[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

KR19990029749A - 2가 반응성 수용성 고분자 유도체 및 이들을 함유하는 복합체 - Google Patents

2가 반응성 수용성 고분자 유도체 및 이들을 함유하는 복합체 Download PDF

Info

Publication number
KR19990029749A
KR19990029749A KR1019980037663A KR19980037663A KR19990029749A KR 19990029749 A KR19990029749 A KR 19990029749A KR 1019980037663 A KR1019980037663 A KR 1019980037663A KR 19980037663 A KR19980037663 A KR 19980037663A KR 19990029749 A KR19990029749 A KR 19990029749A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
soluble polymer
group
ligand
polymer derivative
peg
Prior art date
Application number
KR1019980037663A
Other languages
English (en)
Inventor
도시아끼 다가와
쓰또무 스즈끼
노부히사 야다
가즈히로 나가이께
요꼬 히라까와
사이꼬 호소까와
Original Assignee
미우라 아끼라
미쓰비시 가가꾸 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 미우라 아끼라, 미쓰비시 가가꾸 가부시키가이샤 filed Critical 미우라 아끼라
Publication of KR19990029749A publication Critical patent/KR19990029749A/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A61K31/795—Polymers containing sulfur
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A61K47/6913—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome the liposome being modified on its surface by an antibody
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6853—Carcino-embryonic antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6863—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from stomach or intestines cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Other Resins Obtained By Reactions Not Involving Carbon-To-Carbon Unsaturated Bonds (AREA)

Abstract

아미노기와의 반응성 부위 및 티올기 부분 또는 S-아세틸티오기 부분을 갖는 것을 특징으로 하는 2가 반응성 수용성 고분자 유도체, 상기 고분자 유도체를 통하여 리간드와 작용성 물질이 결합된 복합체, 상기 복합체를 함유하는 의약, 진단약조성물, 및 상기 복합체의 제조방법

