があった(図５４Ｂ、５４Ｃ、１０Ｂ)。
特に、正常健常ドナーから単離されたＰＢＭＣを、上記のようにレンチウイルス抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物で形質導入した。得られたＣＡＲ１９発現Ｔ細胞(ＣＡＲＴ１９)を培養し、継代して増殖および増大能を決定した。１：１比のＣＤ４：ＣＤ８発現Ｔ細胞を、種々の濃度のイブルチニブ(１０nM、１００nMおよび１０００nMイブルチニブ)存在下、または非存在下、培養した。イブルチニブを、各細胞継代で添加した。細胞数を、０日目、５日目、６日目、７日目、９日目および１０日目に計数した(図９Ａ)。細胞体積もモニターした(図９Ｂ)。
ＣＦＳＥ染色およびフローサイトメトリー分析も、イブルチニブ存在下、腫瘍細胞株ＭＯＬＭ１４、ＪＥＫＯ−１およびＲＬでの刺激後のＣＡＲＴ１９細胞の増殖を評価するために使用した。ＭＯＬＭ１４はＡＭＬ細胞株であり、ＪＥＫＯ−１およびＲＬはマントル細胞リンパ腫細胞株である。具体的に、ＲＬ細胞は、再発ＭＣＬ患者の胸水から得た新生物Ｂ細胞由来の新規ＭＣＬ細胞株である。ＣＡＲＴ１９細胞および腫瘍細胞を、１：１比で混合し、増殖を５日間評価した。増殖細胞パーセンテージを、図１０Ａの各ヒストグラムに示す。図１０Ｂに示すような増殖の定量化は、高用量のイブルチニブが、ＭＣＬ細胞株との共培養中、ＣＡＲＴ １９細胞増殖を阻害するはずであることを示す。
Ｔ細胞の脱顆粒は、細胞溶解性Ｔ細胞の活性化および抗原特異的細胞毒性を開始する能力を示す。ＣＤ１０７ａは、Ｔ細胞刺激後に細胞表面上に一過性に発現されるＴ細胞脱顆粒の機能的マーカーである。フローサイトメトリー分析を使用して、腫瘍細胞株ＭＯＬＭ１４、ＪＥＫＯ−１およびＲＬで刺激後のＣＤ１０７ａ発現ＣＡＲＴ１９ Ｔ細胞を定量化した。ＣＤ１０７ａ発現細胞は、図１１Ａに示す細胞プロファイルのＱ２(四分円２)に存在した。図１１Ａのプロファイルから得た結果の定量化を図１１Ｂに示す。これらの結果は、ＣＡＲＴ１９細胞とＭＣＬ−ＲＬまたはＪＥＫＯ−１の共培養が、大量のＣＡＲ特異的ＣＤ１０７ａ脱顆粒を生じることを示す。
イブルチニブ存在下のＣＡＲＴ１９ Ｔ細胞によるサイトカイン産生も、種々の腫瘍細胞株で刺激後定量した。ＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ産生をフローサイトメトリーにより評価した。サイトカイン産生細胞は、図１２、図１３および図１４に示すプロファイルの四分円２に存在した。ＪＥＫＯ−１およびＲＬにより刺激されたＣＡＲＴ１９ Ｔ細胞は、サイトカイン発現増加を示した。また、漸増濃度のイブルチニブ処置は、ＣＡＲＴ１９サイトカイン産生細胞のパーセンテージに影響しなかった。
腫瘍細胞による刺激後、かつ種々の濃度のイブルチニブ存在下のＣＡＲＴ１９細胞からのサイトカイン分泌を、30-plex LUMINEXアッセイにより分析した。ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αのようなＴＨ１細胞により分泌されるサイトカインをアッセイした。ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＭＩＰ１ａ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１ｂ、ＣＰ−１、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−７、ＩＰ−１０、ＩＬ−１ｂ、ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＦＮａ、ＩＬ−１２、ＲＡＮＴＥＳ、エオタキシン、ＩＬ−２Ｒ、ＭＩＧおよびＩＬ−８を含むＴＨ２細胞により文筆されるサイトカインをアッセイした。図１５に示すように、ＴＨ１およびＴＨ２サイトカインは、ＣＡＲＴ１９ Ｔ細胞により分泌された。
また、２つの異なる方法を使用した実験は、イブルチニブ暴露およびイブルチニブ未暴露ＣＡＲＴ１９細胞でＴｈ１／Ｔｈ２極性化の差がないことを示した(図５４Ｄ)。
ＣＡＲＴ１９細胞によるＭＣＬ細胞死はイブルチニブ存在下で増強され、組み合わせからの少なくとも相加的効果を示唆した(図５４Ｅ)。しかしながら、ＣＡＲＴ１９細胞の内因性細胞毒性機能は、イブルチニブ存在下で増強されなかった(図５４Ｆ)。
さらなる生物発光アッセイを行い、腫瘍細胞のＣＡＲＴ１９細胞による殺細胞を評価した。ＣＡＲＴ１９細胞を、９６ウェルプレートでデュプリケートで、１：１、１：０.５、１：０.２５および１：０のように、種々の比でルシフェラーゼレポーターを担持する腫瘍細胞ＭＯＬＭ１４、ＪＥＫＯ−１およびＲＬと播種した。２４時間後、生物発光を検出し、定量した。結果は、ＭＯＬＭ１４サンプルにおける生物発光がＣＡＲＴ１９細胞とのインキュベーション後減少しないことを示した。しかしながら、ＪＥＫＯ−１およびＲＬ細胞について、生物発光はＣＡＲＴ１９細胞存在下で減少し、ＣＡＲＴ１９細胞がＪＥＫＯ−１およびＲＬ細胞死に介在したことを示唆した(図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、１６Ｄ、１６Ｅおよび１６Ｆ)。イブルチニブで処置したとき生物発光はさらに減少し、イブルチニブとＣＡＲＴ１９の組み合わせが、ＣＡＲＴ１９処置単独よりＪＥＫＯ−１およびＲＬ細胞死を増加させたことを示した。これらの結果と一致して、各処置後の総細胞の計算は、ＪＥＫＯ−１およびＲＬ細胞のＣＡＲＴ１９処置が、細胞数の減少を起こし、ＣＡＲＴ１９およびイブルチニブで処置したときさらに減少し(図１７Ｂおよび１７Ｃ)、組み合わせ治療がＭＣＬ細胞死に有効なだけでなく、ＭＣＬ細胞株の効率的殺細胞をもたらすことを示した。
インビボでのイブルチニブ／ＣＡＲＴ１９処置の評価
これらの実験において、マントル細胞リンパ腫のマウスモデルを使用して、インビボでのＣＡＲＴ１９およびイブルチニブ組み合わせ治療を評価した。
図２０、５５および５Ａに示すような概略を本実施例において使用した。図２０は、ＭＣＬのインビボマウスモデルにおける試験ＣＡＲＴ１９／イブルチニブ組み合わせ治療の概略を示す。ＲＬ(ＭＣＬ−３)、ＪＥＫＯ−１(ＭＣＬ−４)およびＮＡＬＭ６(ＭＣＬ−５)細胞株からの１×１０６細胞をＮＳＧマウスに注射する(各実験２０マウス)。生着させるための１週間後、処置を０日目に開始し、ここで、処置は０.５〜１×１０６ ＣＡＲＴ１９細胞(注射による)、２５mg／kg／日イブルチニブ(強制経口投与)またはＣＡＲＴ１９＋イブルチニブ処置である。７日目、１４日目、２１日目および２８日目、生物発光を造影して、腫瘍サイズをモニターする。イブルチニブ処置を受けているマウスは、イブルチニブ処置を続ける。マウスの生存もモニターする。図５５および５６は、ＭＣＬのインビボマウスモデルにおける試験ＣＡＲＴ１９／イブルチニブ組み合わせ治療のさらなる概略を示す。２×１０６ ＭＣＬ−ＲＬ細胞をＮＳＧマウスに注射する。生着させるための１週間後(生着を生物発光造影で確認)、処置を７日目(ＭＣＬ−ＲＬ細胞注射後)に開始し、ここで、処置は媒体対照、ＣＡＲＴ１９細胞(２×１０６細胞)および／またはイブルチニブ(１２５mg／kg／日)である。１４日目、２１日目、２８日目および３５日目(ＭＣＬ−ＲＬ細胞注射後)、生物発光を造影して、腫瘍サイズをモニターする。
ＭＣＬのインビボマウスモデルにおけるイブルチニブ処置単独の効果を試験した。ＧＦＰ／ルシフェラーゼ遺伝子をトランスフェクトしたＲＬ細胞を、免疫欠損ＮＳＧマウスに静脈内注射し、肝臓および脾臓への１００％ＭＣＬ生着と、最終的なリンパ節および骨髄への拡散に到った。マウスを、種々の用量のイブルチニブ、２５mg／kg／日および２５０mg／kg／日で処置した。腫瘍増殖を表す平均生物発光を種々の時点で評価した。図３２に示すように、ＲＬ由来腫瘍は、用量相関感受性を示した。ＲＬ細胞含有マウスにおけるイブルチニブ用量を力価測定するさらなる実験を行っており、図５７に示す。用量が高くなると、毒性を増加させずに良好な抗腫瘍活性をもたらし、ＭＣＬのために臨床で使用される高用量のイブルチニブと一致する(Wang et al. NEJM 369.6(2013):507-16)。
ＣＡＲＴ１９用量設定も行った。ＧＦＰ−ルシフェラーゼレポーターを担持する２つのＭＣＬ細胞株、ＲＬ(ＭＣＬ−１)およびＪＥＫＯ−１(ＭＣＬ−２)を、ＮＳＧマウスに０日目に注射した。ＣＡＲＴ１９ Ｔ細胞を、７日目に種々の用量で、例えば０.５×ｅ６細胞、１×ｅ６細胞または２×ｅ６細胞で注射した。マウスを、例えば、１００日間モニターした。種々の時点で、マウスを腫瘍サイズ(例えば、生物発光造影)(図１８Ａおよび１８Ｂおよび図１９Ａ)および全生存期間(例えば、カプラン・マイヤー生存曲線)(図１８Ｃおよび図１９Ｂ)についてモニターした。異なる用量のＣＡＲＴ１９細胞は用量依存的抗腫瘍有効性を示し、２×１０６ ＣＡＲＴ１９細胞／マウスが最も有効な用量である(図１９Ａ)。
これらの試験は、ＭＣＬに対する２治療の直接の比較を行う機会を提供する。図５８に示すように、長期生存は、ＣＡＲＴ−１９細胞で処置したマウスでのみ達成された。未処置Ｔ細胞＋イブルチニブとイブルチニブ単独を比較したとき、抗腫瘍効果に差はなかった。それゆえに、続く実験の全てにおいて、対照群は媒体およびイブルチニブ単独であった(図５９)。
図５６に模式的に詳述するように、ＣＡＲＴ１９のイブルチニブの添加も試験した。腫瘍負荷に対するイブルチニブの効果の評価は、初期時点での腫瘍増殖のわずかな遅延を示した。対照的に、ＣＡＲＴ１９細胞治療は、数週間腫瘍負荷の明確な減少を生じた。ＣＡＲＴ１９細胞単独を受けたマウスにおいて、この後低悪性度再発が４０日目に開始し、一方ＣＡＲＴ１９細胞ならびにイブルチニブで処置されたマウスは、８０日目まで検出可能な疾患はなかった(図６０)。実験の最後に回収した臓器の病理組織学は、全対照およびイブルチニブ処置マウスにおける疾患の残留性を示し、イブルチニブ処置で腫瘍壊死の病巣があった。ＣＡＲＴ１９単独で処置したマウスの大部分が、ＣＡＲＴ１９細胞の残留性に付随した長期で低悪性度再発を示したが、ＣＡＲＴ１９−イブルチニブで処置したマウスは腫瘍の排除と関連臓器からのＣＡＲＴ１９の消失を示した(データは示していない)。
ＣＡＲＴ１９およびイブルチニブの組み合わせ効果の機構
ここでのインビトロ実験は、イブルチニブが短期ＣＡＲＴ１９エフェクター機能を妨害もしなければ、明らかな増強もしないことを示した。インビボ試験は、イブルチニブ単剤療法が中度の抗腫瘍効果を有することを示した。結果は、イブルチニブがＣＡＲＴ１９細胞の抗腫瘍機能を有意に増強できたことを示した(図６０)。それゆえに、この効果の機構を決定する実験を行った。
ＩＴＫの阻害はＴｈ２極性化を阻害し、Ｔｈ１表現型に歪めることが示されている(Dubovsky et al. Blood 122.15(2013):2539-49)。ＣＡＲＴ１９細胞およびイブルチニブで処置されたマウスにおいて、ＣＡＲＴ１９細胞単剤療法と比較したとき、このアッセイを使用して、Ｔｈ１細胞の増加は観察されなかった(図６１Ａ、６１Ｂ)。しかしながら、マウスのイブルチニブへの暴露は、末梢ＣＡＲＴ１９細胞を増加させた。処置群と対照群で増殖マーカーＫｉ６７に差はなく(図６１Ｃ)、よって、このアッセイは増殖の差異を検出しなかった。同様に、抗アポトーシスマーカーＢｃｌ２またはアポトーシスマーカーホスファチジルセリンに差はなく、ＣＡＲＴ細胞数の差は、アポトーシスの機能障害と関係しないことが示唆された(図６１Ｄ)。イブルチニブが患者における末梢リンパ球増加と関係しているため、イブルチニブ単独で処置したマウスにおいてこれがまた未ら得るか否かを決定する実験を行った。イブルチニブ開始１週間後、イブルチニブ処置マウスにおいて循環ＭＣＬ細胞が増え、結節性／臓器ＭＣＬ細胞が減った。興味深いことに、この増加は、急性白血病細胞株ＮＡＬＭ−６を移植したＮＳＧマウスでも観察されたように、イブルチニブ感受性および耐性インビボモデルの両者で観察された(データは示していない)。
インビボでのＴ細胞増殖におけるイブルチニブの役割を理解するために、我々は、ＮＳＧマウスにＭＣＬ−ＲＬ ＷＴ細胞を移植し、ルシフェラーゼ陽性Ｔ細胞で処置した。ＣＴＬ０１９およびＣＴＬ０１９イブルチニブ処置マウスの両者は、ＵＴＤまたはＵＴＤイブルチニブと比較して、強いＴ細胞増殖を示した(データは示していない)。次いで、我々は、インビボでの異なるＴ細胞サブセットの頻度を試験し、Ｔ細胞注入１週間後、ＰＢ Ｔ細胞で差は見られなかった(データは示していない)。ＣＸＣＲ４がヒトにおけるイブルチニブ駆動Ｂ細胞動員と関係しているため、我々は、ＣＴＬ０１９またはＣＴＬ０１９イブルチニブで処置したマウスのＰＢ Ｔ細胞におけるＣＸＣＲ４発現をインビボで確認し、ＣＸＣＲ４レベルは、２群で類似した(データは示していない)。最後に、ＣＡＲＴ１９およびＣＡＲＴ１９イブルチニブで処置したマウスのＴ細胞のＰＢの阻害性／共刺激受容体発現を分析した。ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７またはＣＴＬＡ４の発現における差異は明確でなかったが、しかしながらＰＤ−１発現減少傾向がＣＴＬ０１９およびイブルチニブと組み合わせたＵＴＤで処置したマウスで示された。
