JP2000510825A - 標的細胞への最適内在化をもたらす免疫リポソーム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、特徴的な細胞表面マーカーを担う標的細胞への薬剤の内在化を最適化させる免疫リポソームを提供する。当該免疫リポソームは、当該特徴的マーカーと特異的に結合する抗体のＦａｂ’ドメイン、両親媒性小胞形成脂質およびポリエチレングリコール誘導脂質を含む。本発明はまた、増殖抑制治療薬を欠くが、なお標的細胞の成長および分裂を抑制することができる増殖抑制免疫リポソームを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 標的細胞への最適内在化をもたらす免疫リポソーム 本発明はリポソームの分野に関する。特に本発明は、標的細胞上の特徴的なマ ーカーを特異的に標的とするリポソームであって、予想外の高率で細胞への取り 込みをもたらす親水性ポリマーを４モルパーセントまで含むリポソームに関する 。 本発明は、米国立予防衛生研究所によって付与されるグラントP50-CA58207、G M28117、CA36773およびCA25526により政府の支援を受けて達成された。合衆国政 府は本発明に関して一定の権利を有する。 発明の背景 多くの医薬および医薬として使用される可能性を有する薬剤は、水への溶解性 の低さ、高レベルの抗原性、毒性または血清中での急速な分解という問題を抱え ており、このことは適切な医薬製剤の開発を妨げている。これら問題の解決法の １つとして従来、水溶液に溶け、さらに当該薬剤が組織および血液と直接接触す るのを防護する配送用担体中に当該薬剤を被包化する方法があった。特に、リポ ソーム技術による製剤化は極めて興味深い。リポソームは、水の層を被包化する 同心円的に整列したリン脂質二重層で構成された小胞である。リポソームは、リ ン脂質が水溶液に曝されたときに偶発的に形成され、生物活性を有する多様な分 子を収容することができる。 リポソームは、薬理学的に活性を有する種々の分子の効能を強化するインビボ 配送系として重要な手段であることが証明されている(Ostroら、「リポソーム、 その生物物理学から治療学まで(Liposomes from Biophysics to Therapeutics)」 、Dekker刊、ニューヨーク、pp.1-369(1987))。動物実験によって、リポソーム はいくつかの抗癌剤および抗真菌剤の毒性を減少させることが示され、このこと が有望な結果が期待される臨床試験につながった(Sculierら、J．Cancer Clin． Oncol.，24:527-538;Gabizonら、Eur．J．Cancer Clin．Oncol.，25:1975-1803( 1989);Treatら、J．Natl．Cancer Inst.，82:1706-1710(1990);Lopez-Berestein ら、J．Infect．Dis.，151:704-710(1985);Presantら、Cancer，62:905-911(198 8))。さらに、リポソームは、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞内感染を治療する抗 寄生虫薬の効果的な担体であること、転移モデルでマクロファージを活性化して 殺腫瘍性を獲得させる場合に有効であること、さらに被包化抗原に対する免疫反 応を強化ししたがって人工ワクチンの創出を促進する場合に有効であることが示 された（「感染症および癌の治療におけるリポソーム（Liposomes in the Thera py of Infectious Diseases and Cancer）」、Lopez-Berestein & Fidler編、Li ss刊、ニューヨーク(1989);Alvingら、Immunol．Lett.，25:275-280(1990)）。 これらの効果の全ては、数分以内に血液循環から大半のリポソームを除去する 肝および脾のマクロファージ細胞（単核食細胞系（ＭＰＳ）および細網内皮系( ＲＥＳ))の能力から生じる（「薬剤担体としてのリポソーム（Liposomes as Dru g Carriers）」、Gregoriadis編、Wiley刊、ニューヨーク(1988)）。しかしなが ら、そのようにリポソームが迅速に排除される性質により、疾患部位にＲＥＳを 越えて薬剤を輸送するインビボ配送系としての可能性は制限される。 最近の報告にはリポソームの血清半減期を延長させるために種々のポリマーの 使用が記載されている。特に、モノシアロガングリオシド（ＧＭ₁）またはポリ エチレングリコールの脂質誘導体のいずれかを含むリポソームの製剤化によって ＭＰＳによる除去を回避し、血清半減期を顕著に延長できることが認められた(A llenら、FEBS Lette.，223:42-46(1987);Klibanovら、FEBS Lett.，268:235-237 (1990);Blumeら、Biochim，Biophys．Acta.，1029:91-97(1990);Allenら、Bioch im．Biophys．Acta，1066:29-36(1991);Papahadjopoulosら、Proc．Natl．Acad ．Sci．USA，88:11460-11464(1991);Seniorら、Biochim．Biophys．Acta.，1062 :77-82(1991);Allenら、Biochim．Biophys．Acta.，1068:133-141(1991))。 単核食細胞系（ＭＰＳ）の細胞による循環リポソームのインビボでの迅速な除 去は、親水性ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いた脂質誘 導体の作用によって克服できることが多くの報告によって示された。これらのリ ポソームは立体的安定化リポソームまたは“スチールス(Stealth)”リポソーム と称される。１０００から５０００の範囲の分子量を有するＰＥＧを用いると循 環の延長およびＭＰＳによる取り込みの減少が達成される（Woodle & Lasic．Bi ochim．Biophys．Acta，1113:171-199(1992)）。しかしながら、ＭＰＳによるこ のリポソーム除去の減少に伴い多様な細胞による取り込みの減少も見られる（K ．D．Leeら、Biochim．Biophys．Acta，1103:185-197(1992)）。さらに、リポソ ーム表面の親水性ポリマーの存在は、リポソームと結合させた向標的部分が固有 のリガンドを認識するのに干渉するようである。おそらくこれは、長鎖ＰＥＧ分 子によって向標的部分の活性部位が立体的に隠蔽されるために生じる（Klibanov ら、Biochim．Biophys．Acta，1062:148-148(1991)）。 最後に、リポソームによって輸送されるほとんどの治療薬は、それらの生物学 的活性を発現させるために標的細胞の細胞質に入るが、一方、ほとんどのリポソ ームは標的細胞によって内在化されないか、または一般にエンドサイトーシス経 路を介する（ここで取り込みが生じる）と理解されている。したがって、標的細 胞に送られる実際の薬剤は、典型的には（例えばリポソーム自体の崩壊によって または“漏出”によって）リポソームから標的細胞の近傍で遊離され、続いて（ 拡散、エンドサイトーシス、食食作用または能動的輸送のいずれかによって）溶 液から標的細胞によって取り込まれる必要がある。実際、ひとたび向標的抗体が 標的に結合するや当該リポソームの脱安定化および分断化が実際に惹起され、そ れによってリポソームの内容物が遊離されるように免疫リポソームがデザインさ れた（米国特許第4957735号参照）。これら“標的感受性”リポソームでさえも 、治療薬が標的細胞によって取り込まれる以前に大量の治療薬が溶液中に失われ る。また別にリポソームがエンドサイトーシス過程によって内在化されたとして も、リポソームは最終的には水解小体（リソソーム）に取り込まれ、そこには多 くの治療薬（例えばタンパク質）を分解することができる強酸状態が存在する。 したがって、有効用量の治療薬の標的細胞細胞質への配送は、血清中での短い 在留時間、在留時間を延長させた場合でも効率の悪い向標的能、標的細胞によっ て取り込まれる以前に溶液中に顕著な量の治療薬が失われること、およびエンド ソーム／リソソーム経路における治療薬の分解によって妨害される。血清半減期 が延び、特定の細胞を特異的に標的とすることができ、さらにまた標的細胞によ って細胞質中に内在化され、それによって治療薬の損失またはエンドソーム／リ ソソーム経路における分解を回避できるリポソームを得ることが明らかに所望さ れる発明の要旨 本発明は、治療薬を標的細胞の細胞質へ配送するために最適化された新規な免 疫リポソームを提供する。これらの免疫リポソームは血中半減期が延長されてお り、特定の細胞を特異的に標的とすることができ、さらに標的細胞によって細胞 質中に内在化され、それによって治療薬の損失またはエンドソームリソソーム経 路による分解を回避できる。 したがって好ましい実施態様の１つでは、本発明は、特徴的細胞表面マーカー をもつ細胞の細胞質中への治療薬の内在化を最適化させる免疫リポソームを提供 する。これらの免疫リポソームは、抗体のＦａｂ’ドメイン（この場合、当該Ｆ ａｂ’ドメインは特徴的マーカーと特異的に結合する）、リポソームを形成する 両親媒性小胞形成脂質、ポリエチレングリコール誘導脂質（この場合、ポリエチ レングリコールは約７５０Ｄから５０００Ｄ、より好ましくは約１２００Ｄから 約３０００Ｄ、最も好ましくは約１９００Ｄの分子量を有する）、およびリポソ ーム内に含まれる治療薬を含む。当該誘導脂質は、総脂質の約１．２モルパーセ ントまで、より好ましくは約２．４モルパーセントまで、最も好ましくは約３． ６モルパーセントまでの量で存在する。好ましい特徴的マーカーには増殖因子レ セプターが含まれる。特に好ましいものはＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３および ＨＥＲ４を含む増殖因子レセプターで、ＨＥＲ２が最も好ましい。Ｆａｂ’ドメ インはヒト化Ｆａｂ’ドメインでもよいが、より具体的には抗ＨＥＲ２単クロー ン性抗体のヒト化Ｆａｂ’ドメインである。さらに増殖抑制免疫リポソームは、 抗体のＦａｂ’ドメインとチオエーテル結合を形成するマレイミド誘導ホスファ チジルエタノールアミン（Ｍ−ＰＥ）含むことができる。小胞形成脂質は、リン 脂質、糖脂質、スフィンゴリピドまたはステロールを含むことができる。免疫リ ポソームは、約５０ｎｍから約５００ｎｍ、より好ましくは約７５ｎｍから約３ ００ｎｍの範囲、最も好ましくは約１００ｎｍの平均直径を有する。リポソーム 中の治療薬剤には、ダウノマイシン、イダルビシン、ミトキサントロン、マイト マイシン、シスプラチンおよび他の白金II類似体、ビンクリスチン、エピルビシ ン、アクラシノマイシン、メトトレキセート、エトポシド、ドキソルビシン、シ トシンアラビノシド、フルオロウラシルおよび他のフッ素化ピリミジン、プリン またはヌクレオシド、ブレオマイシン、マイトマイシン、プリカマイシン、ダク チノマイシン、シクロフォスファミドおよびその誘導体、チオテパ、ＢＣＮＵ、 タキソール、タキソテアー（taxotere）および他のタキサン誘導体並びに単離物 、カンプトテシン、ポリペプチド、核酸、ホスホロチオエートヌクレオチド間結 合を有する核酸、およびポリアミドヌクレオチド間結合を有する核酸が含まれる 。 特に好ましい免疫リポソームでは、当該抗体のＦａｂ’ドメインはrhuMAbHER2 のＦａｂ’ドメインで、当該Ｆａｂ’ドメインはマレイミド誘導ホスファチジル エタノールアミン（Ｍ−ＰＥ）と結合したＦａｂ’ドメインをもち、小胞形成脂 質はホスファチジルコリン（ＰＣ）およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）で、ポリ エチレングリコール誘導脂質はポリエチレングリコール誘導ホスファチジルエタ ノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）で、この場合ポリエチレングリコール成分は約１ ９００Ｄの分子量を有し、ＰＣ：Ｃｈｏｌ：Ｍ−ＰＥの比は１５０：１００：３ でＰＥＧ−ＰＥは総脂質の約３．６モルパーセントまでの量で存在する。 別の特に好ましい実施態様では、抗体Ｆａｂ’ドメインは、ポリエチレングリ コール誘導脂質の遠位端に結合される。この場合には、当該免疫リポソームは１ 種類のポリエチレングリコール誘導脂質を含むことができ、この事例ではＦａｂ ’ドメインは好ましくは少量のＰＥＧ−誘導脂質分画にのみ結合されるが、また 別には免疫リポソームは２種またはそれ以上の異なるＰＥＧ誘導脂質を含むこと ができる。この場合は１種類のＰＥＧ誘導脂質はＦａｂ’抗体ドメインのリンカ ーとして働き、他方のＰＥＧ誘導脂質は（好ましくはより高濃度で存在する）“ 立体的”安定性を提供し、それによってリポソームの除去速度を減少させる。好 ましい実施態様の１つでは、ＰＥＧ誘導脂質に結合するＦａｂ’は総リン脂質の 約０．６モルパーセントから約１モルパーセントを含み、一方、総ＰＥＧ誘導脂 質は総リン脂質の約１０モルパーセントから約１２モルパーセントを含む。Ｆａ ｂ’は好ましくはＰＧＥ−ＰＥまたはＰＧＥ−ＤＳＰＥに結合する。 本発明はまた、特徴的なマーカーをもつ細胞内への治療薬の内在化を最適化さ せる方法を提供する。当該方法は、上記に要約した免疫リポソームのいずれかと 細胞を接触させ、リポソームの内容物を当該細胞に内在化させることを含む。こ の内在化は、リポソームと細胞膜の融合によるか、またはエンドサイトーシス小 胞から早期に脱出することによる。 別の好ましい実施態様では、本発明は、特徴的な細胞表面マーカーをもつ細胞 と特異的に結合し、それによって当該細胞の分裂増殖または成長増殖を抑制する 増殖抑制免疫リポソームを提供する。この免疫リポソームは、特異的に当該マー カーと結合するＦａｂ’ドメイン、およびリポソームを形成する両親媒性小胞形 成脂質を含む。しかしながら、典型的な薬剤配送リポソームと異なり、このリポ ソームは増殖抑制治療薬を含まず、さらに治療薬も全く含まないであろう。標的 細胞の分裂増殖速度の減少が、中性緩衝液または水以外の薬剤を全く含まない“ 空の”リポソームによってもたらされる標的細胞の分裂増殖速度の減少より大き くても１０％未満、より好ましくは５％未満の場合に、ある組成物は増殖抑制治 療薬ではないと定義されるであろう。好ましい特徴的マーカーは増殖因子レセプ ターを含む。特に好ましいものは、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ ４を含む増殖因子レセプターであるが、ＨＥＲ２が最も好ましい。Ｆａｂ’ドメ インは、ヒト化Ｆａｂ’ドメイン、より具体的には抗ＨＥＲ２（抗P185HER2）単 クローン性抗体のヒト化Ｆａｂ’ドメインでもよい。