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ES2330083T3 - Acidos nucleicos y proteinas de estreptococos de los grupos a y b. - Google Patents

Acidos nucleicos y proteinas de estreptococos de los grupos a y b. Download PDF

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ES2330083T3
ES2330083T3 ES01982584T ES01982584T ES2330083T3 ES 2330083 T3 ES2330083 T3 ES 2330083T3 ES 01982584 T ES01982584 T ES 01982584T ES 01982584 T ES01982584 T ES 01982584T ES 2330083 T3 ES2330083 T3 ES 2330083T3
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ES
Spain
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sequence
protein
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antigen
nucleic acid
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Application number
ES01982584T
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English (en)
Inventor
John Telford
Vega Masignani
Immaculada Margarit Y Ros
Guido Grandi
Claire Fraser
Herve Tettelin
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NOVARTIS VACCINES and DIAGNOSTIC
GSK Vaccines SRL
J Craig Venter Institute Inc
Original Assignee
NOVARTIS VACCINES and DIAGNOSTIC
Novartis Vaccines and Diagnostics SRL
J Craig Venter Institute Inc
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Abstract

Una proteína que induce una inmunidad protectora contra Streptococcus agalactiae que comprende: (a) una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID 2 y 4; (b) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 80% o superior con la SEC ID 2 ó 4; o (c) un fragmento de n o más aminoácidos consecutivos a partir de la secuencia de aminoácidos SEC ID 2 o SEC ID 4 donde n es 10, con la condición de que la proteína de (b) o (c) no sea: (i) los 246 aminoácidos C-terminales de la SEC ID 2; o (ii) un 245-mero que son los aminoácidos 336 a 580 de la SEC ID

Description

Ácidos nucleicos y proteínas de estreptococos de los grupos A y B.
Campo técnico
La invención se refiere a ácidos nucleicos y proteínas de la Bacteria Streptococcus agalactiae (GBS).
Antecedentes en la técnica
Las bacterias Gram-positivas Streptococcus agalactiae (o "estreptococos del grupo B", abreviado como "GBS") que una vez se pensó que únicamente infectaban a las vacas, actualmente se sabe que causan enfermedades graves, bacteriemia y meningitis, en individuos inmunocomprometidos y en recién nacidos. Existen dos tipos de infección en recién nacidos. La primera (inicio precoz, habitualmente en los cinco días del nacimiento) se manifiesta por bacteriemia y neumonía. Se contrae verticalmente cuando un bebé atraviesa el canal del parto. GBS coloniza la vagina de aproximadamente el 25% de las mujeres jóvenes, y aproximadamente el 1% de los niños nacidos mediante parto vaginal de madres colonizadas se infectarán. La mortalidad se encuentra entre el 50-70%. La segunda es una meningitis que se produce de 10 a 60 días después del nacimiento. Si las mujeres embarazadas están vacunadas con cápsulas del tipo III de manera que los recién nacidos se inmunicen de modo pasivo, la incidencia de la meningitis de inicio tardío se reduce pero no se elimina totalmente.
La "B" en "GBS" se refiere a la clasificación de Lancefield, que está basada en la antigenicidad de un hidrato de carbono que es soluble en ácido diluido y denominado hidrato de carbono C. Lancefield identificó 13 tipos de hidratos de carbono C, denominados de la A a la O, que podían diferenciarse serológicamente. Los organismos que más comúnmente infectan a los seres humanos se encuentran en los grupos A, B, D y G. Dentro del grupo B, las cepas pueden dividirse en 8 serotipos (Ia, Ib, Ia/c, II, III, IV, V y VI) en base a la estructura de su cápsula poli-
sacárida.
Aunque S. agalactiae se inhibe por antibióticos, no se destruye por penicilina tan fácilmente como Streptococcus pyogenes (GAS). Se prefiere por tanto la vacunación profiláctica.
Las vacunas actuales para GBS están basadas en antígenos de polisacáridos, aunque éstas adolecen de escasa inmunogenicidad.
Se han usado también enfoques anti-idiotípicos (por ejemplo en el documento WO99/54457). No obstante, sigue siendo necesario, vacunas para adultos eficaces contra la infección de S. agalactiae.
Es un objeto de la invención proporcionar proteínas que puedan usarse en el desarrollo de tales vacunas. Las proteínas pueden usarse también para fines diagnósticos y como dianas para antibióticos.
Descripción de la invención
La invención proporciona proteínas, anticuerpos, moléculas de ácido nucleico y composiciones, como se describe en las reivindicaciones. La invención proporciona adicionalmente kits, procedimientos y usos médicos, como se describe en las reivindicaciones.
La invención proporciona proteínas que comprenden las secuencias de aminoácidos de S. agalactiae desveladas en el ejemplo. Estas secuencias de aminoácidos son SEC ID Nº 2 y 4.
También proporciona proteínas que comprenden secuencias de aminoácidos que tienen identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos de S. agalactiae desveladas en el ejemplo. El grado de identidad de secuencia es preferiblemente superior al 80%, 90%, 95%, 99% o más. Estas proteínas incluyen homólogos, ortólogos, variantes alélicas y mutantes funcionales. Típicamente, una identidad del 50% o más entre dos proteínas se considera que es un indicativo de equivalencia funcional. La identidad entre proteínas se determina preferiblemente por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman como se implementa en el programa MPSRCH (Oxford molecular), usando una búsqueda de hueco afín con los parámetros sanción de apertura de hueco = 12 y sanción de prolongación de hueco = 1.
Las proteínas de la invención son GBS80.
La invención proporciona adicionalmente proteínas que comprenden fragmentos de las secuencias de aminoácidos de S. agalactiae desveladas en el ejemplo. Los fragmentos deben comprender al menos n aminoácidos consecutivos de las secuencias y dependiendo de la secuencia en particular, n es 10 o más (por ejemplo 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más). Preferiblemente los fragmentos comprenden uno o más epítopes de la secuencia. Otros fragmentos preferidos son (a) los péptidos de señal N-terminal de las proteínas desveladas en el ejemplo, (b) las proteínas desveladas en el ejemplo, pero sin sus péptidos de señal N-terminal y (c) las proteínas desveladas en el ejemplo, pero sin su resto aminoacídico N-terminal.
Una proteína que tiene identidad de secuencia para GBS80 o es un fragmento de GBS80 preferiblemente no es: (i) los 246 aminoácidos C-terminal de la SEC ID Nº: 2; o (ii) un polímero de 245 unidades que son los aminoácidos 336 a 580 de la SEC ID Nº: 2, desvelados en el documento WO02/12294.
Las proteínas de la invención pueden, por supuesto, prepararse mediante diversos medios (por ejemplo expresión recombinante, purificación a partir de GBS, síntesis química, etc.) y en diversas formas (por ejemplo, nativa, fusiones, glicosilada, no glicosilada, etc.). Preferiblemente se preparan en forma pura sustancialmente (es decir, sustancialmente sin otros estreptococos o proteínas de células huésped) o sustancialmente en formas aisladas. Las proteínas de la invención son preferiblemente proteínas estreptococales.
De acuerdo con un aspecto adicional, la invención proporciona anticuerpos que se unen a estas proteínas. Estos pueden ser policlonales o monoclonales y pueden producirse por cualquier medio adecuado (por ejemplo, por expresión recombinante). Para aumentar la compatibilidad con el sistema inmune humano, los anticuerpos pueden ser quiméricos o humanizados (por ejemplo Breedveld (2000) Lancet 355(9205): 735-740; Gorman y Clark (1990) Semin. Immunol. 2: 457-466), o pueden usarse anticuerpos completamente humanos. Los anticuerpos pueden incluir un marcador detectable (por ejemplo para ensayos de diagnóstico).
Un anticuerpo de la invención preferiblemente no se une a los fragmentos de GBS80 desvelados en el documento WO02/12294, concretamente: (i) los 246 aminoácidos C-terminal de la SEC ID Nº: 2; o (ii) un polímero de 245 unidades que son los aminoácidos 336 a 380 de la SEC ID Nº: 2.
De acuerdo con un aspecto adicional, la invención proporciona ácidos nucleicos que comprenden las secuencias de nucleótidos de S. agalactiae desveladas en el ejemplo. Estas secuencias de ácidos nucleicos son SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 3.
Además, la invención proporciona ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que tienen identidad de secuencia para las secuencias de nucleótidos de S. agalactiae desveladas en el ejemplo. La identidad entre secuencias se determina preferiblemente por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman como se ha desvelado anteriormente.
Además, la invención proporciona ácidos nucleicos que pueden hibridar con el ácido nucleico de S. agalactiae desvelado en el ejemplo preferiblemente en condiciones de "rigurosidad elevada" (por ejemplo 65ºC en solución SSC 0,1x, SDS al 0,5%).
También se proporcionan ácidos nucleicos que comprenden fragmentos de éstas secuencias. Éstas deben comprender al menos n nucleótidos consecutivos de secuencias de S. agalactiae y dependiendo de la secuencia particular, n es 30 o más (por ejemplo, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 o más).