Description

2가 반응성 수용성 고분자 유도체 및 이들을 함유하는 복합체
본 발명은, 스페이서로서, 리간드 (항원, 항체 등의 단백질, 호르몬 등) 와 저분자약제, 마커분자, 단백질, 미셀, 또는 리포솜 등의 작용성 물질이 결합되는 헤테로인 2가 반응성 수용성 고분자 유도체, 이에 의해 얻어지는 복합체, 상기 복합체를 함유하는 의약진단약 조성물 및 상기 복합체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에서 얻어지는 복합체는, 의약품 운반체, 진단, 검사 등에 이용할 수 있다.
근년, 의약품, 동위원소, 마커물질 등에 대하여, 항원, 항체, 트랜스페린 등의 단백질이나 호르몬 등의 리간드를 결합시킴으로써 특이성을 부여하는 연구개발이 여러 분야에서 실시되고 있다.
특히, 항체 등의 단백질을 항암제 등의 의약품이나 방사성 동위원소, 독소 등의 단백질에 결합시켜 부위특이적 의약품이나 특이성이 높은 진단약으로서 이용하는 것이 기대되고 있다. 또 항체와 알칼리포스파타제 등의 효소를 결합한 복합체도 측정검사용 시약 등으로 실용화되고 있다.
이들의 복합화는 직접 결합 또는 리포솜 등의 운반체를 통하여 실시되고 있고, 항체를 예로 들면 항체 당사슬를 알데히드로 산화하여, 히드라지드기를 부여한 작용물질 (효소, 리포솜 등) 과 결합시키는 방법이나, 항체의 아미노기에 말레이미드기를 도입하고 작용물질에 티올기를 도입하여 결합시키는 방법, 환원제에 의해 내재성의 디술피드기를 환원하여 티올을 발생시켜 반응시키는 방법, 아비딘·비오틴을 통하여 결합하는 방법 등이 있다 (총설, 효소면역측정법 제 3 판 이시가와 외 의학서원 (1987)).
한편, 폴리에틸렌글리콜 (이하, PEG 라 칭하는 일도 있음) 은 유연한 수용성 고분자로 단백질 수식제로서 많은 예가 검토되어 왔다. PEG 는 저독성, 저면역원성으로, 또한 PEG 수식에 의해 단백질의 혈중체류성을 크게 개선하는 효과가 공지되어 있다 (DDS 의 진보 1995-1996 나까야마서점 p82-94(1995)).
최근, 이 PEG를 상기에서 서술한 바와 같은 스페이서로서 사용하는 연구도 실시되고 있고, 특히 리포솜분야에서는 PEG 부분을 스페이서로 한 항체결합 리포솜에 대한 연구가 활발해지고 있다.
극성기를 갖는 지질이나 양친매성의 폴리머 등은, 지질미셀, 고분자미셀, 리포솜, 지질미셀 폐쇄 2중상 등의 미립자를 형성한다.
이들의 미립자를 약제나 핵산 등의 운반체로 이용하는 시도가 근년 많아지고 있다. 리포솜에서는 지질상에 지용성물질을, 내부 수상에 수용성물질을 봉입할 수 있고, 저분자화합물뿐만 아니라 단백질 등의 고분자물질까지 담지할 수 있는 것으로부터, 약제, 단백질, 핵산 등의 DDS 용 운반체로서 수많은 연구가 이루어지고 있다. 근년, 약제의 봉입에 의한 독성저감 등의 효과에 더하여, 리포솜 표면에 항체, 당사슬 등을 결합하는 것에 의한 타겟팅 기능 등을 부여한 리포솜의 실용화연구도 진전되고 있다.
한편, 리포솜의 일반적인 결점인 응집, 간장, 비장 등의 망내계에서의 비특이적 포착(捕捉)에 관해서는 폴리에틸렌글리콜, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리글리세린 등의 수용성 고분자를 리포솜에 도입함으로써 개선되는 것이 알려지게 되었다. 특히 폴리에틸렌글리콜 수식에 관해서는 매우 많은 연구가 이루어져, 폴리에틸렌글리콜 수식에 의한 망내계에서의 포착 억제가 효과적인 것은 주지이다.
또한 리포솜에 타겟팅기능과 망내계 회피효과를 모두 갖게 하기 위하여 폴리에틸렌글리콜로 수식한 리포솜의 폴리에틸렌글리콜 말단에 추가로 항체 등의 타겟팅 리간드를 결합시킨 리포솜이 개시되어 있다.
즉, 관능기를 부여한 폴리에틸렌글리콜 지질유도체를 통하여 항체와 리포솜을 복합체화하는 방법이 나타나게 되어, 이하를 예시할 수 있다 (Klibanov 외 J. Liposome Res.2(1992) 321, 일본공개특허공보평6-126152호공보, 일본특허공개공보평6-220070 호공보, WO94/22429, Hansen 외BBA 1239(1995) 133, Shahinian 외BBA 1237(1995) 99).
이들은, 지질과 폴리에틸렌글리콜 유도체를 유기용매 중에서 반응시켜, 지질-PEG-관능기란 화합물을 합성한다. 또한 다른 구성지질과 함께 리포솜화한 후 항체와 결합시킴으로써 항체-PEG-리포솜의 복합체를 얻는다.
구체적인 폴리에틸렌글리콜 지질유도체로서, 일본공개특허공보평6-126152 호 공보에서는 지방족탄화수소-PEG-카르보닐이미다졸이, 또한 일본공개특허공보 평6-220070 호공보 BBA 1237 (1995) 99 에서는 포스파티딜에탄올아민(PE)-PEG-말레이미드가, 또, WO94/22429, Hansen 외 BBA 1239 (1995) 133 에서는 PE-PEG-NH2-비오틴, 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE)-PEG-히드라지드(HZ), DSPE-PEG-3-(2-피리딜티오)프로피오닐(PDP)를 이용한 항체결합 리포솜이 개시되었다.
이들에 의해 항체의 결합율이 향상되는 것, 또, 혈중동태가 개선되는 것이 나타났다.
그러나, 동시에 약간의 문제점도 지적되었다. 즉 DSPE-PEG-HZ를 이용한 방법에서는 항체처리의 과정에서 항체활성의 저하가 있고, 또 항체의 결합효율이 그다지 개선되어 있지 않음이 나타났다. DSPE-PEG-PDP 에서는 리포솜화 후에 환원처리가 필요하고 봉입약제로의 영향의 가능성이 있으며, 또한 조작이 번잡한 것이, PE-PEG-NH2-비오틴에서는 아비딘/비오틴을 통한 결합으로, 생체내투여에서는 이종단백으로서의 면역원성이 생각되는 것, 또한, 지방족탄화수소-PEG-카르보닐이미다졸에서는 PEG 유도체가 봉입하기위한 약제의 아미노기와 반응해버릴 가능성이 있는 것 등의 문제를 들 수 있었다.
또한 충분한 효율로 항체를 결합시키는데는 항체에 대하여 과잉량의 PEG 지질유도체를 리포솜에 편성하지 않으면 안되고, 이 때문에 항체결합 후에서도 활성기를 갖는 PEG 부분이 타성분 (생체내 투여의 경우는 생체성분) 과 반응하기 쉬운 경계영역에 과잉으로 잔존하게 된다. 또 이와 같은 양의 지질-PEG-관능기 유도체를 리포솜에 편성한 경우, 리포솜 내봉물의 누설이 가속되는 것도 나타나 있다 (BBA 1237(1995)99).
이들의 점에서 종래기술은 그렇게 충분히 만족할만한 것은 아니었다.
도 1 은 항체로의 Ac-S-PEG-Suc 도입과 탈보호에 의한 티올기의 생성을 나타낸다. 가로축은 항체와 Ac-S-PEG-Suc 의 반응시의 몰비를, 세로축은 그로써 생성된 항체 1 분자당의 티올기 분자수를 나타낸다. 하얀 원은 Ac-S-PEG-Suc 와의 반응후 히드록실아민으로 탈보호한 항체를, 검은 원은 히드록실아민을 이용한 탈보호처리를 하지않은 항체를 나타낸다.
도 2 는 항 CEA 항체에 Ac-S-PEG-Suc 또는, SATA를 이용하여 티올기를 도입한 항체를 결합한 카르복시플루오레세인 봉입 리포솜의 결합활성을 나타낸다. 각 면역리포솜 및 항체비결합 리포솜을 CEA 고정화 플레이트는 반응시키고, 세정후 플레이트에 결합된 리포솜량을 형광으로 측정하였다. 가로축은 각 리포솜량 (지질량)을 또 세로축은 여기파장 492 ㎚, 형광파장 520 ㎚ 에서의 형광강도를 나타낸다.
원은 Ac-S-PEG-Suc 로 티올기를 도입한 항체를 이용한 면역리포솜을, 사각은, SATA 로 티올기를 도입한 항체를 이용한 면역리포솜을, 또 × 표시는 항체비결합의 리포솜을 나타낸다.
도 3 은 Ac-S-PEG-Suc 로 티올기를 도입한 항체와 플루오레세인말레이미드와 결합한 형광항체의 MKN45 암세포로의 결합활성을 나타낸다.
세포와 반응 후 플로우사이트미터로 해석하였다. 도면 중 a 는 형광항체와 미반응의, b 는 형광항체와 반응한 세포군을 나타낸다. 또, 가로축은 형광량, 세로축은 세포수를 나타낸다.
도 4 는 Ac-S-PEG-Suc를 이용한 면역리포솜 (흰원) 으로부터의 내봉 카르복시플루오레세인의 누설과 대응하는 비수식(修飾)리포솜 (검은 사각) 으로부터의 누설의 비교를 나타낸다.
세로축은 리포솜에 잔존하는 카르복시플루오레세인의 %를, 가로축은 배양시간을 나타낸다.
도 5 는 본 발명에 의한 리간드결합 미셀의 제조법의 개략을 나타낸다. A 는 리간드 중의 관능기를, A' 는 A 와 반응성을 갖는 기를, B 는 미셀입자에 도입한 반응성기로 B' 및 B 와 특이적인 반응성을 갖는다.
도 6 은 항 CEA 항체에 Ac-S-PEG-Suc 또는 SATA 를 이용하여 티올기를 도입한 항체를 결합하고, 또한, 티올화 폴리에틸렌글리콜을 입힌 카르복시플루오레세인 봉입 리포솜의 결합활성을 나나낸다. 가로축은 각 리간드량 (지질량)을, 또 세로축은 여기파장 492 ㎚, 형광파장 520 ㎚ 에서의 형광파장을 나타낸다. 원은 Ac-S-PEG-Suc 로 티올기를 도입한 항체를 이용한 면역리포솜을, 사각은, SATA 로 티올기를 도입한 항체를 이용한 면역리포솜을, 또, × 표시는 항체비결합의 리포솜을 나타낸다.
도 7 은 혈중농도추이의 비교를 나타낸다. 세로축은 혈장중의 아드리아마이신량 농도를, 가로축은 시간을 나타낸다. 각 점은 1 군 네 마리의 평균 및 SD를 나타낸다. 도면 중, 원은 Ac-S-PEG-Suc 로 티올기를 도입한 항체를 이용한 면역리포솜을, 사각은 티올화 PEG 만을 결합한 리포솜을, × 는 티올화 PEG 도 결합하고 있지 않은 단순한 리포솜을 나타낸다.
도 8 은 1-3-1 항체의 DLD-1 세포 및 SV-3T 세포에 대하는 반응성을 나타내는 도면이다. 세로축은 평균 채널수에서 항체를 함유하지 않은 경우의 값을 백그라운드값으로 뺀 값을 나타낸다.
도 9 는 실시예 8에서, 얻어진 면역리포솜의 DLD-1 세포 및, SV-3T 세포에 대한 세포증식 억제활성을 나타내는 도면이다. 세로축은 리포솜샘플 첨가시의 세포수 (MTT 측정검사(assay)에서의 흡광도)를 콘트롤을 100% 로 나타냈다. 가로축은 리포솜을 아드리아마이신 농도로 나타냈다. □ 는 DLD-1 세포를, ○ 는 SV-T3 의 증식율을 나타낸다.
