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KR20220024134A - Tdp-43 단백질이상질환 모델링 - Google Patents

Tdp-43 단백질이상질환 모델링 Download PDF

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Publication number
KR20220024134A
KR20220024134A KR1020217041824A KR20217041824A KR20220024134A KR 20220024134 A KR20220024134 A KR 20220024134A KR 1020217041824 A KR1020217041824 A KR 1020217041824A KR 20217041824 A KR20217041824 A KR 20217041824A KR 20220024134 A KR20220024134 A KR 20220024134A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
tdp
polypeptide
human animal
cell
tardbp
Prior art date
Application number
KR1020217041824A
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English (en)
Inventor
아르티 샤르마-칸닝
데이비드 프렌듀이
브라이언 잠브로비츠
Original Assignee
리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 filed Critical 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Abstract

TDP-43의 핵 국재화 신호 (NLS)도 프리온형 도메인 (PLD)도 배아 줄기 세포 배양 및 시험관내 운동 뉴런으로의 분화에 필요 없다는 발견이 본원에 기재된다. TDP-43 돌연변이체가 세포질에 재분배하고 세포질에서 집합하며 크립틱 엑손 스플라이싱을 조절하지 못하는 이들 TDP-43 돌연변이체를 발현시키는 그리고 ALS형 표현형을 나타내는 운동 뉴런으로 분화시키는 ES 세포의 능력은 상기 단백질이상질환을 해결할 수 있는 후보 치료적 제제의 테스팅을 위하여 TDP-43 단백질이상질환의 모델로서 이들 세포를 작용시킨다. 추가적으로, 이들 ES 세포는, ALS의 특질 증상을 또한 나타내는 그리고 TDP-43 단백질이상질환 치료하기에서 유용한 테스팅 후보 제제에서 사용될 수 있는 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스를 성공적으로 생성하는데 사용될 수 있다.

Description

TDP-43 단백질이상질환 모델링
관련된 출원에 대한 교차-참조
본원은 35 U.S.C. § 119(3) 하에서 (2019년 6월 27일 출원된) 미국 가출원 일련 번호 62/867,785의 이익을 주장하고 이의 개시 내용은 이 전체가 참고로 여기에 편입된다.
EFS 웹을 통해 텍스트 파일로서 제출된 서열 목록 참조
파일 10312WO01_ST25.txt로 문서화된 서열 목록은 35 킬로바이트이고, 2020년 6월 25일 창작되었고, 여기에 참고로 편입된다.
기술 분야
TDP-43 및 이의 도메인, 비-인간 동물 및 이에 대한 비-인간 동물 세포, 그리고 이에 대한 핵산의 생물학적 역할(들)의 평가 방법이 본원에 기재된다. 상기 비-인간 동물, 비-인간 동물 세포 또는 핵산을 포함하는 TDP-43 단백질이상질환의 모델, 및 이의 사용 방법이 또한 제공된다.
발명의 배경
근위축성 측삭 경화증 (ALS)은 운동 뉴런에 영향을 미치는 파괴적인 신경퇴행성 질환으로, 횡격막 근육의 부전의 결과로서 사지 마비 그리고 결국 사망을 유발시킨다. ALS 환자 조직의 사후 검사에서 거의 보편적인 병리학적 발견은 세포질성 내포물에서 TDP-43 (트랜스액티브 반응 DNA 결합 단백질 43 kDa)의 축적이다.
TDP-43은 핵 국재화 신호 (NLS) 도메인, 2개 RNA 인식 모티프 (RRM1 및 RRM2), 추정적 핵 유출 신호 (NES) 도메인, 및 글리신 풍부 프리온형 도메인 (PLD)을 갖는 것을 특징으로 한다. 이종 핵성 리보핵단백질 (hnRNP) 패밀리의 구성원과 유사하게, TDP-43은 모든 포유류 세포의 생존력 그리고 동물의 정상 발달에 요구된 주로 핵성 RNA 결합 단백질이다. 핵에서 세포질로의 TDP-43의 재분배 그리고 불용성 집합체에서 이의 축적은 ALS 질환의 2개 핵심 진단적 특질이다.
TDP-43의 세포질성 축적이 ALS와 연관되어도, TDP-43의 구조적 도메인들의 각각과 TDP-43의 생물학적 기능(들) 사이 관계는 명확하지 않다.
발명의 개요
기능적인 구조적 도메인이 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키고 ALS형 표현형을 나타낼 수 있는 배아 줄기 (ES) 세포, 그로부터 배양된 조직 (예를 들면, 원시 외배엽, 배상체, 운동 뉴런), 및 그로부터 유래된 비-인간 동물이 본원에 제공된다. 이의 제조 및 사용 방법 및 조성물이 또한 제공된다. 기능적 구조 도메인이 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자 그리고 기능적인 구조적 도메인이 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 또한 제공된다. TARDBP 발현의 자가조절을 회복시킬 수 있는, 예시적인 치료적 올리고뉴클레오타이드, 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 또한 제공된다.
예를 들면, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함하는 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류 (예를 들면, 랫트 또는 마우스)) 및 비-인간 동물 세포 (예를 들면, 배아 줄기 (ES) 세포, 배상체, 배아 줄기 세포 유래된 운동 뉴런 (ESMN), 등)가 본원에 기재되고, 여기서 돌연변이된 TARDBP 유전자는 돌연변이체 TDP-43이 돌연변이 (예를 들면, 점 돌연변이, 치환, 대체, 삽입, 결실, 등 중 하나 이상)가 없다면 상응하는 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 포함하도록 돌연변이를 포함하는 야생형 TARDBP 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 야생형 TARDBP 유전자는 서열번호:2 (이의 퇴화 변이체 포함), 서열번호:4(이의 퇴화 변이체 포함), 또는 서열번호:6 (이의 퇴화 변이체 포함)에서 제시된 서열을 포함하고, 이들은 서열번호:1, 서열번호:3, 또는 서열번호:5로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 야생형 TDP-43 폴리펩타이드를 각각으로 인코딩한다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자는 비-인간 동물 또는 비-인간 동물 세포의 내인성 TARDBP 유전자좌에 내인성 TARDBP 유전자를 대체한다. 일부 구현예에서, 비-인간 동물 세포 또는 비-인간 동물은 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자에 대하여 이형접합성이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 비-인간 동물 또는-인간 동물 세포는, 본원에 기재된 경우에 돌연변이된 TARDBP 유전자 이외에도, (a) 야생형 TARDBP 유전자 또는 (b) 녹아웃 돌연변이, 예를 들면, 조건부 녹아웃 돌연변이를 포함하는 TARDBP 유전자를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조건부 녹아웃 돌연변이는 부위-특이적 재조합 인식 서열, 예를 들면, loxp 서열을 포함하고, 임의로 여기서 부위-특이적 재조합 인식 서열 (예를 들면, loxp 서열)은 코딩 엑손, 예를 들면, 엑손 3을 측접한다. 일부 구현예에서, 녹아웃 돌연변이를 포함하는 TARDBP 유전자는, TARDBP 유전자의 결실된 엑손 3을 측접하는, loxp 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 녹아웃 돌연변이는 TDP-43 펩타이드의 전체 코딩 서열의 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, 비-인간 동물 또는 비-인간 동물 세포는 (i) 내인성 TARDBP 유전자좌에, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자로 내인성 TARDBP 유전자의 대체, 및 (ii) 상동 염색체의 다른 내인성 TARDBP 유전자좌에, 녹아웃 돌연변이를 포함하는 TARDBP 유전자 또는 야생형 TARDBP 유전자 어느 한쪽을 포함한다.
일부 구현예에서, 비-인간 동물 또는 비-인간 동물 세포는 내인성 TARDBP 유전자좌에 조건부 녹아웃 돌연변이를 포함하는 TARDBP 유전자 그리고 상동 염색체의 다른 내인성 TARDBP 유전자좌에 전체 TARDBP 코딩 서열의 결실을 포함하는 TARDBP 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 비-인간 동물 세포 또는 비-인간 동물은 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자에 대하여 동형접합성이다.
일부 구현예에서, 비-인간 동물 또는 비-인간 동물 세포는 야생형 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키지 않는다.
일부 구현예에서, 비-인간 동물 또는 비-인간 동물 세포는 야생형 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시킨다.
일부 구현예에서, 선행 청구항들 중 어느 한 항의 비-인간 동물 또는 비-인간 동물 세포는 대조군 세포에서 야생형 TARDBP 유전자의 mRNA 전사 수준에 비교가능한 돌연변이된 TARDBP 유전자의 mRNA 전사 수준, 대조군 세포에서 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 수준에 비교하여 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 증가된 수준, 예를 들면, 운동 뉴런의, 핵에서 보다 세포질에서 발견된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 더 높은 농도, 돌연변이체 TDP 43 폴리펩타이드를 포함하는 야생형 TDP-43 폴리펩타이드 세포질성 집합체와 비교하여 증가된 불용성을 가진 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드, 크립틱 엑손의 증가된 스플라이싱, 및/또는 택일적으로 스플라이싱된 TDP-43 형태의 감소된 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-인간 동물은 주로 빠른 수축 근육, 예컨대 전경골근으로 구성된 근육 조직의 신경차단 및/또는 주로 저 수축 근육, 예컨대 늑간근으로 구성된 근육 조직의 정상 신경지배를 나타낸다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 경우에 비-인간 동물 세포는 시험관내 배양된다. 본원에 기재된 비-인간 동물 세포를 포함하는 비-인간 동물 조직이 또한 본원에 기재된다.
일부 구현예에서, 비-인간 동물 조직 및/또는 비-인간 동물 세포는 조성물에서 포함된다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 야생형 TDP-43 폴리펩타이드와 비교하여 기능적인 구조적 도메인이 결여되고, 여기서 비-인간 동물 또는 비-인간 동물 세포는 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키고, 임의로 여기서 야생형 TDP-43 폴리펩타이드는 서열번호:1, 서열번호:3, 또는 서열번호:5로서 제시된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 핵 국재화 신호 (NLS), RNA 인식 모티프 1 (RRM1), RNA 인식 모티프 2 (RRM2), 추정적 핵 유출 신호 (E), 프리온형 도메인 (PLD), 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 기능적인 구조적 도메인이 결여된다. 일부 구현예에서, 돌연변이된 TARDBP 유전자는 돌연변이를 포함하는, 예를 들면, 점 돌연변이, 치환, 삽입, 결실, 또는 이들의 조합을 포함하는 비-인간 동물의 TARDBP 유전자이다. 일부 구현예에서, 비-인간 동물의 TARDBP 유전자는 서열번호:2 또는 서열번호:4로서 제시된다. 일부 구현예에서, 돌연변이된 TARDBP 유전자는 돌연변이, 예를 들면, 점 돌연변이, 치환, 삽입, 결실, 또는 이들의 조합을 포함하는 인간의 TARDBP 유전자이다. 일부 구현예에서 돌연변이된 TARDBP. 일부 구현예에서, 인간의 TARDBP 유전자는 서열번호:5로서 제시된다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 TDP 43 폴리펩타이드는 하기 (a) NLS에서 아미노산의 점 돌연변이,(b) RRM1에서 아미노산의 점 돌연변이, (c) RRM2에서 아미노산의 점 돌연변이, (d) 핵 유출 신호의 적어도 한 부문의 결실, 및 (e) 프리온형 도메인의 적어도 한 부문의 결실 중 하나 이상으로 인해 기능적인 구조적 도메인이 결여된다. 예를 들어, 일부 구현예에서 ta 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 (a) NLS에서 아미노산의 점 돌연변이,(b) RRM1에서 아미노산의 점 돌연변이, (c) RRM2에서 아미노산의 점 돌연변이, (d) 핵 유출 신호의 적어도 한 부문의 결실, 및 (e) 프리온형 도메인의 적어도 한 부문의 결실을 추가로 포함하여 서열번호;1, 서열번호:3, 또는 서열번호:5로서 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, (a) NLS에서 아미노산의 점 돌연변이는 K82A K83A, R84A, K95A, K97A, K98A, 또는 이들의 조합을 포함하고, (b) RRM1에서 점 돌연변이는 F147L 및/또는 F149L을 포함하고, (c) RRM2에서 점 돌연변이는 F194L 및/또는 F229L을 포함하고, (d) 핵 유출 신호 결실의 적어도 한 부문의 결실은 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 위치 239 및 250에서 그리고 그 사이 아미노산의 결실을 포함하고, (e) 프리온형 도메인의 적어도 한 부문의 결실은 야생형 TDP 43 폴리펩타이드의 위치 274 및 414에서 그리고 그 사이 아미노산의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 야생형 TDP-43 폴리펩타이드와 비교하여 K82A K83A, R84A, K95A, K97A, 및/또는 K98A를 포함하고, 임의로 여기서 야생형 TDP-43 폴리펩타이드는 서열번호:1, 서열번호:3, 또는 서열번호:5로서 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 위치 274 내지 414에서 아미노산을 포함하는 그리고 그 사이 프리온형 도메인이 결여되며, 임의로 여기서 야생형 TDP-43 폴리펩타이드는 서열번호:1, 서열번호:3, 또는 서열번호:5로서 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 야생형 TDP-43 폴리펩타이드에 비교하여 F147L 및 F149L을 포함하고, 임의로 여기서 야생형 TDP-43 폴리펩타이드는 서열번호:1, 서열번호:3, 또는 서열번호:5로서 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 야생형 TDP-43 폴리펩타이드에 비교하여 F194L 및 F229L을 포함하고, 임의로 여기서 야생형 TDP-43 폴리펩타이드는 서열번호:1, 서열번호:3, 또는 서열번호:5로서 제시된 서열을 포함한다 일부 구현예에서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 야생형 TDP-43 폴리펩타이드에 비교하여 위치 239 및 250에서 아미노산을 포함하는 그리고 그 사이 핵 유출 신호가 결여되며, 임의로 여기서 야생형 TDP-43 폴리펩타이드는 서열번호:1, 서열번호:3, 또는 서열번호:5로서 제시된 서열을 포함한다.
본원에 기재된 돌연변이체 TDP 43 폴리펩타이드 및 이를 인코딩하는 핵산 분자가 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 경우에 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자는 5'부터 3'까지: 5' 상동성 아암, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열, 및 3' 상동성 아암을 추가로 포함하고, 여기서 핵산은 설치류 세포에서 상동 재조합을 겪는다. 일부 구현예에서, 5' 및 3' 상동성 아암은 핵산이 내인성 랫트 TARDBP 유전자좌에 상동 재조합을 겪고 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열이 내인성 TARDBP 코딩 서열을 대체하도록 랫트 서열에 상동이다. 일부 구현예에서, 5' 및 3' 상동성 아암은 핵산이 내인성 마우스 TARDBP 유전자좌에 상동 재조합을 겪고 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열이 내인성 TARDBP 코딩 서열을 대체하도록 마우스 서열에 상동이다.
본원에 기재된 비-인간 동물 및 비-인간 동물 세포의 제조 방법이 또한 본원에 기재된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 돌연변이체 TDP 43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함시키기 위해 비-인간 동물 또는 비-인간 동물 세포의 게놈을 변형시키는 단계를 포함하고, 여기서 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 야생형 TDP-43에 비교하여 기능적인 구조적 도메인이 결여되고, 임의로 여기서 야생형 TDP-43 폴리펩타이드는 서열번호:1, 서열번호:3, 또는 서열번호:5로서 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형시키는 단계는 본원에 기재된 경우에 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자로 내인성 TARDBP 유전자를 대체하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형시키는 단계는 녹아웃 돌연변이, 예를 들면, 조건부 녹아웃 돌연변이를 포함하는 TARDBP 유전자로 내인성 TARDBP 유전자를 대체하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 녹아웃 돌연변이를 포함하는 TARDBP 유전자의 발현을 제거하는 조건에서 세포를 배양시키는 단계를 추가로 포함한다.
비-인간 동물, 비-인간 동물 세포, 비-인간 동물 조직, 및 조성물의 사용 방법이 또한 본원에 기재된다. 일부 구현예에서, 비-인간 동물, 비-인간 동물 세포, 비-인간 동물 조직, 및 조성물은 방법들, 예를 들면, 질환의 치료를 위한 치료적 후보를 식별하고/거나 TDP-43 구조적 도메인의 생물학적 기능을 평가하는 방법에서 사용된다. 치료적 후보 식별하기의 일부 구현예에서, 본 방법은 (a) 본원에 기재된 경우에 비-인간 동물, 비-인간 동물 세포, 비-인간 동물, 또는 비-인간 동물 세포 또는 조직을 포함하는 조성물 (예를 들면, 시험관내 배양물)을 후보 제제와 접촉시키는 단계, (b) 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 조직의 표현형 및/또는 TDP-43 생물학적 활성을 평가하는 단계, 및 (c) 야생형 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 대조군 세포 또는 조직의 것에 비교가능한 표현형 및/또는 TDP-43 생물학적 활성을 비-인간 동물, 비-인간 세포 또는 조직에 회복시키는 후보 제제를 식별하는 단계를 포함함.
TDP-4의 생물학적 기능 평가하기의 일부 구현예에서, 본 방법은 (a) 핵 국재화 신호 (NLS), 제1 RNA 인식 모티프 (RRM1), 제1 RNA 인식 모티프 (RRM2), 추정적 핵 유출 신호 (E), 프리온형 도메인 (PLD), 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 기능적인 구조적 도메인이 결여되는 돌연변이체 TDP 43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함하기 위해 배아 줄기 (ES) 세포를 변형시키는 단계, (b) 시험관내 변형된 ES 세포를 임의로 분화시키고/거나 변형된 ES 세포로부터 유전적으로 변형된 비 인간 동물을 수득하는 단계, 및 (c) 유전적으로 변형된 ES 세포, 그로부터 유래된 원시 외배엽, 그로부터 유래된 운동 뉴런, 또는 그로부터 유래된 비-인간 동물의 표현형 및/또는 TDP-43 생물학적 활성을 평가하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제 39 항 또는 제 40 항의 방법, 여기서 표현형은 세포 배양, 형광 동소 하이브리드화, 웨스턴 블랏 분석, 또는 이들의 조합에 의해 평가된다. 일부 구현예에서, 표현형을 평가하는 단계는 유전적으로 변형된 ES 세포, 그로부터 유래된 원시 외배엽, 그로부터 유래된 운동 뉴런, 또는 그로부터 유래된 비-인간 동물 생존력을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 표현형을 평가하는 단계는 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 세포성 자리를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 평가하는 단계는 TDP-43에 의해 조절된 크립틱 엑손을 포함하는 유전자의 스플라이스 산물을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, TDP-43에 의해 조절된 크립틱 엑손을 포함하는 유전자는 Crem, Fyxd2, Clf1을 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 생물학적 활성은 택일적으로 스플라이싱된 TDP-43의 수준을 측정하는 단계를 포함한다.
TDP-43 단백질이상질환 치료에서 후보 제제로서 유용할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 (예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, CRISPR/Cas 시스템, 등)가 또한 본원에 기재된다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 택일적 5' 및 3' 스플라이스 접합부 사이 TDP-43 mRNA 서열을 표적하는 갭머 모티프를 포함한다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 택일적 5' 및 3' 스플라이스 접합부 사이 TDP-43 mRNA 서열을 표적하는 갭머 모티프를 포함하고, 여기서 택일적 5' 스플라이스 접합부는 (a) 염색체 4:148,618,647; (b) 염색체 4:148,618,665; 및 (c) 염색체 4:148,618,674로 이루어지는 군으로부터 선택된 TARDBP 게놈성 위치에 상관관계가 있고, 여기서 택일적 3' 스플라이스 접합부는 염색체 4: 148,617,705의 TARDBP 게놈성 위치에 상관관계가 있다. 일부 siRNA 구현예에서, siRNA는 택일적 5' 및 3' 스플라이스 접합부 사이 TDP-43 mRNA 서열을 표적하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열을 포함하는 siRNA는 택일적 5' 및 3' 스플라이스 접합부 사이 TDP-43 mRNA 서열을 표적하고, 여기서 택일적 5' 스플라이스 접합부는 (a) 염색체 4:148,618,647; (b) 염색체 4:148,618,665; 및 (c) 염색체 4:148,618,674로 이루어지는 군으로부터 선택된 TARDBP 게놈성 위치에 상관관계가 있고, 여기서 택일적 3' 스플라이스 접합부는 염색체 4: 148,617,705의 TARDBP 게놈성 위치에 상관관계가 있다.일부 CRISPR/Cas 시스템 구현예에서, 시스템은 Cas9 단백질 및 적어도 하나의 gRNA를 포함하고, 여기서 gRNA는 TDP-43 mRNA의 5' 택일적 스플라이스 부위에서 또는 근처에서 및/또는 3' 택일적 스플라이스 부위에서 또는 근처에서 서열을 인식한다. 일부 구현예에서, CRISPR/Cas 시스템은 Cas9 단백질 및 적어도 하나의 gRNA를 포함하고, 여기서 gRNA는 (a) 염색체 4:148,618,647; (b) 염색체 4:148,618,665; (c) 염색체 4:148,618,674, (d) 염색체 4: 148,617,705 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 TARDBP 게놈성 위치에서 또는 근처에서 서열을 인식한다.
도면의 간단한 설명
본 특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면이 들어있다. 컬러 도면(들)이 있는 본 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요청 및 필요한 요금의 지불시 청에 의해 제공될 것이다.
도 1은 TDP-43의 예시 (축척하지 않음), 핵 국재화 신호 (NLS; 아미노산 82-98)를 위한 상대 위치, 2개 RNA 인식 모티프 (RRM1; 아미노산 106-176, 및 RRM2; 아미노산 191-262)를 위한 상대 위치, 추정적 핵 유출 신호 (E; 아미노산 239-248)를 위한 상대 위치, 프리온형 도메인 (PLD; 아미노산 274-414)을 위한 상대 위치, ALS-연관된 아미노산 치환 돌연변이, 및 ALS-연관된 C 말단 단편을 제공한다. 별표는 ALS가 있거나 없는 FTD 증상과 연관된 돌연변이를 강조한다. A90V, S92L, N267S, G287S, G294V, G368S, S375G, A382T, I383V, N390S, 및 N390D 돌연변이는 건강한 개체에서 또한 관찰되었다.
도 2a는, 엑손 1-6 (직사각형), 비번역된 영역 (채워지지 않은 직사각형), 및 ATG 개시 코돈으로 시작하는 번역된 영역 (채워진 직사각형)을 묘사하는, 마우스 TARDBP 게놈성 구조의 예시 (축척하지 않음)를 제공한다. 도 2b는 마우스 (m) TDP-43 및 인간 (h) TDP-43 폴리펩타이드의 아미노산 서열 정렬, 폴리펩타이드의 아미노산 위치, 그리고 mTDP-43 및 hTDP-43 서열의 아래 공통 서열을 제공한다. 일반적으로, 정렬 내에서 박스형 영역은 핵 국재화 신호 (NLS: 아미노산 82-98), RNA 인식 모티프 1 (RRM1: 아미노산 106-176), RNA 인식 모티프 2 (RRM2: 아미노산 191-262), 추정적 핵 유출 신호 (E: 아미노산 239-248), 및 글리신 풍부 프리온형 도메인 (PLD: 아미노산 274-414)을 도시한다. 마우스 TDP-43과 인간 TDP-43 사이 아미노산 미스매치는 또한 박스형이고 공통 서열에서 대시 기호로 묘사된다. 엑손 접합부는 표시된 접합부에 연합된 엑손 (EX)을 표시하는 수직선으로서 또한 묘사된다. 아미노산 286과 287 사이 수직선은 택일적 5'-스플라이스 부위를 제공한다 (도 11a 참고).
도 3a는 2개 예시적 TARDBP 무효 대립유전자: (1) 이후 cre-매개된 재조합시 엑손 3의 제거 후 "-"로서 지칭된, loxP 부위-특이적 재조합 인식 부위 (삼각형)에 의해 측접된 엑손 3을 포함하는 조건부 녹아웃 대립유전자 및 (2) 이후 "△CDS"로서 지칭된 전체 TARDBP 코딩 서열의 결실을 포함하는 TARDBP 무효 대립유전자의 예시 (축척하지 않음)를 제공한다. 엑손 1-6 (직사각형), 비번역된 영역 (채워지지 않은 직사각형), 번역된 영역 (채워진 직사각형), 및 시작 ATG 및 정지 TGA 코돈의 상대 자리가 묘사된다. 도 3b는 돌연변이된 TARDBP 유전자의 다양한 형태에 의해 인코딩된 비-제한 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 예시적 묘사 (축척하지 않음)를 제공한다. 구체적으로, 이들 실시예 및 연관된 도 전반에 걸쳐:
"WT"는 야생형 TARDBP 유전자를 지칭하고,
"loxP-Ex3loxP"는 플록스된 엑손 3을 포함하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 지칭하고
"-"는 loxP-Ex3loxP의 cre-매개된 재조합시 야생형 TARDBP 유전자의 엑손 3의 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열이 결여된 돌연변이된 TARDBP 유전자를 지칭하고,
"△CDS"는 TARDBP의 전체 코딩 서열이 결여된 돌연변이된 TARDBP 유전자를 지칭하고,
"△NLS"는 하기 점 돌연변이: K82A K83A, R84A, K95A, K97A, 및 K98A를 포함하는 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 지칭하고,
"△RRM1"은 하기 점 돌연변이: F147L 및 F149L을 포함하는 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 지칭하고,
"△RRM2"는 하기 점 돌연변이: F194L 및 F229L을 포함하는 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 지칭하고,
"△E"는 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 아미노산 239 내지 250이 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 지칭하고,
"△PLD"는 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 아미노산 274 내지 414가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 지칭한다.
△E 및 △PLD 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드 경우, 대각선은 결실되는 영역을 나타낸다.
도 4는 배아 줄기 (ES) 세포를 운동 뉴런으로 분화시키는데 사용된 프로토콜을 예시한다. ES 세포 기에서 엑손 3 (-)의 Cre-매개된 결실 후, 묘사된 경우에 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함하는 ES 세포의 생존가능하게 남아있는, 원시 외배엽 (PE) 기에 도달하는, 및/또는 운동 뉴런 (MN) 기에 도달하는 능력이 또한 도시된다.
도 5는 배아 줄기 세포-유래된 운동 뉴런 (ESMN)의 생존력을 평가하는데 사용된 프로토콜을 예시한다. 조건부 녹아웃 대립유전자 (-)의 활성화 후 지시된 경우에 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함하는 ESMN의 생존력에 관한 결과가 또한 도시된다.
도 6a는 TDP-43의 N-말단 (α-TDP-43 N-term)을 인식하는 항-TDP-43 항체 또는 TDP-43의 C-말단 (α-TDP-43 C-term)을 인식하는 항-TDP-43 항체에 의해 인식된 TDP-43의 영역의 축척하지 않은 묘사를 제공한다. 도 6b는 도 6a에서 묘사된 경우에 TDP-43의 N-말단 (α TDP-43 N-term) 또는 TDP-43의 C-말단 (α TDP-43 C-term)을 인식하는 항체로 염색된 세포의 세포질성 및 핵성 분획의 웨스턴 블랏을 제공한다. 엑손 3 (-)의 Cre-매개된 결실은 ES 세포 기에서 발생하였고 세포는 ES 배지, ADFNK 배지, 레티노산 및 소닉 헤지호그를 포함하는 ADFNK 배지, 및 배아 줄기 세포 유래된 운동 뉴런 (ESMN)을 생산하기 위해 도 4에서 묘사된 프로토콜에 따른 ESMN 배지로 배양되었다. 세포질성 및 핵성 분획은 TDP-43 WT/- 변형된 ESMN, △NLS/- 변형된 ESMN, △E/- 변형된 ESMN, △PLD/- 변형된 ESMN, 또는 사멸하는 △RRM1/- 변형된 세포로부터 단리되었다. 대조군 TDP-43 WT/- ESMN (●), △NLS/- 변형된 ESMN (▲), △RRM1/-변형된 세포 (▼), 또는 △PLD/- 변형된 ESMN (■)의 세포질성 대 핵성 TDP-43의 비를 제공하는 그래프가 또한 제공된다.
도 7은 지시된 경우에 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함하는 변형된 배아 줄기 세포 유래된 운동 뉴런 (ESMN)의 형광 동소 하이브리드화 이미지를 40 배율로 제공한다. 돌연변이된 TARDBP 유전자의 엑손 3이 ES 세포 기에서 (-) 제거되었고 세포가 ES 배지, ADFNK 배지, 레티노산 및 소닉 헤지호그를 포함하는 ADFNK 배지, 및 배아 줄기 세포 유래된 운동 뉴런 (ESMN)을 생산하기 위해 도 4에서 묘사된 프로토콜에 따른 ESMN 배지로 배양된 후 이미지는 포착되었다. 세포는 TDP-43의 C-말단 (α TDP-43 C-term; 최상부 패널)을 인식하는 항체로 또는 항-MAP2 항체 및 DAPI (최하부 패널)로 염색되었다.
도 8은 지시된 경우에 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함하는 변형된 배아 줄기 세포 유래된 운동 뉴런 (ESMN)의 형광 동소 하이브리드화 이미지를 40 배율로 제공한다. 돌연변이된 TARDBP 유전자의 엑손 3이 ES 세포 기에서 (-) 제거되었고 세포가 ES 배지, ADFNK 배지, 레티노산 및 소닉 헤지호그를 포함하는 ADFNK 배지, 및 배아 줄기 세포 유래된 운동 뉴런 (ESMN)을 생산하기 위해 도 4에서 묘사된 프로토콜에 따른 ESMN 배지로 배양된 후 이미지는 포착되었다. 세포는 TDP-43의 N-말단 (α TDP-43 N-term; 최상부 패널)을 인식하는 항체로 또는 항-MAP2 항체 및 DAPI (최하부 패널)로 염색되었다.
도 9a는 세포의 사르코실-가용성 및 사르코실-불용성 분획의 항-TDP-43 항체 염색된 웨스턴 블랏을 제공한다. 엑손 3 (-)의 Cre-매개된 결실은 ES 세포 기에서 발생하였고 세포는 ES 배지, ADFNK 배지, 레티노산 및 소닉 헤지호그를 포함하는 ADFNK 배지, 및 배아 줄기 세포 유래된 운동 뉴런 (ESMN)을 생산하기 위해 도 4에서 묘사된 프로토콜에 따른 ESMN 배지로 배양되었다. 사르코실-가용성 및 사르코실-불용성 분획은 TDP-43 WT/- 변형된 ESMN, △NLS/- 변형된 ESMN, △E/- 변형된 ESMN, △PLD/- 변형된 ESMN, 또는 △RRM1/- 변형된 세포로부터 단리되었다. 이들 ESMN에 의해 발현된 불용성/가용성 TDP-43의 비를 제공하는 그래프가 또한 제공된다. 도 9b는 TDP-43 mRNA (좌측 패널; y-축) 또는 단백질 (우측 패널; y-축) 발현 수준을 도시하는 그래프를 제공한다. 엑손 3 (-)의 Cre-매개된 결실은 ES 세포 기에서 발생하였고 세포는 ES 배지, ADFNK 배지, 레티노산 및 소닉 헤지호그를 포함하는 ADFNK 배지, 및 배아 줄기 세포 유래된 운동 뉴런 (ESMN)을 생산하기 위해 도 4에서 묘사된 프로토콜에 따른 ESMN 배지로 배양되었다. △NLS/- 변형된 ESMN, △E/- 변형된 ESMN, △PLD/- 변형된 ESMN, 또는 사멸하는 △RRM1/- 변형된 세포의 mRNA 수준은 대조군 (TDP-43WT/- 변형된 ESMN (WT/-))에 비교된다. 도 9c는 세포 용해물의 항-TDP-43 또는 항-GAPDH 항체로 염색된 웨스턴 블랏을 제공한다. 엑손 3 (-)의 Cre-매개된 결실은 ES 세포 기에서 발생하였고 세포는 ES 배지, ADFNK 배지, 레티노산 및 소닉 헤지호그를 포함하는 ADFNK 배지, 및 배아 줄기 세포 유래된 운동 뉴런 (ESMN)을 생산하기 위해 도 4에서 묘사된 프로토콜에 따른 ESMN 배지로 배양되었다. 세포 용해물은 최대 16 시간 동안 사이클로헥시미드 (CHX+) 처리 후 TDP-43 WT/- 변형된 ESMN, △NLS/- 변형된 ESMN, △E/- 변형된 ESMN, △PLD/- 변형된 ESMN, 또는 사멸하는 △RRM1/- 변형된 세포로부터 단리되었다. 대조군 TDP-43 WT/- 변형된 ESMN (●), △NLS/- 변형된 ESMN (■), △RRM1/- 변형된 세포 (▲), 또는 △PLD/- 변형된 ESMN (▼)에 의해 발현된 사이클로헥시미드 처리 (x-축; 시간) 후 % TDP-43 단백질 (y-축)을 제공하는 그래프가 또한 제공된다.
도 10은 TDP-43에 의해 조절된다고 생각된 3개 유전자: Crem, Fyxd2, 및 Clf1에서 발생하는 정상 및 크립틱 엑손 스플라이싱의 예시 (축척하지 않음), 뿐만 아니라 정상 스플라이싱된 산물 (채워진 막대) 및 이상 스플라이싱된 산물 (패턴화된 및 채워지지 않은 막대의 수준을 도시하는 그래프를 제공한다. 엑손 3 (-)의 Cre-매개된 결실은 ES 세포 기에서 발생하였고 세포는 ES 배지, ADFNK 배지, 레티노산 및 소닉 헤지호그를 포함하는 ADFNK 배지, 및 배아 줄기 세포 유래된 운동 뉴런 (ESMN)을 생산하기 위해 도 4에서 묘사된 프로토콜에 따른 ESMN 배지로 배양되었다. △NLS/- 변형된 ESMN, △E/- 변형된 ESMN, △PLD/- 변형된 ESMN, 또는 △RRM1/- 변형된 세포 및 대조군 (TDP-43 WT/-)에 의한 Crem, Fyxd2, 및 Clf1의 크립틱 엑손 스플라이싱의 수준이 도시된다
도 11a는 TDP-43 유전자에서 발생하는 정상 및 택일적 스플라이스 이벤트의 예시 (축척하지 않음)를 제공한다. 도 11b는 택일적으로 스플라이싱된 TDP-43 mRNA의 수준을 도시하는 그래프를 제공한다. 엑손 3 (-)의 Cre-매개된 결실은 ES 세포 기에서 발생하였고 세포는 ADFNK 배지, 레티노산 및 소닉 헤지호그를 포함하는 ADFNK 배지, 및 배아 줄기 세포 유래된 운동 뉴런 (ESMN)을 생산하기 위해 도 4에서 묘사된 프로토콜에 따른 ESMN 배지로 배양되었다. 미변형된 ES 세포 (WT/WT), △NLS/- 변형된 ESMN, △E/- 변형된 ESMN, △PLD/- 변형된 ESMN, 또는 사멸하는 △RRM1/- 변형된 세포에 의한 택일적으로 스플라이싱된 TDP-43 mRNA의 수준이 도시된다.
도 12는 TDP-43-/- ES 세포, TDP-43△NLS/- 변형된 ES 세포, TDP-43△PLD/- 변형된 ES 세포, TDP-43△NLS/WT 변형된 ES 세포, TDP-43△PLD/WT 변형된 ES 세포, TDP-43WT/- 변형된 ES 세포, TDP-43loxP-Ex3-loxP/WT 변형된 ES 세포, 또는 야생형 TDP-43WT/WT ES 세포로 주사된 8-세포 배아의 수정 후 생존 시간을 도시하는 그래프를 제공한다. E3.5 (배아 일 3.5), E 10.5 (배아 일 10.5), E 15.5 (배아 일 15.5), P0 (생후 일 0).
