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ES2699578T3 - Modificación direccionada del genoma de rata - Google Patents

Modificación direccionada del genoma de rata Download PDF

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ES2699578T3
ES2699578T3 ES14784879T ES14784879T ES2699578T3 ES 2699578 T3 ES2699578 T3 ES 2699578T3 ES 14784879 T ES14784879 T ES 14784879T ES 14784879 T ES14784879 T ES 14784879T ES 2699578 T3 ES2699578 T3 ES 2699578T3
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rat
locus
cell
acid sequence
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ES14784879T
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Jeffrey D Lee
Alexander Mujica
Wojtek Auerbach
Ka-Man Venus Lai
David M Valenzuela
George D Yancopoulos
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Regeneron Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals Inc
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Abstract

Un método para la modificación direccionada de un locus genómico de interés en una célula de rata pluripotente, que comprende: (a) introducir en la célula de rata pluripotente un vector objetivo grande (LTVEC) que comprende un ácido nucleico inserto flanqueado por un brazo de homología 5' complementario a una primera secuencia de ácidos nucleicos en el locus genómico de interés y un brazo de homología 3' complementario a una segunda secuencia de ácidos nucleicos en el locus genómico de interés, en donde la suma total de los brazos de homología 5' y 3' es al menos 10 kb; y (b) identificar una célula de rata pluripotente modificada genéticamente que comprende una modificación genética direccionada en el locus genómico de interés, en donde la modificación genética direccionada puede transmitirse a través de la línea germinal; en donde la célula de rata pluripotente que se usará para la modificación direccionada del locus genómico de interés se puede obtener mediante el cultivo de células madre embrionarias de rata aisladas en una capa de células alimentadoras que no está modificada para expresar el factor inhibidor de la leucemia (LIF) con un medio que comprende aproximadamente 50 U/mL hasta aproximadamente 150 U/mL LIF y una combinación de inhibidores que consiste en un inhibidor de la vía MEK y un inhibidor de GSK3; en donde la célula de rata pluripotente carece de expresión de c-Myc; en donde la célula de rata pluripotente forma colonias esféricas, de flotación libre en cultivo; y en donde la célula de rata pluripotente modificada tiene un cariotipo normal.

Description

DESCRIPCIÓN
Modificación direccionada del genoma de rata
Referencia a una lista de secuencias presentada como un archivo de texto a través de la web de EFS
La copia oficial de la lista de secuencias se envía electrónicamente a través de la web de EFS como una lista de secuencias en formato ASCII con un archivo llamado 444701SEQLIST.TXT, creado el 16 de abril de 2014 y con un tamaño de 15 kilobytes, y se presenta simultáneamente con la especificación.
Campo de la invención
Células madre totipotentes o pluripotentes no humanas aisladas, en particular células madre embrionarias de rata, que son capaces de mantener la pluripotencia después de una o más modificaciones genéticas en serie in vitro, y que son capaces de transmitir las modificaciones genéticas direccionadas a las generaciones siguientes a través de la línea germinal. Composiciones y métodos para modificar un locus de interés genómico de rata a través de recombinación homóloga bacteriana (BHR) en una célula procariota. Composiciones y métodos para modificar genéticamente un locus de interés genómico de rata utilizando un vector de direccionamiento grande (LTVEC) en combinación con endonucleasas. Composiciones y métodos para producir una rata modificada genéticamente que comprende una o más modificaciones genéticas específicas.
Antecedentes de la invención
En tanto que las ratas han sido consideradas como un importante sistema de modelo animal que puede recapitular la patología de varias enfermedades humanas, incluidas, entre otras, cardiovasculares (por ejemplo, hipertensión), metabólicas (por ejemplo, obesidad, diabetes), neurológicas (por ejemplo, patologías del dolor) y una variedad de cánceres, el uso de ratas en el modelado de enfermedades humanas ha sido limitado, en comparación con los ratones, debido en parte a la falta de disponibilidad de células pluripotentes transmisibles en la línea germinal, que puedan mantener su pluripotencia después de una serie de modificaciones genéticas in vitro, por ejemplo, una o más electroporaciones en serie, y debido en parte a la falta de tecnologías de direccionamiento eficientes que permitan la introducción o eliminación de grandes secuencias de ADN genómico, o el reemplazo de grandes secuencias de ADN genómico endógeno con secuencias de ácidos nucleicos exógenas en células de rata pluripotentes.
Existe una necesidad en la técnica de composiciones y métodos que permitan cambios direccionados precisos en el genoma de una rata, que puedan abrir o expandir áreas actuales de descubrimiento de dianas y validar agentes terapéuticos de forma más rápida y sencilla.
Resumen
En un aspecto, la invención es un método para la modificación direccionada de un locus genómico de interés en una célula pluripotente, que comprende (a) introducir en la célula de rata pluripotente un vector de direccionamiento grande (LTVEC) que comprende un ácido nucleico de inserto flanqueado por un brazo de homología 5' complementario a una primera secuencia de ácidos nucleicos en el locus genómico de interés y un brazo de homología 3' complementario a una segunda secuencia de ácidos nucleicos en el locus genómico de interés, en donde la suma total de los brazos de homología 5' y 3' es de al menos 10 kb; y (b) identificar una célula pluripotente modificada genéticamente que comprende la modificación genética direccionada en el locus genómico de interés, en donde la modificación genética direccionada puede transmitirse a través de la línea germinal, en donde la célula de rata pluripotente que se usa para la modificación direccionada del locus genómico se puede obtener mediante el cultivo de células madre embrionarias de rata aisladas en una capa de células alimentadoras que no están modificadas para expresar el factor inhibidor de la leucemia (LIF) con un medio que comprende de aproximadamente 50 U/mL a aproximadamente 150 U/mL de LIF y una combinación de inhibidores que consiste en un inhibidor de la ruta MEK y un inhibidor de GSK3; en donde la célula de rata pluripotente carece de expresión de c-Myc; en donde la célula de rata pluripotente forma colonias esféricas, de flotación libre en cultivo; y en donde la célula de rata pluripotente modificada tiene un cariotipo normal.
En una realización, la célula pluripotente se deriva de un animal no humano, un roedor, un humano, una rata, un ratón, un hámster, un conejo, un cerdo, un bovino, un ciervo, una oveja, una cabra, un pollo, un gato, un perro, un hurón, un primate (por ejemplo, un tití, mono rhesus), un mamífero domesticado o un mamífero de origen agropecuario, o cualquier otro organismo de interés.
En una realización, la célula pluripotente es una célula pluripotente no humana. En una realización, la célula pluripotente no humana es una célula pluripotente de mamífero. En una realización, la célula pluripotente de mamífero es una célula pluripotente de roedor. En una realización, la célula pluripotente de roedor es una célula pluripotente de rata o ratón. En una realización, la célula pluripotente es una célula madre pluripotente inducida (iPS) humana.
En un ejemplo, la célula pluripotente es un óvulo fertilizado no humano en la etapa de célula única. En un ejemplo, el óvulo fertilizado no humano es un óvulo fertilizado de mamífero. En un ejemplo, el óvulo fertilizado de mamífero es un óvulo fertilizado de roedor en la etapa de una única célula. En un ejemplo, el óvulo fertilizado de mamífero es un óvulo fertilizado de ratón en la etapa de una única célula. En una realización, el óvulo fertilizado de mamífero es un óvulo fertilizado de rata en la etapa de célula única.
En algunas realizaciones, la suma total de los brazos de homología 5' y 3' de LTVEC es al menos 10 kb. En algunas realizaciones, la suma total de los brazos de homología 5' y 3' de LTVEC es de al menos 10 kb, pero menos de 100 kb o la suma total de los brazos de homología 5' y 3' de LTVEC es de al menos 10 kb pero menos de 150kb. En otras realizaciones, el tamaño de la suma total del total de los brazos de homología 5' y 3' de LTVEC es de aproximadamente 10kb a aproximadamente 150kb, de aproximadamente 10 kb a aproximadamente 100kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 75kb, de 20 kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 20kb a aproximadamente 100kb, aproximadamente 20kb a aproximadamente 75 kb, aproximadamente 30 kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 30kb a aproximadamente 100kb, aproximadamente 30kb a aproximadamente 75 kb, aproximadamente 40kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 40kb a aproximadamente 100 kb, aproximadamente 40kb, aproximadamente 75kb, aproximadamente 50kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 50kb a aproximadamente 100kb, o aproximadamente 50 kb a aproximadamente 75kb, aproximadamente 10kb a aproximadamente 30kb, aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, aproximadamente 80kb, aproximadamente 100kb, aproximadamente 100kb a aproximadamente 120kb, o de aproximadamente 120kb a aproximadamente 150kb. En algunas realizaciones, (a) la suma total de los brazos de homología 5' y 3' del LTVEC es de aproximadamente 10 kb a aproximadamente 20 kb, de aproximadamente 20 kb a aproximadamente 40 kb, de aproximadamente 40 kb a aproximadamente 60 kb, de aproximadamente 60 kb a aproximadamente 80 kb, de aproximadamente 80 kb a aproximadamente 100 kb, de aproximadamente 100 kb a aproximadamente 120 kb, o desde aproximadamente 120 kb hasta aproximadamente 150 kb; o (b) la suma total de los brazos de homología 5' y 3' de LTVEC es de aproximadamente 16 kb a aproximadamente 150 kb. En una realización, el tamaño de la eliminación es el mismo o similar al tamaño de la suma total del homólogo 5' y 3' del LTVEC
En algunas de tales realizaciones, la modificación genética direccionada es bialélica.
En algunas realizaciones, la célula pluripotente es una célula de rata pluripotente. En una realización, la célula de rata pluripotente es una célula madre embrionaria de rata (ES). En una realización, la célula de rata pluripotente se deriva de una cepa DA o una cepa ACI. En algunas realizaciones, la célula de rata pluripotente se caracteriza por la expresión de al menos un marcador de pluripotencia seleccionado del grupo que consiste en Dnmt3L, Eras, Err-beta, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2 y Utf1. En algunos de estos métodos, la célula de rata pluripotente se caracteriza por una o más de las siguientes características: (a) derivada de una cepa DA o una cepa ACI; (b) falta de expresión de uno o más de los marcadores de pluripotencia que comprenden Ecat1 y Rexo1; (c) falta de expresión de uno o más de los marcadores mesodérmicos Brachyury y Bmpr2; (d) falta de expresión de uno o más de los marcadores endodérmicos Gata6, Sox17 y Sox7; y (e) falta de expresión de uno o más de los marcadores neuronales Nestin y Pax6. Tales métodos proporcionan que la suma total de los brazos de homología 5' y 3' del LTVEC es de aproximadamente 10kb a aproximadamente 30kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, de aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, de aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, o de aproximadamente 80kb a aproximadamente 100kb, de aproximadamente 100kb a aproximadamente 120kb, de aproximadamente 120kb a aproximadamente 150kb, o de aproximadamente 10 kb pero menos de aproximadamente 150kb. En algunas realizaciones, la suma total de los brazos de homología 5' y 3' de LTVEC es de aproximadamente 16 Kb a aproximadamente 100 Kb. En otras realizaciones, el tamaño de la suma total del total de los brazos de homología 5' y 3' de LTVEC es de aproximadamente 10kb a aproximadamente 150kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 100kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 75kb, de 20kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 20kb a aproximadamente 100kb, aproximadamente 20kb a aproximadamente 75kb, aproximadamente 30kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 30kb a aproximadamente 100kb, aproximadamente 30kb a aproximadamente 75kb, aproximadamente 40kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 40kb a aproximadamente 100kb, aproximadamente 40kb a aproximadamente 75kb, aproximadamente 50kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 50kb a aproximadamente 100kb, aproximadamente 50kb a aproximadamente 75kb, aproximadamente 10kb a aproximadamente 30kb, aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, aproximadamente 60kb, aproximadamente 80kb, aproximadamente 80kb a aproximadamente 100kb, aproximadamente 100kb a aproximadamente 120kb, o desde aproximadamente 120kb a aproximadamente 150kb. En una realización, el tamaño de la eliminación es el mismo o similar al tamaño de la suma total de los brazos de homología 5' y 3' del LTVEC. En algunas realizaciones, la concentración de LIF en el medio está entre aproximadamente 75 U/mL y aproximadamente 125 U/mL, preferiblemente entre aproximadamente 90 U/mL y aproximadamente 110 U/mL, y más preferiblemente aproximadamente 100 U/mL. En algunas realizaciones, el inhibidor de la ruta de MEK es el inhibidor de MEK PD0325901 y/o el inhibidor de GSK3 es CHIR99021. En algunas realizaciones, el inhibidor de la ruta de MEK es el inhibidor de m Ek PD0325901 a una concentración de 0.8 jM a 1.2 |jM, y el inhibidor de GSK3 es CHIR99021 a una concentración de 2.5 jM a 3.5 jM . En algunas realizaciones, la concentración de LIF en el medio es de aproximadamente 100 U/mL, el inhibidor de la vía MEK es el inhibidor de la MEK PD0325901 a una concentración de aproximadamente 1 jM y el inhibidor de GSK3 es CHIR99021 a una concentración de aproximadamente 3 jM . En algunas realizaciones, el medio comprende: medio basal DMEM/F12 a una concentración de 1x; medio neurobasal a una concentración de 1x; penicilina/estreptomicina a una concentración del 1%; L-glutamina a una concentración de 4 mM; 2-mercaptoetanol a una concentración de 0.1 mM; suplemento de N2 a una concentración de 1x; Suplemento B27 a una concentración 1x; LIF a una concentración de 100U/mL; PD0325901 a una concentración de 1 j M, y CHIR99021 a una concentración de 3 j M.
Los métodos además proporcionan que la modificación genética direccionada (a) comprende un reemplazo de una secuencia de ácidos nucleicos de rata endógena con una secuencia de ácidos nucleicos de mamífero homóloga u ortóloga; (b) comprende una eliminación de una secuencia endógena de ácido nucleico de rata; (c) comprende una eliminación de una secuencia endógena de ácido nucleico de rata, en donde la eliminación varía de aproximadamente 5kb a aproximadamente 10kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 20kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, de aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, de aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, de aproximadamente 80kb a aproximadamente 100kb, de aproximadamente 100kb a aproximadamente 150kb, o de aproximadamente 150kb a aproximadamente 200kb, de aproximadamente 200kb a aproximadamente 300kb, de aproximadamente 300kb a aproximadamente 400kb, de aproximadamente 400kb a aproximadamente 500kb, de aproximadamente 500kb a aproximadamente 1Mb, desde aproximadamente 1Mb hasta aproximadamente 1.5Mb, desde aproximadamente 1.5Mb hasta aproximadamente 2Mb, desde aproximadamente 2Mb hasta aproximadamente 2.5Mb, o desde aproximadamente 2.5Mb hasta aproximadamente 3Mb; (d) comprende una secuencia de ácidos nucleicos exógena que varía de aproximadamente 5kb a aproximadamente 10kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 20kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, de aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, de aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, de aproximadamente 80kb a aproximadamente 100kb, de aproximadamente 100kb a aproximadamente 150kb, de aproximadamente 150kb a aproximadamente 200kb, de aproximadamente 200kb a aproximadamente 250kb, de aproximadamente 250kb a aproximadamente 300kb, de aproximadamente 300kb a aproximadamente 350kb, o de aproximadamente 350kb a aproximadamente 400kb; (e) comprende una secuencia de ácidos nucleicos exógena que comprende una secuencia de ácidos nucleicos humana que es homóloga u ortóloga a una secuencia de ácidos nucleicos de rata endógena; (f) comprende una secuencia de ácidos nucleicos quimérica que comprende una secuencia de ácidos nucleicos humana y una secuencia de ácidos nucleicos de rata; (g) varía de aproximadamente 5kb a aproximadamente 10kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 20kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, de aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, de aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, de aproximadamente 80kb a aproximadamente 100kb, de aproximadamente 100kb a aproximadamente 150kb, de aproximadamente 150kb a aproximadamente 200kb, de aproximadamente 200kb a aproximadamente 250kb, de aproximadamente 250kb a aproximadamente 300kb, de aproximadamente 300kb a aproximadamente 350kb, o de aproximadamente 350kb a aproximadamente 400kb; (h) comprende un alelo condicional flanqueado por secuencias diana de recombinasa específicas del sitio; o, (i) comprende un gen informador unido operativamente a un promotor activo en una célula de rata.
Además, se proporciona un método para modificar un locus genómico de interés en una célula de rata pluripotente mediante modificación genética direccionada, en donde el locus genómico de interés comprende (i) una primera secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria al brazo de homología de rata 5'; y (ii) una segunda secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria al brazo de homología de rata 3'. En algunas de tales realizaciones, la primera y la segunda secuencia de ácidos nucleicos están separadas por al menos 5kb. En algunas realizaciones, la primera y la segunda secuencia de ácidos nucleicos están separadas por al menos 5kb, pero menos de 3Mb. En algunos de estos métodos, la primera y la segunda secuencia de ácidos nucleicos están separadas por al menos 5kb pero menos de 10kb, al menos 10kb pero menos de 20kb, al menos 20kb pero menos de 40kb, al menos 40kb pero menos de 60kb, al menos 60kb pero menos de 80kb, al menos aproximadamente 80kb pero menos de 100kb, al menos 100kb pero menos de 150kb, o al menos 150kb pero menos de 200kb, al menos aproximadamente 200kb pero menos de aproximadamente 300kb, al menos aproximadamente 300kb pero menos de aproximadamente 400kb, al menos aproximadamente 400kb pero menos de aproximadamente 500kb, al menos aproximadamente 500kb pero menos de aproximadamente 1Mb, al menos aproximadamente 1Mb pero menos de aproximadamente 1.5Mb, al menos aproximadamente 1.5Mb pero menos de aproximadamente 2Mb, al menos aproximadamente 2Mb pero menos de aproximadamente 2.5Mb, al menos aproximadamente 2.5Mb, pero menos de aproximadamente 3Mb, al menos aproximadamente 1Mb pero menos de aproximadamente 2 Mb, al menos aproximadamente 2Mb pero menos de aproximadamente 3Mb.
En algunas realizaciones, la etapa de introducción (a) comprende además la introducción de un ácido nucleico que codifica un agente de nucleasa que promueve una recombinación homóloga entre el LTVEC y el locus genómico de interés en la célula de rata pluripotente. En algunas de tales realizaciones, el agente de nucleasa comprende (a) nucleasa de dedo de zinc; o, (b) una nucleasa de efector de tipo activador de transcripción (TALEN). En algunas realizaciones, el agente de nucleasa comprende un sistema CRISPR/Cas que comprende una nucleasa Cas9 y un ARN guía (ARNg) que comprende un ARNcr-ARNtracr fusionado.
En algunos métodos, la etapa de introducción comprende además la introducción en la célula de rata pluripotente: (i) un primer constructo de expresión que comprende un primer promotor unido operativamente a una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína (Cas) asociada a Repeticiones Palindrómicas Cortas Regularmente Interespaciadas Agrupada (CRISPR), (ii) un segundo constructo de expresión que comprende un segundo promotor unido operativamente a una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia diana genómica unida operativamente a un ARN guía (ARNg), en donde la secuencia diana genómica está inmediatamente flanqueada en el extremo 3' por una secuencia Protospacer Adyac Motif (PAM). En una realización, el locus genómico de interés comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. En una realización, el ARNg comprende una tercera secuencia de ácidos nucleicos que codifica un ARN (ARNcr) de Repeticiones Palindrómicas Cortas Regularmente Interespaciadas Agrupadas (CRISPR) y un ARN CRISPR de transactivación del (ARNtracr). En otra realización, el genoma de la célula de rata pluripotente comprende una región de ADN diana complementaria a la secuencia diana genómica. En algunos de estos métodos, la proteína Cas es Cas9. En algunos de estos métodos, el ARNg comprende (i) el ARN quimérico de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 2; o, (ii) el ARN quimérico de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 3. En algunos de estos métodos, el ARNcr comprende la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6. En los métodos, el ARNtracr comprende la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, la etapa de identificación emplea un ensayo cuantitativo para evaluar una modificación del alelo (MOA) en el locus genómico de interés. En algunas realizaciones, el locus genómico diana es un locus gamma del receptor de interleucina-2, un locus ApoE, un locus Rag1, un locus Rag2 o un locus Rag2/Rag1.
En algunas realizaciones, la modificación genómica direccionada comprende (i) la inserción de una secuencia de ácidos nucleicos humana homóloga u ortóloga; (ii) reemplazo de la secuencia de ácidos nucleicos de rata en el locus genómico endógeno con la secuencia de ácidos nucleicos humana homóloga u ortóloga; (iii) una secuencia de ácidos nucleicos quimérica que comprende una secuencia de ácidos nucleicos humana y una secuencia de ácidos nucleicos de rata; o (iv) una combinación de los mismos. En algunos de estos locus genómicos de rata, el tamaño de la inserción o reemplazo es de aproximadamente 5kb a aproximadamente 400kb. En algunos de estos locus genómicos de rata, el tamaño de la inserción o reemplazo es de aproximadamente 5kb a aproximadamente 10kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 20kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, de aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, de aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, de aproximadamente 80kb a aproximadamente 100kb, de aproximadamente 100kb a aproximadamente 150kb, de aproximadamente 150kb a aproximadamente 200kb, de aproximadamente 200kb a aproximadamente 250kb, de aproximadamente 250kb a aproximadamente 300kb, de aproximadamente 300kb a aproximadamente 350kb o de aproximadamente 350kb a aproximadamente 400kb. En algunos de estos locus genómicos de rata, el tamaño de la inserción o reemplazo es de al menos unos 200kb, pero menos de unos 300kb, al menos de unos 300kb pero menos de unos 400kb.
Se proporciona además un método para la modificación direccionada de un locus genómico de interés en una célula de rata pluripotente, que comprende: (a) dirigirse a un locus genómico de interés en una célula de rata pluripotente según el método de la invención para formar una célula de rata pluripotente modificada genéticamente, en donde el inserto de ácido nucleico comprende un ácido nucleico humano; y (b) introducción de la célula de rata pluripotente modificada genéticamente en un embrión de rata huésped. Esta descripción también describe (c) la gestación del embrión de rata huésped en una madre sustituta; en donde la madre sustituta produce una progenie de rata que comprende, un locus genómico modificado que comprende: (i) una inserción de una secuencia de ácidos nucleicos humana; (ii) una sustitución de la secuencia de ácidos nucleicos de rata en el locus genómico de interés con una secuencia de ácidos nucleicos humana homóloga u ortóloga; (iii) una secuencia de ácidos nucleicos quimérica que comprende una secuencia de ácidos nucleicos humana y una de rata; o (iv) una combinación de los mismos, en donde el locus genómico modificado puede transmitirse a través de la línea germinal.
En algunos de estos métodos, el constructo de direccionamiento es un vector de direccionamiento grande (LTVEC), y la suma total de los brazos de homología 5' y 3' del LTVEC es al menos 10 kb pero menor que 100kb o la suma total del 5' los brazos de homología 3' de LTVEC son al menos 10 kb pero menos de 150 kb. En algunos de estos métodos, la suma total de los brazos de homología 5' y 3' del constructo de orientación es de aproximadamente 10kb a aproximadamente 30kb, de aproximadamente 20kb a 40kb, de aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, de aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, desde aproximadamente 80kb hasta aproximadamente 100kb, desde aproximadamente 100kb hasta aproximadamente 120kb, o desde aproximadamente 120kb hasta aproximadamente 150kb. En algunos de estos métodos, la secuencia del ácido nucleico humano es de al menos 5kb pero menos de 400kb. En algunos de estos métodos, la secuencia de ácidos nucleicos humana es al menos 5kb pero menos de 10kb, al menos 10kb pero menos de 20kb, al menos 20kb pero menos de 40kb, al menos 40kb pero menos de 60kb, al menos 60kb pero menos de 80kb , al menos aproximadamente 80kb pero menos de 100kb, al menos 100kb pero menos de 150kb, al menos 150kb pero menos de 200kb, al menos 200kb pero menos de 250kb, al menos 250kb pero menos de 300kb, al menos 300kb pero menos de 350kb, o al menos 350kb pero menos de 400kb. En otras realizaciones, el tamaño de la suma total del total de los brazos de homología 5' y 3' de LTVEC es de aproximadamente 10kb a aproximadamente 150kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 100kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 75kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 20kb a aproximadamente 100kb, aproximadamente 20kb a aproximadamente 75kb, aproximadamente 30kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 30kb a aproximadamente 100kb, aproximadamente 30kb a aproximadamente 75kb, aproximadamente 40kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 40kb a aproximadamente 100kb, aproximadamente 40kb, a aproximadamente 75kb, aproximadamente 50kb a aproximadamente 150 kb, aproximadamente 50 kb a aproximadamente 100 kb, aproximadamente 50 kb a aproximadamente 75 kb, aproximadamente 10 kb a aproximadamente 30 kb, aproximadamente 20 kb a aproximadamente 40 kb, aproximadamente 40 kb a aproximadamente 60 kb, aproximadamente 60 kb a aproximadamente 80 kb, aproximadamente 80 kb, aproximadamente 100 kb, aproximadamente 100 kb a aproximadamente 120kb, o de aproximadamente 120kb a aproximadamente 150kb. En un ejemplo, el tamaño de la eliminación es el mismo o similar al tamaño de la suma total de los brazos de homología 5' y 3' del LTVEC.
La descripción también se refiere a métodos para hacer una rata humanizada, la célula pluripotente de rata es una célula madre embrionaria de rata (ES). En algunos de estos métodos, la célula de rata pluripotente se deriva de una cepa DA o una cepa ACI. En algunos de estos métodos, la célula de rata pluripotente se caracteriza por la expresión de al menos un marcador de pluripotencia que comprende Dnmt3L, Eras, Err-beta, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF receptor, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1, y/o una combinación de los mismos. En algunos de estos métodos, la célula de rata pluripotente se caracteriza por una o más de las siguientes características: (a) falta de expresión de uno o más marcadores de pluripotencia que comprenden c-Myc, Ecat1 y/o Rexo1; (b) falta de expresión de uno o más marcadores mesodérmicos que comprenden Brachyury y/o Bmpr2; (c) falta de expresión de uno o más marcadores endodérmicos que comprenden Gata6, Sox17 y/o Sox7; o (d) falta de expresión de uno o más marcadores neuronales que comprenden Nestina y/o Pax6.
Se proporciona además una rata modificada genéticamente que comprende un locus genómico humanizado, en donde la rata modificada genéticamente comprende: (i) una inserción de una secuencia de ácidos nucleicos humana homóloga u ortóloga; (ii) un reemplazo de una secuencia de ácidos nucleicos de rata con una secuencia de ácidos nucleicos humana homóloga u ortóloga en un locus genómico endógeno con una secuencia de ácidos nucleicos humana homóloga u ortóloga; (iii) una secuencia de ácidos nucleicos quimérica que comprende una secuencia de ácidos nucleicos humana y una de rata; o, (iv) una combinación de los mismos, en donde el locus genómico humanizado es capaz de ser transmitido a través de la línea germinal. En algunas de tales ratas modificadas genéticamente, el locus genómico humanizado comprende una secuencia de ácidos nucleicos quimérica que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de rata y humana.
También se divulgan métodos para modificar un locus genómico diana de una rata a través de recombinación homóloga bacteriana (BHR) y comprenden: la introducción en una célula procariota de un vector de direccionamiento grande (LTVEC) que comprende un ácido nucleico de inserción flanqueado con un brazo de homología de rata 5' y el brazo de homología de rata 3', en donde la célula procariota comprende un ácido nucleico de rata y es capaz de expresar una recombinasa que media el BHR en el locus diana, y en donde la suma total de los brazos de homología 5' y 3 'de LTVEC está en menos 10kb pero menos de 100kb o la suma total de los brazos de homología 5' y 3' de LTVEC es al menos 10 kb pero menos de 150kb. En otros ejemplos, el tamaño de la suma total del total de los brazos de homología 5' y 3' de LTVEC es de aproximadamente 10kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 10kb a aproximadamente 100kb, aproximadamente 10kb a aproximadamente 75kb, aproximadamente 20kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 20kb a aproximadamente 100kb, aproximadamente 20kb a aproximadamente 75kb, aproximadamente 30kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 30kb a aproximadamente 100kb, aproximadamente 30kb a aproximadamente 75kb, aproximadamente 40kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 40kb a aproximadamente 100kb, aproximadamente 40kb, aproximadamente 75kb, aproximadamente 50kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 50kb a aproximadamente 100kb, o aproximadamente 50kb a aproximadamente 75kb, aproximadamente 10kb a aproximadamente 30kb, aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, aproximadamente 80kb, aproximadamente 100kb, aproximadamente 100kb a aproximadamente 120kb, o desde aproximadamente 120kb hasta aproximadamente 150kb. En un ejemplo, el tamaño de la eliminación es el mismo o similar al tamaño de la suma total de los brazos de homología 5' y 3' del LTVEC.
En algunos de tales métodos, el locus diana del ácido nucleico de rata comprende una primera secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria al brazo de homología 5' y una segunda secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria al brazo de homología 3'. En algunos de estos métodos, la primera y la segunda secuencia de ácidos nucleicos están separadas por al menos 5kb pero menos de 10kb, al menos 10kb pero menos de 20kb, al menos 20kb pero menos de 40kb, al menos 40kb pero menos de 60kb, al menos 60kb pero menos de 80kb, al menos aproximadamente 80kb pero menos de 100kb, al menos 100kb pero menos de 150kb, o al menos 150kb pero menos de 200kb, al menos aproximadamente 200kb pero menos de aproximadamente 300kb, al menos aproximadamente 300kb pero menos de aproximadamente 400kb, al menos unos 400kb pero menos de unos 500 kb, al menos unos 500kb pero menos de aproximadamente 1Mb, al menos aproximadamente 11Mb pero menos de aproximadamente 2Mb, al menos aproximadamente 2Mb pero menos de aproximadamente 3Mb.
En algunos de estos métodos, la introducción del vector de direccionamiento en la célula procariota conduce a: (i) una eliminación de una secuencia endógena de ácido nucleico de rata del locus genómico diana; (ii) una adición de una secuencia de ácidos nucleicos exógena en el locus genómico diana; (iii) un reemplazo de la secuencia endógena de ácido nucleico de rata con la secuencia de ácidos nucleicos exógena en el locus diana; o (iv) una combinación de los mismos. En algunos de estos métodos, el ácido nucleico insertado comprende (a) un polinucleótido que es homólogo u ortólogo a la secuencia de ácidos nucleicos de rata en el locus genómico diana; o (b) un alelo condicional flanqueado con secuencias de reconocimiento de recombinación específicas del sitio.
La divulgación también se refiere a una célula procariota huésped que comprende un vector de direccionamiento que comprende un ácido nucleico de inserción flanqueado con un brazo de homología de rata 5' y un brazo de homología de rata 3', en donde el ácido nucleico de inserción varía de aproximadamente 5k a aproximadamente 400 kb. En algunas células procariotas huésped, el tamaño del ácido nucleico insertado es de aproximadamente 5kb a aproximadamente 10kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 20kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, de aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, de aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, de aproximadamente 80kb a aproximadamente 100kb, desde aproximadamente 100kb a aproximadamente 150kb, desde aproximadamente 150kb a aproximadamente 200kb, desde aproximadamente 200kb a aproximadamente 250kb, desde aproximadamente 250kb a aproximadamente 300kb, desde aproximadamente 300kb a aproximadamente 350kb, o desde 350kb a aproximadamente 400kb. En algunas células procariotas huésped, la célula procariota comprende un gen de recombinasa unido operativamente a un promotor constitutivamente activo o un promotor inducible.
La divulgación también se refiere a métodos para modificar un locus genómico de interés en una célula mediante modificación genética direccionada que comprende la introducción en la célula.
(a) un vector de direccionamiento grande (LTVEC) que comprende un inserto de ácido nucleico flanqueado con un brazo de homología 5' y un brazo de homología 3', en donde la suma total de los brazos de homología 5' y 3' del LTVEC es al menos 10kb; y
(b) (i) un primer constructo de expresión que comprende un primer promotor unido operativamente a una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína (Cas) asociada a Repeticiones Palindrómicas Cortas Regularmente Interespaciadas Aglomeradas (CRISpR), (ii) un segundo constructo de expresión que comprende un segundo promotor unido operativamente a una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia diana genómica operativamente unida a un ARN guía (ARNg); e identificar una célula pluripotente genéticamente modificada que comprende la modificación genética direccionada en el locus genómico de interés.
En una realización, el locus genómico de interés comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1, en donde el ARNg comprende una tercera secuencia de ácidos nucleicos que codifica un ARN (ARNcr) de Repeticiones Palindrómicas Cortas Regularmente Interespaciadas Aglomeradas (CRISPR) y una transactivación del ARN CRISPR (ARNtracr), y en donde el genoma de la célula comprende una región de ADN diana complementaria a la secuencia diana genómica. En algunos de estos métodos, la proteína Cas es Cas9. En tales métodos, la célula puede ser una célula pluripotente (como una célula madre embrionaria) o una célula procariota. En un ejemplo, la célula pluripotente es de un animal no humano, un mamífero no humano, un roedor, un humano, una rata, un ratón, un hámster, un conejo, un cerdo, un bovino, un ciervo, una oveja, una cabra, un pollo, un gato, un perro, un hurón, un primate (por ejemplo, un tití, un mono rhesus), un mamífero domesticado o un mamífero de origen agropecuario o cualquier otro organismo de interés. En otro ejemplo, la célula procariota es de bacterias, como E. coli.
En otras realizaciones, el tamaño de la suma total del total de los brazos de homología 5' y 3' de LTVEC es de aproximadamente 10kb a aproximadamente 150kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 100kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 75kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 20kb a aproximadamente 100kb , aproximadamente 20kb a aproximadamente 75kb, aproximadamente 30kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 30kb a aproximadamente 100kb, aproximadamente 30kb a aproximadamente 75kb, aproximadamente 40kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 40kb a aproximadamente 100kb, aproximadamente 40kb a aproximadamente 75kb, aproximadamente a aproximadamente 150kb, aproximadamente 50kb a aproximadamente 100kb, o aproximadamente 50kb a aproximadamente 75kb, aproximadamente 10kb a aproximadamente 30kb, aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, aproximadamente 80kb a aproximadamente 100kb, aproximadamente 100kb a aproximadamente 120kb, o desde aproximadamente 120kb a aproximadamente 150kb. En una realización, el tamaño de la eliminación es el mismo o similar al tamaño de la suma total de los brazos de homología 5' y 3' del LTVEC.
En un ejemplo, la célula pluripotente es una célula pluripotente no humana. En un ejemplo, la célula pluripotente no humana es una célula pluripotente de mamífero. En un ejemplo, la célula pluripotente de mamífero es una célula pluripotente de roedor. En un ejemplo, la célula pluripotente de roedor es una célula pluripotente de rata o ratón. En un ejemplo, la célula pluripotente es una célula madre pluripotente inducida humana (iPS).
En un ejemplo, la célula pluripotente es un óvulo fertilizado no humano en la etapa de célula única. En un ejemplo, el óvulo fertilizado no humano es un óvulo fertilizado de mamífero. En un ejemplo, el óvulo fertilizado de mamífero es un óvulo fertilizado de roedor en la etapa de una única célula. En un ejemplo, el óvulo fertilizado de mamífero es un óvulo fertilizado de rata o ratón en la etapa de una única célula.
La divulgación también se refiere a una rata o célula de rata que comprende una modificación genética direccionada en su locus genómico, en donde el locus genómico es un locus gamma del receptor de interleucina-2, un locus ApoE, un locus Rag1, un locus Rag2, o Locus Rag2/Rag1, en donde la modificación genética direccionada comprende: (a) una eliminación de una secuencia endógena de ácido nucleico de rata en el locus genómico; (b) una inserción de un ácido nucleico homólogo, un ácido nucleico ortólogo o un ácido nucleico quimérico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de rata y humano; o (c) una combinación de los mismos. En tal rata o célula de rata, la modificación genética direccionada es transmisible a través de la línea germinal de la rata o una rata propagada desde la célula de rata.
En algunas de tales ratas o células de rata, la eliminación del ácido nucleico de rata endógeno en el locus genómico es de al menos aproximadamente 10kb, o la inserción de la secuencia de ácidos nucleicos exógena en el locus genómico es de al menos aproximadamente 5 kb.
Además, se describe a una rata o célula de rata, en donde (a) la modificación genética direccionada en el locus gamma del receptor de interleucina-2 da como resultado una disminución o ausencia de la actividad de la proteína gamma del receptor de interleucina-2; (b) la modificación genética direccionada en el locus ApoE produce una disminución o ausencia de la actividad de la proteína ApoE; (c) la modificación genética direccionada en el locus Rag1 produce una disminución o ausencia de la actividad de la proteína Rag1; (d) la modificación genética direccionada en el locus Rag2 da como resultado una disminución o ausencia de la actividad de la proteína Rag2; o, (e) la modificación genética direccionada en el locus Rag2/Rag1 produce una disminución o ausencia de la actividad de la proteína Rag2 y la actividad de Rag1.
En algunos ejemplos, la modificación genética direccionada del locus gamma del receptor de interleucina-2 comprende: (a) una eliminación de la región codificante gamma del receptor de interleucina-2 de rata completa o una porción de la misma; (b) un reemplazo de la región codificante gamma del receptor de interleucina-2 de rata completa 0 una porción de la misma con una región codificadora gamma del receptor de interleucina-2 humana o una porción de la misma; (c) un reemplazo de un ectodominio de la región codificante gamma del receptor de interleucina-2 de rata con el ectodominio de un receptor gamma de interleucina-2 humano; o, (d) al menos una eliminación de 3 kb del locus gamma del receptor de interleucina-2. En otras ratas o células de rata similares, la modificación genética direccionada del locus ApoE comprende: (a) una eliminación de la región codificante de ApoE completa o una porción de la misma; o, (b) al menos una eliminación de 1.8 kb del locus ApoE que comprende la región de codificación ApoE.
Además, se describe a una rata o célula de rata, en donde la modificación genética direccionada del locus Rag2 comprende: (a) una eliminación de toda la región codificante de Rag2 o una parte de la misma; o (b) al menos una eliminación de 5.7 kb del locus Rag2 que comprende la región codificante de Rag2. En algunos ejemplos, la modificación genética direccionada del locus Rag2/Rag1 comprende: (a) una eliminación de la región codificante de Rag2 completa o una parte de la misma y una eliminación de la región codificante de Rag1 completa o una porción de la misma; o, (b) una eliminación de al menos 16 kb del locus Rag2/Rag1 que comprende la región de codificación Rag2.
Se divulga además una rata o célula de rata, en donde la modificación genética direccionada comprende una inserción de un casete de expresión que comprende un marcador selectivo en el locus gamma del receptor de interleucina-2, el locus ApoE, el locus Rag1, el locus Rag2 o el locus Rag2/Rag1. En algunas de tales ratas o células de rata, el casete de expresión comprende un gen lacZ unido operativamente al promotor endógeno en el locus genómico y un promotor de ubiquitina humana unido operativamente a un marcador selectivo.
Se divulga además una rata o célula de rata, en donde la modificación genética direccionada en el locus gamma del receptor de interleucina 2, el locus ApoE, el locus Rag1, el locus Rag2 o el locus Rag2/Rag1 comprende la inserción de un casete de selección autoeliminable. En algunas de tales ratas o células de rata, el casete de selección que se elimina automáticamente comprende un gen marcador selectivo unido operativamente a un promotor activo en la célula de rata y un gen de recombinasa unido operativamente a un promotor específico de células germinales masculinas, en donde el casete autoeliminable está flanqueado por sitios de reconocimiento de recombinación reconocidos por la recombinasa. En algunas de estas ratas o células de rata, el promotor específico de células germinales masculinas es un promotor de protamina-1; el gen de recombinasa codifica Cre, y los sitios de reconocimiento de recombinación son sitios loxP. En un ejemplo, el promotor Protamina-1 es un promotor Protamina-1 de ratón o de rata.
Además, se describe una rata o célula de rata, en donde la inserción de la secuencia de ácidos nucleicos exógena en el locus genómico comprende un ácido nucleico informador unido operativamente a un promotor gamma receptor de Interleucina-2 endógeno, un promotor ApoE endógeno, un promotor Rag1 endógeno, o un promotor Rag2 endógeno. En algunas de esas ratas o células de rata, el ácido nucleico informador codifica un indicador que comprende pgalactosidasa, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP), Emerald, proteína fluorescente verde mejorada (EGFP), CyPet, proteína fluorescente cian (CFP), Cerulean, T- Sapphire, luciferasa, fosfatasa alcalina o una combinación de los mismos.
Además, se describe una célula de rata, en donde la célula de rata es una célula de rata pluripotente o una célula madre embrionaria de rata (ES). En algunas de estas células de rata, la célula pluripotente de rata o la célula madre embrionaria de rata (ES) se deriva de una cepa DA o una cepa ACI; (b) se caracteriza por la expresión de al menos un marcador de pluripotencia que comprende Dnmt3L, Eras, Err-beta, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, receptor LIF, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1, o una combinación de los mismos; o (c) se caracteriza por una o más de las siguientes características: (i) falta de expresión de uno o más marcadores de pluripotencia que comprenden c-Myc, Ecat1 y Rexo1; (ii) falta de expresión de marcadores mesodérmicos que comprenden Brachyury y Bmpr2; (iii) falta de expresión de uno o más marcadores endodérmicos que comprenden Gata6, Sox17 y Sox7; o (iv) falta de expresión de uno o más marcadores neuronales que comprenden Nestin y Pax6.
La divulgación también se refiere a un método para modificar un locus genómico diana en un locus gamma del receptor de interleucina-2, un locus ApoE, un locus Rag1, un locus Rag2 o un locus Rag2/Rag1 en una célula de rata pluripotente comprendiendo el método: a) introducir en la célula de rata pluripotente un vector de direccionamiento que comprende un ácido nucleico de inserción flanqueado con brazos de homología de rata 5' y 3' homólogos al locus genómico diana; y (b) identificar una célula de rata pluripotente modificada genéticamente que comprende una modificación genética direccionada en el locus genómico diana, en donde la modificación genética direccionada puede ser transmitida a través de la línea germinal de una rata propagada desde la célula de rata pluripotente. En algunos de estos métodos, el vector de direccionamiento es un vector de direccionamiento grande (LTVEC), en donde la suma total de los brazos de homología de rata 5' y 3' es de al menos aproximadamente 10kb. En algunas realizaciones, la suma total de los brazos de homología de rata 5' y 3' es al menos 10kb pero menos de 150kb. En algunas realizaciones, la suma total de los brazos de homología de rata 5' y 3' es al menos aproximadamente 10kb pero menor que aproximadamente 100kb. En algunas realizaciones, la introducción del vector de direccionamiento en la célula de rata pluripotente conduce a: (i) una eliminación de una secuencia de ácidos nucleicos de rata endógena en el locus genómico diana; (ii) una inserción de una secuencia de ácidos nucleicos exógena en el locus genómico diana; o (iii) una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, la eliminación del ácido nucleico de rata endógeno en el locus genómico es de al menos aproximadamente 10 kb; la eliminación de una secuencia endógena de ácido nucleico de rata en el locus genómico varía de aproximadamente 5kb a aproximadamente 10kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 20kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, de aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, de aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, de aproximadamente 80kb a aproximadamente 100kb, desde aproximadamente 100kb a aproximadamente 150kb, o desde aproximadamente 150kb a aproximadamente 200kb, desde aproximadamente 200kb a aproximadamente 300kb, desde aproximadamente 300kb a aproximadamente 400kb, desde aproximadamente 400kb a aproximadamente 500kb, desde aproximadamente 500kb a aproximadamente 1Mb, desde aproximadamente 1Mb a aproximadamente 1.5Mb, desde aproximadamente 1.5Mb a aproximadamente 2Mb, desde aproximadamente 2Mb a aproximadamente 2.5Mb, o desde aproximadamente 2.5Mb a aproximadamente 3Mb; la inserción de una secuencia de ácidos nucleicos exógena en el locus genómico es de al menos aproximadamente 5 kb; o la inserción de una secuencia de ácidos nucleicos exógena varía de aproximadamente 5kb a aproximadamente 10kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 20kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, de aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, de aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, de aproximadamente 80kb a aproximadamente 100kb, de aproximadamente 100kb a aproximadamente 150kb, de aproximadamente 150kb a aproximadamente 200kb, de aproximadamente 200kb a aproximadamente 250kb, de aproximadamente 250kb a aproximadamente 300kb, de aproximadamente 300kb a aproximadamente 350kb, o de aproximadamente 350kb a aproximadamente 400kb.
En algunas realizaciones, (a) la modificación genética direccionada en el locus gamma del receptor de Interleucina-2 da como resultado una disminución o ausencia de la actividad de la proteína gamma del receptor de Interleucina-2; (b) la modificación genética direccionada en el locus ApoE produce una disminución o ausencia de la actividad de la proteína ApoE; (c) la modificación genética direccionada en el locus Rag1 produce una disminución o ausencia de la actividad de la proteína Rag1; (d) la modificación genética direccionada en el locus Rag2 da como resultado una disminución o ausencia de la actividad de la proteína Rag2; o, (e) la modificación genética direccionada en el locus Rag2/Rag1 produce una disminución o ausencia de la actividad de la proteína Rag2 y la actividad de la proteína Rag1.
En algunas realizaciones, la modificación genética direccionada en el locus gamma del receptor de interleucina-2 comprende (a) una eliminación de la región codificante gamma del receptor de interleucina-2 de rata completa o una porción de la misma; (b) un reemplazo de la región codificante gamma del receptor de interleucina-2 de rata completa o una porción de la misma con una región codificadora gamma del receptor de interleucina-2 humana o una porción de la misma; (c) un reemplazo de un ectodominio de la región codificante gamma del receptor de interleucina-2 de rata con el ectodominio de un gamma del receptor de interleucina-2 humano; o, (d) al menos una eliminación de 3 kb del locus gamma del receptor de Interleucina-2 que comprende la región codificadora gamma del receptor de Interleucina-2.
En algunas realizaciones, la modificación genética direccionada en el locus ApoE comprende: (a) una eliminación de la región codificante de ApoE completa o una parte de la misma; o, (b) al menos una eliminación de 1.8 kb del locus ApoE que comprende la región de codificación ApoE.
En algunas realizaciones, la modificación genética direccionada en el locus Rag2 comprende: (a) una eliminación de la región codificante de Rag2 completa o una parte de la misma; o, (b) al menos una eliminación de 5.7 kb del locus Rag2 que comprende la región de codificación Rag2. En otros métodos, la modificación genética direccionada del locus Rag1/Rag2 comprende: (a) una eliminación de la región codificante de Rag2 completa o una porción de la misma y una eliminación de la región codificante de Rag1 completa o una porción de la misma; o, (b) una eliminación de al menos 16 kb del locus Rag2/Rag1 que comprende las regiones codificantes Rag2 y Rag1.
En algunas de dichas realizaciones para modificar un locus genómico diana, el ácido nucleico de inserción comprende un casete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un marcador selectivo. En algunas de tales realizaciones, el casete de expresión comprende un gen lacZ unido operativamente a un promotor endógeno en el locus genómico y un promotor de ubiquitina humana unido operativamente a un gen marcador selectivo.
En algunas realizaciones, el inserto de ácido nucleico comprende un casete de selección autoeliminable. En algunas de tales realizaciones, el casete de selección autoeliminable comprende un marcador selectivo unido operativamente a un promotor activo en la célula pluripotente de rata y un polinucleótido que codifica una recombinasa unida operativamente a un promotor específico de células germinales masculinas, en donde el casete autoeliminable es flanqueado por sitios de reconocimiento de recombinación reconocidos por la recombinasa. En algunas de tales realizaciones, el promotor específico de células germinales masculinas es un promotor de protamina-1; o, el gen de recombinasa codifica Cre y los sitios de reconocimiento de recombinación son sitios loxP. En algunas realizaciones, el promotor Protamina-1 es un ratón o un promotor Protamina-1 de rata.
En otros métodos, la inserción de la secuencia de ácidos nucleicos exógena en el locus genómico comprende una secuencia de ácidos nucleicos informadora operativamente unida al promotor gamma del receptor de Interleucina-2 endógeno, el promotor ApoE endógeno, el promotor Rag1 endógeno o el promotor Rag2 endógeno. En algunas de tales realizaciones, la secuencia de ácidos nucleicos informadora codifica un informador que comprende pgalactosidasa, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP), Emerald, proteína verde fluorescente mejorada (EGFP), CyPet, proteína fluorescente cian (CFP), Emerald, T-Sapphire, luciferasa, fosfatasa alcalina o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones para modificar un locus genómico diana, la célula pluripotente de rata es una célula madre embrionaria de rata (ES). En algunas de tales realizaciones, la célula de rata pluripotente (a) se deriva de una cepa DA o una cepa ACI; (b) se caracteriza por la expresión de un marcador de pluripotencia que comprende Oct-4, Sox-2, fosfatasa alcalina o una combinación de los mismos; o, (c) se caracteriza por una o más de las siguientes características: (i) falta de expresión de uno o más marcadores de pluripotencia que comprenden c-Myc, Ecatl y Rexol; (ii) falta de expresión de marcadores mesodérmicos que comprenden Brachyury y Bmpr2; (iii) falta de expresión de uno o más marcadores endodérmicos que comprenden Gata6, Sox17 y Sox7; o (iv) falta de expresión de uno o más marcadores neuronales que comprenden Nestin y Pax6.
En algunas realizaciones, el método comprende además identificar la modificación genética direccionada en el locus genómico diana, en donde la etapa de identificación emplea un ensayo cuantitativo para evaluar una modificación del alelo (MOA) en el locus genómico diana.
En algunas realizaciones, la etapa de introducción comprende además la introducción de un segundo ácido nucleico que codifica un agente de nucleasa que promueve una recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus genómico diana en la célula de rata pluripotente. En algunas de tales realizaciones, el agente de nucleasa comprende una proteína quimérica que comprende un dominio de unión a ADN basado en dedos de zinc fusionado a una endonucleasa FokI. Algunos de estos métodos resultan en una modificación bialélica del locus genómico diana.
En algunas realizaciones, la etapa de introducción del método comprende además la introducción en la célula de rata pluripotente: un primer constructo de expresión que comprende un primer promotor unido operativamente a una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína (Cas) asociada a Repeticiones Palindrómicas Cortas Regularmente Interespaciadas Aglomeradas (CRISPR), y una segunda constructo de expresión que comprende un segundo promotor unido operativamente a una segunda secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia diana genómica unida operativamente a un ARN guía (ARNg), en donde la secuencia diana genómica está inmediatamente flanqueada en el extremo 3' termina con una secuencia de motivo adyacente Protospacer (PAM). En una realización, la secuencia diana genómica comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1. En una realización, el ARNg comprende una tercera secuencia de ácidos nucleicos que codifica un ARN (ARNcr) de Repeticiones Palindrómicas Cortas Regularmente Interespaciadas Aglomeradas (CRISPR) y una transactivación del ARN CRISPR (taARNcr). En algunas de tales realizaciones, la proteína Cas es Cas9. En algunas de tales realizaciones, (a) el ARNg es el ARN quimérico de la secuencia de ácidos nucleicos expuesta en la SEQ ID NO: 2; (b) el ARNg es el ARN quimérico de la secuencia de ácidos nucleicos expuesta en la SEQ ID NO:3; (c) el ARNcr comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6; o, (d) el ARNtracr comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 7 y/o la SEQ ID NO:8.
Breve descripción de los dibujos
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La Figura 1 muestra los ESC de ratas, que crecen como colonias esféricas compactas que se desprenden y flotan rutinariamente en la placa.
Las Figuras 2A a D representan diversos marcadores de pluripotencia expresados por ESCs de rata: A representa Oct-4 (verde); B representa Sox-2 (rojo); C representa DAPI (azul); D representa una superposición de marcadores de pluripotencia expresados por rESCs.
La Figura 3 muestra que los ESC de rata expresan niveles de luz de fosfatasa alcalina (un marcador de pluripotencia) (izquierda), y el cariotipo para la línea DA.2B es 42X,Y (derecha). Se realizó un cariotipo porque las ESC de rata a menudo se vuelven tetraploides; por lo tanto, las líneas se preseleccionaron contando los cromosomas en metafase, y las líneas con recuentos en su mayoría normales fueron luego formalmente cariotipificadas.
La Figura 4A-B proporciona una fotografía que muestra el análisis del número de cromosomas de la línea celular ACI.G1 de rata ES.
La Figura 5A-B proporciona una fotografía que muestra el análisis del número de cromosoma de la línea celular DA.2B rata ES.
La Figura 6A-B proporciona una fotografía que muestra el análisis del número de cromosoma de la línea celular DA.C2 rata ES.
La Figura 7 muestra una vista más cercana de una rata ESC de la Figura 1.
La Figura 8 representa la producción de quimeras por inyección de blastocistos y la transmisión del genoma ESC de rata a través de la línea germinal; quimeras producidas por inyección de blastocisto utilizando ESC parentales ACI.G1 de rata; las quimeras de alto porcentaje suelen tener hocicos albinos.
La Figura 9 muestra crías F1 de agutí con compañeros de camada albinos, engendrados por la quimera ACI/SD marcada con un asterisco (*) en la figura 8.
La Figura 10 proporciona un esquema del locus ApoE de rata y denota con barras grises el sitio de corte para nucleasas de dedos de zinc (ZFN1 y ZFN2). Las regiones genómicas correspondientes a los brazos de homología 5' y 3' (5 kb y 5.4 kb, respectivamente) se indican mediante los recuadros gris oscuro. El exón 1 del gen ApoE no está codificado y se muestra como una caja abierta más cercana al brazo de homología 5'. Los tres intrones del gen ApoE se indican como líneas. Los Exones 2 y 3 comprenden regiones de codificación y se muestran como recuadros grises punteados. El exón 4 contiene secuencias codificadas y no codificadas como se indica por el sombreado gris punteado y el cuadro abierto.
La Figura 11 proporciona un resumen de la eficacia de la direccionamiento de ApoE cuando se realiza en presencia de nucleasas de dedos de zinc (ZFN1 o ZFN2)
La Figura 12 muestra El direccionamiento del locus Rosa 26 de rata, que se encuentra entre los genes Setd5 y Thumpd3 como en el ratón, con el mismo espacio. El panel A muestra la estructura del ratón Rosa 26 locus. Los transcriptos de ratón Rosa 26 constan de 2 o 3 Exones. El panel B representa la estructura del locus Rosa 26 de rata; el locus de la rata contiene un segundo exón 1 (Exlb) además del exón homólogo al exón 1 de ratón (Ex1a); ningún tercer exón ha sido identificado en ratas. El panel C representa un alelo de Rosa 26 de rata direccionado; se clonaron brazos de homología de 5 kb cada uno por PCR usando ADN genómico de DA rESC; el alelo objetivo contiene un casete Splicing Acceptor (SA)-lacZ-hUB-neo que reemplaza una eliminación de 117 pb en el intrón Rosa 26 de rata.
La Figura 13A representa un cerebro de control de una rata de tipo salvaje de 14 semanas de edad, que se tiñó con X-gal. El cerebro de control mostró un bajo nivel de tinción de fondo para LacZ (vista dorsal).
La Figura 13B representa la expresión de LacZ en el cerebro de una rata heterocigótica rRosa 26 (14 semanas de edad). El informador lacZ se expresó de manera ubicua en todo el cerebro del heterocigoto rRosa 26.
La Figura 13C muestra un corazón y un timo de control (recuadro) de una rata de tipo salvaje de 14 semanas de edad, que se trataron con X-gal. El corazón y el timo de control mostraron un bajo nivel de tinción de fondo para LacZ.
La Figura 13D representa la expresión de LacZ en el corazón y el timo (recuadro) de una rata heterocigótica rRosa 26 de 14 semanas de edad. El informador lacZ se expresó de forma ubicua en todo el corazón y el timo del heterocigoto rROSA 26.
La Figura 13E muestra un pulmón de control de una rata de tipo salvaje de 14 semanas de edad, que se trató con X-gal. El pulmón de control mostró un bajo nivel de tinción de fondo para LacZ.
La Figura 13F representa la expresión de LacZ en el pulmón de una rata heterozigota rRosa 26 de 14 semanas de edad. El indicador lacZ se expresó de forma ubicua en todo el pulmón del heterocigoto rRosa 26.
Las Figuras 13G y H representan la expresión de LacZ en embriones de rata E12.5. En contraste con el embrión de control de tipo salvaje (H), que muestra un bajo nivel de tinción de LacZ de fondo, el embrión heterocigoto rRosa 26 exhibió una expresión ubicua del indicador de LacZ en todo el embrión.
Las Figuras 13i y J representan la expresión de LacZ en embriones de rata E14.5. En contraste con el embrión de control de tipo salvaje (J), que muestra un bajo nivel de tinción de LacZ de fondo, el embrión de rata heterocigoto rRosa 26 exhibió una expresión ubicua del informador de LacZ en todo el embrión.
La Figura 14 ilustra un evento de recombinación homóloga o no homóloga que ocurre dentro de una célula ES de rata después de una electroporación de un vector de direccionamiento que comprende un casete de selección (casete lacZ-neo).
La Figura 15 ilustra el mecanismo por el cual las endonucleasas de edición del genoma (por ejemplo, ZFN y TALEN) introducen una ruptura de doble cadena (DSB) en una secuencia genómica diana y activan la unión de extremos no homóloga (NHEJ) en una célula ES.
La Figura 16 ilustra una técnica de selección de genes que utiliza ZFN/TALEN para mejorar la eficiencia de la recombinación homóloga de un vector de direccionamiento. DSB representa ruptura de doble hebra.
La Figura 17 proporciona un resumen de la producción de quimeras y la transmisión de la línea germinal del locus ApoE de rata modificado. La modificación direccionada fue asistida por nucleasas de dedos de zinc.
La Figura 18 proporciona un esquema del evento de orientación IL2r-y en combinación con nucleasas de dedos de zinc que apuntan a ZFN U y ZFN D. Los sitios de corte de ZFN se indican en la figura.
La Figura 19 proporciona la eficiencia de direccionamiento cuando se dirige a IL2r-y en combinación con el sistema CRISPR/Cas9.
La Figura 20 proporciona un esquema del locus ApoE de rata y un plásmido de direccionamiento. El esquema superior muestra la estructura genómica del locus ApoE de rata y las regiones genómicas correspondientes a los brazos de homología 5' y 3' (5 kb y 5,4 kb respectivamente; cajas de color gris oscuro). El exón 1 del gen ApoE no está codificado y se muestra como una caja abierta más cercana al brazo de homología 5'. Los tres intrones del gen ApoE se indican como líneas. Los Exones 2 y 3 comprenden regiones de codificación y se muestran como recuadros grises punteados. El exón 4 contiene secuencias codificadas y no codificadas como se indica por el sombreado gris punteado y el cuadro abierto. El panel inferior muestra el plásmido de direccionamiento. Los brazos de homología 5' y 3' (5 kb y 5.4 kb, respectivamente) se indican mediante los recuadros en gris oscuro. El vector de direccionamiento comprende un gen informador (lacZ) y un casete autoeliminable flanqueado por sitios loxP (flechas abiertas). El casete que se elimina automáticamente comprende un promotor Prm1 de ratón unido operativamente al gen Crei y un casete de selección de fármaco que comprende un promotor de ubiquitina humana unido operativamente a un gen de resistencia a neomicina.
La Figura 21 proporciona un esquema para apuntar al locus ApoE en células ES de rata usando nucleasas de dedo de zinc y un vector de direccionamiento que comprende un gen informador (LacZ) y un casete autoeliminable que comprende un promotor Prm1 de ratón operativamente enlazado al gen Crei y un casete de selección de un medicamento que comprende un promotor de ubiquitina humana operativamente unido a un gen de resistencia a neomicina.
La Figura 22 proporciona un esquema del locus ApoE de rata y un vector de direccionamiento grande (LTVEC). El panel superior muestra la organización genómica del locus ApoE de rata y las regiones genómicas correspondientes a los brazos de homología 5' y 3' (45 kb y 23 kb, respectivamente; las cajas de color gris oscuro). El exón 1 de ApoE no está codificado y se muestra como un armario de caja abierta para el brazo de homología 5'. Los tres intrones del gen ApoE se indican como líneas y los Exones 2 y 3 comprenden regiones codificantes y se muestran como recuadros grises punteados. El exón 4 contiene secuencias codificadas y no codificadas como se indica por el sombreado gris punteado y el cuadro abierto. El panel inferior muestra el LTVEc para modificar el locus ApoE de rata. Los brazos de homología 5' y 3' (45 kb y 23 kb, respectivamente) se indican mediante los recuadros de color gris oscuro. El LTVEC comprende un gen informador (lacZ) y un casete que se elimina automáticamente flanqueado por sitios loxP (flechas abiertas), que comprende un promotor Prm1 de ratón unido operativamente al gen Crei y un casete de selección de fármacos que comprende un promotor de ubiquitina humana unido operativamente a un gen de resistencia a la neomicina.
La Figura 23 proporciona un esquema del locus ApoE de rata y denota con barras grises los sitios de corte para las nucleasas de dedos de zinc (ZFN1 y ZFN2) usadas junto con el vector de direccionamiento grande (LTVEC) para mejorar la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y la región cromosómica cognada objetivo.
La Figura 24 representa el locus IL2r-Y de rata que se ha interrumpido por una eliminación de 3.2 kb y la inserción de un gen informador (eGFP) y un casete autoeliminable que comprende un casete de selección de fármaco (hUb-neo) y el gen Crei unido de forma funcional a un ratón Prm1 promotor.
La Figura 25 proporciona un resumen de las líneas de células madre embrionarias de rata objetivo transmisoras de línea germinal.
La Figura 26 proporciona otra representación del locus IL2r-Y de rata que ha sido interrumpido por una eliminación de 3.2 kb y la inserción de un gen informador (eGFP) y un casete autoeliminable que comprende el gen Crei unido operativamente a un promotor Prm1 de ratón y un casete de selección de drogas (hUb-Neo).
La Figura 27 proporciona un esquema del locus Rag2 de rata y un vector de direccionamiento grande (LTVEC) para modificar el locus Rag2 de rata. El panel superior muestra la organización genómica del locus Rag2 de rata y las regiones genómicas afines correspondientes a los brazos de homología 5' y 3' (48 kb y 15 kb, respectivamente; cajas de color gris oscuro). Rag2 comprende un solo exón indicado por el sombreado gris punteado. El panel inferior es el LTVEC. Los brazos de homología 5' y 3' (48 kb y 15 kb, respectivamente) se indican mediante los recuadros de color gris oscuro. El LTVEC comprende un gen informador (lacZ) y un casete que se elimina automáticamente flanqueado por sitios loxP (flechas abiertas) que contiene un promotor Prm1 de rata unido operativamente al gen Crei y un casete de selección de fármacos que contiene un promotor de ubiquitina humana unido operativamente a una neomicina gen de resistencia.
La Figura 28 proporciona la estructura genómica del locus Rag1/Rag2 de rata y las regiones genómicas eliminadas por la orientación Rag2 (eliminación Rag2) o la doble orientación Rag2/Rag1 (eliminación Rag2/Rag1).