結論
Ｂ細胞悪性腫瘍の治療は、ＢＣＲシグナル伝達の小分子阻害剤およびＣＤ１９指向Ｔ細胞ベースの治療を含む。再発ＭＣＬの状況において、ＢＴＫ阻害剤イブルチニブは、現在ＦＤＡにより承認され、高い初期応答率を生み出している。不運なことに、これらの応答は一過性であり、ＣＬＬで使用されるより高い薬物用量を必要とする傾向にある。ＣＡＲＴ−１９は、高リスクＢ−ＡＬＬを有する患者で耐久性の応答をもたらし、同様に他のＢ細胞悪性腫瘍に有効であり得る。予備的データは、成熟Ｂ細胞悪性腫瘍のＣＡＲＴ−１９への応答がＢ−ＡＬＬより低い可能性があることを示唆するが、この差異の機構はまだ確認されていない。この実施例は、ＭＣＬの処置におけるＣＡＲＴ１９へのイブルチニブの付加の影響を試験した。
イブルチニブに対する種々の感受性(１０nM〜１０μM範囲のＩＣ５０)の異なるＭＣＬ細胞株を、インビトロ実験に使用した。これらの種々の細胞株を、イブルチニブ感受性およびイブルチニブ耐性ＭＣＬの両者の具現化のために使用した。最高用量以外の全てのイブルチニブで、ＣＡＲＴ１９細胞機能は障害されず、完全Ｔ細胞増殖動態、腫瘍認識および殺細胞およびサイトカイン産生を備えた。さらに、結果は、イブルチニブ暴露によるＴヘルパー極性化を明らかにしなかった。この知見は、Dubovksy et al. Blood 122.15(2013):2539-49により実施されたＣＤ４のみの実験のモデルとは対照的に、ＣＤ４およびＣＤ８細胞の混合培養の使用を含む、因子の組み合わせによるものであり得る。イブルチニブ感受性およびイブルチニブ耐性細胞株の両者とも、ＣＡＲＴ１９細胞を強く活性化し、殺細胞、サイトカイン産生および増殖を誘発した。ＣＡＲＴ１９とイブルチニブの組み合わせは、インビトロで少なくとも相加的腫瘍細胞死をもたらした。本実施例の結果は、各々を臨床的に意義のある投与量および投与スケジュール(ＣＡＲＴ１９について単回用量、イブルチニブについて連続投与)で単剤療法として使用したとき、イブルチニブを超えるＣＡＲＴ１９の優位性を示す。
研究室で産生したＭＣＬ−ＲＬ細胞株を使用して、全身異種移植ＭＣＬモデルも本実施例において産生した。種々の用量の同種ＣＡＲ１９ Ｔ細胞でのこれらのマウスの処置は、用量依存的抗腫瘍効果を生じた。ＣＡＲＴ−１９に対する類似の用量応答は、イブルチニブ耐性ＪＥＫＯ−１細胞株においても観察された。ＭＣＬ−ＲＬを、種々の用量(例えば、０mg／kg／日、２５mg／kg／日および１２５mg／kg／日)のイブルチニブでインビボで処置し、それぞれ７０日、８１日および１００日(ｐ＜０.００１)の中央全生存期間となった。イブルチニブ１２５mg／kgとＣＡＲＴ１９の直接インビボ比較は、ＣＡＲＴ１９処置マウスについて腫瘍制御の有意な改善を示した。また、ＭＣＬ−ＲＬ移植マウスを、媒体、イブルチニブ、ＣＡＲＴ１９またはＣＡＲＴ１９とイブルチニブの組み合わせ(ｉＣＡＲＴ１９)で処置した。臨床的に意義のある用量で、ＭＣＬのＣＡＲＴ１９での単剤療法は、イブルチニブでの単剤療法より優れ、イブルチニブとＣＡＲＴ１９の組み合わせは、抗腫瘍効果の増強に至った。特に、ｉＣＡＲＴ１９組み合わせは、インビボで、初期に高いＣＡＲＴ１９細胞循環レベル、続いて深い腫瘍応答をもたらし、再発は、イブルチニブをＣＡＲＴ１９に添加したとき、有意に遅延された。ｉＣＡＲＴ１９組み合わせは、腫瘍制御改善をもたらし、マウスの８０％が完全寛解および長期無病生存期間に達した。機構的に、イブルチニブ処置マウスは、Ｔｈ１／Ｔｈ２または記憶表現型の変化無しで、循環ＣＡＲＴ１９細胞数が高かった。それゆえに、ここでの結果は、イブルチニブが合理的な方法でＣＡＲＴ１９と組み合わせることができることを示し、これらの治療の各々の特性が他方の欠損を補い、そうして、増強された長期抗腫瘍効果にいたり得ることを示唆する。ＢＣＲシグナル伝達阻害と抗ＣＤ１９指向Ｔ細胞治療を組み合わせた実験および結果は、Ｂ細胞悪性腫瘍のための非交差耐性治療の合理的組み合わせへの道を築く。
腫瘍応答および再発の動態は、イブルチニブがＣＴＬ０１９単独により達成される初期応答を深めるまたはＣＴＬ０１９細胞の長期免疫監視能の増強のいずれかに役立つことを示唆する。
実施例９：慢性リンパ性白血病のためのイブルチニブ／ＣＡＲ１９ Ｔ細胞組み合わせ治療
イブルチニブは、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)の処置にも有用である。イブルチニブは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に対する胞毒性効果は示されていない。しかしながら、ＣＬＬ細胞において、イブルチニブは、プログラム細胞死を促進し、腫瘍細胞遊走および接着を阻害する。本実施例において、１)イブルチニブ治療を受けている患者からのＣＡＲＴ１９産生に対するイブルチニブの効果；および２)最適インビボ機能のためのＣＡＲＴ１９と組み合わせたイブルチニブでの最適処置タイミングを試験するために実験を行った。
ＣＡＲＴ１９産生および機能に対するイブルチニブの効果
正常ドナーＰＢＭＣを、ここに、例えば実施例６に記載するようなアフェレシスを使用して得た。ＰＢＭＣを５μMのイブルチニブと３０分インキュベートするかまたは未処置のままにし(対照として)、細胞を２回洗浄した。次いで、細胞を、ここに、例えば、実施例４記載する方法を使用して、ＣＡＲ１９を含むレンチウイルス構築物で形質導入して、ＣＡＲＴ１９ Ｔ細胞を産生した。ＦＡＣＳ分析を実施して、未処置ＰＢＭＣと比較して、イブルチニブ処置ＰＢＭＣから産生されたＣＡＲＴ１９ Ｔ細胞の数を決定した。図２１に示すように、形質導入イブルチニブ処置ＰＢＭＣの１５％がＣＡＲ１９を発現し、形質導入未処置ＰＢＭＣの１２％がＣＡＲ１９を発現した。これらの結果は、イブルチニブ処置がレンチウイルス遺伝子導入効率またはＣＡＲＴ１９ Ｔ細胞産生に影響しないことを示す。それゆえに、ＣＡＲＴ１９ Ｔ細胞を、イブルチニブ処置を受けているＣＬＬ患者から産生できる。
さらにインビトロ分析を行って、ＣＡＲＴ１９ Ｔ細胞増殖、ＣＡＲＴ１９細胞毒性およびＴＨ１：ＴＨ２サイトカイン産生比に対するイブルチニブの影響を決定した。
細胞増殖の測定のために、細胞を、実施例４に記載のように、増殖細胞の検出のためのＣＦＳＥで染色し、ＦＡＣＳで分析した。ＣＡＲＴ１９ Ｔ細胞を種々の濃度のイブルチニブ(０.１μM、０.５μM、１μMおよび５μM)とインキュベートし、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激するかまたは未刺激のままとした。図２２において、各濃度のイブルチニブで未刺激対ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ＣＡＲＴ１９ Ｔ細胞を比較するために、ヒストグラムを重層した。各濃度のイブルチニブについて、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激Ｔ細胞増殖が観察され、それによりイブルチニブ処置がＣＡＲＴ１９細胞増殖に影響しないことが示された。
ＣＡＲＴ１９ Ｔ細胞の細胞毒性に対するイブルチニブの効果も、実施例４に記載の方法を使用して評価した。非形質導入およびＣＡＲ１９形質導入Ｔ細胞を培地、ＤＭＳＯまたは１μMイブルチニブで処置した。フローベースの殺細胞アッセイを、エフェクターＣＡＲＴ１９細胞(培地、ＤＭＳＯまたはイブルチニブ処置)を用いるエフェクター対標的(Ｅ：Ｔ)比のタイトレートを使用して行い、ＣＤ１９発現標的細胞に対する特異的細胞毒性活性を決定した。図２３に示すように、イブルチニブで処置したＣＡＲＴ１９ Ｔ細胞は、ＣＤ１９発現標的細胞に対して、対照(培地またはＤＭＳＯで処置したＣＡＲＴ１９ Ｔ細胞)と同じパーセンテージの特異的細胞毒性活性を示した。それゆえに、イブルチニブ処置はＣＡＲＴ１９細胞毒性に影響しない。
イブルチニブ処置は、ヒトＣＬＬ患者においてＴＨ２活性化を制限でき、それゆえにＴ細胞におけるＴＨ１選択圧を促進し、ＴＨ１／ＴＨ２サイトカインをゆがめ得る。イブルチニブまたはＤＭＳＯ(対照)の存在下または非存在下のＴＨ１およびＴＨ２サイトカイン産生を測定するためのアッセイを行った。図２４に示すように、イブルチニブは、ＣＡＲＴ １９細胞におけるＴＨ１およびＴＨ２サイトカインの歪みを促進しない。
インビボでのイブルチニブ／ＣＡＲＴ１９組み合わせ処置の有効性
ＣＡＲＴ１９機能をインビボマウスモデルで評価した。Ｎａｌｍ／６細胞(ヒト急性リンパ芽球性白血病細胞株)をＮＳＧマウスにインプラントし、マウスを少なくとも５０日間連日モニターした。Ｎａｌｍ／６腫瘍モデルは、イブルチニブに非感受性である腫瘍を産生し、それゆえにインビボでのＣＡＲＴ１９機能および腫瘍体積減少／癌処置における有効性の分析が可能である。７日目から開始して、マウスにＤＭＳＯ(対照)またはイブルチニブを強制経口投与により連日投与した。ＣＡＲＴ１９を７日目もしくは９日目に投与するかまたはマウスを未処置のままとした(対照)。４日目、１１日目、１８日目、２５日目および３２日目に、マウスで循環しているＮａｌｍ／６細胞数を、例えば、末梢血ＦＡＣＳ分析により測定して、イブルチニブの存在下または非存在下、ＣＡＲＴ１９がＮａｌｍ／６細胞を除去する有効性を決定した。例えば、細胞を抗ヒトＣＤ１９抗体で染色して、腫瘍担持ＮＳＧマウスにおける血中のヒトＣＤ１９＋(Ｎａｌｍ／６)細胞のパーセントを決定した。
図２５Ａに示すように、ＣＡＲＴ１９注射を受けなかったマウスは、腫瘍Ｎａｌｍ／６細胞の増加を示した。しかしながら、ＤＭＳＯの連日投与と組み合わせてＣＡＲＴ１９注射を受けたマウスは、Ｎａｌｍ／６細胞の除去(減少)の成功が示された。イブルチニブの連日投与と組み合わせてＣＡＲＴ１９注射を受けたマウスも、ＤＭＳＯ処置を受けたマウスと同じ動態および有効性でＮａｌｍ／６細胞の除去の成功を示した。それゆえに、これらの結果は、イブルチニブ処置がこの腫瘍モデルからのＮａｌｍ／６細胞の除去におけるＣＡＲＴ１９機能を障害しないことを示す。
マウスの健康状態を、Ｎａｌｍ／６細胞注射後少なくとも５０日モニターした。図２５Ｂのカプラン・マイヤー生存曲線は、未処置マウス(ＣＡＲＴ１９ Ｔ細胞を受けなかった)およびＤＭＳＯまたはイブルチニブのいずれかを受けたマウスのいずれも、Ｎａｌｍ／６細胞注射後３０日を越えて生存しなかったことを示す。しかしながら、ＤＭＳＯまたはイブルチニブいずれかとのＣＡＲＴ１９ Ｔ細胞での処置は、マウスの生存を増加させた。それゆえに、これらの結果を図１３Ａからの腫瘍負荷結果と合わせて、イブルチニブ処置がインビボでＮＳＧ−Ｎａｌｍ／６腫瘍モデルからの腫瘍細胞の除去におけるＣＡＲＴ１９機能を障害しないことを示す。
ＣＬＬ患者におけるイブルチニブ／ＣＡＲＴ１９組み合わせ処置の最適タイミング
ＣＬＬのイブルチニブ処置中のＣＡＲＴ１９投与の最適な時を、１年間イブルチニブ処置を受けているＣＬＬ患者からのサンプルを使用して評価した。９名のＣＬＬ患者(患者１１１３３００２６、患者１１１３３００３０、患者１１１３３００３９、患者１１１３３００５６、患者１１１３３００７３、患者１１１３３００７４、患者１１１３３００８１、患者１１１３３００８６および患者１１１３３０１１１)からのＰＢＭＣサンプルを、イブルチニブ処置の種々のサイクルで単離し、ＣＡＲＴ１９ Ｔ細胞の産生に使用した。ＰＢＭＣサンプルをベースラインを確立するためにイブルチニブ処置前、その後イブルチニブ処置のサイクル２、１日目およびサイクル１２、１日目に採取した。形質導入、増殖、細胞毒性およびサイトカイン産生のようなＣＡＲＴ１９製造のいくつかの異なるパラメータを評価した。他の評価は、記憶、阻害剤分子および疲弊の評価のようなエクスビボ免疫表現型検査を含み得る。
図２６は、ＣＡＲ形質導入後の他の８患者から得た結果の代表であった、患者１１１３３００３０からのＴ細胞のＣＡＲ１９形質導入からのフローサイトメトリー分析の結果を示す。ＰＢＭＣを、患者から記載した時点(ベースライン、例えば、処置前；サイクル２、１日目；およびサイクル１２、１日目)に採取し、例えば、実施例４に記載するような方法を使用して、ＣＡＲ１９含有レンチウイルスベクターで形質導入した。次いで、形質導入ＰＢＭＣをアネキシン、ＣＤ３、ＣＤ４およびＧＡＭ(ＣＡＲ検出のため)で染色し、次いでＦＡＣＳ分析により分析した。図１４のグラフにおける四角で囲んだ領域は、ＧＡＭ陽性であり、ＣＡＲＴ１９ Ｔ細胞形質導入が成功した細胞のパーセンテージを示す。下の３つのグラフは、ＣＡＲ１９がベースラインで約２３％の細胞、サイクル２、１日目で２８％の細胞およびサイクル１２、１日目で４４％の細胞に形質導入が成功したことを示す。