도 13a, 13b 및 13c는 16 주령 마우스 (n=2)로부터 단리된 척수 조직으로부터 단리된 운동 뉴런의 웨스턴 블랏을 제공한다. 시험된 마우스는 (i) 내인성 TARDBP 유전자좌: 플록스된 엑손 3을 포함하는 돌연변이된 TARDBP 유전자 (loxP-Ex3-loxP), NLS에서 녹아웃 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 TARDBP 유전자 (△NLS), 또는 프리온형 도메인의 결실을 포함하는 돌연변이된 TARDBP 유전자 (△PLD)로부터, 그리고 (ii) 야생형 (WT) TARDBP 유전자인, 상동 염색체에서 기타 TARDBP 유전자좌에 발현하였다. 도 13a는 TDP-43의 N-말단 또는 TDP-43의 C-말단을 인식하는 각자의 α-TDP-43 N-term 또는 α-TDP-43 C-term 항체로 염색된 운동 뉴런의 세포질성 및 핵성 분획을 도시한다 (예를 들면, 도 6a, 참고). loxP-Ex3-loxP/WT 마우스 (●), △NLS/WT 마우스 (▲), 또는 △PLD/WT 마우스 (▼)로부터 단리된 척수 조직의 세포질성 대 핵성 TDP-43의 비를 제공하는 그래프가 또한 제공된다. 도 13b는 16 주령 마우스로 단리된 그리고 인산화된 TDP-43을 인식하는 항체로 염색된 척수 조직의 세포질성 및 핵성 분획의 웨스턴 블랏을 제공한다. 도 13c는 TDP-43의 N-말단 또는 TDP-43의 C-말단을 인식하는 각자의 α-TDP-43 N-term (예를 들면, 도 6a, 참고) 또는 α-TDP-43 C-term 항체 (예를 들면, 도 6a, 참고)로 염색된 세포의 사르코실-가용성 및 사르코실-불용성 분획의 웨스턴 블랏을 제공한다.
도 14는 16 주령 마우스로부터 단리된 척수 조직으로부터 단리된 운동 뉴런의 형광 동소 하이브리드화 이미지를 40X 배율로 제공한다. 시험된 마우스는 (i) 내인성 TARDBP 유전자좌: 플록스된 엑손 3을 포함하는 돌연변이된 TARDBP 유전자 (loxP-Ex3-loxP), NLS에서 녹아웃 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 TARDBP 유전자 (△NLS), 또는 프리온형 도메인의 결실을 포함하는 돌연변이된 TARDBP 유전자 (△PLD)로부터, 그리고 (ii) 야생형 (WT) TARDBP 유전자인, 상동 염색체에서 다른 TARDBP 유전자좌에 발현하였다. 세포는 TDP-43의 N-말단 (α TDP-43 M-term; 최상부 패널)을 인식하는 항체로 또는 항-chAT 항체 및 항-NeuN 항체 (최하부 패널)로 염색되었다. 단지 야생형 TDP-43 (●), 돌연변이체 △NLS TDP-43 폴리펩타이드 및 야생형 TDP-43 폴리펩타이드 (■), 양쪽 돌연변이체 △NLS TDP-43 폴리펩타이드 및 야생형 TDP-43 폴리펩타이드 (■), 또는 양쪽 돌연변이체 △PLD TDP-43 폴리펩타이드 및 야생형 TDP-43 폴리펩타이드 (▲)를 발현시키는 동물에서 세포질성 집합체를 나타내는 운동 뉴런의 백분율을 제공하는 그래프가 또한 도시된다.
도 15a는 16 주령 마우스로부터 단리된 전경골근 조직 또는 늑간근 조직의 형광 동소 하이브리드화 이미지를 10x 또는 40X 배율로 제공한다. 조직은 시냅토피신, 분가로톡신, 및/또는 DAPI를 인식하는 항체로 염색되었다. 화살표는 신경차단된 근육성 접합부를 나타내고, 별표는 부분적으로 신경지배된 신경근육성 접합부를 나타낸다. 도 15b는 loxP-Ex3-loxP/WT 마우스 (●), △NLS/WT 마우스 (▲), 또는 △PLD/WT 마우스 (▼)로부터 단리된 전경골 (TA) 근육 조직 또는 늑간근에서 퍼센트 신경지배된 신경근육성 접합부 (NMJ; y-축)를 제공하는 그래프이다.
상세한 설명
개괄
TDP-43은, RNA 전사, 스플라이싱, 수송, 및 안정성을 포함하는, RNA 프로세싱 및 대사에서 기능하는 주로 핵성 RNA/DNA-결합 단백질이다. TDP-43의 RNA-결합 특성은, 그 자신의 mRNA에서 3' UTR 서열에 결합을 통해서 매개된, 이의 자가조절적 활성에 필수인 것으로 보인다. Ayala 등 (2011) EMBO J.30:277-88. 세포 스트레스 이후, TDP-43은 세포질성 스트레스 과립에 국재화하고 스트레스 과립 형성에서 역할을 할 수 있다. TDP-43은 핵에서 이의 정상 자리부터 세포질까지 오국재화하고, 여기에서 이것이 집합한다. 집합된 TDP-43은 유비퀸화되고, 과인산화되고, 절두된다. 추가적으로, 세포질에서 TDP-43 집합은 ALS의 거의 모든 사례의 구성요소이다. Becker 등 (2017) Nature 544:367-371. ALS 사례의 97 퍼센트는 세포질성 TDP-43 집합체의 사후 병리를 보여준다. 동일한 병리는 산발성 전두측두엽 퇴행 (FTLDU)의 대략적으로 45%에서 보여진다. TDP-43은 FTLDU, 운동 뉴런 질환이 있는 FTLD (FTDMND), 및 ALS/MND (ALS10)의 유비퀴틴-양성, 타우-음성 내포물의 주요 병리적 단백질로 처음 확인되었고, 이들 장애는 TDP-43 단백질이상질환의 상이한 임상 징후를 나타내는 것으로 현재 간주된다. Gitcho 등 (2009) Acta Neuropath 118:633-645. TARDBPB 돌연변이는 가족성 ALS가 있는 환자들의 약 3% 그리고 산발성 질환이 있는 환자들의 약 1.5%에서 발생한다. Lattante 등 (2013) Hum. Mutat. 34:812-26. TARDBP 유전자에서 다양한 돌연변이는 1% 미만의 사례에서 ALS와 연관되었다. 도　1 참고. 도 1에서 도시된 경우에, ALS와 연관된 TARDBP 유전자에서 다수 돌연변이는 프리온형 도메인 (PLD)에서 발견된다. 그러므로, TDP-43에 의해 역할된 모든 기능의 이해는 신경병리 예컨대 ALS, FLTDU, 및 FLTD, 등에서 이의 역할을 설명할 것 같다.
TDP-43이 세포 및 유기체 생명에 필수적이라는 것은 명확하다. TDP-43의 고갈은 배아 치사율을 초래한다. 따라서, 초기 모델은 TDP-43 또는 이들의 돌연변이체 형태의 과발현, 또는 TDP-43의 결실에 의지하였다. ALS 병리에서 TDP-43의 역할을 평가하는 다양한 모델은 창출되었다. Tsao 등 (2012) Brain Res 1462:26-39에서 검토됨.
예를 들어, TDP-43 A315T 돌연변이체를 과발현시키는 트랜스제닉 마우스는 약 3 내지 4 개월령에 진행성 이상을 발달시켰고 약 5 개월령에 사망하였다. Wegorzewska 등 (2009) Proc Natl Acad Sci USA 106:18809-814. 이상이 이들 돌연변이체 마우스의 뇌 및 척수에서 TDP-43 C-말단 단편의 존재와 상관관계가 있었어도, 세포질성 TDP-43 집합체는 검출되지 않았다. 이들 관찰은 TDP-43 연관된 신경퇴행에 대한 뉴런의 취약성이 독성 집합보다 오히려 변경된 DNA/RNA-결합 단백질 기능에 관련된다는 것을 Wegorzewska 등이 제안하게 되었다. Wegorzewska 등 (2009), 상동. 반대로, TDP-43의 과발현을 포함하는 2개 독립적 연구에서, 트랜스제닉 마우스는 세포질성 집합과 상관관계가 있었던 진행성 운동 기능장애를 포함하는 신경퇴행성 특질을 나타냈다. Tsai 등 (2010) J. Exp. Med. 207:1661-1673 및 Wils 등 (2010) Proc Natl Acad Sci USA 107:3858-63).
기능 상실 연구에서, 조건부 녹아웃 돌연변이를 사용하는 TDP-43의 유비쿼터스 결실은 대사적 표현형 및 조기 사망을 나타내는 마우스로 이어졌다. Chiang 등 (2010) Proc Natl Acad Sci USA 107:16320-324. 마우스 배아 줄기 세포에서 TDP-43의 고갈은 특정 유전자의 크립틱 엑손의 mRNA로의 스플라이싱, mRNA의 번역 방해 그리고 넌센스-매개된 mRNA 붕괴 촉진을 초래하였다. Ling 등 (2015) Science 349:650-655. ALS/FTD가 있는 환자로부터 사후 뇌 조직이 크립틱 엑손 스플라이싱의 손상된 억압을 보여주므로, 본 연구는 TDP-43이 크립틱 엑손의 스플라이싱을 정상적으로 억압하고 인트론 무결성을 유지하도록 작용시키는 것, 그리고 TDP-43 스플라이싱 결함이 특정 신경퇴행성 질환에서 TDP-43-단백질이상질환에 기여할 수 있다는 것을 제안한다. Ling 등 (2015), 상동. TDP-43의 N-말단 (예를 들면, NLS)에서 점 돌연변이가 핵에서 TDP-43 올리고머화의 불안정화 그리고 크립틱 스플라이싱 조절의 상실을 초래하므로, N-말단에 의해 구동된 TDP-43의 수미식 올리고머화가 집합 경향의 C-말단 도메인 (예를 들면, PLD)을 분리시키도록, 및 그래서, 병리적 집합체의 형성을 예방하도록 작용한다는 것이 가정된다. Afroz 등 (2017) Nature Communications 8:45.
ALS에서, 명시하기 위한 제1 병리적 속성들 중 하나는 축색돌기가 신경근육성 접합부로부터 수축하여 근육을 신경차단시킨다는 것이다. 이 신경차단은 계속 진행하여 운동 뉴런 세포체의 상실 및 근육 위축을 초래한다. 신경차단은 축색돌기 신경지배의 시냅스전 마커: VAChT, 시냅스 소포 단백질 2 (SV2), 시냅토피신, 및 신경미세섬유의 상실에 의해 관찰될 수 있다. 운동 종판은 남아있지만 결과적으로 단편화하고 소멸할 것이다. 최근에, 용량-의존적 신경차단은 질환-연관된 돌연변이를 포함하는 녹인 TARDBP 유전자에 대하여 동형접합성인 마우스에서 나타났다. Ebstein (2019) Cell Reports 26:364-373.
TDP-43 고갈의 배아 치사율에도 불구하고, 우리는 기능적인 구조적 도메인이 결여된 TDP-43 돌연변이체를 발현시키는 배아 줄기 (ES) 세포가 생존가능하게 남아있고 운동 뉴런 (ESMN)으로 분화될 수 있다는 것을 여기에서 보여준다. 도 4-5, 참고. 이들 관찰은 본원에 기재된 경우에 ES 또는 ESMN이
(1) 기능적인 구조적 도메인이 결여되는, 예를 들면, 기능적 NLS가 결여되는거나, 기능적 RRM1이 결여되거나, 기능적 RRM2가 결여되거나, 기능적 E가 결여되는거나, 기능적 PLD가 결여되고,
(2) 내인성 전사 프로모터 및 전-mRNA 스플라이싱 신호로부터 정상 수준에서 발현되는 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시킨다는 점에서 독특하다. 예를 들면, 도 2 및 도 9, 참고.
본원에 기재된 ES 및 ESMN을 사용하여, RRM1이 ES 세포 및 그로부터 유래된 운동 뉴런의 생존력에 요구되는 것으로 나타난다. 도 4-5, 참고. 게다가, (1) 기능적 NLS 또는 기능적 PLD가 결여된 및 (2) 내인성 유전자좌로부터 정상 수준에서 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 발현은 ESMN에서 ALS 질환의 2개 특질을 재현시킨다:
(i) 핵에서 세포질까지 TDP-43의 재분포, 및
(ii) 세포질성 내포물에서 축적. 도 6-8, 참고.
△PLD 돌연변이체, 즉, 기능적 NLS을 포함하지만 PLD가 결여된 TDP-43 폴리펩타이드가 세포질에서 집합한다는 것이 놀랍다. 예를 들면, Afroz 등 (2017), 상기, 참고. 명백히, △PLD 돌연변이체에 의해 형성된 점상 내포물은 △NLS 돌연변이체, 즉, 기능적 NLS가 결여되고 PLD를 포함하는 TDP-43 폴리펩타이드에 의해 형성된 내포물보다 덜 풍부하고 질적으로 상이한 것으로 보인다. 게다가, △PLD 또는 △NLS를 발현시키는 ESMN의 ALS형 표현형은 유전자의 크립틱 엑손 스플라이싱의 억압에서 양쪽 감소와 상관관계가 있고, 이에 대하여 스플라이스 이벤트는 야생형 TDP-43에 의해 보통 조절된다. 도 9. PLD 도메인, 또는 이의 부문 및 정지 코돈을 인코딩하는 서열이 결여된 택일적 스플라이싱된 TDP-43 mRNA를 초래하는 3'비번역된 영역 인트론을 관여시키는 택일적 스플라이스 이벤트에서 감소와 △PLD 또는 △NLS 돌연변이된 TARDBP 유전자의 발현 사이 ESMN에서 상관관계가 또한 보여진다. 도 10; 또한 Avendano-Vazquez 등 (2012) Genes & Dev. 26:1679-84; Ayala　YM, 등 (2011)　EMBO J　30:　277-288 참고. 이 후자 관찰은 정상 스플라이스 이벤트에서 비롯하는 야생형 또는 ALS-연관된 서열만을 고갈시키는 것이 PLD 돌연변이와 연관된 ALS의 치료를 위하여 잠재적으로 치료적일 수 있다는 것을 제안한다.
야생형 TARDBP 유전자 및 내인성 유전자좌로부터 △PLD 또는 △NLS 돌연변이된 TARDBP 유전자를 발현하는 마우스는 TDP-43 단백질이상질환의 특질을 또한 나타냈다. 핵에서 세포질까지 증가된 TDP-43 오국재화, 세포질성 TDP-43의 인산화, 및 TDP-43의 세포질성 집합은 야생형 단백질만을 발현시키는 동물에 비교하여 돌연변이체 △PLD 또는 △NLS TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 동물의 척수 운동 뉴런에서 관찰되었다 (도 13a-13b, 및 14). PLD가 결여된 TDP-43 돌연변이체가 아닌, 기능적 NLS가 결여된 TDP-43 돌연변이체는 불용성이었다 (도 13c). 게다가, 느린 수축 섬유로 대부분 구성된 근육이 아닌, 빠른 수축 섬유로 대부분 구성된 근육의 신경차단은 돌연변이체 △PLD 또는 △NLS TDP-43 단백질을 발현시키는 이들 마우스에서 또한 관찰되었다 (도 15a-b).
본원에 제공된 발견은 생존가능한 배아 줄기 (ES) 세포, 그리고 그로부터 유래된 조직 및 비-인간 동물 (예를 들면, 원시 외배엽, 그로부터 유래된 운동 뉴런 (ESMN)에서 TDP-43 돌연변이의 평가 방법, 뿐만 아니라 ES 세포, ESMN 세포, 및 기능적인 구조적 도메인이 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 비-인간 동물을 제공한다. ES, ESMN 세포, 기능적인 구조적 도메인이 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 비-인간 동물 (예를 들면, 설치류, 예를 들면, 랫트 및 마우스)은 TDP-43 단백질이상질환의 시험관내 또는 생체내 모델로서, 예를 들면, 이에 대하여 치료적 후보의 식별 방법에서 또한 각각으로 사용될 수 있다.
TARDBP 유전자 및 TDP-43 폴리펩타이드
TARDBP 유전자는, TAR DNA-결합 단백질, TARDBP, 43-KD, 및 TDP43, 및 TDP-43으로서 또한 지칭된, TDP-43폴리펩타이드를 인코딩한다. 상이한 종의 야생형 TARDBP 유전자 및 그로부터 인코딩된 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 핵산 서열은 당업계에 잘 알려진다. 예를 들어, 야생형 TARDBP 유전자 및 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 각자의 핵산 및 아미노산 서열은 그리고 미국 국립 의학 도서관 (NIH) 국립 생명공학 정보 센터 (NCBI) 유전자 데이터베이스에서 찾아질 수 있다. 예를 들면, www.ncbi.nlm.nih.gove/gene/?term=TARDBP에서 웹사이트, 참고. 일부 구현예에서, 야생형 마우스 TARDBP 유전자는 GenBank 등록 번호 NP_663531 (서열번호:1)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 야생형 마우스 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 보존적 아미노산 치환으로 인해 동종과 상이한 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 야생형 마우스 TARDBP 유전자는 GenBank 등록 번호 NM_145556.4 (서열번호:2)로서 제시된 핵산 서열, 또는 유전 코드의 퇴화 및/또는 보존적 코돈 치환으로 인해 동종과 상이한 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 야생형 랫트 TARDBP 유전자는 GenBank 등록 번호 NP_001011979 (서열번호:3)로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 야생형 랫트 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 보존적 아미노산 치환으로 인해 동종과 상이한 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 야생형 랫트 TARDBP 유전자는 GenBank 등록 번호 NM_001011979.2 (서열번호:4)로서 제시된 핵산 서열, 또는 유전 코드의 퇴화 및/또는 보존적 코돈 치환으로 인해 동종과 상이한 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 야생형 인간 TARDBP 유전자는 GenBank 등록 번호 NP_031401.1 (서열번호:5)로서 제시된 아미노산을 포함하는 TDP-43 폴리펩타이드, 또는 보존적 아미노산 치환으로 인해 동종과 상이한 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 야생형 인간 TARDBP 유전자는 GenBank 등록 번호 NM_007375.3 (서열번호:6)으로서 제시된 핵산 서열, 또는 유전 코드의 퇴화 및/또는 보존적 코돈 치환으로 인해 동종과 상이한 이의 변이체를 포함한다.
돌연변이된 TARDBP 유전자가 본원에 기재된다. 돌연변이된 TARDBP 유전자는 녹아웃 돌연변이를 포함할 수 있다. 돌연변이된 TARDBP 유전자는 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있고, 여기서 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 기능적인 구조적 도메인이 결여된다. 예를 들어, 돌연변이된 TARDBP 유전자는 구조적 도메인의 한 부문 또는 전체의 점 돌연변이, 안으로의 삽입, 및/또는 결실을 포함하는 TDP-43 구조적 도메인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있고, 여기서 점 돌연변이, 삽입, 및/또는 결실은 구조적 도메인의 기능 상실을 초래하고, 여기서 돌연변이된 TARDBP 유전자는, 돌연변이로 인해 기능적인 구조적 도메인이 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드에도 불구하고, TDP-43 폴리펩타이드를 여전히 인코딩한다. 폴리펩타이드는 적어도 하나의 야생형 TDP-43 구조적 도메인 또는 이의 변이체를 포함하고/거나 항-TDP-43 항체 또는 이의 항원 결합 부문에 의해 특이적으로 결합되는 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드로서 지칭될 수 있다. 유사하게, 돌연변이된 TARDBP 유전자는 그렇게 분류될 수 있어서 돌연변이된 TARDBP 유전자는 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드, 예를 들면, 적어도 하나의 야생형 TDP-43 구조적 도메인 또는 이의 변이체를 포함하고/거나 항-TDP-43 항체 또는 이의 항원 결합 부문에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 폴리펩타이드를 인코딩한다.
TDP-43의 구조적 도메인은 핵 국재화 신호 (NLS), 2개 RNA 인식 모티프 (RRM1 및 RRM2), 추정적 핵 유출 신호 (E), 및 글리신 풍부 프리온형 도메인 (PLD)으로서 식별되었다. 도 1 및 2 참고. 야생형 TDP-43 폴리펩타이드는 아미노산 82-99에서 TDP-43 NLS, 아미노산 106-176에서 TDP-43 RRM1, 아미노산 191-262에서 TDP-43 RRM2, 아미노산 239-248에서 TDP-43 E, 및 아미노산 274-414에서 TDP-43 PLD를 포함한다.
고전적 NLS 서열은 염기성 아미노산들, 주로 리신 (K) 및 아르기닌 (R) 잔기의 스트레치를 포함하고, 이분 NLS는 약 10-13개 아미노산을 포함하는 링커 영역에 의해 분리된 이들 염기성 아미노산의 2개 클러스터를 포함한다. 고전적 NLS의 염기성 아미노산 서열의 아미노산 치환 및/또는 결실은 고전적 NLS의 기능을 폐기할 수 있다. McLane and Corbett (2009) IUBMB Life 61:697-706. TDP-43 NLS는 위치 82, 83, 84, 95, 97, 및 98에서 리신 및 아르기닌 잔기를 포함한다. 위치 82, 83, 84, 95, 97, 및/또는 98에서 아미노산 치환 및/또는 결실을 포함하기 위해 변형된 야생형 TDP-43 폴리펩타이드는 기능적 NLS가 결여될 수 있다. 기능적 NLS가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 위치 82, 83, 84, 95, 97, 및/또는 98에서 아미노산 치환 및/또는 결실을 포함하기 위해 변형된 서열번호:1에서 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 기능적 NLS가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 위치 82, 83, 84, 95, 97, 및/또는 98에서 아미노산 치환 및/또는 결실을 포함하기 위해 변형된 서열번호:3에서 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 기능적 NLS가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 위치 82, 83, 84, 95, 97, 및 /또는 98에서 아미노산 치환 및/또는 결실을 포함하기 위해 변형된 서열번호:5에서 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 기능적 TDP-43 NLS가 결여된 돌연변이체 TDP-43 단백질을 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자는 (i) 82, 83, 84, 95, 97, 및/또는 98, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환, 및/또는 (ii) 포티온스 82 및 98에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실을 포함하기 위해 변형된 서열번호:1, 서열번호:3, 또는 서열번호:5로서 제시된 서열을 포함하는 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 기능적 TDP-43 NLS가 결여된 돌연변이체 TDP-43 단백질을 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자는 K82A K83A, R84A, K95A, K97A, K98A 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함하기 위해 변형된 서열번호:1, 서열번호:3 또는 서열번호:5로서 제시된 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 기능적 TDP-43 NLS가 결여된 돌연변이체 TDP-43 단백질을 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자는 하기 아미노산 치환: K82A K83A, R84A, K95A, K97A, 및 K98A을 포함하기 위해 변형된 서열번호:1, 서열번호:3 또는 서열번호:5로서 제시된 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
전형적 RRM에 의한 RNA 결합은 전형적 RRM의 4-가닥 역평행 β 시트의 표면과 단일 가닥 RNA 사이 실시된 접촉에 의해 보통 달성된다. Melamed 등 (2013) RNA 19:1537-1551. 중심적 2개 β 가닥에서 2개 고도로 보존된 모티프, RNP1 (공통 K/R-G-F/Y-G/A-F/Y-V/I/L-X-F/Y, 여기에서 X는 임의의 아미노산임) 및 RNP2 (공통 I/V/L-F/Y-I/V/L-X-N-L, 여기에서 X는 임의의 아미노산임)는 RNA 결합의 일차 매개체이다. Melamed 등 (2013), 상동.
야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 아미노산 위치 106-176에 자리잡은, TDP-43 RRM1은 아미노산 위치 106-111에 자리잡은 RNP2 공통 서열 (LIVLGL; 서열번호:7) 그리고 아미노산 위치 145-152에 자리잡은 RNP1 공통 서열 (KGFGFVRF; 서열번호:8)을 포함한다. 이전에, W113, T115, F147, F149, D169, R171, 및 N179는 핵산 결합에 대하여 임계적 잔기로서 식별되었다. (i) 113, 115, 147, 149, 169, 171, 179 및 임의의 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환, (ii) 위치 106-176에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실 또는 치환, (iii) 위치 106-111에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실 또는 치환, (iv) 145-152에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실 또는 치환, 또는 (v) (i)-(iv)의 임의의 조합을 포함하기 위해 변형된 야생형 TDP-43 폴리펩타이드는 기능적 RRM1이 결여될 수 있다. 기능적 RRM1이 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 (i) 113, 115, 147, 149, 169, 171, 179 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환, (ii) 위치 106-176에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실 또는 치환, (iii) 위치 106-111에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실 또는 치환, (iv) 145-152에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실 또는 치환, 또는 (v) (i)-(iv)의 임의의 조합을 포함하기 위해 변형된 서열번호:1로서 제시된 서열을 포함할 수 있다. 기능적 RRM1이 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 (i) 113, 115, 147, 149, 169, 171, 179 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환, (ii) 위치 106-176에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실 또는 치환, (iii) 위치 106-111에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실 또는 치환, (iv) 145-152에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실 또는 치환, 또는 (v) (i)-(iv)의 임의의 조합을 포함하기 위해 변형된 서열번호:3으로서 제시된 서열을 포함할 수 있다. 기능적 RRM1이 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 (i) 113, 115, 147, 149, 169, 171, 179 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환, (ii) 위치 106-176에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실 또는 치환, (iii) 위치 106-111에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실 또는 치환, (iv) 145-152에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실 또는 치환, 또는 (v) (i)-(iv)의 임의의 조합을 포함하기 위해 변형된 서열번호:5로서 제시된 서열을 포함할 수 있다, 따라서, 기능적 RRM1이 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자는 (i) 113, 115, 147, 149, 169, 171, 179 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환, (ii) 위치 106-176에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실 또는 치환, (iii) 위치 106-111에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실 또는 치환, (iv) 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 145-152에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실 또는 치환, 또는 (v) (i)-(iv)의 임의의 조합을 포함하기 위해 변형된 서열번호:1, 서열번호:3, 또는 서열번호:5로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 기능적 RRM1이 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자는 F147L 및/또는 F149L 돌연변이를 포함하기 위해 변형된 서열번호:1, 서열번호:3, 또는 서열번호:5로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 기능적 RRM1이 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자는 하기 아미노산 치환: F147L 및/또는 F149L을 포함하기 위해 변형된 서열번호:1, 서열번호:3, 또는 서열번호:5로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 아미노산 위치 191-262에 자리잡은, TDP-43 RRM2는 아미노산 위치 193-198에 자리잡은 RNP2 공통 서열 (VFVGRC; 서열번호:9) 그리고 아미노산 위치 227-233에 자리잡은 RNP1 공통 서열 (RAFAFVT; 서열번호:10)을 포함한다. F194 및 F229는 핵산 결합에 대하여 임계적 잔기로 간주될 수 있다. (i) 194 및/또는229로 이루어지는 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환, (ii) 위치 193-198에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실 또는 치환, (iii) 위치 227-233에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실 또는 치환, (iv) 191-262에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실 또는 치환, 또는 (v) (i)-(v)의 임의의 조합을 포함하기 위해 변형된 야생형 TDP-43 폴리펩타이드는 기능적 RRM2가 결여될 수 있다. 기능적 RRM2가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 (i) 194 및/또는 229로 이루어지는 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환, (ii) 위치 193-198에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실 또는 치환, (iii) 위치 227-233에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실 또는 치환, (iv) 191-262에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실 또는 치환, 또는 (v) (i)-(iv)의 임의의 조합을 포함하기 위해 변형된 서열번호:1로서 제시된 서열을 포함할 수 있다. 기능적 RRM2가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 (i) 194 및/또는 229로 이루어지는 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환, (ii) 위치 193-198에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실 또는 치환, (iii) 위치 227-233에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실 또는 치환, (iv) 191-262에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실 또는 치환, 또는 (v) (i)-(iv)의 임의의 조합을 포함하기 위해 변형된 서열번호:3으로서 제시된 서열을 포함할 수 있다. 기능적 RRM2가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 (i) 194 및/또는 229로 이루어지는 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환, (ii) 위치 193-198에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실 또는 치환, (iii) 위치 227-233에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실 또는 치환, (iv) 191-262에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실 또는 치환, 또는 (v) (i)-(iv)의 임의의 조합을 포함하기 위해 변형된 서열번호:5로서 제시된 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 기능적 RRM2가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자는 (i) 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 위치 194 및/또는 229에서 아미노산 치환 (ii) 위치 191-262에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실 또는 치환, 또는 (iii) 양쪽 (i) 및 (ii)를 포함하기 위해 변형된 서열번호:1, 서열번호:3, 또는 서열번호:5로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 기능적 RRM2가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자는 F194L 및/또는 F229L 돌연변이를 포함하기 위해 변형된 서열번호:1, 서열번호:3, 또는 서열번호:5로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 기능적 RRM2가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자는 F194L 및 F229L 돌연변이를 포함하기 위해 변형된 서열번호:1, 서열번호:3, 또는 서열번호:5로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 핵 유출 신호는 아미노산 239-248에 자리잡을 수 있다. 기능적 핵 유출 신호가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 위치 236-251에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실 또는 치환을 포함하기 위해 변형된 서열번호:1로서 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 핵 유출 신호가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 적어도 아미노산 239-250의 결실을 포함하기 위해 변형된 서열번호:1로서 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 핵 유출 신호가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 위치 236-251에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실을 포함하기 위해 변형된 서열번호:3으로서 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 핵 유출 신호가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 적어도 아미노산 239-250의 결실을 포함하기 위해 변형된 서열번호:3으로서 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 핵 유출 신호가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 위치 236-251에서 그리고 그 사이 임의의 아미노산의 결실을 포함하기 위해 변형된 서열번호:5로서 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 핵 유출 신호가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 적어도 아미노산 239-250의 결실을 포함하기 위해 변형된 서열번호:5로서 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 기능적 핵 유출 신호가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자는 236-251에서 그리고 그 사이 아미노산의 결실, 예를 들면, 239-250에서 그리고 그 사이 아미노산의 결실을 포함하기 위해 변형된 서열번호:1, 서열번호:3, 또는 서열번호:5로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 프리온형 도메인 (PLD)은 아미노산 274-414에 자리잡을 수 있다. 기능적 PLD가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 위치 274-414에서 그리고 그 사이 적어도 하나의 또는 모든 아미노산의 결실을 포함하기 위해 변형된 서열번호:1로서 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 기능적 PLD가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 위치 274-414에서 그리고 그 사이 적어도 하나의 또는 모든 아미노산의 결실을 포함하기 위해 변형된 서열번호:3으로서 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 기능적 PLD가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 위치 274-414에서 그리고 그 사이 적어도 하나의 또는 모든 아미노산의 결실을 포함하기 위해 변형된 서열번호:5로서 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자는 위치 274-414에서 그리고 그 사이 적어도 하나의 또는 모든 아미노산의 결실을 포함하기 위해 변형된 서열번호:1, 서열번호:3 또는 서열번호:5로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
돌연변이된 TARDBP 유전자는 도 3a에서 예시된 구조를 포함할 수 있다. 돌연변이된 TARDBP 유전자는 도 3a에서 묘사된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다.
돌연변이체 TARDBP 유전자를 포함하고 발현시키는 세포 및 비-인간 동물의 제조 방법
상기 개괄된 경우에, 방법 및 조성물은 TARDBP 유전자좌의 표적된 유전 변형을 허용하기 위해, 예를 들면, 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함하는 세포를 제조하기 위하여 및/또는 TDP-43 구조적 도메인의 생물학적 기능을 평가하기 위하여 본원에 제공된다. 추가의 표적된 유전 변형이 실시될 수 있음이 추가로 인식된다. 이들 표적된 유전 변형을 허용하는 그러한 시스템은 다양한 구성요소들을 이용할 수 있고 참조의 편의를 위하여, 본원에 용어 "표적된 게놈성 통합 시스템"은 총칭으로 통합 이벤트에 요구된 모든 구성요소들 (즉 다양한 뉴클레아제 제제, 인식 부위, 삽입 DNA 폴리뉴클레오타이드, 표적화 벡터, 표적 게놈성 유전자좌, 등)을 포함한다.
돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 비-인간 동물 세포의 제조 방법 및/또는 TDP-43 구조적 도메인의 생물학적 기능을 평가하는 방법은 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함하기 위해 세포의 게놈을 변형시키는 단계를 포함할 수 있다. 돌연변이된 TARDBP 유전자는 돌연변이체 TDP 43 폴리펩타이드를 인코딩시킬 수 있고, 여기서 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 기능적인 구조적 도메인이 결여된다.
돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 비-인간 동물 세포의 제조 방법 및/또는 TDP-43 구조적 도메인의 생물학적 기능을 평가하는 방법은 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함하기 위해 세포의 게놈을 변형시키는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 돌연변이된 TARDBP 유전자는 녹아웃 돌연변이를 포함한다.
본원에 제공된 방법은 표적된 게놈성 통합 시스템의 다양한 구성요소들을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드들 또는 폴리펩타이드 작제물들을 세포에 도입하는 단계를 포함한다. "도입하기"는 서열이 세포의 내부에 접근하는 방식으로 서열 (폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드)을 세포에 제시하는 것을 의미한다. 본원에 제공된 방법은 표적된 게놈성 통합 시스템의 임의의 구성요소를 세포에 도입하기 위한 특정한 방법에 의존하지 않고, 단지 폴리뉴클레오타이드가 하나 이상의 세포의 내부에 접근하는 것에 의존한다. 폴리뉴클레오타이드를 다양한 세포 유형으로 도입하는 방법은 당업계에서 알려지고, 비제한적으로, 안정한 형질감염 방법, 일시적 형질감염 방법, 및 바이러스-매개된 방법을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 방법 및 조성물에서 이용된 세포들은 그들의 게놈에 안정하게 편입된 DNA 작제물을 갖는다. "안정하게 편입된" 또는 "안정하게 도입된"은 뉴클레오타이드 서열이 세포의 게놈으로 통합하고 이의 자손에 의해 유전될 수 있도록 세포에 폴리뉴클레오타이드의 도입을 의미한다. 임의의 프로토콜은 표적된 게놈성 통합 시스템의 DNA 작제물 또는 다양한 구성요소의 안정한 편입에 사용될 수 있다.
형질감염 프로토콜 뿐만 아니라 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 세포에 도입하기 위한 프로토콜은 다양할 수 있다. 비-제한 형질감염 방법은 화학적-기반된 형질감염 방법을 포함한다 리포솜; 나노입자; 인산칼슘 (Graham 등 (1973). Virology 52 (2): 456-67, Bacchetti 등 (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74 (4): 1590-4 and, Kriegler, M (1991). Transfer and Expression: A Laboratory Manual. New York: W. H. Freeman and Company. pp.　96-97); 덴드리머; 또는 양이온성 중합체 예컨대 DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민의 사용을 포함한다. 비 화학적 방법은 전기천공; 초음파-천공; 및 광학 형질감염을 포함한다. 입자계 형질감염은 유전자 총, 자석 보조 형질감염 (Bertram, J. (2006) Current Pharmaceutical Biotechnology 7, 277-28)의 사용을 포함한다. 바이러스성 방법은 형질감염에 또한 사용될 수 있다.
돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함하는 세포는 본원에 개시된 다양한 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 변형시키는 단계는 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자로 내인성 TARDBP 유전자를 대체하는 단계 및/또는 녹아웃 돌연변이, 예컨대 조건부 녹아웃 돌연변이를 포함하는 TARDBP 유전자로 내인성 TARDBP 유전자를 대체하는 단계를 포함할 수 있다. 변형시키는 단계는 녹아웃 돌연변이를 포함하는 TARDBP 유전자의 발현을 제거하는 조건에서 세포를 배양시키는 단계를 포함할 수 있다. TARDBP 유전자의 발현을 제거할 수 있는 조건은 리콤비나제 단백질, 예를 들면, cre-리콤비나제를 발현시키는 단계를 포함할 수 있다.