본 발명자들은 이러한 종래의 문제점을 해결하기 위해 검토한 결과, 합성 수용성 고분자의 유도체로 아미노기와의 반응성 부위 및 티올기 또는 잠재적인 티올기인 S-아세틸티오기를 갖는 것을 특징으로 하는 헤테로인 2가 반응성 수용성 고분자를 스페이서로 이용함으로써 종래의 문제점을 개선할 수 있는 것을 발견하였다.
또, 헤테로인 2가 반응성의 수용성 고분자 유도체를 먼저 리간드에 결합하고, 이어서 그의 다른 말단을 통하여 미셀 등의 작용성 물질에 결합하는, 또한 필요에 따라 작용성 물질과 반응성을 갖는 1가의 수용성 고분자를 결합하는 공정을 이용하여 용이하게 리간드 결합체를 제조하는 방법을 발견하였다.
즉, 본 발명의 요지는 하기이다.
(1) 아미노기와의 반응성 부위 및 티올기 부분 또는 S-아세틸티오기 부분을 갖는 것을 특징으로 하는 2가 반응성 수용성 고분자 유도체.
(2) 상기에서 하기식 (Ⅰ)에서 나타나는 수용성 고분자 유도체:
[식중, S 는 티올기 부분 또는 S-아세틸티오기 부분을 나타내고, P 는 수용성 고분자를 나타내며, N 은 아미노기와의 반응성 부위를 나타낸다. 또, R1및 R2는 임의의 연결기를 나타내지만, R1및/또는 R2는 필수는 아니다].
(3) 상기에서 수용성 고분자가 생분해성 폴리머 또는 폴리에틸렌글리콜인 고분자 유도체.
(4) 상기에서 수용성 고분자가 폴리에틸렌글리콜인 고분자 유도체.
(5) 상기에서 아미노기와의 반응성 부위가 숙신이미드기인 고분자 유도체.
(6) (1) 내지 (5) 에 기재된 고분자 유도체를 통하여 리간드와 작용성 물질이 결합된 복합체.
(7) 하기식 (Ⅱ)에서 나타나는 복합체:
[식중, L 은 작용성 물질을 나타내고, A 는 리간드를 나타내며, S, R1, P, R2및 N 은 상기와 동일의미를 나타낸다].
(8) 상기 작용성 물질이 저분자약제, 마커분자, 단백질, 미셀 및 리포솜에서 선택되는 복합체.
(9) 상기 작용성 물질이 리포솜 또는 미셀인 복합체.
(10) 상기 리간드가 항체인 복합체.
(11) 상기 작용성 물질에, 추가로, 작용성 물질과 반응성을 갖는 1가 반응성 수용성 고분자 유도체가 결합된 복합체.
(12) (6) 내지 (11) 에 기재된 복합체를 함유하는 의약조성물.
(13) (12) 에서 항종양제로 사용되는 것을 특징으로 하는 의약조성물.
(14) (6) 내지 (11) 에 기재된 복합체를 함유하는 진단약 조성물.
(15) (6) 내지 (11) 에 기재된 2가 반응성 수용성 고분자 유도체를 리간드에 결합시키고, 이어서 수용성 고분자 유도체의 다른 말단을 통하여 작용성 물질에 결합시키는 공정으로 이루어지는 제조방법.
(16) 상기 제조방법에서, 추가로, 작용성 물질과 반응성을 갖는 1가 반응성 수용성 고분자 유도체를 결합시키는 공정을 함유하는 제조방법.
(17) 상기 제조방법에서, 2가 반응성 수용성 고분자 유도체와 리간드가, 리간드의 아미노기를 통하여 결합되어 있는 제조방법.
(18) 상기 제조방법에서, 2가 반응성 수용성 고분자 유도체와 작용성 물질이, 2가 반응성 수용성 고분자 유도체의 티올기 부분을 통하여 미셀의 티올기 반응성 부분과 결합되어 있는 제조방법.
즉, 본 발명의 수용성 고분자 (본 고분자화합물 또는 본 수용성 고분자 로 칭하는 일도 있음)를 먼저 아미노기를 갖는 리간드와 결합시켜 티올기 부여 PEG-리간드 복합체를 얻고 (S 아세틸티오기의 경우는 온화한 조건에서 탈아세틸 후), 또한 티올 반응성 부위를 부여된 리포솜 등의 작용성 물질과 반응시킴으로써 용이하게 리간드-PEG-작용성 물질 복합체를 얻을 수 있었다.
이에 의하면 항체 등 리간드의 활성저하를 초래할 우려가 있는 산화나 환원을 필요로 하지 않는다. 또 작용성 물질에 영향을 줄 가능성이 적은 티올기를 통한 반응방법으로 복합체형성이 가능해졌다.
놀랍게도, 본 고분자 화합물을 통하여, 예를 들면, 항체와 리포솜을 결합하면, 고분자 부분을 갖지 않은 동일한 조합의 관능기를 갖는 저분자 화합물을 통하여 결합한 경우에 비교하여 타겟세포에 대하는 높은 결합활성을 나타내는 것이 발견되었다. 또한 종래 지적되었던 내봉물의 누설을 저감하는 효과도 발견되었다.
또, 본 방법에 의하면 먼저 항체 등의 리간드-PEG 유도체를 형성하기 때문에, 종래법과 같은 열역학적으로 불안정한, 작용성 물질에 과잉의 관능기 PEG 지질유도체를 도입하지 않고 리간드-PEG 결합체 형성이 가능하다. 이 때문에, 종래의 관능기 PEG 지질에 의해 발생할 가능성이 있는 영향을 받지 않고, 리포솜 등의 작용성 물질 제조기술, 약제 등의 봉입기술 등 종래의 지견을 충분히 이용하여, 작용성 물질을 형성하는 것이 가능하다.
또, 종래법에서는 리간드 결합후에서도 활성기를 갖는 PEG 부분이 타성분 (생체내 투여의 경우는 생체성분) 과 반응하기 쉬운 경계근방에 과잉으로 잔존하게 되지만 이 문제점도 발생하지 않는다.
또 헤테로인 2가 반응성의 수용성 고분자 유도체를 이용함으로써, 항체 등 리간드의 활성저하를 초래할 우려가 있는 산화나 환원을 실시할 필요가 없다.
발명의 실시형태
이하에 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 수용성 고분자 유도체는 2가 반응성이다. 본 발명에서, 2가 반응성이란, 동일분자내에 있는 관능기와 반응할 수 있는 기가 2 개 있고, 또한, 이들이 다른 것인 경우를 말한다.
본 발명에 이용되는 수용성 고분자는 폴리에틸렌글리콜, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리글리세린, 폴리젖산, 폴리글리콜산, 폴리아미노산 등의 합성고분자로, 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜이다. 또, 폴리올 등의 생분해성 폴리머도 바람직하게 사용된다. 분자량은 약 500 ∼ 20000 이 바람직하고, 1500 ∼ 10000 이 보다 바람직하며, 더욱 바람직하게는 2000 내지 6000 이다.
본 발명의 수용성 고분자 유도체는 상기와 같은 수용성 고분자의 한쪽 말단에 티올기 부분 또는 S-아세틸티오기 부분을 갖고, 다른쪽 말단에 아미노기와의 반응성 부위를 갖는다.
티올기 또는 S-아세틸티오기는 직접 수용성 고분자에 부가하여도 되고, 또는 연결기로서 중간에 알킬렌, 카르보닐, 에스테르, 아미드 등을 통하여 결합하여도 된다.
아미노기와의 반응성 부위로서는, 그 카르보닐기 또는 수산기가 아미노기와의 축합반응을 할 수 있는 부위를 말한다. 구체적으로는, 숙신이미드에스테르, 이소티오시아네이트, 술포닐클로라이드, 카르보닐이미다졸 등을 이용하여 달성할 수 있지만, 보다 바람직하게는, 숙신이미드에스테르이다. 또한, 아미노기와의 반응성 부위도, 직접 수용성 고분자에 부가하여도 되며, 상기와 같은 연결기를 통하여 결합하여도 된다.
본 발명의 수용성 고분자 유도체는, 한정되지 않지만, 예를 들면, N-히드록시숙신이미드에스테르로 활성화된 폴리에틸렌글리콜과 메르캅토에틸아민을 반응함으로써, 또 아미노기를 갖는 폴리에틸렌글리콜에 S-아세틸티오글리콜산 N-히드록시숙신이미드에스테르 (SATA), S-아세틸티오프로피온산 N-히드록시숙신이미드에스테르 또는 S-아세틸티오아세트산·수화물을 반응시킴으로써 얻을 수 있다.
상기와 같이 하여 얻어진 본 발명의 2가 반응성 수용성 고분자 유도체는, 리간드와 작용성 물질을 결합한 복합체를 형성할 수 있다.
리간드는 바람직하게 아미노기를 갖고 있을 필요가 있고, 본 수용성 고분자의 아미노기와의 반응성 부위와 결합한다. 리간드로서는, 렉틴, 항원, 항체, 호르몬, 전달물질 등을 들 수 있고, 바람직하게는 항체이다. 또, 후술하는 복합체의 제조방법의 기술란에서 서술하고 있는 바와 같은 리간드도 사용가능하다.
아미노기를 갖는 리간드와 본 수용성 고분자와의 결합은, 수용액 중에서 리간드와 본 수용성 고분자를 혼합하여 상온에서 반응시킴으로써 용이하게 달성할 수 있다. 리간드에 대하는 고분자 유도체의 몰비는 약 0.3 ∼ 50 배가 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.8 ∼ 30 배 정도이다.
또한, 본 수용성 고분자로서 S-아세틸티오기를 부여한 고분자를 이용하는 경우에는, 상기와 같이 하여 리간드에 결합시킨 후, 탈아세틸하여 티올기로 한 후, 이하에서 서술하는 작용성 물질의 결합에 이용할 수 있다. 탈아세틸 조건은 실질적으로 리간드가 안정된 온화한 조건이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 히드록실아민을 이용하여 중성의 완충용액 중, 상온에서, 최종농도로 거의 20 mM 내지 200 mM 의 범위에서 반응시킴으로써 달성된다.
상기와 같이 하여, 리간드를 결합시킨 후, 본 수용성 고분자의 다른 말단에, 작용성 물질을 결합시킬 수 있다.
작용성 물질이란, 메토트렉세이트, 미토마이신C, 독솔비신, 다우노마이신 등의 저분자약제, 아미노플루오레세인, 플루오레세인카다베린, 루시페릴엘로우 카다베린, 퍼옥시다제, 알칼리포스파타제 등의 마커분자, 네오카르시노스타틴, 디프테리아톡신 A 사슬, 리신 A 사슬, 우로키나제, 엘라스타제, 아르기나제, 아스파라기나제, 스파옥시드디스뮤타제, 플라스미노겐 액티베이터, 인터류킨 2, TNF 등의 단백질, 엔돌핀, 칼시토닌, 브라디키닌, CRF 관련 펩티드 등의 펩티드미셀, 리포솜을 들 수 있지만, 본 발명에서 바람직한 것은, 미셀, 리포솜이다. 또한, 미셀, 리포솜 중에는, 의약품이나 진단약이 봉입되어 있어도 된다. 미셀에 대해서는 후술한다.
이들에 봉입할 수 있는 의약품으로서는 아드리아마이신, 다우노마이신, 빈브라스틴, 시스플라틴, 마이트마이신, 브레오마이신, 액티노마이신, 5-FU(플루오로우라실) 등의 항종양제, 티모롤 등의 아드레날린 차단제, 크로니딘 등의 고혈압제, 프로카인아미드 등의 제토제, 클로로키니네 등의 항말라리아제, 안포텐신 등의 항생물질, 및 이들의 약학적으로 허용될 수 있는 염 및 유도체 ; 리신 A 나 디프테리아톡신 등의 독소 단백질 및 이를 코드하는 DNA, TNF 등의 사이토카인 유전자를 코드하는 DNA, 안티센스 DNA 등의 누클레오티드류 등을 들 수 있다. 상기 항종양제 등의 약학적으로 허용될 수 있는 염으로서는, 다가 음이온성 물질과의 염, 예를 들면 구연산염, 타르타르산염, 글루타민산염이 바람직하다. 특히 바람직하게는 항종양제를 들 수 있다.
