ES2637065T3

ES2637065T3 - Múltiples variantes de la proteína meningocócica NMB1870

Info

Publication number: ES2637065T3
Application number: ES10182503.2T
Authority: ES
Inventors: Maurizio Comanducci; Mariagrazia Pizza
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2002-11-22
Filing date: 2003-11-21
Publication date: 2017-10-10
Anticipated expiration: 2023-11-21
Also published as: HK1088342A1; US9550814B2; ES2436747T3; US20060251670A1; HUE034257T2; US20120148617A1; DK2258716T3; WO2004048404A2; US20170290902A1; AU2003288681A1; JP4767540B2; JP2013176371A; EP2261239A3; SI1562983T1; MXPA05005442A; RU2336091C2; CY1119019T1; EP2261239B1; GB0227346D0; JP2006521782A

Abstract

Una composición que comprende (a) una primera proteína que es capaz de inducir anticuerpos bactericidas, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 24, y (b) una segunda proteína que es capaz de inducir anticuerpos bactericidas, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 41; en la que las primera y segunda proteínas tienen menos de 75 % de identidad de secuencia entre sí.

Description

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linfocinas [76], proteínas estreptocócicas, hormonas [76], factores de crecimiento [76], toxina A o B de C. difficile [77], proteínas de captación de hierro [78], etc. Una proteína vehículo preferida es el toxoide de la difteria CRM197 [79].

Estarán presentes típicamente antígenos en la composición a una concentración de al menos 1 μg/ml cada uno. En general, la concentración de cualquier antígeno dado será suficiente para inducir una respuesta inmunitaria contra ese antígeno.

Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden usarse de forma terapéutica (es decir para tratar una infección existente) o profiláctica (es decir para prevenir infección futura).

Como alternativa al uso de antígenos proteicos en las composiciones inmunogénicas de la invención, puede usarse ácido nucleico (preferentemente ADN, por ejemplo, en forma de un plásmido) que codifica el antígeno.

Las composiciones particularmente preferidas de la invención incluyen uno, dos o tres de: (a) antígenos de sacáridos de serogrupos de meningococo Y, W135, C y (opcionalmente) A; (B) un antígeno de sacárido de Haemophilus influenzae tipo B; y/o (c) un antígeno de Streptococcus pneumoniae.

Serogrupos de meningococo Y, W135, C y (opcionalmente) A

Se han conocido durante muchos años vacunas de polisacáridos contra los serogrupos A, C, W135 e Y. Estas vacunas (MENCEVAX ACWY™ y MENOMUNE™) se basan en los polisacáridos capsulares de los organismos y, aunque son eficaces en adolescentes y adultos, proporcionan una respuesta inmunitaria escasa y protección de corta duración, y no pueden usarse en niños.

A diferencia de los antígenos polisacáridos no conjugados en estas vacunas, las vacunas del serogrupo C recientemente aprobadas (Menjugate™ [80,28], Meningitec™ y NeisVac-C™) incluyen sacáridos conjugados. Menjugate™ y Meningitec™ tienen antígenos oligosacáridos conjugados con un vehículo de CRM197, mientras que NeisVac-C™ usa el polisacárido completo (des-O-acetilado) conjugado con un vehículo de toxoide del tétanos. La vacuna MenActra™ propuesta contiene antígenos de sacáridos capsulares conjugados de cada uno de los serogrupos Y, W135, C y A.

Las composiciones de la presente invención preferentemente incluyen antígenos de sacáridos capsulares de uno o más de los serogrupos de meningococo Y, W135, C y (opcionalmente) A, en los que los antígenos se conjugan con una proteína o proteínas vehículos y/o son oligosacáridos. Por ejemplo, la composición puede incluir un antígeno de sacárido capsular de: serogrupo C; serogrupos A y C; serogrupos A, C y W135; serogrupos A, C e Y; serogrupos C, W135 e Y; o de los cuatro serogrupos A, C, W135 e Y.

Una cantidad típica de cada antígeno de sacárido meningocócico por dosis es de entre 1 μg y 20 μg, por ejemplo de aproximadamente 1 μg, aproximadamente 2,5 μg, aproximadamente 4 μg, aproximadamente 5 μg o aproximadamente 10 μg (expresado como sacárido).

Cuando una mezcla comprende sacáridos capsulares de ambos serogrupos A y C, la relación (p/p) de sacárido MenA:sacárido MenC puede ser mayor de 1 (por ejemplo 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 o mayor). Cuando una mezcla comprende sacáridos capsulares del serogrupo Y y uno o ambos de los serogrupos C y W135, la relación (p/p) de sacárido MenY:sacárido MenW135 puede ser mayor de 1 (por ejemplo 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 o mayor) y/o que la relación (p/p) de sacárido MenY:sacárido MenC puede ser menor de 1 (por ejemplo 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, o menor). Son relaciones preferidas (p/p) para sacáridos de serogrupos A:C:W135:Y: 1:1:1:1; 1:1:1:2; 2:1:1:1; 4:2:1:1; 8:4:2:1; 4:2:1:2; 8:4:1:2; 4:2:2:1; 2:2:1:1; 4:4:2:1; 2:2:1:2; 4:4:1:2 y 2:2:2:1. Son relaciones preferidas (p/p) para sacáridos de serogrupos C:W135:Y: 1:1:1; 1:1:2; 1:1:1; 2:1:1; 4:2:1; 2:1:2; 4:1:2; 2:2:1 y 2:1:1. Se prefiere usar una masa sustancialmente igual de cada sacárido.

Se usarán en general sacáridos capsulares en forma de oligosacáridos. Estos se forman convenientemente por fragmentación de polisacárido capsular purificado (por ejemplo mediante hidrólisis), que habitualmente se seguirá de purificación de los fragmentos del tamaño deseado.

Se realiza preferentemente fragmentación de polisacáridos para proporcionar un grado promedio final de polimerización (DP) en el oligosacárido de menos de 30 (por ejemplo entre 10 y 20, preferentemente aproximadamente 10 para el serogrupo A, entre 15 y 25 para los serogrupos W135 e Y, preferentemente aproximadamente 15-20; entre 12 y 22 para el serogrupo C; etc.). Puede medirse el DP convenientemente mediante cromatografía de intercambio iónico o mediante ensayos colorimétricos [81].

Si se realiza hidrólisis, el tamaño del hidrolizado se elegirá en general para retirar oligosacáridos de longitud corta [29]. Esto puede conseguirse de diversas maneras, tal como ultrafiltración seguida de cromatografía de intercambio iónico. Se retiran preferentemente oligosacáridos con un grado de polimerización de menos de o igual a aproximadamente 6 para el serogrupo A y los de menos de aproximadamente 4 se retiran preferentemente para los serogrupos W135 e Y.

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Se desvelan antígenos de sacáridos MenC preferidos en la referencia 80, como se usa en Menjugate™.

El antígeno de sacárido puede modificarse químicamente. Esto es particularmente útil para reducir la hidrólisis para el serogrupo A [82; véase posteriormente]. Puede realizarse des-O-acetilación de sacáridos meningocócicos. Para oligosacáridos, la modificación puede tener lugar antes o después de la despolimerización.

Cuando una composición de la invención incluye un antígeno de sacárido MenA, el antígeno es preferentemente un sacárido modificado en el que uno o más de los grupos hidroxilo en el sacárido nativo se han reemplazado por un grupo de bloqueo [82]. Esta modificación mejora la resistencia a la hidrólisis.

El número de unidades de monosacáridos que tienen grupos de bloqueo puede variar. Por ejemplo, todas o sustancialmente todas las unidades de monosacáridos pueden tener grupos de bloqueo. Como alternativa, al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de las unidades de monosacáridos pueden tener grupos de bloqueo. Al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 unidades de monosacáridos pueden tener grupos de bloqueo.

De forma similar, el número de grupos de bloqueo en una unidad de monosacárido puede variar. Por ejemplo, el número de grupos de bloqueo en una unidad de monosacárido puede ser 1 o 2. El grupo de bloqueo estará en general en la posición 4 y/o la posición 3 de las unidades de monosacáridos.

La unidad de monosacárido terminal puede tener o no un grupo de bloqueo en lugar de su hidroxilo nativo. Se prefiere conservar un grupo hidroxilo anomérico libre en una unidad de monosacárido terminal para proporcionar un punto de conexión para reacciones posteriores (por ejemplo conjugación). Los grupos hidroxilo anoméricos pueden convertirse en grupos amino (-NH2 o -NH-E, donde E es un grupo protector de nitrógeno) mediante aminación reductora (usando, por ejemplo, NaBH3CN/NH4Cl), y pueden después regenerarse después de haberse convertido otros grupos de hidroxilo en grupos de bloqueo.

Los grupos de bloqueo para reemplazar grupos hidroxilo pueden ser accesibles directamente mediante una reacción de derivatización del grupo hidroxilo, es decir reemplazando el átomo de hidrógeno del grupo hidroxilo con otro grupo. Los derivados adecuados de grupos hidroxilo que actúan como grupos de bloqueo son, por ejemplo, carbamatos, sulfonatos, carbonatos, ésteres, éteres (por ejemplo, silil éteres o alquil éteres) y acetales. Algunos ejemplos específicos de dichos grupos de bloqueo son alilo, Aloc, bencilo, BOM, t-butilo, tritilo, TBS, TBDPS, TES, TMS, TIPS, PMB, MEM, MOM, MTM, THP, etc. Otros grupos de bloqueo que no son directamente accesibles y que reemplazan completamente el grupo hidroxilo incluyen alquilo C1-12, alquilo C3-12, arilo C5-12, arilo C5-12-alquilo C1-6, NR1R2 (R1 y R2 se definen en el siguiente párrafo), H, F, Cl, Br, CO2H, CO2(alquilo C1-6), CN, CF3, CCl3, etc. Son grupos de bloqueo preferidos los grupos que retiran electrones.