그러한 변형시키기 방법은 (1) 비-인간 동물의 다능성 세포의 관심 표적 TARDBP 게놈성 유전자좌에서 돌연변이된 TARDBP 유전자를 통합시켜 본원에 개시된 방법을 이용하는 표적된 TARDBP 게놈성 유전자좌에서 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함하는 유전적으로 변형된 다능성 세포를 생성하는 단계; 및 (2) 표적 TARDBP 게놈성 유전자좌에서 돌연변이된 TARDBP 유전자를 갖는 유전적으로 변형된 다능성 세포를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 동물은 (3) 예를 들면, 전-상실기에서, 비-인간 동물의 숙주 배아에 유전적으로 변형된 다능성 세포를 도입시키는 단계; 그리고 (4) 유전적으로 변형된 다능성 세포를 포함하는 숙주 배아를 대리모에 이식시켜 유전적으로 변형된 다능성 세포에서 유래된 F0 세대를 생성하는 단계에 의해 추가로 생성될 수 있다. 비-인간 동물은 비-인간 포유동물, 설치류, 마우스, 랫트, 햄스터, 원숭이, 농업용 포유동물 또는 가정용 포유동물, 또는 어류 또는 조류일 수 있다.
다능성 세포는 인간 ES 세포, 비-인간 ES 세포, 설치류 ES 세포, 마우스 ES 세포, 랫트 ES 세포, 햄스터 ES 세포, 원숭이 ES 세포, 농업용 포유동물 ES 세포 또는 가축화된 포유동물 ES 세포일 수 있다. 다른 구현예에서, 다능성 세포는 비-인간 세포, 포유류 세포, 인간 세포, 비-인간 포유류 세포, 인간 다능성 세포, 인간 ES 세포, 인간 성체 줄기 세포, 발달적으로-한정된 인간 전구 세포, 인간 iPS 세포, 설치류 세포, 랫트 세포, 마우스 세포, 햄스터 세포이다. 일 구현예에서, 표적된 유전 변형은 돌연변이된 TARDBP 유전자를 초래한다.
마우스 다능성 세포, 전능성 세포, 또는 숙주 배아는, 예를 들어, 근교 균주, 하이브리드 균주, 및 비근교 균주를 포함하는 마우스의 임의의 균주에서 나올 수 있다. 마우스 균주의 예는 129 균주, C57BL 균주 (예를 들면, C57BL/6 균주), 129 및 C57BL/6 (예를 들면, 50% 129 및 50% C57BL/6)의 믹스, BALB/c 균주, 및 스위스 웹스터 균주를 포함한다. 129 균주의 예는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (예를 들면, 12951/SV, 12951/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 12959/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 및 129T2를 포함한다 (예를 들면, Festing 등 (1999) Revised nomenclature for 129 mice, Mammalian Genome 10:836, 참고). C57BL 균주의 예는 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, 및 C57BL/01a를 포함한다. 마우스는 상기 언급된 129 균주 (예를 들면, 129S6 (129/SvEvTac) 균주) 및 상기 언급된 C57BL/6 균주의 믹스, 하나 이상의 상기 언급된 129 균주들의 믹스, 또는 하나 이상의 상기 언급된 C57BL 균주들의 믹스일 수 있다. 마우스는 또한 129 균주를 배제하는 균주에서 나올 수 있다.
랫트 다능성 세포, 전능성 세포, 또는 숙주 배아는, 예를 들어, 근교 균주, 하이브리드 균주, 및 비근교 균주를 포함하는 임의의 랫트 균주에서 나올 수 있다. 랫트 균주의 예는 ACI 랫트 균주, 다크 아구티 (DA) 랫트 균주, 위스타 랫트 균주, LEA 랫트 균주, 스프라그 돌리 (SD) 랫트 균주, 또는 피셔 랫트 균주 예컨대 피셔 F344 또는 피셔 F6을 포함한다. 랫트 다능성 세포, 전능성 세포, 또는 숙주 배아는 상기 인용된 2개 이상 균주의 믹스에서 유래된 균주로부터 또한 수득될 수 있다. 예를 들어, 랫트 다능성 세포, 전능성 세포, 또는 숙주 배아는 DA 균주 및 ACI 균주로부터 선택된 균주에서 또한 유래될 수 있다. ACI 랫트 균주는, 흰색 복부 및 발 및 RT1 av1 일배체형으로, 블랙 아구티를 갖는 것을 특징으로 한다. 그러한 균주는 Harlan Laboratories를 포함하는 다양한 공급처로부터 이용가능하다. ACI 랫트로부터 랫트 ES 세포주의 예는 ACI.G1 랫트 ES 세포이다. 다크 아구티 (DA) 랫트 균주는 아구티 코트 및 RT1 av1 일배체형을 갖는 것을 특징으로 한다. 그러한 랫트는 Charles River 및 Harlan Laboratories를 포함하는 다양한 공급처로부터 이용가능하다. DA 랫트로부터 랫트 ES 세포주의 예는 및 DA.2B 랫트 ES 세포주 또는 DA.2C 랫트 ES 세포주이다. 랫트 균주의 다른 예는, 예를 들어, US 2014/0235933, US 2014/0310828, 및 US 2014/0309487에서 제공되고, 이들의 각각은 전체 목적을 위하여 이 전체가 참고로 본원에 편입된다.
예를 들어, 생식계열-전송가능한 랫트 ES 세포는 N2 보충물, B27 보충물, 약 50 U/mL 내지 약 150 U/mL 백혈병 억제 인자 (LIF), 그리고 MEK 억제제 및 GSK3 억제제로 이루어지는 억제제들의 조합을 포함하는 배지로 피더 세포 층에서 단리된 랫트 ES 세포를 배양시킴으로써 수득될 수 있고, 여기서 피더 세포 층은 LIF를 발현시키기 위해 변형되지 않고, 여기서 랫트 ES 세포는 (i) 랫트 ES 세포의 게놈에 선택 마커를 포함하는 이종 폴리뉴클레오타이드의 적어도 하나의 삽입을 포함하는 표적된 유전 변형을 포함하기 위해 변형되었고 생식계열을 통해서 표적된 유전 변형을 전송할 수 있고; (ii)정상 핵형을 갖고; (iii) c-Myc의 발현이 결여되고; (iv) 배양물에서 구형, 자유-부유 콜로니를 형성한다 (예를 들어, US 2014-0235933 A1 및 US 2014-0310828 A1, 참고, 이들의 각각은 이 전체가 참고로 편입된다). 랫트 배아 줄기 세포의 유도체화 및 표적된 변형의 다른 예는, 예를 들면, Yamamoto 등 ("Derivation of rat embryonic stem cells and generation of protease-activated receptor-2 knockout rats," Transgenic Res. 21:743-755, 2012) 그리고 Kwamata and Ochiya ("Generation of genetically modified rats from embryonic stem cells," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107(32):14223-14228, 2010)에서 제공된다.
핵성 이송 기법은 비-인간 동물을 생성하는데 또한 사용될 수 있다. 간략하게, 핵성 이송 방법은 (1) 난모세포를 제핵시키는 단계; (2) 제핵된 난모세포와 조합되도록 공여체 세포 또는 핵을 단리시키는 단계; (3) 세포 또는 핵을 제핵된 난모세포에 삽입시켜 재구성된 세포를 형성하는 단계; (4) 재구성된 세포를 동물의 자궁에 이식하여 배아를 형성하는 단계; 및 (5) 배아를 발달시키는 단계를 포함한다. 그러한 방법들에서 난모세포는, 이들이 살아있는 동물의 어느 한쪽 난관 및/또는 난소로부터 또한 단리될 수 있어도, 죽은 동물로부터 일반적으로 회수된다. 난모세포는 제핵에 앞서 당업자들에게 알려진 다양한 배지에서 성숙될 수 있다. 난모세포의 제핵은 당업자에게 잘 알려진 다수의 방식으로 수행될 수 있다. 재구성된 세포를 형성하기 위해 제핵된 난모세포에 공여체 세포 또는 핵의 삽입은 보통 융합에 앞서 투명대 아래에 공여체 세포의 미세주사에 의한 것이다. 융합은 접촉/융합 면에 걸쳐서 DC 전기적 펄스의 적용 (전기융합)에 의해, 융합-촉진 화학물, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜에 세포의 노출에 의해, 또는 불활성화된 바이러스, 예컨대 센다이 바이러스의 방식으로 유도될 수 있다. 재구성된 세포는 핵성 공여체 및 수령체 난모세포의 융합 전에, 도중, 및/또는 후에 전기적 및/또는 비-전기적 수단에 의해 전형적으로 활성화된다. 활성화 방법은 전기 펄스, 화학적으로 유도된 충격, 정자에 의한 침투, 난모세포에서 2가 양이온의 증가된 수준, 그리고 난모세포에서 세포성 단백질의 (키나제 억제제를 통해) 인산화 감소를 포함한다. 활성화된 재구성된 세포, 또는 배아는 당업자에게 잘 알려진 배지에서 전형적으로 배양되고 그 다음 동물의 자궁에 이송된다. 예를 들어, US20080092249, WO/1999/005266A2, US20040177390, WO/2008/017234A1, 및 미국 특허 번호 7,612,250, 참고, 이들의 각각은 참고로 본원에 편입됨.
(a) 본원에 기재된 다양한 방법을 이용하는 원핵 세포에서 비-인간 동물의 표적된 게놈성 TARDBP 유전자좌를 변형시키는 단계; (b) 표적된 게놈성 유전자좌에 유전 변형을 포함하는 변형된 원핵 세포를 선택하는 단계; (c) 변형된 원핵 세포의 게놈으로부터 유전적으로 변형된 표적화 벡터를 단리시키는 단계; (d) 비-인간 동물의 다능성 세포에 유전적으로 변형된 표적화 벡터를 도입하여 표적된 TARDBP 게놈성 유전자좌에서 삽입 핵산을 포함하는 유전적으로 변형된 다능성 세포를 생성하는 단계; (e) 유전적으로 변형된 다능성 세포를 선택하는 단계; (f) 전-상실기에서 비-인간 동물의 숙주 배아에 유전적으로 변형된 다능성 세포를 도입하는 단계; 및 (g) 유전적으로 변형된 다능성 세포를 포함하는 숙주 배아를 대리모에 이식하여 유전적으로 변형된 다능성 세포에서 유래된 F0 세대를 생성하는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 경우에 이의 생식계열에서 하나 이상의 유전 변형을 포함하는 비-인간 동물의 다른 제조 방법이 제공된다. 그러한 방법에서 표적화 벡터는 대형 표적화 벡터를 포함할 수 있다. 비-인간 동물은 비-인간 포유동물, 설치류, 마우스, 랫트, 햄스터, 원숭이, 농업용 포유동물 또는 가정용 포유동물일 수 있다. 다능성 세포는 인간 ES 세포, 비-인간 ES 세포, 설치류 ES 세포, 마우스 ES 세포, 랫트 ES 세포, 햄스터 ES 세포, 원숭이 ES 세포, 농업용 포유동물 ES 세포 또는 가정용 포유동물 ES 세포일 수 있다. 다른 구현예에서, 다능성 세포는 비-인간 세포, 포유류 세포, 인간 세포, 비-인간 포유류 세포, 인간 다능성 세포, 인간 ES 세포, 인간 성체 줄기 세포, 발달적으로-한정된 인간 전구 세포, 인간 iPS 세포, 인간 세포, 설치류 세포, 랫트 세포, 마우스 세포, 햄스터 세포이다. 일 구현예에서, 표적된 유전 변형은 돌연변이된 TARDBP 유전자, 예를 들면, 기능적인 구조적 도메인이 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이체 TARDBP 유전자 및/또는 녹아웃 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 TARDBP 유전자를 초래한다
추가 방법에서, 단리시키기 단계 (c)는 (c1) 유전적으로 변형된 표적화 벡터 (즉, 유전적으로 변형된 LTVEC)를 선형화시키는 단계를 추가로 포함한다. 더욱 추가 구현예에서, 도입하기 단계 (d)는 (d1) 뉴클레아제 제제를 다능성 세포에 도입하여 상동 재조합을 용이하게 하는 단계를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 선택하기 단계 (b) 및/또는 (e)는 본원에 기재된 경우에 선택가능한 제제를 원핵 세포 또는 다능성 세포에 적용시킴으로써 실시된다. 일 구현예에서, 선택하기 단계 (b) 및/또는 (e)는 본원에 기재된 경우에 대립유전자의 변형 (MOA) 검정을 통해 실시된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 표적 게놈성 유전자좌의 다양한 유전 변형은 VELOCIGENE® 유전 공학 기술을 사용하는 박테리아성 인공 염색체 (BAC) DNA에서 유래된 LTVEC을 사용하여 박테리아성 세포에서 일련의 상동 재조합 반응 (BHR)에 의해 실시될 수 있다 (예를 들면, 미국 특허 번호 6,586,251 및 Valenzuela, D. M. 등 (2003), Nature Biotechnology 21(6): 652-659, 참고, 그들 전체가 참고로 본원에 편입됨).
일부 구현예에서, 본원에 기재된 경우에 다양한 유전 변형을 포함하는 표적된 다능성 및/또는 전능성 세포는 삽입 공여체 세포로서 사용되고, VELOCIMOUSE® 방법을 통해, 상응하는 유기체, 예를 들면, 8-세포 기 마우스 배아로부터 전-상실기 배아에 도입된다 (예를 들면, US 7,576,259, US 7,659,442, US 7,294,754, 및 US 2008-0078000 A1, 참고, 이들 모두는 그들 전체가 참고로 본원에 편입됨). 유전적으로 변형된 다능성 및/또는 전능성 세포를 포함하는 비-인간 동물 배아는 배반포 기까지 인큐베이션되고 그 다음 대리모에 이식되어 F0 세대를 생산한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 경우에 다양한 유전 변형을 포함하는 표적된 포유류 ES 세포는 배반포 기 배아에 도입된다. 유전적으로 변형된 게놈성 유전자좌 (즉 TARDBP 유전자좌)를 보유하는 비-인간 동물은 본원에 기재된 경우에 대립유전자의 변형 (MOA) 검정을 통해 식별될 수 있다. 유전적으로 변형된 다능성 및/또는 전능성 세포에서 유래된 생성된 F0 세대 비-인간 동물은 야생형 비-인간 동물에 교배되어 F1 세대 자손을 수득한다. 특이적 프라이머 및/또는 프로브로 유전자형화 이후, 유전적으로 변형된 게놈성 유전자좌에 대하여 이형접합성인 F1 비-인간 동물은 서로 교배되어 유전적으로 변형된 게놈성 유전자좌에 대하여 동형접합성인 F2 세대 비-인간 동물 자손을 생산한다.
일 구현예에서, 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함하는 세포의 제조 방법이 제공된다. 그와 같은 방법은 (a) 5' 및 3' 상동성 아암에 의해 측접된 돌연변이된 TARDBP 유전자 또는 이들의 돌연변이된 부문을 포함하는 표적화 작제물과 다능성 세포를 접촉시키는 단계를 포함함; 여기서 표적화 작제물은 세포의 게놈에서 TARDBP 유전자좌로 상동 재조합을 겪어 변형된 다능성 세포를 형성한다. 비-인간 동물의 제조 방법은 (b) 변형된 다능성 세포를 숙주 배아에 도입하는 단계; 및 (c) 대리모에서 숙주 배아를 잉태하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 대리모는 변형된 TARDBP 유전자좌를 포함하는 자손을 생산하고, 여기서 상기 유전 변형은 기능적인 구조적 도메인이 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 초래한다.
일부 구현예에서, 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함하는 세포는 돌연변이된 TARDB 유전자를 포함시키기 위해 ES 세포를 변형시킴 그리고 분화 배지에서 ES 세포를 시험관내 배양시킴으로써 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, ES 세포를 시험관내 배양시키기는 ES 세포를 원시 외배엽 세포 또는 배아 줄기 세포 유래된 운동 뉴런 (ESMN)으로 분화시키는 것을 포함한다.
세포 및 동물
본원에 개시된 (비-인간 동물 조직 또는 비-인간 동물 내에서 포함될 수 있는) 세포는 본원에 개시된 경우에 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함하는 임의의 유형의 세포일 수 있다. 세포는 돌연변이된 비-인간 동물 TARDBP 유전자 (예를 들면, 비-인간 동물의 돌연변이된 TARDBP 유전자) 또는 돌연변이된 인간 TARDBP 유전자를 포함할 수 있다.
세포는 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함할 수 있고, 여기서 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 기능적인 구조적 도메인이 결여되고, 여기서 세포는 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시킨다. 예를 들어, 세포는 핵 국재화 신호 (NLS), RNA 인식 모티프 1 (RRM1), RNA 인식 모티프 2 (RRM2), 추정적 핵 유출 신호 (E), 프리온형 도메인 (PLD), 또는 이들의 조합을 포함하는 기능적인 구조적 도메인이 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함할 수 있다. 세포는 하기: (a) NLS에서 아미노산의 점 돌연변이 (예를 들면, K82A K83A, R84A, K95A, K97A, K98A 또는 이들의 조합), (b) RRM1에서 아미노산의 점 돌연변이 (예를 들면, F147L 및/또는 F149L) (c) RRM2에서 아미노산의 점 돌연변이 (F194L 및/또는 F229L), (d) 핵 유출 신호의 적어도 한 부문의 결실 (예를 들면, 야생형 TDP-43 단백질의 위치 239 및 250에서 그리고 그 사이 아미노산의 결실), 및 (e) 프리온형 도메인의 적어도 한 부문의 결실 (예를 들면, 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 위치 274 및 414에서 그리고 그 사이 아미노산의 결실) 중 하나 이상으로 인해 기능적인 구조적 도메인이 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함할 수 있다. 세포는 하기 돌연변이: K82A K83A, R84A, K95A, K97A, 및 K98A를 포함하는 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함할 수 있고, 여기서 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 기능적 NLS가 결여된다. 세포는 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 위치 274 내지 414에서 아미노산을 포함하는 그리고 그 사이 결실을 포함하는 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함할 수 있고, 여기서 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 기능적 PLD가 결여된다. 세포는 점 돌연변이 F147L 및 F149L을 포함하는 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함할 수 있고, 여기서 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 기능적 RRM1이 결여된다. 세포는 점 돌연변이 F194L 및 F229L을 포함하는 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함할 수 있고, 여기서 돌연변이체 폴리펩타이드는 기능적 RRM2가 결여된다. 세포는 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 위치 239 및 250에서 아미노산을 포함하는 그리고 그 사이 핵 유출 신호의 결실을 포함하는 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함할 수 있고, 여기서 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 기능적 E가 결여된다.
세포는 녹아웃 돌연변이, 예를 들면, 조건부 녹아웃 돌연변이, TARDBP 유전자의 전체 코딩 서열의 결실, 등을 포함하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함할 수 있다. 세포는 조건부 녹아웃 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함할 수 있고, 예를 들면, 돌연변이된 TARDBP 유전자는 부위-특이적 재조합 인식 서열, 예를 들면, loxp 서열을 포함할 수 있다. 세포는 TDP-43 코딩 서열을 포함하는 엑손, 예를 들면 엑손 3을 측접하는 loxp 서열을 포함하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함할 수 있다. 세포는 loxp 서열을 포함하고 TDP-43 코딩 서열, 예를 들면, 엑손 3이 결여된 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함할 수 있다. 세포는 전체 TDP-43 코딩 서열이 결여된 돌연변이된 TARDBP 유전자, 예를 들면, TDP-43 폴리펩타이드의 전체 코딩 서열의 결실을 포함하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는, 예를 들면, 이의 생식계열 게놈에서 내인성 TARDBP 유전자좌에 삽입된 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는, 내인성 TARDBP 유전자좌에 내인성 TARDBP 유전자를 대체하는, 돌연변이된 TARDBP 유전자, 예를 들면, 녹아웃 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 TARDBP 유전자 및/또는 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이된 TARDBP 유전자는 내인성 TARDBP 프로모터 및/또는 조절 요소에 작동가능하게 연결된다.
세포는 돌연변이된 TARDBP 유전자에 대하여 이형접합성 또는 동형접합성일 수 있다. 이배체 유기체는, 상동 염색체의 쌍의 각 유전 좌위에 하나씩, 2개 대립유전자를 갖는다. 대립유전자의 각 쌍은 특이적 유전 좌위의 유전자형을 나타낸다. 유전자형은 특정한 유전자좌에 2개 동일한 대립유전자가 있다면 동형접합성으로서 그리고 2개 대립유전자가 상이하면 이형접합성으로서 기재된다.
세포는 (i) 내인성 TARDBP 유전자좌에, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자로 내인성 TARDBP 유전자의 대체, 및 (ii) 상동 염색체의 다른 내인성 TARDPP 유전자좌에, 녹아웃 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함할 수 있다.
돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함하는 세포는 그로부터 인코딩된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다. 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함하고 그로부터 인코딩된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 세포는 야생형 TDB-43 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있거나, 아닐 수 있다.
돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함하는 세포는 그로부터 인코딩된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있고 하기 (i) 대조군 세포에서 야생형 TARDBP 유전자의 mRNA 전사 수준의 수준에 비교가능한 돌연변이된 TARDBP 유전자의 mRNA 전사물의 수준, (ii) 대조군 세포에서 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 수준에 비교하여 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 증가된 수준, (iii) 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 세포의 핵에서 보다 세포질에서 더 높은 농도로 발견됨, (iv) 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 야생형 TDP-43 폴리펩타이드에 비교하여 증가된 불용성을 나타냄, (v) 돌연변이체 TDP 43 폴리펩타이드를 포함하는 세포질성 집합체, (vi) 야생형 TDP-43을 발현시키는 세포의 것에 비교하여 유전자의 크립틱 엑손의 증가된 스플라이싱, (vii) TDP-43 PLD를 인코딩하는 서열이 결여된 택일적으로 스플라이싱된 TDP-43 mRNA의 감소된 수준 중 하나 이상을 특징으로 할 수 있다.
세포는 시험관내 배양될 수 있고, 생체외, 또는 생체내 시험될 수 있다. 예를 들어, 세포는 동물 내에서 생체내일 수 있다.
세포는, 예를 들어, 균류 세포 (예를 들면, 효모), 식물 세포, 동물 세포, 포유류 세포, 비-인간 포유류 세포, 및 인간 세포를 포함하는, 진핵 세포일 수 있다. 용어 "동물"은, 예를 들어, 포유류, 어류, 파충류, 양서류, 조류, 및 벌레를 포함하는, 동물 왕국의 임의의 구성원을 포함한다. 포유류 세포는, 예를 들어, 비-인간 포유류 세포, 설치류 세포, 랫트 세포, 마우스 세포, 또는 햄스터 세포일 수 있다. 다른 비-인간 포유동물은, 예를 들어, 비-인간 영장류, 원숭이, 유인원, 오랑우탄, 고양이, 개, 토끼, 말, 황소, 사슴, 들소, 가축 (예를 들면, 소과 종 예컨대 암소, 거세소, 및 기타 등등; 양과 종 예컨대 양, 염소, 및 기타 등등; 및 돼지과 종 예컨대 돼지 및 멧돼지)을 포함한다. 조류는, 예를 들어, 닭, 칠면조, 타조, 거위, 오리, 및 기타 등등을 포함한다. 가축화된 동물 및 농업용 동물이 또한 포함된다. 용어 "비-인간"은 인간을 제외한다. 일부 구현예에서, 동물은, 비제한적으로, 마우스, 랫트, 토끼, 개, 고양이, 돼지를 포함하는, 인간 또는 비-인간 동물, 그리고, 비제한적으로, 원숭이 및 챔팬지를 포함하는, 비-인간 영장류일 수 있다. 일부 구현예에서, 비-인간 동물 세포는 설치류 세포, 예를 들면, 랫트 세포 또는 마우스 세포이다.
비-인간 동물은 임의의 유전적 배경에서 나올 수 있다. 예를 들어, 적당한 마우스는 129 균주, C57BL/6 균주, 129 및 C57BL/6의 믹스, BALB/c 균주, 또는 스위스 웹스터 균주에서 나올 수 있다. 129 균주의 예는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (예를 들면, 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 및 129T2를 포함한다. 예를 들면, Festing 등 (1999) Mammalian Genome 10:836, 참고, 모든 목적을 위하여 이 전체가 참고로 본원에 편입됨. C57BL 균주의 예는 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/Kal_wN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, 및 C57BL/Ola를 포함한다. 적당한 마우스는 상기 언급된 129 균주 및 상기 언급된 C57BL/6 균주 (예를 들면, 50% 129 및 50% C57BL/6)의 믹스에서 또한 나올 수 있다. 똑같이, 적당한 마우스는 상기 언급된 129 균주의 믹스 또는 상기 언급된 BL/6 균주 (예를 들면, 129S6 (129/SvEvTac) 균주)의 믹스에서 나올 수 있다.
유사하게, 랫트는, 예를 들어, ACI 랫트 균주, 다크 아구티 (DA) 랫트 균주, 위스타 랫트 균주, LEA 랫트 균주, 스프라그 돌리 (SD) 랫트 균주, 또는 피셔 랫트 균주 예컨대 피셔 F344 또는 피셔 F6을 포함하는, 임의의 랫트 균주에서 나올 수 있다. 랫트는 상기 인용된 2개 이상 균주의 믹스에서 유래된 균주로부터 또한 수득될 수 있다. 예를 들어, 적당한 랫트는 DA 균주 또는 ACI 균주에서 나올 수 있다. ACI 랫트 균주는, 흰색 복부 및 발 및 RT1 av1 일배체형으로, 블랙 아구티를 갖는 것을 특징으로 한다. 그러한 균주는 Harlan Laboratories를 포함하는 다양한 공급처로부터 이용가능하다. 다크 아구티 (DA) 랫트 균주는 아구티 코트 및 RT1 av1 일배체형을 갖는 것을 특징으로 한다. 그러한 랫트는 Charles River 및 Harlan Laboratories를 포함하는 다양한 공급처로부터 이용가능하다. 일부 적당한 랫트는 근교 랫트 균주에서 나올 수 있다. 예를 들면, US 2014/0235933, 참고, 모든 목적을 위하여 이 전체가 참고로 본원에 편입됨.
세포는 또한 미분화된 또는 분화된 상태의 임의의 유형일 수 있다. 예를 들어, 세포는 전능성 세포, 다능성 세포 (예를 들면, 인간 다능성 세포 또는 비-인간 다능성 세포 예컨대 마우스 배아 줄기 (ES) 세포 또는 랫트 ES 세포), 또는 비-다능성 세포일 수 있다. 전능성 세포는 임의의 세포 유형을 발생시킬 수 있는 미분화된 세포를 포함하고, 다능성 세포는 1개 초과 분화된 세포 유형으로 발달하는 능력을 소지하는 미분화된 세포를 포함한다. 그러한 다능성 및/또는 전능성 세포는, 예를 들어, ES 세포 또는 ES형 세포, 예컨대 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포일 수 있다. ES 세포는 배아에 도입시 발달하는 배아의 임의의 조직에 기여할 수 있는 배아-유래된 전능성 또는 다능성 세포를 포함한다. ES 세포는 배반포의 내부 세포 덩어리에서 유래될 수 있고 3개 척추동물 배엽 (내배엽, 외배엽, 및 중배엽) 중 임의의 것의 세포로 분화할 수 있다.
세포는 ES 세포에서 또한 유래될 수 있다. 예를 들어, 세포는 뉴런성 세포 (예를 들면, ES-세포-유래된 운동 뉴런 (ESMN), 원시 외배엽형 세포, 배상체 세포, 등일 수 있다.
본원에 제공된 세포는 또한 생식 세포 (예를 들면, 정자 또는 난모세포)일 수 있다. 세포는 유사분열 수용성 세포 또는 유사분열-비활성 세포, 감수분열 수용성 세포 또는 감수분열-비활성 세포일 수 있다. 유사하게, 세포는 또한 일차 체세포 또는 일차 체세포가 아닌 세포일 수 있다. 체세포는 생식체, 생식 세포, 생식모세포, 또는 미분화된 줄기 세포가 아닌 임의의 세포를 포함한다.
본원에 제공된 적당한 세포는 일차 세포를 또한 포함한다. 일차 세포는 유기체, 기관, 또는 조직에서 직접적으로 단리된 세포 또는 세포의 배양물을 포함한다. 일차 세포는 형질전환되지도 않고 불사화되지도 않은 세포를 포함한다. 이들은 이전에 조직 배양에서 통과되지 않았거나 이전에 조직 배양에서 통과되었지만 조직 배양에서 무기한 통과될 수 없는 유기체, 기관 또는 조직에서 수득된 임의의 세포를 포함한다.
본원에 제공된 다른 적당한 세포는 불멸화된 세포를 포함한다. 불멸화된 세포는 보통 무한대로 증식하지 않을 것이지만, 돌연변이 또는 변경으로 인해, 정상 세포성 노화를 피하였고 대신에 계속 분할을 겪을 수 있는 다세포성 유기체로부터 세포를 포함한다. 그러한 돌연변이 또는 변경은 자연적으로 발생할 수 있거나 의도적으로 유도될 수 있다. 불멸화된 세포의 수많은 유형은 잘 알려진다. 불멸화된 또는 일차 세포는 재조합 유전자 또는 단백질의 배양에 또는 발현에 전형적으로 사용되는 세포를 포함한다.
본원에 제공된 세포는 1-세포 기 배아 (즉, 수정된 난모세포 또는 접합자)를 또한 포함한다. 그러한 1-세포 기 배아는 임의의 유전적 배경 (예를 들면, 마우스에 대하여 BALB/c, C57BL/6, 129, 또는 이들의 조합)에서 나올 수 있고, 신선하거나 냉동될 수 있고, 자연 번식 또는 시험관내 수정에서 유래될 수 있다.
돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 시스템을 이용하는 방법
돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함하는 그리고 본원에 기재된 경우에 그로부터 인코딩된 기능적인 구조적 도메인이 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 세포 및 비-인간 동물 (및 그러한 세포를 포함하는 조직 또는 동물)은 TDP-43의 구조적 도메인의 기능 및/또는 TDP-43 단백질이상질환을 연구하기 위하여 모델을 제공한다. 예를 들어, 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함하는 그리고 기능적인 구조적 도메인이 결여된 그로부터 인코딩된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 세포 또는 비-인간 동물은 TDP-43의 단백질이상질환의 표현형 특징을 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들면, (a)　돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함하는 그리고 기능적인 구조적 도메인이 결여된 그로부터 인코딩된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 배아 줄기 세포 유래된 운동 뉴런 (ESMN) 및/또는 (b) 내인성 TARDBP 유전자좌에 돌연변이된 TARDBP 유전자로 내인성 TARDBP 유전자의 대체를 포함하는 그리고 그로부터 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 비-인간 동물로부터 단리된 것은 하기 (i) 대조군 세포에서 야생형 TARDBP 유전자의 mRNA 전사 수준의 수준에 비교가능한 돌연변이된 TARDBP 유전자의 mRNA 전사물의 수준, (ii) 대조군 세포에서 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 수준에 비교하여 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 증가된 수준, (iii) 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 세포의 핵에서 보다 세포질에서 더 높은 농도로 발견됨, (iv) 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 야생형 TDP-43 폴리펩타이드에 비교하여 증가된 불용성을 나타냄, (v) 돌연변이체 TDP 43 폴리펩타이드를 포함하는 세포질성 집합체, (vi) 야생형 TDP-43을 발현시키는 세포의 것에 비교하여 유전자의 크립틱 엑손의 증가된 스플라이싱, (vii) TDP-43 PLD를 인코딩하는 서열이 결여된 택일적으로 스플라이싱된 TDP-43 mRNA의 감소된 수준 중 하나 이상을 특징으로 할 수 있다.
그래서, 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함하는 그리고 본원에 기재된 경우에 그로부터 인코딩된 기능적인 구조적 도메인이 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 세포 (및 그러한 세포를 포함하는 조직 또는 동물)는 또한 TDP-43의 단백질이상질환의 하나 이상의 증상 (예를 들면, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 세포질성 축적)을 치료, 예방 및/또는 억제하기 위한 및/또는 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 생물학적 기능 (예를 들면, 크립틱 엑손 스플라이싱의 억압 및/또는 택일적 스플라이싱된 TDP-43 mRNA의 수준 증가)을 회복시키기 위한 치료적 후보 제제를 식별하는 시스템을 제공한다. 일부 구현예에서, 치료적 제제의 효과는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함하는 그리고 그로부터 인코딩된 기능적인 구조적 도메인이 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 세포를 치료적 후보 제제와 접촉시킴으로써 결정된다. 접촉하는 단계는 시험관내 수행될 수 있다. 접촉하는 단계는 동물에게 치료적 후보 제제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 검정을 수행하는 단계는 약물과 접촉된 세포 또는 동물의 표현형 및/또는 유전자형에 관한 효과를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 검정을 수행하는 단계는 약물에 대하여 롯트 대 롯트 변동성을 결정하는 단계를 포함한다 (일부 구현예에서, 검정을 수행하는 단계는 투여된 약물과 접촉된 본원에 기재된 세포 또는 동물 그리고 (예를 들면, 야생형 TDP-43을 발현시키는) 대조군 세포 또는 동물에 관한 효과들 사이 차이를 결정하는 단계를 포함한다.
약물의 약동학적 특성을 사정하기 위하여 비-인간 동물에서 (또는 그로부터 단리된 세포에서 및/또는 이를 사용하여) 측정될 수 있는 예시적 파라미터는, 비제한적으로, 응집, 자가포식, 세포 분열, 세포 사멸, 보체-매개된 용혈, DNA 무결성, 약물-특이적 항체 역가, 약물 대사, 유전자 발현 어레이, 대사 활성, 미토콘드리아 활성, 산화적 스트레스, 식균작용, 단백질 생합성, 단백질 분해, 단백질 분비, 스트레스 반응, 표적 조직 약물 농도, 비-표적 조직 약물 농도, 전사적 활성, 및 기타 등등을 포함한다.
전장 TDP-43 mRNA를 선택적으로 감소시키기 위한 올리고뉴클레오타이드
도 11a는 전장 TDP-43 전-mRNA, 및 이의 3'단말에 발생하는 정상 (최상부 패널) 및 택일적 (최하부 패널) 스플라이스 이벤트를 예시한다. 도시된 경우에, 엑손 6은 정상 스플라이스 이벤트로 형성된 전장 TDP-43 단백질에서 프리온형 도메인 (PLD)을 인코딩하고, 이 코딩 서열은 PLD의 단말에서 종결한다. 2개 새로운 엑손 (7 및 8)은 엑손 6 안에서 적어도 3개 택일적 5´-스플라이스 부위 중 1개부터, 예를 들면, 새로운 엑손 7에 인접한, 다운스트림 택일적 3´-스플라이스 부위까지 택일적 스플라이싱 이벤트에 의해 형성된다. 택일적 엑손 7부터 택일적 엑손 8까지 제2 택일적 스플라이스 이벤트에 대한 증거가 있다.
마우스에서, 본원에 기재된 엑손 6의 시작에서 또는 그 안에서 택일적 5'-스플라이스 부위는 하기 위치: (a) 염색체 4:148,618,647; (b) 염색체 4:148,618,665; 및 (c) 염색체 4:148,618,674에 맵핑된다. 엑손 7에서 택일적 3'-스플라이스 부위는 위치 염색체 4: 148,617,705에 맵핑된다. 엑손 7부터 엑손 8까지 제2 택일적 스플라이스 이벤트는 염색체 4: 148,617,566부터 염색체 4: 148,616,844까지 발생한다. 숙련된 장인은 다른 TARDBP 유전자, 예를 들면, 인간 TARDBP 유전자에서 유사한 택일적 5' 및 3' 스플라이스 부위를 결정할 수 있을 것이다.