또, 진단약으로서는, 방사성원소, 예를 들면 인듐, 테크네슘 등의 이미징약제; 포슬러디수퍼옥시다제, 알칼리포스파타제 등의 효소 ; 유로퓸 유도체, 카르복시플루오레세인 등의 형광체 ; N-메틸아크리듐 유도체 등의 발광체 등을 들 수 있다.
이들 의약품 및 진단약용의 미셀, 리포솜으로의 도입은, 그 자체 공지의 통상 이용되는 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들면 미셀, 리포솜 형성시에 pH 균배 등의 농도균배를 형성시켜, 이 포텐셜을 구동력으로 이온화 가능한 약제를 편성시키는 방법 (Cancer Res.495922 (1989))을 이용하여도 된다.
작용성 물질에는 공지의 방법에 의해 티올기와의 반응성 부위를 부여시켜 이용한다. 즉, 말레이미드기, 알킬할라이드기, 아지리딘기, 피리딜디티오기 등에서 선택되는 반응기를 이용할 수 있지만, 바람직하게는 말레이미드기이다. 특별히 한정되는 것은 아니지만, 구체예로서는 말레이미드카프로일디팔미틴포스파티딜에탄올아민 (일본공개특허공보 평4-346918 호공보) 이나 말레이미드페닐부티로일포스파티딜에탄올아민 등의 말레이미드기 부분을 갖는 지질을 포스파티딜콜린이나 콜레스테롤과 함께 공지의 방법에 따라 리포솜화하므로써 (리포솜 2 장 노시마 외 편저 고난또(江南堂)(1988)) 말레이미드기 부분을 갖는 리포솜을 얻을 수 있다. 리포솜으로서는, MLV, LUV, SUV 등의 여러 가지의 리포솜을 이용할 수 있지만, 바람직하게는 LUV 이다.
또 N-숙신이미딜-6-말레이미드헥사노에이트와 단백질을 반응시킴으로써, 말레이미드 부분을 갖는 단백질을 얻을 수 있다. 또한 말레이미드 플루오레세인, 에옥신말레이미드 등의 형광색소를 이용할 수도 있다.
이들 티올 반응성기를 부여한 작용성 물질은, 상기에서 얻어진 티올기를 갖는 본 수용성 고분자 리간드 복합체와 중성부근의 완충액 중에서 혼합함으로써 용이하게 복합체화할 수 있고, 목적으로 하는 리간드-PEG-작용성 물질로 이루어지는 복합체를 얻을 수 있다. 또한 필요에 따라 한외여과, 겔여과 크로마토그래피 이온교환 크로마토그래피 등의 수법을 이용하여 정제하여 사용할 수 있다.
다음으로 본 발명의 복합체의 제조방법을 상세하게 설명한다.
본 발명의 제조방법의 개요를 도 5 에 나타낸다. 도면 중 고분자 (1) 는, 리간드 중의 관능기 A 와 반응성을 갖는 A' 부분 및 작용성 물질에 편성된 반응성 부분 B 와 결합하는 B' 부분으로 이루어진다. 즉, 상기의 2가 반응성 수용성 고분자 유도체인 고분자 (2) 는 B 와 결합하는 B 를 갖는다. B' 와 B 는 동일한 잔기이어도 된다. 이와 같이, 본 발명에 있어서는, 작용성 물질과 반응성을 갖는 1가 반응성 고분자가 결합되어 있어도 된다.
본 발명에서는, 먼저, 헤테로인 2가 반응성의 수용성 고분자 (1)를 리간드에 결합하고, 이어서 그의 다른 말단을 통하여 작용성 물질에 결합하며, 또한, 필요에 따라 작용성 물질과 반응성을 갖는 1가의 고분자 (2)를 결합하는 공정을 이용하여 복합체를 제조하는 것을 특징으로 한다.
리간드 중의 A 로서는 아미노기, 카르복실기, 당사슬 부분을 이용할 수 있지만, 바람직하게는 아미노기이다. 아미노기 반응성의 기로서 A' 는, 상기한 바와 같다.
B 및 B' 의 조합은, 실질적으로 B 가 리간드와 반응하지 않고, 특이적으로 B-B' 결합을 발생하는 조합에서 선택되지만, B' 로서 티올기, B 로서 티올반응성기로 하는 조합이 바람직하다. 티올기는 상기와 바와 같이 반응전에는 보호된 잠재적인 티올기, 즉, S-아세틸티오기이어도 되며, 이 경우는, 반응에 있어서 탈보호로 이용할 수 있다.
본 발명에 이용되는 리간드는, 상술의 다른 트랜스페린, EGF, 알파페이트프로테인 (AFP) 등의 단백질, 인슐린 등의 펩티드 또는 폴리크로날항체, 모노크로날항체 등의 항체에서 선택되는 리간드로, 그 전체이어도, 또 효소처리등으로 얻어지는 그 조각이어도 된다. 각종 질환의 치료용에 이용하는 경우는, 쥐, 인체의 키메라항체, 인체항체가 바람직하다.
수용성 고분자 1 및 2 는 상술의 수용성 고분자로서 예를 든 것이 이용되고, 고분자 (1) 및 (2) 는 다른 조합이어도 또 동일 조합이어도 된다.
리간드와 본 고분자 (1) 와의 반응은 상술한 바와 같다.
상술한 바와 같이, S-아세틸티오기를 부여한 고분자를 이용하는 경우는 리간드에 결합 후, 탈아세틸하여 티올기를 얻을 수 있다.
본 발명에서, 작용성 물질로서는 상기와 같은 것을 들 수 있지만, 특히 미셀, 리포솜이 바람직하다. 따라서, 이하, 복합체로서, 미셀, 리포솜을 대표예로서 본 발명을 설명하는 일도 있지만, 작용성 물질로서는 미셀, 리포솜에 한정되는 것은 아니다. 미셀은, 양친매성분자로 구성된다. 미셀을 구성하는 양친매성분자로서는, 친수성부분 및 소수성부분을 함유하여, 그 자체 공지의 통상 이용되는 방법으로 미셀을 형성할 수 있는 것이면 어떠한 것이어도 되며, 이들 중에서 적합한 양친매성분자로서는 지질을 들 수 있다.
본 발명에서의 미셀을 형성할 수 있는 지질로서는, 예를 들면, 천연포스파티딜콜린, 예를 들면 황란 포스파티딜콜린 (EYPC) 등 ; 포스파티딜콜린 (PC), 예를 들면 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 디미리스토일포스파티딜콜린 (DMPC), 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린 (DOPC) 등 ; 천연포스파티딜에탄올아민, 예를 들면 난황 포스파티딜에탄올아민 (EYPC) ; 포스파티딜에탄올아민 (PE), 예를 들면 디팔미토일포스파티딜에탄올아민 (DPPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE) 등 ; 포스파티딜글리세롤 (PG), 예를 들면 디팔미토일포스파티딜글리세롤 (DPPG) 등 ; 포스파티딜세린 (PS) ; 포스파티딜이노시톨 (PI) ; 포스파티딘산 (PA) 등의 인지질, 스핑고당지질, 글리세로당지질 등을 들 수 있다. 이들의 지질은 단독 또는 2 종 이상, 또는 이들과 콜레스테롤 등의 비극성지질과 조합하여 이용된다.
본 발명에서의 미셀에는, 상기 지질이나 비극성물질 외에, 리간드-고분자 (1) 복합체 및 고분자 (2) 와의 결합에 사용되는 지질유도체가 편성되어 이루어진다. 이와 같은 지질유도체로서는, 미셀에 편성된 반응성 부위 B, 즉, 티올기 반응성 부위로서 말레이미드기, 알킬할라이드기, 아지리딘기, 피리딜디티오기에서 선택된 반응기를 갖는 인지질유도체를 이용할 수 있지만, 바람직하게는 말레이미드기이다. 특별히 한정되는 것은 아니지만, 구체예로서는, 말레이미드카프로일디팔미틸 포스파티딜에탄올아민 (일본 공개특허공보 평4-346918 호공보) 나 말레이미드페닐부티로일포스파티딜에탄올아민 등의 말레이미드기 부분을 갖는 지질을 이용할 수 있다.
상기 지질유도체는, 미셀형성 양친매성분자에 대하여 0.1 ∼ 8 ㏖%, 바람직하게는 0.5 ∼ 3 ㏖%, 보다 바람직하게는 1 ∼ 3 ㏖% 의 조성비로 이용할 수 있다. 콜레스테롤은 미셀형성 양친매성분자에 대하여 0 ∼ 100 ㏖%, 바람직하게는 40 ∼ 70 ㏖% 의 조성비로 이용할 수 있다.
본 발명에서의 미셀은 어떠한 방법으로 제조되는 것이어도 되며, 상기 소재를 이용하여 그 자체 공지의 통상 이용되는 제조기술을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들면 유리벽에 부착시킨 지질박막에 수용액을 더하여 기계적진탕을 가하여 형성하는 멀티라메라리포솜 (MLV) 이나, 초음파처리법, 에탄올주입법, 프렌치프레스법에 의해 얻어지는 스몰유니라메라리포솜 (SUV), 계면활성제 제거법, 역상증발법 (리포솜 스나모또쥰죠 등 난꼬또(南洪堂)1988), MLV를 균일한 포어 지름을 갖는 막을 가압하여 압출하는 인스톨젼법 등으로부터 얻어지는 라쥬니라메라리포솜 (LUV)을 이용할 수 있다 (Liposome Technology, Vol.1 2nd Edition).
또한, 미셀에는, 의약품이나 진단용약제가 봉입되어 있어도 된다.
미셀에 봉일할 수 있는 의약품 진단약으로서는 상술한 바와 같다.
리간드-고분자 (1) 복합체와 리포솜, 미셀과의 반응은 약 4 ℃ ∼ 40 ℃에서 중성의 완충액 중에서 혼합함으로써 용이하게 달성할 수 있다. 또 티올이 보호되어 있는 경우는 반응전에 상술한 바와 같이 탈보호하여 이용할 수 있다.
반응시의 pH 는 약 5 ∼ 8 이 바람직하고, 보다 바람직하게는 5.5 ∼ 7.0 이다. 반응시에 1 mM 정도의 EDTA를 첨가할 수도 있다.
리간드-고분자 (1) 복합체는 미셀에 편성된 반응성 지질의 등량이하를 이용하여 반응시킨다. 소량의 리간드로 목적으로 하는 타겟팅 능력을 얻을 수 있는 경우는, 꼭 다량의 리간드를 결합시킬 필요는 없고, 잔존하는 미셀 상의 반응성기에 고분자 (2)를 더하여 반응시킬 수 있다. 또한, 고분자 (2)를 첨가함으로써, 예를 들면 의약품, 진단약으로서 사용하는 경우 미셀-고분자 (1)-리간드 복합체의 혈중에서의 체류성을 갖게 할 수 있다.
본 발명에서 고분자 (2) 로서는, 상술한 바와 같지만, 고분자 (2) 는 실질적으로 미셀과의 공유결합부만을 갖는다.
한정하는 것은 아니지만, 고분자 (2) 로서 예를 들면, 2,4-비스(폴리에틸렌글리콜)-6-클로로-S-트리아진과 시스틴으로 이루어지는 티올기를 갖는 PEG 유도체 (일본공개특허공보 평4-346918 호공보), N-프로피오네이트-3-(티올)메톡시폴리옥시에틸렌아민 (J. Controlled Release 28(1994) 155) 등을 이용할 수 있다.