De acuerdo con un aspecto adicional, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican las proteínas y los fragmentos de las proteínas de la invención.
Una molécula de ácido nucleico de la invención no es preferiblemente una molécula de ácido nucleico desvelada en el documento WO02/12294, concretamente: (i) un polímero de 741 unidades que consiste en los 3.738 nucleótidos de la SEC ID I con un codón de detención TAA en su extremo 3'; o (ii) un polímero de 737 unidades que son los nucleótidos 1.006 a 1.742 de la SEC ID Nº: 1.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden usarse en reacciones de hibridación (por ejemplo transferencias Northern o Southern, o en micromatrices de ácidos nucleicos o "microplacas de genes") y en reacciones de amplificación (por ejemplo PCR, SDA, SSSR, LCR, TMA, NASBA, etc.) y otras técnicas de ácidos nucleicos.
Debe apreciarse también que la invención proporciona ácidos nucleicos que comprenden secuencias complementarias a las desveladas anteriormente (por ejemplo, para antisentido o sondeo, o para usar como cebadores).
Los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención pueden, por supuesto, prepararse de diversas maneras (por ejemplo mediante síntesis química, a partir de genotecas genómicas o de ADNc, del propio organismo, etc.) y pueden adoptar diversas formas (por ejemplo hélice única, doble hélice, vectores, cebadores, sondas, marcadores, etc.). El ácido nucleico está preferiblemente en forma sustancialmente aislada.
El ácido nucleico de acuerdo con la invención puede marcarse por ejemplo con un marcador radiactivo o fluorescente. Esto es particularmente útil cuando el ácido nucleico va a usarse en técnicas de detección de ácidos nucleicos por ejemplo cuando el ácido nucleico es un cebador o como una sonda para usar en técnicas tales como PCR, LCR, TMA, NASBA, etc.
Además, la expresión "ácido nucleico" incluye ADN y ARN y también sus análogos, tales como los que contienen estructuras modificadas y también ácidos nucleicos peptídicos (PNA), etc.
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De acuerdo con un aspecto adicional, la invención proporciona vectores que comprenden secuencias de nucleótidos de la invención (por ejemplo vectores de clonación o de expresión) y células huésped transformadas con tales vectores.
De acuerdo con un aspecto adicional, la invención proporciona composiciones que comprenden proteínas, anticuerpos y/o ácidos nucleicos de acuerdo con la invención. Estas composiciones pueden ser adecuadas como composiciones inmunogénicas, por ejemplo, o como reactivos de diagnóstico o como vacunas.
La invención también proporciona ácidos nucleicos, proteínas, o anticuerpos de acuerdo con la invención para uso como medicamentos (por ejemplo, composiciones inmunogénicas o como vacunas) o como reactivos de diagnóstico. También proporciona el uso de ácidos nucleicos, proteínas o anticuerpos de acuerdo con la invención en la fabricación de: (i) un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedad y/o infección causada por estreptococos; (ii) un reactivo de diagnóstico para detectar la presencia de estreptococos o de anticuerpos provocados contra estreptococos y/o (iii) un reactivo que puede provocar anticuerpos contra estreptococos. Dichos estreptococos pueden ser cualquier especie, grupo o cepa, pero preferiblemente son S. agalactiae, especialmente del serotipo III o V. Dicha enfermedad puede ser bacteriemia, meningitis, fiebre puerperal, escarlatina, erisipela, faringitis, impétigo, fascitis necrotizante, miositis o síndrome del shock tóxico.
La invención también proporciona una cantidad terapéuticamente eficaz de ácido nucleico, proteína y/o anticuerpo de la invención para tratar un paciente. El paciente puede estar en riesgo de la propia enfermedad o puede ser una mujer embarazada ("inmunización materna" por ejemplo Glezen y Apers (1999) Clin. Infect. Dis. 28: 219-224).
Se prefiere la administración de antígenos de la proteína para inducir la inmunidad.
La administración de anticuerpos de la invención es otro tratamiento preferido. Esta inmunización pasiva es particularmente útil para los niños recién nacidos o para las mujeres embarazadas. Típicamente usarán anticuerpos monoclonales, que se humanizarán o serán completamente humanos.
La invención también proporciona un kit que comprende cebadores (por ejemplo cebadores de PCR) para amplificar una secuencia molde contenida en las secuencias de ácido nucleico de S. agalactiae, el kit comprende un primer cebador y un segundo cebador, en el que el primer cebador es complementario a dicha secuencia molde y el segundo cebador es complementario a un complemento de dicha secuencia molde, donde las partes de dichos cebadores que tienen complementariedad definen los extremos de la secuencia molde a amplificar. El primer cebador y/o el segundo cebador pueden incluir un marcador detectable (por ejemplo un marcador fluorescente).
La invención también proporciona un kit que comprende oligonucleótidos de hélice única primarios y secundarios que permiten la amplificación de las secuencias de ácido nucleico molde de S. agalactiae contenidas en un ácido nucleico de única o doble hélice (o una mezcla de las mismas), en el que: (a) el primer oligonucleótido comprende una secuencia cebadora que es sustancialmente complementaria a dicha secuencia de ácido nucleico molde; (b) el segundo oligonucleótido comprende una secuencia cebadora que es complementaria al complemento de dicha secuencia de ácido nucleico molde; (c) el primer oligonucleótido y/o el segundo oligonucleótido comprende (o comprenden) la secuencia que no es complementaria a dicho ácido nucleico molde; y (d) dichas secuencias cebadoras definen el extremo de la secuencia molde a amplificar. La secuencia (o secuencias) no complementarias de la característica (c) están preferiblemente cadena arriba (es decir 5') de las secuencias cebadoras. Una o ambas de estas secuencias (c) pueden comprender un sitio de restricción (por ejemplo EP-B-0509612) o una secuencia promotora (por ejemplo EPB-0505012). El primer oligonucleótido y/o el segundo oligonucleótido puede incluir un marcador detectable (por ejemplo un marcador fluorescente).
La invención también proporciona una proteína híbrida representada por la fórmula NH_{2}-A-[-X-L-]_{n}-B-COOH, en la que X es una proteína de la invención, L es una secuencia de aminoácidos de engarce opcional, A es una secuencia de aminoácidos N-terminal opcional, B es una secuencia de aminoácidos C-terminal opcional y n es un número entero mayor de 1. El valor de n está entre 2 y x y el valor de x es típicamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10. Preferiblemente n es 2, 3 ó 4; más preferiblemente es 2 ó 3; más preferiblemente, n = 2. Para cada n ejemplo, -X- puede ser la misma o diferente: para cada ejemplo n de [-X-L-], la secuencia de aminoácidos de engarce L puede estar presente o ausente. Por ejemplo, cuando n = 2 el híbrido puede ser NH_{2}-X_{1}-L_{1}-X_{2}-L_{2}-COOH, NH_{2}-X_{1}-X_{2}-COOH, NH_{2}-X_{1}-L_{1}-X_{2}-COOH, NH_{2}-X_{1}-X_{2}-L_{2}-COOH, etc. La secuencia (o secuencias) de aminoácidos de engarce -L- típicamente será corta (por ejemplo 20 o menos aminoácidos es decir 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación, engarzadores de poliglicina (es decir Gly_{n} donde n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) y etiquetas de histidina (es decir His_{n} donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más). Otras secuencias de aminoácidos de engarce adecuadas serán aparentes para los especialistas en la técnica. -A- y -B- son secuencias opcionales que serán típicamente cortas (por ejemplo 40 o menos aminoácidos es decir 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias líder para dirigir el tránsito de proteínas, o secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación o la purificación (por ejemplo etiquetas de histidina, es decir His_{n} donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más). Otras secuencias de aminoácidos adecuadas N-terminal y C-terminal serán aparentes para los especialistas en la técnica.
De acuerdo con aspectos adicionales, la invención proporciona diversos procedimientos.
Se proporciona un procedimiento para la producción de las proteínas de la invención, que comprende la etapa de cultivar una célula huésped de la invención en condiciones que inducen la expresión de la proteína.
Se proporciona un procedimiento para la producción de la proteína o del ácido nucleico de la invención, en el que la proteína o el ácido nucleico se sintetiza en parte o por completo usando medios químicos.
Se proporciona un procedimiento para la detección de los polinucleótidos de la invención, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto una sonda nucleica de acuerdo con la invención con una muestra biológica en condiciones de hibridación para formar dúplex y (b) detectar dichos dúplex.
También se proporciona un procedimiento para la detección de Streptococcus en una muestra biológica (por ejemplo sangre), que comprende la etapa de poner en contacto el ácido nucleico de acuerdo con la invención con la muestra biológica en condiciones de hibridación. El procedimiento puede implicar la amplificación del ácido nucleico (por ejemplo PCR, SDA, SSSR, LCR, TMA, NASBA, etc.) o la hibridación (por ejemplo micromatrices, transferencias, hibridación con sonda en solución, etc.). Se ha desvelado la detección por PCR de Streptococcus en muestras clínicas, en particular de S. pyogenes, [véase por ejemplo Louie y col. (2000) CMAJ 163: 301-309; Louie y col. (1988) J. Clin. Microbiol. 36: 1769-1711]. Ensayos clínicos basados en ácidos nucleicos se describen en general en Tang y col. (1997) Clin. Chem. 43: 2021-2038.