엑손 6 안에서 택일적 5'-스플라이스 부위부터 다운스트림 택일적 3'-스플라이스 부위까지 택일적 스플라이싱은 PLD가 결여된 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열로 대체되는 중인 PLD 코딩 서열의 대부분을 가진 mRNA를 생산하는 것으로 예측된다. 예를 들어, (a) 염색체 4:148,618,647; (b) 염색체 4:148,618,665; 및 (c) 염색체 4:148,618,674 중 어느 하나부터 염색체 4: 148,617,705 (그리고 인간 TARDBP 유전자에서 임의의 상응하는 위치)로부터 택일적 스플라이싱은 PLD가 결여된 TDP-43의 절두된 형태를 인코딩하기 위해 예측된 택일적 mRNA로 대체되는 중인 PLD 코딩 서열의 대부분을 가진 mRNA를 생산할 수 있고, 여기에서 PLD는 18개 아미노산으로 대체된다. 이러한 제2 택일적 스플라이싱 이벤트는 개방 판독 프레임이 엑손 7 5'-스플라이스 부위의 엑손 7 업스트림에서 정지하기 때문에 TDP-43의 단백질의 임의의 새로운 형태를 생산하지 않는다.
PLD가 결여된 TDP-43이 생존력을, 특히 운동 뉴런에서, 그리고 △PLD 또는 △NLS 돌연변이된 TARDBP 유전자를 발현시키는 세포에서 이러한 택일적 스플라이싱된 TDP-43 mRNA의 감소된 수준을, 그들의 ALS형 표현형과 함께, 지원할 수 있다는 관찰은 이러한 택일적 스플라이싱된 TDP-43 mRNA 및 이의 번역된 절두형 산물이 TDP-43 단백질이상질환에 기여할 수 없고, 이에 대해 보호할 수 없다는 것을 시사한다. PLD를 함유하는 단백질의 형태를 인코딩하는 TDP-43 mRNA 아이소폼을 제거 또는 불활성화시키도록 설계된 siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및/또는 CRISPR/Cas9 시스템의 적용은 PLD 없이 절두된 TDP-43 단백질을 생산하는 택일적으로 스플라이싱된 mRNA를 절약하면서 병리학적 집합되기 쉬운 TDP-43의 변이체를 고갈시킬 수 있다. TDP-43의 절두된 형태는 세포성 수명, 특히 운동 뉴런의 생존력을 여전히 지원하면서 병리학적 집합에 저항성일 수 있다.
따라서, 치료적 전략은 PLD를 인코딩하는 서열을 포함하는 그들 TDP-43 mRNA 서열만을, 예를 들면, 엑손 6 안에서 택일적 스플라이스 부위에 후속적인 게놈성 서열에 의해 인코딩된 서열을 포함하는 그들 mRNA를 표적하는 활성 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (ASO) 또는 siRNA를 찾는 것으로 이루어질 것이다. 비-제한 예로서, ASO 또는 siRNA는 PLD 도메인 밖으로 스플라이싱을 초래하는 택일적 5' 스플라이스 부위를 인코딩하는 코돈(들) 후에 TARDBP 유전자로부터 전사된 서열을 포함하는 그들 mRNA를 표적할 수 있다. TDP-43 mRNA의 이 영역을 표적하도록 설계된 ASO 또는 siRNA는 PLD가 결여되는 절두된 및 잠재적으로 보호된 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 택일적으로 스플라이싱된 TDP-43 mRNA를 절약하면서 PLD를 포함하는 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 전장 TDP-43 mRNA만을 인식할 것이다. 다시 말해, ASO 또는 siRNA는 택일적으로 스플라이싱된 TDP-43 mRNA의 분해를 인식 또는 향상시킬 수 없어야 한다. ASO 또는 siRNA는 엑손 7의 3' 택일적 스플라이스 부위의 임의의 3' 비번역된 영역 업스트림 또는 TDP-43 폴리펩타이드의 아미노산 287-414에 대하여 코딩하는 TDP-43 mRNA 서열을 표적할 수 있다. ASO는, 예를 들어 -5-10-5 갭머를 통해서 RNaseH-매개된 절단에 의해 mRNA의 분해를 촉진시킬 수 있다. siRNA는 RNA 간섭에 의해 mRNA 분해 및 또는 단백질 합성을 촉진시킬 수 있다.
또 다른 치료적 전략은 TARDBP 유전자의 엑손 6 안에서 택일적 5' 스플라이스 부위 그리고, 예를 들면, 엑손 7에서 다운스트림 3' 스플라이스 부위에 미치는 게놈성 서열을 선택적으로 표적화 및 결실시키기 위한 CRISPR/Cas 시스템의 적용일 것이다. 이러한 식으로, PLD가 결여된 절두된 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 mRNA만이 전사될 수 있다.
A. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 siRNA
전-mRNA 안에서 서열을 표적하는 작은 간섭 RNA (siRNA) 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (ASO)는 바람직하지 않은 아이소폼의 분해를 향상시킬 수 있다. 본원에 설계된 경우에, ASO 또는 siRNA는 택일적으로 스플라이싱된 TDP-43 mRNA를 절약하면서 PLD를 인코딩하는 TDP-43 mRNA를 파괴하는데 사용될 수 있다. 전장 TDP-43 mRNA만의 수준을 감소시키기 위해, ASO 또는 siRNA는 엑손 6 안에서 택일적 5' 스플라이스 부위 내지 (ii) 다운스트림 택일적 3' 스플라이스 부위 사이에서 서열을 포함하는 TDP-43 mRNA, 예를 들면, TDP-43 폴리펩타이드의 아미노산 287-414에 대하여 코딩하는 서열 및/또는 택일적 스플라이스 부위의 임의의 3' 비번역된 영역 업스트림을 포함하는 TDP-43 mRNA를 표적할 수 있다. 도 11a, 참고. 일부 구현예에서, 엑손 6 안에서 택일적 5' 스플라이스 부위는 (a) 마우스 염색체 4:148,618,647; (b) 마우스 염색체 4:148,618,665;(c) 마우스 염색체 4:148,618,674, 및 (d) 인간 TARDBP 유전자에서 임의의 상응하는 위치로 이루어지는 군으로부터 선택된 TARDBP 게놈성 위치에 상관관계가 있다. 일부 구현예에서, 다운스트림 택일적 3' 스플라이스 부위는 마우스 염색체 4: 148,617,705 또는 인간 TARDBP 유전자에서 상응하는 위치에 상관관계가 있다.
PLD를 인코딩하는 TDP-43 mRNA 서열에 표적된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA는 패턴으로 정렬된 화학적으로 변형된 하위단위, 즉 모티프를 가져서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 특성 예컨대 향상된 억제 활성, 표적 핵산에 대하여 증가된 결합 친화도, 또는 생체내 뉴클레아제에 의한 분해에 대한 내성을 수여할 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 뉴클레아제 분해에 대한 증가된 내성, 증가된 세포성 흡수, 표적 핵산에 대하여 증가된 결합 친화도, 및/또는 증가된 억제 활성을 수여하기 위해 변형된 적어도 하나의 영역을 함유한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 제2 영역은 임의로 세포성 엔도뉴클레아제 RNase H를 위한 기질로서 역할을 할 수 있고, 이는 RNA:DNA 이중체의 RNA 가닥을 절단시킨다.
특정 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 균일한 당-변형된 올리고뉴클레오타이드이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 갭머 모티프를 포함할 수 있다. 갭머에서 RNaseH 절단을 지원하는 복수의 뉴클레오타이드를 갖는 내부 영역은 내부 영역의 뉴클레오사이드와 화학적으로 구별되는 복수의 뉴클레오타이드를 갖는 외부 영역들 사이 위치된다. 갭머 모티프를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 경우에, 갭 세그먼트는 일반적으로 엔도뉴클레아제 절단을 위한 기질로서 역할을 하고, 반면 날개 세그먼트는 변형된 뉴클레오사이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 갭머의 영역은 각 별개 영역을 포함하는 당 모이어티의 유형에 의해 분화된다. 갭머의 영역을 분화시키는데 사용되는 당 모이어티의 유형은 일부 구현예에서 β-D-리보뉴클레오사이드, β-D-데옥시리보뉴클레오사이드, 2'-변형된 뉴클레오사이드 (그러한 2'-변형된 뉴클레오사이드는 특히 2'-MOE 및 2'-O--CH3을 포함할 수 있음), 및 2환식 당 변형된 뉴클레오사이드를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 날개는, 예를 들어 2'-MOE를 포함하여, 몇몇의 변형된 당 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 날개는 몇몇의 변형된 및 미변형된 당 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 날개는 2'-MOE 뉴클레오사이드 및 2'-데옥시뉴클레오사이드의 다양한 조합을 포함할 수 있다.
각 별개 영역은 균일한 당 모이어티, 변이체, 또는 택일성 당 모이어티를 포함할 수 있다. 날개-갭-날개 모티프는 "X-Y-Z"로서 빈번하게 기재되고, 여기에서 "X"는 5'-날개의 길이를 나타내고, "Y"는 갭의 길이를 나타내고, "Z"는 3'-날개의 길이를 나타낸다. "X" 및 "Z"는 균일한, 변이체, 또는 택일성 당 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, "X" 및 "Y"는 하나 이상의 2'-데옥시뉴클레오사이드를 포함할 수 있다."Y"는 2'-데옥시뉴클레오사이드를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 경우에, "X-Y-Z"로서 기재된 갭머는 갭이 5'-날개 및 3' 날개의 각각에 바로 인접하여 위치되는 구성을 갖는다. 그래서, 개재 뉴클레오타이드는 5'-날개 및 갭 사이, 또는 갭 및 3'-날개 사이 실재하지 않는다. 본원에 기재된 안티센스 화합물 중 어느 하나는 갭머 모티프를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, "X" 및 "Z"는 동일하고; 다른 구현예에서 이들은 상이하다. 특정 구현예에서, Y는 8 내지 15개 뉴클레오사이드이다. X, Y, 또는 Z는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30개, 또는 더 많은 뉴클레오사이드 중 어느 하나일 수 있다. 그래서, 본원에 기재된 갭머는, 비제한적으로, 예를 들어, 5-10-5, 5-10-4, 4-10-4, 4-10-3, 3-10-3, 2-10-2, 5-9-5, 5-9-4, 4-9-5, 5-8-5, 5-8-4, 4-8-5, 5-7-5, 4-7-5, 5-7-4, 또는 4-7-4를 포함한다.
PLD를 인코딩하는 TDP-43 mRNA 서열에 표적된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5-10-5 갭머 모티프를 소유할 수 있다.
PLD를 인코딩하는 TDP-43 mRNA 서열에 표적된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 갭-협소화된 모티프를 포함할 수 있다. TDP-43 mRNA에 표적된 갭-협소화된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 5, 4, 3, 2, 또는 1개 화학적으로 변형된 뉴클레오사이드의 날개 세그먼트들에 그리고 그 사이 바로 인접하여 위치된 9, 8, 7, 또는 6개 2'-데옥시뉴클레오타이드의 갭 세그먼트를 가질 수 있다. 화학적으로 변형된 뉴클레오사이드는 2환식 당을 포함할 수 있다. 2환식 당은 4'-(CH2)n-O-2' 브릿지, 여기서 n은 1 또는 2임; 및 4'-CH2-O--CH2-2' 중에서부터 선택된 4' 내지 2' 브릿지를 포함할 수 있다. 2환식 당은 4'-CH(CH3)-O-2' 브릿지를 포함할 수 있다. 화학적 변형은 비-2환식 2'-변형된 당 모이어티, 예를 들면, 2'-O-메틸에틸기 또는 2'-O-메틸기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 택일적 5' 및 3' 스플라이스 부위 사이 TDP-43 mRNA 서열을 표적하는 갭머 모티프를 포함함, 여기서 택일적 5' 스플라이스 부위는 엑손 6 안에 있고, 예를 들면, 여기서 택일적 5' 스플라이스 부위는 (a) 마우스 염색체 4:148,618,647; (b) 마우스 염색체 4:148,618,665; (c) 마우스 염색체 4:148,618,674, 및 (d) 인간 TARDBP 유전자에서 임의의 상응하는 위치로 이루어지는 군으로부터 선택된 TARDBP 게놈성 위치에 상관관계가 있고 여기서 택일적 3' 스플라이스 접합부는 염색체 4: 148,617,705의 TARDBP 게놈성 위치에 상관관계가 있다. 일부 구현예에서, siRNA는 택일적 5' 및 3' 스플라이스 부위 사이 TDP-43 mRNA 서열을 표적하는 서열을 포함하고, 여기서 택일적 5' 스플라이스 부위는 엑손 6 안에 있고, 예를 들면, 여기서 택일적 5' 스플라이스 부위는 (a) 마우스 염색체 4:148,618,647; (b) 마우스 염색체 4:148,618,665; (c) 마우스 염색체 4:148,618,674, 및 (d) 인간 TARDBP 유전자에서 임의의 상응하는 위치로 이루어지는 군으로부터 선택된 TARDBP 게놈성 위치에 상관관계가 있고 여기서 택일적 3' 스플라이스 접합부는 염색체 4: 148,617,705의 TARDBP 게놈성 위치에 상관관계가 있다.
PLD를 인코딩하는 TDP-43 mRNA 서열에 표적된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA는 균일하게 변형될 수 있다. 특정 구현예에서, 각 뉴클레오사이드는 화학적으로 변형된다. 특정 구현예에서, 화학적 변형은 비-2환식 2'-변형된 당 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 2'-변형된 당 모이어티는 2'-O-메톡시에틸기를 포함한다. 특정 구현예에서, 2'-변형된 당 모이어티는 2'-O-메틸기를 포함한다.
ASO 또는 siRNA는 생성된 ASO 또는 siRNA의 활성, 세포성 분포, 또는 세포성 흡수를 향상시키는 하나 이상의 모이어티 또는 컨쥬게이트에 또한 공유적으로 연결될 수 있다. 전형적 컨쥬게이트 그룹은 콜레스테롤 모이어티 및 지질 모이어티를 포함한다. 추가의 컨쥬게이트 그룹은 탄수화물, 인지질, 비오틴, 페나진, 엽산, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오레세인, 로다민, 쿠마린, 및 염료를 포함한다.
ASO 또는 siRNA는 한쪽 또는 양쪽 말단에 일반적으로 부착되는 하나 이상의 안정화 그룹을 갖기 위해 또한 변형될 수 있다. 캡 구조가 안정화 그룹에서 포함된다. 이들 말단 변형은 엑소뉴클레아제 분해로부터 말단 핵산을 갖는 ASO 또는 siRNA를 보호하고 세포 내에서 전달 및/또는 국재화를 도울 수 있다. 캡은 5'-말단 (5'-캡)에서, 또는 3'-말단 (3'-캡)에서 존재할 수 있거나, 양쪽 말단에서 존재할 수 있다. 캡 구조는 잘 알려지고, 예를 들어, 반전된 데옥시 무염기성 캡을 포함한다.
ASO 또는 siRNA는 표적 핵산 (예를 들면, TDP-43 전-mRNA)에 결합하는데 그리고 원하는 효과를 갖는데 적당한 임의의 길이일 수 있다. 예를 들어, ASO는 약 12 내지 약 30, 약 12 내지 약 24, 약 13 내지 약 23, 약 14 내지 약 22, 약 15 내지 약 21, 약 16 내지 약 20, 약 17 내지 약 19, 또는 약 18개 뉴클레오사이드 길이일 수 있다. 또 다른 예로서, ASO는 약 8 내지 약 80, 약 12 내지 약 50, 약 15 내지 약 30, 약 18 내지 약 24, 약 19 내지 약 22, 또는 약 20개 연결된 뉴클레오사이드일 수 있다. 택일적으로, ASO는 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 51, 약 52, 약 53, 약 54, 약 55, 약 56, 약 57, 약 58, 약 59, 약 60, 약 61, 약 62, 약 63, 약 64, 약 65, 약 66, 약 67, 약 68, 약 69, 약 70, 약 71, 약 72, 약 73, 약 74, 약 75, 약 76, 약 77, 약 78, 약 79, 또는 약 80개 연결된 뉴클레오사이드 길이일 수 있다. 예를 들어, ASO는 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 또는 약 25개 연결된 뉴클레오사이드로 이루어질 수 있다. 특이적 예에서, ASO는 약 15 내지 약 25개 연결된 뉴클레오사이드일 수 있다.
ASO 또는 siRNA는 표적 핵산 (예를 들면, TDP-43 전-mRNA, 예를 들면, PLD를 인코딩하는 mRNA 서열)에 상보적일 수 있고/거나 특이적으로 하이브리드화할 수 있다. ASO 및 표적 핵산은 ASO의 핵염기의 충분한 수가 표적 핵산의 상응하는 핵염기와 수소 결합할 수 있는 때 서로에 상보적이어서, 원하는 효과는 발생할 것이다. 특이적으로 하이브리드화가능한은, 특이적 결합이 요구되는 조건 하에서 (예를 들면, 생리학적 조건 하에서) 비-표적 핵산에 관해 최소 또는 무 효과를 나타내는 동안, 원하는 효과를 유도하기 위해 ASO와 표적 핵산 사이 충분한 정도의 상보성을 갖는 ASO를 지칭한다.
일부 ASO 또는 siRNA는 TDP-43 전-mRNA의 같은 길이 부문에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 상보적이다. 택일적으로, ASO는 TDP-43 전-mRNA의 같은 길이 부문에 약 100% 상보적일 수 있다. 표적 핵산과 ASO의 퍼센트 상보성은 일상적 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, ASO의 20개 핵염기 중 18개가 표적 영역에 상보적이고, 그러므로 특이적으로 하이브리드화할 ASO는 90 퍼센트 상보성을 나타낼 것이다. 표적 핵산의 영역과 ASO의 퍼센트 상보성은 잘 알려지는 BLAST 프로그램 (기본적 국소 정렬 검색 도구) 및 PowerBLAST 프로그램을 사용하여 일상적으로 결정될 수 있다 (예를 들면, Altschul 등 (1990) J. Mol. Biol. 215:403 410 및 Zhang and Madden (1997) Genome Res. 7:649-656, 참고). 퍼센트 상동성, 서열 동일성, 또는 상보성은, 디폴트 셋팅을 사용하여, 예를 들어, 갭 프로그램 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)에 의해 결정될 수 있고, 이는 Smith 및 Waterman의 알고리즘 (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489)을 사용한다.
ASO 또는 siRNA 및 TDP-43 전-mRNA 사이 비-상보적 핵염기는 ASO 또는 siRNA가 표적 핵산에 특이적으로 하이브리드화할 수 있도록 유지한다면 용인될 수 있다. 게다가, ASO 또는 siRNA는 끼어들거나(intevening) 인접한 세그먼트가 하이브리드화 이벤트 (예를 들면, 루프 구조, 미스매치 또는 헤어핀 구조)에 관여되지 않도록 TDP-43 전-mRNA의 하나 이상의 세그먼트에 걸쳐서 하이브리드화할 수 있다. 비-상보적 핵염기의 자리는 ASO 또는 siRNA의 5' 단말 또는 3' 단말에 있을 수 있다. 택일적으로, 비-상보적 핵염기 또는 핵염기들은 ASO 또는 siRNA의 내부 위치에서일 수 있다. 2개 이상 비-상보적 핵염기가 존재하는 경우, 이들은 연속적 (즉, 연결된) 또는 비-연속적일 수 있다.
B. TDP-43 PLD를 인코딩하는 게놈성 서열 결실
본원에 나타난 경우에, 세포는 기능적 PLD가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드만을 발현시킴에도 불구하고 생존가능하게 남아있다. 본원에 기재된 경우에 내인성 TARDBP 유전자좌에 단백질형 도메인 (또는 이의 부문)을, 세포, 예를 들면, 배아 줄기 세포로부터 결실시키는데 사용될 수 있는, 클러스터링되는 규칙적으로 산재된 짧은 회문 반복부 (CRISPR)/CRISPR-연관된 (Cas) 시스템, 또는 CRISPR/Cas 시스템의 하나 이상의 구성요소가 본원에 또한 기재된다. CRISPR/Cas 시스템은 엑손 6의 짧은 형태의 5' 스플라이스 부위에서 또는 근처에서 그리고 엑손 7의 3' 스플라이스 부위에서 또는 근처에서 게놈성 서열을, 세포, 예를 들면, 배아 줄기 세포로부터 결실시킬 수 있다. 그러한 구성요소는, 예를 들어, Cas 단백질 및/ 또는 가이드 RNA (gRNA)를 포함하고, 이 gRNA는 2개 별도 RNA 분자; 예를 들면, 타겟터-RNA (예를 들면, CRISPR RNA (crRNA) 및 활성화제 RNA (예를 들면, tracrRNA); 또는 단일-가이드 RNA (예를 들면, 단일-분자 gRNA (sgRNA))를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, CRISPR/Cas 시스템은 Cas9 단백질 및 적어도 하나의 gRNA를 포함하고, 여기서 gRNA는 (a) 염색체 4:148,618,647; (b) 염색체 4:148,618,665; (c) 염색체 4:148,618,674, (d) 염색체 4: 148,617,705 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 TARDBP 게놈성 위치에서 또는 근처에서 서열을 인식한다.
CRISPR/Cas 시스템은 Cas 유전자의 발현에 관여된, 또는 이의 활성을 지향하는 전사물 및 다른 요소를 포함한다. CRISPR/Cas 시스템은, 예를 들어, 유형 I, 유형 II, 또는 유형 III 시스템일 수 있다. 택일적으로, CRISPR/Cas 시스템은 유형 V 시스템 (예를 들면, 하위유형 V-A 또는 하위유형 V-B)일 수 있다. TDP-43 프리온형 도메인 (또는 이의 부문)을 인코딩하는 서열, 또는 본원에 기재된 경우에 내인성 TARDBP 유전자좌에서, 5' 택일적 스플라이스 접합부 (예를 들면, 아미노산 288을 인코딩하는 서열)과 3' 택일적 스플라이스 접합부 (예를 들면, 택일적 엑손 7에 인접) 사이 서열은 핵산의 부위-지향된 절단을 위하여 (Cas 단백질과 복합체화된 가이드 RNA (gRNA)를 포함하는) CRISPR 복합체를 활용함으로써 결실될 수 있다.
본원에 기재된 경우에 CRISPR/Cas 시스템은, gRNA 인식 서열을 표적할 수 있는, Cas 단백질 (예를 들면, Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e (CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1 , Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9 (Csn1 또는 Csx12), Cas10, Casl0d, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1 (CasA), Cse2 (CasB), Cse3 (CasE), Cse4 (CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1 , Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cu1966, 및 이들의 동족체 또는 변형된 버전) 및/또는 하나 이상의 가이드 RNA (gRNA)를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 경우에 CRISPR/Cas 시스템은, (예를 들면, 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있는) Cas 단백질을 인코딩하는 핵산 및/또는 gRNA를 인코딩하는 DNA를 포함하는, 적어도 하나의 발현 작제물을 추가로 포함할 수 있다.
Cas 단백질에 의한 TARDBP 유전자의 부위-특이적 결합 및 절단은, 표적 DNA에서, 양쪽 (i) gRNA와 표적 DNA 사이 염기-짝짓기 상보성 및 (ii) 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)로 불리는, 짧은 모티프에 의해 결정된 자리에서 발생할 수 있다. PAM은 가이드 RNA 인식 서열을 측접시킬 수 있다. 임의로, 가이드 RNA 인식 서열은 PAM에 의해 3' 단말에서 측접될 수 있다. 택일적으로, 가이드 RNA 인식 서열은 PAM에 의해 5' 단말에서 측접될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질의 절단 부위는 PAM 서열의 업스트림 또는 다운스트림 약 1 내지 약 10개 또는 약 2 내지 약 5개 염기 쌍 (예를 들면, 3개 염기 쌍)일 수 있다. 일부 사례에서 (예를 들면, S. 피오게네스로부터 Cas9 또는 밀접하게 관련된 Cas9가 사용된 때), 비-상보적 가닥의 PAM 서열은 5'-N1GG-3'일 수 있고, 여기에서 N1은 임의의 DNA 뉴클레오타이드이고 표적 DNA의 비-상보적 가닥의 가이드 RNA 인식 서열의 바로 3'이다. 따라서, 상보적 가닥의 PAM 서열은 5'-CCN2-3'일 것이고, 여기에서 N2는 임의의 DNA 뉴클레오타이드이고 표적 DNA의 상보적 가닥의 가이드 RNA 인식 서열의 바로 5'이다. 일부 그러한 사례에서, N1 및 N2는 상보적일 수 있고 N1- N2 염기 쌍은 임의의 염기 쌍 (예를 들면, N1=C 및 N2=G; N1=G 및 N2=C; N1=A 및 N2=T; 또는 N1=T, 및 N2=A)일 수 있다. S. 아우레우스로부터 Cas9의 경우에, PAM은 NNGRRT 또는 NNGRR일 수 있고, 여기에서 N은 A, G, C, 또는 T 수 있고, R은 G 또는 A일 수 있다.
본원에 개시된 경우에, 가이드 RNA는 임의의 형태로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA는 RNA의 형태로, 어느 한쪽 2개 분자 (별도 crRNA 및 tracrRNA)로서 또는 1개 분자 (sgRNA)로서, 그리고 임의로 Cas 단백질과 복합체의 형태로 제공될 수 있다. gRNA는 gRNA를 인코딩하는 DNA의 형태로 또한 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA를 인코딩하는 DNA는 단일 RNA 분자 (sgRNA) 또는 별도 RNA 분자 (예를 들면, 별도 crRNA 및 tracrRNA)를 인코딩할 수 있다 (여기서 별도 RNA 분자는 1개 DNA 분자로서, 또는 crRNA 및 tracrRNA를, 각각으로 인코딩하는 별도 DNA 분자로서 제공될 수 있다).
일 구현예에서, 본원에 기재된 경우에 CRISPR/Cas 시스템은 적어도 하나의 gRNA 및/또는 유형 II CRISPR/Cas 시스템으로부터 Cas9에서 유래된 단백질 또는 Cas9 단백질을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 gRNA는 crRNA 및/또는 tracrRNA를 인코딩하는 DNA에 의해 인코딩된다.
표적된 유전 변형은 표적 게놈성 유전자좌 안에서 하나 이상의 가이드 RNA 인식 서열에 하이브리드화하는 하나 이상의 가이드 RNA 및 Cas 단백질과 세포를 접촉시킴으로써 생성될 수 있다. 하나 이상의 가이드 RNA들 중 적어도 하나는 하나 이상의 가이드 RNA 인식 서열들 중 적어도 하나와 복합체를 형성할 수 있고 상기에 Cas 단백질을 가이드할 수 있고, Cas 단백질은 하나 이상의 가이드 RNA 인식 서열들 중 적어도 하나 안에서 표적 게놈성 유전자좌를 절단시킬 수 있다. Cas 단백질에 의한 절단은 이중 가닥 브레이크 또는 단일 가닥 브레이크 (예를 들면, Cas 단백질이 니카제인 경우)를 창출할 수 있다. 이중 가닥 브레이크 또는 단일 가닥 브레이크에 의해 생성된 단말 서열은 그 다음 재조합을 겪을 수 있다.
C. 올리고뉴클레오타이드 도입 방법
세포에 올리고뉴클레오타이드를 도입하기 위한 다양한 방법 및 조성물이 본원에 제공된다. 다양한 세포 유형으로 올리고뉴클레오타이드를 도입하는 방법은 알려지고, 예를 들어, 안정한 형질감염 방법, 일시적 형질감염 방법, 및 바이러스-매개된 방법을 포함한다.
형질감염 프로토콜 뿐만 아니라 세포에 올리고뉴클레오타이드를 도입하기 위한 프로토콜은 다양할 수 있다. 비-제한 형질감염 방법은 리포솜; 나노입자; 인산칼슘 (Graham 등 (1973) Virology 52 (2): 456-467, Bacchetti 등 (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (4): 1590-1594, 및 Kriegler, M (1991). Transfer and Expression: A Laboratory Manual. New York: W. H. Freeman and Company. pp. 96-97); 덴드리머; 또는 양이온성 중합체 예컨대 DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민을 사용하는 화학적-기반된 형질감염 방법을 포함한다. 비-화학적 방법은 전기천공, 초음파-천공, 및 광학 형질감염을 포함한다. 입자-기반된 형질감염은 유전자 총, 또는 자석-보조된 형질감염을 포함한다 (Bertram (2006) Current Pharmaceutical Biotechnology 7, 277-28). 바이러스성 방법은 형질감염에 또한 사용될 수 있다.
세포에 올리고뉴클레오타이드의 도입은 전기천공에 의해, 세포질내 주사에 의해, 바이러스성 감염에 의해, 아데노바이러스에 의해, 아데노-연관된 바이러스에 의해, 렌티바이러스에 의해, 레트로바이러스에 의해, 형질감염에 의해, 지질-매개된 형질감염에 의해, 또는 뉴클레오펙션에 의해 또한 매개될 수 있다. 뉴클레오펙션은 핵산 기질을 세포질에 뿐만 아니라 핵막을 거치고 핵에 전달될 수 있게 하는 개선된 전기천공 기술이다. 이 밖에도, 본원에 개시된 방법에서 뉴클레오펙션의 사용은 전형적으로 일반 전기천공보다 훨씬 더 적은 (예를 들면, 일반 전기천공에 의한 7백만과 비교하여 단지 약 2백만) 세포를 요구한다. 일 예에서, 뉴클레오펙션은 LONZA® NUCLEOFECTOR™ 시스템을 사용하여 수행된다.
세포 (예를 들면, 접합자)에 올리고뉴클레오타이드의 도입은 미세주사에 의해 또한 성취될 수 있다. 접합자 (즉, 1-세포 기 배아)에서, 미세주사는 모계 및/또는 부계 전핵 또는 세포질에 실시될 수 있다. 미세주사가 단 1개 전핵에 실시되면, 부계 전핵은 이의 큰 크기로 인해 바람직하다. 미세주사를 실시하는 방법은 잘 알려진다. 예를 들면, Nagy 등 (Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R., 2003, Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press), 참고; 또한 Meyer 등 (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:15022-15026 및 Meyer 등 (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109:9354-9359 참고.
세포에 올리고뉴클레오타이드를 도입하는 다른 방법은, 예를 들어, 벡터 전달, 입자-매개된 전달, 엑소좀-매개된 전달, 지질-나노입자-매개된 전달, 세포-침투-펩타이드-매개된 전달, 또는 이식가능한-장치-매개된 전달을 포함할 수 있다. 특이적 예로서, 올리고뉴클레오타이드는 담체 예컨대 폴리(락트산) (PLA) 미소구체, 폴리(D,L-락트산-코글리콜산) (PLGA) 미소구체, 리포솜, 미셀, 역 미셀, 지질 달팽이관, 또는 지질 미세소관에서 세포 또는 비-인간 동물에 도입될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드의 도입은 바이러스-매개된 전달, 예컨대 AAV-매개된 전달 또는 렌티바이러스-매개된 전달에 의해 또한 성취될 수 있다. 다른 예시적 바이러스/바이러스성 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스바이러스, 및 단순 포진 바이러스를 포함한다. 바이러스는 분할 세포, 비-분할 세포, 또는 양쪽 분할 및 비-분할 세포를 감염시킬 수 있다. 바이러스는 숙주 게놈으로 통합할 수 있거나 택일적으로 숙주 게놈으로 통합하지 않을 수 있다. 그러한 바이러스는 감소된 면역원을 갖도록 또한 조작될 수 있다. 바이러스는 복제-수용성일 수 있거나 복제-결함성 (예를 들면, 비리온 복제 및/또는 패키징의 추가의 라운드에 필요한 하나 이상의 유전자에서 결함성)일 수 있다. 바이러스는 일시적 발현, 장기-지속형 발현 (예를 들면, 적어도 1 주, 2 주, 1 개월, 2 개월, 또는 3 개월), 또는 영구적 발현을 야기시킬 수 있다. 예시적 바이러스성 역가 (예를 들면, AAV 역가)는 1012, 1013, 1014, 1015, 및 1016 벡터 게놈/mL를 포함한다.
ssDNA AAV 게놈은, 상보적 DNA 가닥의 합성을 허용하는 2개 반전된 말단 반복부에 의해 측접된, 2개 개방 판독 프레임, Rep 및 Cap으로 이루어진다. AAV 전이 플라스미드를 작제하는 경우, 이식유전자는 2개 ITR 사이 배치되고, Rep 및 Cap은 트란스로 공급될 수 있다. Rep 및 Cap 이외에도, AAV는 아데노바이러스로부터 유전자를 함유하는 헬퍼 플라스미드가 필요할 수 있다. 이들 유전자 (E4, E2a, 및 VA)가 AAV 복제를 매개하였다. 예를 들어, 전이 플라스미드, Rep/Cap, 및 헬퍼 플라스미드는 아데노바이러스 유전자 E1+를 함유하는 HEK293 세포에 형질감염되어 감염성 AAV 입자를 생산하였다. 택일적으로, Rep, Cap, 및 아데노바이러스 헬퍼 유전자는 단일 플라스미드로 조합될 수 있다. 유사한 패키징 세포 및 방법은 다른 바이러스, 예컨대 레트로바이러스에 사용될 수 있다.
AAV의 여러 혈청형은 식별되었다. 이들 혈청형은, 특이적 세포 유형의 우선적 형질도입을 허용하는, 이들이 감염시키는 세포의 유형 (즉, 그들의 굴성)에서 상이하다. CNS 조직에 대한 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV8, 및 AAV9를 포함한다. 심장 조직에 대한 혈청형은 AAV1, AAV8, 및 AAV9를 포함한다. 신장 조직에 대한 혈청형은 AAV2를 포함한다. 폐 조직에 대한 혈청형은 AAV4, AAV5, AAV6, 및 AAV9를 포함한다. 췌장 조직에 대한 혈청형은 AAV8을 포함한다. 광수용체 세포에 대한 혈청형은 AAV2, AAV5, 및 AAV8을 포함한다. 망막 색소 상피 조직에 대한 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, 및 AAV8을 포함한다. 골격근 조직에 대한 혈청형은 AAV1, AAV6, AAV7, AAV8, 및 AAV9를 포함한다. 간 조직에 대한 혈청형은 AAV7, AAV8, 및 AAV9, 그리고 특히 AAV8을 포함한다.
굴성은, 상이한 바이러스성 혈청형으로부터 게놈 및 캡시드의 혼합인, 위형화를 통해서 추가로 순화될 수 있다. 예를 들어, AAV2/5는 혈청형 5로부터 캡시드에서 패키징된 혈청형 2의 게놈을 함유하는 바이러스를 나타낸다. 위형화된 바이러스의 사용은 형질도입 효율을 향상시킬 수 있고, 뿐만 아니라 굴성을 변경시킬 수 있다. 상이한 혈청형에서 유래된 하이브리드 캡시드는 바이러스성 굴성을 변경시키는데 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, AAV-DJ는 8개 혈청형으로부터 하이브리드 캡시드를 함유하고 생체내 광범위한 세포 유형에 걸쳐서 고 감염력을 표시한다. AAV-DJ8은 AAV-DJ의 특성을 표시하지만 향상된 뇌 흡수를 가진 또 다른 예이다. AAV 혈청형은 돌연변이를 통해서 또한 변형될 수 있다. AAV2의 돌연변이성 변형의 예는 Y444F, Y500F, Y730F, 및 S662V를 포함한다. AAV3의 돌연변이성 변형의 예는 Y705F, Y731F, 및 T492V를 포함한다. AAV6의 돌연변이성 변형의 예는 S663V 및 T492V를 포함한다. 다른 위형화된/변형된 AAV 변이체는 AAV2/1, AAV2/6, AAV2/7, AAV2/8, AAV2/9, AAV2.5, AAV8.2, 및 AAV/SASTG를 포함한다.