Son grupos de bloqueo preferidos los de la fórmula: -O-X-Y u -OR3 en la que: X es C(O), S(O) o SO2; Y es alquilo C112, alcoxi C1-12, cicloalquilo C3-12, arilo C5-12 o arilo C5-12-alquilo C1-6, cada uno de los cuales puede sustituirse opcionalmente con 1, 2 o 3 grupos seleccionados de forma independiente de F, Cl, Br, CO2H, CO2(alquilo C1-6), CN, CF3 o CCl3; o Y es NR1R2; R1 y R2 se seleccionan independientemente de H, alquilo C1-12, cicloalquilo C3-12, arilo C512, arilo C5-12-alquilo C1-6; o R1 y R2 pueden unirse para formar un grupo heterocíclico saturado C3-12; R3 es alquilo C112 o cicloalquilo C3-12, cada uno de los cuales puede sustituirse opcionalmente con 1, 2 o 3 grupos seleccionados de forma independiente de F, Cl, Br, CO2(alquilo C1-6), CN, CF3 o CCl3; o R3 es arilo C5-12 o arilo C5-12-alquilo C1-6, cada uno de los cuales puede sustituirse opcionalmente con 1, 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados de F, Cl, Br, CO2H, CO2(alquilo C1-6), CN, CF3 o CCl3. Cuando R3 es alquilo C1-12 o cicloalquilo C3-12, este se sustituye típicamente con 1, 2 o 3 grupos como se ha definido anteriormente. Cuando se unen R1 y R2 para formar un grupo heterocíclico saturado C3-12, se entiende que R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno forman un grupo heterocíclico saturado que contiene cualquier número de átomos de carbono entre 3 y 12 (por ejemplo C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12). El grupo heterocíclico puede contener 1 o 2 heteroátomos (tales como N, O o S) distintos del átomo de nitrógeno. Son ejemplos de grupos heterocíclicos saturados C3-12 pirrolidinilo, piperidinilo, morfolinilo, piperazinilo, imidazolidinilo, acetidinilo y aziridinilo.

Los grupos de bloqueo -O-X-Y y -OR3 pueden prepararse a partir de grupos -OH por procedimientos de derivatización convencionales, tales como reacción del grupo hidroxilo con un acil haluro, alquil haluro, sulfonil haluro, etc. Por lo tanto, el átomo de oxígeno en -O-X-Y es preferentemente el átomo de oxígeno del grupo hidroxilo, mientras que el grupo -X-Y en -O-X-Y reemplaza preferentemente el átomo de hidrógeno del grupo hidroxilo.

Como alternativa, los grupos de bloqueo pueden ser accesibles mediante una reacción de sustitución, tal como una sustitución de tipo Mitsonobu. Se conocen bien estos y otros procedimientos de preparación de grupos de bloqueo a partir de grupos hidroxilo.

Más preferentemente, el grupo de bloqueo es -OC(O)CF3 [83], o un grupo carbamato -OC(O)NR1R2, donde R1 y R2 se seleccionan independientemente de alquilo C1-6. Más preferentemente, R1 y R2 son ambos metilo, es decir el grupo de bloqueo es -OC(O)NMe2. Los grupos de bloqueo de carbamato tienen un efecto estabilizante en el enlace glucosídico y pueden prepararse en condiciones suaves.

Los sacáridos MenA modificados preferidos contienen n unidades de monosacáridos, donde al menos h% de las

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10 %, 20, 30 %, 40 %, 50 % o 60 % de los grupos Z pueden ser OAc. Preferentemente, aproximadamente el 70 % de los grupos Z son OAc, siendo el resto de los grupos Z OH o grupos de bloqueo como se ha definido anteriormente. Al menos aproximadamente 7 % de los grupos Q son grupos de bloqueo. Preferentemente, al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o incluso 100 % de los grupos Q son grupos de bloqueo.

Los polisacáridos capsulares meningocócicos se preparan típicamente por un procedimiento que comprende las etapas de precipitación de polisacáridos (por ejemplo usando un detergente catiónico), fraccionamiento de etanol, extracción de fenol en frío (para retirar proteínas) y ultracentrifugación (para retirar LPS) [por ejemplo ref. 84]. Un procedimiento más preferido [30], sin embargo, implica precipitación de polisacárido seguida de solubilización del polisacárido precipitado usando un alcohol inferior. La precipitación puede realizarse usando un detergente catiónico tal como sales de tetrabutilamonio y cetiltrimetilamonio (por ejemplo, las sales de bromuro), o bromuro de hexadimetrina y sales de miristiltrimetilamonio. Se prefiere en particular bromuro de cetiltrimetilamonio (“CTAB”) [85]. Puede conseguirse solubilización del material precipitado usando un alcohol inferior tal como metanol, propan-1-ol, propan-2-ol, butan-1-ol, butan-2-ol, 2-metil-propan-1-ol, 2-metil-propan-2-ol, dioles, etc., pero el etanol es particularmente adecuado para solubilizar complejos de CTAB-polisacárido. Se añade preferentemente etanol al polisacárido precipitado para proporcionar una concentración final (basada en el contenido total de etanol y agua) de entre 50% y 95%.

Después de la resolubilización, el polisacárido puede tratarse adicionalmente para retirar contaminantes. Esto es particularmente importante en situaciones en las que no es aceptable una contaminación incluso mínima (por ejemplo para producción de vacunas humanas). Esto implicará típicamente una o más etapas de filtración, por ejemplo, puede usarse filtración profunda, filtración mediante carbono activado, filtración por tamaño y/o ultrafiltración. Una vez filtrado para retirar los contaminantes, el polisacárido puede precipitarse para tratamiento y/o procesamiento adicional. Esto puede conseguirse convenientemente intercambiando cationes (por ejemplo mediante la adición de sales de calcio o sodio).

Como alternativa a la purificación, pueden obtenerse sacáridos capsulares de la presente invención por síntesis total

o parcial, por ejemplo se desvela síntesis de Hib en ref. 86, y síntesis de MenA en ref. 87.

Las composiciones de la invención comprenden sacáridos capsulares de al menos dos serogrupos de N. meningitidis. Los sacáridos se preparan preferentemente por separado (incluyendo cualquier fragmentación, conjugación, modificación, etc.) y después se mezclan para proporcionar una composición de la invención.

Cuando la composición comprende sacárido capsular del serogrupo A, sin embargo, se prefiere que el sacárido del serogrupo A no se combine con el otro sacárido o los otros sacáridos hasta poco antes de su uso, para minimizar el potencial de hidrólisis. Esto puede conseguirse convenientemente teniendo el componente del serogrupo A (típicamente junto con excipientes apropiados) en forma liofilizada y el componente o los componentes del otro serogrupo en forma líquida (también con excipientes apropiados), usándose los componentes líquidos para reconstituir el componente de MenA liofilizado cuando esté listo para su uso. Cuando se usa un adyuvante de sal de aluminio, se prefiere incluir el adyuvante en el vial que contiene la vacuna líquida, y liofilizar el componente de MenA sin adyuvante.

Una composición de la invención puede por lo tanto prepararse a partir de un kit que comprende: (a) sacárido capsular de serogrupo A de N. meningitidis, en forma liofilizada; y (b) los antígenos adicionales de la composición, en forma líquida. La invención también proporciona un procedimiento para preparar una composición de la invención, que comprende mezclar un sacárido capsular liofilizado del serogrupo A de N. meningitidis con los antígenos adicionales, en el que dichos antígenos adicionales están en forma líquida.

La invención también proporciona un kit que comprende: (a) un primer recipiente que contiene sacáridos capsulares de dos o más de los serogrupos de N. meningitidis C, W135 e Y, todos en forma liofilizada; y (b) un segundo recipiente que contiene en forma líquida (i) una composición que, después de la administración a un sujeto, es capaz de inducir una respuesta de anticuerpos en ese sujeto, en el que la respuesta de anticuerpo es bactericida contra dos o más (por ejemplo 2 o 3) de los linajes hipervirulentos A4, ET-5 y el linaje 3 del serogrupo B de N. meningitidis,

(ii) sacáridos capsulares de ninguno o uno de los serogrupos de N. meningitidis C, W135 e Y, y opcionalmente (iii) antígenos adicionales (véase posteriormente) que no incluyen sacáridos capsulares meningocócicos, en el que la reconstitución de los contenidos del recipiente (a) por los contenidos del recipiente (b) proporciona una composición de la invención.

Dentro de cada dosis, la cantidad de un antígeno de sacárido individual generalmente será de entre 1-50 μg (medido como masa de sacárido), prefiriéndose aproximadamente 2,5 μg, 5 μg o 10 μg de cada uno. Con relaciones en peso de A:C:W135:Y de 1:1:1:1; 1:1:1:2; 2:1:1:1; 4:2:1:1; 8:4:2:1; 4:2:1:2; 8:4:1:2; 4:2:2:1; 2:2:1:1; 4:4:2:1; 2:2:1:2; 4:4:1:2 y 2:2:2:1, por lo tanto, la cantidad representada por el número 1 es preferentemente de aproximadamente 2,5 μg, 5 μg o 10 μg. Para una relación 1:1:1:1 de composición de A:C:W:Y y 10 μg por sacárido, por lo tanto, se administran 40 μg de sacárido por dosis. Las composiciones preferidas tienen aproximadamente los siguientes μg de sacárido por dosis:

A: 10 0 0 0 10 5 2,5

C: 10 10 5 2,5 5 5 2,5

W135: 10 10 5 2,5 5 5 2,5

Y: 10 10 5 2,5 5 5 2,5

Las composiciones preferidas de la invención comprenden menos de 50 μg de sacárido meningocócico por dosis. Otras composiciones preferidas comprenden ≤40 μg de sacárido meningocócico por dosis. Otras composiciones

5 preferidas comprenden ≤30 μg de sacárido meningocócico por dosis. Otras composiciones preferidas comprenden ≤25 μg de sacárido meningocócico por dosis. Otras composiciones preferidas comprenden <20 μg de sacárido meningocócico por dosis. Otras composiciones preferidas comprenden ≤10 μg de sacárido meningocócico por dosis, pero idealmente, las composiciones de la invención comprenden al menos 10 μg de sacárido meningocócico por dosis.