La Figura 29 proporciona un esquema de los loci Rag2 y Rag1 de rata y un gran vector de direccionamiento (LTVEC) utilizado para modificar los loci. El panel superior muestra la organización genómica de los loci Rag1 y Rag2 y las regiones genómicas afines correspondientes a los brazos de homología 5' y 3' (48 kb y 84 kb, respectivamente; cajas de color gris oscuro). Rag2 y Rag1 comprenden cada uno un solo exón indicado por el sombreado gris punteado. El panel inferior es el LTVEC. Los brazos de homología 5' y 3' (48 kb y 84 kb, respectivamente) se indican mediante los recuadros de color gris oscuro. El LTVEC comprende un gen informador (lacZ) y un casete que se elimina automáticamente flanqueado por sitios loxP (flechas abiertas), que comprende un promotor Prm1 de rata unido operativamente al gen Crei y un casete de selección de fármacos que comprende un promotor de ubiquitina humana unido operativamente a un gen de resistencia a la neomicina.
La Figura 30 muestra que las II2rg-/y PBMC no expresan marcadores de linfocitos maduros. Se detectaron linfocitos positivos para GFP en sangre periférica en 2 de las 3 quimeras.
La Figura 31 proporciona un esquema del locus de IL-2rg de rata y un plásmido de direccionamiento para la humanización completa del locus de IL-2rg de rata. El panel superior muestra la organización genómica del locus IL-2rg de rata y las regiones genómicas afines correspondientes a los brazos de homología 5' y 3' (4.4 kb y 5.0 kb, respectivamente; recuadros de color gris oscuro). El panel inferior es el plásmido de direccionamiento. Los brazos de homología 5' y 3' (4.4 kb y 5.0 kb, respectivamente) se indican mediante los recuadros en gris oscuro. El plásmido de direccionamiento comprende la región genómica de IL-2rg humana, un gen informador (GFP) y un casete que se elimina automáticamente flanqueado por sitios loxP (flechas abiertas) que contiene un promotor Prm1 de ratón operativamente enlazado al gen Crei y un casete de selección de fármacos que contiene un promotor de ubiquitina humana unido operativamente a un gen de resistencia a neomicina.
La Figura 32 proporciona un esquema del locus de IL-2rg de rata y un plásmido de direccionamiento para la humanización de ectodominios del locus de IL-2rg de rata. El panel superior muestra la organización genómica del locus IL-2rg de rata y las regiones genómicas afines correspondientes a los brazos de homología 5' y 3' (4.4 kb y 5.0 kb, respectivamente; recuadros de color gris oscuro). El panel inferior es el plásmido de direccionamiento. Los brazos de homología 5' y 3' (4.4 kb y 5.0 kb, respectivamente) se indican mediante los recuadros en gris oscuro. El plásmido de direccionamiento comprende el ectodominio humano de la región genómica de IL-2Rg, un gen informador (GFP) y un casete autoeliminable flanqueado por sitios loxP (flechas abiertas) que contiene un promotor Prm1 de ratón operativamente enlazado al gen Crei y un casete de selección de fármacos un promotor de ubiquitina humana operativamente unido a un gen de resistencia a neomicina.
La Figura 33 proporciona una alineación de secuencia de la proteína IL-2rg humana (SEQ ID NO: 20; NP_000197.1); la proteína IL-2rg de rata (SEQ ID NO: 21; NP_543165.1); y la proteína quimérica IL-2rg (SEQ ID NO: 22) que comprende el ectodominio humano de IL-2rg fusionada con el resto de la proteína IL-2rg de rata. La unión entre la IL-2rg humana y la rata se observa mediante la línea vertical.
Descripción detallada de la invención
Glosario
El término "célula madre embrionaria" o "célula ES", como se usa en el presente documento, incluye una célula totipotente o pluripotente derivada de embrión que es capaz de contribuir a cualquier tejido del embrión en desarrollo tras la introducción en un embrión. El término "célula pluripotente" como se usa en el presente documento incluye una célula indiferenciada que posee la capacidad de desarrollarse en más de un tipo de células diferenciadas.
El término "ácido nucleico homólogo" como se usa en el presente documento incluye una secuencia de ácidos nucleicos que es idéntica o sustancialmente similar a una secuencia de referencia conocida. En una realización, el término "ácido nucleico homólogo" se usa para caracterizar una secuencia que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o incluso 100% idéntico a una secuencia de referencia conocida.
El término "ácido nucleico ortólogo", como se usa en el presente documento, incluye una secuencia de ácidos nucleicos de una especie que es funcionalmente equivalente a una secuencia de referencia conocida en otra especie.
El término "vector de direccionamiento grande" o "LTVEC", como se usa en el presente documento, incluye vectores de direccionamiento grandes para células eucariotas que se derivan de fragmentos de ADN genómico clonado más grandes que los utilizados típicamente por otras metodologías destinadas a realizar el abordaje de genes homólogos en células eucarióticas. Ejemplos de LTVEC incluyen, entre otros, cromosoma bacteriano homólogo (BAC) y cromosoma artificial de levadura (YAC).
El término "modificación de alelo" (MOA), tal como se usa en el presente documento, incluye la modificación de la secuencia de ADN exacta de un alelo de un gen o genes o locus (loci) cromosómico en un genoma. Ejemplos de "modificación del alelo (MOA)" como se describe en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, eliminaciones, sustituciones o inserciones de tan solo un nucleótido individual o eliminaciones de muchas kilobases que abarcan un gen(es) o locus cromosómico (loci) de interés, así como cualquiera y todas las posibles modificaciones entre estos dos extremos.
El término "sitio de recombinación" como se usa en el presente documento incluye una secuencia de nucleótidos que es reconocida por una recombinasa específica del sitio y que puede servir como un sustrato para un evento de recombinación.
Las modificaciones genéticas "en serie" incluyen dos o más modificaciones a, por ejemplo, una célula ES de rata, realizadas de forma independiente. Por ejemplo, se realiza una primera modificación a un genoma de células ES de rata empleando un primer constructo de ácido nucleico adecuado. La primera modificación se puede lograr por electroporación, o cualquier otro método conocido en la técnica. Luego se realiza una segunda modificación en el mismo genoma de células ES de rata empleando una segunda constructo de ácido nucleico adecuada. La segunda modificación se puede lograr mediante una segunda electroporación, o cualquier otro método conocido en la técnica. En diversas formas de realización, después de la primera y la segunda modificación genética de la misma célula ES de rata, se pueden lograr modificaciones genéticas en serie de una tercera, una cuarta, una quinta, una sexta, etc. (una detrás de otra), por ejemplo, la electroporación en serie o cualquier otro método adecuado (en serie) conocido en la técnica.
El término "recombinasa específica de sitio" como se usa en el presente documento incluye un grupo de enzimas que pueden facilitar la recombinación entre "sitios de recombinación" donde los dos sitios de recombinación están físicamente separados dentro de una única molécula de ácido nucleico o en moléculas de ácido nucleico separadas. Ejemplos de "recombinasa específica de sitio" incluyen, pero no se limitan a, recombinasas de Cre, Flp y Dre.
El término "línea germinal" en referencia a una secuencia de ácidos nucleicos incluye una secuencia de ácidos nucleicos que puede pasarse a la progenie.
La expresión "cadena pesada" o "cadena pesada de inmunoglobulina" incluye una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina, que incluye secuencia de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, de cualquier organismo. Los dominios variables de cadena pesada incluyen tres CDR de cadena pesada y cuatro regiones FR, a menos que se especifique lo contrario. Los fragmentos de cadenas pesadas incluyen CDR, CDR y FR, y combinaciones de los mismos. Una cadena pesada típica tiene, siguiendo el dominio variable (de N-terminal a C-terminal), un dominio Ch1, una bisagra, un dominio Ch2 y un dominio Ch3. Un fragmento funcional de una cadena pesada incluye un fragmento que es capaz de reconocer específicamente un epítopo (por ejemplo, reconocer el epítopo con una Kd en el rango micromolar, nanomolar o picomolar), que es capaz de expresar y secretar de una célula, y que comprende al menos una CDR. Los dominios variables de la cadena pesada están codificados por la secuencia de nucleótidos de la región variable, que generalmente comprende los segmentos Vh, Dh y Jh derivados de un repertorio de segmentos Vh, Dh y Jh presentes en la línea germinal. Las secuencias, las ubicaciones y la nomenclatura para los segmentos de cadenas pesadas V, D y J para varios organismos se pueden encontrar en la base de datos IMGT, a la que se puede acceder a través de Internet en la red mundial (www) en la URL "imgt.org".
La expresión "cadena ligera" incluye una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina de cualquier organismo y, a menos que se especifique lo contrario, incluye cadenas ligeras kappa (k) y lambda (A) humanas y una VpreB, así como cadenas ligeras sustitutas. Los dominios variables de cadena ligera suelen incluir tres CDR de cadena ligera y cuatro regiones marco (FR), a menos que se especifique lo contrario. En general, una cadena ligera de longitud completa incluye, desde el término amino hasta el término carboxilo, un dominio variable que incluye FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, y una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena ligera. Los dominios variables de la cadena ligera están codificados por la secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena ligera, que generalmente comprende segmentos de genes Vl de cadena ligera y Jl de cadena ligera, derivados de un repertorio de segmentos de genes V y J de cadena ligera presentes en la línea germinal. Las secuencias, las ubicaciones y la nomenclatura de los segmentos de los genes V y J de las cadenas ligeras para varios organismos se pueden encontrar en la base de datos IMGT, a la que se puede acceder a través de Internet en la web (www) en la u Rl "imgt.org". Las cadenas ligeras incluyen aquellas, por ejemplo, que no se unen selectivamente a un primer o segundo epítopo unidos selectivamente por la proteína de unión a epítopo en donde aparecen. Las cadenas ligeras también incluyen aquellas que se unen y reconocen, o ayudan a la cadena pesada con la unión y el reconocimiento, uno o más epítopos unidos selectivamente por la proteína de unión a epítopo en donde aparecen.
La expresión "unido operativamente" comprende una relación en donde los componentes operan de manera funcional. En un caso, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína puede estar unida operativamente a secuencias reguladoras (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencia silenciadora, etc.) para conservar la regulación transcripcional adecuada. En un caso, una secuencia de ácidos nucleicos de una región variable de inmunoglobulina (o segmentos V(D)J) puede unirse operativamente a una secuencia de ácidos nucleicos de una región constante de inmunoglobulina para permitir una recombinación adecuada entre las secuencias en una inmunoglobulina pesada o secuencia de la cadena ligera.
1. Locus diana que comprende un ácido nucleico de rata
Se describen diversos métodos y composiciones, que permiten la integración de al menos un ácido nucleico de inserción en un locus diana. Como se usa en el presente documento, un "locus genómico de interés" comprende cualquier segmento o región de ADN dentro del genoma que uno desea integrar un ácido nucleico de inserción. Los términos "locus genómico de interés" y "locus genómico diana de interés" se pueden usar de manera intercambiable. El locus genómico de interés puede ser nativo de la célula, o alternativamente puede comprender un segmento de ADN heterólogo o exógeno que se integró en el genoma de la célula. Dichos segmentos de ADN heterólogos o exógenos pueden incluir transgenes, casetes de expresión, fabricantes de selección que codifican polinucleótidos, o regiones heterólogas o exógenas de ADN genómico. El término "locus" se define aquí como un segmento de ADN dentro del ADN genómico. Las modificaciones genéticas como se describen en el presente documento pueden incluir una o más eliminaciones de un locus de interés, adiciones a un locus de interés, reemplazo de un locus de interés y/o cualquier combinación de los mismos. El locus de interés puede comprender regiones codificadoras o regiones reguladoras no codificantes.
El locus genómico de interés puede comprender además cualquier componente de un sistema de integración direccionado que incluye, por ejemplo, un sitio de reconocimiento, un marcador de selección, un ácido nucleico de inserto previamente integrado, polinucleótidos que codifican agentes de nucleasa, promotores, etc. Alternativamente, el locus genómico de interés se puede ubicar dentro de un cromosoma artificial de levadura (YAC), un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cromosoma artificial humano o cualquier otra región genómica diseñada en una célula huésped apropiada. En diversos ejemplos, el locus direccionado puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos nativa, heteróloga o exógena de un procariota, un eucariota, una levadura, una bacteria, un mamífero no humano, una célula no humana, un roedor, un humano, una rata, un ratón, un hámster, un conejo, un cerdo, un bovino, un ciervo, una oveja, una cabra, un pollo, un gato, un perro, un hurón, un primate (por ejemplo, tití, mono rhesus), mamífero domesticado o un mamífero de origen agropecuario o cualquier otro organismo de interés o una combinación de los mismos.
En realizaciones específicas, el locus genómico de interés comprende un locus diana de un "ácido nucleico de rata". Dicha región comprende un ácido nucleico de una rata que está integrado dentro del genoma de una célula.
Los ejemplos no limitantes del locus diana incluyen un locus genómico que codifica una proteína expresada en una célula B, un locus genómico que expresa un polipéptido en una célula B inmadura, un locus genómico que expresa un polipéptido en una célula B madura, un loci de inmunoglobulina (Ig), o un loci receptor de células T, que incluye, por ejemplo, un locus alfa del receptor de células T. Ejemplos adicionales de locus genómico diana incluyen un locus FcERla, un locus TLR4, un locus PRLR, un locus Notch4, un locus Accn2, un locus Adamts5, un locus TRPA1, un locus FolH1, un locus LRP5, un locus receptor IL2, incluido, para, por ejemplo, un locus de receptor de IL2 (IL2Rg), un locus ApoE, un locus Rag1, un locus Rag2, un locus Rag1/Rag2 y un locus ERBB4. Cualquier locus diana puede ser de una rata.
En un ejemplo, el locus diana codifica una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de mamífero. En una realización, el locus diana codifica una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de rata. En un ejemplo, el locus diana comprende una secuencia de ADN genómico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana de rata, ratón o no reorganizada operativamente unida a una secuencia de ácidos nucleicos de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. En una realización, la secuencia de ácidos nucleicos de la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina es una secuencia de ácidos nucleicos de la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina de rata, ratón o humana seleccionada de un CH1, una bisagra, un CH2, un CH3, y una combinación de los mismos. En una realización, la secuencia de ácidos nucleicos de la región constante de la cadena pesada comprende una CH1-bisagra-CH2-CH3. En una realización, el locus diana comprende una secuencia de ácidos nucleicos de región variable de cadena pesada de rata, ratón o inmunoglobulina humana reorganizada operativamente unida a una secuencia de ácidos nucleicos de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. En un ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos de la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina es una secuencia de ácidos nucleicos de la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina de rata, ratón o humana seleccionada de un CH1, una bisagra, un CH2, un CH3 y una combinación de los mismos. En una realización, la secuencia de ácidos nucleicos de la región constante de la cadena pesada comprende una CH1-bisagra-CH2-CH3.
En un ejemplo, el locus diana comprende una secuencia de ADN genómico que codifica una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina de mamífero. En un ejemplo, la secuencia de ADN genómico comprende una secuencia de ácidos nucleicos de región variable de la cadena ligera de A y/o k de mamífero no reordenado.
En un ejemplo, la secuencia de ADN genómico comprende una secuencia de ácidos nucleicos de región variable de cadena ligera de A y/o k de mamífero reordenada. En un ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos de la región variable de la cadena ligera A o k no reorganizada está unida operativamente a una secuencia de ácidos nucleicos de la región constante de la cadena ligera de la inmunoglobulina de mamífero seleccionada de una secuencia de ácidos nucleicos de la región constante de la cadena ligera A y un ácido nucleico de la región constante de la cadena ligera k secuencia. En una realización, la secuencia de ácidos nucleicos de la región constante de la cadena ligera de la inmunoglobulina de mamífero es una secuencia de ácidos nucleicos de la región constante de la cadena ligera de la inmunoglobulina de rata. En un ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos de la región constante de la cadena ligera de la inmunoglobulina de mamífero es una secuencia de ácidos nucleicos de la región constante de la cadena ligera de la inmunoglobulina de ratón. En un ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos de la región constante de la cadena ligera de la inmunoglobulina de mamífero es una secuencia de ácidos nucleicos de la región constante de la cadena ligera de la inmunoglobulina humana.
Como se usa en el presente documento, un locus ApoE de rata, un locus gamma (Il-2rg) de rata de receptor de interleucina-2 de rata, un locus Rag2 de rata, un locus Rag1 de rata y/o un locus Rag2/Rag1 de rata comprenden las regiones respectivas de genoma de rata en donde se ubican cada uno de estos genes o combinaciones de genes. Al modificar cualquiera de los locus ApoE de rata, el locus gamma del receptor de interleucina-2 de rata, el locus Rag2 de rata, el locus Rag1 de rata y/o el locus Rag2/Rag1 de rata combinados puede comprender cualquier alteración deseada del locus dado. Ejemplos no limitantes de modificación al locus de rata dado se discuten con más detalle en el presente documento.
Por ejemplo, en realizaciones específicas, uno o más del locus ApoE de rata, el locus gamma del receptor de Interleucina-2 de rata, el locus Rag2 y/o el locus Rag2/Rag1 se modifican de tal manera que la actividad y/o el nivel de la proteína ApoE codificada o la proteína gamma del receptor de interleucina-2 o la proteína Rag1 o la proteína Rag2 o una combinación de las proteínas Rag1 y Rag2 disminuyen. En otras realizaciones, la actividad de la proteína ApoE, la proteína gamma del receptor de la interleucina 2, la proteína Rag1 o la proteína Rag2, o una combinación de las proteínas Rag1 y Rag2 está ausente.
Por "disminuido" se entiende cualquier disminución en el nivel o actividad del gen/proteína codificado en el locus de interés. Por ejemplo, una disminución en la actividad puede comprender (1) una disminución estadísticamente significativa en el nivel general o la actividad de una proteína dada (es decir, ApoE, receptor de interleucina-2 gamma, Rag2, Rag2 o una combinación de Rag1 y Rag2) que incluye, por ejemplo, una disminución de nivel o actividad de 0.5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120% o mayor en comparación con un control apropiado. Los métodos para ensayar una disminución en la concentración y/o la actividad de cualquiera de ApoE, receptor de interleucina-2, Rag1 y Rag2 son conocidos en la técnica.
En otras realizaciones, uno o más del locus ApoE de rata, el locus gamma del receptor de interleucina-2 de rata, el locus Rag2 de rata, el locus Rag1 de rata y/o el locus Rag2/Rag1 de rata comprenden una modificación tal que la actividad y/o el nivel del polipéptido ApoE codificado, el polipéptido gamma del receptor de interleucina-2, el polipéptido Rag2, el polipéptido Rag1, o ambos, el polipéptido Rag1 y Rag2 aumenta. Por "aumento" se entiende cualquier aumento en el nivel o actividad del gen/polipéptido codificado en el locus de interés. Por ejemplo, un aumento en la actividad puede comprender (1) un aumento estadísticamente significativo en el nivel general o la actividad de una proteína dada (es decir, ApoE, receptor de interleucina-2 gamma, Rag1, Rag2 o Rag1 y Rag2) que incluye, por ejemplo, un aumento de nivel o actividad de 0.5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120% o más cuando se compara con un control apropiado. Los métodos para ensayar un aumento en la concentración y/o la actividad de cualquiera de las proteínas gamma del receptor de ApoE, Rag1, Rag2 e interleucina-2 son conocidos en la técnica.
La modificación genética del locus ApoE de rata, el locus gamma del receptor de Interleucina-2 de rata, el locus Rag2 de rata, el locus Rag1 de rata y/o el locus Rag2/Rag1 de rata puede comprender una eliminación de una secuencia endógena de ácido nucleico de rata en el locus genómico, una inserción de un ácido nucleico exógeno en el locus genómico, o una combinación de los mismos. La eliminación y/o inserción puede ocurrir en cualquier lugar dentro del locus dado como se discute en otra parte en el presente documento.
Otras realizaciones descritas en el presente documento comprenden la modificación de uno o más del locus ApoE de rata, el locus gamma del receptor de Interleucina-2 de rata, el locus Rag2 de rata, el locus Rag1 de rata y/o el locus Rag2/Rag1 de rata mediante la sustitución de una parte del locus ApoE de rata, el locus gamma del receptor de interleucina-2, locus Rag2, locus Rag1 y/o locus Rag2/Rag1 con la porción homóloga u ortóloga correspondiente de un locus ApoE, un locus gamma del receptor de interleucina-2, un locus Rag2, un locus Rag1 y/o un locus Rag2/Rag1 de otro organismo.
En todavía otras realizaciones, la modificación de uno o más del locus ApoE de rata, el locus gamma del receptor de interleucina-2 de rata, el locus Rag2, el locus Rag1 y/o el locus Rag2/Rag1 se lleva a cabo mediante la sustitución de una parte del locus ApoE de rata, el locus gamma del receptor de interleucina-2 de rata y/o el locus Rag2 de rata, y/o el locus Rag1 y/o locus Rag2/Rag1 con un polinucleótido de inserción que comparte en toda su longitud al menos el 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% a una porción de un locus ApoE, un locus gamma del receptor de interleucina-2, un locus Rag2, un locus Rag1 y/o un locus Rag2/Rag1 que está reemplazando.
El polinucleótido de inserción dado y/o la región correspondiente del locus de rata que se está eliminando puede ser una región codificante, un intrón, un exón, una región no traducida, una región reguladora, un promotor, un potenciador o cualquier combinación de los mismos o cualquier porción de los mismos. Además, el polinucleótido de inserto dado y/o la región del locus de rata que se está eliminando puede tener cualquier longitud deseada, incluyendo, por ejemplo, entre 10-100 nucleótidos de longitud, 100-500 nucleótidos de longitud, 500-1kb de nucleótido de longitud, 1Kb a 1.5kb de nucleótido de longitud, 1.5kb a 2kb de nucleótidos de longitud, 2kb a 2.5kb de nucleótidos de longitud, 2.5kb a 3kb de nucleótidos de longitud, 3kb a 5kb de nucleótidos de longitud, 5kb a 8kb de nucleótidos de longitud, 8kb a 10kb de nucleótidos en longitud o más. En otros casos, el tamaño de la inserción o reemplazo es de aproximadamente 5kb a aproximadamente 10kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 20kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, de aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, de aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, de aproximadamente 80kb de aproximadamente 100kb, de aproximadamente 100kb a aproximadamente 150kb, de aproximadamente 150kb a aproximadamente 200kb, de aproximadamente 200kb a aproximadamente 250kb, de aproximadamente 250kb a aproximadamente 300kb, de aproximadamente 300kb a aproximadamente 350kb, de aproximadamente 350kb a aproximadamente 400kb, de aproximadamente 400kb a aproximadamente 800kb, de aproximadamente 800kb a 1Mb, de aproximadamente 300kb a aproximadamente 400kb, de aproximadamente 400kb a aproximadamente 500kb, de aproximadamente 500kb a 1Mb, de aproximadamente 1Mb a aproximadamente 1.5Mb, de aproximadamente 1.5Mb a aproximadamente 2Mb, de aproximadamente 2Mb a aproximadamente 2.5Mb, de aproximadamente 2.5Mb a aproximadamente 2.8Mb, de aproximadamente 2.8Mb a aproximadamente 3Mb. En otras realizaciones, el polinucleótido de inserción dado y/o la región del locus de rata que se está eliminando es al menos 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o 900 nucleótidos o al menos 1kb, 2kb, 3kb, 4kb, 5kb, 6kb, 7kb, 8kb, 9kb, 10kb, 11kb, 12kb, 13kb, 14 kb, 15kb, 16kb o más.
El polinucleótido insertado dado puede ser de cualquier organismo, incluido, por ejemplo, un roedor, una rata, un ratón, un hámster, un mamífero, un mamífero no humano, un humano, un animal de origen agropecuario o un animal doméstico.
Como se describe con más detalle en el presente documento, se describen diversos métodos para generar modificaciones direccionadas a cualquier locus de interés de rata, que incluyen, por ejemplo, modificaciones direccionadas en el locus ApoE de rata, el locus gamma del receptor de interleucina-2 de rata, el locus Rag2 de rata, el locus Rag1 de rata y/o el locus Rag2/Rag1 de rata. Además, se describen ratas modificadas genéticamente o células de rata pluripotentes modificadas genéticamente (por ejemplo, células ES de rata), que comprenden una eliminación, una inserción, un reemplazo y/o una combinación de los mismos en el locus gamma del receptor de interleucina 2, en el locus ApoE, en el locus Rag2 de rata, en el locus Rag1 de rata, y/o en el locus Rag2/Rag1 de rata. Dichas modificaciones genéticas (incluidas aquellas que resultan en una ausencia, una disminución, un aumento o una modulación en la actividad del locus diana) y también pueden transmitirse a través de la línea germinal. En realizaciones específicas, las modificaciones genéticas dan como resultado una desactivación del locus diana deseado. Tales ratas encuentran uso en una variedad de sistemas experimentales como se discute en otra parte del presente documento.
Por ejemplo, los bloqueos de ApoE (apolipoproteína E) en ratas ofrecen un modelo animal para estudiar la función endotelial, que incluye, entre otros, la formación de placa, los cambios transcripcionales (Pistola de Secuenciación de Transcriptoma Completo (RNA-Seq) y función ex vivo. Además, el tamaño más grande de las ratas facilita todos estos ensayos y mejora potencialmente la calidad de los datos de RNA-Seq. ApoE es una molécula de transporte importante y puede transportar lípidos, como el colesterol, a través del torrente sanguíneo. ApoE también puede funcionar en el sistema nervioso, por ejemplo, para eliminar el p-amiloide del cerebro. Las modificaciones en la ApoE se han implicado en diversas afecciones, que incluyen, por ejemplo, aterosclerosis, hiperlipidemia y enfermedad de Alzheimer. Los animales bloqueados para ApoE muestran un deterioro deficiente de la lipoproteína de la sangre y desarrollan aterosclerosis. Por lo tanto, los animales bloqueados de ApoE proporcionan un modelo para estudiar condiciones y/o procesos como, por ejemplo, la función del endotelio, la formación de placa, los cambios transcripcionales (RNA-Seq), hiperlipidemia, aterosclerosis y enfermedad de Alzheimer. Los ensayos para medir la actividad de ApoE son conocidos en la técnica. Por ejemplo, una disminución en la actividad de ApoE puede medirse analizando una disminución en los niveles de ApoE en una muestra de sangre obtenida de un sujeto mediante inmunoensayos, como por ejemplo mediante ELISA o mediante técnicas de inmunotransferencia. Además, el gran tamaño de las ratas facilita todos estos ensayos y mejora la calidad de los datos.
RAG1 (gen activador de la recombinación 1) y RAG2 (gen activador de la recombinación 2) son enzimas que forman parte de un complejo de múltiples subunidades que tienen actividad de recombinación VDJ y desempeñan un papel importante en el reordenamiento y la recombinación de los genes de inmunoglobulina y receptores de células T en los linfocitos. RAG1 y RAG2 inducen una división del ADN de doble cadena para facilitar la recombinación y la unión de segmentos de los genes del receptor de células T y los receptores de células B (es decir, inmunoglobulina). El bloqueo de RAG1 y/o RAG2 causa una pérdida de células B y células T en el animal que resulta en una inmunodeficiencia grave. Los animales bloqueados para RAG1 y/o RAG2 encuentran uso, por ejemplo, en estudios de xenoinjertos (es decir, xenoinjertos de células humanas en ratas), cáncer, desarrollo de vacunas, enfermedades autoinmunes, enfermedades infecciosas y enfermedades de injerto contra huésped (GVHD). Varios ensayos para medir la actividad de RAG1 y/o RAG2 son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, medir la eficacia de recombinación o evaluar la presencia o ausencia de células B y/o células T en un sujeto. Además, el gran tamaño de las ratas facilita todos estos ensayos y potencialmente mejora la calidad de los datos.
El receptor de IL-2 (IL-2R) se expresa en la superficie de ciertas células inmunes y se une a la citoquina interleucina-2 (IL-2). El IL-2R es una proteína de membrana integral que comprende al menos tres cadenas de subunidades separadas, incluida una cadena alfa (IL-2Ra, CD25), una cadena beta (IL-2Rb, CD122) y una cadena gamma (IL2-Rg, CD132). La cadena gamma del receptor IL-2 (también conocida como IL2r-y o IL2Rg) es una cadena gamma común que es compartida por varios receptores de citoquinas, incluyendo, por ejemplo, los receptores para IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21. IL-2Rg comprende un ectodominio en la superficie extracelular de la célula, que contribuye a la unión del ligando, un dominio transmembrana y un dominio intracelular que puede interactuar con varias moléculas para inducir vías de transducción de señales intracelulares. El gen Il2rg se encuentra en el cromosoma X en mamíferos y ciertas mutaciones en el gen de la cadena gamma en los seres humanos pueden causar una inmunodeficiencia combinada severa ligada al X (XSCID) humana caracterizada por un defecto profundo en las células T. Además, el ectodominio de la cadena gamma puede desprenderse del receptor transmembrana y liberarse como un receptor de cadena gamma soluble. El receptor de cadena gamma soluble puede detectarse en la sangre de un sujeto y puede funcionar para regular la señalización de citoquinas.
En algunas realizaciones, la cadena de IL-2Rg de rata se reemplaza con la cadena de IL2-Rg humana de modo que la rata expresa una cadena de IL-2Rg completamente humana. En otros casos, puede ser útil reemplazar solo el ectodominio de la cadena IL-2Rg de rata con el ectodominio de la cadena IL-2Rg humana. En tales casos, la cadena de IL-2Rg humanizada resultante expresada en una rata comprende un ectodominio humano, y el resto de la molécula proviene de la rata.
La humanización en longitud completa de IL-2Rg es útil porque las ratas que tienen este locus modificado producirán IL-2Rg humana. Esto permitirá la detección de IL-2Rg humano en ratas con anticuerpos específicos para IL-2Rg humano. La ectohumanización (es decir, la sustitución del ectodominio de rata de IL-2Rg con el ectodominio humano de IL-2Rg) dará como resultado un polipéptido de IL-2Rg que se unirá a los ligandos humanos para IL2-Rg, pero debido a que el dominio citoplásmico todavía es de rata, su forma ectohumanizada de IL-2Rg también interactuará con la maquinaria de señalización de rata.
2. Modificación de un locus diana de rata
A. Direccionamiento de vectores e inserción de ácidos nucleicos
i. Inserción de ácidos nucleicos
Como se usa en el presente documento, el "ácido nucleico de inserción" comprende un segmento de ADN que se desea integrar en el locus diana. En una realización, el ácido nucleico de inserción comprende uno o más polinucleótidos de interés. En otras realizaciones, el ácido nucleico de inserción puede comprender uno o más casetes de expresión. Un casete de expresión dado puede comprender un polinucleótido de interés, un polinucleótido que codifica un marcador de selección y/o un gen indicador junto con los diversos componentes reguladores que influyen en la expresión. Ejemplos no limitantes de polinucleótidos de interés, marcadores de selección y genes informadores que pueden incluirse dentro del inserto de ácido nucleico se discuten en detalle en otra parte de este documento.
En realizaciones específicas, el ácido nucleico insertado puede comprender un ácido nucleico de rata, que puede incluir un segmento de ADN genómico, un ADNc, una región reguladora, o cualquier parte o combinación de los mismos. En otras realizaciones, el ácido nucleico insertado puede comprender un ácido nucleico de un mamífero no humano, un roedor, un humano, una rata, un ratón, un hámster, un conejo, un cerdo, un bovino, un ciervo, una oveja, una cabra, un pollo, un gato, un perro, un hurón, un primate (por ejemplo, un tití, un mono rhesus), un mamífero domesticado o un mamífero de origen agropecuario o cualquier otro organismo de interés. Como se describe con más detalle en el presente documento, el ácido nucleico insertado empleado en los diversos métodos y composiciones puede dar como resultado la "humanización" de un locus diana que comprende un ácido nucleico de rata.
En una realización, el inserto de ácido nucleico comprende un alelo activado de al menos un exón de un gen endógeno. En una realización, el inserto de ácido nucleico comprende un alelo activado de todo el gen endógeno (es decir, "activación por de intercambio de genes").
En una realización, el inserto de ácido nucleico comprende un elemento regulador, que incluye, por ejemplo, un promotor, un potenciador o un elemento de unión a represor transcripcional.
En realizaciones adicionales, el ácido nucleico de inserción comprende un alelo condicional. En una realización, el alelo condicional es un alelo multifuncional, como se describe en el documento US 2011/0104799. En realizaciones específicas, el alelo condicional comprende: (a) una secuencia de actuación en orientación de sentido con respecto a la transcripción de un gen diana, y un casete de selección de fármaco en orientación de sentido o antisentido; (b) en orientación antisentido una secuencia de nucleótidos de interés (NSI) y un módulo condicional por inversión (COIN, que utiliza un intrón que divide el exón y un módulo invertible de tipo Genetrap; véase, por ejemplo, US 2011/0104799); y (c) unidades recombinables que se recombinan tras la exposición a una primera recombinasa para formar un alelo condicional que (i) carece de la secuencia de activación y la DSC, y (ii) contiene el NSI en orientación de sentido y la COIN en orientación antisentido.
El inserto de ácido nucleico varía de aproximadamente 5kb a aproximadamente 10kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 20kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, de aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, de aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, de aproximadamente 80kb a aproximadamente 100kb, de aproximadamente 100kb a aproximadamente 150 kb, de aproximadamente 150 kb a aproximadamente 200 kb, de aproximadamente 200 kb a aproximadamente 250 kb, de aproximadamente 250 kb a aproximadamente 300 kb, de aproximadamente 300 kb a aproximadamente 350 kb, o de aproximadamente 350 kb a aproximadamente 400 kb.
En una realización, el ácido nucleico insertado comprende una eliminación de una secuencia de ADN genómico de rata que varía de aproximadamente 1kb a aproximadamente 200kb, de aproximadamente 2kb a aproximadamente 20kb, o de aproximadamente 0.5kb a aproximadamente 3mb. En una realización, la extensión de la eliminación de la secuencia de ADN genómico es mayor que la longitud total del brazo de homología 5' y el brazo de homología 3'. En una realización, el alcance de la eliminación de la secuencia de ADN genómico varía de aproximadamente 5kb a aproximadamente 10kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 20kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, de aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, de aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, de aproximadamente 80kb a aproximadamente 100kb, de aproximadamente 100kb a aproximadamente 150kb, de aproximadamente 150kb a aproximadamente 200kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 30kb, de aproximadamente 30kb a aproximadamente 40kb, de aproximadamente 40kb a aproximadamente 50kb, de aproximadamente 50kb a aproximadamente 60kb, de aproximadamente 60kb a aproximadamente 70kb, desde aproximadamente 70kb a aproximadamente 80kb, desde aproximadamente 80kb a aproximadamente 90kb, desde aproximadamente 90kb a aproximadamente 100kb, desde aproximadamente 100kb a aproximadamente 110kb, desde aproximadamente 110kb a aproximadamente 120kb, desde aproximadamente 120kb a aproximadamente 130kb, desde aproximadamente 130kb a aproximadamente 140kb, desde aproximadamente 140kb a aproximadamente 150kb, desde aproximadamente 150kb a aproximadamente 160kb, desde aproximadamente 160kb a aproximadamente 170kb, desde aproximadamente 170kb a aproximadamente 180kb, desde aproximadamente 180kb a aproximadamente 190kb, desde aproximadamente 190kb a aproximadamente 200kb, desde aproximadamente 200kb a aproximadamente 250kb, desde aproximadamente 250kb a aproximadamente 300kb, desde aproximadamente 300kb a aproximadamente 350kb, de aproximadamente 350kb a aproximadamente 400kb, de aproximadamente 400kb a aproximadamente 800kb, de aproximadamente 800kb a 1Mb, de aproximadamente 1Mb a aproximadamente 1.5Mb, de aproximadamente 1.5Mb a aproximadamente 2Mb, de aproximadamente 2Mb, a aproximadamente 2.5Mb, de aproximadamente 2.5Mb a aproximadamente 2.8Mb, desde aproximadamente 2.8Mb a aproximadamente 3Mb, desde aproximadamente 200kb a aproximadamente 300kb, desde aproximadamente 300kb a aproximadamente 400kb, desde aproximadamente 400kb a aproximadamente 500kb, desde aproximadamente 500kb a aproximadamente 1Mb, desde aproximadamente 1Mb a aproximadamente 1.5Mb , desde aproximadamente 1.5Mb hasta aproximadamente 2Mb, desde aproximadamente 2Mb hasta aproximadamente 2.5Mb, o desde aproximadamente 2.5Mb hasta aproximadamente 3Mb.
En una realización, el ácido nucleico de inserción comprende una inserción o un reemplazo de una secuencia de ácidos nucleicos de rata con una secuencia de ácidos nucleicos humana homóloga u ortóloga. En una realización, el ácido nucleico insertado comprende una inserción o sustitución de una secuencia de ADN de rata con una secuencia de ácidos nucleicos humana homóloga u ortóloga en un locus endógeno de rata que comprende la secuencia de ADN de rata correspondiente.
En una realización, la modificación genética es una adición de una secuencia de ácido nucleico. En una realización, la secuencia de nucleótidos añadida varía de 5kb a 200kb.
En una realización, el inserto de ácido nucleico comprende una modificación genética en una secuencia codificadora. En una realización, la modificación genética comprende una mutación por eliminación de una secuencia codificadora. En una realización, la modificación genética comprende una fusión de dos secuencias codificantes endógenas.
En una realización, el inserto de ácido nucleico comprende una inserción o un reemplazo de una secuencia de ácidos nucleicos de rata con una secuencia de ácidos nucleicos humana homóloga u ortóloga. En una realización, el ácido nucleico insertado comprende una inserción o sustitución de una secuencia de ADN de rata con una secuencia de ácidos nucleicos humana homóloga u ortóloga en un locus endógeno de rata que comprende la secuencia de ADN de rata correspondiente.
En una realización, la modificación genética comprende una eliminación de una secuencia no codificadora de proteínas, pero no comprende una eliminación de una secuencia codificadora de proteínas. En una realización, la eliminación de la secuencia no codificadora de proteínas comprende una eliminación de un elemento regulador. En una realización, la modificación genética comprende una eliminación de un promotor. En una realización, la modificación genética comprende una adición de un promotor o un elemento regulador. En una realización, la modificación genética comprende una sustitución de un promotor o un elemento regulador.
En una realización, la secuencia de ácidos nucleicos del vector de direccionamiento puede comprender un polinucleótido que cuando se integra en el genoma producirá una modificación genética de una región del locus ApoE de rata, en donde la modificación genética en el locus ApoE da lugar a una disminución de la actividad de ApoE, aumento de la actividad de ApoE o una modulación de la actividad de ApoE. En una realización, se genera un ApoE bloqueado (“alelo nulo”).
En una realización, la secuencia de ácidos nucleicos del vector de direccionamiento puede comprender un polinucleótido que cuando se integre en el genoma producirá una modificación genética de una región del locus del receptor de interleucina-2 de rata, en donde la modificación genética en el locus del receptor de interleucina-2 da como resiltado una disminución en la actividad del receptor de interleucina-2. En una realización, se genera un bloqueo del receptor de interleucina-2 ("alelo nulo").
En realizaciones adicionales, el inserto de ácido nucleico da como resultado el reemplazo de una porción del locus ApoE de rata, el locus gamma y/o el locus Rag2 del receptor de interleucina-2 y/o el locus Rag1 y/o el locus Rag2/Rag1 con la porción homóloga u ortóloga correspondiente de un locus ApoE, un locus gamma del receptor de interleucina-2, un locus Rag2, un locus Rag1 y/o un locus Rag2/Rag1 de otro organismo.
En otras realizaciones, el inserto de ácido nucleico comprende un polinucleótido que comparte en toda su longitud al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% a una porción de un locus ApoE, un locus gamma del receptor de interleucina-2, un locus Rag2, un locus Rag1 y/o un locus Rag2/Rag1 que está reemplazando.
El polinucleótido de inserto dado y la región correspondiente del locus de rata que se reemplaza pueden ser una región codificante, un intrón, un exón, una región no traducida, una región reguladora, un promotor, un potenciador o cualquier combinación de los mismos. Además, el polinucleótido de inserto dado y/o la región del locus de rata que se está eliminando puede tener cualquier longitud deseada, incluyendo, por ejemplo, entre 10-100 nucleótidos de longitud, 100-500 nucleótidos de longitud, 500-1kb de nucleótido de longitud, 1Kb a 1.5kb de nucleótido de longitud, 1.5kb a 2kb de nucleótidos de longitud, 2kb a 2.5kb de nucleótidos de longitud, 2.5kb a 3kb de nucleótidos de longitud, 3kb a 5kb de nucleótidos de longitud, 5kb a 8kb de nucleótidos de longitud, 8kb a 10kb de nucleótidos en longitud o más. En otros casos, el tamaño de la inserción o reemplazo es de aproximadamente 5kb a aproximadamente 10kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 20kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, de aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, de aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, de aproximadamente 80kb de aproximadamente 100kb, de aproximadamente 100kb a aproximadamente 150kb, de aproximadamente 150kb a aproximadamente 200kb, de aproximadamente 200kb a aproximadamente 250kb, de aproximadamente 250kb a aproximadamente 300kb, de aproximadamente 300kb a aproximadamente 350kb, de aproximadamente 350kb a aproximadamente 400kb, de aproximadamente 400kb a aproximadamente 800kb, de aproximadamente 800kb a 1Mb, de aproximadamente 1Mb a aproximadamente 1.5Mb, de aproximadamente 1.5Mb a aproximadamente 2Mb, de aproximadamente 2Mb, a aproximadamente 2.5Mb, de aproximadamente 2.5Mb a aproximadamente 2.8Mb, de aproximadamente 2.8Mb a aproximadamente 3Mb . En otras realizaciones, el polinucleótido de inserción dado y/o la región del locus de rata que se está eliminando es al menos 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o 900 nucleótidos o al menos 1 kb, 2kb, 3kb, 4kb, 5kb, 6kb, 7kb, 8kb, 9kb, 10kb, 11kb, 12kb, 13kb, 14 kb, 15kb, 16kb o más.
En una realización, el promotor es promotor constitutivamente activo.
En una realización, el promotor es un promotor inducible. En una realización, el promotor inducible es un promotor regulado químicamente. En una realización, el promotor regulado químicamente es un promotor regulado por alcohol. En una realización, el promotor regulado por alcohol es un promotor del gen de la alcohol deshidrogenasa (alcA). En una realización, el promotor regulado químicamente es un promotor regulado por tetraciclina. En una realización, el promotor regulado por tetraciclina es un promotor sensible a tetraciclina. En una realización, el promotor regulado por tetraciclina es una secuencia de operador de tetraciclina (tetO). En una realización, el promotor regulado por tetraciclina es un promotor tet-On. En una realización, el promotor regulado por tetraciclina es un promotor tet-Off. En una realización, el promotor regulado químicamente es un promotor regulado por esteroides. En una realización, el promotor regulado por esteroides es un promotor de un receptor de glucocorticoides de rata. En una realización, el promotor regulado por esteroides es un promotor de un receptor de estrógeno. En una realización, el promotor regulado por esteroides es un promotor de un receptor de ecdisona. En una realización, el promotor regulado químicamente es un promotor regulado por metal. En una realización, el promotor regulado por metal es un promotor de metaloproteína. En una realización, el promotor inducible es un promotor regulado físicamente. En una realización, el promotor regulado físicamente es un promotor regulado por temperatura. En una realización, el promotor regulado por temperatura es un promotor de choque térmico. En una realización, el promotor regulado físicamente es un promotor regulado por luz. En una realización, el promotor regulado por luz es un promotor inducible por luz. En una realización, el promotor regulado por la luz es un promotor reprimible por la luz.
En una realización, el promotor es un promotor específico de tejido. En una realización, el promotor es un promotor específico de neuronas. En una realización, el promotor es un promotor específico de la glía. En una realización, el promotor es un promotor específico de células musculares. En una realización, el promotor es un promotor específico de células cardíacas. En una realización, el promotor es un promotor específico de células renales. En una realización, el promotor es un promotor específico de células óseas. En una realización, el promotor es un promotor específico de células endoteliales. En una realización, el promotor es un promotor específico de células inmunes. En una realización, el promotor de células inmunes es un promotor de células B. En una realización, el promotor de células inmunes es un promotor de células T.
En una realización, el promotor es un promotor regulado por el desarrollo. En una realización, el promotor regulado por el desarrollo está activo solo durante una etapa embrionaria de desarrollo. En una realización, el promotor regulado por el desarrollo está activo solo en una célula adulta.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico insertado comprende un ácido nucleico flanqueado con secuencias diana de recombinación específicas del sitio. Se reconoce que, mientras que el ácido nucleico del inserto completo puede estar flanqueado por dichas secuencias diana de recombinación específicas del sitio, cualquier región o polinucleótido individual de interés dentro del ácido nucleico del inserto también puede estar flanqueado por dichos sitios. La recombinasa específica de sitio puede introducirse en la célula por cualquier medio, incluso introduciendo el polipéptido de recombinasa en la célula o introduciendo un polinucleótido que codifica la recombinasa específica de sitio en la célula huésped. El polinucleótido que codifica la recombinasa específica del sitio puede ubicarse dentro del ácido nucleico del inserto o dentro de un polinucleótido separado. La recombinasa específica de sitio puede estar operativamente unida a un promotor activo en la célula que incluye, por ejemplo, un promotor inducible, un promotor que es endógeno a la célula, un promotor que es heterólogo a la célula, un promotor específico de la célula, un promotor específico de tejido, o un promotor específico de etapa de desarrollo. Las secuencias diana de recombinación específicas del sitio, que pueden flanquear el ácido nucleico de inserción o cualquier polinucleótido de interés en el ácido nucleico de inserción, pueden incluir, pero no se limitan a, loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2, lox5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, rox, y una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, los sitios de recombinación específicos del sitio flanquean un polinucleótido que codifica un marcador de selección y/o un gen indicador contenido dentro del ácido nucleico del inserto. En tales casos, después de la integración del ácido nucleico de inserción en el locus diana, se pueden eliminar las secuencias entre los sitios de recombinación específicos del sitio.
En una realización, el inserto de ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica un marcador de selección. El marcador de selección puede estar contenido en un casete de selección. Dichos marcadores de selección incluyen, pero no se limitan a, neomicina fosfotransferasa (neor), higromicina B fosfotransferasa (hygr), puromicina-N-acetiltransferasa (purof), blasticidina S desaminasa (bsrr), xantina/guanina fosforribosil transferasa (gpt) o virus del herpes simple timidina quinasa (HSV-k), o una combinación de los mismos. En una realización, el polinucleótido que codifica el marcador de selección está unido operativamente a un promotor activo en la célula, célula de rata, célula de rata pluripotente o la célula de rata ES. Cuando se apilan en serie los polinucleótidos de interés en un locus diana, el marcador de selección puede comprender un sitio de reconocimiento para un agente de nucleasa, como se describe anteriormente. En una realización, el polinucleótido que codifica el marcador de selección está flanqueado con secuencias diana de recombinación específicas del sitio.
El inserto de ácido nucleico puede comprender además un gen informador unido operativamente a un promotor, en donde el gen informador codifica una proteína reportera seleccionada del grupo que consiste en o que comprende LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange mKO, mCitrine, Venus, YPet, proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP), Emerald, proteína fluorescente verde mejorada (EGFP), CyPet, proteína fluorescente cian (CFP), Cerulean, T-Sapphire, luciferasa, fosfatasa alcalina y/o combinación de los mismos. Dichos genes informadores pueden unirse operativamente a un promotor activo en la célula. Dichos promotores pueden ser un promotor inducible, un promotor que es endógeno al gen informador o a la célula, un promotor que es heterólogo al gen informador o a la célula, un promotor específico de la célula, un promotor específico del tejido o un promotor específico de etapa una etapa del desarrollo.
En una realización, el inserto de ácido nucleico puede comprender un ácido nucleico de mamífero que comprende un locus genómico que codifica una proteína expresada en el sistema nervioso, el sistema esquelético, el sistema digestivo, el sistema circulatorio, el sistema muscular, el sistema respiratorio, El sistema cardiovascular, el sistema linfático, el sistema endocrino, el sistema urinario, el sistema reproductivo, o una combinación de los mismos. En una realización, el ácido nucleico de mamífero comprende un locus genómico que codifica una proteína expresada en una médula ósea o una célula derivada de médula ósea. En una realización, el ácido nucleico comprende un locus genómico que codifica una proteína expresada en una célula de bazo.
En una realización, el ácido nucleico de los mamíferos comprende un locus genómico que codifica una proteína expresada en el sistema nervioso, el sistema esquelético, el sistema digestivo, el sistema circulatorio, el sistema muscular, el sistema respiratorio, el sistema cardiovascular, sistema linfático, el sistema endocrino, el sistema urinario, el sistema reproductivo, o una combinación de los mismos. En una realización, el ácido nucleico de mamífero comprende un locus genómico que codifica una proteína expresada en una médula ósea o una célula derivada de médula ósea. En una realización, el ácido nucleico comprende un locus genómico que codifica una proteína expresada en una célula de bazo. En una realización, el locus genómico comprende una secuencia de ADN genómico de ratón, una secuencia de ADN genómico de rata y una secuencia de ADN genómico humano, o una combinación de las mismas. En una realización, el locus genómico comprende, en cualquier orden, secuencias de ADN genómico de rata y humano. En una realización, el locus genómico comprende, en cualquier orden, secuencias de ADN genómico de ratón y humano. En una realización, el locus genómico comprende, en cualquier orden, secuencias de ADN genómico de ratón y rata. En una realización, el locus genómico comprende, en cualquier orden, secuencias de ADN genómico de rata, ratón y humano.
En una realización, el locus genómico comprende una secuencia de ADN genómico de ratón, una secuencia de ADN genómico de rata, una secuencia de ADN genómico humano, o una combinación de las mismas. En una realización, el locus genómico comprende, en cualquier orden, secuencias de ADN genómico de rata y humano. En una realización, el locus genómico comprende, en cualquier orden, secuencias de ADN genómico de ratón y humano. En una realización, el locus genómico comprende, en cualquier orden, secuencias de ADN genómico de ratón y rata. En una realización, el locus genómico comprende, en cualquier orden, secuencias de ADN genómico de rata, ratón y humano.
En una realización, la modificación genética comprende al menos un alelo de enfermedad humana de un gen humano. En una realización, la enfermedad humana es una enfermedad neurológica. En una realización, la enfermedad humana es una enfermedad cardiovascular. En una realización, la enfermedad humana es una enfermedad renal. En una realización, la enfermedad humana es una enfermedad muscular. En una realización, la enfermedad humana es una enfermedad de la sangre. En una realización, la enfermedad humana es un cáncer. En una realización, la enfermedad humana es una enfermedad del sistema inmune.
En una realización, el alelo de la enfermedad humana es un alelo dominante. En una realización, el alelo de la enfermedad humana es un alelo recesivo. En una realización, el alelo de la enfermedad humana comprende un alelo de polimorfismo de nucleótido único (SNP).
En una realización, la modificación genética produce una forma mutante de una proteína con una característica de unión alterada, localización alterada, expresión alterada y/o patrón de expresión alterado.
En una realización, el inserto de ácido nucleico comprende un casete de selección. En una realización, el casete de selección comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un marcador selectivo, en donde la secuencia de ácidos nucleicos está unida operativamente a un promotor activo en células ES de rata. En una realización, el marcador selectivo se selecciona de o comprende un gen de resistencia a la higromicina o un gen de resistencia a la neomicina.
En una realización, el ácido nucleico comprende un locus genómico que codifica una proteína expresada en una célula B. En una realización, el ácido nucleico comprende un locus genómico que codifica una proteína expresada en una célula B inmadura. En una realización, el ácido nucleico comprende un locus genómico que codifica una proteína expresada en una célula B madura.
En una realización, el inserto de ácido nucleico comprende un elemento regulador. En una realización, el elemento regulador es un promotor. En una realización, el elemento regulador es un potenciador. En una realización, el elemento regulador es un elemento de unión a represor transcripcional.
En una realización, la modificación genética comprende una eliminación de una secuencia no codificadora de proteínas, pero no comprende una eliminación de una secuencia codificadora de proteínas. En una realización, la eliminación de la secuencia no codificadora de proteínas comprende una eliminación de un elemento regulador. En una realización, la modificación genética comprende una eliminación de un elemento regulador. En una realización, la modificación genética comprende una adición de un promotor o un elemento regulador. En una realización, la modificación genética comprende una sustitución de un promotor o un elemento regulador.
ii. Casetes de Expresión
En el presente documento se divulgan polinucleótidos o moléculas de ácido nucleico que comprenden los diversos componentes empleados en un sistema de integración genómica diana descrito en el presente documento (es decir, uno cualquiera o cualquier combinación de agentes de nucleasa, sitios de reconocimiento, ácidos nucleicos de inserción, polinucleótidos).
Los términos "polinucleótido", "secuencia de polinucleótido", "secuencia de ácido nucleico" y "fragmento de ácido nucleico" se usan indistintamente en el presente documento. Estos términos abarcan secuencias de nucleótidos y similares. Un polinucleótido puede ser un polímero de ARN o ADN de cadena simple o doble, que opcionalmente contiene bases de nucleótidos sintéticas, no naturales o alteradas. Un polinucleótido en forma de un polímero de ADN puede estar compuesto por uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico, ADN sintético o mezclas de los mismos. Los polinucleótidos pueden comprender desoxirribonucleótidos y los ribonucleótidos incluyen tanto moléculas naturales como análogos sintéticos, y cualquier combinación de estos. Los polinucleótidos divulgados en el presente documento también abarcan todas las formas de secuencias que incluyen, pero no se limitan a, formas monocatenarias, formas bicatenarias, horquillas, estructuras de vástago y bucle, y similares.
Además, se describen polinucleótidos recombinantes que comprenden los diversos componentes del sistema de integración genómica direccionada. Los términos "polinucleótido recombinante" y "constructo de ADN recombinante" se usan indistintamente en el presente documento. Un constructo recombinante comprende una combinación artificial o heteróloga de secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, secuencias reguladoras y codificantes que no se encuentran juntas en la naturaleza. En otras realizaciones, Un constructo recombinante puede comprender secuencias reguladoras y secuencias de codificación que se derivan de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias de codificación derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente a la encontrada en la naturaleza. Tal constructo se puede usar sola o se puede usar en conjunto con un vector. Si se usa un vector, entonces la elección del vector depende del método que se usa para transformar las células huésped como es bien conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede usar un vector plasmídico. También se describen los elementos genéticos necesarios para transformar, seleccionar y propagar con éxito las células huésped que comprenden cualquiera de los fragmentos de ácido nucleico aislados divulgados en el presente documento. La selección puede realizarse mediante el análisis Southern del ADN, el análisis Northern de la expresión del ARNm, el análisis de inmunotransferencia de la expresión de proteínas o el análisis fenotípico, entre otros.
En realizaciones específicas, uno o más de los componentes del sistema de integración genómica diana descrito en el presente documento pueden proporcionarse en un casete de expresión para la expresión en una célula procariota, una célula eucariota, una célula bacteriana, una célula de levadura o una célula de mamífero u otro organismo. o tipo de celular de interés. El casete puede incluir secuencias reguladoras 5' y 3' operativamente unidas a un polinucleótido descrito en el presente documento. "Conectado operativamente" comprende una relación en donde los componentes operan enlazados funcionan de la manera deseada. Por ejemplo, un enlace operable entre un polinucleótido de interés y una secuencia reguladora (es decir, un promotor) es un enlace funcional que permite la expresión del polinucleótido de interés. Los elementos unidos operativamente pueden ser contiguos o no contiguos. Cuando se usa para referirse a la unión de dos regiones codificantes de proteínas, unidas operativamente significa que las regiones codificantes están en el mismo marco de lectura. En otro caso, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína puede estar unida operativamente a secuencias reguladoras (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencia silenciadora, etc.) para conservar la regulación transcripcional adecuada. En un caso, una secuencia de ácidos nucleicos de una región variable de inmunoglobulina (o segmentos V(D)J) puede unirse operativamente a una secuencia de ácidos nucleicos de una región constante de inmunoglobulina para permitir una recombinación adecuada entre las secuencias en una inmunoglobulina pesada o secuencia de la cadena ligera.
El casete puede contener adicionalmente al menos un polinucleótido adicional de interés para ser cointroducido en el organismo. Alternativamente, el polinucleótido adicional de interés puede proporcionarse en múltiples casetes de expresión. Dicho casete de expresión está provisto de una pluralidad de sitios de restricción y/o sitios de recombinación para la inserción de un polinucleótido recombinante para estar bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras. El casete de expresión puede contener adicionalmente genes marcadores de selección.
El casete de expresión puede incluir en la dirección de transcripción 5'-3', una región de iniciación de la transcripción y la traducción (es decir, un promotor), un polinucleótido recombinante descrito aquí, y una región de terminación de la transcripción y traducción (es decir, la región de terminación) funcional en célula de mamífero o una célula huésped de interés. Las regiones reguladoras (es decir, los promotores, las regiones reguladoras de la transcripción y las regiones de terminación de la traducción) y/o un polinucleótido descrito en el presente documento pueden ser nativos/análogos a la célula huésped o entre sí. Alternativamente, las regiones reguladoras y/o un polinucleótido descrito en el presente documento pueden ser heterólogos a la célula huésped o entre sí. Por ejemplo, un promotor operativamente enlazado a un polinucleótido heterólogo es de una especie diferente de la especie de la que se derivó el polinucleótido, o, si de la misma/especie análoga, uno o ambos están sustancialmente modificados de su forma original y/o locus genómico, o el promotor no es el promotor nativo para el polinucleótido unido operativamente. Alternativamente, las regiones reguladoras y/o un polinucleótido recombinante descrito en el presente documento pueden ser completamente sintéticos.
La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación de la transcripción, puede ser nativa con el polinucleótido recombinante unido operativamente, puede ser nativa con la célula huésped o puede derivar de otra fuente (es decir, extraña o heteróloga) al promotor, el polinucleótido recombinante, la célula huésped o cualquier combinación de los mismos.
En la preparación del casete de expresión, los diversos fragmentos de ADN pueden manipularse, para proporcionar las secuencias de ADN en la orientación apropiada. Hacia este fin, pueden emplearse adaptadores o enlazadores para unir los fragmentos de ADN u otras manipulaciones pueden estar implicadas para proporcionar sitios de restricción convenientes, eliminación de ADN superfluo, eliminación de sitios de restricción, o similares. Para este propósito, pueden estar implicadas mutagénesis in vitro, reparación de cebadores, restricción, recocido, resustituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones.
Se pueden usar varios promotores en los casetes de expresión divulgados en el presente documento. Los promotores pueden seleccionarse en función del resultado deseado. Se reconoce que diferentes aplicaciones pueden mejorarse mediante el uso de diferentes promotores en los casetes de expresión para modular el tiempo, la ubicación y/o el nivel de expresión del polinucleótido de interés. Dichas constructos de expresión también pueden contener, si se desea, una región reguladora del promotor (por ejemplo, una expresión inducible, constitutiva, regulada desde el punto de vista ambiental o del desarrollo, o expresión selectiva/específica de células o tejidos), un sitio de inicio de iniciación de la transcripción, un ribosoma sitio de unión, una señal de procesamiento de ARN, un sitio de terminación de la transcripción y/o una señal de poliadenilación.
El casete de expresión que contiene los polinucleótidos divulgados en el presente documento también puede comprender un gen marcador de selección para la selección de células transformadas. Los genes marcadores seleccionables se utilizan para la selección de células o tejidos transformados.
Cuando sea apropiado, las secuencias empleadas en los métodos y composiciones (es decir, el polinucleótido de interés, el agente de nucleasa, etc.) pueden optimizarse para aumentar la expresión en la célula. Es decir, los genes se pueden sintetizar usando codones preferidos en una célula de interés dada que incluye, por ejemplo, codones preferidos de mamíferos, codones preferidos de humanos, codones preferidos de roedores, codones preferidos de ratón, codones preferidos de rata, etc. para expresión mejorada.
Los diversos métodos y composiciones divulgados en el presente documento pueden emplear marcadores de selección. Se pueden usar diversos marcadores de selección en los métodos y composiciones divulgados en el presente documento. Dichos marcadores de selección pueden, por ejemplo, conferir resistencia a un antibiótico tal como G418, higromicina, blastocidina, neomicina o puromicina. Dichos marcadores de selección incluyen neomicina fosfotransferasa (neor), higromicina B fosfotransferasa (hygr), puromicina-N-acetiltransferasa (purof) y blasticidina S desaminasa (bsrf). En otras realizaciones más, el marcador de selección está unido operativamente a un promotor inducible y la expresión del marcador de selección es tóxica para la célula. Ejemplos no limitantes de dichos marcadores de selección incluyen xantina/guanina fosforribosil transferasa (gpt), haoxipantantina-guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT) o timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV-TK). El polinucleótido que codifica los marcadores de selección está unido operativamente a un promotor activo en la célula.
iii. Vectores de direccionamiento
Los vectores de direccionamiento se emplean para introducir el ácido nucleico de inserción en el locus diana del ácido nucleico de rata. El vector de direccionamiento comprende el ácido nucleico de inserto y además comprende un brazo de homología 5' y 3', que flanquean el ácido nucleico de inserto. Los brazos de homología, que flanquean el ácido nucleico de inserción, corresponden a regiones dentro del locus diana del ácido nucleico de rata. Para facilitar la referencia, las regiones genómicas afines correspondientes dentro del locus genómico diana se denominan en el presente documento "sitios objetivo". Por ejemplo, un vector de direccionamiento puede comprender un primer ácido nucleico de inserción flanqueado por un primer y un segundo brazo de homología complementarios a un primer y un segundo sitio de destino. Como tal, el vector de direccionamiento ayuda de ese modo a la integración del ácido nucleico de inserción en el objetivo locus del ácido nucleico de rata a través de un evento de recombinación homóloga que se produce entre los brazos de homología y los sitios diana complementarios dentro del genoma de la célula.
En una realización, el locus diana del ácido nucleico de rata comprende una primera secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria al brazo de homología 5' y una segunda secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria al brazo de homología 3'. En una realización, la primera y la segunda secuencias de ácidos nucleicos están separadas por al menos 5kb. En otra realización, la primera y la segunda secuencias de ácidos nucleicos están separadas por al menos 5kb pero menos de 200kb. En una realización, la primera y la segunda secuencias de ácidos nucleicos están separadas por al menos 10 kb. En una realización, la primera y la segunda secuencia de ácidos nucleicos están separadas por al menos 20kb, al menos 30kb, al menos 40kb, al menos 50kb, al menos 60kb, al menos 70kb, al menos 80kb, al menos 90kb, al menos 100kb, al menos 110kb, al menos 120kb, al menos 130kb, al menos 140kb, al menos 150kb, al menos 160kb, al menos 170kb, al menos 180kb, al menos 190kb, o al menos 200kb. En otras realizaciones adicionales, la primera y la segunda secuencia de ácidos nucleicos están separadas por al menos 5kb pero menos de 10kb, al menos 5kb pero menos de 3Mb, al menos 10kb pero menos de 20kb, al menos 20kb pero menos de 40kb, al menos 40kb pero menos de 60kb, al menos 60kb pero menos de 80kb, al menos aproximadamente 80kb pero menos de 100kb, al menos 100kb pero menos de 150kb, o al menos 150kb pero menos de 200kb, al menos aproximadamente 200kb pero menos de aproximadamente 300kb, al menos unos 300kb pero menos de unos 400kb, al menos unos 400kb pero menos de unos 500kb, al menos unos 500kb pero menos de aproximadamente 1Mb, al menos aproximadamente 1.5Mb pero menos de unos 2Mb, al menos aproximadamente 1Mb pero menos de unos 1.5Mb, al menos aproximadamente 2Mb, pero menos de 2.5Mb, al menos aproximadamente 2.5Mb pero menos de 3Mb, o al menos aproximadamente 2Mb pero menos de aproximadamente 3Mb.
