CN103405761A - 多种脑膜炎球菌血清群的液体疫苗 - Google Patents

Abstract

以单剂量混合时，脑膜炎球菌血清群C、W135和Y的偶联荚膜多糖对人体是安全和具有免疫原性。当加入血清群A的偶联荚膜多糖时，保持了这种作用。这些偶联抗原无需冻干，可在单一水性剂量中稳定地混合。通过使用少量成分明确的多肽抗原，可实现对血清群B感染的广泛保护力。对五种血清型的任一种而言，这些多肽抗原可与糖抗原混合而不丧失其保护效力。即使加入Hib偶联物，仍然有效。通过加入血清群B菌株的蛋白抗原，可提高血清群W135偶联物的效力。将Hib偶联物加入到脑膜炎球菌偶联物中可提高对脑膜炎球菌血清群W135的整体活性。

Description

多种脑膜炎球菌血清群的液体疫苗

本申请是2004.10.04提交的CN200480035625.6，题为“多种脑膜炎球菌血清群的液体疫苗”的分案申请。

这里引用的所有文献全部被纳入本文作为参考。

技术领域

本发明涉及抗细菌性脑膜炎的免疫接种领域，尤其涉及针对多种病原体所引起的细菌性脑膜炎的混合免疫接种。

发明背景

脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)是一种寄居在咽喉部可引起脑膜炎(并且，有时引起败血病而不是脑膜炎)的不能运动的人病原体革兰氏阴性菌。它可引起地方病和流行病。在引入抗b型流感嗜血杆菌(Hib)的偶联疫苗后，脑膜炎奈瑟球菌已成为导致美国细菌性脑膜炎的主要原因。引起细菌性脑膜炎的第三类病原体是肺炎链球菌，但现在已可获得有效的疫苗(PrevNar^TM[1])。类似于Hib疫苗，肺炎链球菌疫苗依据的是偶联的荚膜多糖抗原。

基于微生物的荚膜多糖，已经鉴定到几种脑膜炎奈瑟球菌的血清群，包括(A，B，C，H，I，K，L，29E，W135，X，Y和Z)。血清群A是撒哈拉沙漠以南非洲最常见的流行疾病原。血清群B和C与绝大部分发生在美国和大多数发达国家的病例有关。美国和发达国家中的其它一些病例是由血清群W135和Y引起的。虽然荚膜多糖是最有效的保护性免疫原，每个血清群需要不同的糖抗原，而且该方法不适于免疫抵御血清群B。因此，近年来采用血清群C的偶联糖疫苗获得成功(Menjugate^TM[2],Meningitec^TM和NeisVac-C^TM)但对血清群A、B、W135或Y所致疾病却无作用；相反，它们选择性地使这些血清群成为脑膜炎球菌疾病的主要原因。

一种可注射的血清群A、C、Y和W135荚膜多糖的四价疫苗已经知道了很多年[3，4]，并批准可用于人类。此疫苗中的多糖不是偶联的，而是以1:1:1:1的重量比存在[5]，各含有50μg纯化多糖。虽然在青少年和成人中有效，但其诱导的免疫应答差、保护时间短，不能用于婴儿[例如，参考6]。而且，该疫苗的缺点是用时需要从冻干形式重建。

对于血清群B，所提供的一种疫苗效果捉摸不定。试验了其外膜囊泡疫苗[例如，参考7]，但通常保护力只限于用于制备该疫苗的菌种。

因此，仍然需要能保护儿童对脑膜炎球菌血清群A、C、W135和Y的疫苗，还需要给药前无需重建的疫苗。而且，仍然需要对血清群B能提供广泛保护力的疫苗。

发明概述

本发明满足了所有这些需要，依据是八项独立的发现。第一，发明者发现，当以单剂量混合时，脑膜炎球菌血清群C、W135和Y的偶联荚膜多糖在人体中安全且具有免疫原性。第二，发现当加入血清群A的偶联荚膜多糖时保持了这种作用。第三，发现这些偶联抗原可以单一水性剂量稳定地混合而无需冻干。第四，发现通过使用少量特定多肽抗原可实现对血清群B感染的广泛保护力。第五，发现这些多肽抗原可与糖抗原联用，而不会丧失对五种血清群任一种的保护效力。第六，发现即使加入Hib偶联物，仍然保持效力。第七，发现加入血清群B菌株的蛋白质抗原可提高血清群W135偶联物的效力。最后，发现将Hib偶联物加入到脑膜炎球菌偶联物中可提高对脑膜炎球菌血清群W135的整体活性。

因此，本发明提供了一种水性免疫原性组合物，给予受试者后，该组合物能够诱导对脑膜炎奈瑟球菌血清群B、C、W135和Y的杀菌性免疫应答反应，所述组合物包含：(i)偶联的血清群C荚膜多糖抗原；(ii)偶联的血清群W135荚膜多糖抗原；(iii)偶联的血清群Y荚膜多糖抗原；和(iv)一种或多种血清群B的多肽抗原。该水性组合物也可诱导对脑膜炎奈瑟球菌血清群A的杀菌性免疫应答反应，因而还包含：(v)偶联的血清群A荚膜多糖抗原。

本发明还提供一种水性免疫原性组合物，给予受试者后，该组合物可诱导(a)对至少脑膜炎奈瑟球菌血清群W135的杀菌性免疫应答反应和(b)对b型流感嗜血杆菌疾病的保护性免疫应答反应，所述组合物包含：(i)偶联的血清群W135荚膜多糖抗原；(ii)偶联的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖抗原。该组合物可还包含血清群C、Y及任选A的偶联荚膜多糖抗原。其还可包含脑膜炎奈瑟球菌血清群B的多肽抗原。

优选的糖抗原是寡糖抗原。

血清群C、W135和Y

制备脑膜炎球菌荚膜多糖的技术已经知道了许多年，一般涉及以下步骤：多糖沉淀(例如，使用阳离子去污剂)，乙醇分馏，冷苯酚提取(以除去蛋白质)和超速离心(以除去LPS)[例如，参见8]。

一种更优选的方法[9]涉及多糖沉淀后，用低级醇增溶沉淀的多糖。沉淀可采用阳离子去污剂如四丁基铵和十六烷基三甲基铵盐(例如，溴盐)，或溴化己二甲铵和十四烷基三甲基铵盐来实现。尤其优选溴化十六烷基三甲基铵(“CTAB”)[10]。沉淀物质的增溶可采用低级醇如甲醇、丙-1-醇、丙-2-醇、丁-1-醇、丁-2-醇、2-甲基-丙-1-醇、2-甲基-丙-2-醇、二醇等来实现，但特别适合增溶CTAB-多糖复合物的是乙醇。可将乙醇加入到沉淀的多糖中，使最终的乙醇浓度(以乙醇和水的总含量计)为50%-95%。

再次溶解后，可进一步处理多糖以除去污染物。这在即使是微量污染物也不能接受的情况下尤其重要(例如，对于人疫苗生产)。这通常将包括一次或多次过滤步骤如深度过滤，可采用活性碳过滤，分子大小过滤和/或超滤。

一旦过滤除去污染物，可沉淀多糖作进一步处理和/或加工。这可通过阳离子交换方便地实现(例如，通过加入钙或钠盐)。

纯化后，将荚膜多糖与载体蛋白偶联，如下所述。

纯化和偶联脑膜炎球菌多糖的其它可选方法见参考文献11和12中所述。

另一种替代的纯化方法是从头合成或部分合成，例如参考文献13所述的Hib合成和参考文献14所述的MenA合成方法来获得本发明荚膜多糖。

可对多糖进行化学修饰，例如O-乙酰化或脱-O-乙酰化。任何脱-O-乙酰化或超-乙酰化可发生在多糖的特定位置上。例如，大多数血清群C菌株的O-乙酰基位于唾液酸残基的C-7和/或C-8上，但约15%的临床分离菌株缺乏这些O-乙酰基团[15,16]。乙酰化似乎不会影响其保护效力(例如，不同于Menjugate^TM产品，NeisVac-C^TM产品使用了脱-O-乙酰化多糖，但这两种疫苗都有效)。血清群W135糖是唾液酸-半乳糖二糖单元的聚合物。血清群Y糖类似于血清群W135糖，除了该二糖重复单元包含葡萄糖而不是半乳糖外。类似于血清群C糖，MenW135和MenY多糖具有不同的O-乙酰化，但位于唾液酸7和9位[上17]。优选在偶联前进行这种化学修饰，但也可在偶联期间进行。

优选分别纯化不同血清群的糖，然后在偶联之前或之后混合。

血清群A

本发明组合物可包含偶联的血清群A荚膜多糖抗原。可用与血清群C、W135和Y(如上所述)相同的方法纯化和偶联该糖，虽然其结构不同：血清群C、W135和Y的荚膜是围绕的唾液酸(N-乙酰基-神经氨酸，NeuAc)，血清群A的荚膜是N-乙酰基-甘露糖胺(唾液酸的天然前体)。血清群A糖特别易水解，其在水性介质中不稳定性意味着(a)血清群A液体疫苗的免疫原性会随时间下降，(b)由于糖水解产物释放入疫苗，其质量控制更加困难。

天然MenA荚膜多糖是(α1→6)-连接的N-乙酰基-D-甘露糖胺-1-磷酸盐的均聚物，C₃和C₄位上有部分O-乙酰化。主要糖苷键是1-6磷酸二酯键，包括D-甘露糖胺的C₁半缩醛基和C₆醇基。平均链长为93个单体。它具有以下通式：

本发明者制备了修饰的糖抗原，它保留天然血清群A多糖的免疫原活性但在水中要稳定得多。该单糖单元的C3和4碳位结合的羟基被封闭基团取代[参考文献18]。

具有封闭基团而替代羟基的单糖单元的数目可不同。例如，所有或基本上所有的单糖单元可具有封闭基团。或者，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%的单糖单元可具有封闭基团。至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个单糖单元具有封闭基团。

类似地，单糖单元是封闭基团的数量可不同。例如，任何特定单糖单元上封闭基团的数量可为1或2。

末端单糖单元可具有或不具有取代其天然羟基的封闭基团。优选保留末端单糖单元上的游离异头(anomeric)羟基，以提供下一步反应(例如，偶联)的连接手柄。可将其它羟基转化为封闭基团后再发生还原氨基化作用(例如，用NaBH₃CN/NH₄Cl)，将异头羟基转化为氨基(-NH₂或-NH-E，其中E是氮保护基)。

通过羟基的衍生化反应，即用另一种基团取代羟基的氢原子，可直接实现封闭基团取代羟基。用作封闭基团的合适的羟基衍生物包括，例如，氨甲酯、磺酸酯、碳酸酯、酯、醚(例如，甲硅烷基醚或烷基醚)和缩醛。一些这种封闭基团的具体例子包括：烯丙基、Aloc、苄基、BOM、叔丁基、三苯甲基、TBS、TBDPS、TES、TMS、TIPS、PMB、MEM、MOM、MTM、THP等。不能直接获得、可完全取代羟基的其它封闭基团包括C_1-12烷基、C_3-12烷基、C_5-12芳基、C_5-12芳基-C_1-6烷基、NR¹R²(R¹和R²如以下段落所定义)、H、F、Cl、Br、CO₂H、CO₂(C_1-6烷基)、CN、CF₃、CCl₃等。

优选的封闭基团为通式：-O-X-Y或-OR³，其中，X是C(O)、S(O)或SO₂；Y是C_1-12烷基、C_1-12烷氧基、C_3-12环烷基、C_5-12芳基或C_5-12芳基-C_1-6烷基，各自任选地被1、2或3个独立地选自F、Cl、Br、CO₂H、CO₂(C_1-6烷基)、CN、CF₃或CCl₃的基团取代；或Y是NR¹R²；R¹和R²独立地选自H、C_1-12烷基、C_3-12环烷基、C_5-12芳基、C_5-12芳基-C_1-6烷基；或R¹和R²可偶联形成C_3-12饱和杂环基；R³是C_1-12烷基或C_3-12环烷基，各自可任选地被1、2或3个独立地选自F、Cl、Br、CO₂(C_1-6烷基)、CN、CF₃或CCl₃的基团取代；或R³是C_5-12芳基或C_5-12芳基-C_1-6烷基，各自可任选地被1、2、3、4或5个选自F、Cl、Br、CO₂H、CO₂(C_1-6烷基)、CN、CF₃或CCl₃的基团取代。当R³是C_1-12烷基或C_3-12环烷基时，一般被1、2或3个上述基团取代。当R¹和R²偶联形成C_3-12饱和杂环基时，表示R¹和R²与氮原子一起形成含3-12间任何数量碳原子的饱和杂环基(例如，C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂)。该杂环基可包含1或2个除氮原子外的杂原子(例如N、O或S)。C_3-12饱和杂环基的例子是吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、咪唑烷基、氮杂环丁基和氮丙啶基。

通过标准的衍生化过程，例如羟基与酰卤、烷基卤、磺酰卤等的反应，可从-OH制备封闭基团-O-X-Y和-OR³。因此，-O-X-Y中的氧原子优选为羟基氧原子，而-O-X-Y中优选用-X-Y基团取代羟基的氢原子。

或者，可通过取代反应如Mitsonobu型取代反应，获得封闭基团。制备羟基的封闭基团的这些和其它方法是公知的。

更优选地，封闭基团是-OC(O)CF₃[19]，或氨甲酯基团-OC(O)NR¹R²，其中R¹和R²独立地选自C_1-6烷基。更优选地，R¹和R²都是甲基，即封闭基团是-OC(O)NMe₂。氨甲酯封闭基团对糖苷键具有稳定作用，可在温和条件下制备。

优选修饰的MenA多糖包含n个单糖单元，其中，至少h%的单糖单元在3和4位不具有-OH。h值为24或以上(例如，25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、98、99或100)，优选50或以上。缺失的羟基优选为上述封闭基团(取代)。

其它优选的修饰MenA多糖包含的单糖单元中，至少s个单糖单元3位不具有-OH且4位不具有-OH。s值至少为1(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90)。缺失的-OH优选为上述封闭基团(取代)。

可用于本发明的合适的修饰MenA多糖具有以下通式：

其中，

n是1-100的整数(优选是5-25，更优选15-25的整数)；

T是通式(A)或(B)：

各Z基团独立地选自OH或上述封闭基团；和

各Q基团独立地选自OH或上述封闭基团；

Y选自OH或上述封闭基团；

E是H或氮保护基；

并且，约7%以上(例如，8%、9%、10%或以上)的Q基团是封闭基团。

各n+2Z基团可相同或不同。类似地，各n+2Q基团可相同或不同。所有Z基团可是OH。或者，至少10%、20、30%、40%、50%或60%的Z基团是OAc。优选地，约70%的Z基团是OAc，其余的Z基团是OH或上述封闭基团。至少约7%的Q基团是封闭基团。优选地，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或甚至是100%的Q基团是封闭基团。

优选的封闭基团是吸电子基团。不希望被理论所限制，认为：由于糖苷键上的多糖羟基可发生分子内亲核攻击(例如，通过形成环状中间体)，因此糖苷键不稳定易水解。羟基亲核性越强，分子内亲核攻击的趋势越高。吸电子封闭基团具有使氧孤电子对移位的作用，从而降低氧亲核性并降低分子内亲核攻击的趋势。

因此，为提供对血清群A的保护力，该水性组合物可包含上述MenA修饰糖。

优选本发明组合物可在37℃储存28天，28天后，偶联的MenA多糖只有不到f％起始总量将解离，其中，f为20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或以下。

共价结合

通常在本发明组合物中荚膜多糖是与载体蛋白偶联的。一般，偶联可使糖从T-非依赖性抗原转化为T-依赖性抗原，从而提高了糖的免疫原性，而能引发免疫记忆。

偶联尤其适用于儿科疫苗，是一种公知的技术[例如，参考文献20-29所述]。

优选的载体蛋白是细菌毒素或类毒素，例如白喉类毒素或破伤风类毒素、或CRM₁₉₇白喉毒素突变体[30-32]。其它合适的载体包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[33]；合成的肽[34,35]；热休克蛋白[36,37]；百日咳蛋白[38,39]；细胞因子[40]；淋巴因子[40]；激素[40]；生长因子[40]；人工蛋白，包括各种病原体衍生抗原的多种人CD4⁺T细胞表位[41]如N19蛋白[42]；流感嗜血杆菌的蛋白D[43,44]；肺炎链球菌溶血素[45]；肺炎球菌表面蛋白PspA[46]；铁摄取蛋白[47]；艰难梭状芽胞杆菌的毒素A或B[48]；细菌毒素突变体(例如，霍乱毒素“CT”或大肠杆菌不耐热毒素“LT”)；如Glu-29取代的CT[49]等。优选的载体是白喉类毒素、破伤风类毒素、流感嗜血杆菌蛋白D，尤其是CRM₁₉₇。

在本发明组合物中，可使用一种以上载体蛋白，以降低载体抑制的风险。这种不同的载体蛋白可用于不同的血清群，例如血清群A多糖可与CRM₁₉₇偶联，而血清群C多糖可与破伤风类毒素偶联。也可以对其特定多糖抗原使用一种以上的载体蛋白，例如，可将血清群A糖分为两组，一些与CRM₁₉₇偶联，另一些与破伤风类毒素偶联。然而，一般来说，优选对所有血清群使用相同的载体蛋白，优选CRM₁₉₇。

一种载体蛋白可携带一种以上的多糖抗原[50]。例如，一种载体蛋白可与血清群A和C的糖偶联。为此一目的，可在偶联反应之前混合这些糖。然而，一般来说，优选每种血清群具有不同的偶联物。

优选糖:(载体)蛋白的比率(w/w)为1:5(即蛋白质过量)-到5:1(即多糖过量)的偶联物。优选比率1:2到5:1，更优选1:1.25到1:2.5。MenA和MenC优选过量的载体蛋白。

偶联物可与游离载体蛋白联用[51]。当某给定的载体蛋白在本发明组合物中以游离和偶联形式存在时，优选非偶联形式在整个组合物中的量不大于载体蛋白总量的5重量%，更优选小于2重量%。

可采用任何合适的偶联反应，需要时采用合适的接头。

通常在偶联前活化或功能化糖。活化可包括，例如，氰基试剂如CDAP(例如，1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐[52,53等])。其它合适的技术利用碳二亚胺、肼、活性酯、降冰片烷、p-硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU；也见参考文献27的内容)。

可采用已知方法，例如，参考文献54和55所述方法，通过接头基团形成连接键。一种类型的连接键包括多糖的还原氨基化，所产生的氨基与己二酸接头基团的一端连接，然后蛋白质与己二酸接头基团的另一端连接[25,56,57]。其它接头基团包括B-丙酰氨基[58]、硝基苯基-乙胺[59]、卤酰基卤化物[60]、糖苷键[61]、6-氨基己酸[62]、ADH[63]、C₄-C₁₂分子[64]等。作为使用接头基团的一种地带方法，也可直接连接。直接连接蛋白质包括多糖的氧化，然后与蛋白质还原氨基化，例如参考文献65和66所述。

优选的方法包括将氨基引入糖(例如，通过用-NH₂取代末端=O)基团，然后用己二酰二酯(例如，己二酸N-羟基琥珀酰亚胺二酯)衍生化，并与载体蛋白反应。另一种优选的反应利用CDAP与蛋白D载体的活化，例如对于MenA或MenC。

偶联后，分离游离和偶联的糖。有许多合适的方法，包括疏水色谱法、切线超滤法、渗滤法等[也见参考文献67和68等]。

当本发明组合物包含偶联的寡糖时，优选寡糖的制备在偶联反应之前。

偶联后，本发明方法包括测定未偶联载体蛋白水平的步骤。一种进行此种测定的方法涉及毛细管电泳法[69](例如在游离溶液中)、或胶束电动色谱法[70]。

偶联后，本发明方法可包括测定未偶联糖水平的步骤。一种进行此种测定的方法涉及HPAEC-PAD[67]。

偶联后，本发明方法包括将非偶联多糖与偶联多糖分离的步骤。一种分离这些糖的方法是利用选择性沉淀一种组分的方法。优选通过脱氧胆酸盐处理选择性沉淀偶联糖，而使非偶联糖留在溶液中[67]。

偶联后，本发明方法包括测定偶联物的分子大小和/或摩尔质量的步骤。尤其是测定其分布。一种进行此种测定的方法包括分子筛色谱法，通过多角度光散射光度法和差异性折射法(SEC-MALS/RI)检测[71]。

寡糖

荚膜多糖通常以寡糖形式使用。这可通过使纯化的荚膜多糖断裂成片段而方便地形成(如通过水解)，通常接着是纯化获得所需大小的片断。

进行多糖的片段化优选使寡糖的最终平均聚合度(DP)低于30(例如在10和20之间，优选血清群A约为10；血清群W135和Y在15和25之间，优选约15至20；血清群C在12和22之间；等等)。DP可以通过离子交换色谱或比色试验方便地测定[72]。

进行水解时，水解产物通常要进行大小分级，以去除长度短的寡糖[73]。这可通过多种方法实现，如超滤后进行离子交换色谱。聚合度低于或等于约6(个单糖)的寡糖优选从血清群A中去除，聚合度低于4的寡糖优选从血清群W135和Y中去除。

多糖的化学水解通常包括在该领域的标准条件下用酸或碱处理。荚膜多糖解聚形成其组成单糖的条件是本领域已知的。一种解聚方法包括使用过氧化氢[11]。将过氧化氢加入到多糖中(例如，最终H₂O₂浓度为1%)，然后孵育(与55℃)该混合液直到实现所需的链长度减少。随时间减少链长度后，从混合物取样，测定样品中糖的(平均)分子量。一旦达到所需的链长度，即快速冷却终止解聚反应。

血清群B

抗病原体如乙型肝炎病毒、白喉和破伤风的疫苗通常包含一种蛋白质抗原(例如，HBV表面抗原、或破伤风类毒素)。相反，无细胞性百日咳疫苗通常至少含有三种百日咳杆菌蛋白，PrevNar^TM肺炎球菌疫苗含有七种不同的偶联糖抗原。其它疫苗如细胞性百日咳疫苗、麻疹疫苗、灭活的脊髓灰质炎疫苗(IPV)和脑膜炎球菌OMV疫苗性质上是大量抗原的天然复杂混合物。因此单一抗原、少量已鉴定抗原或未鉴定抗原的复杂混合物是否能引发保护力，取决于所要对抗的病原体。

如上所述，发现血清群B脑膜炎球菌疫苗效果捉摸不定。基于OMV的疫苗显示保护效力范围狭窄。而且，OMV中存在大量未鉴定抗原，以及其可变性质，意味着OMV存在各种质量控制问题。

本发明者发现，可实现对血清群B感染的广泛保护力，这可通过使用少量已鉴定的血清群B多肽抗原来实现，因而本发明组合物包含一种或多种多肽抗原，使得组合物可诱导对两种或多种(例如2或3种)脑膜炎奈瑟球菌血清群B的超毒性谱系A4、ET-5和谱系3的杀菌性免疫应答反应。

已报道了脑膜炎球菌血清群A[74]和B[75,76]的基因组序列，可从其编码的多肽选择合适的抗原[例如，参考文献77-82]。操作候选抗原以改善异源性表达[参考文献83-85]。

一种优选的组合物包含Tbp蛋白和Hsf蛋白[86]。Hsf是一种自身运载蛋白[87-89]，也称为nhhA[89]、GNA0992[77]或NMB0992[75]。Tbp是转铁蛋白偶联蛋白[90-93]，包括TbpA和TbpB以及TbpA和TbpB的高分子量和低分子量形式。Tbp包括各上述蛋白质和这些蛋白质的复合物以及能够偶联转铁蛋白的其它蛋白质或复合物。虽然Tbp可指TbpA或TbpB的高或低分子形式，但优选同时存在TbpA和/或TbpB的高分子量和低分子量形式。最优选地，存在高分子量和低分子量的TbpA。

另一种优选的组合物包含血清群B的低聚糖脂(LOS)[94]。可采用除血清群B多肽以外的LOS或用LOS代替血清群B多肽。

另一种优选的组合物包含选自奈瑟菌具有不同功能的至少两种不同蛋白质类别的抗原之一。这种蛋白质类别的例子是：粘附素、自身运载蛋白、毒素、整合性外膜蛋白和铁摄取蛋白。采用参考文献95的命名法，这些抗原选自：至少一种选自FhaB、NspA PilC、Hsf、Hap、MafA、MafB、Omp26、NMB0315、NMB0995、NMB1119和NadA的奈瑟球菌粘附素；至少一种选自Hsf、Hap、IgA蛋白酶、AspA和NadA的奈瑟球菌自身运载蛋白；至少一种选自FrpA、FrpC、FrpA/C、VapD、NM-ADPRT(NMB1343)以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3中的一种或两种的奈瑟球菌毒素；至少一种选自TbpA、TbpB、LbpA、LbpB、HpuA、HpuB、Lipo28(GNA2132)、Sibp、NMB0964、NMB0293、FbpA、Bcp、BfrA、BfrB和P2086(XthA)的奈瑟球菌铁摄取蛋白；至少一种奈瑟球菌膜偶联蛋白，优选外膜蛋白，尤其是选自PilQ、OMP85、FhaC、NspA、TbpA、LbpA、TspA、TspB、TdfH、PorB、MItA、HpuB、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA(GNA1946)、NMB1124、NMB1162、NMB1220、NMB1313、NMB1953、HtrA和PLDA(OMPLA)的整合性外膜蛋白。认为这些奈瑟球菌抗原的组合可令人惊讶地提高疫苗抵抗奈瑟球菌感染的效力[95]。

特别优选的组合物包含一种或多种以下抗原[96]：(1)“NadA”蛋白，优选低聚物形式(例如，三聚物)；(2)“741”蛋白；(3)“936”蛋白；(4)“953”蛋白；和(5)“287”蛋白。

MenB的“NadA”(奈瑟球菌粘附素A)在参考文献80中描述为蛋白“961”(SEQ ID2943和2944)在参考文献75中描述为“NMB1994”(也可参见GenBank登录号：11352904和7227256)。该蛋白的详细研究见参考文献97。用于本发明时，NadA可采用多种形式。NadA的优选形式是其平截或缺失变体，例如参考文献83-85所述。具体地说，优选不具有C末端膜锚着区的NadA(例如，菌株2996缺失残基351-405，得到SEQ ID NO：1)，有时使用上标“C”以示区别，例如NadA^(C)。没有大肠杆菌膜锚着区域的NadA的表达可使蛋白质分泌进入培养物上清液，同时除去其23mer前导肽(例如，保留菌株2996的327mer[SEQ ID NO：2])。有时用上标“NL”区别不具有前导肽的多肽，例如NadA^(NL)或NadA^(c)(NL)。优选的NadA多肽具有：(a)与SEQ ID NO：2有50%或更多(例如，60%、70%、80%、90%、95%、99%或更高)相同性的氨基酸序列；和/或(b)包含由SEQ ID NO:1的至少n个连续氨基酸构成的片段，其中，n为7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。优选的(b)片段缺乏SEQ ID NO：1的C端和/或N端的一个或多个氨基酸(例如，缺乏1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)(例如，NadA^(C)、NadA^(NL)、NadA^(C)(NL))。其它优选的片段包含SEQ ID1的表位，尤其优选的SEQ ID1片段是SEQ ID2。这些不同的序列包括NadA的变体(例如，等位基因变体、同源物、直系同源物、旁系同源物、突变体等)。各种NadA序列如参考文献98的图9所示。

MenB的“741”蛋白见参考文献80所述(SEQ ID2535和2536)，“NMB1870”见参考文献75所述(也可参见GenBank登录号GI:7227128)。血清群A中GenBank登录号为7379322.741的相应蛋白[74]自然是脂蛋白。当用于本发明时，741蛋白可采取多种形式。741的优选形式是其平截或缺失变体，如参考文献83-85中所述。具体地说，可删除741的N末端直到聚甘氨酸序列并包含该序列(例如，删除菌株MC58的残基1-72[SEQ ID NO:3])，有时用前缀“△G”以示区别。这种缺失可促进表达。删除也可除去741的脂化位点。优选741序列具有：(a)与SEQ ID NO：3有50%或更多(例如，60%、70%、80%、90%、95%、99%或更高)相同性氨基酸序列；和/或(b)包含由SEQ ID NO:3的至少n个连续氨基酸构成的片段，其中，n为7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。优选的(b)片段包含741的表位。其它优选的片段缺乏SEQ ID NO：3的C端和/或N端的一个或多个氨基酸(例如，缺乏1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)。这些序列包括741的变体(例如，等位基因变体、同源物、直系同源物、旁系同源物、突变体等)。各种741序列见于参考文献85的SEQ ID1-22，参考文献99的SEQ ID1-23，参考文献100的SEQ ID1-299。

血清群B的“936”蛋白见参考文献80所述(SEQ ID2883和2884)，在参考文献75中称为“NMB2091”(也可参见GenBank登录号GI:7227353)。血清群A相应基因[74]的GenBank登录号为7379093。当用于本发明时，936蛋白可采取多种形式。936的优选形式是其平截或缺失变体，如参考文献83-85中所述。具体地说，可删除936的N端前导肽(例如，删除菌株MC58的残基1-23，得到936^(NL)[SEQ ID NO：4])。优选的936序列具有：(a)与SEQ ID NO：4有50%或更多(例如，60%、70%、80%、90%、95%、99%或更高)相同性的氨基酸序列；和/或(b)包含由SEQ ID NO:4的至少n个连续氨基酸构成的片段，其中，n为7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。优选的(b)片段包含936的表位。其它优选的片段缺乏SEQ ID NO：4的C端和/或N端的一个或多个氨基酸(例如，缺乏1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)。这些序列包括936的变体(例如，等位基因变体、同源物、直系同源物、旁系同源物、突变体等)。

血清群B的“953”蛋白见参考文献80所述(SEQ ID2917和2918)，在参考文献75中称为“NMB1030”(也可参见GenBank登录号GI:7226269)。血清群A的相应蛋白[74]的GenBank登录号为7380108。当用于本发明时，953蛋白可采取多种形式。953的优选形式是其平截或缺失变体，如参考文献83-85中所述。具体地说，可删除953的N端前导肽(例如，删除菌株MC58的残基1-19，得到953^(NL)[SEQ ID NO：5])。优选的953序列具有：(a)与SEQ ID NO：5有50%或更多(例如，60%、70%、80%、90%、95%、99%或更高)相同性的氨基酸序列；和/或(b)包含由SEQ ID NO:5的至少n个连续氨基酸构成的片段，其中，n为7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。优选的(b)片段包含953的表位。其它优选的片段缺乏SEQ ID NO：5的C端和/或N端的一个或多个氨基酸(例如，缺乏1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)。这些序列包括953的变体(例如，等位基因变体、同源物、直系同源物、旁系同源物、突变体等)。953的等位基因形式可见参考文献82的图19。

血清群B的“287”蛋白见参考文献80所述(SEQ ID3103和3104)，在参考文献75中称为“NMB2132”，在参考文献77中称为“GNA2132”(也可参见GenBank登录号GI:7227388)。血清群A的相应蛋白[74]的GenBank登录号为7379057。当用于本发明时，287蛋白可采取多种形式。287的优选形式是其平截或缺失变体，如参考文献83-85中所述。具体地说，可删除287的N端直到聚甘氨酸序列并包含该序列(例如，删除菌株MC58的残基1-24，得到△G287[SEQID NO：6])。这种缺失可促进表达。优选的287序列具有：(a)与SEQ ID NO：6具有50%或更多(例如，60%、70%、80%、90%、95%、99%或更高)相同性的氨基酸序列；和/或(b)包含由SEQ ID NO:6的至少n个连续氨基酸构成的片段，其中，n为7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。优选的(b)片段包含287的表位。其它优选的片段缺乏SEQ ID NO：6的C端和/或N端的一个或多个氨基酸(例如，缺乏1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)。这些序列包括287的变体(例如，等位基因变体、同源物、直系同源物、旁系同源物、突变体等)。287的等位基因形式可见参考文献82的图5和15，以及参考文献80的实施例13和图21(SEQ ID3179-3184)。

优选的MenB抗原包含菌株2996、MC58、95N477和394/98之一中发现的氨基酸序列。蛋白287优选得自菌株2996，或更优选得自菌株394/98。蛋白741优选得自血清群B菌株MC58、2996、394/98或95N477，或得自血清群C菌株90/18311。更优选菌株MC58。蛋白936,953和NadA优选得自菌株2996。当某组合物包含特定蛋白质抗原(例如741或287)时，该组合物可包含一种以上变体形式的该抗原，例如蛋白质相同、但得自不同菌株。可包含串联或独立蛋白质形式的这些蛋白质。

然而，在一些实施方式中，本发明组合物包含一种以上菌株的相同蛋白质。已发现该方法对741蛋白有效。该蛋白是引发抗脑膜炎球菌抗体应答极其有效的抗原，能在所有脑膜炎球菌血清群中表达。系统进化分析法显示，该蛋白质可分成两组，其中一组再一分为二，共三种变体[101]，针对给定变体的血清对相同变体组中具有杀菌活性，但对能表达其它两种变体的菌株没有活性，即变体组内才有交叉保护力，但变体组间无交叉保护力。因此，为了达到最大的菌株交叉保护效力，优选组合物应包含蛋白741一种以上的变体。每种变体的示例性序列为SEQ ID NO:10,11和12，从以天然脂蛋白形式共价连接于脂质的N端半胱氨酸残基开始。因此，优选该组合物应包含以下至少两种：(1)第一种蛋白质，其包含与SEQ ID10至少有a%序列相同的氨基酸序列和/或包含SEQ ID10的至少x个连续氨基酸的片段构成的氨基酸序列；(2)第二种蛋白质，其包含与SEQ ID11至少有b%序列相同的氨基酸序列和/或包含SEQ ID11的至少y个连续氨基酸的片段构成的氨基酸序列；以及(3)第三种蛋白质，其包含与SEQ ID41至少有c%序列相同的氨基酸序列和/或包含SEQ ID41的至少z个连续氨基酸的片段构成的氨基酸序列。a值至少是85，例如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5或更高。b值至少是85，例如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5或更高。c值至少是85，例如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5或更高。a、b和c值之间没有内在的相互联系。x值至少是7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。y值至少是7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。z值至少是7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。x、y和z值之间没有内在的相互联系。优选地，任何特定的741氨基酸序列不属于(1)、(2)和(3)中的一种以上类别。因此，任何特定的741序列只属于(1)、(2)和(3)中的一种类别。因此，优选地：蛋白(1)与蛋白(2)的序列相同性小于i%；蛋白(1)与蛋白(3)的序列相同性小于j%；蛋白(2)与蛋白(3)的序列相同性小于k%。i值为60或更高(例如61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90等等)并且最高为a。j值为60或更高(例如61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90等等)并且最高为b。k值为60或更高(例如61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90等等)并且最高为c。i、j和k值不存在内在的相互联系。

本发明组合物可包含少量(例如少于t种抗原，其中t是10、9、8、7、6、5、4或3)经纯化的血清群B抗原。尤其优选地，该组合物不应包含这些抗原的复杂或不明确的混合物，例如，优选地，组合物中不包含外膜囊泡。这些抗原优选地以重组方式在异源宿主中表达并纯化。对于包含t种MenB抗原的组合物，可存在t种不同的多肽，但为了进一步降低复杂性，优选将至少两种抗原表达为一条多肽链中(“杂合”蛋白质[参考文献83-85])，即t种抗原形成不到t种多肽。杂合蛋白具有两个主要优点：第一，通过加入合适的杂合伴侣蛋白，有助于克服蛋白质不稳定或表达差的问题；第二，简化了商业生产，只需要进行一次表达和纯化可产生两种不同用途的蛋白质。本发明组合物中包含的杂合蛋白可包含上述五种抗原中的两种或以上(即2、3、4或5种)。杂合优选由五种抗原中的两种构成。

在五种基本抗原的组合(NadA、741、953、936和287)中，抗原可以一种以上的杂合蛋白和/或非杂合蛋白形式存在。然而，优选地，抗原以杂合或非杂合形式存在，但不是同时存在，虽然同时包含杂合和非杂合形式(优选脂蛋白)的蛋白741抗原是有用的，尤其是当使用一种以上741变体时。

杂合蛋白可以由公式：NH₂-A-[-X-L-]n-B-COOH来表示，式中，X是五种基本抗原之一的氨基酸序列；L是任选的接头氨基酸序列；A是任选的N端氨基酸序列；B是任选的C端氨基酸序列；n为2、3、4或5。

最优选地，n是2。用于本发明的两种抗原杂合物包括：NadA和741；NadA和936；NadA和953；NadA和287；741和936；741和953；741和287；936和953；936和287；953和287。两种优选的蛋白质是：X₁是936，X₂是741；X₁是287，X₂是953。

当-X-部分具有野生型前导肽序列时，在该杂合蛋白中可包含或删去该部分。在一些实施方式中，除了位于杂合蛋白N端的-X-部分的前导肽，可删除所述前导肽，也就是说，保留X₁前导肽，但删除X₂…Xn的前导肽。这等同于删除所有前导肽并将X1的前导肽作为-A-部分使用。

对于[-X-L-]的每种n的情况，可以具有或不具有接头氨基酸序列-L-。例如，当n=2时，杂合蛋白可以是NH₂-X₁-L₁-X₂-L₂-COOH、NH₂-X₁-X₂-COOH、NH₂-X₁-L₁-X₂-COOH、NH₂-X₁-X₂-L₂-COOH等等。接头氨基酸序列-L-通常较短(例如20个或更少的氨基酸，即19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。实例包括有利于克隆的短肽序列、聚甘氨酸接头序列(即Glyn，其中n=2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)、以及组氨酸尾(即Hisn，其中n=3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。其他合适的接头氨基酸序列对本领域技术人员来说是显而易见的。一种有用的接头是含Bam HI限制性位点形成的Gly-Ser二肽(这样有助于克隆和操作)的GSGGGG(SEQ ID NO:9)，(Gly)₄四肽(SEQ ID NO:73)是另一种典型的聚甘氨酸接头。当X_n+1是△G蛋白，L_n是甘氨酸接头时，这等同于X_n+1不是△G蛋白且不存在L_n。

-A-是任选的N端氨基酸序列。该序列通常较短(例如40个或更少的氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。实例包括引导蛋白质运输的前导肽序列，或有利于克隆或纯化的短肽序列(例如，组氨酸尾，即Hisn，其中n=3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。其他适当的N端氨基酸序列是本领域技术人员已知的。如果X₁缺乏其自身的N端甲硫氨酸，优选-A-是可提供N端甲硫氨酸的寡肽(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸)。

-B-是任选的C端氨基酸序列。该序列通常较短(例如40个或更少的氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。实例包括引导蛋白质运输的序列，有利于克隆或纯化的短肽序列(例如，包含组氨酸尾，即Hisn，其中n=3、4、5、6、7、8、9、10或更多)，或能提高蛋白质稳定性的序列。其他适当的C端氨基酸序列是本领域技术人员已知的。

两种特别优选的本发明杂合蛋白如下：

n

A

X1

L1

X2

L2

B

SEQ ID NO：

2

MA

△G287

GSGGGG

953NL)

-

-

7

2

A

936(NL)

GSGGGG

△G741

-

-

8

这两种蛋白可与NadA(尤其是SEQ ID NO:2)联用。因此，本发明优选的MenB抗原组合物包含：含氨基酸序列SEQ ID NO：2的第一多肽，含氨基酸序列SEQ ID NO：7的第二多肽，和含氨基酸序列SEQ ID NO：8的第三多肽。这是本发明中使用的一组优选MenB抗原。

如上所述，本发明组合物可诱导血清杀菌性抗体应答，有效抵御两种或三种MenB超毒性谱系A4、ET-5和谱系3。它们还可诱导对一种或多种超毒性谱系亚组、亚组III、亚组IV-1或ET-37复合物，和对其它谱系如高侵袭性谱系的杀菌性抗体应答。这些抗体应答可在小鼠中方便地测定，是疫苗效力的标准指标[例如，见参考文献77的脚注14]。血清杀菌活性(SBA)测定的是补体介导的杀菌活性，可采用人或幼兔补体进行试验。WHO标准要求疫苗在90％以上患者中可诱导SBA增加至少4倍。该组合物不需要诱导对这些超毒性谱系的每一种和所有MenB菌株的杀菌抗体；而是对于任何给定的由特定超毒谱系中的4种或更多血清群B脑膜炎球菌菌株构成的组而言，该组合物诱导的抗体具有针对该组至少50％(例如60％、70％、80％、90％或更高)成员的杀菌活性。优选的菌株组包括从以下至少4个国家分离的菌株：GB、AU、CA、NO、IT、US、NZ、NL、BR和CU。所述血清优选具有至少1024的杀菌滴度(例如2¹⁰、2¹¹、2¹²、2¹³、2¹⁴、2¹⁵、2¹⁶、2¹⁷、2¹⁸或更高，优选至少2¹⁴)，即所述免疫血清经1024倍稀释时能够杀灭至少50％特定菌株的测试菌，见参考文献77所述。

优选的组合物可诱导对以下血清群B脑膜炎球菌菌株的杀菌应答反应：(i)菌簇A4、菌株961-5945(B:2b:P1.21,16)和/或菌株G2136(B:-)；(ii)ET-5复合物、菌株MC58(B:15:P1.7,16b)和/或菌株44/76(B:15:P1.7,16)；(iii)谱系3、菌株394/98(B:4:P1.4)和/或菌株BZ198(B:NT:-)的杀菌应答反应。更优选组合物可诱导对菌株961-5945、44/76和394/98的杀菌应答。菌株961-5945和G2136都是奈瑟菌MLST参照菌株[参考文献102中是638和1002]。菌株MC58可广泛获得(例如，ATCC BAA-335)，在参考文献75中列出了此菌株序列。菌株44/76已被广泛应用和鉴定(例如，参考文献103)，是奈瑟菌MLST对照菌株之一[参考文献102中是237；参考文献104中表2第32行]。菌株394/98于1998年在新西兰最早分离得到，采用该菌株已发表了几篇研究(例如，参考文献105和106)。菌株BZ198是另一种MLST对照菌株[参考文献102中是409；参考文献104中表2第41行]。该组合物还可诱导对ET-37复合体的血清群W135菌株LNP17592(W135:2a:P1.5,2)的杀菌应答。这是2000年在法国分离得到的Haji菌株。

本发明组合物中可包含的其它MenB多肽抗原包括包含以下氨基酸序列之一的抗原：参考文献78的SEQ ID NO：650、参考文献78的SEQ ID NO：878、参考文献78的SEQ ID NO：884、参考文献79的SEQ ID NO：4、参考文献80的SEQ ID NO：598、参考文献80的SEQ ID NO：818、参考文献80的SEQ ID NO：864、参考文献80的SEQ ID NO：866、参考文献80的SEQ ID NO：1196、参考文献80的SEQ ID NO：1272、参考文献80的SEQ ID NO：1274、参考文献80的SEQ ID NO：1640、参考文献80的SEQ ID NO：1788、参考文献80的SEQID NO：2288、参考文献80的SEQ ID NO：2466、参考文献80的SEQ ID NO：2554、参考文献80的SEQ ID NO：2576、参考文献80的SEQ ID NO：2606、参考文献80的SEQ ID NO：2608、参考文献80的SEQ ID NO：2616、参考文献80的SEQ ID NO：2668、参考文献80的SEQ ID NO：2780、参考文献80的SEQ ID NO：2932、参考文献80的SEQ ID NO：2958、参考文献80的SEQ ID NO：2970、参考文献80的SEQ ID NO：2988；或包含以下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有：(a)与所述序列有50%或更多(例如，60%、70%、80%、90%、95%、99%或更高)的相同性；和/或(b)包含所述序列的至少n个连续氨基酸片段，其中，n为7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。优选的(b)片段包含相关序列的表位。可包含一个以上(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多)的所述多肽。

其它抗原组分

本发明组合物中也可包含非脑膜炎球菌抗原和非奈瑟菌抗原，优选不降低对脑膜炎球菌组分免疫应答反应的抗原。例如，参考文献107公开了脑膜炎奈瑟球菌血清群B和C的寡糖与Hib多糖的混合物。尤其优选的非脑膜炎球菌抗原包括：

—白喉抗原，如白喉类毒素[例如参考文献108第3章]；

—破伤风抗原，例如破伤风类毒素[例如参考文献108第4章]；

—百日咳杆菌(Bordetella pertussis)的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，也可任选与百日咳杆菌黏附素(pertactin)和/或凝集原2和3组合使用[例如参考文献109和110]；

—细胞百日咳抗原；

—甲型肝炎病毒例如灭活的病毒的抗原[例如，111,112]；

—乙型肝炎病毒的抗原，如表面和/或核心抗原[如112，113]，表面抗原优选吸附在磷酸铝上[114]；

—脊髓灰质炎抗原[例如，115,116]，如IPV。

该混合物可包含这些抗原的一种或多种，需要时可使它们脱毒(如通过化学和/或遗传学方法使百日咳毒素脱毒)。

当该混合物中包含白喉抗原时，优选还包含破伤风抗原和百日咳抗原。类似地，当包含破伤风抗原时，优选还包含白喉抗原和百日咳抗原。类似的，当包含百日咳抗原时，优选还包含白喉抗原和破伤风抗原。

该混合物中的抗原一般以每种至少1μg/ml的浓度存在。通常，其给定抗原的浓度应足以引起对该抗原的免疫应答反应。混合这些抗原不会消除各单一糖抗原的保护效力，虽然可能降低实际的免疫原性(例如，ELISA滴度)。

作为在该混合物中所用蛋白质抗原的一种替代，可采用编码该抗原的核酸。因而可用编码该蛋白的核酸(优选DNA，如质粒形式)代替混合物中的蛋白组分。类似的，本发明组合物可包含能模拟多糖抗原的蛋白质，例如模拟表位的[117]或抗独特型抗体。它们可代替各个多糖组分，或补充多糖组分。例如，该疫苗可包含MenC[118]或MenA[119]荚膜多糖的肽模拟物，代替多糖本身。本发明组合物中包含的两种优选的非脑膜炎球菌抗原是能提供抗b型流感嗜血杆菌(Hib)和抗肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)保护力的抗原。

b型流感嗜血杆菌(Hib)

当该组合物包含b型流感嗜血杆菌(H.influenzae)抗原时，该抗原通常是Hib荚膜多糖类抗原。b型流感嗜血杆菌多糖抗原是众所周知的。

为了增强其免疫原性(特别是在儿童体内)，宜将Hib糖与载体蛋白共价结合。多糖偶联物的制备，以及Hib荚膜多糖的具体制备通常已充分公开[例如参考文献21-29等]。本发明可采用任何合适的Hib偶联物。下面描述了合适的载体蛋白，对Hib糖优选的载体是CRM₁₉₇(“HbOC”)、破伤风类毒素(“PRP-T”)以及脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitides)的外膜复合物(“PRP-OMP”)。

该偶联物的糖部分可以是多糖(例如全长的磷酸聚核糖基核糖醇(PRP))，但优选水解多糖以形成寡糖(例如分子量约1-5kDa)。

一种优选的偶联物包括经己二酸脂肪酸接头与CRM₁₉₇共价连接的Hib寡糖[120，121]。破伤风类毒素也是一种优选的载体。

给予Hib抗原优选产生抗-PRP抗体，浓度≥0.15μg/ml，更优选≥1μg/ml。

当组合物包含Hib糖抗原时，优选其不包含氢氧化铝佐剂。如果该组合物包含磷酸铝佐剂，则Hib抗原可吸附于该佐剂[122]，或可以不吸附[123]。通过在抗原/佐剂混合时选择合适的pH，选择具有合适等电点的佐剂，和选择组合物中各种抗原合适的混合顺序，可防止吸附[124]。

本发明组合物可以包含一种以上的Hib抗原。可以冻干Hib抗原，例如用于与脑膜炎球菌抗原一起重建。

肺炎链球菌

当所述组合物包含肺炎链球菌(S.pneumoniae)抗原时，该抗原通常优选与载体蛋白偶联的荚膜多糖抗原[例如参考文献125-127]。优选包含一种以上肺炎链球菌(S.pneumoniae)血清型的多糖。例如，广泛采用了23种不同血清型的多糖混合物，例如采用5到11种不同血清型多糖的偶联疫苗[128]。例如，PrevNar^TM[1]包含7种血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)的抗原，每种多糖通过还原氨基化与CRM197偶联，每0.5毫升剂量(4μg的血清型6B)含2μg每种糖类并且偶联物吸附在磷酸铝佐剂上。本发明的组合物优选包括至少血清型6B、14、19F和23F。偶联物可以吸附在磷酸铝上。

作为使用肺炎球菌多糖抗原之外的一种替代，组合物可以包括一种或多种多肽抗原。可以获得几种肺炎球菌菌株的基因组序列[129，130]并可以进行反向疫苗学[131-134]来鉴定适当的多肽抗原[135，136]。例如，该组合物可以包括一种或多种以下参考文献137中所定义的抗原：PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128和Spl30。该组合物可包含一种以上(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14种)的这些抗原。

在一些实施方式中，该组合物可包含肺炎球菌多糖和多肽。可以使用其简单的混合物，或可将肺炎球菌多糖抗原与肺炎球菌蛋白偶联。适合于这种实施方式的载体蛋白包括前面段落中所列举的抗原[137]。

可以冻干肺炎球菌抗原，例如与Hib抗原一起冻干。

药物组合物

本发明组合物，除上述组分外，通常还包含一种或多种“药学上可接受的载体”，包括本身不会诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的代谢慢的大分子如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖[138]、海藻糖[139]、乳糖和脂质凝聚物(例如油珠或脂质体)。这些载体是本领域技术人员所熟知的。该疫苗还可包含稀释剂，例如水、盐水、甘油等。此外，还可存在辅助性物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。无菌无热原的磷酸盐缓冲生理盐水是典型的运载体。药学上可接受的赋形剂的全面论述见参考文献140。

本发明组合物是水性形式，即溶液或悬浮液。可以其包装形式直接给予这种组合物的液体制剂，而不需要用水性介质重建，因而适于注射。组合物可以装在小瓶中，或是装在已充满药物的注射器中提供。注射器有或没有针头。注射器可装有单剂量的该组合物，而小瓶可装有单剂量或多个剂量。

本发明液体组合物还适合与冻干形式的其它疫苗重建，以重建冻干的Hib或DTP抗原。当本发明组合物用于这种临时重建时，本发明提供一种药盒，其装有两个小瓶，或可装有一支已充满药物的注射器和一个小瓶，注射器的内容物用于再活化小瓶内容物然后注射。

可以单剂量形式或多剂量形式包装本发明组合物。对于多剂量形式，与预充满药物的注射器相比，优选小瓶。可用常规方法确定有效的剂量体积，但一般注射用组合物的人用剂量体积为0.5ml。

该组合物的pH优选为6-8，更优选7。可利用缓冲剂维持合适的pH。当组合物包含氢氧化铝时，优选采用组氨酸缓冲剂[141]。组合物可以无菌和/或无热原。本发明组合物可与人体等渗。

本发明组合物是免疫原性组合物，更优选疫苗组合物。本发明疫苗可以是预防性(即防止感染)或治疗性(即治疗感染)疫苗，但通常是预防性疫苗。用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫学有效量的抗原，以及其它所需组分。“免疫学有效量”指以单剂量或多剂量的一部分给予个体时对治疗或预防有效。所述剂量根据待治疗个体的健康和生理情况、年龄、待治疗个体的分类学(例如，除人以外的灵长类动物、灵长类动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力，所需的保护程度、疫苗的配方、对医疗情况的主治医生评估、以及其它相关因素而不同。预期该量落在可通过常规试验测定的较宽的范围内。

在每个剂量内，各多糖抗原的量通常为1-50μg(以糖质量测定)，例如约1μg、约2.5μg、约4μg、约5μg、或约10μg。

每剂量中存在的各多糖量基本相同。然而，MenY糖:MenW135糖的比率(w/w)可大于1(例如2:1、3:1、4:1、5:1、10:1或更高)和/或MenY糖：MenC糖的比率(w/w)可小于1(例如1:2、1:3、1:4、1:5或更低)。

血清群A:C:W135:Y的糖类的优选比率(w/w)是：1:1:1:1；1:1:1:2；2:1:1:1；4:2:1:1；8:4:2:1；4:2:1:2；8:4:1:2；4:2:2:1；2:2:1:1；4:4:2:1；2:2:1:2；4:4:1:2；和2:2:2:1。血清群C:W135:Y的糖类的优选比率(w/w)是：1:1:1；1:1:2；1:1:1；2:1:1；4:2:1；2:1:2；4:1:2；2:2:1；以及2:1:1。优选使用基本相同量的每种糖。

优选本发明组合物包含少于50μg脑膜炎球菌多糖/每剂量。其它优选的组合物包含≤40μg脑膜炎球菌多糖/每剂量。其它优选的组合物包含≤30μg脑膜炎球菌多糖/每剂量。其它优选的组合物包含≤25μg脑膜炎球菌多糖/每剂量。其它优选的组合物包含≤20μg脑膜炎球菌多糖/每剂量。其它优选的组合物包含≤10μg脑膜炎球菌多糖/每剂量，但优选地，本发明组合物包含至少10μg总脑膜炎球菌多糖/每剂量。

本发明组合物可包含抗菌剂，尤其是在多剂量形式中。

本发明组合物可包含去污剂，例如吐温(聚山梨酯)如吐温80。通常去污剂存在的量较低，例如<0.01%。

本发明组合物可包含钠盐(例如氯化钠)，以产生等渗。通常NaCl浓度为10±2mg/ml。

本发明组合物通常包含缓冲剂。常用磷酸盐缓冲剂。

通常与其它免疫调节剂联合给予本发明组合物。具体地说，该组合物通常包含一种或多种佐剂。这些佐剂包括但不限于：

A.含矿物质的组分

用作本发明佐剂的含矿物质组分包括矿物盐类，例如铝盐和钙盐。本发明包括矿物质盐，例如氢氧化物(如羟基氧化物)、磷酸盐(如羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[例如见参考文献142第8和第9章]，或不同矿物质的混合物，这些矿物质可采取任何合适的形式(例如，凝胶、结晶、无定形等)，优选可吸附的。含矿物质的组分也可配制成金属盐颗粒[143]。

B.油性乳剂

适合用作本发明佐剂的油性乳剂成分包括角鲨烯-水乳剂，例如MF59[参考文献142第10章；也见于参考文献144](5%角鲨烯,0.5%吐温80和0.5%司盘85，用微流体仪配制成亚微米颗粒)。也可采用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。

C.皂苷制剂[参考文献142第22章]

皂苷制剂也可用作本发明佐剂。皂苷是在多种植物的树皮、树叶、茎、根，甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜苷的异源组合。得自南美皂树(Quillaiasaponaria Molina tree)树皮的皂苷已在广泛的研究中用作佐剂。也可从市场上购买到Smilax ornata(sarsaprilla)、锥花丝石竹(Gypsophillapaniculata)(brides veil)和肥皂根(Saponaria off cianalis)(皂根)的皂苷。皂苷佐剂制剂包含纯化的制剂如QS21，和脂质制剂如ISCOM。QS21以Stimulon^TM市售。

已采用HPLC和RP-HPLC来纯化皂苷组分。已鉴定了这些技术纯化的特定组份，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。优选地，皂苷是QS21。一种制备QS21的方法见参考文献145所述。皂苷制剂还可包含甾醇如胆固醇[146]。

皂苷和胆固醇的组合可用于形成独特的颗粒，称为免疫刺激复合物(ISCOM)[参考文献142第23章]。ISCOM通常还包含磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。ISCOM中可使用任何已知的皂苷。优选地，ISCOM包含一种或多种QuilA、QHA和QHC。ISCOM还在参考文献146-148中有所描述。任选地，ISCOMS不含附加的去污剂[149]。

基于皂苷的佐剂发展综述见参考文献150和151。

D.病毒小体和病毒样颗粒

病毒小体和病毒样颗粒(VLP)也可用作本发明的佐剂。这些结构通常包含一种或多种任选地与磷脂偶联或配制入磷脂中的病毒蛋白。它们通常是非病原性、非复制性的，通常不含任何天然病毒基因组。可用重组方法产生或从全病毒分离得到这种病毒蛋白。这些适用于病毒小体或VLP中的病毒蛋白包括来源于流感病毒(例如HA或NA)、乙型肝炎病毒(例如核蛋白或包膜蛋白)、戊型肝炎病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒、人乳头状瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、QB-噬菌体(例如外壳蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(例如反转录转座子Ty蛋白pl)的蛋白。VLP在参考文献152-157中有进一步描述。病毒小体在(例如)参考文献158中有进一步描述。

E.细菌或微生物衍生物

适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，例如肠道细菌的脂多糖(LPS)非毒性衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物。

LPS的非毒性衍生物包括单磷酰脂质A(MPL)和3-O-脱酰MPL(3dMPL)。3dMPL是3脱-O-酰化单磷酰脂质A与4、5或6酰化链的混合物。3脱-O-酰化单磷酰脂质A优选的“小颗粒”形式见参考文献159中所述。3dMPL的这种“小颗粒”小到足以在除菌过滤时通过0.22μm膜[159]。其它非毒性LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，例如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸盐衍生物如RC-529[160,161]。

脂质A衍生物包括大肠杆菌(Escherichia coli)的脂质A衍生物，例如OM-174。OM-174在(例如)参考文献162和163中有描述。

适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列(含有通过磷酯键与鸟嘌呤连接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含回文结构或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也显示具有免疫刺激作用。

CpG序列可包含核苷酸修饰/类似修饰如硫代磷酯酰修饰，可以是双链或单链。参考文献164、165和166公开了可能的类似取代基，例如用2’-脱氧-7-脱氮鸟嘌呤代替鸟嘌呤。CpG寡核苷酸的佐剂作用在参考文献167-172中也有描述。

CpG序列可介导TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[173]。CpG序列可特异性诱导Th1免疫应答，例如CpG-A ODN，或它可特异性诱导B细胞应答，例如CpG-B ODN。CpG-A和CpG-B ODN在参考文献174-176中有描述。优选地，CpG是CpG-A ODN。

优选地，构建CpG寡核苷酸时使其5’端可为受体所识别。优选将两个CpG寡核苷酸序列的3’端相连接形成“免疫聚体”。例如，见参考文献173和177-179。

细菌ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物可用作本发明的佐剂。优选地，该蛋白质得自大肠杆菌(大肠杆菌不耐热肠毒素“LT”)、霍乱(“CT”)或百日咳(“PT”)。使用脱毒的ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂见参考文献180所述，作为胃肠外佐剂见参考文献181所述。毒素和类毒素优选全毒素形式，包括A和B亚单位。优选地，A亚单位含有脱毒突变；优选B亚单位不突变。优选地，佐剂是脱毒的LT突变体如LT-K63、LT-R72和LT-G192。使用ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72作为佐剂在参考文献182-189中描述。氨基酸取代基的参考编号优选根据参考文献190中提出的ADP-核糖基化毒素的A和B亚单位的排列对比，该参考文献的内容被纳入本文作为参考。

F.人免疫调节剂

适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，例如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[191]等)[192]、干扰素(例如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。

G.生物粘着剂和粘膜粘着剂

生物粘着剂和粘膜粘着剂也可用作本发明的佐剂。合适的生物粘着剂包括酯化透明质酸微球[193]或粘膜粘着剂如聚(丙烯酸)交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素。壳聚糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂[194]。

H.微粒

微粒也可用作本发明的佐剂。优选由可生物降解和非毒性材料(例如聚(α-羟基酸)、聚羟基丁酸、聚正酯、聚酐、聚己酸内酯等)形成的微粒(即直径约100m-150nm的微粒，更优选直径约200-300nm，最优选直径约500nm-10μm)，优选聚(丙交酯-共-乙交酯)，任选经处理而具有负电荷表面(例如用SDS)或正电荷表面(例如用阳离子去污剂如CTAB)。

I.脂质体(参考文献142第13和14章)

适合用作佐剂的脂质体制剂的例子见参考文献195-197所述。

J.聚氧乙烯酯和聚乙烯酯制剂

适合用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯酯和聚乙烯酯[198]。这种制剂还包含聚氧乙烯脱水山梨糖醇表面活性剂和辛苯糖醇[199]以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂和至少一种其它非离子表面活性剂如辛苯糖醇[200]的混合物。优选的聚氧乙烯醚选自：聚氧乙烯-9-月桂醚(聚乙二醇单十二醚9)、聚氧乙烯-9-甾醇醚(steory ether)、聚氧乙烯-8-甾醇醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。

K.聚磷腈(PCPP)

PCPP制剂在参考文献201和202中有描述。

L.胞壁酰肽

适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺(去甲-MDP)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二软脂酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE).

M.咪唑喹诺酮化合物

适合用作本发明佐剂的咪唑喹诺酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系物(例如，"瑞喹莫德3M")，见参考文献203和204所述。

本发明还包含一种或多种上述佐剂的组合。例如，本发明中可使用以下佐剂组合物：(1)皂苷和水包油乳剂[205]；(2)皂苷(例如QS21)+无毒性LPS衍生物(例如3dMPL)[206]；(3)皂苷(例如QS21)+无毒性LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选地+甾醇)[207]；(5)dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂的组合[208]；(6)SAF，含10%角鲨烷、0.4%吐温80^TM、5%普流罗尼嵌段聚合物L121，及thr-MDP，经微体化成为亚微米乳液或经涡旋产生粒径较大的乳剂；(7)Ribi^TM佐剂系统(RAS)，(Ribi Immunochem)含2%角鲨烷、0.2%吐温80及单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)的一种或多种细菌细胞壁成分，优选MPL+CWS(DetoxTM)；以及(8)一种或多种矿物盐(例如铝盐)+LPS无毒性衍生物(例如3dMPL)。

用作免疫刺激剂的其它物质在参考文献142第7章中有描述。

尤其优选采用铝盐佐剂，抗原通常可吸附于这些铝盐上。Menjugate^TM和NeisVac^TMMenC偶联物采用氢氧化物佐剂，而Meningitec^TM可采用磷酸盐。本发明组合物可用氢氧化铝吸附一些抗原，而这些抗原可与磷酸铝偶联。然而，一般来说，优选只使用一种盐如氢氧化物或磷酸盐，而不是两种。优选避免使用氢氧化铝作为佐剂，尤其是当该组合物包含Hib抗原时。因而优选不含氢氧化铝的组合物。而可使用磷酸铝，典型的佐剂是无定形羟基磷酸铝，PO₄/Al摩尔比0.84-0.92,含量0.6mg Al³⁺/ml。可采用低剂量磷酸铝吸附，例如50-100μgAl³⁺/每剂量偶联物。当使用磷酸铝并且不希望抗原吸附于佐剂时，宜在溶液中加入游离的磷酸根离子(例如，通过采用磷酸盐缓冲液)。

不是所有的偶联物都要吸附，即一些或所有偶联物可游离在溶液中。

磷酸钙是另一种优选的佐剂。

处理方法

本发明还提供提高哺乳动物抗体应答反应的方法，该方法包括对哺乳动物给予本发明药物组合物。

本发明提供一种提高哺乳动物免疫应答反应的方法，该方法包括给予有效量的本发明组合物的步骤。免疫应答优选是保护性的，优选包括抗体应答。该方法可引发更强的免疫应答反应。

哺乳动物优选是人。当疫苗用作预防用途时，人优选是儿童(例如刚学会走路的孩子或婴儿)或青少年；当疫苗用作治疗用途时，人优选是成人。用于儿童的疫苗也可给予成人，以评价安全性、剂量、免疫原性等。

本发明还提供用作药物的本发明组合物。该药物优选能够引起哺乳动物免疫应答反应(即，它是免疫原性组合物)，更优选疫苗。

本发明还提供(i)偶联的血清群C荚膜多糖抗原；(ii)偶联的血清群W135荚膜多糖抗原；(iii)偶联的血清群Y荚膜多糖抗原；(iv)一种或多种血清群B的多肽抗原；以及，任选地，(v)偶联的血清群A荚膜多糖抗原，在制备用于提高哺乳动物免疫应答反应的药物中的应用。

这些应用和方法优选用于预防和/或治疗由奈瑟菌引起的疾病(如脑膜炎、败血症、菌血症、淋病等)。优选预防和/或治疗细菌性和/或脑膜炎球菌性脑膜炎。

一种评价治疗效果的方法包括给予本发明组合物后监测奈瑟菌感染。一种评价预防效果的方法包括给予组合物后监测针对五种基本抗原的免疫应答反应。本发明组合物的免疫原性可用以下方法测定：将其给予受试者(例如12-16月大的儿童或动物模型[209])，然后检测包括血清杀菌抗体(SBA)以及抗荚膜IgG的总抗体和高亲力抗体的ELISA滴度(GMT)。这些免疫应答反应通常应在组合物给药约4周后测定，并与该组合物给药前测定的值进行比较。优选SBA提高至少4倍或8倍。在给予单一剂量组合物时，可以进行一次以上的给药后测定。

本发明优选的组合物可以在患者体内产生优于每种抗原组分对受试人群可接受百分比的血清保护力标准的抗体滴度。抗原所具有的相关抗体滴度(认为某宿主对该抗原是血清阳转的)是熟知的，并且这些滴度由例如WHO等组织公布。优选大于80％的具有统计学意义的受试者样品是血清阳转的，更优选大于90％，还要优选大于93％，最优选96％－100％。

本发明组合物通常可直接给予患者。直接给药可通过不经消化道的注射实现(例如皮下、腹膜内、静脉内、肌内或组织间隙注射)，或通过直肠、口服、阴道、局部、透皮、鼻内、眼睛、耳部、肺部或其他粘膜给药。优选股部或上臂肌内给药。注射可以通过注射针(例如皮下注射用针)，但另外可以使用无针注射。典型的肌内注射剂量是0.5ml。

本发明可以用于诱导全身和/或粘膜免疫。

治疗剂量可以是单剂量方案或多剂量方案。多剂量可用于初次免疫方案和/或强化免疫方案。强化剂量方案可以在初次剂量方案之后。可常规确定初次剂量之间(例如4-16周之间)以及初次和强化之间的适当间隔时间。

奈瑟菌感染影响到身体各个部位，因此本发明的组合物可制备成各种形式。例如，该组合物可以制备成可以注射的液体溶液或悬浮液。该组合物可制备用于肺部给药，例如利用细粉或喷雾的吸入器给药。该组合物可以制备成栓剂或阴道栓剂。该组合物可以制备成用于鼻、耳或眼睛给药，例如喷雾剂、滴剂、凝胶剂或粉末剂[例如，参考文献210和211]。报道成功进行了肺炎球菌糖[212,213]、肺炎球菌多肽[214]、Hib多糖[215]、MenC糖[216]以及Hib和MenC糖偶联物的混合物[217]的鼻腔给药。

储存稳定性

本发明组合物具有改善的稳定性，尤其是血清群A糖组分。本发明提供制备疫苗组合物的方法，该方法包括以下步骤：(1)混合(i)偶联的血清群C荚膜多糖抗原、(ii)偶联的血清群W135荚膜多糖抗原、(iii)偶联的血清群Y荚膜多糖抗原和(iv)一种或多种血清群B的多肽抗原；(2)将步骤(1)得到的组合物储存至少1周；(3)准备装有步骤(2)储存的组合物的注射器，用于给患者注射；和，任选地，(4)将该组合物注射给予患者。

步骤(1)也可包括混合(v)偶联的血清群A荚膜多糖抗原。还可包括混合(vi)偶联的Hib抗原。还可包括混合(vii)肺炎球菌抗原。步骤(2)优选包括至少2周、4周、6周、8周、10周、12周或更长的储存期。储存步骤(2)可在或不在室温以下(例如10±10℃)。

本发明还提供了制备疫苗组合物的方法，该方法包括以下步骤：(1)混合(i)偶联的血清群C荚膜多糖抗原、(ii)偶联的血清群W135荚膜多糖抗原、(iii)偶联的血清群Y荚膜多糖抗原和(iv)一种或多种血清群B的多肽抗原；以及(2)从混合抗原提取单位剂量体积；和(c)将提取的单位剂量包装在热熔密封容器中。

步骤(1)也可包括混合(v)偶联的血清群A荚膜多糖抗原。还可包括混合(vi)偶联的Hib抗原。还可包括混合(vii)肺炎球菌抗原。热熔密封容器可以是小瓶或注射器。

本发明提供装有本发明组合物的热熔密封容器。

概要

术语“包含”指“包括”以及“由……构成”，例如“包含”X的组合物可以仅由X构成，或可以包括其它物质，例如X+Y。

术语“约”是关于数值x的，例如x±10%。

“基本上”不排斥“完全地”，例如“基本上”没有的组合物可以完全没有Y。需要时，“基本上”这个词可以从本发明的定义中省略。

两个氨基酸序列间序列相同性百分比指，排列对比时，比较两个序列中相同氨基酸序列的百分比。这种比对和百分同源性或序列相同性可用本领域已知的软件程序测定，例如见参考文献218部分7.7.18中的描述。优选的比对采用Smith-Waterman同源搜索算法来测定，该算法采用参数为缺口开放罚分(gapopen penalty)12及缺口延伸罚分(gap extension penalty)2、BLOSUM矩阵62的仿射缺口搜索。Smith-Waterman同源搜索算法见参考文献219中的描述。

术语“烷基”是指直链和支链形式的烷基基团。烷基基团可以间插有选自-O-、-NH-或-S-的1、2或3种杂原子。烷基基团也可以间插有1、2或3个双键和/或三键。然而，术语“烷基”通常指不含有杂原子间隔或双键或三键间隔的烷基基团。在提及C_1-12烷基的情况下，指该烷基基团可以包含介于1到12之间任何数目的碳原子(例如C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂)。类似地，当提及C_1-6烷基时，指该烷基基团可以包括介于1和6之间任何数目的碳原子(例如C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆)。

术语“环烷基”包括环烷基、聚环烷基和环烯烃基，以及它们与烷基基团的组合，例如环烷基烷基基团。环烷基可以间插有选自-O-、-NH-或-S-的1、2或3种杂原子。然而，术语“环烷基”通常指不含有杂原子间隔的环烷基基团。环烷基基团的实例包括环戊基、环己基、环己烯基、环己基甲基以及金刚烷基基团。当提及C_3-12环烷基时，指该环烷基基团可以包含介于3和12之间任何数目的碳原子(例如C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂)。

术语“芳基”指例如苯基和萘基等芳香基团。当提及C_5-12芳基时，指该芳基可以包括介于5和12之间任何数目的碳原子(例如C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂)。

术语“C_5-12芳基-C_1-6烷基”指例如苯甲基、苯乙基和萘甲基等基团。

氮保护基团包括甲硅烷基(例如TMS、TES、TBS、TIPS)、酰基衍生物(例如苯邻二甲酰亚胺、三氟乙酰胺、甲氧羰基、乙氧羰基、t-丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Z或Cbz)、9-芴基甲氧羰基(Fmoc)、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧羰基、2,2,2-三氯乙氧羰基(Troc))、磺酰基衍生物(例如β-三甲基甲硅烷基乙基磺酰基(SES))、亚磺酰基衍生物、C_1-12烷基、苯甲基、二苯甲基、三苯甲基、9-苯基芴基等等。优选的氮保护基团是Fmoc。

能促进克隆和纯化等的序列不是本发明必需的，可省略或除去。

应理解糖环可以开环或闭环形式存在，闭环形式如本文结构通式所示，开环形式也包括在本发明范围内。

可用各种方法(例如，重组表达、细胞培养物的纯化、化学合成(至少部分合成)等)制备各种形式(例如天然、融合、非糖基化、脂化等)的本发明多肽。优选基本纯的形式(即基本上不含其它奈瑟菌脑膜炎球菌或宿主细胞蛋白)。虽然多肽的表达可发生在奈瑟菌中，但优选在异源宿主中。异源宿主可以是原核生物(例如细菌)或真核生物。优选大肠杆菌，但其它合适的宿主包括枯草杆菌(Bacillus subtilis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、乳酰胺奈瑟菌(Neisseria lactamica)、灰色奈瑟菌(Neisseria cinerea)、分枝杆菌(Mycobacteria)(例如结核分支杆菌(M.tuberculosis))、酵母菌等。

可以许多方法(例如，化学合成(至少部分合成)，从基因组或cDNA库，从生物体自身等)制备本发明核酸，并可采取多种形式(例如，单链、双链、带菌体、探针等)。优选基本纯的形式(即基本上不含其它脑膜炎奈瑟球菌或宿主细胞核酸)制备。术语“核酸”包括DNA和RNA及其类似物，例如含修饰的主链(例如硫代磷酯酰化等)的核酸，以及肽核酸(PNA)等。本发明还包括含有上述核酸的互补序列的核酸(例如反义或用于探针的目的)。

按血清分群后，脑膜炎球菌分类包括血清型、血清亚型，然后是免疫型，标准命名法列出了血清群、血清型、血清亚型和免疫型，每个用冒号分隔，例如B:4:P1.15:L3,7,9。在血清群B中，有些谱系经常引发疾病(高入侵性)，有些谱系比其他谱系引发更严重形式的疾病(超毒性)，其他的几乎罕见引发疾病。已知有7个超毒性谱系，即亚群I、III和IV-1、ET-5复合物、ET-37复合物、A4簇落和谱系3。这些谱系已经通过多位点酶电泳(MLEE)而得以确定定义，但是多位点序列分型(MLST)也已经用于脑膜炎球菌的分类[参考文献104]。

本发明具体实施方式

△G287-953杂合蛋白

将编码脑膜炎球菌血清群B菌株394/98蛋白287和脑膜炎球菌血清群B菌株2996蛋白953的DNA消化并与短接头序列连接，得到编码氨基酸序列SEQID7的质粒。将该质粒转染入大肠杆菌中，培养此菌表达此蛋白质。充分生长后，收集细菌并纯化此蛋白质。离心细菌培养物，以沉淀物:缓冲液体积比为1:8，在50mM醋酸盐缓冲液(pH5)中匀浆化沉淀物。采用高压匀浆器(AVESTIN,14000psi下4个循环)裂解细菌。裂菌后，加入尿素使最终浓度为5M，然后室温搅拌1小时。用200mM醋酸盐缓冲液(pH4)+5M尿素将pH从6降低至5。2-8℃，将该混合物16800g离心60分钟。收集上清液，用SARTOBRANP(0.45-0.22μm SARTORIUS)过滤。滤过上清液中的蛋白质在-20℃至少能稳定30天，2-8℃至少能稳定15天。

在阳离子交换柱上进一步纯化蛋白质(SPFF,Amersham Biosciences)，用350mMNaCl+50mM醋酸盐+5M尿素pH5.00洗脱。大部分杂质存在于流穿液体中。用低浓度NaCl(180mM)预洗脱有利于去除两种污染性大肠杆菌蛋白质。

调节洗脱物质至pH8(用200mM TRIS/HCl+5M尿素pH9)，在Q琼脂糖HP柱(Amersham)上进一步纯化，用150mM NaCl+20mM TRIS/HCl pH8.00的5M尿素溶液洗脱。同样，低浓度盐(90mM)预洗脱可用于去除杂质。

用PBS pH7.00(150mMNaCl+10mM磷酸钾,pH7.00)以1:2稀释从Q HP柱过滤洗脱的物质，然后通过切线超滤用10倍体积的PBS pH7.00渗滤。渗滤结束时，物质浓缩1.6倍，至约1.2mg/ml总蛋白质，用30,000Da的截留膜(再生性纤维素膜50crn²,MilliporePLCTK30)透析该物质，产率约为90%。

936-△G741杂合蛋白

将编码脑膜炎球菌血清群B菌株2996蛋白936和脑膜炎球菌血清群B菌株MC58蛋白741的DNA消化并与短接头序列连接，得到编码氨基酸序列SEQ ID8的质粒。将该质粒转染大肠杆菌中，培养此菌表达该蛋白质。该重组蛋白不分泌，但在细菌中仍是可溶性蛋白。

充分生长后，离心细菌，得到湿菌糊，处理如下：

－在20mM磷酸钠pH7.00的存在下，用高压系统匀浆化。

－通过正交过滤离心和澄清。

－阳离子柱色谱(SP琼脂糖快速色谱)，用150mM NaCl的20mM磷酸钠pH7.00洗脱。

－阴离子柱色谱(Q琼脂糖XL)，收集流穿液。

－疏水柱色谱(苯基琼脂糖6快速高分配(High Sub)色谱)，用20mM磷酸钠pH7.00洗脱。

－用PBS pH7.4渗滤，用10Kd截留。

－最后除菌过滤，储存于-20℃。

最终物质中的蛋白质在-20℃和2-8℃都稳定至少3个月。

NadA^(NL)(C)蛋白

消化编码脑膜炎球菌血清群B菌株2996NadA蛋白的DNA，除去编码其C端的序列，得到编码的氨基酸序列SEQ ID1的质粒。将该质粒转染入大肠杆菌中，培养此菌以表达该蛋白。重组蛋白可分泌入培养基中，分泌的蛋白(SEQID2)中不含前导肽。上清液的处理如下：

－浓缩7倍和用缓冲液20mM TRIS/HCl pH7.6，通过错流UF(截留30Kd)渗滤。

－阴离子柱色谱(Q琼脂糖XL)，用400mM NaCl的20mM TRIS/HCl pH7.6洗脱。

－疏水柱色谱(苯基琼脂糖6快速高分配色谱)，用50mM NaCl的TRIS/HClpH7.6洗脱。

－羟基磷灰石陶瓷柱色谱(HA Macro.Prep)，用200mM磷酸钠pH7.4洗脱。

－用缓冲液PBS pH7.4渗滤(截留30Kd)。

－最后除菌过滤，储存在-20℃。

最终物质中的蛋白质在-20℃和2-8℃都可至少稳定6个月。

NadA蛋白易降解，可用蛋白质印迹或质谱(例如MALDI-TOF)检测NadA的截断形式，表明多至10kDa MW丧失。降解产物可通过凝胶过滤与天然NadA相分离(例如，用柱TSK300SWXL,预柱TSKSWXL,TOSOHAAS)。过滤得到三个峰：(i)保留时间12.637分钟，表观MW885.036Da的第一峰；(ii)保留时间13.871分钟，表观MW530.388Da的第二峰；(iii)保留时间13.871分钟，表观MW530.388Da的第三峰。三个峰的光散射分析表明，实际MW值为(i)208500Da、(ii)98460Da、(iii)78760Da。因此，第一峰含有NadA凝聚物，第三峰含有降解产物。

NadA^(NL)(C)的预期分子量为34.113Da，所以峰(ii)含有三聚体蛋白质，即所需的抗原。

抗原组合物

用包含三种蛋白质的组合物免疫小鼠，为进行比较，也分别测试了这三种蛋白质。每组10只小鼠。该混合物能够诱导对各种菌株的高杀菌滴度(抗体)：

“-”表示该菌株不含NadA基因

观察每只小鼠，三重混合物诱导了对产生各个抗原的三种血清群B菌株的高效且一致的杀菌(抗体)滴度：

#	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											2996	32768	16384	65536	32768	32768	65536	65536	32768	65536	8192
MC58	65536	32768	65536	65536	65536	8192	65536	32768	32768	65536
											394/98	65536	4096	16384	4096	8192	4096	32768	16384	8192	16384

与OMV联用和比较

在其它试验中，与菌株H44/76(Norway)或菌株394/98(New Zealand)制备的10μg OMV联合给予所述抗原(每种抗原20μg/剂量)。阳性对照是血清群B的抗荚膜SEAM-3单抗(mAb)或抗其它菌株的CRM₁₉₇-偶联荚膜多糖单抗。该混合物几乎总是得到高于单用OMV的(抗体)滴度，将此混合物加入到OMV几乎总能显著提高OMV的效力。在许多情况下，可观察到此抗原混合物诱导了与阳性对照相匹配的或超过阳性对照的应答反应。

超毒性谱系菌检测

测试了以下抗原对多种超毒性谱系血清群B菌株的效力：

(a)NadA^(NL)(C)

(b)△G287-953

(c)936-△G741

(d)(a)、(b)和(c)的混合物

(e)从菌株H44/76(Norway)制备的OMV

(f)从菌株394/98(New Zealand)制备的OMV

(g)△G287和(e)的混合物

(h)(d)和(e)的混合物

(i)(d)和(f)的混合物

SEAM-3用作阳性对照。

结果如下，以所示超毒性谱系中血清杀菌(抗体)滴度超过1024的菌株百分比表示：

	#菌株	(a)	(b)	(c)	(d)	(e)	(f)	(g)	(h)	(i)	S-3
												A4	4	50	50	0	100	25	25	25	100	100	+
ET-5	8	25	75	88	100	71	14	71	100	100	+
												谱系3	13	0	75	15	93	8	85	8	92	93	+
ET-37	4	11	22	0	33	0	0	0	22	25	+

针对特定的参照菌株，杀菌(抗体)滴度如下所示：

因此，组合物(d)、(h)和(i)可诱导对多种超毒性谱系A4、ET-5和谱系3血清群B脑膜炎球菌菌株的杀菌性抗体应答反应。用组合物(h)和(i)产生的抗体滴度通常高于用(d)，但对超毒性谱系A4、ET-5和谱系3的菌株覆盖范围不佳。

组合物(d)、(h)和(i)对不明类型菌株的覆盖也较高。

与脑膜炎球菌和/或Hib偶联物联用

三重MenB组合物与血清群C、W135和Y的寡糖偶联物混合，得到包含以下抗原的疫苗：

组分	每0.5ml剂量中的含量
		血清群C偶联物	10μg糖+12.5-25μg CRM197
血清群W135偶联物	10μg糖+12.5-25μg CRM197
		血清群Y偶联物	10μg糖+12.5-25μg CRM197
△G287-953	20μg多肽
		936-△G741	20μg多肽
NadA	20μg多肽

制备类似的疫苗，其包含MenA偶联物(10μg糖+12.5-33μCRM₁₉₇)和/或HbOCHib偶联物(10μg糖+2-5μgCRM₁₉₇)。

在一系列试验中，混合血清群C、W135和Y的偶联物，每种偶联物为40μg/ml(以糖定量)。为在使用前储存MenB抗原，用15mg蔗糖、10mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)冻干混合的偶联物[在50mTorr真空下，-45℃3小时，-35℃20小时，50mTorr下30℃10小时，125mTorr下30℃9小时]。冻干前最后体积为0.3ml。重新悬浮在0.6ml水溶液中后，存在的每种血清群多糖为12μg。冻干只是为了使用方便，不影响最终产品在正常储存期间的效力和稳定性。

以相同的方法制备第二批物质，但还包含与血清群C、W135和Y多糖相同剂量的血清群A偶联物。

以相同的方法制备第三批物质(血清群A、C、W135和Y)，但还包含与脑膜炎球菌多糖相同剂量的Hib-CRM₁₉₇偶联物。

为进行比较，制备了血清群A和C偶联物的冻干制剂。将MenA偶联物与15mg蔗糖一起冻干，重建后得到12μg的多糖，如上所述。将MenC偶联物与9mg甘露醇一起冻干，重建后得到12μg的多糖。

这些物质与600μ1血清群混合物(d)组合(或，作为相同组合物中缺少抗原的对照，即组2和3)，得到8种组合物：

组分	1	2	3	4	5	6	7	8
NadA(NL)(C)μg/剂量	20			20	20	20	20	20
									936-741μg/剂量	20			20	20	20	20	20
287-953μg/剂量	20			20	20	20	20	20
									MenA-CRMμg/剂量*		2.4	2.4	2.4			2.4	2.4
MenC-CRMμg/剂量*		2.4	2.4		2.4	2.4	2.4	2.4
									MenW-CRMμg/剂量*		2.4	2.4			2.4	2.4	2.4
MenY-CRMμg/剂量*		2.4	2.4			2.4	2.4	2.4
									Hib-CRMμg/剂量*			2.4					2.4
氢氧化铝mg/剂量	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15
									组氨酸mM	10	10	10	10	10	10	10	10
蔗糖mg/剂量		3	3	3		3	3	3
									甘露醇mg/剂量					1.8
磷酸钾pH7.2mM		3	3	3		3	3	3
									磷酸钠pH7.2mM					3
氯化钠mg/剂量	1.8	1.8	1.8	1.8	1.8	1.8	1.8	1.8

*所示量为多糖

第0、21和35天，以200μl对CD/1只小鼠(8只小鼠/组)的体积腹膜内给予这些组合物，第49天最后取血。用SBA试验检测第49天血清对多种血清群A、B、C、W135和Y的脑膜炎球菌菌株的抗体滴度。结果如下：

因此，即使加入了偶联的脑膜炎球菌和Hib多糖抗原后，脑膜炎球菌蛋白抗原仍然有效。类似地，即使加入蛋白质抗原后，脑膜炎球菌(多糖)偶联物仍然有效。这些数据的确提示，在偶联物中加入蛋白抗原可提高抗MenW135的效力(对照组2和7)。而且，存在一定水平的交叉反应性，尤其对于血清群Y，单用蛋白抗原也产生了良好的抗MenY(抗体)滴度[参考文献220]，组4和5也是。

数据还表明，在脑膜炎球菌(多糖)偶联物中加入Hib(多糖)偶联物(对照组2和3)也可提高抗W135活性。

使用修饰的MenA多糖

纯化MenA的荚膜多糖，经水解得到MenA寡糖。50℃，用50mM醋酸钠缓冲液pH4.75，以多糖浓度10mg/mL，水解多糖(2g)约4小时[73]。水解后，旋转蒸发干燥溶液。

用下述反应流程活化寡糖：

将寡糖溶解在DMSO中，糖浓度10mg/mL。按寡糖:CDI的摩尔比为1:20，加入21.262g CDI，室温搅拌该反应混合物16小时。用80:20(v/v)丙酮:DMSO混合液选择性沉淀然后离心，纯化产生的MenA-CDI化合物。通过测定游离咪唑与偶联咪唑的比率，计算出该活化反应的效率约为67.9%。

在第二反应步骤中，将MenA-CDI寡糖溶解在DMSO中，糖浓度约为10mg/mL。按MenA-CDI单位:DMA的摩尔比为1:100，加入36.288g99%的二甲胺氢氧化物(即R¹和R²=Me)，室温搅拌该反应混合液16小时。冻干反应产物，再溶解在10mg/mL水溶液中。

为除去寡糖制剂中的低分子量反应试剂(尤其是二甲胺(DMA))，用3.5kDaMWCO膜(Spectra/Por^TM)进行透析步骤。进行了四个透析步骤：(i)用2L1M的氯化钠透析16小时(透析因子1:20)，(ii)用2L0.5M的氯化钠透析16小时(透析因子1:20)，(iii)和(iv)各用2L WFI(透析因子1:20)透析16小时。为改进纯度，还用1kDa MWCO膜(Centricon)进行渗滤步骤。

将纯化的MenA-CDI-DMA产物溶解在pH6.5、25mM L-组氨酸(Fluka)缓冲液中。

为制备修饰的MenA糖偶联物(MenA-CDI-DMA)，整个加工过程如下：

－水解多糖，得到寡糖片段

－筛选寡糖片段

－还原氨基化所筛选寡糖上的末端醛基

－CDI反应前用Fmoc基团保护末端-NH₂基团

－DMA反应期间进行-NH₂的内部脱保护

－用SIDEA(N-羟基琥珀酰亚胺已二酸)活化末端-NH₂基团

－共价结合CRM₁₉₇蛋白

升高温度下，修饰的MenA寡糖偶联物比其天然MenA寡糖偶联物的抗水解能力强得多。例如，37℃28天后，该修饰寡糖所释放的糖为6.4%，而天然抗原为23.5%。而且，修饰的寡糖诱导的(抗体)滴度不显著低于天然糖结构诱导的滴度。

将修饰的MenA偶联物与MenC、MenW135和MenY偶联物混合，代替未修饰寡糖偶联物。将该四价混合物与三种MenB多肽混合，得到对脑膜炎奈瑟球菌血清群A、B、C、W135和Y的单剂量有效疫苗。

肺炎球菌组合

将三种组合的MenB蛋白与肺炎球菌多糖偶联物混合，每种肺炎球菌血清型(多糖)的最终浓度为2μg/剂量(是血清型6B的两倍)。因此，该重建疫苗包含以下抗原：

组分	每0.5ml剂量中的含量
		血清群A偶联物	5μg糖+6.25-16.5μg CRM197
血清群C偶联物	5μg糖+6.25-12.5μg CRM197
		血清群W135偶联物	5μg糖+3.3-10μg CRM197
血清群Y偶联物	5μg糖+3.3-10μg CRM197
		肺炎球菌血清型4偶联物	2μg糖+2.5μg CRM197
肺炎球菌血清型9V偶联物	2μg糖+2.5μg CRM197
		肺炎球菌血清型14偶联物	2μg糖+2.5μg CRM197
肺炎球菌血清型18C偶联物	2μg糖+2.5μg CRM197
		肺炎球菌血清型19F偶联物	2μg糖+2.5μg CRM197
肺炎球菌血清型23F偶联物	2μg糖+2.5μg CRM197
		肺炎球菌血清型6B偶联物	4μg糖+5μg CRM197

应理解，仅仅以示例性的方式描述了本发明，对此所作的各种改进仍属于本发明范围和精神。

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Claims (17)

1.一种水性免疫原性组合物，给予对象后，该组合物能诱导对脑膜炎奈瑟球菌血清群B、C、W135和Y的杀菌性免疫应答反应，其中，所述组合物包含：(i)偶联的血清群C荚膜多糖抗原；(ii)偶联的血清群W135荚膜多糖抗原；(iii)偶联的血清群Y荚膜多糖抗原；和(iv)一种或多种血清群B多肽抗原，

其中所述多肽抗原是寡聚体形式的“NadA”蛋白、“741”蛋白、“936”蛋白、“953”蛋白和“287”蛋白，其中：

所述NadA蛋白具有：(a)与SEQ ID NO：2有80%或更多相同性的氨基酸序列；和/或(b)包含由SEQ ID NO:1的至少7个连续氨基酸构成的片段，和包含SEQ ID：1的表位；

所述741蛋白具有(a)与SEQ ID NO：3有80%或更多相同性的氨基酸序列；和/或(b)包含由SEQ ID NO:3的至少7个连续氨基酸构成的片段，和包含SEQ IDNO:3的表位；

所述936蛋白具有(a)与SEQ ID NO：4有80%或更多相同性的氨基酸序列；和/或(b)包含由SEQ ID NO:4的至少7个连续氨基酸构成的片段，和包含SEQ IDNO:4的表位；

所述953蛋白具有(a)与SEQ ID NO：5有80%或更多相同性的氨基酸序列；和/或(b)包含由SEQ ID NO:5的至少7个连续氨基酸构成的片段，和包含SEQ IDNO:5的表位；

所述287蛋白具有(a)与SEQ ID NO：6有80%或更多相同性的氨基酸序列；和/或(b)包含由SEQ ID NO:6的至少7个连续氨基酸构成的片段，和包含SEQ IDNO:6的表位，和

其中一种或多种血清组C、W135和Y荚膜多糖抗原被O-乙酰化。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含：含氨基酸序列SEQ ID NO：2的第一多肽、含氨基酸序列SEQ ID NO：7的第二多肽和含氨基酸序列SEQ ID NO：8的第三多肽。

3.如权利要求1所述的组合物，还包含：(v)偶联的血清群A荚膜多糖抗原。

4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，修饰所述血清群A荚膜多糖，以使至少20%的单糖单元在其3或4位没有-OH。

5.如权利要求2或3所述的组合物，其特征在于，所述组合物可在37℃储存28天，28天后，偶联的MenA糖初始总量只有不到20%将发生解离。

6.如上述权利要求任一项所述的组合物，其特征在于，所述偶联的糖是寡糖。

7.如上述权利要求任一项所述的组合物，其特征在于，所述糖与选自以下的载体蛋白偶联：白喉类毒素、破伤风类毒素、流感嗜血杆菌蛋白D和CRM197。

8.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含：含氨基酸序列SEQ ID NO：2的第一多肽、含氨基酸序列SEQ ID NO：7的第二多肽和含氨基酸序列SEQ ID NO：8的第三多肽。

9.如上述权利要求任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含能提供抗B型流感嗜血杆菌(Hib)保护力的糖抗原。

10.如上述权利要求任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含能提供抗肺炎链球菌保护力的抗原。

11.如上述权利要求任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含磷酸铝佐剂。

12.如上述权利要求任一项所述的包装在热熔密封容器内的组合物。

13.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述容器是小瓶或注射器。

14.如上述权利要求任一项所述的用作药物的组合物。

15.(i)偶联的血清群C荚膜多糖抗原；(ii)偶联的血清群W135荚膜多糖抗原；(iii)偶联的血清群Y荚膜多糖抗原；(iv)一种或多种血清群B的多肽抗原；以及，任选地，(v)偶联的血清群A荚膜多糖抗原在制备用于提高哺乳动物免疫应答反应的药物中的应用。

16.如权利要求1-14任一所述的组合物的用途，用于制备提高哺乳动物抗体应答反应的药物，所述组合物包含：

(i)偶联的血清群C荚膜多糖抗原；(ii)偶联的血清群W135荚膜多糖抗原；(iii)偶联的血清群Y荚膜多糖抗原；和(iv)一种或多种血清群B多肽抗原，

其中所述多肽抗原是寡聚体形式的“NadA”蛋白、“741”蛋白、“936”蛋白、“953”蛋白和“287”蛋白，其中：

所述NadA蛋白具有：(a)与SEQ ID NO：2有80%或更多相同性的氨基酸序列；和/或(b)包含由SEQ ID NO:1的至少7个连续氨基酸构成的片段，和包含SEQ ID：1的表位；

所述741蛋白具有(a)与SEQ ID NO：3有80%或更多相同性的氨基酸序列；和/或(b)包含由SEQ ID NO:3的至少7个连续氨基酸构成的片段，和包含SEQ IDNO:3的表位；

所述936蛋白具有(a)与SEQ ID NO：4有80%或更多相同性的氨基酸序列；和/或(b)包含由SEQ ID NO:4的至少7个连续氨基酸构成的片段，和包含SEQ IDNO:4的表位；

所述953蛋白具有(a)与SEQ ID NO：5有80%或更多相同性的氨基酸序列；和/或(b)包含由SEQ ID NO:5的至少7个连续氨基酸构成的片段，和包含SEQ IDNO:5的表位；

所述287蛋白具有(a)与SEQ ID NO：6有80%或更多相同性的氨基酸序列；和/或(b)包含由SEQ ID NO:6的至少7个连续氨基酸构成的片段，和包含SEQ IDNO:6的表位，和

其中一种或多种血清组C、W135和Y荚膜多糖抗原被O-乙酰化。

17.一种水性免疫原性组合物，给予受试者后，该组合物能够诱导对脑膜炎奈瑟球菌血清群B、C、W135和Y的杀菌性免疫应答反应，所述组合物包含：(i)偶联的血清群C荚膜多糖抗原；(ii)偶联的血清群W135荚膜多糖抗原；(iii)偶联的血清群Y荚膜多糖抗原；和(iv)含氨基酸序列SEQ ID NO：2的第一多肽，含氨基酸序列SEQ ID NO：7的第二多肽，和含氨基酸序列SEQ ID NO：8的第三多肽,其中一种或多种血清组C、W135和Y荚膜多糖抗原被O-乙酰化。