고분자 (2) 는 미셀과 리간드-고분자 (1) 복합체의 반응후 추가로 계속 반응시켜도 되며, 미셀-리간드-고분자 (1) 복합체를 일단 정제하고나서 추가로 첨가하여도 된다.
첨가량은 미셀에 편성된 반응성지질의 0.2 ∼ 5 ㏖ 등량, 바람직하게는 0.5 ∼ 2 ㏖ 등량으로, 중성의 완충액 중에서 약 4 ℃ ∼ 40 ℃에서 혼합함으로써 용이하게 반응을 달성할 수 있다.
반응시의 pH는 약 5 ∼ 8 이 바람직하고, 보다 바람직하게는 5.5 ∼ 7.0 이다. 반응시에 1 mM 정도의 EDTA를 첨가할 수도 있다.
본 발명에서 얻어진 리간드 결합 미셀은, 추가로 필요에 따라 한외여과, 겔투과 크로마토그래피 이온 교환 크로마토그래피 등의 수법을 이용하여 정제하여 사용할 수 있다.
이하에 실시예를 나타내 더욱 상세한 설명을 하지만, 본 발명은 그 요지를 초과하지 않는 한 이들에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1
염화메틸렌 10 ㎖ 에 용해한 폴리(에틸렌글리콜)-비스-ω-아미노-α-카르복실(PEG 평균분자량 3400, Shearwater polymers, Inc) 1 g 에 S-아세틸티오글리콜산N-히드록시숙신이미드에스테르 (시그마, sigma) 74.8 ㎎ 및 트리에틸아민 k41 ㎕을 첨가하였다. 교반하여 용해 후, 다시 10 ㎎ 의 S-아세틸티오글리콜산 N-히드록시숙신이미드를 첨가하여 실온에서 3.5 시간 교반하여 반응하였다. 반응진행은 TLC (클로로포름/메탄올=85/10, 요오드발색, 이하 TLC 는 동일한 조건에서 실시하였다) 로 첨가한 폴리(에틸렌글리콜)-비스-ω-아미노-α-카르복실의 낮은 Rf의 점이 높은 Rf (약0.6) 로 이동함으로써 확인되었다.
질소하에 용매를 증류한 반응물에 클로로포름 10 ㎖를 첨가하여 용해하였다. 클로로포름으로 팽윤된 셉-펙(sep-pak, SILICA PLUS Wates사) 에 첨가하여 클로로포름/메탄올 (4/1 (v/v)) 로 용출함으로써 샘플을 전처리 (前處理) 하였다. 다시 질소하에 용매를 증류하여 클로로포름에 용해 후, 실리카겔칼럼 (로파칼럼 Lichroprep Si60 25 × 310 ㎝ 간또우카가꾸) 에 첨가하였다. 클로로포름으로 세정후, 클로로포름/메탄올 (85/15 (V/V)) 로 전개용리하여 TLC 의 Rf 가 약 0.6 의 주생성물을 뽑아서 정제하였다. 질소하에 용매를 증류하여 583 ㎎을 얻었다. 543 ㎎을 약 2 ㎖ 의 탈수한 염화메틸렌에 용해하여 디에틸에테르를 더하여 침전화하여 여과하여 취하고 진공펌프에서 감압건조하였다. 탈수한 염화메틸렌 5 ㎖ 에 용해한 후, N-히드록시숙신이미드 (시그마) 17.8 ㎎을 더하여 10 분간 교반하였다. 또한 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 31.9 ㎎을 첨가하여 질소분위기하에서, 교반하면서 실온에서 하룻밤 반응하였다. 침전물을 여과한 후, 질소하에 용매를 증류하여 소량의 탈수염화메틸렌에 용해하였다. 에틸에테르를 더하여 석출한 침전을 여과하고 취하여 진공펌프로 감압건조하여 TLC 로 단일 목적물 337 ㎎ (이하, Ac-S-PEG-Suc 로 표기)를 취득하였다.1H-NMR 에 의해 목적생성물을 확인하였다.
ppm 귀속
2.38 s 3H a
2.80∼2.85 m 4H i
2.88 t 2H h
3.40 dd 2H d
3.52 dd 2H e
3.55 s 2H b
3.60 - - f
3.82 t 2H g
6.65 s 1H c
또한, 인체γ글로불린으로의 결합실험에서 목적생성물을 확인하였다.
즉, 50 mM 인산완충액 (pH 7.0) 및 1 mM EDTA 로 이루어지는 완충액에 용해한 인체γ글로불린 (IgG, F(ab')2) (4.7 ㎎/㎖) 0.9 ㎖ 에, 탈수메탄올에 용해한 30 ㎎/㎖ 의 Ac-S-PEG-Suc를 첨가하였다. 첨가량은 항체 몰비에서 0 ∼ 8 배로 하고, 첨가량과 PEG 도입량의 관계를 조사하였다. Ac-S-PEG-Suc를 첨가하여 25 ℃에서 1 시간 반응 후, 세파크릴 S100 (파르마시아사제)를 이용하여, 상기와 동일한 완충액으로 전개함으로써 겔크로마토그래피 정제하여 미반응의 Ac-S-PEG-Suc (PEG 분자량 3.4 K) 와 항체 (분자량 100 K)를 분리하였다.
얻어진 수식항체의 일부에 대하여 히드록실아민으로 탈보호하였다. 즉 항체용액 0.9 ㎖ 에 0.1 ㎖의 히드록실아민용액 (0.5 M 히드록실아민, 0.5 MHEPES, 25 mM EDTA, pH 7.0)을 더하여 25 ℃, 10 분간 반응하여 탈아세틸 후, 0.1 M 인산완충액 pH6.0, 1mM EDTA 로 평형화한 PD-10 (파르마시아사제) 로 저분자를 제거하여 티올기를 갖는 항체를 얻었다. 항체에 도입된 티올기는 4,4' 디티오피리딘 (시그마사)를 이용하는 방법에 준하여 측정하였다 (조꾸세이카가꾸(續生化學)실험강좌 5 p109 일본생화학편). 대조로서 히드록실아민으로 탈보호처리를 하고 있지 않은 각 수식항체의 티올함량을 동일하게 측정하였다. 그 결과, 도 1 에 나타낸 바와 같이 Ac-S-PEG-Suc 로 수식한 인체 γ 글로블린은 히드록실아민으로 탈보호에 의해 발생하는 잠재적인 티올기, 즉 S-아세틸티오기를 갖고 있으며, 그것은 Ac-S-PEG-Suc 의 첨가량에 의존하여 증대되는 것이 확인되었다.
실시예 2
항 CEA 마우스 모노크로날항체 (IgG1, F(ab')2) 에 실시예 1 과 동일하게 Ac-S-PEG-Suc를 반응시켜 수식항체를 얻은 후, 양이온 교환수지로 항체단백을 정제하였다. 즉 반응액 (3.4 ㎎/㎖ 2 ㎖) 에 0.1 M 아세트산을 첨가하여 pH 4 로 조정하고, 0.1 M 아세트산 pH4.0 의 완충액으로 평형화한 2 ㎖ 베드의 SP 세파로스 (파르마시아사 제) 에 첨가하였다. 상기와 동일한 완충액 4 ㎖ 로 세정후 50 mM 인산완충액 (pH7.5) 으로 단백질을 용출하였다. 센트리콘 30 (아미콘사) 한외여과기로 완충액을 50 mM 인산완충액 (pH 7.0), 1 mM EDTA 로 조정한 후, 실시예 1 과 동일하게 히드록실아민을 더하여 탈보호하였다. SH 기가 부여된 항체는 PD-10에서 탈염 및 0.1 M 인산완충액 pH 6.0, 1 mM EDTA 용액으로 교환하여 이하에 서술하는 리포솜과의 결합에 이용하였다. 또한 Ac-S-PEG-Suc 및 Ac-S-PEG-Suc 의 가수분해물에 상당하는 Ac-S-PEG-COOH (실시예 1 에서 숙신이미드화 전의 화합물) 은 본 조건에서 SP 세팔로스에는 결합되어 있지 않았다.
또 대조로서 Ac-S-PEG-Suc 대신에 S-아세틸기와 숙신이미드기의 사이에 PEG 부분을 갖지 않는 S-아세틸티오글리콜산 N-히드록시숙신이미드에스테르 (시그마) (이하, SATA 라 칭하는 일도 있음)를 본 항체와 반응하여, PD-10 으로 탈염, 히드록실아민 탈보호, PD-10 탈염 (0.1 M 인산완충액 pH6.0, 1mM EDTA) 하여 동일하게 티올기가 부여된 항체를 조정하였다.
형광색소 카르복시플루오레세인을 봉입하고, 티올과의 반응성을 갖는 말레이미드화 인지질을 막성분으로 갖는 리포솜을 이용하여 상술 항체와의 결합을 검토하였다.
즉, 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC)/콜레스테롤 (CHOL)/말레이미드카프로일디팔미토일포스파티딜에탄올아민 (일본공개특허공보 평4-346918 호공보) 18/10/0.5 (몰비) 로 이루어지는 지질혼합 100 ㎎ 에 0.1 M 키르복실플루오레세인 수용액 (pH7 부근에 조정) 1 ㎖를 더하고 수화하여 멀티라메라리포솜을 제작하였다. 또한 압출기(extruder, LIpex Biomembranes)를 이용하여 0.1 ㎛ 의 폴리카보네이트막으로 정립 (整粒) 하였다.
항체와 리포솜의 결합은 0.1 M 구연산 완충액 pH6 중, 항체 최종농도 0.48 ㎎/㎖, 리포솜 최종농도 (지질로서) 19 ㎎/㎖ 로서 25 ℃에서 1 시간 반응함으로써 실시하여, 반응 후 세팔로스 CL6B (파르마시아사) 에 의해 겔여과 크로마토분리함으로써 미반응 항체 및 비봉입 카르복시플루오레세인을 분리제거하였다.
제작한 각 면역리포솜의 활성은 항원을 고정화한 96 구멍 플라스틱스플레이트 상으로의 결합량을 내봉한 카르복시플루오레세인의 형광량을 측정함으로써 실시하였다. 즉, 96 구멍 플레이트 (팔콘사) 에 20 ㎍/㎖ 의 항원 CEA를 50 ㎕/구멍만큼을 첨가하여 37 ℃, 2 시간 고정화하였다. CEA를 제거후 PBS 로 세정하고 5% 소혈청 알부민으로 블록킹하였다. PBS 로 세정후, 1% 소혈청 알부민으로 각 농도로 희석한 리포솜 용액을 50 ㎕/구멍 첨가하여, 4 ℃에서 90 분간 반응하였다. PBS 로 충분히 세정후, 2% 트리톤×100 함유 PBS를 100 ㎕/구멍 첨가하여 37 ℃에서 30 분 배양함으로써 리포솜으로부터 카르복시플루오레세인을 용출시켰다. 그 일부를 취해 PBS 로 희석하여 여기파장 492 ㎚, 형광파장 520 ㎚ 으로 형광측정을 실시하여 항원 플레이트에 결합된 리포솜량을 비교하였다.
그 결과, 도 2 에 나타낸 바와 같이, Ac-S-PEG-Suc를 이용하여 항체에 SH를 도입하여 제작한 면역리포솜에서 높은 결합활성이 나타났다.
실시예 3
실시예 2 의 리포솜 대신에 말레이미드 함유 형광색소인 플루오레세인말레이미드 (후나코시)를 이용하여 복합체를 제작하였다. 즉 실시예 2 에 나타낸 SH-PEG-항CEA 항체 (0.1 M 인산완충액 pH6.0, 1mM EDTA 용액) 2.5 ㎎/㎖, 0.35 ㎖ 에 플루오레세인말레이미드의 DMSO 용액 3.8 ㎎/㎖를 5 ㎕ 첨가하여 교반하면서 25 ℃에서 30 분 반응하였다.
반응후 PBS 로 평형화한 PD-1O (파르마시아) 로 겔여과함으로써 미반응의 플루오레세인말레이미드를 제거하였다. 495 ㎚ 과, 280 ㎚ 의 흡광도보다 플루오레세인말레이미드의 도입율을 산출한 바 1 항체당 0.9 분자의 플루오레세인말레이미드가 도입되었다. 본 형광라벨항체를 인체 위암세포주 MKN45 에 첨가하여, 인체혈청중 50 ㎍/㎖에서 빙냉하에 1 시간 혼합하였다. PBS 로 충분히 세정한 후, 플로우사이트미터로 암세포로의 결합을 관찰하였다. 그 결과, 도 3 에 나타낸 바와 같이 본 복합체가 암세포와 결합하여 형광을 나타내고 있는 것이 확인되었다.