Un brazo de homología del vector de direccionamiento puede tener cualquier longitud que sea suficiente para promover un evento de recombinación homóloga con un sitio objetivo correspondiente, que incluya, por ejemplo, al menos 5-10kb, 5-15kb, 10-20kb, 20-30kb, 30-40kb, 40-50kb, 50-60kb, 60-70kb, 70-80kb, 80-90kb, 90-100kb, 100-110kb, 110-120kb, 120-130kb, 130-140kb, 140-150kb, 150-160kb, 160-170kb, 170-180kb, 180-190kb, 190-200kb de longitud o más. Como se describe con más detalle a continuación, los vectores de orientación grandes pueden emplear brazos de orientación de mayor longitud. En una realización específica, la suma total del brazo de homología 5' y el brazo de homología 3' es al menos 10kb o la suma total del brazo de homología 5' y el brazo de homología 3' es de al menos aproximadamente 16kb a aproximadamente 100kb o alrededor de 30kb a unos 100kb. En otras realizaciones, el tamaño de la suma total del total de los brazos de homología 5' y 3' de LTVEC es de aproximadamente 10kb a aproximadamente 150kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 100kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 75kb, de 20kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 20kb a aproximadamente 100kb, aproximadamente 20kb a aproximadamente 75kb, aproximadamente 30kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 30kb a aproximadamente 100kb, aproximadamente 30kb a aproximadamente 75kb, aproximadamente 40kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 40kb a aproximadamente 100kb, aproximadamente 40kb, aproximadamente 75kb, aproximadamente 50kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 50kb a aproximadamente 100kb, o aproximadamente 50kb a aproximadamente 75kb, aproximadamente 10kb a aproximadamente 30kb, aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, aproximadamente 80kb, aproximadamente 100kb, aproximadamente 100kb a aproximadamente 120kb, o desde aproximadamente 120kb hasta aproximadamente 150kb. En una realización, el tamaño de la eliminación es el mismo o similar al tamaño de la suma total de los brazos de homología 5' y 3' del LTVEC.
Cuando se emplean agentes de nucleasa, las regiones genómicas afines correspondientes a los brazos de homología 5' y 3' de un vector de direccionamiento están "ubicadas en una proximidad suficiente" a los sitios diana de nucleasa para promover la aparición de un evento de recombinación homóloga entre las regiones genómicas afines y los brazos de homología en una ruptura de muesca o doble hebra en el sitio de reconocimiento. Por ejemplo, los sitios objetivo de las nucleasas pueden ubicarse en cualquier lugar entre las regiones genómicas afines correspondientes a los brazos de homología 5' y 3'. En realizaciones específicas, el sitio de reconocimiento es inmediatamente adyacente a al menos una o ambas regiones genómicas afines.
Como se usa en el presente documento, un brazo de homología y un sitio objetivo (es decir, una región genómica relacionada) se "complementan" o son "complementarios" entre sí cuando las dos regiones comparten un nivel suficiente de identidad de secuencia entre sí para actuar como sustratos para una reacción de recombinación homóloga. Por "homología" se entiende secuencias de ADN que son idénticas o comparten la identidad de secuencia con una secuencia correspondiente o "complementaria". La identidad de secuencia entre un sitio objetivo dado y el brazo de homología correspondiente encontrado en el vector de direccionamiento puede ser cualquier grado de identidad de secuencia que permita que se produzca una recombinación homóloga. Por ejemplo, la cantidad de identidad de secuencia compartida por el brazo de homología del vector de direccionamiento (o un fragmento del mismo) y el sitio objetivo (o un fragmento del mismo) puede ser al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia, de modo que las secuencias experimentan recombinación homóloga. Además, una región complementaria de homología entre el brazo de homología y el sitio diana complementario puede ser de cualquier longitud que sea suficiente para promover la recombinación homóloga en el sitio de reconocimiento escindido. Por ejemplo, un brazo de homología dado y/o un sitio objetivo complementario pueden comprender regiones complementarias de homología que son al menos 5-10kb, 5-15kb, 10-20kb, 20-30kb, 30-40kb, 40-50kb, 50-60kb , 60-70kb, 70-80kb, 80-90kb, 90-100kb, 100-110kb, 110-120kb, 120-130kb, 130-140kb, 140-150kb, 150-160kb, 160-170kb, 170-180kb, 180-190kb, 190-200kb de longitud o mayor (como se describe en los vectores LTVEC descritos en otra parte del presente documento) de modo que el brazo de homología tenga suficiente homología para experimentar recombinación homóloga con los sitios diana correspondientes dentro del genoma de la célula. Para facilitar la referencia, los brazos de homología se denominan en el presente documento como un brazo de homología 5' y 3'. Esta terminología se relaciona con la posición relativa de los brazos de homología con respecto al ácido nucleico de inserción dentro del vector de direccionamiento.
Por lo tanto, los brazos de homología del vector de direccionamiento están diseñados para ser complementarios de un sitio objetivo con el locus diana. Por lo tanto, los brazos de homología pueden ser complementarios a un locus que es nativo a la célula, o alternativamente pueden ser complementarios a una región de un segmento heterólogo o exógeno de ADN que se integró en el genoma de la célula, incluidos, entre otros a, transgenes, casetes de expresión, o regiones heterólogas o exógenas del ADN genómico. Alternativamente, los brazos de homología del vector de direccionamiento pueden ser complementarios a una región de un cromosoma artificial humano o cualquier otra región genómica diseñada contenida en una célula huésped apropiada. Aún más, los brazos de homología del vector de direccionamiento pueden ser complementarios o derivados de una región de una biblioteca BAC, una biblioteca de cósmidos o una biblioteca de fagos P1. Por lo tanto, en realizaciones específicas, los brazos de homología del vector de direccionamiento son complementarios a un locus genómico de rata que es nativo, heterólogo o exógeno a una célula dada. En otras formas de realización, los brazos de homología son complementarios a un locus genómico de rata que no se puede atacar utilizando un método convencional o que pueden ser atacados solo incorrectamente o con una eficiencia significativamente baja, en ausencia de una ruptura de muesca o doble cadena inducida por una nucleasa agente. En una realización, los brazos de homología se derivan de un ADN sintético.
En otras realizaciones más, los brazos de homología 5' y 3' son complementarios al mismo genoma que el genoma direccionado. En una realización, los brazos de homología son de un genoma relacionado, por ejemplo, el genoma direccionado es un genoma de rata de una primera cepa, y los brazos direccionados son de un genoma de rata de una segunda cepa, en donde la primera cepa y la segunda cepa son diferente. En otras realizaciones, los brazos de homología son del genoma del mismo animal o del genoma de la misma cepa, por ejemplo, el genoma objetivo es un genoma de rata de una primera cepa, y los brazos direccionados son de un genoma de rata de la misma rata o de la misma cepa.
El vector de direccionamiento (tal como un vector de direccionamiento grande) también puede comprender un casete de selección o un gen indicador como se describe en otra parte en el presente documento. El casete de selección puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un marcador de selección, en donde la secuencia de ácidos nucleicos está unida operativamente a un promotor. El promotor puede estar activo en una célula procariota de interés y/o activo en una célula eucariótica de interés. Dichos promotores pueden ser un promotor inducible, un promotor que es endógeno al gen informador o la célula, un promotor que es heterólogo al gen informador o a la célula, un promotor específico de la célula, un promotor específico del tejido o un promotor específico de la etapa de desarrollo. En una realización, el marcador de selección se selecciona de o comprende neomicina fosfotransferasa (neor), higromicina B fosfotransferasa (hygr), puromicina-N-acetiltransferasa (purof), blasticidina S desaminasa (bsrr), xantina/guanina fosforribosil transferasa (gpt), y la timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV-k), y/o una combinación de los mismos. El marcador de selección del vector de direccionamiento puede estar flanqueado por los brazos de homología 5' y 3' o puede encontrarse 5' o 3' en los brazos de homología.
En una realización, el vector de direccionamiento (como un vector de direccionamiento grande) comprende un gen informador unido operativamente a un promotor, en donde el gen informador codifica una proteína informadora seleccionada del grupo que consiste en o comprende LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP), Emerald, proteína fluorescente verde mejorada (EGFP), CyPet, proteína fluorescente cian (CFP), Cerulean, T-Sapphire, luciferasa, fosfatasa alcalina y/o una combinación de los mismos. Dichos genes informadores pueden unirse operativamente a un promotor activo en la célula. Dichos promotores pueden ser un promotor inducible, un promotor que es endógeno al gen del informe o la célula, un promotor que es heterólogo al gen informador o a la célula, un promotor específico de la célula, un promotor específico del tejido o un promotor específico de etapa de desarrollo.
En una realización, el uso combinado del vector de direccionamiento (incluyendo, por ejemplo, un vector de direccionamiento grande) con el agente de nucleasa da como resultado un aumento de la eficacia de direccionamiento en comparación con el uso del vector de direccionamiento solo. En una realización, cuando el vector de direccionamiento se usa junto con el agente de nucleasa, la eficiencia de direccionamiento del vector de direccionamiento se incrementa al menos dos veces, al menos tres veces, o al menos 4 veces cuando se compara con cuando el objetivo vector se utiliza solo.
Cuando se emplea un vector de direccionamiento, el diseño del vector puede ser tal que permita la inserción de una secuencia dada que es de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 200 kb como se describe en el presente documento. En una realización, la inserción es de aproximadamente 5kb a aproximadamente 10kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 20kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 30kb, de aproximadamente 30kb a aproximadamente 40kb, de aproximadamente 40kb a aproximadamente 50kb, de aproximadamente 50kb a aproximadamente 60kb, de aproximadamente 60kb a aproximadamente 70kb, desde aproximadamente 80kb a aproximadamente 90kb, desde aproximadamente 90kb a aproximadamente 100kb, desde aproximadamente 100kb a aproximadamente 110kb, desde aproximadamente 110kb a aproximadamente 120kb, desde aproximadamente 120kb a aproximadamente 130kb, desde aproximadamente 130kb a aproximadamente 140kb, desde aproximadamente 140kb a aproximadamente 150kb, desde aproximadamente 150kb a aproximadamente 160kb, desde aproximadamente 160kb a aproximadamente 170kb, desde aproximadamente 170kb a aproximadamente 180kb, desde aproximadamente 180kb a aproximadamente 190kb, o desde aproximadamente 190kb a aproximadamente 200kb, desde aproximadamente 5kb a aproximadamente 10kb, desde aproximadamente 10kb a aproximadamente 20kb, desde aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, desde aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, desde aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, desde aproximadamente 80kb a aproximadamente 100kb, desde aproximadamente 100kb a aproximadamente 150kb, desde aproximadamente 150kb a aproximadamente 200kb, desde aproximadamente 200kb a aproximadamente 250kb, desde aproximadamente 250kb a aproximadamente 300kb, desde aproximadamente 300kb a aproximadamente 350kb, o desde alrededor de 350kb hasta alrededor de 400kb.
Cuando se emplea un vector de direccionamiento, el diseño del vector puede ser tal que permita el reemplazo de una secuencia dada que es de aproximadamente 5kb a aproximadamente 200kb o de aproximadamente 5kb a aproximadamente 3.0Mb como se describe aquí. En una realización, el reemplazo es de aproximadamente 5kb a aproximadamente 10kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 20kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 30kb, de aproximadamente 30kb a aproximadamente 40kb, de aproximadamente 40kb a aproximadamente 50kb, de aproximadamente 50kb a aproximadamente 60kb, de aproximadamente 60kb a aproximadamente 70kb, desde aproximadamente 80kb a aproximadamente 90kb, desde aproximadamente 90kb a aproximadamente 100kb, desde aproximadamente 100kb a aproximadamente 110kb, desde aproximadamente 110kb a aproximadamente 120kb, desde aproximadamente 120kb a aproximadamente 130kb, desde aproximadamente 130kb a aproximadamente 140kb, desde aproximadamente 140kb a aproximadamente 150kb, desde aproximadamente 150kb a aproximadamente 160kb, desde aproximadamente 160kb a aproximadamente 170kb, desde aproximadamente 170kb a aproximadamente 180kb, desde aproximadamente 180kb a aproximadamente 190kb, desde aproximadamente 190kb a aproximadamente 200kb, desde aproximadamente 5kb a aproximadamente 10kb, desde aproximadamente 10kb de aproximadamente 20kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, de aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, de aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, de aproximadamente 80kb a aproximadamente 100kb, de aproximadamente 100kb a aproximadamente 150kb, o de aproximadamente 150kb a aproximadamente 200kb, de aproximadamente 200kb a unos 300kb, desde unos 300kb a unos 400kb, desde unos 400kb a unos 500kb, de aproximadamente 500kb a aproximadamente 1Mb, de aproximadamente 1Mb a aproximadamente 1.5Mb, de aproximadamente 1.5Mb a aproximadamente 2Mb, de aproximadamente 2Mb a aproximadamente 2.5Mb, o de aproximadamente 2.5Mb a aproximadamente 3Mb.
En una realización, el vector de direccionamiento comprende un gen de recombinasa específico del sitio. En una realización, el gen de recombinasa específico del sitio codifica una recombinasa Cre. En una realización, el gen de la recombinasa Cre es Crei, en donde dos Exones que codifican la recombinasa Cre están separados por un intrón para evitar su expresión en una célula procariota.
En una realización, el gen de recombinasa Cre comprende además una señal de localización nuclear para facilitar la localización de Cre (o cualquier agente de recombinasa o nucleasa) en el núcleo (por ejemplo, el gen es un gen NL-Cre). En una realización específica, el gen de la recombinasa Cre comprende además una señal de localización nuclear y un intrón (por ejemplo, NL-Crei).
En diversas realizaciones, un promotor adecuado para la expresión del agente de nucleasa (que incluye la recombinasa Cre o Crei discutida anteriormente) se selecciona de o comprende un Prm1, Blimp1, Gata6, Gata4, Igf2, Lhx2, Lhx5 y/o Pax3. En una realización específica, el promotor es el promotor Gata6 o Gata4. Los diversos promotores pueden ser de cualquier organismo, incluido, por ejemplo, un roedor como un ratón o una rata. En otra realización específica, el promotor es un promotor Prm1. En otra realización específica, el promotor es un promotor Prm1 de rata. En otra realización específica, el promotor es un promotor Prm1 de ratón. En otra realización específica, el promotor es un promotor Blimp1 o un fragmento del mismo, por ejemplo, un fragmento de 1kb o 2kb de un promotor Blimp1. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 8,697,851 y la Publicación de Solicitud de los Estados Unidos 2013-0312129.
iv. Vectores de direccionamiento grandes
El término "vector de direccionamiento grande" o "LTVEC", como se usa en el presente documento, comprende vectores de direccionamiento grandes que comprenden brazos de homología que corresponden y se derivan de secuencias de ácidos nucleicos más grandes que las utilizadas típicamente por otros enfoques destinados a realizar un direccionamiento homólogo en las células y/o que comprende ácidos nucleicos de inserción que comprenden secuencias de ácidos nucleicos más grandes que las utilizadas típicamente por otras metodologías destinadas a realizar un direccionamiento de recombinación homóloga en células. Por ejemplo, el LTVEC hace posible la modificación de loci grandes que no pueden ser acomodados por los vectores de direccionamiento basados en plásmidos tradicionales debido a sus limitaciones de tamaño. En realizaciones específicas, los brazos de homología y/o el ácido nucleico de inserción de LTVEC comprenden la secuencia genómica de una célula eucariota. El tamaño del LTVEC es demasiado grande para permitir el rastreo de eventos de direccionamiento mediante ensayos convencionales, por ejemplo, inmunotransferencia Southern y PCR de largo alcance (por ejemplo, 1kb-5kb). Ejemplos de LTVEC incluyen, pero no están limitados a, vectores derivados de un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cromosoma artificial humano o un cromosoma artificial de levadura (YAC). Ejemplos no limitativos de LTVEC y los métodos para hacerlos se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 6,586,251, 6,596,541, 7,105,348, y WO 2002/036789 (PCT/USO1/45375), y US 2013/0137101.
El LTVEC puede ser de cualquier longitud, incluyendo, pero no limitado a, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 400kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 30kb, de aproximadamente 30kb a 40kb, de aproximadamente 40kb a aproximadamente 50kb, de aproximadamente 50kb a aproximadamente 75kb, de aproximadamente 75kb a aproximadamente 100kb, de aproximadamente 100kb a 125kb, de aproximadamente 125kb a aproximadamente 150kb, de aproximadamente 150kb a aproximadamente 175kb, aproximadamente 175kb a aproximadamente 200kb, de aproximadamente 200kb a aproximadamente 225kb, de aproximadamente 225kb a aproximadamente 250kb, de aproximadamente 250kb a aproximadamente 275kb o de aproximadamente 275kb a aproximadamente 300kb, de aproximadamente 200kb a aproximadamente 300kb, de aproximadamente 300kb a aproximadamente 350kb, de aproximadamente 350kb a aproximadamente 400kb, de aproximadamente 350kb a aproximadamente 550kb. En una realización, el LTVEC es de aproximadamente 100 kb.
En una realización, el LTVEC comprende un inserto de ácido nucleico que varía de aproximadamente 5kb a aproximadamente 200kb, de aproximadamente 5kb a aproximadamente 10kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 20kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 30kb, de aproximadamente 0.5kb a aproximadamente 30kb, de aproximadamente 0.5kb a aproximadamente 40kb, desde aproximadamente 30kb a aproximadamente 150kb, desde aproximadamente 0.5kb a aproximadamente 150kb, desde aproximadamente 30kb a aproximadamente 40kb, desde aproximadamente 40kb a aproximadamente 50kb, desde aproximadamente 60kb a aproximadamente 70kb, desde aproximadamente 80kb a aproximadamente 90kb, desde aproximadamente 90kb a aproximadamente 100kb, desde aproximadamente 100kb a aproximadamente 110kb, desde aproximadamente 120kb a aproximadamente 130kb, desde aproximadamente 130kb a aproximadamente 140kb, desde aproximadamente 140kb a aproximadamente 150kb, desde aproximadamente 150kb a aproximadamente 160kb, desde aproximadamente 160kb a aproximadamente 170kb, desde aproximadamente 170kb a aproximadamente 180kb, desde aproximadamente 180kb a aproximadamente 190kb, o desde aproximadamente 190kb a aproximadamente 200kb, desde aproximadamente 5kb a aproximadamente 10kb, desde aproximadamente 10kb a aproximadamente 20kb, desde aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, desde aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, desde aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, desde aproximadamente 80kb a aproximadamente 100kb, desde aproximadamente 100kb a aproximadamente 150kb, para de aproximadamente 150kb a aproximadamente 200kb, de aproximadamente 200kb a aproximadamente 250kb, de aproximadamente 250kb a aproximadamente 300kb, de aproximadamente 300kb a aproximadamente 350kb, o de aproximadamente 350kb a aproximadamente 400kb;
Cuando se emplea un LTVEC, el diseño del vector puede ser tal que permita la sustitución de una secuencia dada que es de aproximadamente 5kb a aproximadamente 200kb o de aproximadamente 5kb a aproximadamente 3Mb como se describe en el presente documento. En una realización, el reemplazo es de aproximadamente 5kb a aproximadamente 10kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 20kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 30kb, de aproximadamente 30kb a aproximadamente 40kb, de aproximadamente 40kb a aproximadamente 50kb, de aproximadamente 50kb a aproximadamente 60kb, de aproximadamente 60kb a aproximadamente 70kb, desde aproximadamente 80kb a aproximadamente 90kb, desde aproximadamente 90kb a aproximadamente 100kb, desde aproximadamente 100kb a aproximadamente 110kb, desde aproximadamente 110kb a aproximadamente 120kb, desde aproximadamente 120kb a aproximadamente 130kb, desde aproximadamente 130kb a aproximadamente 140kb, desde aproximadamente 140kb a aproximadamente 150kb, desde aproximadamente 150kb a aproximadamente 160kb, desde aproximadamente 160kb a aproximadamente 170kb, desde aproximadamente 170kb a aproximadamente 180kb, desde aproximadamente 180kb a aproximadamente 190kb, desde aproximadamente 190kb a aproximadamente 200kb, desde aproximadamente 5kb a aproximadamente 10kb, desde aproximadamente 10kb de aproximadamente 20kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, de aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, de aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, de aproximadamente 80kb a aproximadamente 100kb, de aproximadamente 100kb a aproximadamente 150kb, o de aproximadamente 150kb a aproximadamente 200kb, de aproximadamente 200kb a unos 300kb, desde unos 300kb a unos 400kb, desde unos 400kb a unos 500kb, de aproximadamente 500kb a aproximadamente 1Mb, de aproximadamente 1Mb a aproximadamente 1.5Mb, de aproximadamente 1.5Mb a aproximadamente 2Mb, de aproximadamente 2Mb a aproximadamente 2.5Mb, o de aproximadamente 2.5Mb a aproximadamente 3Mb.
En una realización, los brazos de homología de LTVEC se derivan de una biblioteca BAC, una biblioteca de cósmidos o una biblioteca de fagos P1. En otras realizaciones, los brazos de homología se derivan del locus genómico diana de la célula y, en algunos casos, el locus genómico diana, que el LTVEC está diseñado para direccionar, no es direccionable utilizando un método convencional. En otras realizaciones más, los brazos de homología se derivan de un ADN sintético.
En una realización, una suma total del brazo de homología 5' y el brazo de homología 3' en el LTVEC es de al menos 10 kb. En otras realizaciones, la suma total de los brazos de homología 5' y 3' del LTVEC es de aproximadamente 10kb a aproximadamente 30kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, de aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, de aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, de aproximadamente 80kb a aproximadamente 100kb, de 100kb a aproximadamente 120kb, de aproximadamente 120kb a aproximadamente 140kb, de aproximadamente 140kb a aproximadamente 160kb, de aproximadamente 160kb a aproximadamente 180kb, de aproximadamente 180kb a aproximadamente 200kb. En una realización, la suma total de los brazos de homología 5' y 3' de LTVEC es de aproximadamente 30 kb a aproximadamente 100 kb. En otras realizaciones, el tamaño de la suma total del total de los brazos de homología 5' y 3' de LTVEC es de aproximadamente 10kb a aproximadamente 150kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 100kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 75kb, de 20kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 20kb a aproximadamente 100kb, aproximadamente 20kb a aproximadamente 75kb, aproximadamente 30kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 30kb a aproximadamente 100kb, aproximadamente 30kb a aproximadamente 75kb, aproximadamente 40kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 40kb a aproximadamente 100kb, aproximadamente 40kb a aproximadamente 75kb, aproximadamente 50kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 50kb a aproximadamente 100kb, o aproximadamente 50kb a aproximadamente 75kb, aproximadamente 10kb a aproximadamente 30 kb, aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, aproximadamente 80kb, aproximadamente 100kb, aproximadamente 100kb a aproximadamente 120kb, o desde aproximadamente 120kb hasta aproximadamente 150kb. En una realización, el tamaño de la eliminación es el mismo o similar al tamaño de la suma total de los brazos de homología 5' y 3' del LTVEC.
En otras realizaciones, el brazo de homología 5' varía de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 100 kb. En una realización, el brazo de homología 3' varía de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 100 kb. En otras realizaciones, la suma total de los brazos de homología 5' y 3' es de aproximadamente 5kb a aproximadamente 10kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 20kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 30kb, de aproximadamente 30kb a aproximadamente 40kb, de aproximadamente 40kb a aproximadamente 50kb, de aproximadamente 50kb a aproximadamente 60kb, de aproximadamente 60kb a aproximadamente 70kb, de aproximadamente 70kb a aproximadamente 80kb, de aproximadamente 80kb a aproximadamente 90kb, de aproximadamente 90kb a aproximadamente 100kb, de aproximadamente 100kb a aproximadamente 110kb, de aproximadamente 110kb a aproximadamente 120kb de aproximadamente 120kb a aproximadamente 130kb, de aproximadamente 130kb a aproximadamente 140kb, de aproximadamente 140kb a aproximadamente 150kb, de aproximadamente 150kb a aproximadamente 160kb, de aproximadamente 160kb a aproximadamente 170kb, de aproximadamente 170kb a aproximadamente 180kb, de aproximadamente 180kb a aproximadamente 190kb, de aproximadamente 190kb a aproximadamente 200kb, o de aproximadamente 30kb a aproximadamente 100kb, aproximadamente 10kb a aproximadamente 30kb, aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, aproximadamente 80kb a aproximadamente 100kb, aproximadamente 100kb a aproximadamente 120kb , o desde aproximadamente 120kb hasta aproximadamente 150kb.
En una realización, el LTVEC comprende un ácido nucleico de inserción que es homólogo u ortólogo a una secuencia de ácidos nucleicos de rata flanqueada por los brazos de homología de LTVEC. En una realización, la secuencia de ácidos nucleicos de inserción es de una especie distinta de una rata. En una realización, el ácido nucleico de inserción que es homólogo u ortólogo a la secuencia de ácidos nucleicos de rata es un ácido nucleico de mamífero. En una realización, el ácido nucleico de mamífero es un ácido nucleico de ratón. En una realización, el ácido nucleico de mamífero es un ácido nucleico humano. En una realización, el ácido nucleico de inserción es un ADN genómico. En una realización, el inserto es de 5kb a 200kb como se describe anteriormente.
En una realización, el LTVEC comprende un casete de selección o un gen indicador. Varias formas del gen de casete de selección y informador que pueden emplearse se discuten en otra parte en el presente documento.
Como se describe en otra parte en el presente documento, el LTVEC también puede usarse en los métodos divulgados en el presente documento en combinación con un agente de nucleasa que promueve una recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus diana de un ácido nucleico de rata en una célula de rata pluripotente.
En una realización, el vector de direccionamiento grande (LTVEC) comprende un gen de recombinasa específico del sitio. En una realización, el gen de recombinasa específico del sitio codifica una recombinasa Cre. En una realización, el gen de la recombinasa Cre es Crei, en donde dos Exones que codifican la recombinasa Cre están separados por un intrón para evitar su expresión en una célula procariota. En una realización, el gen de recombinasa Cre comprende además una señal de localización nuclear para facilitar la localización de Cre (o cualquier agente de recombinasa o nucleasa) en el núcleo (por ejemplo, el gen es un gen NL-Cre). En una realización específica, el gen de la recombinasa Cre comprende además una señal de localización nuclear y un intrón (por ejemplo, NL-Crei).
En diversas realizaciones, un promotor adecuado para la expresión del agente de nucleasa (que incluye la recombinasa Cre o Crei discutida anteriormente) se selecciona entre Prm1, Blimp1, Gata6, Gata4, Igf2, Lhx2, Lhx5 y Pax3. En una realización específica, el promotor es el promotor Gata6 o Gata4. Los diversos promotores pueden ser de cualquier organismo, incluido, por ejemplo, un roedor como un ratón o una rata. En otra realización específica, el promotor es un promotor Prm1. En otra realización específica, el promotor es un promotor Prm1 de rata. En otra realización específica, el promotor es un promotor Prm1 de ratón. En otra realización específica, el promotor es un promotor Blimp1 o un fragmento del mismo, por ejemplo, un fragmento de 1 kb o 2 kb de un promotor Blimp1. Consulte, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 8,697,851 y la Publicación de Solicitud de los Estados Unidos 2013­ 0312129.
En una realización, el LTVEC comprende un ácido nucleico de inserción que puede producir una eliminación, adición, reemplazo o una combinación de los mismos de una región del locus ApoE de rata, el locus IL-2Rg, el locus Rag2, el locus Rag1 y/o el locus Rag2/Rag1 como se explica en detalle en otra parte del presente documento. En realizaciones específicas, la modificación genética en el locus ApoE da como resultado una disminución, un aumento o una modulación en la actividad ApoE, la actividad IL-2Rg, la actividad Rag2, la actividad Rag1 y/o la actividad Rag2 y Rag1. En una realización, se genera un ApoE bloqueado, y un IL-2Rg bloqueado, un Rag2 bloqueado, un Rag1 bloqueado, se genera un Rag2/Rag1 bloqueado. Como se explica más adelante, los agentes de nucleasa pueden emplearse con cualquiera de los sistemas de orientación LTVEC para dirigirse a cualquier locus genómico de interés.
v. Agentes de nucleasa y sitios de reconocimiento para agentes de nucleasa
Como se describe en detalle anteriormente, los agentes de nucleasa pueden utilizarse en los métodos y composiciones descritos aquí para ayudar en la modificación del locus diana tanto en una célula procariota como en una célula de rata pluripotente. Dicho agente de nucleasa puede promover la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y el locus diana. En una realización, el agente de nucleasa comprende un agente de endonucleasa.
Como se usa en el presente documento, el término "sitio de reconocimiento para un agente de nucleasa" comprende una secuencia de ADN en donde se induce una ruptura de muesca o de doble cadena por un agente de nucleasa. El sitio de reconocimiento para un agente de nucleasa puede ser endógeno (o nativo) a la célula o el sitio de reconocimiento puede ser exógeno a la célula. En realizaciones específicas, el sitio de reconocimiento es exógeno a la célula y, por lo tanto, no está presente de forma natural en el genoma de la célula. En otras realizaciones adicionales, el sitio de reconocimiento es exógeno para la célula y para los polinucleótidos de interés que se desea posicionar en el locus genómico diana. En realizaciones adicionales, el sitio de reconocimiento exógeno o endógeno está presente solo una vez en el genoma de la célula huésped. En realizaciones específicas, se identifica un sitio nativo o endógeno que ocurre solo una vez dentro del genoma. Dicho sitio puede usarse luego para diseñar agentes de nucleasa que producirán una ruptura de muesca o de doble cadena en el sitio de reconocimiento endógeno.
La longitud del sitio de reconocimiento puede variar, e incluye, por ejemplo, sitios de reconocimiento que tienen al menos 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 o más nucleótidos de longitud. En una realización, cada monómero del agente de nucleasa reconoce un sitio de reconocimiento de al menos 9 nucleótidos. En otras realizaciones, el sitio de reconocimiento tiene una longitud de aproximadamente 9 a aproximadamente 12 nucleótidos, de aproximadamente 12 a aproximadamente 15 nucleótidos, de aproximadamente 15 a aproximadamente 18 nucleótidos, o de aproximadamente 18 a aproximadamente 21 nucleótidos de longitud, y cualquier combinación de dichos subrangos (por ejemplo, 9-18 nucleótidos). El sitio de reconocimiento podría ser palindrómico, es decir, la secuencia en una cadena se lee igual en la dirección opuesta en la cadena complementaria. Se reconoce que un agente de nucleasa dado puede unirse al sitio de reconocimiento y escindir ese sitio de unión o, alternativamente, el agente de nucleasa puede unirse a una secuencia que es diferente del sitio de reconocimiento. Además, el término sitio de reconocimiento comprende tanto el sitio de unión del agente de nucleasa como el sitio de escisión/muesca independientemente de si el sitio de escisión/muesca está dentro o fuera del sitio de unión del agente de nucleasa. En otra variación, la escisión por el agente de nucleasa puede ocurrir en posiciones de nucleótidos inmediatamente opuestas entre sí para producir un corte de extremo romo o, en otros casos, las incisiones pueden escalonarse para producir sobresalientes de una sola hebra, también llamados "extremos pegajosos", que puede ser 5' sobresalientes, o 3' sobresalientes.
Cualquier agente de nucleasa que induzca una ruptura de muesca o de doble cadena en un sitio de reconocimiento deseado puede usarse en los métodos y composiciones descritos aquí. Puede emplearse un agente de nucleasa natural o nativo siempre que el agente de nucleasa induzca una ruptura de muesca o de doble cadena en un sitio de reconocimiento deseado. Alternativamente, puede emplearse un agente de nucleasa modificado o manipulado. Un "agente de nucleasa diseñado" comprende una nucleasa que está diseñada (modificada o derivada) de su forma nativa para reconocer específicamente e inducir una ruptura de muesca o de doble cadena en el sitio de reconocimiento deseado. Por lo tanto, un agente de nucleasa diseñado puede derivarse de un agente de nucleasa nativo, natural o puede ser creado o sintetizado artificialmente. La modificación del agente de nucleasa puede ser tan poco como un aminoácido en un agente de escisión de proteínas o un nucleótido en un agente de escisión de ácido nucleico. En algunas realizaciones, la nucleasa modificada genéticamente induce una ruptura de muesca o de doble cadena en un sitio de reconocimiento, en donde el sitio de reconocimiento no era una secuencia que hubiera sido reconocida por un agente de nucleasa nativo (no manipulado o no modificado). Producir una ruptura de muesca o de doble hebra en un sitio de reconocimiento u otro ADN se puede denominar aquí como "cortar" o "escindir" el sitio de reconocimiento u otro ADN.
También se proporcionan variantes activas y fragmentos de los sitios de reconocimiento ejemplificados. Dichas variantes activas pueden comprender al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con el sitio de reconocimiento dado, en donde las variantes activas retienen la actividad biológica y, por lo tanto, pueden ser reconocidas y escindidas por un agente de nucleasa de una manera específica de secuencia. Los ensayos para medir la ruptura de doble cadena de un sitio de reconocimiento por un agente de nucleasa son conocidos en la técnica y generalmente miden la capacidad de una nucleasa para cortar el sitio de reconocimiento.
El sitio de reconocimiento del agente de nucleasa se puede colocar en cualquier lugar dentro o cerca del locus diana. El sitio de reconocimiento puede estar ubicado dentro de una región de codificación de un gen, o dentro de regiones reguladoras, que influyen en la expresión del gen. Por lo tanto, un sitio de reconocimiento del agente de nucleasa se puede ubicar en un intrón, un exón, un promotor, un potenciador, una región reguladora o cualquier región codificante no proteica.
En una realización, el agente de nucleasa es una nucleasa efectora similar a un activador de transcripción (TALEN). Las nucleasas efectoras TAL son una clase de nucleasas específicas de secuencia que pueden usarse para hacer rupturas de doble cadena en secuencias diana específicas en el genoma de un organismo procariótico o eucariota. Las nucleasas efectoras TAL se crean al fusionar un efector similar a un activador de transcripción (TAL) nativo o diseñado, o una parte funcional de la misma, con el dominio catalítico de una endonucleasa, como, por ejemplo, FokI. El dominio de unión al ADN del efector TAL, único y modular, permite el diseño de proteínas con potencialmente cualquier especificidad de reconocimiento de ADN dada. Por lo tanto, los dominios de unión al ADN de las nucleasas efectoras TAL pueden diseñarse para reconocer sitios específicos del ADN y, por lo tanto, usarse para hacer rupturas de doble cadena en las secuencias objetivo deseadas. Véase, WO 2010/079430; Morbitzer et al. (2010) PNAS 10.1073/pnas.1013133107; Scholze & Boch (2010) Virulence 1: 428-432; Christian et al. Genetics (2010) 186: 757­ 761; Li et al. (2010) Nuc. Acids Res. (2010) doi: 10.1093/nar/gkq704; y Miller et al. (2011) Nature Biotechnology 29: 143-148.
Ejemplos de nucleasas TAL adecuadas y métodos para preparar nucleasas TAL adecuadas se describen, por ejemplo, en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2011/0239315 A1, 2011/0269234 A1, 2011/0145940 A1, 2003/0232410 A 1,2005/0208489 A1, 2005/0026157 A 1,2005/0064474 A1, 2006/0188987 A1 y 2006/0063231 A1. En diversas realizaciones, las nucleasas efectoras TAL están diseñadas para cortar en o cerca de una secuencia de ácidos nucleicos diana en, por ejemplo, un locus genómico de interés, en donde la secuencia de ácidos nucleicos diana está en o cerca de una secuencia a modificar por un vector de direccionamiento. Las nucleasas TAL adecuadas para uso con los diversos métodos y composiciones divulgadas en el presente documento incluyen aquellas que están diseñadas específicamente para unirse a o cerca de secuencias de ácidos nucleicos diana para ser modificadas por vectores de direccionamiento como se describe aquí.
En una realización, cada monómero de TALEN comprende 12-25 repeticiones de TAL, en donde cada repetición de TAL se une a un subsitio de 1 pb. En una realización, el agente de nucleasa es una proteína quimérica que comprende un dominio de unión a ADN basado en la repetición de TAL unido operativamente a una nucleasa independiente. En una realización, la nucleasa independiente es una endonucleasa FokI. En una realización, el agente de nucleasa comprende un primer dominio de unión a ADN basado en repetición TAL y un segundo dominio de unión a ADN basado en repetición TAL, en donde cada uno del primer y el segundo dominio de unión de ADN basado en repetición TAL está unido operativamente a una nucleasa FokI, en donde el primer y el segundo dominio de unión al ADN basado en la repetición de TAL reconocen dos secuencias de ADN diana contiguas en cada hebra de la secuencia de ADN diana separadas por aproximadamente 6 pb a aproximadamente 40 pb del sitio deescisión, y en donde las nucleasas FokI se dimerizan y forman una ruptura de doble cadena en una secuencia diana.
En una realización, el agente de nucleasa comprende un primer dominio de unión a ADN basado en repetición TAL y un segundo dominio de unión a ADN basado en repetición TAL, en donde cada uno del primer y el segundo dominio de unión de ADN basado en repetición TAL es ligado operativamente a una nucleasa FokI, en donde el primer y el segundo dominio de unión a ADN basado en la repetición de TAL reconocen dos secuencias de ADN diana contiguas en cada cadena de la secuencia de ADN diana separadas por un sitio de escisión de 5 pb o 6 pb, y en donde las nucleasas de FokI dimerizan y hacer una ruptura de doble hebra.
El agente de nucleasa empleado en los diversos métodos y composiciones divulgados en el presente documento puede comprender además una nucleasa de dedo de zinc (ZFN). En una realización, cada monómero de la ZFN comprende 3 o más dominios de unión a ADN basados en dedos de zinc, en donde cada dominio de unión a ADN basado en dedos de zinc se une a un subsitio de 3pb. En otras realizaciones, el ZFN es una proteína quimérica que comprende un dominio de unión a ADN basado en dedos de zinc operativamente unido a una nucleasa independiente. En una realización, la endonucleasa independiente es una endonucleasa FokI. En una realización, el agente de nucleasa comprende un primer ZFN y un segundo ZFN, en donde cada uno del primer ZFN y el segundo ZFN está unido operativamente a una nucleasa FokI, en donde el primer y el segundo ZFN reconocen dos secuencias de ADN diana contiguas en cada cadena de la secuencia de a Dn diana separada por aproximadamente 6pb a aproximadamente 40pb del sitio de escisión o de aproximadamente 5pb a aproximadamente 6pb del sitio de escisión, y en donde las nucleasas FokI se dimerizan y producen una ruptura de doble hebra. Véase, por ejemplo, US20060246567; US20080182332; US20020081614; US20030021776; WO/2002/057308A2; US20130123484; US20100291048; y, WO/2011/017293A2.
En una realización de los métodos divulgados en el presente documento, el agente de nucleasa comprende (a) una proteína quimérica que comprende un dominio de unión a ADN basado en dedos de zinc fusionado a una endonucleasa FokI; o, (b) una proteína quimérica que comprende una Nucleasa Efectora de Efecto de Activador de Transcripción (TALEN) fusionada a una endonucleasa FokI.
En otra realización más, el agente de nucleasa es una meganucleasa. Las meganucleasas se han clasificado en cuatro familias según motivos de secuencia conservada, las familias son las familias de caja LAGLIDADG (SEQ ID NO: 16), GIY-YIG, H-N-H y His-Cys. Estos motivos participan en la coordinación de iones metálicos e hidrólisis de enlaces fosfodiéster. Las HEasas son notables por sus largos sitios de reconocimiento y por tolerar algunos polimorfismos de secuencia en sus sustratos de ADN. Los dominios de meganucleasa, la estructura y la función son conocidos, véase, por ejemplo, Guhan y Muniyappa (2003) Crit Rev Biochem Mol Biol 38: 199-248; Lucas et al., (2001) Nucleic Acids Res 29: 960-9; Jurica and Stoddard, (1999) Cell Mol Life Sci 55: 1304-26; Stoddard, (2006) Q Rev Biophys 38: 49-95; y Moure et al., (2002) Nat Struct Biol 9: 764. En algunos ejemplos, se utiliza una variante natural y/o una meganucleasa derivada por manipulación. Se conocen métodos para modificar la cinética, las interacciones del cofactor, la expresión, las condiciones óptimas y/o la especificidad del sitio de reconocimiento, y la detección de la actividad, véase por ejemplo, Epinat et al., (2003) Nucleic Acids Res 31: 2952-62; Chevalier et al., (2002) Mol Cell 10: 895-905; Gimble et al., (2003) Mol Biol 334: 993-1008; Seligman et al., (2002) Nucleic Acids Res 30: 3870-9; Sussman et al., (2004) J Mol Biol 342: 31-41; Rosen et al., (2006) Nucleic Acids Res 34: 4791-800; Chames et al., (2005) Nucleic Acids Res 33: e178; Smith et al., (2006) Nucleic Acids Res 34: e149; Gruen et al., (2002) Nucleic Acids Res 30: e29; Chen and Zhao, (2005) Nucleic Acids Res 33: e154; WO2005105989; WO2003078619; WO2006097854; WO2006097853; WO2006097784; y WO2004031346.
Cualquier meganucleasa se puede usar aquí, incluyendo, pero no limitándose a, I-SceI, I-SceII, I-SceIII, I-SceIV, I-SceV, I-SceVI, I-SceVII, I-CeuI, I-CeuAIIP, I-CreI, I-CrepsbIP, I-CrepsbIIP, I-CrepsbIIIP, I-CrepsbIVP, I-TliI, I-PpoI, PI-PspI, F-SceI, F-SceII, F-SuvI, F-TevI, F-TevII, I-AmaI, I-AniI, I-ChuI, I-CmoeI, I-CpaI, I-CpaII, I-CsmI, I-CvuI, I-CvuAIP, I-DdiI, I-DdiII, I-DirI, I-DmoI, I-HmuI, I-HmuII, I-HsNIP, I-LlaI, I-MsoI, I-NaaI, I-NanI, I-NcIIP, I-NgrIP, I-NitI, I-NjaI, I-Nsp236IP, I-PakI, I-PboIP, I-PcuIP, I-PcuAI, I-PcuVI, I-PgrIP, I-PobIP, I-PorI, I-PorIIP, I-PbpIP, I-SpBetaIP, I-ScaI, I-SexIP, I-SneIP, I-SpomI, I-SpomCP, I-SpomIP, I-SpomIIP, I-SquIP, I-Ssp6803I, I-SthPhiJP, I-SthPhiST3P, I-SthPhiSTe3bP, I-TdeIP, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, I-UarAP, I-UarHGPAIP, I-UarHGPA13P, I-VinIP, I-ZbiIP, PI-MtuI, PI-MtuHIP PI-MtuHIIP, PI-PfuI, PI-PfuII, PI-PkoI, PI-PkoII, PI-Rma43812IP, PI-SpBetaIP, PI-SceI, PI-TfuI, PI-TfuII, PI-ThyI, PI-TliI, PI-TliII, o cualquier variante activa o fragmento de las mismas.
En una realización, la meganucleasa reconoce secuencias de ADN de doble cadena de 12 a 40 pares de bases. En una realización, la meganucleasa reconoce una secuencia diana perfectamente coincidente en el genoma. En una realización, la meganucleasa es una nucleasa de alojamiento. En una realización, la nucleasa de alojamiento es una familia LAGLIDADG (SEQ ID NO: 16) de nucleasa de alojamiento. En una realización, la familia LAGLIDADG (SEQ ID NO: 16) de nucleasa de alojamiento se selecciona entre I-SceI, I-CreI y I-Dmol.
Los agentes de nucleasa pueden comprender además endonucleasas de restricción, que incluyen endonucleasas de Tipo I, Tipo II, Tipo III y Tipo IV. Las endonucleasas de restricción Tipo I y Tipo III reconocen sitios de reconocimiento específicos, pero típicamente se escinden en una posición variable del sitio de unión a la nucleasa, que puede estar a cientos de pares de bases del sitio de escisión (sitio de reconocimiento). En los sistemas de Tipo Ii, la actividad de restricción es independiente de cualquier actividad de metilasa, y la escisión ocurre típicamente en sitios específicos dentro o cerca del sitio de unión. La mayoría de las enzimas Tipo II cortan secuencias palindrómicas, sin embargo, las enzimas Tipo lia reconocen los sitios de reconocimiento no palindrómicos y se escinden fuera del sitio de reconocimiento, las enzimas Tipo llb cortan secuencias dos veces con ambos sitios fuera del sitio de reconocimiento, y las enzimas Tipo II reconocen un sitio de reconocimiento asimétrico y escinden en un lado y en una distancia definida de aproximadamente 1-20 nucleótidos desde el sitio de reconocimiento. Las enzimas de restricción de tipo IV se dirigen al ADN metilado. Las enzimas de restricción se describen y clasifican con más detalle, por ejemplo, en la base de datos REBASE (página web en rebase.neb.com; Roberts et al, (2003) Nucleic Acids Res 31: 418-20), Roberts et al, (2003) Nucleic Acids Res 31: 1805-12, and Belfort et al., (2002) en Mobile DNA II, pp. 761-783, Eds. Craigie et al, (ASM Press, Washington, DC).
El agente de nucleasa empleado en los diversos métodos y composiciones también puede comprender un sistema CRISPR/Cas. Dichos sistemas pueden emplear, por ejemplo, una nucleasa Cas9, que en algunos casos está optimizada con codones para el tipo de célula deseado en donde se va a expresar. El sistema emplea además un constructo ARNcr-ARNtracr fusionado que funciona con el Cas9 optimizado por codones. Este ARN único a menudo se conoce como un ARN guía o ARNg. Dentro de un ARNg, la porción de ARNcr se identifica como la "secuencia diana" para el sitio de reconocimiento dado y el ARNtracr se conoce a menudo como el "andamio". En resumen, un fragmento de ADN corto que contiene la secuencia diana se inserta en un plásmido de expresión de ARN guía. El plásmido de expresión de ARNg comprende la secuencia diana (en algunas realizaciones alrededor de 20 nucleótidos), una forma de la secuencia de ARNtracr (el andamio), así como un promotor adecuado que es activo en la célula y elementos necesarios para el procesamiento adecuado en células eucarióticas. Muchos de los sistemas se basan en oligos complementarios personalizados que se reconocen para formar un ADN de doble cadena y luego se clonan en el plásmido de expresión de ARNg. El casete de expresión de ARNg y el casete de expresión Cas9 se introducen en la célula. Véase, por ejemplo, Mali P et al. (2013) Science 2013 Feb 15; 339 (6121): 823-6; Jinek M et al. Science 2012 17 de agosto; 337 (6096): 816-21; Hwang WY et al. Nat Biotechnol 2013 Mar; 31 (3): 227-9; Jiang W et al. Nat Biotechnol 2013 Mar; 31(3): 233-9; y, Cong L et al. Ciencia 2013 15 de febrero; 339 (6121): 819-23.
En una realización, el método para modificar un locus genómico de interés en una célula de rata pluripotente comprende además la introducción en la célula de rata pluripotente: (a) un primer constructo de expresión que comprende un primer promotor unido operativamente a una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína (Cas) asociada con Repeticiones Palindrómicas Cortas Regularmente Interespaciadas Aglomeradas (CRISPR); (b) un segundo constructo de expresión que comprende un segundo promotor unido operativamente a una secuencia diana genómica unida a un ARN guía (ARNg), en donde la secuencia diana genómica está flanqueada en el extremo 3' por una secuencia de Motivo Protoespaciador Adyacente (PAM). En una realización, la secuencia diana genómica comprende la secuencia de nucleótidos de GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG (GN1-20 GG; SEQ ID NO: 1). En una realización, la secuencia diana genómica comprende la SEQ ID NO: 23, en donde N tiene una longitud de entre 1 y 20 nucleótidos. En otra realización, la secuencia diana genómica comprende entre 14 y 20 nucleótidos de longitud de SEQ ID NO: 1.
En una realización, el ARNg comprende una tercera secuencia de ácidos nucleicos que codifica un ARN de CRISPR (ARNCR) de Repeticiones Palindrómicas Cortas Regularmente Interespaciadas Aglomeradas y un ARN de CRISPR (ARNtracr) transactivante. En realizaciones específicas, la proteína Cas es Cas9.
En algunas realizaciones, el ARNg comprende (a) el ARN quimérico de la secuencia de ácidos nucleicos 5'-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUU-3' (SEQ ID NO: 2); o, (b) el ARN quimérico de la secuencia de ácidos nucleicos 5'-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG-3' (SEQ ID NO: 3).
En otra realización, el ARNcr comprende 5'-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAA-3' (SEQ ID NO: 4); 5'-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAAUAAG (SEQ ID NO: 5); o 5'-GAGUCCGAGCAGAAGAAGAAGUUUUA-3' (SEQ ID NO: 6).
En aún otras realizaciones, el ARNtracr comprende, 5'-AAGGCUAGUCCG-3' (SEQ ID NO: 7) o 5'-AAGGCUAGUCCGU UAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU-3' (SEQ ID NO: 8).
En una realización, la proteína Cas es una proteína Cas de tipo I. En una realización, la proteína Cas es una proteína Cas de tipo II. En una realización, la proteína Cas de tipo ll es Cas9. En una realización, la primera secuencia de ácidos nucleicos codifica una proteína Cas optimizada en codón humano.
En una realización, el primer ácido nucleico comprende una mutación que altera al menos un residuo de aminoácido de los sitios activos de nucleasa en la proteína Cas, en donde la proteína Cas mutante genera una ruptura en una sola cadena de la región del ADN objetivo, y en donde la mutación disminuye la recombinación no homóloga en la región del ADN objetivo.
En una realización, el primer ácido nucleico que codifica la proteína Cas comprende además una señal de localización nuclear (NLS). En una realización, la señal de localización nuclear es una señal de localización nuclear SV40.
En una realización, el segundo promotor que impulsa la expresión de la secuencia diana genómica y el ARN guía (ARNg) es un promotor de la ARN polimerasa III. En una realización, el promotor de la ARN polimerasa III es un promotor U6 humano. En una realización, el promotor de ARN polimerasa III es un promotor de U6 polimerasa III de rata. En una realización, el promotor de ARN polimerasa III es un promotor de U6 polimerasa III de ratón.
En una realización, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican ARNcr y el ARNtracr se unen a través de un bucle sintético, en donde, tras la expresión, el ARNcr y el ARNtracr forman un dúplex de ARNcr:ARNtracr.
En una realización, el primer constructo de expresión y el segundo constructo de expresión se expresan a partir de un mismo plásmido.
En una realización, los constructos de expresión primero y segundo se introducen junto con el LTVEC. En una realización, los constructos de expresión primero y segundo se introducen por separado del LTVEC durante un período de tiempo.
En una realización, el método comprende introducir una pluralidad de el segundo constructo y una pluralidad de LTVEC para la edición multiplex de loci diana distintos como se describe en el presente documento.
También se proporcionan variantes activas y fragmentos de agentes de nucleasa (es decir, un agente de nucleasa diseñado). Dichas variantes activas pueden comprender al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con el agente de nucleasa nativo, en donde las variantes activas conservan la capacidad de cortar en un sitio de reconocimiento deseado y, por lo tanto, retienen la actividad inductora de ruptura de muesca o de doble cadena. Por ejemplo, cualquiera de los agentes de nucleasa divulgados en el presente documento puede modificarse a partir de una secuencia de endonucleasa nativa y diseñarse para reconocer e inducir una ruptura de muesca o de doble cadena en un sitio de reconocimiento que no fue reconocido por el agente de nucleasa nativo. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la nucleasa modificada por ingeniería genética tiene una especificidad para inducir una ruptura de muesca o de doble cadena en un sitio de reconocimiento que es diferente del sitio de reconocimiento del agente de nucleasa nativo correspondiente. Los ensayos para determinar la actividad inductora de ruptura de muesca o de doble cadena son conocidos y en general miden la actividad general y la especificidad de la endonucleasa en sustratos de ADN que contienen el sitio de reconocimiento.
El agente de nucleasa se puede introducir en la célula por cualquier medio conocido en la técnica. El polipéptido que codifica el agente de nucleasa se puede introducir directamente en la célula. Alternativamente, un polinucleótido que codifica el agente de nucleasa se puede introducir en la célula. Cuando un polinucleótido que codifica el agente de nucleasa se introduce en la célula, el agente de nucleasa se puede expresar de forma transitoria, condicional o constitutiva dentro de la célula. Por lo tanto, el polinucleótido que codifica el agente de nucleasa puede estar contenido en un casete de expresión y estar unido operativamente a un promotor condicional, un promotor inducible, un promotor constitutivo o un promotor específico de tejido. Dichos promotores de interés se discuten con más detalle en otra parte del presente documento. Alternativamente, el agente de nucleasa se introduce en la célula como un ARNm que codifica o que comprende un agente de nucleasa.
En una realización, el ARNc y el ARNtracr se expresan como transcripciones de ARN separadas.
En realizaciones específicas, el polinucleótido que codifica el agente de nucleasa está integrado de manera estable en el genoma de la célula y está unido operativamente a un promotor activo en la célula. En otras realizaciones, el polinucleótido que codifica el agente de nucleasa está en el mismo vector de direccionamiento que comprende el ácido nucleico de inserción, mientras que en otros casos el polinucleótido que codifica el agente de nucleasa está en un vector o un plásmido que está separado del vector de direccionamiento que comprende el ácido nucleico de inserción.
Cuando el agente de nucleasa se proporciona a la célula a través de la introducción de un polinucleótido que codifica el agente de nucleasa, tal polinucleótido que codifica un agente de nucleasa puede modificarse para sustituir codones que tienen una mayor frecuencia de uso en la célula de interés, en comparación a la secuencia de polinucleótidos de origen natural que codifica el agente de nucleasa. Por ejemplo, el polinucleótido que codifica el agente de nucleasa puede modificarse para sustituir codones que tienen una mayor frecuencia de uso en una célula procariota o eucariota de interés, incluida una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula humana, una célula no humana, una célula de mamífero, una célula de roedor, una célula de ratón, una célula de rata o cualquier otra célula huésped de interés, en comparación con la secuencia de polinucleótidos que se produce de forma natural.
En una realización, el agente de endonucleasa se introduce junto con el LTVEC. En una realización, el agente de endonucleasa se introduce por separado del LTVEC durante un período de tiempo. En una realización, el agente de endonucleasa se introduce antes de la introducción de la LTVEC. En una realización, el agente de endonucleasa se introduce en la célula ES de rata después de la introducción de la LTVEC.
En una realización, el agente de endonucleasa es un constructo de expresión que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una endonucleasa, en donde la secuencia de ácidos nucleicos está unida operativamente a un promotor. En una realización, el promotor es un promotor constitutivamente activo. En una realización, el promotor es un promotor inducible. En una realización, el promotor es activo en la célula de rata pluripotente. En una realización, el agente de endonucleasa es un ARNm que codifica una endonucleasa.
B. Métodos para integrar un polinucleótido de interés en un locus diana
Se proporcionan métodos para modificar un locus diana de interés. En una realización, un locus diana en una célula de rata pluripotente se dirige a la modificación genética. Dicho método comprende: (a) introducir en la célula de rata pluripotente un vector direccionado que comprende un inserto de ácido nucleico flanqueado con un brazo de homología de rata 5' y un brazo de homología de rata 3'; y (b) identificar una célula de rata pluripotente modificada genéticamente que comprende la modificación genética direccionada en el locus diana, en donde la modificación genética direccionada puede transmitirse a través de la línea germinal. En realizaciones específicas, la suma total del brazo de homología 5' y el brazo de homología 3' es al menos 10kb y se emplea un vector de direccionamiento grande.
En otras realizaciones, el tamaño de la suma total del total de los brazos de homología 5' y 3' de LTVEC es de aproximadamente 10kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 10kb a aproximadamente 100kb, aproximadamente 10kb a aproximadamente 75kb, aproximadamente 20kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 20kb a aproximadamente 100kb, aproximadamente 20kb a aproximadamente 75kb, aproximadamente 30kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 30kb a aproximadamente 100kb, aproximadamente 30kb a aproximadamente 75kb, aproximadamente 40kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 40kb, aproximadamente 100kb, aproximadamente 40kb a aproximadamente 75kb, aproximadamente 50kb a aproximadamente 150kb, aproximadamente 50kb a aproximadamente 100kb, o aproximadamente 50kb a aproximadamente 75kb, aproximadamente 10kb a aproximadamente 30kb, aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, aproximadamente 80kb a aproximadamente 100kb, aproximadamente 100kb a aproximadamente 120kb, o desde aproximadamente 120kb a aproximadamente 150kb. En una realización, el tamaño de la eliminación es el mismo o similar al tamaño de la suma total de los brazos de homología 5' y 3' del LTVEC.
La célula pluripotente de rata puede ser una célula madre embrionaria de rata. En una realización específica, (a) la célula ES de rata se deriva de una cepa DA o una cepa ACI; o, (b) la célula ES de rata se caracteriza por la expresión de un marcador de pluripotencia que comprende Oct-4, Sox-2, fosfatasa alcalina o una combinación de los mismos. En otros casos, la célula madre embrionaria de rata empleada comprende una célula ES de rata como se describe en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 14/185,703, presentada el 20 de febrero de 2014.
Como se describe en otra parte del presente documento, el ácido nucleico insertado puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico. En realizaciones no limitantes, (a) el inserto de ácido nucleico comprende un reemplazo de una secuencia endógena de ácido nucleico de rata con una secuencia de ácidos nucleicos de mamífero homóloga u ortóloga; (b) el inserto de ácido nucleico comprende una eliminación de una secuencia endógena de ácido nucleico de rata; (c) el inserto de ácido nucleico comprende una eliminación de una secuencia endógena de ácido nucleico de rata, en donde la eliminación varía de 5kb a 200kb o de 5kb a 3Mb (como se describe en detalle en el presente documento); (d) el inserto de ácido nucleico comprende una adición de una secuencia de ácidos nucleicos exógena (que incluye, por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos exógena que varía de aproximadamente 5kb a aproximadamente 10kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 20kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, de aproximadamente 40kb de aproximadamente 60kb, de aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, de aproximadamente 80kb a aproximadamente 100kb, de aproximadamente 100kb a aproximadamente 150kb, de aproximadamente 150kb a aproximadamente 200kb, de aproximadamente 200kb a aproximadamente 250kb, de aproximadamente 250kb a aproximadamente 300kb, de aproximadamente 300kb a aproximadamente 350kb, o de aproximadamente 350kb a aproximadamente 400kb); (e) el inserto de ácido nucleico comprende una secuencia de ácidos nucleicos exógena que comprende una secuencia de ácidos nucleicos homóloga u ortóloga; (f) la secuencia de ácidos nucleicos homóloga u ortóloga de (a) en donde la secuencia de ácidos nucleicos es una secuencia de ácidos nucleicos humana; (g) el inserto de ácido nucleico comprende la secuencia de ácidos nucleicos homóloga u ortóloga de (a) en donde la secuencia de ácidos nucleicos es una secuencia de ácidos nucleicos quimérica que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de rata y humana; (h) el ácido nucleico del inserto comprende la secuencia de ácidos nucleicos exógena de (e), en donde el ácido nucleico del inserto varía de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 200 kb; (i) el ácido nucleico de inserción comprende un alelo condicional flanqueado con secuencias diana de recombinasa específicas del sitio; (j) el inserto de ácido nucleico comprende un gen indicador unido operativamente a un promotor; (k) el inserto de ácido nucleico comprende uno o más segmentos del gen Vh de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana no reordenado, uno o más segmentos del gen D de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana no reordenado, y uno o más Jh de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana no reordenado, segmentos del gen, que están unidos de manera funcional a una secuencia de ácidos nucleicos de región constante de cadena pesada de roedor; (1) el ácido nucleico inserto comprende una secuencia de ácidos nucleicos de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana reorganizada operativamente unida a una secuencia de ácidos nucleicos de región constante de cadena pesada de roedor; (m) el inserto de ácido nucleico comprende uno o más segmentos del gen Vk o Va de inmunoglobulina humana no reorganizados y uno o más segmentos del gen Jk o Ja de inmunoglobulina humana no reorganizados, que están operativamente enlazados a una inmunoglobulina A de mamíferos A o k cadena ligera cadena ligera región constante región nucleica secuencia ácida (n) el inserto de ácido nucleico comprende una secuencia de ácidos nucleicos de región variable de la cadena ligera A o k reorganizada humana unida operativamente a una secuencia de ácidos nucleicos de región constante de la cadena ligera A o k de cadena ligera k; (o) la secuencia de ácidos nucleicos de la región constante de la cadena pesada de mamífero de (k) y/o (1) comprende una secuencia de ácidos nucleicos de la región constante de rata, una secuencia de ácidos nucleicos de la región constante humana, o una combinación de las mismas; o, (p) el ácido nucleico de la región constante de la cadena ligera de A o k de los mamíferos de (m) y/o (n) comprende una secuencia de ácidos nucleicos de la región constante de rata, una secuencia de ácidos nucleicos de la región constante humana, o una combinación de los mismos.
En una realización, el ácido nucleico inserto comprende uno o más segmentos funcionales del gen Vh humano que comprenden Vh1-2, Vh1-3, Vh1-8, Vh1-18, Vh1-24, Vh1-45, Vh1-46, Vh1-58, Vh1-69, Vh2-5, Vh2-26, Vh2-70, Vh3-7, Vh3-9, Vh3-11, Vh3-13, Vh3-15, Vh3-16, Vh3-20, Vh3-21, Vh3-23, Vh3-30, Vh3-30-3, Vh 3-30-5, Vh3-33, Vh3-35, Vh3-38, Vh3-43, Vh3-48, Vh3-49, Vh3-53, Vh3-64, Vh3-66, Vh3-72, Vh3-73, Vh3-74, Vh4-4, Vh4-28, Vh4-30-1, Vh4-30-2, Vh4-30-4, Vh4-31, Vh4-34, Vh4-39, Vh4-59, Vh4-61, Vh5-51, Vh6-1, Vh7-4-1, Vh7-81, o una combinación de los mismos.
En una realización, el ácido nucleico insertado comprende uno o más segmentos funcionales del gen D humano que comprenden D1-1, D1-7, D1-14, D1-20, D1-26, D2-2, D2-8, D2-15, D2-21, D3-3, D3-9, D3-10, D3-16, D3-22, D4-4, D4-11, D4-17, D4-23, D5-12, D5-5, D5-18, D5-24, D6-6, D6-13, D6-19, D6-25, D7-27, o una combinación de los mismos.