10 Los conjugados de MenC Menjugate™ y NeisVac™ usan un adyuvante de hidróxido, mientras que Meningitec™ usa un fosfato. Es posible en composiciones de la invención adsorber algunos antígenos en un hidróxido de aluminio pero teniendo otros antígenos en asociación con un fosfato de aluminio. Para combinaciones de serogrupos tetravalentes, por ejemplo, están disponibles las siguientes permutaciones:

Serogrupo: Sal de aluminio (H = un hidroxilo; P = un fosfato)

A: P H P H H H P P P H H H P P P H

C: P H H P H H P H H P P H P H P P

W135: P H H H P H H P H H P P P P H P

Y: P H H H H P H H P P H P H P P P

15 Para combinaciones de serogrupos de N. meningitidis trivalentes, están disponibles las siguientes permutaciones:

Serogrupo: Sal de aluminio (H = un hidróxido; P = un fosfato)

C: P H H H P P P H

W135: P H H P H P H P

Y: P H P H H H P P

Haemophilus influenzae tipo B

Cuando la composición incluye un antígeno de H. influenzae de tipo B, este será típicamente un antígeno de sacárido capsular Hib. Se conocen bien antígenos de sacáridos de H. influenzae b.

20 Provechosamente, el sacárido Hib está conjugado covalentemente con una proteína vehículo, para potenciar su inmunogenicidad, especialmente en niños. La preparación de conjugados de polisacáridos en general, y del polisacárido capsular Hib en particular, está bien documentada [por ejemplo referencias 88 a 96, etc.]. La invención puede usar cualquier conjugado de Hib adecuado. Se describen posteriormente proteínas vehículos adecuadas, y son vehículos preferidos para sacáridos Hib CRM197 (“HbOC”), toxoide del tétanos (“PRP-T”) y el complejo de

25 membrana externa de N. meningitidis (“PRP-OMP”).

El resto de sacárido del conjugado puede ser un polisacárido (por ejemplo polirribosilribitol fosfato (PRP) de longitud completa), pero se prefiere hidrolizar polisacáridos para formar oligosacáridos (por ejemplo PM de ~1 a ~5 kDa).

Un conjugado preferido comprende un oligosacárido Hib unido covalentemente con CRM197 mediante un enlazador de ácido adípico [97, 98]. El toxoide del tétanos también es un vehículo preferido.

30 Las composiciones de la invención pueden comprender más de un antígeno Hib.

Cuando una composición incluye un antígeno de sacárido Hib, se prefiere que no incluya también un adyuvante de

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hidróxido de aluminio. Si la composición incluye un adyuvante de fosfato de aluminio entonces el antígeno Hib puede adsorberse en el adyuvante [99] o puede no estar adsorbido [100].

Los antígenos Hib pueden liofilizarse, por ejemplo junto con antígenos meningocócicos.

Streptococcus pneumoniae

Cuando la composición incluye un antígeno de S. pneumoniae, este será típicamente un antígeno de sacárido capsular que se conjuga preferentemente con una proteína vehículo [por ejemplo referencias 31 -33]. Se prefiere incluir sacáridos de más de un serotipo de S. pneumoniae. Por ejemplo, se usan ampliamente mezclas de polisacáridos de 23 serotipos diferentes, así como vacunas conjugadas con polisacáridos de entre 5 y 11 serotipos diferentes [101]. Por ejemplo, PrevNar™ [102] contiene antígenos de siete serotipos (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y 23F) con cada sacárido conjugado individualmente con CRM197 por aminación reductora, con 2 μg de cada sacárido por cada 0,5 ml de dosis (4 μg de serotipo 6B), y con conjugados adsorbidos en un adyuvante de fosfato de aluminio. Las composiciones de la invención incluyen preferentemente al menos los serotipos 6B, 14, 19F y 23F. Los conjugados pueden adsorberse en un fosfato de aluminio.

Como una alternativa al uso de antígenos de sacáridos de neumococos, la composición puede incluir uno o más antígenos polipeptídicos. Están disponibles secuencias genómicas para varias cepas de neumococos [103, 104] y pueden someterse a vacunología inversa [105-108] para identificar antígenos polipeptídicos adecuados [109, 110]. Por ejemplo, la posición puede incluir uno o más de los siguientes antígenos: PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Sp125, Sp101, Sp128 y Sp130, como se define en la referencia 111.

En algunas realizaciones, la composición puede incluir antígenos tanto de sacáridos como polipéptidos de neumococos. Estos pueden usarse en mezcla sencilla, o el antígeno de sacárido de neumococo puede conjugarse con una proteína neumocócica. Las proteínas vehículo adecuadas para dichas realizaciones incluyen los antígenos enumerados en el párrafo anterior [111].

Los antígenos neumocócicos pueden estar liofilizados, por ejemplo junto con antígenos meningocócicos y/o Hib.

Conjugación covalente

Los sacáridos capsulares en composiciones de la invención habitualmente estarán conjugados con proteína o proteínas vehículo. En general, la conjugación potencia la inmunogenicidad de sacáridos ya que los convierte de antígenos independientes de T a antígenos dependientes de T, permitiendo de este modo la sensibilización para memoria inmunológica. La conjugación es particularmente útil para vacunas pediátricas y es una técnica bien conocida [por ejemplo revisada en ref. 112 y 88-96].

Son proteínas vehículo preferidas toxinas o toxoides bacterianos, tales como toxoide de la difteria o toxoide del tétanos. Se prefiere en particular la toxina de la difteria mutante CRM197 [79, 113, 114]. Otras proteínas vehículo adecuadas incluyen la proteína de membrana externa de N. meningitidis [68], péptidos sintéticos [69,70], proteínas de choque térmico [71,72], proteínas de pertussis [73,74], citocinas [76], linfocinas [76], hormonas [76], factores de crecimiento [76], proteínas artificiales que comprenden múltiples epítopos de linfocitos T CD4+ humanos de diversos antígenos derivados de patógenos [115], proteína D de H. influenzae [75,116], proteína de superficie neumocócica PspA [117], proteínas de captación de hierro [78], toxina A o B de C. difficile [77], etc. Son vehículos preferidos toxoide de la difteria, toxoide del tétanos, proteína D de H. influenzae y CRM197.

Dentro de una composición de la invención, es posible usar más de una proteína vehículo para por ejemplo reducir el riesgo de supresión de vehículo. Por lo tanto pueden usarse diferentes proteínas vehículo para diferentes serogrupos, por ejemplo sacáridos del serogrupo A podían conjugarse con CRM197 mientras que sacáridos del serogrupo C podrían conjugarse con toxoide del tétanos. También es posible usar más de una proteína vehículo para un antígeno de sacárido particular, por ejemplo los sacáridos del serogrupo A podrían estar en dos grupos, con algunos conjugados con CRM197 y otros conjugados con toxoide del tétanos. En general, sin embargo, se prefiere usar la misma proteína vehículo para todos los sacáridos.

Una única proteína vehículo podría portar más de un antígeno de sacárido [118]. Por ejemplo, una única proteína vehículo podría tener sacáridos de los serogrupos A y C conjugados con ella. Para conseguir este objetivo, los sacáridos pueden mezclarse antes de la reacción de conjugación. En general, sin embargo, se prefiere tener conjugados separados para cada serogrupo.

Se prefieren conjugados con una relación de sacárido:proteína (p/p) de entre 1:5 (es decir exceso de proteína) y 5:1 (es decir exceso de sacárido). Se prefieren relaciones entre 1:2 y 5:1, así como se prefieren más relaciones entre 1:1,25 y 1:2,5. Se prefiere proteína vehículo en exceso para MenA y MenC.

Los conjugados pueden usarse junto con proteína vehículo libre [119]. Cuando está presente una proteína vehículo dada tanto en forma libre como en forma conjugada en una composición de la invención, la forma no conjugada es preferentemente no más del 5 % de la cantidad total de la proteína vehículo en la composición en su conjunto, y más preferentemente está presente a menos de 2 % en peso.

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Puede usarse cualquier reacción de conjugación adecuada, con cualquier enlazador adecuado cuando sea necesario.

El sacárido típicamente se activará o funcionalizará antes de la conjugación. La activación puede implicar, por ejemplo, cianilar reactivos tales como CDAP (por ejemplo tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino piridinio [120, 121, etc.]). Otras técnicas adecuadas usan carbodiimidas, hidrazidas, ésteres activos, norborano, ácido pnitrobenzoico, N-hidroxisuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU; véase también la introducción a la referencia 94).

Pueden prepararse enlaces mediante un grupo enlazador usando cualquier procedimiento conocido, por ejemplo, los procedimientos descritos en las referencias 122 y 123. Un tipo de enlace implica aminación reductora del polisacárido, acoplando el grupo amino resultante con un extremo de un grupo enlazador de ácido adípico, y después acoplando una proteína con el otro extremo del grupo enlazador de ácido adípico [92, 124, 125]. Otros enlazadores incluyen B-propionamido [126], nitrofenil-etilamina [127], haloacil haluros [128], enlaces glucosídicos [129], ácido 6-aminocaproico [130], ADH [131], restos C4 a C12 [132], etc. Como alternativa al uso de un enlazador, puede usarse enlace directo. Los enlaces directos con la proteína pueden comprender oxidación del polisacárido seguida de aminación reductora con la proteína, como se describe, por ejemplo, en las referencias 133 y 134.

Se prefiere un procedimiento que implica la introducción de grupos amino en el sacárido (por ejemplo reemplazando grupos =O terminales con -NH2) seguido por derivatización con un diéster adípico (por ejemplo N-hidroxisuccinimido diéster de ácido adípico) y reacción con proteína vehículo. Otra reacción preferida usa activación de CDAP con un vehículo de proteína D, por ejemplo para MenA o MenC.

Después de la conjugación, pueden separarse sacáridos libres y conjugados. Hay muchos procedimientos adecuados, incluyendo cromatografía hidrófoba, ultrafiltración tangencial, diafiltración, etc. [véase también ref. 135 y 136, etc.].

Cuando la composición de la invención incluye un oligosacárido conjugado, se prefiere que la preparación de oligosacárido preceda a la conjugación.

Vesículas de membrana externa

Se prefiere que las composiciones de la invención no incluyan mezclas complejas o indefinidas de antígenos, que son características típicas de VME. Sin embargo, un modo en que la invención puede aplicarse a VME es cuando se van a administrar VME en un programa de múltiples dosis.