실시예 4
클로로포름 1 ㎖ 에 PEG 디숙신이미딜숙시네이트 (니혼유시 샘프라이트 4001 PEG평균분자량 5000)을 20 ㎎ (4 μ㏖) 용해하였다. PEG 용액을 교반하면서 탈수한 메탄올에 용해한 메르캅토에틸아민염산염 (시그마) 4 μ㏖을 적하하였다. 또한 72 mM 트리에틸아민 (탈수메탄올 중) 56 ㎕을 첨가하였다. 질소분위기하에 실온에서 7 시간 반응한 후 닌히드린 반응에 의해 아미노기의 소비를 본 바, 닌히드린네거티브로 디숙신이미드 PEG 와 반응하고 있는 것이 확인되었다. 얻어진 SH-PEG-숙신이미드를 질소기류하에 건고하여 탈수 메탄올 1 ㎖ 에 재용해하였다. 불용물을 여과하여 이하의 항체와의 반응에 이용하엿다.
PEG 유도체 48.7 ㎕을 50 mM 인산완충액 pH 7.5, 1 mM EDTA 에 용해한 인체 γ 글로불린 3.9 ㎎/㎖, 0.5 ㎖ 에 교반하면서 첨가하고, 37 ℃에서 1 시간 진탕하였다. 미반응의 PEG 유도체와 항체는 0.1 M 인산완충액 pH6.0, 1mM EDTA 로 평형화한 세파덱스 G75 칼럼 (1.2 ㎝ × 12 ㎝)을 이용한 겔여과 크로마토그래피로 실시하였다. 동 완충액으로 전개하여 처음에 용출된 항체 부분을 모아 도입된 티올량을 실시예 1 과 동일하게 정량하였다. 그 결과, 항체 1 ㏖ 당 0.75 ㏖ 의 티올이 도입되었다.
또한 실시예 2 와 동일하게 리포솜으로 결합되어, 얻어진 리포솜을 SDS 전기영동으로 해석한 바 항체의 결합이 확인되었다.
실시예 5
카르복시플루오레세인의 누설비교
실시예 2 와 동일하게 제작한 항체결합 0.1 M 카르복시플루오레세인 봉입 리포솜에 추가로 티올화 폴리에틸렌글리콜 (일본공개특허공보 평4-346918 호공보)을 반응하여 항체 및 폴리에틸렌글리콜을 결합한 면역리포솜을 제작하였다. 20 mM 인산완충액, 0.3 M NaCl 로 평형화한 PD-10 칼럼으로 겔여과하여 미봉입의 카르복시플루오레세인을 제거하였다. 또한 37 ℃에서 배양하여 리포솜으로부터 누설되는 카르복시플루오레세인량을 측정하였다.
카르복시플루오레세인의 누설은 Shahinian 등 (BBA 1239 (1995) 157) 방법으로 정량화하였다. 즉 배양하고 있는 리포솜으로부터 일정시간후에 샘플링하여 상기와 동일한 완충액으로 희석하여 형광량 (여기파장 492 ㎚ 형광파장 520 ㎚)을 측정하였다. 동시에 리포솜을 2% SDS 에 더하여 가용화 (붕괴) 후의 형광량을 측정하였다. 봉입되어 있는 카르복시플루오레세인은 자기소광하고 있어 형광강도는 리포솜으로부터 누설된 카르복시플루오레세인량을 반영하는 것으로부터, 양자의 비로 누설량을 산출하였다.
도 4 에 나타낸 바와 같이 항체-PEG-리포솜은 비수식의 리포솜 (EMC-리포솜) 과 동등 이상의 안정성이 나타났다.
Shahinian 등 (BBA 1239 (1995) 157) 은 PEG 선단에 말레이미드기를 도입한 리포솜 (말레이미드-PEG-리포솜 또는 항체결합-PEG-리포솜) 이 PEG 부분이 없는 EMC-PE를 이용한 리포솜보다 큰 것을 나타내고 있는데, 본 방법으로 제작한 리포솜에서는 대응하는 EMC-리포솜과 동등이상의 안정성을 나타냈다.
실시예 6
실시예 2 와 동일하게 하여 카르복시플루오레세인 봉입항체결합 리포솜을 제작하였다. 또한 리포솜 반응액에 분자량 6000 의 PEG를 이용하여 제작한 티올화 폴리에틸렌글리콜 (일본공개특허공보 평4-346918 호공보)을 첨가하였다. 0.1 M 인산완충액 pH 6.0, 1mM EDTA 에 용해한 티올화 폴리에틸렌글리콜을 지질 100 ㎎ 에 대하여 2.5 μ㏖ 첨가하여 10 ℃에서 하룻밤 반응하였다. 반응후, 세팔로스 CL6B (파르마시아사) 에 의해 겔여과 크로마토분리함으로써 미반응 항체, 티올화 폴리에틸렌글리콜 및 비봉입 카르복시플루오레세인을 분리제거하였다.
또한 실시예 2 와 동일하게 항원을 고정화한 96 구멍 플라스틱스플레이트 상으로의 결합량을 내봉한 카르복시플루오레세인의 형광량을 측정하였다. 그 결과 티올화 폴리에틸렌글리콜로 입힌 항체결합 리포솜에서도 도 6 에 나타낸 바와 같이 Ac-S-PEG-Suc를 이용하여 항체에 SH를 도입하여 제작한 리포솜으로 높은 결합활성이 나타났다.
실시예 7
리포솜으로서 하기에 나타낸 아드리아마이신 봉입리포솜 및 항체로서 인체IgG를 이용하는 것 이외는 실시예 5 와 동일하게 하여 항체 및 PEG를 결합한 아드리아마이신 봉입리포솜 (PEG 면역리포솜)을 제작하였다. 대조로서 티올화 PEG 만을 결합한 리포솜 (PEG 리포솜) 및, 양자모두 결합하지 않는 리포솜 (리포솜)을 제작하였다.
아드리아마이신 봉입 리포솜은 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC)/콜레스테롤 (CHOL)/말레이미드카프로일디팔미토일포스파티딜에탄올아민 18/10/0.5 (몰비) 로 이루어지는 고형지질혼합물 100 ㎎ 당 1 ㎖ 의 0.3 M 구연산 완충액 pH4.0을 더하여 볼텍스믹서로 수화하여 멀티라메라리포솜을 제작, 이어서 이 리포솜을 순차적으로 200 ㎚ 및 100 ㎚ 의 포어 사이즈의 폴리카보네이트막을 장착한 압출기 (니혼유시 리포솜) 로 60 ℃ 에서 가온하면서 가압여과하여, 정립한 리포솜을 제작하였다. 또한 얻어진 리포솜용액을 1M NaOH 로 중화한 후, 지질중량의 1/10 중량의 아드리아마이신 (교와핫꼬우)를 첨가하여, 97% 이상의 아드리아마이신을 봉입함으로써 제작되었다.
각 리포솜의 혈중체류성을 비교하기 위해, 수컷 BALB/c 마우스에 아드리아마이신량으로서 2 ㎎/㎏을 꼬리정맥에서 투여하였다. 각 시간 후에 도살하여 혈장을 채취하였다. 아드리아마이신량을 Konno 등의 방법 (Cancer Res.474471(1987)) 에 따라 염산 에탄올로 추출후, 형광측정에 의해 정량하였다.
또한 유리 아드리아마이신은 투여후 신속하게 혈장에서 소실되어, 이 조건에서는 검출되지 않은 것으로부터, 검출된 아드리아마이신량은 각 리포솜체로서의 거동을 반영한다고 생각된다.
그 결과를 도 7 에 나타냈는데, 본 방법으로 제작한 항체 및 PEG를 결합한 아드리아마이신 봉입리포솜은 높은 혈중안정성을 나타냈다.
실시예 8
아드리아마이신을 봉입한 본 발명의 2가 반응성 수용성 고분자 유도체를 이용한 면역리포솜의 종양세포에 대한 항종양활성을 시험관 내에서 검증하였다. 인체 대장암에 반응성을 갖는 인체항체의 예를 이용하여, 이하에 나타내는 바와 같이 본 면역리포솜의 타겟 세포에 대한 선택적인 항종양효과가 확인되었다.
·대장암반응성 1-3-1 항체
통상적인 방법으로 IgG 에 클라스스위치하여 CHO 세포에서 발현한 일본공개특허공보 평5-304987 호 공보에 기재의 인체대장암 반응성 인체 모노크로날항체 1-3-1을 펩신소화에 의해 (일본공개특허공보 평4-346918 호 공보참조) F(ab') 단편으로 사용하였다.
항체의 반응성을 확인하는 목적으로 FITC 로 형광표식한 상기 항체를 제작하고, 인체 대장암세포 DLD-1 (다니뽕세이야꾸사제) 및 정상세포로서 인체 제대혈관내피세포유래 SV-3T (Agrec.Biol.Chem.55(11),2847-2853,1991) 에 대하는 반응성을 플로사이트미터로 측정하였다.
즉, 본 형광항체를 BSA 용액 (1% BSA를 함유하는 PBS) 으로 50 μg/㎖ 가 되도록 조제하여, 세포에 더하여 빙상에서 1 시간 반응시켰다. BSA 용액으로 1 회 세정후, 최종농도 2 μg/㎖ 의 프로피듐아이오다이드 (PI)를 더하여, 플로사이트미터 (FACScan 벡톤데킨손) 로 측정하였다.
생세포, 즉 PI 음성세포를 게팅조작에 의해 선택하여, FITC 의 형광강도를 나타내는 평균채널값에 대하여, 각각의 세포에서의 항체를 함유하지 않는 경우의 값을 백그라운드값으로 뺀 값을 도 8 에 나타냈다.
1-3-1 항체는, SV-3T 세포 8 보다도, DLD-1 세포에 대하여 높은 반응성이 확인되었다.
·면역리포솜의 제작
실시예 7 과 동일하게 하여 아드리아마이신 봉입 PEG 면역리포솜을 제작하였다.
·세포증식억제활성 (Cytotoxicity)
본 면역리포솜을 건강인에서 유래하는 혈청으로 순차적으로 희석하여 아드리아마이신 환산농도로 40 μg/㎖ 에서의 희석계열을 제작하였다. 세포에 첨가하여 37 ℃ 1 시간 배양한 후, 배지에서 1 회 세정하여 37 ℃에서 배양하였다. 리포솜샘플을 첨가하고 있지 않은 콘트롤이 합류하는 시점에서 MTT 측정검사 (J. Immunol. Methods,6555(1983)) 를 실시하여 세포수를 계측하였다.
각 리포솜 농도에서의 세포수를 콘트롤의 세포수를 100% 로 상대 표시하였다.
도 9 에 인체 DLD-1 세포 및 SV-3T 세포에 대한 증식억제활성을 나타냈다. 본 면역리포솜은 타겟인 대장암 DLD-1 에 대하여 보다 특이적인 억제효과를 나타냈다. 즉, 본 면역리포솜은 항종양효과를 갖는 것을 알 수 있다.
본 발명의 2가 반응성 수용성 고분자 유도체를 이용하면, 리간드 및 리포솜 등의 작용성 물질과 혼합, 반응시킴으로써, 용이하게 리간드-고분자-작용성 물질 복합체를 얻을 수 있다. 본 발명의 수용성 고분자 유도체에 의하면, 리간드의 활성저하나, 작용성 물질에 대한 영향을 방지할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 의하면, 항체 등의 리간드를 PEG 등의 고분자 유도체에 결합시킨 후 미셀에 결합시키기 때문에, 열역학적으로 불안정한 미셀에 대하여 PEG 등의 고분자 유도체를 과잉량 도입하지 않고, 따라서, 이들의 영향을 받지않고, 리간드결합체를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에서 미셀 중에 약물 등을 봉입한 경우, 내봉물의 누설을 저감시키는 것이 가능하고, 또, 항원 등의 표적분자에 대하여 높은 결합활성을 나타내는 것이 가능하다.