En una realización, el ácido nucleico insertado comprende uno o más segmentos génicos Jh funcionales que comprenden Jh1, Jh2, Jh3, Jh4, Jh5, Jh6, o una combinación de los mismos. En una realización, el ácido nucleico de inserción comprende uno o más segmentos génicos VK humanos que comprenden Yk4-1, Yk5-2, Vk 7-3, Vk 2-4, Yk1-5, Yk1-6, Yk3-7, Yk1-8, Yk1-9, Vk2-10, Vk3-11, Vk1-12, Vk1-13, Vk2-14, Vk3-15, Vk1-16, Vk1-17, Vk2-18, Vk2-19, Vk3-20, Vk6-21, Vk1-22, Vk1-23, Vk2-24, Vk3-25, Vk2-26, Vk1-27, Vk2-28, Vk2-29, Vk2-30, Vk3-31, Vk1-32, Vk1-33, Vk3-34, Vk1-35, Vk2-36, Vk1-37, Vk2-38, Vk1-39, Vk2-40, o una combinación de los mismos.
En una realización, el ácido nucleico insertado comprende uno o más segmentos del gen VA humano que comprenden VA3-1, VA4-3, VA2-8, VA3-9, VA3-10, VA2-11, VA3-12, VA2-14, VA3-16, VA2-18, VA3-19, VA3-21, VA3-22, VA2-23, VA3-25, VA3-27, o una combinación de los mismos.
En una realización, el ácido nucleico insertado comprende uno o más segmentos del gen Jk humano que comprenden Jk1, Jk2, Jk3, Jk4, Jk5, o una combinación de los mismos.
En realizaciones específicas, tras la modificación del locus diana en una célula de rata pluripotente, la modificación genética se transmite a través de la línea germinal.
En una realización, la secuencia de ácidos nucleicos insertada comprende un polinucleótido que cuando se integra en el genoma producirá una modificación genética de una región del locus ApoE de rata, en donde la modificación genética en el locus ApoE produce una disminución en la actividad ApoE, un aumento en la actividad de ApoE o una modulación de la actividad de ApoE. En una realización, se genera un ApoE bloqueado.
En una realización, la secuencia de ácidos nucleicos insertada comprende un polinucleótido que cuando se integra en el genoma producirá una modificación genética de una región del locus gamma del receptor de Interleucina-2 de rata, en donde la modificación genética en el locus del receptor gamma de la interleucina-2 da como resultado una disminución en la actividad del receptor de interleucina-2, un aumento en la actividad gamma del receptor de interleucina-2, o una modulación de la actividad del receptor de interleucina-2. En una realización, se genera un bloqueo del receptor de interleucina-2.
En otra realización más, la secuencia de ácidos nucleicos insertada comprende un polinucleótido que cuando se integra en el genoma producirá una modificación genética de una región del locus Rag1 de rata, el locus Rag2 de rata y/o el locus de rata Rag2/Rag1, en donde la modificación genética en la rata Rag1, Rag2 y/o Rag2/Rag1 produce una disminución en la actividad de la proteína Rag1, Rag2 o Rag1 y Rag2, un aumento en la actividad de la proteína Rag1, Rag2 o Rag1 y Rag2, o una modulación en actividad de la proteína Rag1, Rag2 o Rag 1 y Rag2. En una realización, se genera un bloqueo de Rag1, Rag2 o Rag2/Rag1.
En realizaciones adicionales, el ácido nucleico insertado da como resultado el reemplazo de una parte del locus ApoE de rata, el locus gamma del receptor de interleucina-2 y/o el locus Rag2, y/o el locus Rag1 y/o el locus Rag2/Rag1 con la porción ortóloga correspondiente de un locus ApoE, un locus gamma del receptor de interleucina-2, un locus Rag2, un locus Rag1 y/o un locus Rag2/Rag1 de otro organismo.
En todavía otras realizaciones, el inserto de ácido nucleico comprende un polinucleótido que comparte en toda su longitud al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%. 98%, 99% a una porción de un locus ApoE, un locus gamma del receptor de interleucina-2, un locus Rag2, un locus Rag1 y/o un locus Rag2/Rag1 que está reemplazando.
El polinucleótido de inserción dado y la región correspondiente del locus de rata que se reemplaza pueden ser una región codificante, un intrón, un exón, una región no traducida, una región reguladora, un promotor o un potenciador o cualquier combinación de los mismos. Además, el polinucleótido de inserto dado y/o la región del locus de rata que se reemplaza puede tener cualquier longitud deseada, incluyendo por ejemplo, entre 10-100 nucleótidos de longitud, 100-500 nucleótidos de longitud, 500-1 kb de nucleótido de longitud, 1Kb a 1.5kb de nucleótido de longitud, 1.5kb a 2kb de nucleótidos de longitud, 2kb a 2.5kb de nucleótidos de longitud, 2.5kb a 3kb de nucleótidos de longitud, 3kb a 5kb de nucleótidos de longitud, 5kb a 8kb de nucleótidos de longitud, 8kb a 10kb de nucleótidos en longitud o más. En otros casos, el tamaño de la inserción o reemplazo es de aproximadamente 5kb a aproximadamente 10kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 20kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, de aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, de aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, de aproximadamente 80kb de aproximadamente 100kb, de aproximadamente 100kb a aproximadamente 150kb, de aproximadamente 150kb a aproximadamente 200kb, de aproximadamente 200kb a aproximadamente 250kb, de aproximadamente 250kb a aproximadamente 300kb, de aproximadamente 300kb a aproximadamente 350kb, de aproximadamente 350kb a aproximadamente 400kb, de aproximadamente 400kb a aproximadamente 800kb, de aproximadamente 800kb a 1Mb, de aproximadamente 1Mb a aproximadamente 1.5Mb, de aproximadamente 1.5Mb a aproximadamente 2Mb, de aproximadamente 2Mb, a aproximadamente 2.5Mb, de aproximadamente 2.5Mb a aproximadamente 2.8Mb, de aproximadamente 2.8Mb a aproximadamente 3Mb . En otras realizaciones, el polinucleótido de inserción dado y/o la región del locus de rata que se reemplaza es al menos 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o 900 nucleótidos o al menos 1 kb, 2kb, 3kb, 4kb, 5kb, 6kb, 7kb, 8kb, 9kb, 10kb, 11kb, 12kb, 13kb, 14 kb, 15kb, 16kb o más.
i. Métodos para modificar un locus diana de un ácido nucleico de rata a través de recombinación homóloga bacteriana (BHR)
Se divulgan métodos y composiciones para modificar un locus diana de un ácido nucleico de rata mediante recombinación homóloga bacteriana (BHR) en una célula procariota. Tales métodos encuentran uso en la utilización de recombinación homóloga bacteriana en una célula procariota para modificar genéticamente un locus diana de un ácido nucleico de rata para crear un vector de direccionamiento. Dicho vector de direccionamiento que comprende el locus diana modificado genéticamente puede introducirse en una célula eucariota, por ejemplo, una célula de rata pluripotente. La "recombinación homóloga" incluye el intercambio de fragmentos de ADN entre dos moléculas de ADN en los sitios de cruce dentro de las regiones de homología. Por lo tanto, "recombinación homóloga bacteriana" o "BHR" incluye la recombinación homóloga que se produce en las bacterias.
Se divulgan métodos para modificar un locus diana de un ácido nucleico de rata mediante recombinación homóloga bacteriana (BHR) que comprenden la introducción en una célula procariota de un vector de direccionamiento que comprende un ácido nucleico de inserción flanqueado con un brazo de homología de rata 5' y un brazo de homología de rata 5', en donde la célula procariota comprende un ácido nucleico de rata y es capaz de expresar una recombinasa que media en el BHR en el locus diana. Dichos vectores de direccionamiento pueden incluir cualquiera de los grandes vectores de direccionamiento divulgados en el presente documento.
En un ejemplo, el método comprende la introducción en una célula procariota: (i) un primer constructo que comprende un ácido nucleico de rata que tiene una secuencia de ADN de interés; (ii) un segundo constructo de direccionamiento que comprende un inserto de ácido nucleico flanqueado con un brazo de homología 5' de rata y un brazo de homología 3' de rata, y (iii) un tercer constructo que codifica una recombinasa que media la recombinación homóloga bacteriana. En un ejemplo, el primero, el segundo y el tercer constructo se introducen en la célula procariota por separado durante un período de tiempo. En un ejemplo, la célula procariota comprende un ácido nucleico que codifica la recombinasa, y el método no requiere la introducción del tercer constructo. En un ejemplo, la recombinasa se expresa bajo el control de un promotor inducible.
En un ejemplo, el primer constructo que comprende el ácido nucleico de rata se deriva de un cromosoma artificial bacteriano (BAC) o un cromosoma artificial de levadura (YAC).
Se puede seleccionar una célula procariota que comprende el ácido nucleico de inserción en el locus genómico diana. Este método puede repetirse en serie como se describe en el presente documento para permitir la introducción de múltiples ácidos nucleicos de inserción en el locus de rata objetivo en la célula procariota. Una vez que el locus de ácido nucleico de rata diana se "construye" dentro de la célula procariota, un vector de direccionamiento que comprende el locus diana de rata modificado puede aislarse de la célula procariota e introducirse en un locus genómico diana dentro de una célula de mamífero (es decir, una célula de rata pluripotente, o una célula madre embrionaria de rata).
Las células de rata preferidas para recibir vectores de direccionamiento se describen en la Solicitud de los Estados Unidos 14/185.703, presentada el 20 de febrero de 2014, cuyos contenidos se resumen en el presente documento.
Estas células de rata son células de rata pluripotentes capaces de mantener su pluripotencia después de una o más modificaciones genéticas específicas in vitro, y son capaces de transmitir las modificaciones genéticas específicas a través de la línea germinal.
Las células de rata pluripotentes sometidas a electroporación se colocan en placas a una alta densidad para la selección de células resistentes al fármaco que comprenden el vector de direccionamiento. El proceso de selección de medicamentos elimina la mayoría de las células en placa (~99%), dejando atrás colonias individuales, cada una de las cuales es un clon derivado de una sola célula. De las células restantes, la mayoría de las células (~ 80-100%) contienen el vector de direccionamiento (que comprende un casete de selección de medicamentos) integrado en una ubicación aleatoria en el genoma. Por lo tanto, las colonias se seleccionan individualmente y se genotipifican para identificar células ES de rata que albergan el vector de direccionamiento en la ubicación genómica correcta (por ejemplo, utilizando la modificación del ensayo de alelos que se describe a continuación).
Se puede usar un ensayo cuantitativo de alto rendimiento, a saber, la modificación del alelo (MOA), para la genotipificación. Un ensayo de este tipo permite una exploración a gran escala de uno o varios alelos modificados en un cromosoma parental después de una modificación genética. El ensayo de MOA se puede llevar a cabo mediante diversas técnicas analíticas, que incluyen, entre otras, una PCR cuantitativa, por ejemplo, una PCR en tiempo real (qPCR). Por ejemplo, la PCR en tiempo real comprende un primer conjunto de cebadores que reconoce el locus diana y un segundo conjunto de cebadores que reconoce un locus de referencia no direccionado. Además, el conjunto de cebadores comprende una sonda fluorescente que reconoce la secuencia amplificada. En un ejemplo, el ensayo cuantitativo se lleva a cabo a través de Invader Probes®. En un ejemplo, el ensayo cuantitativo se lleva a cabo mediante ensayos MMP®. En un ejemplo, el ensayo cuantitativo se lleva a cabo a través de TaqMan® Molecular Beacon. En un ejemplo, el ensayo cuantitativo se lleva a cabo mediante la tecnología de sonda Eclipse™. (Véase, por ejemplo, US2005/0144655).
La célula de rata pluripotente seleccionada o las células ES de rata que comprenden la modificación genética direccionada pueden introducirse en un embrión de rata huésped, por ejemplo, un embrión de rata en estadio premórula o blastocisto, e implantarse en el útero de una madre sustituta para generar una rata fundadora (rata F0). Posteriormente, la rata fundadora se puede criar en una rata de tipo salvaje para crear heterocigotos de progenie F1 para la modificación genética. El apareamiento de la rata F1 heterozigota puede producir una progenie homozigota para la modificación genética. El apareamiento de la rata F1 heterozigota puede producir una progenie homozigota para la modificación genética. En algunas realizaciones, pueden llevarse a cabo diversas modificaciones genéticas de los loci diana divulgados en el presente documento utilizando un vector de direccionamiento grande (LTVEC) como se describe en detalle en otra parte del presente documento. Por ejemplo, un LTVEC puede derivarse del ADN del Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC) utilizando la tecnología de ingeniería genética VELOCIGENE® (Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6,586,251 y Valenzuela, D.M. et al. (2003), High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotechnology 21(6): 652-659).
El uso de recombinación homóloga bacteriana (BHR) para generar un vector de direccionamiento grande (LTVEC) evita las limitaciones de los plásmidos para alojar un fragmento grande de ADN genómico y la consiguiente baja eficiencia de introducir una modificación direccionada en un locus endógeno en células de rata pluripotentes. Se pueden realizar una o más modificaciones genéticas específicas en la generación de un LTVEC. Un LTVEC de ejemplo producido en la célula procariota puede comprender un ácido nucleico de inserción que porta una secuencia genómica de rata con una o más modificaciones genéticas o un ácido nucleico exógeno (por ejemplo, un homólogo u ortólogo de un ácido nucleico de rata), que está flanqueado por brazos homólogos de rata complementarios a regiones genómicas específicas.
También se proporcionan células procariotas huésped que comprenden los diversos vectores de direccionamiento divulgados en el presente documento. Dichas células procariotas incluyen, pero no se limitan a, bacterias tales como E. coli. En una realización, una célula procariota huésped comprende un vector de direccionamiento que comprende un ácido nucleico de inserción flanqueado con un brazo de homología de rata 5' y un brazo de homología de rata 3', en donde el ácido nucleico de inserción varía de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 200 kb.
La célula procariota huésped puede comprender además un ácido nucleico que codifica un polipéptido de recombinasa o el ácido nucleico que codifica el polipéptido de recombinasa está unido operativamente a un promotor inducible.
Además, se describen diversos métodos y composiciones, que emplean el LTVEC como se describe en el presente documento en combinación con una célula procariota para producir modificaciones genéticas direccionadas. Tales composiciones y métodos se discuten en otra parte en el presente documento.
Se divulgan métodos para modificar un locus diana de un ácido nucleico mediante recombinación homóloga bacteriana (BHR) que comprenden la introducción en una célula procariota de un vector de direccionamiento que comprende un ácido nucleico de inserción flanqueado con un brazo de homología 5' y un brazo de homología 3', en donde la célula procariota comprende ácidos nucleicos correspondientes a los brazos de homología 5' y 3' y la célula procariota es capaz de expresar una recombinasa que media el BHR en el locus diana. Dichos vectores de direccionamiento pueden incluir cualquiera de los grandes vectores de direccionamiento divulgados en el presente documento. Tales métodos pueden emplear un LTVEC como se describe en detalle en el presente documento y además emplean el sistema CRISPR/Cas como se describe en otro lugar en el presente documento.
ii. Métodos para modificar un locus de interés diana en una célula de rata pluripotente
Se divulga además un método para modificar un locus diana de interés en una célula de rata pluripotente mediante modificación genética direccionada, que comprende (a) introducir en la célula de rata pluripotente un vector de direccionamiento que comprende un inserto de ácido nucleico flanqueado con un brazo de homología de rata 5' y un brazo de homología de rata 3', en donde la suma total del brazo de homología 5' y el brazo de homología 3' es al menos 10 kb; y (b) identificar una célula de rata pluripotente modificada genéticamente que comprende la modificación genética direccionada en el locus de interés diana. En una realización, la suma total del brazo de homología 5' y el brazo de homología 3' es de al menos aproximadamente 16 kb a aproximadamente 30 kb. En realizaciones específicas, la modificación genética direccionada puede transmitirse a través de la línea germinal. Dichos vectores de direccionamiento pueden incluir cualquiera de los grandes vectores de direccionamiento divulgados en el presente documento.
La divulgación se refiere a un método para modificar un locus genómico de interés en una célula de rata pluripotente mediante modificación genética direccionada, que comprende: (a) proporcionar una célula de rata pluripotente que es capaz de mantener su pluripotencia después de al menos una modificación genética direccionada su genoma y es capaz de transmitir la modificación direccionada a una línea germinal de una generación F1; (b) introducir un vector de direccionamiento grande (LTVEC) en la célula de rata pluripotente, en donde el LTVEC comprende un inserto de ácido nucleico flanqueado con un brazo de homología 5' y un brazo de homología 3', en donde el brazo de homología 5' y el brazo de homología 3' comprende un fragmento de ADN genómico de rata; y (c) identificar una célula de rata pluripotente modificada genéticamente que comprende la modificación genética direccionada.
Se pueden usar diversos métodos para identificar células que tienen el ácido nucleico de inserción integrado en el locus diana de interés. La inserción del ácido nucleico insertado en el locus diana de interés da como resultado una "modificación del alelo". El término "modificación de alelo" y los métodos para la detección del alelo modificado se discuten con más detalle en otra parte de este documento.
La divulgación se refiere a un método para modificar un locus genómico de interés en una célula de rata pluripotente a través de la orientación de genes mediada por endonucleasa, comprendiendo el método: (a) proporcionar una célula de rata pluripotente aislada que es capaz de transmitir el genoma genéticamente modificado a una línea germinal de una generación F1; (b) introducir en la célula de rata pluripotente un agente endonucleasa; en donde el agente de endonucleasa hace una ruptura de muesca o de doble cadena en una secuencia de ADN diana ubicada en el locus genómico de interés, y en donde la ruptura de muesca o de doble cadena en la secuencia de DNA diana en la célula ES de rata induce: (i) reparación de a Dn mediada por la unión por el extremo no homólogo (NHEJ) de la muesca o la ruptura de doble cadena, en donde la reparación de ADN mediada por NHEJ genera un alelo mutante que comprende una inserción o una eliminación de una secuencia de ácidos nucleicos en la secuencia de ADN diana; o (ii) reparación de ADN mediada por recombinación homóloga que resulta en la restauración de una secuencia de ácidos nucleicos de tipo salvaje; y (c) identificar el locus genómico de interés modificado.
La divulgación se refiere a un método para modificar un locus genómico de interés en una célula madre embrionaria de rata aislada (ES) a través de un agente de nucleasa, que comprende: (a) proporcionar una célula ES de rata aislada que es capaz de transmitir la modificación genética direccionada a una línea germinal de una generación F1; (b) introducción en la célula ES de rata: (i) un vector de direccionamiento grande (LTVEC) que comprende un ácido nucleico de inserto flanqueado con un brazo de homología 5' de rata y un brazo de homología 3' de rata, en donde el inserto es una secuencia de ácidos nucleicos que es de al menos 5 kb; y (ii) un agente de endonucleasa, en donde el agente de endonucleasa realiza una ruptura de muesca o de doble cadena en una secuencia de ADN diana localizada en el locus genómico de interés, y en donde la secuencia diana no está presente en el ácido nucleico de inserción; y (c) identificar la modificación genética direccionada en la célula madre embrionaria (ES) de rata.
La divulgación se refiere a un método para modificar un locus genómico de interés en una célula de rata pluripotente mediante ingeniería de genoma guiada por ARNcomprendiendo el método: (a) proporcionar una célula de rata pluripotente que puede transmitir el gen genéticamente modificado genoma a una línea germinal de una generación F1; (b) introducción en la célula de rata pluripotente: (i) un primer constructo de expresión que comprende un primer promotor unido operativamente a una primera secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína (CAS) asociada a Repeticiones Palindrómicas Cortas Regularmente Interespaciadas Aglomeradas (CRISPR) un segundo constructo de expresión que comprende un segundo promotor unido operativamente a una secuencia diana genómica unida a un ARN guía (ARNg), en donde la secuencia diana genómica está flanqueada en el extremo 3 por una secuencia de Motivo Protoespaciador Adyacente (PAM). En una realización, la secuencia diana genómica comprende la secuencia de nucleótidos de GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG (GN1-20GG; SEQ ID NO: 1). En una realización, la secuencia diana genómica comprende la SEQ ID NO: 1, en donde N tiene una longitud de entre 14 y 20 nucleótidos. En una realización, el ARNg comprende una tercera secuencia de ácidos nucleicos que codifica un ARN de Repeticiones Palindrómicas Cortas Regularmente Interespaciadas Aglomeradas (CRISPR) (ARNcr) y una cuarta secuencia de ácidos nucleicos que codifica un ARN CRISPR (ARNtracr) transactivador. En una realización, tras la expresión, la proteína Cas forma un complejo CRISPR-Cas que comprende el ARNcr y el ARNtracr, y el complejo CRISPR-Cas produce una ruptura de muesca o doble cadena en una secuencia de ADN objetivo ubicada en el locus genómico de interés, y en donde la ruptura de la muesca o la doble cadena en la secuencia de ADN diana en la célula de rata pluripotente induce: (i) la reparación de ADN mediada por la unión de extremo no homóloga (NHEJ) de la muesca o la ruptura de doble cadena creada por el complejo CRISPR-Cas, en donde el NHEJ genera un alelo mutante que comprende una inserción o una eliminación de una secuencia de ácidos nucleicos en la secuencia de ADN diana; o (ii) reparación de ADN mediada por recombinación homóloga que resulta en la restauración de una secuencia de ácidos nucleicos de tipo salvaje; y (c) identificar el locus genómico de interés modificado.
En una realización, la célula de rata pluripotente es una célula madre pluripotente de rata inducida (iPS). En una realización, la célula de rata pluripotente es una célula progenitora de desarrollo restringido.
La presencia de una muesca o una ruptura de doble cadena en el sitio de reconocimiento dentro del marcador de selección, en diversas realizaciones, aumenta la eficiencia y/o la frecuencia de recombinación entre un vector de direccionamiento (es decir, un LTVEC) y el locus diana de interés. En una realización, la recombinación es recombinación homóloga. En otra realización, la recombinación es una inserción por unión de extremo no homóloga. En diversas realizaciones, en presencia de la ruptura de la muesca o de la doble cadena, la eficiencia de la orientación de un vector de direccionamiento (es decir, un LTVEC) en el locus genómico diana es al menos aproximadamente 2 veces mayor, al menos aproximadamente 3 veces mayor, al menos aproximadamente 4 veces más que en ausencia de la ruptura de la muesca o de la doble cadena (utilizando, por ejemplo, el mismo vector de direccionamiento y los mismos brazos de homología y los correspondientes sitios de destino en el locus genómico de interés pero en ausencia de un agente de nucleasa agregado) eso hace que el muesca o la doble hebra se rompan).
En una realización, la modificación genética direccionada en el locus diana es bialélica. Por "bialélico" se entiende que ambos alelos de un gen comprenden la modificación genética direccionada. En ciertas realizaciones, el uso combinado de un vector de direccionamiento (incluyendo, por ejemplo, un LTVEC) con un agente de nucleasa da como resultado una modificación genética direccionada bialélica del locus genómico de interés en una célula en comparación con el uso del vector de direccionamiento solo. Cuando el vector de direccionamiento se usa junto con un agente de nucleasa, la eficiencia de direccionamiento bialélico aumenta al menos dos veces, al menos tres veces, al menos 4 veces o más en comparación con cuando el vector de direccionamiento se usa solo. En otras formas de realización, la eficacia de la orientación biallelica es al menos 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4% o 5% o mayor.
Se divulgan composiciones que comprenden una rata modificada genéticamente que tiene una modificación genética direccionada en el locus gamma del receptor de interleucina-2 o en el locus ApoE. Los diversos métodos y composiciones aquí descritos permiten que estos loci modificados se transmitan a través de la línea germinal.
En realizaciones específicas, una rata modificada genéticamente o una célula de rata pluripotente modificada genéticamente comprende un locus genómico que tiene una modificación genética direccionada en el locus del receptor gamma interleucina-2 o que tiene una modificación genética direccionada en el locus ApoE, en donde el receptor gamma interleucina-2 el locus genómico o el locus ApoE comprenden: (i) una eliminación de al menos una porción del locus del receptor gamma interleucina-2 o al menos una porción del locus ApoE; (ii) una inserción de una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga en el locus ApoE o en el locus del receptor gamma interleucina-2; o (iii) una combinación de los mismos, en donde el locus genómico modificado genéticamente es capaz de ser transmitido a través de la línea germinal.
Se describen adicionalmente métodos que permiten que se produzcan tales ratas modificadas genéticamente y que se produzcan tales células de rata pluripotentes modificadas genéticamente. Tales métodos incluyen un método para modificar un locus genómico de ApoE o un locus de receptor de interleucina-2 gamma en una célula de rata pluripotente mediante modificación genética direccionada. El método comprende (a) introducir en la célula de rata pluripotente un vector de direccionamiento que comprende un ácido nucleico insertado flanqueado con un brazo de homología de rata 5' al locus ApoE y un brazo de homología de rata 3' al locus ApoE, (b) que identifica una célula de rata pluripotente modificada genéticamente que comprende la modificación genética direccionada en el locus genómico de interés de ApoE, en donde la modificación genética direccionada es capaz de transmitirse a través de la línea germinal.
Los métodos adicionales incluyen (a) introducir en la célula de rata pluripotente un vector de direccionamiento que comprende un inserto de ácido nucleico flanqueado con un brazo de homología de rata 5' al locus gamma del receptor de la interleucina 2 y un brazo de homología de rata 3' al locus gamma del receptor de la interleucina 2, (b) identificación de una célula de rata pluripotente modificada genéticamente que comprende la modificación genética direccionada en el locus gamma del receptor de interleucina-2, donde la modificación genética direccionada es capaz de transmitirse a través de la línea germinal.
iii. Métodos de integración de polinucleótidos múltiples de interés en el locus direccionado
Los diversos métodos y composiciones divulgados en el presente documento permiten la integración direccionada de múltiples polinucleótidos de interés con un locus diana dado. Los diversos métodos expuestos anteriormente se pueden repetir secuencialmente para permitir la integración direccionada de cualquier número de ácidos nucleicos de inserción en un locus específico dado. Por lo tanto, los diversos métodos proporcionan la inserción de al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más insertos de ácidos nucleicos en el locus diana. En realizaciones particulares, tales métodos de apilamiento secuencial permiten la reconstrucción de grandes regiones genómicas de una célula de mamífero (es decir, un humano, un no humano, un roedor, un ratón, un mono, una rata, un hámster, un mamífero domesticado o un animal de origen agropecuario) en un locus diana. En tales casos, la transferencia y reconstrucción de regiones genómicas que incluyen tanto regiones codificantes como no codificantes permiten preservar la complejidad de una región determinada al retener, al menos en parte, las regiones codificantes, las regiones no codificantes y las regiones codificantes. Variaciones en el número de copias encontradas dentro de la región genómica nativa. Por lo tanto, los diversos métodos proporcionan, por ejemplo, métodos para generar regiones genómicas "heterólogas" o "exógenas" dentro de cualquier célula de mamífero o animal de interés, particularmente dentro de una célula huésped procariota o dentro de una célula de rata pluripotente o una célula ES de rata. En un ejemplo no limitante, se genera una región genómica "humanizada" dentro de un animal no humano (es decir, dentro de una rata).
3. Un locus genómico humanizado
En el presente documento se describen diversos métodos y composiciones que comprenden un locus de rata humanizado. Como se usa en el presente documento, por locus genómico "humanizado" se entiende una región de un genoma no humano que comprende al menos una secuencia de ácidos nucleicos humana. Un "locus de rata humanizado" comprende una región de ADN de rata que tiene insertada una secuencia de ADN humano. La secuencia de ADN humano puede ser una secuencia de ADN humano natural o puede modificarse desde su forma nativa. En realizaciones específicas, el ADN humano comparte al menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia humana nativa. Si una secuencia humana no es una secuencia humana nativa, al menos tiene mayor identidad de secuencia con una secuencia humana nativa que con una secuencia de rata ortóloga. Además, la secuencia de ADN humano puede comprender un ADNc, una región de ADN genómico humano, una región reguladora no codificante, o cualquier parte de una región de codificación, genómica o reguladora del ADN humano. La secuencia de ADN humano insertada en el locus de rata puede comprender cualquiera de los polinucleótidos de inserción como se describe en otra parte en el presente documento. En realizaciones específicas, la secuencia de ADN humano es ortóloga al locus diana de rata, mientras que, en otros casos, la secuencia de ADN humano es homóloga al locus diana de rata.
En una realización, la modificación genética direccionada es una inserción o un reemplazo de una secuencia de ácidos nucleicos de rata endógena con una secuencia de ácidos nucleicos humana homóloga u ortóloga. En una realización, la modificación genética direccionada comprende una inserción o reemplazo de una secuencia endógena de ácido nucleico de rata con una secuencia de ácidos nucleicos humana homóloga u ortóloga en un locus de rata endógeno que comprende la correspondiente secuencia de ácidos nucleicos de rata.
Los métodos para hacer un locus de rata humanizado (o una rata o célula de rata que comprende el locus de rata humanizado) comprenden la introducción en el locus diana que comprende un ácido nucleico de rata una secuencia de ácidos nucleicos humana. En una realización, se proporciona un método para hacer una rata humanizada. Dicho método comprende (a) modificar un genoma de una célula de rata pluripotente con un vector de direccionamiento que comprende un ácido nucleico de inserción que comprende una secuencia de ácidos nucleicos humana para formar una célula donante; (b) introducir la célula donante en un embrión de rata huésped; y (c) gestar el embrión de rata huésped en una madre sustituta; en donde la madre sustituta produce una progenie de rata que comprende la secuencia del ácido nucleico humano. En realizaciones específicas, el locus de rata humanizado es capaz de transmitirse a través de la línea germinal. En una realización adicional, el vector de direccionamiento comprende un vector de direccionamiento grande (LTVEC) y el ácido nucleico de inserción que comprende una secuencia de ácidos nucleicos humana es de al menos 5 kb.
En otros métodos, el locus de rata humanizado se fabrica modificando un locus diana de un ácido nucleico de rata mediante recombinación homóloga bacteriana (BHR). El método comprende introducir en una célula procariota un vector de direccionamiento que comprende un ácido nucleico de inserción flanqueado con un brazo de homología de rata 5' y un brazo de homología de rata 3', en donde el ácido nucleico de inserción comprende una secuencia de ácidos nucleicos humana, y en donde la célula procariota comprende un ácido nucleico de rata y es capaz de expresar una recombinasa que media el BHR en el locus diana.
El locus genómico de rata humanizado puede comprender (a) una inserción de una secuencia de ácidos nucleicos humana homóloga u ortóloga; (b) un reemplazo de una secuencia endógena de ácido nucleico de rata con una secuencia de ácidos nucleicos humana homóloga u ortóloga; o (c) una combinación de los mismos. En realizaciones específicas, el locus genómico de rata humanizado es capaz de transmitirse a través de la línea germinal. En otras realizaciones más, la secuencia ortóloga humana reemplaza la secuencia correspondiente encontrada en la rata.
Se puede usar cualquier secuencia de ácidos nucleicos humana en los métodos y composiciones divulgados en el presente documento. Ejemplos no limitantes de secuencias de ácidos nucleicos humanos que pueden usarse en los métodos y composiciones se discuten en detalle en otra parte de este documento.
La secuencia de ácidos nucleicos humana para la inserción en el locus de interés de rata puede ser de cualquier tamaño. En una realización, la secuencia de ácidos nucleicos humana puede ser de aproximadamente 500 nucleótidos a aproximadamente 200kb, de aproximadamente 500 nucleótidos a aproximadamente 5kb, de aproximadamente 5kb a aproximadamente 200kb, de aproximadamente 5kb a aproximadamente 10kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 20kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 30kb, desde aproximadamente 30kb a aproximadamente 40kb, desde aproximadamente 40kb a aproximadamente 50kb, desde aproximadamente 60kb a aproximadamente 70kb, desde aproximadamente 80kb a aproximadamente 90kb, desde aproximadamente 90kb a aproximadamente 100kb, desde aproximadamente 100kb a aproximadamente 110kb, desde aproximadamente 120kb a aproximadamente 130kb, desde aproximadamente 130kb a aproximadamente 140kb, desde aproximadamente
140kb a aproximadamente 150kb, desde aproximadamente 150kb a aproximadamente 160kb, desde aproximadamente 160kb a aproximadamente 170kb, desde aproximadamente 170kb a aproximadamente 180kb, desde aproximadamente 180kb a aproximadamente 190kb, o desde aproximadamente 190kb a unos 200kb. En una realización específica, la secuencia de ácidos nucleicos humana es de al menos 5 kb.
Se describe un locus genómico de rata en donde la secuencia de ácidos nucleicos humana homóloga u ortóloga comprende (a) uno o más segmentos del gen Vh de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana no reorganizados, uno o más segmentos del gen de la cadena pesada D de la inmunoglobulina humana no reorganizados y uno o más segmentos de inmunoglobulina humana no reorganizados del gen Jh de cadena pesada, que están unidos operativamente a una secuencia de ácidos nucleicos de región constante de cadena pesada de mamífero; (b) una secuencia de ácidos nucleicos de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana reorganizada operativamente unida a una secuencia de ácidos nucleicos de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de mamífero; (c) uno o más segmentos del gen Vk o Va de la inmunoglobulina humana no reorganizados y uno o más segmentos del gen Jk o Ja de la inmunoglobulina humana no reorganizados, que están operativamente enlazados a una secuencia de ácidos nucleicos de la región ligera de la cadena ligera de un mamífero, inmunoglobulina A o k; o,
(d) una secuencia de ácidos nucleicos de la región variable de la cadena ligera A o k de la inmunoglobulina humana reorganizada operativamente unida a una secuencia de ácidos nucleicos de la región constante de la cadena ligera A o k de la cadena ligera de la inmunoglobulina de mamífero.
Se describe un locus genómico de rata en donde (a) la secuencia de ácidos nucleicos de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de mamífero es una secuencia de ácidos nucleicos de región constante de rata, una secuencia de ácidos nucleicos de región constante humana, o una combinación de los mismos; o, (b) la secuencia de ácidos nucleicos de región constante de cadena ligera de cadena ligera de A o k de mamífero es una secuencia de ácidos nucleicos de región constante de rata, una secuencia de ácidos nucleicos de región constante humana, o una combinación de los mismos.
Se describe un locus genómico de rata en donde la secuencia de ácidos nucleicos de la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina se selecciona de o comprende un CH1, una bisagra, un CH2, un CH3 y/o una combinación de los mismos.
En un ejemplo, el locus genómico de rata comprende uno o más segmentos funcionales del gen Vh humano que comprenden Vh1-2, Vh1-3, Vh1-8, Vh1-18, Vh1-24, Vh1-45, Vh1-46, Vh1-58, Vh1-69, Vh2-5, Vh2-26, Vh2-70, Vh3-7,
Vh3-9, Vh3-11, Vh3-13, Vh3-15, Vh3-16, Vh3-20, Vh3-21, Vh3-23, Vh3-30, Vh3-30-3, Vh3-30-5, Vh3-33, Vh3-38, Vh3-43, Vh3-48, Vh3-49, Vh3-53, Vh3-64, Vh3-66, Vh3-72, Vh3-73, Vh3-74, Vh4-4, Vh4-28, Vh4-30-1, Vh4-30-2,
Vh4-30-4, Vh4-31, Vh4-34, Vh4-39, Vh4-59, Vh4-61, Vh5-51, Vh6-1, Vh7-4-1, Vh7-81, o una combinación de los mismos.
En un ejemplo, el locus genómico de rata comprende uno o más segmentos funcionales del gen D humano que comprenden D1-1, D1-7, D1-14, D1-20, D1-26, D2-2, D2-8, D2-15, D2-21, D3-3, D3-9, D3-10, D3-16, D3-22, D4-4,
D4-11, D4-17, D4-23, D5-12, D5-5, D5-18, D5-24, D6-6, D6-13, D6-19, D6-25, D7-27, o una combinación de los mismos.
En un ejemplo, el locus genómico de rata comprende uno o más segmentos funcionales del gen JH que comprenden
Jh1, Jh2, Jh3, Jh4, Jh5, Jh6, y / o una combinación de los mismos. En una realización, el ácido nucleico insertado comprende uno o más segmentos génicos VK humanos que comprenden Vk4-1, Vk5-2, V k7-3, Vk2-4, Vk1-5, Vk1-6,
Vk3-7, Vk1-8, Vk1-9, Vk2-10, Vk3-11, Vk1-12, Vk1-13, Vk2-14, Vk3-15, Vk1-16, Vk1-17, Vk2-18, Vk2-19, Vk3-20, Vk6-21, Vk1-22, Vk1-23, Vk2-24, Vk3-25, Vk2-26, Vk1-27, Vk2-28, Vk2-29, Vk2-30, Vk3-31, Vk1-32, Vk1-33, Vk3-34, Vk1-35, Vk2-36, Vk1-37, Vk2-38, Vk1-39, Vk2-40, o una combinación de los mismos.
En un ejemplo, el locus genómico de rata comprende uno o más segmentos del gen VA humano que comprenden VA3-1, VA4-3, VA2-8, VA3-9, VA3-10, VA2-11, VA3-12, VA2-14, VA3 -16, VA2-18, VA3-19, VA3-21, VA3-22, VA2-23, VA3-25,
VA3-27, o una combinación de los mismos.
En un ejemplo, el locus genómico de rata comprende uno o más segmentos de genes JK humanos que comprenden
Jk1, Jk2, Jk3, Jk4, Jk5, o una combinación de los mismos.
En otro ejemplo, el locus genómico de rata comprende un locus genómico humanizado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos del receptor de interleucina-2 humana (IL2R) o una variante o un fragmento de la misma. En realizaciones específicas, la secuencia de ácidos nucleicos de IL2R comprende un receptor alfa de interleucina-2, un
receptor beta de interleucina-2, o una secuencia de ácidos nucleicos gamma del receptor de interleucina-2 o variantes o fragmentos de la misma.
En ejemplos adicionales, un locus genómico de rata comprende un locus genómico humanizado que comprende una porción del locus ApoE humano, el locus gamma del receptor de Interleucina-2 humano, el locus Rag2 humano, el locus Rag1 humano y/o el Rag2 humano El locus/Rag1 reemplaza la porción homóloga u ortóloga correspondiente del locus ApoE de rata, el locus gamma del receptor de Interleucina-2 de rata, el locus Rag2 de rata, el locus Rag1 de rata y/o el locus Rag2/Rag1 de rata. En una realización, el ectodominio de rata de IL-2Rg se reemplaza con el ectodominio de IL-2Rg humano, con el resto de la molécula que es de la rata.
En otro ejemplo, se proporciona una rata modificada genéticamente que comprende un locus genómico humanizado. Dichas ratas modificadas genéticamente comprenden (a) una inserción de una secuencia de ácidos nucleicos humana homóloga u ortóloga; (b) un reemplazo de la secuencia de ácidos nucleicos de rata con una secuencia de ácidos nucleicos humana homóloga u ortóloga en un locus genómico endógeno; o (c) una combinación de los mismos, en donde el locus genómico humanizado es capaz de ser transmitido a través de la línea germinal.
También se proporcionan ratas modificadas genéticamente que comprenden cualquiera de los diversos loci genómicos humanizados divulgados en el presente documento y descritos anteriormente.
4. Polinucleótidos de interés.
Cualquier polinucleótido de interés puede estar contenido en los diversos ácidos nucleicos del inserto y, por lo tanto, integrarse en el locus diana. Los métodos divulgados en el presente documento proporcionan al menos 1,2, 3, 4, 5, 6 o más polinucleótidos de interés para integrarse en el locus genómico diana.
El polinucleótido de interés dentro del ácido nucleico de inserción cuando se integra en el locus genómico diana puede introducir una o más modificaciones genéticas en la célula. La modificación genética puede comprender una eliminación de una secuencia de ácidos nucleicos endógena y/o la adición de un polinucleótido exógeno o heterólogo u ortólogo en el locus genómico diana. En una realización, la modificación genética comprende un reemplazo de una secuencia de ácidos nucleicos endógena con un polinucleótido exógeno de interés en el locus genómico diana. Por lo tanto, los métodos divulgados en el presente documento permiten la generación de una modificación genética que comprende un bloqueo, una eliminación, una inserción, un reemplazo (activación), una mutación puntual, un intercambio de dominio, un intercambio de Exones, un intercambio de intrones, un intercambio de secuencia reguladora, un intercambio de genes, o una combinación de los mismos. Dichas modificaciones pueden ocurrir tras la integración del primero, segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto, séptimo o cualquier ácido nucleico de inserción posterior en el locus genómico diana.
El polinucleótido de interés dentro del inserto de ácido nucleico y/o integrado en el locus diana puede comprender una secuencia que es nativa de la célula en donde se introduce; el polinucleótido de interés puede ser heterólogo a la célula a la que se introduce; el polinucleótido de interés puede ser exógeno a la célula en donde se introduce; el polinucleótido de interés puede ser ortólogo a la célula en donde se introduce; o el polinucleótido de interés puede ser de una especie diferente a la célula en donde se introduce. Como se usa en el presente documento, "nativo" en referencia a una secuencia insertada en el locus diana es una secuencia que es nativa de la célula que tiene el locus diana o nativa de la célula de la que se derivó el locus diana (es decir, de una rata). Como se usa en el presente documento, "heterólogo" en referencia a una secuencia incluye una secuencia que se origina a partir de una especie extraña, o, si es de la misma especie, es sustancialmente diferente o está modificada de su forma nativa en composición y/o locus genómico por intervención humana deliberada. Como se usa en el presente documento, "exógeno" en referencia a una secuencia es una secuencia que se origina a partir de una especie extraña. El polinucleótido de interés puede ser de cualquier organismo de interés que incluye, entre otros, no humano, un roedor, un hámster, un ratón, una rata, un humano, un mono, un mamífero de origen agropecuario o un mamífero no agrícola. El polinucleótido de interés puede comprender además una región codificante, una región no codificante, una región reguladora o un ADN genómico. Por lo tanto, el 1°, 2°, 3°, 4°, 5°, 6°, 7° y/o cualquiera de los ácidos nucleicos del inserto posterior pueden comprender tales secuencias.
En una realización, el polinucleótido de interés dentro del ácido nucleico del inserto y/o integrado en el locus diana es nativo de una secuencia de ácidos nucleicos de ratón, un ácido nucleico humano, un ácido nucleico no humano, un ácido nucleico de roedor, un ácido nucleico de rata, un ácido nucleico de hámster, un ácido nucleico de mono, un ácido nucleico de mamífero de origen agropecuario o un ácido nucleico de mamífero no agrícola. En otras realizaciones adicionales, el polinucleótido de interés integrado en el locus diana es un fragmento de un ácido nucleico genómico. En una realización, el ácido nucleico genómico es un ácido nucleico genómico de ratón, un ácido nucleico genómico humano, un ácido nucleico no humano, un ácido nucleico de roedor, un ácido nucleico de rata, un ácido nucleico de hámster, un ácido nucleico de mono, un ácido nucleico de mono. ácido nucleico de mamífero o un ácido nucleico de mamífero no agrícola o una combinación de los mismos.
En una realización, el polinucleótido de interés puede variar desde aproximadamente 500 nucleótidos hasta aproximadamente 200kb como se describe anteriormente. El polinucleótido de interés puede ser de aproximadamente 500 nucleótidos a aproximadamente 5kb, de aproximadamente 5kb a aproximadamente 200kb, de aproximadamente 5kb a aproximadamente 10kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 20kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 30kb, de aproximadamente 30kb a aproximadamente 40kb, de aproximadamente 40kb a aproximadamente 50kb, desde aproximadamente 60kb a aproximadamente 70kb, desde aproximadamente 80kb a aproximadamente 90kb, desde aproximadamente 90kb a aproximadamente 100kb, desde aproximadamente 100kb a aproximadamente 110kb, desde aproximadamente 120kb a aproximadamente 130kb, desde aproximadamente 130kb a aproximadamente 140kb, desde aproximadamente 140kb a aproximadamente 150kb, desde aproximadamente 150kb a aproximadamente 160kb, desde aproximadamente 160kb a aproximadamente 170kb, desde aproximadamente 170kb a aproximadamente 180kb, desde aproximadamente 180kb a aproximadamente 190kb, o desde aproximadamente 190kb a aproximadamente 200kb, desde aproximadamente 5kb a aproximadamente 10kb, desde aproximadamente 10kb a aproximadamente 20kb, desde aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, desde aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, desde aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, desde aproximadamente 80kb a aproximadamente 100kb, desde aproximadamente 100kb a aproximadamente 150kb, desde aproximadamente 150kb a aproximadamente 200kb, desde aproximadamente 200kb a aproximadamente 250kb, desde aproximadamente 250kb a aproximadamente 300kb, desde aproximadamente 300kb a aproximadamente 350kb, o de aproximadamente 350kb a aproximadamente 400kb.
El polinucleótido de interés dentro del inserto de ácido nucleico y/o insertado en el locus genómico diana puede codificar un polipéptido, puede codificar un ARNmi, o puede comprender cualquier región reguladora o no codificante de interés que incluya, por ejemplo, una secuencia reguladora, una secuencia promotora, una secuencia potenciadora, una secuencia de unión a represor transcripcional, o una eliminación de una secuencia no codificadora de proteínas, pero no comprende una eliminación de una secuencia codificadora de proteínas. Además, el polinucleótido de interés dentro del inserto de ácido nucleico y/o insertado en el locus genómico diana puede codificar una proteína expresada en el sistema nervioso, el sistema esquelético, el sistema digestivo, el sistema circulatorio, el sistema muscular, el sistema respiratorio, el sistema cardiovascular, el sistema linfático, el sistema endocrino, el sistema urinario, el sistema reproductivo, o una combinación de los mismos. En una realización, el polinucleótido de interés dentro del inserto de ácido nucleico y/o insertado en el locus genómico diana codifica una proteína expresada en una médula ósea o una célula derivada de médula ósea. En una realización, el polinucleótido de interés dentro del inserto de ácido nucleico y/o integrado en el locus diana codifica una proteína expresada en una célula de bazo. En otras realizaciones adicionales, el polinucleótido de interés dentro del inserto de ácido nucleico y/o insertado en el locus diana codifica una proteína expresada en una célula B, codifica una proteína expresada en una célula B inmadura o codifica una proteína expresada en una célula B madura.
El polinucleótido de interés dentro del polinucleótido de inserción puede comprender una porción de un locus ApoE, un locus IL-2-Rg, un locus Rag1, un locus Rag2 y/o un locus Rag2/Rag1. Tales porciones de estos loci dados se discuten en otra parte en el presente documento, al igual que las diversas regiones homólogas y ortólogas de cualquier organismo de interés que pueda emplearse.
En una realización, el polinucleótido de interés dentro del inserto de ácido nucleico y/o insertado en el locus diana comprende una secuencia de ácidos nucleicos genómica que codifica una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina. La expresión "cadena pesada" o "cadena pesada de inmunoglobulina" se describe en otra parte de este documento.
En una realización, el polinucleótido de interés dentro del ácido nucleico de inserción y/o integrado en el locus diana comprende una secuencia de ácidos nucleicos genómica que codifica una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana.
En una realización, la secuencia de ácidos nucleicos genómica comprende uno o más segmentos génicos Vh de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reorganizados, uno o más segmentos génicos D de cadena pesada D de inmunoglobulina humana no reorganizados, y uno o más segmentos génicos Jh de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reorganizados, que están unidos operativamente a una secuencia de ácidos nucleicos de región constante de cadena pesada de mamífero. En una realización, la secuencia de ácidos nucleicos genómica comprende una secuencia de ácidos nucleicos de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana reorganizada operativamente unida a una secuencia de ácidos nucleicos de región constante de cadena pesada de mamífero. En una realización, la secuencia de ácidos nucleicos genómica comprende una o más inmunoglobulinas humanas Vk o Va no reorganizadas, segmentos génicos y una o más inmunoglobulina humana Jk o Ja no reorganizadas, segmentos génicos, que están operativamente enlazados a una inmunoglobulina de mamífero A o k cadena ligera cadena de la región constante secuencia de ácido nucleico. En una realización, la secuencia de ácidos nucleicos genómica comprende una secuencia de ácidos nucleicos de región variable de la cadena ligera A o k reorganizada operativamente unida a una secuencia de ácidos nucleicos de región constante de la cadena ligera de la A o k de la cadena ligera de k. En una realización, la secuencia de ácidos nucleicos de la región constante de la cadena pesada comprende una secuencia de ácidos nucleicos de la región constante de rata, una secuencia de ácidos nucleicos de la región constante humana, o una combinación de las mismas. En una realización, el ácido nucleico de la región constante de la cadena ligera de A o k comprende una secuencia de ácidos nucleicos de la región constante de rata, una secuencia de ácidos nucleicos de la región constante humana, o una combinación de los mismos.
En una realización, la secuencia de ácidos nucleicos de la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina se selecciona de o comprende un CH1, una bisagra, un CH2, un CH3 y/o una combinación de los mismos. En una realización, la secuencia de ácidos nucleicos de la región constante de la cadena pesada comprende una CH1-bisagra-CH2-CH3.
En una realización, el polinucleótido de interés dentro del ácido nucleico de inserción y/o integrado en el locus diana comprende una secuencia de ácidos nucleicos genómica que codifica una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina. La expresión "cadena ligera" incluye una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina de cualquier organismo, y se describe en otra parte en el presente documento.
En una realización, el polinucleótido de interés dentro del ácido nucleico de inserción y/o integrado en el locus genómico diana comprende una secuencia de ácidos nucleicos genómica que codifica una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana.
En una realización, la secuencia de ácidos nucleicos genómica comprende una o más segmentos génicos inmunoglobulina humana Vk o Va no reordenados y uno o más segmentos génicos de inmunoglobulina humana no reorganizados Jk o Ja, , que están operativamente enlazados a una secuencia de ácidos nucleicos de la región constante de la cadena ligera de la cadena ligera y la cadena ligera A o k de inmunoglobulina de roedor. En una realización, la secuencia de ácidos nucleicos genómica comprende una secuencia de ácidos nucleicos de región variable de cadena ligera A o k reorganizada operativamente unida operativamente a una secuencia de ácidos nucleicos de región constante de cadena ligera A o k de cadena ligera de roedor. En una realización, la secuencia de ácidos nucleicos de región constante de cadena ligera comprende una secuencia de ácidos nucleicos de región constante de rata, una secuencia de ácidos nucleicos de región constante humana, o una combinación de los mismos. En una realización, el ácido nucleico de la región constante de la cadena ligera de A o k comprende una secuencia de ácidos nucleicos de la región constante de rata, una secuencia de ácidos nucleicos de la región constante humana, o una combinación de los mismos.
El polinucleótido de interés dentro del inserto de ácido nucleico y/o integrado en el locus diana puede codificar una proteína extracelular o un ligando para un receptor. En realizaciones específicas, el ligando codificado es una citoquina. Las citoquinas de interés incluyen una quimioquina seleccionada de o que comprende CCL, CXCL, CX3CL y/o XCL. La citoquina también puede comprender un factor de necrosis tumoral (TNF). En otras realizaciones más, la citoquina es una interleucina (IL). En una realización, la interleucina se selecciona de o comprende IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10 , IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL -23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35, y/o IL-36. En una realización, la interleucina es IL-2. En realizaciones específicas, tales polinucleótidos de interés dentro del inserto de ácido nucleico y/o integrados en el locus genómico diana son de un humano y, en realizaciones más específicas, pueden comprender la secuencia genómica humana.
El polinucleótido de interés dentro del inserto de ácido nucleico y/o integrado en el locus genómico diana puede codificar Apolipoproteína E (ApoE).
El polinucleótido de interés dentro del inserto de ácido nucleico y/o integrado en el locus diana puede codificar una proteína citoplásmica o una proteína de membrana. En una realización, la proteína de membrana es un receptor, tal como un receptor de citoquinas, un receptor de interleucina, un receptor alfa de interleucina 2, un receptor beta de interleucina 2, un receptor gamma de interleucina 2 o un receptor tirosina quinasa. En otros casos, el polinucleótido de interés dentro del ácido nucleico insertado y/o integrado en el locus diana puede comprender una región ortóloga u homóloga del locus diana.
El polinucleótido de interés dentro del inserto de ácido nucleico y/o integrado en el locus diana puede comprender un polinucleótido que codifica al menos una región de un receptor de células T, incluido el receptor de células T alfa. En métodos específicos, cada uno de los ácidos nucleicos del inserto comprende una región genómica del locus del receptor de las células T (es decir, el locus alfa del receptor de las células T) de manera que, al completarse la integración en serie, una porción o la totalidad del locus del receptor de las células T genómicas tiene sido integrado en el locus diana. Dichos ácidos nucleicos de inserción pueden comprender al menos uno o más de un segmento variable o un segmento de unión de un locus receptor de células T (es decir, del locus alfa del receptor de células T). En otras realizaciones adicionales, el polinucleótido de interés que codifica la región del receptor de células T puede ser, por ejemplo, de un mamífero, un mamífero no humano, un roedor, un ratón, una rata, un ser humano, un mono, un mamífero de origen agropecuario o un polinucleótido de mamífero doméstico que codifica una proteína mutante.
En otras realizaciones, el polinucleótido de interés integrado en el locus diana codifica una proteína nuclear. En una realización, la proteína nuclear es un receptor nuclear. En realizaciones específicas, tales polinucleótidos de interés dentro del ácido nucleico de inserción y/o integrados en el locus diana son de un humano y, en realizaciones más específicas, pueden comprender una secuencia genómica humana.
El polinucleótido de interés dentro del inserto de ácido nucleico y/o integrado en el locus genómico diana puede comprender una modificación genética en una secuencia codificadora. Dichas modificaciones genéticas incluyen, pero no se limitan a, una mutación por eliminación de una secuencia codificadora o la fusión de dos secuencias de codificación.
El polinucleótido de interés dentro del inserto de ácido nucleico y/o integrado en el locus diana puede comprender un polinucleótido que codifica una proteína mutante, que incluye, por ejemplo, una proteína mutante humana. En una realización, la proteína mutante se caracteriza por una característica de unión alterada, localización alterada, expresión alterada y/o patrón de expresión alterado. En una realización, el polinucleótido de interés dentro del inserto de ácido nucleico y/o integrado en el locus diana comprende al menos un alelo de enfermedad, que incluye, por ejemplo, un alelo de una enfermedad neurológica, un alelo de una enfermedad cardiovascular, un alelo de una enfermedad renal, un alelo de una enfermedad muscular, un alelo de una enfermedad de la sangre, un alelo de un gen causante de cáncer o un alelo de una enfermedad del sistema inmunológico. En tales casos, el alelo de la enfermedad puede ser un alelo dominante o el alelo de la enfermedad es un alelo recesivo. Además, el alelo de la enfermedad puede comprender un alelo de polimorfismo de nucleótido único (SNP). El polinucleótido de interés que codifica la proteína mutante puede ser de cualquier organismo, incluido, entre otros, un mamífero, un mamífero no humano, un roedor, un ratón, una rata, un humano, un mono, un mamífero de origen agropecuario o un polinucleótido de mamíferos domésticos que codifica una proteína mutante.
En una realización, la modificación genética produce una forma mutante de una proteína con una característica de unión alterada, localización alterada, expresión alterada y/o patrón de expresión alterado.
En una realización, la modificación genética produce una eliminación, adición, reemplazo o una combinación de las mismas de una región del locus ApoE de rata, en donde la modificación genética en el locus ApoE da como resultado una disminución en la actividad de ApoE, en una realización, se genera un ApoE bloqueado.
En una realización, la modificación genética produce una eliminación, adición, reemplazo o una combinación de los mismos de una región del locus Rag1 de rata, en donde la modificación genética en el locus Rag1 da como resultado una disminución en la actividad de Rag1. En una realización, se genera un Rag1 bloqueado. En una realización, la modificación genética produce una eliminación, adición, reemplazo o una combinación de los mismos de una región del locus Rag2 de rata, en donde la modificación genética en el locus Rag2 da como resultado una disminución en la actividad de Rag2. En una realización, se genera un Rag2 bloqueado. En una realización, la modificación genética produce una eliminación, adición, reemplazo o una combinación de las mismas de una región del locus Rag1/Rag2 de rata, en donde la modificación genética en el locus Rag1/Rag2 da como resultado una disminución en la actividad Rag1 y una disminución en Actividad de Rag2. En una realización, se genera un Rag1/Rag2 bloqueado.
En una realización, la modificación genética produce una eliminación, adición, reemplazo o una combinación de las mismas de una región del locus gamma del receptor de interleucina-2 de rata, en donde la modificación genética en el locus gamma del receptor de interleucina-2 da como resultado una disminución en el receptor de interleucina-2 gamma. En una realización, se genera una desactivación gamma del receptor de interleucina-2.
Como se discutió en otra parte en el presente documento, las realizaciones adicionales descritas en el presente documento comprenden uno o más del locus ApoE de rata, el locus gamma del receptor de Interleucina-2 de rata, el locus Rag2, el locus Rag1 y/o el locus Rag2/Rag1 se modifican a través de el reemplazo de una porción del locus ApoE de rata, el locus gamma del receptor de interleucina-2, el locus Rag2, el locus Rag1 y/o el locus Rag2/Rag1 con la porción ortóloga correspondiente de un locus ApoE, un locus gamma del receptor de interleucina-2, un locus Rag2, un locus Rag1 y/o un locus Rag2/Rag1 de otro organismo.
En una realización, se generan múltiples modificaciones genéticas. En una realización, una modificación genética produce una eliminación, adición, reemplazo o una combinación de los mismos de una región del locus gamma del receptor de Interleucina-2 de rata, en donde la modificación genética en el locus gamma del receptor de Interleucina-2 da como resultado una disminución en el receptor gamma de la interleucina-2 y una segunda modificación genética producen una eliminación, adición, reemplazo o una combinación de los mismos de una región del locus Rag2 de rata, en donde la modificación genética en el locus Rag2 da como resultado una disminución en la actividad Rag2. En una realización, se genera un bloqueo de receptor gamma de interleucina-2/Rag2. Tal rata tiene un fenotipo SCID.
En una realización, el ácido nucleico de los mamíferos comprende un locus genómico que codifica una proteína expresada en el sistema nervioso, el sistema esquelético, el sistema digestivo, el sistema circulatorio, el sistema muscular, el sistema respiratorio, el sistema cardiovascular, sistema linfático, el sistema endocrino, el sistema urinario, el sistema reproductivo, o una combinación de los mismos. En una realización, el ácido nucleico de mamífero comprende un locus genómico que codifica una proteína expresada en una médula ósea o una célula derivada de médula ósea. En una realización, el ácido nucleico comprende un locus genómico que codifica una proteína expresada en una célula de bazo. En una realización, el locus genómico comprende una secuencia de ADN genómico de ratón, una secuencia de ADN genómico de rata y una secuencia de ADN genómico humano, o una combinación de las mismas. En una realización, el locus genómico comprende, en cualquier orden, secuencias de ADN genómico de rata y humano. En una realización, el locus genómico comprende, en cualquier orden, secuencias de ADN genómico de ratón y humano. En una realización, el locus genómico comprende, en cualquier orden, secuencias de ADN genómico de ratón y rata. En una realización, el locus genómico comprende, en cualquier orden, secuencias de ADN genómico de rata, ratón y humano.
En una realización, el ácido nucleico inserto comprende una modificación genética en una secuencia codificadora de un gen. En una realización, la modificación genética comprende una mutación por eliminación en la secuencia codificadora. En una realización, la modificación genética comprende una fusión de dos secuencias codificantes endógenas.
En una realización, la modificación genética comprende una eliminación de una secuencia no codificadora de proteínas, pero no comprende una eliminación de una secuencia codificadora de proteínas. En una realización, la eliminación de la secuencia no codificadora de proteínas comprende una eliminación de un elemento regulador. En una realización, la modificación genética comprende una adición de un promotor. En una realización, la modificación genética comprende una sustitución de un promotor o elemento regulador. En una realización, el elemento regulador es un potenciador. En una realización, el elemento regulador es un elemento de unión a represor transcripcional.
En una realización, la modificación genética comprende la colocación de una secuencia de ácidos nucleicos humana que codifica una proteína humana mutante. En una realización, la modificación genética comprende al menos un alelo de enfermedad humana de un gen humano. En una realización, la enfermedad humana es una enfermedad neurológica. En una realización, la enfermedad humana es una enfermedad cardiovascular. En una realización, la enfermedad humana es una enfermedad renal. En una realización, la enfermedad humana es una enfermedad muscular. En una realización, la enfermedad humana es una enfermedad de la sangre. En una realización, la enfermedad humana es un cáncer. En una realización, la enfermedad humana es una enfermedad del sistema inmune. En una realización, el alelo de la enfermedad humana es un alelo dominante. En una realización, el alelo de la enfermedad humana es un alelo recesivo. En una realización, el alelo de la enfermedad humana comprende un alelo de polimorfismo de nucleótido único (SNP).
El polinucleótido de interés dentro del inserto de ácido nucleico y/o integrado en el locus diana también puede comprender una secuencia reguladora, que incluye, por ejemplo, una secuencia promotora, una secuencia potenciadora o una secuencia de unión a represor transcripcional. En realizaciones específicas, el polinucleótido de interés dentro del inserto de ácido nucleico y/o integrado en el locus genómico diana comprende un polinucleótido que tiene una eliminación de una secuencia no codificadora de proteínas, pero no comprende una eliminación de una secuencia codificadora de proteínas. En una realización, la eliminación de la secuencia no codificadora de proteínas comprende una eliminación de una secuencia reguladora. En otra realización, la eliminación del elemento regulador comprende una eliminación de una secuencia promotora. En una realización, la eliminación del elemento regulador comprende una eliminación de una secuencia potenciadora. Dicho polinucleótido de interés puede ser de cualquier organismo, incluido, entre otros, un mamífero, un mamífero no humano, un roedor, un ratón, una rata, un humano, un mono, un mamífero de origen agropecuario o un polinucleótido de mamífero doméstico que codifique una proteína mutante.
5. Métodos de introducción de secuencias y generación de animales transgénicos
Como se describió anteriormente, se divulgan métodos y composiciones en el presente documento para permitir la integración direccionada de uno o más polinucleótidos de interés en un locus diana. Dichos sistemas emplean una variedad de componentes y, para facilitar la referencia, en el presente documento el término "sistema de integración direccionado" comprende genéticamente todos los componentes necesarios para un evento de integración (es decir, en ejemplos no limitantes, los diversos agentes de nucleasas, sitios de reconocimiento, polinucleótidos de ADN de inserción, vectores de direccionamiento, locus genómico diana y/o polinucleótidos de interés).
Los métodos divulgados en el presente documento comprenden la introducción en una célula de uno o más polinucleótidos o constructos polipeptídicos que comprenden los diversos componentes del sistema de integración genómica direccionada. "Introducción" significa presentar a la célula la secuencia (polipéptido o polinucleótido) de tal manera que la secuencia obtenga acceso al interior de la célula. Los métodos divulgados en el presente documento no dependen de un método particular para introducir cualquier componente del sistema de integración genómica diana en la célula, solo que el polinucleótido obtiene acceso al interior de al menos una célula. Los métodos para introducir polinucleótidos en diversos tipos de células son conocidos en la técnica e incluyen, entre otros, métodos de transfección estables, métodos de transfección transitoria y métodos mediados por virus.
En algunas realizaciones, las células empleadas en los métodos y composiciones tienen un constructo de ADN incorporado de forma estable en su genoma. "Incorporado de forma estable" o "introducido de forma estable" significa la introducción de un polinucleótido en la célula de modo que la secuencia de nucleótidos se integre en el genoma de la célula y pueda ser heredada por su progenie. Se puede usar cualquier protocolo para la incorporación estable de los constructos de ADN o los diversos componentes del sistema de integración genómica diana.