이식유전자 발현을 가속화시키기 위해, 자가-상보적 AAV (scAAV) 변이체는 사용될 수 있다. AAV가 AAV의 단일 가닥 DNA 게놈의 상보적 가닥을 합성하기 위해 세포의 DNA 복제 기구에 의존하기 때문에, 이식유전자 발현은 지연될 수 있다. 이러한 지연을 해결하기 위해, 감염시 자발적으로 어닐링할 수 있는 상보적 서열을 함유하는 scAAV는 사용되어, 숙주 세포 DNA 합성을 위한 요건을 제거할 수 있다. 하지만, 단일 가닥 AAV (ssAAV) 벡터는 또한 사용될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드의 도입은 또한 지질 나노입자 (LNP)-매개된 전달에 의해 성취될 수 있다. 지질 제형은 그들의 세포성 흡수를 개선하면서 분해로부터 생물학적 분자를 보호할 수 있다. 지질 나노입자는 분자간 힘에 의해 서로와 물리적으로 연관된 복수의 지질 분자를 포함하는 입자이다. 이들은 미소구체 (단층형 및 다층형 소포, 예를 들면, 리포솜 포함), 에멀젼의 분산상, 미셀, 또는 현탁액에서의 내부상을 포함한다. 그러한 지질 나노입자는 전달을 위하여 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드를 캡슐화시키는데 사용될 수 있다. 양이온성 지질을 함유하는 제형은 다가음이온 예컨대 핵산을 전달하는데 유용하다. 포함될 수 있는 다른 지질은 중성 지질 (즉, 미하전된 또는 쯔비터이온성 지질), 음이온성 지질, 형질감염을 향상시키는 헬퍼 지질, 그리고 나노입자가 생체내 실재할 수 있는 시간을 증가시키는 스텔스 지질이다. 적당한 양이온성 지질, 중성 지질, 음이온성 지질, 헬퍼 지질, 및 스텔스 지질의 예는, 모든 목적을 위하여 이 전체가 참고로 본원에 편입된, WO 2016/010840 A1에서 찾아질 수 있다.
생체내 투여는, 예를 들어, 비경구, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 척수강내, 복강내, 국부, 비강내, 또는 근육내를 포함하는 임의의 적당한 루트에 의한 것일 수 있다. 투여의 합성 모드는, 예를 들어, 경구 및 비경구 루트를 포함한다. 비경구 루트의 예는 정맥내, 동맥내, 골내, 근육내, 피내, 피하, 비강내, 및 복강내 루트를 포함한다. 특이적 예는 정맥내 주입이다. 비강 점적 및 유리체내 주사는 다른 특이적 예이다. 투여의 국소 모드는, 예를 들어, 척수강내, 뇌실내, 실질내 (예를 들면, 선조체에 (예를 들면, 미상에 또는 피각에), 대뇌 피질, 중심전 이랑, 해마 (예를 들면, 치아 이랑 또는 CA3 영역에 국소화된 실질내 전달), 측두 피질, 편도체, 전두 피질, 시상, 소뇌, 수질, 시상하부, 중뇌개, 피개, 또는 흑색질), 안내, 안와내, 결막하, 유리체내, 망막하, 및 경공막 루트를 포함한다. (전신적 접근과 비교된) 구성요소의 상당히 더 작은 양은 전신으로 (예를 들어, 정맥내로) 투여된 때에 비교하여 국소로 (예를 들어, 실질내 또는 유리체내) 투여된 때 효과를 발휘할 수 있다. 투여의 국소 모드는 구성요소의 치료적으로 유효량이 전신으로 투여되는 때 발생할 수 있는 잠재적으로 독성 부작용의 발생률을 또한 감소 또는 제거시킬 수 있다.
세포 배양에서 시약 (예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오타이드)의 흡수를 촉진시키기 위한 하나의 일반적 방법은 핵산을 형질감염시키기 위한 양이온성 지질의 사용을 포함한다. 양이온성 지질을 음으로 하전된 핵산과 혼합시키는 것은 세포 막을 횡단할 수 있고 세포의 세포질에 활성 핵산을 방출시킬 수 있는 복합체를 산출한다. 시약 (예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오타이드)를 세포에 전기천공하는 것이 또한 가능하다. 이 방법은 지질에 의해 용이하게 형질감염될 수 없는 세포주에 고도로 효과적일 수 있고 유용할 수 있다.
세포가 (예를 들면, 동물에서) 생체내이면, 동물에 대한 투여는 임의의 적당한 수단에 의한 것일 수 있다. 예를 들어, 투여는 비경구 루트, 예컨대 복강내, 정맥내, 및 피하의 투여를 포함할 수 있다. 비경구 투여는 주사 또는 주입을 통한 투여를 의미한다. 비경구 투여는, 예를 들어, 피하 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 동맥내 투여, 복강내 투여, 또는 두개내 투여 (예를 들면, 척수강내 또는 뇌실내 투여)를 포함한다.
일부 방법에서, 투여는 도입되는 중인 시약이 뉴런 또는 신경계에 도달하도록 하는 수단에 의한 것이다. 이것은, 예를 들어, 말초 전달에 의해 또는 신경계에 직접 전달에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, Evers 등 (2015) Adv. Drug Deliv. Res. 87:90-103, 참고, 모든 목적을 위하여 이 전체가 참고로 본원에 편입됨.
신경계에 도달하기 위한 시약 (예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오타이드) 경우, 이들은, 혈뇌 장멱 또는 혈액-척수 장벽으로 구성된, 혈관성 장벽을 먼저 횡단해야 한다. 혈관성 장벽을 횡단하는데 사용될 수 있는 하나의 기전은 수용체-매개된 세포내이입이다. 사용될 수 있는 또 다른 기전은 세포-침투 펩타이드 (CPP)-기반된 전달 시스템이다. 상이한 CPP는 뚜렷한 세포성 전위 경로를 사용하고, 이는 세포 유형 및 화물에 의존한다. 예를 들어, 아르기닌-풍부 CPP로 태그화된 전신으로 전달된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 혈뇌 장벽을 횡단할 수 있다. 사용될 수 있는 또 다른 전달 기전은, 단백질 및 핵산의 이송을 통해서 세포들 사이 통신을 매개한다고 알려진 세포외 소포인, 엑소좀이다. 예를 들어, 광견병 바이러스 당단백질 (RVG)에서 유래된 짧은 바이러스성 펩타이드로 형질도입된 엑소좀의 IV 주사는 혈뇌 장벽의 횡단 및 뇌로의 전달을 초래할 수 있다.
뇌척수액으로의 직접 주입을 통해서 혈관성 장벽을 우회하는 기법이 또한 이용가능하다. 예를 들어, 시약 (예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오타이드)은 뇌실내로 (ICV) 주입될 수 있고, 그 이후 시약 (예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오타이드)은 실질에 진입하기 위해 심실 시스템을 접하는 뇌실막 세포 층을 통과해야 할 것이다. 척수내 (IT) 전달은 척수의 지주막하 공간에 시약 (예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오타이드)의 전달을 의미한다. 여기로부터, 시약 (예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오타이드)는 실질에 진입하기 위해 연막을 통과해야 할 것이다. 시약 (예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오타이드)은 이식된 저장소에 연결되는 출구 카테터를 통해서 ICT 또는 IT 전달될 수 있다. 약물은 저장소에 주사될 수 있고 CSF에 직접적으로 전달될 수 있다. 비강내 투여는 사용될 수 있는 전달의 택일적 루트이다.
본 발명의 범위는 여기에 첨부된 청구항에 의해 한정되고 본원에 기재된 특정한 구현예에 의해 제한되지 않으며; 본 개시내용을 읽으면, 당업자는 그러한 기재된 구현예에 등가일 수 있거나, 달리 청구항의 범위 내일 수 있는 다양한 변형을 인식할 것이다. 일반적으로, 전문용어는, 달리 명확하게 명시되지 않는 한, 당업계에서 이의 이해된 의미를 따른다. 본 명세서, 또는 이들의 관련한 부문 내에서 인용된 참고문헌은 그들 전체가 참고로 본원에 편입된다.
서수 용어 예컨대 "제1," "제2," "제3", 등의 사용은, 청구 요소를 수정하기 위한 청구에서, 자체로 하나의 청구 요소가 또 다른 것보다 임의의 우선권, 우위, 또는 순서 혹은 한 방법의 행위가 수행되는 일시적 순서를 뜻하지 않지만, 청구 요소를 구별하기 위해 특정 이름을 갖는 하나의 청구 요소를 동일한 이름을 갖는 또 다른 요소와 구별하는 위한 그저 라벨로서 (그러나 서수 용어의 사용을 위하여) 사용된다.
명세서에서 그리고 청구항에서 관사 "한" 및 "하나"는, 명백히 반대로 명시되지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 한 그룹의 하나 이상의 구성원들 사이 "또는"을 포함하는 청구항 또는 설명은 그룹 구성원들 중 1개, 1개 초과, 또는 모두가 반대로 명시되지 않는 한 또는 달리 문맥으로부터 명백하지 않는 한 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 이에 이용되거나, 달리 관련하면 만족된 것으로 간주된다. 본 발명은 그룹의 정확히 1개 구성원이 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 이에 이용되거나, 달리 관련하는 구현예를 포함한다. 본 발명은 또한 1개 초과, 또는 전체 그룹 구성원이 주어진 생성물 또는 공정에 존재하거나, 이에 이용되거나, 달리 관련하는 구현예를 포함한다. 게다가, 달리 명시되지 않는 한 또는 모순이나 불일치가 발생할 것이 당업자에게 명백하지 않는 한 열거된 청구항들의 하나 이상으로부터, 하나 이상의 제한, 요소, 절, 설명적 용어, 등이 동일한 기본 청구항 (또는, 관련되는 경우, 임의의 다른 청구항)에 종속된 또 다른 청구항에 도입되는 모든 변동, 조합, 및 순열을 본 발명이 포괄하는 것이 이해되어야 한다. 요소들이 목록으로서 제시되는 경우, (예를 들면, 마쿠쉬 그룹 또는 유사한 형식으로) 요소들의 각 서브그룹이 또한 개시되고, 임의의 요소(들)이 그룹에서 제거될 수 있음이 이해되어야 한다. 일반적으로, 본 발명, 또는 본 발명의 양태가 특정한 요소, 속성, 등을 포함하는 것으로서 지칭되는 경우, 본 발명의 구현예 또는 본 발명의 양태가 그러한 요소, 속성, 등으로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지는 것이 이해되어야 한다. 단순함을 위하 그들 구현예는 모든 사례에서 본원에 그렇게 많은 단어들로 구체적으로 제시되지 않는다. 구체적 제외가 명세서에서 인용되는지 여부와 무관하게, 본 발명의 임의의 구현예 또는 양태가 청구항에서 명료하게 제외될 수 있음이 또한 이해되어야 한다.
"대조군"은 결과가 비교되는 표준인 "대조군"의 당업계에서 이해되는 의미를 포함한다. 전형적으로, 대조군은 그러한 변수에 대한 결론을 내리기 위해 변수를 단리시킴으로써 실험에서의 무결성을 높이는데 사용된다. 일부 구현예에서, 대조군은 비교물을 제공하기 위해 테스트 반응 또는 검정과 동시에 수행되는 반응 또는 검정이다. "대조군"은 또한 "대조 동물"을 포함한다. "대조 동물"은 본원에 기재된 경우에 변형, 본원에 기재된 경우에 상이한 변형, 또는 무 변형 (즉, 야생형 동물)을 가질 수 있다. 하나의 실험에서, "테스트" (즉, 테스트되는 중인 변수)는 적용된다. 제2 실험에서, 테스트되는 중인 변수인, "대조군"은 적용되지 않는다. 일부 구현예에서, 대조군은 (즉, 이전에 수행된 테스트 또는 검정이나, 이전에 알려진 양 또는 결과의) 이력 대조군이다. 일부 구현예에서, 대조군은 인쇄되거나 달리 저장된 기록이거나 이를 포함한다. 대조군은 양성 대조군 또는 음성 대조군일 수 있다.
"결정하기", "측정하기", "평가하기", "사정하기", "검정하기" 및 "분석하기"는 임의의 형태의 측정을 포함하고 요소가 존재하는지 아닌지를 결정하는 것을 포함한다. 이들 용어는 양쪽 정량적 및/또는 정성적 결정을 포함한다. 검정하는 단계는 상대적 또는 절대적일 수 있다. "의 존재에 대한 검정하기"는 존재하는 것의 양 결정하기 및/또는 존재 여부 결정하기일 수 있다.
본원에 호환적으로 사용된, 용어들 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는, 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 또는 이들의 유사체 또는 변형된 버전을 포함하는, 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체성 형태를 포함한다. 이들은 단일-, 이중-, 및 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈성 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 그리고 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 또는 기타 천연, 화학적으로 변형된, 생화학적으로 변형된, 비-천연, 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 중합체를 포함한다.
본원에 호환적으로 사용된, 용어들 "단백질", "폴리펩타이드", 및 "펩타이드"는, 코딩된 및 비-코딩된 아미노산 그리고 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 또는 유도체화된 아미노산을 포함하는, 임의의 길이의 아미노산의 중합체성 형태를 포함한다. 용어들은 또한 변형된 중합체, 예컨대 변형된 펩타이드 백본을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 용어 "도메인"은 특정한 기능 또는 구조를 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드의 임의의 부분을 지칭한다. 달리 특정되지 않는 한, 본원에 지칭된 임의의 구조적 도메인은 TDP-43 구조적 도메인을 지칭한다.
용어 "야생형"은 정상 (돌연변이성, 이환된, 변경된, 또는 기타 등등과 대조되는) 상태 또는 상황에서 발견된 채로 구조 및/또는 활성을 갖는 실체를 포함한다. 야생형 유전자 및 폴리펩타이드는 여러 상이한 형태 (예를 들면, 대립유전자)로 종종 실재한다.
용어 "내인성"은 세포 또는 동물 안에서 자연적으로 발견되거나 발생하는 자리, 핵산 또는 아미노산 서열을 지칭한다. 예를 들어, 비-인간 동물의 내인성 TARDBP 서열은 비-인간 동물에서 내인성 TARDBP 유전자좌에 자연적으로 발생하는 야생형 TARDBP 서열을 지칭한다.
용어 "유전자좌"는 유전자의 특이적 자리 (또는 유의미한 서열), DNA 서열, 폴리펩타이드-인코딩 서열, 또는 유기체의 게놈의 염색체 상의 위치를 지칭한다. 예를 들어, "TARDBP 유전자좌"는 TARDBP 유전자의 특이적 자리, TARDBP DNA 서열, TARDBP 2-인코딩 서열, 또는 그러한 서열이 상주하는 장소에 관해 식별된 유기체의 게놈의 염색체 상의 TARDBP 위치를 지칭할 수 있다. "TARDBP 유전자좌"는, 예를 들어, 인핸서, 프로모터, 5' 및/또는 3' 비번역된 영역 (UTR), 또는 이들의 조합을 포함하는, TARDBP 유전자의 조절 요소를 포함할 수 있다.
용어 "유전자"는 산물 (예를 들면, RNA 산물 및/또는 폴리펩타이드 산물)을 코딩하고 비-코딩 인트론으로 방해된 코딩 영역을 포함하는 염색체에서 DNA 서열 그리고 유전자가 (5' 및 3' 비번역된 서열을 포함하는) 전장 mRNA에 상응하도록 양쪽 5' 및 3' 단말에서 코딩 영역에 인접하여 자리잡은 서열을 지칭한다. 유전자의 다른 비-코딩 서열은 조절 서열 (예를 들면, 프로모터, 인핸서, 및 전사 인자 결합 부위), 폴리아데닐화 신호, 내부 리보솜 진입 부위, 소음기, 절연 서열, 및 매트릭스 부착 영역을 포함한다. 이들 서열은 유전자의 코딩 영역에 가까이 (예를 들면, 10 kb 이내) 또는 원위 부위일 수 있고, 이들은 유전자의 전사 및 번역의 수준 또는 속도에 영향을 미친다.
용어 "대립유전자"는 유전자의 변이체 형태를 지칭한다. 일부 유전자는, 염색체 상에서, 동일한 위치, 또는 유전적 유전자좌에 자리잡은, 다양한 상이한 형태를 갖는다. 이배체 유기체는, 상동 염색체의 내인성 유전자좌에 2개 대립유전자, 각각을 갖는다. 대립유전자의 각 쌍은 특이적 유전적 유전자좌의 유전자형을 나타낸다. 유전자형은 특정한 유전자좌에 2개 동일한 대립유전자가 있다면 동형접합성으로서 그리고 2개 대립유전자가 상이하면 이형접합성으로서 기재된다.
"작동가능하게 연결된"은 기재된 구성요소가 그들의 의도된 방식으로 그들을 기능하게 하는 관계에 있는 병치를 포함한다. 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 대조군 서열은 코딩 서열의 발현이 대조군 서열과 상용성인 조건 하에서 달성되는 방식으로 결찰된다. "작동가능하게 연결된" 서열은 관심 유전자로 연속적인 발현 대조군 서열 그리고 관심 유전자를 제어하기 위해 트란스로 또는 멀리서 작용하는 발현 대조군 서열 양쪽을 포함한다. 용어 "발현 대조군 서열"은, 이들이 결찰되는 코딩 서열의 발현 및 프로세싱에 영향을 주는데 필요한, 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. "발현 대조군 서열"은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적 RNA 프로세싱 신호 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호; 세포질성 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열 (즉, 코자크 공통 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 원하는 경우, 단백질 분비를 향상시키는 서열을 포함한다. 그러한 대조군 서열의 성질은 숙주 유기체에 의존하여 상이하다. 예를 들어, 원핵생물에서, 그러한 대조군 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜적 결합 부위 및 전사 종결 서열을 포함하고, 반면 진핵생물에서 전형적으로 그러한 대조군 서열은 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "대조군 서열"은 존재가 발현 및 프로세싱에 필수적인 구성요소를 포함하기 위한 것이고, 존재가 유리한 추가의 구성요소, 예를 들어, 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 또한 포함할 수 있다.
"표현형"은 세포 또는 유기체에 의해 표시된 형질을, 또는 형질들의 클래스 또는 세트까지 포함한다. 일부 구현예에서, 특정한 표현형은 특정한 대립유전자 또는 유전자형과 상관관계가 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 표현형은 불연속적일 수 있고; 일부 구현예에서, 표현형은 연속적일 수 있다. 표현형은 세포의 생존 능력 또는 세포 적합성을 포함할 수 있다. 표현형은 단백질, 예를 들면, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 발현 수준, 세포성 국재화 및/또는 용해도/안정성 프로파일을 포함할 수 있고, 이들 표현형들의 각각은 잘-알려진 방법 예컨대 웨스턴 블랏 분석, 형광성 동소 하이브리드화, 정성적 RT-PCR, 등을 사용하여 결정될 수 있다.
"프로모터"는 특정한 폴리뉴클레오타이드 서열에 대하여 적절한 전사 개시 부위에 RNA 합성을 개시하도록 RNA 폴리머라제 II를 지시할 수 있는 TATA 박스를 보통 포함하는 DNA의 조절 영역이다. 프로모터는 전사 개시 속도에 영향을 미치는 다른 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 본원에 개시된 프로모터 서열은 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드의 전사를 조정한다. 프로모터는 본원에 개시된 세포 유형들 (예를 들면, 진핵 세포, 비-인간 포유류 세포, 인간 세포, 설치류 세포, 다능성 세포, 1-세포 기 배아, 분화된 세포, 또는 이들의 조합) 중 하나 이상에서 활성일 수 있다. 프로모터는, 예를 들어, 구성적으로 활성 프로모터, 조건부 프로모터, 유도성 프로모터, 일시적으로 한정된 프로모터 (예를 들면, 발달적으로 조절된 프로모터), 또는 공간적으로 한정된 프로모터 (예를 들면, 세포-특이적 또는 조직-특이적 프로모터)일 수 있다. 프로모터의 예는, 예를 들어, 모든 목적을 위하여 이 전체가 참고로 본원에 편입된, WO 2013/176772에서 찾아질 수 있다.
"참조"는 관심 제제, 세포, 동물, 코호트, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값이 비교되는 표준 또는 대조 제제, 세포, 동물, 코호트, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값을 포함한다. 일부 구현예에서, 참조 제제, 세포, 동물, 코호트, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값은 테스트되고/거나 관심 제제, 세포, 동물, 코호트, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값의 테스팅 또는 결정과 실질적으로 동시에 결정된다. 일부 구현예에서, 참조 제제, 세포, 동물, 코호트, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값은, 유형적 매체에서 임의로 구현된, 이력 참조이다. 일부 구현예에서, 참조는 대조군을 지칭할 수 있다. "참조"는 또한 "참조 세포"를 포함한다. "참조 세포"는 본원에 기재된 경우에 변형, 본원에 기재된 경우에 상이한 변형 또는 무 변형 (즉, 야생형 세포)을 가질 수 있다. 전형적으로, 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 참조 제제, 세포, 동물, 코호트, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값은 관심 제제, 동물 (예를 들면, 포유동물), 코호트, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값을 결정 또는 특성규명하는데 활용된 것들에 비교가능한 조건 하에서 결정되거나 특성규명된다.
용어 "변이체"는 (예를 들면, 1개 뉴클레오타이드에 의해) 참조 뉴클레오타이드 서열과 상이한 뉴클레오타이드 서열 또는 (예를 들면, 1개 아미노산에 의해) 참조 아미노산 서열과 상이하지만, 참조 서열의 생물학적 기능을 보유하는 단백질 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 변이체는 유전 코드 및/또는 보존적 코돈/아미노산 치환의 퇴화로 인해 참조 서열과 상이하다.
2개 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 특정된 비교 윈도우에서 최대 일치로 정렬된 때 동일한 2개 서열에서 잔기를 지칭한다. 서열 동일성의 백분율이 단백질을 참조하여 사용되는 경우, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 종종 상이하고, 여기에서 아미노산 잔기는 유사한 화학적 특성 (예를 들면, 전하 또는 소수성)을 가진 다른 아미노산 잔기로 치환되고 그러므로 분자의 기능적 특성을 변화시키지 않는다. 서열이 보존적 치환에서 상이한 경우, 퍼센트 서열 동일성은 치환의 보존적 성질을 수정하기 위해 상향으로 조정될 수 있다. 그러한 보존적 치환에 의해 상이한 서열은 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 갖는 것으로 언급된다. 이러한 조정을 하기 위한 수단은 잘 알려진다. 전형적으로, 이것은 전체 미스매치보다 오히려 부분적으로서 보존적 치환 점수화, 이에 의해 백분율 서열 동일성 증가시키기를 포함한다. 그래서, 예를 들어, 동일한 아미노산이 점수 1로 주어지고 비-보존적 치환이 점수 0으로 주어진 경우, 보존적 치환은 0과 1 사이 점수로 주어진다. 보존적 치환의 점수화는, 예를 들면, 프로그램 PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California)에서 이행된 대로, 계산된다.
"서열 동일성의 백분율"은 비교 윈도우에서 2개 최적으로 정렬된 서열 (완벽하게 매칭된 잔기의 최대 수)을 비교함으로써 결정된 값을 포함하고, 여기서 비교 윈도우에서 폴리뉴클레오타이드 서열의 부문은 2개 서열의 최적 정렬을 위하여 (부가 또는 결실을 포함하지 않는) 참조 서열에 비교된 경우 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 양쪽 서열에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 산출하고, 비교의 윈도우에서 위치의 총 수로 매칭된 위치의 수를 나눗셈하고, 그 결과를 100 곱셈하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 달리 특정되지 않는 한 (예를 들면, 더 짧은 서열이 연결된 이종 서열을 포함하면), 비교 윈도우는 비교되는 중인 2개 서열 중 더 짧은 것의 전장이다.
달리 언급되지 않는 한, 서열 동일성/유사성 값은 하기 파라미터: GAP Weight 50 및 Length Weight 3을 사용하는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 % 동일성 및 % 유사성, 그리고 nwsgapdna.cmp 점수화 매트릭스; GAP Weight 8 및 Length Weight 2를 사용하는 아미노산 서열에 대하여 % 동일성 및 % 유사성, 그리고 BLOSUM62 점수화 매트릭스; 또는 이들의 임의의 등가 프로그램을 사용하는 GAP Version 10을 사용하여 수득된 값을 포함한다. "등가 프로그램"은, 해당 임의의 2개 서열에 대하여, 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 매치를 갖는 정렬 그리고 GAP Version 10에 의해 생성된 상응하는 정렬에 비교된 경우 동일한 퍼센트 서열 동일성을 생성하는 임의의 서열 비교 프로그램을 포함한다.
용어 "보존적 아미노산 치환"은 유사한 크기, 전하, 또는 극성의 상이한 아미노산을 가진 서열에서 정상적으로 존재하는 아미노산의 치환을 지칭한다. 보존적 치환의 예는 또 다른 비-극성 잔기의 비-극성 (소수성) 잔기 예컨대 이소류신, 발린, 또는 류신으로의 치환을 포함한다. 똑같이, 보존적 치환의 예는 또 다른 것의 한쪽 극성 (친수성) 잔기로의 예컨대 아르기닌과 리신 사이, 글루타민과 아스파라긴 사이, 또는 글리신과 세린 사이 치환을 포함한다. 추가적으로, 또 다른 것의 염기성 잔기 예컨대 리신, 아르기닌, 또는 히스티딘으로의 치환, 또는 또 다른 산성 잔기의 한쪽 산성 잔기 예컨대 아스파르트산 또는 글루탐산으로의 치환은 보존적 치환의 추가의 예이다. 비-보존적 치환의 예는 극성 (친수성) 잔기 예컨대 시스테인, 글루타민, 글루탐산 또는 리신의 비-극성 (소수성) 아미노산 잔기 예컨대 이소류신, 발린, 류신, 알라닌, 또는 메티오닌으로의 및/또는 비-극성 잔기의 극성 잔기로의 치환을 포함한다. 전형적 아미노산 카테고리화는 아래 표 1에서 요약된다.
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용어 "시험관내"는 인공 환경을 그리고 인공 환경 (예를 들면, 시험관) 안에서 발생하는 공정 또는 반응까지 포함한다. 용어 "생체내"는 자연 환경 (예를 들면, 세포 또는 유기체 또는 바디)을 그리고 자연 환경 안에서 발생하는 공정 또는 반응을 포함한다. 용어 "생체외"는 개체의 바디로부터 제거된 세포를 그리고 그러한 세포 안에서 발생하는 공정 또는 반응을 포함한다.
비-제한 예시적 구현예는 하기를 포함한다.
구현예 1. 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함하는 비-인간 동물 세포로서,
돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 야생형 TDP-43 폴리펩타이드에서 발견된 기능적인 구조적 도메인이 결여되고,
비-인간 동물 또는 비-인간 동물 세포가 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키고,
야생형 TDP-43 폴리펩타이드가 서열번호:1, 서열번호:3, 또는 서열번호:5로서 제시된 서열을 포함하는,
비-인간 동물 세포.
구현예 2. 구현예 1에 있어서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 핵 국재화 신호 (NLS), RNA 인식 모티프 1 (RRM1), RNA 인식 모티프 2 (RRM2), 추정적 핵 유출 신호 (E), 프리온형 도메인 (PLD), 또는 이들의 조합을 포함하는 기능적인 구조적 도메인이 결여되는, 비-인간 동물 세포.
구현예 3. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 비-인간 동물 세포가 배아 줄기 (ES) 세포, 배상체, 또는 배아 줄기 세포 유래된 운동 뉴런 (ESMN)인, 비-인간 동물 세포.
구현예 4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 돌연변이된 TARDBP 유전자가 비-인간 동물의 돌연변이된 TARDBP 유전자인, 비-인간 동물 세포.
구현예 5. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 돌연변이된 TARDBP 유전자가 돌연변이된 인간 TARDBP 유전자인, 비-인간 동물 세포.
구현예 6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 하기 중 하나 이상으로 인해 기능적인 구조적 도메인이 결여되는, 비-인간 동물 세포:
(a) NLS에서 아미노산의 점 돌연변이,
(b) RRM1에서 아미노산의 점 돌연변이,
(c) RRM2에서 아미노산의 점 돌연변이,
(d) 핵 유출 신호의 적어도 한 부문의 결실, 및
(e) 프리온형 도메인의 적어도 한 부문의 결실.
구현예 7. 구현예 6에 있어서,
(a) NLS에서 아미노산의 점 돌연변이가 K82A K83A, R84A, K95A, K97A, K98A, 또는 이들의 조합을 포함하고,
(b) RRM1에서 점 돌연변이가 F147L 및/또는 F149L을 포함하고,
(c) RRM2에서 점 돌연변이가 F194L 및/또는 F229L을 포함하고,
(d) 핵 유출 신호 결실의 적어도 한 부문의 결실이 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 위치 239 및 250에서 그리고 그 사이 아미노산의 결실을 포함하고,
(e) 프리온형 도메인의 적어도 한 부문의 결실이 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 위치 274 및 414에서 그리고 그 사이 아미노산의 결실을 포함하는,
비-인간 동물 세포.
구현예 8. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 K82A K83A, R84A, K95A, K97A, 및 K98A를 포함하는, 비-인간 동물 세포.
구현예 9. 구현예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 야생형 폴리펩타이드의 위치 274 내지 414에서 아미노산을 포함하는 그리고 그 사이 프리온형 도메인이 결여되는, 비-인간 동물 세포.
구현예 10. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 F147L 및 F149L을 포함하는, 비-인간 동물 세포.
구현예 11. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 F194L 및 F229L을 포함하는, 비-인간 동물 세포.
구현예 12. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 위치 239 및 250에서 아미노산을 포함하는 그리고 그 사이 핵 유출 신호가 결여되는, 비-인간 동물 세포.
구현예 13. 구현예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자가 내인성 TARDBP 유전자좌에 내인성 TARDBP 유전자를 대체하는, 비-인간 동물 세포.
구현예 14. 구현예 13에 있어서, 비-인간 동물 세포가 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자에 대하여 이형접합성인, 비-인간 동물 세포.
구현예 15. 구현예 13에 있어서, 비-인간 동물 세포가 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자에 대하여 동형접합성인, 비-인간 동물 세포.
구현예 16. 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 비-인간 동물 세포가 녹아웃 돌연변이를 포함하는 TARDBP 유전자를 추가로 포함하는, 비-인간 동물 세포.
구현예 17. 구현예 16에 있어서, 녹아웃 돌연변이가 조건부 녹아웃 돌연변이를 포함하는, 비-인간 동물 세포.
구현예 18. 구현예 16 또는 구현예 17에 있어서, 녹아웃 돌연변이가 부위-특이적 재조합 인식 서열을 포함하는, 비-인간 동물 세포.
구현예 19. 구현예 16 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 녹아웃 돌연변이가 loxp 서열을 포함하는, 비-인간 동물 세포.
구현예 20. 구현예 19에 있어서, loxp 서열이 녹아웃 돌연변이를 포함하는 TARDBP 유전자의 엑손 3을 측접하는, 비-인간 동물 세포.
구현예 21. 구현예 16에 있어서, 녹아웃 돌연변이가 TDP-43의 펩타이드의 전체 코딩 서열의 결실을 포함하는, 비-인간 동물 세포.
구현예 22. 구현예 16 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 비-인간 동물 세포가 변형된 TARDBP 유전자좌에 대하여 이형접합성이고
(i) 하나의 염색체에서 내인성 TARDBP 유전자좌에, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자로 내인성 TARDBP 유전자의 대체, 및
(ii) 다른 상동 염색체에서 내인성 TARDBP 유전자좌에, 녹아웃 돌연변이를 포함하는 TARDBP 유전자 또는 야생형 TARDBP 유전자 어느 한쪽
을 포함하는, 비-인간 동물 세포.
구현예 23. 구현예 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 비-인간 동물 세포가 야생형 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키지 않는, 비-인간 동물 세포.
구현예 24. 구현예 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 비-인간 동물 세포가 야생형 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는, 비-인간 동물 세포.
구현예 25. 구현예 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서,
(i) 대조군 세포에서 야생형 TARDBP 유전자의 mRNA 전사 수준에 비교가능한 돌연변이된 TARDBP 유전자의 mRNA 전사 수준,
(ii) 대조군 세포에서 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 수준에 비교하여 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 증가된 수준,
(iii) 예를 들면, 운동 뉴런의, 핵에서 보다 세포질에서 발견된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 더 높은 농도,
(iv) 야생형 TDP-43 폴리펩타이드에 비교하여 증가된 불용성을 가진 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드
(v) 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 포함하는 세포질성 집합체,
(vi) 크립틱 엑손의 증가된 스플라이싱, 및/또는
(vii) 택일적으로 스플라이싱된 TDP-43 형태의 감소된 수준
을 포함하는, 비-인간 동물 세포.
구현예 26. (i) 하나의 염색체에서 내인성 TARDBP 유전자좌에, TARDBP 유전자의 조건부 녹아웃 돌연변이, 및 (ii) 다른 상동 염색체에서 내인성 TARDBP 유전자좌에, 전체 TARDBP 코딩 서열의 결실을 포함하는, 비-인간 동물 세포.
구현예 27. 구현예 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 세포가 배아 줄기 (ES) 세포, 원시 외배엽 세포, 또는 운동 뉴런 (ESMN)에서 유래된 운동 뉴런인, 비-인간 동물 세포.
구현예 28. 구현예 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 비-인간 동물 세포가 설치류 세포인, 비-인간 동물 세포.
구현예 29. 구현예 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 비-인간 동물 세포가 랫트 세포인, 비-인간 동물 세포.
구현예 30. 구현예 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 비-인간 동물 세포가 마우스 세포인, 비-인간 동물 세포.
구현예 31. 구현예 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 비-인간 동물 세포가 시험관내 배양되는, 비-인간 동물 세포.
구현예 32. 구현예 1 내지 31 중 어느 하나의 비-인간 동물 세포를 포함하는, 비-인간 동물 조직.
구현예 33. 구현예 1 내지 32 중 어느 하나의 비-인간 동물 세포 또는 조직을 포함하는, 조성물.
구현예 34. 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함시키기 위해 비-인간 동물 또는 비-인간 동물 세포의 게놈을 변형시키는 단계를 포함하는 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 비-인간 동물 또는 비-인간 동물 세포의 제조 방법으로서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 야생형 TDP-43에 비교하여 기능적인 구조적 도메인이 결여되고, 임의로 야생형 TDP-43 폴리펩타이드가 서열번호:1, 서열번호:3, 또는 서열번호:5로서 제시된 서열을 포함하는, 방법.
구현예 35. 구현예 34에 있어서, 변형시키는 단계가 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자로 내인성 TARDBP 유전자를 대체하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 36. 구현예 34 또는 구현예 35에 있어서, 변형시키는 단계가 녹아웃 돌연변이를 포함하는 TARDBP 유전자로 내인성 TARDBP 유전자를 대체하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 37. 구현예 36에 있어서, 녹아웃 돌연변이가 조건부 녹아웃 돌연변이를 포함하는, 방법.
구현예 38. 구현예 37에 있어서, 녹아웃 돌연변이를 포함하는 TARDBP 유전자의 발현을 제거하는 조건에서 세포를 배양시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 39. 질환의 치료를 위한 치료적 후보의 식별 방법으로서,
(a) 구현예 1 내지 31 중 어느 하나의 비-인간 동물 세포 또는 조직 혹은 구현예 32의 조성물을 후보 제제와 접촉시키는 단계,
(b) 비-인간 세포 또는 조직의 표현형 및/또는 TDP-43 생물학적 활성을 평가하는 단계, 및
(c) 야생형 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 대조군 세포 또는 조직의 것에 비교가능한 표현형 및/또는 TDP-43 생물학적 활성을 비-인간 세포 또는 조직에 회복시키는 후보 제제를 식별하는 단계
를 포함하는, 방법.
구현예 40. TDP-43 구조적 도메인의 생물학적 기능의 평가 방법으로서,
(a) 핵 국재화 신호 (NLS), 제1 RNA 인식 모티프 (RRM1), 제1 RNA 인식 모티프 (RRM2), 추정적 핵 유출 신호 (E), 프리온형 도메인 (PLD), 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 기능적인 구조적 도메인이 결여되는 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함시키기 위해 배아 줄기 (ES) 세포를 변형시키는 단계,
(b) 시험관내 변형된 ES 세포를 임의로 분화시키고/거나 변형된 ES 세포로부터 유전적으로 변형된 비-인간 동물을 수득하는 단계, 및
(c) 유전적으로 변형된 ES 세포, 그로부터 유래된 원시 외배엽, 그로부터 유래된 운동 뉴런, 또는 그로부터 유래된 비-인간 동물의 표현형 및/또는 TDP-43 생물학적 활성을 평가하는 단계
를 포함하는, 방법.