増殖抑制免疫リポソームは さらに、抗体のＦａｂ’ドメインとチオエーテル結合を形成するマレインイミド 由来ホスファチジルエタノールアミン（Ｍ−ＰＥ）を含みうる。小胞形成脂質は リン脂質、糖脂質、スフィンゴリピドまたはステロールを含むであろう。増殖抑 制免疫リポソームはまた親水性ポリマーを含むことができる。好ましい親水性ポ リマーには、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、モノシアロ ガングリオシド（ＧＭ₁）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）または硫酸セ レブロシド（ＣＳ）が含まれる。脂質に取り込まれるとき、ポリエチレングリコ ールは、ポリエチレングリコール誘導脂質、好ましくはポリエチレングリコール 誘導リン脂質（例えばＰＥＧ−ＰＥ）として取り込まれるであろう。ポリエチレ ングリコールの分子量は、約７５０Ｄから約５０００Ｄ、より好ましくは約１２ ００Ｄから約３０００Ｄの範囲で、最も好ましくは約１９００Ｄである。リポソ ームは、約５０ｎｍから約５００ｎｍ、より好ましくは約７５ｎｍから約３００ ｎｍの範囲の平均直径を有し、最も好ましくは約１００ｎｍである。特に好まし い免疫リポソームの１つでは、抗体Ｆａｂ’ドメインはrhuMAbHER2で、Ｆａｂ’ ドメ インはＭ−ＰＥに結合し、小胞形成脂質はホスファチジルコリン（ＰＣ）および コレステロール（Ｃｈｏｌ）で、ポリエチレングリコール誘導脂質はポリエチレ ングリコール誘導ホスファチジルエタノールアミンで、この場合、ポリエチレン グリコール成分は約１９００Ｄの分子量を有し、ＰＣ：Ｃｈｏｌ：Ｍ−ＰＥの比 は１５０：１００：３で、ＰＥＧ−ＰＥは総脂質の約３．６モルパーセントまで の量で存在する。 本発明はまた、特徴的マーカーをもつ細胞の増殖を抑制する方法を提供する。 この方法は、上記に要約した増殖抑制リポソームのいずれかと細胞を接触させる ことを含む。 さらにもう１つの実施態様では、本発明はまた、上記で述べた増殖抑制剤また は治療薬を運ぶ免疫リポソームのいずれかを含む医薬組成物を提供する。この医 薬組成物は、治療的に有効な用量の免疫リポソームおよび医薬的に許容可能な担 体または賦形剤を含む。 図面の簡単な説明 図１は、抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームのSK-BR-3細胞との結合を示す、流動 細胞計測法（フローサイトメトリー）による測定結果の柱状図を示す。洗浄後に SK-BR-3細胞と結合した状態の免疫リポソームを、rhuMAbHER2−Ｆａｂ’フラグ メントを認識するＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧによって検出した。SK-BR-3細 胞は、通常の免疫リポソーム（Ａ）、立体的安定化（６モル％のＰＥＧ−ＰＥ） 免疫リポソーム（Ｂ）、および遊離のrhuMAbHER2−Ｆａｂ’フラグメント（Ｃ） とともに同等な抗体濃度（３．３μｇ／ｍｌ）で保温した。 図２は、抗ｐ１８５^HER2通常免疫リポソームのＢＴ−４７４細胞との結合を示 す。（Ａ）方法の項で述べるように、単層培養のＢＴ−４７４細胞を競合¹²⁵Ｉ 標識rhuMAbHER2の存在下で通常免疫リポソームで処理した。（Ｂ）（Ａ）に示し たデータのスキャチャード変換（Schatchard transformation）。 図３は、抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームのSK-BR-3細胞に対する抗分裂増殖活 性を示す。SK-BR-3細胞の単層培養を横軸に示す抗体用量の免疫リポソームで処 理し、方法の項で述べるように相対的な細胞分裂増殖を求めた。抗体を欠くコン トロール（対照実験）リポソームの場合はリポソーム濃度にしたがって投与し、 適切に 対応する免疫リポソームと同等なリポソーム濃度でプロットした。コントロール （無抗体）通常リポソーム；コントロール立体的安定化（６モル％ＰＥＧ−ＰＥ ）リポソーム；通常免疫リポソーム；抗ｐ１８５^HER2立体的安定化（６モル％Ｐ ＥＧ−ＰＥ）免疫リポソーム；遊離（無リポソーム）rhuMAbHER2−Ｆａｂ’；お よび遊離rhuMAbHER2二価抗体は符号一覧に表示したように示されている。 図４は、ドキソルビシンを含む抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームの細胞毒性を示 す。ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌ免疫リポソームには、方法の項で述べるようにドキソル ビシンを包含させた。（Ａ）SK-BR-3細胞、（Ｂ）WI-38細胞。培養細胞を１時間 以下のように処理した：通常免疫リポソーム（三角）；立体的安定化（２モル％ ＰＥＧ−ＰＥ）免疫リポソーム（黒丸）；コントロール（無関係抗体）立体的安 定化（２モル％ＰＥＧ−ＰＥ）免疫リポソーム（白丸）；または遊離ドキソルビ シン単独（黒四角）。免疫リポソームは６０〜７０μｇ抗体／μｍｏｌリン脂質 、および５５〜８０μｇドキソルビシン／μｍｏｌリン脂質を含み、抗体／ドキ ソルビシン比は０．８〜１．２であった。細胞は、方法の項で述べるように処理 後３日で計測した。 好ましい実施態様の説明 定義および一般的パラメーター 以下の定義は、本明細書の発明を説明するために用いられる種々の用語の意味 および範囲を説明し既定するために記載される。 本明細書では以下の略語が用いられる：ＤＯＸ、ドキソルビシン；Ｃｈｏｌ、 コレステロール；ＰＡ、ホスファチジン酸；ＰＣ、ホスファチジルコリン；ＰＩ 、ホスファチジルイノシトール；ＳＭ、スフィンゴミエリン；Ｍ−ＤＰＥ、マレ イミド誘導ジパルミチオールエタノールアミン；ＰＢＳ、燐酸緩衝食塩水；ＬＵ Ｖ、大型単層小胞；ＭＬＶ、多層小胞；ＰＥ、ホスファチジルエタノールアミン ；ＰＥＧ、ポリエチレングリコール；ＰＥＧ−ＰＥ、ポリエチレングリコール誘 導ホスファチジルエタノールアミン。 “両親媒性小胞形成脂質”という用語は、例えばリン脂質に代表されるような 、疎水性および極性ヘッド基部分を有し、さらに単独で偶発的に水中で二層小胞 を形成することができる脂質か、または（ｂ）リン脂質と結合して脂質二重層に 安 定的に取り込まれ、その際、当該二重膜の内部疎水領域とその疎水部分が接触し 、さらにその極性ヘッド基部分が当該膜の外部極性表面に向かって並んでいる一 切の両親媒性脂質を含むことを意図している。後者のタイプの小胞形成脂質の例 はコレステロールおよびコレステロール誘導体、例えば硫酸コレステロールおよ びヘミコハク酸コレステロールである。 本明細書で用いられるように、“特異的な結合”という用語は、共有もしくは 非共有反応または共有および非共有反応の組合せによって仲介される、酵素／基 質、レセプター／作動薬、抗体／抗原、およびレクチン／炭水化物のような対合 形成種の間で生じる結合を指す。当該２種の反応が非共有結合による複合体を形 成する場合は、生じた結合は典型的には静電気的水素結合または親油性反応の結 果である。したがって、“特異的な結合”は対合形成種の間で生じ、この場合、 抗体／抗原または酵素／基質反応の特徴を有する結合複合体を生じる２つのもの の間で相互反応が存在する。特に、特異的な結合は、対の一方と特定の種とが結 合し、当該結合するものの相手方が所属する化合物の同一類内の他の種とは結合 しないことを特徴とする。したがって、例えば抗体は、好ましくはただ１つのエ ピトープと結合し、タンパク質の同一類内の他のエピトープとは結合しない。 本明細書で用いられる“リガンド”または“向標的部分”という用語は、一般 に特定の標的分子と特異的に結合し、上記のように結合複合体を形成することが できる全ての分子を指す。したがって、リガンドおよびその対応する標的分子は 特異的結合対を形成する。その例には、抗体、リンホカイン、サイトカイン、レ セプタータンパク質（例えばＣＤ４およびＣＤ８）、可溶化レセプタータンパク 質（例えば可溶性ＣＤ４）、ホルモン、増殖因子および所望の標的細胞と特異的 に結合するようなもの、並びに対応する核酸と塩基対相補性を介して結合する核 酸が含まれるが、ただしこれらに限られるものではない。特に好ましい向標的部 分には抗体および抗体フラグメント（例えばＦａｂ’ドメイン）が含まれる。 “免疫リポソーム”という用語は抗体または抗体フラグメントを含むリポソーム を指し、当該抗体または抗体フラグメントは、溶液中に存在する可能性があるか 、または細胞表面に結合している可能性がある特定の“標的”分子と当該リポソ ームを特異的に結合させることができる向標的部分として作用する。当該標的 分子が、典型的には比較的過剰に（例えば１０倍以上）、かつ特定の細胞型、ま た別には、全てが特定の生理的状態を発現している多数の細胞型に付随して見出 されるものである場合、当該標的分子は、当該細胞型の“特徴的マーカー”また は当該生理的状態の“特徴的マーカー”と呼ばれる。したがって、例えば癌の特 徴は、特定マーカー、例えば乳癌の場合はＨＥＲ２（c-erbB-2/neu）プロトオン コジーンの過剰発現ということができる。 本明細書で用いられるように“親水性ポリマー”とは、脂質分子に結合した長 鎖の高度に水和した可撓性天然ポリマーを指す。その例には、ポリエチレングリ コール修飾またはポリプロピレングリコール修飾の脂質ＰＩもしくはＣＳ、また はガングリオシドＧＭ₁が含まれるが、ただしこれらに限られるものではない。 “モルパーセント”という用語は、リポソーム中の親水性ポリマーの百分率を 指す場合は、別に記載が無いかぎりリポソーム中の総脂質に対して表される。し たがって、例えばホスファチジルコリン（ＰＣ）対コレステロール比が１５０： １００であるリポソームでは、親水性ポリマー（例えばＰＥＧ）の４モルパーセ ントはＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＰＥＧの比が約１５０：１００：１０であることを表す であろう。 “分裂増殖”という用語は細胞の分割または有糸分裂を指す。分裂増殖は標準 的アッセイ、例えば放射性ヌクレオチド（チミジン）の取り込みによって、また は直接観察によって測定できる。 薬剤配送における免疫リポソーム 実施態様の１つでは、本発明は、治療薬をホストの特異的組織へ選択的に配送 する免疫リポソームおよびこれらのリポソームの使用方法を提供する。本発明の リポソームは、標的組織細胞の細胞質中への当該リポソームの内在化を最適化さ せる組成物を用いる。“内在化を最適化させる”または“最適内在化”という語 句は、それによって標的細胞の細胞質への最大の配送が達成され、したがって最 大の治療効果が達成されるようなリポソーム内容物の配送を指すために用いられ る。細胞質への免疫リポソームの内在化は、リポソームの血中半減期、リポソー ムのその標的細胞の認識および結合能力、並びに当該標的細胞細胞質中へのリポ ソームの取り込みの関数であることは理解されていろ。親水性ポリマーのリポソ ームへの添加は、リポソームの集塊形成（凝集）およびＲＥＳによるリポソーム の取り込みの両方を低下させることによって血中半減期を高めることは周知であ る。高濃度の親水性ポリマーは、向標的部分またはリガンドによる認識と結合に 干渉し、さらにその後の標識細胞による取り込みに干渉し、それによって標的細 胞によるリポソーム内容物の内在化を減少させると一般的に考えられる。当該細 胞の細胞質への最適内在化とは、親水性ポリマーおよび向標的のために適切なも のを全く欠いているリポソームの半減期より極めて長い血中半減期をなお維持し ながら、標的細胞細胞質への最大取り込みが達成される状態を指す。 特に本発明は部分的には予想外の発見に依拠するが、これは、親水性ポリマー （例えばＰＥＧ−修飾脂質）を総（小胞形成）脂質の約３．６モルパーセントま での量で含むリポソームは、予想外の効率で標的細胞の細胞質に内在化され、一 方、親水性ポリマーを欠くリポソームで認められる血中半減期よりも実質的に長 い血中半減期を維持するというものである。これは、リポソームの１つまたは２ つ以上の脂質成分と結合したＦａｂ’フラグメントを含む免疫リポソームの場合 に特に言えることである。 さらに、３．６モルパーセントまでの親水性ポリマーを含むリポソームが向標 的部分として抗体のＦａｂ’フラグメントと結合した場合、当該リポソームは、 Ｆａｂ’単独の場合よりも高い細胞特異性および結合親和性を示すということも また予想外の発見であった。実際、本発明の免疫リポソームによって達成される 結合特異性は完全な抗体の結合親和性に匹敵しうるものである。完全な抗体は、 抗体の特異性と反応迅速性（avidity）を大きく左右する１対の可変ドメイン“ アーム”を含む四量体であるので、この結果は特に驚くべきことである。１本の “ア一ム”のみから成るＦａｂ’領域は典型的には完全な抗体の有する特性と反 応迅速性を欠いている。したがって、Ｆａｂ’フラグメントは典型的には貧弱な 向標的部分を形成すると予想される。 Ｆａｂ’フラグメントはリポソームのいずれの部分にも結合できるが、一方Ｆ ａｂ’が親水性ポリマー（例えばポリエチレングリコール）の遠位端に結合する 場合は、たとえ高レベルの親水性ポリマー（例えば総リン脂質の１５モルパーセ ントまで、より好ましくは総リン脂質の約１０から１２モルパーセント）が存在 していたとしても標的細胞による高い水準のリポソーム内在化が達成されるとい うことは本発明の驚くべき発見であった。したがって、好ましい実施熊様の１つ では、本発明は標的細胞によって内在化されるリポソームを提供するが、当該リ ポソームは、親水性ポリマー（例えばポリエチレングリコール）の遠位端に結合 させたＦａｂ’フラグメントを含む。当該Ｆａｂ’フラグメントは好ましくは大 半の親水性ポリマーには結合されない。典型的には、Ｆａｂ’は、約１から約２ ０％の親水性ポリマーに、より好ましくは約４から約１０モルパーセントの親水 性ポリマーに、最も好ましくは約６から約１０モルパーセントの親水性ポリマー にのみ結合されるであろう。したがってＦａｂ’フラグメントを含む親水性ポリ マー（例えばＰＥＧ−Ｆａｂ’）は、したがって総リン脂質の０．１から２．０ モルパーセント、より好ましくは約０．４から約１．０モルパーセント、最も好 ましくは総リン脂質の約０．６から約１．０モルパーセントで存在する。 本発明の免疫リポソームは、高レベルの標的特異性を維持し、（治療薬を運ぶ ）リポソームそれ自体を効果的に内在化し、それによって治療薬の溶液中への顕 著な損失または該治療薬のエンドソーム／リソソーム経路での分解を回避して、 親水性ポリマーを欠くリポソームと比較してより長い血中半減期を維持し標的細 胞細胞質への当該治療薬の配送を最適化させる。本発明のリポソームは、したが って特異的な標的細胞に治療薬を配送する担体として特に有用である。