次に、ＣＡＲＴ１９細胞または非形質導入細胞(対照)の増殖速度(または集団倍加)を、１２日間各時点(ベースライン、サイクル２、１日目およびサイクル１２、１日目)で評価した。図２７は、３名の患者、患者１１１３３００３９(＃３９)、患者１１１３３００２６(＃２６)および患者１１１３３００３０(＃３０)の１２日間にわたる集団倍加のグラフ表示を示す。これらの結果は、増殖速度に関して、サイクル２、１日目とサイクル１２、１日目の間またはその時点で単離されたＰＢＭＣがＣＡＲ形質導入に好ましいことを示す。
ＣＡＲＴ１９機能に影響するイブルチニブ処置の潜在的機構
ＣＬＬ患者サンプルからのＣＡＲＴ１９機能に影響し得るイブルチニブ処置の種々の機構を評価した。
ＣＤ１９発現(ＣＤ１９＋)細胞をＦＡＣＳ分析により評価した。イブルチニブ処置を受けているＣＬＬ患者からのＰＢＭＣを、ベースライン(イブルチニブ処置前)、サイクル２、１日目およびサイクル１２、１日目に単離し、続いてＣＤ１９について染色した。ＦＡＣＳ分析は、イブルチニブがＣＤ１９発現細胞の低下を引き起こすことを示した(図２８Ａ、図２８Ｂおよび図２８Ｃ)。それゆえに、これらの結果は、イブルチニブ処置がリンパ球増加を誘発することを示す。
イブルチニブ処置中の腫瘍細胞上の経時的なＣＤ２００発現を試験するためにさらなる分析を実施した。免疫抑制分子ＣＤ２００は、初代Ｂ細胞ＣＬＬ腫瘍細胞上で上方制御されている。ＣＤ２００は、単球／マクロファージ細胞系譜の細胞およびＴリンパ球上に発現されるその受容体、ＣＤ２００Ｒに結合する。ＣＤ２００とその受容体との相互作用は、マクロファージ細胞系譜に阻害性シグナルを伝達し、サイトカインプロファイルをＴＨ１からＴＨ２に変え、制御性Ｔ細胞の誘発に至る。患者１１１３３００３０、１１１３３００２６および１１１３３００３９からのベースライン(スクリーン)、サイクル２、１日目およびサイクル１２、１日目のサンプルをアネキシン、ＣＤ１９(ＣＤ１９発現腫瘍細胞についてソートするため)およびＣＤ２００について染色し、ＦＡＣＳで分析した。各時点での腫瘍細胞上のＣＤ２００発現を検出するヒストグラムを各患者で重層した(図２９Ａ、２９Ｂおよび２９Ｃ)。一般に、腫瘍細胞上のＣＤ２００発現は、イブルチニブ処置中、経時的に減少した。
イブルチニブ処置中のＰＤ１発現Ｔ細胞頻度も評価した。患者からのサンプルを、ベースライン、サイクル２、１日目およびサイクル１２、１日目に得て、アネキシン、ＣＤ３、ＣＤ８およびＰＤ１について染色した。アネキシン陰性およびＣＤ３陽性の細胞を、ＣＤ８およびＰＤ１発現について分析した。ＣＤ８およびＰＤ１を発現する細胞を、図３０Ａ、３０Ｂおよび３０Ｃにおいて枠で囲むことにより示す。ベースライン(図３０Ａ)、サイクル２、１日目(図３０Ｂ)およびサイクル１２、１日目(図３０Ｃ)の細胞のＦＡＣＳプロファイルの比較は、イブルチニブ処置がＰＤ１発現細胞の頻度を経時的に減少させることを示す。
上記の実験から得たデータは、イブルチニブを受けているＣＬＬ患者へのＣＡＲＴ１９治療投与の最適時は、サイクル２とサイクル１２の間またはサイクル１２であることを示す。
実施例１０：ホジキンリンパ腫のためのＣＡＲ１９ Ｔ細胞治療
ＣＡＲ１９ Ｔ細胞治療はホジキンリンパ腫(ＨＬ)の処置にも使用できる。ホジキンリンパ腫は、クローン胚中心Ｂ細胞由来の悪性ホジキンリード・シュテルンベルク(ＨＲＳ)細胞の存在により特徴付けられる。ＨＬに対するＣＡＲ１９ Ｔ細胞治療の治療有効性を示す数因子が存在する。ＨＬ腫瘍のＣＤ１９染色は、腫瘍および腫瘍微小環境内のＣＤ１９発現(ＣＤ１９＋)細胞を示す(図３３)。研究により、大部分のＨＬ患者において、ＣＤ１９を発現するクローンＢ細胞集団(ＣＤ２０＋ＣＤ２７＋ＡＬＤＨ＋)がホジキンリンパ腫細胞株の産生および維持を担い、また血中にも循環することが示されている(Jones et al., Blood, 2009, 113(23):5920-5926)。このクローンＢ細胞集団はまた悪性ＨＲＳ細胞を発生させるかまたはその産生に寄与することも示唆されている。それゆえに、ＣＡＲＴ１９治療は、腫瘍形成または腫瘍細胞維持に寄与するこのＢ細胞集団を枯渇させる。他の研究は、Ｂ細胞枯渇が複数のマウスモデルで固形腫瘍増殖を遅延させることを示している(Kim et al., J Immunotherapy, 2008, 31(5):446-57)。ＨＬ腫瘍微小環境におけるＢ細胞枯渇がいくぶん抗腫瘍効果を生じるであろうとの考えの支持として、リツキサンのような現在の治療が、ＨＬにおける腫瘍性Ｂ細胞のターゲティングおよび枯渇について臨床的に試験されている(Younes et al., Blood, 2012, 119(18):4123-8)。慢性炎症と関連する新規発癌も、Ｂ細胞依存性であることが示されている(de Visser, et al., Cancer Cell, 2005, 7(5):411-23)。これらの試験からの結果は、特にＨＬ腫瘍微小環境における、Ｂ細胞集団のターゲティングが、疾患進行または腫瘍増殖の軽減または阻止により、ＨＬの処置に有用であることを示す。
さらに、正常ＣＤ１９発現Ｂ細胞はまたＨＬにおける腫瘍微小環境に浸潤する。ＣＬＬおよびＡＬＬにおけるＣＡＲＴ１９治療での先の試験(例えば、実施例４および５に記載)は、ＣＤ１９＋標的へのＣＡＲＴ１９暴露がサイトカイン産生およびマクロファージ産生をもたらすことを示す。それゆえに、腫瘍促進性微小環境から抗腫瘍微小環境へのＨＬ腫瘍微小環境の調節が、ＨＬに存在する正常ＣＤ１９＋Ｂ細胞と相互作用するためのＣＡＲＴ１９の注入により達成できる。例えば、ＣＤ１９発現標的へのＣＡＲＴ１９暴露は、細胞毒性Ｔ細胞の増殖、マクロファージの活性化ならびに白血球、マクロファージおよび抗原提示細胞のような腫瘍増殖を阻害する種々の機能を備えた他の免疫エフェクター細胞の動員により、抗腫瘍活性を促進する、サイトカイン、例えば、炎症性サイトカイン産生を起こす。標的ＣＤ１９＋Ｂ細胞が悪性でない可能性があるために(例えば、正常に循環しているＢ細胞)、遅延性よりむしろ一過性のＣＡＲＴ１９効果が、腫瘍微小環境調節のために好ましい可能性がある。
ＨＬ患者におけるＣＡＲＴ１９治療の治療有効性を試験するための試験を下記のように実施できる(図３４)。試験はまたＨＬ対象におけるＣＡＲＴ１９の安全性および耐容性ならびにＨＬ腫瘍微小環境に対するＣＡＲＴ１９細胞の効果も評価する。
古典的ＨＬを有する８患者を、本試験で処置する。患者はあらゆる年齢であるが、小児と成人患者について薬物送達の別々のプロトコールを確立できる。本試験における患者は、治癒的である可能性のある処置選択肢(例えば自己(ＡＳＣＴ)または同種幹細胞移植)がなくまたはこのような治癒的処置選択肢に適さない。例えば、患者は、サルベージ化学療法後ＰＥＴ＋、ブレンツキシマブ処置後ＰＥＴ＋または先のブレンツキシマブ暴露を伴うまたは伴わないＡＳＣＴ後ＰＥＴ＋のいずれかであり得る。患者は、現在利用可能な治療で予後が限られている(数ヶ月から２年以下の予測生存)。そして最終的に、患者は、抗ＣＤ２０抗体治療を受けない。例えば、患者がＣＡＲＴ１９の６回注入に不十分なＴ細胞数であるならば、実施可能性の欠如のために患者を除外する。
ｍＲＮＡ ＣＡＲ１９をインビトロ転写により産生する。ＣＡＲ１９ ｍＲＮＡをドナーＴ細胞に電気穿孔し、得られた細胞を増殖し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズとのインキュベーションにより刺激する。１×１０８〜５×１０８ ＲＮＡ電気穿孔ＣＡＲ１９ Ｔ細胞を含む用量を、２週間、週に３回患者に送達する(例えば、０日目、２日目、４日目、７日目、９日目および１１日目)。全体的応答率を、処置１ヶ月後の臨床、ＣＴおよびＰＥＴ走査により評価する。応答および生存を、最初のＣＡＲＴ１９注入(０日目)後、最初の６ヶ月は毎月、その後、２年まで３ヶ月毎にモニターする。モニタリング技術は、ＣＡＲＴ１９処置前後の腫瘍またはリンパ節の生検(例えば、免疫組織化学的分析および／または遺伝子発現プロファイリングのためのＲＮＡ)およびＰＥＴ走査を含む。例えば、ＨＬ腫瘍微小環境に対するＣＡＲＴ１９細胞の効果は、選択した患者からの処置前および処置約１週間後(または細胞表現型の改変を可能にするための処置後適切な時)の利用できるリンパ節生検で実施する遺伝子発現プロファイリングの結果の比較により分析する。ＣＡＲＴ１９処置の安全性および耐容性を評価するために、サイトカイン放出症候群(ＣＲＳ)およびマクロファージ活性化症候群(ＭＡＳ)の頻度を含む、有害事象の頻度および重症度を報告する。
化学療法剤を、ＣＡＲＴ１９処置と同時に投与し得る。ＣＡＲＴ１９の初期投与は、白血球枯渇化学療法、例えば、シトキサンが前にあり得る。
実施例１１：ＣＬＬ患者の非応答者サブセットは、免疫チェックポイント阻害剤分子の発現増加を示す
本試験において、３４名のＣＬＬ患者から臨床的に産生したＣＡＲＴ１９細胞を、ＰＤ−１、ＬＡＧ３およびＴＩＭ３のような免疫チェックポイント阻害剤分子の発現について試験した。ＣＡＲＴ１９に対するこのコホートの応答は知られ、ゆえに、応答とバイオマーカー発現パターンの相関を評価できる。
ＣＡＲＴ治療に対する種々の応答のＣＬＬ患者から製造したＣＡＲＴ１９細胞をフローサイトメトリーにより分析して、ＣＡＲおよび免疫チェックポイント阻害剤分子ＰＤ−１、ＬＡＧ３およびＴＩＭ３の発現を決定した。ＣＡＲＴ１９細胞は、健常ドナー(ＨＤ)(ｎ＝２)；ＣＡＲＴ治療に応答した(ＣＲ)ＣＬＬ患者(ｎ＝５)；ＣＡＲＴ治療に部分応答した(ＰＲ)ＣＬＬ患者(ｎ＝８)；ＣＡＲＴ治療に応答しなかった(ＮＲ)ＣＬＬ患者(ｎ＝２１)由来であった。細胞を、当分野で知られるフローサイトメトリー分析の標準法に従い、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＡＲ１９分子および免疫チェックポイント分子ＰＤ−１、ＬＡＧ３およびＴＩＭ３を特異的に認識する蛍光標識抗体で染色した。各マーカー、例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋などの発現をフローサイトメトリー分析ソフトウェアにより決定し、亜集団(例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＡＲ１９発現Ｔ細胞)を、免疫チェックポイント分子ＰＤ−１、ＬＡＧ３およびＴＩＭ３の発現についてさらに分析した。
表面マーカー発現の決定に使用したフローサイトメトリープロファイル分析の例を図３５Ａおよび３５Ｂに示す。ＣＤ４発現Ｔ細胞をフローサイトメトリーを使用して決定し、プロファイルのｘ軸がＣＡＲ１９発現を示し(上部左(Ｑ５)および下部左(Ｑ８)四分円はＣＡＲ１９陰性ＣＤ４＋細胞を示し、上部右(Ｑ６)および下部右(Ｑ７)四分円はＣＡＲ１９発現ＣＤ４＋細胞を示す)、ｙ軸がＰＤ−１発現を示すように(下部左(Ｑ８)および右(Ｑ７)四分円はＰＤ−１陰性ＣＤ４＋細胞を示し、上部左(Ｑ５)および右(Ｑ６)四分円はＰＤ−１発現ＣＤ４＋細胞を示す)、ＣＡＲ１９およびＰＤ−１発現についてさらに分析した。ＣＡＲＴ応答者からのＣＤ４＋集団において、総ＣＤ４＋細胞の４４.７％がＰＤ−１を発現し、ＣＡＲ１９発現細胞の約２２.３％がＰＤ−１陽性であり、一方ＣＡＲ１９発現細胞の２７.２％がＰＤ−１陰性であった(図３５Ａ)。対照的に、非応答者からのＣＤ４＋集団において、総ＣＡＲ１９発現細胞の有意な減少があり(ＣＲの４９.５％と比較して約１５.３％)、１４.７％のＣＡＲ１９発現細胞がＰＤ−１陽性であり、わずか０.６４％がＰＤ−１陰性であった(図３５Ｂ)。図３５Ａと図３５Ｂのプロファイルの比較は、ＣＡＲＴ応答者(約４４.７％)と比較して、非応答者からのＣＤ４＋細胞のはるかに高いパーセンテージがＰＤ−１を発現する(約９２.９％)ことを示す。
上記方法および分析を使用して、ＣＤ４＋集団およびＣＤ８＋集団のＰＤ−１発現(ＰＤ−１＋)細胞のパーセンテージを、各応答群における各患者について決定した。ＣＡＲ治療応答者(ＣＲ)と比較して、非応答者は、ＣＤ４＋(図３５Ｃ)およびＣＤ８＋(図３５Ｄ)集団の両者におけるＰＤ−１＋細胞の大きなパーセンテージを有することが示され、平均ＰＤ−１パーセンテージ増加はＣＤ４＋およびＣＤ８＋集団の両者で統計学的有意であった。部分応答者(ＰＲ)は、ＣＤ４＋(図３５Ｃ)およびＣＤ８＋(図３５Ｄ)集団の両者において、応答者(ＣＲ)より高いパーセンテージのＰＤ−１＋細胞を示した。
次に、ＣＡＲ１９発現ＣＤ４＋集団およびＣＡＲ１９発現ＣＤ８＋集団のＰＤ−１発現(ＰＤ−１＋)細胞のパーセンテージを、各応答群における各患者について実施した。上記と類似した分析を実施し、ＣＡＲ１９発現についてＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞を分析し、ＣＡＲ１９発現細胞同定後、ＣＡＲ１９発現細胞の集団からＰＤ−１発現を有する細胞のパーセンテージを決定するさらなる工程を伴った。総ＣＤ４＋およびＣＤ８＋集団で観察されたのと類似の傾向が、ＣＡＲ１９発現ＣＤ４＋およびＣＤ８＋集団で観察され、非応答者はＣＡＲ治療応答者(ＣＲ)と比較して、ＣＤ４＋(図３６Ａ)およびＣＤ８＋(図３６Ｂ)集団の両者においてＰＤ−１＋細胞の大きなパーセンテージを有することが示され、平均ＰＤ−１パーセンテージ増加はＣＤ４＋およびＣＤ８＋集団の両者で統計学的有意であった。部分応答者(ＰＲ)は、ＣＤ４＋(図３６Ａ)およびＣＤ８＋(図３６Ｂ)集団の両者において、応答者(ＣＲ)より高いパーセンテージのＰＤ−１＋細胞を示した。