구현예 41. 구현예 39 또는 구현예 40에 있어서, 표현형이 세포 배양, 형광 동소 하이브리드화, 웨스턴 블랏 분석, 또는 이들의 조합에 의해 평가되는, 방법.
구현예 42. 구현예 39 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 표현형을 평가하는 단계가 유전적으로 변형된 ES 세포, 그로부터 유래된 원시 외배엽, 그로부터 유래된 운동 뉴런, 또는 그로부터 유래된 비-인간 동물 생존력을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 43. 구현예 39 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 표현형을 평가하는 단계가 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 세포성 자리를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 44. 구현예 39 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 평가하는 단계가 TDP-43에 의해 조절된 크립틱 엑손을 포함하는 유전자의 스플라이스 산물을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 45. 구현예 44에 있어서, TDP-43에 의해 조절된 크립틱 엑손을 포함하는 유전자가 Crem, Fyxd2, Clf1을 포함하는, 방법.
구현예 46. 구현예 39 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 평가하는 단계가 택일적으로 스플라이싱된 TDP-43의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 47. TDP-43 폴리펩타이드의 PLD를 인코딩하고/거나 엑손 6의 다운스트림 및 엑손 7의 업스트림 비번역된 서열을 포함하는 TDP-43 mRNA 서열을 표적하는 갭머 모티프를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드로서,
임의로 TDP-mRNA가 엑손 6 안에서 택일적 5' 스플라이스 부위와 다운스트림 택일적 3' 스플라이스 부위 사이 서열을 포함하고,
임의로 택일적 5' 스플라이스 부위가 (a) 마우스 염색체 4:148,618,647; (b) 마우스 염색체 4:148,618,665; (c) 마우스 염색체 4:148,618,674, 및 (d) 인간 TARDBP 유전자에서 임의의 상응하는 위치로 이루어지는 군으로부터 선택된 TARDBP 게놈성 위치에 상관관계가 있고/거나 택일적 3' 스플라이스 접합부가 염색체 4: 148,617,705의 TARDBP 게놈성 위치에 상관관계가 있는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
구현예 48. TDP-43 폴리펩타이드의 PLD를 인코딩하고/거나 엑손 6의 다운스트림 및 엑손 7의 업스트림 비번역된 서열을 포함하는 TDP-43 mRNA 서열을 표적하는 서열을 포함하는 siRNA로서,
임의로 TDP-mRNA 서열이 엑손 6 안에서 택일적 5' 스플라이스 부위와 다운스트림 택일적 3' 스플라이스 부위 사이이고,
임의로 택일적 5' 스플라이스 부위가 (a) 마우스 염색체 4:148,618,647; (b) 마우스 염색체 4:148,618,665; (c) 마우스 염색체 4:148,618,674, 및 (d) 인간 TARDBP 유전자에서 임의의 상응하는 위치로 이루어지는 군으로부터 선택된 TARDBP 게놈성 위치에 상관관계가 있고/거나 택일적 3' 스플라이스 접합부가 염색체 4: 148,617,705의 TARDBP 게놈성 위치에 상관관계가 있는, siRNA.
구현예 49. Cas9 단백질 및 적어도 하나의 gRNA를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템으로서, gRNA가 PLD가 결여된 절두된 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 택일적 mRNA를 초래하는 택일적 스플라이스 부위에 대하여 인코딩하는 서열에서 또는 근처에서 서열을 인식하고,
임의로 택일적 스플라이스 부위가 엑손 6 안에서 택일적 5' 스플라이스 부위 및 다운스트림 택일적 3' 스플라이스 부위를 포함하고,
임의로 택일적 5' 스플라이스 부위가 (a) 마우스 염색체 4:148,618,647; (b) 마우스 염색체 4:148,618,665; (c) 마우스 염색체 4:148,618,674, 및 (d) 인간 TARDBP 유전자에서 임의의 상응하는 위치로 이루어지는 군으로부터 선택된 TARDBP 게놈성 위치에 상관관계가 있고/거나 택일적 3' 스플라이스 접합부가 염색체 4: 148,617,705의 TARDBP 게놈성 위치에 상관관계가 있는, CRISPR/Cas 시스템.
구현예 50. 구현예 2의 배아 줄기 세포를 포함하는, 비-인간 동물.
구현예 51. 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함하는, 비-인간 동물로서,
돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 야생형 TDP-43 폴리펩타이드에 비교하여 기능적인 구조적 도메인이 결여되고,
비-인간 동물이 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키고,
임의로 야생형 TDP-43 폴리펩타이드가 서열번호:1, 서열번호:3, 또는 서열번호:5로서 제시된 서열을 포함하는, 비-인간 동물.
구현예 52. 구현예 51에 있어서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 핵 국재화 신호 (NLS), RNA 인식 모티프 1 (RRM1), RNA 인식 모티프 2 (RRM2), 추정적 핵 유출 신호 (E), 프리온형 도메인 (PLD), 또는 이들의 조합을 포함하는 기능적인 구조적 도메인이 결여되는, 비-인간 동물.
구현예 53. 구현예 51 또는 구현예 52에 있어서, 돌연변이된 TARDBP 유전자가 비-인간 동물의 돌연변이된 TARDBP 유전자인, 비-인간 동물.
구현예 54. 구현예 51 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 돌연변이된 TARDBP 유전자가 돌연변이된 인간 TARDBP 유전자인, 비-인간 동물.
구현예 55. 구현예 51 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 하기 중 하나 이상으로 인해 기능적인 구조적 도메인이 결여되는, 비-인간 동물:
(a) NLS에서 아미노산의 점 돌연변이,
(b) RRM1에서 아미노산의 점 돌연변이,
(c) RRM2에서 아미노산의 점 돌연변이,
(d) 핵 유출 신호의 적어도 한 부문의 결실, 및
(e) 프리온형 도메인의 적어도 한 부문의 결실.
구현예 56. 구현예 55에 있어서,
(a) NLS에서 아미노산의 점 돌연변이가 K82A K83A, R84A, K95A, K97A, K98A, 또는 이들의 조합을 포함하고,
(b) RRM1에서 점 돌연변이가 F147L 및/또는 F149L을 포함하고,
(c) RRM2에서 점 돌연변이가 F194L 및/또는 F229L을 포함하고,
(d) 핵 유출 신호 결실의 적어도 한 부문의 결실이 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 위치 239 및 250에서 그리고 그 사이 아미노산의 결실을 포함하고,
(e) 프리온형 도메인의 적어도 한 부문의 결실이 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 위치 274 및 414에서 그리고 그 사이 아미노산의 결실을 포함하는, 비-인간 동물.
구현예 57. 구현예 51 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 K82A K83A, R84A, K95A, K97A, 및 K98A를 포함하는, 비-인간 동물.
구현예 58. 구현예 51 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 야생형 폴리펩타이드의 위치 274 내지 414에서 아미노산을 포함하는 그리고 그 사이 프리온형 도메인이 결여되는, 비-인간 동물.
구현예 59. 구현예 51 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 F147L 및 F149L을 포함하는, 비-인간 동물.
구현예 60. 구현예 51 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 F194L 및 F229L을 포함하는, 비-인간 동물.
구현예 61. 구현예 51 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 위치 239 및 250에서 아미노산을 포함하는 그리고 그 사이 핵 유출 신호가 결여되는, 비-인간 동물.
구현예 62. 구현예 51 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자가 내인성 TARDBP 유전자좌에 내인성 TARDBP 유전자를 대체하는, 비-인간 동물.
구현예 63. 구현예 62에 있어서, 비-인간 동물이 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자에 대하여 이형접합성인, 비-인간 동물.
구현예 64. 구현예 51 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 비-인간 동물이 녹아웃 돌연변이를 포함하는 TARDBP 유전자를 추가로 포함하는, 비-인간 동물.
구현예 65. 구현예 64에 있어서, 녹아웃 돌연변이가 조건부 녹아웃 돌연변이를 포함하는, 비-인간 동물.
구현예 66. 구현예 64 또는 구현예 65, 녹아웃 돌연변이가 부위-특이적 재조합 인식 서열을 포함하는, 비-인간 동물.
구현예 67. 구현예 64 내지 66 중 어느 하나에 있어서, 녹아웃 돌연변이가 loxp 서열을 포함하는, 비-인간 동물.
구현예 68. 구현예 67에 있어서, loxp 서열이 녹아웃 돌연변이를 포함하는 TARDBP 유전자의 엑손 3을 측접하는, 비-인간 동물.
구현예 69. 구현예 64에 있어서, 녹아웃 돌연변이가 TDP-43의 펩타이드의 전체 코딩 서열의 결실을 포함하는, 비-인간 동물.
구현예 70. 구현예 64 내지 69 중 어느 하나에 있어서, 비-인간 동물이 변형된 TARDBP 유전자좌에 대하여 이형접합성이고
(i) 하나의 염색체에서 내인성 TARDBP 유전자좌에, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자로 내인성 TARDBP 유전자의 대체, 및
(ii) 다른 상동 염색체에서 내인성 TARDBP 유전자좌에, 녹아웃 돌연변이를 포함하는 TARDBP 유전자 또는 야생형 TARDBP 유전자 어느 한쪽
을 포함하는, 비-인간 동물.
구현예 71. 구현예 50 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 비-인간 동물이 야생형 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는, 비-인간 동물.
구현예 72. 구현예 50 내지 71 중 어느 하나에 있어서,
(i) 대조군 동물에서 야생형 TARDBP 유전자의 mRNA 전사 수준에 비교가능한 돌연변이된 TARDBP 유전자의 mRNA 전사 수준,
(ii) 대조군 동물에서 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 수준에 비교하여 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 증가된 수준,
(iii) 예를 들면, 운동 뉴런의, 핵에서 보다 세포질에서 발견된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 더 높은 농도,
(iv) 야생형 TDP-43 폴리펩타이드에 비교하여 증가된 불용성을 가진 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드
(v) 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 포함하는 세포질성 집합체,
(vi) 크립틱 엑손의 증가된 스플라이싱,
(vii) 택일적으로 스플라이싱된 TDP-43 형태의 감소된 수준,
(viii) 주로 빠른 수축 근육, 예컨대 전경골근으로 구성된 근육 조직의 신경차단 및/또는
(ix) 주로 저 수축 근육, 예컨대 늑간근으로 구성된 근육 조직의 정상 신경지배를 포함하는, 비-인간 동물.
구현예 73. 내인성 TARDBP 유전자좌에 조건부 녹아웃 돌연변이를 포함하는 TARDBP 유전자 그리고 상동 염색체의 다른 내인성 TARDBP 유전자좌에 전체 TARDBP 코딩 서열의 결실을 포함하는 TARDBP 유전자를 포함하는, 비-인간 동물.
구현예 74. 구현예 50 내지 73 중 어느 하나에 있어서, 비-인간 동물이 설치류인, 비-인간 동물.
구현예 75. 구현예 50 내지 74 중 어느 하나에 있어서, 비-인간 동물이 랫트인, 비-인간 동물.
구현예 76. 구현예 50 내지 74 중 어느 하나에 있어서, 비-인간 동물이 마우스인, 비-인간 동물.
구현예 77. 질환의 치료를 위한 치료적 후보의 식별 방법으로서,
(a) 구현예 50 내지 76 중 어느 하나의 비-인간 동물을 후보 제제와 접촉시키는 단계,
(b) 비-인간 동물의 표현형 및/또는 TDP-43 생물학적 활성을 평가하는 단계, 및
(c) 표현형 및/또는 TDP-43 생물학적 활성을 비-인간에 회복시키는 후보 제제를 식별하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 78. 하기 중 하나 이상에 포함하기 위해 변형된 서열번호:1, 3, 또는 5로서 제시된 서열을 포함하는, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드:
(a) NLS에서 아미노산의 점 돌연변이,
(b) RRM1에서 아미노산의 점 돌연변이,
(c) RRM2에서 아미노산의 점 돌연변이,
(d) 핵 유출 신호의 적어도 한 부문의 결실, 및
(e) 프리온형 도메인의 적어도 한 부문의 결실.
구현예 79. 구현예 78에 있어서,
(a) NLS에서 아미노산의 점 돌연변이가 K82A K83A, R84A, K95A, K97A, K98A, 또는 이들의 조합을 포함하고,
(b) RRM1에서 점 돌연변이가 F147L 및/또는 F149L을 포함하고,
(c) RRM2에서 점 돌연변이가 F194L 및/또는 F229L을 포함하고,
(d) 핵 유출 신호 결실의 적어도 한 부문의 결실이 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 위치 239 및 250에서 그리고 그 사이 아미노산의 결실을 포함하고,
(e) 프리온형 도메인의 적어도 한 부문의 결실이 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 위치 274 및 414에서 그리고 그 사이 아미노산의 결실을 포함하는, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드.
구현예 80. 구현예 78 또는 구현예 79에 있어서 K82A 돌연변이, K83A 돌연변이, R84A 돌연변이, K95A 돌연변이, K97A 돌연변이, 및/또는 K98A 무아티온을 포함하는, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드.
구현예 81. 구현예 78 내지 80 중 어느 하나에 있어서, 야생형 폴리펩타이드의 위치 274 내지 414에 아미노산을 포함하는 그리고 그 사이 프리온형 도메인의 결실을 포함하는, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드.
구현예 82. 구현예 78 내지 81 중 어느 하나에 있어서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 F147L 돌연변이 및/또는 F149L 돌연변이를 포함하는, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드.
구현예 83. 구현예 78 내지 82 중 어느 하나에 있어서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 F194L 돌연변이 및/또는 F229L 돌연변이를 포함하는, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드.
구현예 84. 구현예 78 내지 83 중 어느 하나에 있어서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 위치 239 및 250에 아미노산을 포함하는 그리고 그 사이 핵 유출 신호가 결여되는, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드.
구현예 85. 구현예 78 내지 84 중 어느 하나의 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 핵산.
구현예 86. 구현예 85에 있어서, 5'부터 3'까지: 5' 상동성 아암, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열, 및 3' 상동성 아암을 추가로 포함하는 핵산으로서, 핵산이 설치류 세포에서 상동 재조합을 겪는, 핵산.
구현예 87. 구현예 86에 있어서, 핵산이 내인성 랫트 TARDBP 유전자좌에 상동 재조합을 겪고 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열이 내인성 TARDBP 코딩 서열을 대체하도록 5' 및 3' 상동성 아암이 랫트 서열에 상동인, 핵산.
구현예 88. 구현예 86에 있어서, 핵산이 내인성 마우스 TARDBP 유전자좌에 상동 재조합을 겪고 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열이 내인성 TARDBP 코딩 서열을 대체하도록 5' 및 3' 상동성 아암이 마우스 서열에 상동인, 핵산.
구현예 89. 세포에서 PLD가 결여된 절두된 TDP-43을 인코딩하는 택일적 TDP-43 mRNA를 절약하면서 PLD를 포함하는 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 TDP-43 mRNA를 선택적으로 감소시키는 방법으로서, 세포에
(i) TDP-43 폴리펩타이드의 PLD를 인코딩하고/거나 엑손 6의 다운스트림 및 엑손 7의 업스트림 비번역된 서열을 포함하는 TDP-43 mRNA 서열을 표적하는 갭머 모티프를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드,
(ii) TDP-43 폴리펩타이드의 PLD를 인코딩하고/거나 엑손 6의 다운스트림 및 엑손 7의 업스트림 비번역된 서열을 포함하는 TDP-43 mRNA 서열을 표적하는 서열을 포함하는 siRNA, 및/또는
(iii) Cas9 단백질 및 적어도 하나의 gRNA를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템으로서, PLD가 결여된 절두된 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 택일적 mRNA를 초래하는 택일적 스플라이스 부위에 대하여 인코딩하는 서열에서 또는 근처에서 서열을 gRNA가 인식하는, CRISPR/Cas 시스템을 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 90. 구현예 89에 있어서,
(i) 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 구현예 47의 ASO이고/거나,
(ii) siRNA가 구현예 48의 siRNA이고/거나,
(iii) CRISPR/Cas 시스템이 구현예 49의 CRISPR/Cas 시스템인, 방법.
구현예 91. 구현예 89 또는 구현예 90에 있어서, 세포가 생체내인, 방법.
Figure pct00002
Figure pct00003
실시예
하기 실시예는 예시적 목적으로만 제공되고 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.
실시예 1: 돌연변이된 TARDBP 유전자를 발현시키는 배아 줄기 세포의 생성
TDP-43이 생존력에 필수적이므로, 제1 내인성 TDP-43 대립유전자에서 조건부 녹아웃 및 다른 제2 내인성 TDP-43 대립유전자에서 돌연변이를 포함하는 배아 줄기 (ES) 세포는 제1 내인성 대립유전자로부터 야생형 TDP-43이 조건의 활성화까지 ES 세포의 생존력을 지속하도록 생성될 수 있고, 그 활성화 후 제2 대립유전자로부터 발현된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 규명될 수 있다.
다양한 TDP-43 구조적 도메인에 의해 역할된 생물학적, 생화학적, 및/또는 병원성 역할(들)을 평가하기 위해, 마우스 ES 세포는 (i) 내인성 TARDBP 유전자좌에, 조건부 녹아웃 돌연변이, 및 (ii) 상동 염색체에서 다른 TARDBP 유전자좌에, 5개 구조적 도메인 ― 핵 국재화 신호 (NLS), RNA 인식 모티프 1 (RRM1), RNA 인식 모티프 2 (RRM2), 추정적 유출 신호 (E), 또는 프리온형 도메인 (PLD) ― 중 1개가 어느 한쪽 그들의 기능을 폐지하도록 예측된 방식으로 변경되었거나 결실되었던 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함하기 위해 변형되었다. 도 3, 참고. 돌연변이된 TARDBP 유전자(들)을 갖는 그리고 기능적 NLS, RRM1, RRM2, E, 또는 PLD가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 세포들의 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 양쪽 (1) 표현형 및 (2) 생물학적 활성은 실시예 2 및 3에서 각각으로 기재된 경우에 분석되었다.
조건부 대립유전자는 TDP-43 엑손 3의 결실이 무 기능적 단백질을 생산한다는 것을 보여주는 이전에 공표된 작업에 기반하여 설계되었다. Chiang 등 (2010) Proc Natl Acad Sci USA 107:16320-324. 내인성 마우스 TARDBP 유전자의 엑손 3은 loxp 부위로 플록스되었다. cre-매개된 재조합 후, 게놈성 좌표 chr4:147995844-147996841의 결실은 영향받았다. 플록스된 엑손 3을 포함하는 ES 세포는 본원에 기재된 경우에 돌연변이된 TARDBP 유전자로 추가 변형되었다. 대조군으로서, 하나의 대립유전자에서 조건부 녹아웃 돌연변이 그리고 다른 대립유전자에서 제2 엑손의 개시 코돈부터 정지 코돈 (게놈성 좌표 chr4:147992370-147999471)까지의 결실로 변형된 마우스 ES 세포는 또한 창출되었다.
실시예 2: 돌연변이된 TARDBP 유전자를 발현시키는 세포의 표현형적 분석
실시예 1에서 생성된 배아 줄기 (ES) 세포, 그로부터 유래된 원시 외배엽, 또는 그로부터 유래된 운동 뉴런 (ESMN)의 표현형은 세포의 생존력 그리고 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 국재화 및 안정성을 평가함으로써 분석되었다.
명백히, 기능적 NLS 또는 기능적 PLD가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 ES 세포는 생존가능하였고; 기능적 PLD가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 세포는 감소된 적합성을 갖는 것으로 나타났다. 도 4. ES 세포도 기능적 RRM1 또는 RRM2가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 ESMN도 생존가능하게 남아있지 않았다. 도 4 및 5.
기능적 NLS가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 ESMN에서 핵부터 세포질까지 재분포하였고, 돌연변이체 TDP-43은 ALS 병리를 연상시키는 많은 큰 집합체형 내포물에 축적하였다. 도 6-8. 기능적 NLS의 결여는, 핵성 염색의 상실로, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 방대한 세포질성 집합을 야기시켰다. 도 7-8. 기능적 PLD가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 또한 ESMN의 세포질에 재분포하였고 기능적 NLS가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드에 의해 생산된 것보다 덜 풍부하고 질적으로 상이한 것으로 나타났던 반점 내포물에 축적하였다. 도 6-8. PLD의 결실은, 핵성 염색이 유지되었어도, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 세포질로의 가장 큰 정도의 오국재화를 야기시켰다. 도 7-8.
기능적 NLS 또는 PLD가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 돌연변이체 TDP-44의 증가된 용해도를 나타냈다. 도 9a. 기능적 E 또는 RRM1이 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 용해도는 야생형 TDP-43 폴리펩타이드와 비교하여 변화되지 않았다. 도 9a. 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 임의의 것에 대하여 mRNA 발현 수준에서 차이가 없었어도, 단백질 수준에서 증가는 기능적 NLS, PLD 또는 RRM1이 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드에 대하여 보여졌다. 도 9b. 이들 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드에 대하여 mRNA 발현 수준이 야생형 TDP-43의 발현 수준에 비교가능하였으므로, 증가된 단백질 수준은 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 증가된 안정성 때문일 것 같았다. 도 9c.
기능적인 구조적 도메인이 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 세포의 표현형을 분석하는데 사용된 물질 및 방법은 아래 기재된다.
세포 배양
배아 줄기 (ES) 세포 및 이들로부터 유래된 운동 뉴런 (ESMN)의 생존력을 지원하기 위해, 세포에 의해 발현된 단백질의 유일한 형태로서, 돌연변이체 TDP-43 단백질의 능력은 배양에서 분화에 의해 테스트되었다. ES 세포는 2 일 동안 배아 줄기 세포 배지 (ESM; DMEM + 15% 태아 소 혈청 + 페니실린/스트렙토마이신 + 글루타민 + 비-필수 아미노산 + 뉴클레오사이드 + β-머캅토에탄올 + 피루브산나트륨 + LIF)에서 배양되었고, 그 동안 배지는 매일 변화되었다. ES 배지는 트립신처리 1 시간 전 7 mL의 ADFNK 배지 (고급 DMEM/F12 + 신경기저 배지 + 10% 녹아웃 혈청 + 페니실린/스트렙토마이신 + 글루타민 + β-머캅토에탄올)로 대체되었다. ADFNK 배지는 흡인되었고, ESC는 0.05% 트립신-EDTA로 트립신처리되었다. 펠렛화된 세포는 12 mL의 ADFNK에서 재현탁되었고 현탁액에서 2 일 동안 성장되었다. 세포는 레티노산 (RA), 평평해진 작용제 및 푸르모르파민으로 보충된 ADFNK에서 추가 4 일 동안 배양되어 사지형 운동 뉴런 (ESMN)을 수득하였다. 해리된 운동 뉴런은 배아-줄기-세포-유래된 운동 뉴런 배지 (ESMN; 신경기저 배지 + 2% 말 혈청 + B27 + 글루타민 + 페니실린/스트렙토마이신 + β-머캅토에탄올 + 10 ng/mL GDNF, BDNF, CNTF)에서 플레이팅되었고 성숙되었다. 조건부 녹아웃 대립유전자는 ES 세포 기 (도 4, 6-9) 또는 플레이팅 (도 5) 후 7 일에 전기천공을 통해 전달된 cre 리콤비나제를 사용하여 활성화되었다.
돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 세포내 국재화
TDP-43의 돌연변이체의 세포내 국재화는 TDP-43 폴리펩타이드의 N-말단 (α-TDP-43 N-term)을 인식하는 항체 그리고 TDP-43 폴리펩타이드의 C-말단 프리온형 도메인 (α-TDP-43 C-term) (Proteintech, Rosemont, IL)을 인식하는 항체를 사용하여 분석되었다. 가용성 세포질성 단백질 추출물은 빙상에서 10 분 동안 프로테아제 및 포스파타제 억제제 (Roche)로 보충된 빙냉된 용해 완충액 (10mM KCl, 10mM Tris-HCl, pH 7.4, 1mM MgCl2, 1mM DTT, 0.01% NP-40)에서 ES 세포-유래된 MN을 인큐베이션시킴으로써 제조되었다. 세포는 그 다음 27-게이지 주사기에 5회 통과되었다. 4000rpm으로 5 분 동안 4℃에 원심분리 이후, 가용성 세포질성 추출물을 포함하는 단백질 상청액은 수집되었다. 불용성 핵성 단백질 추출물은 프로테아제 및 포스파타제로 보충된 RBS-100 완충액 (10mMTris-HCl pH 7.4, 2.5mM MgCl2, 100mM NaCl, 0.1% NP-40)의 같은 부피로 펠렛을 재현탁시킴으로써 제조되었다. 같은 부피의 2X SDS 샘플 완충액은 각 분획에 첨가되었고 샘플은 90℃로 가열되었다. 같은 부피의 각 분획은 그 다음 14% SDS 겔에 로딩되었고 50 분 동안 225V로 전기천공되었고 이어서 α-TDP-43-N-term 항체 또는 α-TDP-43-C-term 항체를 사용하여 TDP-43에 대하여 웨스턴 블랏팅되었고, 이들 중 후자는 PLD 결실 돌연변이체를 인식하지 못할 것이다. 밀도측정은 ImageJ를 사용하여 수행되었다. 도 6b. 세포질성/핵성 TDP-43의 비는 프리즘을 위한 그래프패드를 사용하여 플롯팅되었고 통계적으로 분석되었다. 도 6b; 도 9b, 우측 패널.
형광 동소 하이브리드화 (FISH)
ES 세포-유래된 MN은 폴리오르니틴/라미닌 코팅된 커버슬립에서 플레이팅되었고 7 일 동안 배양되었다. 커버슬립은 빙냉된 4% PFA에서 15 분 동안 침지-고정되었고, 1x PBS에서 세정되었다. 세포는 0.2% Triton X-100 (TBS-T)이 있는 Tris 완충된 식염수 (pH 7.4)에서 희석된 5% 정상 당나귀 혈청으로 차단되었고 4℃에 밤새 5% 정상 당나귀 혈청으로 TBS-T에서 희석된 일차 항혈청 (TDP-43 C-term 및 MAP2)에서 인큐베이션되었다. TBS-T로 세정 후, 세포는 Alexa 488 및 568 (1:1,000; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)에 커플링된 종-특이적 이차 항체로 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션되었다. TBS-T로 세정 후, 염색된 조직 커버슬립은 Flouromount (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA)에서 현미경 슬라이드에 장착되었고 40X 배율로 Leica 710LSM 공촛점 현미경을 사용하여 이미지화되었다. 도 7 및 도 8.
돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 용해도
이 프로토콜은 Jo 등 (2014) Nature Communications 5:3496으로부터 발췌되었다. 500ul의 빙냉된 가용성 완충액 (0.1 M MES (pH 7), 1 mM EDTA, 0.5 mM MgSO4, 1 M 수크로스)은 50 mM N-에틸말레이미드 (NEM), 1 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1 mM PMSF 및 10 ug/ml 각각의 아프로티닌, 류펩틴 및 펩스타틴을 함유함). 세포는 21-게이지 바늘에 3-5 통과되었고, 이어서 23-게이지 바늘에 3-5 통과되었다. 등가 부피의 균질액은 그 다음 각 샘플로부터 수집되었고 50,000xg로 20 분 동안 4℃에 원심분리되었고, 나머지는 -80℃에 보관되었다. 상청액은 제거되었고, 각 펠렛은 1% N-라우로일사르코신 (사르코실) 및 프로테아제 억제제 (1 mM PMSF, 50 mM NEM 및 10 ug/ml 각각의 아프로티닌, 류펩틴 및 펩스타틴)를 함유하는 700 ul RAB 완충액 (100 mM MES (pH6.8), 10% 수크로스, 2 mM EGTA, 0.5 mM MgSO4, 500 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 10 mM NaH2PO4, 20 mM NaF)에서 재현탁되었고, 실온에서 1 분 동안 와동되었고, 그 다음 끊임없이 회전하면서 밤새 4℃에 인큐베이션되었다. 샘플은 그 다음 12℃에 30 분 동안 200,000xg로 원심분리되었고, 상청액은 사르코실-가용성 분획으로서 수집되었다. 펠렛은 700 ul RAB 완충액에서 재현탁되었고 26-게이지 바늘에 3-5 회 통과되어 펠렛을 완전히 분산시켜, 사르코실 불용성 분획을 창출하였다. 사르코실 가용성 및 불용성 분획의 등가 부문은 그 다음 분취되었고 같은 부피의 2X SDS 샘플 완충액은 각각에 첨가되었다. 샘플은 90℃로 가열되었다. 같은 부피의 각 분획은 그 다음 14% SDS 겔에 로딩되었고 50 분 동안 225V로 전기천공되었고 이어서 TDP-43에 대하여 웨스턴 블랏팅되었다. 밀도측정은 ImageJ를 사용하여 수행되었다. 도 9a. 가용성:불용성 TDP-43의 비는 프리즘을 위한 그래프패드를 사용하여 플롯팅되었고 통계적으로 분석되었다. 도 9a.
돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 발현 수준
TDP-43 돌연변이체의 발현 수준은 본원에 기재된 경우에 웨스턴 블랏 분석에 의해 분석되었다. 본 실시예에서 메신저 RNA 수준은 정량적 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 수행되었다.
각 샘플로부터 총 RNA는 정상 엑손 4 및 엑손 5의 접합부에 미치는 프라이머 그리고 마우스 TDP-43 유전자좌의 영역을 검출하는 프로브를 사용하여 추출되었고 역 전사되었다. DROSHA의 qPCR은 용이하게 이용가능한 키트의 프로브 및 프라이머를 사용하여 수행되었다.
구체적으로, RNA는 실시예 1에서 기재된 경우에 배아-줄기-세포 유래된 운동 뉴런 (ESMN)으로부터 단리되었다.
총 RNA는 제조업체의 프로토콜 (Zymo Research)에 따른 Direct-zol RNA Miniprep 플러스 키트를 사용하여 단리되었다. 총 RNA는 제조업체의 프로토콜 (Invitrogen)에 따른 Turbo 무DNA 키트를 사용하여 DNase로 처리되었고 20 ng/μL로 희석되었다. 역 전사 (RT) 및 PCR은 Quantitect Probe RT-PCR 키트 (Qiagen)로 1-단계 반응에서 수행되었다. qRT-PCR 반응은 10 μL의 최종 부피로 만들기 위해 RT-PCR Master 믹스, ROX 염료, RT-믹스, 및 20X 유전자 특이적 프라이머-프로브 믹스를 함유하는 8 μL 혼합물 및 2 μL RNA를 함유하였다.
달리 언급되지 않는 한, 최종 프라이머 및 프로브 농도는 각각 0.5μM 및 0.25μM이었다. qRT-PCR은 ViiA™ 7 Real-Time PCR Detection System (ThermoFisher)에서 수행되었다. PCR 반응은 광학적 384-웰 플레이트에서 45 주기 동안 10 분 45℃에 이어서 10 분 95℃에 RT-단계 그리고 5초 95℃, 30초 60℃ 주기화하는 2-단계로 4중 실시되었다. 분석 (Pan 검정)에서 사용된 프라이머 및 프로브의 서열은 아래 표 2에서 제공된다.
Figure pct00004
돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 안정성
ES 세포 콜로니는 2 일후 해리되었고 ADFNK 배지에서 배양되었다. 배지는 2 일에 대체되었고 레티노산 (100 nM 내지 2 μM) (Sigma) 및 소닉 헤지호그 (Shh-N; 300 nM) (Curis Inc.)로 보충되었고 배아 바디 (EB)는 4 일 동안 배양되었다. 4 일차 배상체는 사이클로헥시미드 (100 μg/ml)로 처리되어 새로운 단백질 합성을 차단시켰다. 배지는 첨가된 신선한 사이클로헥시미드로 4시간 마다 교체되었다. 세포 용해물은 지시된 시점에 수집되었고 TDP-43 및 GAPDH 항체로 면역블랏팅에 의해 분석되었다. 도 9c.
실시예 3: TDP-43 돌연변이체에 의한 TDP-43 생물학적 활성의 분석
크립틱 엑손은 GU-풍부 TDP-43 결합 부위를 종종 갖고, TDP-43은 크립틱 엑손의 인식을 억압하여서 정상 스플라이싱을 촉진시키는 것으로 나타났다. TDP-43의 상실은 조절된 유전자의 단백질 수준 및 정상 mRNA의 상실을 초래한다. TDP-43은 또한 TDP-43 수준을 유지시키기 위해 음성 피드백 자가조절적 루프로서 이의 자체 전사물의 3' 단말에 결합한다. 기능적인 구조적 도메인이 결여된 생물학적 활성 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는 크립틱 엑손 스플라이싱을 계속 억압하고/거나 테스트되었던 이의 자가조절적 루프에 참여하는 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 능력을 평가함으로써 테스트되었다.
기능적 RRM1, NLS, 또는 PLD가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자 또는 야생형 TARDBP 유전자에 대하여 이형접합성인 ESMN은 크립틱 엑손을 포함하는 3개 유전자의 발현 산물에 대하여 분석되었고, 이의 스플라이싱은 야생형 TDP-43에 의해 억압되는 것으로 알려진다: Crem, Fyxd2, 및 Clf1. 도 10. 정상 스플라이싱된 Crem, Fyxd2, 및 Clf1 산물은 기능적 RRM1, NLS, 또는 PLD가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 모든 ESMN에서 보여졌고, 정상 스플라이스 산물은 야생형 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 ESMN에 비교가능한 양으로 발견되었다. 도 10. 하지만, 크립틱 엑손의 스플라이싱은 야생형 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 ESMN에 비교하여 기능적 RRM1, NLS, 또는 PLD가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 ESMN에서 증가되었다. 도 10. 이 데이터는 기능적 RRM1, NLS, 또는 PLD가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 Crem, Fyxd2, 및 Clf1 유전자의 크립틱 엑손 스플라이싱을 억압시키지 못한다는 것을 시사한다. 도 10.
기능적 NLS, RRM1, RRM2, E, 또는 PLD가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자 또는 야생형 TARDBP 유전자에 대하여 이형접합성인 ESMN은 택일적으로 스플라이싱된 TDP-43 mRNA의 수준에 대하여 분석되었다. 도 11b. 야생형 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 대조군 ESMN에 비교하여, 기능적 NLS, RRM1, E, 또는 PLD가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 ESMN은 택일적 스플라이싱된 TDP-43 mRNA의 감소된 수준을 나타냈다. 도 11b. 기능적 E가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 ESMN은 택일적 스플라이싱된 TDP-43 mRNA의 비교가능한 수준을 나타냈다. 도 11b. 기능적 NLS 또는 PLD가 결여된 TDP-43 돌연변이체를 발현시키는 ESMN이 ALS 표현형을 나타내는 것을 보여주는 실시예 2에서 제공된 데이터와 조합된 (도 5), 본 데이터는, 택일적으로 스플라이싱된 TDP-43 mRNA를 절약하면서, 정상적으로 스플라이싱된 TDP-43 mRNA의 수준을 감소시키는 쪽으로 지향된 전략이 TDP-43 연관된 병리학에 대하여 치료적일 수 있다는 것을 시사한다.
기능적인 구조적 도메인이 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 세포의 표현형을 분석하는데 사용된 물질 및 방법은 아래 기재된다.
정량적 폴리머라제 연쇄 반응
각 샘플로부터 총 RNA는 심문된 유전자 유전자좌 (Crem, Fxyd2, Clf1, TDP-43)의 그들 영역을 검출하는 프로브 그리고 스플라이싱 영역을 측접하는 프라이머를 사용하여 추출되었고 역 전사되었다. 심문된 Crem, Fxyd2, 및 Clfl 유전자에 대하여 검출가능한 영역은 각 심문된 유전자에 대하여 정상 및 크립틱 엑손 마우스 서열의 접합부에 미치는 것들을 포함하였다. 심문된 TDP-43 영역에 대하여 검출가능한 영역은 택일적 스플라이스 영역에 미치는 것들을 포함하였다. DROSHA의 qPCR은 용이하게 이용가능한 키트의 프라이머 및 프로브를 사용하여 수행되었다.