Los protocolos de transfección y los protocolos para introducir polipéptidos o secuencias de polinucleótidos en las células pueden variar. Métodos de transfección no limitantes incluyen métodos de transfección basados en químicos que incluyen el uso de liposomas; nanopartículas; fosfato de calcio (Graham et al. (1973). Virology 52(2): 456-67, Bacchetti et al. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74(4): 1590-4, and Kriegler, M (1991). Transfer and Expression: A Laboratory Manual. New York: W.H. Freeman and Company. pp. 96-97); dendrímeros; o polímeros catiónicos tales como DEAE-dextrano o polietilenimina. Los métodos no químicos incluyen la electroporación; sonoporación; y transfección óptica. La transfección basada en partículas incluye el uso de una pistola de genes, transfección asistida por imán (Bertram, J. (2006) Current Pharmaceutical Biotechnology 7, 277-28). Los métodos virales también se pueden utilizar para la transfección.
En una realización, la introducción de uno o más de los polinucleótidos en una célula está mediada por electroporación, por inyección intracitoplásmica, por una infección viral, por adenovirus, por lentivirus, por retrovirus, por transfección, por transfección mediada por lípidos o es mediada a través de Nucleofection™.
En una realización, la introducción de uno o más de los polinucleótidos en una célula comprende, además: la introducción de un constructo de expresión que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de interés operativamente unida a un promotor. En una realización, el promotor es un promotor constitutivamente activo. En una realización, el promotor es un promotor inducible. En una realización, el promotor es activo en la célula madre embrionaria de rata.
En una realización, el constructo de expresión se introduce junto con el LTVEC. En una realización, el constructo de expresión se introduce por separado del LTVEC durante un período de tiempo.
En una realización, la introducción de uno o más polinucleótidos en la célula puede realizarse múltiples veces durante un período de tiempo. En una realización, la introducción de uno o más polinucleótidos en la célula se realiza al menos dos veces durante un período de tiempo, al menos tres veces durante un período de tiempo, al menos cuatro veces durante un período de tiempo, al menos cinco veces durante un período de tiempo, al menos seis veces durante un período de tiempo, al menos siete veces durante un período de tiempo, al menos ocho veces durante un período de tiempo, al menos nueve veces durante un período de tiempo, al menos diez veces durante un período de tiempo, al menos once veces, al menos doce veces durante un período de tiempo, al menos trece veces durante un período de tiempo, al menos catorce veces durante un período de tiempo, al menos quince veces durante un período de tiempo, al menos dieciséis veces durante un período de tiempo, al menos diecisiete veces durante un período de tiempo, al menos dieciocho veces durante un período de tiempo, al menos diecinueve veces durante un período de tiempo, o al menos veinte veces durante un período de tiempo.
En una realización, el agente de nucleasa se introduce en la célula simultáneamente con el vector de direccionamiento o el vector de direccionamiento grande (LTVEC). Alternativamente, el agente de nucleasa se introduce por separado del vector de direccionamiento o el LTVEC durante un período de tiempo. En una realización, el agente de nucleasa se introduce antes de la introducción del vector de direccionamiento o el LTVEC, mientras que, en otras realizaciones, el agente de nucleasa se introduce después de la introducción del vector de direccionamiento o el LTVEC.
En una realización, la etapa de selección comprende un ensayo cuantitativo para evaluar la modificación del alelo (MOA) de un cromosoma parental. En una realización, el ensayo cuantitativo se lleva a cabo a través de una PCR cuantitativa. En una realización, la PCR cuantitativa es una PCR en tiempo real (qPCR). En una realización, la PCR en tiempo real comprende un primer conjunto de cebadores que reconoce el locus diana y un segundo conjunto de cebadores que reconoce un locus de referencia no direccionado. En una realización, el conjunto de cebadores comprende una sonda fluorescente que reconoce la secuencia amplificada. En una realización, el ensayo cuantitativo se lleva a cabo mediante hibridación in situ mediada por fluorescencia (FISH). En una realización, el ensayo cuantitativo se lleva a cabo mediante hibridación genómica comparativa. En una realización, el ensayo cuantitativo se lleva a cabo a través de amplificación de ADN isotérmica. En una realización, el ensayo cuantitativo se lleva a cabo a través de amplificación de ADN isotérmica. En una realización, el ensayo cuantitativo se lleva a cabo mediante hibridación cuantitativa a una(s) sonda(s) inmovilizada(s). En una realización, el ensayo cuantitativo se lleva a cabo a través de Invader Probes®. En una realización, el ensayo cuantitativo se lleva a cabo mediante ensayos MMP®. En una realización, el ensayo cuantitativo se lleva a cabo a través de TaqMan® Molecular Beacon. En una realización, el ensayo cuantitativo se lleva a cabo mediante la tecnología de sonda Eclipse™. (Véase, por ejemplo, US2005/0144655).
También se describe un método para hacer una rata humanizada, que comprende: (a) modificar un genoma de una célula de rata pluripotente con un vector de direccionamiento que comprende un ácido nucleico de inserción que comprende una secuencia de ácidos nucleicos humana para formar una célula donante; (b) introducir la célula donante en un embrión de rata huésped; y (c) gestar el embrión de rata huésped en una madre sustituta; en donde la madre sustituta produce una progenie de rata que comprende la secuencia del ácido nucleico humano. En una realización, la célula donante se introduce en un embrión de rata huésped que está en la etapa de blastocisto o en una etapa de premórula (es decir, una etapa de 4 células o una etapa de 8 células). Además, la etapa (a) también se puede realizar con un vector de direccionamiento grande (LTVEC) y/o una secuencia de ácidos nucleicos humana de al menos 5Kb de longitud. En otras realizaciones adicionales, la modificación genética es capaz de transmitirse a través de la línea germinal.
Se pueden generar ratas modificadas genéticamente empleando los diversos métodos divulgados en el presente documento. Tales métodos comprenden (1) integrar uno o más polinucleótidos de interés en el locus diana de una célula de rata pluripotente para generar una célula de rata pluripotente modificada genéticamente que comprende el ácido nucleico de inserción en el locus genómico diana que emplea los métodos divulgados en el presente documento; (2) seleccionar la célula de rata pluripotente modificada genéticamente que tiene uno o más polinucleótidos de interés en el locus genómico diana; (3) introducción de la célula de rata pluripotente modificada genéticamente en un embrión huésped de rata; y (4) implantar el embrión de rata huésped que comprende la célula de rata pluripotente modificada genéticamente en una madre sustituta. Se genera una progenie de la célula de rata pluripotente genéticamente modificada. En una realización, la célula donante se introduce en un embrión huésped de rata en la etapa de blastocisto o en la etapa de premórula (es decir, la etapa de 4 células o la etapa de 8 células). La progenie que es capaz de transmitir la modificación genética a través de la línea germinal se genera. La célula de rata pluripotente puede ser una célula ES de rata como se describe en otra parte en el presente documento.
Las técnicas de transferencia nuclear también se pueden usar para generar ratas modificadas genéticamente. En resumen, los métodos para la transferencia nuclear incluyen los pasos de: (1) enuclear un ovocito; (2) aislar una célula o núcleo donante para combinar con el ovocito enucleado; (3) insertar la célula o el núcleo en el ovocito enucleado para formar una célula reconstituida; (4) implantar la célula reconstituida en el útero de un animal para formar un embrión; y (5) permitir que el embrión se desarrolle. En tales métodos, los ovocitos generalmente se recuperan de animales muertos, aunque también pueden aislarse de oviductos y/o ovarios de animales vivos. Los ovocitos se pueden madurar en una variedad de medios conocidos por los expertos en la técnica antes de la enucleación. La enucleación del ovocito se puede realizar de varias maneras bien conocidas por los expertos en la técnica. La inserción de la célula o el núcleo del donante en el ovocito enucleado para formar una célula reconstituida generalmente se realiza mediante microinyección de una célula del donante en la zona pelúcida antes de la fusión. La fusión se puede inducir mediante la aplicación de un pulso eléctrico de CC a través del plano de contacto/fusión (electrofusión), mediante la exposición de las células a sustancias químicas que promueven la fusión, como el polietilenglicol, o mediante un virus inactivado, como el virus Sendai. Una célula reconstituida se activa típicamente por medios eléctricos y/o no eléctricos antes, durante y/o después de la fusión del donante nuclear y el ovocito receptor. Los métodos de activación incluyen pulsos eléctricos, choque inducido químicamente, penetración por el esperma, niveles crecientes de cationes divalentes en el ovocito y reducción de la fosforilación de proteínas celulares (como los inhibidores de la quinasa) en el ovocito. Las células reconstituidas activadas, o embriones, se cultivan típicamente en un medio bien conocido por los expertos en la técnica y luego se transfieren al útero de un animal. Véase, por ejemplo, los documentos US20080092249, WO/1999/005266A2, US20040177390, WO/2008/017234A1, y la patente de los Estados Unidos No. 7,612,250.
Se proporciona un método para hacer una rata modificada genéticamente, que comprende la modificación de un locus genómico de interés en una célula de rata pluripotente empleando la orientación de genes mediada por endonucleasa para introducir una modificación en un locus genómico de rata de interés para formar una célula de rata pluripotente modificada, manteniendo el célula de rata pluripotente modificada en condiciones suficientes para mantener la pluripotencia, empleando la célula de rata pluripotente modificada como célula donante en un embrión huésped de rata, y gestando el embrión huésped que comprende la célula de rata pluripotente modificada en una madre sustituta, en donde el embrión huésped es gestado por la madre sustituta y nace una progenie de rata modificada genéticamente.
En un ejemplo, la secuencia diana se ubica en un intrón. En un ejemplo, la secuencia diana se encuentra en un exón. En un ejemplo, la secuencia diana se encuentra en un promotor. En un ejemplo, la secuencia diana está ubicada en una región reguladora promotora. En un ejemplo, la secuencia diana se encuentra en una región potenciadora.
En un ejemplo, el paso de introducción se realiza varias veces durante un período de tiempo utilizando una pluralidad de endonucleasas que reconocen distintas secuencias diana. En un ejemplo, la etapa se realiza al menos dos veces durante un período de tiempo utilizando una pluralidad de endonucleasas que reconocen distintas secuencias diana, al menos tres veces durante un período de tiempo utilizando una pluralidad de endonucleasas que reconocen distintas secuencias diana, al menos cuatro veces durante un período de tiempo utilizando una pluralidad de endonucleasas que reconocen distintas secuencias diana, al menos cinco veces durante un período de tiempo utilizando una pluralidad de endonucleasas que reconocen distintas secuencias diana, al menos seis veces durante un período de tiempo utilizando una pluralidad de endonucleasas que reconocen distintas secuencias diana, al menos siete veces durante un período de tiempo utilizando una pluralidad de endonucleasas que reconocen distintas secuencias diana, al menos ocho veces durante un período de tiempo utilizando una pluralidad de endonucleasas que reconocen distintas secuencias diana, al menos nueve veces durante un período de tiempo utilizando una pluralidad de endonucleasas que reconocen distintas secuencias diana, al menos diez veces durante un período de tiempo utilizando una pluralidad de endonucleasas que reconocen distintas secuencias diana, al menos once veces durante un período de tiempo utilizando una pluralidad de endonucleasas que reconocen distintas secuencias diana, al menos doce veces durante un período de tiempo utilizando una pluralidad de endonucleasas que reconocen distintas secuencias diana, al menos trece veces durante un período de tiempo utilizando una pluralidad de endonucleasas que reconocen distintas secuencias diana, al menos catorce veces durante un período de tiempo utilizando una pluralidad de endonucleasas que reconocen distintas secuencias diana, al menos quince veces durante un período de tiempo utilizando una pluralidad de endonucleasas que reconocen distintas secuencias diana, al menos dieciséis veces durante un período de tiempo utilizando una pluralidad de endonucleasas que reconocen distintas secuencias diana, al menos diecisiete veces durante un período de tiempo utilizando una pluralidad de endonucleasas que reconocen distintas secuencias diana, al menos dieciocho veces durante un período o tiempo utilizando una pluralidad de endonucleasas que reconocen distintas secuencias diana, al menos diecinueve veces durante un período de tiempo utilizando una pluralidad de endonucleasas que reconocen distintas secuencias diana, o al menos veinte veces durante un período de tiempo utilizando una pluralidad de endonucleasas que reconocen distintas secuencias diana.
En un ejemplo, el paso de introducción está mediado por electroporación, por inyección intracitoplásmica, por un adenovirus, por lentivirus, por retrovirus, por transfección, por transfección mediada por lípidos o está mediado por Nucleofection™.
En un ejemplo, el método comprende además la introducción de un ácido nucleico exógeno en la célula de rata pluripotente modificada genéticamente. En un ejemplo, el ácido nucleico exógeno es un transgén. En un ejemplo, el ácido nucleico exógeno se introduce en un locus endógeno. En un ejemplo, el ácido nucleico exógeno se introduce ectópicamente (por ejemplo, en un locus diferente de su locus endógeno).
Se proporciona un método para hacer una rata modificada genéticamente, que comprende modificar un locus genómico de interés en una célula de rata pluripotente empleando ingeniería de genoma guiada por ARN para introducir una modificación en un locus genómico de interés de rata para formar una célula de rata pluripotente modificada, manteniendo la célula de rata pluripotente modificada en condiciones suficientes para mantener la pluripotencia, empleando la célula de rata pluripotente modificada como célula donante en un embrión huésped de rata, y gestando el embrión huésped que comprende la célula de rata pluripotente modificada en una madre sustituta, en donde el embrión huésped es gestado por la madre sustituta y nace una progenie de rata modificada genéticamente.
En un ejemplo, el método tiene una tasa de direccionamiento que oscila entre aproximadamente el 2% y aproximadamente el 80%.
En un ejemplo, el método comprende cointroducir una pluralidad de el segundo constructo de expresión que comprende secuencias diana genómicas distintas para la edición múltiple de loci genómicos distintos. En un ejemplo, el método comprende la introducción de una pluralidad de el segundo constructo de expresión que comprende secuencias diana genómicas distintas para la edición múltiple de loci genómicos distintos durante un período de tiempo.
En un ejemplo, la introducción de pasos se realiza varias veces durante un período de tiempo. En un ejemplo, la introducción de la etapa (b) se realiza al menos dos veces durante un período de tiempo, al menos tres veces durante un período de tiempo, al menos cuatro veces durante un período de tiempo, al menos cinco veces durante un período de tiempo , al menos seis veces durante un período de tiempo, al menos siete veces durante un período de tiempo, al menos ocho veces durante un período de tiempo, al menos nueve veces durante un período de tiempo, al menos diez veces durante un período de tiempo, al menos once veces durante un período de tiempo, al menos doce veces durante un período de tiempo, al menos trece veces durante un período de tiempo, al menos catorce veces durante un período de tiempo, al menos quince veces durante un período de tiempo , al menos dieciséis veces durante un período de tiempo, al menos diecisiete veces durante un período de tiempo, al menos dieciocho veces durante un período de tiempo, al menos diecinueve veces durante un período de tiempo, al menos veinte veces durante un período de tiempo.
En un ejemplo, el primer constructo de expresión y el segundo constructo de expresión se expresan a partir de un mismo plásmido.
En un ejemplo, la etapa de introducción está mediada por electroporación, por inyección intracitoplasmática, por un adenovirus, por lentivirus, por retrovirus, por transfección, por transfección mediada por lípidos o está mediada por Nucleofection™.
En un ejemplo, el método comprende además la introducción de un ácido nucleico exógeno en la célula de rata pluripotente que comprende el alelo mutante.
En un ejemplo, el ácido nucleico exógeno es un transgén. En una realización, el ácido nucleico exógeno se introduce en un locus endógeno. En un ejemplo, el ácido nucleico exógeno se coloca ectópicamente (por ejemplo, en un lugar diferente de su locus endógeno).
En un ejemplo, el método comprende además la introducción de un ácido nucleico exógeno en la célula de rata pluripotente modificada genéticamente. En un ejemplo, el ácido nucleico exógeno es un transgén. En un ejemplo, el ácido nucleico exógeno se introduce en un locus endógeno. En un ejemplo, el ácido nucleico exógeno se introduce ectópicamente (por ejemplo, en un locus diferente de su locus endógeno).
En un aspecto, se proporciona un método para hacer una rata humanizada, que comprende el método de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas, y que comprende la modificación de un genoma de una célula de rata pluripotente con un LTVEC que comprende un inserto que comprende una secuencia humana de al menos 5 kb, y empleando la célula de rata pluripotente como una célula donante, introduciendo la célula donante en un embrión huésped, y gestando el embrión huésped en una madre sustituta, en donde la madre sustituta da a luz una progenie de rata que comprende la humanización.
Se proporcionan otros métodos para hacer una rata modificada genéticamente que comprende en su línea germinal una o más modificaciones genéticas como se describe en el presente documento, que comprende: (a) modificar un locus de rata objetivo contenido en una célula procariota que emplea los diversos métodos divulgados en el presente documento; (b) seleccionar una célula procariota modificada que comprende la modificación genética en el locus de rata seleccionado; (c) aislar el vector de direccionamiento modificado genéticamente del genoma de la célula procariota modificada; (d) introducir el vector de direccionamiento modificado genéticamente en una célula de rata pluripotente para generar una célula pluripotente modificada genéticamente que comprende el ácido nucleico de inserción en el locus genómico direccionado; (e) seleccionar la célula pluripotente de rata modificada genéticamente; (f) introducción de la célula de rata pluripotente modificada genéticamente en un embrión de rata huésped en una etapa de premórula; y (g) implantar el embrión de rata huésped que comprende la célula de rata pluripotente modificada genéticamente en una madre sustituta para generar una generación F0 derivada de la célula de rata pluripotente modificada genéticamente. En tales métodos, el vector de direccionamiento puede comprender un vector de direccionamiento grande. La célula de rata pluripotente puede ser una célula ES de rata. En métodos adicionales, la etapa de aislamiento (c) comprende además (c1) la linealización del vector de direccionamiento modificado genéticamente (es decir, el LTVEC modificado genéticamente). En otros ejemplos adicionales, la etapa de introducción (d) comprende además (d1) la introducción de un agente de nucleasa como se describe en el presente documento en la célula de rata pluripotente. En un ejemplo, los pasos de selección (b) y/o (e) se llevan a cabo aplicando un agente seleccionable como se describe en el presente documento a la célula procariota o la célula de rata pluripotente. En un ejemplo, los pasos de selección (b) y/o (e) se llevan a cabo mediante un ensayo de modificación del alelo (MOA) como se describe en el presente documento.
Métodos adicionales para modificar un locus genómico diana de una célula de mamífero mediante recombinación homóloga bacteriana (BHR) en una célula procariota se describen y comprenden: (a) proporcionar una célula procariota que comprende un locus diana que comprende un ácido nucleico de rata, (b) introducir en la célula procariota un vector direccionado que comprende un ácido nucleico de inserción flanqueado con un brazo de homología de rata 5' y un brazo de homología de rata 3', en donde el ácido nucleico de inserción comprende una región de mamífero (que incluye, por ejemplo, un inserto de ADN de un ser humano), y (c) seleccionar una célula procariota direccionada que comprende el ácido nucleico insertado en el locus de rata objetivo, en donde la célula procariota es capaz de expresar una recombinasa que media en la BHR. La etapa (a1) puede comprender proporcionar una célula procariota que comprende un locus diana que comprende un ácido nucleico de rata que comprende un primer polinucleótido que comprende un primer sitio de reconocimiento para un primer agente de nucleasa, y la etapa (b1) puede comprender además expresar en la célula procariota un agente de nucleasa eso hace una ruptura de muesca o de doble cadena en o cerca del primer sitio de reconocimiento. Las etapas (a)-(c) se pueden repetir en serie como se describe en el presente documento para permitir la introducción de múltiples ácidos nucleicos de inserción en el locus de rata objetivo en la célula procariota. Una vez que el locus genómico diana se "construye" con la célula procariota, un vector de direccionamiento que comprende el locus de rata objetivo modificado puede aislarse de la célula procariota e introducirse en un locus genómico diana dentro de una célula de rata pluripotente. Las células de rata pluripotentes (es decir, células ES de rata) que comprenden el locus genómico modificado pueden transformarse en ratas modificadas genéticamente.
En algunos ejemplos, pueden llevarse a cabo diversas modificaciones genéticas de los loci genómicos diana divulgados en el presente documento mediante una serie de reacciones de recombinación homóloga (BHR) en células bacterianas utilizando un LTVEC derivado de ADN del Cromosoma Artificial Bacteriano (BAC) utilizando VELOCIGENE® tecnología de ingeniería genética (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 6,586,251 y Valenzuela, DM et al. (2003), High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotechnology 21(6): 652-659 ).
En algunas realizaciones, las células ES de rata direccionadas que comprenden diversas modificaciones genéticas como se describen en el presente documento se utilizan como células ES de inserción y se introducen en un embrión en etapa premórula de un organismo correspondiente, por ejemplo, un embrión de ratón en etapa de 8 células, a través del método VELOCIMOUSE® (Véase, por ejemplo, US 7,576,259, US 7,659,442, US 7,294,754, y US 2008­ 0078000 A1). El embrión de rata que comprende las células ES de rata modificadas genéticamente se incuba hasta la etapa de blastocisto y luego se implanta en una madre sustituta para producir un F0. Las ratas que tienen el locus genómico modificado genéticamente pueden identificarse mediante un ensayo de modificación del alelo (MOA) como se describe en el presente documento. La rata de generación F0 resultante derivada de las células de rata ES modificadas genéticamente se cruza con una rata de tipo salvaje para obtener descendientes de generación F1. Tras la genotipificación con cebadores y/o sondas específicas, las ratas F1 que son heterozigotas para el locus genómico genéticamente modificado se cruzan entre sí para producir ratas que son homozigotas para el locus genómico genéticamente modificado. Alternativamente, una rata hembra F0 y una rata macho F0 que tienen la modificación genética pueden cruzarse para obtener una rata F1 homozigota para la modificación genética.
Se proporciona un genoma de rata modificado genéticamente en el presente documento, que comprende una modificación direccionada de una secuencia de ácidos nucleicos de rata endógena con una secuencia de ácidos nucleicos de rata homóloga u ortóloga.
En un ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos no rata homóloga u ortóloga tiene una longitud de aproximadamente 5kb a aproximadamente 200kb. En un ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos no rata homóloga u ortóloga varía de aproximadamente 5kb a aproximadamente 10kb. En un ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos no rata homóloga u ortóloga varía de aproximadamente 10kb a aproximadamente 20kb. En un ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos no rata homóloga u ortóloga oscila entre aproximadamente 20kb y aproximadamente 30kb. En un ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos no rata homóloga u ortóloga oscila entre aproximadamente 30kb y aproximadamente 40kb. En un ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos no rata homóloga u ortóloga varía de aproximadamente 40kb a aproximadamente 50 kb. En un ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos no rata homóloga u ortóloga varía de aproximadamente 50kb a aproximadamente 60kb. En un ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos no rata homóloga u ortóloga varía de aproximadamente 60kb a aproximadamente 70kb. En un ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos no rata homóloga u ortóloga oscila entre aproximadamente 70kb y aproximadamente 80kb. En un ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos no rata homóloga u ortóloga varía de aproximadamente 80kb a aproximadamente 90kb. En un ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos no rata homóloga u ortóloga varía de aproximadamente 90kb a aproximadamente 100kb. En un ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos no rata homóloga u ortóloga oscila entre aproximadamente 100kb y aproximadamente 110kb. En un ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos no rata homóloga u ortóloga oscila entre aproximadamente 110kb y aproximadamente 120kb. En un ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos no rata homóloga u ortóloga varía de aproximadamente 120kb a aproximadamente 130kb. En un ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos no rata homóloga u ortóloga varía de aproximadamente 140kb a aproximadamente 150kb. En un ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos no rata homóloga u ortóloga varía de aproximadamente 150kb a aproximadamente 160kb. En un ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos no rata homóloga u ortóloga varía de aproximadamente 160kb a aproximadamente 170kb. En un ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos no rata homóloga u ortóloga varía de aproximadamente 170kb a aproximadamente 180kb. En un ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos no rata homóloga u ortóloga varía de aproximadamente 180kb a aproximadamente 190kb. En un ejemplo, la secuencia de ácidos nucleicos no rata homóloga u ortóloga varía de aproximadamente 190kb a aproximadamente 200kb. Varios polinucleótidos de interés que pueden emplearse en el ácido nucleico de inserción se describen en otra parte en el presente documento.
6. Células
Los diversos métodos y composiciones descritos aquí emplean un sistema de direccionamiento de locus genómico en una célula. En un ejemplo, la célula es una célula pluripotente. En un ejemplo, la célula pluripotente es una célula pluripotente no humana. En un ejemplo, la célula pluripotente no humana es una célula pluripotente de mamífero. En un ejemplo, la célula pluripotente es una célula madre pluripotente inducida humana (iPS).
En una realización, la célula pluripotente es una célula de rata pluripotente. En una realización, la célula de rata pluripotente es una célula madre embrionaria de rata (ES). En una realización, la célula de rata pluripotente es una célula madre pluripotente inducida (iPS) o es una célula progenitora de desarrollo restringido. En otras realizaciones, la célula de rata pluripotente es capaz de mantener su pluripotencia después de al menos una modificación genética direccionada de su genoma y es capaz de transmitir la modificación direccionada a una línea germinal de una generación F1.
En un ejemplo, la célula pluripotente es un óvulo fertilizado no humano en la etapa de célula única. En un ejemplo, el óvulo fertilizado no humano es un óvulo fertilizado de mamífero. En un ejemplo, el óvulo fertilizado de mamífero es un óvulo fertilizado de roedor en la etapa de una única célula. En un ejemplo, el óvulo fertilizado de mamífero es un óvulo fertilizado de rata o ratón en la etapa de una única célula.
Las diversas células empleadas en el método y las composiciones divulgadas en el presente documento también pueden comprender células procariotas, tales como una célula bacteriana, que incluye E. coli. En ejemplos específicos, la célula procariota es una cepa de E. coli competente para la recombinación. En un ejemplo, la célula procariota comprende un ácido nucleico que codifica la recombinasa, mientras que, en otros casos, la célula procariota no comprende el ácido nucleico que codifica la recombinasa, y el ácido nucleico que codifica la recombinasa se introduce en la célula procariota. En un ejemplo, el ácido nucleico que codifica la recombinasa comprende un ADN o un ARNm. En algunos ejemplos, el ácido nucleico que codifica la recombinasa es pABG. En un ejemplo, la recombinasa se expresa bajo el control de un promotor inducible. En una realización, la expresión de la recombinasa está controlada por arabinosa.
A. Células madre embrionarias (ES) de rata
Como se describe en detalle anteriormente, las diversas composiciones y métodos divulgados en el presente documento pueden emplear células madre embrionarias (ES) de rata. En una realización, la célula de rata pluripotente es una célula ES de rata. En una realización, la célula ES de rata se deriva de una cepa de rata es una rata Wistar, una cepa LEA, una cepa Sprague Dawley, una cepa Fischer, F344, F6 y Dark Agouti o ACI. En una realización, la cepa de rata es una mezcla de dos o más de una cepa seleccionada del grupo que consiste en Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 y Dark Agouti. En una realización, la célula ES de rata se deriva de una cepa consanguínea. En una realización, la célula ES de rata se deriva de una cepa seleccionada de una cepa DA y una cepa ACI. En una realización específica, la célula ES de rata se deriva de una cepa ACI. En una realización, la célula ES de rata se deriva de un blastocisto de rata.
En otras realizaciones, la célula ES de rata se caracteriza por la expresión de al menos un marcador de pluripotencia. En realizaciones específicas, la célula ES de rata se caracteriza por la expresión de un marcador de pluripotencia que comprende Oct-4, Sox-2, fosfatasa alcalina o una combinación de los mismos. En una realización, la célula ES de rata es una célula ES de rata macho (XY) o una célula ES de rata hembra (XX).
En una realización, después de una a 15 modificaciones genéticas en serie, las células ES de rata modificadas genéticamente tras la exposición al medio de diferenciación son capaces de diferenciarse en una pluralidad de tipos de células.
En una realización, después de una a 15 modificaciones genéticas en serie, las células ES de rata modificadas genéticamente son capaces de mantenerse en un estado indiferenciado en cultivo. En una realización, las células ES de rata modificadas genéticamente y cultivadas en estado indiferenciado, cuando se emplean como células donantes en un embrión huésped de rata, pueblan el embrión y forman un blastocisto que comprende de una a quince modificaciones genéticas. En una realización, el blastocisto, cuando se implanta en una madre sustituta en condiciones adecuadas para la gestación, se desarrolla en una progenie de rata F0 que comprende de una a 15 modificaciones genéticas.
Se describe una célula ES de rata aislada que es capaz de mantener la pluripotencia después de una o más modificaciones genéticas in vitro, y que es capaz de transmitir un genoma genéticamente modificado a una línea germinal de una generación F1.
En una realización, la célula ES de rata mantiene su pluripotencia para desarrollarse en una pluralidad de tipos celulares después de una o más modificaciones genéticas en serie in vitro (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o seis o más modificaciones genéticas en serie). En una realización, la modificación genética está mediada por una electroporación, por inyección intracitoplasmática, por una infección viral, por un adenovirus, por lentivirus, por retrovirus, por transfección, por transfección mediada por lípidos o por Nucleofaction™.
En una realización, la célula ES de rata mantiene su pluripotencia para desarrollarse en una pluralidad de tipos celulares después de una única ronda de electroporación con un ácido nucleico exógeno. En una realización, la célula ES de rata mantiene su pluripotencia para convertirse en una pluralidad de tipos de células después de una ronda 2a, 3a, 4a, 5a, 6a, 7a, 8a, 9a, 10a, 11a, 12a, 13a, 14a o 15a de electroporación con un ácido nucleico exógeno.
En otras realizaciones, las células ES de rata empleadas son las descritas en la Solicitud de los Estados Unidos No.
14/185,703, presentada el 20 de febrero de 2014.
La célula de rata pluripotente empleada en los diversos métodos y composiciones divulgadas en el presente documento puede caracterizarse por la expresión de al menos un marcador de pluripotencia que comprende Dnmt3L, Eras, Err-beta, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF receptor, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1, y/o una combinación de los mismos. En otros casos, la célula de rata pluripotente empleada en los diversos métodos y composiciones descritas aquí se caracteriza por una o más de las siguientes características: (a) falta de expresión de uno o más marcadores de pluripotencia que comprenden c-Myc, Ecat1 y/o Rexo1; (b) falta de expresión de uno o más marcadores mesodérmicos que comprenden Brachyury y/o Bmpr2; (c) falta de expresión de uno o más marcadores endodérmicos que comprenden Gata6, Sox17 y/o Sox7; o (d) falta de expresión de uno o más marcadores neuronales que comprenden Nestina y/o Pax6. Como se usa en el presente documento, "falta de expresión" en lo que se refiere a la expresión de un marcador de pluripotencia significa que la expresión del marcador de pluripotencia es igual o inferior al fondo experimental según se determina para cada experimento individual.
En una realización no limitativa, las células ES de rata descritas en el presente documento tienen una o más de cualquiera de las siguientes propiedades:
(a) tener competencia en la línea germinal, es decir, cuando la célula ES de rata se implanta en un embrión huésped de rata, el genoma de la línea celular ES de rata se transmite a una descendencia;
(b) tener competencia en la línea germinal después de al menos una modificación genética direccionada, lo que significa que cuando la célula ES de rata que tiene la modificación genética direccionada se implanta en un embrión huésped de rata, la modificación genética direccionada dentro del genoma de la línea celular ES de rata se transmite en una descendencia;
(c) tener pluripotencia in vitro;
(d) tener totipotencia in vitro;
(e) cuando se cultiva in vitro, se adhieren a una capa de células alimentadoras;
(f) cuando se cultivan in vitro, forman colonias de tipo esfera cuando se colocan en placas in vitro sobre una capa de células alimentadoras;
(g) mantener la pluripotencia cuando se cultiva in vitro en condiciones que comprenden una capa de células alimentadoras que no están modificadas genéticamente para expresar el factor inhibidor de la leucemia (LIF), donde los medios de cultivo comprenden una concentración suficiente de LIF;
(h) mantener la pluripotencia cuando se cultiva in vitro en condiciones que comprenden una capa de células alimentadoras, en donde los medios de cultivo comprenden LIF de ratón o una variante activa o fragmento de la misma;
(i) comprenden una firma molecular que se caracteriza por
i) la expresión de uno o más de los genes específicos de células ES de rata que comprenden Adheres Junctions Associate Protein (Ajap1), Claudina 5 (Cldn5), factor 9 de intercambio de nucleótido guanina Cdc42 (Arhgef9), proteína quinasa dependiente de calcio/calmodulina (Camk4), efrina-Al (Efnal), receptor de EPH A4 (Epha4), proteína de unión gap beta 5 (Gjb5), factor 1 de unión al factor de crecimiento insulínico similar (Ig fbp ll), interleulina 36 beta(Il1f8), receptor interleucina 28, alfa (Il28ra), factor 1 de determinación izquierda-derecha (Lefty1), receptor del factor inhibidor de la leucemia alfa (Lifr), receptor 2 del ácido lisofosfatídico (Lpar2), receptor de pentraxina neuronal (Ntm), proteína tirosina fosfatasa no receptor tipo 18 (Ptpn18), homeobox tipo 2 Caudal (Cdx2), Fibronectina tipo III y dominios de repetición de anquirina 1 (Fank1), Caja E1 Forkhead (factor 2 de transcripción tiroidea) (Foxe1), Peludo/potenciador de la división relacionado con el motivo 2 YRPW (Hey2), Caja E1 Forkhead (factor 2 de transcripción tiroidea) (Foxe1), Peludo/potenciador de la división relacionado con motivo 2 YRPW (Hey2), factor 1 de unión al potenciador linfoide (Lef1), tipo sal 3 (Drosophila) (Sall3), Homeobox SATB 1 (Satb1), miR-632, o una combinación de los mismos;
2. ii) la expresión de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ,23 , 24, 25 o más de los genes específicos de células ES de rata que comprenden Adheres Junctions Associate Protein (Ajap1), Claudina 5 (Cldn5), factor 9 de intercambio de nucleótido guanina Cdc42 (Arhgef9), proteína quinasa IV dependiente de calcio/calmodulina (Camk4), efrina-Al (Efna1), receptor de EPH A4 (Epha4), proteína de la unión beta 5 (Gjb5), factor 1 de unión al factor de crecimiento insulínico similar (Igfbpl1), Interleulin 36 beta(Il1f8), receptor de interleucina 28, alfa (Il28ra), factor 1 de determinación izquierda-derecha (Lefty1), receptor de factor inhibidor de la leucemia alfa (Lifr), receptor 2 de ácido lisofosfatídico (Lpar2), receptor de pentraxina neuronal (Ntm), proteína tirosina fosfatasa no receptor tipo 18 (Ptpn18) ), Homeobox tipo Caudal 2 (Cdx2), fibronectina tipo III y dominios de repetición de anquirina 1 (Fank1), Caja E1 Forkhead (factor 2 de transcripción tiroidea) (Foxe1), velludo/potenciador de la división relacionado con el motivo 2 YRPW (Hey2) Caja E1 Forkhead (factor 2 de transcripción de la tiroides) (Foxe1), velloso/potenciador de la división relacionado con el motivo 2 YRPW (Hey2), factor 1 de unión al reforzador linfoide (Lef1), tipo sal 3 (Drosophila) (Sall3), SATB Homeobox 1 (Satb1), miR-632, o una combinación de los mismos;
iii) al menos un aumento de 20 veces en la expresión de uno o más de los genes específicos de células ES de rata como se establece en la Tabla 9 cuando se compara con una célula ES de ratón F1H4;
iv) al menos un aumento de 20 veces en la expresión de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más de los genes específicos de células ES de rata como se establece en la Tabla 9 cuando se comparan con una célula ES de ratón F1H4;
v) la expresión de uno o más de los genes específicos de células ES de rata como se establece en la Tabla 10;
vi) la expresión de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más de los genes específicos de células ES de rata como se establece en la Tabla 10;
vii) al menos un aumento de 20 veces en la expresión de uno o más de los genes específicos de células ES de rata como se establece en la Tabla 10 cuando se compara con una célula ES de ratón F1H4;
viii) al menos un aumento de 20 veces en la expresión de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más de los genes específicos de células ES de rata como se establece en la Tabla 10 cuando se comparan con una célula ES de ratón F1H4;
ix) al menos una disminución de 20 veces en la expresión de uno o más de los genes específicos de células ES de rata como se establece en la Tabla 8 cuando se compara con una célula ES de ratón F1H4;
x) al menos una disminución de 20 veces en la expresión de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más de los genes específicos de células ES de rata como se establece en la Tabla 8 cuando se comparan con una célula ES de ratón F1H4;
xi) cualquier combinación de expresión de los genes específicos de células ES de rata de las partes (i)-(x);
xii) un nivel de expresión relativo de marcadores de pluripotencia como se muestra en la Tabla 11 para al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 de los marcadores de pluripotencia listados. Véase, columna de clasificación de pluripotencia de la Tabla 11 para los niveles de expresión relativos;
xiii) un nivel de expresión relativo de los marcadores mesodérmicos como se muestra en la Tabla 11 para al menos 2, 3 o 4 de los marcadores mesodérmicos listados. Véase, columna de clasificación mesodérmica en la Tabla 11 para los niveles de expresión relativos;
xiv) un nivel de expresión relativo de marcadores endodérmicos como se muestra en la Tabla 11 para al menos 2, 3, 4, 5 o 6 de los marcadores endodérmicos listados. Consulte la columna de clasificación endodérmica en la Tabla 11 para los niveles de expresión relativos;
xv) un nivel de expresión relativo de marcadores neurales como se muestra en la Tabla 11 para al menos 2 y 3 de los marcadores neuronales enumerados. Véase, columna de clasificación neuronal en la Tabla 11 para los niveles de expresión relativos;
xvi) un nivel de expresión relativo de marcadores de trofectodermo como se muestra en la Tabla 11 para los marcadores de trofectodermo listados. Consulte la columna de clasificación del trofectodermo en la Tabla 11 para los niveles de expresión relativos;
xvii) cualquier nivel de expresión relativa de uno o más (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30) de los marcadores de pluripotencia, marcadores mesodérmicos, marcadores endodérmicos, marcadores neurales y/o marcadores de trofectodermo expuestos en la Tabla 11;
xviii) el nivel de expresión relativa de cada uno de los marcadores establecidos en la Tabla 11;
xix) cualquier combinación de las firmas establecidas en xii-xiix; y/o
xx) cualquier combinación de la firma establecida en i-xiix;
(j) tener la capacidad de producir una rata F0;
(k) son susceptibles de subcultivarse y mantener el estado indiferenciado;
(l) tienen el mismo número de cromosomas que una célula de rata normal;
(m) mantener la pluripotencia in vitro sin requerir señalización LIF paracrina;
(n) auto renovación, lo que significa que se dividen indefinidamente mientras mantienen la pluripotencia;
(o) las células ES de rata expresan al menos un marcador de pluripotencia que comprende Dnmt3L, Eras, Err-beta, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, receptor LIF, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2, Utf1 y/o una combinación de los mismos;
(p) las células ES de rata no expresan uno o más marcadores de diferenciación que comprenden c-Myc, Ecat1 y/o Rexo1;
(q) las células ES de rata no expresan uno o más marcadores mesodérmicos que comprenden Brachyury, Bmpr2 y/o una combinación de los mismos;
(r) las células ES de rata no expresan uno o más marcadores endodérmicos que comprenden Gata6, Sox 17, Sox7 y/o una combinación de los mismos; y/o
(s) las células ES de rata no expresan uno o más marcadores neurales que comprenden Nestina, Pax6 y/o una combinación de los mismos.
Una o más de las características reseñadas en (a)-(s) pueden estar presentes en una célula ES de rata, una población de células ES de rata o una línea celular ES de rata empleadas en los métodos y composiciones divulgadas en el presente documento, en donde las células ES de rata no han sufrido una modificación genética direccionada. Además, después de una o más modificaciones genéticas en el locus diana de la rata, como se describe en detalle más arriba, la una o más de las características reseñadas en (a)-(s) pueden conservarse en la célula ES de rata después de la modificación genética del locus diana.
En una realización, la célula ES de rata exhibe una eficacia de recombinación homóloga de al menos 2%, al menos 3%, al menos 4%, al menos 5%, al menos 6%, al menos 7%, al menos 8%, al menos 9%, al menos 10%, al menos 11%, al menos 12%, al menos 13%, al menos 14%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30 %, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, o al menos 80%.
En una realización, la eficiencia de recombinación homóloga que emplea la célula ES de rata es mayor que 4%.
En una realización, la célula ES de rata tiene un tiempo de duplicación que varía de 24 horas a 36 horas. En una realización, la célula ES de rata tiene un tiempo de duplicación de 25 horas.
En una realización, la célula ES de rata se puede pasar hasta al menos 15 veces en medio 2i (Millipore Cat. SF016-200). En una realización, la célula ES de rata se puede pasar al menos 14 veces en medio 2i (Millipore Cat. No. SF016-200). En una realización, la célula ES de rata se puede pasar al menos 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 o 5 veces en medio 2i.
En una realización, cuando se trasplantan a un embrión de rata en etapa premórula, la célula ES de rata puede contribuir a al menos el 90% de las células en una generación F0. En una realización, cuando se trasplantan a un embrión de rata en etapa premórula, la célula ES de rata puede contribuir a al menos el 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de las células en una generación F0.
En realizaciones específicas, las diversas células ES de rata y líneas celulares empleadas en los diversos métodos y composiciones divulgadas en el presente documento se usan para generar una modificación direccionada en un locus diana. La célula ES de rata que tiene estas modificaciones genéticas específicas puede ser competente en la línea germinal, lo que significa que cuando la célula ES de rata que tiene la modificación genética específica se implanta en un embrión huésped de rata, la modificación genética específica de la célula ES de rata se transmite a la descendencia (es decir, la población F1). Así, en diversos aspectos, las células ES de rata en los diversos métodos y composiciones se emplean para obtener una alta frecuencia, o alta eficacia, de la transmisión de la línea germinal de un genoma de célula de rata a partir de células ES de rata que han sufrido una modificación genética direccionada. En diversas realizaciones, la frecuencia de transmisión de la línea germinal es mayor que 1:600, mayor que 1:500, mayor que 1:400, mayor que 1:300, mayor que 1:200 y mayor que 1:100. En diversas realizaciones, la frecuencia de transmisión de la línea germinal es mayor que 1%, mayor que 2%, mayor que 3%, mayor que 4%, mayor que 5%, mayor que 6%, mayor que 7%, mayor que 8%, más del 9%, más del 10%, hasta aproximadamente el 16%, más del 25%, más del 50%, más del 60%, más del 65%, más del 70%, más del 75% o más. En diversas realizaciones, la frecuencia de transmisión de la línea germinal varía de 9% a 16%. En diversos aspectos, el porcentaje de la progenie derivada de rESC donante en la generación F1 es 1% o más, 2% o más, 3% o más, 10% o más, 20% o más, 30% o más, 40% o más, 50% o más, 60% o más, de 3% a alrededor de 10% o más; de 3% o más a aproximadamente 63%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 30%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 50%, de aproximadamente 30% a aproximadamente 70%, de aproximadamente 30% a aproximadamente 60%, de aproximadamente 20% hasta aproximadamente el 40%, desde aproximadamente el 20% hasta el 65%, o desde aproximadamente el 40% hasta el 70%. Por lo tanto, una célula ES de rata que tiene una modificación genética direccionada tiene la capacidad de transmitir su genoma a la población F1.
Una célula ES de rata que tiene una modificación genética direccionada puede ser pluripotente y/o totipotente. Se pueden usar diversos métodos para determinar si una célula ES de rata es pluripotente. Por ejemplo, la célula ES puede analizarse para la expresión de diversos marcadores pluripotentes que incluyen, entre otros, Oct-4, Sox2, fosfatasa alcalina o una combinación de los mismos. Véase, por ejemplo, Okamoto, K. et al., Cell, 60: 461-472 (1990), Scholer, HR et al., EMBO J. 9: 2185-2195 (1990)) y Nanog (Mitsui, K. et al., Cell, 113: 631-642 (2003), Chambers, I. et al., Cell, 113: 643-655 (2003) para diversos métodos de análisis de la presencia o el nivel de tales marcadores. Véanse también las Figuras 2 y 3 descritas aquí. Otros marcadores de pluripotencia incluyen, por ejemplo, la presencia de al menos 1, 2, 3, 4 o 5 marcadores de pluripotencia que comprenden Nanog, Klf4, Dppa2, Fgf4, Rex1, Eras, Errbeta y/o Sall 3. Otros marcadores de pluripotencia incluyen, por ejemplo, la ausencia de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 marcador de pluripotencia que comprende T/Brachyury, Flk1, Nodal, Bmp4, Bmp2, Gata6, Sox17, Hhex1, Sox7 y/o Pax6.
En realizaciones específicas, la expresión y/o el nivel de expresión de estos marcadores pueden determinarse usando RT-PCR. Hay varios kits disponibles para determinar el nivel y/o la presencia de fosfatasa alcalina, incluyendo, por ejemplo, un kit de tinción de tejidos ALP (Sigma) y el Kit de sustrato de fosfatasa alcalina roja vector I (Funakoshi) y similares. Ensayos adicionales incluyen hibridación in situ, inmunohistoquímica, inmunofluorescencia. En realizaciones específicas, la célula ES de rata se caracteriza por la expresión de al menos un marcador de pluripotencia, que incluye, por ejemplo, la expresión de Oct-4, Sox2, fosfatasa alcalina o una combinación de los mismos, y preferiblemente los tres marcadores.
Las diversas células ES de rata empleadas en el método y las composiciones divulgadas en el presente documento son capaces de mantener la pluripotencia y/o totipotencia mientras se mantienen en condiciones de cultivo in vitro. Por lo tanto, las diversas células ES de rata proporcionadas en el presente documento pueden, en algunas realizaciones, subcultivarse mientras se mantiene el estado indiferenciado. Diversos métodos para cultivar células ES de rata se discuten con más detalle en otra parte de este documento y en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 14/185,703, presentada el 20 de febrero de 2014.
En algunas realizaciones, las células madre embrionarias de rata empleadas aquí se han aislado del embrión de rata empleando varias técnicas de aislamiento, purificación y expansión de cultivo que se discuten en detalle en la Solicitud de los Estados Unidos. En la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 14/185,703, presentada el 20 de febrero, 2014.
Un embrión de rata o célula ES de rata "aislada" se ha eliminado de su entorno natural. El término "aislado" puede significar libre de 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de los constituyentes con los que se encuentra un componente en su estado natural. Como se usa en el presente documento, una "línea celular" de rata ES comprende una población de células de rata aisladas que se desarrollaron a partir de una única célula ES de rata y, por lo tanto, la población de células dentro de una línea celular dada tiene una composición genética uniforme distinta a la de las mutaciones o los cambios cariotípicos ocurre durante la propagación o durante modificaciones genéticas específicas. Por ejemplo, las células ES de rata pueden caracterizarse por un alto nivel de euploidía. Sin embargo, en algunas líneas celulares el nivel de euploidía es inferior al 100% debido a cambios cariotípicos en la propagación de la línea desde una sola célula. Además, una población dada de células ES de rata puede comprender al menos 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109 o 1x1010 células o más. Algunas poblaciones celulares tienen células suficientes para permitir la selección de una célula modificada deseada pero no un número excesivamente mayor para reducir la posibilidad de que se desarrollen mutaciones o cambios cariotípicos en la línea celular. Por ejemplo, algunas poblaciones de células tienen de 1x103 a 1x106 células.
Como se analiza en otra parte del presente documento, se proporcionan diversos métodos para la modificación genética direccionada de una línea celular ES de rata. Cuando se llevan a cabo tales métodos, al menos una célula dentro de una línea de células ES de rata contiene la modificación genética direccionada. A través de diversas técnicas de cultivo y/o selección, se producen líneas celulares de rata ES que tienen una o más modificaciones genéticas direccionadas deseadas.
En realizaciones específicas, una célula ES de rata, una población de células ES de rata o una línea celular ES de rata (que no han sufrido una modificación genética direccionada y/o tienen una modificación genética específica) son euploides y así tener un número de cromosoma que es un múltiplo exacto del número haploide. En una realización adicional, una célula ES de rata, una población de células ES de rata o una línea celular ES de rata (que no han sufrido una modificación genética direccionada y/o tienen una modificación genética específica) son diploides, y así tener dos conjuntos haploides de cromosomas homólogos. Cuando se hace referencia a una población de células ES de rata o una población de células de una población determinada de células ES de rata o una línea de células ES de rata (que no han sufrido una modificación genética específica y/o tienen una modificación genética específica), al menos aproximadamente 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de las células con la población dada son euploides y/o diploides. En otros casos, al referirse a una población de células ES de rata o una población de células de una línea celular de ES de rata determinada (que no han sufrido una modificación genética específica y/o tienen una modificación genética específica), al menos aproximadamente el 50% a 95%, aproximadamente 60% a 90%, aproximadamente 60% a 95%, aproximadamente 60% a 85%, aproximadamente 60% a 80%, aproximadamente 70% a 80%, aproximadamente 70% a 85%, aproximadamente 70% a aproximadamente 90%, aproximadamente 70% a aproximadamente 95%, aproximadamente 70% a aproximadamente 100%, aproximadamente 80% a aproximadamente 100%, aproximadamente 80% a aproximadamente 95%, aproximadamente 80% a aproximadamente 90%, aproximadamente 90% a aproximadamente 100%, aproximadamente 90% a aproximadamente 99%, aproximadamente 90% a aproximadamente 98%, aproximadamente 90% a aproximadamente 97%, aproximadamente 90% a aproximadamente 95% de las células dentro de la población dada son euploides y/o diploides.
En otras realizaciones adicionales, una célula ES de rata, una población de células ES de rata o una línea celular ES de rata (que no han sufrido una modificación genética direccionada y/o tienen una modificación genética específica) tienen 42 cromosomas. Cuando se hace referencia a una población de células ES de rata o una población de células de una línea celular ES de rata dada (que no han sufrido una modificación genética específica y/o tienen una modificación genética específica) al menos aproximadamente el 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de las células con la población dada tienen 42 cromosomas. En otros casos, al referirse a una población de células ES de rata o una población de células de una línea celular de ES de rata dada (que no han sufrido una modificación genética específica y/o tienen una modificación genética específica) al menos aproximadamente del 50% al 95%, aproximadamente del 60% al 90%, aproximadamente del 60% al 95%, aproximadamente del 60% al 85%, aproximadamente del 60% al 80%, aproximadamente del 70% al 80%, aproximadamente del 70% al 85%, aproximadamente del 70% a aproximadamente 90% aproximadamente del 70% a aproximadamente 95%, aproximadamente del 70% a aproximadamente 100%, aproximadamente del 80% a aproximadamente 100%, aproximadamente del 80% a aproximadamente 95%, aproximadamente del 80% a aproximadamente 90%, aproximadamente del 90% a aproximadamente 100% aproximadamente del 90% a aproximadamente 99%, aproximadamente 90% a aproximadamente 98%, aproximadamente 90% a aproximadamente 97%, aproximadamente 90% a aproximadamente 95% de las células dentro de la población dada tienen 42 cromosomas.
En otras realizaciones, una célula ES de rata, una población de células ES de rata o una línea celular ES de rata (que no se han sometido a una modificación genética direccionada y/o tienen una modificación genética específica) aquí descritas forman colonias similares a esferas cuando se siembra una capa de células alimentadoras in vitro. La morfología "similar a una esfera" se refiere a la forma de las colonias de células ES de rata en cultivo, en lugar de la forma de células ES individuales. Las colonias de células ES de rata son de tipo esférico. Las colonias, que están ligeramente adheridas a las células alimentadoras, parecen circulares (tienen una morfología circular). Las colonias que flotan libremente son de tipo esférico. Las colonias de células ES de rata son de tipo esférico y muy compactas, lo que significa que los límites entre las células son muy difíciles de ver. El borde de la colonia aparece brillante y nítido. Los núcleos individuales son difíciles de distinguir porque las células son muy pequeñas (de modo que el núcleo ocupa la mayor parte del volumen de la célula). Las células ES de ratón forman colonias alargadas y se unen fuertemente a las células alimentadoras. La morfología de mESC puede variar con la tensión; por ejemplo, las colonias B6 son más redondas y más abovedadas que las colonias F1H4, pero aún son más alargadas que las rESC. Las colonias de células ES humanas son más planas y más dispersas que las colonias mESC. Las colonias ES de rata instantánea no son planas y no se parecen a las colonias de células ES humanas.
En otras realizaciones adicionales, una célula ES de rata, una población de células ES de rata o una línea celular ES de rata (que no han sufrido una modificación genética direccionada y/o tienen una modificación genética direccionada) tienen una morfología circular. A continuación, se proporciona una escala de morfología para un círculo, donde una puntuación de 10 representa un círculo perfecto y una puntuación de 1 representa una elipse.
Escala de morfología de un círculo:
10 = Un círculo con una estructura que tiene un eje longitudinal y un eje vertical que corre a través del centro de la estructura y tiene la misma longitud.
9 = Una estructura que tiene un eje longitudinal y un eje vertical que corre a través del centro de la estructura, en donde uno de los ejes está entre 0.9999 y 0.9357 de la longitud del otro eje.
8 = Una estructura que tiene un eje longitudinal y un eje vertical que recorre el centro de la estructura, en donde uno de los ejes está entre 0.9357 y 0.875 de la longitud del otro eje.
7 = Una estructura que tiene un eje longitudinal y un eje vertical que atraviesa el centro de la estructura, en donde uno de los ejes está entre 0.875 y aproximadamente 0.8125 de la longitud del otro eje.
6 = Una estructura que tiene un eje longitudinal y un eje vertical que atraviesa el centro de la estructura, en donde uno de los ejes está entre 0.8125 y 0.750 de la longitud del otro eje.
5 = Una estructura que tiene un eje longitudinal y un eje vertical que atraviesa el centro de la estructura, donde uno de los ejes está entre 0.750 y 0.6875 de la longitud del otro eje.
4 = Una estructura que tiene un eje longitudinal y un eje vertical que recorre el centro de la estructura, en donde uno de los ejes está entre 0.6875 y 0.625 de la longitud del otro eje.
3 = Una estructura que tiene un eje longitudinal y un eje vertical que atraviesa el centro de la estructura, en donde uno de los ejes está entre 0.625 y 0.5625 de la longitud del otro eje.
2 = Una estructura que tiene un eje longitudinal y un eje vertical que atraviesa el centro del círculo, en donde uno de los ejes está entre 0.5625 y 0.523 de la longitud del otro eje.
1 = Una elipse se define como que tiene un eje longitudinal y un eje vertical que recorre el centro de la estructura, en donde uno de los ejes está entre 0.523 y 0.500 de la longitud del otro eje.
En una realización no limitativa, la población de células ES de rata o una población de células de una línea celular ES de una rata dada (que no han sufrido una modificación genética direccionada y/o tienen una modificación genética específica) tienen al menos aproximadamente el 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de las células con la población dada tienen una puntuación de morfología circular de 10, 9 u 8. En otras realizaciones, la población de células ES de rata o una población de células de una rata dada la línea celular ES (que no ha sufrido una modificación genética específica y/o tiene una modificación genética específica) tiene al menos aproximadamente 50% a 95%, aproximadamente 60% a 90%, aproximadamente 60% a 95%, aproximadamente 60% a 85%, aproximadamente 60% a 80%, aproximadamente 70% a 80%, aproximadamente 70% a 85%, aproximadamente 70% a aproximadamente 90%, aproximadamente 70% a aproximadamente 95%, aproximadamente 70% a aproximadamente 100%, aproximadamente 80% a aproximadamente 100%, aproximadamente 80% a aproximadamente 95%, aproximadamente 80% a aproximadamente 90%, aproximadamente 90% a aproximadamente 100%, aproximadamente 90% a aproximadamente 99%, aproximadamente 90% a aproximadamente 98%, aproximadamente 90% a aproximadamente 97%, aproximadamente 90% a aproximadamente 95% de las células dentro de la población dada tienen una puntuación de morfología circular de 10, 9 u 8.
En otra realización no limitante, la población de células ES de rata o una población de células de una línea celular de ES de rata dada (que no han sufrido una modificación genética direccionada y/o tienen una modificación genética específica) tienen al menos aproximadamente 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de las células con la población dada tienen una puntuación de morfología circular de 7, 6, 5, 4 o 3. En otras realizaciones no limitantes, la población de células ES de rata o una población de células de una línea celular ES de rata dada (que no han sufrido una modificación genética específica y/o tienen una modificación genética específica) tienen al menos aproximadamente 50% a 95%, aproximadamente 60% a 90%, aproximadamente 60% a 95%, aproximadamente 60% a 85%, aproximadamente 60% a 80%, aproximadamente 70% a 80%, aproximadamente 70% a 85%, aproximadamente 70% a aproximadamente 90%, aproximadamente 70% a aproximadamente 95%, aproximadamente 70% a aproximadamente 100%, aproximadamente 80% a aproximadamente 100%, aproximadamente 80% a aproximadamente 95%, aproximadamente 80% a aproximadamente 90%, aproximadamente 90% a aproximadamente 100%, aproximadamente 90% a aproximadamente 99%, aproximadamente 90% a aproximadamente 98%, aproximadamente 90% a aproximadamente 97%, aproximadamente 90% a aproximadamente 95% de las células dentro de la población dada tienen una puntuación de morfología circular de 7, 6, 5, 4 o 3.
En otras realizaciones adicionales, se forman colonias de tipo esfera cuando las células ES de rata (que no han sufrido una modificación genética direccionada y/o tienen una modificación genética específica) se colocan sobre una capa de células alimentadoras in vitro. A continuación, se proporciona una escala de morfología para una esfera, donde una puntuación de 10 representa una esfera perfecta y una puntuación de 1 representa una estructura elíptica tridimensional.
Escala de morfología de una estructura similar a una esfera:
10 = Una esfera es una estructura que tiene un eje X y un eje Y y un eje Z, cada uno de los cuales atraviesa el centro de la estructura y tiene la misma longitud.
9 = Una estructura que tiene un eje X y un eje Y y un eje Z que se extiende a través del centro de la estructura, en donde uno de los ejes está entre 0.9999 y 0.9357 la longitud de al menos uno de los otros ejes.
8 = Una estructura que tiene un eje X y un eje Y y un eje Z que se extiende a través del centro de la estructura, en donde uno de los ejes está entre 0.9357 y 0.875, la longitud de al menos uno o ambos ejes.
7 = Una estructura que tiene un eje X y un eje Y y un eje Z que se extiende a través del centro de la estructura, en donde uno de los ejes está entre 0,875 y 0,8125 de la longitud de al menos uno o ambos de los otros ejes.
6 = Una estructura que tiene un eje X y un eje Y y un eje Z que corre a través del centro de la estructura, en donde uno de los ejes está entre 0.8125 y 0.750 la longitud de al menos uno o ambos de los otros ejes.
5 = Una estructura que tiene un eje X y un eje Y y un eje Z que se extiende a través del centro de la estructura, en donde uno de los ejes es 0.750 a 0.6875, la longitud de al menos uno o ambos ejes.
4 = Una estructura que tiene un eje X y un eje Y y un eje Z que se ejecuta a través del centro de la estructura, en donde uno de los ejes es 0.6875 a 0.625 la longitud de al menos uno o ambos de los otros ejes.
3 = Una estructura que tiene un eje X y un eje Y y un eje Z que se extiende a través del centro de la estructura, en donde uno de los ejes está entre 0.625 y 0.5625 la longitud de al menos uno o ambos ejes.
2 = Una estructura que tiene un eje X y un eje Y y un eje Z que se extiende a través del centro de la estructura, en donde uno de los ejes está entre 0.5625 y 0.523, la longitud de al menos uno o ambos ejes.
1 = Una estructura que tiene un eje X y un eje Y y un eje Z que se extiende a través del centro de la estructura, en donde uno de los ejes está entre 0.523 y 0.500 de la longitud de al menos uno o ambos ejes.
En una realización no limitativa, la población de células ES de rata o una población de células de una línea celular ES de rata dada (que no han sufrido una modificación genética direccionada y/o tienen una modificación genética específica) tienen al menos aproximadamente el 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de las colonias que se forman cuando las células se colocan sobre una capa de células alimentadoras in vitro tienen una morfología similar a una esfera de 10, 9 u 8. En otras realizaciones, la población de células ES de rata o una población de células de una línea celular ES de rata dada (que no han sufrido una modificación genética específica y/o tienen una modificación genética específica) tienen al menos aproximadamente 50% a 95%, aproximadamente 60% a 90%, aproximadamente 60% a 95%, aproximadamente 60% a 85%, aproximadamente 60% a 80%, aproximadamente 70% a 80%, aproximadamente 70% a 85%, aproximadamente 70% a aproximadamente 90%, aproximadamente 70% a aproximadamente 95%, aproximadamente 70% a aproximadamente 100%, aproximadamente 80% a aproximadamente 100%, aproximadamente 80% a aproximadamente 95%, aproximadamente 80% a aproximadamente 90%, aproximadamente 90% a aproximadamente 100%, aproximadamente el 90% a aproximadamente el 99%, aproximadamente el 90% a aproximadamente el 98%, aproximadamente el 90% a aproximadamente el 97%, aproximadamente el 90% a aproximadamente el 95% de las colonias que se forman cuando las células se colocan sobre una capa de células alimentadoras in vitro tienen una morfología en forma de esfera de un 10, 9 u 8.
En otra realización no limitante, la población de células ES de rata o una población de células de una línea celular ES de rata dada (que no han sufrido una modificación genética direccionada y/o tienen una modificación genética específica) tienen al menos aproximadamente el 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de las colonias que se forman cuando las células se colocan sobre una capa de células alimentadoras in vitro tienen una morfología similar a una esfera de 7, 6, 5, 4 o 3. En otras realizaciones, la población de células ES de rata o una población de células de una línea celular de ES de rata dada (que no han sufrido una modificación genética específica y/o tienen una modificación genética específica) tienen al menos aproximadamente 50% a 95%, aproximadamente 60% a 90%, aproximadamente 60% a 95%, aproximadamente 60% a 85%, aproximadamente 60% a 80%, aproximadamente 70% a 80%, aproximadamente 70% a 85%, aproximadamente 70% a aproximadamente 90%, aproximadamente 70% a aproximadamente 95%, aproximadamente 70% a aproximadamente 100%, aproximadamente 80% a aproximadamente 100%, aproximadamente 80% a aproximadamente 95%, aproximadamente 80% a aproximadamente 90%, aproximadamente 90% a aproximadamente 100%, aproximadamente 90% a aproximadamente 99%, aproximadamente 90% a aproximadamente 98%, aproximadamente 90% a aproximadamente 97%, aproximadamente 90% a aproximadamente 95% de las colonias que se forman cuando las células se colocan en una capa de células alimentadoras in vitro tienen una morfología similar a una esfera de 7, 6, 5, 4 o 3.
Una célula ES de rata dada, empleada en los diversos métodos y composiciones divulgadas en el presente documento puede ser una célula ES de rata macho (XY), una población masculina (XY) de células ES de rata, o una línea celular ES de rata macho (XY). En otras realizaciones, una población de células ES de rata o una línea celular ES de rata empleada en el presente documento puede ser una célula ES de rata hembra (XX), una población femenina (XX) de células ES de rata, o una línea celular ES de rata hembra (XX). Cualquier célula ES de rata, población de células ES de rata o línea celular ES de rata puede comprender la euploidía y/o diploidía como se describió anteriormente.
Las diversas células ES de rata empleadas en los métodos y composiciones pueden ser de cualquier cepa de rata, incluyendo, entre otras, una cepa de rata ACI, una cepa de rata Dark Agouti (DA), una cepa de rata Wistar, una cepa de rata LEA, una cepa de rata Sprague Dawley (SD) o una cepa de rata Fischer como Fisher F344 o Fisher F6. Las diversas células ES de rata también pueden obtenerse a partir de una cepa derivada de una mezcla de dos o más cepas citadas anteriormente. En una realización, la célula ES de rata se deriva de una cepa seleccionada de una cepa dA y una cepa ACI. En una realización específica, la célula ES de rata se deriva de una cepa ACI. La cepa de rata ACI se caracteriza por ser agutí negro, con vientre y pies blancos y un haplotipo RT1av1. Dichas cepas están disponibles en una variedad de fuentes, incluidos los Laboratorios Harlan. En otras realizaciones, las diversas células ES de rata son de una cepa de rata Dark Agouti (DA), que se caracteriza por tener una capa de agutí y un haplotipo RT1av1. Dichas ratas están disponibles en una variedad de fuentes, incluidos Charles River y Harlan Laboratories. En una realización adicional, las diversas células ES de rata empleadas en el presente documento son de una cepa de rata consanguínea.
En realizaciones específicas, la línea celular ES de rata es de una rata ACI y comprende la célula ES rata ACI.G1 como se describe en detalle en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 14/185,703, presentada el 20 de febrero de 2014. En otra realización, la línea celular ES de rata es de una rata DA y comprende la línea celular ES de rata DA.2B o la línea celular ES de rata DA.2C como se describe en detalle en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 14/185,703, presentada el 20 de febrero de 2014.
Una célula ES de rata dada descrita en el presente documento puede obtenerse a partir de un embrión de rata en diversas etapas del desarrollo del embrión de rata. Los embriones de rata empleados para derivar las células ES de rata pueden ser un embrión en etapa de mórula, un embrión en etapa de blastocisto o un embrión de rata en una etapa de desarrollo entre un embrión en etapa de mórula y un embrión en etapa de blastocisto. Por lo tanto, en realizaciones específicas, el embrión de rata empleado está en o entre las etapas de Witschi de 5 y 7. En otras realizaciones, el embrión de rata empleado está en la etapa de Witschi 5, 6 o 7.
En una realización, la célula ES de rata se obtiene de un blastocisto de rata. En otras realizaciones, la célula ES de rata se obtiene de un blastocisto de una rata superovulada. En otras realizaciones, las células ES de rata se obtienen de un embrión en estadio de 8 células, que luego se cultivan in vitro hasta que se convierte en un estadio de blastocistema de mórula, un embrión entre los estadios 5 y 7 de Witschi, o en un embrión en la etapa 5, 6 o 7 de Witschi. En ese momento, los embriones se colocan en placas. Los embriones en etapa de mórula comprenden una bola compacta de células sin cavidad interna. Los embriones en etapa de blastocisto tienen una cavidad interna visible (el blastocoel) y contienen una masa celular interna (ICM). Las células ICM forman células ES.
B. Derivación y propagación de células madre embrionarias de rata (ES)
Los métodos de derivación y propagación de células madre embrionarias de rata son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 14/185,703, presentada el 20 de febrero de 2014. En realizaciones específicas, tales métodos comprenden (a) proporcionar un cultivo in vitro que comprende una capa de células alimentadoras y una población de células madre embrionarias (ES) de rata aisladas; (b) cultivo in vitro en condiciones que son suficientes para mantener la pluripotencia y/o totipotencia de la célula ES de rata aislada. Tales métodos permiten de este modo la propagación de una población de células ES de rata y/o una línea celular de ES de rata.
Se proporcionan métodos para cultivar una línea de células madre embrionarias de rata. Dichos métodos comprenden cultivar in vitro una capa de células alimentadoras y una línea celular ES de rata, en donde las condiciones de cultivo mantienen la pluripotencia de las células ES de rata y comprenden un medio que tiene un factor inhibidor de la leucemia de ratón (LIF) o una variante activa o fragmento de la misma. Los métodos pueden comprender además pasar y cultivar in vitro las células de la línea celular ES de rata, en donde cada cultivo posterior in vitro comprende cultivar las células ES de rata en la capa de células alimentadoras en condiciones que mantienen la pluripotencia de las células ES de rata y comprende un medio con ratón LIF o una variante activa o fragmento de la misma.
Los medios de cultivo empleados en los diversos métodos y composiciones pueden mantener las células ES de rata. Los términos "mantener" y "mantenimiento" se refieren a la conservación estable de al menos una o más de las características o fenotipos de las células ES de rata que se describen aquí. Dichos fenotipos pueden incluir mantener la pluripotencia y/o la totipotencia, la morfología celular, los perfiles de expresión génica y las otras características funcionales de las células madre de rata descritas en el presente documento. El término "mantener" también puede abarcar la propagación de células madre, o un aumento en el número de células madre que se cultivan. El término contempla además las condiciones de cultivo que permiten que las células madre permanezcan pluripotentes, mientras que las células madre pueden o no continuar dividiéndose y aumentando en número.
El término "célula de alimentación" o "capa de células de alimentación" comprende un cultivo de células que crecen in vitro y secretan al menos un factor en el medio de cultivo que se utiliza para apoyar el crecimiento de otra célula de interés en el cultivo. Las células alimentadoras empleadas aquí ayudan a mantener la pluripotencia de las células ES de rata, y en realizaciones específicas, una o más de las otras características o fenotipos descritos aquí. Se pueden usar diversas células alimentadoras, incluidos, por ejemplo, fibroblastos embrionarios de ratón, incluidos fibroblastos embrionarios de ratón obtenidos entre el día 12 y el día 16 del embarazo. En realizaciones específicas, la capa de células alimentadoras comprende una monocapa de fibroblastos embrionarios de ratón inactivados mitóticamente (MEF).
Los cultivos in vitro de las células ES de rata comprenden además una cantidad eficaz de factor inhibidor de leucemia (LIF) o una variante activa o fragmento de la misma. El factor inhibidor de la leucemia (LIF) pertenece a la familia de receptores IL-6. LIF se une a un receptor de membrana heterodimérico formado por una subunidad específica de LIF, gp190 o LIFR, y la subunidad gp130, que se comparte con los otros miembros de la familia IL-6. LIF inhibe la diferenciación de células madre embrionarias en ratones y contribuye a la auto renovación de las células madre. El LIF humano y el ratón comparten un 79% de homología de secuencia y exhiben actividad de especies cruzadas. La LIF de rata (rtLIF) es una proteína de 22.1 kDa que contiene 202 residuos de aminoácidos que exhibe una identidad de secuencia de aminoácidos del 91% con la LIF murina (Takahama et al. 1998). Hay seis posibles sitios de glicosilación ligada a asparagina (N-glicosilación) que se conservan entre el polipéptido LIF de las diversas especies y un sitio adicional de Asn150 que es específico para LIF de rata. La estructura terciaria del LIF del ratón y su función se describen con más detalle en Aikawa et al. (1998) Biosci. Biotechnol. Biochem. 62 1318-1325 and Senturk et al. (2005) Immunology of Pregnancy, editor Gil Mor., Patente de los Estados Unidos No. 5,750,654 and D P Gearing (1987) EMBO Journal 1987-12-20. Una secuencia LIF de ratón parcial se informa en el sitio web SwissProt con el número de acceso P09056.
La actividad LIF del ratón se evalúa por su capacidad para inducir la diferenciación de las células de leucemia mieloide M1. La actividad específica es 1 x 106 unidades/ml (Cat. No. 03-0011 de Stemgent) y 1 x 107 unidades/ml (Cat. No.
03-0011-100 de Stemgent), donde 50 unidades se definen como la cantidad del LIF de ratón requerido para inducir la diferenciación en el 50% de las colonias M1 en 1 ml de medio. Véase, también, Williams, R.L. et al. (1988) Nature 336: 684-687.; Metcalf, D. et al. (1988) Leukemia 2: 216-221; Niwa, H. et al. (2009) Nature 460: 118-122; Xu, J. et al. (2010) Cell Biol Int. 34: 791-797; Fukunaga, N. et al. (2010) Cell Reprogram. 12: 369-376; y Metcalf D. (2003) Stem Cells 21: 5-14. Una "cantidad efectiva de LIF" comprende una concentración de LIF que permite que las células ES de rata de un cultivo in vitro permanezcan en un estado pluripotente indiferenciado. Diversos marcadores que se pueden usar para analizar las células que permanecen en un estado pluripotente se discuten en otra parte de este documento.
El polipéptido LIF empleado en los diversos métodos y composiciones divulgados en el presente documento puede ser de cualquier organismo, incluido un mamífero, un roedor, un ser humano, una rata o un ratón. En una realización, el polipéptido LIF es de un ratón. En otras realizaciones adicionales, el polipéptido LIF de ratón comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en el número de acceso SwissProt: P09056 y también se expone en la SEQ ID NO: 9.
En otras realizaciones, se puede usar una variante o fragmento activo del polipéptido LIF de ratón como se establece en la SEQ ID NO: 9 o en el número de acceso SwissProt: P09056. Dichas variantes y fragmentos activos (incluidas las variantes activas que tienen al menos 75%, 80%, 85% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9 se analiza con más detalle en otra parte del presente documento.
El polipéptido LIF o la variante activa o fragmento de la misma puede proporcionarse al cultivo in vitro de diversas maneras. En una realización, la cantidad eficaz del polipéptido LIF o la variante activa o fragmento de la misma se añade a los medios de cultivo. En otros ejemplos descritos, las células alimentadoras se han modificado genéticamente para sobreexpresar el polipéptido LIF o la variante activa o fragmento de la misma. Dichas células alimentadoras incluyen células alimentadoras preparadas a partir de fibroblastos de ratón DIA-M tratados con mitomicina o irradiados con rayos gamma que expresan LIF asociado a la matriz. El método para generar y utilizar dichas células alimentadoras modificadas genéticamente se puede encontrar, por ejemplo, en See, Buehr et al. (2003) Biol Reprod 68: 222-229, Rathjen et al. (1990) Cell 62 1105-1115, y Buehr et al. (2008) Cell 135: 1287-1298. El LIF heterólogo expresado en las células alimentadoras puede ser del mismo organismo que las células alimentadoras o de un organismo diferente al de la célula alimentadora. Además, el LIF heterólogo expresado en las células alimentadoras puede ser del mismo organismo o de un organismo diferente al de las células ES que la capa de alimentación soporta.
En aún otras realizaciones, las células alimentadoras empleadas en los diversos métodos divulgados en el presente documento no están modificadas genéticamente para expresar un polipéptido LIF heterólogo o una variante activa o fragmento de la misma. Por lo tanto, en realizaciones particulares, la monocapa de fibroblastos embrionarios de ratón inactivados mitóticamente empleado en los métodos no se ha modificado genéticamente para expresar un polipéptido LIF heterólogo.
En otras realizaciones, el polipéptido LIF o la variante activa o fragmento de la misma se añade a los medios de cultivo. Cuando se agrega LIF a los medios de cultivo, el LIF puede ser de cualquier organismo, incluido un mamífero, un roedor, un humano, una rata o un ratón. En una realización, el LIF presente en los medios de cultivo es de un ratón. En otras realizaciones adicionales, el polipéptido LIF de ratón comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 9. En otras realizaciones, puede usarse una variante o fragmento activo del polipéptido LIF de ratón como se expone en la SEQ ID NO: 9. Dichas variantes y fragmentos activos (incluidas las variantes activas que tienen al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% la identidad de secuencia a la SEQ ID NO: 9) se discute con más detalle en otra parte del presente documento.
En ejemplos específicos, las células ES de rata y las líneas celulares ES de rata descritas en el presente documento mantienen la pluripotencia in vitro sin requerir señal LIF paracrina.
En realizaciones específicas, LIF o una variante activa o fragmento de la misma está presente en los medios de cultivo en cualquier concentración que mantenga las células ES de rata. El polipéptido LIF o una variante activa o fragmento de la misma está presente en el medio de cultivo a aproximadamente 25U/ml a aproximadamente 50U/ml, a aproximadamente 50U/ml a aproximadamente 100U/ml, a aproximadamente 100U/ml a aproximadamente 125U/ml, a aproximadamente 125U/ml a aproximadamente 150U/ml, a aproximadamente 150U/ml a aproximadamente 175U/ml, a aproximadamente 175U/ml a aproximadamente 200U/ml, a aproximadamente 200U/ml a aproximadamente 225U/ml, a aproximadamente 225Um a aproximadamente 250U/ml, de aproximadamente 250U/ml a aproximadamente 300U/ml, de aproximadamente 300U/ml a aproximadamente 325U/ml, de aproximadamente 325U/ml a aproximadamente 350U/ml, de aproximadamente 350U/ml a aproximadamente 400U/ml, de aproximadamente 400U/ml a aproximadamente 425U/ml, a aproximadamente 425U/ml a aproximadamente 450U/ml, a aproximadamente 450U/ml a aproximadamente 475U/ml, a aproximadamente 475U/ml a aproximadamente 500U/ml, a aproximadamente 75U/ml a aproximadamente 500U/ml o mayor. En otras realizaciones, el polipéptido LIF o variante activa o fragmento de la misma está presente en el medio de cultivo a aproximadamente 25U/ml a aproximadamente 50U/ml, a aproximadamente 25U/ml a aproximadamente 100U/ml, a aproximadamente 75U/ml a aproximadamente 125U/ml , de aproximadamente 50U/ml a aproximadamente 150U/ml, de aproximadamente 90U/ml a aproximadamente 125U/ml, de aproximadamente 90U/ml a aproximadamente 110U/ml, de aproximadamente 80U/ml a aproximadamente 150U/ml, o de aproximadamente 80U/ml hasta aproximadamente 125U/ml. En una realización específica, el polipéptido LIF o variante activa o fragmento de la misma está presente en el medio de cultivo a aproximadamente 100 U/ml.
Cuando se emplea LIF de ratón, el polipéptido LIF de ratón o variante activa o fragmento de la misma está presente en el medio de cultivo en cualquier concentración que mantenga las células ES de rata. El polipéptido LIF de ratón o variante activa o fragmento de la misma está presente a aproximadamente 25U/ml a aproximadamente 50U/ml, a aproximadamente 50U/ml a aproximadamente 100U/ml, a aproximadamente 100U/ml a aproximadamente 125U/ml, a aproximadamente 125U/ml a aproximadamente 150U/ml, aproximadamente 150U/ml a aproximadamente 175U/ml, aproximadamente 175U/ml a aproximadamente 200U/ml, aproximadamente 200U/ml a aproximadamente 225U/ml, aproximadamente 225U/ml a aproximadamente 250U/ml, aproximadamente 250U/ml a aproximadamente 300U/ml, a aproximadamente 300U/ml a aproximadamente 325U/ml, a aproximadamente 325U/ml a aproximadamente 350U/ml, a aproximadamente 350U/ml a aproximadamente 400U/ml, a aproximadamente 400U/ml a aproximadamente 425U/ml, a aproximadamente 425U/ml a aproximadamente 450U/ml, a aproximadamente 450U/ml a aproximadamente 475U/ml, a aproximadamente 475U/ml a aproximadamente 500U/ml, a aproximadamente 75U/ml a aproximadamente 500U/ml o más. En otras realizaciones, el polipéptido LIF de ratón o variante activa o fragmento de la misma está presente a aproximadamente 25U/ml a aproximadamente 50U/ml, a aproximadamente 25U/ml a aproximadamente 100U/ml, a aproximadamente 75U/ml a aproximadamente 125U/ml, a aproximadamente 50U/ml a aproximadamente 150U/ml, a aproximadamente 90U/ml a aproximadamente 125U/ml, a aproximadamente 90U/ml a aproximadamente 110U/ml, a aproximadamente 80U/ml a aproximadamente 150U/ml, o aproximadamente a 80U/ml a aproximadamente 125U/ml. En una realización específica, el polipéptido LIF de ratón o variante activa o fragmento de la misma está presente en el medio de cultivo a aproximadamente 100U/ml.
Los medios de cultivo empleados mantienen células ES de rata. Como tal, en realizaciones específicas, los medios de cultivo empleados en los diversos métodos y composiciones mantendrán la pluripotencia de todas o la mayoría (es decir, más del 50%) de las células ES de rata en una línea celular durante un período de al menos 5, 10 o 15 pases. En una realización, los medios de cultivo comprenden uno o más compuestos que ayudan a mantener la pluripotencia. En una realización, los medios de cultivo comprenden un inhibidor de la ruta MEK y un inhibidor del glucógeno sintasa quinasa-3 (GSK-3). También se describen ejemplos en los que los medios pueden comprender además componentes adicionales que ayudan a mantener las células ES, incluyendo, por ejemplo, inhibidores del receptor de FGF, inhibidores de ROCK y/o inhibidores de ALK (receptor de TGFb). Un ejemplo no limitante de un inhibidor del receptor de FGF incluye PD184352. Un ejemplo no limitante de un inhibidor de ROCK incluye Y-27632, y un ejemplo no limitativo de un inhibidor de ALK (receptor de TGFb) incluye A-83-01. En los ejemplos, el medio 2i se usa con 10 uM ROCKi cuando se descongela el rESC crioconservado o cuando se vuelve a colocar el rESC después de la disociación con tripsina.
En otras realizaciones, los medios comprenden una combinación de inhibidores que consisten en un inhibidor de la ruta de MEK y un inhibidor del glucógeno sintasa quinasa-3 (GSK-3).
En una realización no limitativa, los medios de cultivo comprenden un inhibidor de GSK-3 que comprende CHIR99021 y/o un inhibidor de MEK que comprende PD0325901. En otras realizaciones, los medios comprenden una combinación de inhibidores que consisten en CHIR99021 y PD0325901. Cualquiera de estos compuestos se puede obtener, por ejemplo, de Stemgent. En realizaciones específicas, CHIR99021 está presente en los medios de cultivo a una concentración de aproximadamente 0.5 p a aproximadamente 3 pM, aproximadamente 0.5 p a aproximadamente 3.5 |jM, aproximadamente 0.5 jiM a aproximadamente 4 jiM, aproximadamente 0.5 jiM a aproximadamente 1 jiM, aproximadamente 1 jiM a aproximadamente 1.5 jiM, aproximadamente 1.5 jM a aproximadamente 2 jiM, aproximadamente 2 jiM a aproximadamente 2.5 jiM, aproximadamente 2.5 a aproximadamente 3 jiM, 3 jiM a aproximadamente 3.5 jiM. En realizaciones adicionales, CHIR99021 está presente en los medios de cultivo a una concentración de aproximadamente 3 jiM. En otras realizaciones, PD0325901 está presente en los medios de cultivo a una concentración de aproximadamente 0.4 jiM a aproximadamente 1 uM, aproximadamente 0.4 jiM a aproximadamente 1.5 uM, aproximadamente 0.4 jiM a aproximadamente 2 jiM, aproximadamente 0.4 jiM a aproximadamente 0.8 jiM, 0.8 jiM a aproximadamente 1.2 jiM, aproximadamente 1.2 a aproximadamente 1.5 jiM. En realizaciones adicionales, PD0325901 está presente en los medios de cultivo a una concentración de aproximadamente 1 jiM. En realizaciones específicas, CHIR99021 está presente en los medios de cultivo a una concentración de aproximadamente 3 jiM y PD0325901 está presente en una concentración de aproximadamente 1 jM.
En una realización no limitativa, los medios de cultivo empleados en los diversos métodos y composiciones divulgados en el presente documento son medios 2i que comprenden: medio basal DMEM/F12 (a una concentración de 1x (50%)); medios neurobasales (a una concentración de 1x (50%)); penicilina/estreptomicina (a una concentración del 1%); L-glutamina (a una concentración de 4 mM); 2-mercaptoetanol (a una concentración de 0.1 mM); suplemento de N2 (a una concentración de 1x); Suplemento B27 (a una concentración 1x); LIF (a una concentración de 100U/ml); PD0325901 (inhibidor de Me K) (a una concentración de 1 jiM) y CHIR99021 (inhibidor de GSK) (a una concentración de 3 jiM).
Los medios adicionales que pueden emplearse incluyen los descritos en Li et al. (2008) Cell 135: 1299-1310, Yamamoto et al. (2012) Transgenic Rats 21: 743-755, Ueda et al. (2008) PLoS ONE 3(6): e2800, Meek et al. (2010) PLoS ONE 4 (12): e14225; Tong et al. (2010) Nature 467: 211-213; Publicación de Patente de los Estados Unidos 2012/0142092, Buehr et al. (2008) Cell 135: 1287-1298, Li et al. (135) Cell 1299-1310, cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Cuando se emplean dichos medios, la concentración y la fuente de LIF se pueden modificar como se describe en el presente documento. En realizaciones específicas, los diversos medios de cultivo se utilizan en combinación con LIF de ratón o una variante activa o fragmento de la misma, e incluso en realizaciones adicionales, los diversos medios de cultivo comprenden una LIF de ratón o una variante activa o fragmento de la misma a una concentración de aproximadamente 50U/ml a aproximadamente 100U/ml, aproximadamente 50U/ml a aproximadamente 150U/ml, o aproximadamente 100U/ml.
La temperatura de los cultivos de células ES de rata, tanto para la producción de la línea celular ES como para el cultivo y mantenimiento de la línea ES, se realiza típicamente a aproximadamente 35°C hasta aproximadamente 37.5°C. En una realización específica, la temperatura es de 37.0°C. El cultivo se realiza típicamente al 7.5% de CO2.
7. Identidad de secuencia
Los métodos y composiciones divulgados en el presente documento emplean una variedad de diferentes componentes del sistema de integración genómica direccionada (es decir, agentes de nucleasa, sitios de reconocimiento, ácidos nucleicos de inserción, polinucleótidos de interés, vectores de direccionamiento, marcadores de selección y otros componentes). A lo largo de la descripción, se reconoce que algunos componentes del sistema de integración genómica diana pueden tener variantes y fragmentos activos. Tales componentes incluyen, por ejemplo, agentes de nucleasa (es decir, agentes de nucleasa modificados por ingeniería genética), sitios de reconocimiento de agentes de nucleasa, polinucleótidos de interés, sitios diana y brazos de homología correspondientes del vector de direccionamiento. La actividad biológica para cada uno de estos componentes se describe en otra parte de este documento.
Como se usa en el presente documento, "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos polinucleótidos o secuencias polipeptídicas hace referencia a los residuos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para una correspondencia máxima en una ventana de comparación específica. Cuando se usa el porcentaje de identidad de secuencia en referencia a las proteínas, se reconoce que las posiciones de los residuos que no son idénticas a menudo difieren por las sustituciones de aminoácidos conservadoras, donde los residuos de aminoácidos son sustituidos por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en las sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia puede ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Se dice que las secuencias que difieren por tales sustituciones conservadoras tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la técnica. Por lo general, esto implica calificar una sustitución conservadora como una falta de coincidencia parcial en lugar de total, lo que aumenta el porcentaje de identidad de secuencia. Así, por ejemplo, cuando a un aminoácido idéntico se le asigna un puntaje de 1 y a una sustitución no conservadora se le asigna un puntaje de cero, se le asigna un puntaje entre cero y 1 a la sustitución conservadora. Se calcula el puntaje de las sustituciones conservadoras, por ejemplo, tal como se implementó en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California).
Como se usa en el presente documento, "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado comparando dos secuencias alineadas de manera óptima en una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, brechas) como en comparación con la secuencia de referencia (que no incluye adiciones o eliminaciones) para una alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que se produce la base de ácido nucleico o aminoácido idéntico en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.
A menos que se indique lo contrario, los valores de identidad/similitud de secuencia divulgados en el presente documento se refieren al valor obtenido al usar GAP Versión 10 utilizando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos usando GAP Peso de 50 y Longitud Peso de 3, y el nwsgapdna.cmp matriz de puntuación % de identidad y % de similitud para una secuencia de aminoácidos usando GAP Peso de 8 y Longitud Peso de 2, y la matriz de puntuación BLOSUM62; o cualquier programa equivalente de los mismos. "Programa equivalente" significa cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualquiera de las dos secuencias en cuestión, genere una alineación que tenga coincidencias idénticas de residuos de nucleótidos o aminoácidos y un porcentaje idéntico de identidad de secuencia en comparación con la alineación correspondiente generada por GAP Versión 10.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque cualquier método y materiales similares o equivalentes a los divulgados en el presente documento también se pueden usar en la práctica o prueba de la invención descrita, ahora se describen los métodos y materiales preferidos.
Se debe tener en cuenta que tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un/una", "y", y "el/la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado.
Las publicaciones discutidas en el presente documento se proporcionan únicamente por su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en el presente documento debe interpretarse como una admisión de que la invención descrita no tiene derecho a ser anterior a dicha publicación en virtud de la invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales, que pueden necesitar confirmación independiente.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y descripción completas de cómo hacer y usar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención ni están destinados a representar que los experimentos a continuación son todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a las cifras utilizadas (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio en peso, la temperatura está en grados centígrados y la presión está en o cerca de la atmosférica.
Ejemplo 1. Derivación y caracterización de células ES de rata
1.1. Caracterización de células ES de rata
Como se muestra en la figura 1, las ESC de rata crecen como colonias esféricas compactas, que de manera rutinaria se desprenden y flotan en la placa (primer plano, figura 7). Las ESC de rata expresan marcadores de pluripotencia que incluyen Oct-4 (figura 2A) y Sox2 (figura 2B), y expresan altos niveles de fosfatasa alcalina (figura 3, panel izquierdo). El cariotipo para la línea DA.2B es 42X,Y (figura 3, panel derecho). Las ESC de rata a menudo se vuelven tetraploides; por lo tanto, las líneas fueron preescrutadas contando los cromosomas en metafase; las líneas con recuentos en su mayoría normales fueron luego formalmente cariotipo.
Los blastocistos ACI se obtuvieron de hembras superovuladas obtenidas comercialmente. Los blastocistos DA se cultivaron a partir de embriones de 8 células congelados obtenidos comercialmente. Las zonas pelucidae se eliminaron con Acid Tyrodes; y los blastocistos se colocaron en placas sobre MEF inactivados mitóticamente. Los crecimientos se seleccionaron y expandieron utilizando métodos estándar. Todos los blastocistos se cultivaron en placas, se cultivaron y se expandieron utilizando medios 2i (Li et al. (2008) Germline competent embryonic stem cells derived from rat blastocysts, Cell 135: 1299-1310).
Tabla 1. Derivación de células ES de rata
ACI DA
Fuente de embriones Blastocistos Embriones congelados de 8 células cultivados a (superovulación) blastocistos
Tabla 1. Derivación de células ES de rata
ACI DA
Blastocistos 107 22
sembrados:
Crecimientos: 32 (30% de blastos) 10 (45% de blastos)
Líneas: 16 (50% de crecimientos) 9 (90% de crecimientos)
Cariotipificado : 3; todos los 42X,Y 6: 342X,X
3 42X,Y
GLT validado 1 (ACI.G1) 1 42X,X (DA.2C)
142X,Y (DA.2B)
1.2: Producción de ratas
Las ratas quiméricas se produjeron mediante inyección de blastocistos y transmisión del genoma ESC de rata. En la figura 8 se muestran las quimeras producidas por microinyección de blastocistos utilizando ESC parentales ACI.G1 de rata. Las crías F1 agutí con compañeros de camada albinos, engendrados por la quimera ACI/SD marcadas con un asterisco (*) en la figura 8 se muestran en la figura 9.
Transmisión de la línea germinal de la ESC de rata parental.
Se evaluaron tres líneas de ESC de euploides de rata para la pluripotencia mediante microinyección en blastocistos SD albinos. Las quimeras se identificaron por el color del pelaje agutí, lo que indica la contribución de la rata ESC. Para cada línea, la mayoría de las quimeras transmitieron el genoma rESC a la descendencia F1 (Tabla 2).
Tabla 2. Transmisión de la línea germinal de rESC parental
Línea Quimeras Transmisores de línea Cachorros totales de Cachorros derivados Eficiencia criadas germinal quimeras GLT de rESC GLT (%) ACI.G1 5 3(60%) 103 11 11
DA.2B 5 4(80%) 129 11 9
DA.2C
(XX) 3 2(66%) 45 7 16
1.3.: Derivación de células madre embrionarias de rata.
Protocolo de superovulación, ratas.
Día 0: inyectado con suero de yegua preñada: IP, 20 U (0.4 ml).
Día 1: no hay acción.
Día 2: (46 horas más tarde): inyectado con hCG, IP, 50 U (1 ml).
- establecimiento de apareamientos solteros femeninos.
Día 3: Conexiones comprobadas. Las hembras fueron conectadas. Este es el día 0.5.
Día 6 (e3.5): Hembras sometidas a eutanasia y embriones enjuagados.
Protocolo de derivación celular ES (superovulación).
Día 0:
1) Rata hembra sometida a eutanasia con CO2.
2) Abdomen ventral frotado con etanol al 70%; utilizando unas tijeras, se abre la pared del cuerpo ventral para exponer las vísceras.
3) Se diseccionaron los oviductos y los cuernos uterinos y se colocaron en una placa de cultivo de tejidos que contenía medio caliente N2B27. Se lavó la mayor cantidad de sangre posible y se transfirió a una nueva placa con N2B27. 4) Utilizando una jeringa de 1 ml y una aguja roma de 27 g, se lavó con el medio a través de los cuernos uterinos y oviductos para expulsar los blastocistos al medio.
5) Se recogieron los blastocitos con una pipeta bucal y se transfirieron a una placa de cultivo de embriones que contenía KSOM 2i (1 |jMP00325901, 3 jM CHIR99021). KSOM es un medio de cultivo producido por Millipore. El número de catálogo es MR-106-D.
6) Cultivado durante la noche a 37°; 7.5% de CO2.
Protocolo de derivación celular ES (embriones congelados).
Día 0:
1) Se descongelaron los embriones congelados de 8 células (obtenidos comercialmente) en medio M2. Se cultiva 10 minutos a temperatura ambiente.
2) Transferido a KSOM 2i y cultivo durante la noche.
Protocolo de derivación celular ES (igual para ambos)
Día 1:
1) Se transfieren los embriones soemtidos a cavitación a medio 2i y cultivo durante la noche.
2) Cultivo continuo de embriones sin cavitación en KSOM 2i
Día 2:
1.1) Se transfieren todos los embriones restantes al medio 2i (ya sea que se hayan sometido a cavitación o no). 2. 2) Cultivado durante la noche; Se continuó cultivando los embriones anteriores en medio 2i.
Día 3:
1) Transferir los embriones durante 30-60 segundos con Acid Tyrodes para eliminar la zona pelúcida.
2) Embriones lavados 3x en medio 2i para eliminar los Acid Tyrodes.
3) Se depositó cada embrión en un pozo separado de una placa de alimentación de 96 pozos (el pozo contiene una monocapa de fibroblastos embrionarios de ratón inactivados mitóticamente (MEF).
4) Cultivado durante la noche en medio 2i.
Días 4-5:
1) Embriones en placa monitorizados para detectar la presencia de un crecimiento (una masa de células amorfas no diferenciadas). Las excrecencias están listas para la transferencia cuando tienen aproximadamente el doble del tamaño del embrión sembrado.
2) Cada día: eliminar los medios gastados con una micropipeta y reemplazarlos con medios 2i nuevos.
3) Crecimiento transferido a nuevos pozos de alimentación:
a. Se eliminaron los medios gastados y se lavó suavemente con PBS.
b. Se eliminó el PBS y se añadieron 30 j l de tripsina al 0.05%; incubar durante 10 minutos.
c. Se detuvo la reacción de tripsina al agregar 30 j l de 2i 10% de FBS.
d. Separar suavemente las células con una micropipeta y transferir todo el contenido del pozo a un nuevo pozo en una placa de alimentación de 24 pozos. Este fue el pase 1 (P1).
e. Se cultiva durante la noche en medio 2i.
Día 5-8: (el tiempo depende de cuán rápido se expande cada línea)
1) Medios modificados cada día (medios 2i) y monitorizados para detectar la presencia de colonias con una morfología ESC.
2) Cuando aparecen colonias, continuar el cultivo hasta que las colonias se expandan a ~50% de confluencia. 3) Colonias tripsinizadas y pasadas como antes; sembrado en alimentadores, 1 pozo por línea, en un plato de 6 pozos. Este fue el pase 2 (P2).
En marcha:
1. 1) Alimentación continua y monitorizo de cada línea hasta aproximadamente 50% de confluencia.
2. 2) Células tripsinizadas como es usual.
3. 3) se inactivó la tripsina con 2i 10% de FBS; formación de pellas con las células por centrifugación (5', 1200 rpm en la centrífuga de mesa Beckman-Coulter).
4. 4) Aspirar el sobrenadante y resuspender suavemente las células en 400 pl de medio de congelación (70% 2i, 20% FBS, 10% DMSO).
5. 5) Distribuir las células en 2 viales y congelar a -80°. Este fue el pase 3 (P3).
6. 6) Para el almacenamiento a largo plazo, transferir los viales al almacenamiento de N2 líquido.
Los medios 2i se prepararon como sigue en la Tabla 3.
Reactivo Vendedor Concentración Medio basal DMEM/F12 Invitrogen/Life Technologies 1x
Medios neurobasales 1x Penicilina/Estreptomicina Invitrogen/Life Technologies 1%
L-Glutamina Invitrogen/Life Technologies 4 mM
2-Mercaptoetanol Invitrogen/Life Technologies 0.1 mM Suplemento N2 Invitrogen/Life Technologies 1x
Suplemento B27 Invitrogen/Life Technologies 1x
LIF Millipore 100 U/ml PD0325901 (Inhibidor de MEK). Stemgent 1 uM
CHIR99021 (inhibidor de GSK). Stemgent 3 uM
Materiales: Gonadotropina sérica de yegua embarazada (PMSG)
Gonadotropina coriónica de orina en embarazo humana (HCG)
Ratas hembras (5-12 semanas de edad)
Ratas machos (12 semanas a 8 meses de edad), una por jaula.
Jeringas/agujas
Sala de animales con luces encendidas 6:00-18:00.
Procedimiento:
Día 1: 8:00-10:00 AM
Inyectar hembras con 20 UI de PMSG (0.4 ml), IP
Desechar el PMSG no utilizado.
Día 3: 8:00-10:00 AM (48 horas después de la inyección de PMSG)
Inyectar hembras con 50 UI de HCG (1 ml), IP
Colocar una hembra por macho en jaula de apareamiento.
Desechar la HCG no utilizada.
Día 4: 8:00-10:00 AM (24 horas después de la inyección de HCG)
Compruebe las hembras para los enchufes.
Proveedores de hormonas
PMSG: Sigma #G-4877 (1000 UI). Resuspender en PBS a un final [ ] de 50 UI/ml. Almacenar a -20° en alícuotas de 1 ml.
HCG: Sigma #CG-5 (5000 UI). Resuspender en PBS a un final [ ] de 50 UI/ml. Almacenar a -20° en alícuotas de 1 ml.
1.4.: Cariotipificar líneas de células madre embrionarias de rata
Las líneas celulares ES de rata generadas en el presente documento fueron cariotipificadas, y los resultados se resumen en las Tablas 4-7.
Tabla 4
Resultados de cariotipificación ACI.G1 Número de células Número de células cariotipificadas 7 Número de células analizadas 20 Cantidad de 42 células XY 18 Número de células anormales 2
40, XY, -5, -9 1
41, XY, -14 1
42, XY 18 Otras notas: A dos células analizadas les faltaban autosomas diferentes, lo que puede ser una ocurrencia esporádica debido a un artefacto técnico. El 90% de las células analizadas tenían un
cariotipo normal 42, XY.
La Figura 4 proporciona una fotografía que muestra el análisis del número de cromosoma de la línea
celular ES de rata ACI.G1.
Tabla 5
Resultados de cariotipificación DA.2B Número de células Número de células cariotipificadas 6
Número de células analizadas 20 Cantidad de 42 células XY 20 Número de células anormales 0
42, XY 20
Otras notas: Todas las células analizadas tenían un cariotipo diploide 42, XY normal.
La Figura 5 proporciona una fotografía que muestra el análisis del número de cromosoma de la
línea celular ES.2 de rata DA.2B.
Tabla 6
Resultados de cariotipificación DA.C2 Número de células Número de células cariotipificadas 5
Número de células analizadas 20 Cantidad de 42 células XY 20 Número de células anormales 0
42, XX
Otras notas: el 100% de las células analizadas tenían cariotipo de rata XX hembra normal.
La Figura 6 proporciona una fotografía que muestra el análisis del número de cromosoma de la
línea celular ES de rata DA.C2.
Tabla 7.
Cepa Blastocistos Líneas Líneas
sembrados establecidas cariotipificadas Cariotipos
BN x SD Todas las líneas fueron de alto % de F1 41 8(20%) 5 poliploides complejos.
G1: 90% 42 XY; otros fueron 70-85% ACI 27 16 (60%) 3 euploides
2B: 100% 42 XY; 2C: 100% 42 XX; otros DA 20 9 (45%) 6 eran 95-100% euploides
F344 4 1 (25%) 0
Totales 92 34 (37%)
1.5.: Electroporación del vector en células madre embrionarias de rata
1. Pase de células de rata ES 24-48 horas antes de la electroporación.
2. Se cambiaron los medios a RVG2i ROCKi (10 pM Y-27632) 24 horas antes de la electroporación
3. Medios modificados 30' antes de la tripsinización.
4. Alícuotas de ADN para electroporación.
5. Permitir que el ADN se caliente a temperatura ambiente durante >10 min.
6. ADN calentado durante 5' a 62°C. Colocar el ADN en hielo.
7. Células tripsinizadas:
a. Recolectar colonias flotantes. Placa lavada para recoger tantos flotadores como sea posible.
b. Colonias en pellas: 3' a 750 rpm.
c. Pellas lavados 1x con 5-10 ml de PBS y centrifugado/pella
d. Sobrenadante aspirado; agregar 500A de tripsina, 0.05% 1% de suero de pollo.
i. No se agruparon más de 1 placa de 10 cm de colonias por tubo. Si hay demasiadas colonias empaquetadas en el fondo del tubo durante la tripsinización, se agruparán y la mayoría de las células se perderán.
e. 4' a 37°. Colonias pipeteadas varias veces para minimizar la aglomeración.
f. Pasos repetidos 1-2 X: 4' a 37°.
g. Se inactivó la tripsina con 500A RVG2i 10% FBS.
8. Células en pellas: 5' a 1200 rpm.
9. Resuspender las células en 10 ml de PBS. Contar dos alícuotas de 20A para determinar el número total de células.
10. Células en pellas (5'/1200 rpm); calcular el número total de células y el volumen total de resuspensión para lograr la concentración celular correcta (objetivo #/75 pl de regulador EP).
11. Resuspender en un volumen mínimo de regulador EP; medir el volumen total y ajustar al volumen deseado con el regulador EP. El regulador de electroporación es vendido por Millipore. El catálogo # es ES-003-D. Véase, Valenzuela et al. (2003) Nature Biotechnology 21: 652-659.
12. Añadir células 75A a ADN50A; transferir la solución de células/ADN 125A a un pozo de una cubeta BTX de 48 pozos.
a. Se llenaron los pozos vacíos en la misma columna con regulador EP 125A.
13. Pulsó la cubeta una vez en el electroporador BTX:
а. Ajustes: 400V; O; 100 pF (la configuración puede variar)
14. Colocar la cubeta en hielo durante 15' para recuperarla.
15. Se eliminaron las células en 5 ml de RVG2i 10 pM ROCKi.
16. Se añadieron a una placa de 15 cm con 20 ml de RVG2i 10pM ROCKi. La placa tiene 2x MEF neoR (u otros MEF según el proyecto). El marcador seleccionable neoR es el gen de la neomicina fosfotransferasa (neo) de Beck et al. (1982) Gene, 19: 327-36 o en la Patente de los Estados Unidos No, 7,205,148 o 6,596,541.
17. Incubar a 37°. Comenzar la selección 48 horas más tarde.
El inhibidor de ROCK utilizado fue Y-27632.
1.6: Selección de una modificación genética direccionada en una célula madre embrionaria de rata.
1. Células pasadas durante 24-48 horas antes de la electroporación.
2. Medios modificados a RVG2i ROCKi (10 pM Y-27632) 24 h. antes de la electroporación
3. Medios modificados 30' antes de la tripsinización.
4. Alícuotas de ADN para electroporación.
5. Permitir que el ADN se caliente a temperatura ambiente durante >10 min.
б. ADN calentado durante 5' a 62°C. Colocar el ADN en hielo.
7. Células tripsinizadas:
a. Recolectar colonias flotantes. Placa lavada para recoger tantos flotadores como sea posible.
b. Colonias en pellas: 3' a 750 rpm.
c. Pellas lavadas 1x con 5-10 ml de PBS y centrifugado/pella
d. Sobrenadante aspirado; agregar 500A de tripsina, 0.05% 1% de suero de pollo.
i. No se agruparon más de 1 placa de 10 cm de colonias por tubo. Si hay demasiadas colonias empacadas en el fondo del tubo durante la tripsinización, se agruparán y la mayoría de las células se perderán.
e. 4' a 37°. Colonias pipeteadas varias veces para minimizar la aglomeración
f. Repetido 1-2 X: 4' a 37°.
g. Se inactivó la tripsina con 500A RVG2i 10% FBS.
8. Células en pellas: 5' a 1200 rpm.
9. Células resuspendidas en 10 ml de PBS. Contar dos alícuotas de 20A para determinar el número total de células.
10. Células en pellas (5'/1200 rpm); calcular el número total de células y el volumen total de resuspensión para lograr la concentración celular correcta (objetivo #/75 pl de regulador EP).
11. Resuspender en un volumen mínimo de regulador EP; volumen total medido y ajustado al volumen objetivo con regulador EP.
12. Se agregaron células de 75A a 50A de ADN; transferir la solución de células/ADN 125A a un pozo de una cubeta BTX de 48 pozos.
a. Se llenaron los pozos vacíos en la misma columna con regulador EP 125A.
13. Pulsó la cubeta una vez en el electroporador BTX:
a. Ajustes: 400V; 100 pF (la configuración puede variar)
14. Colocar la cubeta en hielo durante 15' para recuperarla.
15. Se retiraron las células en 5 ml de RVG2i ROCKi 10 pM.
16. Añadido a una placa de 15 cm con 20 ml de RVG2i 10pM ROCKi. La placa tenía 2x MEF neoR (u otros MEF según el proyecto).
17. Incubado a 37°. Comenzó la selección 48 horas después.
18. El protocolo de selección G418 fue el siguiente:
a. Día 2 (2° día después del EP): células incubadas en medios 2i G418, 75 pg/ml.
b. Día 3: células incubadas en medio 2i sin G418
c. Día 4: células incubadas en medios 2i G418, 75 pg/ml.
d. Día 5: células incubadas en medio 2i sin G418
e. Día 6: células incubadas en medios 2i G418, 75 pg/ml.
f. Día 7: células incubadas en medio 2i sin G418
g. Día 8: células incubadas en medios 2i G418, 75 pg/ml.
h. Día 9: células incubadas en medio 2i sin G418
i. Día 10: células incubadas en medios 2i G418, 75 pg/ml.
j. Día 11: células incubadas en medio 2i sin G418
k. Día 12: se recogieron colonias para expandirlas para la selección. Cada colonia se disoció en tripsina al 0.05% suero de pollo al 1% durante 10 minutos y luego se colocó en 1 pozo de una placa de alimentación de 96 pozos. 19. Colonias expandidas por 3 días en medios 2i.
20. Pase de clones 1:1 a nuevas placas de alimentación de 96 pozos.
21. Clones expandidos por 3 días en medios 2i.
22. Para cada clon, colonias disociadas en tripsina. Se congelaron 2/3 de cada clon y se almacenaron a -80°; se sembró el 1/3 restante en placas de laminina (placas de 96 pozos recubiertas con 10 pg/ml de laminina).
23. Cuando las placas de laminina fueron confluentes, pasaron al laboratorio de detección para la genotipificación de los clones.
l . 7. Firma molecular de las células madre embrionarias de rata
Los genes listados en la Tabla 8 se expresaron 20 veces más bajo en células ES de rata que los genes correspondientes en células ES de ratón. Los genes listados en la Tabla 9 se expresaron a niveles 20 veces superiores en células ES de rata que en los genes correspondientes en células ES de ratón.
Los datos de micromatrices en las Tablas 8 y 9 se generaron de la siguiente manera. Se cultivaron células ES de rata (ACI.G2 y DA.2B) y células ES de ratón (F1H4) en medio 2i durante 3 pases hasta que confluyeron. Las células F1H4 se cultivaron en placas recubiertas de gelatina en ausencia de alimentadores. Se derivaron células ES de ratón F1H4 de embriones heterocigotos 129S6/SvEvTac y C57BL/6NTac (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 7,294,754 y Poueymirou, W.T., Auerbach, W., Frendewey, D., Hickey, J.F., Escaravage, J.M., Esau, L., Dore, A.T., Stevens, S., Adams, N.C., Dominguez, M.G., Gale, N.W., Yancopoulos, G.D., DeChiara, T.M., Valenzuela, D.M. (2007)).
Se usó el siguiente protocolo para la preparación de la muestra: se marcaron tubos Eppendorf de 1.5 mL con el ID de la muestra. Las células cultivadas en una placa se enjuagaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 37°C. Se eliminó el PBS y se agregaron 300 ul de Trizol®. Se usó un raspador para romper las células en Trizol® (Life Technology). Las células lisadas se recogieron en Trizol® en un tubo Epperdorf de 1.5 mL. Para las células cultivadas en suspensión, las células se enjuagaron en PBS a 37°C y se recogieron en un tubo de 1.5 mL. Las células se hicieron girar hacia abajo; el PBS fue eliminado; y se añadieron 300 ul de Trizol® a las células. Las membranas celulares se rompieron por pipeteo. Las muestras se clasificaron para FACS con 10 a 105 células, el volumen se concentró a menos de 100 uL. Se añadieron 4 volúmenes de regulador de lisis de ARN y se mezclaron mediante pipeteo. Para la muestra, se añadió 320 uL de regulador de lisis de ARN a la muestra de 80 uL. Las muestras se almacenaron a -20°C.
Se utilizó RNA-Seq para medir el nivel de expresión de los genes de ratón y rata. Las lecturas de secuenciación fueron mapeadas al genoma de referencia de ratón y rata por Tophat, y los RPKM (fragmentos por kilobase de exón por millón de fragmentos mapeados) fueron calculados para genes de ratón y rata. Se seleccionaron genes de homología basados en el símbolo del gen y luego se usó la prueba t para comparar el nivel de expresión de cada gen entre el ratón y la rata. miR-632 estaba en el top 10 más alto expresado en ESC de ratas, pero no se expresó en células ES de ratón. Aunque no existen datos comparativos de miR-632, con base en el nivel de su expresión en comparación con otros genes expresados en ESC de ratas y su función conocida en el desarrollo embrionario, miR-632 se seleccionó como un marcador para las células ES de ratas.
Tabla 8. Los genes listados se expresaron en niveles 20 veces más bajos en células ES de rata que en los genes correspondientes en células ES de ratón.
ID Símbolo Nombre de gen Entrez Locación Tipo(s)
Casete de unión a ATP, subfamilia B Membrana de
Abcb1b Abcb1b (MDR/TAP), miembro 1B plasma Transportador
Acta2 ACTA2 actina, alfa 2, músculo liso, aorta Citoplasma Otros
Actg2 ACTG2 actina, gamma 2, músculo liso, entérico Citoplasma Otros
Aebp1 AEBP1 Proteína 1 de unión a AE Núcleo Peptidasa
Espacio
Angptl2 ANGPTL2 Angiopoyetina tipo 2 extracelular Otros
dominio de repetición 1 de ankirina regulador de Ankrd1 ANKRD1 (músculo cardíaco) Citoplasma transcripción
Membrana de
Anxa1 ANXA1 anexina A1 plasma Otros
Membrana de
Anxa6 ANXA6 anexina A6 plasma Otros
Membrana de
Anxa8 ANXA8L2 anexina A8 tipo 2 plasma Otros
Factor de intercambio de nucleótidos de
Arhgef25 ARHGEF25 guanina Rho (FMAM) 25 Citoplasma Otros
Membrana de
Axl AXL Receptor AXL tirosina quinasa plasma Quinasa
proteína 1 de señalización unida a la regulador de Basp1 BASP1 membrana, abundante en el cerebro Núcleo transcripción
Espacio
Bgn BGN Biglicano extracelular Otros
médula ósea antígeno de células Membrana de
Bst2 BST2 estromales 2 plasma Otros
regulador de Btf3 BTF3 factor de transcripción básico 3 Núcleo transcripción
regulador de Btg2 BTG2 Familia BTG, miembro 2 Núcleo transcripción
Caps1 CAPSL similar a la calcifosina Otros Otros
ID Símbolo Nombre de gen Entrez Locación Tipo(s)
Membrana de receptor Caví CAVÍ caveolina Í, proteína caveolae, 22 kDa plasma transmembrana Ccdc80 CCDC80 dominio de espiral que contiene 80 Núcleo Otros
Ccnd2 CCND2 ciclina D2 Núcleo Otros Membrana de Otros
Cd248 CD248 Molécula CD248, endosialina plasma
Membrana de
Cd44 CD44 Molécula CD44 (grupo sanguíneo indio) plasma enzima Membrana de Receptor acoplado Cd97 CD97 Molécula CD97 plasma a proteína G Proteína efectora CDC42 (unión a Rho Otros Cdc42ep5 CDC42EP5 GTPasa) 5 Citoplasma
cadherina Í Í , tipo 2, OB-cadherina Membrana de Otros
C dhíí CDHÍÍ (osteoblasto) plasma
inhibidor de quinasa dependiente de regulador de Cdkn2a CDKN2A ciclina 2A Núcleo transcripción Cdoí CDOÍ cisteína dioxigenasa tipo Í Citoplasma enzima Dominio CAP-GLY que contiene la Citoplasma Otros
Clip3 CLIP3 proteína enlazadora 3
Cln5 CLN5 Lipofuscinosis ceroide, neuronal 5 Citoplasma Otros
Cnní CNNÍ Calponina Í, básica, musculo liso Citoplasma Otros Espaciador Otros
C olía í COLÍAÍ colágeno, tipo I, alfa Í extracelular
Espaciador Otros
Colí a2 COLÍA2 colágeno, tipo I, alfa 2 extracelular
Espaciador Otros Col3aí COL3AÍ colágeno, tipo III, alfa Í extracelular
Espaciador Otros Col5a2 COL5A2 colágeno, tipo V, alfa 2 extracelular
Espaciador Otros Col6a2 COL6A2 colágeno, tipo VI, alfa 2 extracelular
Cryab CRYAB cristalina, alfa B Núcleo Otros
factor estimulante de colonias Í Espaciador
Csfí CSFÍ (macrófagos) extracelular citoquina
Cth CTH cistationasa (cistationina gamma-liasa) Citoplasma enzima repetición de triple hélice de colágeno que Espaciador
Cthrcí CTHRCÍ contiene Í extracelular Otros
Ctsc CTSC catepsina C Citoplasma peptidasa Inductores angiogénicos ricos en cisteína, Espaciador
Cyr61 CYR6Í 6Í extracelular Otros Polipéptido de la caja 58 DEAD (Asp-Glu-Ddx58 DDX58 Ala-Asp) Citoplasma enzima inhibidor dickkopf WNT de la vía de Espaciador
Dkk3 DKK3 señalización 3 extracelular citoquina ID Símbolo Nombre de gen Entrez Locación Tipo(s) Dmc1 DMC1 Recombinasa 1 de ADN meiótico Núcleo enzima Dpysl3 DPYSL3 Dihidropirimidinasa tipo 3 Citoplasma enzima
Dse DSE dermatan sulfato epimerasa Citoplasma enzima Duspl DUSP1 Fosfatasa de especificidad dual 1 Núcleo fosfatasa Fosfatasa 27 de especificidad dual
Dusp27 DUSP27 (putativo) Otros fosfatasa Dusp9 DUSP9 Fosfatasa de especificidad dual 9 Núcleo fosfatasa Membrana de
Ece2 ECE2 enzima 2 convertidora de endotelina plasma peptidasa Espaciador
Ecm1 ECM1 proteína 1 de matriz extracelular extracelular Transportador regulador de Egr1 EGR1 respuesta de crecimiento temprano 1 Núcleo transcripción Membrana de
Emp1 EMP1 Proteína 1 de membrana epitelial plasma Otros Membrana de
Emp3 EMP3 Proteína 3 de membrana epitelial plasma Otros
Ephx2 EPHX2 epóxido hidrolasa 2, citoplasmática Citoplasma enzima factor de coagulación III (tromboplastina, Membrana de receptor
F3 F3 factor tisular) plasma transmembrana Virus del sarcoma murino de Finkel-Biskis-Reilly (FBR-MuSV) expresado de
Fau FAU forma ubicua Citoplasma Otros Espacio
Fbn1 FBN1 fibrilina 1 extracelular Otros regulador de Fbxo15 FBXO15 proteína 15 de caja F Otros transcripción regulador de Fhl2 FHL2 cuatro y medio dominios LIM 2 Núcleo transcripción Flnc FLNC filamina C, gamma Citoplasma Otros homólogo de oncogén viral de regulador de Fos FOS osteosarcoma murino FBJ Núcleo transcripción Fundc2 FUNDC2 Dominio FUN 14 que contiene 2 Citoplasma Otros Membrana de
Gjb3 GJB3 proteína de unión brecha, beta 3, 31kDa plasma Transportador Membrana de Otros
Gpa33 GPA33 glicoproteína A33 (transmembrana) plasma
Proteína 1 tipo 1 de unión al promotor rico Otros
G pbp lll GPBP1L1 en GC Otros
Membrana de Otros
Gpc3 GPC3 glipicano 3 plasma
proteína 10 unida al receptor del factor de Otros
Grb10 GRB10 crecimiento Citoplasma
Gstml GSTM5 glutatión S-transferasa mu 5 Citoplasma enzima
ID Símbolo Nombre de gen Entrez Locación Tipo(s)
Hap1 HAP1 proteína 1 asociada a la huntingtina Citoplasma Otros HIST2H2B E Otros Hist1h2bc (incluye otros) Aglomerado de histonas 2, H2be Núcleo
Hmga2 HMGA2 Grupo de alta movilidad AT-gancho 2 Núcleo enzima dominio 3 de unión a grupo nucleosómico Núcleo Otros Hmgn3 Hmgn3 de alta movilidad
Hormadl HORMAD1 Dominio HORMA que contiene 1 Núcleo Otros hidroxiesteroide (17-beta)
Hsd17b14 HSD17B14 deshidrogenasa 14 Citoplasma enzima Hspbl HSPB1 proteína 1 de choque térmico 27kDa Citoplasma Otros
Hspb8 HSPB8 proteína 8 de choque térmico 22kDa Citoplasma Quinasa Espacio
Htral HTRA1 HtrA serina peptidasa 1 extracelular peptidasa Ifi204 (incluye regulador de Ifi204 otros) gen 204 activado por interferón Núcleo transcripción Ifi44 IFI44 proteína 44 inducida por interferón Citoplasma Otros Proteína 1B inducida por interferón con Otros
Ifitl IFIT1B repeticiones de tetratricopéptido Citoplasma
proteína 2 transmembrana inducida por
Ifitm3 IFITM2 interferón Citoplasma Otros
factor 2 de crecimiento similar a la Espacio factor de Igf2 IGF2 insulina (somatomedina A) extracelular crecimiento proteína 7 de unión al factor de Espacio
Igfbp7 IGFBP7 crecimiento similar a la insulina extracelular Transportador Membrana de receptor
I l lr l l IL1RL1 Interleucina 1 similar al receptor 1 plasma transmembrana Espacio factor de Inhba INHBA inhibina, beta A extracelular crecimiento Espacio factor de Inhbb INHBB inhibina, beta B extracelular crecimiento regulador de Irf7 IRF7 factor 7 regulador de interferón Núcleo transcripción Espacio
Isg15 ISG15 modificador ISG15 de tipo ubiquitina extracelular Otros integrina, alfa 5 (receptor de fibronectina, Membrana de receptor Itga5 ITGA5 polipéptido alfa) plasma transmembrana regulador de Jun JUN protooncogéno jun Núcleo transcripción regulador de Junb JUNB protooncogéno jun B Núcleo transcripción Lectina, proteína 3 de unión a galactósido, Membrana de receptor Lgals3bp LGALS3B P soluble, plasma transmembrana Espacio
Lgals9 LGALS9 lectina, galactósido de unión, soluble, 9 extracelular Otros
Lmna LMNA lamina A/C Núcleo Otros
ID Símbolo Nombre de gen Entrez Locación Tipo(s)
Espacio
Lox LOX lisil oxidasa extracelular enzima Espacio
Loxl2 LOXL2 lisil oxidasa tipo 2 extracelular enzima Espacio
Loxl3 LOXL3 lisil oxidasa tipo 3 extracelular enzima Proteína 1 relacionada con el receptor de Membrana de receptor
Lrp1 LRP1 lipoproteínas de baja densidad plasma transmembrana Mageb16 MAGEB16 antígeno de melanoma familia B, 16 Otros Otros molécula de adhesión celular de Membrana de
Mcam MCAM melanoma plasma Otros Espacio
Mgp MGP proteína matriz Gla extracelular Otros
matriz de metalopeptidasa 2 (gelatinasa Espacio
A, gelatinasa 72kDa, colagenasa tipo IV extracelular
Mmp2 MMP2 72kDa) peptidasa Mxra8 MXRA8 8 asociada con remodelación de matriz. Otros Otros
Myl9 MYL9 Miosina, cadena ligera 9, reguladora. Citoplasma Otros Cadena ligera de miosina, músculo
Mylpf MYLPF esquelético rápido fosforilable Citoplasma Otros proteína de unión 2 NGFI-A (proteína de regulador de Nab2 NAB2 unión 2 EGR1) Núcleo transcripción NADH deshidrogenasa (ubiquinona) 1
Ndufb4 NDUFB4 subcomplejo beta, 4, 15 kDa Citoplasma Transportador nucleofosmina (fosfoproteína nucleolar regulador de Npm1 NPM1 B23, numatrina) Núcleo transcripción receptor nuclear Subfamilia de receptores nucleares 0, dependiente de Nr0b1 NROB1 grupo B, miembro 1 Núcleo ligando receptor nuclear Subfamilia de receptores nucleares 4, dependiente de Nr4a1 NR4A1 grupo A, miembro 1 Núcleo ligando Membrana de
Nrp2 NRP2 neuropilina 2 plasma Quinasa Oasla OAS1 2'-5'-oligoadenilato sintetasa 1,40/46kDa Citoplasma enzima Oasl2 Oasl2 2'-5'oligoadenilato sintetasa similar a 2 Otros enzima P4ha2 P4HA2 prolil 4-hidroxilasa, polipéptido alfa II Citoplasma enzima
familia de poli(ADP-ribosa)polimerasa,
Parp3 PARP3 miembro 3 Núcleo enzima potenciador de procolágeno C- Espacio
Pcolce PCOLCE endopeptidasa extracelular Space Otros
Fosfato de citidililtransferasa 1, colina,
Pcytlb PCYT1B beta Citoplasma enzima
factor de crecimiento derivado de Espacio factor de Pdgfc PDGFC plaquetas C extracelular Space crecimiento ID Símbolo Nombre de gen Entrez Locación Tipo(s)
Dominio de homología similar a
Phldal PHLDA1 Pleckstrina, familia A, miembro 1 Citoplasma Otros Dominio de homología similar a
Phlda2 PHLDA2 Pleckstrina, familia A, miembro 2 Citoplasma Otros Espacio
Pla2g1b PLA2G1B fosfolipasa A2, grupo IB (páncreas) extracelular enzima fosfolipasa A2, grupo IVA (citosólico, Citoplasma
Pla2g4a PLA2G4A dependiente de calcio) enzima
Porcn PORCN homólogo de puercoespín (Drosophila) Citoplasma Otros Espacio Otros
Postn POSTN periostina, factor especifico osteoblasto extracelular
regulador de Prrxl PRRX1 Homeobox relacionados emparejados 1 Núcleo transcripción Espacio
Prss23 PRSS23 proteasa, serina, 23 extracelular peptidasa subunidad proteasoma (prosoma, Citoplasma
Psmb8 PSMB8 macropain), tipo beta, 8 peptidasa prostaglandina-endoperóxido sintasa 2 Citoplasma
(prostaglandina G/H sintasa y
Ptgs2 PTGS2 ciclooxigenasa) enzima Espacio factor de Ptn PTN pleiotrofina extracelular crecimiento polimerasa I y factor de liberación de regulador de Ptrf PTRF transcripción Núcleo transcripción receptor nuclear dependiente de Rarg RARG receptor de ácido retinoico, gamma Núcleo ligando Regulador de la señalización G de la Otros
Rgs16 RGS16 proteína 16. Citoplasma
Rn45s Rn45s ARN prerribosómico 45S Otros Otros
Rpl10a RPL10A proteína ribosómica L10a Otros Otros
Rpl31 RPL31 proteína ribosómica L31 Otros Otros
Rpl37a RPL37A proteína ribosómica L37a Citoplasma Otros
RPS10- Citoplasma Otros Rps10 NUDT3 Lectura RPS10-NUDT3
Citoplasma regulador de Rps14 RPS14 proteína ribosómica S14 traducción Rps20 Rps20 proteína ribosómica S20 Citoplasma Otros
Rps26 RPS26 proteína ribosómica S26 Citoplasma Otros regulador de Rps9 RPS9 proteína ribosómica S9 Citoplasma traducción S100a4 S100A4 proteína A4 de unión al calcio S100 Citoplasma Otros
S100a6 S100A6 proteína A6 de unión al calcio S100 Citoplasma Transportador proteína 1 de interacción con
Schipl SCHIP1 schwannomina Citoplasma Otros
ID Símbolo Nombre de gen Entrez Locación Tipo(s)
Membrana de
Sdc2 SDC2 sindecan 2 plasma Otros inhibidor de la serpina peptidasa, clado E
(nexina, inhibidor del activador del Espacio
Serpinel SERPINE1 plasminógeno tipo 1), miembro 1 extracelular Otros inhibidor de la serpinapeptidasa, clado E
(nexina, inhibidor del activador del Espacio
Serpine2 SERPINE2 plasminógeno tipo 1), miembro 2 extracelular Otros inhibidor de la serpinapeptidasa, clado F
(alfa-2 antiplasmina, factor derivado del Espacio
Serpinfl SERPINF1 epitelio pigmentario), miembro 1 extracelular Otros Membrana del
Sh3gl2 SH3GL2 SH3-dominio GRB2 tipo 2 plasma enzima portador de soluto familia 19 Membrana del
Slc19a2 SLC19A2 (transportador de tiamina), miembro 2 plasma Transportador miembro de la familia de portadores de
solutos 25 (portador mitocondrial;
translocador de nucleótidos de adenina),
Slc25a5 SLC25A5 miembro 5 Citoplasma Transportador familia de portadores de solutos 29
(transportador de nucleósidos en Membrana del
Slc29a1 SLC29A1 equilibrio), miembro 1 plasma Transportador Slc35f2 SLC35F2 portador de soluto familia 35, miembro F2 Otros Otros pequeño polipéptido ribonucleoproteína
Snrpn SNRPN nuclear N Núcleo Otros
Snx22 SNX22 selección de nexina 22 Otros Transportador
Proteína secretada, ácida, rica en cisteína Espacio
Sparc SPARC (osteonectina) extracelular Otros Espacio
Spp1 SPP1 fosfoproteína secretada 1 extracelular citoquina
Sult4a1 SULT4A1 familia de sulfotransferasa 4A, miembro 1 Citoplasma enzima Tagln TAGLN Transgelina Citoplasma Otros
factor de alargamiento de la transcripción regulador de Tcea3 TCEA3 A (SII), 3 Núcleo transcripción factor de crecimiento transformante, beta Espacio Factor de Tgfb3 TGFB3 3 extracelular crecimiento Espacio Otros
Thbs 1 THBS1 trombospondina 1 extracelular
Espacio Otros
Thbs2 THBS2 trombospondina 2 extracelular
miembro 1 de la familia de seis Membrana del Otros Tm4sf1 TM4SF1 transmembrana 4 L seis plasma
Motivo inhibidor de BAX transmembrana Otros Tmbiml TMBIM1 que contiene 1 Citoplasma
Tmem176b TMEM176 B proteína transmembrana 176B Otros Otros
ID Símbolo Nombre de gen Entrez Locación Tipo(s)
Espacio Otros
Tnc TNC Tenascina C extracelular
Tpd5211 TPD52L1 proteína tumoral tipo D52 1 Citoplasma Otros
Tpm2 TPM2 Tropomiosina 2 (beta) Citoplasma Otros
Usp18 USP18 peptidasa 18 específica de ubiquitina Citoplasma Peptidasa
Vim VIM Vimentina Citoplasma Otros Dominio central de cuatro disulfuros WAP Espacio
Wfdc2 WFDC2 2 extracelular Otros Proteína 2 de la vía de señalización Espacio Factor de Wisp2 WISP2 inducible WNT1 extracelular crecimiento regulador de Ybx1 YBX1 Proteína 1 de unión de caja Y Núcleo transcripción
Tabla 9. Los genes listados se expresaron a niveles 20 veces superiores en células ES de rata que en los genes correspondientes en células ES de ratón.