Se proporciona un procedimiento para la detección de las proteínas de la invención, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto un anticuerpo de la invención con una muestra biológica en condiciones adecuadas para la formación de complejos anticuerpo-antígeno; y (b) la detección de dichos complejos.
La invención también proporciona un procedimiento para determinar si un compuesto de ensayo se une a una proteína de la invención. Si un compuesto del ensayo se une a una proteína de la invención y esta unión inhibe el ciclo de vida de la bacteria GBS, entonces el compuesto de ensayo puede usarse como un antibiótico o como un compuesto líder para el diseño de antibióticos. Este procedimiento comprenderá típicamente las etapas de poner en contacto un compuesto del ensayo con una proteína de la invención y determinar si el compuesto del ensayo se une a dicha proteína. Las proteínas preferidas de la invención para usar en estos procedimientos son enzimas (por ejemplo sintetasas ARNt), transportadores de membrana y proteínas ribosomales. Los compuestos de ensayo adecuados incluyen proteínas, polipéptidos, hidratos de carbono, lípidos, ácidos nucleicos (por ejemplo ADN, ARN y formas modificadas de los mismos), así como pequeños compuestos orgánicos (por ejemplo de PM entre 200 y 2000 Da). Los compuestos de ensayo pueden proporcionarse individualmente, pero serán típicamente parte de una biblioteca (por ejemplo una biblioteca combinatoria). Los procedimientos para detectar una interacción de unión incluyen NMR, ensayos de unión a filtros, ensayos de retraso en gel, ensayos de desplazamiento, resonancia de plasmones de superficie, doble híbrido inverso, etc. Puede ensayarse un compuesto que se une a una proteína de la invención para actividad antibiótica poniendo en contacto el compuesto con una bacteria GBS y después controlando la inhibición del crecimiento. La invención también proporciona un compuesto identificado usando estos procedimientos:
La invención también proporciona una composición que comprende una proteína o la invención y uno o más de los siguientes antígenos:
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un antígeno de proteína de Helicobacter pylori tal como VacA, CagA, NAP, HopX, HopY [por ejemplo, documento WO98/04702] y/o ureasa.
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un antígeno de proteína de N. meningitidis del serogrupo B, tal como los de los documentos WO99/24578, WO99/36544, WO99/57280, WO00/22430, Tettelin y col. (2000) Science 287: 1809-1815, Pizza y col. (2000) Science 287: 1816-1820 y WO96/29412, siendo particularmente preferidos la proteína '287' y derivados.
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una preparación de vesícula de membrana externa (OMV) de N. meningitidis del serogrupo B, tal como las desveladas en WO01/52885; Bjune y col. (1991) Lancet 338(8775): 1093-1096; Fukasawa y col. (1999) Vaccine 17: 2951-2958; Rosenqvist y col. (1998) Dev. Biol. Stand 92: 323-333, etc.
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un antígeno sacárido de N. meningitidis del serogrupo A, C, W 135 y/o Y, tal como el oligosacárido desvelado en Costantino y col. (1992) Vaccine 10: 691-698 from serogroup C [véase también Costantino y col. (1999) Vaccine 17: 1251-1263].
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un antígeno sacárido de Streptococcus pneumoniae [por ejemplo, Watson (2000) Pediatr Infect Dis J 19: 331-332; Rubin (2000) Pediatr Clin North Am 47: 269-285, v; Jedrzejas (2001) Microbiol Mol Biol Rev 65: 187-207].
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un antígeno del virus de la hepatitis A, tal como un virus inactivado [por ejemplo, Bell (2000) Pediatr infect Dis J 19: 1187-1188; Iwarson (1995) APMIS 103: 321-326].
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un antígeno del virus de la hepatitis B, tal como antígenos de superficie y/o de núcleo [por ejemplo, Gerlich y col. (1990) Vaccine 8 Supl. S63-68 y 79-80].
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un antígeno del virus de la hepatitis C [por ejemplo, Hsu y col. (1999) Clin Liver Dis 3. 901-915].
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un antígeno de Bordetella pertussis, tal como holotoxina de tos ferina (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3 [por ejemplo Gustafsson y col. (1996) N. Engl. J. Med. 334: 349-355; Rappuoli y col. (1991) TIBTECH 9: 232-238].
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un antígeno de difteria, tal como un toxoide de la difteria [por ejemplo, capítulo 3 de Vaccines (1988) eds. Plotkin 6 Mortimer. ISBN 0-7216- 1946-0] por ejemplo el mutante CRM_{197} [por ejemplo Del Guidice y col. (1998) Molecular Aspects of Medicine 19: 1-70).
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un antígeno del tétano, tal como un toxoide de tétano [por ejemplo capítulo 4 de Plotkin y Mortimer].
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un antígeno sacárido de Haemophilus influenzae B.
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un antígeno de N. gonorrhoeae [por ejemplo los documentos WO99/24578, WO99/36544, WO99/57280].
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un antígeno de Chlamydia pneumoniae [por ejemplo el documento PCT/IB01/01445; Kalman y col. (1999) Nature Genetics 21: 385-389; Read y col. (2000) Nucleic Acids Res 28: 1397-406; Shirai y col. (2000) J. Infect. Dis. 181 (Suppl 3): S524-S527; documentos WO99/27105; WO00/27994; WO00/37494].
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un antígeno de Chlamydia trachomatis [por ejemplo el documento WO99/28475].
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un antígeno de Porphyromonas gingivalis [por ejemplo Ross y col. (2001) Vaccine 19: 4135-4142].
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un antígeno (o antígenos) de la polio [por ejemplo, Sutter y col. (2000) Pediatr Clin North Am 47: 287-308; Zimmerman 6 Spann (1999) Am Farm Physician 59: 113-118, 125-126] tal como IPV o OPV.
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un antígeno (o antígenos) de la rabia [por ejemplo Dreesen (1997) Vaccine 15 Suppl: S2-6] tal como virus inactivado liofilizado [por ejemplo MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1998 Jan 16, 47(1): 12, 19; RabAvert^{TM}].
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antígenos contra el sarampión, paperas y/o rubéola [por ejemplo capítulos 9, 10 y 11 de Plotkin y Mortimer].
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antígeno (o antígenos) de la gripe [por ejemplo capítulo 19 de Plotkin y Mortimer], tal como proteínas de superficie de hemaglutinina y/o neuraminidasas.
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un antígeno de Moraxella catarrhalis [por ejemplo McMichael (2000) Vaccine 19 Suppl 1: S101-107].
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un antígeno de Staphylococcus aureus [por ejemplo Kuroda y col. (2001) Lancet 357(9264): 1255-1240; véanse también las páginas 1218-1219].
Cuando se incluye un antígeno sacárido o de hidrato de carbono, preferiblemente se conjuga con una proteína transportadora para aumentar la inmunogenecidad [por ejemplo Ramsay y col. (2001) Lancet 357(9251): 195-196; Lindberg (1999) Vaccine 17 Suppl 2: S28-36; Conjugate Vaccines (eds. Cruse y col.) ISBN 3805549326, particularmente el vol. 10: 48-114, etc.]. Son proteínas transportadoras preferidas las toxinas o toxoides bacterianos, tales como toxoides de difteria o tétano. Se prefiere particularmente el toxoide de la difteria CRM_{197.} Otras proteínas transportadoras adecuadas incluyen la proteína de la membrana externa de N. meningitidis [por ejemplo el documento EP-0372501], péptidos sintéticos [por ejemplo los documentos EP-0378881, EP-0427347], proteínas de choque térmico [por ejemplo el documento WO93/17712], proteínas de la tos ferina [por ejemplo los documentos WO98/58668; EP-0471177], la proteína D de H. influenzae [por ejemplo, el documento WO00/56360], la toxina A o B de C. difficile [por ejemplo el documento WO00/61761], etc. Puede usarse cualquier reacción de conjugación adecuada, con cualquier engarzador adecuado cuando sea necesario.
Los antígenos de proteínas tóxicas pueden destoxificarse cuando sea necesario (por ejemplo la destoxificación de la toxina de la tos ferina por medios químicos y/o genéticos).
Cuando se incluye un antígeno de difteria en la composición se prefiere incluir también el antígeno del tétano y los antígenos de la tos ferina. De manera similar, cuando se incluye el antígeno del tétano se prefiere incluir también antígenos de difteria y tos ferina. De manera similar, cuando se incluye un antígeno de tos ferina se prefiere incluir también antígenos de difteria y tétanos.
Los antígenos se adsorben preferiblemente en una sal de aluminio.
Los antígenos estarán presentes típicamente en la composición a una concentración de al menos 1 \mug/ml cada uno. En general, la concentración de cualquier antígeno proporcionado será suficiente para provocar una respuesta inmune contra ese antígeno.
La invención también proporciona composiciones que comprenden dos o más proteínas de la presente invención.
Las dos o más proteínas pueden comprender secuencias de GBS o pueden comprender secuencias de GAS y GBS.