구체적으로, RNA는 실시예 2에서 기재된 경우에 분화된 배아-줄기-세포-유래된 운동 뉴런 (ESMN)으로부터 단리되었다. 총 RNA는 제조업체의 프로토콜 (Zymo Research)에 따른 Direct-zol RNA Miniprep 플러스 키트를 사용하여 단리되었다. 총 RNA는 제조업체의 프로토콜 (Invitrogen)에 따른 Turbo 무DNA 키트를 사용하여 DNase로 처리되었고 20 ng/μL로 희석되었다. 역 전사 (RT) 및 PCR은 Quantitect Probe RT-PCR 키트 (Qiagen)로 1-단계 반응에서 수행되었다. qRT-PCR 반응은 10 μL의 최종 부피를 만들기 위해 RT-PCR Master 믹스, ROX 염료, RT-믹스, 및 20X 유전자 특이적 프라이머-프로브 믹스를 함유하는 8 μL 혼합물 및 2 μL RNA를 함유하였다.
달리 언급되지 않는 한, 최종 프라이머 및 프로브 농도는 각각 0.5μM 및 0.25μM이었다. qRT-PCR은 ViiA™ 7 Real-Time PCR Detection System (ThermoFisher)에서 수행되었다. PCR 반응은 광학적 384-웰 플레이트에서 50 주기 동안 10 분 45℃에 이어서 10 분 95℃에 RT-단계 그리고 5초 95℃, 30초 60℃ 주기화하는 2-단계로 4중 실시되었다.
Crem의 엑손 1부터 엑손 2까지 생산적 Crem 스플라이싱을 평가하기 위한 qRT-PCR은 서열번호:14 및 서열번호:15로서 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머, 그리고 서열번호:16으로서 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머로 수행되었다. Crem의 크립틱 엑손에 대한 엑손 1의 스플라이싱은 서열번호:17 및 서열번호:18로서 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머, 그리고 서열번호:19로서 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머로 평가되었다. 엑손 2에 대한 Crem의 크립틱 엑손의 스플라이싱은 서열번호:20 및 서열번호:21로서 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머, 그리고 서열번호:22로서 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머로 평가되었다.
Fyxd2의 엑손 3부터 엑손 4까지 생산적 Fyxd2 스플라이싱을 평가하기 위한 qRT-PCR은 서열번호:23 및 서열번호:24로서 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머, 그리고 서열번호:25로서 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머로 수행되었다. Fyxd2의 크립틱 엑손에 대한 엑손 3의 스플라이싱은 서열번호:26 및 서열번호:27로서 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머, 그리고 서열번호:28로서 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머로 평가되었다. 엑손 4에 대한 Fyxd2의 크립틱 엑손의 스플라이싱은 서열번호:29 및 서열번호:30으로서 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머, 그리고 서열번호:31로서 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머로 평가되었다.
생산적 Crlf1 스플라이스 산물을 위한 qRT-PCR은 서열번호:32 및 서열번호:33으로서 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머, 그리고 서열번호:34로서 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머로 수행되었다. Crlf1의 크립틱 엑손에 대한 엑손 1의 스플라이싱은 서열번호:35 및 서열번호:36으로서 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머, 그리고 서열번호:37로서 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머로 평가되었다. 엑손 2에 대한 Crlf1의 크립틱 엑손의 스플라이싱은 서열번호:38 및 서열번호:39로서 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머, 그리고 서열번호:40으로서 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머로 평가되었다.
PLD 도메인을 인코딩하는 서열이 결여된 택일적으로 스플라이싱된 TDP-43 mRNA는 서열번호:41 및 서열번호:42로서 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머, 그리고 서열번호:43으로서 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 평가되었다.
본 실시예의 각 qPCR 분석 (정상 및 크립틱 스플라이싱)에서 사용된 프라이머 및 프로브의 서열은 아래 표 3에서 제공된다.
표 3
Figure pct00005
실시예 4: 돌연변이된 TDP-43 단백질 을 발현시키는 마우스의 생성
TDP-43의 결실이 배아 치사율을 초래하여도, 내인성 TARDBP 유전자좌로부터 돌연변이체 △NLS TDP-43 유전자 또는 돌연변이체 △PLD TDP-43 유전자만을 발현시키는 배아 줄기 세포는 생존가능하고 시험관내 운동 뉴런으로 분화될 수 있다. 이 데이터는 내인성 TARDBP 유전자좌로부터 기능적인 구조적 도메인이 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 배아 줄기 세포가 TDP-43의 단백질이상질환의 동물 모델 창출에서 생존가능할 수 있고 유용할 수 있다는 가능성을 제기한다. 예를 들어, 그러한 배아 줄기 세포는, 정상 및 병리학적 생물학적 과정에서 TDP-43 구조적 도메인의 역할을 시험하기 위해 기능적인 구조적 도메인이 결여된 돌연변이체 TDP-43 단백질을 발현시키는 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스를 생성하는데 사용될 수 있다.
기능적 NLS 또는 PLD 도메인이 결여된 돌연변이체 TDP-43 단백질을 발현시키는 배아 또는 동물을 창출하기 위해, VelociMouse® 방법 (Dechiara, T.M., (2009), Methods Mol Biol 530:311-324; Poueymirou 등 (2007), Nat. Biotechnol. 25:91-99)이 사용되었고, 여기에서
(i) 내인성 TARDBP 유전자좌에, 조건부 플록스된 엑손 3 (loxP-Ex3-loxP)을 포함하는 TARDBP 유전자, 플록스된 엑손 3 (-)의 Cre-매개된 결실, NLS에서 녹아웃 돌연변이 (△NLS), 프리온형 도메인의 결실 (△PLD)시 무효 대립유전자, 또는 야생형 TARDBP 유전자 (WT), 도 3a, 참고, 및
(ii) 상동 염색체에서 다른 TARDBP 유전자좌에, 야생형 (WT) TARDBP 유전자 또는 플록스된 엑손 3 (-)의 Cre-매개된 결실시 무효 대립유전자를 포함하는 표적된 ES 세포는 압축되지 않은 8-세포 기 스위스 웹스터 배아에 주사되었다. 수정 후 배아의 생존력은 시험되었고 살아서 태어난 F0 세대 마우스를 생산하는 능력은 사정되었다.
이전 실험과 일치하게, 기능적 TDP-43 단백질 (TDP-43-/-)이 결여된 배아는 생존가능하지 않았고 E3.5 (도 12) 기를 넘어 생존가능하지 않았다. 유사하게, 기능적 NLS가 결여된 TDP-43 단백질 (TDP-43△NLS/-)만 또는 기능적 PLD가 결여된 TDP-43 단백질 (TDP-43△PLD/-)만을 발현시키는 배아는, 그러한 배아가 더 오래 생존하였어도, 생존가능하지 않았다 (도 12). TARDPB 유전자좌의 1개 대립유전자로부터 야생형 TDP-43 단백질의 발현은 상동 염색체에서 다른 대립유전자로부터 어느 한쪽 기능적 NLS가 결여된 TDP-43 단백질 (TDP-43△NLS/-) 또는 기능적 PLD가 결여된 TDP-43 단백질 (TDP-43△PLD/-)을 발현시키는 배아를 구조하였다 (도 12).
살아서 태어난 F0 세대 마우스는
(i) 내인성 TARDBP 유전자좌에, 야생형 유전자 (WT), 플록스된 엑손 3 (-)의 cre-매개된 결실, 플록스된 엑손 3 (loxP-Ex3-loxP), NLS에서 녹아웃 돌연변이 (△NLS), 프리온형 도메인의 결실 (△PLD)을 포함하는 TARDBP 유전자, 도 3a, 참고, 및
(iii) 상동 염색체에서 다른 TARDBP 유전자좌에, 야생형 (WT) TARDBP 유전자
를 포함하는 ES 세포로 주사된 8-세포 기 스위스 웹스터 배아로부터 성공적으로 생산되었다.
실시예 4: 기능적인 구조적 도메인이 결여된 돌연변이된 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 마우스의 표현형적 분석
실시예 3에서 생성된 동물의 표현형은 동물로부터 단리된 운동 뉴런 또는 척수 조직에서 TDP-43 폴리펩타이드의 국재화, 인산화 상태, 및 용해도를 평가함으로써 분석되었다. 추가적으로, 동물의 근육의 신경차단 또는 신경지배는 또한 결정되었다.
16 주령 마우스의 척수에서 유래된 운동 뉴런의 세포질성 및 핵성 분획은 하기: (1) 야생형 TDP-43 단백질의 N-말단을 인식하고 그래서 야생형 TDP-43, △NLS TDP-43, 및 △PLD TDP-43을 결합시키는 항체, (2) 야생형 TDP-43 단백질의 C-말단을 인식하고 그래서 야생형 TDP-43 및 △NLS TDP-43을 결합시키지만, △PLD TDP-4를 결합시키지 않는 항체, 또는 (3) TDP-43을 이의 인산화된 형태로 인식하는 항체로 웨스턴 블랏 분석에 의해 평가되었다.
도 13a-13c에서 도시된 경우에, 야생형 및 △NLS 돌연변이체 TDP-43 단백질은 약 43 Kd의 예상된 크기에서 검출되었고, 반면 △PLD 돌연변이체는 약 30 Kd의 예상된 크기에서 검출되었다. 실시예 2에서 분석된 ESMN과 유사하게, 기능적 NLS 또는 PLD가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드는, 야생형 TDP-43 단백질의 존재 하에서 조차, 척수 조직에서 핵부터 세포질까지 재분포하였다. 도 13a. 약 43 Kd의 인산화된 TDP-43 폴리펩타이드는, 야생형 TDP-43 폴리펩타이드만을 발현시키는 마우스가 아닌, 돌연변이체 △NLS 또는 △PLD 폴리펩타이드를 발현시키는 마우스의 척수에서 유래된 운동 뉴런의 세포질에서 검출되었다. 도 13b. 운동 뉴런의 핵에서 임의의 인산화된 TDP-43은 시험된 모든 샘플에서 검출불가능한 채로 남아있었다. 도 13b. 인산화 부위가 아미노산 위치 409/410에 있으므로, 기능적 PLD가 결여된 인산화된 TDP-43 폴리펩타이드가 검출되지 않았던 것이 놀랍지 않다. 도 13b. NLS 도메인에서 기능적 돌연변이를 포함하는 △NLS 돌연변이체 TDP-43 단백질을 발현시키는 16-주령 마우스로부터 척수의 운동 뉴런은 전반적으로 불용성 TDP-43 단백질 증가된 수준을 나타냈다. 도 13c. △PLD 돌연변이체 TDP-43 단백질을 발현시키는 마우스에서 TDP-43 단백질의 용해도에서의 증가인 것으로 나타나지 않았다. △PLD 돌연변이체가 불용성 분획에서 검출되지 않았기 때문에, △PLD 돌연변이체는 가용성으로 보인다. 도 13c.
△NLS 도메인에서 기능적 돌연변이를 포함하는 △NLS 돌연변이체 TDP-43 단백질 또는 기능적 PLD가 결여된 △PLD TDP-43 돌연변이체 단백질을 발현시키는 마우스의 운동 뉴런의 서브세트는 방대한 세포질성 TDP-43 집합을 나타냈다. 도 14. 세포질성 집합은 기능적 NLS가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 마우스의 것들에 비교하여 △PLD 돌연변이체 단백질을 발현시키는 마우스의 운동 뉴런에서 덜 빈번하게 검출되었다. 도 14.
신경차단이 ALS에서 나타나는 제1 병리학적 속성들 중 하나이므로, 대부분 빠른 수축 근육 섬유 (전경골) 또는 느린 수축 섬유 (늑간근)를 포함하는 근육은 신경차단에 대하여 분석되었다. TDP-43의 오국재화는 주로 빠른 수축 섬유를 포함하지만 느린 수축 섬유를 포함하지 않는 근육의 부분적으로 신경지배된 종판 (*) 및 신경차단 (화살표)을 초래하였다. 도 15a-15b.
본원에 나타난 데이터는 본원에 기재된 동물이 ALS의 귀중한 질환 모델일 수 있다는 것을 시사한다. 전형적 ALS 환자에서, 원위 신속-피로성 (FF) 운동 단위는 가장 먼저 영향받고, 근육에서 신경원성 변화는 운동 뉴런 상실 전에 관찰될 수 있다. 유사하게, 가장 널리 사용된 'ALS' 모델인, SOD1 G93A 마우스에서 운동 뉴런 상실은, FF 운동 단위의 초기 및 우선적 관여와, 골격근의 신경차단에 의해 또한 선행된다. 반대로, 주로 느린 섬유에 의해 신경지배된 근위 근육, 예컨대 늑간근 및 횡경막은 끝까지 일반적으로 절약되고 - 이들 근육의 신경차단은 치명적이다. 늑간근의 신경차단은 질환이 진행함에 따라 예상될 수 있다.
양쪽 (a) 기능적 NLS 또는 PLD가 결여된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드 및 (b) 야생형 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 마우스의 표현형을 분석하는데 사용된 물질 및 방법은 아래 기재된다.
돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 세포내 국재화 및 인산화의 검출
TDP-43 돌연변이체의 세포내 국재화는 TDP-43 폴리펩타이드의 N-말단 (α-TDP-43 N-term)을 인식하는 항체 그리고 TDP-43 폴리펩타이드의 C-말단 프리온형 도메인 (α-TDP-43 C-term) (Proteintech, Rosemont, IL)을 인식하는 항체를 사용하여 분석되었다. 가용성 세포질성 단백질 추출물은 빙상에서 10 분 동안 프로테아제 및 포스파타제 억제제 (Roche)로 보충된 빙냉된 용해 완충액 (10mM KCl, 10mM Tris-HCl, pH 7.4, 1mM MgCl2, 1mM DTT, 0.01% NP-40)에서 총 척수 조직을 인큐베이션시킴으로써 제조되었다. 세포는 그 다음 27-게이지 주사기에 5회 통과되었다. 4000rpm으로 5 분 동안 4℃에 원심분리 이후, 가용성 세포질성 추출물을 포함하는 단백질 상청액은 수집되었다. 불용성 핵성 단백질 추출물은 프로테아제 및 포스파타제로 보충된 RBS-100 완충액 (10mMTris-HCl pH 7.4, 2.5mM MgCl2, 100mM NaCl, 0.1% NP-40)의 같은 부피에서 펠렛을 재현탁시킴으로써 제조되었다. 같은 부피의 2X SDS 샘플 완충액은 각 분획에 첨가되었고 샘플은 90℃로 가열되었다. 같은 부피의 각 분획은 그 다음 14% SDS 겔에 로딩되었고 50 분 동안 225V로 전기천공되었고 이어서 α-TDP-43-N-term 항체 (도 13a), α-TDP-43-C-term 항체 (도 13a), 또는 아미노산 409/410에서 TDP-43의 인산화를 검출하는 α-포스포TDP-43 항체 (도 13b) (Cosmo Bio USA; 카탈로그 번호 CAC-TIP-PTD-M01)를 사용하여 TDP-43에 대하여 웨스턴 블랏팅되었다. α-TDP-43-C-term 항체도 α-포스포TDP-43 항체도 PLD 결실 돌연변이체를 인식하지 않을 것이다. 밀도측정은 ImageJ를 사용하여 수행되었다. (도 13a 및 13b) 세포질성/핵성 TDP-43의 비는 프리즘을 위한 그래프패드를 사용하여 플롯팅되었고 통계적으로 분석되었다. (도 13a, 하위 패널).
형광 동소 하이브리드화 (FISH)
척수는 척주로부터 단리되었고, 4% PFA에서 밤새 (또는 FUS 면역염색을 위하여 1 시간 동안) 침지-고정되었고, 1x PBS에서 세정되었다. 척수 세그먼트는 4% 저 융점 아가로스 (Promega)에서 내장되었고 직렬 횡단 절편 (70μm)은 비브라톰 (Leica VT 1000S)을 사용하여 컷팅되었고 자유-부유 가공되었다. 자유-부유 척수 절편은 0.2% Triton X-100 (TBS-T)이 있는 Tris 완충된 식염수 (pH 7.4)에서 희석된 5% 정상 당나귀 혈청으로 차단되었고 실온에서 밤새 5% 정상 당나귀 혈청이 있는 TBS-T에서 희석된 일차 항혈청에서 인큐베이션되었다. 사용된 일차 항체는 ChAT (1:250) EMD Millpore Cat AB144P; TDP-43 (1:10,000) Proteintech 10782-2-AP 및 NeuN (1:500) EMD Millipore MAB377이다. TBS-T로 세정 후, 조직 절편은 Alexa 488, 555, 647 (1:1,000; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), Cy3 또는 Cy5 (희석 1:500; Jackson Immunoresearch Labs, West Grove, PA, USA)에 커플링된 종-특이적 이차 항체로 실온에서 4 시간 동안 인큐베이션되었다. TBS-T로 세정 후, 염색된 조직 절편은 Flouromount G (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA)에서 현미경 슬라이드에 장착되었고 LSM 510 공촛점 현미경을 사용하여 40x 배율 및 1.5 줌에서 이미지화되었다. (도 14)
돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 용해도
이 프로토콜은 Jo 등 (2014) Nature Communications 5:3496으로부터 발췌되었다. 500ul의 빙냉된 가용성 완충액 (0.1 M MES (pH 7), 1 mM EDTA, 0.5 mM MgSO4, 1 M 수크로스)은 50 mM N-에틸말레이미드 (NEM), 1 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1 mM PMSF 및 10 ug/ml 각각의 아프로티닌, 류펩틴 및 펩스타틴을 함유함). 16-주령 마우스로부터 척수 조직내 세포는 21-게이지 바늘에 3-5 통과, 이어서 23-게이지 바늘에 3-5 통과에 의해 용해되었다. 등가 부피의 균질액은 그 다음 각 샘플로부터 수집되었고 50,000xg로 20 분 동안 4℃에 원심분리되었고, 나머지는 -80℃에 보관되었다. 상청액은 제거되었고, 각 펠렛은 1% N-라우로일사르코신 (사르코실) 및 프로테아제 억제제 (1 mM PMSF, 50 mM NEM 및 10 ug/ml 각각의 아프로티닌, 류펩틴 및 펩스타틴)를 함유하는 700 ul RAB 완충액 (100 mM MES (pH6.8), 10% 수크로스, 2 mM EGTA, 0.5 mM MgSO4, 500 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 10 mM NaH2PO4, 20 mM NaF)에서 재현탁되었고, 실온에서 1 분 동안 와동되었고, 그 다음 끊임없이 회전하면서 밤새 4℃에 인큐베이션되었다. 샘플은 그 다음 12℃에 30 분 동안 200,000xg로 원심분리되었고, 상청액은 사르코실-가용성 분획으로서 수집되었다. 펠렛은 700 ul RAB 완충액에서 재현탁되었고 26-게이지 바늘에 3-5 회 통과되어 펠렛을 완전히 분산시켜, 사르코실 불용성 분획을 창출하였다. 사르코실 가용성 및 불용성 분획의 등가 부문은 그 다음 분취되었고 같은 부피의 2X SDS 샘플 완충액은 각각에 첨가되었다. 샘플은 90℃로 가열되었다. 같은 부피의 각 분획은 그 다음 14% SDS 겔에 로딩되었고 50 분 동안 225V로 전기천공되었고 이어서 TDP-43에 대하여 웨스턴 블랏팅되었다. 밀도측정은 ImageJ를 사용하여 수행되었다. (도 13c). 가용성:불용성 TDP-43의 비는 프리즘을 위한 그래프패드를 사용하여 플롯팅되었고 통계적으로 분석되었다. (도 13c).
신경차단 연구
근육 분석을 위하여, 전경골 (TA), 및 늑간 근육은 해부되었고, 4% PFA에서 침지에 의해 2 시간 동안 후-고정되었고, 1x 인산염 완충된 식염수, pH 7.4 (PBS)에서 세정되었다. 근육은 그 다음 수크로스의 기울기 (0.1M 인산염 완충액, pH 7.4내 10%-20%-30% 수크로스)에서 평형화되었고, O.C.T. 화합물 (Sakura, Torrance, CA)에서 내장되었고 -20℃에 냉동되었다. 연속 절편 (30μm 두께)은 냉동 마이크로톰 (Leica CM 3050S)을 사용하여 컷팅되었다. 근육 (30 μm)의 냉동절편은 시냅스전 말단을 식별하기 위해 Synaptophysin (invitrogen)에 대한 항체, 그리고 시냅스후 아세틸콜린 수용체를 검출하기 위한 Alexa 488-컨쥬게이션된 α-BTX (Invitrogen)로 염색되었다. 이미지는 x10 및 x 40 대물렌즈를 사용하는 Zeiss Pascal LSM 510 공촛점 현미경을 사용하여 획득되었다. 백분율 (%)NMJ 신경지배는 VAChT와 α-BTX 신호 사이 중첩의 영역의 총 수 (신경지배된 종판 총 수)를 α-BTX 신호 영역의 수 (종판의 총 수)로 나눗셈함으로써 결정되었다.
SEQUENCE LISTING <110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. SHARMA-KANNING, AARTI FRENDEWEY, DAVID ZAMBROWICZ, BRIAN <120> MODELING TDP-43 PROTEINOPATHY <130> 10312WO01 <150> 62/867,785 <151> 2019-06-27 <160> 43 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 414 <212> PRT <213> NP_663531 - Wildtype mouse TDP-43 <400> 1 Met Ser Glu Tyr Ile Arg Val Thr Glu Asp Glu Asn Asp Glu Pro Ile 1 5 10 15 Glu Ile Pro Ser Glu Asp Asp Gly Thr Val Leu Leu Ser Thr Val Thr 20 25 30 Ala Gln Phe Pro Gly Ala Cys Gly Leu Arg Tyr Arg Asn Pro Val Ser 35 40 45 Gln Cys Met Arg Gly Val Arg Leu Val Glu Gly Ile Leu His Ala Pro 50 55 60 Asp Ala Gly Trp Gly Asn Leu Val Tyr Val Val Asn Tyr Pro Lys Asp 65 70 75 80 Asn Lys Arg Lys Met Asp Glu Thr Asp Ala Ser Ser Ala Val Lys Val 85 90 95 Lys Arg Ala Val Gln Lys Thr Ser Asp Leu Ile Val Leu Gly Leu Pro 100 105 110 Trp Lys Thr Thr Glu Gln Asp Leu Lys Asp Tyr Phe Ser Thr Phe Gly 115 120 125 Glu Val Leu Met Val Gln Val Lys Lys Asp Leu Lys Thr Gly His Ser 130 135 140 Lys Gly Phe Gly Phe Val Arg Phe Thr Glu Tyr Glu Thr Gln Val Lys 145 150 155 160 Val Met Ser Gln Arg His Met Ile Asp Gly Arg Trp Cys Asp Cys Lys 165 170 175 Leu Pro Asn Ser Lys Gln Ser Pro Asp Glu Pro Leu Arg Ser Arg Lys 180 185 190 Val Phe Val Gly Arg Cys Thr Glu Asp Met Thr Ala Glu Glu Leu Gln 195 200 205 Gln Phe Phe Cys Gln Tyr Gly Glu Val Val Asp Val Phe Ile Pro Lys 210 215 220 Pro Phe Arg Ala Phe Ala Phe Val Thr Phe Ala Asp Asp Lys Val Ala 225 230 235 240 Gln Ser Leu Cys Gly Glu Asp Leu Ile Ile Lys Gly Ile Ser Val His 245 250 255 Ile Ser Asn Ala Glu Pro Lys His Asn Ser Asn Arg Gln Leu Glu Arg 260 265 270 Ser Gly Arg Phe Gly Gly Asn Pro Gly Gly Phe Gly Asn Gln Gly Gly 275 280 285 Phe Gly Asn Ser Arg Gly Gly Gly Ala Gly Leu Gly Asn Asn Gln Gly 290 295 300 Gly Asn Met Gly Gly Gly Met Asn Phe Gly Ala Phe Ser Ile Asn Pro 305 310 315 320 Ala Met Met Ala Ala Ala Gln Ala Ala Leu Gln Ser Ser Trp Gly Met 325 330 335 Met Gly Met Leu Ala Ser Gln Gln Asn Gln Ser Gly Pro Ser Gly Asn 340 345 350 Asn Gln Ser Gln Gly Ser Met Gln Arg Glu Pro Asn Gln Ala Phe Gly 355 360 365 Ser Gly Asn Asn Ser Tyr Ser Gly Ser Asn Ser Gly Ala Pro Leu Gly 370 375 380 Trp Gly Ser Ala Ser Asn Ala Gly Ser Gly Ser Gly Phe Asn Gly Gly 385 390 395 400 Phe Gly Ser Ser Met Asp Ser Lys Ser Ser Gly Trp Gly Met 405 410 <210> 2 <211> 7454 <212> DNA <213> NM_145556.4 - Wildtype mouse TARDBP coding sequence <400> 2 ctcggaaggc cgagtggccg ttctgtcctt catctgtcag tttttcagac ccagctgttt 60 tcattgttgc gtttctttac ttttttctat acgccgaaga gcctgctagc atccgagcct 120 ctgggaggag agagcgcctg tggcttccct cggagagcgc ccctcctgca gggaagccag 180 tgggagaggc cgaaggcggg cgagggcggg aggcggccct agcgccattt tgtgggcacg 240 gagcggtagc gcggctgttg tcggattcct tcccgtctgt gcttcctcct tgtgcttcct 300 agcagtggcc tagcggagat ttaagcaaag atgtctgaat atattcgggt aacagaagat 360 gagaacgatg aacccattga aataccatca gaagacgatg ggacggtgtt gctgtccaca 420 gttacagccc agtttccagg ggcatgcggc ctgcgctacc ggaatcccgt gtctcagtgt 480 atgagaggag tccgactggt ggaaggaatt ctgcatgccc cagatgctgg ctggggcaat 540 ctggtatatg ttgtcaacta tcccaaagat aacaaaagga aaatggatga 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tctgggttaa cccccagcca gccacagttc cagtgaagtc tgttctcatt aaggatgcag 5700 cttcttttcg cggtaggcaa acaggcatga tgcttccgtt gattgtgact ttgttcttga 5760 gtttaatcaa tgctatatca ttgtcaaaac cagcaccgtg agtgtagcct tcatgtataa 5820 agatttcctc gggccaggct tgagtgtaat gaggtgagag ccttttgagg atgcccattc 5880 ggatgttcag ggaggacgct gccattcttt tctcatatac agcatgagcg gctgttagga 5940 cccaattgtc atgtataagt gcacctgctg ctgctgtagt ttgacccagc aacaagactt 6000 gccaaggaaa gtcaccaggc tttgcaggct gccctccaac tatgcgtcct cctatagtgt 6060 gtgtggacag cccacaaact gagggataaa aaacaagtat ttaatgccct acaaattgat 6120 aggcatcctc cctgttgagt gaggctattt aagtttttgt ttagcctgct cacctccttg 6180 taaagatcag taagagatct cagagattgt tttgctgaaa gagaacagca tgagggagtc 6240 tggacaggac ttgtgtgcag gaggacatga cactacttag aggccaaaga caaccccctc 6300 accacaccct gagctgcttg tttttctctt tttgggctct ctgggaattc tgggaaagca 6360 ggaactatga tttacaaagt ttctgttgtc tttaaatgta agactctaaa ttacaatgtt 6420 gcagcaatag ccaaagtgct tctggttcaa aaattggtaa ttttggtctg gtggagccct 6480 ccaaacactt ttaccgttct ttgcaaactg agggctcagg aatgcaacac atgttcttta 6540 ttgtggttgt gcactttgat taaaacttgg aagccgcatg tcagccaaat acaaggctag 6600 aaaactaatt taaaccagct aacacggggg taatgagtgt attattacct ttcaattaaa 6660 aaaaaagcac tctcaactgt tgttggagcc aattctggta aagaaattta agtactatta 6720 aaaggcaaat tgcattaatg tttaaaaatc ttgatgtcgt tgaaaacaat tgcttaggga 6780 aataatgaag ttattagctt tggggtttaa tagcattttt acagagaaga aaagtaacaa 6840 gagttcttgg ttataaatgt ataaacggtt tgagataatt taagaaatca tttaattttt 6900 tatgcttgcc tagttataag gtcaaaaaca atcaagtgca tgatgcacct agcttccgtg 6960 tggaagggga aatgtgagca cactgttggg aaacactaag ctccagcctc agccaagtgc 7020 tgagctttct gcctccccag ccagaccctg cctattgtct gccagctact ctgtcagcta 7080 tgaatctctt ttataaatgg cgtccattac caggctcaca aaccgggggg agtttttctc 7140 ctttggagct cgtccagaat ccatcagcct cacacacata tttacctgca agtcattgga 7200 aaagcaaaaa tgtttagctg tagttgtcat ttgcttgaat aaccccttga aaaatgttga 7260 ttcttgagca tctgtggtgg ggagaggtgt gtgaataacc attttacatg atttcataaa 7320 taggtgtctg cattaccatg tttgcttgca aagtggaaac cttttagatg tgtaacttga 7380 atatgtatca agatctcaag tgcttaatga taaggttttg acttgttaaa ttaaaccatt 7440 tggaatatat tgtg 7454 <210> 3 <211> 285 <212> PRT <213> NP_001011979 - Wildtype rat TDP-43 <400> 3 Met Ser Glu Tyr Ile Arg Val Thr Glu Asp Glu Asn Asp Glu Pro Ile 1 5 10 15 Glu Ile Pro Ser Glu Asp Asp Gly Thr Val Leu Leu Ser Thr Val Thr 20 25 30 Ala Gln Phe Pro Gly Ala Cys Gly Leu Arg Tyr Arg Asn Pro Val Ser 35 40 45 Gln Cys Met Arg Gly Val Arg Leu Val Glu Gly Ile Leu His Ala Pro 50 55 60 Asp Ala Gly Trp Gly Asn Leu Val Tyr Val Val Asn Tyr Pro Lys Asp 65 70 75 80 Asn Lys Arg Lys Met Asp Glu Ala Asp Ala Ser Ser Ala Val Lys Val 85 90 95 Lys Arg Ala Val Gln Lys Thr Ser Asp Leu Ile Val Leu Gly Leu Pro 100 105 110 Trp Lys Thr Thr Glu Gln Asp Leu Lys Asp Tyr Phe Ser Thr Phe Gly 115 120 125 Glu Val Leu Met Val Gln Val Lys Lys Asp Leu Lys Thr Gly His Ser 130 135 140 Lys Gly Phe Gly Phe Val Arg Phe Thr Glu Tyr Glu Thr Gln Val Lys 145 150 155 160 Val Met 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ggtggaagga attctgcatg ccccagatgc 300 tggctggggc aatctggtct atgttgtcaa ctatcccaaa gataacaaaa ggaaaatgga 360 tgaggcggat gcttcctctg cagtgaaagt gaaaagagca gtccagaaga catctgacct 420 catagtgttg ggtctcccct ggaaaacaac agagcaggac ctaaaagact acttcagtac 480 ttttggagag gttcttatgg ttcaggtcaa gaaagatctt aaaactggtc actcaaaagg 540 gtttggcttt gttcgattta cggaatatga aactcaagtg aaagtaatgt cacagcgaca 600 tatgatagat gggcgatggt gtgactgtaa acttccaaat tctaagcaaa gcccagacga 660 gcctttgaga agcagaaagg tgtttgttgg acgttgtaca gaggacatga ctgctgaaga 720 gcttcagcag ttcttctgtc agtatggaga agtggtagat gtcttcattc ccaaaccatt 780 cagagctttt gcctttgtta cctttgcaga tgataaggtt gcccagtctc tttgtggaga 840 ggacttgatc attaaaggaa tcagcgtgca tatatccaat gctgaaccta agcataatag 900 caatagacag ttagaaagaa gtggaagatt tggtggaaaa tctccatttg ggagatcatg 960 atgtcatggt gtttggttct tttggttttg tttttaacac ttgtcttcct tcatatacga 1020 aagtacaata tgaagccttc atttaatctc tgcagttcat ctcatttcaa atgtttatgg 1080 aagaagcact tcattgaaag tagtgctgta aatattctgc cataggaata cttctgtcta 1140 catgctttct catccaagaa ttcgtcatca cgctgcacag gctgcgtctt tgacggtggg 1200 tgttccattt ttatccgcta ctctttattt catggaatcg tatcaacgct atgaacgcaa 1260 ggctgtgata tggaaccaga aggctgtttg aacttttgaa accttgtgtg ggattgatgg 1320 tggtgccgag gcatgaaagg ctagtatgag cgagaaaagg agagagcgcg tgcagagact 1380 tggtggtgga aaatggatat tttttaactt ggagagatgt gtccctcaat cctgtggctt 1440 tggtgcgaga gtgtgcagag agcaatgata gcagataact aacgtacgag tgtttctgca 1500 tcagaggaca tccacgtctg ttggaagact ttgagttttg ttcttaggaa acccacagta 1560 gctgaatgtg ttaagtgaaa tacttgtact tccctcccct ctgtcaactg ctgtgaatgc 1620 tgtatggtgt gtgttctcct ctgttactga tctggaagtg tgggaacgtg aactgaagct 1680 gatgggctgc gaacatggac tgagcttgtg gtgtgctttg caggagaact tggaagcaga 1740 gttcaccagt gagctcaggt gtctcaaaga agggtggaag ttctcatgtc tgttagctat 1800 tcataagaat gctgtttgct gcagttctgt gtcctgtgct tggatgcttt ttataagagt 1860 tgtcattgtt ggaaattctt aaataaaact gatttaaata atatgtgtct ttgttttgca 1920 gccctgaatg caaagaattc atagcagtta attccccttt ttgacccttt tgagatggaa 1980 ctttcataaa gtttcttggc agtagtttat tttgcttcaa ataaacttat ttgaaaagtt 2040 <210> 5 <211> 414 <212> PRT <213> NP_031401.1 - Wildtype human TDP-43 <400> 5 Met Ser Glu Tyr Ile Arg Val Thr Glu Asp Glu Asn Asp Glu Pro Ile 1 5 10 15 Glu Ile Pro Ser Glu Asp Asp Gly Thr Val Leu Leu Ser Thr Val Thr 20 25 30 Ala Gln Phe Pro Gly Ala Cys Gly Leu Arg Tyr Arg Asn Pro Val Ser 35 40 45 Gln Cys Met Arg Gly Val Arg Leu Val Glu Gly Ile Leu His Ala Pro 50 55 60 Asp Ala Gly Trp Gly Asn Leu Val Tyr Val Val Asn Tyr Pro Lys Asp 65 70 75 80 Asn Lys Arg Lys Met Asp Glu Thr Asp Ala Ser Ser Ala Val Lys Val 85 90 95 Lys Arg Ala Val Gln Lys Thr Ser Asp Leu Ile Val Leu Gly Leu Pro 100 105 110 Trp Lys Thr Thr Glu Gln Asp Leu Lys Glu Tyr Phe Ser Thr Phe Gly 115 120 125 Glu Val Leu Met Val Gln Val Lys Lys Asp Leu Lys Thr Gly His Ser 130 135 140 Lys Gly Phe Gly Phe Val Arg Phe Thr Glu Tyr Glu Thr Gln Val Lys 145 150 155 160 Val Met Ser Gln Arg His Met Ile Asp Gly Arg Trp Cys Asp Cys Lys 165 170 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ccaagatgag 660 cctttgagaa gcagaaaagt gtttgtgggg cgctgtacag aggacatgac tgaggatgag 720 ctgcgggagt tcttctctca gtacggggat gtgatggatg tcttcatccc caagccattc 780 agggcctttg cctttgttac atttgcagat gatcagattg cgcagtctct ttgtggagag 840 gacttgatca ttaaaggaat cagcgttcat atatccaatg ccgaacctaa gcacaatagc 900 aatagacagt tagaaagaag tggaagattt ggtggtaatc caggtggctt tgggaatcag 960 ggtggatttg gtaatagcag agggggtgga gctggtttgg gaaacaatca aggtagtaat 1020 atgggtggtg ggatgaactt tggtgcgttc agcattaatc cagccatgat ggctgccgcc 1080 caggcagcac tacagagcag ttggggtatg atgggcatgt tagccagcca gcagaaccag 1140 tcaggcccat cgggtaataa ccaaaaccaa ggcaacatgc agagggagcc aaaccaggcc 1200 ttcggttctg gaaataactc ttatagtggc tctaattctg gtgcagcaat tggttgggga 1260 tcagcatcca atgcagggtc gggcagtggt tttaatggag gctttggctc aagcatggat 1320 tctaagtctt ctggctgggg aatgtagaca gtggggttgt ggttggttgg tatagaatgg 1380 tgggaattca aatttttcta aactcatggt aagtatattg taaaatacat atgtactaag 1440 aattttcaaa attggtttgt tcagtgtgga gtatattcag cagtattttt gacatttttc 1500 tttagaaaaa ggaagagcta aaggaatttt ataagttttg ttacatgaaa ggttgaaata 1560 ttgagtggtt gaaagtgaac tgctgtttgc ctgattggta aaccaacaca ctacaattga 1620 tatcaaaagg tttctcctgt aatattttat ccctggactt gtcaagtgaa ttctttgcat 1680 gttcaaaacg gaaaccattg attagaacta cattctttac cccttgtttt aatttgaacc 1740 ccaccatatg gatttttttc cttaagaaaa tctcctttta ggagatcatg gtgtcacagt 1800 gtttggttct tttgttttgt tttttaacac ttgtctcccc tcatacacaa aagtacaata 1860 tgaagccttc atttaatctc tgcagttcat ctcatttcaa atgtttatgg aagaagcact 1920 tcattgaaag tagtgctgta aatattctgc cataggaata ctgtctacat gctttctcat 1980 tcaagaattc gtcatcacgc atcacaggcc gcgtctttga cggtgggtgt cccattttta 2040 tccgctactc tttatttcat ggagtcgtat caacgctatg aacgcaaggc tgtgatatgg 2100 aaccagaagg ctgtctgaac ttttgaaacc ttgtgtggga ttgatggtgg tgccgaggca 2160 tgaaaggcta gtatgagcga gaaaaggaga gagcgcgtgc agagacttgg tggtgcataa 2220 tggatatttt ttaacttggc gagatgtgtc tctcaatcct gtggctttgg tgagagagtg 2280 tgcagagagc aatgatagca aataatgtac gaatgttttt tgcattcaaa ggacatccac 2340 atctgttgga agacttttaa gtgagttttt gttcttagat aacccacatt agatgaatgt 2400 gttaagtgaa atgatacttg tactccccct acccctttgt caactgctgt gaatgctgta 2460 tggtgtgtgt tctcttctgt tactgatatg taagtgtggc aatgtgaact gaagctgatg 2520 ggctgagaac atggactgag cttgtggtgt gctttgcagg aggacttgaa gcagagttca 2580 ccagtgagct caggtgtctc aaagaagggt ggaagttcta atgtctgtta gctacccata 2640 agaatgctgt ttgctgcagt tctgtgtcct gtgcttggat gctttttata agagttgtca 2700 ttgttggaaa ttcttaaata aaactgattt aaataatatg tgtctttgtt ttgcagccct 2760 gaatgcaaag aattcatagc agttaattcc ccttttttga cccttttgag atggaacttt 2820 cataaagttt cttggcagta gtttattttg cttcaaataa acttatttga aaagttgtct 2880 caagtcaaat ggattcatca cctgtcatgc attgacacct gatacccaga cttaattggt 2940 atttgttctt gcattggcca aagtgaaaat tttttttttt cttttgaaat ctagttttga 3000 ataagtctgg gtgaccgcac ctaaaatggt aagcagtacc ctccggcttt ttcttagtgc 3060 ctctgtgcat ttgggtgatg ttctatttac atggcctgtg taaatctcca ttgggaagtc 3120 atgccttcta aaaagattct tatttggggg agtgggcaaa atgttgatta ttttctaatg 3180 ctttgtagca aagcatatca attgaaaagg gaatatcagc accttcctag tttgggattt 3240 gaaaagtgga attaattgca gtagggataa agtagaagaa accacaaatt atcttgtgcc 3300 tgaaatccat taagaggcct gatagcttta agaattaggg tgggttgtct gtctggaagt 3360 gttaagtgga atgggctttg tcctccagga ggtgggggaa tgtggtaaca