ID Símbolo Nombre de Entrez Gene Ubicación Tipo(s)
Ajap1 Ajap1 proteína 1 asociada a la unión adherente Otros Otros
Amd1 AMD1 adenosilmetionina descarboxilasa 1 Citoplasma Enzima dominio de repetición de anquirina 2 (estiramiento Regulador de Ankrd2 ANKRD2 muscular sensible) Núcleo transcripción Cdc42 guanina factor de intercambio de
Arhgef9 ARHGE F9 nucleótidos (GEF) 9 Citoplasma Otros
ATP sintasa, transporte de H , complejo F0
Atp5h Atp5h mitocondrial, subunidad d Citoplasma Enzima
Btg3 BTG3 Familia BTG, miembro 3 Núcleo Otros
Espacio
Car6 CA6 anhidrasa carbónica VI extracelular Enzima proteína quinasa IV dependiente de
Camk4 CAMK4 calcio/calmodulina Núcleo Quinasa Capn12 CAPN12 Calpaina 12 Otros Peptidasa chaperonina que contiene TCP1, subunidad 6B
Cct6b CCT6B (zeta 2) Citoplasma Transportador Regulador de Cdx2 CDX2 homeobox 2 tipo caudal Núcleo transcripción Membrana del Otros
Cldn5 CLDN5 claudina 5 plasma
Clec3a CLEC3A Familia 3 de dominios de lectina tipo C, miembro A Otros Otros Membrana del
Clic6 CLIC6 canal intracelular de cloruro 6 plasma canal de iones deshidrogenasa/reductasa (familia SDR) con Enzima
Dhrsx DHRSX enlace X Otros
Dpysl2 DPYSL2 Dihidropirimidinasa tipo 2 Citoplasma Enzima Dusp26 DUSP26 Fosfatasa 26 de especificidad dual (putativo) Citoplasma Enzima
ID Símbolo Nombre de Entrez Gene Ubicación Tipo(s)
Eci3 Eci3 enoil-coenzima A delta isomerasa 3 Otros Enzima Eef2k EEF2K factor de alargamiento eucariótico-2 quinasa Citoplasma Quinasa Membrana del
Efnal EFNA1 Efrina-A1 plasma Otros Membrana del
Epha4 EPHA4 Receptor EPH A4 plasma Quinasa Fibronectina tipo III y dominios 1 de repetición de Regulador de Fankl FANK1 anquirina Núcleo transcripción Fhit FHIT tríada de histidina frágil Citoplasma Enzima Filipl FILIP1 proteína 1 Filamina A interactuante Citoplasma Otros Espacio Otros
Fmod FMOD Fibromodulina extracelular
Caja E1 Fokhead (factor de transcripción tiroidea regulador de Foxel FOXE1 2) Núcleo transcripción Espacio
Fry FRY homólogo furry (Drosophila) extracelular Otros Membrana del
Gjb5 GJB5 proteína de unión en muesca, beta 5, 31.1kDa plasma Transportador Gpx2 GPX2 glutatión peroxidasa 2 (gastrointestinal) Citoplasma Enzima Grxcr2 GRXCR 2 glutareedoxina, rica en cisteína 2 Otros Otros Dominio HECT, C2 y WW que contiene la proteína Espacio
Hecw2 HECW2 ligasa 2 de ubiquitina E3 extracelular Enzima velloso/potenciador de división relacionado con el regulador de Hey2 HEY2 motivo 2 de YRPW. Núcleo transcripción Membrana del
Icos Icos coestimulador inducible de células T plasma Otros Membrana del receptor Ifitml IFITM1 proteína 1 transmembrana inducida por interferón plasma transmembrana IL1F8 miembro de la familia Interleucina-1 (Interleucina Espacio
Il1f8 (IL36B) 36 beta) extracelular Citoquina Membrana del Receptor de Il28ra IL-28RA receptor de interleucina 28, alfa plasma citoquina proteína tipo 1 que se une al factor de crecimiento Otros Otros
Igfbpll IGFBPL 1 similar a la insulina
Proteína 1 de interacción para los factores de
Ipcefl IPCEF1 intercambio de citohesina Citoplasma Enzima
Lctl Lctl similar a la lactasa Citoplasma Otros
Ldhd LDHD lactato deshidrogenasa D Citoplasma Enzima regulador de Lef1 LEF1 factor 1 de unión al potenciador linfoide Núcleo transcripción Espacio Factor de Leftyl LEFTY1 factor 1 de determinación izquierda-derecha extracelular crecimiento Membrana del Receptor Lifr LIFR receptor alfa de factor inhibidor de la leucemia plasma transmembrana ID Símbolo Nombre de Entrez Gene Ubicación Tipo(s)
Membrana del Receptor acoplado Lpar2 LPAR2 Receptor 2 de ácido lisofosfatídico plasma a proteína G Espacio
Mog MOG glicoproteína de oligodendrocito de mielina extracelular Otros
Mom5 MORN5 Repetición de MORN que contiene 5 Otros Otros proteína subunidad 2 de unión a la cápsula
Pigz NCBP2 nuclear, 20kDa Núcleo Otros Membrana del Receptor Nptxr NPTXR receptor de pentraxina neuronal plasma transmembrana Membrana del
Ntm NTM neurotrimina plasma Otros
Nutf2 NUTF2 factor 2 de transporte nuclear Núcleo Transportador Membrana del
Ocln OCLN Ocludina plasma Enzima receptor 1 de lipoproteína oxidada de baja Membrana del receptor Olr1 OLR1 densidad (similar a la lectina) plasma transmembrana proteína de unión a poli(A), citoplásmica 4 (forma regulador de Pabpc4 PABPC4 inducible) Citoplasma traducción Pde11a PDE11A Fosfodiesterasa 11A Citoplasma Enzima Espacio
Pdyn PDYN prodinorfina extracellular e Transportador Per3 PER3 reloj 3 del periodo circadiano Núcleo Otros Membrana del
Pllp PLLP Plasmolipina plasma Transportador PPP1R14 proteína fosfatasa 1, subunidad 14C reguladora Otros Ppp1r14c C (inhibidora) Citoplasma
Antígeno expresado preferentemente en Otros Pramel6 Pramel6 melanoma tipo 6 Otros
proteína tirosina fosfatasa, no receptora tipo 18
Ptpn18 PTPN18 (derivado del cerebro) Núcleo Fosfatasa Pycrl PYCR1 pirrolina-5-carboxilato reductasa 1 Citoplasma Enzima Membrana del
Rab26 RAB26 RAB26, miembro de la familia de oncogenes RAS plasma Enzima Proteína 2 que modifica la actividad del receptor Membrana del
Ramp2 RAMP2 (acoplado a proteína G) plasma Transportador Rbm24 RBM24 proteína 24 del motivo de unión de ARN Otros Otros Membrana del
Rhag RHAG Glicoproteína asociada al Rh plasma Peptidasa Rpl3 RPL3 proteína ribosómica L3 Citoplasma Otros
Sall3 SALL3 3 tipo sal (Drosophila) Núcleo Otros regulador de Satbl SATB1 SATB Homeobox 1 Núcleo transcripción Espacio
Scg2 SCG2 Secretogranina II extracelular Citoquina ID Símbolo Nombre de Entrez Gene Ubicación Tipo(s) portador de soluto de la familia 15 (transportador Membrana del
Slc15a1 SLC15A 1 de oligopéptidos), miembro 1 plasma Transportador portador de soluto de la familia 1 (transportador de
glutamato de alta afinidad neuronal/epitelial, Membrana del
Slc1a1 SLC1A1 sistema Xag), miembro 1 plasma Transportador portador de soluto de la familia 24 (intercambiador Otros Otros Slc24a5 Slc24a5 de sodio/potasio/calcio), miembro 5
portador de soluto de la familia 37 (transportador
Slc37a2 SLC37A 2 de glucosa-6-fosfato), miembro 2 Otros Transportador sintrofina, beta 1 (proteína A1 asociada a Membrana del
40424 SNTB1 distrofina, 59 kDa, componente básico 1) plasma Otros
ST6 (alfa-N-acetil-neuraminil-2,3-beta-galactosil-ST6GAL 1,3)-N-acetilgalactosaminida alfa-2,6-St6galnac3 NAC3 sialiltransferasa 3 Citoplasma Enzima Tex12 TEX12 expresado en testículo 12 Núcleo Otros
Espacio Otros
Tex15 TEX15 expresado en testículo 15 extracelular
factor de transcripción AP-2 alfa (activador de la regulador de Tfap2a TFAP2A proteína 2 alfa de unión al potenciador) Núcleo transcripción Membrana del Otros
Tmc1 TMC1 canal transmembrana tipo 1 plasma
Tmem130 TMEM130 proteína transmembrana 130 Otros Otros Tmem30b TMEM30B proteína transmembrana 30B Otros Otros Translocasa del homólogo 20 de la membrana
Tomm20 TOMM20 mitocondrial externa (levadura) Citoplasma Transportador Miembro 3 de la familia de la caja de grupo de alta Otros Otros
Tox3 TOX3 movilidad TOX
Ttc25 TTC25 dominio 25 de repetición tetratricopéptido Citoplasma Otros
Espacio Factor de Tymp TYMP timidina fosforilasa extracelular crecimiento Ubb Ubb Ubiquitina B Citoplasma Otros
Vamp7 VAMP7 proteína 7 de membrana asociada a la vesícula Citoplasma Transportador Espacio Otros Wfdc12 Wfdc12 Dominio 12 central de cuatro disulfuros WAP extracelular
Wfdc15a Wfdc15a Dominio 15a central de cuatro disulfuros WAP Otros Otros Wfdc6a Wfdc6a Dominio 6a central de cuatro disulfuros WAP Otros Otros
Tabla 10. Un subconjunto de genes de la Tabla 9, que se expresan a niveles 20 veces más altos en células ES de rata que los genes correspondientes en células ES de ratón.
ID Nombre de Gen Entrez
Ajap1 Proteína asociada con uniones de adherencia
Cldn5 Claudina 5
Arhgef9 Cdc42 factor 9 de intercambio de nucleótido guanina
ID Nombre de Gen Entrez
Camk4 Proteína quinasa IV dependiente de calcio/calmodulina
Efna1 efrina-A1
Epha4 Receptor EPH A4
Gjb5 proteína beta 5 de brecha de unión
Igfbpl1 proteína tipo 1 de unión al factor de crecimiento similar a la insulina
Il1f8 Interleucina 36 beta
Il28ra receptor Interleucina 28, alfa
Lefty1 factor 1 de determinación izquierda-derecha
Lifr Receptor alfa del factor inhibidor de leucemia
Lpar2 Receptor 2 de ácido lisofosfatídico
Ntm Receptor de pentraxina neuronal
Ptpn18 Proteína tipo 18 no receptora de tirosina fosfatasa
Cdx2 Homeobox 2 tipo caudal
Fank1 Fibronectina tipo III y dominios 1 de repetición de anquirina
Foxe1 Caja E1 Forkhead (factor 2 de transcripción tiroidea)
Hey2 velloso/potenciador de la división relacionado con el motivo 2 de YRPW
Lef1 Factor 1 de unión al potenciador linfoide
Sall3 3 tipo Sal (Drosophila)
Satb1 homeobox 1 SATB
También se ha desarrollado una firma molecular adicional que emplea los marcadores/genes de pluripotencia para las células ES de rata. La Tabla 11 proporciona una lista de genes y sus rangos de expresión de los datos de perfiles de ARN. Se aisló ARNm a partir de células ES de rata y se comparó el nivel de expresión de diversos marcadores entre sí. El término "rango" significa los niveles de expresión comparativos de genes individuales: cuanto más alto es el rango (1 es el más alto), más alta es la expresión. Por ejemplo, el rango de 13 de Oct4 significa que, de todos los genes analizados, se expresó más alto que todos menos 12 genes. Fue fundamento este experimento cualquier valor de expresión por debajo de 30; 6107 genes tenían valores de expresión de 30 o más.
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Ejemplo 2: Inactivación de loci genómicos en ratas
2.1: Inactivación de loci genómicos endógenos usando un agente de endonucleasa
Para introducir un alelo mutante en un locus genómico de rata endógeno, las células ES de rata descritas en el presente documento se someten a electroporación con vectores de expresión (o ARNm) que expresan ZFNs 1 y 2 (o TALENs 1 y 2). Estas proteínas se unen a sus secuencias diana en cadenas opuestas, separadas por aproximadamente 6 pb a aproximadamente 40 pb. Se forma una ruptura de doble cadena dentro del locus diana, que la célula intenta reparar mediante la unión final no homóloga (NHEJ). En muchos casos, el NHEJ da como resultado la creación de una eliminación, que a menudo interrumpe la función del gen (la mayoría de las veces produce una mutación de cambio de marco). Para identificar un clon positivo que comprenda un alelo mutante, las células sometidas a electroporación se colocan en placas a baja densidad, porque no se realiza la selección del fármaco. Las colonias se seleccionan y ensayan en el sitio objetivo para ver si se produjo una mutación (por ejemplo, utilizando una modificación del ensayo de alelo (MOA) descrito anteriormente). Las células ES seleccionadas que comprenden el alelo mutante se introducen luego en un embrión de rata huésped, por ejemplo, un embrión de rata en estadio premórula o blastocisto, y se implantan en el útero de una madre sustituta para generar una rata fundadora (rata F0). Posteriormente, la rata fundadora se cría en una rata de tipo salvaje para crear heterocigotos de progenie F1 para el alelo mutante. El apareamiento de la rata F1 heterozigota puede producir progenie homozigota para el alelo mutante.
2.2.: Rata ESC direccionada a la inactivación del gen de la apolipoproteína E (ApoE) de rata utilizando nucleasas de dedos de zinc
Las nucleasas de dedo de zinc usan dominios de unión a ADN modulares específicos de secuencia para dirigir la actividad de la endonucleasa a una secuencia diana única en el genoma. Los ZFN están diseñados como un par de monómeros. Cada monómero contiene un dominio de escisión no específico de la endonucleasa FokI fusionada a 3 o más dominios de unión al ADN con dedos de zinc. Cada dedo de zinc se une a un subsitio de 3 pb y la especificidad se logra mediante los sitios objetivo combinados de ambos monómeros. Los ZFN producen rupturas de doble cadena (DSB) en el ADN, y las mutaciones (inserciones o supresiones) ocurren con frecuencia durante la unión de extremos no homólogos (NHEJ). Los DSB también estimulan la reparación direccionada por homología (HDR) mediante recombinación homóloga si se proporciona una secuencia donante con ZFN.
Dichos ZFN se emplearon en combinación con los diversos métodos y composiciones divulgados en el presente documento para mejorar la eficacia de direccionamiento. El locus de apolipoproteína E (ApoE) de rata se seleccionó como se describe en el Ejemplo 3.2(a)(i), excepto que los vectores de expresión que expresan ZFNs 1 y 2 también se introdujeron en las células ES de rata. Consúltese la Figura 10 que proporciona un esquema del evento de orientación de ApoE en combinación con rTZFNIP y rTZFN2P. La eficiencia de la direccionamiento se determinó como se explica a continuación en el Ejemplo 6 y los resultados se muestran en la Figura 11. Sorprendentemente, la eficiencia del direccionamiento aumentó 8-10 veces.
Se construyó un vector de direccionamiento de plásmidos con un casete de casete de selección de fármacos que se elimina automáticamente y un gen lacZ como gen informador. Se logró una buena eficiencia de direccionamiento y se produjo un alto % de quimeras. Las nucleasas de dedo de zinc (ZFN) también se probaron en combinación con vectores de direccionamiento para examinar su efecto en la mejora de la eficiencia de direccionamiento. El vector de direccionamiento se coexpresó con los vectores de expresión para 2 pares de ZFN que cortaron el locus ApoE. Los clones ESC de rata sometidos a electroporación con el vector de direccionamiento y un conjunto de ZFN mostraron una eficacia de direccionamiento de 8 a 10 veces mayor que la de los clones ESC de rata sometidos a electroporación con un vector de direccionamiento solo. Además, se detectó una orientación homozigota bialélica en aproximadamente el 2% de nuestros clones. Se obtuvo un alto porcentaje de quimeras de dos de estos clones direccionados.
Los clones ESC de rata direccionados a ApoE (con asistencia de ZFN) se microinyectaron en blastocistos SD, que luego se transfirieron a hembras receptoras pseudopreñadas SD, utilizando técnicas estándar. Las quimeras se identificaron por el color del pelaje; las quimeras F0 macho fueron criadas a hembras SD. Las crías de la línea germinal F1 fueron genotipificadas para detectar la presencia del alelo ApoE objetivo (Figura 17). Hubo un alto porcentaje de quimeras en dos de estos clones direccionados.
Una rata ApoE bloqueada proporciona un medio para estudiar diversos tipos de trastornos y enfermedades. En los seres humanos, la apolipoproteína se encuentra en quilomicrones, HDL, LDL y VLDL. ApoE es esencial para el catabolismo normal de los constituyentes lipoproteínicos ricos en triglicéridos. Los defectos en APOE dan como resultado numerosos estados de enfermedad que incluyen, por ejemplo, hipercolesterolemia familiar, hiperlipemia, betalipoproteinemia, disbetalipoproteinemia familiar, hiperlipoproteinemia de tipo III (HLP III), riesgo de enfermedad coronaria. Una isoforma (ApoE4) está asociada con la enfermedad de Alzheimer familiar y esporádica de inicio tardío, posiblemente también con EM.
En ratones, ApoE se encuentra principalmente en HDL; transporta el colesterol, como en los humanos. Los ratones deficientes en ApoE (2 KO independientes) tienen 5 veces más colesterol que el plasma normal; desarrollaron depósitos ricos en células espumosas en sus aortas proximales a los 3 meses de edad (comparable al síndrome humano).
Los bloqueos de ApoE en ratas ofrecen un modelo animal para estudiar la función endotelial, que incluye, entre otros, la formación de placa, los cambios transcripcionales (RNA-Seq), la función ex vivo. Además, un tamaño mayor de ratas facilitaría todos estos ensayos y potencialmente mejoraría la calidad de los datos de RNA-Seq.
2.3. Inactivación del locus gamma (IL2r-y) del receptor de interleucina-2 de rata utilizando nucleasas de dedos de zinc
El locus gamma (IL2r-y) del receptor de interleucina-rata se seleccionó como se describe en el Ejemplo 3.3(a), excepto que los vectores de expresión que expresan ZFN U (ZFN en sentido ascendente) y ZFN D (ZFN en sentido descendente) también se introdujeron en as células ES de rata. La Figura 18 proporciona un esquema del evento de orientación IL2r-y en combinación con ZFN U y ZFN D. La secuencia del locus IL2r-y que estos dedos de zinc se unen se indica en la Figura 18. La eficiencia de la orientación se determinó como se explica a continuación en el Ejemplo 3.3(a) y los resultados se muestran en la Figura 18. En resumen, los clones direccionados como homozigotas se confirmaron mediante PCR. Para el par ZFN1: 173 clones mutantes de 192 seleccionados (90%) y para el par ZFN2: 162 clones de 192 (84%) seleccionados.
Los clones ESC de rata direccionados a IL2r-y (con asistencia ZFN) se microinyectaron en blastocistos SD, que luego se transfirieron a hembras receptoras pseudopreñadas SD, utilizando técnicas estándar. Las quimeras se identificaron por el color del pelaje; Las quimeras F0 macho fueron criadas a hembras SD. Las crías de la línea germinal F1 fueron genotipificadas para detectar la presencia del alelo IL2r-y objetivo.
2.4. : Inactivación del receptor de interleucina-2 de rata (IL2r-y) utilizando CRISPR/Cas9
El locus IL2r-y de rata se seleccionó como se describe en el Ejemplo 3.3(a), excepto que el sistema CRISPR/Cas9 también se introdujo en las células ES de rata para ayudar en la eficiencia de la direccionamiento. SBI: System Biosciences Cas9 "SmartNuclease" se emplearon vectores todo en uno y la expresión de Cas9 fue direccionada por el promotor CAG, EF1a, PGK o CMV. El ARNg personalizado se ligó en un vector y se expresó mediante el promotor H1. Se diseñaron 4 ARNgs contra Il2g. La eficiencia de direccionamiento cuando se emplean los diversos ARN de guía se muestra en la Figura 19.
Ejemplo 3: Modificación direccionada de loci genómicos de rata
3.1: Direccionamiento en Rata ESC: El locus de rata Rosa 26..
El locus Rosa 26 de rata se encuentra entre los genes Setd5 y Thumpd3 como en el ratón, con el mismo espaciado. El locus Rosa 26 de rata (Figura 12, Panel B) difiere del locus Rosa 26 de ratón (Figura 12, Panel A). Las transcripciones de Rosa 26 de ratón consisten en 2 o 3 Exones. El locus de rata contiene un segundo exón 1 (Ex1b) además del exón homólogo al exón 1 de ratón (Ex1a). No ha sido identificado ningún tercer exón en ratas. La orientación de un alelo Rosa 26 de rata se representa en la Figura 12 (parte inferior), donde se clonaron brazos de homología de 5 kb cada uno por PCR utilizando ADN genómico de rata e Sc DA. El alelo específico contiene un casete SA (aceptor de empalme)-lacZ-hUb-neo que reemplaza una eliminación de 117 pb en el intrón Rosa 26 de rata.
Se determinó la eficiencia de la direccionamiento en el locus Rosa 26 de rata (Tabla 12). El vector linealizado se sometió a electroporación en ESC de rata con DA o ACI, y las colonias transfectadas se cultivaron en medios 2i G418, utilizando técnicas estándar. Las colonias individuales se seleccionaron y se cribaron utilizando un ensayo de pérdida de Alelo (LOA) (Valenzuela, D. et. Al. (2003). High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21: 652-660).
Tabla 12. Eficiencia de direccionamiento en rata Rosa 26
Línea celular Colonias escogidas Positivos reconfirmados Eficiencia de direccionamiento (%)
DA.2B 192 4 2.1
ACI.G1 96 4 4.2
Producción de quimeras y transmisión de la línea germinal utilizando clones ESC direccionados a Rosa 26. Se volvieron a inyectar clones ESC de rata direccionados a Rosa 26 reconfirmados en blastocistos SD, que luego se transfirieron a hembras receptoras pseudopreñadas SD, utilizando técnicas estándar. Las quimeras se identificaron por el color del pelaje; las quimeras F0 macho fueron criadas a hembras SD. Las crías de la línea germinal (agutí) F1 fueron genotipificadas por la presencia del alelo Rosa 26 diana; nueve de 22 cachorros de agutí fueron genotipificados como heterocigotos en el locus Rosa 26 (Tabla 13).
Tabla 13. Transmisión de la línea germinal utilizando Rosa 26 rESC direccionado
Línea clones R26 Clones Clones de Cachorros Cachorros Cachorros celular inyectados productores de transmisión de la vados de derivados de quimeras línea germinal totales deri
rESC ESC (%)
AH7: 64 AH7:41 AH7: 63 DA.2B 4 3 2
AE3: 112 AE3:6 AE3:3
ACI.G1 4 4 1 DE9: 39 DE9: 4 10
3.2.(a)(i): Direccionamiento del locus de apolipoproteína E (ApoE) de rata.
El locus de apolipoproteína E (ApoE) de rata se direccionó para alterar la función de ApoE. El direccionamiento del locus ApoE se realizó utilizando un vector de direccionamiento que comprende un casete lacZ-hUb-neo flanqueado con un homólogo de brazos de homología 5' y 3' al locus ApoE. La figura 20 muestra un locus ApoE de rata modificado genéticamente que se ha interrumpido por una eliminación de 1.8 kb y la inserción de un casete lacZ-hUb-neo, que incluye además un casete Cre que se puede borrar y que contiene un gen Crei controlado por un promotor de protamina. Las condiciones de electroporación fueron las siguientes: 6 |jg de ADN; 2.05 x 106 células; 400V; 200 uF: 342 V, 593 usec; placa en 15 cm 2x neoR MEF densos en 2i 10 uM ROCKi.
Se determinó la eficacia de direccionamiento en el locus ApoE y se muestra en la Tabla 14. El vector linealizado se sometió a electroporación en ratas ESC DA.2B derivadas de la cepa DA, y las colonias transfectadas se cultivaron usando técnicas estándar. Las colonias individuales se seleccionaron y se cribaron utilizando un ensayo de pérdida de alelo (LOA).
Tabla 14. Eficiencia de direccionamiento en la rata ApoE
Línea celular Vector Colonias escogidas Direccionadas Eficiencia de direccionamiento (%)
DA.2B ApoE-mSDC 192 7 3.7
DA.2B ApoE-mSDC 192 15 7.8
Se realizó la producción de quimeras y la transmisión de la línea germinal utilizando clones ESC direccionados contra ApoE. Los clones ESC de rata direccionados a ApoE se microinyectaron en blastocistos SD, que luego se transfirieron a hembras receptoras pseudopreñadas SD, utilizando técnicas estándar. Las quimeras se identificaron por el color del pelaje; las quimeras F0 macho fueron criadas a hembras SD. Los cachorros de F1 fueron genotipificados para detectar la presencia del alelo ApoE objetivo (Tabla 15).
Tabla 15 Resultados de la microinyección
Exp Clon Cachorros Quimeras
1 ApoE-AF5 4 3 (90, 90, 90)
2 ApoE- BC4 5 0
En la figura 21 también se proporcionan datos de direccionamiento adicionales para ApoE.
3.2.(a)(ii). Direccionamiento de ApoE en ratas con un vector de direccionamiento
La figura 20 proporciona un esquema del locus ApoE de rata y un plásmido de direccionamiento. El esquema superior de la figura 20 muestra la estructura genómica del locus ApoE de rata y las regiones genómicas correspondientes a los brazos de homología 5' y 3' (5 kb y 5.4 kb, respectivamente; cuadros de color gris oscuro). El exón 1 de ApoE no está codificado y se muestra como una caja abierta más cercana al brazo de homología 5'. Los 3 intrones de ApoE se indican como líneas y los Exones 2 y 3 comprenden regiones de codificación y se muestran como recuadros grises punteados. El exón 4 contiene secuencias codificadas y no codificadas como se indica por el sombreado gris punteado y el cuadro abierto.
El esquema inferior en la figura 20 es el vector de direccionamiento. Los brazos de homología 5' y 3' (5 kb y 5,4 kb respectivamente) están indicados por los recuadros en gris oscuro. El vector de direccionamiento comprende un gen informador (lacZ) y un casete autoeliminable flanqueado por sitios loxP (flechas abiertas). El casete que se elimina automáticamente comprende el gen Crei unido operativamente a un promotor Prm1 de ratón y un casete de selección que comprende un gen de resistencia a neomicina unido operativamente a un promotor de ubiquitina humana.
El gen Crei comprende dos Exones que codifican una recombinasa de Cre, que están separados por un intrón (Crei) para evitar su expresión en una célula procariota. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 8,697,851 y la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos 2013-0312129, que describen el casete de autoeliminación en detalle. Al emplear el promotor Prm1, el casete que se elimina automáticamente se puede eliminar específicamente en células germinales masculinas de rata F0. El vector de direccionamiento se sometió a electroporación en las células ES de rata obtenidas en el Ejemplo 1 y las células se colocaron en placas sobre MEF resistentes a neomicina densa de 15 cm 2x en 2i 10 uM de ROCKi. Las células ES de rata transformadas se cultivaron, seleccionaron y mantuvieron como se describe en el Ejemplo 1.
Como se muestra en la Tabla 23, se seleccionaron 384 colonias y se obtuvieron 23 clones direccionados. La eficiencia de direccionamiento fue de 5.99%. Se inyectaron 3 clones en blastocistos como se describe aquí en el Ejemplo 1. Se obtuvieron 3 clones que producen quimeras y 2 de los clones transmitieron la modificación direccionada a través de la línea germinal.
3.2.(A)(iii). Direccionamiento de ApoE en ratas con un vector de direccionamiento en combinación con nucleasas con dedos de zinc
El vector de direccionamiento empleado en el Ejemplo 3.2(a)(ii) se usó en combinación con nucleasas de dedos de zinc para apuntar al locus ApoE de rata. La Tabla 16 proporciona un resumen de la organización genómica del locus ApoE de rata. Las posiciones mostradas en la Tabla 16 se tomaron de la compilación 5.0 de la Secuencia de referencia del genoma de rata (ENSMBL). ApoE está en el cromosoma 1 en la cadena (-).
Tabla 16. Resumen del locus ApoE de rata y las posiciones de los sitios de unión a nucleasa de dedo de Zinc y los sitios de corte.
Característica Inicio Fin longitud Notas
Exón 1 81881110 81881182 73 5' no codificado
Exón2 81880269 81880332 64 contiene ATG
ATG 81880309 81880311 3 codón de inicio
Exón3 81879607 81879775 169
Sitio de unión ZFNla 81879707 81879693 15 CAGGCCCTGAACCGC (SEQ ID NO: 10)
sitio de corte ZFN1 81879692 81879687 6 TTCTGG (SEQ ID NO: 11)
Sitio de unión ZFN1b 81879686 81879671 16 GATTACCTGCGCTGGG (SEQ ID NO: 12)
Intrón 3-4 81879776 81879207 400
sitio de unión ZF21a 81879591 81879577 15 TTCACCCTCCGCACC (SEQ ID NO: 13)
sitio de corte ZFN2 81879576 81879570 7 TGCTGAG (SEQ ID NO: 14)
Sitio de unión ZF21b 81879569 81879552 18 TATCCAGATCCAGGGGTT(SEQ ID NO: 15)
Exón 4 81878371 81879208 838 contiene TGA
TGA 81878482 81878484 3
Eliminación de apoE 81878482 81880311 1830
La figura 10 proporciona un esquema del locus ApoE de rata y denota con barras grises el sitio de corte para ZFN1 y ZFN2. El sitio de corte para ZFN1 está en el exón 3 y el sitio de corte para ZNF2 está en el intrón 3. La posición exacta de ambos sitios ZFN se muestra en la Tabla 16. Las regiones genómicas correspondientes a los brazos de homología 5' y 3' (5 kb y 5.4 kb, respectivamente) se indican mediante los recuadros en gris oscuro. El exón 1 de ApoE no está codificado y se muestra como una caja abierta más cercana al brazo de homología 5'. Los tres intrones del gen ApoE se indican como líneas y los Exones 2 y 3 comprenden regiones codificantes y se muestran como recuadros grises punteados. El exón 4 contiene secuencias codificadas y no codificadas como se indica por el sombreado gris punteado y el cuadro abierto.
El vector de direccionamiento empleado fue el mismo que en el Ejemplo 3.2(a)(ii) y se muestra en la figura 20. Los ZFN se introdujeron como dos plásmidos de expresión, uno para cada mitad del par de ZFN. Se utilizaron 20 |jg del plásmido para ZFN1 y 20 jg del plásmido para ZFN2. Los ZFN fueron comprados de Sigma. La expresión de cada ZFN fue direccionada por el promotor CMV.
El vector de direccionamiento se sometió a electroporación en las células ES de rata obtenidas en el Ejemplo 1 y las células se sembraron en placas con 15 cm 2x de MOS neoR densos en 2i 10 uM ROCKi. Las células Es de rata transformadas se cultivaron, seleccionaron y mantuvieron como se describe en el Ejemplo 1.
Como se muestra en la Tabla 23, se seleccionaron 384 colonias y se obtuvieron 290 clones direccionados. La eficiencia de direccionamiento fue del 75.52%. Se inyectaron 2 clones en blastocistos como se describe aquí en el Ejemplo 1. Se obtuvieron dos clones que producen quimeras y uno de los clones transmitió la modificación direccionada a través de la línea germinal.
Además, al emplear ZFN1 y ZFN2 se produjeron 8 clones direccionados bialélicos con una eficiencia del 2.08%.
3.2. (b)(i): Modificación direccionada del locus de apolipoproteína E (ApoE) de rata utilizando un vector de direccionamiento grande (LTC).
El direccionamiento del locus ApoE se realiza utilizando un vector de direccionamiento grande (LTVEC) que comprende un casete Prm1-Crei lacZ-de ratón flanqueado con un brazo de homología 5' al locus ApoE de aproximadamente 45 kb y un brazo de homología 3' al locus ApoE alrededor de 23 Kb. La figura 22 muestra el locus ApoE de rata en donde el locus ApoE se ha interrumpido por una eliminación de 1.83 kb y la inserción del gen lacZ y un casete autoeliminable que comprende el casete mPrm1-Crei y un casete de selección hUb-neo. Los métodos empleados en el ejemplo 3.2(a)(i) se pueden usar para introducir este vector en células ES de rata.
Ejemplo 3.2.(b)(ii). Direccionamiento del locus ApoE de rata con un vector de direccionamiento grande (LTVEC)
La figura 22 proporciona un esquema del locus ApoE de rata y un vector de direccionamiento grande (LTEVC). El esquema superior de la figura 22 muestra la organización genómica del locus ApoE de rata y las regiones genómicas correspondientes a los brazos de homología 5' y 3' (45 kb y 23 kb, respectivamente; cuadros de color gris oscuro). El exón 1 de ApoE no está codificado y se muestra como una caja abierta más cercana al brazo de homología 5'. Los 3 intrones de ApoE se indican como líneas y los Exones 2 y 3 comprenden regiones de codificación y se muestran como recuadros grises punteados. El exón 4 contiene secuencias codificadas y no codificadas como se indica por el sombreado gris punteado y el cuadro abierto.
El esquema inferior en la figura 22 es el LTVEC. Los brazos de homología 5' y 3' (45 kb y 23 kb, respectivamente) se indican mediante los recuadros de color gris oscuro. El vector de direccionamiento comprende un gen informador (lacZ) y un casete que se elimina automáticamente flanqueado por sitios loxP (flechas abiertas), que comprende el gen Crei unido operativamente a un promotor Prm1 de ratón y un casete de selección de fármacos que comprende un gen de resistencia a neomicina unido operativamente a un promotor de ubiquitina humana. Crei comprende dos Exones que codifican la recombinasa Cre que están separados por un intrón (Crei) para evitar su expresión en una célula procariota. Consulte, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 8,697,851 y la Publicación de Solicitud de los Estados Unidos 2013-0312129, que describe en detalle el casete que se elimina automáticamente. Al emplear un promotor Prm1 de ratón, el casete que se elimina automáticamente se puede eliminar específicamente en células germinales masculinas de rata F0.
El LTVEC se sometió a electroporación en las células ES de rata obtenidas en el Ejemplo 1 y las células se sembraron en placas con 15 cm 2x de MOS neoR densos en 2i 10 uM ROCKi. Las células ES de rata transformadas se cultivaron, seleccionaron y mantuvieron como se describe en el Ejemplo 1.
Como se muestra en la Tabla 23, se seleccionaron 288 colonias y se obtuvieron 8 clones direccionados. La eficiencia de direccionamiento fue del 2.78%. Se inyectaron 3 clones en un embrión huésped en una etapa de blastocisto como se describe aquí en el Ejemplo 2 para producir ratas quiméricas (F0). Además, se produjo un clon direccionado bialélico que proporciona una eficiencia bialélica del 0.35%.
3.2. (b)(iii). Direccionamiento de ApoE en ratas con un vector de direccionamiento grande (LTVEC) en combinación con nucleasas de dedos de zinc
El LTVEC empleado en el Ejemplo 3.2.(b)(ii) se usó en combinación con nucleasas de dedos de zinc para apuntar al locus ApoE de rata. La Tabla 16 proporciona un resumen de la organización genómica del locus ApoE de rata y las posiciones mostradas se tomaron de la compilación 5.0 de la secuencia de referencia del genoma de rata (ENSMBL).
La figura 23 proporciona un esquema del locus ApoE de rata y denota con barras grises el sitio de corte para ZFN1 y ZFN2. El sitio de corte para ZFN1 está en t exón 3 y el sitio de corte para ZNF2 está en el intrón 3. La posición exacta de ambos sitios ZFN se muestra en la Tabla 16. Los brazos de homología 5' y 3' (45 kb y 23 kb, respectivamente) se denotan por las casillas gris oscuro. El exón 1 del gen ApoE no está codificado y se muestra como una caja abierta más cercana al brazo de homología 5'. Los tres intrones del gen ApoE se indican como líneas. Los Exones 2 y 3 comprenden regiones de codificación y se muestran como recuadros grises punteados. El exón 4 contiene secuencias codificadas y no codificadas como se indica por el sombreado gris punteado y el cuadro abierto.
El LTVEC empleado fue el mismo que en el Ejemplo 3.2(b)(ii) y se muestra en la figura 22. Los ZFN se introdujeron como dos plásmidos de expresión, uno para cada mitad del par de ZFN. Se usaron 20 |jg del plásmido para ZFN1 y 20 jg del plásmido para z FN2. Los ZFNs fueron comprados de Sigma. La expresión de cada ZFN fue direccionada por el promotor CMV.
El vector de direccionamiento se sometió a electroporación en las células ES de rata obtenidas en el Ejemplo 1 y las células se sembraron en placas con 15 cm 2x de MOS neoR densos en 2i 10 uM ROCKi. Las células Es de rata transformadas se cultivaron, seleccionaron y mantuvieron como se describe en el Ejemplo 1.
Como se muestra en la Tabla 23, se seleccionaron 288 colonias y se obtuvieron 16 clones direccionados. La eficiencia de direccionamiento fue del 5.56%. Se inyectó un clon en blastocistos como se describe en el presente documento en el Ejemplo 2.
Además, el empleo de ZFN1 y ZFN2 produjo un clon bialélico direccionado, con una eficiencia del 0.35%.
3.3(a): Direccionamiento del locus gamma del receptor de Interleucina-2 de rata (IL2r-y)
El locus del receptor de interleucina-2 gamma (IL2r-y) de rata fue direccionado para interrumpir la función IL2r-y. IL2r-Y desempeña un papel importante para la señalización de IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21 y las mutaciones en IL2r-y están asociadas con defectos graves en el desarrollo de células T, B y NK..
El direccionamiento del locus IL2r-y se realizó utilizando un vector de direccionamiento que comprende un casete eGFP-hUb-neo flanqueado con una homología de 5' y 3' brazos homólogos al locus IL2r-y. La figura 26 representa la estructura genómica del locus IL2r-y de rata en donde el locus IL2r-y se ha interrumpido por una eliminación de 3.2 kb. El locus IL2r-y objetivo también comprendía un gen eGFP y un casete autoeliminable que contiene Crei unido operativamente a un promotor Protamina 1 de ratón y un casete de selección de fármaco que comprende un promotor hUb unido operativamente a un gen de resistencia a neomicina.
La eficacia de direccionamiento en el locus IL2r-y se determinó y se muestra en la Tabla 17. El vector linealizado se sometió a electroporación en DA.2B rata ESC y las colonias transfectadas se cultivaron utilizando técnicas estándar. Las colonias individuales se seleccionaron y se cribaron utilizando un ensayo de pérdida de alelo (LOA).
Tabla 17. Eficiencia de direccionamiento de IL2r-y de rata
Línea celular Vector Colonias escogidas Direccionado Eficiencia de direccionamiento (%)
DA.2B II2rg-floxed neo 136 1 0.7
DA.2B II2rg-mSDC 96 4 4.2
Se realizó la producción de quimeras y la transmisión de la línea germinal utilizando clones de ESC direccionados a IL2r-y. Los clones de ESC de rata direccionados a IL2r-y se microinyectaron en blastocistos SD, que luego se transfirieron a hembras receptoras pseudopreñadas SD, utilizando técnicas estándar. Las quimeras se identificaron por el color del pelaje; las quimeras F0 macho fueron criadas a hembras SD. Las crías de la línea germinal F1 se genotipificaron para determinar la presencia del alelo IL2r-y direccionado (Tabla 18).
Tabla 18 Resultados de la microinyección
Exp Clon Cachorros Quimeras
1 Il2rg-AA1 5 2 (90, 70)
2 Il2rg-AA1 10 3 (90, 90, 80)
El fenotipo de la quimera Il2rg-/Y #3 se estudió más a fondo. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se tiñeron con anticuerpos que reconocen antígenos en varios linajes linfoides. Se detectaron PBMC positivas para GFP en 2 de las quimeras. Además, las células GFP+ fueron negativas para el marcador de células T CD3, y en su mayoría fueron negativas para el marcador de células B B220 y el marcador de células NK CD161a. Vea la figura 30. Las pequeñas poblaciones de doble positivo son consistentes con el fenotipo bloqueado Il2rg publicado en ratones. Estos datos se obtuvieron de una rata quimérica, que contiene células gamma-positivas para el receptor de IL2, y esto puede complicar el análisis del fenotipo.
3.3(b): Modificación direccionada del locus gamma del receptor de Interleucina-2 de rata (IL2r-y)
El locus del receptor de interleucina-2 gamma (IL2r-y) de rata fue direccionado para interrumpir la función IL2r-y en ratas. La figura 26 muestra la estructura genómica del locus Il2rg de rata y el vector de direccionamiento introducido en el locus. eGFP se eligió como informador para que el inmunofenotipo de las ratas genéticamente modificadas pudiera examinarse utilizando FACS. El casete autoeliminable (hUb-Neo; Prm1-Cre) se usó para eliminar el casete de la sección del fármaco y el gen Cre específicamente en células germinales masculinas de la rata F0. Además, el vector de direccionamiento se diseñó para eliminar toda la región de codificación (aproximadamente 3.2 kb) del gen Il2rg de rata.
El tamaño de la eliminación en ESC de ratas se confirmó mediante PCR usando cebadores específicos para el locus Il2rg de rata. Tras la microinyección de los clones direccionados en embriones huésped en una etapa de blastocisto, se obtuvo un alto porcentaje de quimeras. Esas quimeras se han establecido para la cría. Para determinar si la orientación funcionó como se esperaba, la sangre periférica de las quimeras se recolectó antes de la reproducción, y el fenotipo de las células inmunitarias en la sangre periférica se analizó mediante FACS. Como se muestra en la figura 30, se detectaron células positivas para GFP en la sangre periférica en 2 de las 3 quimeras examinadas (panel superior derecho), y las ratas quiméricas contenían menos del 1% de células T, menos del 1% de células B, y menos del 1% de células NK, que son positivas para GFP (es decir, células Il2rg KO).
3.4(a). Direccionamiento del locus Rag2 en ratas con un vector de direccionamiento grande (LTVEC)
La Tabla 19 proporciona un resumen de la organización genómica del locus Rag2 de rata y las posiciones mostradas se tomaron de la compilación 5.0 de la secuencia de referencia del genoma de rata (ENSMBL). Rag2 está en el cromosoma 3 en la cadena (+).
Tabla 19. Resumen de la organización genómica del locus Rag2 de rata.
Características Inicio Fin Longitud Notas
Exón 1 97,851,317 97,851,448 132
Exón 2 97,854,635 97,854,693 59
Exón 3 97,858,260 97,859,615 1,356 contiene la secuencia codificadora completa
ATG 97,856,286 97,856,288 3 codón de inicio
TGA 97,857,867 97,857,869 3 codón de detención
Eliminación de Rag2 97,856,289 97,859,784 3,496
La figura 27 proporciona un esquema del locus Rag2 de rata y un vector de direccionamiento grande (LTVEC). El esquema superior de la figura 27 muestra la organización genómica del locus ApoE de rata y las regiones genómicas correspondientes a los brazos de homología 5' y 3' (48 Kb y 15 Kb, respectivamente; recuadro gris oscuro). Rag2 comprende un solo exón indicado por el sombreado gris punteado.
El esquema inferior en la Figura 27 es el LTVEC. Los brazos de homología 5' y 3' (48 kb y 15 kb, respectivamente) se indican mediante los recuadros de color gris oscuro. El LTVEC comprende un gen informador (lacZ) y un casete autoeliminable flanqueado por sitios loxP (flechas abiertas). El casete que se elimina automáticamente comprende un promotor Prm1 de ratón unido operativamente al gen Crei y un casete de selección de fármaco que comprende un promotor de ubiquitina humana unido operativamente a un gen de resistencia a neomicina. Crei comprende dos Exones que codifican la recombinasa Cre y están separados por un intrón (Crei) para evitar su expresión en una célula procariota. Consulte, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 8,697,851 y la Publicación de Solicitud de los Estados Unidos 2013-0312129, que describen en detalle el casete que se elimina automáticamente. Al emplear un promotor Prm1 de ratón, el casete que se elimina automáticamente se puede eliminar específicamente en células germinales masculinas de rata F0.
El LTVEC se sometió a electroporación en las células ES de rata obtenidas en el Ejemplo 1 y las células se sembraron en placas con 15 cm 2x de MEF neoR densos en 2i 10 uM ROCKi. Las células ES de rata transformadas se cultivaron y se mantuvieron como se describe en el Ejemplo 1. Las colonias se seleccionan como se describe en otra parte en el presente documento y se obtienen clones direccionados. Los clones direccionados luego se inyectan en un embrión huésped como se describe en otra parte del presente documento para producir una rata F0.
3.4.(b). Direccionamiento del locus Rag1 y Rag 2 en ratas
La figura 28 proporciona la estructura genómica del locus Rag1/Rag2 de rata. CDS denota la secuencia codificadora y las cajas grises representan Exones. Rag2 está en la línea "más" con la transcripción a la derecha. Rag1 está en la cadena "menos" con la transcripción a la izquierda. Mbp = millones de pares de bases.
La Tabla 20 proporciona un resumen de la organización genómica del locus Rag2 y Rag1 de rata y las posiciones mostradas se tomaron de la compilación 5.0 de la secuencia de referencia del genoma de rata (ENSMBL). Rag1 está en el cromosoma 3 en la cadena (-).
Tabla 20. Resumen de la organización genómica del locus Rag1 de rata.
Características Inicio Fin Longitud Notas
Exón 1 97,877,145 97,877,066 80
Exón 2 97,872,503 97,866,047 6,457 contiene la secuencia codificadora completa
ATG 97,872,489 97,872,487 3 Codón de inicio
TAA 97,869,369 97,869,367 3 Codón de detención
Eliminación de Rag1-2 97,856,289 97,872,486 16,198
La figura 29 proporciona un esquema del locus Rag2 y Rag1 de rata y un vector de direccionamiento grande (LTVEC). El esquema superior de la figura 29 muestra la organización genómica de los loci Rag1 y Rag2 y las regiones genómicas correspondientes a los brazos de homología 5' y 3' (48 kb y 84 kb, respectivamente; cajas de color gris oscuro). Rag2 y Rag 1 comprenden cada uno un solo exón indicado por el sombreado gris punteado. El esquema inferior en la figura 29 es el LTVEC. Los brazos de homología 5' y 3' (48 kb y 84 kb, respectivamente) se indican mediante los recuadros de color gris oscuro. El LTVEC comprende un gen informador (lacZ) y un casete autoeliminable flanqueado por sitios loxP (flechas abiertas). El casete que se elimina automáticamente comprende un promotor Prm1 de rata unido operativamente al gen Crei y un casete de selección de fármaco que comprende un promotor de ubiquitina humana unido operativamente a un gen de resistencia a neomicina. Crei comprende dos Exones que codifican la recombinasa Cre y están separados por un intrón (Crei) para evitar su expresión en una célula procariota. Consulte, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 8,697,851 y la Publicación de Solicitud de los Estados Unidos 2013-0312129, que describe en detalle el casete que se elimina automáticamente. Al emplear un promotor Prm1 de rata que impulsa la expresión de Crei específicamente en células germinales masculinas, el casete que se puede eliminar de las células germinales masculinas de rata F0.
El LTVEC se sometió a electroporación en las células ES de rata obtenidas en el Ejemplo 1 y las células se sembraron en placas con 15 cm 2x de MOS neoR densos en 2i 10 uM ROCKi. Las células ES de rata transformadas se cultivaron y se mantuvieron como se describe en el Ejemplo 1.
Las colonias se criban como se describe en otra parte en el presente documento y se obtienen clones direccionados. Los clones direccionados luego se inyectan en un embrión huésped como se describe en otra parte del presente documento para producir una rata F0.
Ejemplo 4. Humanización.
4.1. Humanización de Loci Genómicos de rata
La humanización de loci genómicos de rata se lleva a cabo empleando las células ES de rata descritas en el presente documento, que son capaces de mantener su pluripotencia después de una o más electroporaciones in vitro, y son capaces de transmitir las modificaciones genéticas direccionadas a las generaciones posteriores. Además, para evitar las limitaciones de los plásmidos para acomodar un fragmento grande de ADN genómico, y para superar la baja eficiencia de la introducción de una modificación genética direccionada en un locus endógeno en células ES de rata, se llevan a cabo una o más modificaciones genéticas específicas en bacterias, por ejemplo, E. coli, utilizando recombinación homóloga bacteriana (BHR) y empleando un vector de direccionamiento grande (LTVEC). El LTVEC descrito aquí, por ejemplo, incluye un fragmento grande de una secuencia genómica de rata endógena con una o más modificaciones o comprende un ácido nucleico exógeno (por ejemplo, un ácido nucleico humano homólogo u ortólogo) flanqueado con brazos de homología de rata complementarios a regiones genómicas específicas.
4.2. Humanización de locus de inmunoglobulina de rata
La humanización de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena de rata se lleva a cabo mediante la eliminación de una o más secuencias de ácidos nucleicos de cadena pesada de inmunoglobulina endógena de rata (por ejemplo, uno o más segmentos de genes Vh endógenos, uno o más segmentos de genes D humanos y uno o más más segmentos de genes Jh humanos); e introduciendo en el locus de inmunoglobulina modificado un vector de direccionamiento, por ejemplo, un vector de direccionamiento grande (LTVEC) que comprende: (i) una o más secuencias de ácidos nucleicos de región variable humana no reorganizadas (por ejemplo, uno o más segmentos de genes Vh humanos, uno o más segmentos del gen D, y uno o más segmentos del gen Jh humano), o una o más secuencias de ácidos nucleicos de la región variable humana reorganizadas (por ejemplo, uno o más segmentos del gen V-D-J reorganizado humano); (ii) un casete de selección (por ejemplo, un gen de resistencia a la neomicina flanqueado con sitios loxP); y (iii) brazos de homología de ratas 5' y 3'.
En resumen, uno o más segmentos génicos de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina endógena de rata (es decir, uno o más segmentos génicos Vh, uno o más segmentos génicos D humanos y uno o más segmentos génicos Jh humanos) en un clon BAC de rata son eliminados o inactivados direccionando el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina endógena de rata con un casete de selección flanqueado por brazos de homología de rata. Más específicamente, se construye un vector de direccionamiento para contener un casete de selección (por ejemplo, un gen de resistencia a neomicina flanqueado con sitios loxP) flanqueado con brazos de homología de rata 5' y 3' que son complementarios a las secuencias genómicas de rata objetivo (por ejemplo, rata corriente arriba y corriente abajo) secuencias de ADN genómico que abarcan uno o más segmentos del gen Vh de rata, uno o más segmentos del gen D humano y uno o más segmentos del gen Jh humano).
A continuación, las células bacterianas que contienen un fragmento grande de ADN genómico de rata que abarca un locus de cadena pesada de inmunoglobulina de rata se seleccionan y se introducen con un plásmido (por ejemplo, pABG) que codifica una recombinasa unida operativamente a un promotor inducible de forma transitoria. El vector de direccionamiento construido anteriormente se introduce luego en las células bacterianas competentes para la recombinación. Después de la electroporación, las células bacterianas se tratan con un inductor (por ejemplo, arabinósido) para iniciar la recombinación homóloga entre el vector de direccionamiento y la secuencia genómica diana de rata en el clon BAC. Las células transformadas se colocan en placas de alta densidad y se someten a selección de medicamentos para encontrar colonias que sean resistentes a los medicamentos. Se seleccionan las colonias resistentes a los fármacos y se criban para la modificación direccionada.
Con el fin de facilitar la identificación de la modificación genética direccionada, se emplea un ensayo cuantitativo de alto rendimiento, a saber, la modificación del ensayo del alelo (MOA), que permite un rastreo a gran escala de un alelo(s) modificado en un cromosoma parental tras una modificación genética. El ensayo de MOA se puede llevar a cabo mediante diversas técnicas analíticas, que incluyen, entre otras, una PCR cuantitativa, por ejemplo, una PCR en tiempo real (qPCR). Por ejemplo, la PCR en tiempo real comprende un primer conjunto de cebadores que reconoce el locus diana y un segundo conjunto de cebadores que reconoce un locus de referencia no direccionado. Además, el conjunto de cebadores puede comprender una sonda fluorescente que reconoce la secuencia amplificada. Alternativamente, el ensayo cuantitativo se puede llevar a cabo mediante una variedad de técnicas analíticas, que incluyen, entre otras, hibridación in situ mediada por fluorescencia (FISH), hibridación genómica comparativa, amplificación de ADN isotérmica, hibridación cuantitativa con una(s) sonda(s) inmovilizada(s), Invader Probes®, MMP assays®, TaqMan® Molecular Beacon y la tecnología de sonda Eclipse™. (Véase, por ejemplo, US2005/0144655).
Las células bacterianas que comprenden el clon BAC de rata modificado, es decir, un clon BAC que contiene una secuencia de ADN genómico de rata en donde se han eliminado uno o más segmentos génicos de la región variable de la cadena pesada endógenos (segmentos génicos Vh, D y/o Jh) o se inactivan, luego se someten a electroporación con un vector de direccionamiento grande (LTVEC) que comprende: (i) una o más secuencias de ácidos nucleicos de la región variable humana no reorganizadas (por ejemplo, uno o más segmentos génicos Vh humanos no reorganizados, uno o más segmentos génicos D humanos, y uno o más segmentos del gen JH humano), o una o más secuencias de ácidos nucleicos de la región variable humana reorganizadas (por ejemplo, uno o más segmentos del gen V-D-J humano reorganizados).
El inicio de la recombinación homóloga en las células bacterianas y la selección de clones positivos se realizan como se describió anteriormente. Las secuencias de ácidos nucleicos de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reorganizadas o reordenadas, cuando se direccionan al locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógena, se unen operativamente a una secuencia de ácidos nucleicos de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina endógena de rata. Alternativamente, el locus endógeno de la región constante de la cadena pesada de la rata se puede inactivar, por ejemplo, eliminando uno o más segmentos génicos de la región constante de la cadena pesada de la rata (CH) del locus de la región constante de la cadena pesada endógena, y se puede reemplazar con una constante de la cadena pesada humana secuencia de ácidos nucleicos de la región.
Del mismo modo, la humanización de una inmunoglobulina endógena de rata k o A locus de cadena ligera se lleva a cabo mediante la eliminación de una o más inmunoglobulina endógena de rata k y/o A secuencias de ácidos nucleicos de región variable de la cadena variable (por ejemplo, uno o más gen de Vk de rata endógeno segmentos y uno o más segmentos endógenos del gen Jk de rata); y direccionamiento del locus de la cadena ligera de inmunoglobulina modificada con un vector de direccionamiento, por ejemplo, un vector de direccionamiento grande (LTVEC), que comprende: (i) una o más secuencias de ácidos nucleicos de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana no reorganizadas (por ejemplo, uno o más segmentos degenes Vk humanos y uno o más segmentos del gen Jk humano), o una o más secuencias de ácidos nucleicos de la región variable humana reorganizadas (por ejemplo, uno o más segmentos del gen Vk-Jk reorganizados humanos); (ii) un casete de selección (por ejemplo, un gen de resistencia a la neomicina flanqueado con sitios loxP); y (iii) brazos de homología de ratas 5' y 3'.
Las secuencias de ácidos nucleicos de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana no reordenadas o reordenadas, cuando se direccionan al locus de cadena ligera de inmunoglobulina endógena, se unen operativamente a la secuencia de ácidos nucleicos de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina endógena de rata.
El LTVEC así producido en las células bacterianas comprende, por ejemplo, un inserto de ácido nucleico que contiene un locus de cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina de rata humanizada en donde uno o más segmentos génicos de región variable de cadena ligera o cadena de rata endógena de rata se han reemplazado con uno o segmentos de genes de región variable de cadena más pesada o ligera más humana; y brazos homólogos de rata (por ejemplo, que van desde 5kb a 150kb) complementarios a secuencias diana genómicas específicas. El LTVEC que comprende la modificación genética descrita anteriormente luego se linealiza y se somete a electroporación en las células ES de rata. Las células ES de rata sometidas a electroporación se colocan en placas a una alta densidad para seleccionar células ES resistentes al fármaco que comprenden el vector de direccionamiento. El proceso de selección de medicamentos elimina la mayoría de las células en placa (~99%), dejando atrás colonias individuales, cada una de las cuales es un clon derivado de una sola célula. De las células restantes, la mayoría de las células (-80-100%) contienen el vector de direccionamiento integrado en una ubicación aleatoria en el genoma. Por lo tanto, las colonias se seleccionan y se genotipifican individualmente para identificar células ES de rata que comprenden el vector de direccionamiento en la ubicación genómica correcta (por ejemplo, utilizando el ensayo de modificación del alelo (MOA) descrito anteriormente).
Para aumentar la eficacia de la modificación genética direccionada, las células ES de rata se someten a electroporación con vectores de expresión (o ARNm) que expresan ZFNs 1 y 2 (o TALENs 1 y 2) junto con el LTVEC. Los brazos de homología del vector de direccionamiento se encuentran fuera del sitio de destino de ZFN, por lo tanto, el ZFN no separa el vector de direccionamiento. La ruptura de doble hebra producida por los ZFN estimula la reparación direccionada por homología (HDR), que de otro modo representa un porcentaje muy pequeño de reparaciones que se producen normalmente en células de mamíferos (en comparación con la unión terminal no homóloga; NHEj ).
Alternativamente, se pueden introducir vectores de expresión que contienen una nucleasa asociada a CRISPR de tipo II (por ejemplo, Cas9), un ARN guía (que incluye CRISPR-RNA (ARNcr) y transactivación de CRISPR a Rn (ARNtracr)), como se describe aquí, en las células bacterianas junto con el LTVEC para aumentar la eficacia de la recombinación homóloga en el locus genómico diana. Las células sometidas a electroporación se colocan en placas de alta densidad y se someten a selección de fármacos para encontrar colonias que sean resistentes a los fármacos. Las colonias resistentes al fármaco se seleccionan y criban para la modificación direccionada utilizando el ensayo de modificación del alelo (MOA) como se describe en el presente documento. Siguiendo estos procedimientos, se puede lograr una mejora en la eficiencia de la direccionamiento. Por ejemplo, la cantidad de mejora puede ser pequeña (por ejemplo, mejora de 10% a 15%) o grande (por ejemplo, mejora de 10% a 80%).
Las células ES de rata seleccionadas que comprenden la modificación genética direccionada se introducen luego en un embrión de rata huésped, por ejemplo, un embrión de rata en estadio premórula o blastocisto, y se implantan en el útero de una madre sustituta para generar una rata fundadora (rata F0). Posteriormente, la rata fundadora se cría en una rata de tipo salvaje para crear heterocigotos de progenie F1 para la modificación genética. El apareamiento de la rata F1 heterozigota puede producir una progenie homozigota para la modificación genética.
4.3(a). Reemplazo de IL2rg de rata con gamma de receptor de IL2 humano
La tabla 21 proporciona un resumen de la organización genómica del locus gamma del receptor de interleucina 2 de rata y las posiciones mostradas se tomaron de la compilación 5.0 de la secuencia de referencia del genoma de rata (ENSMBL). IL2rg está en el cromosoma X en la cadena (-).
Tabla 21. Resumen de la organización genómica del locus Il2rg de rata
Características Inicio Fin Longitud Notas
Exón 1 72,021,388 72,021,516 129 contiene ATG
ATG 72,017,500 72,017,502 3 Codón de inicio
Exón2 72,021,007 72,021,160 154
sitio de unión ZEN1a 72,021,014 72,021,028 15 CAGGCCCTGAACCGC (SEQ ID NO: 17)
sitio de corte ZFN1 72,021,008 72,021,013 6 TTCTGG (SEQ ID NO: 18)
sitio de unión ZEN1b 72,020,993 72,021,007 15 GATTACCTGCGCTGGG (SEQ ID NO: 20)
Exón 3 72,020,606 72,020,790 185
Exón 4 72,020,274 72,020,413 140
Características Inicio Fin Longitud Notas
Exón 5 72,019,662 72,019,824 163
Exón 6 72,019,101 72,019,197 97
Exón 7 72,018,844 72,018,910 67
Exón 8 72,017,856 72,018,506 651 contiene TGA
TGA 72,018,321 72,018,323 3 Codón de detención
Eliminación de il2rg 72,018,323 72,021,502 3,180
El esquema inferior en la figura 26 es el vector de direccionamiento para la eliminación de IL2rg 3.2kb. El vector de direccionamiento comprende un gen informador (eGFP) unido operativamente al promotor endógeno y un casete autoeliminable flanqueado por sitios loxP (flechas abiertas). El casete que se elimina automáticamente comprende el gen Crei unido operativamente a un promotor Prm1 de ratón y un casete de selección que comprende un gen de resistencia a neomicina unido operativamente a un promotor de ubiquitina humana.