細胞増殖抑制物質としての免疫リポソーム 本発明はまた、腫瘍細胞の分裂増殖を抑制するために用いられ、したがって増 殖抑制治療薬を被包化することなく抗腫瘍活性を提供することができる増殖抑制 免疫リポソームを提供する。実際、本発明の増殖抑制免疫リポソームは、それら が治療薬を含まないときに有効である。一般に、本発明の増殖抑制免疫リポソー ムは、特徴的なマーカーをもつ細胞と特異的に結合する抗体のＦａｂ’ドメイン および両親媒性小胞形成脂質を含む。特に当該リポソームは抗ＨＥＲ２単クロー ン性抗体のＦａｂ’ドメインと結合させることができる。好ましい実施態様では 、当該抗体はヒト単クローン性抗ＨＥＲ２抗体のＦａｂ’フラグメント(rhuMAbH ER2-Fab')である。溶液中の遊離rhuMAbHER2−Ｆａｂ’と異なり、一価のＦａｂ ’フラグメントのリポソーム（膜）固着によって二価のrhuMAbHER2に匹敵する抗 分 裂増殖活性および抗腫瘍活性がもたらされる。溶液中の抗体rhuMAbHER2−Ｆａｂ ’はこの特性を持たない。一般的に、抗ＨＥＲ２免疫リポソーム中のＦａｂ’フ ラグメントの膜固着は、おそらくは腫瘍細胞表面上のｐ１８５^HER2の架橋を可能 にすることによってこの抗分裂増殖活性を付与すると考えられる。 Ｆａｂ’フラグメントはリポソームのいずれの部分にも結合させることができ る。したがって、例えば実施態様の１つでは、当該Ｆａｂ’は直接リポソームに 結合されるが、一方、別の実施態様では当該Ｆａｂ’は親水性ポリマー（例えば ＰＥＧ）に結合させることができる。 上記で示したように、増殖抑制免疫リポソームは増殖抑制剤を含まない。“増 殖抑制剤”とは、当該薬剤が投与された細胞の増殖速度を減少させる化学物質を 指す。極端な事例では、増殖抑制剤はそれが投与された細胞に対して細胞毒性を 有するかもしれない。本明細書で用いられるように、細胞の増殖速度とは細胞の 分裂速度を指す。分裂速度の増加は典型的には代謝速度の増加に付随し、したが って分裂速度は（例えば標識された代謝前駆物質（例えばトリチウム標識チミジ ン）の取り込みによって）代謝速度を検出することによってアッセイできる。し たがって、成長速度または分裂速度の増加は代謝速度の増加を示すと考えられ、 逆もまた同様である。 増殖抑制剤は当業者には周知で、ドキソルビシン、リシンＡ、ゲロニンが含ま れるが、ただしこれらに限定されない。いくつかの組成物（例えば抗生物質）は それらの主要な活性に付随する結果として僅かの増殖抑制活性を示すかもしれな い。そのような組成物は本明細書では増殖抑制剤とは見做されない。“増殖抑制 治療薬を含まないリポソーム”という語句は、本発明の増殖抑制免疫リポソーム で得られる細胞の成長および分裂の抑制が、リポソーム／Ｆａｂ’構築物それ自 体の結果であり、リポソーム内容物の結果ではないという事実を捉えることを意 図している。したがって、本明細書で用いられる増殖抑制剤は、増殖抑制免疫リ ポソームに存在するとき、一切の治療薬または増殖抑制剤を欠く同じ免疫リポソ ームの投与によって認められる細胞分裂速度の減少より少なくとも１０％より大 きい細胞分裂速度の減少を生じる リポソームが治療薬を全く含まず、したがって“空”のリポソームを投与した 場合でさえ、本発明の増殖抑制リポソームは細胞の成長および分裂を抑制するが 、一方、当業者には、増殖抑制治療薬以外の治療薬を被包化し、それによって二 重の活性、追加活性、更なる追加活性を示すリポソームを達成することが望まし いことは理解されよう。したがって、例えば抗生物質を担持した免疫リポソーム は、標的細胞の成長および分裂を抑制する能力と同様に抗生物質活性も合わせて 示すであろう。 本発明の増殖抑制リポソームおよび治療薬含有免疫リポソームは、腫瘍細胞の 分裂増殖を抑制するために、または広範囲のホストで特定の細胞を標的として治 療薬を送り込むために用いることができる。好ましいホストには哺乳類の種、例 えばヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ゲッ歯類、ラルゴ モルフ（largomorphs）などが含まれる。 リポソーム組成物 一般に、本発明の免疫リポソームは、１つまたは２つ以上の小胞形成脂質、向 標的部分として作用する抗体のＦａｂ’ドメイン、および特に治療薬配送免疫リ ポソームの場合には、親水性ポリマーを含む。一般的には、小胞形成脂質は、治 療薬が存在する場合はそれを被包化する二重層を形成するために作用し、親水性 ポリマーはリポソームの集塊形成の防止およびＲＥＳによるリポソームの取り込 みの低下のために作用してそれによって血中半減期を延長し、リガンドはリポソ ームを標的（すなわち特徴的マーカー、当該マーカーに対して当該リガンドは特 異的である）を含む細胞または組織とリポソームを特異的に結合させるために作 用する。Ｆａｂ’フラグメントの使用と合わせた低いモル百分率の親水性ポリマ ーによって、リポソームが特異的に標的に向かうことが可能になり、さらに予想 外にも完全なリポソームが、標的細胞の細胞質内に高レベルで内在化されること になった。 Ａ）小胞形成脂質 小胞形成脂質は、好ましくは２つの炭化水素鎖（典型的にはアシル鎖および極 性ヘッド基）をもつ脂質である。この部類に含まれるものは、リン脂質、例えば ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホ スファチジン酸（ＰＡ）、ホファチジルイノシトール（ＰＩ）およびスフィンゴ ミエリン（ＳＭ）で、この場合２つの炭化水素鎖は典型的には長さが約１４〜２ ２炭素原子で、さらに様々な程度の不飽和を有するか、または１４〜１８炭素鎖 の飽和リン脂質である。またこの部類に含まれるものは、糖脂質（例えばセレブ ロシドおよびガングリオシド）である。 好ましい実施態様では、リポソーム中の主要脂質成分はホスファチジルコリン である。多様な鎖の長さおよび多様な飽和度をもつ種々のアシル鎖基を有するホ スファチジルコリンは利用可能であるか、または周知の技術によって分離もしく は合成できる。一般に、リポソームが濾過滅菌の目的のために特に約０．３ミク ロン未満の大きさでなければならないときは、飽和度の低いホスファチジルコリ ンの方がより容易に大きさによって分けることができる。炭素鎖の長さがＣ₁₄か らＣ₂₂の飽和脂肪酸を含むホスファチジルコリンが好ましい。一または二不飽和 脂肪酸並びに飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸の混合物をもつホスファチジルコリ ンもまた用いることができる。本発明で有用なリポソームはまた、コリン以外の ヘッド基（例えばエタノールアミン、セリン、グリセロールおよびイノシトール ）を有するスフィンゴミエリンまたはリン脂質を含むことができる。特に、本発 明の方法および組成物で有用なリポソームの生成に適切なリン脂質には、例えば ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、レシチン、β，γ−ジパ ルミトイル−α−レシチン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、ホス ファチジン酸、Ｎ−(２，３−ジ(９−（Ｚ）−オクタデセニルオキシ))−プロプ −１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物、ホスファチジルエタ ノールアミン、リソレシチン、リソホスファチジルエタノールアミン、ホスファ チジルイノシトール、セファリン、カルジオリピン、セレブロシド、燐酸ジセチ ル、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン 、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグ リセロール、パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルコリン、ジ−ステアロ イル−ホスファチジルコリン、ステアロイル−パルミトイル−ホスファチジルコ リン、ジ−パルミトイル−ホスファチジルエタノールアミン、ジ−ステアロイル −ホスファチジルエタノールアミン、ジ−ミリストイル−ホスファチジルセリン 、ジ−オレイル−ホスファチジルコリンなどが含まれる。燐非含有脂質もまた本 発 明の組成物のリポソームで用いることができる。これらには、例えばステアリル アミン、ドセシルアミン、パルミチン酸アセチル、脂肪酸アミドなどが含まれる 。本発明のリポソームでの使用に適切な別の脂質は当業者には周知で、種々の周 知の刊行物に記載されている（例えば以下の刊行物であるが、これらはともに援 用により本明細書に含まれる：「マッカチョンの洗剤と乳濁剤(McCutcheon's De tergents and Emulsifiers)」および「マッカチョンの機能性素材(McCutcheon's Functional Materials)」、Allured Publishing Co.刊、リッジウッド、ニュー ジャージ）。好ましいリポソームは、ステロール（好ましくはコレステロール） を０．１から１．０のモル比（コレステロール：リン脂質）で含むであろう。最 も好ましいリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン／コレステロール、ジス テアロイルホスファチジルコリン／コレステロール、ジパルミトイルホスファチ ジルコリン／コレステロール、およびスフィンゴミエリン／コレステロールであ る。少量（すなわち１０％未満）の他の誘導脂質もこれら上記の組成物を有する リポソームにしばしば存在する。 本発明の重要な特徴にしたがえば、小胞形成脂質は比較的流動性の脂質でも、 また比較的硬質な脂質でもよい。前者は、典型的には当該脂質相が、液体から液 体結晶質への比較的低い融点（例えば室温または室温以下）を有することを意味 し、後者は、当該脂質が比較的高い融点（例えば６０℃まで）を有することを意 味する。一般に、より硬質な（すなわち飽和）脂質は、脂質二重層構造において 膜剛性に寄与し、またより大きな二重層の血中での安定性にも寄与する。他の脂 質成分（例えばコレステロール）もまた脂質二重層構造の膜剛性および安定性に 寄与することが知られている。上記で述べたように、長鎖（例えばＣ₁₄〜Ｃ₂₂） 飽和脂質＋コレステロールが標的組織（例えば固形腫瘍）に治療用組成物を配送 する好ましい組成物の１つである。なぜならば、これらのリポソームは、それら が血流中を循環しているときに血漿中に薬剤を遊離する傾向を持たないからであ る。アシル鎖が種々の飽和度をもつリン脂質は市販ルートで入手できる。例えば 、卵のホスファチジルコリン（ＥＰＣ）はアバンチポーラリピド（Avanti Polar Lipids，Alabaster，アラバマ）から購入でき、水素添加ダイズホスファチジル コリン（ＨＳＰＣ）はナッターマン(Natterman，コローン、ドイツ)から入手で き る。また別には、リン脂質は公表された方法にしたがって調製できる（例えば、 D．M．Small，「脂質の物理化学（The physical chemistry of lipids）」、Ple num Press刊、ニューヨーク(1986);D.D．Laslc，「リポソーム：その物理学から 応用まで(Liposomes:from physics to applications)」、Elsevier刊、アムステ ルダム、ニューヨーク(1993)）。 Ｂ）親水性ポリマー 上記で述べたように、親水性ポリマーの存在はリポソームの血中半減期を延長 させる傾向を有する（例えば次の文献を参照された：Woodleら、Biochim．Bioph ys．Acta.，1113:171-199(1992))。したがって、親水性ポリマー（例えばポリエ チレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質またはガングリオシドＧ_M1）をリポソーム に添加することがしばしば所望される。そのような成分の添加は、向標的部分が リポソームに結合するときにリポソームが凝集するのを防止する。これらの成分 はまた当該リン脂質の循環寿命を増加させる手段を提供する。しかしながら、親 水性ポリマーはＲＥＳによるリポソームの取り込みを減少させ、それによって血 中半減期を延長させる一方で、同様に標的細胞による取り込みも付随して減少す ることが認められた。小胞形成脂質（コレステロールを除く）の１から４モルパ ーセントの濃度の親水性ポリマー（例えばＰＥＧ）は、適切な血中半減期と合わ せて最適な細胞取り込みを提供するということは、本発明の予想外の発見であっ た。 種々の多くの方法をリポソームへの取り込みのためにＰＥＧ調製に用いること ができる。好ましい実施態様では、ＰＥＧはＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノー ルアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）またはＰＥＧ誘導ジステアロイルホスファチジルエタ ノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）として取り込まれる。ＰＥＧ−ＰＥを調製す る方法は周知で、典型的には活性化メトキシＰＥＧ（ただ１つの反応性末端をも つ）およびＰＥを用いることを必要とする。したがって、ＰＥＧ−スクシンイミ ジルコハク酸塩を塩基有機溶媒中で反応させることができる(Klibanovら、FEBS Lett.，268:235-237(1990))。ＰＥＧ−ＰＥの特に好ましい調製方法は、ＰＥＧ とカルボニルジイミダゾルとの反応とそれに続くＰＥの添加を基にしている(Woo dleら、Proc．Intern．Symp．Control．Rel．Bioact．Mater.，17:77-78(1990); Papahadjopoulosら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88:11460-11464(1991);Alle nら、Biochim．Blophys．Acta.，1066:29-36(1991);Woodleら、Biochim．Biophy s．Acta.，1105:193-200(1992);Woodleら、Period．Biol.，93:349-352(1991)) 。同様に、塩基性有機溶媒中の塩化シアヌル活性化ＰＥＧも文献に記載されてい る(Blumeら、Biochim．Biophys．Acta.，1029:91-97(1990)および米国特許第521 3804号(これは参照により本明細書に含まれる))。完全に異なる手法は予め形成 したリポソームにＰＥＧを結合させることによるもので、塩化トレシル活性化Ｐ ＥＧを用い、これを続いてＰＥ含有リポソームに高ｐＨ条件下で添加する(Senio rら、Biochim．Biophys．Acta.，1-62:77-82(1991))。