ttgaatacag 3420 ttgaataaaa tcgcttacaa aactcacact ctcacaatgc attgttaagt atgtaaaagc 3480 aataacattg attctctgtt gtactttttt gtaactaatt ctgtgagagt tgagctcatt 3540 ttctagttgg aagaatgtga tatttgttgt gttggtagtt tacctaatgc ccttacctaa 3600 ttagattatg ataaataggt ttgtcatttt gcaagttaca taaacattta tcaatgaagt 3660 catcctttag acttgtaatc gccacattgt ttcattattc agtttcctct gtaaagggat 3720 cttgagttgt tttaattttt tttttctgca tctgaatctg catgatttcc aaaccctgta 3780 ccatctgaat tttgcatttt agcacttgca ctattactca gcagcagtaa catggtaaca 3840 cttaaaatgg tactcgggga cctccaaaga ctaaactgac aagccttcaa ggagcccagg 3900 ggtaagttaa cttgtcaacg gcatggttta atcccttctt tacacttgtg taaatttcag 3960 ttactggtca tagaaggctt tcaatgttga gtggcctttt attaacatgt ttatggtact 4020 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21 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TDP-43 Ex3-Ex4 Probe <400> 13 aagcccagac gagcctttga gaag 24 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Crem Ex1-Ex2 assay Forward Primer <400> 14 tggctgtaac tggagatgaa ac 22 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Crem Ex1-Ex2 assay Reverse Primer <400> 15 ccttgtggca aagcagtagt a 21 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Crem Ex1-Ex2 Probe <400> 16 acatgccaac ttaccagatc cgagc 25 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Crem Ex1-Cryptic assay Forward Primer <400> 17 tggctgtaac tggagatgaa ac 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Crem Ex1-Cryptic assay Reverse Primer <400> 18 ggaagagaag caactcctca aa 22 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Crem Ex1-Cryptic Probe <400> 19 acacacacac acacacacac acac 24 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Crem Cryptic-Ex2 assay Forward Primer <400> 20 catgggttcc aaaggatcaa ac 22 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Crem Cryptic-Ex2 assay Reverse Primer <400> 21 tgtggcaaag cagtagtagg 20 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Crem Cryptic-Ex2 Probe <400> 22 acatgccaac ttaccagatc cgagc 25 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fyxd2Ex3-Ex4 assay Forward Primer <400> 23 actatgaaac cgtccgcaaa 20 <210> 24 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fyxed Ex3-Ex4 assay Reverse Primer <400> 24 cccacagcgg aaccttt 17 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fyxed Ex3-Ex4 Probe <400> 25 cgtgggcctc ctcatcattc tcag 24 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fyxed Ex3-Cryptic assay Forward Primer <400> 26 actatgaaac cgtccgcaaa 20 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fyxed Ex3-Cryptic assay Reverse Primer <400> 27 cctctttgct tcaccaaatg tc 22 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fyxed Ex3-Cryptic Probe <400> 28 cgtgggcctc ctcatcattc tcag 24 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fyxed Cryptic-Ex4 assay Forward Primer <400> 29 ttctggaatt cccacacact c 21 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fyxed Cryptic-Ex4assay Reverse Primer <400> 30 cccacagcgg aaccttt 17 <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fyxed Cryptic-Ex4 Probe <400> 31 ctctgaatga aagctgggct cttgga 26 <210> 32 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Crlf1 Ex1-Ex2 assay Forward Primer <400> 32 ctgtcctcgc tgtggtc 17 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Crlf1 Ex1-Ex2 assay Reverse Primer <400> 33 ggaggagccg atgagaag 18 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Crlf1 Ex1-Ex2 Probe <400> 34 tctgttgctc tgtgtcctcg gg 22 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Crlf1 Ex1-Cryptic assay Forward Primer <400> 35 gtcgcctctg ttgctctg 18 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Crlf1 Ex1-Cryptic assay Reverse Primer <400> 36 tccatccatt catccatcca tc 22 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Crlf1 Ex1-Cryptic Probe <400> 37 acctcagttc ctggcatatt g 21 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Crlf1 Cryptic-Ex2 assay Forward Primer <400> 38 gagacctcag agaactgaat gg 22 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Crlf1 Cryptic-Ex2 assay Reverse Primer <400> 39 ccaggtgtgt ctccatgtat ag 22 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Crlf1 Cryptic-Ex2 Probe <400> 40 ttctcatcgg ctcctccctg caag 24 <210> 41 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TDP-43 Ex6-Ex7 assay Forward Primer <400> 41 gctgaaccta agcataatag caatag 26 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TDP-43 Ex6-Ex7 assay Reverse Primer <400> 42 ggatgagaaa gcatgtagac ag 22 <210> 43 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TDP-43 Ex6-Ex7 Probe <400> 43 tggaagaagc acttcattga aagtagtgc 29

Claims (88)

  1. 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함하는 비-인간 동물 세포로서,
    상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 야생형 TDP-43 폴리펩타이드에서 발견된 핵 국재화 신호 (NLS), RNA 인식 모티프 1 (RRM1), RNA 인식 모티프 2 (RRM2), 추정적 핵 유출 신호 (E), 프리온형 도메인 (PLD), 또는 이들의 조합을 포함하는 기능적인 구조적 도메인이 결여되고,
    상기 비-인간 동물 세포가 상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키고,
    임의로 상기 야생형 TDP-43 폴리펩타이드가 서열번호:1, 서열번호:3, 또는 서열번호:5로서 제시된 서열을 포함하는, 비-인간 동물 세포.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 비-인간 동물 세포가 배아 줄기 (ES) 세포, 배상체, 또는 배아 줄기 세포 유래된 운동 뉴런 (ESMN)인, 비-인간 동물 세포.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 돌연변이된 TARDBP 유전자가 상기 비-인간 동물의 돌연변이된 TARDBP 유전자인, 비-인간 동물 세포.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 돌연변이된 TARDBP 유전자가 돌연변이된 인간 TARDBP 유전자인, 비-인간 동물 세포.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 하기 중 하나 이상으로 인해 기능적인 구조적 도메인이 결여되는, 비-인간 동물 세포:
    (a) 상기 NLS에서 아미노산의 점 돌연변이,
    (b) 상기 RRM1에서 아미노산의 점 돌연변이,
    (c) 상기 RRM2에서 아미노산의 점 돌연변이,
    (d) 상기 핵 유출 신호의 적어도 한 부문의 결실, 및
    (e) 상기 프리온형 도메인의 적어도 한 부문의 결실.
  6. 제 5 항에 있어서,
    (a) 상기 NLS에서 아미노산의 상기 점 돌연변이가 K82A K83A, R84A, K95A, K97A, K98A, 또는 이들의 조합을 포함하고,
    (b) RRM1에서 상기 점 돌연변이가 F147L 및/또는 F149L을 포함하고,
    (c) RRM2에서 상기 점 돌연변이가 F194L 및/또는 F229L을 포함하고,
    (d) 상기 핵 유출 신호 결실의 적어도 한 부문의 결실이 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 위치 239 및 250에서 그리고 그 사이 상기 아미노산의 결실을 포함하고,
    (e) 상기 프리온형 도메인의 적어도 한 부문의 상기 결실이 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 위치 274 및 414에서 그리고 그 사이 상기 아미노산의 결실을 포함하는, 비-인간 동물 세포.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 K82A K83A, R84A, K95A, K97A, 및 K98A를 포함하는, 비-인간 동물 세포.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 야생형 폴리펩타이드의 위치 274 내지 414에서 상기 아미노산을 포함하는 그리고 그 사이 상기 프리온형 도메인이 결여되는, 비-인간 동물 세포.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 F147L 및 F149L을 포함하는, 비-인간 동물 세포.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 F194L 및 F229L을 포함하는, 비-인간 동물 세포.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 위치 239 및 250에서 상기 아미노산을 포함하는 그리고 그 사이 상기 핵 유출 신호가 결여되는, 비-인간 동물 세포.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 상기 돌연변이된 TARDBP 유전자가 내인성 TARDBP 유전자좌에 내인성 TARDBP 유전자를 대체하는, 비-인간 동물 세포.
  13. 제 13 항에 있어서, 상기 비-인간 동물 세포가 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 상기 돌연변이된 TARDBP 유전자에 대하여 이형접합성인, 비-인간 동물 세포.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 비-인간 동물 세포가 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 상기 돌연변이된 TARDBP 유전자에 대하여 동형접합성인, 비-인간 동물 세포.
  15. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물 세포가 녹아웃 돌연변이를 포함하는 TARDBP 유전자를 추가로 포함하는, 비-인간 동물 세포.
  16. 제 16 항에 있어서, 상기 녹아웃 돌연변이가 조건부 녹아웃 돌연변이를 포함하는, 비-인간 동물 세포.
  17. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 상기 녹아웃 돌연변이가 부위-특이적 재조합 인식 서열을 포함하는, 비-인간 동물 세포.
  18. 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 녹아웃 돌연변이가 loxp 서열을 포함하는, 비-인간 동물 세포.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 loxp 서열이 녹아웃 돌연변이를 포함하는 TARDBP 유전자의 엑손 3을 측접하는, 비-인간 동물 세포.
  20. 제 16 항에 있어서, 상기 녹아웃 돌연변이가 TDP-43 펩타이드의 상기 전체 코딩 서열의 결실을 포함하는, 비-인간 동물 세포.
  21. 제 15 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물 세포가 상기 변형된 TARDBP 유전자좌에 대하여 이형접합성이고
    (i) 하나의 염색체에서 내인성 TARDBP 유전자좌에, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 상기 돌연변이된 TARDBP 유전자로 내인성 TARDBP 유전자의 대체, 및
    (ii) 다른 상동 염색체에서 상기 내인성 TARDBP 유전자좌에, 상기 녹아웃 돌연변이를 포함하는 상기 TARDBP 유전자 또는 야생형 TARDBP 유전자 중 어느 하나를 포함하는, 비-인간 동물 세포.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물 세포가 야생형 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키지 않는, 비-인간 동물 세포.
  23. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물 세포가 야생형 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는, 비-인간 동물 세포.
  24. 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 대조군 세포에서 야생형 TARDBP 유전자의 mRNA 전사 수준에 비교가능한 상기 돌연변이된 TARDBP 유전자의 mRNA 전사 수준,
    (ii) 대조군 세포에서 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 수준에 비교하여 상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 증가된 수준,
    (iii) 예를 들면, 운동 뉴런의, 핵에서 보다 세포질에서 발견된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 더 높은 농도,
    (iv) 야생형 TDP-43 폴리펩타이드에 비교하여 증가된 불용성을 가진 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드
    (v) 상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 포함하는 세포질성 집합체,
    (vi) 크립틱 엑손의 증가된 스플라이싱, 및/또는
    (vii) 상기 택일적으로 스플라이싱된 TDP-43 형태의 감소된 수준을 포함하는, 비-인간 동물 세포.
  25. (i) 하나의 염색체에서 내인성 TARDBP 유전자좌에, 상기 TARDBP 유전자의 조건부 녹아웃 돌연변이, 및
    (ii) 다른 상동 염색체에서 상기 내인성 TARDBP 유전자좌에, 상기 전체 TARDBP 코딩 서열의 결실을 포함하는, 비-인간 동물 세포.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 배아 줄기 (ES) 세포, 원시 외배엽 세포, 또는 운동 뉴런에서 유래된 운동 뉴런 (ESMN)인, 비-인간 동물 세포.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물 세포가 설치류 세포인, 비-인간 동물 세포.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물 세포가 랫트 세포인, 비-인간 동물 세포.
  29. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물 세포가 마우스 세포인, 비-인간 동물 세포.
  30. 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물 세포가 시험관내 배양되는, 비-인간 동물 세포.
  31. 제 1 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항의 비-인간 동물 세포를 포함하는, 비-인간 동물 조직.
  32. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항의 비-인간 동물 세포 또는 조직을 포함하는, 조성물.
  33. 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함하기 위해 비-인간 동물 또는 비-인간 동물 세포의 게놈을 변형시키는 단계를 포함하는 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 비-인간 동물 또는 비-인간 동물 세포의 제조 방법으로서, 상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 야생형 TDP-43에 비교하여 기능적인 구조적 도메인이 결여되고, 임의로 상기 야생형 TDP-43 폴리펩타이드가 서열번호:1, 서열번호:3, 또는 서열번호:5로서 제시된 서열을 포함하는, 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 변형시키는 단계가 상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 상기 돌연변이된 TARDBP 유전자로 내인성 TARDBP 유전자를 대체하는 단계를 포함하는, 방법.
  35. 제 33 항 또는 제 34 항에 있어서, 변형시키는 단계가 녹아웃 돌연변이를 포함하는 TARDBP 유전자로 내인성 TARDBP 유전자를 대체하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  36. 제 35 항에 있어서, 상기 녹아웃 돌연변이가 조건부 녹아웃 돌연변이를 포함하는, 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 녹아웃 돌연변이를 포함하는 상기 TARDBP 유전자의 발현을 제거하는 조건에서 상기 세포를 배양시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  38. 질환의 치료를 위한 치료적 후보를 식별하는 방법으로서,
    (a) 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항의 비-인간 동물 세포 또는 조직 혹은 제 32 항의 조성물을 상기 후보 제제와 접촉시키는 단계,
    (b) 상기 비-인간 세포 또는 조직의 상기 표현형 및/또는 TDP-43 생물학적 활성을 평가하는 단계, 및
    (c) 야생형 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는 대조군 세포 또는 조직의 것에 비교가능한 표현형 및/또는 TDP-43 생물학적 활성을 상기 비-인간 세포 또는 조직에 회복시키는 후보 제제를 식별하는 단계를 포함하는, 방법.
  39. TDP-43 구조적 도메인의 생물학적 기능을 평가하는 방법으로서,
    (a) 핵 국재화 신호 (NLS), 제1 RNA 인식 모티프 (RRM1), 제1 RNA 인식 모티프 (RRM2), 추정적 핵 유출 신호 (E), 프리온형 도메인 (PLD), 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 기능적인 구조적 도메인이 결여되는 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함하기 위해 배아 줄기 (ES) 세포를 변형시키는 단계,
    (b) 임의로 시험관내 상기 변형된 ES 세포를 분화시키는 단계 및/또는 유전적으로 변형된 비-인간 동물을 상기 변형된 ES 세포로부터 수득하는 단계, 및
    (c) 상기 유전적으로 변형된 ES 세포, 그로부터 유래된 원시 외배엽, 그로부터 유래된 운동 뉴런, 또는 그로부터 유래된 비-인간 동물의 상기 표현형 및/또는 TDP-43 생물학적 활성을 평가하는 단계를 포함하는, 방법.
  40. 제 38 항 또는 제 39 항에 있어서, 상기 표현형이 세포 배양, 형광 동소 하이브리드화, 웨스턴 블랏 분석, 또는 이들의 조합에 의해 평가되는, 방법.
  41. 제 38 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표현형이 상기 유전적으로 변형된 ES 세포, 그로부터 유래된 원시 외배엽, 그로부터 유래된 운동 뉴런, 또는 그로부터 유래된 비-인간 동물의 생존력을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
  42. 제 38 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표현형을 상기 평가하는 단계가 상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 세포성 자리를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  43. 제 38 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 상기 생물학적 활성을 평가하는 단계가 TDP-43에 의해 조절된 크립틱 엑손을 포함하는 유전자의 상기 스플라이스 산물을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
  44. 제 43 항에 있어서, TDP-43에 의해 조절된 크립틱 엑손을 포함하는 상기 유전자가 Crem, Fyxd2, Clf1을 포함하는, 방법.
  45. 제 38 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 상기 생물학적 활성을 평가하는 단계가 택일적으로 스플라이싱된 TDP-43의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
  46. TDP-43 폴리펩타이드의 PLD를 인코딩하고/거나 엑손 6의 다운스트림 및 엑손 7의 업스트림 비번역된 서열을 포함하는 TDP-43 mRNA 서열을 표적하는 갭머 모티프를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
  47. TDP-43 폴리펩타이드의 PLD를 인코딩하고/거나 엑손 6의 다운스트림 및 엑손 7의 업스트림 비번역된 서열을 포함하는 TDP-43 mRNA 서열을 표적하는 서열을 포함하는, siRNA.
  48. Cas9 단백질 및 적어도 하나의 gRNA를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템으로서, 상기 gRNA가 PLD가 결여된 절두형 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 택일적 mRNA를 초래하는 택일적 스플라이스 부위에 대하여 인코딩하는 서열에서 또는 그 근처에서 서열을 인식하는, 시스템.
  49. 제 2 항의 배아 줄기 세포를 포함하는, 비-인간 동물.
  50. 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 돌연변이된 TARDBP 유전자를 포함하는 비-인간 동물로서,
    상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 야생형 TDP-43 폴리펩타이드에서 발견된 상기 핵 국재화 신호 (NLS), 상기 RNA 인식 모티프 1 (RRM1), 상기 RNA 인식 모티프 2 (RRM2), 상기 추정적 핵 유출 신호 (E), 상기 프리온형 도메인 (PLD), 또는 이들의 조합을 포함하는 기능적인 구조적 도메인이 결여되고,
    임의로 상기 야생형 TDP-43 폴리펩타이드가 서열번호:1, 서열번호:3, 또는 서열번호:5로서 제시된 서열을 포함하는, 비-인간 동물.
  51. 제 50 항에 있어서, 상기 돌연변이된 TARDBP 유전자가 상기 비-인간 동물의 돌연변이된 TARDBP 유전자인, 비-인간 동물.
  52. 제 50 항 또는 제 51 항에 있어서, 상기 돌연변이된 TARDBP 유전자가 돌연변이된 인간 TARDBP 유전자인, 비-인간 동물.
  53. 제 50 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 하기 중 하나 이상으로 인해 기능적인 구조적 도메인이 결여되는, 비-인간 동물:
    (a) 상기 NLS에서 아미노산의 점 돌연변이,
    (b) 상기 RRM1에서 아미노산의 점 돌연변이,
    (c) 상기 RRM2에서 아미노산의 점 돌연변이,
    (d) 상기 핵 유출 신호의 적어도 한 부문의 결실, 및
    (e) 상기 프리온형 도메인의 적어도 한 부문의 결실.
  54. 제 53 항에 있어서,
    (a) 상기 NLS에서 아미노산의 상기 점 돌연변이가 K82A K83A, R84A, K95A, K97A, K98A, 또는 이들의 조합을 포함하고,
    (b) RRM1에서 상기 점 돌연변이가 F147L 및/또는 F149L을 포함하고,
    (c) RRM2에서 상기 점 돌연변이가 F194L 및/또는 F229L을 포함하고,
    (d) 상기 핵 유출 신호 결실의 적어도 한 부문의 상기 결실이 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 위치 239 및 250에서 그리고 그 사이 상기 아미노산의 결실을 포함하고,
    (e) 상기 프리온형 도메인의 적어도 한 부문의 상기 결실이 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 위치 274 및 414에서 그리고 그 사이 상기 아미노산의 결실을 포함하는, 비-인간 동물.
  55. 제 50 항 내지 제 54 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 K82A K83A, R84A, K95A, K97A, 및 K98A를 포함하는, 비-인간 동물.
  56. 제 50 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 야생형 폴리펩타이드의 위치 274 내지 414에서 상기 아미노산을 포함하는 그리고 그 사이 상기 프리온형 도메인이 결여되는, 비-인간 동물.
  57. 제 50 항 내지 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 F147L 및 F149L을 포함하는, 비-인간 동물.
  58. 제 50 항 내지 제 57 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 F194L 및 F229L을 포함하는, 비-인간 동물.
  59. 제 50 항 내지 제 58 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 위치 239 및 250에서 상기 아미노산을 포함하는 그리고 그 사이 상기 핵 유출 신호가 결여되는, 비-인간 동물.
  60. 제 50 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 상기 돌연변이된 TARDBP 유전자가 내인성 TARDBP 유전자좌에 내인성 TARDBP 유전자를 대체하는, 비-인간 동물.
  61. 제 60 항에 있어서, 상기 비-인간 동물이 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 상기 돌연변이된 TARDBP 유전자에 대하여 이형접합성인, 비-인간 동물.
  62. 제 50 항 내지 제 61 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물이 녹아웃 돌연변이를 포함하는 TARDBP 유전자를 추가로 포함하는, 비-인간 동물.
  63. 제 62 항에 있어서, 상기 녹아웃 돌연변이가 조건부 녹아웃 돌연변이를 포함하는, 비-인간 동물.
  64. 제 62 항 또는 제 63 항에 있어서, 상기 녹아웃 돌연변이가 부위-특이적 재조합 인식 서열을 포함하는, 비-인간 동물.
  65. 제 62 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 녹아웃 돌연변이가 loxp 서열을 포함하는, 비-인간 동물.
  66. 제 65 항에 있어서, 상기 loxp 서열이 녹아웃 돌연변이를 포함하는 상기 TARDBP 유전자의 엑손 3을 측접하는, 비-인간 동물.
  67. 제 62 항에 있어서, 상기 녹아웃 돌연변이가 TDP-43 펩타이드의 상기 전체 코딩 서열의 결실을 포함하는, 비-인간 동물.
  68. 제 62 항 내지 제 67 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물이 상기 변형된 TARDBP 유전자좌에 대하여 이형접합성이고
    (i) 하나의 염색체에서 내인성 TARDBP 유전자좌에, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 상기 돌연변이된 TARDBP 유전자로 내인성 TARDBP 유전자의 대체, 및
    (ii) 다른 상동 염색체에서 상기 내인성 TARDBP 유전자좌에, 상기 녹아웃 돌연변이를 포함하는 TARDBP 유전자 또는 야생형 TARDBP 유전자 어느 한쪽을 포함하는, 비-인간 동물.
  69. 제 49 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물이 야생형 TDP-43 폴리펩타이드를 발현시키는, 비-인간 동물.
  70. 제 49 항 내지 제 69 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 대조군 동물에서 야생형 TARDBP 유전자의 mRNA 전사 수준에 비교가능한 상기 돌연변이된 TARDBP 유전자의 mRNA 전사 수준,
    (ii) 대조군 동물에서 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 수준에 비교하여 상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 증가된 수준,
    (iii) 예를 들면, 운동 뉴런의, 핵에서 보다 세포질에서 발견된 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드의 더 높은 농도,
    (iv) 야생형 TDP-43 폴리펩타이드에 비교하여 증가된 불용성을 가진 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드
    (v) 상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 포함하는 세포질성 집합체,
    (vi) 크립틱 엑손의 증가된 스플라이싱,
    (vii) 상기 택일적으로 스플라이싱된 TDP-43 형태의 감소된 수준,
    (viii) 주로 빠른 수축 근육, 예컨대 전경골근으로 구성된 근육 조직의 신경차단 및/또는
    (ix) 주로 저 수축 근육, 예컨대 늑간근으로 구성된 근육 조직의 정상 신경지배를 포함하는, 비-인간 동물.
  71. i) 하나의 염색체에서 내인성 TARDBP 유전자좌에, 상기 TARDBP 유전자의 조건부 녹아웃 돌연변이, 및 (ii) 다른 상동 염색체에서 상기 내인성 TARDBP 유전자좌에 상기 전체 TARDBP 코딩 서열의 결실을 포함하는, 비-인간 동물.
  72. 제 49 항 내지 제 71 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물이 설치류인, 비-인간 동물.
  73. 제 49 항 내지 제 72 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물 랫트인, 비-인간 동물.
  74. 제 49 항 내지 제 72 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-인간 동물이 마우스인, 비-인간 동물.
  75. 질환의 치료를 위한 치료적 후보를 식별하는 방법으로서,
    (a) 제 49 항 내지 제 74 항 중 어느 한 항의 비-인간 동물을 후보 제제와 접촉시키는 단계,
    (b) 상기 비-인간 동물의 상기 표현형 및/또는 TDP-43 생물학적 활성을 평가하는 단계, 및
    (c) 표현형 및/또는 TDP-43 생물학적 활성을 상기 비-인간에 회복시키는 상기 후보 제제를 식별하는 단계를 포함하는, 방법.
  76. 하기 중 하나 이상을 포함하기 위해 변형된 서열번호:1, 3, 또는 5로서 제시된 서열을 포함하는, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드:
    (a) 상기 NLS에서 아미노산의 점 돌연변이,
    (b) 상기 RRM1에서 아미노산의 점 돌연변이,
    (c) 상기 RRM2에서 아미노산의 점 돌연변이,
    (d) 상기 핵 유출 신호의 적어도 한 부문의 결실 , 및
    (e) 상기 프리온형 도메인의 적어도 한 부문의 결실.
  77. 제 76 항에 있어서,
    (a) 상기 NLS에서 아미노산의 상기 점 돌연변이가 K82A K83A, R84A, K95A, K97A, K98A, 또는 이들의 조합을 포함하고,
    (b) RRM1에서 상기 점 돌연변이가 F147L 및/또는 F149L을 포함하고,
    (c) RRM2에서 상기 점 돌연변이가 F194L 및/또는 F229L을 포함하고,
    (d) 상기 핵 유출 신호 결실의 적어도 한 부문의 결실이 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 위치 239 및 250에서 그리고 그 사이 상기 아미노산의 결실을 포함하고,
    (e) 상기 프리온형 도메인의 적어도 한 부문의 상기 결실이 야생형 TDP-43 폴리펩타이드의 위치 274 및 414에서 그리고 그 사이 상기 아미노산의 결실을 포함하는, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드.
  78. 제 76 항 또는 제 77 항에 있어서, K82A 돌연변이, K83A 돌연변이, R84A 돌연변이, K95A 돌연변이, K97A 돌연변이, 및/또는 K98A 돌연변이를 포함하는, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드.
  79. 제 76 항 내지 제 78 항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 폴리펩타이드의 위치 274 내지 414에서 상기 아미노산을 포함하는 그리고 그 사이 상기 프리온형 도메인의 결실을 포함하는, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드.
  80. 제 76 항 내지 제 79 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 F147L 돌연변이 및/또는 F149L 돌연변이를 포함하는, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드.
  81. 제 76 항 내지 제 80 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 F194L 돌연변이 및/또는 F229L 돌연변이를 포함하는, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드.
  82. 제 76 항 내지 제 81 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드가 위치 239 및 250에서 상기 아미노산을 포함하는 그리고 그 사이 상기 핵 유출 신호가 결여되는, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드.
  83. 제 76 항 내지 제 82 항 중 어느 한 항의 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 핵산.
  84. 제 83 항의 핵산으로서, 5'부터 3'까지: 5' 상동성 아암, 상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 상기 핵산 서열, 및 3' 상동성 아암을 추가로 포함하며, 상기 핵산이 설치류 세포에서 상동 재조합을 겪는, 핵산.
  85. 제 84 항에 있어서, 상기 5' 및 3' 상동성 아암은, 상기 핵산이 내인성 랫트 TARDBP 유전자좌에 상동 재조합을 겪고 상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 상기 핵산 서열이 상기 내인성 TARDBP 코딩 서열을 대체하도록 랫트 서열에 상동인, 핵산.
  86. 제 84 항에 있어서, 상기 5' 및 3' 상동성 아암은, 상기 핵산이 내인성 마우스 TARDBP 유전자좌에 상동 재조합을 겪고 상기 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 상기 핵산 서열이 상기 내인성 TARDBP 코딩 서열을 대체하도록 마우스 서열에 상동인, 핵산.
  87. 세포에서 PLD가 결여된 절두형 TDP-43을 인코딩하는 택일적 TDP-43 mRNA를 절약하면서 PLD를 포함하는 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 TDP-43 mRNA의 선택적 감소 방법으로서, 세포에
    (i) TDP-43 폴리펩타이드의 PLD를 인코딩하고/거나 엑손 6의 다운스트림 및 엑손 7의 업스트림 비번역된 서열을 포함하는 TDP-43 mRNA 서열을 표적하는 갭머 모티프를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드,
    (ii) TDP-43 폴리펩타이드의 PLD를 인코딩하고/거나 엑손 6의 다운스트림 및 엑손 7의 업스트림 비번역된 서열을 포함하는 TDP-43 mRNA 서열을 표적하는 서열을 포함하는 siRNA, 및/또는
    (iii) Cas9 단백질 및 적어도 하나의 gRNA를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템으로, 상기 gRNA가 PLD가 결여된 절두형 TDP-43 폴리펩타이드를 인코딩하는 택일적 mRNA를 초래하는 택일적 스플라이스 부위에 대하여 인코딩하는 서열에서 또는 그 근처에서 서열을 인식하는, 시스템을 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
  88. 임의의 구현예 또는 임의의 적용가능한 청구항 카테고리, 예를 들어, 특허 출원에서 초기에 기재된, 개시된 또는 예시된 주제에 의해 포괄된 산물, 공정 또는 용도를 특징으로 하는,
    돌연변이체 TDP-43을 발현시키는 비-인간 동물, 비-인간 동물의 제조 방법, 비-인간 동물의 제조 방법에서 사용을 위한 핵산, 비-인간 동물의 제조 방법에서 사용을 위한 세포, 그렇게 제조된 상기 비-인간 동물의 용도, 그리고 상기 비-인간 동물에서 유래된 세포 및/또는 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드, 돌연변이체 TDP-43 폴리펩타이드들 및 돌연변이체 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 발현시키는 세포, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 또는 siRNA, CRISPR/Cas 시스템.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114903010B (zh) * 2022-05-19 2024-06-07 暨南大学 神经退行性疾病模型的构建方法
WO2023235677A1 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Animal model of tdp-43 proteinopathy
WO2024073604A2 (en) * 2022-09-28 2024-04-04 Atalanta Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treatment of neurodegenerative diseases
CN116144658B (zh) * 2022-12-19 2023-08-08 神济昌华(北京)生物科技有限公司 用于构建神经退行性动物模型的sgRNA及其应用

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU8587598A (en) 1997-07-26 1999-02-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Trans-species nuclear transfer
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
AUPR451401A0 (en) 2001-04-20 2001-05-24 Monash University A method of nuclear transfer
US7612250B2 (en) 2002-07-29 2009-11-03 Trustees Of Tufts College Nuclear transfer embryo formation method
PT1802193E (pt) 2004-10-19 2014-06-23 Regeneron Pharma Método para gerar um murganho homozigótico para uma modificação genética
CN101117633B (zh) 2006-08-03 2011-07-20 上海交通大学附属儿童医院 一种细胞核移植方法
US8476485B2 (en) * 2010-06-24 2013-07-02 Academia Sinica Non-human animal model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS) with loss-of-TDP-43 function
PT2800811T (pt) 2012-05-25 2017-08-17 Univ California Métodos e composições para modificação de adn alvo dirigida por arn e para modulação dirigida por arn de transcrição
WO2013180214A1 (ja) * 2012-05-31 2013-12-05 学校法人慶應義塾 筋萎縮性側索硬化症および／または前頭側頭葉変性症のモデルマウス
RU2690352C2 (ru) 2013-02-20 2019-05-31 Регенерон Фармасютикалс, Инк. Генетическая модификация крыс
DK2986729T3 (en) 2013-04-16 2018-10-29 Regeneron Pharma TARGETED MODIFICATION OF ROOT THROUGH
EP4223285A3 (en) 2014-07-16 2023-11-22 Novartis AG Method of encapsulating a nucleic acid in a lipid nanoparticle host
WO2016205615A1 (en) * 2015-06-17 2016-12-22 The Johns Hopkins University Tdp-43 in degenerative disease
US11028390B2 (en) * 2017-07-10 2021-06-08 Osaka University Antisense oligonucleotide controlling expression amount of TDP-43 and use thereof

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