ＣＡＲ治療に対する種々の応答の患者からのＰＤ−１、ＬＡＧ３およびＴＩＭ３を発現する細胞の分布を決定するために、さらなる分析を実施した。ＣＤ４＋集団におけるＰＤ−１、ＬＡＧ３およびＴＩＭ３発現の代表的細胞プロファイル分析を図３７に示す。細胞集団を、まず、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋発現について分析した。ＣＤ４＋集団(またはＣＤ８＋集団、示していない)を次いで、ＰＤ−１およびＣＡＲ１９発現について分析した(図３７、左プロファイル)。先に記載したように、非応答者(ＮＲ)は、ＣＡＲＴ応答者(ＣＲ)と比較して、総ＰＤ−１＋であった細胞の有意に増加したパーセンテージを有した(ＣＲについて４４.７％ＰＤ−１陽性と比較して、ＮＲについて約９２.９％ＰＤ−１陽性)。さらに、非応答者において、ＣＡＲ１９発現細胞は、大部分ＰＤ−１陽性であった(１４.７％ＰＤ−１陽性およびＣＡＲ＋対０.６４％ＰＤ−１陰性およびＣＡＲ＋)。次いで、該集団をＰＤ−１およびＬＡＧ３共発現について分析した(図３７、中央プロファイル)。ＰＤ−１およびＬＡＧ３の両者を発現する細胞を上部右四分円(Ｑ２)に示す。非応答者は、ＣＡＲＴ応答者と比較して、両免疫チェックポイント阻害剤、ＰＤ−１およびＬＡＧ３を発現する細胞のパーセンテージが有意に増加していた(６７.３％対７.３１％)。ＰＤ−１発現もＴＩＭ３発現と共に分析した。図３７において、右プロファイルの四角は、ＰＤ−１およびＴＩＭ３の両者を発現する細胞を示す。ＰＤ−１およびＬＡＧ３で得られた結果に類似して、非応答者は、ＣＡＲＴ応答者と比較して、両免疫チェックポイント阻害剤、ＰＤ−１およびＴＩＭ３を発現する細胞パーセンテージが有意に高かった(８３.３％対２８.５％)。ＰＤ−１発現細胞(ＰＤ１＋)、ＰＤ−１およびＬＡＧ３発現細胞(ＰＤ１＋ＬＡＧ３＋)およびＰＤ−１およびＴＩＭ３発現細胞(ＰＤ１＋ＴＩＭ３＋)のパーセンテージは、上記のように、フローサイトメトリー分析を使用して、各応答群における各患者で試験した。非応答者は、ＣＡＲＴ応答者と比較して、ＰＤ１＋ＬＡＧ３＋細胞(図３８Ａ)およびＰＤ１＋ＴＩＭ３＋細胞(図３８Ｂ)の増加したパーセンテージを示し、これは両細胞集団で統計的に有意であった。部分応答者はまたＣＡＲＴ応答者と比較して両細胞集団の増加したパーセンテージを示し、平均は非応答者と比較して減少していた。
これらの結果は、ＣＡＲ治療に応答しない患者が、ＣＡＲ治療に応答するまたは一部応答する患者と比較して、免疫チェックポイント阻害剤(例えば、ＰＤ−１、ＬＡＧ３およびＴＩＭ３)の発現増加を示すことを示す。それゆえに、これらの結果は、免疫チェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ−１、ＬＡＧ３またはＴＩＭ３の発現を阻害または減少する薬剤が、免疫チェックポイント経路(例えば、が介在するＰＤ−１、ＬＡＧ３またはＴＩＭ３)を介する免疫抑制を防止するためにＣＡＲ治療を受けている患者に投与し、それによりＣＡＲ発現細胞の有効性を増加させるのに有用であり得ることを示す。
実施例１２：高齢者における免疫老化に対するｍＴＯＲ阻害の効果
加齢と最も明確に結びついている経路の一つは、ｍＴＯＲ経路である。ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンがマウスで寿命を延長し、高齢マウスで多様な加齢関連状態を改善することが示されている(Harrison, DE et al. (2009) Nature 460:392-395; Wilkinson JE et al. (2012) Aging Cell 11:675-682;およびFlynn, JM et al. (2013) Aging Cell 12:851-862)。それゆえに、これらの知見は、ｍＴＯＲ阻害剤がヒトにおける加齢および加齢関連状態に有益な効果を有し得ることを示す。
短い臨床試験時間枠で試験できる年齢関連表現型は免疫老化である。免疫老化は、感染に対する感受性の増加およびインフルエンザワクチン接種を含むワクチン接種に対する応答の減少に至る、高齢者で生じる免疫機能の減少である。年齢による免疫機能の減少は、造血幹細胞(ＨＳＣ)がナイーブリンパ球を産生する能力の減少および抗原刺激に対する応答が不完全な疲弊したＰＤ−１陽性リンパ球数の増加を含む、免疫欠損の蓄積による(Boraschi, D et al. (2013) Sci. Transl. Med.5:185ps8; Lages, CS et al. (2010) Aging Cell 9:785-798;およびShimatani, K et al., (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:15807-15812)。高齢マウスでの試験は、ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンでの６週間の処置がＨＳＣ機能を若返らせ、ナイーブリンパ球産生増加、インフルエンザワクチン接種に対する応答改善および寿命延長に至ることを示した(Chen, C et al. (2009) Sci. Signal. 2:ra75)。
ヒト加齢関連表現型に対するｍＴＯＲ阻害の効果をおよびｍＴＯＲ阻害剤ＲＡＤ００１が免疫老化を軽減するかを評価するために、ＲＡＤ００１またはプラセボを投与された高齢志願者におけるインフルエンザワクチンに対する応答を評価した。ここに示す知見は、ＲＡＤ００１が、十分耐容性である用量で高齢志願者のインフルエンザワクチンに対する応答を増強したことを示唆する。ＲＡＤ００１はまた年齢とともに蓄積されるプログラム死(ＰＤ)−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔリンパ球のパーセンテージも減少させた。これらの結果は、ｍＴＯＲ阻害が高齢志願者における免疫老化に有益な効果を有することを示す。
ここに記載するとおり、ラパマイシン類似体であるｍＴＯＲ阻害剤ＲＡＤ００１での６週間処置は、高齢ヒト志願者におけるインフルエンザワクチン接種に対する応答を改善した。
方法
治験集団
不安定な基礎疾患のない６５歳以上の高齢志願者が、ニュージーランドおよびオーストラリアの９箇所で参加した。スクリーニング時の除外基準はヘモグロビン＜９.０ｇ／dL、白血球数＜３,５００／mm３、好中球数＜２,０００／mm３または血小板数＜１２５,０００／mm３、未管理の糖尿病、不安定虚血性心疾患、臨床的に顕著な基礎肺疾患、免疫不全の病歴または免疫抑制性治療歴、凝固障害の病歴または長期抗凝固を必要とする医学的状態、概算糸球体濾過速度＜３０ml／分、重度の未管理高コレステロール血症(＞３５０mg／dL、９.１mmol／Ｌ)または高トリグリセリド血症(＞５００mg／dL、５.６mmol／Ｌ)の存在を含んだ。
処置アーム間のベースライン個体群統計は類似した(表７)。２１８名の参加対象中、２１１名が治験を終了した。７名は治験を中止した。５名は有害事象(ＡＥ)が原因であり、１名は同意の上中止し、１名はプロトコール違反の結果、治験から除外した。
＊肥満度指数は、身長(ｍ)の二乗で除した体重(kg)である
治験設計および遂行
２０１１年１２月から２０１２年４月まで、２１８名の高齢志願者が、無作為化、観察者盲検化、プラセボ対照試験に参加した。対象を、各処置アームにおけるＲＡＤ００１対プラセボ比５：２で、検証された自動化無作為化系を使用して処置アームに無作為化した。処置アームは
ＲＡＤ００１ ０.５mg連日またはプラセボ
ＲＡＤ００１ ５mg毎週またはプラセボ
ＲＡＤ００１ ２０mg毎週またはプラセボ
であった。
ＲＡＤ００１ ０.５mg連日および２０mg毎週コホートにおけるプラセボがこれらのコホートにおけるＲＡＤ００１錠剤とわずかに異なったため、本治験は観察者盲検であった。対象を評価する治験担当者は治験薬物を見ておらず、それゆえに完全に盲検式であった。全コホートの処置期間は６週間であり、その間、対象は２週間毎に診療所での安全性評価を受けた。対象が４週間投与された後、ＲＡＤ００１定常レベルを投与前および投与１時間後に測定した。６週間コースの治験薬完了後、対象はＲＡＤ００１が誘発した可能性のある免疫抑制から回復するために２週間休薬させ、その後株Ｈ１Ｎ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９、Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９、Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８を含む２０１２年季節性インフルエンザワクチンを接種した(Agrippal(登録商標), Novartis Vaccines and Diagnostics, Siena, Italy)。インフルエンザワクチン接種４週間後、対象から血清を採取し、インフルエンザ力価を測定した。３種のインフルエンザワクチン株ならびに２種の異種株(Ａ／Ｈ１Ｎ１株Ａ／Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｙ／８／７６およびＡ／Ｈ３Ｎ２株Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／１１)に対する抗体力価を、標準血球凝集阻害アッセイにより測定した(Kendal, AP et al. (1982) Concepts and procedures for laboratory-based influenza surveillance. Atlanta: Centers for Disease Control and Prevention B17-B35)。
Ａ／Ｈ１Ｎ１／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９特異的ＩｇＧおよびＩｇＭレベルを、先に記載のとおりインフルエンザワクチン接種前および４週間後に測定した(Spensieri, F. et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:14330-14335)。結果を蛍光強度として表した。
全ての対象にインフォームド・コンセント書類を渡した。治験は、Good Clinical Practiceの原則に従い、適切な倫理委員会および規制当局により承認された。
安全性
有害事象評価ならびに血液学的および生化学的安全性評価のための採血は、来院日に実施した。有害事象情報は、対象が治験薬を受けている６週間の間、家で記載した日記からも集めた。全有害事象データを、インフォームド・コンセント時から最後の来院３０日後まで集めた。事象は治験医により軽度、中程度または重度と分類された。
統計解析
幾何平均力価比の一次解析を、無情報事前分布を用いる正規ベイズ回帰モデルを使用して行った。このモデルを、対数尺度で各抗体力価に適合させた。各モデルの主要評価項目は８４日目測定値であった。６３日目測定値をアウトカムベクターに包含させた。モデルを、先のステートメントと混ぜたＳＡＳ ９.２ ｐｒｏｃを使用してフィットさせた。マトリクス共分散構造は、非構造化(選択肢タイプ＝ＵＮ)として考慮した。平らである事前分布を使用した。抗体陽転率の二次解析のために、ロジスティック回帰を使用した。
治療企図集団は、少なくとも１回の完全用量の治験薬を投与され、有効性データに影響する重大なプロトコール逸脱がない全対象と定義された。治験に参加した２１８名の対象中１９９名治験が治療企図集団であった。
免疫表現型検査
末梢血単核細胞を、ベースライン、６週間の治験薬処置後および対象が６週間治験薬物から離れており、インフルエンザワクチン接種した４週間後である治験の最後の３時点に採血した全血から単離した。７６個のＰＢＭＣサブセットを、先に記載されたように、Human Immune Monitoring Center at Stanford University, CA, USAで８色免疫表現型検査パネルを使用したフローサイトメトリーにより解析した(Maecker, HT et al. (2012) Nat Rev Immunol. 12:191-200)。７６個のＰＢＭＣサブセットを、８色凍結乾燥免疫表現型検査パネルを使用するフローサイトメトリーにより解析した(BD Lyoplate、BD Biosciences, San Diego, CA)。生存能＞８０％および２×１０６細胞を超える収量のＰＢＭＣサンプルを解析に入れた。