Cuando se va a administrar más de una dosis de VME, cada dosis puede complementarse (añadiendo la proteína purificada o por expresión de la proteína dentro de las bacterias de las que derivan las VME) por una de la primera proteína, segunda proteína o tercera proteína como se ha definido anteriormente. Preferentemente diferentes dosis se complementan con diferentes variantes de NMB1870. En un programa de VME de tres dosis, por ejemplo, cada dosis podría contener una proteína diferente de la primera proteína, segunda proteína y tercera proteína de modo que, tras recibir tres dosis de VME, se hayan recibido las tres variantes. En un programa de VME de dos dosis, podría usarse una variante por cada dosis de VME (omitiendo de este modo una variante), o una o ambas dosis de VME podrían complementarse con más de una variante para proporcionar cobertura con las tres variantes. En realizaciones preferidas, hay tres dosis de VME, y cada una de las tres dosis de VME contiene tres poblaciones de vesículas modificadas genéticamente diferentes que presentan cada una tres subtipos, proporcionando de este modo nueve subtipos diferentes en total.

Este enfoque puede usarse en general para mejorar preparaciones de microvesículas de N. meningitidis serogrupo B [137], “VME nativas” [138], ampollas o vesículas de la membrana externa [ref. 139 a 144, etc.]. Estas pueden prepararse a partir de bacterias que se han manipulado genéticamente [145-148] por ejemplo para aumentar la inmunogenicidad (por ejemplo hiperexpresar inmunógenos), para reducir la toxicidad, para inhibir la síntesis de polisacáridos capsulares, para regular negativamente la expresión de PorA, etc. Pueden prepararse a partir de cepas de alta formación de ampollas [149-152]. Pueden incluirse vesículas de una Neisseria no-patógena [153]. Puede prepararse VME sin el uso de detergentes [154, 155]. Pueden expresar proteínas que no son de Neisseria en su superficie [156]. Pueden tener LPS agotados. Pueden mezclarse con antígenos recombinantes [139, 157]. Pueden usarse vesículas de bacterias con diferentes subtipos de proteína de membrana externa de clase I, por ejemplo seis subtipos diferentes [158, 159] usando dos poblaciones de vesículas modificadas por ingeniería genética diferentes que presentan cada una tres subtipos, o nueve subtipos diferentes que usan tres poblaciones de vesículas modificadas por ingeniería genética diferentes que presentan cada una tres subtipos, etc. Los subtipos útiles incluyen: P1.7,16; P1.5-1,2-2; P1.19,15-1; P1.5-2,10; P1.12-1,13; P1.7-2,4; P1.22,14; P1.7-1,1; P1.18-1,3,6.

También es posible, por supuesto, complementar las preparaciones de vesículas con dos o tres variantes diferentes.

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Inmunización

La composición de la invención es preferentemente una composición inmunogénica, y la invención proporciona una composición inmunogénica de la invención para su uso como un medicamento. Por ejemplo, la composición puede usarse en un procedimiento para inducir una respuesta de anticuerpo en un mamífero, que comprende administrar una composición inmunogénica de la invención al mamífero. La respuesta de anticuerpo es preferentemente una respuesta de anticuerpo protectora y/o bactericida.

La composición puede usarse para proteger a un mamífero contra una infección por Neisseria (por ejemplo meningocócica) administrándola al mamífero.

El mamífero es preferentemente un ser humano. El ser humano puede ser un adulto o, preferentemente un niño.

Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden usarse de forma terapéutica (es decir para tratar una infección existente) o profiláctica (es decir para evitar infección futura).

Las composiciones son particularmente útiles para prevenir/tratar enfermedades incluyendo, pero sin limitación, meningitis (particularmente meningitis bacteriana) y bacteriemia.

La eficacia del tratamiento terapéutico puede ensayarse supervisando la infección por Neisseria después de la administración de la composición de la invención. La eficacia del tratamiento profiláctico puede ensayarse supervisando las respuestas inmunitarias contra NMB1870 después de la administración de la composición. La inmunogenicidad de composiciones de la invención puede determinarse administrándolas a sujetos de ensayo (por ejemplo niños de 12-16 meses de edad, o modelos animales [160]) y determinando después parámetros convencionales incluyendo anticuerpos bactericidas en suero (ABS) y títulos de ELISA (GMT) de IgG anticápsula de alta avidez. Estas respuestas inmunitarias se determinarán generalmente aproximadamente 4 semanas después de la administración de la composición, y se compararán con valores determinados antes de la administración de la composición. Se prefiere un aumento de ABS de al menos 4 veces u 8 veces. Cuando se administra más de una dosis de la composición, puede realizarse más de una determinación después de la administración.

Las composiciones preferidas de la invención pueden conferir un título de anticuerpo en un paciente que es superior al criterio para seroprotección para cada componente antigénico para un porcentaje aceptable de sujetos humanos. Se conocen bien antígenos con un título de anticuerpo asociado por encima del que se considera que un hospedador está seroconvertido contra el antígeno, y dichos títulos son publicados por organizaciones tales como la OMS. Preferentemente más del 80 % de una muestra estadísticamente significativa de sujetos está seroconvertido, más preferentemente más del 90 %, aun más preferentemente más del 93 % y más preferentemente 96-100 %.

Las composiciones de la invención se administrarán en general directamente a un paciente. El suministro directo puede conseguirse mediante inyección parenteral (por ejemplo por vía subcutánea, por vía intraperitoneal, por vía intravenosa, por vía intramuscular o al espacio intersticial de un tejido) o mediante administración rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, ótica, pulmonar u otra mucosa. Se prefiere la administración intramuscular en el muslo o en la parte superior del brazo. La inyección puede ser mediante una aguja (por ejemplo una aguja hipodérmica), pero también puede usarse como alternativa inyección sin aguja. Una dosis intramuscular típica es de 0,5 ml.

Las composiciones pueden usarse para inducir inmunidad sistémica y/o mucosa.

El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis individual o un programa de múltiples dosis. Pueden usarse múltiples dosis en un programa de inmunización primaria y/o en un programa de inmunización de refuerzo. Un programa de dosis primaria puede seguirse de un programa de dosis de refuerzo. El tiempo adecuado entre dosis de sensibilización (por ejemplo entre 4-16 semanas) y entre sensibilización y refuerzo, puede determinarse de forma rutinaria.

La composición inmunogénica de la invención generalmente incluirá un vehículo farmacéuticamente aceptable, que puede ser cualquier sustancia que no induzca en sí misma la producción de anticuerpos perjudiciales para el paciente que recibe la composición, y que pueden administrarse sin toxicidad indebida. Los vehículos adecuados pueden ser macromoléculas grandes, que se metabolizan lentamente, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivas. Los expertos en la materia conocen bien dichos vehículos. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden incluir líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. También pueden estar presentes en dichos vehículos sustancias adyuvantes, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes de pH y similares. Son vehículos adecuados los liposomas. Un análisis exhaustivo de vehículos farmacéuticos está disponible en ref. 161.

Las infecciones por Neisseria afectan a diversas áreas del cuerpo y por lo tanto las composiciones de la invención pueden prepararse de diversas formas. Por ejemplo, las composiciones pueden prepararse como inyectables, como soluciones o suspensiones líquidas. También pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución, o suspensión, en vehículos líquidos antes de la inyección. La composición puede prepararse para administración

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tópica, por ejemplo como una pomada, crema o polvo. La composición puede prepararse para administración oral, por ejemplo como un comprimido o una cápsula, o como un jarabe (opcionalmente aromatizado). La composición puede prepararse para administración pulmonar, por ejemplo como un inhalador, usando un polvo fino o una pulverización. La composición puede prepararse como un supositorio o un pesario. La composición puede prepararse para administración nasal, ótica u ocular, por ejemplo como gotas.

La composición es preferentemente estéril. Está preferentemente sin pirógenos. Se tampona preferentemente por ejemplo a entre pH 6 y pH 8, generalmente aproximadamente pH 7. Cuando una composición comprende una sal de hidróxido de aluminio, se prefiere usar un tampón de histidina [162]. Las composiciones de la invención pueden ser isotónicas con respecto a seres humanos.

Las composiciones inmunogénicas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de inmunógeno, así como cualquier otro de otros componentes especificados, según sea necesario. Por “cantidad inmunológicamente eficaz”, se entiende que la administración de esa cantidad a un individuo, bien en una única dosis o bien como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o la prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y condición física del individuo para tratar, la edad, el grupo taxonómico del individuo para tratar (por ejemplo primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación por el médico tratante de la situación médica, y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad quede en un intervalo relativamente amplio que pueda determinarse mediante ensayos rutinarios. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis individual o un programa de múltiples dosis (por ejemplo incluyendo dosis de refuerzo). La composición puede administrarse junto con otros agentes inmunorreguladores.

Una composición inmunogénica generalmente incluirá un adyuvante. Los adyuvantes preferidos para potenciar la eficacia de la composición incluyen, pero sin limitación: (A) MF59 (Escualeno 5 %, Tween 80 0,5 % y Span 85 0,5 %, formulados en partículas submicrométricas usando un microfluidificador) [véase capítulo 10 de ref. 163; véase también ref. 164]; (B) micropartículas (es decir una partícula de ~100 nm a ~150 μm de diámetro, más preferentemente de ~200 nm a ~30 μm de diámetro y más preferentemente de ~500 nm a ~10 μm de diámetro) formadas a partir de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo un poli(α-hidroxiácido), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.), prefiriéndose poli(lactida-coglicólido) (PLG), que tiene opcionalmente una superficie con carga (por ejemplo añadiendo un detergente catiónico, aniónico o no iónico tal como SDS (negativo) o CTAB (positivo) [por ejemplo ref. 165 y 166]); (C) liposomas [véase Capítulos 13 y 14 de ref. 163]; (D) ISCOM [véase capítulo 23 de ref. 163], que pueden estar desprovistos de detergente adicional [167]; (E) SAF, que contiene Escualano 10 %, Tween 80 0,4 %, polímero en bloque de Pluronic L121 5 % y thr-MDP, bien microfluidificado en una emulsión submicrométrica o agitado vorticialmente para generar una emulsión de mayor tamaño de partícula [véase Capítulo 12 de ref. 163]; (F) sistema de adyuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem) que contiene Escualeno 2 %, Tween 80 0,2 % y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforil lípido A (MPL), trehalosa dimicolato (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS), preferentemente MPL + CWS (Detox™); (G) adyuvantes de saponina, tales como QuilA o QS21 [véase el Capítulo 22 de ref. 163], también conocido como Stimulon™; (H) quitosano [por ejemplo 168]; (I) adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA); (J) citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferones (por ejemplo interferón-γ), factor estimulante de colonias de macrófagos, factor de necrosis tumoral, etc. [véase capítulos 27 y 28 de ref. 163], RC529;