誘導ＰＥＧもまた市販ル ートで入手できる。したがって、例えばＰＥＧ−ＰＥはアバンチポーラリピド（ Avanti Polar Lipids，Alabaster，アラバマ）、またはリポソームテクノロジー (Liposome Technology，Menlo Park，カリフォルニア)から入手できる。他の多 くの結合も利用できることは当業者には理解されるところである。 Ｃ）Ｆａｂ’抗体フラグメント 好ましい実施態様では、本発明のリポソームは抗体のＦａｂ’領域と共役させ られるが、当該領域は、Ｆａｂ’抗体フラグメントを誘導した標的分子（例えば 特徴的マーカー）をもつ標的細胞とリポソームを特異的に結合させる向標的部分 として作用する。一般的には、抗体のＦａｂ’領域は、抗体の一方のアームの可 変領域およびＣ_H１領域を含む単量体を表す。 “抗体”とは、実質的に免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の フラグメントによってコードされた１つまたは２つ以上のポリペプチドから成る タンパク質を指す。認定された免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、ア ルファ、ガンマ、デルタ、エプシロンおよびミュー定常領域遺伝子とともに、無 数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、カッパまたはラムダの いずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたは エプシロンとして分類されるが、これらは順にそれぞれ免疫グロブリンクラスの ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを規定する。 基本的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は四量体を含むことが分かってい る。各四量体は２つの同一のポリペプチド鎖対を含み、各対は１つの“軽鎖”（ 約 ２５ｋＤ）および１つの“重鎖”（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ−末 端は、主に抗原認識に必要な約１００から１１０またはそれ以上のアミノ酸の可 変領域を規定する。可変軽鎖（Ｖ_L）および可変重鎖（Ｖ_H）という用語はそれぞ れこれら軽鎖および重鎖を指す。 抗体は、完全な免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼの消化によ って生成された多数のよく性状が調べられたフラグメントとして存在するかもし れない。特に、ペプシンは、ヒンジ領域内のジスルフィド結合より下で抗体を消 化しＦ(ａｂ)'₂を生じる。Ｆ(ａｂ)'₂は、それ自体Ｖ_H−Ｃ_H1にジスルフィド結 合によって結合した軽鎖であるＦａｂの二量体である。Ｆ(ａｂ)'₂は温和な条件 下で還元され、ヒンジ領域内のジスルフィド結合が破壊され、それによってＦ( ａｂ)'₂二量体はＦａｂ’単量体に変換される。Ｆａｂ’単量体は、本質的には ヒンジ領域の一部分をもつＦａｂである（抗体フラグメントのより詳細な専門用 語については以下を参照されたい：「基礎免疫学（Fundamental Immunology）」 、W．E．Paul編、Raven Press刊、ニューヨーク(1993)）。Ｆａｂ’ドメインが 無傷の完全な抗体の消化の関係から規定される一方で、そのようなＦａｂ’フラ グメントは、化学的または組換えＤＮＡ技術のいずれかによって新規に合成でき ることは当業者には理解されよう。 本発明で用いられるＦａｂ’領域は、動物（特にマウスまたはラット）または ヒト起源の抗体に由来するか、またはキメラ（Morrisonら、Proc．Natl．Acad． Sci．USA，81:6851-6855(1984)、この文献は参照により本明細書に含まれる）も しくはヒト化(Jonesら、Nature，321:522-525(1986)およびイギリス特許出願公 告公報第8707252号、両文献とも参照により本明細書に含まれる）されていても よい。 Ｆａｂ’領域は、リポソーム内容物を配送することを所望する細胞の表面分子 または特徴的マーカーと特異的に結合するように選択される。分子は、それが細 胞型また別にはその全てが特定の生理的状態（例えば形質転換）を発現している 多数の細胞型に付随して見出される場合、当該細胞、組織または生理学的条件に 特徴的である。固有の特徴的マーカーは、好ましくは特定の組織もしくは細胞型 の細胞表面に、または特定の生理的状態を発現している組織もしくは細胞型の表 面に見出され、当該生物の他の組織もしくは細胞型には見出されない。しかしな がら、それほどの当該マーカーの特異性レベルが要求されないことがしばしばで あることは当業者には理解されよう。例えば、特徴的な細胞表面マーカーは、非 標的組織のみが当該リポソームに接近可能でない場合十分な組織特異性を示すで あろう。また別には、有効な特異性は、他の組織と比較したとき標的組織におけ るマーカーの過剰発現によって達成できるであろう。これによって標的組織によ る優先的な取り込みがもたらされ、有効な組織特異性が得られるであろう。した がって、例えば多くの癌は、細胞表面マーカー(例えば乳癌の場合はＨＥＲ２(c- erbB-2，neu)プロトオンコジーンによってコードされるレセプター)の過剰発現 によって特徴づけられる。 標的として所望される個々の組織にしたがって、リポソームに良好な特徴的マ ーカーを提供する多数の細胞表面マーカーが存在することは当業者には理解され るところであろう。これらの細胞表面マーカーには、炭水化物、タンパク質、糖 タンパク質、ＭＨＣ複合体、およびレセプタータンパク質（例えばＨＥＲ、ＣＤ ４およびＣＤ８レセプタータンパク質）とともに他の増殖因子レセプタータンパ ク質が含まれるが、ただしこれらに限定されるものではない。 増殖因子レセプターは特に好ましい特徴的細胞表面マーカーである。増殖因子 レセプターは、特異的に増殖因子と結合し、それによって個々の増殖因子に特徴 的な細胞反応を仲介する細胞表面レセプターである。本明細書で用いられる“増 殖因子”という用語は、細胞の分裂もしくは分化を活性化もしくは刺激するか、 または運動性もしくはタンパク質の分泌のような生物学的反応を刺激するタンパ ク質またはポリペプチドリガンドを指す。当業者には増殖因子はよく知られてお り、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮性増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン 様増殖因子（ＩＧＦ）、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）、線維芽細胞増殖因 子（ＦＧＦ）、インターロイキン２（ＩＬ２）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、イン ターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン４（ＩＬ４）、インターロイキン １（ＩＬ１）、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン７（ＩＬ７） 、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー 刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、エ リ スロポイエチンなどが含まれるが、ただしこれらに限定されるものではない。本 明細書で用いられる増殖因子という用語にはサイトカインおよびコロニー刺激因 子が含まれるということは当業者には理解されよう。 特に好ましいマーカーは、増殖因子レセプターのＨＥＲ類に見出される。さら に具体的には、ＨＥＲＩ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４がより好ましく、 ＨＥＲ２が最も好ましい。ＨＥＲレセプターは、それ自体高度に特異的な抗体標 的を提供するタンパク質のチロシンキナーゼを含む。したがって実施態様の１つ では、ＨＥＲ２のＰ１８５チロシンキナーゼは、本発明の免疫リポソームで用い られるＦａｂ’抗体に対して最も好ましい標的を提供する。 特徴的マーカーは天然に存在するマーカーである必要はなく、むしろ個々の標 的細胞に導入できることが必要であることは理解されよう。これは、細胞または 組織に特定のマーカーを直接付加することによって達成できるが、例えば特定の 標的組織にマーカーを直接注射するか、また別には標的組織によって選択的に取 り込まれるマーカーを生物体全体に投与することによって実施される。ある実施 態様では、マーカーは、発現カセット中の核酸によってコードされる遺伝子産物 であろう。当該マーカー遺伝子は、特定の標的細胞でのみ活性を有するプロモー ターの制御下にあるであろう。したがって、当該発現カセットを含むベクター導 入は、当該特定の標的細胞でのみ当該マーカーの発現をもたらすであろう。特徴 的マーカーを標的細胞に導入するために組換えＤＮＡ技術を用いる多数の手法が あることは当業者には理解されよう。 好ましい実施態様の１つでは、当該向標的部分は、増殖因子レセプターの生成 物または成分、特にＨＥＲ２(c-erbB-2，neu)プロトオンコジーンの生成物と特 異的に結合するであろう。向標的部分がＨＥＲ２によってコードされる増殖因子 レセプター−チロシンキナーゼであるタンパク質ｐ１８５^HER2と結合することが 特に好ましい。タンパク質ｐ１８５^HER2は乳癌で通常過剰に発現される（Slamon ら、Science，235:177-182(1987)）。向標的部分の、他の適切な標的には、ＥＧ ＦＲ（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４、これらレセプターの組合せ、並び に他の癌に付随するマーカーが含まれるが、ただしこれらに限られるものではな い。他の興味がもたれる抗体には、ＢＰ９６(Friedmanら、Cancer Res.，53:33 4-339(1993))、ｅ２３からｅｒｂＢ２(Batraら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA， 89:5867-5871(1992))、前立腺癌のＰＲ１(Brinkmannら、Proc．Natl．Acad．Sci ．USA，90:547-551(1993))および卵巣癌のＫ１(Changら、Int．J．Cancer，50:3 73-381(1992))が含まれる、ただしこれらに限られるものではない。 本発明の免疫リポソームは、当業者に周知の種々の技術によりＦａｂ’抗体ド メイン部分をリポソームに取り込ませることによって調製できる。例えば、ビオ チン共役Ｆａｂ’はストレプトアビジン含有リポソームと結合させることができ る。また別にはビオチン付加Ｆａｂ’は、アビジンまたはストレプトアビジンリ ンカーによってビオチン誘導リポソームに共役させることができる。したがって 、例えばビオチン付加単クローン性抗体はビオチンを付加して、アビジンリンカ ーの手段によりビオチン付加ホスファチジルエタノールアミンを含むリポソーム に結合させられた（例えば次の文献を参照のこと:Ahmadら、Cancer Res.，52:48 17-4820(1992)、この文献は参照により本明細書に含まれる）。リポソーム当た り典型的には約３０から１２５、より好ましくは典型的には約５０から１００Ｆ ａｂ’分子が用いられる。 好ましい実施態様では、向標的部分は直接リポソームに共役させることができる 。直接共役させる手段は当業者には周知である。例えば次の文献を参照されたい :G．Gregoriadis，「リポソーム技術（Liposome Technolog）」、（CRC Press刊 、Boca Raton，フロリダ(1984)）およびD.D．Lasic，「リポソーム：その物理学 から応用まで(Liposomes:from physics to applications)」、（Elsevier刊、ア ムステルダム、ニューヨーク(1993)）。特に好ましいものはチオエーテル連結に よる共役である。これは、抗体をマレイミド誘導脂質(例えばマレイミド誘導ホ スファチジルエタノールアミン（Ｍ−ＰＥ）またはジパルミトイルエタノールア ミン(Ｍ−ＤＥＰ))と反応させることによって達成できる。この手法はマーチン らにより詳細に記載されている（Martinら、J．Biol．Chem.，257:286-288(1982 )、この文献は参照により本明細書に含まれる）。 別の好ましい実施態様では、向標的部分（例えばＦａｂ’フラグメント）は親 水性ポリマー（例えばＰＥＧ）に結合される。向標的分子をポリマーリンカーに 結合させる手段は当業者には周知である(例えば以下を参照のこと：「単クロー ン性抗体:基礎と応用(Monoclonal Antibodies: Principles and Applications)」 、第４章、Birch & Lennox編、John Wiley & Sons，Inc.刊、ニューヨーク(1995 );Blumeら、Biochem．Biophys．Acta.，1149:180-184(1993))。特に好ましい実 施態様では、Ｆａｂ’フラグメントはＦａｂ’の−ＳII基を介してマレイミド誘 導ＰＥＧに連結される。リンカー基を供給するために、標準的な方法にしたがっ てジステアロイルホスファチジルエタノールアミンおよび異種二官能基ＰＥＧ誘 導体、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−ＰＥＧ−マレイミドからα−ジステア ロイルホスファチジルエタノールアミノカルボニル−ω−マルイミドプロピオニ ルアミドポリエチレングリコールを合成する。このＰＥＧ−ＰＥのマレイミド誘 導体を前述および下記で述べるようにリポソームの調製物に混合し、Ｆａｂ’フ ラグメントをｐＨ７．２でスルフヒドリル基を介してリポソームと共役させるこ とができる。 リポソームの調製 例えば以下の文献に記載されているように多様な方法がリポソームの調製に用 いられる:Szokaら、Ann．Rev．Biophys．Bioeng.，9:467(1980);米国特許第4186 183号、4217344号、4235871号、4261975号、4485054号、4501728号、4774085号 、4837028号、4946787号；ＰＣＴ出願公告公報WO91/17424号；Szoka & Papahadj opoulos，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，75:4194-4198(1978);Deamer & Bangham ，Biochim．