Claims (18)

  1. 아미노기와의 반응성 부위 및 티올기 부분 또는 S-아세틸티오기 부분을 갖는 것을 특징으로 하는 2가 반응성 수용성 고분자 유도체.
  2. 제 1 항에 있어서, 하기식 (Ⅰ)에서 나타나는 수용성 고분자 유도체:
    [화학식 1]
    [식중, S 는 티올기 부분 또는 S-아세틸티오기 부분을 나타내고, P 는 수용성 고분자를 나타내며, N 은 아미노기와의 반응성 부위를 나타낸다. 또, R1및 R2는 임의의 연결기를 나타내지만, R1및/또는 R2는 필수는 아니다].
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 수용성 고분자가 생분해성 폴리머 또는 폴리에틸렌글리콜인 고분자 유도체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항중의 어느 한 항에 있어서, 수용성 고분자가 폴리에틸렌글리콜인 고분자 유도체.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항중의 어느 한 항에 있어서, 아미노기와의 반응성 부위가 숙신이미드기인 고분자 유도체.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항중의 어느 한 항에 기재된 고분자 유도체를 통하여 리간드와 작용성 물질이 결합된 복합체.
  7. 제 6 항에 있어서, 하기식 (Ⅱ)에서 나타나는 복합체:
    [화학식 2]
    [식중, L 은 작용성 물질을 나타내고, A 는 리간드를 나타내며, S, R1, P, R2및 N 은 상기와 동일의미를 나타낸다].
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 작용성 물질이 저분자약제, 마커분자, 단백질, 미셀 및 리포솜에서 선택되는 복합체.
  9. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 작용성 물질이 리포솜 또는 미셀인 복합체.
  10. 제 6 항 내지 제 9 항중의 어느 한 항에 있어서, 리간드가 항체인 복합체.
  11. 제 6 항 내지 제 10 항중의 어느 한 항에 있어서, 작용성 물질에, 추가로, 작용성 물질과 반응성을 갖는 1가 반응성 수용성 고분자 유도체가 결합된 복합체.
  12. 제 6 항 내지 제 11 항중의 어느 한 항에 기재된 복합체를 함유하는 의약조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 항종양제로 사용되는 것을 특징으로 하는 의약조성물.
  14. 제 6 항 내지 제 11 항중의 어느 한 항에 기재된 복합체를 함유하는 진단약조성물.
  15. 제 6 항 내지 제 11 항중의 어느 한 항에 있어서, 제 1 항 내지 제 5 항의 어느 한 항에 기재된 2가 반응성 수용성 고분자 유도체를 리간드에 결합시키고, 이어서 수용성 고분자 유도체의 다른 말단을 통하여 작용성 물질에 결합시키는 공정으로 이루어지는 제조방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 추가로, 작용성 물질과 반응성을 갖는 1가 반응성 수용성 고분자 유도체를 결합시키는 공정을 함유하는 제조방법.
  17. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 2가 반응성 수용성 고분자 유도체와 리간드가, 리간드의 아미노기를 통하여 결합되어 있는 제조방법.
  18. 제 15 항 내지 제 17 항중의 어느 한 항에 있어서, 2가 반응성 수용성 고분자 유도체와 작용성 물질이, 2가 반응성 수용성 고분자 유도체의 티올기 부분을 통하여 미셀의 티올기 반응성 부분과 결합되어 있는 제조방법.
KR1019980037663A 1997-09-17 1998-09-12 2가 반응성 수용성 고분자 유도체 및 이들을 함유하는 복합체 KR19990029749A (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP25162497 1997-09-17
JP97-251624 1997-09-17
JP25162597 1997-09-17
JP97-251625 1997-09-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR19990029749A true KR19990029749A (ko) 1999-04-26