(K) una saponina (por ejemplo QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + un esterol) [169]; (L) monofosforil lípido A (MPL) o MPL 3-O-desacilado (3dMPL) [por ejemplo capítulo 21 de ref. 163]; (M) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua [170]; (N) oligonucleótidos que comprenden motivos CpG [171] es decir que contienen al menos un dinucleótido CG, usándose opcionalmente 5-metilcitosina en lugar de citosina; (O) un éter de polioxietileno o un éster de polioxietileno [172]; (P) un tensioactivo de sorbitán éster de polioxietileno en combinación con un octoxinol [173] o un tensioactivo de polioxietilen alquil éter o éster en combinación con al menos un tensioactivo no iónico adicional tal como un octoxinol [174]; (Q) un oligonucleótido inmunoestimulante (por ejemplo un oligonucleótido CpG) y una saponina [175]; (R) un inmunoestimulante y una partícula de sal metálica [176]; (S) una saponina y una emulsión de aceite en agua [177]; (T) enterotoxina termolábil de E. coli (“LT”), o mutantes destoxificados de la misma, tales como los mutantes de K63 o R72 [por ejemplo Capítulo 5 de ref. 38]; (U) toxina del cólera (“CT”), o mutantes destoxificados de los mismos [por ejemplo Capítulo 5 de ref. 38]; (V) ARN bicatenario; (W) sales de aluminio, tales como hidróxidos de aluminio (incluyendo oxihidróxidos), fosfatos de aluminio (incluyendo hidroxifosfatos), sulfato de aluminio, etc. [Capítulos 8 y 9 en ref. 163] o sales de calcio, tales como fosfato cálcico; y (X) otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes para potenciar la eficacia de la composición [por ejemplo véase capítulo 7 de ref. 163]. Son adyuvantes preferidos para inmunización parenteral sales de aluminio (fosfatos de aluminio y particularmente hidroxifosfatos, y/o hidróxidos y particularmente oxihidróxido) y MF59. Los mutantes de toxina son adyuvantes de mucosa preferidos. QS21 es otro adyuvante útil para NMB1870, que puede usarse solo o en combinación con cualquiera de (A) a (X), por ejemplo con una sal de aluminio.

Los péptidos de muramilo incluyen N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanilD-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1’-2’-dipalmitoil-sn-glicero-3hidroxifosforiloxi)-etilamina MTP-PE), etc.

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Expresión de proteínas

Se conocen en este campo técnicas de expresión bacterianas. Un promotor bacteriano es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse con ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción corriente abajo (3’) de una secuencia codificante (por ejemplo gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio en la transcripción que se sitúa habitualmente próxima al extremo 5’ de la secuencia codificante. Esta región de inicio de la transcripción habitualmente incluye un sitio de unión a ARN polimerasa y un sitio de inicio de la transcripción. Un promotor bacteriano también puede tener un segundo dominio denominado un operador, que puede solapar con un sitio de unión a ARN polimerasa adyacente en el que comienza la síntesis de ARN. El operador permite la transcripción regulada (inducible) negativa, ya que una proteína represora génica puede unirse con el operador y de este modo inhibir la transcripción de un gen específico. Puede producirse expresión constitutiva en ausencia de elementos reguladores negativos, tales como el operador. Además, puede conseguirse regulación positiva por una secuencia de unión a proteína activadora génica, que, si está presente, está habitualmente próxima (5’) a la secuencia de unión a ARN polimerasa. Un ejemplo de una proteína activadora génica es la proteína activadora de catabolitos (CAP), que ayuda a iniciar la transcripción del operón lac en Escherichia coli (E. coli) [Raibaud y col. (1984) Annu. Rev. Genet. 18: 173]. La expresión regulada puede ser por lo tanto positiva o negativa, potenciando o reduciendo de este modo la transcripción.

Las secuencias que codifican enzimas de ruta metabólica proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas metabolizadoras de azúcar, tales como galactosa, lactosa (lac) [Chang y col. (1977) Nature 198: 1056] y maltosa. Los ejemplos adicionales incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas biosintéticas tales como triptófano (trp) [Goeddel y col. (1980) Nuc. Acids Res. 8: 4057; Yelverton y col. (1981) Nucl. Acids Res. 9: 731; Patente de Estados Unidos 4.738.921; documentos EP-A-0036776 y EP-A-0121775]. El sistema promotor de β-lactamasa (bla) [Weissmann (1981) “The cloning of interferon and other mistakes” en Interferon 3 (ed. I. Gresser)], los sistemas promotores de bacteriófago lambda PL [Shimatake y col. (1981) Nature 292: 128] y T5 [patente de Estados Unidos 4.689.406] también proporcionan secuencias promotoras útiles. Otro promotor de interés es un promotor de arabinosa inducible (pBAD).

Además, promotores sintéticos que no aparecen en la naturaleza también actúan como promotores bacterianos. Por ejemplo, pueden unirse secuencias de activación de la transcripción de un promotor bacteriano o de bacteriófago con las secuencias de operón de otro promotor bacteriano o de bacteriófago, creando un promotor híbrido sintético [Patente de Estados Unidos 4.551.433]. Por ejemplo, el promotor tac es un promotor trp-lac híbrido que comprende secuencias tanto de promotor de trp como de operón lac que están reguladas por el represor lac [Amann y col. (1983) Gene 25: 167; De Boer y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 21]. Además, un promotor bacteriano puede incluir promotores de origen natural de origen no bacteriano que tienen la capacidad de unirse con ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción. También puede acoplarse un promotor natural de origen no bacteriano con una ARN polimerasa compatible para producir altos niveles de expresión de algunos genes en procariotas. El sistema de promotor/ARN polimerasa T7 de bacteriófago es un ejemplo de un sistema de promotor acoplado [Studier y col. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113; Tabor y col. (1985) Proc Natl. Acad. Sci. 82: 1074]. Además, un promotor híbrido también puede estar comprendido por un promotor de bacteriófago y una región operadora de E. coli (documento EPO-A-0 267 851).

Además de una secuencia promotora activa, un sitio de unión a ribosoma eficaz también es útil para la expresión de genes ajenos en procariotas. En E. coli, el sitio de unión a ribosoma se denomina la secuencia Shine-Dalgarno (SD) e incluye un codón de inicio (ATG) y una secuencia de 3-9 nucleótidos de longitud localizada 3-11 nucleótidos cadena arriba del codón de inicio [Shine y col. (1975) Nature 254: 34]. Se cree que la secuencia SD promueve la unión del ARNm con el ribosoma por el emparejamiento de bases entre la secuencia SD y el extremo 3’ y de ARNr 16S de E. coli [Steitz y col. (1979) “Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA.” En Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R. F. Goldberger)]. Para expresar genes eucariotas y genes procarióticos con sitio de unión al ribosoma débil [Sambrook y col. (1989) “Expression of cloned genes in Escherichia coli.” En Molecular Cloning: A Laboratory Manual].

Una secuencia promotora puede unirse directamente con la molécula de ADN, en cuyo caso el primer aminoácido en el extremo N terminal será siempre una metionina, que está codificada por el codón de inicio ATG. Si se desea, puede escindirse metionina en el extremo N terminal de la proteína mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno o mediante incubación in vivo o in vitro con una peptidasa N terminal de metionina bacteriana (documento EP-A-0219237).

Habitualmente, las secuencias de terminación de la transcripción reconocidas por bacterias son regiones reguladoras localizadas 3’ del codón de terminación de la traducción, y por lo tanto junto con el promotor flanquean la secuencia codificante. Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm que puede traducirse al polipéptido codificado por el ADN. Las secuencias de terminación de la transcripción incluyen frecuentemente secuencias de ADN de aproximadamente 50 nucleótidos capaces de formar estructuras de tallo y bucle que ayudan a terminar la transcripción. Los ejemplos incluyen secuencias de terminación de la transcripción derivadas de genes con fuertes promotores, tales como el gen trp en E. coli así como otros genes biosintéticos.

Habitualmente, los componentes descritos anteriormente, que comprenden una secuencia señal, promotora (si se

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desea), secuencia codificante de interés, y secuencia de terminación de la transcripción, se ponen juntas en construcciones de expresión. Las construcciones de expresión se mantienen con frecuencia en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo plásmidos) capaz de tener mantenimiento estable en un hospedador, tal como bacteria. El replicón tendrá un sistema de replicación, permitiendo de este modo que se mantenga en un hospedador procariota bien para expresión o bien para clonación y amplificación. Además, un replicón puede ser un plásmido de un número de copias alto o bajo. Un plásmido de un número de copias alto generalmente tendrá un número de copias que varía de aproximadamente 5 a aproximadamente 200, y habitualmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 150. Un hospedador que contiene un plásmido de número de copias alto preferentemente contendrá al menos aproximadamente 10, y más preferentemente al menos aproximadamente 20 plásmidos. Puede seleccionarse un vector de número de copias alto o bajo, dependiendo del efecto del vector y la proteína ajena en el hospedador.

Como alternativa, las construcciones de expresión pueden integrarse en el genoma bacteriano con un vector integrador. Los vectores integradores habitualmente contienen al menos una secuencia homóloga del cromosoma bacteriano que permite que el vector se integre. Las integraciones parecen resultar de recombinaciones entre ADN homólogo en el vector y el cromosoma bacteriano. Por ejemplo, los vectores de integración construidos con ADN de diversas cepas de Bacillus se integran en el cromosoma de Bacillus (documento EP-A-0127328). Los vectores de integración también pueden estar comprendidos por secuencias de bacteriófago o transposón.

Habitualmente, las construcciones de expresión extracromosómicas y de integración pueden contener marcadores seleccionables para permitir la selección de cepas bacterianas que se han transformado. Los marcadores seleccionables pueden expresarse en el hospedador bacteriano y pueden incluir genes que hacen a las bacterias resistentes a fármacos tales como ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, kanamicina (neomicina) y tetraciclina [Davies y col. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32: 469]. Los marcadores seleccionables pueden incluir también genes biosintéticos, tales como los de las rutas biosintéticas de histidina, triptófano y leucina.