Biophys．Acta.，443:629-634(1976);Fraleyら、Proc．Natl．Acad ．Sci．USA，76:3348-3352(1979);Hopeら、Biochim．Biophys．Acta.，812:55-6 5(1985);Mayerら、Biochim．Biophys．Acta.，858:161-168(1986);Williamsら、 Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85:242-246(1988)；「リポソーム(Liposomes)」 、Marc J．Ostro編、Marcel Dekker，Inc.,刊、ニューヨーク(1983)、第１章；H opeら、Chem．Phys．Lip.，40:89(1986)（これらは全て参照により本明細書に含 まれる）。適切な方法には、例えば、音波破砕、噴射、高圧／均質化、微細流動 化、洗剤透析、小型リポソーム小胞のカルシウム誘発融合、およびエーテル注入 法が含まれろが、全て当技術分野では周知である。１つの方法によって多様なサ イズの多重薄膜小胞が生成される。この方法では、小胞形成脂質を適切な有機溶 媒または溶媒系に溶解し、真空または不活性気体下で乾燥させて薄い脂質フィル ムを 形成する。所望される場合は、当該フィルムを適切な溶媒（例えば第三ブタノー ル）に再溶解し、続いて凍結乾燥させてより均質な脂質混合物を生成する。これ はさらに容易に水和することができる粉末様の形状である。このフィルムを緩衝 水溶液で覆い、典型的には１５〜６０分震盪して水和させる。得られる多重薄膜 小胞のサイズ分布は、より激しい震盪状態の下で脂質を水和させることによって 、またはデオキシコレートのような可溶化洗剤を添加することによって一層小さ なサイズへとシフトさせることができる。 好ましい実施態様では、多重薄膜リポソームは、報告された逆相蒸発法(Szoka & Papahadjopoulos，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，75:4194-4198(1978)）によ って製造される。 単層薄膜小胞は一般に音波破砕または噴射によって調製される。音波破砕は一 般に、氷浴中でチップ型音波発生装置（例えばブランソン(Branson)チップ型音 波発生装置）を用いて実施される。典型的には、懸濁物は数回の音波破砕サイク ルに付される。噴射は生体膜噴射装置(例えばリペックスバイオメンブレン噴射 装置(Lipex Biomembrane Extruder))によって実施できる。噴射膜の規定された 孔サイズによって特定サイズの単層薄膜リポソーム小胞を生成することが可能で ある。リポソームはまた、非対称性セラミックフィルター（例えばセラフローマ イクロフィルター（Ceraflow Microfilter、ノートン社(Norton Company，Worce ster，メリーランド)より市販）を通して噴射させて生成できる。 リポソームの調製に続いて、生成中にサイズ分けされていないリポソームを所 望のサイズ範囲を得るためにサイズ分けして比較的狭いリポソームサイズ分布を 達成することができる。０．２〜０．４ミクロンのサイズ範囲ではリポソーム懸 濁液を通常のフィルター（典型的には０．２２ミクロンフィルター）によって濾 過滅菌することができる。フィルター滅菌法は、リポソームが約０．２〜０．４ ミクロンまでサイズ分けされている場合は高処理量で実施できる。 リポソームを所望のサイズに分けるにはいくつかの技術が利用できる。サイズ 分け方法の１つは米国特許第4529561号または4737323号（これらの文献は参照に より本明細書に含まれる）に記載されている。水浴式またはプローブ式音波破砕 によってリポソーム懸濁液を音波破砕して、サイズが約０．０５ミクロン未満の 小さな単層薄膜小胞まで徐々にサイズを減少させる。別の方法は均質化（ホモジ ェナイゼーション）で、これは、大きなリポソームを小さなものに分断する剪断 エネルギーを用いる。典型的な均質化方法では、選択したリポソームサイズ（典 型的には約０．１から０．５ミクロン）が認められるまで、多層薄膜小胞を標準 的な乳濁液均質化装置中において再循環させる。リポソーム小胞のサイズは、ブ ルームフィールドが記載したように擬似電気光分散（ＱＥＬＳ）によって決定で きる（Bloomfield，Ann．Rev．Biophys．Bioeng.，10:421-450(1981)、この文献 は参照により本明細書に含まれる）。リポソームの平均直径は生成リポソームの 音波破砕によって減少させることができる。断続的音波破砕サイクルとＱＥＬＳ 測定を交互に実施して効果的なリポソーム合成を導くことができる。 小孔ポリカーボネート膜または非対称性セラミック膜を通すリポソーム噴射も また、リポソームサイズを減少させて比較的良好に限定されたサイズ分布を得る 有効な方法である。典型的には、所望のリポソームサイズが得られるまで懸濁液 を当該膜に１回または２回以上通して循環させる。リポソームをより小さな孔の 膜から連続的に噴射させ、リポソームサイズを徐々に減少させることができる。 本発明で使用するためにはリポソームは約０．０５ミクロンから約０．１５ミク ロンのサイズを有する。より好ましくはリポソームは約０．０５から０．５ミク ロンのサイズを有する。 免疫リポソームの内容物 使用できる治療薬は下記に挙げた化合物を含むいずれかの化合物である。これ らは、適切な積載率でリポソームに安定的に捕捉され、治療的に有効な用量で投 与できる（用量は下記の各化合物の後ろの括弧内に表示されている、ｍ²は体表 面積を指す）。これらは、両親媒性抗腫瘍化合物、例えば植物アルカロイドビン クリスチン（１．４ｍｇ／ｍ²）、ビンブラスチン（４〜１８ｍｇ／ｍ²）および エトポシド（３５〜１００ｍｇ／ｍ²）、並びにアントラサイクリン系抗生物質( ドキソルビシン（６０〜７５ｍｇ／ｍ²）、エピルビシン（６０〜１２０ｍｇ／ ｍ²）およびダウノルビシン(２５〜４５ｍｇ／ｍ²))を含む。水溶性抗代謝物質 （例えばメトトレキセート（３ｍｇ／ｍ²）、シトシンアラビノシド（１００ｍ ｇ／ｍ²）およびフルオロウラシル(１０〜１５ｍｇ／ｍ²))、抗生物質（例えば ブレオマイ シン（１０〜２０単位／ｍ²）、マイトマイシン（２０ｍｇ／ｍ²）、プリカマイ シン（２５〜３０μｇ／ｍ²）およびダクチノマイシン（１５μｇ／ｍ²）、並び にアルキル化剤（シクロホスファミドおよびその誘導体（３〜２５ｍｇ／ｋｇ） 、チオテパ（０．３〜０．４ｍｇ／ｋｇおよびＢＣＮＵ（１５０〜２００ｍｇ／ ｍ²）を含む）もまたこの場合に有用である。他の適切な薬剤には、アクラシノ マイシン、イダルビシン、ミトキサントロン、シスプラチンおよび他の白金II類 似体が含まれる。リポソームはまた、タキソール、タキソテア、ジヒドロキシタ キサン、カンプトテシン並びに他のタキサン誘導体および単離物を含むタキサン 系物質を含むことができる。さらに、リポソームは被包化した腫瘍治療用ペプチ ド（例えば植物または細菌由来毒素）およびタンパク質薬剤（例えばＩＬ−２お よび／またはＴＮＦ）、および／または免疫調節剤（例えばＭ−ＣＳＦ）を含む ことができる。これらは、単独でも抗腫瘍薬剤（例えばアントラサイクリン系抗 生物質）と組み合わされて存在してもよい。免疫リポソームは、フッ素化ピラミ ジンおよびプリン塩基またはヌクレオシド含むことができる。免疫リポソームは またオリゴヌクレオチドのような核酸を含むことができるが、これらは、天然ま たは修飾塩基を含み、ホスホジエステルヌクレオチド間連結または修飾ヌクレオ チド間連結（例えばホスホロチオエートまたはポリアミド連結）を有する。核酸 は、ＤＮＡまたはＲＮＡ結合による転写または翻訳を阻止するためにアンチセン スまたは三重体形成分子を用いてもよいことは当業者には理解されよう。また別 には、核酸を用いて細胞を形質転換させ、異種タンパク質の発現を誘発させても よい。この後者の場合には当該核酸は発現カセットを含むが、このカセットはプ ロモーターの制御下で発現されるべきタンパク質をコードする核酸配列を含む。 治療組成物の免疫リポソームへの積載 通常の薬剤をリポソームに積載する方法は当業者には周知である。最も一般的 な方法には、被包化技術および膜電位差積載法が含まれる。被包化技術では、リ ポソームを作製する緩衝液中に薬剤を入れる。後者の方法は、米国特許第488517 2号、5059421号および5171578号に詳細に開示されている（これらの文献は参照 により本明細書に含まれる）。 簡単に記せば、膜電位差積載法は、適切な水性媒体中に溶解させたとき荷電さ れた状態で存在することができる薬剤であれば、本質的にいずれの一般的薬剤に も用いることができる。薬剤はリポソーム膜中に割入できるように比較的親油性 であることが好ましいであろう。膜電位差は、リポソーム二重層間または向標的 部分リポソーム共役物間で生じ、薬剤はこの膜電位差の手段によってリポソーム に積載される。膜電位差は、１つまたは２つ以上の荷電種（例えばＮａ⁺、Ｋ⁺お よび／またはＨ⁺）について膜の表裏で濃度勾配をつくるこによって得られる。 この濃度勾配は、異なる内部媒体と外部媒体をもつリポソームまたは向標的部分 リポソーム共役物を生成することによって作製される。したがって、イオン化し たとき陽性に荷電される薬剤については、外部電位と比較して陰性の内部電位を 有する膜電位差を膜の表裏で作製し、一方、陰性に荷電される薬剤については反 対の向きが用いられる。 血中半減期のアッセイ 標的組織にリポソームを局在化させるために要求されることの１つは、投与後 の免疫リポソームの血中における寿命の延長である。免疫リポソームの血中寿命 の測定法の１つとして、リポソーム投与後のそれぞれの時間で求められる血液／ ＲＥＳ比がある。典型的には、標識（例えば蛍光マーカー、高密度電子試薬また は放射性マーカー）をリポソームの内部に含むかまたはリポソームを構成する脂 質と結合した状態で含む免疫リポソームをテスト生物に注射する。一定の時間後 に、当該生物を殺処分し、血中で検出される標識量（例えば発光測定またはシン チレーション計測による）を個々の組織（例えば肝または脾）に局在する量と比 較する。 血中免疫リポソームの保持タイムコースもまた、標識含有リポソームの投与後 一定間隔で血液をサンプリングして当該循環中に残留する標識量を決定すること によって簡単に求めることができる。結果は最初の投与量の部分として表すこと ができる。 標的細胞の細胞質内への取り込みのアッセイと組織分布の決定 標的細胞細胞質内への免疫リポソームの取り込みおよび内在化は、標識（例え ば蛍光マーカー、高密度電子試薬または放射性マーカー）を含む免疫リポソーム を投与し、続いて標的細胞の細胞質内の当該標的の有無を検出することによって 同様に決定できる。例えば、リポソームを構成すろ脂質に共役させた蛍光マーカ ー（例えばローダミン）を含む免疫リポソームを生物に、または簡単に培養細胞 に投与できる。続いて組織または細胞を固定し、蛍光顕微鏡を用いて蛍光を検出 できる。同様に、高密度電子標識（例えば金）を用い電子顕微鏡により検出して もよい。適切な多くの標識が有り、検出方法は標識の選択により左右されること は当業者には理解されよう。 免疫リポソームの抗分裂活性のアッセイ 本発明は、細胞表面レセプターに対して作製されたＦａｂ’向標的部分をもつ 、本質的に空の免疫リポソームを構成する増殖抑制免疫リポソームを提供する。 特に好ましいものは増殖因子レセプターである。細胞分裂の特に効果的な抑制物 質であるＦａｂ’免疫リポソームの特定は日常的なスクリーニングを用いて達成 できる。このスクリーニングは、細胞が増殖因子または他の特徴的な細胞表面マ ーカー（それに対してＦａｂ’フラグメントが作製される）をもつ細胞培養を提 供し、当該培養細胞を被験免疫リポソームと接触させ、さらに細胞分裂速度に生 じた変化を測定することを必要とする。細胞の分裂速度を測定する手段は当業者 には周知である。 例えばある手法では、分裂速度は、一定の時問における実際の細胞数における 変化を測定することによって直接評価できる。したがって、実施例３で説明する ように、腫瘍細胞（例えばSK-BR-3またはBT-474細胞）を単層培養で増殖させ、 続いて抗体濃度を基準に種々の濃度の免疫リポソームと３７℃で保温した。４日 間の持続処理の後、細胞単層培養をＰＢＳで洗浄し、クリスタルバイオレット色 素（０．５％メタノール溶液）で染色し、以前に報告(Hudziakら、Mol．Cell Bi ol.，9:1165-1172(1982)、この文献は参照により本明細書に含まれる)にしたが って相対分裂を求めた。 また別には、細胞分裂速度の増加は、典型的には代謝速度の増加を伴うことは 周知である。したがって分裂は、被験免疫リポソームに暴露した細胞の代謝速度 の変化を測定することによって間接的に評価できる。代謝速度を測定する多くの 手段は当業者には周知である。特に好ましい手法の１つは、標識した代謝前駆物 質（例えばトリチウム化チミジン）の取り込み速度を測定することである。簡単 に記せば、これは〔³Ｈ〕−チミジンを免疫リポソームを含むテスト培養および 免疫リポソームを欠くコントロール培養に与えることによって達成される。一定 時間後、細胞を採集し、細胞によって取り込まれた〔³Ｈ〕−チミジン量を標準 的技術（例えばシンチレーション計測）を用いて測定する。テスト細胞とコント ロール細胞の比較によって代謝における変化、したがって分裂速度の変化が示さ れる。 医薬組成物 本発明の免疫リポソームを含む医薬組成物は標準的な技術にしたがって調製さ れ、さらに医薬的に許容される担体を含む。一般に通常の食塩水が医薬的に許容 できる担体として用いられるであろう。他の適切な担体には、例えば水、緩衝水 、０．４％食塩水、０．３％グリシンなどが含まれるが、これらの担体は安定性 強化のために糖タンパク質（例えばアルブミン、リポタンパク質、グロブリンな ど）を含む。これらの組成物は通常の周知の滅菌技術によって滅菌できる。得ら れた水溶液は使用のために梱包されるか、または無菌的状態で濾過され凍結乾燥 させてもよい。凍結乾燥調製物は投与前に滅菌水溶液と混合される。組成物は、 生理的状態に近づけるために医薬的に許容される補助剤(例えばｐＨ調節および 緩衝剤、浸透圧調節剤(例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウ ム、塩化カリウム、塩化カルシウムなど))を含むことができる。さらに、リポソ ーム懸濁液は、貯蔵時の遊離ラジカルおよび脂質過酸化による損傷から脂質を保 護する脂質保護剤を含むことができる。親油性遊離ラジカル吸収剤、例えばアル ファトコフェノールおよび水溶性鉄特異的キレーター（例えばフェリオキサミン ）が適切である。 医薬製剤中の免疫リポソームの濃度は大きく変動し（すなわち、重量で約０． ０５％未満から、通常は約２〜５％もしくはそれ未満から１０〜３０％まで）、 用いられる投与態様にしたがって主に液体の容量、粘度によって選択される。