ベースラインから治験薬処置６週目までおよびベースラインから治験の最後(１２週目)までの免疫表現型の相対的変化を、各ＲＡＤ００１投薬コホートで計算した。スチューデントＴ検定を行い、ベースラインから２回の採血時点までの免疫表現型の相対的変化が、それぞれ、プラセボ効果について調整した後、各投与群内で０とは有意に異なるかを試験した。処置効果解析における欠損値補完は行わなかった。それゆえに、患者がベースラインで表現型データ欠損があるとき、この患者は、この表現型の解析を行わなかった。患者の６週目または１２週目の表現型データが欠損しているとき、この患者は、影響する時点でのこの表現型の解析に貢献しなかった。
３投薬群下の７６表現型の６０８試験を行い、プラセボ効果に対する処置効果を比較した。層別化偽発見率(ＦＤＲ)管理方法論を、今なお相当に優れた検出力を提供する複数の試験と関係する偽陽性の発生を制御するために実施した。細胞型群を層別因子として取り、各層内のＦＤＲ(ｑ値)計算をそれぞれ行った。全帰無仮説は、対応するｑ値≦０.１の０.０５有意水準で棄却された。０.０５有意水準および対応するｑ＜０.１で棄却される複数試験調節戦略は、結果の１０％未満が偽であることを確実にした。
第二の解析において、免疫表現型は、全３個のＲＡＤ００１投薬群を合わせたプールした処置群とプラセボ群で変化する。どの免疫表現型変化が処置群とプラセボ群を区別するかを決定するために、各測定した表現型の患者内細胞数比を、ベースラインと治験薬処置６週目およびベースラインと治験終了時(１２週目)で計算した。比を対数変換し、プールした処置およびプラセボ群の間の差異を検出するために、各時点の共分散の解析により分析した。７６個の表現型の１５２試験を実施して、プラセボ効果に対するプールした処置効果を比較した。層別化偽発見率(ＦＤＲ)管理方法論を、今なお相当に優れた検出力を提供する複数の試験と関係する偽陽性の発生を制御するために実施した(Benjamini, Y. et al. (1995) J. Roy. Statist. 57:289-300;およびSun, L. et al. (2006) Genet. Epidemiol. 30:519-530)。細胞型群を層別因子として取り、ＦＤＲ(ｑ値)計算を、それぞれ各層内で実施した。０.０５有意水準およびｑ値２０％未満での全帰無仮説は棄却された。これは、０.０５未満のＰ値および各観察された有意な結果が複数試験によるものである２０％未満の確率のみを棄却すると解釈できる。
結果
一般に、ＲＡＤ００１は、特に０.５mg連日および５mg毎週投与レジメンで良好な耐容性であった。治験中に死亡例はなかった。３名の対象は、ＲＡＤ００１と無関係であると評価された４つの重篤な有害事象(ＳＡＥ)を経験した。４つのＳＡＥは、先に６週間５mg毎週ＲＡＤ００１の６週のコースを完了していた正常血小板数の対象の左眼の網膜出血とその後の失明；プラセボ処置対象における重度の背部痛およびプラセボ処置対象における重度の胃腸炎であった。あらゆる処置群における発生率＞２％の処置関連有害事象(ＡＥ)のリストを表８に提供する。最も一般的なＲＡＤ００１関連ＡＥは、大部分の症例で、軽度であった口腔内潰瘍であった。全体的に、ＲＡＤ００１を投与された対象と、プラセボ処置対照の重度のＡＥ発生率は類似した。１個の重度のＡＥのみがＲＡＤ００１と関連すると評価され、２０mg毎週ＲＡＤ００１処置対象の口腔内潰瘍であった。
ＲＡＤ００１が高齢志願者における免疫機能を改善する能力を、２０１２年の季節性インフルエンザワクチンに対する血清学的応答を測定することにより評価した。３種のインフルエンザワクチン株の各々に対するベースラインおよびインフルエンザワクチン接種４週間後の血球凝集阻害(ＨＩ)幾何平均力価(ＧＭＴ)を表９に示す。一次解析変数は、ＨＩ ＧＭＴ比(ワクチン接種４週間後／ベースライン)であった。治験を、少なくとも３種のインフルエンザワクチン株中２種において、１)プラセボに対して相対的に≧１.２倍ＧＭＴ；および２)８０％以上が、１を超えるプラセボ補正ＧＭＴ比である事後確率の存在を証明できるように強化した。このエンドポイントは、ＭＦ−５９ワクチンアジュバントにより誘発されるインフルエンザＧＭＴ比の１.２倍増加がインフルエンザ疾病の減少と関連するために、選択した(Iob, A et al. (2005) Epidemiol Infect 133:687-693)。
ベースラインは、インフルエンザワクチン接種２週間前を示す
４週目はインフルエンザワクチン接種４週間後を示す
Ｎはコホートあたりの対象数である
ＧＭＴは幾何平均力価である
ＧＭＴ比は、ワクチン接種４週目のＧＭＴ／ベースラインのＧＭＴである
ＣＶ％は、変動係数を示す
治療企図(ＩＴＴ)集団において、高用量(２０mg毎週)コホートではなく、低い、免疫増強用量ＲＡＤ００１(０.５mg連日または５mg毎週)コホートが、治験の主要評価項目に合った(図４０Ａ)。これは、低用量でＲＡＤ００１の異なる免疫調節機構が存在し、高用量で、ｍＴＯＲ阻害の既知免疫抑制性効果が発揮されるようになる可能性を示す。さらに、本結果は、低い、免疫増強用量ＲＡＤ００１処置後の高齢者における免疫機能の改善傾向を示唆する。
サブグループ解析において、低ベースラインインフルエンザ力価(≦１：４０)のサブセットの対象は、ＩＴＴ集団より高い力価のＲＡＤ００１関連増加を経験した(図４０Ｂ)。これらのデータは、ＲＡＤ００１が、ベースラインで予防的(＞１：４０)力価を有さず、それゆえにインフルエンザ疾病の最高のリスクにある対象のインフルエンザワクチン応答の増強に特に有効であることを示す。
ＲＡＤ００１濃度対各インフルエンザワクチン株に対する力価増加の散布図は、逆暴露／応答相関を示す(図４１)。Ｓ６キナーゼ(Ｓ６Ｋ)のｍＴＯＲ介在リン酸化に基づくモデリングおよびシミュレーションは、２０mg毎週投与レジメンがｍＴＯＲ介在Ｓ６Ｋ活性をほぼ完全に阻止し、５mg毎週投与レジメンはＳ６Ｋ活性を５０％を超えて阻止し、０.５mg連日投与レジメンは、Ｓ６Ｋリン酸化を投与の合間に約３８％まで阻止することを予測する(Tanaka, C et al. (2008) J. Clin. Oncol 26:1596-1602)。それゆえに、低い、免疫増強用量ＲＡＤ００１での、部分的ｍＴＯＲ阻害、例えば、ｍＴＯＲ介在Ｓ６Ｋリン酸化阻害は、高齢者の免疫応答の増強における高用量ＲＡＤ００１でのほぼ完全なｍＴＯＲ阻害よりも有効ではないにしても、有効であり得る。
インフルエンザワクチン接種４週間後の抗体陽転率も評価した。抗体陽転は、ワクチン接種前力価陰性(すなわち、ＨＩ力価＜１：１０)から、ワクチン接種後ＨＩ力価≧１：４０への変化または非陰性(≧１：１０)ワクチン接種前ＨＩ力価からの少なくとも４倍増加として定義された。治療企図集団、Ｈ３Ｎ２およびＢ株への抗体陽転率は、プラセボコホートと比較してＲＡＤ００１で増加したが、該増加は統計的有意性には合わなかった(表１０)。ベースラインインフルエンザ力価≦１：４０の対象の亜集団において、ＲＡＤ００１処置はまたＨ３Ｎ２およびＢ株に対する抗体陽転率を増加させ、これらの結果は、０.５mg連日投薬コホートでＢ株に対して統計額的有意性に達した。これらのデータは、さらにＲＡＤ００１が、高齢者におけるインフルエンザワクチン接種に対する血清学的応答を増強させたことを示す。
＊ ＲＡＤ００１とプラセボの間の抗体陽転のオッズ比は、有意に１と異なる(固定効果として処理したロジスティック回帰により得た両側ｐ値＜０.０５)
現在の季節性インフルエンザワクチンは、しばしば、以前に広まったウイルスのバリアントとして存在するインフルエンザ株の継続する出現に対して適切な保護を提供しない。しかしながら、ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンの存在下でインフルエンザに対してワクチン接種したマウスは、プラセボと比較して、インフルエンザに対する広い血清学的応答を発達させた。広い血清学的応答は、ワクチンに含まれないインフルエンザの異種株での感染に対する保護を提供する、複数のサブタイプのインフルエンザにより発現される保存的エピトープに対する抗体を含んだ(Keating, R et al. (2013) Nat Immunology 14:2166-2178)。ＲＡＤ００１が高齢志願者におけるインフルエンザに対する血清学的応答を広幅化するかについて、インフルエンザワクチン(Ａ／Ｈ１Ｎ１株Ａ／Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ／８／７６およびＡ／Ｈ３Ｎ２株Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／１１)に含まれないインフルエンザの２種の異種株に対するＨＩ力価を測定した。異種株に対するＨＩ ＧＭＴ比の増加は、プラセボコホートと比較してＲＡＤ００１で高かった(図４２)。さらに、異種株に対する抗体陽転率は、プラセボコホートと比較してＲＡＤ００１で高かった。５mgおよび２０mg毎週ＲＡＤ００１投薬コホートにおける抗体陽転率の増加は、Ｈ３Ｎ２異種株に対して統計的有意であった(表１１)。プールしたＲＡＤ００１コホートについてのＨ３Ｎ２抗体陽転率は３９％であり、それに対しプラセボコホートは２０％であった(ｐ＝０.００７)。ここに示した結果は、ｍＴＯＲ阻害がインフルエンザワクチン接種に対する高齢志願者の血清学的応答を広幅化し、季節性インフルエンザワクチンに含まれないインフルエンザの異種株に対する抗体力価を高めることを示唆する。
ラパマイシンで処置したマウスにおけるインフルエンザの異種株に対する血清学的応答の広幅化は、Ｂ細胞におけるクラススイッチングの阻止および抗インフルエンザＩｇＭレベルの増加と関係している(Keating, R. et al. (2013) Nat Immunol 14:2166-2178)。しかしながら、クラススイッチングの阻止は、ワクチン接種後抗インフルエンザＩｇＭおよびＩｇＧレベルがＲＡＤ００１コホートとプラセボ処置コホート間で差がなかったため、ＲＡＤ００１で処置したヒトにおける広幅化された血清学的応答とは関係しない可能性がある(図４３)。
＊ ＲＡＤ００１とプラセボの間の抗体陽転のオッズ比は、有意に１より異なる(固定効果として処理したロジスティック回帰により得た両側ｐ値＜０.０５)
ＲＡＤ００１が高齢志願者における免疫機能を増強する機構に取り組むため、免疫表現型検査を、ベースライン、治験薬処置６週間後およびインフルエンザワクチン接種４週間後(治験薬中止６週間後)に対象から得たＰＢＭＣサンプルで実施した。大部分のＰＢＭＣサブセットのパーセンテージはＲＡＤ００１コホートとプラセボの間で差がなかったが、ＰＤ−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８細胞のパーセンテージは、プラセボコホートと比較してＲＡＤ００１で低かった(図４４)。ＰＤ−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８細胞は年齢とともに蓄積し、ＰＤ−１がＴ細胞受容体誘発Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生および細胞溶解性機能を阻止するため、抗原刺激に対する不完全な応答を有する(Lages, CS et al. (2010) Aging Cell 9:785-798)。プラセボコホートにおいてＰＤ−１陽性Ｔ細胞のパーセンテージの経時的増加があった。１２週目(ワクチン接種４週間後)で、インフルエンザウイルスがＰＤ−１陽性Ｔ細胞を増加させることが示されているため、この増加はインフルエンザワクチン接種によるものであり得る(Erikson, JJ et al. (2012) JCI 122:2967-2982)。しかしながら、全ＲＡＤ００１コホートでＣＤ４ ＰＤ−１陽性Ｔ細胞のパーセンテージは６週目および１２週目でベースラインから下がった(図４４Ａ)。ＣＤ８ ＰＤ−１陽性細胞のパーセンテージも、２つの低用量ＲＡＤ００１コホートで６週目および１２週目の両者でベースラインから下がった(図４４Ｂ)。ＰＤ−１陰性ＣＤ４ Ｔ細胞のパーセンテージを評価し、プラセボコホートと比較してＲＡＤ００１コホートで増加した(図４４Ｃ)。
ＲＡＤ００１コホートからの結果をプールし、ベースラインＰＤ−１発現の差異について調整したより厳密な統計解析下、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、プールしたＲＡＤコホート(ｎ＝８４)で、６週目にＰＤ−１陽性ＣＤ４ Ｔ細胞の３０.２％の統計的に有意な減少があり、ｐ＝０.０３(ｑ＝０.１３)であった(図４５Ａ)。プラセボコホートと比較した、プールしたＲＡＤにおける１２週目のＰＤ−１陽性ＣＤ４ Ｔ細胞の減少は３２.７％であり、ｐ＝０.０５(ｑ＝０.１９)である。図４５Ｂは、プラセボコホート(ｎ＝２５)と比較して、プールしたＲＡＤ００１コホート(ｎ＝８４)における６週目のＰＤ−１陽性ＣＤ８ Ｔ細胞の統計的に有意な３７.４％の減少を示し、ｐ＝０.００８(ｑ＝０.０７)である。プラセボコホートと比較した、プールしたＲＡＤ００１の１２週目のＰＤ−１陽性ＣＤ８ Ｔ細胞減少は４１.４％であり、ｐ＝０.０６６(ｑ＝０.２１)である。それゆえに、図４４および４５の結果は、合わせて、ＰＤ−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージのＲＡＤ００１関連減少が、免疫機能の増強に貢献している可能性を示唆する。