A continuación se indica un resumen de técnicas y procedimientos convencionales que pueden emplearse para realizar la invención (por ejemplo para utilizar las secuencias desveladas para vacunación o con fines de diagnóstico). Este resumen no limita la invención, en su lugar, proporciona ejemplos que pueden usarse pero que no son nece-
sarios.
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General
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de la experienciencia de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía por ejemplo Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989); DNA Cloning, Volúmenes I y II (D.N. Glover ed. 1985); Olignucleotide Synthesis (M.J. Gait et, 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames y S. J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames y S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especialmente en volúmenes 154 y 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Millerand M.P. Calos eds. 1987. Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer y Walker etds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes (1987) Protein Purification: Principles and Practice, Segunda Edición (Springer-Verlag, N.Y.), y Handbook of Experimental Inmunology, Volúmenes I-IV (D.. Weir y C.C. Blackwell eds. 1986).
En esta memoria descriptiva se usan las abreviaturas convencionales para los nucleótidos y aminoácidos.
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Definiciones
Una composición que contiene X no "contiene sustancialmente" Y cuando al menos el 85% en peso del total de
X + Y en la composición es X. Preferiblemente, X comprende al menos aproximadamente el 90% en peso del total de
X + Y en la composición, más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% o incluso el 99% en peso.
La expresión "que comprende" significa "que incluye" así como "que consiste" por ejemplo una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional por ejemplo X + Y.
El término "heterólogo" se refiere a dos componentes biológicos que no se encuentran juntos en la naturaleza. Los componentes pueden ser células huésped, genes o regiones reguladoras, tal como promotores. Aunque los componentes heterólogos no se encuentran juntos en la naturaleza, pueden funcionar juntos, como cuando un promotor heterólogo de un gen está unido operativamente al gen. Otro ejemplo es cuando una secuencia de estreptococos es heteróloga a la de una célula huésped de ratón. Ejemplos adicionales serían dos epítopes de la misma o diferentes proteínas que están ensamblados en una sola proteína en una disposición no encontrada en la naturaleza.
Un "origen de replicación" es una secuencia polinucleotídica que inicia y regula la replicación de polinucleótidos, tal como un vector de expresión. El origen de la replicación se comporta como una unidad autónoma de replicación de polinucleótidos dentro de una célula, capaz de replicarse bajo su propio control. Puede necesitarse un origen de replicación para un vector para replicar una célula huésped particular. Con determinados orígenes de replicación, puede reproducirse un vector de expresión con un elevado número de copias en presencia de las proteínas apropiadas dentro de la célula. Son ejemplos de orígenes las secuencias que se replican autónomamente, que son eficaces en levaduras; y el antígeno T viral, eficaz en células COS-7.
Una secuencia "mutante" se define como ADN, ARN o una secuencia de aminoácidos que difiere pero que tiene identidad de secuencia con la secuencia nativa o la desvelada. Dependiendo de la secuencia particular, el grado de identidad de secuencia entre la secuencia nativa o desvelada y la secuencia mutante es preferiblemente superior al 50% (por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más, calculado usando el algoritmo de Smith-Waterman como se ha desvelado anteriormente). Como se usa en el presente documento, una "variante alélica" de una molécula de ácido nucleico, o región, para la cual se proporciona una secuencia de ácido nucleico en el presente documento es una molécula de ácido nucleico, o región, que se produce esencialmente en el mismo locus en el genoma de otro o un aislado secundario, y que, debido a la variación natural causada, por ejemplo, por mutación o recombinación, tiene una secuencia similar pero no idéntica de ácido nucleico. Una variante alélica de región codificante típicamente codifica una proteína que tiene actividad similar a la de la proteína codificada por el gen con el cual se está comparando. Una variante alélica puede comprender una alteración en las regiones no traducidas 5' o 3' del gen, tal como en las regiones de control reguladoras (véase, por ejemplo la patente de Estados Unidos Nº 5.753.235).
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Sistemas de Expresión
Las secuencias de nucleótidos de estreptococos pueden expresarse en una diversidad de sistemas de expresión diferentes; por ejemplo las usadas con células de mamíferos, baculovirus, plantas, bacterias y levaduras.
i. Sistemas de Mamíferos
Los sistemas de expresión en mamíferos son conocidos en la técnica. Un promotor de un mamífero es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa de mamífero e iniciar la transcripción (3') cadena abajo de una secuencia codificante (por ejemplo gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de la transcripción, que normalmente se sitúa próximo al extremo 5' de la secuencia codificante y una caja TATA, normalmente localizada cadena arriba de los pares de bases (pb) 25-30 del sitio de inicio de la transcripción. Se cree que la caja TATA dirige la ARN polimerasa II para iniciar la síntesis del ARN en el sitio correcto. Un promotor de mamífero contendrá también un elemento promotor cadena arriba, normalmente situado de 100 a 200 pb cadena arriba de la caja TATA. Un elemento promotor cadena arriba determina la velocidad a la que se inicia la transcripción y puede actuar en cualquier orientación (Sambrook y col. (1989) "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells". In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed.].
Los genes virales de mamíferos a menudo se expresan de forma elevada y tienen una amplia variedad de huéspedes; por lo tanto, secuencias que codifican genes virales de mamíferos proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen el promotor temprano de SV40, el promotor LTR del virus de tumor mamario de ratón, el promotor tardío principal de adenovirus (Ad MLP) y el promotor del virus del herpes simple. Además secuencias procedentes de genes no virales, tales como el gen de la metaloteionina murina, también proporciona secuencias promotoras útiles. La expresión puede ser bien constituida o bien regulada (inducible), dependiendo de que el promotor pueda inducirse con glucocorticoides en células sensibles a hormonas.
La presencia de un elemento potenciador (potenciador), combinado con los elementos promotores desvelados anteriormente, incrementarán normalmente los niveles de expresión. Un potenciador es una secuencia reguladora de ADN que puede estimular la transcripción hasta 1000 veces cuando se une a promotores homólogos o heterólogos, comenzando la síntesis en el sitio de inicio del ARN normal. Los potenciadores también se activan cuando se sitúan cadena arriba o cadena abajo del sitio de inicio la transcripción, en orientación normal o invertida, o a una distancia de más de 1000 nucleótidos del promotor [Maniatis y col. (1987) Science 236:1237; Alberts y col. (1989) Molecular Biology of the Cell, 2ª ed.]. Los elementos potenciadores procedentes de virus puede ser particularmente útiles porque normalmente tienen una diversidad de huéspedes más amplia. Los ejemplos incluyen el potenciador del gen temprano de SV40 [Dijkema y col. (1985) EMBO J 4: 761] y los potenciadores/promotores procedentes de la repetición terminal larga (LTR) del virus del Sarcoma de Rous [Gorman y col. (1982b) Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 6777] y del citomegalovirus humano [Boshart y col. (1985) Cell 41: 521]. Adicionalmente, algunas potenciadores son regulables y se vuelven activos únicamente en presencia de un inductor, tal como una hormona o un ión metálico [Sassone-Corsi y Borelli (1986) Trends Genet. 2: 215; Maniatis y col. (1987) Science 236: 1237].
Una molécula de ADN puede expresarse intracelularmente en células de mamífero. Una secuencia promotora puede unirse directamente con la molécula de ADN, en cuyo caso el primer aminoácido del extremo N de la proteína recombinante será siempre una metionina, que se codifica por el codón de inicio ATG. Si se desea, el extremo N puede escindirse de la proteína por incubación in vitro con bromuro de cianógeno.
Como alternativa, también pueden secretarse proteínas extrañas desde la célula a los medios de cultivo creando moléculas de ADN quiméricas que codifican una proteína de fusión comprendida por un fragmento de secuencia líder que proporciona la secreción de la proteína extraña en células de mamíferos. Preferiblemente, hay sitios de procesamiento codificados entre el fragmento líder y el gen extraño que pueden escindirse in vivo o in vitro. Normalmente el fragmento de secuencia líder codifica un péptido de señal compuesto por aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína desde la célula. La secuencia líder tripartita del adenovirus es un ejemplo de una secuencia líder que proporciona la secreción de una proteína extraña en células de mamíferos.
Normalmente, las secuencias de terminación de la transcripción y poliadenilación reconocidas por las células de mamíferos son regiones reguladoras localizadas a 3' del codón de terminación de la traducción, y por tanto, junto con los elementos promotores, flanquean la secuencia codificante. El extremo 3' del ARNm maduro se forma por escisión y poliadenilación postranscripcional especifica de sitio [Birnstiel y col. (1985) Cell 41:349; Proudfoot and Whitelaw (1988) "Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA". In Transcription and splicing (ed. B.D. Hames and D.M. Glover); Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sci. 14:105]. Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm que puede traducirse en el polipéptido codificado por el ADN. Ejemplos de señales de terminación/poliadenilación de la transcripción incluyen las procedentes de SV40 [Sambrook y col (1989) "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells". In Molecular Cloning: A Laboratory Manual].