Family

ID=26540283

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019980037663A KR19990029749A (ko) 1997-09-17 1998-09-12 2가 반응성 수용성 고분자 유도체 및 이들을 함유하는 복합체

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20020025312A1 (ko)
EP (2) EP0903152B1 (ko)
KR (1) KR19990029749A (ko)
CN (1) CN1207323C (ko)
AT (1) ATE253942T1 (ko)
CA (1) CA2247764A1 (ko)
DE (1) DE69819644T2 (ko)
ES (1) ES2210635T3 (ko)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2001244602A1 (en) * 2000-03-30 2001-10-15 Ajinomoto Co. Inc. Drugs retained in target tissue over long time
AU2002357557A1 (en) 2002-05-14 2003-11-11 Beijing Jiankai Technology Co. Ltd. Targeted hydrophilic polymer, binders with interferon and medical composite comprising above binders
US8663650B2 (en) * 2003-02-21 2014-03-04 Ac Immune Sa Methods and compositions comprising supramolecular constructs
US7332164B2 (en) 2003-03-21 2008-02-19 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Heterobifunctional polymeric bioconjugates
US7807171B2 (en) * 2003-07-25 2010-10-05 Ac Immune Sa Therapeutic vaccine targeted against P-glycoprotein 170 for inhibiting multidrug resistance in the treatment of cancers
US20080026995A1 (en) * 2003-07-25 2008-01-31 Ac Immune Sa Therapeutic vaccine targeted against p-glycoprotein 170 for inhibiting multidrug resistance in the treatment of cancers
US7361516B2 (en) * 2004-09-24 2008-04-22 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Field of modular multifunctional ligands
AU2006239315B2 (en) * 2005-04-28 2012-03-01 Ventana Medical Systems, Inc. Enzymes conjugated to antiobodies via a PEG heterobifuctional linker
DK2963011T3 (en) 2005-11-23 2018-08-06 Ventana Med Syst Inc MOLECULAR CONJUGATE
FR2949469A1 (fr) * 2009-08-25 2011-03-04 Sanofi Aventis Derives anticancereux, leur preparation et leur application en therapeutique
EP3527220A1 (en) 2010-08-12 2019-08-21 AC Immune S.A. Vaccine engineering
US9687447B2 (en) 2010-10-26 2017-06-27 Ac Immune S.A. Method for preparing liposome-based constructs
CN102743585B (zh) * 2012-06-25 2013-09-18 李庆付 一种治疗灭杀艾滋病病毒复方中草药胶囊及制备方法
US10076326B2 (en) 2015-09-23 2018-09-18 Ethicon Llc Surgical stapler having current mirror-based motor control
PL3623390T3 (pl) 2015-12-29 2024-04-02 Galderma Holding SA Węglowodanowy środek sieciujący
EP3252082A1 (en) * 2016-05-31 2017-12-06 Galderma S.A. Method for deacetylation of biopolymers
PL417159A1 (pl) 2016-05-11 2017-11-20 Instytut Biologii Doświadczalnej Im. Marcelego Nenckiego Koniugaty białka prionowego z dendrymerami do zastosowania w leczeniu choroby Alzheimera
PT3623390T (pt) 2016-05-31 2023-10-27 Galderma Sa Reticulador de hidrato de carbono
AU2020395955A1 (en) 2019-12-02 2022-07-14 Galderma Holding SA High molecular weight esthetic compositions

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4429008B1 (en) * 1981-12-10 1995-05-16 Univ California Thiol reactive liposomes
US5024834A (en) * 1988-07-12 1991-06-18 Cetus Corporation Thioether linked immunotoxin conjugates
US5527528A (en) * 1989-10-20 1996-06-18 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Solid-tumor treatment method
JP3220180B2 (ja) * 1991-05-23 2001-10-22 三菱化学株式会社 薬剤含有タンパク質結合リポソーム
CA2072249C (en) * 1991-06-28 2003-06-17 Saiko Hosokawa Human monoclonal antibody specifically binding to surface antigen of cancer cell membrane
JP3351476B2 (ja) * 1993-01-22 2002-11-25 三菱化学株式会社 リン脂質誘導体及びそれを含有するリポソーム
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US6214388B1 (en) * 1994-11-09 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
AU7282698A (en) * 1997-05-15 1998-12-08 Theratech, Inc. Targeted delivery to t lymphocytes
EP1118334A1 (en) * 2000-01-11 2001-07-25 Aventis Behring Gesellschaft mit beschränkter Haftung Method for the production of conjugates and uses thereof for the prevention and treatment of allergic reactions and autoimmune diseases
EP1118335A1 (en) * 2000-01-11 2001-07-25 Aventis Behring GmbH Method for the production of conjugates for the treatment of allergic reactions and autoimmune diseases

Also Published As

Publication number Publication date
ES2210635T3 (es) 2004-07-01
CA2247764A1 (en) 1999-03-17
ATE253942T1 (de) 2003-11-15
EP1352662A1 (en) 2003-10-15
EP0903152B1 (en) 2003-11-12
US20020025312A1 (en) 2002-02-28
EP0903152A3 (en) 1999-07-07
CN1214348A (zh) 1999-04-21
EP0903152A2 (en) 1999-03-24
CN1207323C (zh) 2005-06-22
DE69819644D1 (de) 2003-12-18
DE69819644T2 (de) 2004-10-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR19990029749A (ko) 2가 반응성 수용성 고분자 유도체 및 이들을 함유하는 복합체
Marqués-Gallego et al. Ligation strategies for targeting liposomal nanocarriers
US5264221A (en) Drug-containing protein-bonded liposome
EP0932391B1 (en) Fusogenic liposome composition and method
US7060291B1 (en) Modular targeted liposomal delivery system
US6936272B2 (en) 10139483Therapeutic liposome composition and method of preparation
JP3351476B2 (ja) リン脂質誘導体及びそれを含有するリポソーム
EP1174126B1 (en) Antibody and polyalkylene glycol-bonded liposome
US20080241161A1 (en) Remedy for mammary cancer
Stephenson et al. Folate receptor-mediated targeting of liposomal drugs to cancer cells
Emanuel et al. Preparation and characterization of doxorubicin-loaded sterically stabilized immunoliposomes
US20050074499A1 (en) Ligand-bonded complex
JP4385152B2 (ja) ２価反応性水溶性高分子誘導体及びそれを含有する複合体
Allen et al. Targeted sterically stabilized liposomal drug delivery
Goldstein et al. The design and evaluation of a novel targeted drug delivery system using cationic emulsion–antibody conjugates
WO1993025225A1 (en) Liposomal formulations for administering to cancer patients
EP1231895B1 (en) Modular targeted liposomal delivery system
EP1170018A1 (en) Ligand-bonded complex
JPH07291853A (ja) リポソームおよび薬物運搬体
Hirota et al. Targeting cancer therapy in mice by use of newly developed immunoliposomes bearing adriamycin
Misra et al. Functionalized liposomes: A nanovesicular system
EP1214935A2 (en) Fusogenic liposome composition and method
US20080069867A1 (en) Diagnostic and/or Remedy for Ovarian Cancer
AU736055B2 (en) Fusogenic liposome composition and method
AU761204B2 (en) Fusogenic liposome composition and method

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid