JP2010162038A - 髄膜炎菌タンパク質ｎｍｂ１８７０の複数の改変体 - Google Patents

Abstract

【課題】髄膜炎菌性の病気および／または感染症に対する、特に血清群Ｂに対する免疫を提供するためのさらなる改良された組成物を提供すること。
【解決手段】髄膜炎菌タンパク質ＮＭＢ１８７０は先行技術において記載されている。本発明者らは、ＮＭＢ１８７０が、抗髄膜炎菌抗体応答を誘発するのに効果的な抗原であること、および、それは、すべての髄膜炎菌血清群にわたって発現されていることを発見した。４２種類の異なったＮＭＢ１８７０の配列が同定されていて、これらの群は３種類の変異型に分類されている。ある変異型に対してできた血清は、同じ変異型群の中で殺菌作用があるが、別の２つの変異型の一方を発現する菌株に対しては活性を持たない。すなわち、変異型内交差防御はあるが、変異型間交差防御はない。したがって、最大の菌株横断的効果のため、本発明は、異なったＮＭＢ１８７０変異型を含む混合物を使用する。
【選択図】なし

Description

本明細書において引用される文献はすべて、その全体が参考として本明細書で援用される。

（技術分野）
本発明は、ワクチン接種の分野に属し、特に、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）など、ナイセリア属の病原性細菌によって起きる病気に対するワクチン接種の分野に属する。

（背景技術）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、グラム陰性の莢膜に覆われた細菌で、人口の約１０％の上気道に定住している。定住されている１０、０００人あたり約一回（すなわち、人口１００、０００人あたり一回）、この細菌は血流に入り、そこで増殖して敗血症を引き起こす。この細菌は、血流から血液脳関門を横切って髄膜炎を引き起こす。どちらの病気も壊滅的で、効果的な抗生物質を利用できるにもかかわらず、感染した子供と若年成人のうちの５〜１５％を数時間内に殺すことができる。生き残った人の２５％までに、永続的な続発症が残る。

病気の予防は、一部ではワクチン接種によって行われている。免疫は、病気の防御が、補体媒介性殺菌を誘導できる血清抗体の存在と関係すること、および、精製された莢膜ポリ多糖がこれらの抗体を誘導できることが発見された１９６９年になって可能となった。多糖体および結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）のワクチンが、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹに対しては利用可能であるが、この方法は血清群Ｂには適用できない。なぜなら、莢膜多糖体がポリシアル酸のポリマーであって、これは、ヒトにおいては自己抗原だからである。血清群Ｂに対するワクチンを開発するために、外膜ベシクル（ＯＭＶ）に含まれる表面露出タンパク質が用いられている。これらのワクチンは、血清の殺菌抗体応答を誘発して、病気を防御するが、菌株間の交差防御を誘導できない［１］。

血清群ＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの完全ゲノム配列が公開されていて［２］、ワクチン抗原を同定するために解析されている［３］。血清群ＡのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの完全ゲノム配列も知られており［４］、また、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのＦＡ１０９０株の完全ゲノム配列も利用可能である［５］。参考文献６〜９は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに由来するタンパク質を開示しており、これらのタンパク質を発現させるための方法が、参考文献１０〜１２に開示されている。

髄膜炎菌性の病気および／または感染症に対する、特に血清群Ｂに対する免疫を提供するためのさらなる改良された組成物を提供することが、本発明の目的である。

本発明は、以下の項目を提供する。
（項目１）
組成物であって、以下の抗原：（ａ）配列番号２４に対して８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、および／または配列番号２４に由来する７個以上連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む、第１のタンパク質；（ｂ）配列番号３３に対して８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、および／または配列番号３３に由来する７個以上連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む、第２のタンパク質；ならびに（ｃ）配列番号４１に対して８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、および／または配列番号４１に由来する７個以上連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む第３のタンパク質、のうちの２つ以上を含む、組成物。
（項目２）
タンパク質（ａ）がタンパク質（ｂ）に対して７０％よりも低い配列同一性を有し、タンパク質（ａ）がタンパク質（ｃ）に対して７０％よりも低い配列同一性を有し、そしてタンパク質（ｂ）がタンパク質（ｃ）に対して７０％よりも低い配列同一性を有する、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記組成物が、血清群ＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＭＣ５８株、９６１−５９４５株、およびＭ１２３９株のそれぞれに対して有効な殺菌反応を誘導することができる、項目１〜項目２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４）
前記組成物が、抗体応答を誘発することができ、該抗体応答が、超病原性系統ＥＴ−３７、ＥＴ−５、クラスターＡ４、系統３、サブグループＩ、サブグループＩＩＩ、およびサブグループＩＶ−１の２つ以上においてＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの菌株に対して殺菌性である、項目１〜項目３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５）
前記タンパク質の一種類以上が、リポタンパク質である、項目１〜項目４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６）
前記タンパク質の一種類以上が、そのＮ末端の１０アミノ酸以内に、アミノ酸配列ＴＲＳＫＰ（配列番号７０）またはＴＲＳＫＰＶ（配列番号７１）を含まない、項目１〜項目５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７）
前記タンパク質の一種類以上が、そのＮ末端の１０アミノ酸以内に、アミノ酸配列ＰＳＥＰＰＦＧ（配列番号７２）を含まない、項目１〜項目６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８）
前記タンパク質の一種類以上が、アミノ酸配列ＧＧＧＧ（配列番号７３）を含む、項目１〜項目７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９）
前記タンパク質の一種類以上が、融合タンパク質の形態で使用される、項目１〜項目８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０）
前記融合タンパク質が、配列番号４６および／またはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＰ４リポタンパク質のリーダー配列を含む、項目９に記載の組成物。
（項目１１）
配列番号１〜４５、７７、７９〜８５、８７〜９４および１２３〜１４２より選択されたアミノ酸配列を含む、１種類以上のタンパク質を含む、項目１〜項目１０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２）
式：ＮＨ _２ −Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］ _ｎ −Ｂ−ＣＯＯＨのハイブリッドタンパク質を含む組成物であって、ここで：ｎは２以上であり、Ｌは任意のリンカーアミノ酸配列であり、Ａは任意のＮ−末端アミノ酸配列であり、Ｂは任意のＣ末端アミノ酸配列であり、そしてＸ部分は、以下：（ａ）配列番号２４に対して８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、および／または配列番号２４に由来する７個以上連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む、第１のタンパク質；（ｂ）配列番号３３に対して８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、および／または配列番号３３に由来する７個以上連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む、第２のタンパク質；ならびに（ｃ）配列番号４１に対して８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、および／または配列番号４１に由来する７個以上連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む、第３のタンパク質、のうちの２つ以上を含む部分である、組成物。
（項目１３）
前記ハイブリッドタンパク質が、以下のアミノ酸配列：配列番号７９、８２、８３、８５、８７、８８、８９、９０および１４２の一つを含む、項目１２に記載の組成物。
（項目１４）
１５種類よりも少ない抗原を含む、項目１〜項目１３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１５）
ＮＭＢ１８７０タンパク質以外のナイセリアの抗原を含む、項目１〜項目１４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１６）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓから調製されたベシクルを含む、項目１〜項目１５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１７）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹに由来する糖抗原を含む、項目１〜項目１６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１８）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹに由来する糖抗原を含む、項目１７に記載の組成物。
（項目１９）
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型に由来する糖抗原を含む、項目１〜項目１８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２０）
前記糖抗原が、一種類以上の担体タンパク質に結合している、項目１７、１８または１９に記載の組成物。
（項目２１）
前記糖抗原がオリゴ糖である、項目１７、１８、１９または２０に記載の組成物。
（項目２２）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する抗原を含む、項目１〜項目２１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２３）
前記血清群Ａの糖抗原が、天然型糖類の一以上のヒドロキシル基が封鎖基に置換された修飾糖類類である、項目１７〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２４）
血清群Ａの糖抗原がｎ個の単糖単位を含む場合、該単糖単位の５０％以上が３位および４位の両方に−ＯＨ基を有さない、項目１７〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２５）
前記血清群Ａの糖類が単糖単位を含み、該単糖単位の一つ以上が、３位に−ＯＨ基を有さず、かつ４位に−ＯＨ基を有さない、項目１７〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２６）
前記血清群Ａの糖類が以下の式：

を有し、ここで、ｎは１から１００までの整数（好ましくは１５から２５までの整数）であり；
Ｔは、以下の式（Ａ）または（Ｂ）：、

であって、各Ｚ基は、ＯＨ基または封鎖基から独立に選択され；および、
各Ｑ基は、ＯＨ基または封鎖基から独立に選択され；
Ｙは、ＯＨ基または封鎖基から選択され；
ＥがＨまたは窒素保護基であり；
ならびに、Ｑ基の７％よりも多くが封鎖基である、項目１７〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２７）
前記担体タンパク質がジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、ＣＲＭ _１９７ 、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのプロテインＤ、または肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡである、項目２０に記載の組成物。
（項目２８）
以下：（ｉ）前記抗原（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の２つ以上；（ｉｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、およびＹのそれぞれに由来する糖抗原、（ｉｉｉ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型に由来する糖抗原、および（ｉｖ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する抗原を含む、項目１〜項目２７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２９）
医薬として使用するための、項目１〜項目２８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３０）
哺乳動物において抗体応答を引き起こす方法であって、項目１〜項目２９のいずれか一項に記載の組成物を、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目３１）
前記方法が、ナイセリアの感染から前記哺乳動物を防御する、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
哺乳動物においてナイセリアの感染を予防するための医薬の製造における、項目１に規定される抗原（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうちの２つ以上の使用。
（項目３３）
項目１２または項目１３に記載のタンパク質をコードする、核酸。
（発明の開示）
参考文献２に開示されている約２２００種類のタンパク質の一つが「ＮＭＢ１８７０」である。このタンパク質は、元来、菌株ＭＣ５８由来のタンパク質「７４１」として開示されていたもので［参考文献８における配列番号２５３５および２５３６；本明細書の配列番号１］、「ＧＮＡ１８７０」［参考文献３に従う］または「ＯＲＦ２０８６」［１３］とも呼ばれていた。

今では、ＮＭＢ１８７０が、抗髄膜炎菌性抗体応答を誘導するための非常に効果的な抗原であって、髄膜炎菌の血清群すべてで発現されていることが分かっている。

ＮＭＢ１８７０は、これまでに調べられたすべての髄膜炎菌の菌株で発見されている。４２種類の異なった髄膜炎菌ＮＭＢ１８７０の配列が同定されており、これらの配列を３種類の改変体にグループ分けすることができることが分かった。さらに、ある改変体に対して生成された血清は、同じ改変体群の中では殺菌作用があるが、残りの２種類の改変体のどちらかを発現する菌株に対しては活性がないこと、すなわち、改変体内での交差防御はあるが、改変体間での交差防御はないことが分かっている。したがって、最大の菌株横断的な効率を得るためには、１つより多くの改変体を、患者を免疫するために使用する必要がある。

したがって、本発明は、以下の抗原を少なくとも２つ含む組成物を提供する。すなわち、
（ａ）配列番号２４に対して少なくともａ％の配列同一性を有するアミノ酸配列、および／または配列番号２４の少なくともｘ個連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む第１のタンパク質；
（ｂ）配列番号３３に対して少なくともｂ％の配列同一性を有するアミノ酸配列、および／または配列番号３３の少なくともｙ個連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む第２のタンパク質；および
（ｃ）配列番号４１に対して少なくともｃ％の配列同一性を有するアミノ酸配列、および／または配列番号４１の少なくともｚ個連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む第３のタンパク質。

また、本発明は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの複数の（例えば２、３、４、５、またはそれ以上の）菌株および／または血清群に対する免疫を備えさせるためのＮＭＢ１８７０の使用を提供する。

（（ａ）、（ｂ）および（ｃ）における、またはこれらの間の変動）
ａの値は少なくとも８５、例えば、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５またはそれ以上である。

ｂの値は少なくとも８５、例えば、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５またはそれ以上である。

ｃの値は少なくとも８５、例えば、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５またはそれ以上である。

ａ、ｂおよびｃの値は、本質的に互いに関連してはいない。

ｘの値は少なくとも７、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０である。ｙの値は少なくとも７、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０である。ｚの値は少なくとも７、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０である。ｘ、ｙおよびｚの値は、本質的に互いに関連してはいない。

所定のアミノ酸配列が、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の一つ以上のカテゴリーに入らないことが好適である。したがって、いずれのＮＭＢ１８７０配列も、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）というカテゴリーの一つだけに含まれる。したがって、タンパク質（ａ）は、タンパク質（ｂ）に対してｉ％よりも低い配列同一性を有し、タンパク質（ａ）は、タンパク質（ｃ）に対してｊ％よりも低い配列同一性を有し、また、タンパク質（ｂ）は、タンパク質（ｃ）に対してｋ％よりも低い配列同一性を有する。ｉの値は、６０以上（例えば、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０など）であり、高くてもａである。ｊの値は、６０以上（例えば、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０など）であり、高くてもｂである。ｋの値は、６０以上（例えば、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０など）であり、高くてもｃである。ｉ、ｊおよびｋの値は、本質的に互いに関連してはいない。

したがって、本発明の例示的２タンパク質実施態様において、タンパク質（ａ）は、配列番号２４に対して８５％よりも高い配列同一性を有するかもしれず、タンパク質（ｂ）は、配列番号３３に対して８５％よりも高い配列同一性を有するかもしれないが、タンパク質（ａ）および（ｂ）は、互いに対して７５％よりも低い配列同一性を有する。したがって、タンパク質（ａ）および（ｂ）は、それぞれの「プロトタイプ」配列にはそれぞれ非常に近縁であるが、互いに対しては、それほど近縁ではない。

したがって、本発明の例示的３タンパク質実施態様において、タンパク質（ａ）は、配列番号２４に対して８５％よりも高い配列同一性を有するかもしれず、タンパク質（ｂ）は、配列番号３３に対して８５％よりも高い配列同一性を有するかもしれず、タンパク質（ｃ）は、配列番号４１に対して８５％よりも高い配列同一性を有するかもしれないが、タンパク質（ａ）および（ｂ）は、互いに対して７５％よりも低い配列同一性を有し、タンパク質（ａ）および（ｃ）は、互いに対して７５％よりも低い配列同一性を有し、タンパク質（ａ）および（ｂ）は、互いに対して７５％よりも低い配列同一性を有する。

（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の２種類以上を混合したものは、好ましくは、以下の３つの菌株群の少なくとも２つの各菌株に由来する１種類以上のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株に対して殺菌性である抗体応答を誘発することができる。

（ａ）ＭＣ５８、ｇｂ１８５（＝Ｍ０１−２４０１８５）、ｍ４０３０、ｍ２１９７、ｍ２９３７、ｉｓｓ１００１、ＮＺ３９４／９８、６７／００、９３／１１４、ｂｚ１９８、ｍ１３９０、ｎｇｅ２８、ｌｎｐ１７５９２、００−２４１３４１、ｆ６１２４、２０５９００、ｍ１９８／１７２、ｂｚ１３３、ｇｂ１４９（＝Ｍ０１−２４０１４９）、ｎｍ００８、ｎｍ０９２、３０／００、３９／９９、７２／００、９５３３０、ｂｚ１６９、ｂｚ８３、ｃｕ３８５、ｈ４４／７６、ｍｌ５９０、ｍ２９３４、ｍ２９６９、ｍ３３７０、ｍ４２１５、ｍ４３１８、ｎ４４／８９、１４８４７、
（ｂ）９６１−５９４５、２９９６、９６２１７、３１２２９４、１１３２７、ａ２２、ｇｂ０１３（＝Ｍ０１−２４００１３）、ｅ３２、ｍ１０９０、ｍ４２８７、８６０８００、５９９、９５Ｎ４７７、９０−１８３１１、ｃ１１、ｍ９８６、ｍ２６７１、１０００、ｍ１０９６、ｍ３２７９、ｂｚ２３２、ｄｋ３５３、ｍ３６９７、ｎｇｈ３８、Ｌ９３／４２８６、
（ｃ）Ｍ１２３９、１６８８９、ｇｂ３５５（＝Ｍ０１−２４０３５５）、ｍ３３６９、ｍ３８１３、ｎｇｐ１６５。

例えば、混合物は、血清群ＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株ＭＣ５８、９６１−５９４５およびＭ１２３９のそれぞれに対して有効な殺菌応答を誘導することができる。

（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の２種類以上を混合したものは、好ましくは、臨床上関連する髄膜炎菌の血清群Ｂの少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）に対して殺菌性である抗体応答を誘発することができる。

（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の２種類以上を混合したものは、好ましくは、血清群ＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの菌株、および血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹの少なくとも１つ（例えば１つ、２つ、３つ、４つ）の菌株に対して殺菌性である抗体応答を誘発することができる。

（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の２種類以上を混合したものは、好ましくは、Ｎ．ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓおよび／またはＮ．ｃｉｎｅｒｅａの菌株に対して殺菌性である抗体応答を誘発することができる。

（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の２種類以上を混合したものは、好ましくは、図９に示した樹状図（すなわち、配列番号１から２３をＫｉｍｕｒａ＆Ｊｕｋｅｓ−Ｃａｎｔｏｒのアルゴリズムによって解析して得られた樹状図）の３つの主枝のうち少なくとも２つの主枝に由来する菌株に対して殺菌性である抗体応答を誘発することができる。

（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の２種類以上を混合したものは、好ましくは、超病原性（ｈｙｐｅｒｖｉｒｕｌｅｎｔ）系統ＥＴ−３７、ＥＴ−５、クラスターＡ４、系統３、サブグループＩ、サブグループＩＩＩ、およびサブグループＩＶ−１の少なくとも２つ（例えば２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ）のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの菌株に対して殺菌性になるという抗体応答を誘発することができる［１４、１５］。

本発明に係る組成物は、さらに、１種類以上の過侵襲性（ｈｙｐｅｒｉｎｖａｓｉｖｅ）系統に対する殺菌性抗体応答を誘導することができる。

（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の２種類以上の混合物は、好ましくは、ＳＴ１、ＳＴ４、ＳＴ５、ＳＴ８、ＳＴ１１、ＳＴ３２およびＳＴ４という多遺伝子座配列型［１６］の少なくとも２つ（例えば２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ）のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの菌株に対して殺菌性である抗体応答を誘発することができる。この混合物はまた、ＳＴ４４株に対して殺菌性である抗体応答を誘発することができる。

殺菌性抗体応答は、マウスにおいて適宜測定され、ワクチンの有効性を示す標準的な指標となる［例えば、参考文献３の末尾の注１４参照］。この組成物は、特定の系統またはＭＬＳＴ内のすべてのＭｅｎＢ株に対する殺菌性抗体を誘導する必要はないが、ある特定の超病原性系統またはＭＬＳＴ内の４つ以上の血清群Ｂの髄膜炎菌株からなる所定の群について、この組成物によって誘導された抗体は、この群の５０％以上（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上）に対して殺菌性である。好適な菌株群は、以下の国々の少なくとも４国において単離されたものである。すなわち、ＧＢ、ＡＵ、ＣＡ、ＮＯ、ＩＴ、ＵＳ、ＮＺ、ＮＬ、ＢＲおよびＣＵ。好ましくは、この血清は、少なくとも１０２４（例えば２^１０、２^１１、２^１２、２^１３、２^１４、２^１５、２^１６、２^１７、２^１８またはそれ以上で、好ましくは少なくとも２^１４）の殺菌力価を有する。すなわち、例えば、参考文献３の末尾の注１４に記載されているように、該血清は、１０２４分の１に希釈されても、特定の系統の被検細菌の少なくとも５０％を殺菌することができる。

（リポタンパク）
ＮＭＢ１８７０は、本来はＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのリポタンパクである。Ｅ．ｃｏｌｉで発現されても、脂質化されることが分かっている。

本発明に係る組成物に含まれるＮＭＢ１８７０タンパク質の１種類以上（例えば、１種類、２種類、３種類、４種類、５種類、６種類、７種類、８種類、９種類、１０種類）がリポタンパクであることが好ましい。

本発明は、配列番号２４から４５までの１つ以上に対して少なくとも５０％（例えば６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又はそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または配列番号２４から４５まで（好ましくは配列番号２５から４５まで）の１つ以上に由来する少なくとも７個（例えば８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０個）の連続したアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含むタンパク質であって、リポタンパクであるという特徴を有するタンパク質を提供する。

好ましくは、上記リポタンパクはＮ末端のシステイン残基を有し、これに対して脂質が共有結合する。バクテリアの発現を介してこのリポタンパクを調製するには、一般的に、ジアシルグリセリルトランスフェラーゼによる脂質化、その後のリポタンパク特異的（ＩＩ型）ＳＰａｓｅによる切断を促すための適当なＮ末端シグナルペプチドが必要である。したがって、本発明に係るリポタンパクは、Ｎ末端システインを持つことができ（例えば配列番号２４から４５）、したがって、これは、通常のＮ末端メチオニンを有する新生タンパク質（例えば配列番号１から２２）を翻訳後修飾した産物である。

リポタンパクは、脂質二重層と結合することができ、界面活性剤で可溶化することができる。

（配列）
本発明にとって有用なＮＭＢ１８７０タンパク質は、配列番号１から２３までの１つ以上に対して少なくとも５０％（例えば６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又はそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列、および／または配列番号１から２３までの１つ以上に由来する少なくとも７個（例えば８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０個）の連続したアミノ酸フラグメントからなるアミノ酸配列を含む。

好適なフラグメントには、（ａ）エピトープ、好ましくは殺菌性エピトープを含むフラグメント；（ｂ）配列番号１から２３までの２つ以上に共通するフラグメント；（ｃ）１個以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、またはそれ以上など）のＮ末端残基が欠失している配列番号１から２３；（ｄ）１個以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５など）のＣ末端残基が欠失している配列番号１から２３；および（ｅ）シグナルペプチドをもたない配列番号１から２３（例えば配列番号２４から４５）が挙げられる。これら好適なフラグメントは、互いに排他的なものではなく、例えば、あるフラグメントは、カテゴリー（ａ）および（ｂ）、またはカテゴリー（ｃ）および（ｄ）などに含まれ得る。

さらに、本発明にとって有用なＮＭＢ１８７０タンパク質は、配列番号１２３から１４１までの１つ以上に対して少なくとも５０％（例えば６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列、および／または配列番号１２３から１４１までの１つ以上に由来する少なくとも７個（例えば８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０個）の連続したアミノ酸フラグメントからなるアミノ酸配列を含む。

さらに、本発明にとって有用なＮＭＢ１８７０タンパク質は、参考文献１３の配列番号１から２５２までの１つ以上に対して少なくとも５０％（例えば６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列、および／または参考文献１３の配列番号１から２５２までの１つ以上に由来する少なくとも７個（例えば８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０個）の連続したアミノ酸フラグメントからなるアミノ酸配列を含む。参考文献１３の配列番号３００−３０２はコンセンサス配列を提供し、そして、参考文献１３の配列番号２５４〜２９９はフラグメントである。好ましいフラグメントとしては、（ａ）エピトープ、好ましくは殺菌性エピトープを含むフラグメント；（ｂ）配列番号１２３から１４１までの２つ以上に共通するフラグメント；（ｃ）１個以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、またはそれ以上など）のＮ末端残基が欠失している配列番号１２３から１４１；（ｄ）１個以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５など）のＣ末端残基が欠失している配列番号１２３から１４１；および（ｅ）シグナルペプチドをもたない配列番号１２３から１４１が挙げられる。これら好適なフラグメントは、互いに排他的なものではなく、例えば、あるフラグメントは、カテゴリー（ａ）および（ｂ）、またはカテゴリー（ｃ）および（ｄ）などに含まれ得る。

配列番号１から２３および１２３から１４１に１００％より低い同一性をもつ好適なアミノ酸配列は、その対立遺伝子多型体、ホモログ、オルトログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ）、パラログ、変異体などである。配列番号１から２３および１２３から１４１と比較したときに対立遺伝子多型体、ホモログ、オルトログ、パラログ、または変異体における１個以上の違いは、保存的アミノ酸置換、すなわち、１つのアミノ酸の、同類の側鎖をもつ別のアミノ酸との置換を含むことが好ましい。遺伝子にコードされたアミノ酸は、一般的に以下の４つのファミリーに分かれる。（１）酸性、すなわちアスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性、すなわちリジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性、すなわちアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性、すなわちグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、場合によって、芳香族アミノ酸として一緒に分類される。一般的に、これらファミリー内での単一のアミノ酸置換は、生物活性に大きな影響を与えない。

好適なタンパク質のサブセットは、タンパク質のＮ末端の１０アミノ酸以内に、アミノ酸配列ＴＲＳＫＰ（配列番号７０）またはＴＲＳＫＰＶ（配列番号７１）を含まない。別の好適なタンパク質のサブセットは、タンパク質のＮ末端の１０アミノ酸以内に、アミノ酸配列ＰＳＥＰＰＦＧ（配列番号７２）を含まない。

本発明で使用する別の好適なタンパク質のサブセットは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ）_ｎ（ここで、ｎは１、２、３、４以上）を含む（例えば配列番号７３）。

本発明に係る好適なタンパク質の特徴は、宿主動物に投与された後、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を誘導できることである。

タンパク質は、例えば化学合成（少なくとも一部）、プロテアーゼを用いた長いポリペプチド鎖の分解、ＲＮＡからの翻訳、細胞培養物からの精製（例えば組換え発現、またはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ培養液から）など、さまざまな方法によって調製することができる。Ｅ．ｃｏｌｉ宿主における異種性発現が、好適な発現経路である（例えばＤＨ５α、ＢＬ２１（ＤＥ_３）、ＢＬＲなど）。

本発明に係るタンパク質は、固体支持体に付着または固定させることが可能である。

本発明に係るタンパク質は、例えば放射活性標識、蛍光標識、またはビオチン標識などの検出用標識を含むことも可能である。これらは、免疫アッセイ技術において得に有用である。

タンパク質は、さまざまな形態を採ることができる（例えば天然型、融合型、グリコシル化型、非グルコシル化型、脂質化型、ジスルフィド架橋型など）。タンパク質は、好ましくは髄膜炎菌タンパク質である。

タンパク質は、好ましくは、実質的に純粋であるか、実質的に単離されている形態（すなわち、他のナイセリアまたは宿主のタンパク質を実質的に含まない）か、または実質的に単離された形態で調製される。一般的に、該タンパク質は、例えば、本来の環境から隔離された自然ではない環境で提供される。ある実施態様において、対象となるタンパク質は、対照と較べると、該タンパク質が濃縮されている組成物中に存在する。そのように、精製タンパク質が提供され、精製されたとは、他の発現タンパク質を実質的に含まない組成物の中に存在することを意味する。ここで、実質的に含まないとは、組成物の９０％未満、普通は６０％未満、より普通には５０％未満が、別の発現タンパク質で構成されていることを意味する。

「タンパク質」という用語は、あらゆる長さのアミノ酸ポリマーを意味する。このポリマーは、直鎖状でも分枝状でもよく、修飾アミノ酸を含むことも可能であり、非アミノ酸によって中断されていてもよい。また、この用語は、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または、標識成分との結合体化のような、その他の操作または修飾など、天然または介入によって修飾されているアミノ酸ポリマーも含む。また、この定義の範囲内には、例えば、１種類以上のアミノ酸のアナログ（非天然型アミノ酸などを含む）、ならびに、当技術分野で知られている別の修飾を含むタンパク質が含まれる。タンパク質は、単一の鎖または結合した鎖として生じ得る。

また、本発明は、配列番号７７、７９、８２、８３、８５、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３および９４の１つ以上に対して少なくとも５０％（例えば６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれ以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列、および／または配列番号７７、７９、８２、８３、８５、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３および９４の１つ以上に由来する少なくとも７個（例えば８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０個）の連続したアミノ酸フラグメントからなるアミノ酸配列を含む。

本発明が、単一のＮＭＢ１８７０タンパク質に係る場合、本発明は、参考文献１３の配列番号１から３０２のいずれかに開示されているアミノ酸配列を含むタンパク質を包含しない。しかし、本発明が、ＮＭＢ１８７０の混合物に係る場合には、そのようなタンパク質を選択的に使用することができる。

（ハイブリッドタンパク質およびタンデムタンパク質）
上記の通り、ＮＭＢ１８７０は、融合タンパク質の形態で使用することが可能であるが、融合タンパク質としてではなく発現させることもできる（例えばＧＳＴ、ＭＢＰ、ｈｉｓ−タグなどなしに）。

融合タンパク質は、Ｃ末端および／またはＮ末端に融合パートナーを持つことができる。配列番号１から２３とともにＮ末端融合パートナーを用いる場合、当業者は、（もし含まれるのであれば）開始コドンはバリンとして発現されることに気づく。なぜなら、ＧＴＧは、開始コドンとして使用される場合（その場合、Ｎ−ホルミル−メチオニンとして翻訳される）を除いてバリンとして翻訳されるからである。

好適なＮ末端融合パートナーとしては、他のタンパク質（具体的には、他のリポタンパク）由来のリーダーペプチドが挙げられるが、それらは、天然型のＮＭＢ１８７０のリーダーペプチドに代わることができる（すなわち、Ｎ末端システインの前の配列を、目的のリーダーペプチドで置換できる）。例としては、配列番号４６、およびＨ．ＩｎｆｌｕｅｎｚａｅＰ４リポタンパクのリーダー配列を含む配列である［例えば１７］。

好適な融合タンパク質のタイプが、参考文献１０、１１および１２に開示されており、文献中、２種類以上（例えば３、４、５、６またはそれ以上）のナイセリアタンパク質が結合して、１本のポリペプチド鎖として翻訳されている。一般的に、このようなハイブリッドタンパク質は、以下の式で表すことができる。

ＮＨ_２−Ａ−［Ｘ−Ｌ−］_ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨ
ここで、Ｘはナイセリアの配列を含むアミノ酸配列であり、Ｌは任意のリンカーアミノ酸配列であり、Ａは任意のＮ−末端アミノ酸配列であり、Ｂは任意のＣ末端アミノ酸配列であり、そして、ｎは１よりも大きい整数である。ｎの値は２とｘとの間であり、ｘの値は、典型的には３、４、５、６、７、８、９または１０である。好ましくは、ｎは２、３または４であり、より好ましくは、２または３であり、最も好ましくはｎ＝２である。

本発明によれば、上で定義したとおり、−Ｘ−部分の少なくとも１つはＮＭＢ１８７０配列である。「タンデム」タンパク質と呼ばれるハイブリッドタンパク質において、少なくとも１つの−Ｘ−部分が、例えば、Ｘ_１が配列番号２４であり、Ｘ_２が配列番号２５であるなど、他の−Ｘ−部分の少なくとも一つに対して配列同一性を有する。３種類のＮＭＢ１８７０改変体の２個または３個がタンデムタンパク質として連結しているタンパク質が好適である。

Ｘ_１以外のＸ部分については、特に、Ｘ_１がＮＭＢ１８７０配列でない場合には、好ましくは、天然のリーダーペプチドは削除されるべきである。一つの実施態様において、リーダーペプチドは、ハイブリッドタンパク質のＮ末端に位置する−Ｘ−部分のリーダーペプチド以外では除去される。すなわち、リーダーペプチドＸ_１は保持されるが、Ｘ_２…Ｘ_ｎのリーダーペプチドは削除される。これは、すべてのリーダーペプチドを除去して、Ｘ_１のリーダーペプチドを−Ａ−部分として用いるのと同じである。

−Ｘ−部分として使用するのに好適なＮＭＢ１８７０配列は、成熟Ｎ末端の近傍に見られるポリ−グリシン配列のところまで削除して、それを含む。例えば、ＮＭＢ１８７０配列は、ＶＡＡ…（または、ｍ３８１３菌株についてはＩＡＡ…）で開始する。このようなＮＭＢ１８７０配列としては、配列番号８０、８１および８４が挙げられる。

［−Ｘ−Ｌ−］のそれぞれのｎの例については、リンカーのアミノ酸配列−Ｌ−はあっても、なくてもよい。例えば、ｎ＝２のとき、ハイブリッドは、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｌ_１−Ｘ_２−Ｌ_２−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｌ_１−Ｘ_２−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｌ_２−ＣＯＯＨなどであり得る。リンカーのアミノ酸配列−Ｌ−は、典型的には短い（例えば２０またはそれよりも少ないアミノ酸、すなわち１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。例として、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリ−グリシンリンカー（すなわち、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上であるＧｌｙ_ｎ）、およびヒスチジンタグ（すなわち、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上であるＨｉｓ_ｎ）などがある。当業者には、他の適当なリンカーアミノ酸配列が明らかである。有用なリンカーはＧＳＧＧＧＧ（配列番号１４４）であって、これは、Ｇｌｙ−ＳｅｒジペプチドがＢａｍＨＩ制限酵素部位から形成されており、クローニングや操作をするのに役立つ。そして、Ｇｌｙ_４テトラペプチド（配列番号７３）も別の典型的なポリ−グリシンリンカーである。別の有用なリンカーは配列番号７８である。

−Ａ−は、任意のＮ−末端アミノ酸配列である。これは、典型的には短い（例えば４０またはそれよりも少ないアミノ酸、すなわち３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１などである）。例としては、タンパク質の輸送に関与するリーダー配列、または、クローニングまたは精製を容易にする短いペプチド配列（例えばヒスチジンタグ、すなわちｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上であるＨｉｓ_ｎ）などがある。当業者には、他の適当なＮ−末端アミノ酸配列が明らかである。Ｘ_１が、本来のＮ−末端メチオニンを失っている場合には、−Ａ−が、翻訳されたタンパク質の中にそのようなメチオニン残基を提供することができる（例えば、−Ａ−は、単一のＭｅｔ残基である）。ＮＭＢ１８７０を発現させる上で有用な−Ａ−部分は配列番号８６である。成熟リポタンパクにおいて、好ましくは、−Ａ−はＮ−末端システインを提供する（例えば、−Ａ−は単一のシステイン残基である）。

−Ｂ−は、任意のＣ−末端アミノ酸配列である。これは、典型的には短い（例えば４０またはそれよりも少ないアミノ酸、すなわち３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１などである）。例には、タンパク質の輸送に関与する配列、クローニングまたは精製を容易にする短いペプチド配列（例えばヒスチジンタグ、すなわちｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上であるＨｉｓ_ｎ）、またはタンパク質の安定性を高める配列が挙げられる。当業者には、他の適当なＣ−末端アミノ酸配列が明らかである。

本発明に係る好適なハイブリッドタンパク質において、Ｘ部分の一つは「タンパク質９３６」である。例えば、ｎ＝２、Ａ＝Ｍｅｔ、Ｘ_１＝９３６配列（例えば、プロセシングされたＭＣ５８タンパク質である配列番号７６）、Ｌ_１＝ポリ−グリシンリンカー（例えば配列番号１４４）、Ｘ_２＝Ｎ−末端が本来のポリ−グリシン配列まで削除されているが、それを含むＮＭＢ１８７０配列、そしてＬ_２およびＢは除去することができる。このようなハイブリッドタンパク質の例が配列番号７７であって、菌株ｍ１２３９由来の短縮型ＮＭＢ１８７０が、菌株ＭＣ５８由来のプロセシングされた９３６の下流に存在する。９３６（菌株２９９６）および短縮型ＮＭＢ１８７０（菌株２９９６またはＭ１２３９）のハイブリッドタンパク質のさらなる例は配列番号９１、９２、９３および９４である。

ｎ＝３の場合の好適なタンデムタンパク質は、３種類のＮＭＢ１８７０改変体のすべてを任意の順序で有することができる。

ｎ＝２の場合の好適なタンデムタンパク質は、２種類の異なったＮＭＢ１８７０改変体を有することができる。

ｎ＝２の場合（２種類の異なったＮＭＢ１８７０改変体）の好適なタンデムタンパク質の例は、配列番号７９、８２、８３、８５、８７、８８、８９および９０であり、これらは、菌株ＭＣ５８（改変体１）、２９９６（改変体２）およびＭ１２３９（改変体３）を使用している。

ｎ＝３の場合のタンデムタンパク質の例は、配列番号１４２に示されている。

（ＮａｄＡ）
Ｎａｄタンパク質は、参考文献１９１および１９２に開示されている。これらの参考文献は、３つの異なったＮａｄＡ対立遺伝子を開示している。しかし、いくつか小さな改変は見られる（例えば、血清群Ｃの菌株ＩＳＳ１０２４は、アレル２に７個からなる反復配列が１つ欠失しているという改変体を有し、血清群Ｃの菌株ＩＳＳ７５９および９７３−１７２０はともに、リーダーペプチドに単一のアミノ酸変異を有するアレル３の改変体を含み、そして、血清群Ｂの菌株９５３３０はアレル１と２の組換えを含んでいる）。

髄膜炎菌のＨａｊｉ菌株からＮａｄＡの配列を決定したところ、配列番号１４３が同定された。このタンパク質は、既知のアレル２および３の組換え体である。

本発明は、配列番号１４３に対して少なくとも５０％（例えば６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれ以上、例えば、１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または配列番号１４３に由来する少なくとも７個（例えば８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０個）の連続したアミノ酸フラグメントからなるアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。

好適なフラグメントとしては、（ａ）エピトープ、好ましくは殺菌性エピトープを含むフラグメント；（ｂ）配列番号１４３と、参考文献１９１および１９２に開示されているＮａｄＡ配列の少なくとも１つに共通するフラグメント；（ｃ）１個以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、またはそれ以上など）のＮ末端残基が欠失している配列番号１４３；（ｄ）１個以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５など）のＣ末端残基が欠失している配列番号１４３；および（ｅ）シグナルペプチドをもたない配列番号１４３などである。これら好適なフラグメントは、互いに排他的なものではなく、例えば、あるフラグメントは、カテゴリー（ａ）および（ｂ）、またはカテゴリー（ｃ）および（ｄ）などに含まれ得る。

配列番号１４３に１００％より低い同一性をもつ好適なアミノ酸配列は、その対立遺伝子改変体、ホモログ、オルトログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ）、パラログ、変異体などである。配列番号１４３と比較したときに対立遺伝子改変体、ホモログ、オルトログ、パラログ、または変異体における１個以上の違いは、保存的アミノ酸置換を含むことが好ましい。

（核酸）
本発明は、上で定義したとおりの本発明に係るタンパク質をコードする核酸を提供する。また、本発明は、（ａ）上記核酸に由来する少なくともｎ個連続するヌクレオチドのフラグメントであって、ｎが１０以上（例えば、１２、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００以上）であるもの；および／または（ｂ）上記核酸と少なくとも５０％（例えば６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有する配列を含む核酸を提供する。

さらに、本発明は、好ましくは「高ストリンジェント」条件下（例えば０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ溶液中６５℃）で、本発明に係るタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズすることができる核酸を提供する。

本発明に係る核酸をハイブリダイゼーション反応（例えばノザンブロットもしくはサザンブロット、または核酸マイクロアレイもしくは「遺伝子チップ」）および増幅反応（例えばＰＣＲ、ＳＤＡ、ＳＳＳＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡなど）およびその他の核酸技術に使用することができる。

本発明に係る核酸は、全部または一部を化学合成によって、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー由来、細菌そのもの由来などのヌクレアーゼ（例えば制限酵素）を用いた長いポリヌクレオチドの消化によってなど、多くの方法で調製することができる。

本発明に係る核酸は、例えば一本鎖、二本鎖、ベクター、プライマー、プローブ、標識されたもの、非標識のものなど、さまざまな形態をとることができる。

本発明に係る核酸は、好ましくは、単離された形態か、または実質的に単離された形態である。

本発明は、例えばアンチセンスもしくはプロービングのため、またはプライマーとして使用するための、上記した配列に相補的な配列を含む核酸を包含する。

「核酸」という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、また、改変された骨格を含むものなど、それらのアナログも含み、そして、ペプチド核酸（ＰＮＡ）なども含む。

本発明に係る核酸は、放射性または蛍光性の標識で標識することができる。これは、例えば、核酸を、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡなどの技術において使用するためのプライマーまたはプローブとする場合など、核酸を核酸検出技術に用いる場合に特に有用である。

また、本発明は、本発明に係るヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、核酸免疫に適したものなどのクローニングベクターまたは発現ベクター）、およびこのようなベクターによって形質転換された宿主細胞を提供する。

（さらなる抗原成分）
本発明に係る組成物は、少数の（例えばｔが５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４または３であるとき、ｔ種類の抗原よりも少ない）精製された血清群Ｂ抗原を含む。特に好適には、この組成物は、複合体または未定義の抗原混合物を含まないはずである。例えば、外膜ベシクルを組成物中に含まないことが好ましい。好ましくは、この抗原は異種宿主において組換えによって発現されて、精製される。

本発明に係る組成物は、少なくとも２種類の異なったＮＭＢ１８７０タンパク質を含む。また、別のナイセリア抗原を、細菌毎に１つ以上の抗原を標的して、エスケープ変異体を選抜する可能性を低下させたワクチンとして含むことも可能である。この組成物に含まれるナイセリア抗原は、
（ａ）参考文献６に開示されている偶数の配列番号（すなわち２、４、６、…、８９０、８９２）の４４６個の配列；
（ｂ）参考文献７に開示されている偶数の配列番号（すなわち２、４、６、…、８８、９０）の４５個の配列；
（ｃ）参考文献８に開示されている配列番号２〜３０２０の偶数番号、配列番号３０４０〜３１１４の偶数番号、および配列番号３１１５〜３２４１のすべての１６７４個の配列；
（ｄ）参考文献２のＮＭＢ０００１からＮＭＢ２１６０までの２１６０個のアミノ酸配列；
（ｅ）参考文献１０、１１または１２に開示されているアミノ酸配列；
（ｆ）（ａ）から（ｅ）までの改変体、ホモログ、オルトログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ）、パラログ、突然変異体など；または
（ｇ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓから調製された外膜ベシクル［例えば、参考文献１３９参照］
を含むタンパク質を包含する。

ナイセリア抗原に加えて、この組成物は、他の疾患または感染に対して免疫化するための抗原を含み得る。例えば、この組成物は、一つ以上の以下のさらなる抗原を含み得る：−Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来の抗原（例えば、ＣａｇＡ［１８〜２１］、ＶａｃＡ［２２、２３］、ＮＡＰ［２４、２５、２６］、ＨｏｐＸ［例えば、２７］、ＨｏｐＹ［例えば、２７］および／またはウレアーゼ）
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹ由来の糖抗原（例えば、血清群Ｃ由来の参考文献２８に開示されるオリゴ糖［参考文献２９も参照のこと］または参考文献３０のオリゴ糖。
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の糖抗原［例えば、３１、３２、３３］
−Ａ型肝炎ウイルス（例えば、不活化ウイルス）由来の抗原［例えば、３４、３５］
−Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、表面抗原および／またはコア抗原）［例えば、３５、３６］
−ジフテリア抗原（例えば、ジフテリアトキソイド）［例えば、参考文献３７の第３章］（例えば、ＣＲＭ_ｌ９７変異体［例えば、３８］）
−破傷風抗原（例えば、破傷風トキソイド）［例えば、参考文献３４の第４章］
−Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原（例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の百日咳ホロ毒素（ＰＴ）および線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ））（必要に応じて、ペルタクチン（ｐｅｒｔａｃｔｉｎ）ならびに／またはアグルチノーゲン（ａｇｇｌｕｔｉｎｏｇｅｎ）２および３［例えば、参考文献３９および４０］と組み合わせる）
−Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ菌由来の糖抗原［例えば、２９］−Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば、４１］
−Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の抗原［例えば、６、７、８、４２］
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原［例えば、４３〜４９］
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原［例えば、５０］
−Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の抗原［例えば、５１］
−ポリオ抗原［例えば、５２、５３］（例えば、ＩＰＶ）
−狂犬病抗原［例えば、５４］（例えば、凍結乾燥不活化ウイルス［例えば、５５、ＲａｂＡｖｅｒｔ^ＴＭ］）
−麻疹抗原、流行性耳下腺炎抗原および／または風疹抗原［例えば、参考文献３７の第９章、第１０章および第１１章］
−インフルエンザ抗原［例えば、参考文献３７の第１９章］、（例えば、赤血球凝集素タンパク質および／またはノイラミダーゼ表面タンパク質）
−Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来の抗原［例えば、５６］
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）由来のタンパク質抗原［例えば、５７、５８］
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）由来の糖抗原−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌）由来の抗原［例えば、５８、５９、６０］
−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の抗原［例えば、６１］
−Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ由来の抗原［例えば、６２、６３、６４］
−フラビウイルス科のウイルス（ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ属）由来の抗原（例えば、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルスの４つの血清型、ダニ媒介脳炎ウイルス、西ナイルウイルス由来）
−ペスチウイルス抗原（例えば、古典的ブタ熱病（ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｐｏｒｃｉｎｅ
ｆｅｖｅｒ）ウイルス、ウシウイルス性下痢（ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｏｅａ）ウイルス、および／またはボーダー病（ｂｏｒｄｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）ウイルス
−パルボウイルス抗原（例えば、パルボウイルスＢ１９由来）
−プリオンタンパク質（例えば、ＣＪＤプリオンタンパク質）
−アミロイドタンパク質（例えば、βペプチド［６５］）
−癌抗原（例えば、参考文献６６の表１、または参考文献６７の表３および表４に列挙される抗原）
本組成物は、これらのさらなる抗原を１種以上含み得る。

毒素タンパク質は、必要な場合、解毒され得る（例えば、化学的および／または遺伝的手段による百日咳毒素の解毒［４０］）。

ジフテリア抗原がこの組成物に含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原も含むことが好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原も含むことが好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原も含むことが好ましい。したがって、ＤＴＰの組み合わせが好ましい。

糖抗原は、好ましくは、結合体形態である。この結合体の担体タンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質［６８］、合成ペプチド［６９、７０］、熱ショックタンパク質［７１、７２］、百日咳タンパク質［７３，７４］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のタンパク質Ｄ［７５］、サイトカイン［７６］、リンホカイン［７６］、連鎖球菌タンパク質、ホルモン［７６］、成長因子［７６］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素ＡまたはＢ［７７］、鉄取り込みタンパク質［７８］などを含む。好ましい担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７ジフテリアトキソイド［７９］である。

本組成物の抗原は、代表的に、少なくとも各々１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般的に、任意の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を引き起こすに十分である。

本発明の免疫原性組成物は、治療用に（すなわち、現存の感染を処置するために）使用され得るか、または予防用に（すなわち、将来の感染を防ぐために）使用され得る。

本発明の免疫原性組成物にタンパク質抗原を使用することの代替として、その抗原をコードする核酸（好ましくは、ＤＮＡ、例えば、プラスミドの形態）が使用され得る。

特に好ましい本発明の組成物は、以下の一つ、二つ、または三つを含有する：（ａ）髄膜炎菌血清群Ｙ由来の糖抗原、髄膜炎菌血清群Ｗ１３５由来の糖抗原、髄膜炎菌血清群Ｃ、および（必要に応じて）髄膜炎菌血清群Ａ由来の糖抗原；（ｂ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ
Ｂ型由来の糖抗原；ならびに／または（ｃ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原。
（髄膜炎菌血清群Ｙ、Ｗ１３５、Ｃおよび（必要に応じて）Ａ）
血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹに対する多糖ワクチンが、長年知られている。これらのワクチン（ＭＥＮＣＥＶＡＸ ＡＣＷＹ^ＴＭおよびＭＥＮＯＭＵＮＥ^ＴＭ）は、生物の莢膜多糖に基づき、これらのワクチンは、青年および成人において有効であるが、生じる免疫応答は乏しく、かつ防御の持続時間は短く、そしてそれらは、乳児において使用することができない。

これらのワクチンにおいて、結合体化されていない多糖抗原とは対照的に、最近認可された血清群Ｃワクチン（Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ^ＴＭ［８０、２８］、Ｍｅｎｉｎｇｉｔｅｃ^ＴＭおよびＮｅｉｓＶａｃ−Ｃ^ＴＭ）は結合体化された糖を含有する。Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ^ＴＭおよびＭｅｎｉｎｇｉｔｅｃ^ＴＭは、ＣＲＭ_１９７担体に結合体化されたオリゴ糖抗原を有し、一方で、ＮｅｉｓＶａｃ−Ｃ^ＴＭは、破傷風トキソイド担体に結合された完全な多糖（脱Ｏ−アセチル化多糖）を使用する。提唱されるＭｅｎＡｃｔｒａ^ＴＭワクチンは、血清群Ｙ、Ｗ１３５、ＣおよびＡの各々に由来する結合体化された莢膜糖抗原を含有する。

本発明の組成物は、好ましくは、一以上の髄膜炎菌血清群Ｙ、髄膜炎菌血清群Ｗ１３５、髄膜炎菌血清群Ｃおよび（必要に応じて）髄膜炎菌血清群Ａ由来の莢膜糖抗原を含有する。ここでこの抗原は担体タンパク質に結合体化されるか、そして／または、オリゴ糖である。例えば、この組成物は、血清群Ｃ；血清群ＡおよびＣ；血清群Ａ、ＣおよびＷ１３５；血清群Ａ、ＣおよびＹ；血清群Ｃ、Ｗ１３５およびＹ；または血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹの４つ全てに由来する莢膜糖抗原を含み得る。

一用量当たりの各髄膜炎菌糖抗原の代表的量は、１μｇと２０μｇの間（例えば、約１μｇ、約２．５μｇ、約４μｇ、約５μｇ、または約１０μｇ（糖として表示））である。

混合物が、血清群Ａおよび血清群Ｃの両方由来の莢膜糖を含む場合、ＭｅｎＡ糖：ＭｅｎＣ糖の比（ｗ／ｗ）は、１より大きくあり得る（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１またはそれ以上）。混合物が、血清群Ｙならびに血清群Ｃおよび血清群Ｗ１３５の一方、あるいは両方に由来する莢膜糖を含む場合、ＭｅｎＹ糖：ＭｅｎＷ１３５糖の比（ｗ／ｗ）は、１より大きくあり得（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１またはそれ以上）、そして／または、ＭｅｎＹ糖：ＭｅｎＣ糖の比（ｗ／ｗ）は、１より小さくあり得る（例えば、１：２、１：３、１：４、１：５またはそれ以下）。血清群Ａ由来の糖：血清群Ｃ由来の糖：血清群Ｗ１３５由来の糖：血清群Ｙ由来の糖についての好ましい比（ｗ／ｗ）は、１：１：１：１；１：１：１：２；２：１：１：１；４：２：１：１；８：４：２：１；４：２：１：２；８：４：１：２；４：２：２：１；２：２：１：１；４：４：２：１；２：２：１：２；４：４：１：２；および２：２：２：１である。血清群Ｃ由来の糖：血清群Ｗ１３５由来の糖：血清群Ｙ由来の糖についての好ましい比（ｗ／ｗ）は、１：１：１；１：１：２；１：１：１；２：１：１；４：２：１；２：１：２；４：１：２；２：２：１；および２：１：１である。実質的に同等の質量の各糖を使用することが好ましい。

莢膜糖は、概して、オリゴ糖形態で使用される。これらは、精製された莢膜多糖のフラグメント化によって（例えば、加水分解によって）、都合よく形成され、その後に、通常、所望のサイズのフラグメントの精製が続く。

多糖のフラグメント化は、好ましくは、オリゴ糖において、３０より小さい（例えば、血清群Ａについて１０と２０の間、好ましくは、約１０；血清群Ｗ１３５および血清群Ｙについて１５と２５の間；好ましくは約１５〜２０；血清群Ｃについて１２と２２の間など）最終的な平均重合度（ＤＰ）を生じさせるように成し遂げられる。ＤＰは、イオン交換クロマトグラフィーによってかまたは比色アッセイによって、都合よく測定され得る［８１］。

加水分解が行われる場合、この加水分解産物は、概して、短い長さのオリゴ糖を除去するために大きさで選別される（ｂｅ ｓｉｚｅｄ）［２９］。これは、種々の方法（限外濾過に続くイオン交換クロマトグラフィーなど）において、成し遂げられ得る。好ましくは、血清群Ａについて、約６以下の重合度を有するオリゴ糖は除去され、そして好ましくは、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙについて、約４より少ない重合度を有するオリゴ糖は除去される。

好ましいＭｅｎＣ糖抗原は、Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ^ＴＭにおいて使用されたように、参考文献８０に開示される。

この糖抗原は、化学的に修飾され得る。これは、特に、血清群Ａの加水分解の減少に有用である［８２；以下を参照のこと］。髄膜炎菌の糖の脱Ｏ−アセチル化が、行われ得る。修飾は、オリゴ糖については、脱重合の前または脱重合の後に起こり得る。

本発明の組成物が、ＭｅｎＡ糖抗原を含有する場合、この抗原は、好ましくは、修飾された糖であって、この修飾された糖はネイティブ糖の一以上のヒドロキシル基が、封鎖（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）基によって置換されている［８２］。この修飾は、加水分解に対する抵抗を改善する。

封鎖基を有する単糖単位の数は、変動し得る。例えば、全単糖単位または実質的な全単糖単位は、封鎖基を有し得る。あるいは、単糖単位のうち少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％は封鎖基を有し得る。少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の単糖単位は、封鎖基を有し得る。

同様に、単糖単位上の封鎖基の数は、変動し得る。例えば、単糖単位上の封鎖基の数は、１または２であり得る。この封鎖基は、概して、単糖単位の４位および／または３位にある。

末端の単糖単位は、天然のヒドロキシル基の代わりに封鎖基を有しても、有さなくてもよい。さらなる反応（例えば、結合体化）のための柄を提供するため、末端の単糖単位上に遊離型アノマーのヒドロキシル基を保持することが好ましい。アノマーのヒドロキシル基は、還元的アミノ化（例えば、ＮａＢＨ_３ＣＮ／ＮＨ_４Ｃｌを使用する）によって、アミノ基（−ＮＨ_２または−ＮＨ−Ｅ、ここでＥは窒素保護基である）に変換され得、次いで、他のヒドロキシル基が封鎖基に変換された後に、アノマーのヒドロキシル基は、再生され得る。

ヒドロキシル基を置換する封鎖基は、ヒドロキシル基の誘導体化反応を介して（すなわち、ヒドロキシル基の水素原子を別の基に置換することによって）、直接接触可能であり得る。封鎖基として働くヒドロキシル基の適切な誘導体は、例えば、カルバメート、スルホネート、カルボネート、エステル、エーテル（例えば、シリルエーテルまたはアルキルエーテル）、およびアセタールである。このような封鎖基のいくつかの特定の例は、アリル、Ａｌｏｃ、ベンジル、ＢＯＭ、ｔ−ブチル、トリチル、ＴＢＳ、ＴＢＤＰＳ、ＴＥＳ、ＴＭＳ、ＴＩＰＳ、ＰＭＢ、ＭＥＭ、ＭＯＭ、ＭＴＭ、ＴＨＰなどである。直接接触可能でなく、かつ完全にヒドロキシル基を置換する他の封鎖基としては、Ｃ_１−１２アルキル、Ｃ_３−１２アルキル、Ｃ_５−１２アリール、Ｃ_５−１２アリール−Ｃ_１−６アルキル、ＮＲ^１Ｒ^２（Ｒ^１およびＲ^２は以下の段落で規定される）、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ_２Ｈ、ＣＯ_２（Ｃ_１−６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ_３、ＣＣｌ_３などが挙げられる。好ましい封鎖基は電子求引性基である。

好ましい封鎖基は、式：−Ｏ−Ｘ−Ｙまたは−ＯＲ^３のものであって、ここで：ＸはＣ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）、またはＳＯ_２であり；ＹはＣ_１−１２アルキル、Ｃ_１−１２アルコキシ、Ｃ_３−１２シクロアルキル、Ｃ_５−１２アリール、またはＣ_５−１２アリール−Ｃ_１−６アルキルであり、これらの各々は、必要に応じて、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ_２Ｈ、ＣＯ_２（Ｃ_１−６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ_３、またはＣＣｌ_３から独立的に選択される１つ、２つ、または３つの基で置換され得るか；あるいは、ＹはＮＲ^１Ｒ^２であり；Ｒ^１およびＲ^２は、Ｈ、Ｃ_１−１２アルキル、Ｃ_３−１２シクロアルキル、Ｃ_５−１２アリール、Ｃ_５−１２アリール−Ｃ_１−６アルキルから独立的に選択されるか；あるいはＲ^１およびＲ^２は結合され、Ｃ_３−１２飽和複素環式基を形成し得；Ｒ^３はＣ_１−１２アルキルまたはＣ_３−１２シクロアルキルであり、これらのそれぞれは、必要に応じて、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ_２（Ｃ_１−６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ_３、またはＣＣｌ_３から独立的に選択される１つ、２つ、または３つの基で置換され得るか；あるいはＲ^３は、Ｃ_５−１２アリールまたはＣ_５−１２アリール−Ｃ_１−６アルキルであり、これらのそれぞれが、必要に応じて、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ_２Ｈ、ＣＯ_２（Ｃ_１−６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ_３またはＣＣｌ_３から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの基で置換され得る。Ｒ^３がＣ_１−１２アルキルまたはＣ_３−１２シクロアルキルである場合、それは代表的に、上記で規定されるような１つ、２つ、または３つの基で置換される。Ｒ^１およびＲ^２が結合され、Ｃ_３−１２飽和複素環式基を形成する場合、それは、窒素原子とともに、Ｒ^１およびＲ^２が、３と１２の間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０、Ｃ_１１、Ｃ_１２）を含む飽和複素環式基を形成することを意味する。この複素環式基は、上記窒素原子以外の１つまたは２つのヘテロ原子（Ｎ、Ｏ、またはＳなど）を含み得る。Ｃ_３−１２飽和複素環式基の例は、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、イミダゾリジニル、アゼチジニル、およびアジリジニルである。

封鎖基−Ｏ−Ｘ−Ｙおよび−ＯＲ^３は、標準的な誘導体化手順（ハロゲン化アシル、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化スルホニルなどとのヒドロキシル基の反応など）によって、−ＯＨ基から調製され得る。従って、−Ｏ−Ｘ−Ｙにおける酸素原子は、好ましくは、ヒドロキシル基の酸素原子であり、一方、−Ｏ−Ｘ−Ｙにおける−Ｘ−Ｙ基は、好ましくは、ヒドロキシル基の水素原子を置換する。

あるいは、この封鎖基は、置換反応（ミツノブ（Ｍｉｔｓｏｎｏｂｕ）型置換など）を介して、接触可能であり得る。ヒドロキシル基から封鎖基を調製する、これらの方法および他の方法は周知である。

より好ましくは、封鎖基は、−ＯＣ（Ｏ）ＣＦ_３［８３］、またはカルバメート基−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ^１Ｒ^２であって、ここでＲ^１およびＲ^２は、Ｃ_１−６アルキルから独立に選択される。より好ましくは、Ｒ^１およびＲ^２は両方ともメチルである（すなわち、封鎖基は−ＯＣ（Ｏ）ＮＭｅ_２である）。カルバメート封鎖基は、グリコシド結合に対して安定化効果を有し、穏やかな条件下で調製され得る。

好ましい、修飾されるＭｅｎＡ糖は、ｎ個の単糖単位を含み、単糖単位のうちの少なくともｈ％は３位および４位の両方に−ＯＨ基を有さない。ｈの値は２４以上（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９、または１００）であり、好ましくは、５０以上である。−ＯＨ基の非存在は、好ましくは、上記で規定されるような封鎖基である。

他の好ましい修飾されるＭｅｎＡ糖は、単糖単位を含むのであって、ここで単糖単位のうちの少なくともｓは、３位に−ＯＨを有さず、そして４位にも−ＯＨを有さない。ｓの値は、少なくとも１（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０）である。−ＯＨ基の非存在は、好ましくは、上記で規定されるように、封鎖基である。

本発明の使用に適した修飾されるＭｅｎＡ糖は、以下の式を有する：

ｎは１〜１００の整数（好ましくは、１５〜２５の整数）であり；
Ｔは式（Ａ）または式（Ｂ）であって：

ここで各Ｚ基は、独立して、上記で規定されるようなＯＨまたは封鎖基から選択され；そして、
各Ｑ基は、独立して、上記で規定されるようなＯＨまたは封鎖基から選択され；
Ｙは、ＯＨまたは上記で規定されるような封鎖基から選択され；
Ｅは、Ｈまたは窒素保護基であり；
ここでＱ基のうち約７％より多く（例えば、８％、９％、１０％以上）は封鎖基である。

ｎ＋２個のＺ基の各々は、相互に同一または異なり得る。同様に、ｎ＋２個のＱ基の各々は、相互に同一または異なり得る。全てのＺ基はＯＨであり得る。あるいは、Ｚ基のうち少なくとも、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または６０％はＯＡｃであり得る。好ましくは、Ｚ基の約７０％はＯＡｃであり、Ｚ基の残部は上記で規定されるようなＯＨまたは封鎖基である。Ｑ基のうち少なくとも約７％は封鎖基である。好ましくは、Ｑ基のうち、少なくとも、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％でさえ、封鎖基である。

髄膜炎菌の莢膜多糖は、代表的に、（例えば、陽イオン性界面活性剤を用いた）多糖沈殿、エタノール分画、（タンパク除去のための）冷フェノール抽出、および（ＬＰＳ除去のための）超遠心の工程を包含するプロセスによって調製される［例えば、参考文献８４］。しかしながら、より好ましいプロセス［３０］は、多糖沈殿後に続く低級アルコールを用いる沈殿した多糖の可溶化を包含する。沈殿は、テトラブチルアンモニウム塩およびセチルトリメチルアンモニウム塩（例えば、臭化塩）、または臭化ヘキサジメチリン塩およびミリスチルトリメチルアンモニウム塩のような陽イオン性界面活性剤を使用して成し遂げられ得る。臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）は特に好ましい［８５］。沈殿した物質の可溶化は、低級アルコール（メタノール、プロパン−１−オール、プロパン−２−オール、ブタン−１−オール、ブタン−２−オール、２−メチル−プロパン−１−オール、２−メチル−プロパン−２−オール、ジオールなど）の使用により成し遂げられ得るが、しかし、エタノールは、ＣＴＡＢ−多糖複合体の可溶化に特に適している。エタノールは、好ましくは、５０％と９５％との間の終濃度（エタノールおよび水の全体量をベースとして）を与えるように、沈殿した多糖に加えられる。

再可溶化後、この多糖は、夾雑物を除去するためにさらに処理され得る。これは、微量な夾雑物ですら、許容されない状況（例えば、ヒトワクチン作製のため）において、特に重要である。これは、代表的に、濾過（例えば、デプス濾過、活性炭を通じた濾過、サイズ濾過および／または限外濾過）の一以上の工程を包含する。一旦夾雑物を除去するために濾過されると、多糖は、さらなる処理、および／またはプロセスのために沈殿され得る。これは、好都合なことに、陽イオン交換（例えば、カルシウム塩またはナトリウム塩の添加）によって成し遂げられ得る。

精製に代わる手段として、本発明の莢膜糖は、全合成または部分合成によって得られ得る（例えば、Ｈｉｂ合成は参考文献８６において開示され、ＭｅｎＡ合成は参考文献８７において開示される）。

本発明の組成物は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも二つの血清群由来の莢膜糖を含有する。糖は、好ましくは、（任意の断片化、結合体化、修飾などを含めて）別々に調製され、次いで本発明の組成物を生じさせるために混合される。

しかしながら、この組成物が、血清群Ａ由来の莢膜糖を含有する場合、加水分解の可能性を最小限に抑えるために、血清群Ａの糖は、使用直前まで、この他の糖に混合されないことが好ましい。これは、好都合なことに、血清群Ａ成分（代表的には適切な賦形剤とともに）を凍結乾燥形態にさせ、そして他の血清群成分（これもまた適切な賦形剤とともに）を液体形態にさせ、使用準備が整った場合、この液体成分を使用して、この凍結乾燥ＭｅｎＡ成分を再構成することによって、成し遂げられ得る。アルミニウム塩アジュバントが使用される場合、液体ワクチンを含むバイアル内にアジュバントを含むこと、およびＭｅｎＡ成分をアジュバントなしで凍結乾燥させることが好ましい。

従って、本発明の組成物は、以下のものを含むキットから調製され得る：（ａ）凍結乾燥形態の、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ由来の莢膜糖；および（ｂ）液体形態の、この組成物由来のさらなる抗原。本発明はまた、本発明の組成物を調製する方法を提供し、この方法は凍結乾燥されたＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ由来の莢膜糖をさらなる抗原と混合する工程を含み、ここで上記のさらなる抗原は液体形態である。

本発明はまた、以下を含めるキットを提供する：（ａ）全ての凍結乾燥形態の、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｃ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｗ１３５、およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｙ由来の莢膜糖のうちの２以上を含む、第一の容器；ならびに（ｂ）液体形態の以下を含む、第二の容器：（ｉ）被験体に投与後、被験体内で抗体応答を誘導し得る組成物であって、この抗体応答は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂの超病原性系統Ａ４、ＥＴ−５および系統３のうちの２以上（例えば２または３）に対して殺菌性である、組成物、（ｉｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｃ、Ｗ１３５およびＹに由来しないか、またはこれらのうちの一つ由来の莢膜糖、ならびに必要に応じて（ｉｉｉ）髄膜炎菌の莢膜糖を含まないさらなる抗原（以下を参照のこと）。ここで容器（ｂ）の内容物による容器（ａ）の内容物の再構築は、本発明の組成物を提供する。

各用量内で、個々の糖抗原の量は、概して、（糖の質量として測定して）１〜５０μｇの間になり、約２．５μｇ、５μｇまたは１０μｇの各抗原の量が好ましい。従って、１：１：１：１；１：１：１：２；２：１：１：１；４：２：１：１；８：４：２：１；４：２：１：２；８：４：１：２；４：２：２：１；２：２：１：１；４：４：２：１；２：２：１：２；４：４：１：２；および２：２：２：１であるＡ：Ｃ：Ｗ１３５：Ｙの重量比で、数１によって表される量は、好ましくは、約２．５μｇ、５μｇまたは１０μｇである。従って、１：１：１：１比のＡ：Ｃ：Ｗ：Ｙの組成物および一つの糖当たり１０μｇについては、４０μｇの糖が、一用量当たり投与される。好ましい組成物は、一用量当たり、およそ、以下のμｇの糖を有する。

好ましい本発明の組成物は、一用量当たり、５０μｇ未満の髄膜炎菌の糖を含有する。他の好ましい組成物は、一用量当たり≦４０μｇの髄膜炎菌の糖を含有する。他の好ましい組成物は、一用量当たり≦３０μｇの髄膜炎菌の糖を含有する。他の好ましい組成物は、一用量当たり≦２５μｇの髄膜炎菌の糖を含有する。他の好ましい組成物は、一用量当たり≦２０μｇの髄膜炎菌の糖を含有する。他の好ましい組成物は、一用量当たり≦１０μｇの髄膜炎菌の糖を含有するが、しかし、理想的には、本発明の組成物は、一用量当たり少なくとも１０μｇの髄膜炎菌の糖を含有する。

Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ^ＴＭおよびＮｅｉｓＶａｃ^ＴＭのＭｅｎＣ結合体は、水酸化物アジュバントを使用し、一方Ｍｅｎｉｎｇｉｔｅｃ^ＴＭはリン酸塩を使用する。本発明の組成物において、水酸化アルミニウムにいくつかの抗原を吸着させることが可能性であるが、リン酸化アルミニウムに会合する他の抗原を有することも可能性である。例えば、四価の血清群の組み合わせについては、以下の順列が利用可能である。

四価のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群の組み合わせについては、以下の順列が利用可能である。

（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型）
この組成物が、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型抗原を含有する場合、それは、代表的に、Ｈｉｂ莢膜糖抗原である。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ由来の糖抗原は周知である。

有利には、Ｈｉｂ糖は、とりわけ子供においてその免疫原性を増強するため、担体タンパク質に共有結合される。概して、多糖結合体の調製、および特にＨｉｂ莢膜多糖の調製は、よく実証されている［例えば、参考文献８８〜９６など］。本発明は、任意の適切なＨｉｂ結合体を使用し得る。適切な担体タンパク質は、以下に記載され、Ｈｉｂ糖にとっての好ましい担体はＣＲＭ_１９７（「ＨｂＯＣ」）、破傷風トキソイド（「ＰＲＰ−Ｔ」）およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜複合体（「ＰＲＰ−ＯＭＰ」）である。

この結合体の糖部分は多糖であり得る（例えば、全長ポリリボシルリビトールホスフェート（ＰＲＰ））。しかしオリゴ糖（例えば、分子量約１〜約５ｋＤａ）を形成するために多糖を加水分解することが好ましい。

好ましい結合体は、アジピン酸リンカーを介してＣＲＭ_１９７に共有結合したＨｉｂオリゴ糖を含む［９７、９８］。破傷風トキソイドもまた、好ましい担体である。

本発明の組成物は、１種類より多くのＨｉｂ抗原を含み得る。

組成物が、Ｈｉｂ糖抗原を含有する場合、この組成物は水酸化アルミニウムアジュバントも含有しないことが好ましい。この組成物が、リン酸アルミニウムアジュバントを含有する場合、Ｈｉｂ抗原はアジュバントに吸着され得るか［９９］、またはＨｉｂ抗原は吸着されなくてもよい［１００］。

Ｈｉｂ抗原は、（例えば、髄膜炎菌抗原とともに）凍結乾燥され得る。

（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）
この組成物が、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原を含有する場合、これは、代表的に、好ましくは、担体タンパク質に結合体化される莢膜糖抗原である［例えば、参考文献３１〜３３］。一より多くのＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清型由来の糖を含有することが好ましい。例えば、２３の異なる血清型由来の多糖混合物は広く使用される（５と１１との間の異なる血清群由来の多糖との結合体化ワクチン［１０１］のように）。例えば、ＰｒｅｖＮａｒ^ＴＭ［１０２］は、各糖が還元的アミノ化によりＣＲＭ_１９７に個々に結合体化される状態で、各糖が０．５ｍｌの用量当たり２μｇ（血清型６Ｂは４μｇ）で、かつ、結合体がリン酸アルミニウムアジュバントに吸着された状態で、７つの血清型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ）由来の抗原を含む。本発明の組成物は、好ましくは、少なくとも血清型６Ｂ、１４、１９Ｆおよび２３Ｆを含有する。結合体は、リン酸アルミニウム上に吸着され得る。

肺炎球菌由来の糖抗原の使用に代わる手段として、この組成物は、一以上のポリペプチド抗原を含有し得る。肺炎球菌のいくつかの株のゲノム配列は入手可能であり［１０３、１０４］、ワクチン学を覆す対象であり得［１０６〜１０８］、適したポリペプチド抗原を同定し得る［１０９、１１０］。例えば、この組成物は、以下の抗原のうち一以上を含有し得る：参考文献１１１で規定されるような、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、およびＳｐ１３０。

いくつかの実施形態において、この組成物は、肺炎球菌由来の糖抗原およびポリペプチド抗原の両方を含有し得る。これらは、単純な混合で使用され得るか、または肺炎球菌の糖抗原は、肺炎球菌のタンパク質に結合体化され得る。このような実施形態にとって適した担体タンパク質には、前の段落において収載される抗原が挙げられる［１１１］。

肺炎球菌抗原は（例えば、肺炎球菌抗原および／またはＨｉｂ抗原とともに）凍結乾燥され得る。

（共有結合性結合体化）
本発明の組成物における莢膜糖は、通常、担体タンパク質に結合される。一般に、結合体化は、糖をＴ細胞非依存性抗原からＴ細胞依存性抗原へ転換し、よって、免疫学的記憶の初回刺激を可能とすることから、糖の免疫原性を増強する。結合体化は、小児科ワクチンにとって特に有用であり、周知の技術である［例えば、参考文献１１２および８８〜９６で概説される］。

好ましい担体タンパク質は、細菌性毒素または細菌性トキソイド（ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイド）である。ＣＲＭ_１９７変異体ジフテリアトキソイド［７９、１１３、１１４］は特に好ましい。他の適した担体タンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質［６８］、合成ペプチド［６９、７０］、熱ショックタンパク質［７１、７２］、百日咳タンパク質［７３、７４］、サイトカイン［７６］、リンホカイン［７６］、ホルモン［７６］、増殖因子［７６］、種々の病原体由来抗原由来の複数のヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［１１５］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のプロテインＤ［７５、１１６］、肺炎球菌の表面タンパク質ＰｓｐＡ［１１７］、鉄取り込みタンパク質［７８］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａ、または毒素Ｂ［７７］などが挙げられる。好ましい担体は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅプロテインＤ、およびＣＲＭ_１９７である。

本発明の組成物内で、（例えば、担体抑制の危険を減少させるため）一より多くの担体タンパク質を使用することが可能である。従って、異なる担体タンパク質は、異なる血清群に使用され得る（例えば、血清群Ａの糖はＣＲＭ_１９７に結合体化され得、一方で血清群Ｃの糖は破傷風トキソイドに結合体化され得る）。特定の糖抗原に一より多くの担体タンパク質を使用することもまた可能である（例えば、血清群Ａの糖は、いくつかの糖がＣＲＭ_１９７に結合体化され、他の糖が破傷風トキソイドに結合体化された、二つの群であり得る）。しかしながら、概して、同一の担体タンパク質を全ての糖に使用することが好ましい。

単一担体タンパク質は一より多くの糖抗原を保有し得る［１１８］。例えば、単一担体タンパク質は、その担体タンパク質に結合された血清群Ａおよび血清群Ｃ由来の糖を有し得る。この目的を成し遂げるため、糖は結合体化反応の前に混合され得る。しかしながら、概して、各血清群のための別個の結合体を有することが好ましい。

１：５（すなわち、過剰のタンパク質）と５：１（すなわち、過剰の糖）との間の糖：タンパク質の比（ｗ／ｗ）を有する結合体が好ましい。１：２と５：１との間の比が好ましく、１：１．２５と１：２．５との間の比はより好ましい。過剰の担体タンパク質は、ＭｅｎＡおよびＭｅｎＣについて好ましくあり得る。

結合体は、遊離の担体タンパク質との結合体化において使用され得る［１１９］。ある担体タンパク質が、本発明の組成物中に遊離型形態および結合体化形態の両方で存在する場合、非結合体化形態は、好ましくは、全体として、その組成物中の担体タンパク質の総量の５％以下であり、より好ましくは、２重量％未満である。

任意の適した結合体化反応は、必要な場合、任意の適したリンカーとともに使用され得る。

糖は、典型的に、結合体化の前に活性化されるか、または官能化される。例えば、活性化は、ＣＤＡＰ（例えば、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジウムテトラフルオロボレート［１２０、１２１など］）のようなシアン化試薬を含む。他の適した技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを使用する；参考文献９４への序論をまた参照のこと）。

リンカー基を介した連結は、任意の公知の手順（例えば、参考文献１２２および１２３に記載された手順）を利用して作られ得る。一つの型の連結は、多糖の還元的アミノ化、結果として生じるアミノ基と、アジピン酸リンカー基の一端とのカップリング、およびその後の、アジピン酸リンカー基の他の一端へのタンパク質のカップリングを含む［９２、１２４、１２５］。他のリンカーは、Ｂ−プロピオンアミド［１２６］、ニトロフェニル−エチルアミン［１２７］、ハロゲン化ハロアシル［１２８］、グリコシド結合［１２９］、６−アミノカプロン酸［１３０］、ＡＤＨ［１３１］、Ｃ_４〜Ｃ_１２部分［１３２］などを含む。リンカーの使用に代わる手段として、直接的結合が使用され得る。そのタンパク質への直接的結合は、例えば、参考文献１３３および参考文献１３４に記載されるような多糖の酸化とその後のタンパク質との還元的アミノ化を含み得る。

糖へのアミノ基の導入（例えば、末端＝Ｏ基の−ＮＨ_２との交換による導入）およびその後のアジピン酸ジエステル（例えば、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステル）での誘導体化、ならびに担体タンパク質との反応を包含するプロセスは、好ましい。別の好ましい反応は、プロテインＤ担体（例えば、ＭｅｎＡまたはＭｅｎＣのための担体）でのＣＤＡＰ活性化を使用する。

結合体化後、遊離型糖および結合体化糖は、分離され得る。疎水性クロマトグラフィー、接線限外濾過、ダイアフィルトレーションなどを包含する多くの適切な方法がある［参考文献１３５および１３６などをまた参照のこと］。

本発明の組成物が結合体化されたオリゴ糖を含有する場合、オリゴ糖の調製は結合体化に先行することが好ましい。

（外膜ベシクル）
好ましくは、本発明に係る組成物は、ＯＭＶの典型的な特徴である、複合体のまたは未定義の抗原混合物を含むべきでない。しかし、本発明をＯＭＶに適用し得る１つの方法は、ＯＭＶを、複数回投与スケジュールにおいて投与するものである。

ＯＭＶを１用量以上投与しようとする場合、各用量に、上で定義したとおりの第１のタンパク質、第２のタンパク質、または第３のタンパク質の１つを（精製したタンパク質を付加するか、または、ＯＭＶが由来する細菌の中でタンパク質を発現させて）補充することができる。好ましくは、さまざまなＮＭＢ１８７０改変体によって、さまざまな用量に補充される。例えば、３回のＯＭＶ投与スケジュールにおいて、各用量は、第１のタンパク質、第２のタンパク質、または第３のタンパク質のうちの異なったものを１つ含むことができ、ＯＭＶを３用量服用すれば、３種類の改変体をすべて服用している。２回のＯＭＶ投与スケジュールにおいて、各ＯＭＶ用量に対して１つの改変体を使用する（したがって、１つの改変体を除く）ことができ、また３種類の改変体をすべてカバーするために、ＯＭＶの１用量または両方の用量に１種類以上の改変体を補充することができる。好適な実施態様において、３用量のＯＭＶがある（３つのＯＭＶ用量のそれぞれが、３種類の異なった遺伝子操作されたベシクル集団を含み、この集団のそれぞれが、３種類のサブタイプを提示し、したがって全部で９種類の異なったサブタイプをもたらす）。

この方法は、一般的に、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂのマイクロベシクル［１３７］、「天然型ＯＭＶ」［１３８］、小胞（ｂｌｅｂｓ）または外膜ベシクル［例えば参考文献１３９から１４４など参照］の調製法を改良するために用いることができる。これらは、例えば、免疫原性を高める（例えば過発現（ｈｙｐｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓ）免疫原）、毒性を低下させる、莢膜多糖の合成を阻害する、ＰｏｒＡ発現を下方制御するなどのために遺伝子操作した細菌から調製することができる。それらは、過剰に小胞形成する（ｈｙｐｅｒｂｌｅｂｂｉｎｇ）菌株から調製することも可能である［１４９〜１５２］。非病原性ナイセリア由来のベシクルも含まれ得る［１５３］。ＯＭＶは、界面活性剤を使用しないでも調製することができる［１５４、１５５］。それらは、表面に非ナイセリアタンパク質を発現することも可能である［１５６］。それらは、ＬＰＳが除去されていてもよい。それらは、組換え抗原と混合することもできる［１３９、１５７］。さまざまなクラスＩ外膜タンパク質サブタイプをもつ細菌からのベシクル、例えば、それぞれが３種類のサブタイプを示す２つの異なった遺伝子工学的に改造されたベシクル集団を用いた６種類の異なったサブタイプ、または、それぞれが３種類のサブタイプを示す３つの異なった遺伝子工学的に改造されたベシクル集団を用いた９種類の異なったサブタイプなどを用いることができる。有用なサブタイプとしては、Ｐ１．７，１６；Ｐ１．５−１，２−２；Ｐ１．１９，１５−１；Ｐ１．５−２，１０；Ｐ１．１２−１，１３；Ｐ１．７−２，４；Ｐ１．２２，１４；Ｐｌ．７−１，１；Ｐ１．１８−１，３，６が挙げられる。

当然ながら、２種類または３種類の異なった改変体をベシクル調製物に補充することも可能である。

（免疫化）
本発明に係る組成物は、好ましくは免疫原性組成物であり、本発明は、薬物として使用するために本発明の免疫原性組成物を提供する。

また、本発明は、哺乳動物において抗体応答を惹起する方法であって、本発明に係る免疫原性組成物を哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。好ましくは、抗体応答は防御および／または殺菌抗体応答である。
本発明は、ナイセリア属（例えば髄膜炎菌）による感染から哺乳動物を防御するための方法であって、本発明に係る免疫原性組成物を哺乳動物に投与することを含む方法も提供する。

また、本発明は、哺乳動物においてナイセリア属（例えば髄膜炎菌）による感染を予防するための薬物を製造における、上で定義されている抗原（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の少なくとも２つの使用を提供する。

哺乳動物は、好ましくはヒトである。ヒトは成人でもよく、または、好ましくは子供でもよい。

本発明に係る免疫原性組成物は治療に（すなわち、既存の感染症を処置するために）、または予防的に（すなわち、将来の感染を防ぐために）用いることができる。

これらの使用および方法は、髄膜炎（特に細菌性髄膜炎）および菌血症を含む（これらに限定されない）病気を予防／処置するのに特に有用である。

治療的処置の有効性は、本発明に係る組成物を投与した後のナイセリア感染を監視することによって試験することができる。予防的処置の有効性は、組成物を投与した後のＮＭＢ１８７０に対する免疫応答をモニターして試験することができる。本発明に係る組成物の免疫原性は、それらを被験体（例えば１２〜１６ヶ月齢の子供、または動物モデル［１６０］）に投与してから、血清中の殺菌性抗体（ＳＢＡ）ならびに全抗莢膜ＩｇＧおよび高アビディティ抗莢膜ＩｇＧのＥＬＩＳＡ力価（ＧＭＴ）など、標準的なパラメーターを測定して決定することができる。これらの免疫応答は、組成物を投与してからほぼ４週間後に決定することができ、組成物を投与する前に測定された値と比較される。少なくとも４倍または８倍のＳＢＡ増加が好適である。１用量以上の組成物が投与される場合には、投与後測定が２回以上行うことができる。

好適な本発明に係る組成物は、患者において、ヒト被験体の許容できる割合についての各抗原成分に対する血清防御（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）に関する基準よりも高い抗体力価を付与することができる。その抗原に対して宿主がセロコンバージョンを起こすと考えられているよりも高い関連抗体力価をもつ抗原は周知であり、そのような力価は、ＷＨＯなどの機関によって公表されている。統計的に有意な被験体のサンプルの好ましくは８０％よりも多くがセロコンバージョンを起こし、より好ましくは９０％よりも多くが、さらにより好ましくは９３％よりも多くが、もっとも好ましくは９６〜１００％がセロコンバージョンを起こす。

本発明の組成物は、通常、直接患者に投与される。直接的な送達は、非経口注射（例えば皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、または組織の間質腔への注射）によって、または、直腸、口、膣、局所、経皮、鼻腔内、眼、耳、肺もしくはその他の粘膜への投与によって行うことができる。筋肉内投与は、大腿部または上腕部へが好ましい。注射は、針（例えば皮下注射用の針）によることもできるが、その代わりに針なしの注射を用いることができる。典型的な筋肉内用量は０．５ｍｌである。

本発明を用いて、全身および／または粘膜の免疫を誘導することも可能である。

投薬治療は、単回投与スケジュールでも複数回投与スケジュールでも可能である。複数回投与を初回免疫スケジュールおよび／または追加免疫スケジュールで用いることも可能である。初回免疫投与スケジュールの後、追加免疫投与スケジュールを行うことができる。初回投与間の適当な時間間隔（４〜１６週間）、および初回および追加免疫の間の時間間隔は慣習的に決めることができる。

本発明に係る免疫原性組成物は、通常、医薬上許容され得る担体を含むが、この担体は、それ自体は組成物を投与される患者に対して有害な抗体の産生を引き起こすことのない、任意の物質であって、過度の毒性なしに投与することができる。適当な担体は、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性化ウイルス粒子など、大型でゆっくりと代謝される高分子でもよい。このような担体は、当業者に周知である。医薬上許容され得る担体は、水、食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体を含み得る。湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質も、そのようなビヒクル中に存在させることができる。リポソームは適切な担体である。医薬上許容の担体の詳細な考察は、参考文献１６１で得られる。

ナイセリア感染症は、身体のさまざまな領域に影響を与えるため、本発明に係る組成物は、さまざまな形態で調製することができる。例えば、組成物は、溶液または懸濁液いずれかの注射液として調製することができる。注射前に溶液にしたり、懸濁液にしたり、液状ビヒクルにするのに適した固体も調製することもできる。組成物は、例えば軟膏、クリームまたは粉剤として局所投与するために調製することもできる。組成物は、例えば錠剤もしくはカプセルとして、またはシロップ（必要に応じて風味付けしたもの）として経口投与するために調製することができる。組成物は、例えば吸入器として、微粉末またはスプレーを用いて肺に投与するために調製することができる。組成物は、坐剤または膣坐薬として調製することができる。組成物は、例えば点薬として鼻、耳または眼に投与するために調製することができる。

好ましくは、組成物は滅菌されている。発熱物質を含まないものが好適である。好ましくは、例えばｐＨ６とｐＨ８との間、通常は約ｐＨ７に緩衝されている。組成物が、水酸化アルミニウム塩を含む場合、ヒスチジンバッファーを使用するのが好適である［１６２］。本発明に係る組成物は、ヒトに関して等張である。

免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の免疫原、および、必要ならば、別の特定な成分のいずれかを含む。「免疫学的に有効な量」とは、その量を一回量として、または連続投与の一部として個体に投与したときに、処置または予防に効果があることを意味する。この量は、処置を受ける個体の健康および身体の状態、年齢、処置を受ける個体の分類群（例えば非ヒト霊長類、霊長類など）、抗体産生する個体の免疫系の能力、所望の防御程度、ワクチンの処方、医学的状況に関する処置医の評価、およびその他の関連要素によって変動する。この量は、日常的な試験によって決定することができる比較的広い範囲に含まれると期待される。投薬処置は、単回投与スケジュールでも、複数回投与スケジュール（例えば追加投与を含む）でもよい。組成物は、別の免疫調節剤とともに投与することができる。

一般的に、免疫原性組成物はアジュバントを含む。組成物の効果を高めるのに好適なアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（Ａ）ＭＦ５９（マイクロフルイダイザーを用いてミクロン未満の粒子に製剤された５％スクアレン、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ８０および０．５％ Ｓｐａｎ ８５）［参考文献１６３の第１０章参照、また、参考文献１６４参照］；（Ｂ）生物分解性および非毒性の材料（例えばポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成された微粒子（すなわち、直径約１００ｎｍから約１５０μｍ、より好ましくは直径約２００ｎｍから約３０μｍ、もっとも好ましくは直径約５００ｎｍから約１０μｍの粒子）（ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）であること（「ＰＬＧ」）が好適で、必要に応じて（例えば、ＳＤＳ（負荷電）またはＣＴＡＢ（正荷電）などの陽イオン性、陰イオン性、または非イオン性界面活性剤を加えることによって）荷電表面を有する）［例えば、参考文献１６５および１６６］；（Ｃ）リポソーム［参考文献１６３の第１３および１４章参照］；（Ｄ）付加的な界面活性剤を欠くＩＳＣＯＭ［参考文献１６３の第２３章参照］［１６７］；（Ｅ）１０％スクアレン、０．４％ Ｔｗｅｅｎ ８０、５％プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含むＳＡＦであって、微粒子流動（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｄ）させてミクロン未満の乳濁液となっているか、より大きな粒子サイズの乳濁液を生成するために撹拌したもの［参考文献１６３の第１２章参照］；（Ｆ）２％スクアレン、０．２％ Ｔｗｅｅｎ ８０、およびモノホスホリリピドＡ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ Ａ）（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群由来の１種類以上の細菌細胞壁成分、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ^ＴＭ）を含むＲｉｂｉ^ＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；（Ｇ）Ｓｔｉｍｕｌｏｎｔ^ＴＭとしても知られている、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１などのサポニンアジュバント［参考文献１６３の第２２章参照］；（Ｈ）キトサン［例えば１６８］；（Ｉ）完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）およびフロインド不完全アジュバント（ＩＦＡ）；（Ｊ）インターロイキン（例えば１Ｌ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２）、インターフェロン（例えばインターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子などのサイトカイン［参考文献１６３の第２７および２８章参照］、ＲＣ５２９；（Ｋ）サポニン（例えばＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）［１６９］；（Ｌ）モノホスホリリピドＡ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ Ａ）（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）［例えば参考文献１６３の第２１章参照］；（Ｍ）３ｄＭＰＬと、例えばＱＳ２１および／または水中油乳液を併用したもの［１７０］；（Ｎ）必要に応じてシトシンの代わりに５−メチルシトシンが用いられる、ＣｐＧモチーフを含む（すなわち、少なくとも１個のＣＧジヌクレオチドを含む）、オリゴヌクレオチド［１７１］；（Ｏ）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル［１７２］；（Ｐ）オクトキシノールと併用されるポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤［１７３］、あるいはオクトキシノールなどのさらなる非イオン性界面活性剤の少なくとも１種類と併用されたポリオキシエチレンアルキルエーテルもしくはエステルの界面活性剤［１７４］；（Ｑ）免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えばＣｐＧオリゴヌクレオチド）およびサポニン［１７５］；（Ｒ）免疫刺激剤および金属塩粒子［１７６］；（Ｓ）サポニンおよび水中油乳濁液［１７７］；（Ｔ）大腸菌の非耐熱性エンテロトキシン（「ＬＴ」）、またはその無毒化変異体（Ｋ６３またはＲ７２変異体など）［例えば、参考文献３８の第５章］；（Ｕ）コレラ毒素（「ＣＴ」）またはその無毒化変異体［例えば、参考文献３８の第５章］；（Ｖ）二本鎖ＲＮＡ；（Ｗ）水酸化アルミニウム（オキシ水酸化物を含む）、リン酸アルミニウム（ヒドロキシリン酸を含む）、硫酸アルミニウムなどのアルミニウム塩［例えば参考文献１６３の第８および９章参照］、または、リン酸カルシウムなどのカルシウム塩；ならびに（Ｘ）免疫刺激剤として作用して、組成物の有効性を高めるその他の物質［例え、参考文献１６３の第７章参照］。アルミニウム塩（リン酸アルミニウムおよび特にヒドロキシリン酸アルミニウム、ならびに／または水酸化アルミニウムおよび特にはオキシ水酸化アルミニウム）およびＭＦ５９が非経口免疫にとって好適なアジュバントである。毒素の変異体は好適な粘膜アジュバントである。ＱＳ２１は、ＮＭＢ１８７０にとってもう一つの有用なアジュバントであって、単独または（Ａ）から（Ｘ）までのいずれか、例えばアルミニウム塩と併用して使用することができる。

ムラミールペプチドには、Ｎ−アセチル−ムラミール−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミール−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミール−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２ ’−ジパルミトイル−ｓｎ−グルセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられる。

（タンパク質発現）
細菌の発現技術は当技術分野において公知である。細菌のプロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼに結合して、コード配列（例えば構造遺伝子）をｍＲＮＡへと下流（３’）方向に転写開始させることができる任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、コード配列の５’末端付近に通常存在する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。また、細菌のプロモーターは、オペレーターと呼ばれ、隣接するＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複することもあり、そこからＲＮＡ合成が開始する第２のドメインを有することもある。オペレーターは、遺伝子リプレッサータンパク質がオペレーターに結合して特定の遺伝子の転写を阻害するため、負に制御された（誘導型）転写を可能にする。オペレーターなどの負の調節エレメントがないときには構成的発現が生じ得る。さらに、あるとすれば、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列の近傍（５’）にある遺伝子活性化因子タンパク質結合配列によって正の調節が達成され得る。遺伝子活性化因子タンパク質の例は、カタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）であり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてｌａｃオペロンの転写開始を助ける［Ｒａｉｂａｕｄら、（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：１７３］。したがって、制御された発現は正または負のいずれかであり、それによって転写が促進されるか抑制される。

代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）［Ｃｈａｎｇら、（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ １９８：１０５６］、およびマルトースなどの糖代謝酵素に由来するプロモーター配列などがある。別の例には、トリプトファン（ｔｒｐ）などの生合成酵素に由来するプロモーター配列が含まれる［Ｇｏｅｄｄｅｌら、（１９８０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら、（１９８１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；ＥＰ−Ａ−００３６７７６およびＥＰ−Ａ−０１２１７７５］。β−ラクタマーゼ（ｂｌａ）プロモーター系［Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「Ｔｈｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｍｉｓｔａｋｅｓ．」、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編）］、バクテリオファージラムダＰＬ［Ｓｈｉｍａｔａｋｅら、（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８］およびＴ５［米国特許第４，６８９，４０６号］のプロモーター系も有用なプロモーター配列を提供する。対象となる別のプロモーターは誘導型アラビノースプロモーター（ｐＢＡＤ）である。

さらに、天然には存在しない合成プロモーターも細菌のプロモーターとして機能する。例えば、１つの細菌またはバクテリオファージのプロモーターの転写活性化配列を、別の細菌またはバクテリオファージのプロモーターのオペロン配列と結合させて、合成ハイブリッドプロモーターを作出することができる［米国特許第４，５５１，４３３号］。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーターと、ｌａｃリプレッサーによって制御されるｌａｃオペロンの配列を含むハイブリッドのｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである［Ａｍａｎｎら、（１９８３）Ｇｅｎｅ ２５：１６７；ｄｅ Ｂｏｅｒら、（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２１］。さらに、細菌のプロモーターには、細菌以外の起源をもつ天然のプロモーターであって、細菌のＲＮＡポリメラーゼに結合して転写を開始させることができるプロモーターも含まれ得る。また、非細菌由来の天然型プロモーターは、適合性のあるＲＮＡポリメラーゼと結合して、原核生物の中でいくつかの遺伝子の高レベル発現を行わせることができる。バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、結合したプロモーター系の例である［Ｓｔｕｄｉｅｒら、（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；Ｔａｂｏｒら、（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：１０７４］。さらに、ハイブリッドプロモーターも、バクテリオファージのプロモーターおよび大腸菌のオペレーター領域を含むことができる（ＥＰＯ−Ａ−０ ２６７ ８５１）。

機能的なプロモーター配列以外に、効率的なリボソーム結合部位も、原核生物の中で外来遺伝子を発現させるのに役立つ。大腸菌においては、リボソーム結合部位はシャイン−ダルガルノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）、および開始コドンから３から１１ヌクレオチド上流のところにある長さ３〜９ヌクレオチドの配列を含む［Ｓｈｉｎｅら、（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５４：３４］。ＳＤ配列は、ＳＤ配列と大腸菌１６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端との間で塩基対合することによって、ｍＲＮＡがリボソームに結合するのを促進すると考えられている［Ｓｔｅｉｔｚら、（１９７９）“Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｇｎａｌｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ“、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編）］。真核生物の遺伝子、および弱いリボソーム結合部位をもつ原核生物の遺伝子を発現させるため［Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ．」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ］。

プロモーター配列は、ＤＮＡ分子と直接連結させることも可能であり、その場合には、Ｎ−末端にある最初のアミノ酸は常にメチオニンであって、ＡＴＧ開始コドンによってコードされている。所望であれば、Ｎ−末端のメチオニンは、臭化シアンとインビトロでインキュベートして、または、細菌のメチオニンＮ−末端ペプチダーゼとインビボまたはインビトロでインキュベートしてタンパク質から切断することができる（ＥＰ−Ａ−０２１９２３７）。

通常、細菌によって認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’側にある調節領域であり、そのため、プロモーターと一緒にコード配列の近傍に存在する。これらの配列は、該ＤＮＡによってコードされているポリペプチドに翻訳され得るｍＲＮＡの転写を指令する。転写終結配列は、多くの場合、転写の終結を補助するステムループ構造を形成することができる約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を含む。例には、大腸菌のｔｒｐ遺伝子およびその他の生合成遺伝子など、強いプロモーターをもつ遺伝子に由来する転写終結配列が含まれる。

通常、プロモーター、シグナル配列（所望であれば）、対象とするコード配列、および転写終結配列を含む上記構成要素は、まとめて発現構築物に組み込まれる。発現構築物は、しばしば、細菌などの宿主中で安定して維持され得る染色体外要素（例えばプラスミド）などのレプリコンの中で維持される。レプリコンは複製系を有するため、発現のためにせよ、クローニングおよび増幅のためにせよ、原核生物宿主の中で維持することができる。さらに、レプリコンは高コピー数のプラスミドでも低コピー数のプラスミドでもよい。高コピー数のプラスミドは、一般的に、約５から約２００個まで、通常は約１０個から約１５０個のコピー数をもつ。高コピー数のプラスミドを含む宿主は、好ましくは、少なくとも約１０個、より好ましくは少なくとも約２０個のプラスミドを含む。宿主に対するベクターおよび外来タンパク質の効果に応じて、高コピー数のベクターまたは低コピー数のベクターのどちらを選ぶこともできる。

あるいは、発現構築物を、組み込みベクターによって細菌のゲノムに組み込むこともできる。組み込みベクターは、通常、ベクターの組み込みを可能にする、細菌の染色体に相同な配列を少なくとも１つ含む。組み込みは、ベクター中の相同的ＤＮＡと細菌の染色体との間の組換えによって起こると考えられている。例えば、さまざまなバシラス属の菌株由来のＤＮＡによって構築された組み込みベクターは、バシラス属の染色体に組み込まれる（ＥＰ−Ａ−０１２７３２８）。また、組み込みベクターは、バクテリオファージまたはトランスポゾンの配列から構成することもできる。

通常、染色体外組み込み発現構築物は、形質転換された菌株を選択するための選択マーカーを含むことができる。選択マーカーは、細菌宿主の中で発現させることができ、そして、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）、およびテトラサイクリンなどの薬剤に対して細菌を抵抗性にする遺伝子を含むことができる［Ｄａｖｉｅｓら、（１９７８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３２：４６９］。また、選択マーカーは、ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシンの生合成経路など、生合成遺伝子を含むこともできる。

あるいは、上記構成要素には、形質転換ベクターに一緒に組み込むことのできるものもある。形質転換ベクターは、上記したように、通常、レプリコンの中で維持されているか、または組み込みベクターへと発達する選択マーカーを含む。

発現用および形質転換用のベクターは、染色体外レプリコンであっても、組み込みベクターであっても、多くの細菌に形質転換できるよう開発されている。例えば、発現ベクターは、なかでも、以下の細菌のために開発されている。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）［Ｐａｌｖａら、（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−００３６２５９およびＥＰ−Ａ−００６３９５３；ＷＯ８４／０４５４１］、大腸菌［Ｓｈｉｍａｔａｋｅら、（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８；Ａｍａｎｎら、（１９８５）Ｇｅｎｅ ４０：１８３；Ｓｔｕｄｉｅｒら、（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；ＥＰ−Ａ−００３６７７６、ＥＰ−Ａ−０１３６８２９およびＥＰ−Ａ−０１３６９０７］、クレモリス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ）［Ｐｏｗｅｌｌら、（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５４：６５５］；ストレプトコッカス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）［Ｐｏｗｅｌｌら、（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５］、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）［米国特許第４，７４５，０５６号］。

外来ＤＮＡを細菌宿主の中に導入する方法は、当技術分野において周知であり、通常、ＣａＣｌ_２、または二価カチオンおよびＤＭＳＯなどその他の薬剤のいずれかで処理された細菌の形質転換を含む。また、エレクトロポレーションによって細菌細胞の中にＤＮＡを導入することもできる。形質転換の手順は、通常、形質転換される細菌の種によって変化する。例えば、［Ｍａｓｓｏｎら、（１９８９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６０：２７３；Ｐａｌｖａら、（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−００３６２５９およびＥＰ−Ａ−００６３９５３；ＷＯ８４／０４５４１、バシラス属］、［Ｍｉｌｌｅｒら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８５６；Ｗａｎｇら、（１９９０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：９４９、カンピロバクター］、［Ｃｏｈｅｎら、（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９：２１１０；Ｄｏｗｅｒら、（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７；Ｋｕｓｈｎｅｒ（１９７８）“Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｗｉｔｈ ＣｏｌＥｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｈ．Ｗ．ＢｏｙｅｒおよびＳ．Ｎｉｃｏｓｉａ編）；Ｍａｎｄｅｌら、（１９７０）Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５９；Ｔａｋｅｔｏ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９４９：３１８、エシェリキア属］、［Ｃｈａｓｓｙら、（１９８７）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４４：１７３、乳酸桿菌属］、［Ｆｉｅｄｌｅｒら、（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ１７０：３８、シュードモナス属］、［Ａｕｇｕｓｔｉｎら、（１９９０）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２０３、スタヒロコッカス属］、［Ｂａｒａｎｙら、（１９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：６９８；Ｈａｒｌａｎｄｅｒ（１９８７）”Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊ．ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＲ．Ｃｕｒｔｉｓｓ ＩＩＩ編）；Ｐｅｒｒｙら、（１９８１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５；Ｐｏｗｅｌｌら、（１９８８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５４：６５５；Ｓｏｍｋｕｔｉら、（１９８７）Ｐｒｏｃ．４ｔｈ Ｅｖｒ．Ｃｏｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｉｎｏｌｏｇｙ １：４１２、連鎖球菌］を参照。

（放棄）
好ましくは、本発明は以下を除外する。（ａ）２００２年１１月２２日以前に公開配列データベース（例えばＧｅｎＢａｎｋまたはＧＥＮＥＳＥＱ）で利用可能なアミノ酸配列および核酸配列；（ｂ）２００２年１１月２２日以前の出願日または適用可能であれば優先日をもつ親出願に開示されているアミノ酸配列および核酸配列。特に、例えば参考文献１３など、本明細書に引用されている参考文献のいずれかに記載されている配列番号エントリは除外され得る。

（一般）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「構成する（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を意味し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、もっぱらＸから構成されるか、またはさらなる何か（例えば、Ｘ＋Ｙ）を含有し得る。

数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。

単語「実質的に」は、「完全に」を除外せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」の組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要に応じて、その単語「実質的に」は、本発明の規定から除外され得る。

「配列同一性」は、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）で実行されているスミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）同一性検索アルゴリズムによって、ギャップ出現時ペナルティ（ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ）を１２、ギャップ伸長時ペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）を１とするアフィンギャップ検索を用いて決定される。

血清群の後、髄膜炎菌の分類は、血清型、血清サブタイプ、そして免疫型を含み、標準的な命名法は、血清群、血清型、血清サブタイプ、そして免疫型を挙げ、それぞれを、例えばＢ：４：Ｐ１．１５：Ｌ３，７，９というふうにコロンで区切る。血清群Ｂの中には、しばしば病気を引き起こす系統（過侵襲性）もあり、他よりも重篤な病状を引き起こす系統（超病原性）もあり、そして、そもそもほとんど病気を引き起こさない系統もある。７つの超病原性系統、すなわちサブグループＩ、ＩＩＩおよびＩＶ−１、ＥＴ−５複合体、ＥＴ−３７複合体、Ａ４群、および系統３が認定されている。これらは、多座酵素電気泳動（ＭＬＥＥ）によって定義されたものであるが、多座配列タイピング（ＭＬＳＴ）も髄膜炎菌を分類するために使用されている［参考文献１６］。４つの主要な超病原性群はＳＴ３２、ＳＴ４４、ＳＴ８およびＳＴ１１複合体である。

用語「アルキル」は、直鎖状形態および分枝状形態の両方のアルキル基に言及する。そのアルキル基は、−Ｏ−、−ＮＨ−あるいは−Ｓ−から選択される１つ、２つ、または３つのヘテロ原子で割り込まれ得る。そのアルキル基はまた、１つ、２つ、または３つの二重結合または１つ、２つ、または３つの三重結合で割り込まれ得る。しかしながら、用語「アルキル」は、通常、ヘテロ原子の割り込み、あるいは二重結合または三重結合の割り込みを有さないアルキル基に言及する。言及がＣ_１−１２アルキルになされる場合、それは、アルキル基が１と１２との間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０、Ｃ_１１、Ｃ_１２）を含み得ることを意味する。同様に、言及がＣ_１−６アルキルにされる場合、そのアルキル基は、１と６との間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６）を含み得ることを意味する。

用語「シクロアルキル」は、シクロアルキル基、ポリシクロアルキル基、およびシクロアルケニル基、ならびにアルキル基とのこれらの組み合わせ（シクロアルキルアルキル基など）を含む。そのシクロアルキル基は、−Ｏ−、−ＮＨ−または−Ｓ−から選択される１つ、２つ、３つのヘテロ原子で割り込まれ得る。しかしながら、用語「シクロアルキル」は、通常、ヘテロ原子の割り込みを有さないシクロアルキル基に言及する。シクロアルキル基の例は、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘキセニル基、シクロヘキシルメチル基、およびアダマンチル基を含む。言及がＣ_３−１２シクロアルキルにされる場合、それは、そのシクロアルキル基が、３と１２との間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０、Ｃ_１１、Ｃ_１２）を含み得ることを意味する。

用語「アリール」は、芳香族基（フェニルまたはナフチルなど）に言及する。言及がＣ_５−１２アリールにされる場合、それは、そのアリール基が、５と１２との間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０、Ｃ_１１、Ｃ_１２）を含み得ることを意味する。

用語「Ｃ_５−１２アリール−Ｃ_１−６アルキル」は、ベンジル、フェニルエチルおよびナフチルメチルのような基に言及する。

窒素保護基は、シリル基（ＴＭＳ、ＴＥＳ、ＴＢＳ、ＴＩＰＳなど）、アシル誘導体（フタルイミド、トリフルオロアセトアミド、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（ＺまたはＣｂｚ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル（Ｔｒｏｃ））、スルホニル誘導体（β−トリメチルシリルエタンスルホニル（ＳＥＳ））、スルフェニル誘導体、Ｃ_１−１２アルキル、ベンジル、ベンズヒドリル、トリチル、９−フェニルフルオレニルなどを含む。好ましい窒素保護基はＦｍｏｃである。

図１は、ＮＭＢ１８７０の上流領域の塩基配列を示している。 図２は、ＴｂｐＢタンパク質ならびに抗原ＮＭＢ２１２３およびＮＭＢ１８７０の構造を概略的に示している。リーダーペプチドおよび近傍のグリシンリッチ領域が示されている。５つの保存ボックスが異なったモチーフによって示されており、それらの位置がタンパク質配列上にマップされている。 図３は、増殖曲線とともに髄膜炎菌ＭＣ５８におけるＮＭＢ１８７０の量が増加することを示している。 図４は、同じ期間内に上清においてＮＭＢ１８７０の量が増加することを示している。ＰｏｒＡ量およびＮＭＢ１３８０の量は増加しない。レーンの上の数字は、培養液のＯＤ_{６２０ｎｍ}値を示している。ＫＯは、ＭＣ５８のＮＭＢ１８７０ノックアウト変異体を示し、Ｗｃｌは全細胞ライセート対照を意味する。 図５は、抗ＮＭＢ１８７０でプローブしたＯＭＶを示している。 図６は、抗ＮＭＢ１８７０を用いた、莢膜で覆われたＭＣ５８または莢膜で覆われていない変異体ＭＣ５８のＦＡＣＳ解析を示している。 図７は、高発現性（レーン１および２）、中発現性（３および４）、および低発現性（５および６）のＮＭＢ１８７０発現体（ｅｘｐｒｅｓｓｅｒｓ）の全細胞ライセートで泳動した濃度勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロットである。レーン7は、ＭＣ５８ ＮＭＢ１８７０ノックアウトを含む。レーンは、以下である：（１）ＭＣ５８；（２）Ｈ４４／７６；（３）ＮＺ３９４／９８；（４）９６１−５９４５；（５）６７／００；（６）Ｍ１２３９：（７）ＭＣ５８Δｎｍｂ１８７０。 図８は、高発現性、中発現性および低発現性の発現体、およびＮＭＢ１８７０ノックアウト変異体のそれぞれについて、ＦＡＣおよび殺菌力価を示したものである。中発現性および低発現性の発現体は、ＭＣ５８に対して９１．６％適合する、同一のＮＭＢ１８７０アミノ酸配列を有する。 図９は、ＮＭＢ１８７０タンパク質の距離による系統群を示す樹状図である。「１」、「２」および「３」という標識は３種類の改変体を示している。角括弧の中の数字は、樹状図の各枝に表された同一配列をもつ系統の数を示す。超病原性系統が、総数と異なるときには、その系統数を付けて示されている。Ｂ以外の血清群も示されている。血清学的解析で使用された３種類の菌株（ＭＣ５８、９６１−５９６５およびＭ１２３９）およびもう一つの菌株が、丸の中に示されている。 図１０は、改変体１（ＭＣ５８）、改変体２（９６１−５９６５）および改変体３（Ｍ１２３９）の配列アラインメントである。アミノ酸番号は、成熟タンパク質の第１アミノ酸であると推定されているシステインから開始している。灰色および黒で囲んだ部分は、それぞれ保存された、同一の残基を示している。 図１１は、改変体１（ＭＣ５８）、改変体２（９６１−５９６５）および改変体３（Ｍ１２３９）の標準株を用いた、改変体１（第１列）、改変体２（第２列）および改変体３（第３列）に対する血清のＦＡＣＳ解析を示す。莢膜多糖に対する対照血清を第４列に示す（モノクローナル抗体Ｓｅａｍ３）。細胞質タンパク質に対する対照血清を第５列に示す（抗ＮＭＢ１３８０）。第６列は、各標準株のノックアウト変異体（ＫＯ）を含み、同種抗血清でプローブしている。 図１２は（改変体１）は、３種類の別々のＮＭＢ１８７０の改変体について、多座配列タイピング（ＳＴ）によって分類した樹状図である。 図１３（改変体２）は、３種類の別々のＮＭＢ１８７０の改変体について、多座配列タイピング（ＳＴ）によって分類した樹状図である。 図１４（改変体３）は、３種類の別々のＮＭＢ１８７０の改変体について、多座配列タイピング（ＳＴ）によって分類した樹状図である。

（発明の実施形態）
（血清群Ｂの菌株ＭＣ５８におけるＮＭＢ１８７０−開始コドンの同定）
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＴＩＧＲ）およびＳａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｅｒによってそれぞれ同定されたＭｅｎＢおよびＭｅｎＡのゲノム配列中にＮＭＢ１８７０遺伝子が同定された［２，４；ＮＭＢ１８７０およびＮＭＡ０５８６］。しかし、ＭｅｎＢの開始コドンはＭｅｎＡの開始コドンより１２０ｂｐ上流にあるため、ＡＴＧ開始コドンの位置に関して食い違いがあった。この先行技術の両アノテーションとは対照的に、本発明は、先行技術の開始コドンよりも下流にある（ＭｅｎＡでは１８ｂｐ下流、ＭｅｎＢの開始コドンでは１３８ｂｐ下流になる）ＧＴＧコドンを開始コドンとして位置づけていて、参考文献８と一致させる。
図１に示すように、ＧＴＧからの開始（＋１）は、正確な間隔に置かれたリボソーム結合部位の存在、およびリポタンパクのシグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）の予測とつじつまが合う。先行技術であるＴＩＧＲのＭｅｎＢ開始コドンを四角で囲んで示し、ＳａｎｇｅｒのＭｅｎＡの開始コドンを丸で囲んで示した。逆位反復配列を水平の矢印で示す。

ＮＭＢ１８７０は、フルクトース−ビスホスフェートアルドラーゼ遺伝子ｎｍｂ１８６９の終止コドンから１５７塩基下流に位置するモノシストロン性の遺伝子である。ＭｅｎＡ Ｚ２４９１でも、全体的な構成は類似しているが、ＧＴＧ開始コドンから３１塩基上流に、ＩＳ１１０６の内部反復領域に相同で、かつ２つの１６塩基対の反復配列が隣接している１８６ヌクレオチドの挿入がある。推定リボソーム結合部位（斜線部）が、ＧＴＧ開始コドンから８塩基対上流に存在する。配列番号７５から開始して、最大で９個のミスマッチを許容するＧＣＧＦｉｎｄＰａｔｔｅｒｎによって予測されたように、ｆｕｒボックス（大腸菌のｆｕｒボックス共通配列と１１／１９一致する［１７８］；配列番号７４および７５）が、開始コドンの３５ｂｐ上流に存在する。プロモーターと推定される配列も検出された。

遺伝子およびタンパク質の配列のコンピュータによる配列解析にはＧＣＧウィスコンシンパッケージソフト（バージョン１０．０）を用いた。位置の推定にはＰＳＯＲＴプログラム［１７９］を用いた。ＮＭＢ１８７０は、−Ｌｅｕ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓ−型のリポ−ボックスモチーフであって、システインの後に、リポタンパクの外膜局在に一般的に関係するアミノ酸であるセリンが続く［１８０］モチーフをもつシグナルペプチドによって特徴づけられる表面露出タンパク質の典型的なシグネチャーを持っている。このリポ−ボックスは、ＭＣ５８のヌクレオチド３６の後ろに一塩基（Ｇ）の挿入によるフレームシフトによって、淋菌では失われており、正しいリーディングフレームは、７３番目の後ろに８ｂｐの挿入があって回復されている。

成熟ＭＣ５８タンパク質は、２６，９６４Ｄａの分子量と７．９６のｐＩ値をもつリポタンパクであると推定されており、リポ−ボックスモチーフの下流に４個のグリシンが存在するのが特徴である。

ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎソフトウエア［１８１］を用いた二次構造予測解析では、ＮＭＢ１８７０は、大部分がベータシートから構成された球状タンパク質であることが示されている。

（配列解析）
相同性検索には、非重複タンパク質データベースを用いたＰＳＩ−ＢＬＡＳＴアルゴリズムが使用された。ＮＣＢＩのサイトで維持されている、ヒトゲノムを含む既存の原核生物および真核生物の非重複タンパク質データベースを検索しても相同的なタンパク質は見つからなかったが、このことは、ＮＭＢ１８７０がナイセリア属に特異的なものであることを示唆している。しかし、アクチノバシラス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のトランスフェリン結合タンパク質ＴｆｂＡのＣ−末端側部位にいくらかの同一性（１４６アミノ酸にわたって２８％の同一性）をもつドメインが見つかった［１８３］（図２）。このドメインをより詳細に見ると、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｉｓ、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）のトランスフェリン結合タンパク質との相同性、および、以前ＴｂｐＢのホモログであるとアノテーションされたＮ．ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｉｓの表面抗原ＮＭＢ２１３２［３］との相同性が明らかになった。

この配列相同性が、機能的な相同性を反映しているか否かを確認するために、組換えＮＭＢ１８７０（下記参照）、ヒトトランスフェリンｈＴＦ（Ｓｉｇｍａ Ｔ−４１３２）、およびこれら２つの混合物（最終濃度７μＭ）をＰＢＳ中４℃で一晩（Ｏ／Ｎ）透析した。透析の後、各タンパク質およびそれらの混合液を２０μｌずつ、泳動バッファーとしてＰＢＳを用いたＨＰＬＣ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２０００ ＰＣ ３．２／３０ゲル濾過カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でロードした［１８７］。ブルーデキストラン２０００（Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ ２０００）ならびに分子量スタンダードであるリボヌクレアーゼＡ、キモトリプシンＡ、オボアルブミンＡ、ウシ血清アルブミン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてカラムを較正した。流速０．０４ｍｌ／分で、また溶出された物質を２１４ｎｍおよび２８０ ｎｍで観察しながらＳｍａｒｔシステムを用いてゲル濾過を行った。（ＮＭＢ１８７０保持容量は、１．６８ｍｌで、ｈｔｆについては１．４７ｍｌであった。）４０μｌの画分を集めてＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。ＭＣ５８の組換えトランスフェリン結合タンパク質２（Ｔｂｐ２）を陽性対照として使用した。

組換えタンパク質は、インビボでヒトトランスフェリンに結合できなかった。

プロモーター中のＦｕｒボックスは、ＮＭＢ１８７０の発現が鉄によって調節されている可能性があることを示唆している。しかし、このタンパク質の発現は、鉄濃度が低い状態では増加するようには見えない。

このタンパク質の興味深い特徴は、脂質化されたシステインの下流に４個のグリシン鎖が存在することである。脂質化されたシステインの下流に３個以上グリシンが連続しているのは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｉｓの別の５つのリポタンパク、すなわちトランスフェリン結合タンパク質Ｂ（ＴｂｐＢ）、ＡＢＣ輸送タンパク質ＮＭＢ０６２３の外膜成分、仮定的タンパク質ＮＭＢ１０４７、ＴｂｐＢホモログＮＭＢ２１３２、およびＡｓｐＡリポタンパクでも見られる［１８８］。これらのタンパク質のいずれにおいても、ポリ−グリシン鎖はポリ−Ｇトラクト（ｔｒａｃｔ）によってコードされておらず、この特徴が抗原による免疫調節を生じさせるためには利用されていないことを示唆している。

グリシンリッチ領域によるリポタンパクの検索を、ＮＣＢＩサイト［１８１］で探し出した２２種類の完全ゲノム配列に対してＦｉｎｄＰａｔｔｅｒｎを用いて実施した。この検索によって、すべてではないがいくつかの細菌種において２９種類のリポタンパクを探し出した。このタイプのリポタンパクをもつ生物には、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｃａｌｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｌｙｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを含む、グラム陰性菌もグラム陽性菌も含まれていたが、一方で、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅは有していなかった。このシグネチャーをもつリポタンパクのほとんどは、ＡＢＣ輸送タンパク質に属し、したがって、未知の機能をもつタンパク質であった。一次構造におけるこの共通の特徴は、グリシン反復には共通の役割があることを示唆しているが、これまでのところその機能は分かっていない。しかし、分泌および表面局在の特異的経路にリポタンパクを導く働きをしている可能性がある［１９０］。

（他の菌株の配列決定）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ集団の遺伝的および地理的な多様性を代表する７０菌株を選んで、さらにＮＭＢ１８７０について調べた。菌株は、１９か国に由来し、７３％が血清群Ｂに属し、３２菌株が過去５年間に単離されたものであった。この菌株パネルは、ほとんどが血清群Ｂの菌株を含んでいて、数菌株が血清群Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ１３５およびＺで、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）とナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ）がそれぞれ１菌株ずつである。菌株については、参考文献１９１および１９２により詳しく開示されている。ＡＴＣＣから入手可能な菌株もある（例えば、菌株ＭＣ５８は参照番号ＢＡＡ−３３５として入手可能である）。

コード配列の外側にあるプライマーを使用して、ＮＭＢ１８７０遺伝子を増幅した（Ａ１、配列番号５５；およびＢ２、配列番号５６）。約１０ｎｇの染色体ＤＮＡを増幅のための鋳型として用いた。ＰＣＲ条件は、９４℃で４０秒、５８℃で４０秒、６８℃で４０秒を３０サイクル。ＰＣＲフラグメントを、ＱｉａｇｅｎのＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットで精製し、ＡＢＩ ３７７自動配列決定装置を使用して行われる配列解析に付した。配列決定は、プライマーＡ１、Ｂ２、２２（配列番号５７）および３２（配列番号５８）を用いて行った。

ナイセリア属の７０菌株すべてでＰＣＲによって遺伝子が検出された。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａでは、ウエスタンブロッティングによってバンドは検出されたが、遺伝子は増幅されなかった。

７０菌株すべてで遺伝子のヌクレオチド配列を決定した。全部で２３種類の異なったタンパク質の配列がコードされていた（配列番号１から２３）。ＫｉｍｕｒａとＪｕｋｅｓ−Ｃａｎｔｏｒのアルゴリズムを用いた、これら２３の配列のコンピュータ解析によって、これらの配列が３種類の改変体に分けられた（図９）。ＮＭＢ１８７０タンパク質配列の多重配列アラインメント（ＰｉｌｅＵＰ）から開始し、系統樹推定パッケージ（Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｐａｃｋａｇ：Ｐｈｙｌｉｐ）の中で利用可能なプログラムであるタンパク質配列節約法（Ｐａｒｓｉｍｏｎｙ ｍｅｔｈｏｄ）（ＰｒｏｔＰａｒｓ）を用いて樹状図を得、ＫｉｍｕｒａとＪｕｋｅｓ−Ｃａｎｔｏｒのアルゴリズムを用いたＧＣＧのプログラムＤｉｓｔａｎｃｅによって確認した。

さらに１００菌株からＮＭＢ１８７０の配列を決定した。これらの多くは、配列番号１から２３のいずれか一つと同一であったが、さらに１９のユニークな配列が配列番号１４０から１５８として与えられた。

図１２〜１４は、ＳＴ多座配列タイプによって分類された、さまざまな配列の樹状図を示している。改変体１（図１２）の中で、参照菌株はＭＣ５８であり、参照菌株に対してもっとも低い配列同一性が８９．４％であり、平均は９３．７％であった。改変体２（図１３）において、参照菌株は２９９６であり、配列同一性は最低９３．４％に伸びる（平均９６．３％）。改変体３（図１４）において、参照菌株Ｍ１２３９に対してもっとも低い配列同一性は９４．７％であった（平均９５．８％）。ＳＴ３２ｃｐｘが、最も均質な超病原性クラスターであり、改変体１由来のＮＭＢ１８７０配列を１種類だけ有する（またＮＭＢ１３４３およびＮａｄＡの一つの形態だけ）。ほとんどのＳＴ４４ｃｐｘ菌株は、ＮＭＢ１８７０の改変体１（いくつか異なる配列）をもつが、いくつかの菌株は改変体３（単一の配列）を有する。これらのデータは、ＳＴ３２ｃｐｘが、他のクラスターと比較するとＳＴ４４ｃｐｘに近縁であることを示唆しているが、このことは、ｐｏｒＡ遺伝子型（クラスＩＩＩ）に基づいたデータと合致する。ＳＴ１１およびＳＴ８の複合体は、その大分部が、ＮＭＢ１８７０の改変体２の中のさまざまな配列によって表され、これらの複合体が、他のクラスターと比較するとともに近縁であり、ｐｏｒＡ遺伝子型（クラスＩＩ）と適合する。ＳＴ１１ｃｐｘは、３つの改変体すべてを含み、４つのうちもっと多様な超病原性クラスターであることを示している。

菌株ＭＣ５８、９６１−５９４５およびＭ１２３９が、それぞれ改変体１、２および３の標準菌株として任意に選ばれた。この３種類の標準菌株の間における配列多様性を図１０に示す。アミノ酸の同一性は、改変体１と改変体２の間では７４．１％、改変体１と改変体３の間では６２．８％、また改変体２と改変体３の間では８４．７％であった。各改変体内では配列はよく保存されており、最も遠いものでも、それらの標準菌株に対してそれぞれ９１．６％、９３．４％および９３．２％の同一性であった。ナイセリア・シネレアは改変体１に属し、ＭＣ５８に９６．７％の同一性をもつ。図９に示されているように、改変体１は、超病原性系統ＥＴ−５に由来する全ての菌株、ほとんどの系統３菌株、血清群Ａの菌株、Ｗ−１３５の最近の単離物２つ、およびＥＴ−３７の一つを含む。改変体２は、超病原性複合体Ａ４、血清群ＹおよびＺ、古いＷ−１３５単離物の一つ、および５つのＥＴ−３７菌株を含む。改変体３は、４つのユニークなＳＴ菌株、１つのＥＴ−３７菌株、１つの系統３菌株および淋菌を含む。

各改変体群における菌株、およびそれらのＮＭＢ１８７０配列は以下の通りである。

配列番号１３９（菌株２２０１７３ｉ）、１４０（菌株ｇｂ１０１およびＩＳＳ９０８）および１４１（菌株ｎｇｅ３１）は、これら３種類の改変体から離れている（それほどではないが、菌株ｍ３８１３も同様である）。

改変体１において、菌株ｌｎｐ１７５９２の配列（菌株００−２４１３４１、００−２４１３５７、２ＮＤ８０、２ＮＤ２２１およびＩＳＳ１１４２にも見られる）が、Ｗ−１３５ Ｈａｊｉ血清群にも見られる。Ｈａｊｉ菌株の中では、ＮａｄＡの配列（配列番号１４３）がアレル２と３の組換えである［１９１、１９２］。

（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるクローニング、発現、および精製）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｉｓのＭＣ５８、９６１−５９４９およびＭ１２３９の菌株のゲノムからＰＣＲでＮＭＢ１８７０遺伝子を増幅した。フォワードプライマーとリバースプライマーは、推定リーダーペプチドをコードする配列を含まないようにｎｍｂ１８７０コード配列を増幅するために設計した。Ｍ１２３９および９６１−５９４５の改変体は、Ｅ．ｃｏｌｉでは発現可能でないことが分かった。したがって、淋菌のタンパク質には存在するが、髄膜炎菌の対応タンパク質には存在しない配列番号４６の配列をＮ−末端に付加して発現させた。増幅に使用されたオリゴヌクレオチドは以下のとおりである。

フォワードプライマーについてはＮｄｅＩおよびリバースプライマーについてはＸｈｏＩ（Ｍ１２３９についてはＨｉｎｄＩＩＩ）に相当する制限酵素部位を下線で示した。９６１−５９４９およびＭ１２３９のフォワードプライマーについては、淋菌の配列部分をイタリック体で示し、髄膜炎菌のＮＭＢ１８７０と一致する配列を太字で示した。

プライマーの組み合わせがＦｏｒ１／Ｒｅｖ１である場合のＰＣＲ条件は、９４℃で３０秒間変性、５７℃で３０秒間アニーリング、６８℃で１分間伸長反応（５サイクル）、９４℃で３０秒間変性、６８℃で３０秒間アニーリング、６８℃で１分間伸長反応（３０サイクル）である。プライマーの組み合わせがＦｏｒ２／Ｒｅｖ２およびＦｏｒ３／Ｒｅｖ２およびＦｏｒ３／Ｒｅｖ３５８℃である場合、９４℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、６８℃で１分間（５サイクル）、９４℃で３０秒間、７１℃で３０秒間アニーリング、６８℃で１分間（３０サイクル）である。

以下のプライマー：ｆ−ｌＦｏｒ

およびｆ−ｌＲｅｖ

を用い、以下の条件：９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間（３０サイクル）を用いて、ＭＣ５８のゲノムから全長のｎｍｂ１８７０遺伝子を増幅した。

高忠実度Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、約１０ｎｇの染色体ＤＮＡに対してＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化して、ｐＥＴ−２１ｂ＋発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位にクローニングした。

組換えタンパク質を、Ｈｉｓタグ化融合タンパク質として大腸菌のなかで発現させ、前述したように［３］ＭＣＡＣ（金属キレートアフィニティークロマトグラフィー）で精製し、マウスを免疫するために使用して抗血清を得た。大腸菌ＤＨ５αをクローニング操作に使用し、ＢＬ２１（ＤＥ_３）を発現に使用した。

（ｎｍｂ１８７０およびｓｉａＤの同系変異体）
菌株ＭＣ５８、９６１−５９４５およびＭ１２３９をプラスミドｐＢＳΔｎｍｂ１８７０ＥＲＭで形質転換して、ｎｍｂ１８７０遺伝子を切断してエリスロマイシン抗生物質カセットによって置換した同系のノックアウト変異体を調製した。このプラスミドは、ｎｍｂ１８７０の下流および上流にある５００ｂｐの隣接領域にエリスロマイシン抵抗性遺伝子を含んでいる。これらの領域を、以下のオリゴヌクレオチド、Ｕｆｏｒ

（配列番号５９、Ｘｂａ１部位を下線で示す）；ＵＲｅｖ

（配列番号６０、Ｓｍａ１部位を下線で示す）；ＤＦｏｒ

（配列番号６１，Ｓｍａ１部位を下線で示す）、およびＤｒｅｖ

（配列番号６２、Ｘｈｏ１部位を下線で示す）を用いて、ＭＣ５８のゲノムから増幅した。同じ方法で莢膜欠損変異体を作出した。ｓｉａＤ遺伝子を欠失させ、プラスミドｐＢＳΔＣａｐＥＲＭを用いて、ｅｒｍＣで置き換えた。それぞれ１０００ｂｐおよび１０５６ｂｐの上流および下流の隣接領域を、以下のプライマー：ＵＣａｐＦｏｒ

（配列番号６３、Ｘｂａｌ部位を下線で示す）；ＵｃａｐＲｅｖ

（配列番号６４、Ｓｍａｌ部位を下線で示す）；ＤＣａｐＦｏｒ

（配列番号６５、Ｓｍａｌ部位を下線で示す）およびＤＣａｐＲｅｖ

（配列番号６６、Ｘｈｏｌ部位を下線で示す）を用いて、ＭＣ５８のゲノムから増幅した。増幅されたフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングして、天然のコンピテントであるＮ．ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｉｓの菌株ＭＣ５８に形質転換した。この混合物をＧＣ寒天プレートにスポットして、５％ＣＯ_２下３７℃で６時間インキュベートしてから、ＰＢＳに希釈して、５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含むＧＣ寒天プレートに塗布した。菌株ＭＣ５８Δｎｍｂｌ８７０、９６１−５９４５Δｎｍｂｌ８７０およびＭ１２３９Δｎｍｂｌ８７０におけるｎｍｂ１８７０の欠失がＰＣＲによって確認され、ウエスタンブロット解析によってＮＭＢ１８７０が発現しないことが確認された。ＭＣ５８ΔｓｉａＤ菌株において、ｓｉａＤ遺伝子が欠失していることおよび莢膜が発現しないことを、それぞれＰＣＲおよびＦＡＣＳによって確認した。

（リポタンパク）
ＮＭＢ１８７０の脂質化を調べるために、参考文献１９３に記載されているように、全長ｎｍｂ１８７０遺伝子をもつ組換えＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ_３）菌株によるパルミチン酸の取り込みを調べた。

髄膜炎菌の菌株ＭＣ５８とＭＣ５８Δｎｍｂｌ８７０をＧＣ培地で増殖させて、［９，１０−^３Ｈ］−パルミチン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で標識した。５ｍｌの培地からの細胞を１０分間煮沸して溶解し、１３，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清をＴＣＡで沈殿させ、冷アセトンで２回洗浄した。タンパク質を、５０μｌの１．０％ＳＤＳに懸濁して、１５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、クマシー・ブリリアントブルーで染色し、固定して、Ａｍｐｌｉｆｙ溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に１５分間浸した。ゲルをＨｙｐｅｒｆｉｌｍ ＭＰ （Ａｍｅｒｓｈａｍ）に−８０℃で３日間暴露した。

ＭＣ５８では適正な分子量の放射活性バンドが検出されたが、Δｎｍｂｌ８７０ノックアウト変異体では検出されなかった。

［９，１０−^３Ｈ］−パルミチン酸存在下で増殖させた組換えＥ．ｃｏｌｉも、期待された分子量のところに放射活性バンドを生じた。これにより、Ｅ．ｃｏｌｉがリポタンパクモチーフを認識して、組換えタンパク質に脂質テイルを付加することが確認された。

（タンパク質の検出）
菌株ＭＣ５８を定常期にＧＣ培地において５％ＣＯ_２下３７℃で増殖させた。増殖中（ＯＤ_{６２０ｎｍ} ０．０５−０．９）に試料を集めた。ＭＣ５８Δｎｍｂｌ８７０をＯＤ_{６２０ｎｍ} ０．５まで増殖させた。細菌の細胞を遠心分離によって集めて、ＰＢＳで１回洗浄し、ＯＤ値を標準化するために、さまざまな容量のＰＢＳに再懸濁した。０．２μｍのフィルターを用いて培養上清を濾過し、２５０μｌの５０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を添加して１ｍｌを沈殿させた。試料を氷上で２時間インキュベートし、４℃で４０分間遠心分離し、沈殿物を７０％氷冷エタノールで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。そして、試料（ＯＤ_６２０ ０．０３に相当）それぞれ３μｌを、１２％ポリアクリルアミドゲルで泳動して、ニトロセルロース膜に電気的に転移させた。

Ｅ．ｃｏｌｉで発現したタンパク質に対して惹起されたポリクローナル抗体を１：１０００の希釈率で用い、次いでＨＰＲ−標識された抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を１／２０００に希釈したものを用いて、標準的な方法でウエスタンブロット解析を行った。ＬａｂＳｃａｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およびＩｍａｇｅｍａｓｔｅｒソフトウエア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてスキャンを行った。

図３に示すように、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの全細胞抽出物から約２９．５ｋＤａのタンパク質を検出した。培養液の光学密度が０．０５から０．９ ＯＤ_{６２０ｎｍ}に増加する一方で、全細胞ライセートにおけるタンパク質の量は、増殖曲線の過程でほぼ２倍になった。培養上清においても、同じサイズのバンドが検出された。植菌されたばかりの培養液（ＯＤ_{６２０ｎｍ} ０．０５）の上清ではタンパク質は検出されなかったが、０．１から０．９ ＯＤ_{６２０ｎｍ}に増加する間に約４倍に増加した（図４、左側パネル）。上清における発現の真の性質が、同じ試料を膜小胞および細胞質タンパク質について調べることによって確認された。図４の中央パネルに示されているように、ＰｏｒＡの上清調製物にはＰｏｒＡが存在しないことは、膜小胞による汚染の可能性を排除する一方で、細胞質タンパク質ＮＭＢ１３８０が上清中に存在しないことで、上清試料が、細胞溶解からもたらされたものでないことを確認した（右側パネル）。

ＭＣ５８Δｎｍｂｌ８７０ノックアウト菌株は、全細胞ライセートにおいても、培養上清（図３および４の「ＫＯレーン」）においてもタンパク質を示さなかった。

外膜ベシクルでＮＭＢ１８７０を検出し、このタンパク質が、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの膜画分とともに分離することが確認された（図５）。しかし、ＯＭＶで免疫されたマウスからの血清は、ウエスタンブロッティングでは組換えＮＭＢ１８７０を認識せず、このタンパク質がＯＭＶ調製物においては免疫原性がないことを示唆している。

抗ＮＭＢ１８７０抗体を用いたＦＡＣＳ解析によって、該タンパク質は表面露出しているため、莢膜型および無莢膜型のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ菌株の両方において抗体が結合できることが確認された（図６）。ＦＡＣＳ解析は、二次抗体の抗マウス（全分子）ＦＩＴＣ−結合体（Ｓｉｇｍａ）を用いて検出される抗体結合とともにＦＡＣＳ−Ｓｃａｎフローサイトメーターを用いた。陽性のＦＡＣＳ対照には、髄膜炎菌Ｂの莢膜ポリ多糖に特異的なモノクローナル抗体であるＳＥＡＭ３［１９４］を用い、陰性対照は、細胞質タンパク質ＮＭＢ１３８０に対するマウスのポリクローナル抗血清からなっていた［１９５］。

４３菌株のウエスタンブロッティングによって、試験した菌株のすべてによってＮＭＢ１８７０が発現されることが示された。しかし、図７に示されているように、発現レベルは、菌株によってかなり変動した。調べた菌株は、高度、中度および低度の発現株に大きく分類できる。

２つの菌株では中度レベルで発現し、２つの菌株では低レベルで発現したＡ４以外では、超病原性系統に由来する菌株（ＥＴ−５、系統３、ＥＴ−３７）のほとんどは、タンパク質を高レベルで発現させた。興味深いことに、このタンパク質は、従来ＯＭＶワクチン株として用いられてきた菌株によって高レベルで発現された。各菌株によって発現されるタンパク質の量を予測するための明確な遺伝子パターンは見つからなかった。プロモーター領域にＩＳエレメントが存在していても（これは８／７０の菌株（１つは血清群Ａ由来、３つは系統３に由来し、４つは別のものとして分類されたものである）で発見されたのであるが）、タンパク質の発現とは何の相関も示さなかった。

ウエスタンブロットをスキャンしたところ、高度と中度の間、中度と低度の間、または高度と低度の間では、それぞれ発現に２倍、５倍、および９倍の違いがあり得ることが明らかになった。発現レベルが異なることについて、すぐに分かる理由はなく、また、遺伝子の上流にあるＤＮＡ配列の解析によっても、発現と相関する特徴は何も見られなかった。

（抗体応答）
健康な被験者および回復期にある被験者からの血清を、ウエスタンブロットによって抗ＮＭＢ１３８０抗体について解析した。精製したＮＭＢ１８７０（１μｇ／レーン）を１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで泳動し、ニトロセルロース膜に移した。結合したタンパク質を、血清の１／２００希釈液で、次いでＨＰＲ−標識された抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を１／２０００に希釈したもので検出した。健康な人々からの血清の２／１０だけがＮＭＢ１８７０を認識し、回復期血清の２１／４０は該タンパク質を認識したことから、ＮＭＢ１８７０は、感染期間中インビボで免疫原性をもつとの結論に達した。したがって、組換えで免疫したマウスの抗血清をさらに調べた。

抗血清を調製するために、２０μｇの改変体１、改変体２および改変体３のＮＭＢ１３８０組換えタンパク質を用いて、６週齢のＣＤ１メスマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を免疫した。１群につき４から６匹を用いた。組換えタンパク質は、初回投与には完全フロインドアジュバンド（ＣＦＡ）とともに、第２回（２１日目）および第３回（３５日目）の追加免疫にはフロインド不完全アジュバント（ＩＦＡ）とともに腹腔内に投与した。フロインドアジュバンドの代わりに水酸化アルミニウムアジュバント（３ｍｇ／ｍｌ）用いて同じ免疫スケジュールを行った。解析のための血液試料は４９日目に採取した。

前述したように［３、１９６］、抗血清が、補体介在による莢膜型髄膜炎菌株の殺菌を誘導できるかを、補体の供給源として用いられる仔ウサギ血清のプール（ＣｅｄａｒＬａｎｅ）を用いて調べた。健康なヒト成人由来の血清（最終濃度２５または５０％で調べても内因性の抗菌活性はない）も補体の供給源として用いた。血清の抗菌力価は、細菌を反応混合物とインキュベートして６０分後に１ｍｌあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）が、時間０での１ｍｌあたりの対照のＣＦＵと比較して５０％減少するという結果をもたらす血清希釈と定義されていた。典型的には、補体存在下で陰性対照抗体とインキュベートされた細菌は、６０分間のインキュベーションの間にＣＦＵ／ｍｌの１５０から２００％の上昇を示した。

高度、中度および低度の発現体の代表的菌株をアッセイのために選んだ。ＦＡＣＳ解析によって、選択された菌株の表面上でのタンパク質の示差的発現を確認した（図８）。すなわち、高発現菌株の代表であるＭＣ５８は、１／６４，０００まで希釈した血清によっても高効率で殺菌された。中度発現菌株の代表であるＮＺ３９４／９８（元来ＮＺ９８／２５４）は、１／１６，０００まで希釈した血清によっても高効率で殺菌された、さらに、低発現菌株の代表である菌株６７／００も、１／２，０４８まで希釈した血清によって殺菌された。ｎｍｂ１８７０遺伝子がノックアウトされている対照菌株は、同じ血清によって殺菌されることはなかった。

これらの血清が、インビボでも防御を付与できるか否かを確かめるために、幼ラットモデルにおいて受動防御を誘導できるか調べた。５日齢の幼ラットを、時間０において、抗ＮＭＢ１８７０抗血清、または抗ＰｏｒＡモノクローナル抗体で腹腔内的に予め処理し、２時間後、５×１０^３ＣＦＵ／ラットのＭｅｎＣ ４２４３（ＯＡｃ−陽性）またはＭｅｎＢ ＮＺ３９４／９８を腹腔内にチャレンジした。２４時間後に定量的な血液培養物が得られた。チョコレート寒天プレートに塗布することによって、血液培養液中の細菌計測数（ＣＦＵ／ｍｌ、相乗平均）が得られた。陽性対照血清は、ＭｅｎＣに対しては抗ＰｏｒＡ（Ｐ１．２）で、ＭｅｎＢに対してはＳＥＡＭ３であった。実験の結果は以下のとおりであった。

したがって、陰性対照の動物のほとんどが菌血症になった一方で、抗ＮＭＢ１８７０血清で受動免疫したラットの血液からは細菌のコロニーは回収されなかった。

（殺菌活性は改変体特異的である）
各型の改変体を、Ｈｉｓタグ化タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉで発現させ、マウスを免疫するために使用した。これらの血清は、ＦＡＣＳおよび殺菌アッセイ法によって、３種類の改変体の菌株間における免疫学的交差反応性を試験するために使用された。図１１に示すように、ＦＡＣＳ解析によって、すべての菌株が各血清によって認識されたが、認識の程度はかなり変動し、これは通常、タンパク質間のアミノ酸相同性を反映する。

より詳しく解析すると、抗改変体１の血清（図１１，第１行）は、（予想どおり）ＭＣ５８菌株を非常によく認識し、より低い程度で９６１−５９４５菌株（７４．１％同一性）を、またより小さい範囲でＭ１２３９菌株（６２．８％同一性）を認識した。同様の傾向が、改変体２および改変体３に対する血清にも見られた（図１１，第２行および第３行）が、抗改変体２の血清を用いた場合には、その違いはそれほど顕著ではなかった。

莢膜に対するモノクローナル抗体は、３つの菌株すべてを等しく十分に認識したが（第４行）、陰性対照として用いられた細胞質タンパク質ＮＭＢ１３８０に対する血清は、どれも認識しなかった（第５行）。同様に、ｎｍｂ１８７０ノックアウト変異体は、いずれの血清によっても認識されなかった（第６行）。

改変体間における免疫認識の違いは、殺菌アッセイ法によってより明らかになった。

これらのデータは、各改変体に対する血清が、同種菌株の有効な補体媒介性の殺菌を誘導できたことを示している（力価は１６，０００と６４，０００との間の範囲）が、一方で別の改変体の菌株に対しては活性が低い（１２８〜２，０４８）か、なかった（＜４）。緊密なアミノ酸相同性から予測されるように、改変体２および３の間の交差殺菌力価は、他のものよりは高かった。ヒト補体を使用したときは、同種の標準菌株を用いて、改変体１、２および３それぞれについて、４，０９６、２５６および５１２という殺菌力価が得られた。異種菌株に対しては、力価は検出されなかった。

（ハイブリッドタンパク質およびタンデムタンパク質）
ハイブリッドタンパク質およびタンデムタンパク質は、ＮＨ_２−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］_ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨという式で表すことができる。このタイプのさまざまなタンパク質をコードする遺伝子を構築した。ここで、ｎ＝２、Ｘ_１およびＸ_２のＮ末端は、それらのポリ−グリシン領域までを欠失しており、また−Ｌ_１−および−Ｂ−は存在しない（または、Ｂは、精製に用いるポリ−ヒスチジンタグである）。以下の表は、成熟形態における、これらのタンパク質の成分を示し、また、全長ポリメラーゼの配列番号、および、成分配列Ａ、Ｘ_１、Ｌ_１およびＸ_２に対する配列番号と菌株を示している。

したがって、これら１２種類のＮＭＢ１８７０タンパク質のうち、８種類はタンデムタンパク質（ＭＷほぼ５５ｋＤａ）であり、４種類は、Ｎ−末端に「９３６_２９９６」を有するハイブリッドタンパク質（ＭＷほぼ４９ｋＤａ）である。以下の２種類のリンカーを使用した。（ａ）淋菌のＮＭＢ１８７０ホモログ（配列番号４６）に由来する配列番号７８；および（ｂ）グリシンリッチリンカー（配列番号１４４）。配列番号７８は、その２つのＢａｍＨＩ残基（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を除いて、成熟タンパク質のＮ−末端にも用いられた。すなわち配列番号８６である。

１２種類のタンパク質は、大腸菌で発現されるとすべて可溶性であり、精製後、マウスを免疫するために使用された。最大４種類の髄膜炎菌の菌株に対して血清の殺菌抗体（ＳＢＡ）反応を評価して、３種類のＮＭＢ１８７０改変体１から３のそれぞれから一つを確定した（上付の添え字で示す）。アジュバントは、ＣＦＡ（上）または水酸化アルミニウム（下）のどちらかであった。

これらの結果は、免疫反応の改変体特異的な性質を明確に示している。例えば、タンパク質（１）および（２）は、ＮＭＢ１８７０の改変体１および２に由来する配列を含んでおり、最善のＳＢＡの結果が、これら２つの改変体に対して見られる。同様に、タンパク質（３）および（４）を用いるときに、最善の結果が改変体１および３に対して見られる。改変体２および３からのＮＭＢ１８７０を用いると、Ｎ−末端からＣ−末端どちらの順序でも優れた活性が見られ、タンパク質（５）および（８）を用いると、改変体１に対してほとんど活性をもたない。「９３６」部分によって提供されている抗２９９６活性をいくらかもつハイブリッドタンパク質を用いると、ＮＭＢ１８７０応答の改変体特異的な性質も明らかになる。

以下のオリゴヌクレオチドプライマーは、１２種類のタンパク質を構築する際に用いた。

三重のタンデムタンパク質（Ｔｒｉｐｌｅ ｔａｎｄｅｍ ｐｒｏｔｅｉｎ）
ｎ＝３である、「三重のタンデム」タンパク質を、菌株（１）ＭＣ５８、（２）２９９６および（３）ｍ１２３９に基づいて構築した。７５７ｍｅｒの三重タンデムタンパク質ＮＨ_２−Ａ−Ｘ_１−Ｌ_１−Ｘ_２−Ｌ_２−Ｘ_３−Ｌ_３−Ｂ−ＣＯＯＨは、配列番号１４２のアミノ酸配列を有する。

Ｘ_２およびＸ_３は、どちらもそれらのポリ−グリシンリッチ領域までＮ−末端を欠いている（すなわち、ΔＧ配列となっている）。

（殺菌性ＳＢＡ力価）
９種類の異なったタンパク質でマウスを免疫し、得られた血清の殺菌活性を、免疫に用いたタンパク質が由来した菌株と一致する菌株、免疫に用いたタンパク質とは異なる菌株の両方を含む、髄膜炎菌のさまざまな菌株に対して試験した。９種類のタンパク質は、以下であった：
（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）９３６とＮＭＢ１８７０とのハイブリッドタンパク質
（Ａ）ＮＭＢ１８７０_ＭＣ５８＝改変体１［１２］
（Ｂ）ＮＭＢ１８７０_２９９６＝改変体２、例えば配列番号９１および９２
（Ｃ）ＮＭＢ１８７０_{Ｍ１２２３９}＝改変体３、例えば配列番号９１および９２
（Ｄ）、（Ｅ）および（Ｆ）単一の菌株由来のＮＭＢ１８７０
（Ｄ）ＮＭＢ１８７０_ＭＣ５８＝改変体１、例えば、配列番号８０
（Ｅ）ＮＭＢ１８７０_２９９６＝改変体２、例えば配列番号８１
（Ｆ）ＮＭＢ１８７０_{Ｍ１２３９}＝改変体３、例えば配列番号８４
（Ｇ）、（Ｈ）および（Ｉ）ＮＭＢ１８７０のタンデムタンパク質
（Ｇ）ＮＭＢ１８７０_ＭＣ５８−ＮＭＢ１８７０_２９９６＝改変体１および２、例えば、配列番号７９および８２
（Ｈ）ＮＭＢ１８７０_２９９６−ＮＭＢ１８７０_{Ｍ１２３９}＝改変体２および３、例えば配列番号８７および８８
（Ｉ）ＮＭＢ１８７０_ＭＣ５８−ＮＭＢ１８７０_{Ｍ１２３９}＝改変体１および３、例えば配列番号８３および８５
ＮＭＢ１８７０の改変体１を有する最大２０までの菌株に対する、ＮＭＢ１８７０の改変体２を有する最大２２までの菌株に対する、および改変体３を有する最大５個までの菌株に対する、殺菌応答を測定した。

タンパク質（Ａ）〜（Ｃ）に対して惹起された血清の殺菌作用は、被験菌株の遺伝子型と適合した。例えば、ＣＦＡを免疫のためのアジュバントとして使用すると、菌株ＭＣ５８（改変体１）に対するＳＢＡ力価は、（Ａ）２６２１４４；（Ｂ）＜４；（Ｃ）＜４であった。同様に、菌株９６１−５９４５（改変体２）に対して血清を試験すると、ＳＢＡは、（Ａ）２５６；（Ｂ）３２７６８；（Ｃ）４０９６であった。最後に、菌株Ｍ１２３９（改変体３）の力価は、（Ａ）＜４；（Ｂ）５１２；（Ｃ）３２７６８であった。

ＣＦＡまたは水酸化アルミニウムをアジュバントとして使用したところ、タンパク質（Ａ）は、以下の菌株に対して５１２以上のＳＢＡ力価を生じた：Ｍ０１−２４０１８５、Ｍ２１９７、ＬＰＮ１７５９２、Ｍ６１９０（すべてＥＴ３７）；ＭＣ５８、ＢＺ８３、ＣＵ３８５、Ｎ４４／８９、４４／７６、Ｍ２９３４、Ｍ４２１５（すべてＥＴ５）；ＢＺ１３３、Ｍ１３９０、ＩＳＳ１０２６、ＩＳＳ１１０６、ＩＳＳ１１０２（系統３）；Ｆ６１２４（ｓＩＩＩ）；およびＭ２９３７（その他）。これらの菌株は、血清群Ａ、Ｂ、ＣおよびＷ１３５をカバーしているが、血清群Ｙの菌株は試験しなかった。

ＣＦＡまたは水酸化アルミニウムをアジュバントとして使用したところ、タンパク質（Ｂ）は、以下の菌株に対して５１２以上のＳＢＡ力価があった：２９９６、９６１−５９４５、９６２１７（Ａ４群）；Ｍ０１−２４００１３、Ｃ１１、ＮＧＨ３８、Ｍ３２７９、Ｍ４２８７、ＢＺ２３２（その他）。これらの菌株は、血清群Ｂ、およびＣをカバーしているが、血清群Ａ、Ｗ１３５またはＹの菌株は試験しなかった。

ＣＦＡまたは水酸化アルミニウムをアジュバントとして使用したところ、タンパク質（Ｃ）は、以下の菌株に対して５１２以上のＳＢＡ力価があった：Ｍ０１−０２４０３６４、ＮＧＰ１６５（ＥＴ３７）；Ｍ１２３９（系統３）；Ｍ０１−２４０３５５、Ｍ３３６９（その他）。これらの菌株は、血清群Ｂであり、カバーしているが、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５またはＹの菌株は試験しなかった。

タンパク質（Ａ）から（Ｃ）で見られるＳＢＡパターンが、タンパク質（Ｄ）から（Ｆ）でも見られた。菌株ＭＣ５８に対して、タンパク質（Ｄ）を用いて得られた血清と水酸化アルミニウムアジュバントは、１６３８４というＳＢＡ力価をもたらしたが、一方で、タンパク質（Ｅ）または（Ｆ）を用いて得られた血清と同じアジュバントとは、４より低いＳＢＡ力価をもたらした。菌株９６１−５９４５に対して、タンパク質（Ｄ）または（Ｆ）の血清は、（Ｅ）を用いて得られた力価よりも低い力価を生じた。菌株Ｍ１２３９に対しては、ＳＢＡ力価は、（Ｄ）＜４；（Ｅ）１２８；（Ｆ）１６３８４であった。

タンデムタンパク質によってＳＢＡの有効性が広がった。タンパク質（Ｇ）を用いて得られた血清は、菌株ＭＣ５８と９６１−５９４５に対する殺菌作用があり、また、ＮＭＢ１８７０の改変体１または改変体２を有する他の菌株も同様であった。タンパク質（Ｈ）に対する血清は、ＮＭＢ１８７０の改変体１を有する菌株に対しては低い力価しか与えなかったが、他の菌株、例えば、菌株９６１−５９４（改変体２）に対する１６３８４、および菌株Ｍ３３６９（改変体３）に対する３２７６８に対しては高い力価を与えた。

ＣＦＡアジュバント化タンパク質（Ｈ）で免疫して得られた血清は、ＬＮＰ１７０９４、９６２１７、９６１−５９４５、２９９６、５／９９（Ａ４群）；Ｃ４６７８、Ｍ０１−０２４０３６４、ＮＧＰ１６５（ＥＴ３７）；Ｍ１２３９（系統３）；Ｍ２５５２、ＢＺ２３２、Ｍ３２７９、Ｍ４２８７、１０００、ＮＧＨ３８、Ｃｌｌ、Ｍ０１−２４００１３、Ｍ０１−２４０３５５、Ｍ３３６９（その他）に対して５１２以上のＳＢＡ力価を与えた。これらの菌株は、血清群Ｂ、およびＣをカバーしているが、血清群Ａ、Ｗ１３５またはＹの菌株に対する活性はタンパク質（Ｈ）を用いて試験しなかった。

ＣＦＡアジュバントによるタンパク質（Ｉ）で免疫して得られた血清は、Ｍ０１−０２４０３６４、１４７８４、Ｍ６１９０、ＭＣ５８、ＬＰＮ１７５９２、Ｍ２１９７（ＥＴ３７）；４４／７６（ＥＴ５）；Ｍ１２３９、ＩＳＳ１１０２、ＩＳＳ１１０６、ＩＳＳ１０２６、３９４／９８（系統３）；Ｍ２９３７（その他）に対して５１２以上のＳＢＡ力価を与えた。これらの菌株は、血清群Ｂ、ＣおよびＷ１３５をカバーしているが、血清群Ａ、またはＹの菌株に対する活性はタンパク質（Ｉ）を用いて試験しなかった。

ＮＭＢ１８７０の改変体１を含むタンパク質によって免疫した後、改変体１のＮＭＢ１８７０をもつ、最大２０までの菌株に対して試験された血清は、以下のＳＢＡ力価を与えた。

ＮＭＢ１８７０の改変体２を含むタンパク質によって免疫した後、改変体２のＮＭＢ１８７０をもつ、最大２０までの菌株に対して試験された血清は、以下のＳＢＡ力価を与えた。

ＮＭＢ１８７０の改変体３を含むタンパク質によって免疫した後、改変体３のＮＭＢ１８７０をもつ、最大５までの菌株に対して試験された血清は、以下のＳＢＡ力価を与えた。

（結論）
まず、ＮＭＢ１８７０は、広範な免疫のために有用な抗原とは考えられない。その発現レベルは菌株間で変動し、顕著な配列多様性があり、また、異なった改変体との間で交差防御が起こらない。しかし、この抗原を非常に低いレベルでしか発現しない菌株でさえも、抗ＮＭＢ１８７０血清には感受性であることが明らかにされた。さらに、配列の多様性は、３種類の変異型に限られるため、多数の抗原を必要としないで広範な免疫を達成することができる。さらに、これら３つのタンパク質は、血清群Ｂの髄膜炎菌だけでなく、より多くの髄膜炎菌に対する免疫を提供できると考えられる。

１種類以上の改変体に対して活性のある単一のポリペプチド鎖をもたらすために、ＮＭＢ１８７０のさまざまな改変体を融合タンパク質として発現させることができる。

ＮＭＢ１８７０は、感染の過程では免疫原性であり、殺菌性抗体を誘導することができ、また、幼ラットを細菌による攻撃から保護することができる。

ＮＭＢ１８７０に関するさらなる実験情報は、参考文献１９７に記載されている。

以上の説明は本発明を例示するだけのものであり、本発明の範囲および精神を残したまま、各種の改変が行われ得る。

（配列表の簡単な説明）

（参考文献：これらの内容は、本明細書において全てを参考として援用される）

（配列表）

Claims (1)

1. 本明細書中に記載の発明。

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