Normalmente, los componentes desvelados anteriormente, que comprenden un promotor, una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de la transcripción se ponen juntos en construcciones de expresión. Si se desea, también pueden incluirse potenciadores, intrones con sitios aceptores y donantes de empalme funcionales, y secuencias líder en una construcción de expresión. Las construcciones de expresión a menudo se mantienen en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo plásmidos) capaz de mantenerse estable en un huésped, tal como células de mamíferos o bacterias. Los sistemas de replicación de mamíferos incluyen los procedentes de virus de animales, que necesitan factores que actúan en trans para replicarse. Por ejemplo, los plásmidos que contienen los sistemas de replicación de papovavirus, tales como SV40 [Gluzman (1981) Cell 23:175] o los poliomavirus, se replican con un número de copias extremadamente alto en presencia del antígeno T viral apropiado. Ejemplos adicionales de replicones de mamíferos incluyen los que proceden de papilomavirus bovino y virus de Epstein-Barr. De manera adicional, el replicón puede tener dos sistemas de replicación, permitiendo de esta manera conservarse, por ejemplo, en células de mamíferos para la expresión y en un huésped procariota para la clonación y amplificación. Ejemplos de tales vectores lanzadera de bacteria-mamífero incluyen pMT2 [Kaufman y col. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:946] y pHEBO [Shimizu y col. (1986) Mol. Cell. Biol 6:1074].
El procedimiento de transformación usado depende del huésped a transformar. Se conocen en la técnica procedimientos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero e incluyen la transfección mediada con dextrano, precipitación en fosfato cálcico, transfección mediada con polibreno, fusión de protoplasto, electroporación, encapsulación del polinucleótido (o polinucleótidos) en liposomas y microinyección directa del ADN en el núcleo.
Las líneas celulares de mamíferos disponibles como huéspedes para la expresión se conocen en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en la colección de cultivos tipo americano (ATCC), que incluyen pero sin limitación, células de ovario de hámster Chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células del carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo Hep G2) y varias líneas celulares más.
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ii. Sistemas de Baculovirus
El polinucleótido que codifica la proteína también puede insertarse en un vector de expresión de insecto adecuado y está unido operativamente a elementos de control dentro del vector. El vector de construcción emplea técnicas conocidas en este campo. Generalmente, los componentes del sistema de expresión incluyen un vector de transferencia, normalmente un plásmido bacteriano, que contiene fragmentos del genoma de baculovirus y un sitio de restricción conveniente para la inserción del gen o genes heterólogos a expresar; un baculovirus de tipo silvestre con una secuencia homóloga a la del fragmento específico de baculovirus en el vector de transferencia (esto permite la recombinación homó-
loga del gen heterólogo en el genoma del baculovirus) y células huésped de insecto y medios de cultivo apropiados.
Después de insertar la secuencia de ADN que codifica la proteína en el vector de transferencia, el vector y el genoma viral de tipo silvestre se transfectan en una célula huésped de insecto donde se permite recombinar al vector y al genoma viral. El virus recombinante empaquetado se expresa y las placas recombinantes se identifican y purifican. Los materiales y procedimientos para los sistemas de expresión baculovirus/células de insectos se encuentran disponibles en el mercado en forma de kit, entre otros, Invitrogen, San Diego CA (kit "MaxBac"). Los especialistas en la técnica conocen generalmente estas técnicas y se describen extensamente en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) (en lo sucesivo en el presente documento "Summers y Smith").
Antes de la inserción de la secuencia de ADN que codifica la proteína en el genoma del baculovirus, los componentes anteriormente desvelados, que comprenden un promotor, un líder (si se desea), una secuencia codificante y una secuencia de terminación de la transcripción están normalmente ensamblados en una construcción de sustitución intermedia (vector de transferencia). Esta puede contener un gen único y elementos reguladores unidos operativamente; genes múltiples, cada uno con su propio grupo de elementos reguladores unidos operativamente; o genes múltiples, regulados por el mismo conjunto de elementos reguladores. Las construcciones de sustitución intermedias a menudo se mantienen en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaces de mantenerse estables en un huésped, tal como una bacteria. El replicón tendrá un sistema de replicación, permitiendo de este modo mantenerse en un huésped adecuado para la clonación y amplificación.
En la actualidad, el vector de transferencia más comúnmente usado para la introducción de genes extraños en AcNPV es pAc373. También se han diseñado muchos otros vectores conocidos por los especialistas en la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, pVL985 (que altera el codón de inicio de polihedrina de ATG a ATT y que introduce en un sitio
de clonación BamHI a 32 pares de bases cadena abajo de ATT; véase Luckow and Summers, Virology (1989) 17:31.
El plásmido normalmente también contiene la señal de poliadenilación de polihedrina (Miller y col. (1988) Ann. Rev. Microbiol., 42:177) y un gen procariota resistente a ampicilina (amp) y un origen de replicación para la selección y propagación en E. coli.
Los vectores de transferencia de baculovirus normalmente contienen un promotor de baculovirus. Un promotor de baculovirus es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa de baculovirus e iniciar la transcripción cadena abajo (5' a 3') de una secuencia codificante (por ejemplo, un gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de iniciación de la transcripción que normalmente se sitúa próxima al extremo 5' de la secuencia codificante. Esta región de iniciación de la transcripción normalmente incluye un sitio de unión a ARN polimerasa y un sitio de iniciación de la transcripción. Un vector de transferencia de baculovirus también puede tener un segundo dominio denominado potenciador, que, si está presente, normalmente es distal con respecto a la estructura del gen. La expresión puede regularse o ser constitutiva.
Los genes estructurales, transcritos abundantemente en la última fase de un ciclo de infección viral, proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen secuencias procedentes del gen que codifica la proteína poliédrica vírica. Friesen y col., (1986) "The Regulation of Baculovirus Gene Expression", in: The Molecular Biology of Baculoviruses (ed. Walter Doerfler); EPO Publ. Nos. 127 839 and 155 476; y el gen que codifica la proteína p10, Vlak y col., (1988), J. Gen. Virol. 69:765.
Las secuencias de señal adecuadas que codifican ADN pueden proceder de genes de proteínas secretadas de insectos o baculovirus, tales como el gen de polihedrina de baculovirus (Carbonell y col. (1988) Gene, 73:409). Como alternativa, puesto que las señales para las modificaciones postranscripcionales de células de mamíferos (tales como la escisión de péptidos de señal, escisión proteolítica y fosforilación) parece que se reconocen por las células de insectos y las señales requeridas para la secreción y acumulación nuclear también parecen estar conservadas entre las células de invertebrados y las células de vertebrados, también pueden usarse secuencias líderes de origen no insecto, tales como las procedentes de genes que codifican el \alpha-interferón humano, Maeda y col., (1985), Nature 315:592; el péptido de liberación de gastrina humana, Lebacq-Verheyden y col., (1988), Molec. Cell. Biol. 8:3129; IL-2 humano, Smith y col., (1985) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 82:8404; IL-3 de ratón, (Miyajima y col., (1987) Gene 58:273; y la glucocerebrosidasa humana, Martin y col. (1988) DNA, 7:99, para proporcionar la secreción en insectos.
Un polipéptido o poliproteína recombinante puede expresarse intracelularmente o puede secretarse, si se expresa con las secuencias reguladoras adecuadas. La buena expresión intracelular de proteínas extrañas no fusionadas normalmente requiere genes heterólogos que idealmente tienen una secuencia líder más corta que contiene señales de inicio de la traducción adecuadas que preceden a una señal de inicio ATG. Si se desea, la metionina del extremo N puede escindirse de la proteína madura por incubación in vitro con bromuro de cianógeno.
Como alternativa, las poliproteínas o proteínas recombinantes que no se secretan de forma natural pueden secretarse a partir de la células de insecto creando moléculas de ADN quimérico que codifica una proteína de fusión que comprende un fragmento de la secuencia líder que proporciona la secreción de la proteína extraña en insectos. Normalmente el fragmento de secuencia líder codifica un péptido de señal que comprende aminoácido hidrófobos que dirigen la translocación de la proteína al retículo endoplásmico.
Tras la inserción de la secuencia de ADN y/o el gen que codifica el precursor del producto de expresión de la proteína, una célula huésped de insecto se cotransforma con el ADN heterólogo del vector de transferencia y el ADN genómico de baculovirus de tipo silvestre - normalmente mediante co-transfección. El promotor y la secuencia de terminación de la transcripción de la construcción normalmente comprenderá una sección de 2-5kb del genoma del baculovirus. En la técnica se conocen procedimientos para introducir ADN heterólogo en el sitio deseado en el virus del baculovirus. (Véase Summers y Smith anteriormente; Ju y col. (1987); Smith y col., Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156; y Luckow and Summers (1989)). Por ejemplo, la inserción puede ser en un gen tal como el gen de polihedrina, por recombinación entrecruzada doble homóloga; la inserción también puede ser en un sitio de la enzima de restricción modificado por ingeniería genética en el gen del baculovirus deseado. Miller y col., (1989), Bioessays 4:91. Cuando se clona la secuencia de ADN, en lugar del gen de polihedrina en el vector de expresión, está flanqueada en ambos extremos 5' y 3', por secuencias específicas de polihedrina y se sitúa cadena abajo del promotor de la
polihedrina.