Como alternativa, algunos de los componentes anteriormente descritos pueden unirse en vectores de transformación. Los vectores de transformación están comprendidos habitualmente por un marcador seleccionable que se mantiene en un replicón o se desarrolla a un vector integrador, como se ha descrito anteriormente.

Se han desarrollado vectores de expresión y transformación, bien replicones extracromosómicos o bien vectores de integración, para transformación en muchas bacterias. Por ejemplo, se han desarrollado vectores de expresión para, entre otras, las siguientes bacterias: Bacillus subtilis [Palva y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; documentos EP-A-0 036 259 y EP-A-0 063 953; WO 84/04541], Escherichia coli [Shimatake y col. (1981) Nature

292: 128; Amann y col. (1985) Gene 40: 183; Studier y col. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113; documentos EP-A-0 036 776, EP-A-0 136 829 y EP-A-0 136 907], Streptococcus cremoris [Powell y col. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655]; Streptococcus lividans [Powell y col. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655], Streptomyces lividans [patente de Estados Unidos 4.745.056].

Se conocen bien en la técnica procedimientos para introducir ADN exógeno en hospedadores bacterianos y habitualmente incluyen la transformación de bacterias tratadas con CaCl2 u otros agentes, tales como cationes divalentes y DMSO. También puede introducirse ADN en células bacterianas por electroporación. Los procedimientos de transformación habitualmente varían con la especie bacteriana para transformar. Véase, por ejemplo [Masson y col. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60:2 73; Palva y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; documentos EP-A-0 036 259 y EP-A-0 063 953; WO 84/04541, Bacillus], [Miller y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 856; Wang y col. (1990) J. Bacteriol. 172: 949, Campylobacter], [Cohen y col. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci.

69: 2110; Dower y col. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 6127; Kushner (1978) “An improved method for transformation of Escherichia coli with ColEl-derived plasmids. En Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (eds. H. W. Boyer y S. Nicosia); Mandel y col. (1970) J. Mol. Biol. 53: 159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949: 318; Escherichia], [Chassy y col. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44:173 Lactobacillus]; [Fiedler y col. (1988) Anal. Biochem 170:38, Pseudomonas]; [Augustin y col. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66: 203, Staphylococcus], [Barany y col. (1980) J. Bacteriol. 144: 698; Harlander (1987) “Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, en: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti y R. Curtiss III); Perry y col. (1981) Infect. Immun.

32: 1295; Powell y col. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655; Somkuti y col. (1987) Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1: 412, Streptococcus].

General

La expresión “que comprende” significa “que incluye” así como “que consiste en” por ejemplo una composición “que comprende” X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo X + Y.

El término “aproximadamente” en relación con un valor numérico x significa, por ejemplo, x±10 %.

La palabra “sustancialmente” no excluye “completamente”, por ejemplo una composición que está “sustancialmente libre” de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra “sustancialmente” puede omitirse de la definición de la invención.

La “identidad de secuencia” se determina preferentemente por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith

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también para la desactivación de NMB1870. Los que tienen expresión intermedia y baja tienen secuencias de aminoácidos de NMB1870 idénticas, con una coincidencia del 91,6 % con MC58.

La Figura 9 es un dendrograma que muestra el agrupamiento de cepas de acuerdo con las distancias entre proteínas NMB1870. Las etiquetas “1”, “2” y “3” indican las tres variantes. Los números entre corchetes indican el número de cepas con secuencia idéntica presentes en cada rama del dendrograma. Se indican los linajes hipervirulentos, seguidos del número de cepas cuando este es diferente del número total. También se muestran serogrupos distintos de B. Las tres tipos de cepas (MC58, 961-5965 y M1239) y las otras cepas usadas en el análisis serológico están dentro de círculos.

La Figura 10 es un alineamiento de secuencias de variante 1 (MC58), variante 2 (961-5945) y variante 3 (M1239). Los números de aminoácidos se inician desde la cisteína que se ha predicho que será el primer aminoácido de la proteína madura. Los fondos gris y negro indican restos conservados e idénticos, respectivamente.

La Figura 11 muestra análisis de FACS de sueros frente a variante 1 (primera fila), variante 2 (segunda fila) y variante 3 (tercera fila), usando la cepa tipo de variante 1 (MC58), variante 2 (961-5945) y variante 3 (M1239). Se muestra el suero de control frente al polisacárido capsular en la fila 4 (anticuerpo monoclonal Seam3). Se muestra el suero de control frente a una proteína citoplasmática en la fila 5 (anti NMB1380). La fila 6 contiene los mutantes de desactivación (KO) de cada cepa tipo, explorados con el antisuero homólogo.

Las Figuras 12 (variante 1), 13 (variante 2) y 14 (variante 3) muestran dendrogramas para las tres variantes separadas de NMB1870, clasificadas por tipos de secuencia multilocus (ST).

Modos de llevar a cabo la invención

NMB1870 en la cepa de serogrupo B MC58 -identificación del codón de inicio

El gen de NMB1870 se identificó en las secuencias genómicas de MenB y MenA publicadas por The Institute for Genomic Research (TIGR) y Sanger Center, respectivamente [2,4; NMB1870 y NMA0586]. Sin embargo, hay una discrepancia acerca de la posición del codón de inicio ATG ya que el codón de inicio de MenB está 120 pb cadena arriba del codón de inicio de MenA. A diferencia de ambas anotaciones de la técnica anterior, la presente invención coloca el codón de inicio como un codón GTG que está cadena abajo de los codones de inicio de la técnica anterior (18 pb cadena abajo para MenA, 138 pb para MenB) y de acuerdo con la referencia 8. Como se muestra en la Figura 1, el inicio GTG (+1) es coherente con la presencia de un sitio de unión a ribosoma correctamente separado y con la predicción de la identificación lipoproteica. El codón de inicio de MenB TIGR de la técnica anterior se muestra en una caja, y el codón de inicio MenA Sanger está en un círculo. Se muestran repeticiones invertidas por flechas horizontales.

NMB1870 es un gen monocistrónico localizado 157 bases cadena abajo del codón de terminación del gen de la fructosa-bisfosfato aldolasa nmb1869. En MenA Z2491 la organización general es similar, pero 31 pares de bases cadena arriba del codón de inicio GTG hay una inserción de 186 nucleótidos que son homólogos de una región de repetición interna de IS 1106 y están flanqueados por dos repeticiones invertidas de 16 pares de bases. Está presente un sitio de unión a ribosoma potencial (sombreado) 8 pb cadena arriba del codón de inicio GTG. Se localiza una caja fur (11/19 coincidencias con el consenso de caja fur de E. coli [178]; SEQ ID NO: 74 y 75) 35 pb cadena arriba del codón de inicio, como se predice por GCG FindPatterns partiendo de SEQ ID NO: 75 y que permite un máximo de nueve desapareamientos. También se detectaron secuencias promotoras potenciales.

El paquete de programas GCG Wisconsin Package (versión 10.0) se usó para análisis secuencial informático de secuencias génicas y proteicas. Se usó el programa PSORT [179] para predicción de localizaciones. NMB1870 tiene la típica identificación de una lipoproteína expuesta en superficie, caracterizada por un péptido señal con un motivo de caja lipo del tipo -Leu-X-X-Cys-, donde la cisteína estaba seguida de una serina, un aminoácido generalmente asociado con localización de membrana externa de lipoproteínas [180]. La caja lipo se ha perdido en gonococo debido a una inserción de una única base (G) que desplaza la fase después del nucleótido 36 de MC58, restableciéndose la fase correcta de lectura por una inserción de 8 pb después de la posición 73.

Se predice que la proteína MC58 madura es una lipoproteína con un peso molecular de 26.964 Da y un pI de 7,96, y se caracteriza por la presencia de cuatro glicinas cadena abajo del motivo de caja lipo.

El análisis de predicción de estructura secundaria usando el software PredictProtein [181] indica que NMB1870 es una proteína globular compuesta principalmente de láminas beta.

Análisis de secuencia

Se usó el algoritmo PSI-BLAST para búsquedas de homología [182] usando la base de datos de proteínas no redundante. No se descubrieron proteínas homólogas buscando en bases de datos de proteínas procariotas y eucariotas no redundantes existentes mantenidas en el sitio de NCBI, incluyendo el genoma humano, lo que sugiere que NMB1870 es específico de Neisseria. Sin embargo, se descubrió un dominio con algo de homología (28 % de

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identidad sobre 146 aminoácidos) con la parte C terminal de la proteína de unión a transferrina TfbA de Actinobacillus pleuropneumoniae [183] (Figura 2). Una inspección más cercana de este dominio reveló homologías también con las proteínas de unión a transferrina de N. meningitidis [184], H. influenzae [185], Moraxella catarrhalis

[186] y con el antígeno de superficie de N. meningitidis NMB2132, previamente indicado como homólogo de TbpB [3].

Para ver si esta homología de secuencia refleja una homología funcional, se dializaron NMB1870 recombinante (véase posteriormente), transferrina humana hTF (Sigma T-4132) y la mezcla de las dos (concentración final de 7 μM) durante una noche en PBS a 4 ºC. Después de diálisis se cargaron 20 μl de cada proteína y la mezcla de ellas en una columna de filtración en gel de HPLC Superdex 200 PC 3.2/30 (Amersham) usando PBS como tampón de ejecución [187]. Se usaron Azul Dextrano 2000 y los patrones de peso molecular ribonucleasa A, quimotripsina A, ovoalbúmina A, albúmina de suero bovino (Amersham) para calibrar la columna. Se realizó filtración en gel usando un sistema Smart con un caudal de 0,04 ml/min y el material eluido se supervisó a 214 nm y 280 nm (el volumen de retención de NMB1870 fue de 1,68 ml y 1,47 ml para htf). Se recogieron fracciones de 40 μl y se analizaron mediante SDS-PAGE. Se usó la proteína de unión a transferrina recombinante MC58 2 (Tbp2) como control positivo.

La proteína recombinante no consiguió unirse con transferrina humana in vitro.