例 えば、濃度は、処置に関連して液体の充填量を減少させるために増加させること ができる。これは、粥状硬化症付随うっ血性心不全または重篤な高血圧の患者で は特に所望されるであろう。また別には、刺激性脂質を含む免疫リポソームは、 投与部位における炎症を軽減させるために希釈してもよい。投与される免疫リポ ソーム量は、用いられる個々のＦａｂ’、処置される症状、配送される治療薬お よび医師の判断によって左右される。投与される免疫リポソームの量は、一般に 、治療的に有効用量の個々の薬理学的物質を配送するために十分な量であろう。 治療的に有効な用量を配送するために必要な免疫リポソームの量は、上記の取り 込みアッセイによって決定できる。種々の薬理学的物質について治療的に有効な 用量は当業者には周知で、上記の多数の薬剤について代表的な範囲が示されてい る。典型的な免疫リポソーム用量は、一般的には約０．０１から約５０ｍｇ／ｋ ｇ体重、好ましくは約０．１から約１０ｍｇ／ｋｇ体重であろう。 好ましくは、医薬組成物は、非経口的に（すなわち動脈内、静脈内、腹腔内、 皮下または筋肉内）投与される。より好ましくは、当該医薬組成物は、瞬時大量 （ボーラス）注射により静脈内または腹腔内に投与される。このような使用に適 した具体的な製剤化は成書に記載されている（「レミントンの医薬品科学(Remin gton's Pharmaceutical Sciences)」（１７版）、Mack Publishing Company刊、 フィラデルフィア、ペンシルバニア(1985)）。典型的には、これら製剤は、許容 可能な担体（好ましくは水性担体）中に懸濁させたリポソーム溶液を含むであろ う。多様な水性担体（例えば水、緩衝水、０．９％等張食塩水など）を用いるこ とができる。これらの組成物は通常のよく知られた滅菌方法によって滅菌するか 、または濾過滅菌される。得られた水溶液を使用のために梱包するか、または凍 結乾燥する。この凍結乾燥調製物は投与前に滅菌水溶液と混合される。当該組成 物は、生理的条件に近似させるために必要な医薬的に許容できる補助剤、例えば ｐＨ調節および緩衝剤、浸透圧調節剤、湿潤剤など、例えば酢酸ナトリウム、乳 酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモ ノラウリル酸塩、オレイン酸トリエタノールアミンなどを含むことができる。実施例 本発明を以下の実施例によって説明する。これらの実施例は説明のために提供 されるが、本発明を制限するものではない。 実施例１ リポソームおよび免疫リポソームの調製 Ａ）材料） 鶏卵のホスファチジルコリン（ＥＰＣ）はアバンチポーラーリピド（Avanti P olar Lipids，Alabaster，アラバマ）から、コレステロール（Ｃｈｏｌ）はカル ビオケム（Calbiochem，サンディエゴ、カリフォルニア）から、Ｎ−トリス〔ヒ ドロキシメチル〕−２アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）はシグマ(Sigma)から 、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）はナッターマン（Natterman, コローン、ドイツ）から、ローダミン標識リン脂質はアバンチから、デスフェリ オキサミンメシレート（デスフェラル）はチバガイギー（Ciba-Geigy，サミット 、ニュージャージ）から、ドキソルビシンはファルミタリア、カルロエルバ（Fa rmitalia，Carlo Erba，ミラノ、イタリア）またはシータス（Cetus，Emeryvill e，カリフォルニア）から、およびＮ−〔４ｐ−マレイミドフェニル）ブチリル 〕ホスファチジルエタノールアミン（Ｍ−ＰＥ）はモリキュラープローブ（Mole cular Probes，ポートランド、オレゴン）から購入した。ＰＥＧ（Ｍ_r＝１９０ ０）誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）は記載にしたがって 合成し(Allenら、Biochim．Biophys．Acta，1066:29-36(1991))、さらにリポソ ームテクノロジー(Liposome Technology，Inc.，Menlo Park，カリフォルニア) から入手した。 Ｂ）Ｆａｂ’フラグメントの調製 重鎖および軽鎖のクローニングrhuMAbHER2配列を先行文献記載(Carterら、Bio technology，10:163-167(1992))にしたがって大腸菌(E．Coli)で同時発現させた 。抗体フラグメント(rhuMAbHER2-Fab')を大腸菌の醗酵ペーストからストレプト コッカスプロテインＧを用いて(Carterら、Biotechnology，10:163-167(1992)、 この文献は参照により本明細書に含まれる）アフィニティークロマトグラフィー によって回収した。典型的には、６０〜９０％が還元遊離チオール（Ｆａｂ’− ＳＨ）を含むＦａｂ’が得られた。コントロールとして無関係のヒト化Ｆａｂ’ を用いた。抗ＣＤ１８ネズミ単クローン性抗体に由来するrhuMAbH52-Fab’は、r huMAbHER2-Fab’と抗原結合ループが置換している点だけが異なり、既知のネズ ミまたはヒトの既知の抗原のいずれとも検出可能な結合を示さなかった(Eigenbr otら、Proteins:Structure，Function and Genetics，18:49-62(1994))。 Ｃ）リポソームの調製 リポソームは、ＥＰＣ：Ｃｈｏｌ（２：１）または記載が有る場合はＨＳＰＣ ： Ｃｈｏｌ（３：２）およびＰＥＧ−ＰＥ（０〜６モルパーセント）を含む脂質組 成物を用いて逆相蒸発法（Szoka & Papahadjopoulos，Proc．Natl．Acad．Sci． USA，75:4194-4198(1987))にしたがって調製した。続いて、連続的に０．１から ０．０５μｍの限定された孔サイズをもつポリカーボネート膜フィルターから陽 圧下でアルゴンガスとともに繰り返しリポソームを噴射した(Olsonら、Biochim ．Biophys．Acta，55:9-23(1979);Szokaら、Biochim．Biophys．Acta，601:559- 571(1980))。この方法によって、動的光分散で測定した場合６０〜１２０ｎｍの 直径を呈するリポソームが得られた。リポソーム濃度はホスフェートアッセイに よって決定した（Bartlettら、J．Biol．Chem.，234:466-468(1959))。免疫リポ ソームの調製のためには、２モル％のＭ−ＰＥ（総リン脂質に対して）をリポソ ーム作製前にクロロホルム中の脂質混合物に混合した(Martin & Papahadjopoulo s，J．Biol．Chem.，257:286-288(1982))。被包化ドキソルビシンを含まないリ ポソームはＨＥＰＥＳ−ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）中で３００mOsmで調製し た。ドキソルビシンを含むＨＳＰＣ／Ｃｈｏｌリポソームは１ｍＭデスフェラル を含む２５０ｍＭ硫酸アンモニウム中でｐＨ５．５で調製した。被包化されなか った硫酸アンモニウムはＧ−７５セファデクスを用いてゲル濾過によって除去し た。続いてこのリポソーム懸濁液に粉末形のドキソルビシンを０．１ｍｇドキソ ルビシン／μモルリン脂質で溶解した(Papahadjopoulosら、Proc．Natl．Acad． Sci．USA，88:11460-11464(1991);Huangら、Cancer Res.，52:6774-6781(1992)) 。リポソームはその内部空間にドキソルビシンを捕捉する(Lasicら、Febs Lett. ，312:255-258(1992))。塩勾配による薬剤の積載効率は高く、１０μモルのリン 脂質に対して１ｍｇの薬剤を用いた場合は当該効率は９９％超の積載率に達した 。 Ｆａｂ’は、チオエーテル連結を介して薬剤を積載した後で先行文献記載にし たがって(Martinら、J．Biol．Chem.，257:286-288(1982))リポソームに共役さ せた。マレイミドは低いｐＨでより安定であるので、全ての工程はｐＨ５．５で 実施した。未反応Ｆａｂ’は、セファクリルＳ−４００を用いてゲル濾過で免疫 リポソームから分離した。免疫リポソーム上のマレイミド基は、共役後Ｍ−ＰＥ に対して２倍過剰のメルカプトエタノールで不活性化した。共役Ｆａｂ’の量は バイオラド（BioRad）タンパク質アッセイによって決定した ４種類のリポソームを調製した。抗体をもたない“通常の”リポソームはホス ファチジルコリンおよびコレステロールのみで構成され、“立体的安定化”リポ ソームはさらにＰＥＧ−ＰＥを含んでいた。免疫リポソームは、ヒト化抗体rhuM AbHER2に由来するＦａｂ’フラグメントを上記のものと共役させ、通常または立 体的安定化免疫リポソームを調製した。完全な抗体ではなくＦａｂ'フラグメン トを用いた理由は以下の通りである。１）rhuMAbHER2-Fab’フラグメントは組換 えタンパク質として大腸菌内で極めて高効率で発現できる（Carterら、上掲書） ；２）Ｆａｂ’ヒンジ領域内の遊離チオール基は修飾リポソームに対して容易に 利用できる共有結合部位を提供し、さらに抗原結合部位から離れている；３）rh uMAbHER2-Fab'は完全な抗体よりもはるかに少ない抗分裂活性を有し、したがっ て抗ｐ１８５^HER2−Ｆａｂ’のリポソームへの結合がこの活性を再構成するか否 かを調べるために重要であった。典型的には、共役によってリポソーム粒子当た り約５０〜１００のＦａｂ’分子がもたらされた。 実施例２ 免疫リポソームの結合 抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームの乳癌細胞（ｐ１８５^HER2レセプターを過剰発 現する）へのインビトロ結合能を２つの方法、流動細胞計測（フローサイトメト リー）アッセイおよび競合結合アッセイによって調べた。流動細胞計測アッセイ では、高レベルのｐ１８５^HER2を発現するSK-BR-3細胞またはMCF-7細胞を氷上で ４５分間抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームに暴露し、ＰＢＳで洗浄し、結合した免 疫リポソーム（ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ）を検出するために抗ヒト二次抗 体で染色した。ＰＢＳで再び洗浄し、続いて流動細胞計測に付した（図１）。SK -BR-3細胞は、顕著な量の通常または立体的安定化抗ｐ１８５^HER2免疫リポソー ムのいずれとも結合したが、Ｆａｂ’を欠くコントロールリポソームとは結合し なかった。ｐ１８５^HER2を過剰発現していないMCF-7乳癌細胞は抗ｐ１８５^HER2 免疫リポソームとは極めてわずかの結合を示しただけであった（データは提示さ れていない）。 別の結合測定は競合結合アッセイによって実施した。このアッセイでは、単層 培養のSK-BR-3細胞（乳癌細胞）またはBT-474細胞を同時に¹²⁵Ｉ標識rhuMAbHER2 またはmuMAb4D5とともに０．１ｎＭで１８時間４℃で保温し、抗ｐ１８５^HER2免 疫リポソームの濃度を上昇させていった（図２）。結合カウントはガンマ計測に よって求めた。抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームは、SK-BR-3細胞（データは提示 されていない）およびBT-474細胞（これもまた高レベルのｐ１８５^HER2を発現す る）の両方に対してrhuMAbHER2の結合に効果的にとってかわった。結合親和性の 概算値は、免疫リポソーム上のＦａｂ’が遊離リガンドとして機能すると仮定し てスキャチャード分析によって得た。このモデルを用いた場合、免疫リポソーム の見かけの結合定数は、遊離（すなわち非リポソーム性）rhuMAbHER2-Fab1また は無傷の完全なrhuMAbHER2のそれに匹敵するものであった。Ｆａｂ’を欠く通常 または立体的安定化（６モル％のＰＥＧ−ＰＥ）コントロールリポソームはほと んど結合を示さなかった。結合データの要旨は表１に示す。 表１．抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームのBT-474細胞との結合 実施例３ “増殖抑制”免疫リポソームの抗分裂活性 免疫リポソーム単独（被包化薬剤を含まない）の抗分裂活性を調べるために、 腫瘍細胞（例えばSK-BR-3細胞またはBT-474細胞）を単層培養に増殖させ、続い て抗体を基準にして免疫リポソームの濃度を変えながら３７℃で保温した。４日 間処理を持続させた後、単層細胞培養をＰＢＳで洗浄し、クリスタルバイオレッ ト（０．５％メタノール溶液）で染色して先の記載(Hudziakら、Mol．Cell Biol .， 9:1165-1172(1989)）にしたがって相対分裂を決定した。 完全な（二価）rhuMAbHER2が単層培養のｐ１８５^HER2過剰発現乳癌細胞の増殖 を抑制し、一方、この抗体の一価のＦａｂ’フラグメント(rhuMAbHER2-Fab')は 増殖抑制での効果ははるかに小さかった(O'Connellら、「インビボおよびインビ トロのタンパク質の折り畳み」より、（218-239ページ）、J.L．Cleland編、ワ シントンD.C．アメリカ化学学会(1993))。この発見は、二価抗体によるｐ１８５^HER2 レセプターの架橋が抗分裂活性作用に重要であろことを示唆し、有効原子価 を増すことによってrhuMAbHER2-Fab'フラグメントのリポソーム固着がＦａｂ'の 抗分裂活性を改善するか否かという疑問が浮上した。 抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームのSK-BR-3単層培養細胞に対する影響を調べ、r huMAbHER2およびrhuMAbHER2-Fab'と比較した（図３）。Ｆａｂ’を欠く通常また は立体的安定化コントロールリポソームによる処理は細胞増殖に顕著な影響を与 えなかった。対照的に、通常および立体的安定化抗ｐ１８５^HER2免疫リポソーム は用量依存的に増殖を抑制した。免疫リポソームの増殖抑制効果は約３０％の増 殖抑制（コントロール増殖の７０％）のプラトーに達し、無傷の完全な遊離rhuM AbHER2で認められる４０％増殖抑制に迫った。対照的に、遊離rhuMAbHER2-Fab' は僅かな増殖抑制を誘発しただけであった。同様な結果は、ｐ１８５^HER2過剰発 現BT-474乳癌細胞でも得られた（データは提示されていない）。 リポソーム結合rhuMAbHER2-Fab'は、溶液中に遊離している同じ量のrhuMAbHER 2-Fab'よりはるかに強い抗分裂作用をもたらすということは特記すべきことであ る。