El vector de expresión de baculovirus recién formado se empaqueta posteriormente en un baculovirus recombinante infeccioso. La recombinación homóloga se produce a baja frecuencia (aproximadamente entre el 1% y aproximadamente el 5%); de esta manera, la mayor parte del virus producido después de la cotransfección aún es un virus de tipo silvestre. Por lo tanto, es necesario un procedimiento para identificar virus recombinantes. Una ventaja del sistema de expresión es una selección visual que permite distinguir virus recombinantes. La proteína polihedrina, producida por el virus nativo, se produce a niveles muy elevados en los núcleos de células infectadas en la última etapa después de la infección viral. La proteína polihedrina acumulada forma cuerpos de oclusión que también pueden contener partículas incluidas. Estos cuerpos de oclusión, de hasta 15 \mum de tamaño, son muy refráctiles, proporcionándoles una apariencia brillante luminosa que se visualiza fácilmente al microscopio óptico. Las células infectadas con virus recombinantes carecen de cuerpos de oclusión. Para distinguir los virus recombinantes de los virus de tipo silvestre, el sobrenadante de la transfección se siembra en placa sobre una monocapa de células de insectos por técnicas conocidas por los especialistas en la técnica. Concretamente, las placas se exploran al microscopio óptico para detectar la presencia (indicativo de virus de tipo silvestre) o ausencia (indicativo de virus recombinante) de cuerpos de oclusión. "Current Protocols in Microbiology" Vol. 2 (Ausubel y col. eds) at 16.8 (Supp. 10, 1990); Summers and Smith, anteriormente; Miller y col. (1989).
Se han desarrollado vectores de expresión de baculovirus recombinantes para la infección en varias células de insecto. Por ejemplo, se han desarrollad baculovirus recombinantes para, entre otros: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, y Trichoplusia ni (documento WO 89/046699; Carbonell y col., (1985) J. Virol. 56:153; Wright (1986) Nature 321:718; Smith y col., (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156; y véase generalmente, Fraser, y col. (1989) In Vitro Cell. Dev. Biol. 25:225).
Están disponibles en el mercado células y medios de cultivo celulares para la expresión directa y por fusión de polipéptidos heterólogos en un sistema de expresión de baculovirus; la tecnología de cultivo celular se conoce generalmente por los especialistas en la técnica. Véase, por ejemplo, Summers y Smith anteriormente.
Las células de insecto modificadas pueden después crecer en un medio nutritivo apropiado, que permite el mantenimiento estable del plásmido (o plásmidos) presente en el insecto huésped modificado. Cuando el producto de expresión génica está bajo control inducible, el huésped puede cultivarse a densidad elevada e inducirse la expresión. Como alternativa, cuando la expresión es constitutiva, el producto se expresará de manera continúa en el medio y el medio nutritivo debe circular continuamente, mientras que se elimina el producto de interés y aumentan los nutrientes agotados. El producto puede purificarse mediante tales técnicas como cromatografía, por ejemplo, HPLC, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, etc; electroforesis; centrifugación en gradiente de densidad; extracción de disolvente, etc. Si es apropiado, el producto puede purificarse adicionalmente, si se requiere, para eliminar sustancialmente cualquier proteína del insecto que esté también presente en el medio, para proporcionar un producto al menos sustancialmente sin residuos del huésped, por ejemplo proteínas, lípidos y polisacáridos.
Para obtener la expresión de la proteína, las células huésped recombinantes procedentes de los transformantes se incuban en condiciones que permiten la expresión de la secuencia que codifica la proteína recombinante. Estas condiciones variarán, dependiendo de la célula huésped seleccionada. Sin embargo, los especialistas en la técnica determinan fácilmente las condiciones, en base a lo que se conoce en la técnica.
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iii. Sistemas Vegetales
Se conocen en la técnica muchos sistemas de cultivo de células vegetales y de expresión genética en plantas completas. Los sistemas de expresión genética celular en plantas ejemplares incluyen los escritos en patentes tales como: US 5.693.506; US 5.659.122; y US 5.608.143. Se han desvelado ejemplos adicionales de expresión genética en cultivos de células vegetales por Zenk, Phytochemistry 30: 3861-3863 (1991). Pueden encontrarse descripciones de péptidos señal de proteínas vegetales además de en las referencias desveladas anteriormente en Vaulcombe y col., Mol. Gen Genet. 209: 33-40 (1987); Chandler y col., Plant Molecular Biology 3: 407-418 (1984); Rogers, J. Biol. Chem. 260: 3731-3738 (1985); Rothstein y col., Gene 55: 353-356 (1987); Whittier y col., Nucleic Acids Research 15: 2515-2535 (1987); Wirsel y col., Molecular Microbiology 3:3-14 (1989); Yu y col., Gene 122: 247-253 (1992). Puede encontrarse una descripción de la regulación de la expresión de genes vegetales por la fitohormona, ácido giberélico y enzimas secretadas inducidas por ácido giberélico en R. L Jones y J. MacMillin, Gibberellins, en: Advanced Plant Physiology, Malcolm B. Wilkins, ed., 1984 Pitman Publishing Limited, Londres, págs. 21-52. Referencias que describen otros genes regulados metabólicamente: Sheen, Plant Cell, 2: 1027-1038 (1990); Maas y col., EMBO J. 9: 3447-3452 (1990); Benkel y Hickey, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 1337-1339 (1987).
Típicamente, usando procedimientos conocidos en la técnica, se inserta una secuencia polinucleotídica deseada en un casete de expresión que comprende elementos reguladores genéticos diseñados para su funcionamiento en plantas. El casete de expresión se inserta en un vector de expresión deseado con secuencias acompañantes cadena arriba y cadena abajo del casete de expresión adecuadas para la expresión en un huésped vegetal. Las secuencias acompañantes serán de origen plasmídico o vírico y proporcionarán características necesarias al vector para permitir que los vectores trasladen ADN desde un huésped de clonación original, tal como bacterias, al huésped vegetal deseado. La construcción de vector bacteriano/vegetal básica proporcionará preferiblemente un origen de replicación procariota de amplio intervalo de huésped; un marcador de selección procariota; y, para transformaciones en Agrobacterium, secuencias de ADN T para transferencia mediada por Agrobacterium a cromosomas vegetales. Cuando el gen heterólogo no es fácilmente sensible a detección, la construcción tendrá también preferiblemente un gen marcador de selección adecuado para determinar si una célula vegetal se ha trasformado. Se encuentra una revisión general de marcadores adecuados, por ejemplo, para los miembros de la familia del césped en Wilmink y Dons, 1993, Plant Mol. Biol. Reptr, 11 (2): 165-185.
También se recomiendan secuencias adecuadas para permitir la integración de la secuencia heteróloga en el genoma vegetal. Esto podría incluir secuencias de transposones y similares para recombinación homóloga así como secuencias Ti que permiten una inserción aleatoria de un casete de expresión heterólogo en un genoma vegetal. Los marcadores de selección procariotas adecuados incluyen resistencia antibióticos tales como ampicilina o tetraciclina. También pueden estar presentes en el vector otras secuencias de ADN que codifican funciones adicionales, como se conoce en la técnica.
Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden incluirse en un casete de expresión para la expresión de la proteína o proteínas de interés. Habitualmente, sólo habrá un casete de expresión, aunque son posibles dos o más. El casete de expresión recombinante contendrá además de la secuencia codificante de proteína heteróloga los siguientes elementos, una región promotora, secuencias no traducidas 5' vegetales, un codón de inicio dependiendo de si el gen estructural viene o no provisto de uno y una secuencia de terminación de la transcripción y traducción. Sitios para enzimas de restricción únicas en los extremos 5' y 3' del casete permiten una inserción sencilla en un vector preexistente.
Una secuencia codificante heteróloga puede ser para cualquier proteína relacionada con la presente invención. La secuencia que codifica la proteína de interés codificará un péptido señal que permita el procesamiento y la traslocación de la proteína, según sea apropiado, y habitualmente carecerá de cualquier secuencia que pueda dar como resultado la unión de la proteína deseada de la invención a una membrana. Puesto que, en su mayor parte, la región de inicio de la transcripción será para un gen que se exprese y se trasloque durante la germinación, mediante el empleo del péptido señal que proporciona la traslocación se puede proporcionar también la traslocación de la proteína de interés. De este modo, la proteína o proteínas de interés se traslocarán desde las células en las que se expresan y pueden recogerse eficazmente. Típicamente la secreción en semillas es a través de la capa de aleurona o epitelio escutelar hacia el endospermo de la semilla. Aunque no es necesario que la proteína se secrete desde las células en las que se produce la proteína, facilita el aislamiento y la purificación de la proteína recombinante.
Puesto que la expresión final del producto génico deseado será en una célula eucariota es deseable determinar si alguna porción del gen clonado contiene secuencias que se eliminarán por procesamiento como intrones por la maquinaria del espliceosoma del huésped. Si es así, puede realizarse una mutagénesis dirigida de la región "intrónica" para evitar perder una porción del mensaje genético como un falso código de intrón, Reed y Maniatis, Cell 41: 95-105, 1985.