La caja Fur en el promotor sugiere que la expresión de NMB1870 puede regularse por hierro. Sin embargo, la expresión de la proteína no parece aumentar en condiciones de bajo hierro.

Una característica interesante de la proteína es la presencia de un tramo de cuatro glicinas cadena abajo de la cisteína lipidada. Tres o más glicinas consecutivas cadena abajo de una cisteína lipidada están presentes también en otras cinco lipoproteínas en N. meningitidis, concretamente la proteína de unión a transferrina B (TbpB), el componente de membrana externa de un transportador ABC NMB0623, la proteína hipotética NMB1047, el homólogo de TbpB NMB2132, y la lipoproteína AspA [188]. En ninguna de estas proteínas el tramo de poliglicina está codificado por un tramo de poli G, lo que sugiere que esta característica no se usa para generar modulación antigénica.

Se llevó a cabo una búsqueda de lipoproteínas con una región rica en glicina en 22 secuencias genómicas completas recuperadas en el sitio de NCBI [189] usando FindPatterns. La búsqueda recuperó 29 lipoproteínas en algunas de las especies bacterianas, pero no en todas. Los organismos con este tipo de lipoproteínas incluyen bacterias tanto Gram negativas como Gram positivas, incluyendo Haemophilus influenzae, Enterococcus fecalis, Mycobacterium tuberculosis, Lysteria monocytogenes y Staphylococcus aureus, mientras que otras tales como E. coli, Bacillus subtilis, Helicobacter pylori, Streptococcus pneumoniae, S. pyogenes y Vibrio cholerae no tienen ninguna. La mayoría de lipoproteínas con este distintivo pertenecen a transportadores ABC, seguido de proteínas de función desconocida. Aunque esta característica común en la estructura primaria sugiere un papel común para las repeticiones de glicina, hasta la fecha se desconoce la función Sin embargo, puede actuar para guiar las lipoproteínas a una ruta específica de secreción y localización superficial [190].

Secuenciación para otras cepas

Se seleccionaron 70 cepas representativas de la diversidad genética y geográfica de la población de N. meningitidis para investigación adicional de NMB1870. Las cepas derivan de 19 países diferentes, 73 % pertenece al serogrupo B y 32 se han aislado en los últimos cinco años. El panel de cepas incluye principalmente cepas de serogrupo B, algunas cepas de serogrupos A, C, Y, W-135 y Z, y una cepa de cada una de N. gonorrhoeae y N. cinerea. Las cepas se desvelan en más detalle en las referencias 191 y 192. Algunas cepas están disponibles de la ATCC (por ejemplo la cepa MC58 está disponible con la referencia BAA-335).

El gen de NMB1870 se amplificó usando cebadores externos a la secuencia codificante (A1, SEQ ID 55; y B2, SEQ ID 56). Se usaron aproximadamente 10 ng de ADN cromosómico como molde para la amplificación. Las condiciones de PCR fueron: 30 ciclos, 94 ºC durante 40 s, 58 ºC durante 40 s, 68 ºC durante 40 s. Los fragmentos de PCR se purificaron por el Kit de Purificación de PCR QIAquick Qiagen y se enviaron para análisis de secuencia, que se realizó usando un Secuenciador Automático ABI 377. La secuenciación se realizó usando los cebadores A1, B2, 22 (SEQ ID 57) y 32 (SEQ ID 58).

El gen se detectó por PCR en las 70 cepas de Neisseria. En N. lactamica pudo detectarse una banda mediante transferencia de Western, pero no se pudo amplificar el gen.

La secuencia de nucleótidos del gen se determinó en las 70 cepas. Estaban codificadas un total de 23 secuencias proteicas diferentes (SEQ ID NO 1 a 23). El análisis informático de estas 23 secuencias, usando algoritmo de Kimura y Jukes-Cantor, las dividió en tres variantes (Figura 9). El dendrograma se obtuvo partiendo del alineamiento de múltiples secuencias de secuencias de proteína NMB1870 (PileUP) usando el Procedimiento de Parsimonia de Secuencia Proteica (ProtPars), un programa disponible dentro del Paquete de Inferencia de Filogenia (Phylip) y se confirmó mediante el programa GCG Distances, usando los algoritmos Kimura y Jukes-Cantor.

Se determinaron las secuencias de NMB1870 de 100 cepas adicionales. Muchas de estas fueron idénticas a una de las SEQ ID NO 1 a 23, pero se proporcionan 19 secuencias únicas adicionales como SEQ ID NO 140 a 158.

Las Figuras 12-14 muestran dendrogramas de las diversas secuencias, clasificadas por tipos de secuencia multilocus ST. Dentro de la variante 1 (Figura 12) la cepa de referencia es MC58, siendo la menor identidad de secuencia con la referencia 89,4 % frente a un promedio de 93,7 %. Dentro de la variante 2 (Figura 13) la cepa de referencia es 2996 y las secuencias se extienden hasta 93,4 % de identidad (promedio 96,3 %). Dentro de la 5 variante 3 (Figura 14) la menor identidad con la cepa de referencia M1239 es 94,7 % (promedio 95,8 %). ST32cpx es el grupo hipervirulento más homogéneo, que alberga solamente una secuencia de NMB8170 de la variante 1 (también solamente de una forma de NMB 1343 y de NadA). La mayoría de las cepas de ST44cpx albergan la variante 1 (varias secuencias diferentes) de NMB1870, teniendo algunas la variante 3 (secuencia individual). Estos datos sugieren que ST32cpx está más cerca de ST44cpx, en comparación con otros grupos, que coincide con datos

10 basados en el genotipo de porA (clase III). Los complejos ST11 y ST8 están representados principalmente por diferentes secuencias dentro de la variante 2 de NMB1870, lo que sugiere que estos complejos están más cerca entre sí, en comparación con otros grupos, y que coinciden con el genotipo de porA (clase II). ST11cpx alberga las tres variantes, lo que indica que es el grupo hipervirulento más diverso de los cuatro.

Las cepas MC58, 961-5945 y M1239 se seleccionaron arbitrariamente como cepas tipo para las variantes 1, 2 y 3,

15 respectivamente. La diversidad de secuencia entre las tres cepas tipo se muestra en la Figura 10. La identidad de aminoácidos fue de 74,1 % entre la variante 1 y la variante 2, 62,8 % entre la variante 1 y la variante 3 y 84,7 % entre la variante 2 y la variante 3. Las secuencias dentro de cada variante estaban bien conservadas, mostrando las más distantes 91,6 %, 93,4 % y 93,2 % de identidad con sus cepas tipo, respectivamente. N. cinerea pertenece a la variante 1, y comparte 96,7 % de homología con MC58. Como se muestra en la Figura 9, la variante 1 alberga todas

20 las cepas de los linajes hipervirulentos ET-5, la mayoría de las cepas del linaje 3, las cepas del serogrupo A, dos aislados recientes de W-135 y un ET-37. La variante 2 alberga todas las cepas del complejo hipervirulento A4, de los serogrupos Y y Z, un aislado de W-135 viejo y cinco cepas ET-37. La variante 3 alberga cuatro cepas ST únicas, una cepa de ET-37, una cepa de linaje 3 y gonococo.

Las cepas en cada grupo de variante, y sus secuencias de NMB1870, son las siguientes:

1: gb185 (secuencia compartida con ES14784, M.00.0243291) m4030 (secuencia compartida con M3812) m2197

m2937 iss1001 (secuencia compartida con NZ394/98, 67/00, 93/114, bz198, m1390, nge28, 14996, 65/96, ISS1120, S59058, ISS1017, ISS1043, ISS1026, ISS1102, ISS1106, ISS656, ISS678, ISS740, ISS749, ISS995, ISS845, ISS1167, ISS1157, ISS1182, M4717, M6094, D8273) lnp17592 (secuencia compartida con 00-241341, 00-241357, 2ND80. 2ND221, ISS1142) f6124 (secuencia compartida con 205900) m198/172 (secuencia compartida con bz133, gb149, nm008, nm092, ES14963, FN131218, S5902, S90307, M4105, ISS1180, FN131345) mc58 (secuencia compartida con 30/00, 39/99, 72/00, 95330, bz169, bz83, cu385, h44/76, m1590, m2934, m2969, m3370, m4215, m4318, n44/89, 14847, ES14898, lnp15709, lnp17391, lnp17503, FN131654, M3985, S590104, S9029, S9097, D8346, FN131682, ISS832, ISS648, ISS1067,ISS1071,ISS1159) FN131217 ES14933 GB0993 M6190 F19324 ISS1113 gb0345 (secuencia compartida con M1820, ISS1082)

(continuación)

M0445 17 secuencias, 98 cepas

2: L93/4286 m2671 961-6945 (secuencia compartida con 2996, 96217, 312294, 11327, a22, ISS1141, ISS1173, ISS759, ISS743, ISS866, F17094, NMB, SWZ107) gb013 (secuencia compartida con e32, m1090, m4287, 66094, M3153, M4407, NGH36) 860800 (secuencia compartida con 599) 95N477 (secuencia compartida con 90-18311, c11, m986, F370/85, M.00.0243143, ISS838, ISS839, ISS1092, M1569) 1000 (secuencia compartida con m1096, M2552, M4458, M5149, M6208) m3279 (secuencia compartida con bz232, dk353, m3697, ngh38, M5258, D8221) MK82 8047 C4678 ISS1133 NG6/88 M0579 F16325 15 secuencias, 56 cepas

16889

m3813

m1239

3: ngp165

gb355 (secuencia compartida con m3369, D8300, gb0364, M2441)

gb988

[fa1090 gonococo]

7 secuencias, 11 cepas

NB: la abreviatura “gb” al comienzo del nombre de una cepa significa “M.01.0240”.

SEQ ID NO 139 (cepa 220173i), 140 (cepas gb101 e ISS908) y 141 (cepa nge31) están distantes de estas tres variantes (como lo está, en menor grado, la cepa m3813).

5 Dentro de la variante 1, la secuencia de la cepa lnp17592 (también vista en las cepas 00-241341, 00-241357, 2ND80, 2ND221 e ISS1142) se ve en el serogrupo W-135 Haji. Dentro de las cepas de Haji, la secuencia de NadA (SEQ ID NO: 143) es una recombinación entre los alelos 2 y 3 [191, 192].