妥当な説明の１つは、rhuMAbHER2-Fab'のリポソーム固着によってｐ１８５^{H ER2} の架橋が可能になり、それによって完全な二価抗体の生物学的活性に匹敵す るものが得られるというものである。 実施例４ ドキソルビシン含有抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームの細胞毒性 空の抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームはｐ１８５^HER2過剰発現乳癌培養細胞に対し て抗分裂活性を示すが、細胞毒性剤をそれらリポソームに積載して当該免疫リポ ソームの抗新形成作用を大きく増大させ、それによって向標的薬剤配送システム を作製することを考えた。ドキソルビシンは、ｐ１８５^HER2過剰発現乳癌に対 して、免疫療法が併用されていてもいなくても、特に有用であることが予備臨床 的にも臨床的にも示唆されたので用いた。したがって、ドキソルビシン積載抗ｐ １８５^HER2免疫リポソームのｐ１８５^HER2過剰発現乳癌細胞および非悪性細胞( ｐ１８５^HER2を過剰発現していない）に対する細胞毒性および特異性を調べるこ とは重要である。 抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームによって示された効果的な内在化（実施例５参 照）のために、ｐ１８５^HER2過剰発現乳癌細胞を殺すについて当該リポソームは 遊離ドキソルビシン(容易に細胞膜を通過する小さい（ＭＷ５４４）両親媒性分 子))と同じように有効であると期待された。他方、ｐ１８５^HER2を過剰に発現し ない細胞（しかし遊離ドキソルビシンに感受性を有する）は、当該免疫リポソー ムがそれらを標的とすることができないのでドキソルビシン積載抗ｐ１８５^HER2 免疫リポソームの細胞毒性損傷から逃避できるであろう。 ドキソルビシン積載免疫リポソームの細胞毒性を調べるために、単層培養した SK-BR-3細胞またはWI-38細胞を遊離ドキソルビシンまたはドキソルビシン積載免 疫リポソームと１時間保温し、続いて培養液で十分洗浄した。その後細胞をさら に３７℃で３日間保温し、その後で上記で述べたようにクリスタルバイオレット 染色によって細胞数を概算した。アラマーブルー染色、ＭＴＴ染色および直接細 胞数計測を含む他の細胞増殖アッセイとの比較によって実質的に同じ結果が得ら れた。 種々のドキソルビシン積載免疫リポソーム調製物で１時間処理したSK-BR-3細 胞の結果を図４に示す。これらの条件下では、rhuMAbHER2の抗分裂作用は、細胞 をrhuMAbHER2に持続して曝すことが要求されるので明白ではない(Hudziakら、Ce ll Biol.，9:1165-1172(1989))。遊離ドキソルビシンで１時間処理した場合、１ Ｃ₅₀が約０．３μｇ／ｍｌの顕著な細胞毒性が得られた。ドキソルビシン積載抗 ｐ１８５^HER2免疫リポソームは、通常の抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームについて は約０．２μｇ／ｍｌ、立体的安定化（２モル％のＰＥＧ−ＰＥ）抗ｐ１８５^{HE R2} 免疫リポソームについては約１．０μｇ／ｍｌのＩＣ₅₀で用量依存細胞毒性を 示した。これらの結果は、ｐ１８５^HER2過剰発現培養細胞への抗ｐ１８５^HER2免 疫リポソームによるドキソルビシンの配送は、遊離ドキソルビシンの細胞への迅 速な拡散と同じ有効な方法であることを示した。ドキソルビシン積載抗ｐ１８５^HER2 免疫リポソームは、無関係のＦａｂ’を含むドキソルビシン積載免疫リポソ ームよりも１０から３０倍高い細胞毒性をもっていた。後者の免疫リポソームは 比較的高い濃度（３．３μｇ／ｍｌ超）でのみ細胞増殖に影響を与えた。 WI-38細胞（わずかのレベルのｐ１８５^HER2を発現する非悪性肺線維芽細胞株 ）もまたドキソルビシンおよびドキソルビシン積載抗ｐ１８５^HER2免疫リポソー ムで処理した（図４Ｂ）。遊離ドキソルビシンは、WI-38細胞に対してもまた顕 著な用量依存細胞毒性を示した。しかしながら、ドキソルビシン積載抗ｐ１８５^HER2 免疫リポソームは、これら細胞に対してはるかに低い（２０倍低い）細胞毒 性を示し、無関係のＦａｂ’を含むドキソルビシン積載免疫リポソームと変わり がなかった。これらの結果は、ｐ１８５^HER2過剰発現標的に対する抗ｐ１８５^{HE R2} 免疫リポソーム処理の特異性を示し、さらにSK-BR-3細胞に対して認められた 細胞毒性は、単にドキソルビシンが抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームから、さらに 溶液中に漏出したためではないことを確認させた。 実施例５ 標的細胞の細胞質内への免疫リポソームの内在化 標的細胞の細胞質内への免疫リポソームの内在化を蛍光顕微鏡によって調べる ために、リン脂質成分の１モル％でローダミン−ホスファチジルエタノールアミ ンが添加されたリポソームおよび免疫リポソームを実施例１で述べたように調製 した。生じたローダミン標識リポソームまたは免疫リポソームを、カバースリッ プ上に準融合状態に増殖させたSK-BR-3細胞とともに３７℃で種々の時間保温し た。続いて細胞を３％パラホルムアルデヒドで固定し、抗漂白試薬として０．１ ％ｐ−フェニレンジアミン(Sigma)を含む９０％グリセロール／１００ｍＭトリ ス（ｐＨ８．５）中に包埋し、ライツアリストプラン（Leitz Aristoplan）蛍光 顕微鏡またはモレキュラーダイナミクスマルチプローブ(Molecular Dynamics Mu ltiProbe)２００１共焦点顕微鏡を用いて観察した。 内在化および細胞内配置を電子顕微鏡で調べるために、免疫リポソームに以前 の報告(Huangら、Cancer Res.，52:5135-5143(1992);Straubingerら、Cell，32: 10639-1079(1983))にしたがってコロイド状金粒子を加えた。金含有免疫リポソ ー ムをカバースリップ上に増殖させたSK-BR-3細胞とともに３７℃で種々の時間保 温し、続いて細胞を固定して電子顕微鏡のために処理した。リポソームの固定は 一次固定ではタンニン酸を用いて実施した(Straubingerら、上掲書）。この一次 固定は適切ではあるが超微細構造の最適な保存は提供しない。 抗体（rhuMAbHER2）は、レセプター仲介エンドサイトーシスを介してｐ１８５^HER2 過剰発現腫瘍細胞によって迅速に内在化される（Sarupら、Growth Regul.， 1:72-82(1991)）。抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームがSK-BR-3細胞内に内在化され るか否かを調べるために、細胞をローダミン標識免疫リポソームで種々の時間処 理して固定し蛍光顕微鏡によって観察した。Ｆａｂ’を欠く通常または立体的安 定化コントロールリポソームで処理されたSK-BR-3細胞は表面のローダミン蛍光 も内部ローダミン蛍光も示さず、これら細胞にコントロールリポソームは結合す る能力をもたないということと一致した。通常の抗ｐ１８５^HER2免疫リポソーム で処理したとき、SK-BR-3細胞は、処理後３０分以内に細胞表面および細胞内の 両方に濃い蛍光のフォーカスを示した。共焦点蛍光顕微鏡によって、ローダミン の蛍光はSK-BR-3細胞の表面およびその細胞内に内在化されることが確認された 。対照的に、高濃度のＰＥＧ−ＰＥ（６モル％）を含む立体的安定化抗ｐ１８５^HER2 免疫リポソームによる処理は、３０分後にわずかの細胞内蛍光をもたらすに 留まった。ＰＥＧ−ＰＥの存在によって免疫リポソームの内在化は遅延するらし いので、低い濃度のＰＥＧ−ＰＥを含む立体的安定化免疫リポソームを調べた。 ２モル％のＰＥＧ−ＰＥを含む免疫リポソームは３０分後には中程度の（すなわ ち通常の免疫リポソームで認められたものより少なく、６モル％のＰＥＧ−ＰＥ 含有免疫リポソームで認められたものより多い）細胞内蛍光をもたらした。幾分 遅延した内在化にもかかわらず、２％ＰＥＧ−ＰＥ含有立体的安定化免疫リポソ ームはより長い保温時間（例えば２時間）で細胞内に蓄積された。したがって、 抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームはSK-BR-3細胞内に内在化されるが、一方、内在 化速度は免疫リポソームのＰＥＧ−ＰＥ含有量に反比例した。 免疫リポソームの細胞内配置およびそれらの含有量を調べるために、カプセル 化コロイド状金粒子を含む免疫リポソームを用いて電子顕微鏡検査を実施した。 通常の抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームで３０分処理したSK-BR-3細胞は、細胞表 面 に結合し、さらに細胞内に存在する多数の金含有免疫リポソームを示した。多く の免疫リポソームは、細胞膜に接した状態および明らかに細胞膜と結合した状態 で観察された。いくつかの免疫リポソームは、被覆された凹みの中以外にも被覆 された小胞内、エンドソーム、多小胞性小体およびリソソーム内にも見出され た。このような細胞内分布は、被覆された凹みを経由して内在化されるというこ とと一致する。しかしながら、被覆された凹みを形成せずに細胞膜と融合してい るように見える免疫リポソームもまた観察された。さらに、いくつかの金粒子は リポソームカプセル内や膜結合細胞内小器官とは結合して存在せず、細胞質内に 遊離しているように見えた。細胞質内に遊離している金粒子は、リポソームと細 胞膜との融合現象から生じたのかもしれない。また別に、遊離金粒子は、エンド サイトーシスに続いて被覆された凹みのどこかで生じたカプセル化金粒子の漏出 で生じたのかもしれない。 実施例６ 免疫リポソームのインビボ腫瘍における局在化および生体内分布 並び免疫リポソームの含有量 若い（４〜６週齢）雌のＳＣＩＤマウスの大腿部の皮下組織または乳房脂肪パッ ドの皮下組織にBT-474細胞を注射し、さらにこれら細胞の腫瘍形成増殖を助ける ために皮下にエストロジェンペレットを埋め込んだ。触診可能腫瘍が少なくとも ３００ｍｍ³に達したとき（典型的には接種後１４日）、総脂質約１μモルを含 む約２００μＬの容積で１回静注（尾静脈から）するか、または１回腹腔内注射 することによつて免疫リポソームを投与した。注射後指定した期間で動物を殺処 分し、その場で食塩水を器官に灌流させ、直ちに組織を分析のために切り出した 。ローダミン標識免疫リポソームの注射後の生体内分布および画像分析のために 、直ちに切り出した組織を固定し共焦点蛍光顕微鏡で検査した。免疫リポソーム によって配送されたドキソルビシンの局在化の定量のために、切り出した組織を 均質化して酸性化エタノール抽出を実施した。続いて抽出ドキソルビシンを先の 報告(Gablzonら、J．Natl．Cancer Inst.，81:1484-1488(1989))にしたがって分 光蛍光測定アッセイによって測定した。 抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームの生体内分布およびインビボで腫瘍内に局在し さらに蓄積することができるそれらの能力を腫瘍の異種移植モデルで調べた。こ のモデルでは、定着した皮下BT-474腫瘍の異種移植片をもつ免疫不全マウスに免 疫リポソームを１回静注するか、または腹腔内注射して処理した。共焦点蛍光顕 微鏡による画像化調査を実施し、処理後殺処分した動物の種々の組織内のローダ ミン標識免疫リポソームを検出した。静注後６時間以内に、ローダミンの蛍光は この異種移植腫瘍内に認められ、一方、顕著な蛍光は周辺の筋肉内には認められ なかった。しかしながらこの技術は腫瘍組織内の免疫リポソーム量を精確には表 すことができなかった。免疫リポソームによって配送されたドキソルビシンの生 体内分布および局在化の定量的評価のために、処理動物の組織抽出物からドキソ ルビシンをアッセイした。腹腔内注射してから２４時間で、立体的安定化抗ｐ１ ８５^HER2免疫リポソームによって配送されたドキソルビシンは異種移植腫瘍内に 蓄積され、ドキソルビシンは周辺の筋肉内および血中にも低量見出された(表２) 。 表２．抗ｐ１８５^HER2免疫リポソームのドキソルビシンのインビボ配送： 静注１回２４時間後の生体内分布 実施例５ ＰＥＧ上にＦａｂ’をもつ免疫リポソームの調製 発明の免疫リポソームの向標的特異性および内在化を改善するために、リポ ソームに埋め込まれたポリエチレングリコール鎖の遠位端に腫瘍特異的Ｆａｂ’ フラグメント(rhuMAbHER2-Fab')をスルフヒドリル反応性マレイミド基を介して 共役させた。Ｆａｂ’のＳIIと反応するリンカー基（マレイミド）を提供するた めに、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンおよび異種二官能基ＰＥ Ｇ誘導体（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−ＰＥＧ−マレイミド）から、α− ジステアロイルホスファチジルエタノールアミノカルボニル−ω−マルイミドプ ロピオニルアミドポリエチレングリコールを標準的な方法にしたがって合成した 。ＰＥＧ−ＰＥのマレイミド誘導体をリポソーム調製時に混合し、ｐＨ７．２条 件下でＦａｂ’フラグメントをスルフヒドリル基を介してリポソームと共役させ た。 リポソーム組成物は、Ｍ−ＰＥはもはや抗体フラグメントの結合に必要とされ ないので除外されているという点を除き上記に述べたとおりであった。典型的に はＰＥＧ（ＰＥＧ−ＰＥ）は総燐脂質の約１０から約１２モルパーセントの範囲 で、Ｆａｂ’共役ＰＥＧ誘導体脂質は総脂質の約０．６から約１モルパーセント の範囲であった。 ＨＥＲ過剰発現乳癌細胞の培養では、そのような立体的に安定な抗ＨＥＲ２リ ポソームは、ポリエチレングリコール修飾リン脂質の量に関係なく同じ結合効率 と内在化効率を有した。 上記の実施例は本発明の説明のために提供され、本発明の範囲を制限するもの ではない。本発明の他の変化型は当業者には極めて明白であり、添付の請求の範 囲に包含される。本明細書に引用した全ての刊行物、特許および特許出願は援用 して本文の一部とする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/136 Ａ６１Ｋ 31/135 ６０１ 31/407 31/40 ６０９ 31/704 31/70 ６１１ 33/24 33/24 38/00 39/395 Ｙ 39/395 39/44 39/44 47/24 47/24 47/28 47/28 Ｃ０７Ｋ 17/00 Ｃ０７Ｋ 17/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 パーク、ジョン ダブリュ. アメリカ合衆国 94131 カリフォルニア 州 サン フランシスコ ダイアモンド ハイツ ブルヴァード ＃300 5235 (72)発明者 ホン、キールン アメリカ合衆国 94107 カリフォルニア 州 サン フランシスコ デ ハロ スト リート 1360 (72)発明者 カーポティン、ドミトリ アメリカ合衆国 94121 カリフォルニア 州 サン フランシスコ フォーティサー ド アベニュ 435