El vector puede microinyectarse directamente en células vegetales mediante el uso de micropipetas para transferir mecánicamente el ADN recombinante. Crossway, Mol. Gen. Genet, 202: 179-185, 1985. El material genético también puede transferirse al interior de la célula vegetal mediante el uso de polietilenglicol, Krens, y col., Nature, 296, 72-74, 1982. Otro procedimiento de introducción de segmentos de ácidos nucleicos es penetración balística de alta velocidad mediante partículas pequeñas con el ácido nucleico en el interior de la matriz de perlas o partículas pequeñas o en la superficie, Klein, y col., Nature, 327, 70-73, 1987 y Knudsen y Muller, 1991, Planta, 185: 330-336, que muestra el bombardeo de partículas del endospermo de cebada para generar cebada transgénica. Otro procedimiento más de introducción sería la fusión de protoplastos con otras entidades, minicélulas, células, lisosomas u otros cuerpos fusionables de superficie lipídica, Fraley, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1859-1863, 1982.
El vector también puede introducirse en las células vegetales por electroporación (Fromm y col., Proc. Natl Acad Sci. USA 82: 5824, 1985). En esta técnica, se electroporan protoplastos vegetales en presencia de plásmidos que contienen la construcción genética. Impulsos eléctricos de alta fuerza de campo permeabilizan de forma reversible biomembranas permitiendo la introducción de los plásmidos. Los protoplastos vegetales electroporados vuelven a formar la pared celular, se dividen y forman el callo vegetal.
Todas las plantas de las que pueden aislarse y cultivarse protoplastos para dar plantas regeneradas completas pueden trasformarse mediante la presente invención de modo que se recuperen plantas completas que contengan el gen transferido. Se sabe que prácticamente todas las plantas pueden regenerarse a partir de células o tejidos cultivados, incluyendo, pero sin limitación, todas las especies principales de caña de azúcar, remolacha azucarera, algodón, frutales y otros árboles, legumbres y vegetales. Algunas plantas adecuadas incluyen, por ejemplo, especies de los géneros Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersion, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hererocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum y Datura.
Los medios para la regeneración varían de una especie a otra de planta, pero generalmente se proporciona primero una suspensión de protoplastos transformados que contienen copias del gen heterólogo. Se forma tejido del callo y pueden inducirse vástagos a partir de callos y posteriormente enraizarse. Como alternativa, puede inducirse la formación de embriones a partir de la suspensión de protoplastos. Estos embriones germinan como embriones naturales para formar plantas. Los medios de cultivo contendrán generalmente diversos aminoácidos y hormonas, tales como auxina y citocinas. También es ventajoso añadir ácido glutámico y prolina al medio, especialmente para especies tales como maíz y alfalfa. Los vástagos y raíces se desarrollan normalmente de forma simultánea. Una regeneración eficaz dependerá del medio, del genotipo y de la historia del cultivo. Si se controlan estas tres variables, entonces la regeneración es totalmente reproducible y repetible. En algunos sistemas de cultivo de células vegetales, la proteína deseada de la invención puede excretarse o, como alternativa, la proteína puede extraerse de la planta completa. Cuando la proteína deseada de la invención se secreta al medio, puede recogerse. Como alternativa, los embriones y medias semillas sin embrión u otro tejido vegetal pueden romperse mecánicamente para liberar cualquier proteína secretada entre células y tejidos. La mezcla puede suspenderse en una solución de tampón para recuperar las proteínas solubles. Después, se usarán procedimientos de aislamiento y purificación de proteínas convencionales para purificar la proteína recombinante. Se ajustarán parámetros de tiempo, temperatura, pH, oxígeno y volúmenes por medio de procedimientos de rutina para optimizar la expresión y recuperación de proteína heteróloga.
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iv. Sistemas Bacterianos
Se conocen en la técnica procedimientos de expresión bacteriana. Un promotor bacteriano es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a una ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción cadena abajo (3') de una secuencia codificante (por ejemplo, un gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de la transcripción que habitualmente se sitúa proximal al extremo 5' de la secuencia codificante. Esta región de inicio de la transcripción incluye habitualmente un sitio de unión a ARN polimerasa y un sitio de inicio de la transcripción. Un promotor bacteriano también puede tener un segundo dominio denominado operador, que puede solapar con un sitio de unión a ARN polimerasa adyacente en el que comienza la síntesis de ARN. El operador permite una transcripción regulada (inducible) negativa ya que una proteína represora de genes puede unirse al operador y por lo tanto inhibir la transcripción de un gen especifico. Puede producirse una expresión constitutiva en ausencia de elementos reguladores negativos, tales como el operador. Además, puede conseguirse una regulación positiva mediante una secuencia de unión a proteína activadora de genes, que si está presente está habitualmente proximal (5') a la secuencia de unión a ARN polimerasa. Un ejemplo de una proteína activadora de genes es la proteína activadora de catabolito (CAP) que ayuda a iniciar la transcripción del operón lac en Escherichia coli (E. coli) [Raibaud y col. (1984) Annu. Rev. Genet. 18: 173]. Por lo tanto, la expresión regulada puede ser positiva o negativa, aumentando o reduciendo por lo tanto la transcripción.
Las secuencias que codifican enzimas de rutas metabólicas proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen secuencias promotoras procedentes de enzimas que metabolizan azúcares, tales como galactosa, lactosa (lac) [Chang y col. (1977) Nature 198: 1056] y maltosa. Los ejemplos adicionales incluyen secuencias promotoras procedentes de enzimas biosintéticas tales como triptófano (trp) [Goeddel y col. (1980) Nuc. Acids Res. 8: 4057; Yelverton y col. (1981) Nucl. Acids Res. 9: 731; Patente de Estados Unidos 4.738.921; documentos EP-A-0036776 y EP-A-0121775]. El sistema promotor de g-lactamasa (bla), [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes". En Interferon 3 (ed. I. Gresser)], los sistemas promotores de bacteriófago lambda PL [Shimatake y col. (1981) Nature 292: 128] y T5 [Patente de Estados Unidos 4.689.406] también proporcionan secuencias promotoras útiles.
Además, promotores sintéticos que no aparecen en la naturaleza también funcionan como promotores bacterianos. Por ejemplo, pueden unirse secuencias de activación de la transcripción de un promotor bacteriano o de bacteriófago con las secuencias de operón de otro promotor bacteriano o de bacteriófago, generando un promotor híbrido sintético [Patente de Estados Unidos 4.551.433]. Por ejemplo, el promotor tac es un promotor trp-lac híbrido compuesto por secuencias tanto de promotor trp como de operón lac que están reguladas por el represor lac [Amann y col. (1983) Gene 25: 167; de Boer y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 21 ]. Además, un promotor bacteriano puede incluir promotores de origen natural de origen no bacteriano que tengan la capacidad de unirse a una ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción. Un promotor de origen natural de origen no bacteriano también puede acoplarse con una ARN polimerasa compatible para producir altos niveles de expresión de algunos genes en procariotas. El sistema de ARN polimerasa/promotor de bacteriófago T7 es un ejemplo de un sistema promotor acoplado [Studier y col. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113; Tabor y col. (1985) Proc Natl. Acad. Sci. 82: 1074]. Además, un promotor híbrido también puede estar compuesto por un promotor de bacteriófago y una región de operador de E. Coli (documento EPO-A-0 267 851).
Además de una secuencia promotora en funcionamiento, un sitio de unión al ribosoma eficaz también es útil para la expresión de genes extraños en procariotas. En E. coli, el sitio de unión al ribosoma se denomina secuencia de Shine-Dalgarno (SD) e incluye un codón de inicio (ATG) y una secuencia de 3-9 nucleótidos de longitud localizada 3-11 nucleótidos cadena arriba del codón de inicio [Shine y col. (1975) Nature 254: 34]. Se piensa que la secuencia de SD promueve la unión de ARNm al ribosoma por el emparejamiento de bases entre la secuencia de SD y el extremo 3' del ARNr 16S de E. coli [Steitz y col. (1979) "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA". En Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R. F. Goldberger)]. Para expresar genes eucariotas y genes procariotas con un sitio de unión al ribosoma débil [Sambrook y col. (1989) "Expression of cloned genes in Escherichia coli". En Molecular Cloning: A Laboratory Manual].
Una molécula de ADN puede expresarse intracelularmente. Una secuencia promotora puede unirse directamente con la molécula de ADN, en cuyo caso el primer aminoácido en el extremo N-terminal siempre será una metionina, que está codificada por el codón de inicio ATG. Si se desea, puede escindirse de la proteína la metionina en el extremo N-terminal por incubación in vitro con bromuro de cianógeno o por incubación in vivo o in vitro con una peptidasa bacteriana de metionina N-terminal (documento EP-A-0 219 237).