結論
結論として、ここに提供したデータは、ｍＴＯＲ阻害剤ＲＡＤ００１が、インフルエンザワクチン接種に対する応答で評価して、ヒト高齢者の免疫学的機能における年齢関連減少を軽減し、この改善が許容されるリスク対効果バランスで得られることを示す。高齢マウスでの試験において、ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンでの６週間処置はインフルエンザワクチン接種に対する応答を増加しただけでなく、寿命も延長し、免疫老化の改善は、加齢関連表現型に対するより広範な効果のマーカーであり得ることを示唆する。
ＲＡＤ００１投薬をワクチン接種２週間前に中断したため、ＲＡＤ００１の免疫増強効果は、薬物処置中止後も残留する適切な細胞集団における変化により介在され得る。ここに示した結果は、ＲＡＤ００１が、プラセボと比較して疲弊したＰＤ−１陽性ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージを減少させたことを示す。ＰＤ−１発現はＴＣＲシグナル伝達により誘発され、慢性ウイルス感染を含む永続性抗原刺激の設定で高いままである。理論に縛られることを望まないが、ＲＡＤ００１が高齢志願者における慢性免疫活性化を減少し、それによりＰＤ−１発現を減少させた可能性がある。ＲＡＤ００１はまたイムノフィリンシクロスポリンＡについて報告されているように、ＰＤ−１発現を直接的にも阻害し得る(Oestreich, KJ et al. (2008) J Immunol. 181:4832-4839)。ＰＤ−１陽性Ｔ細胞のパーセンテージのＲＡＤ００１誘発減少は、Ｔ細胞応答の品質を改善させる可能性がある。これは、ｍＴＯＲ阻害が、マウスおよび霊長類におけるワクチン接種に対する記憶ＣＤ８ Ｔ細胞応答の品質を改善したことを示す試験と先の一致する(Araki, K et al. (2009) Nature 460:108-112)。高齢マウスにおいて、ｍＴＯＲ阻害はまた造血幹細胞の数を増加させ、ナイーブリンパ球の産生増加に至ることも示されている(Chen, C et al. (2009) Sci Signal 2:ra75)。本実施例においてＲＡＤ００１対プラセボコホートでナイーブリンパ球のパーセンテージに有意な差は検出されなかったが、この可能性がある機構をさらに調査し得る。
ＲＡＤ００１がインフルエンザの異種株に対する血清学的応答を広幅化する機構をさらに調査し得る。ラパマイシンも、インフルエンザワクチン接種後Ｂ細胞におけるクラススイッチングを阻止することが示されている。その結果、抗インフルエンザ抗体の独特のレパートリーが産生され、それがインフルエンザワクチンに含まれないインフルエンザウイルスサブタイプでの致死的感染に対する株間保護を促進した(Keating, R et al. (2013) Nat Immunol. 14:2166-2178)。ここに記載した結果は、ＲＡＤ００１がインフルエンザワクチン接種２週間前にＲＡＤ００１を中止した高齢対象におけるＢ細胞クラススイッチングを改変したことを示さなかった。基礎機構をさらに解明する必要があるが、ここに記載する異種インフルエンザ株に対する血清学的応答の増加は、インフルエンザの季節性ワクチンと地域社会で広まっている株があまり適合していない年のインフルエンザ疾病に対する保護の増強に寄与し得る。
インフルエンザ抗体力価に対するＲＡＤ００１の効果は、高齢者のインフルエンザワクチン接種に対する応答の増加について承認されているＭＦ５９ワクチンアジュバントの効果と同等であった(Podda, A (2001) Vaccine 19:2673-2680)。それゆえに、インフルエンザワクチン接種に対する抗体応答のＲＡＤ００１駆動増強は、高齢者におけるＭＦ５９アジュバント添加インフルエンザワクチンで証明される臨床的利益に翻訳され得る(Iob, A et al. (2005) Epidemiol Infect. 133:687-693)。しかしながら、ＲＡＤ００１はまた臓器移植患者の免疫応答の抑制にも使用される。これらの外見上逆説的な結果は、ｍＴＯＲ阻害剤の免疫調節効果が用量および／または抗原依存性であり得る可能性を惹起する(Ferrer, IR et al. (2010) J Immunol. 185:2004-2008)。逆ＲＡＤ００１暴露／ワクチン接種応答相関の傾向がここで見られた。完全なｍＴＯＲ阻害は通常のシクロフィリン−ラパマイシン機構を介して免疫機能を抑制するが、部分的ｍＴＯＲ阻害は、少なくとも高齢者において、異なる加齢関連表現型阻害により免疫機能を増強する可能性がある。興味深いことに、ｍＴＯＲ活性は、高齢動物モデルにおける造血幹細胞を含む多様な組織で増加する(Chen C. et al. (2009) Sci Signal 2:ra75 and Barns, M. et al. (2014) Int J Biochem Cell Biol. 53:174-185)。それゆえに、ｍＴＯＲ活性の、若い組織で見られるレベルへの下落が、ｍＴＯＲ活性のより完全な抑制とは逆に、老化減少適応症に臨床的利益があり得る。
加齢関連適応症の処置におけるＲＡＤ００１のようなｍＴＯＲ阻害剤の安全性プロファイルは懸念されている。腫瘍学または臓器移植適応症で使用される用量でのＲＡＤ００１の毒性は、多くの加齢関連適応症では許容されないであろう口内炎、下痢、悪心、血球減少、高脂血症および高血糖を含む。しかしながら、これらのＡＥは、血中のＲＡＤ００１のトラフレベルに関係する。それゆえに、本治験で使用したＲＡＤ００１投与レジメンは、トラフレベルを最少化するように選択した。０.５mg連日、５mg毎週および２０mg毎週投薬コホートの平均ＲＡＤ００１トラフレベルは、それぞれ０.９ng／ml、０.３ng／ml(定量下限)未満および０.７ng／mlであった。これらのトラフレベルは、臓器移植および癌患者で使用される投与レジメンと関係するトラフレベルより顕著に低い。さらに、６週間の限られた処置コースが有害事象のリスクを減らした。これらの結果は、この治験で使用された投与レジメンが、高齢者のある状態については許容されるリスク対効果を有し得ることを示唆する。それにもかかわらず、ここに記載した試験の対象の相当数が、０.５mg連日ほど低い投薬でも口腔内潰瘍を発症した。それゆえに、低い、免疫増強用量ＲＡＤ００１の安全性プロファイルはさらなる治験を必要とする。現在利用可能なラパログよりも問題のない安全性プロファイルを有するｍＴＯＲ阻害剤は、将来加齢関連状態における良好な治療選択肢を提供し得る。
実施例１３：高齢者対象におけるワクチンに対する免疫応答の増強
免疫機能は高齢者で低下し、感染発生率増加およびワクチン接種に対する応答減少に至る。ｍＴＯＲ阻害がヒトにおいて抗加齢効果を有するかの決定の第一段階として、無作為化プラセボ対照治験を実施し、ｍＴＯＲ阻害剤ＲＡＤ００１が、高齢志願者におけるワクチン接種に対する応答により評価された免疫機能の加齢関連低下を反転させるかを決定した。全例で、適切な患者同意を得て、治験は国の保健機関により承認された。
ＲＡＤ００１の次の３投与レジメンを治験で使用した：
２０mg毎週(トラフレベル：０.７ng／ml)
５mg毎週(トラフレベルは検出限界以下であった)
０.５mg連日(トラフレベル：０.９ng／ml)。
移植および腫瘍適応症で承認されているＲＡＤ００１の用量より低いトラフレベルのために、これらの投与レジメンを選択した。トラフレベルは、体内の薬物の最低レベルである。１０mg連日腫瘍学投与レジメンに付随するＲＡＤ００１のトラフレベルは約２０ng／mlである。０.７５〜１.５mg ｂｉｄ移植投与レジメンに付随するトラフレベルは約３ng／mlである。対照的に、我々の免疫化治験で使用した投与レジメンに付随するトラフレベルは３〜２０倍低かった。
ＲＡＤ００１関連ＡＥがトラフレベルと関係するため、３投与レジメンは正常志願者に対する適切な安全性を有することが予測された。さらに、３用量は、一定範囲のｍＴＯＲ阻害を与えることが予想された。Ｐ７０ Ｓ６キナーゼ(Ｐ７０ Ｓ６Ｋ)は、ｍＴＯＲによりリン酸化される下流標的である。Ｐ７０ Ｓ６Ｋリン酸化のレベルは、ｍＴＯＲ活性の指標として働く。ＲＡＤ００１の前臨床試験および臨床試験で得たＰ７０ Ｓ６Ｋリン酸化データのモデリングおよびシミュレーションに基づき、２０mg毎週が丸一週間ｍＴＯＲ活性をほぼ完全に阻害すると予測され、一方５mg毎週および０.５mg連日はｍＴＯＲ活性を一部阻害すると予測された。
６５歳以上の高齢志願者を、３つのＲＡＤ００１処置群(５０対象／アーム)またはプラセボ(２０対象／アーム)の一つに無作為化した。対象を治験薬物で６週間処置し、２週間休薬し、インフルエンザワクチン接種(Aggrippal, Novartis)および肺炎球菌ワクチン接種(Pneumovax 23, Merck)をした。インフルエンザワクチン接種に対する応答を、ワクチン接種４週間後、インフルエンザワクチンの３インフルエンザ株(Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２およびＢインフルエンザサブタイプ)に対する血球凝集阻害アッセイによる幾何平均力価(ＧＭＴｓ)の測定により評価した。治験の主要評価項目は(１)安全性および耐容性および(２)ワクチン接種４週間後、プラセボと比較した、インフルエンザワクチン株の２／３のインフルエンザ力価の１.２倍増加であった。このエンドポイントは、インフルエンザ力価の１.２倍増加が、ワクチン接種後のインフルエンザ疾病の減少と関連し、それゆえに臨床的に適切であるために、選択した。５mg毎週および０.５mg １日用量は十分耐容性であり、２０mg毎週用量と異なり、ＧＭＴ主要評価項目を満たした(図４０Ａ)。高齢志願者においてプラセボと比較して、ＲＡＤ００１がインフルエンザワクチン接種に対する応答を改善しただけでなく、肺炎球菌ワクチン接種に対する応答も改善した。肺炎球菌ワクチンは、２３種の肺炎球菌血清型からの抗原を含む。血清型の７種に対する抗体力価を我々の対象で測定した。６／７血清型に対する抗体力価が、プラセボと比較して全３つのＲＡＤコホートで増加した。
合わせたインフルエンザおよび肺炎球菌力価データは、部分的(８０〜１００％未満)ｍＴＯＲ阻害が、完全なｍＴＯＲ阻害よりも免疫機能における加齢関連低下の反転により有効であることを示す。
実施例１４：低用量ｍＴＯＲ阻害はエネルギーおよび運動を増やす
前臨床モデルにおいて、ラパログであるラパマイシンでのｍＴＯＲ阻害は、老齢マウスにおける自発的身体活動性を増加させる(Wilkinson et al. Rapamycin slows aging in mice. (2012) Aging Cell; 11:675-82)。興味深いことに、実施例１３に記載した０.５mg連日投薬コホートの対象も、投与１年後のアンケートで、プラセボと比較してエネルギーおよび運動能の増加を報告した(図４６)。これらのデータは、ラパログでの部分的ｍＴＯＲ阻害が、単なる免疫機能を超えて加齢関連罹病率に対する効果を有し得ることを示唆する。
実施例１５：ＲＡＤ００１でのＰ７０ Ｓ６キナーゼ阻害
モデリングおよびシミュレーションを実施し、ｍＴＯＲ活性を部分的に阻害すると予測されるＲＡＤ００１の連日および毎週用量範囲を予測した。上記のとおり、Ｐ７０ Ｓ６ＫはｍＴＯＲによりリン酸化され、Ｐ７０ Ｓ６Ｋのノックアウトが寿命を増加するため加齢とより密接に結びついたｍＴＯＲの下流標的である。それゆえにモデリングを、Ｐ７０ Ｓ６Ｋ活性を一部阻害するＲＡＤ００１の用量で行った。≧０.１mgおよび＜２０mgの範囲の毎週投薬がＰ７０ Ｓ６Ｋ活性の部分的阻害を達成すると予測される(図４７)。
連日投薬について、３０pM〜４nMの濃度のＲＡＤ００１が細胞株におけるＰ７０ Ｓ６Ｋ活性を部分的に阻害する(表１２)。これらの血清濃度は、≧０.００５mg〜＜１.５mg連日のＲＡＤ００１の用量で達成されると予測される。
結論
Ｐ７０ Ｓ６Ｋを部分的にしか阻害しない用量のｍＴＯＲ阻害剤を用いる、加齢関連罹患を処置するまたは一般に免疫応答を増強する方法が提供される。加齢適応症における低用量のＲＡＤ００１での部分的ｍＴＯＲ阻害の有効性は予想外の発見である。≧０.１mg〜＜２０mg毎週および≧０.００５mg〜＜１.５mg連日のＲＡＤ００１用量範囲が部分的ｍＴＯＲ阻害を達成し、それゆえに加齢関連罹患または免疫応答の増強に有効性を有することが期待される。
実施例１６：外来性ＩＬ−７はＣＡＲ Ｔ細胞の機能を増強する
ＣＡＲ Ｔ細胞の養子移入後、一部の患者は、最適以下のレベルの抗腫瘍活性をもたらし得る、ＣＡＲ Ｔ細胞の限定的持続を経験する。この実施例において、外来性ヒトＩＬ−７投与の効果を、ＣＡＲ Ｔ細胞に対する初期最適以下応答が観察されているマウス異種移植モデルで評価する。