El gen Crei comprende dos Exones que codifican una recombinasa Cre, que están separados por un intrón (Crei) para evitar su expresión en una célula procariota. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 8,697,851 y la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos 2013-0312129, que describen el casete de autoeliminación en detalle. Al emplear el promotor Prm1 de ratón, el casete de expresión de Cre y el casete de selección de fármaco se pueden eliminar específicamente en células germinales masculinas de rata F0. El vector de direccionamiento se sometió a electroporación en las células ES de rata obtenidas en el Ejemplo 1 y las células se colocaron en placas sobre MEF resistentes a neomicina densa de 15 cm 2x en 2i 10 uM de ROCKi. Las células ES de rata transformadas se cultivaron, seleccionaron y mantuvieron como se describe en el Ejemplo 1.
Como se muestra en la Tabla 23, se examinaron 168 colonias y se obtuvieron 6 clones direccionados. La eficiencia de direccionamiento fue de 3.57%.
Los clones se inyectan en blastocistos como se describe aquí en el Ejemplo 1. Se obtienen clones que producen ratas F0 y se obtienen ratas F0 que transmiten la modificación direccionada a través de la línea germinal.
Ejemplo 4.3(b). Reemplazo del ectodominio IL2rg de rata con el ectodominio IL2rg humano
La humanización de longitud completa del receptor de IL 2 gamma es útil porque las ratas que tienen este locus modificado producirán Il2rg humano; y esto permitiría la detección de Il2rg humano en ratas con anticuerpos específicos para Il2rg humano.
La ectohumanización (es decir, reemplazando el ectodominio de rata de Il2rg con el ectodominio humano de Il2rg) dará como resultado un polipéptido Il2rg que unirá los ligandos humanos para Il2rg, pero debido a que el dominio citoplasmático todavía es rata, su forma ectohumanizada de Il2rg también interactuará con la maquinaria de señalización de rata. La figura 33 proporciona una secuencia de alineación de la proteína IL-2rg humana (SEQ ID NO: 20; NP_000197.1); la proteína IL-2rg de rata (SEQ ID NO: 21; NP_543165.1); y la proteína quimérica IL-2rg (SEQ ID NO: 22) que comprende el ectodominio humano de IL-2rg fusionada con el resto de la proteína IL-2rg de rata. La unión entre la IL-2rg humana y la rata se observa mediante la línea vertical.
La Tabla 22 proporciona un resumen de la organización genómica del locus gamma del receptor de interleucina 2 de rata y las posiciones mostradas se tomaron de la compilación 5.0 de la secuencia de referencia del genoma de rata (ENSMBL). IL2rg está en el cromosoma X en la cadena (-). También se señala la posición del ectodominio de IL2rg.
Tabla 22. Resumen de la organización genómica del locus Il2rg de rata
Características Inicio Fin Longitud Notas
Exón 1 71,111,444 71,111,543 100 contiene ATG
ATG 71,111,537 71,111,539 3 codón de inicio
Exón 2 71,110,897 71,111,050 154
Exón 3 71,110,504 71,110,688 185
Exón 4 71,110,156 71,110,295 140
Características Inicio Fin Longitud Notas
Exón 5 71,109,228 71,109,390 163
Exón 6 71,108,599 71,108,645 47 contiene el dominio transmembrana
Exón 7 71,108,277 71,108,346 70
Exón 8 71,107,404 71,107,921 518 contiene TGA
TGA 71,108,736 71,108,738 3 Codón de detención
humanización integral de longitud
completa 71,107,404 71,111,539 4,136 (ATG a TGA más 3' poli-A)
(ATG al inicio del dominio ectohumanización 71,108,679 71,111,539 2,861 transmembrana)
Se construyeron vectores de direccionamiento de plásmidos para reemplazar el ectodominio de rata de la región codificante gamma del receptor de interleucina 2 con el ectodominio humano como se muestra en la Figura 31. El vector de direccionamiento se sometió a electroporación en las células ES de rata obtenidas en el Ejemplo 1 y las células fueron sembradas en 15 cm 2x de MEF densos resistentes a neomicina en 2i 10 uM ROCKi. Las células ES de rata transformadas se cultivaron, seleccionaron y mantuvieron como se describe en el Ejemplo 1.
Como se muestra en la Tabla 23, se examinaron 192 colonias y se obtuvieron 13 clones direccionados. La eficiencia de direccionamiento fue de 6.77%.
Los clones se inyectan en blastocistos como se describe aquí en el Ejemplo 1. Se obtienen clones que producen ratas F0 y se obtienen ratas F0 que transmiten la modificación direccionada a través de la línea germinal.
Ejemplo 5. Resumen
Tabla 23. Resumen de direccionamiento de rata con diversos tipos de vectores y agentes de nucleasa discutidos en los Ejemplos 3 y 4.
Figure imgf000097_0001

Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Un método para la modificación direccionada de un locus genómico de interés en una célula de rata pluripotente, que comprende:
(a) introducir en la célula de rata pluripotente un vector objetivo grande (LTVEC) que comprende un ácido nucleico inserto flanqueado por un brazo de homología 5' complementario a una primera secuencia de ácidos nucleicos en el locus genómico de interés y un brazo de homología 3' complementario a una segunda secuencia de ácidos nucleicos en el locus genómico de interés, en donde la suma total de los brazos de homología 5' y 3' es al menos 10 kb; y (b) identificar una célula de rata pluripotente modificada genéticamente que comprende una modificación genética direccionada en el locus genómico de interés,
en donde la modificación genética direccionada puede transmitirse a través de la línea germinal;
en donde la célula de rata pluripotente que se usará para la modificación direccionada del locus genómico de interés se puede obtener mediante el cultivo de células madre embrionarias de rata aisladas en una capa de células alimentadoras que no está modificada para expresar el factor inhibidor de la leucemia (LIF) con un medio que comprende aproximadamente 50 U/mL hasta aproximadamente 150 U/mL LIF y una combinación de inhibidores que consiste en un inhibidor de la vía MEK y un inhibidor de GSK3;
en donde la célula de rata pluripotente carece de expresión de c-Myc;
en donde la célula de rata pluripotente forma colonias esféricas, de flotación libre en cultivo; y
en donde la célula de rata pluripotente modificada tiene un cariotipo normal.
2. El método de la reivindicación 1, en donde la modificación genética direccionada es bialélica.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde la célula de rata pluripotente es una célula madre embrionaria de rata (ES).
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la célula de rata pluripotente se caracteriza por la expresión de al menos un marcador de pluripotencia seleccionado del grupo que consiste en Dnmt3L, Eras, Errbeta, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, receptor LIF, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2 y Utf1.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la célula de rata pluripotente se caracteriza por una o más de las siguientes características:
(a) derivado de una cepa DA o una cepa ACI;
(b) falta de expresión de uno o más de los marcadores de pluripotencia Ecat1 y Rexo1;
(c) falta de expresión de uno o más de los marcadores mesodérmicos Brachyury y Bmpr2;
(d) falta de expresión de uno o más de los marcadores endodérmicos Gata6, Sox17 y Sox7; y
(e) falta de expresión de uno o más de los marcadores neuronales Nestin y Pax6.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la concentración de LIF en el medio está entre aproximadamente 75 U/mL y aproximadamente 125 U/mL, preferiblemente entre aproximadamente 90 U/mL y aproximadamente 110 U/mL, y más preferiblemente alrededor de 100 U/mL.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el inhibidor de la ruta de MEK es el inhibidor de MEK PD0325901 y/o el inhibidor de GSK3 es CHIR99021.
8. El método de la reivindicación 7, en donde el inhibidor de la ruta de MEK es el inhibidor de MEK PD0325901 a una concentración de 0.8 pM a 1.2 pM, y el inhibidor de GSK3 es CHIR99021 a una concentración de 2.5 pM a 3.5 pM.
9. El método de la reivindicación 8, en donde la concentración de LIF en el medio es de aproximadamente 100 U/mL, el inhibidor de la vía MEK es el inhibidor de MEK PD0325901 a una concentración de aproximadamente 1 pM, y el inhibidor de GSK3 es CHIR99021 a una concentración de aproximadamente 3 pM.
10. El método de la reivindicación 9, en donde el medio comprende: medio basal DMEM/F12 a una concentración de 1x; medio neurobasal a una concentración de 1x; penicilina/estreptomicina a una concentración del 1%; L-glutamina a una concentración de 4 mM; 2-mercaptoetanol a una concentración de 0.1 mM; suplemento de N2 a una concentración de 1x; suplemento B27 a una concentración 1x; LIF a una concentración de 100U/mL; PD0325901 a una concentración de 1 pM, y CHIR99021 a una concentración de 3 pM.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde:
(a) la suma total de los brazos de homología 5' y 3' del LTVEC es de aproximadamente 10 kb a aproximadamente 20 kb, de aproximadamente 20 kb a aproximadamente 40 kb, de aproximadamente 40 kb a aproximadamente 60 kb, de aproximadamente 60 kb a aproximadamente 80 kb, desde aproximadamente 80 kb a aproximadamente 100 kb, desde aproximadamente 100 kb a aproximadamente 120 kb, o desde aproximadamente 120 kb a aproximadamente 150 kb; o
(b) la suma total de los brazos de homología 5' y 3' de LTVEC es de aproximadamente 16 kb a aproximadamente 150 kb.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la modificación genética direccionada comprende:
(a) reemplazo de una secuencia endógena de ácido nucleico de rata con una secuencia homóloga u ortóloga de ácido nucleico;
(b) eliminación de una secuencia endógena de ácido nucleico de rata;
(c) eliminación de una secuencia endógena de ácido nucleico de rata,
en donde la eliminación varía de aproximadamente 5kb a aproximadamente 10kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 20kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, de aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, de aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, de aproximadamente 80kb a aproximadamente 100kb, desde aproximadamente 100kb a aproximadamente 150kb, desde aproximadamente 150kb a aproximadamente 200kb, desde aproximadamente 200kb a aproximadamente 300kb, desde aproximadamente 300kb a aproximadamente 400kb, desde aproximadamente 400kb a aproximadamente 500kb, desde aproximadamente 500kb hasta aproximadamente 1Mb, desde aproximadamente 1Mb hasta aproximadamente 1.5Mb, desde aproximadamente 1.5Mb hasta aproximadamente 2Mb, desde aproximadamente 2Mb hasta aproximadamente 2.5Mb, o desde aproximadamente 2.5Mb hasta aproximadamente 3Mb;
(d) una secuencia de ácidos nucleicos exógena que varía de aproximadamente 5kb a aproximadamente 10kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 20kb, de aproximadamente 20 kb a aproximadamente 40kb, de aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, de aproximadamente 60 kb a aproximadamente 80kb, de aproximadamente 80kb a aproximadamente 100kb, de aproximadamente 100 kb a aproximadamente 150kb, de aproximadamente 150kb a aproximadamente 200kb, de aproximadamente 200 kb a aproximadamente 250kb, de aproximadamente 250kb a aproximadamente 300kb, de aproximadamente 300 kb a aproximadamente 350kb, o desde aproximadamente 350kb a aproximadamente 400kb;
(e) una secuencia de ácidos nucleicos exógena que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que es homóloga u ortóloga a una secuencia de ácidos nucleicos de rata endógena;
(f) una secuencia de ácidos nucleicos quimérica que comprende una secuencia de ácidos nucleicos humana y una secuencia de ácidos nucleicos de rata;
(g) un alelo condicional flanqueado por secuencias diana de recombinasa específicas del sitio; o
(h) un gen informador unido operativamente a un promotor activo en una célula de rata.
13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde la modificación genética direccionada comprende:
(i) inserción de una secuencia de ácidos nucleicos humana que es homóloga u ortóloga a una secuencia de ácidos nucleicos de rata en un locus genómico endógeno;
(ii) reemplazo de la secuencia de ácidos nucleicos de rata en el locus genómico endógeno con la secuencia de ácidos nucleicos humana homóloga u ortóloga;
(iii) una secuencia de ácidos nucleicos quimérica que comprende una secuencia de ácidos nucleicos humana y una secuencia de ácidos nucleicos de rata; o
(iv) una combinación de los mismos.
14. El método de la reivindicación 13, en donde el tamaño de la inserción o reemplazo es de aproximadamente 5kb a aproximadamente 10kb, de aproximadamente 10kb a aproximadamente 20kb, de aproximadamente 20kb a aproximadamente 40kb, de aproximadamente 40kb a aproximadamente 60kb, de aproximadamente 60kb a aproximadamente 80kb, de aproximadamente 80kb a aproximadamente 100kb, de aproximadamente 100kb a aproximadamente 150kb, de aproximadamente 150kb a aproximadamente 200kb, de aproximadamente 200kb a aproximadamente 250kb, de aproximadamente 250kb a aproximadamente 300kb, desde aproximadamente 300kb a aproximadamente 350kb, o desde aproximadamente 350kb a aproximadamente 400kb.
15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde introducir la etapa (a) comprende además introducir un ácido nucleico que codifica un agente de nucleasa que promueve una recombinación homóloga entre el LTVEC y el locus genómico de interés en la célula de rata pluripotente.
16. El método de la reivindicación 15, en donde el agente de nucleasa comprende:
(a) una nucleasa de dedo de zinc; o
(b) una nucleasa efectora de tipo activador de transcripción (TALEN).
17. El método de la reivindicación 15, en donde el agente de nucleasa comprende un sistema CRISPR/Cas que comprende una nucleasa Cas9 y una ARN guía (ARNg) que comprende un ARNr-ARNtracr fusionado.
18. El método de la reivindicación 17, en donde:
(a) El ARNg comprende:
(i) un ARN quimérico de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 2; o
(ii) un ARN quimérico de la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 3;
(b) el ARNcr comprende la SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; o SEQ ID NO: 6;
o
(c) el ARNtracr comprende la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 8.
19. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en donde la etapa de identificación emplea un ensayo cuantitativo para evaluar una modificación del alelo (MOA) en el locus genómico de interés.
20. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-19, en donde el locus genómico diana es un locus gamma del receptor de interleucina-2, un locus ApoE, un locus Rag1, un locus Rag2 o un locus Rag2/Rag1.
21. Un método para la modificación direccionada de un locus genómico de interés en una célula de rata pluripotente, que comprende:
(a) direccionar un locus genómico de interés en una célula de rata pluripotente según el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-20 para formar una célula de rata pluripotente modificada genéticamente, en donde el ácido nucleico de inserción comprende un ácido nucleico humano; y
(b) introducir célula de rata pluripotente modificada genéticamente en un embrión de rata huésped.
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Families Citing this family (163)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3960865A1 (en) 2010-08-02 2022-03-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice that make binding proteins comprising vl domains
EP3613852A3 (en) 2011-07-22 2020-04-22 President and Fellows of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
PL2847335T3 (pl) * 2012-04-25 2019-01-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Celowanie dużymi wektorami do celowania wspomagane nukleazą
JP6343605B2 (ja) 2012-05-25 2018-06-13 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア Ｒｎａ依存性標的ｄｎａ修飾およびｒｎａ依存性転写調節のための方法および組成物
PL2928496T3 (pl) 2012-12-06 2020-04-30 Sigma-Aldrich Co. Llc Modyfikacja i regulacja genomu w oparciu o CRISPR
CN105121631B (zh) 2013-02-20 2019-04-19 瑞泽恩制药公司 大鼠的遗传修饰
EP3741868B1 (en) 2013-03-15 2024-05-22 The General Hospital Corporation Rna-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
CN105308184B (zh) 2013-04-16 2020-06-02 瑞泽恩制药公司 大鼠基因组的靶向修饰
US10011850B2 (en) 2013-06-21 2018-07-03 The General Hospital Corporation Using RNA-guided FokI Nucleases (RFNs) to increase specificity for RNA-Guided Genome Editing
EP3022304B1 (en) * 2013-07-19 2018-12-26 Larix Biosciences LLC Methods and compositions for producing double allele knock outs
CA2917714A1 (en) 2013-08-07 2015-02-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Lincrna-deficient non-human animals
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
EP2877571B1 (en) * 2013-09-18 2018-05-30 Kymab Limited Methods, cells and organisms
KR102523466B1 (ko) 2013-11-07 2023-04-20 에디타스 메디신, 인코포레이티드 지배적인 gRNA를 이용하는 CRISPR-관련 방법 및 조성물
EP3460063B1 (en) * 2013-12-11 2024-03-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the targeted modification of a genome
RU2685914C1 (ru) * 2013-12-11 2019-04-23 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Способы и композиции для направленной модификации генома
US20150166982A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting pi3k point mutations
CN106255410B (zh) 2014-03-21 2020-01-10 瑞泽恩制药公司 产生单结构域结合蛋白的非人动物
KR20160131118A (ko) 2014-03-21 2016-11-15 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 상이한 결합 특징을 전시하는 vl 항원 결합 단백질
JP6212659B2 (ja) 2014-05-30 2017-10-11 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ヒト化ジペプチジルペプチダーゼｉｖ（ｄｐｐ４）動物
PL3152312T3 (pl) 2014-06-06 2020-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Sposoby i kompozycje do modyfikowania docelowego locus
CN106604994B (zh) 2014-06-23 2021-12-14 通用医疗公司 通过测序评估的DSBs的全基因组无偏鉴定(GUIDE-Seq)
LT3161128T (lt) 2014-06-26 2018-10-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Būdai ir kompozicijos, skirti tikslinei genetinei modifikacijai, ir panaudojimo būdai
CA2956224A1 (en) 2014-07-30 2016-02-11 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
CN107002042A (zh) 2014-10-15 2017-08-01 瑞泽恩制药公司 用于产生或维持多能细胞的方法和组合物
KR102683423B1 (ko) * 2014-11-21 2024-07-10 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 쌍 형성된 가이드 rna를 사용하는 표적화된 유전자 변형을 위한 방법 및 조성물
KR102629128B1 (ko) 2014-12-03 2024-01-25 애질런트 테크놀로지스, 인크. 화학적 변형을 갖는 가이드 rna
AU2015360667B2 (en) * 2014-12-09 2021-09-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 274 gene
CN107208113A (zh) 2014-12-19 2017-09-26 瑞泽恩制药公司 用于通过单步多重靶向进行靶向遗传修饰的方法和组合物
EP3245232B1 (en) 2015-01-12 2021-04-21 The Regents of The University of California Heterodimeric cas9 and methods of use thereof
EP3250689B1 (en) 2015-01-28 2020-11-04 The Regents of The University of California Methods and compositions for labeling a single-stranded target nucleic acid
AU2016226077B2 (en) 2015-03-03 2021-12-23 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificity
AU2016233250C1 (en) 2015-03-16 2022-08-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animal exhibiting diminished upper and lower motor neuron function and sensory perception
CN107438622A (zh) 2015-03-19 2017-12-05 瑞泽恩制药公司 选择结合抗原的轻链可变区的非人动物
CA2981715A1 (en) 2015-04-06 2016-10-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chemically modified guide rnas for crispr/cas-mediated gene regulation
EP3689139A1 (en) 2015-05-29 2020-08-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a disruption in a c9orf72 locus
EP3303634B1 (en) 2015-06-03 2023-08-30 The Regents of The University of California Cas9 variants and methods of use thereof
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
US9926546B2 (en) 2015-08-28 2018-03-27 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
JP6799586B2 (ja) 2015-08-28 2020-12-16 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 遺伝子操作ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ
CA2995248A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Rodent model of prostate cancer
CN105177110A (zh) * 2015-09-11 2015-12-23 中国科学院微生物研究所 核酸的检测方法
WO2017044843A1 (en) 2015-09-11 2017-03-16 The General Hospital Corporation Full interrogation of nuclease dsbs and sequencing (find-seq)
WO2017053729A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Nuclease-mediated genome editing of primary cells and enrichment thereof
WO2017059313A1 (en) 2015-09-30 2017-04-06 The General Hospital Corporation Comprehensive in vitro reporting of cleavage events by sequencing (circle-seq)
WO2017070632A2 (en) 2015-10-23 2017-04-27 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
ES2872799T3 (es) 2015-11-20 2021-11-02 Regeneron Pharma Animales no humanos que tienen un gen 3 de activación linfocitaria humanizado
WO2017143071A1 (en) 2016-02-18 2017-08-24 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for gene editing in stem cells
AU2017228293B2 (en) 2016-02-29 2023-05-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Rodents having a humanized Tmprss gene
EP3429567B1 (en) 2016-03-16 2024-01-10 The J. David Gladstone Institutes Methods and compositions for treating obesity and/or diabetes and for identifying candidate treatment agents
WO2017201476A1 (en) * 2016-05-20 2017-11-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for breaking immunological tolerance using multiple guide rnas
US20210010022A1 (en) * 2016-05-27 2021-01-14 Cambridge Enterprise Limited Novel nucleic acid construct
LT3462853T (lt) 2016-06-03 2023-03-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Graužikai, vykdantys egzogeninės terminalinės deoksinukleotidiltransferazės raišką
US10767175B2 (en) 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
US10221395B2 (en) 2016-06-16 2019-03-05 Cedars-Sinai Medical Center Efficient method for reprogramming blood to induced pluripotent stem cells
US11572545B2 (en) 2016-06-16 2023-02-07 Cedars-Sinai Medical Center Efficient method for reprogramming blood to induced pluripotent stem cells
MX2019001211A (es) 2016-07-29 2019-09-16 Regeneron Pharma Ratones que comprenden mutaciones que dan lugar a la expresión de la fibrilina-1 truncada en c.
IL264565B2 (en) 2016-08-03 2024-07-01 Harvard College Adenosine nuclear base editors and their uses
AU2017308889B2 (en) 2016-08-09 2023-11-09 President And Fellows Of Harvard College Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
CN107815465B (zh) 2016-08-31 2021-03-16 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
US11279948B2 (en) 2016-08-31 2022-03-22 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric OX40
MX2019003674A (es) 2016-09-30 2021-01-08 Univ California Enzimas modificadoras de ácido nucleico guiadas por arn y métodos de uso de estas.
MX2019003745A (es) 2016-09-30 2019-12-11 Regeneron Pharma Animales no humanos que tienen una expansion de repeticiones de hexanucleotidos en un locus c9orf72.
US10669539B2 (en) 2016-10-06 2020-06-02 Pioneer Biolabs, Llc Methods and compositions for generating CRISPR guide RNA libraries
EP3526320A1 (en) 2016-10-14 2019-08-21 President and Fellows of Harvard College Aav delivery of nucleobase editors
EP3554546A4 (en) 2016-12-14 2021-04-14 Ligandal, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR ADMINISTRATION OF NUCLEIC ACID AND PROTEIN PAYLOADS
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
EP3570668A1 (en) 2017-01-19 2019-11-27 Open Monoclonal Technology, Inc. Human antibodies from transgenic rodents with multiple heavy chain immunoglobulin loci
EP3583201B1 (en) 2017-02-14 2024-01-17 University of Pittsburgh - Of the Commonwealth System of Higher Education Methods of engineering human induced pluripotent stem cells to produce liver tissue
CN110461146A (zh) 2017-02-27 2019-11-15 再生元制药公司 视网膜劈裂的非人类动物模型
WO2018165504A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
CN108467873B (zh) * 2017-03-17 2020-03-13 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 一种cd132基因缺失的免疫缺陷动物模型的制备方法及应用
IL269458B2 (en) 2017-03-23 2024-02-01 Harvard College Nucleic base editors that include nucleic acid programmable DNA binding proteins
CN106987604B (zh) * 2017-03-29 2021-05-28 北京希诺谷生物科技有限公司 一种制备动脉粥样硬化疾病模型犬的方法
US12060572B2 (en) 2017-04-20 2024-08-13 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Recombination activating gene (RAG) induced V(D)J gene targeting
WO2018195545A2 (en) 2017-04-21 2018-10-25 The General Hospital Corporation Variants of cpf1 (cas12a) with altered pam specificity
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
JP2020521451A (ja) 2017-05-25 2020-07-27 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 望ましくないオフターゲット塩基エディター脱アミノ化を制限するためのスプリットデアミナーゼの使用
CN109136273B (zh) * 2017-06-16 2022-09-27 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 制备免疫缺陷的大鼠的方法及其应用
JP2020534795A (ja) 2017-07-28 2020-12-03 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ファージによって支援される連続的進化（ｐａｃｅ）を用いて塩基編集因子を進化させるための方法および組成物
MX2020001178A (es) 2017-07-31 2020-09-25 Regeneron Pharma Celulas madre embrionarias de raton transgenico con cas y ratones y usos de los mismos.
BR112020001996A2 (pt) 2017-07-31 2020-08-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. animal não humano, e, métodos para testar e para otimizar a capacidade de uma crispr/cas nuclease de excisar um ácido nucleico genômico in vivo, para testar a recombinação induzida por crispr/cas de um ácido nucleico genômico com um ácido nucleico de doador exógeno in vivo e para otimizar a capacidade de crispr/cas de induzir a recombinação de um ácido nucleico genômico com um ácido nucleico de doador exógeno in vivo.
CN111278450B (zh) 2017-08-23 2024-04-09 通用医疗公司 具有改变的PAM特异性的工程化的CRISPR-Cas9核酸酶
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
JP2020534812A (ja) * 2017-09-08 2020-12-03 ライフ テクノロジーズ コーポレイション 改良された相同組換えおよびその組成物のための方法
US11572574B2 (en) 2017-09-28 2023-02-07 Toolgen Incorporated Artificial genome manipulation for gene expression regulation
RU2022103641A (ru) * 2017-09-28 2022-03-18 Тулджен Инкорпорейтед Искусственная модификация генома для регуляции экспрессии гена
WO2019067872A1 (en) * 2017-09-29 2019-04-04 Intellia Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR EDITING THE TTR GENE AND TREATING AMYLOID DOSE ATTR
CN111163633B (zh) 2017-09-29 2022-09-09 瑞泽恩制药公司 包含人源化ttr基因座的非人类动物及其使用方法
FI3687287T3 (fi) 2017-09-29 2023-10-12 Regeneron Pharma Humanisoitua c1q-kompleksia ilmentävät jyrsijät
US11725228B2 (en) 2017-10-11 2023-08-15 The General Hospital Corporation Methods for detecting site-specific and spurious genomic deamination induced by base editing technologies
EP3697906A1 (en) 2017-10-16 2020-08-26 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
CN111655031B (zh) 2017-11-30 2022-11-18 瑞泽恩制药公司 包含人源化trkb基因座的非人动物
RS63772B1 (sr) 2017-12-05 2022-12-30 Regeneron Pharma Miševi koji imaju modifikovani lambda laki lanac imunoglobulina i njihove upotrebe
KR102647714B1 (ko) 2018-03-19 2024-03-18 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 CRISPR/Cas 시스템을 사용한 동물에서의 전사 조절
SG11202008799PA (en) 2018-03-24 2020-10-29 Regeneron Pharma Genetically modified non-human animals for generating therapeutic antibodies against peptide-mhc complexes, methods of making and uses thereof
EP3772926A1 (en) 2018-03-26 2021-02-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized rodents for testing therapeutic agents
CN112204148B (zh) * 2018-03-27 2024-04-30 宾夕法尼亚大学董事会 具有增强功能的修饰的免疫细胞及其筛选方法
EP3781585A4 (en) 2018-04-17 2022-01-26 The General Hospital Corporation SENSITIVE IN VITRO TESTS FOR SUBSTRATE PREFERENCES AND SITE FOR NUCLEIC ACID BINDERS, MODIFIERS AND CLEAVAGE AGENTS
CN108624622A (zh) * 2018-05-16 2018-10-09 湖南艾佳生物科技股份有限公司 一种基于CRISPR-Cas9系统构建的能分泌小鼠白细胞介素-6的基因工程细胞株
CN109868285A (zh) * 2018-05-29 2019-06-11 江苏艾尔康生物医药科技有限公司 一种免疫缺陷大鼠动物模型的构建方法及应用
US10463029B1 (en) 2018-06-07 2019-11-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Rodent model of steel syndrome
EP3806627A1 (en) 2018-06-13 2021-04-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. A rodent model of fibrodysplasia ossificans progressiva
AU2019287727B2 (en) 2018-06-14 2022-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals capable of DH-DH rearrangement in the immunoglobulin heavy chain coding sequences
US20210285009A1 (en) 2018-07-13 2021-09-16 The Regents Of The University Of California Retrotransposon-based delivery vehicle and methods of use thereof
EP3823443B1 (en) 2018-07-16 2024-05-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Rodent models of ditra disease and uses thereof
WO2020047124A1 (en) * 2018-08-28 2020-03-05 Flagship Pioneering, Inc. Methods and compositions for modulating a genome
KR102545031B1 (ko) 2018-09-13 2023-06-20 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 C3 사구체병증 모델로서의 보체 인자 h 유전자 녹아웃 래트
US11407995B1 (en) 2018-10-26 2022-08-09 Inari Agriculture Technology, Inc. RNA-guided nucleases and DNA binding proteins
US11434477B1 (en) 2018-11-02 2022-09-06 Inari Agriculture Technology, Inc. RNA-guided nucleases and DNA binding proteins
CN109504708A (zh) * 2018-12-03 2019-03-22 江苏集萃药康生物科技有限公司 一种筛选标记自我删除的基因打靶载体及方法
CA3120799A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated repeat expansion
SG11202106423PA (en) 2019-01-17 2021-07-29 Regeneron Pharma A rodent model of mood disorders
US11946040B2 (en) 2019-02-04 2024-04-02 The General Hospital Corporation Adenine DNA base editor variants with reduced off-target RNA editing
US20220145330A1 (en) 2019-02-10 2022-05-12 The J. David Gladstone Institutes, a testamentary trust established under the Will of J. David Glads Modified mitochondrion and methods of use thereof
CN112400022B (zh) * 2019-02-18 2023-06-30 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 具有人源化免疫球蛋白基因座的经遗传修饰的非人动物
CA3131145A1 (en) * 2019-02-21 2020-08-27 Nemametrix Inc Monogenic or polygenic disease model organisms humanized with two or more genes
EP3927153A1 (en) 2019-02-22 2021-12-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Rodents having genetically modified sodium channels and methods of use thereof
EP3935156A4 (en) 2019-03-07 2022-12-28 The Regents of The University of California CRISPR-CAS EFFECTOR POLYPEPTIDES AND METHODS OF USE
US20200288683A1 (en) 2019-03-15 2020-09-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Loss of function rodent model of solute carrier 39 member 5
JP2022527740A (ja) 2019-03-19 2022-06-06 ザ ブロード インスティテュート，インコーポレーテッド 編集ヌクレオチド配列を編集するための方法および組成物
WO2020206139A1 (en) 2019-04-04 2020-10-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized coagulation factor 12 locus
CA3137761A1 (en) 2019-06-04 2020-12-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus with a beta-slip mutation and methods of use
AU2020289554A1 (en) 2019-06-05 2021-11-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a limited lambda light chain repertoire expressed from the kappa locus and uses thereof
CA3137764A1 (en) 2019-06-07 2020-12-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized albumin locus
KR20220024134A (ko) 2019-06-27 2022-03-03 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 Tdp-43 단백질이상질환 모델링
US11825819B2 (en) 2019-10-03 2023-11-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crnn loss of function rodent model
WO2021108363A1 (en) 2019-11-25 2021-06-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-mediated upregulation of humanized ttr allele
US20220354097A1 (en) * 2019-12-25 2022-11-10 Gempharmatech Co., Ltd. Il-15 humanized mouse model and use thereof
US20210227812A1 (en) 2020-01-28 2021-07-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized pnpla3 locus and methods of use
US20230081547A1 (en) 2020-02-07 2023-03-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized klkb1 locus and methods of use
KR20220150295A (ko) 2020-03-04 2022-11-10 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 B4galt1-매개 기능의 설치류 모델
CN113355325B (zh) * 2020-03-06 2023-07-14 中国科学院广州生物医药与健康研究院 人源化ace2基因改造小鼠胚胎干细胞模型制备方法及应用
CN113355323B (zh) * 2020-03-06 2023-07-11 生物岛实验室 人源化ace2基因改造小鼠模型的制备方法及应用
US20230102342A1 (en) 2020-03-23 2023-03-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use
US20230172170A1 (en) 2020-04-21 2023-06-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized cxcl13 gene
IL297761A (en) 2020-05-08 2022-12-01 Broad Inst Inc Methods and compositions for simultaneously editing two helices of a designated double-helix nucleotide sequence
AU2021283564A1 (en) 2020-06-02 2022-12-08 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animals with common light chain immunoglobulin locus
EP4221496A1 (en) 2020-10-01 2023-08-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Rodent animals expressing human cr1
KR20230124973A (ko) 2020-12-21 2023-08-28 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 tslp 유전자, 인간화 tslp 수용체 유전자, 및/또는인간화 il7ra 유전자를 갖는 비인간 동물
CN112852875B (zh) * 2021-02-26 2022-10-21 福建省立医院 示踪肿瘤T淋巴细胞浸润的CD3e转基因小鼠模型的构建方法
CN113229213B (zh) * 2021-05-14 2022-06-14 福州大学 通过近红外荧光探针标记血栓实现肺栓塞造模及无创定量检测的方法
KR20240055811A (ko) 2021-09-10 2024-04-29 애질런트 테크놀로지스, 인크. 프라임 편집을 위한 화학적 변형을 갖는 가이드 rna
WO2023081756A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Precise genome editing using retrons
IL312971A (en) 2021-12-08 2024-07-01 Regeneron Pharma Mutant myocilin disease model and uses thereof
US20230279442A1 (en) 2021-12-15 2023-09-07 Versitech Limited Engineered cas9-nucleases and method of use thereof
WO2023141602A2 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2023150798A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for defining optimal treatment timeframes in lysosomal disease
IL314673A (en) 2022-02-11 2024-10-01 Regeneron Pharma Compositions and methods for screening 4R tau-targeted substances
WO2023212560A1 (en) 2022-04-26 2023-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. A rodent model of fibrodysplasia ossificans progressiva
WO2023235677A1 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Animal model of tdp-43 proteinopathy
US20230417899A1 (en) 2022-06-27 2023-12-28 Oshkosh Corporation Position tracking for a lift device
WO2024020346A2 (en) 2022-07-18 2024-01-25 Renagade Therapeutics Management Inc. Gene editing components, systems, and methods of use
WO2024020057A1 (en) 2022-07-19 2024-01-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified animal model and its use to model the human immune system
WO2024044723A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
US20240224964A9 (en) 2022-09-29 2024-07-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Correction of hepatosteatosis in humanized liver animals through restoration of il6/il6r/gp130 signaling in human hepatocytes

Family Cites Families (229)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT87133B (pt) 1987-04-02 1992-07-31 Amrad Corp Ltd Metodo de purificacao do factor inibidor da leucemia (lif) e de composicoes farmaceuticas contendo polipeptidos com actividade do lif
WO1995006716A1 (en) 1993-08-30 1995-03-09 Northwestern University Rat pluripotent embryonic stem cells and method of obtaining and using same
JP2000505294A (ja) 1996-02-16 2000-05-09 ザ ユニバーシティ オブ エディンバラ 分化の阻害のためのｄｉａ／ｌｉｆ―欠損胚幹細胞により発現されるサイトカイン
US5830729A (en) 1996-04-18 1998-11-03 Institut Pasteur I Sce I-induced gene replacement and gene conversion in embryonic stem cells
US6136566A (en) 1996-10-04 2000-10-24 Lexicon Graphics Incorporated Indexed library of cells containing genomic modifications and methods of making and utilizing the same
AU8587598A (en) 1997-07-26 1999-02-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Trans-species nuclear transfer
WO2000039316A1 (en) * 1998-12-31 2000-07-06 The J. David Gladstone Institutes Transgenic rodents and rodent cell lines expressing hiv co-receptors
US6599692B1 (en) 1999-09-14 2003-07-29 Sangamo Bioscience, Inc. Functional genomics using zinc finger proteins
EP1147209A2 (en) 1999-02-03 2001-10-24 The Children's Medical Center Corporation Gene repair involving the induction of double-stranded dna cleavage at a chromosomal target site
US20030104526A1 (en) 1999-03-24 2003-06-05 Qiang Liu Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
CA2394850C (en) 1999-12-06 2012-02-07 Sangamo Biosciences, Inc. Methods of using randomized libraries of zinc finger proteins for the identification of gene function
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US7105348B2 (en) 2000-10-31 2006-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US20050144655A1 (en) 2000-10-31 2005-06-30 Economides Aris N. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
WO2002046412A2 (en) 2000-12-07 2002-06-13 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins
ES2389251T3 (es) 2000-12-19 2012-10-24 Altor Bioscience Corporation Animales transgénicos que comprenden un sistema inmunitario humanizado
US7947469B2 (en) 2001-01-22 2011-05-24 Gendaq, Ltd. Modulation of HIV infection
WO2002057293A2 (en) 2001-01-22 2002-07-25 Sangamo Biosciences, Inc. Modified zinc finger binding proteins
NZ527527A (en) 2001-02-14 2005-08-26 Leo T Mammalian multipotent adult stem cells (MASC) with the capacity to differentiate into cells of mesodermal, ectodermal or endodermal origin and uses thereof
AUPR451401A0 (en) 2001-04-20 2001-05-24 Monash University A method of nuclear transfer
US8106255B2 (en) 2002-01-23 2012-01-31 Dana Carroll Targeted chromosomal mutagenasis using zinc finger nucleases
DK1485475T3 (da) 2002-03-15 2008-01-21 Cellectis Hybrid meganuklease og enkeltkædet maganuklease og brug deraf
US20030232410A1 (en) 2002-03-21 2003-12-18 Monika Liljedahl Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
US7612250B2 (en) 2002-07-29 2009-11-03 Trustees Of Tufts College Nuclear transfer embryo formation method
US9447434B2 (en) 2002-09-05 2016-09-20 California Institute Of Technology Use of chimeric nucleases to stimulate gene targeting
AU2003290518A1 (en) 2002-09-06 2004-04-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions concerning designed highly-specific nucleic acid binding proteins
US20030175968A1 (en) 2002-10-30 2003-09-18 Golic Kent G. Gene targeting method
US7344886B2 (en) 2002-11-29 2008-03-18 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co., Kg Neomycin-phosphotransferase-genes and methods for the selection of recombinant cells producing high levels of a desired gene product
AU2004204509A1 (en) 2003-01-13 2004-07-29 Mario R. Capecchi Persistent expression of candidate molecule in proliferating stem and progenitor cells for delivery of therapeutic products
GB2398784B (en) 2003-02-26 2005-07-27 Babraham Inst Removal and modification of the immunoglobulin constant region gene cluster of a non-human mammal
WO2005001087A2 (en) 2003-06-11 2005-01-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying genes in eukaryotic cells
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US8409861B2 (en) 2003-08-08 2013-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted deletion of cellular DNA sequences
EP1726640B1 (en) 2004-03-04 2016-01-13 Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. Rat embryonic stem cell
EP1591521A1 (en) 2004-04-30 2005-11-02 Cellectis I-Dmo I derivatives with enhanced activity at 37 degrees C and use thereof
EP1789540B9 (en) 2004-09-03 2012-02-22 Moraga Biotechnology Inc. Non-embryonic totipotent blastomer-like stem cells and methods therefor
CA2579677A1 (en) 2004-09-16 2006-03-30 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions and methods for protein production
EP1802193B1 (en) 2004-10-19 2014-04-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for generating a mouse homozygous for a genetic modification
FR2879622B1 (fr) 2004-12-17 2008-02-01 Agronomique Inst Nat Rech Procede in vitro de production d'ovocytes ou d'oeufs presentant une modification genomique ciblee
WO2006097784A1 (en) 2005-03-15 2006-09-21 Cellectis I-crei meganuclease variants with modified specificity, method of preparation and uses thereof
ATE466933T1 (de) 2005-03-15 2010-05-15 Cellectis I-crei-meganuklease-varianten mit modifizierter spezifität sowie verfahren zu ihrer herstellung und verwendung
US10022457B2 (en) 2005-08-05 2018-07-17 Gholam A. Peyman Methods to regulate polarization and enhance function of cells
US9074180B2 (en) 2006-03-30 2015-07-07 The University Court Of The University Of Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitors, and uses thereof
GB0615327D0 (en) 2006-03-30 2006-09-13 Univ Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitors and uses thereof
CA2638774C (en) * 2006-03-31 2015-11-24 Medarex, Inc. Transgenic animals expressing chimeric antibodies for use in preparing human antibodies
CN101117633B (zh) 2006-08-03 2011-07-20 上海交通大学附属儿童医院 一种细胞核移植方法
EP2415873B1 (en) 2006-12-14 2015-01-21 Dow AgroSciences LLC Optimized non-canonical zinc finger proteins
US7771967B2 (en) * 2006-12-22 2010-08-10 The J. David Gladstone Institutes Nucleic acid encoding apolipoprotein E-I3
US10155038B2 (en) 2007-02-02 2018-12-18 Yale University Cells prepared by transient transfection and methods of use thereof
DE602008003684D1 (de) 2007-04-26 2011-01-05 Sangamo Biosciences Inc Gezielte integration in die ppp1r12c-position
PL2336329T3 (pl) 2007-06-01 2013-04-30 Omt Inc Kompozycje i sposoby hamowania endogennych genów immunoglobulin i wytwarzanie transgenicznych ludzkich idiotypowych przeciwciał
CN102159722B (zh) 2008-08-22 2014-09-03 桑格摩生物科学股份有限公司 用于靶向单链切割和靶向整合的方法和组合物
US20100076057A1 (en) 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
EP2180058A1 (en) 2008-10-23 2010-04-28 Cellectis Meganuclease recombination system
US20110030072A1 (en) 2008-12-04 2011-02-03 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of immunodeficiency genes in animals
AU2009322964B2 (en) * 2008-12-04 2014-10-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Genome editing in rats using zinc-finger nucleases
BRPI0922572A2 (pt) 2008-12-17 2019-09-24 Scripps Research Inst método para cultivar células pluripotentes, cultura de células de mamífero pluripotentes, meio de cultura de célula, célula animal pluripotente isolada, e, método para aumentar a pluripotência de uma célula de mamífero.
US20110239315A1 (en) 2009-01-12 2011-09-29 Ulla Bonas Modular dna-binding domains and methods of use
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
WO2010107493A2 (en) 2009-03-20 2010-09-23 Sangamo Biosciences, Inc. Modification of cxcr4 using engineered zinc finger proteins
US8722964B2 (en) 2009-04-23 2014-05-13 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. Genetically engineered or transgenic rats exhibiting a cancer phenotype due to a disruption of germline tumor suppressor genes
US8772008B2 (en) 2009-05-18 2014-07-08 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for increasing nuclease activity
EP2449112A1 (en) 2009-07-01 2012-05-09 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. Genetically modified rat models for severe combined immunodeficiency (scid)
EP2456876A2 (en) 2009-07-24 2012-05-30 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. Genetically modified rat models for cytokine-cytokine signaling pathways
CN102858985A (zh) * 2009-07-24 2013-01-02 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 基因组编辑方法
WO2011011767A1 (en) 2009-07-24 2011-01-27 Sigma-Aldrich Co. Method for genome editing
US20120178647A1 (en) 2009-08-03 2012-07-12 The General Hospital Corporation Engineering of zinc finger arrays by context-dependent assembly
US8518392B2 (en) 2009-08-14 2013-08-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Promoter-regulated differentiation-dependent self-deleting cassette
US20120276537A1 (en) 2009-10-28 2012-11-01 Kuehn Ralf Homologous recombination in the oocyte
CN102666854B (zh) 2009-10-29 2016-08-24 瑞泽恩制药公司 多功能等位基因
US20120315670A1 (en) 2009-11-02 2012-12-13 Gen9, Inc. Compositions and Methods for the Regulation of Multiple Genes of Interest in a Cell
US9309537B2 (en) * 2009-12-01 2016-04-12 National Cancer Center Chimeric rat produced using rat embryonic stem cells in the presence of an ES cell differentiation suppressant
PL2816112T3 (pl) 2009-12-10 2019-03-29 Regents Of The University Of Minnesota Modyfikacja DNA za pośrednictwem efektorów TAL
WO2011078665A1 (en) 2009-12-21 2011-06-30 Keygene N.V. Improved techniques for transfecting protoplasts
WO2011091311A2 (en) 2010-01-22 2011-07-28 Dow Agrosciences Llc Excision of transgenes in genetically modified organisms
WO2011100058A1 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules
EP2571512B1 (en) 2010-05-17 2017-08-23 Sangamo BioSciences, Inc. Novel dna-binding proteins and uses thereof
GB201009732D0 (en) 2010-06-10 2010-07-21 Gene Bridges Gmbh Direct cloning
PT2579711T (pt) 2010-06-11 2019-06-11 Regeneron Pharma Produção de fêmeas férteis xy a partir de células es xy
WO2012012667A2 (en) 2010-07-21 2012-01-26 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modification of a hla locus
WO2012018726A1 (en) 2010-08-02 2012-02-09 Cellectis Sa Method for increasing double-strand break-induced gene targeting
US9402377B2 (en) 2010-09-20 2016-08-02 Yale University Human SIRPAalpha transgenic animals and their methods of use
DK3375284T3 (da) 2011-02-15 2023-06-12 Univ Yale Humaniserede M-CSF-mus og anvendelser deraf
WO2012129198A1 (en) * 2011-03-23 2012-09-27 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. Genetically modified rat models for obesity and diabetes
US20140304847A1 (en) 2011-06-07 2014-10-09 Ralf Kühn Recombination efficiency by inhibition of nhej dna repair
WO2013032918A1 (en) * 2011-08-26 2013-03-07 Yecuris Corporation Fumarylacetoacetate hydrolase (fah)-deficient and immunodeficient rats and uses thereof
PL2771357T3 (pl) 2011-10-28 2018-12-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Myszy ze zmodyfikowanym genetycznie receptorem komórek T
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
PL2847335T3 (pl) * 2012-04-25 2019-01-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Celowanie dużymi wektorami do celowania wspomagane nukleazą
DE102012103797A1 (de) * 2012-04-30 2013-10-31 KRAH Elektronische Bauelemente GmbH Flüssigkeitsgekühlter Widerstand
US10174331B2 (en) 2012-05-07 2019-01-08 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration of transgenes
JP6343605B2 (ja) 2012-05-25 2018-06-13 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア Ｒｎａ依存性標的ｄｎａ修飾およびｒｎａ依存性転写調節のための方法および組成物
US20150128300A1 (en) 2012-06-12 2015-05-07 Genentech, Inc. Methods and compositions for generating conditional knock-out alleles
ES2757623T3 (es) 2012-07-25 2020-04-29 Broad Inst Inc Proteínas de unión a ADN inducibles y herramientas de perturbación genómica y aplicaciones de las mismas
EP3346003B1 (en) 2012-10-23 2021-06-09 Toolgen Incorporated Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof
PL2928496T3 (pl) 2012-12-06 2020-04-30 Sigma-Aldrich Co. Llc Modyfikacja i regulacja genomu w oparciu o CRISPR
WO2014093479A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Montana State University Crispr (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) rna-guided control of gene regulation
EP2931899A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
EP4286402A3 (en) 2012-12-12 2024-02-14 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
EP3031921A1 (en) 2012-12-12 2016-06-15 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
EP2931898B1 (en) 2012-12-12 2016-03-09 The Broad Institute, Inc. Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
EP2931892B1 (en) 2012-12-12 2018-09-12 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
ES2542015T3 (es) 2012-12-12 2015-07-29 The Broad Institute, Inc. Ingeniería de sistemas, métodos y composiciones de guía optimizadas para manipulación de secuencias
DK2931897T3 (en) 2012-12-12 2018-02-05 Broad Inst Inc CONSTRUCTION, MODIFICATION AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS, PROCEDURES AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION AND THERAPEUTICAL APPLICATIONS
AU2013359212B2 (en) 2012-12-12 2017-01-19 Massachusetts Institute Of Technology Engineering and optimization of improved systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation
DK2931891T3 (da) 2012-12-17 2019-08-19 Harvard College Rna-styret modificering af menneskelige genomer
EP2938184B1 (en) 2012-12-27 2018-10-31 Keygene N.V. Method for removing genetic linkage in a plant
WO2014127287A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 Massachusetts Institute Of Technology Method for in vivo tergated mutagenesis
CN105121631B (zh) 2013-02-20 2019-04-19 瑞泽恩制药公司 大鼠的遗传修饰
AU2014218621B2 (en) 2013-02-25 2019-11-07 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption
WO2014131833A1 (en) 2013-02-27 2014-09-04 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum Für Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) Gene editing in the oocyte by cas9 nucleases
WO2014143381A1 (en) 2013-03-09 2014-09-18 Agilent Technologies, Inc. Methods of in vivo engineering of large sequences using multiple crispr/cas selections of recombineering events
RU2018122288A (ru) 2013-03-14 2019-03-06 Карибо Биосайенсиз, Инк. Композиции и способы с участием нуклеиновых кислот, нацеленных на нуклеиновые кислоты
US20140349400A1 (en) 2013-03-15 2014-11-27 Massachusetts Institute Of Technology Programmable Modification of DNA
US20140273230A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
US9234213B2 (en) 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
JP6346266B2 (ja) 2013-03-21 2018-06-20 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 操作されたジンクフィンガータンパク質ヌクレアーゼを使用するｔ細胞受容体遺伝子の標的化された破壊
JP2016522679A (ja) 2013-04-04 2016-08-04 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いたゲノム編集の治療的使用
US20160040155A1 (en) 2013-04-16 2016-02-11 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Activating an alternative pathway for homology-directed repair to stimulate targeted gene correction and genome engineering
CN105308184B (zh) 2013-04-16 2020-06-02 瑞泽恩制药公司 大鼠基因组的靶向修饰
WO2014172470A2 (en) 2013-04-16 2014-10-23 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods of mutating, modifying or modulating nucleic acid in a cell or nonhuman mammal
EP2796558A1 (en) 2013-04-23 2014-10-29 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Improved gene targeting and nucleic acid carrier molecule, in particular for use in plants
AU2014262867B2 (en) 2013-05-10 2019-12-05 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
EP3730615A3 (en) 2013-05-15 2020-12-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition
AU2014273082B2 (en) 2013-05-29 2018-11-08 Cellectis A method for producing precise DNA cleavage using Cas9 nickase activity
DK3004337T3 (da) 2013-05-29 2017-11-13 Cellectis Fremgangsmåde til konstruktion af T-celler til immunoterapi ved brug af RNA-guidet Cas nuklease-system
ES2883131T3 (es) 2013-05-29 2021-12-07 Cellectis Métodos para la modificación de células T para inmunoterapia utilizando el sistema de nucleasa CAS guiado por ARN
US20140359795A1 (en) 2013-05-31 2014-12-04 Recombinetics, Inc. Genetic techniques for making animals with sortable sperm
EP3008181B1 (en) 2013-06-11 2019-11-06 The Regents of The University of California Methods and compositions for target dna modification
CN105793425B (zh) 2013-06-17 2021-10-26 布罗德研究所有限公司 使用病毒组分靶向障碍和疾病的crispr-cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用
WO2014204725A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Optimized crispr-cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
SG11201510284XA (en) 2013-06-17 2016-01-28 Broad Inst Inc Delivery and use of the crispr-cas systems, vectors and compositions for hepatic targeting and therapy
BR112015031611A2 (pt) 2013-06-17 2017-12-12 Massachusetts Inst Technology aplicação, manipulação e otimização de sistemas, métodos e composições para direcionamento e modelação de doenças e distúrbios de células pós-mitóticas
EP3011035B1 (en) 2013-06-17 2020-05-13 The Broad Institute, Inc. Assay for quantitative evaluation of target site cleavage by one or more crispr-cas guide sequences
KR20160044457A (ko) 2013-06-17 2016-04-25 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 서열 조작을 위한 탠덤 안내 시스템, 방법 및 조성물의 전달, 조작 및 최적화
RU2016101246A (ru) 2013-06-19 2017-07-24 СИГМА-ЭЛДРИЧ КО. ЭлЭлСи Направленная интеграция
US10011850B2 (en) 2013-06-21 2018-07-03 The General Hospital Corporation Using RNA-guided FokI Nucleases (RFNs) to increase specificity for RNA-Guided Genome Editing
KR20220025922A (ko) 2013-07-09 2022-03-03 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 멀티플렉스 rna-가이드된 게놈 조작
EP3019595A4 (en) 2013-07-09 2016-11-30 THERAPEUTIC USES OF A GENERIC CHANGE WITH CRISPR / CAS SYSTEMS
KR102285485B1 (ko) 2013-07-10 2021-08-04 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 Rna-가이드된 유전자 조절 및 편집을 위한 직교 cas9 단백질
EP3022304B1 (en) 2013-07-19 2018-12-26 Larix Biosciences LLC Methods and compositions for producing double allele knock outs
US11306328B2 (en) 2013-07-26 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College Genome engineering
US20150082478A1 (en) 2013-08-22 2015-03-19 E I Du Pont De Nemours And Company Plant genome modification using guide rna/cas endonuclease systems and methods of use
SG10201801658XA (en) 2013-08-29 2018-03-28 Univ Temple Methods and compositions for rna-guided treatment of hiv infection
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
EP2877571B1 (en) 2013-09-18 2018-05-30 Kymab Limited Methods, cells and organisms
WO2015048690A1 (en) 2013-09-27 2015-04-02 The Regents Of The University Of California Optimized small guide rnas and methods of use
WO2015052231A2 (en) 2013-10-08 2015-04-16 Technical University Of Denmark Multiplex editing system
US9957526B2 (en) 2013-10-17 2018-05-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
EP3865575A1 (en) 2013-11-06 2021-08-18 Hiroshima University Vector for nucleic acid insertion
KR102523466B1 (ko) 2013-11-07 2023-04-20 에디타스 메디신, 인코포레이티드 지배적인 gRNA를 이용하는 CRISPR-관련 방법 및 조성물
US10787684B2 (en) 2013-11-19 2020-09-29 President And Fellows Of Harvard College Large gene excision and insertion
CN106103699B (zh) 2013-11-28 2019-11-26 地平线探索有限公司 体细胞单倍体人类细胞系
RU2685914C1 (ru) 2013-12-11 2019-04-23 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Способы и композиции для направленной модификации генома
EP3080260B1 (en) 2013-12-12 2019-03-06 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas systems and methods for altering expression of gene products, structural information and inducible modular cas enzymes
MX2016007327A (es) 2013-12-12 2017-03-06 Broad Inst Inc Suministro, uso y aplicaciones terapeuticas de sistemas y composiciones crispr-cas para dirigirlos a trastornos y enfermedades usando componentes para suministro de particulas.
KR20160089527A (ko) 2013-12-12 2016-07-27 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 게놈 편집을 위한 ｃｒｉｓｐｒ-ｃａｓ 시스템 및 조성물의 전달, 용도 및 치료적 응용
KR20160097338A (ko) 2013-12-12 2016-08-17 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 뉴클레오티드 반복 장애에서의 ｃｒｉｓｐｒ-ｃａｓ 시스템의 조성물 및 방법 및 용도
WO2015089473A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation
JP2017527256A (ja) 2013-12-12 2017-09-21 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド ＨＢＶ及びウイルス性疾患及び障害のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用
CA2932948A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Cellectis New method of selection of algal-transformed cells using nuclease
EP3083958B1 (en) 2013-12-19 2019-04-17 Amyris, Inc. Methods for genomic integration
WO2015105928A1 (en) 2014-01-08 2015-07-16 President And Fellows Of Harvard College Rna-guided gene drives
EP3096609B1 (en) 2014-01-24 2021-09-22 Children's Medical Center Corporation High-throughput mouse model for optimizing antibody affinities
US10233456B2 (en) 2014-01-30 2019-03-19 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Method, vectors, cells, seeds and kits for stacking genes into a single genomic site
WO2015117041A1 (en) 2014-01-30 2015-08-06 Nair Ramesh B Gene modification-mediated methods and compositions for generating dominant traits in eukaryotic systems
ES2802984T3 (es) 2014-02-11 2021-01-22 Univ Colorado Regents Ingeniería del genoma multiplex mediante CRISPR
EP3110454B1 (en) 2014-02-24 2020-11-18 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration
US11028388B2 (en) 2014-03-05 2021-06-08 Editas Medicine, Inc. CRISPR/Cas-related methods and compositions for treating Usher syndrome and retinitis pigmentosa
CA2948728A1 (en) 2014-03-10 2015-09-17 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating leber's congenital amaurosis 10 (lca10)
EP3858376A1 (en) 2014-03-12 2021-08-04 Precision Biosciences, Inc. Dystrophin gene exon deletion using engineered nucleases
KR102569558B1 (ko) 2014-03-14 2023-08-22 시버스 유에스 엘엘씨 올리고뉴클레오타이드 매개 유전자 보수를 사용한 표적화된 유전자 변형의 효율을 증가시키기 위한 방법 및 조성물
AU2015231353B2 (en) 2014-03-18 2020-11-05 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for regulation of zinc finger protein expression
CN106459951A (zh) 2014-03-26 2017-02-22 马里兰大学派克分院 驯养的大型动物的受精卵中的靶向基因组编辑
GB201406968D0 (en) 2014-04-17 2014-06-04 Green Biologics Ltd Deletion mutants
US20170076039A1 (en) 2014-04-24 2017-03-16 Institute For Basic Science A Method of Selecting a Nuclease Target Sequence for Gene Knockout Based on Microhomology
GB201407852D0 (en) 2014-05-02 2014-06-18 Iontas Ltd Preparation of libraries od protein variants expressed in eukaryotic cells and use for selecting binding molecules
EP3142706A1 (en) 2014-05-16 2017-03-22 Vrije Universiteit Brussel Genetic correction of myotonic dystrophy type 1
CA2949713A1 (en) 2014-05-30 2015-12-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods of delivering treatments for latent viral infections
PL3152312T3 (pl) 2014-06-06 2020-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Sposoby i kompozycje do modyfikowania docelowego locus
JP6930834B2 (ja) 2014-06-16 2021-09-01 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー Ｈ１プロモーターを用いるｃｒｉｓｐｒガイドｒｎａの発現のための組成物および方法
LT3161128T (lt) 2014-06-26 2018-10-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Būdai ir kompozicijos, skirti tikslinei genetinei modifikacijai, ir panaudojimo būdai
JP7113618B2 (ja) 2014-07-15 2022-08-05 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 養子細胞療法用の操作された細胞
US9944933B2 (en) 2014-07-17 2018-04-17 Georgia Tech Research Corporation Aptamer-guided gene targeting
WO2016011428A1 (en) 2014-07-17 2016-01-21 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Methods of treating cells containing fusion genes
CN107075511B9 (zh) 2014-08-27 2021-10-26 新英格兰生物实验室公司 合成子的形成
ES2730378T3 (es) 2014-08-27 2019-11-11 Caribou Biosciences Inc Procedimientos para incrementar la eficiencia de la modificación mediada por Cas9
WO2016036754A1 (en) 2014-09-02 2016-03-10 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for rna-directed target dna modification
BR112017001470A2 (pt) 2014-09-07 2018-02-20 Selecta Biosciences Inc métodos e composições para atenuar as respostas imunes do vetor de transferência anti-viral de terapia genética
WO2016049163A2 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Use and production of chd8+/- transgenic animals with behavioral phenotypes characteristic of autism spectrum disorder
WO2016049024A2 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for modeling competition of multiple cancer mutations in vivo
WO2016049258A2 (en) 2014-09-25 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Functional screening with optimized functional crispr-cas systems
EP3201343B1 (en) 2014-09-29 2022-03-23 The Jackson Laboratory High efficiency, high throughput generation of genetically modified mammals by electroporation
EP3845655A1 (en) 2014-10-01 2021-07-07 The General Hospital Corporation Methods for increasing efficiency of nuclease-induced homology-directed repair
EP3204496A1 (en) 2014-10-10 2017-08-16 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for promoting homology directed repair
WO2016061073A1 (en) 2014-10-14 2016-04-21 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Composition and method for in vivo engineering of chromosomal rearrangements
CN107002042A (zh) 2014-10-15 2017-08-01 瑞泽恩制药公司 用于产生或维持多能细胞的方法和组合物
CA2964796C (en) 2014-10-17 2022-01-11 The Penn State Research Foundation Methods and compositions for multiplex rna guided genome editing and other rna technologies
WO2016061523A1 (en) 2014-10-17 2016-04-21 Howard Hughes Medical Institute Genomic probes
US20170306306A1 (en) 2014-10-24 2017-10-26 Life Technologies Corporation Compositions and Methods for Enhancing Homologous Recombination
EP3215623A4 (en) 2014-11-06 2018-09-26 President and Fellows of Harvard College Cells lacking b2m surface expression and methods for allogeneic administration of such cells
AU2015342749B2 (en) 2014-11-07 2022-01-27 Editas Medicine, Inc. Methods for improving CRISPR/Cas-mediated genome-editing
KR102683423B1 (ko) 2014-11-21 2024-07-10 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 쌍 형성된 가이드 rna를 사용하는 표적화된 유전자 변형을 위한 방법 및 조성물
JP2017535296A (ja) 2014-11-27 2017-11-30 ダンツィガー イノベイションズ リミテッドＤａｎｚｉｇｅｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ． ゲノム編集のための核酸構築物
WO2016089866A1 (en) 2014-12-01 2016-06-09 President And Fellows Of Harvard College Rna-guided systems for in vivo gene editing
WO2016094872A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Dead guides for crispr transcription factors
WO2016094880A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of crispr systems and compositions for genome editing as to hematopoietic stem cells (hscs)
WO2016094874A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Escorted and functionalized guides for crispr-cas systems
WO2016097751A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 The University Of Bath Method of cas9 mediated genome engineering
CN107208113A (zh) 2014-12-19 2017-09-26 瑞泽恩制药公司 用于通过单步多重靶向进行靶向遗传修饰的方法和组合物
US10190106B2 (en) 2014-12-22 2019-01-29 Univesity Of Massachusetts Cas9-DNA targeting unit chimeras
WO2016108926A1 (en) 2014-12-30 2016-07-07 The Broad Institute Inc. Crispr mediated in vivo modeling and genetic screening of tumor growth and metastasis
US20180155708A1 (en) 2015-01-08 2018-06-07 President And Fellows Of Harvard College Split Cas9 Proteins
CN113388670B (zh) 2015-01-09 2024-02-02 生物辐射实验室股份有限公司 检测基因组编辑
EP3245232B1 (en) 2015-01-12 2021-04-21 The Regents of The University of California Heterodimeric cas9 and methods of use thereof
WO2016115326A1 (en) 2015-01-15 2016-07-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for modulating genome editing
CA2975166C (en) 2015-01-28 2020-01-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Crispr hybrid dna/rna polynucleotides and methods of use
WO2016130697A1 (en) 2015-02-11 2016-08-18 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Methods and kits for generating vectors that co-express multiple target molecules
US12129471B2 (en) 2015-02-23 2024-10-29 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of human genetic diseases including hemoglobinopathies
BR112017017810A2 (pt) 2015-02-23 2018-04-10 Crispr Therapeutics Ag materiais e métodos para tratamento de hemoglobinopatias
JP6871169B2 (ja) 2015-03-02 2021-05-12 シナイ ヘルス システム 相同組換え因子
GB201504223D0 (en) 2015-03-12 2015-04-29 Genome Res Ltd Biallelic genetic modification
EP3274453B1 (en) 2015-03-26 2021-01-27 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-mediated gene conversion
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems

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