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 特徴的な細胞表面マーカーを担う細胞に特異的に結合する増殖抑制免疫 リポソームであって、当該免疫リポソームは、当該マーカーと特異的に結合する 抗体のＦａｂ’ドメインおよび両親媒性小胞形成脂質を含み、当該脂質は増殖抑 制治療剤を含まないリポソームを形成し、当該免疫リポソームは当該細胞の増殖 を抑制する前記増殖抑制免疫リポソーム。 ２． 当該マーカーが増殖因子レセプターである請求項１に記載の免疫リポソ ーム。 ３． 当該マーカーが、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４から成 る群から選ばれる増殖因子レセプターである請求項２に記載の免疫リポソーム。 ４． 当該マーカーがＨＥＲ２である請求項３に記載の免疫リポソーム。 ５． 当該Ｆａｂ’ドメインが抗ＨＥＲ２単クローン性抗体のヒト化Ｆａｂ’ ドメインである請求項４に記載の免疫リポソーム。 ６． さらに、当該リポソームが、当該抗体のＦａｂ’ドメインとのチオエー テル結合を形成するマレイミド誘導ホスファチジルエタノールアミン(Ｍ−ＰＥ) を含む請求項１に記載の免疫リポソーム。 ７． Ｆａｂ’が当該リポソームにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカ ーを介して結合される請求項１に記載の免疫リポソーム。 ８． 当該小胞形成脂質が、リン脂質、糖タンパク質、スフィンゴリピドおよ びステロールから成る群から選ばれる脂質を含む請求項１に記載の免疫リポソー ム。 ９． さらにポリエチレングリコール誘導脂質を含み、当該ポリエチレングリ コールが約７５０Ｄから５０００Ｄの平均分子量を有する請求項１に記載の免疫 リポソーム。 １０． 当該Ｆａｂ’が当該ポリエチレングリコールに結合される請求項９に 記載の免疫リポソーム、 １１． 当該リポソームの平均直径が約５０ｎｍから約５００ｎｍの範囲にあ る請求項１に記載の免疫リポソーム。 １２． 当該リポソームの平均直径が約１００ｎｍである請求項９に記載の免 疫リポソーム。 １３． 抗体の当該Ｆａｂ’ドメインがrhuMAbHER2であり； 抗体の当該Ｆａｂ’ドメインがマレイミド誘導ホスファチジルエタノールア ミン（Ｍ−ＰＥ）に共役され； 当該小胞形成脂質がホスファチジルコリン(ＰＣ)およびコレステロール(Ｃ ｈｏｌ)であり； さらに当該誘導脂質がポリエチレングリコール誘導ホスファチジルエタノ ールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）であって、当該ポリエチレングリコールが約１ ９００Ｄの分子量を有し、比ＰＣ：Ｃｈｏｌ：Ｍ−ＰＥが約１５０：１００ ： ３で、当該ＰＥＧ−ＰＥが総脂質の約３．６モルパーセントまでの量で存在 する請求項８に記載の免疫リポソーム。 １４． 特徴的な細胞表面マーカーを担う細胞の増殖を抑制する方法であって、 当該方法が当該細胞を増殖抑制免疫リポソームと接触させることを含み、当該免 疫リポソームが、当該マーカーと特異的に結合する抗体のＦａｂ’ドメインおよ び増殖抑制治療剤を含まないリポソームを形成する両親媒性小胞形成脂質を含む 、前記の細胞の増殖を抑制する方法。 １５． 当該マーカーが、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４から 成る群から選ばれる増殖因子レセプターである請求項１２に記載の方法。 １６． 当該Ｆａｂ’ドメインが単クローン性抗体のヒト化Ｆａｂ’ドメイン である請求項１３に記載の方法。 １７． さらに、当該リポソームが、当該抗体とのチオエーテル結合を形成す るマレイミド誘導ホスファチジルエタノールアミン（Ｍ−ＰＥ）を含む請求項１ ２に記載の方法。 １８． 当該小胞形成脂質が、リン脂質、糖タンパク質、スフィンゴリピドお よびステロールから成る群から選ばれる脂質を含む請求項１２に記載の方法。 １９． 当該免疫リポソームが、さらにポリエチレングリコール誘導脂質を含 み、当該ポリエチレングリコールが約７５０Ｄから５０００Ｄの平均分子量を有 する請求項１２に記載の方法。 ２０． 当該リポソームの平均直径が約５０ｎｍから約５００ｎｍの範囲にあ る請求項１２に記載の方法。 ２１． 抗体の当該Ｆａｂ’ドメインがrhuMAbHER2であり；抗体の当該Ｆａｂ ’ドメインがマレイミド誘導ホスファチジルエタノールアミン（Ｍ−ＰＥ）に共 役され；当該小胞形成脂質がホスファチジルコリン（ＰＣ）およびコレステロー ル（Ｃｈｏｌ）を含み；さらに当該誘導脂質がポリエチレングリコール誘導ホス ファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）であって、当該ポリエチレングリ コールが約１９００Ｄの分子量を有し；比ＰＣ：Ｃｈｏｌ：Ｍ−ＤＰＥが約１５ ０：１００：３で、当該ＰＥＧ−ＰＥが総脂質の約３．６モルパーセントまでの 量で存在する請求項１２に記載の方法。 ２２． 特徴的な細胞表面マーカーを担う細胞の細胞質内への治療薬の内在化 を最適化させる免疫リポソームであって、当該免疫リポソームが、 当該マーカーと特異的に結合する抗体のＦａｂ’ドメインと；リポソームを 形成する両親媒性小胞形成脂質と； ポリエチレングリコール誘導脂質のポリエチレングリコールが約７５０Ｄ から５０００Ｄの平均分子量を有し、その誘導脂質が総脂質の約３．６モル パーセントまでの量で存在するポリエチレングリコール誘導脂質；および 当該リポソーム内に含有される治療薬を含む、前記治療薬の内在化を最適化 させる免疫リポソーム。 ２３． 当該マーカーが、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４から 成る群から選ばれる増殖因子レセプターである請求項２０に記載の免疫リポソー ム。 ２４． 当該Ｆａｂ’ドメインが単クローン性抗体のヒト化Ｆａｂ’ドメイン である請求項２１に記載の免疫リポソーム。 ２５． さらに、当該リポソームが、抗体のＦａｂ’ドメインとの当該チオエ ーテル結合を形成するマレイミド誘導ホスファチジルエタノールアミン（Ｍ−Ｐ Ｅ）を含む請求項２０に記載の免疫リポソーム。 ２６． 当該小胞形成脂質が、リン脂質、糖タンパク質、スフィンゴリピドお よびステロールから成る群から選ばれる請求項２０に記載の免疫リポソーム。 ２７． 当該リポソームの平均直径が約５０ｎｍから約５００ｎｍの範囲にあ る請求項２０に記載の免疫リポソーム。 ２８． 当該治療薬が、ダウノマイシン、イダルビシン、ミトキサントロン、 マイトマイシン、シスプラチンおよび他の白金II類似体、ビンクリスチン、エピ ルビシン、アクラシノマイシン、メトトレキセート、エトポシド、ドキソルビシ ン、シトシンアラビノシド、フルオロウラシルおよび他のフッ素化ピリミジン、 プリンまたはヌクレオシド、ブレオマイシン、マイトマイシン、プリカマイシン 、ダクチノマイシン、シクロホスファミドおよびその誘導体、チオテパ、ＢＣＮ Ｕ、タキソール、タキソテアおよび他のタキサン誘導体並びに単離物、カンプト テシン、ポリペプチド、核酸、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する 核酸、およびポリアミドヌクレオチド間結合を有する核酸から成る群から選ばれ る請求項２０に記載の免疫リポソーム。 ２９． 抗体の当該Ｆａｂ’ドメインがrhuMAbHER2であり；当該小胞形成脂質 がホスファチジルコリン（ＰＣ）およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）を含み；当 該誘導脂質がポリエチレングリコール誘導ホスファチジルエタノールアミン（Ｐ ＥＧ−ＰＥ）であって、当該ポリエチレングリコールが約１９００Ｄの分子量を 有し；当該抗体がマレイミド誘導ホスファチジルエタノールアミン（Ｍ−ＤＰＥ ）に共役され；当該ＰＣ：Ｃｈｏｌ：Ｍ−ＰＥの比が約１５０：１００：３：６ で、当該ＰＥＧ−ＰＥが総脂質の約３．６モルパーセント未満の量で存在する請 求項２０に記載の免疫リポソーム。 ３０． ａ）当該細胞を ｉ）当該マーカーと特異的に結合する抗体のＦａｂ’ドメインと、 ii）リポソームを形成する両親媒性小胞形成脂質と、 iii）ポリエチレングリコールの平均分子量が約７５０Ｄから５０ ００Ｄであり、ポリエチレングリコール誘導脂質が総脂質の約３． ６モルパーセントまでの量で存在するポリエチレングリコール誘導 脂質、および iv）当該リポソーム内に含有される治療薬を含む免疫リポソームと 接触させる 工程、及び ｂ）当該リポソーム自体を当該細胞内に内在化させる 工程を含む、特徴的な細胞表面マーカーを担う細胞の細胞質内への治療薬の内 在化を最適化させる方法。 ３１． 当該内在化が、当該リポソームを当該細胞の細胞質内に直接輸送する ことを含む請求項２８に記載の方法。 ３２． 当該マーカーが、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４から 成る群から選ばれる増殖因子レセプターである請求項２８に記載の方法。 ３３． 当該Ｆａｂ’ドメインが単クローン性抗体のヒト化Ｆａｂ’ドメイン である請求項３０に記載の方法。 ３４． 当該小胞形成脂質が、リン脂質、糖タンパク質、スフィンゴリピドお よびステロールから成る群から選ばれる請求項２８に記載の方法。 ３５． 当該治療薬が、ダウノマイシン、イダルビシン、ミトキサントロン、 マイトマイシン、シスプラチンおよび他の白金II類似体、ビンクリスチン、エピ ルビシン、アクラシノマイシン、メトトレキセート、エトポシド、ドキソルビシ ン、シトシンアラビノシド、フルオロウラシルおよび他のフッ素化ピリミジン、 プリンまたはヌクレオシド、ブレオマイシン、マイトマイシン、プリカマイシン 、ダクチノマイシン、シクロホスファミドおよびその誘導体、チオテパ、ＢＣＮ Ｕ、タキソール、タキソテアおよび他のタキサン誘導体並びに単離物、カンプト テシン、ポリペプチド、核酸、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する 核酸、およびポリアミドヌクレオチド間結合を有する核酸から成る群から選ばれ る請求項２８に記載の免疫リポソーム。 ３６． 抗体の当該Ｆａｂ’ドメインがrhuMAbHER2であり；当該小胞形成脂質 がホスファチジルコリン（ＰＣ）およびコレステロール（Ｃｈｏｌ）を含み；当 該誘導脂質がポリエチレングリコール誘導ホスファチジルエタノールアミン（Ｐ ＥＧ−ＰＥ）であって、当該ポリエチレングリコールが約１９００Ｄの分子量を 有し；抗体の当該Ｆａｂ’ドメインがマレイミド誘導ホスファチジルエタノール アミン（Ｍ−ＰＥ）に共役され；当該ＰＣ：Ｃｈｏｌ：Ｍ−ＤＰＥの比が約１５ ０：１００：３：６で、当該ＰＥＧ−ＰＥが総脂質の約３．６モルパーセントま で の量で存在する請求項２８に記載の免疫リポソーム。 ３７． 特徴的な細胞表面マーカーと特異的に結合する抗体のＦａｂ’ドメイ ンでポリエチレングリコール誘導脂質に結合されたものと、リポソームを形成す る両親媒性小胞形成脂質、及びポリエチレングリコール誘導脂質を含む、当該特 徴的な細胞表面マーカーを担う細胞の細胞質内に内在化される免疫リポソームで あって、当該免疫リポソームを当該細胞と接触させるとき、当該免疫リポソーム が当該細胞の細胞質内に内在化される前記細胞質内に内在化される免疫リポソー ム。 ３８． 当該ポリエチレングリコールが約７５０Ｄから５０００Ｄの平均分子 量を有する請求項３７に記載の免疫リポソーム。 ３９． 当該マーカーが、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４から 成る群から選ばれる増殖因子レセプターである請求項３７に記載の免疫リポソー ム。 ４０． 当該Ｆａｂ’ドメインが単クローン性抗体のヒト化Ｆａｂ’ドメイン である請求項３９に記載の免疫リポソーム。 ４１． ポリエチレングリコール誘導脂質に結合された当該Ｆａｂ’がＰＥＧ 誘導ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）の遠位端に結 合されたrhuMAbHER2であり；当該ポリエチレングリコール誘導脂質がＰＥＧ−Ｐ Ｅであり、当該小胞形成脂質がホスファチジルコリン（ＰＣ）およびコレステロ ール（Ｃｈｏｌ）を含み；当該ＰＣ：Ｃｈｏｌの比が約３：２で、当該ＰＥＧ− ＰＥが総リン脂質の約１０モルパーセントから約１２モルパーセントの範囲で、 さらにポリエチレングリコール誘導脂質に結合した当該Ｆａｂ’が総リン脂質の 約０．６から約１．０モルパーセントの範囲である、請求項３７に記載の免疫リ ポソーム。 ４２． 特徴的な細胞表面マーカーを担う細胞を免疫リポソームと接触させる ことを含む当該特徴的な細胞表面マーカーを担う細胞の細胞質内にリポソームを 内在化させる方法であって、当該リポソームが、当該マーカーと特異的に結合す る抗体のＦａｂ’ドメインであってポリエチレングリコール誘導脂質に結合され たものと、リポソームを形成する両親媒性小胞形成脂質、及びポリエチレングリ コール誘導脂質を含み、当該接触によって当該細胞の細胞質内への当該リポソー ムの内在化がもたらされる前記細胞質内にリポソームを内在化させる方法。 ４３． 当該ポリエチレングリコールが約７５０Ｄから５０００Ｄの平均分子 量を有する請求項４２に記載の免疫リポソーム。 ４４． 当該マーカーが、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４から 成る群から選ばれる増殖因子レセプターである請求項４２に記載の方法。 ４５． 当該Ｆａｂ’ドメインが単クローン性抗体のヒト化Ｆａｂ’ドメイン である請求項４２に記載の方法。 ４６． ポリエチレングリコール誘導脂質に結合された当該Ｆａｂ’がＰＥＧ 誘導ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）の遠位端に結 合されたrhuMAbHER2であり；当該ポリエチレングリコール誘導脂質がＰＥＧ−Ｐ Ｅであり、当該小胞形成脂質がホスファチジルコリン（ＰＣ）およびコレステロ ール（Ｃｈｏｌ）を含み；当該ＰＣ：Ｃｈｏｌの比が約３：２で、当該ＰＥＧ− ＰＥが総リン脂質の約１０モルパーセントから約１２モルパーセントの範囲で、 さらにポリエチレングリコール誘導脂質に結合した当該Ｆａｂ’が総リン脂質の 約０．６から約１．０モルパーセントの範囲である、請求項４２に記載の方法。