ＩＬ−７受容体ＣＤ１２７の発現を、まず異なる癌細胞株およびＣＡＲ発現細胞で評価した。２個のマントル細胞リンパ腫細胞株(ＲＬおよびＪｅｋｏ−１)および１個のＢ−ＡＬＬ細胞株(Ｎａｌｍ−６)を、ＣＤ１２７発現についてフローサイトメトリーで分析した。図４８Ａに示すように、試験した３癌細胞株試験中、ＲＬはＣＤ１２７の最高発現を有し、続いてＪｅｋｏ−１およびＮａｌｍ−６であることが示された。ＣＡＲＴ１９細胞をＮＳＧマウスに注入し、ＣＤ１２７発現を、フローサイトメトリーにより循環ＣＡＲＴ１９細胞において評価した。図４８Ｂに示すように、ＣＤ１２７は全循環ＣＡＲＴ１９細胞で均一に発現される。
次に、ＣＡＲＴ１９細胞の抗腫瘍活性に対する外来性ＩＬ−７処置の効果を、リンパ腫動物モデルにおいて評価した。ＮＳＧマウスに、ルシフェラーゼ発現マントル細胞株(ＲＬ ｌｕｃ)を０日目(Ｄ０)に移植し、続いて６日目にＣＡＲＴ１９細胞で処置した。ＮＳＧマウスを群に分け、ここで、第一群はＣＡＲＴ１９細胞を受けず、第二群は０.５×１０６ ＣＡＲＴ１９細胞を受け、第三群は１×１０６ ＣＡＲＴ１９細胞を受け、第４群は２×１０６ ＣＡＲＴ１９細胞を受けた。腫瘍サイズを、８０日を越えて移植腫瘍の平均バイオルミネセンスを測定することによりモニターした。２×１０６ ＣＡＲＴ１９細胞を受けたマウスのみが、腫瘍に対する拒絶および腫瘍増殖阻止を示した(図４９Ａ)。０.５×１０６ ＣＡＲＴ１９細胞または１×１０６ ＣＡＲＴ１９細胞を受けた２群のマウスは、最適以下の抗腫瘍応答を示した。これらの２群のマウスを次いで無作為化し、３匹のマウス(０.５×１０６ ＣＡＲＴ１９細胞を受けたマウス＃３８２７および＃３８２９および１×１０６ ＣＡＲＴ１９細胞を受けたマウス＃３８１５)は、８５日目に開始して、週に３回２００ng／マウスの用量で外来性組み換えヒトＩＬ−７の腹腔内注射を受け、２匹のマウスは受けなかった。平均バイオルミネセンスで決定した、８５〜１２５日目に外来性ＩＬ−７を受けたマウスの腫瘍負荷を図４９Ｂに示す。ＩＬ−７を受けた全マウスが、腫瘍負荷の１〜３ログ減少の劇的応答を示した。元々高用量ＣＡＲＴ１９細胞を受けたマウス(１×１０６ ＣＡＲＴ１９細胞を受けたマウス＃３８１５)は、より著明な応答を示した。ＩＬ−７処置を受けたマウスと対照で腫瘍負荷を比較したとき、ＩＬ−７処置前後で、腫瘍負荷における腫瘍減少は、ＩＬ−７処置を受けたマウスでのみ見られた(図４９Ｃ)。
リンパ腫動物モデルにおけるＩＬ−７処置後のＴ細胞動態も試験した。ヒトＣＡＲＴ１９細胞は、ＩＬ−７処置は血液で検出不可能であった。ＩＬ−７での処置により、処置マウスにおけるＴ細胞数の急速であるが、不定の増加があった(図５０Ａ)。ＩＬ−７を受けたマウスで観察されるＴ細胞増殖の程度はまた腫瘍応答と相関した。ＩＬ−７処置中のピーク増殖時に血液で最高数のＴ細胞が検出されたマウス(マウス＃３８１５)は、腫瘍負荷の最も強い減少を有した(図４９Ｂ参照)。さらに、ピーク増殖の時間は、ベースラインとして注射したＴ細胞用量と相関した。血液中のＣＤ３発現細胞数／レベルも、ＩＬ−７処置前後に測定した。対照マウスにおいて、ＣＤ３発現細胞はほとんど検出されなかったが、ＩＬ−７処置マウスは、ＩＬ−７処置後ＣＤ３＋細胞の有意な増加を示した(図５０Ｂ)。
まとめると、この実施例の結果は、外来性ＩＬ−７処置がインビボでＴ細胞増殖および抗腫瘍活性を増加させることを示し、ＣＡＲ治療後最適以下の結果の患者へのＩＬ−７が、これらの患者における抗腫瘍応答を改善できることを示す。
均等物
ここに引用する全ての特許、特許出願および刊行物の開示は、その全体を引用により本明細書に包含させる。本発明は、具体的態様を引用して開示されているが、本発明の他の態様および変形が、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく他の当業者により想到され得ることは明らかである。以下に記載する特許請求の範囲は、全てのこのような態様および等価な変形を含むと解釈されることを意図している。

Claims (75)

  1. ＣＤ１９の発現と関係する疾患を有する哺乳動物の処置において、１以上のキナーゼ阻害剤と組み合わせて使用するためのＣＤ１９と結合するＣＡＲ分子を発現する細胞(例えば、細胞の集団)(“ＣＡＲ１９発現細胞”)を含む組成物であって、ここで、キナーゼ阻害剤がブルトン型チロシンキナーゼ(ＢＴＫ)阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ４(ＣＤＫ４)阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤またはマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ相互作用キナーゼ(ＭＮＫ)阻害剤から選択される、組成物。
  2. 哺乳動物にブルトン型チロシンキナーゼ(ＢＴＫ)阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ４(ＣＤＫ４)阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤またはマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ相互作用キナーゼ(ＭＮＫ)阻害剤から選択される１以上のキナーゼ阻害剤と組み合わせて、ＣＤ１９と結合するＣＡＲ分子を発現する細胞(例えば、細胞の集団)(ＣＡＲ１９発現細胞)の有効量を投与することを含む、ＣＤ１９の発現と関係する疾患を有する哺乳動物を処置する方法。
  3. キナーゼ阻害剤およびＣＡＲ１９発現細胞を第一選択の治療として哺乳動物に投与する、請求項１または２に記載の使用または方法。
  4. ＣＡＲ１９発現細胞を、哺乳動物にキナーゼ阻害剤の投与後に投与する、請求項１または２に記載の使用または方法。
  5. (ｉ)ＣＡＲ１９発現細胞をキナーゼ阻害剤の投与の休止後に投与するか、または
    (ii)キナーゼ阻害剤の投与をＣＡＲ１９発現細胞の投与前に開始し、ＣＡＲ１９発現細胞を、継続しているキナーゼ阻害剤の投与と組み合わせて投与する、
    請求項４に記載の使用または方法。
  6. 哺乳動物がＢＴＫ阻害剤(例えば、イブルチニブ)に対する完全または部分応答者またはＣＡＲ１９発現細胞に対する完全または部分応答者であるまたはそうであると決定される、請求項１〜４のいずれかに記載の使用または方法。
  7. ＢＴＫ阻害剤がイブルチニブ、ＧＤＣ−０８３４、ＲＮ−４８６、ＣＧＩ−５６０、ＣＧＩ−１７６４、ＨＭ−７１２２４、ＣＣ−２９２、ＯＮＯ−４０５９、ＣＮＸ−７７４またはＬＦＭ−Ａ１３から選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の使用または方法。
  8. ＣＤＫ４阻害剤がパルボシクリブ、アロイシンＡ、フラボピリドール、２−(２−クロロフェニル)−５,７−ジヒドロキシ−８−[(３Ｓ,４Ｒ)−３−ヒドロキシ−１−メチル−４−ピペリジニル]−４−クロメノン、クリゾチニブ(ＰＦ−０２３４１０６６、Ｐ２７６−００、ＲＡＦ２６５、インジスラムロスコビチン、ジナシクリブ、ＢＭＳ ３８７０３２、ＭＬＮ８０５４、ＡＧ−０２４３２２、ＡＴ７５１９、ＡＺＤ５４３８、ＢＭＳ９０８６６２またはリボシクリブから選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の使用または方法。
  9. ｍＴＯＲ阻害剤がラパマイシン、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、セマピモド、ＡＺＤ８０５５、ＰＦ０４６９１５０２、ＳＦ１１２６、ＸＬ７６５またはＯＳＩ−０２７のようなラパマイシンアナログから選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の使用または方法。
  10. ＭＮＫ阻害剤がＣＧＰ０５２０８８、ＣＧＰ５７３８０、セルコスポラミド、ＥＴＣ−１７８０４４５−２または４−アミノ−５−(４−フルオロアニリノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンから選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の使用または方法。
  11. キナーゼ阻害剤がイブルチニブであり、イブルチニブが約２５０mg、３００mg、３５０mg、４００mg、４２０mg、４４０mg、４６０mg、４８０mg、５００mg、５２０mg、５４０mg、５６０mg、５８０mgまたは６００mg連日の用量を有する、請求項１〜１０のいずれかに記載の使用または方法。
  12. 細胞がＣＤ１９結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ分子を発現する、請求項１〜１１のいずれかに記載の使用または方法。
  13. 細胞内シグナル伝達ドメインが共刺激ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む、請求項１２に記載の使用または方法。
  14. ＣＡＲ分子が抗ＣＤ１９結合ドメインの軽鎖相補性決定領域１(ＬＣ ＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣ ＣＤＲ２)、軽鎖相補性決定領域３(ＬＣ ＣＤＲ３)、重鎖相補性決定領域１(ＨＣ ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ ＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣ ＣＤＲ３)を含む抗ＣＤ１９結合ドメインを含む、請求項１２または１３に記載の使用または方法。
  15. 抗ＣＤ１９結合ドメインが表７のマウス軽鎖可変領域、表７のマウス重鎖可変領域または両者を含む、請求項１２〜１４のいずれかに記載の使用または方法。
  16. 抗ＣＤ１９結合ドメインが配列番号５のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号２６のＬＣ ＣＤＲ２および配列番号２７のＬＣ ＣＤＲ３を含む、請求項１２〜１５のいずれかに記載の使用または方法。
  17. 抗ＣＤ１９結合ドメインが配列番号１９のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号２０〜２３のいずれかのＬＣ ＣＤＲ２および配列番号２４のＨＣ ＣＤＲ３を含む、請求項１２〜１６のいずれかに記載の使用または方法。
  18. 抗ＣＤ１９結合ドメインが配列番号５９の配列またはそれと９５〜９９％同一である配列を含む、請求項１２〜１７のいずれかに記載の使用または方法。
  19. 抗ＣＤ１９結合ドメインがヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインである、請求項１２〜１４、１６または１７のいずれかに記載の使用または方法。
  20. ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列から選択される配列を含む、請求項１９に記載の使用または方法。
  21. ヒト化抗ＣＤ１９結合ドメインがリンカーを介して重鎖可変に結合する軽鎖可変領域を含むｓｃＦｖである、例えば、リンカーが配列番号５３の配列を含む、請求項１９または２０に記載の使用または方法。
  22. ＣＡＲ分子がＴ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７またはＣＤ１５４から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の使用または方法。
  23. 膜貫通ドメインが配列番号１５の配列を含む、請求項２２に記載の使用または方法。
  24. 抗ＣＤ１９結合ドメインがヒンジ領域により膜貫通ドメインに結合し、例えば、ここで、ヒンジ領域が配列番号１４または配列番号４５の配列を含む、請求項１２に記載の使用または方法。
  25. ＣＡＲ分子が共刺激ドメインを含み、例えば、共刺激ドメインがＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)または４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含み、例えば、共刺激ドメインが配列番号１６または配列番号５１の配列を含む、請求項１〜２４のいずれかに記載の使用または方法。
  26. ＣＡＲ分子が細胞内シグナル伝達ドメインを含み、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインが４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインまたは両者を含むかまたは細胞内シグナル伝達ドメインがＣＤ２７、ＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインまたは両者の配列を含む、請求項１〜２５のいずれかに記載の使用または方法。