Clonación, expresión y purificación en E. coli

Se amplificaron los genes de NMB1870 por PCR a partir del genoma de las cepas de N. meningitidis MC58, 961

10 5945 y M1239. Los cebadores directo e inverso se diseñaron para amplificar la secuencia codificante de nmb1870 desprovista de la secuencia codificante del péptido líder potencial. Se descubrió que las variantes M1239 y 961-5945

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La mayoría de las cepas de linajes hipervirulentos (ET-5, linaje 3, ET-37) expresaron altos niveles de la proteína, con la excepción de A4 cuando dos cepas expresaron niveles intermedios y dos cepas expresaron niveles bajos. Resulta interesante que la proteína se expresó a nivel alto por cepas que se han usado de forma clásica como cepas de vacuna de VME. No se ha descubierto que ningún patrón genético evidente prediga la cantidad de proteína expresada por cada cepa. Incluso la presencia del elemento de IS en la región promotora, que se descubrió en 8/70 cepas (una del serogrupo A, tres del linaje 3 y cuatro de las clasificadas como otras), no mostró ninguna correlación con la expresión de la proteína.

La exploración de las transferencias de Western mostró que la diferencia de expresión entre alto e intermedio, intermediado y bajo o alto y bajo podría ser de dos, cinco y nueve veces, respectivamente. No hay ninguna razón inmediatamente aparente para los niveles de expresión diferentes, y el análisis de las secuencias de ADN cadena arriba del gen no mostró ningún elemento que se correlacionara con la expresión.

Respuestas de anticuerpos

Se analizaron sueros de sujetos sanos y convalecientes con respecto a anticuerpos anti NMB1870 por transferencia de Western. Se cargó NMB1870 purificado (1 μg/carril) en geles de SDS-poliacrilamida 12,5 % y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La proteína unida se detectó con dilución 1/200 de suero, seguido de una dilución 1/2000 de IgG anti humano marcado con HPR (Sigma). Aunque solamente 2/10 de los sueros de personas sanas reconocieron NMB1870, 21/40 sueros convalecientes reconocieron la proteína, lo que conduce a la conclusión de que NMB 1870 es inmunogénico in vivo durante la infección. Los antisueros de ratones inmunizados con NMB1870 recombinante se investigaron por lo tanto adicionalmente.

Para preparar antisueros, se usaron 20 μg de proteínas recombinantes NMB1870 variante 1, variante 2 y variante 3 para inmunizar ratones hembra CD1 de seis semanas de edad (Charles River). Se usaron de cuatro a seis ratones por grupo. Las proteínas recombinantes se proporcionaron i.p., junto con adyuvante de Freund completo (CFA) para la primera dosis y adyuvante incompleto de Freund (IFA) para las segunda (día 21) y tercera (día 35) dosis de refuerzo. Se realizó el mismo programa de inmunización usando adyuvante de hidróxido de aluminio (3 mg/ml) en lugar de adyuvante de Freund. Se tomaron muestras de sangre para análisis el día 49.

Los antisueros se ensayaron con respecto a su capacidad para inducir destrucción mediada por complemento de cepas de N. meningitidis encapsuladas, como se ha descrito previamente [3, 196] usando suero de cría de conejo agrupado (CedarLane) usado como fuente de complemento. También se usó suero de un adulto humano sano (sin ninguna actividad bactericida intrínseca cuando se ensayó a una concentración final de 25 o 50 %) como fuente de complemento. Se definieron los títulos bactericidas en suero como la dilución en suero resultante en el 50 % de reducción en unidades formadoras de colonias (UFC) por ml después de 60 minutos de incubación de bacterias con mezcla de reacción, en comparación con UFC de control por ml en el tiempo 0. Típicamente, las bacterias incubadas con el anticuerpo de control negativo en presencia de complemento mostraron un aumento de 150 a 200 % en UFC/ml durante la incubación de 60 min.

Se seleccionaron cepas representativas de la expresión alta, intermedia y baja para el ensayo. La expresión diferencial de la proteína en la superficie de las cepas seleccionadas se confirmó por análisis de FACS (Figura 8) -MC58, un representante de las cepas de expresión alta se destruyó con alta eficacia por el suero diluido hasta 1/64.000; NZ394/98 (originalmente NZ98/254), un representante de la expresión intermedia también se destruyó con alta eficacia, por el suero diluido hasta 1/16.000 e incluso la cepa 67/00, un representante de las cepas de expresión baja se destruyó por el antisuero diluido hasta 1/2.048. Las cepas de control, en las que se había desactivado el gen nmb1870, no se destruyeron por el mismo antisuero.

Para confirmar si los sueros también eran capaces de conferir protección in vivo, se ensayaron con respecto a su capacidad para inducir protección pasiva en el modelo de cría de rata. Se pretrataron crías de rata de cinco días de edad i.p. con antisuero anti NMB1870 o con anticuerpo monoclonal anti PorA en el tiempo 0 y se expusieron dos horas después i.p. a 5 x 103 UFC/rata de MenC 4243 (OAc-positivo) o MenB NZ394/98. Se obtuvieron cultivos de sangre cuantitativos 24 horas después. Se obtuvieron recuentos bacterianos en los cultivos de sangre (UFC/ml, medias geométricas) sembrando sangre en placas de agar chocolate. El suero de control positivo fue anti PorA (P1.2) para MenC y SEAM3 para MenB. Los resultados de los experimentos fueron los siguientes:

Pretratamiento: Cepa de Exposición 4243 Cepa de Exposición NZ394/98

Positivos: UFC/ml x103 Positivos UFC/ml x103

PBS: 5/5 450 - -

Suero de control negativo: 5/5 500 9/14 1260

Suero de control positivo: 1/5 0,003 0/7 <0,001

Anti NMB1870: 0/9 <0,001 0/14 <0,001

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(continuación)

SEQ ID: A X1 L1 X2 pI

(11): 93 Cys ’936’ (SEQ ID 76) SEQ ID 78 M1239 (SEQ ID 84)

(12): 94 Cys ’936’ (SEQ ID 76) SEQ ID 144 M1239 (SEQ ID 84)

De estas doce proteínas, por lo tanto, ocho son proteínas NMB1870 en tándem (PM ~ 55 kDa) y cuatro son proteínas híbridas con “9362996” en el extremo N terminal (PM ~ 49 kDa). Se usaron dos enlazadores: (a) SEQ ID

5 NO: 78, que deriva del homólogo de NMB1870 gonocócico (SEQ ID NO: 46); y (b) un enlazador rico en glicina (SEQ ID NO: 144). También se usó SEQ ID NO: 78 en el extremo N de proteínas maduras, sin sus dos restos de BamHI N terminales (Gly-Ser) es decir SEQ ID NO: 86.

Las doce proteínas fueron solubles cuando se expresaron en E. coli y, después de la purificación, se usaron para inmunizar ratones. Se evaluaron las respuestas de anticuerpo bactericida en suero (SBA) frente a hasta cuatro

10 cepas meningocócicas, asegurando una de cada una de las tres variantes de NMB1870 1 a 3 (mostradas como superíndices). El adyuvante fue CFA (parte superior) o un hidróxido de aluminio (parte inferior)

Proteína: SBA

2996(2): MC58(1) M1239(3) 961/5945(2)

(1): 4096 1024 262144 32768 2048 128 32768 2048

(2): 8192 1024 262144 16384 2048 512 32768 1024

(3): -- 131072 32768 32768 4096 4096 1024

(4): -- 262144 32768 32768 1024 8192 512

(5): 512 1024 <4 16 4096 4096 32768 8192

(6): 4096 2048 <4 16 32768 4096 32768 16384

(7): -- 4 16 4096 4096 32768 8192

(8): 2048 1024 32 32 32768 8192 32768 16384

(9): 2048 4096 <4 <4 <4 512 32768 16384

(10): 4096 512 <4 <4 256 <4 131072 2048

(11): 256 4 <4 4 >32768 4096 2048 128

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NMB1870 es inmunogénico durante la infección, es capaz de inducir anticuerpos bactericidas, y protege a crías de rata de exposición bacteriana.

Puede encontrarse información experimental adicional sobre NMB1870 en la referencia 197.

Se entenderá que la invención se ha descrito anteriormente solamente como ejemplo y pueden realizarse modificaciones permaneciendo aún dentro del alcance de la invención.

Breve descripción del listado de secuencias

SEQ ID NO:: Descripción

1-23: 23 secuencias de NMB1870 diferentes, longitud completa

24-45: 23 secuencias de NMB1870 diferentes, con cisteínas N terminales

46: Secuencia de aminoácidos N terminal usada para expresión

47-66: Cebadores de PCR

67-69: Secuencias parciales de la Figura 1

70-73 & 86: Motivos de secuencia para conservación u omisión de proteínas de la invención

74-75: Cajas Fur

76: “936” de MC58, con péptido líder procesado

77: Ejemplo de un híbrido 936MC58-ΔG-NMB1870M1239

78: Secuencia derivada de gonococo usada para expresión quimérica

79, 82, 83, 85, 87, 88, 89, 90: Proteínas NMB1870 en tándem

80, 81, 84: Secuencias de NMB 1870 truncadas

91-94: Proteínas híbridas de “936” y NMB1870

95-122: Cebadores de PCR

123-141: Secuencias de NMB1870 de longitud completa

142: Secuencia de NMB 1870 en tándem triple

143: Secuencia de Haji NadA

144: Enlazador de glicina

Referencias

[1] Jodar y col. (2002) Lancet 359(9316): 1499-1508. 10 [2] Tettelin y col. (2000) Science 287: 1809-1815.

[3] Pizza y col. (2000) Science 287: 1816-1820.

[4] Parkhill y col. (2000) Nature 404: 502-506.

[5] http://dna1.chem.ou.edu/gono.html

[6] WO99/24578. 15 [7] WO99/36544.

[8] WO99/57280.

[9] WO00/22430.

[10] WO01/64920.

[11] WO01/64922. 20 [12] WO03/020756.

[13] WO03/063766.

[14] Achtman (1995) Global epidemiology of meningococcal disease. Páginas 159-175 de Meningococcal disease (ed. Cartwight). ISBN: 0-471-95259-1.

[15] Caugant (1998) APMIS 106: 505-525.

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Claims

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