  27. 細胞内シグナル伝達ドメインが配列番号１６の配列、配列番号１７の配列または両者を含み、細胞内シグナル伝達ドメインが配列番号１６の配列、配列番号４３の配列または両者を含み、細胞内シグナル伝達ドメインが配列番号５１の配列、配列番号１７の配列または両者を含むかまたは細胞内シグナル伝達ドメインが配列番号５１の配列、配列番号４３の配列または両者を含む、請求項２６に記載の使用または方法。
  28. ＣＡＲ分子がさらにリーダー配列を含み、例えば、ここで、リーダー配列が配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２７のいずれかに記載の使用または方法。
  29. ＣＡＲ分子が配列番号５８、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１または配列番号４２のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２８のいずれかに記載の使用または方法。
  30. ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４またはＴＧＦＲベータから選択される免疫阻害分子を阻害する薬剤と組み合わせて使用する、請求項１〜２９のいずれかに記載の使用または方法。
  31. 組成物が１〜５×１０８ ＣＡＲ発現細胞を含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の使用または方法。
  32. ＣＤ１９の発現と関係する疾患が癌である、請求項１〜３１のいずれかに記載の使用または方法。
  33. ＣＤ１９の発現と関係する疾患が血液癌、例えば、白血病またはリンパ腫から選択される血液癌である、請求項１〜３２のいずれかに記載の使用または方法。
  34. 癌が慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)、マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)、多発性骨髄腫、急性リンパ系白血病(ＡＬＬ)、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ系白血病(ＢＡＬＬ)、Ｔ細胞急性リンパ系白血病(ＴＡＬＬ)、小リンパ球性白血病(ＳＬＬ)、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽細胞性形質細胞様樹状細胞新生物、バーキットリンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫(ＤＬＢＣＬ)、慢性炎症と関係するＤＬＢＣＬ、濾胞性リンパ腫、小児濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞または大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫(粘膜関連リンパ組織型節外性辺縁帯リンパ腫)、辺縁帯リンパ腫、骨髄異形成および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、脾臓辺縁帯リンパ腫、脾臓リンパ腫／白血病、脾臓汎発性赤色髄小Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病異型、リンパ形質細胞性リンパ腫、重鎖疾患、形質細胞骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、骨外形質細胞腫、結節性辺縁帯リンパ腫、小児結節性辺縁帯リンパ腫、皮膚原発濾胞中心リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、縦隔原発(胸腺)大Ｂ細胞リンパ腫、血管内大Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ＋大Ｂ細胞リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性キャッスルマン病に生じる大Ｂ細胞リンパ腫、原発浸出リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫または分類不可能リンパ腫から選択される、請求項３２に記載の使用または方法。
  35. 癌がＭＣＬ、ＣＬＬ、ＡＬＬ、ホジキンリンパ腫または多発性骨髄腫から選択される、請求項３２に記載の使用または方法。
  36. サイトカインと組み合わせて使用する、請求項１〜３５のいずれかに記載の使用または方法。
  37. サイトカインがＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−２１である、請求項３６に記載の使用または方法。
  38. ＣＡＲが調節可能なＣＡＲ(ＲＣＡＲ)である、請求項１〜３７のいずれかに記載の使用または方法。
  39. ＲＣＡＲが
    細胞内シグナル伝達ドメインおよび第一スイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー、
    ＣＤ１９に結合する抗原結合ドメインを含む抗原結合メンバーおよび第二スイッチドメイン；および
    膜貫通ドメイン
    を含む、請求項３８に記載の使用または方法。
  40. 哺乳動物がＢＴＫ変異を有するまたはそれを有すると同定される、請求項１〜３９のいずれかに記載の使用または方法。
  41. ＣＤ１９の発現と関係する疾患が血液癌であり、キナーゼ阻害剤に対する耐性、哺乳動物に対するＣＡＲ分子を発現する細胞または両者が遅延または減少する、請求項１〜４０のいずれかに記載の使用または方法。
  42. ＣＤ１９の発現と関係する疾患が血液癌であり、血液癌の寛解が延長するまたは血液癌の再発が遅延する、請求項１〜４１のいずれかに記載の使用または方法。
  43. ＣＡＲ１９発現細胞を第二キナーゼ阻害剤と組み合わせて投与し、ここで、哺乳動物がイブルチニブに対して非応答者または再発者であるかまたはそうであると同定されたとき、第二キナーゼ阻害剤がイブルチニブ以外である、請求項１または２に記載の使用または方法。
  44. 第二キナーゼ阻害剤がＧＤＣ−０８３４、ＲＮ−４８６、ＣＧＩ−５６０、ＣＧＩ−１７６４、ＨＭ−７１２２４、ＣＣ−２９２、ＯＮＯ−４０５９、ＣＮＸ−７７４またはＬＦＭ−Ａ１３またはこれらの組み合わせから選択される１以上である、請求項４３に記載の使用または方法。
  45. 哺乳動物がキナーゼ阻害剤に対する部分応答者であり(またはそうであると同定される)、哺乳動物にＣＡＲ１９発現細胞を、単独でまたはＢＴＫ阻害剤と組み合わせて、部分応答の期間投与する、請求項１〜４４のいずれかに記載の使用または方法。
  46. 哺乳動物がイブルチニブでの処置後疾患が進行するまたは安定である非応答者であり(またはそうであると同定される)、哺乳動物にＣＡＲ１９発現細胞を、単独でまたは第二ＢＴＫ阻害剤と組み合わせて、疾患が進行しているまたは安定な期間の間投与し、ここで、第二キナーゼ阻害剤はイブルチニブ以外である、請求項１または２に記載の使用または方法。
  47. キナーゼ阻害剤がイブルチニブであり、イブルチニブが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のサイクルで投与するために製剤され、例えば、サイクル長が２１日または２８日である、請求項１〜４６のいずれかに記載の使用または方法。
  48. 少なくとも１つのＣＤ１９ ＣＡＲ発現細胞でのリンパ球注入を実施することを含む、請求項１〜４７のいずれかに記載の使用または方法。
  49. 細胞およびキナーゼ阻害剤が同時投与のために製剤される、請求項１〜４８のいずれかに記載の使用または方法。
  50. 細胞およびキナーゼ阻害剤が逐次送達のために製剤される、請求項１〜４９のいずれかに記載の使用または方法。
  51. 哺乳動物がリンパ球枯渇を受けている、請求項１〜５０のいずれかに記載の使用または方法。
  52. リンパ球枯渇がメルファラン、シトキサン、シクロホスファミドおよびフルダラビンの１以上の投与を含む、請求項５１に記載の使用または方法。
  53. 低い、免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤を哺乳動物に投与することをさらに含む、請求項１〜５２のいずれかに記載の使用または方法。
  54. ｍＴＯＲ阻害剤がエベロリムスまたはラパマイシンである、請求項５３に記載の使用または方法。
  55. ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞)または細胞の集団を製造する方法であって、
    細胞または細胞の集団とＢＴＫ阻害剤を接触させ、そして
    ＣＡＲ分子が発現されるような条件下で、ＣＡＲ分子をコードする核酸を細胞または細胞の集団に導入する(例えば、形質導入する)
    ことを含む、方法。
  56. ＣＡＲ分子がＣＤ１９と結合するＣＡＲ分子である、請求項５５に記載の方法。
  57. 細胞がＴ細胞またはＮＫ細胞であるかまたは細胞の集団がＴ細胞、ＮＫ細胞または両者を含む、請求項５５または５６に記載の方法。
  58. 細胞または細胞の集団とＢＴＫ阻害剤を１０〜２０分、２０〜３０分、３０〜４０分、４０〜６０分または６０〜１２０分接触させ、続いてＢＴＫ阻害剤の大部分または全てを細胞または細胞の集団から除去する、請求項５５〜５７のいずれかに記載の方法。
  59. ＢＴＫ阻害剤を細胞または細胞の集団が回収された後にまたは細胞または細胞の集団を刺激する前に、請求項５５〜５８のいずれかに記載の方法。
  60. ＢＴＫ阻害剤がイブルチニブ、ＧＤＣ−０８３４、ＲＮ−４８６、ＣＧＩ−５６０、ＣＧＩ−１７６４、ＨＭ−７１２２４、ＣＣ−２９２、ＯＮＯ−４０５９、ＣＮＸ−７７４またはＬＦＭ−Ａ１３から選択される、請求項５５〜５９のいずれかに記載の方法。
  61. 細胞の集団が癌細胞も含む、請求項５５〜６０のいずれかに記載の方法。
  62. ＢＴＫ阻害剤が癌細胞におけるＢＴＫを阻害する、請求項６１に記載の方法。
  63. Ｔ制御性細胞(例えば、ＣＤ２５＋細胞)を細胞の集団から枯渇させることをさらに含む、請求項５５〜６２のいずれかに記載の方法。
  64. 免疫エフェクター細胞の集団、ＢＴＫ阻害剤およびＣＡＲ分子またはＣＡＲ分子をコードする核酸を含む、反応混合物。
  65. 免疫エフェクター細胞の１以上がＣＡＲ分子を発現するかまたはＣＡＲ分子をコードする核酸を含む、請求項６４に記載の反応混合物。
  66. ＢＴＫ阻害剤がイブルチニブ、ＧＤＣ−０８３４、ＲＮ−４８６、ＣＧＩ−５６０、ＣＧＩ−１７６４、ＨＭ−７１２２４、ＣＣ−２９２、ＯＮＯ−４０５９、ＣＮＸ−７７４またはＬＦＭ−Ａ１３から選択される、請求項６４に記載の反応混合物。
  67. さらに癌細胞を含む、請求項６４に記載の反応混合物。
  68. 免疫エフェクター細胞の集団およびＣＡＲ分子またはＣＡＲ分子をコードする核酸を含む反応混合物であって、ここで、免疫エフェクター細胞が共有結合的に不活性化されたＩＴＫを含む、反応混合物。
  69. さらに癌細胞を含む、請求項６８に記載の反応混合物。
  70. 癌細胞が共有結合的に不活性化されたＢＴＫを含む、請求項６８に記載の反応混合物。
  71. ＣＤ１９と結合するＣＡＲ分子を発現する細胞(“ＣＡＲ１９発現細胞”)および１以上のキナーゼ阻害剤を含む組成物であって、ここで、キナーゼ阻害剤がブルトン型チロシンキナーゼ(ＢＴＫ)阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ４(ＣＤＫ４)阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤またはマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ相互作用キナーゼ(ＭＮＫ)阻害剤から選択される、組成物。
  72. ＣＡＲ１９発現細胞および１以上のキナーゼ阻害剤が単一用量形態または２以上の用量形態で存在する、請求項７１に記載の組成物。
  73. 医薬として使用するための、請求項７１または７２に記載の組成物。
  74. ＣＤ１９の発現と関係する疾患の処置に使用するための、請求項７１または７２に記載の組成物。
  75. ＣＡＲ１９発現細胞がヒト免疫エフェクター細胞(例えば、ヒトＴ細胞またはヒトＮＫ細胞)または細胞の集団である、請求項１〜７４のいずれかに記載の使用、方法または組成物。
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