Las proteínas de fusión proporcionan una alternativa a la expresión directa. Habitualmente, una secuencia de ADN que codifica la porción N-terminal de una proteína bacteriana endógena, u otra proteína estable, se fusiona al extremo 5' de secuencias codificantes heterólogas. Tras la expresión, está construcción proporcionará una fusión de las dos secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, el gen celular de bacteriófago lambda puede unirse al extremo 5' terminal de un gen extraño y expresarse en bacterias. Esta proteína de fusión resultante conserva preferiblemente un sitio para una enzima de procesamiento (factor Xa) para escindir la proteína de bacteriófago del gen extraño [Nagai y col. (1984) Nature 309:810]. También pueden prepararse proteínas de fusión con secuencias de los genes lacZ [Jia y col. (1987) Gene 60: 197], trpE [Allen y col. (1987) J. Biotechnol. 5: 93; Makoff y col. (1989) J. Gen. Microbiol. 135: 11] y Chey [documento EP-A-0 324 647]. La secuencia de ADN en la unión de las dos secuencias de aminoácidos puede o no codificar un sitio escindible. Otro ejemplo es una proteína de fusión de ubiquitina. Dicha proteína de fusión está compuesta por la región de ubiquitina que preferiblemente conserva un sitio para una enzima de procesamiento (por ejemplo, proteasa de procesamiento específica de ubiquitina) para escindir la ubiquitina de la proteína extraña. Mediante este procedimiento, puede aislarse una proteína extraña nativa [Miller y col. (1989) Biol Technology 7: 698].
Como alternativa, también pueden secretarse proteínas extrañas a partir de la célula por generación de moléculas de ADN quimérico que codifican una proteína de fusión compuesta por un fragmento de secuencia de péptido señal que proporciona la secreción de la proteína extraña en bacterias [Patente de Estados Unidos 4.336.336]. El fragmento de secuencia señal codifica habitualmente un péptido señal compuesto por aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína desde la célula. La proteína se secreta hacia el medio de cultivo (bacterias gram-positivas) o hacia el espacio periplásmico, localizado entre la membrana interna y externa de la célula (bacteria gram-negativa). Preferiblemente, existen sitios de procesamiento que pueden escindirse in vivo o in vitro, codificados entre el fragmento de péptido señal y el gen extraño.
Puede obtenerse ADN que codifica secuencias señal adecuadas a partir de genes para proteínas bacterianas secretadas, tales como el gen de la proteína de membrana externa de E. coli (ompA) [Masui y col. (1983), en: Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb y col. (1984) EMBO J. 3: 2437] y la secuencia señal de fosfatasa alcalina de E. coli (phoA) [Oka y col. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7212]. Como ejemplo adicional, puede usarse la secuencia señal del gen de alfa-amilasa de diversas cepas de Bacillus para secretar proteínas heterólogas a partir de B. subtilis [Palva y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; documento EP-A-0 244 042].
Habitualmente, las secuencias de terminación de la transcripción reconocidas por bacterias son regiones reguladoras localizadas 3' al codón de terminación de la traducción y, por lo tanto, junto con el promotor flanquean la secuencia codificante. Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm que puede traducirse en el polipéptido codificado por el ADN. Las secuencias de terminación de la transcripción incluyen frecuentemente secuencias de ADN de aproximadamente 50 nucleótidos capaces de formar estructuras de tallo bucle que ayudan a terminar la transcripción. Los ejemplos incluyen secuencias de terminación de la transcripción procedentes de genes con promotores fuertes, tales como el gen trp en E. coli, así como otros genes biosintéticos.
Habitualmente, los componentes desvelados anteriormente que comprenden un promotor, secuencia señal (si se desea), secuencia codificante de interés y secuencia de terminación de la transcripción se ponen juntos en construcciones de expresión. Las construcciones de expresión se mantienen con frecuencia en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos), capaz del mantenimiento estable en un huésped tal como bacterias. El replicón tendrá un sistema de replicación, permitiendo de este modo que se mantenga en un huésped procariota para su expresión o para la clonación y amplificación. Además, un replicón puede ser un plásmido de alto o bajo número de copias. Un plásmido de alto número de copias tendrá generalmente un número de copias que varía de aproximadamente 5 a aproximadamente 200 y habitualmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 150. Un huésped que contiene un plásmido de alto número de copias contendrá preferiblemente al menos aproximadamente 10 y, más preferiblemente, al menos aproximadamente 20 plásmidos. Puede seleccionarse un vector de alto o bajo número de copias dependiendo del efecto del vector y de la proteína extraña sobre el huésped.
Como alternativa, las construcciones de expresión pueden integrarse en el genoma bacteriano con un vector de integración. Los vectores de integración contienen habitualmente al menos una secuencia homóloga al cromosoma bacteriano que permite que el vector se integre. Las integraciones parecen ser el resultado de recombinaciones entre ADN homólogo en el vector y el cromosoma bacteriano. Por ejemplo, los vectores de integración construidos con ADN de diversas cepas de Bacillus se integran en el cromosoma de Bacillus (documento EP-A-0 127 328). Los vectores de integración también pueden estar compuestos por secuencias de bacteriófago o trans-
posón.
Habitualmente, las construcciones de expresión extracromosómicas y de integración pueden contener marcadores de selección para permitir la selección de cepas bacterianas que se hayan trasformado. Pueden expresarse marcadores de selección en el huésped bacteriano y pueden incluir genes que hacen a las bacterias resistentes a fármacos tales como ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, kanamicina (neomicina) y tetraciclina [Davies y col. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32: 469]. Los marcadores de selección también pueden incluir genes biosintéticos, tales como aquellos en las rutas biosintéticas de la histidina, triptófano y leucina. Como alternativa, algunos de los componentes desvelados anteriormente pueden ponerse juntos en vectores de transformación. Los vectores de transformación están compuestos habitualmente por un marcador de selección que se mantiene en un replicón o se desarrolla en un vector de integración como se ha desvelado anteriormente.
Se han desarrollado vectores de expresión y transformación, ya sean replicones extracromosómicos o vectores de integración, para su transformación en muchas bacterias. Por ejemplo, se han desarrollado vectores de expresión para, entre otras, las siguientes bacterias: Bacillus subtilis [Palva y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; documentos EP-A-0 036 259 y EP-A-0 063 953; WO 84/04541], Escherichia coli [Shimatake y col. (1981) Nature 292: 128; Amann y col. (1985) Gene 40: 183; Studier y col. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113; documentos EP-A-0 036 776,
EP-A-0 136 829 y EP-A-0 136 907], Streptococcus cremoris [Powell y col. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655]; Streptococcus lividans [Powell y col. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655], Streptomyces lividans [Patente de Estados Unidos 4.745.056].
Se conocen bien en la técnica procedimientos de introducción de ADN exógeno en huéspedes bacterianos y habitualmente incluyen la transformación de bacterias tratadas con CaCl_{2} u otros agentes, tales como cationes divalentes y DMSO. También puede introducirse ADN en células bacterianas por electroporación. Los procedimientos de transformación variarán habitualmente con la especie bacteriana que se vaya a transformar. Véase, por ejemplo, [Masson y col. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60: 273; Palva y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; documentos EP-A-0 036 259 y EP-A-0 063 953; WO 84/04541, Bacillus], [Miller y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 856; Wang y col. (1990) J Bacteriol. 172: 949, Campylobacter], [Cohen y col. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 69: 2110; Dower y col. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 6127; Kushner (1978) "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColE1-derived plasmids. En Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (eds. H. W. Boyer y S. Nicosia); Mandel y col. (1970) J. Mol. Biol. 53: 159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949: 318; Escherichia], [Chassy y col. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44: 173 Lactobacillus]; [Fiedler y col. (1988) Anal. Biochem 170: 38, Pseudomonas]; [Augustin y col. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66: 203, Staphylococcus], [Barany y col. (1980) J. Bacteriol. 144: 698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, en: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti y R. Curtiss III); Perry y col. (1981) Infect. Immun. 32: 1295; Powell y col. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655; Somkuti y col. (1987) Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1: 412, Streptococcus].
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v. Expresión en Levaduras
El especialista en la técnica también conoce sistemas de expresión en levaduras. Un promotor de levadura es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a una ARN polimerasa de levadura e iniciar la transcripción cadena abajo (3') de una secuencia codificante (por ejemplo, gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de la transcripción que habitualmente se sitúa proximal al extremo 5' de la secuencia codificante. Esta región de inicio de la transcripción incluye habitualmente un sitio de unión a ARN polimerasa (la "Caja TATA") y un sitio de inicio de la transcripción. Un promotor de levadura también puede tener un segundo dominio denominado secuencia activadora cadena arriba (UAS) que, si está presente, habitualmente está distal al gen estructural. La UAS permite una expresión regulada (inducible). Se produce una expresión constitutiva en ausencia de UAS. La expresión regulada puede ser positiva o negativa, aumentando o reduciendo por lo tanto la transcripción.
La levadura es un organismo fermentador con una ruta metabólica activa, por lo tanto las secuencias que codifican enzimas de la ruta metabólica proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen alcohol deshidrogenasa (ADH) (documento EP-A-0 284 044), enolasa, glucoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAP o GAPDH), hexoquinasa, fosfofructoquinasa, 3-fosfoglicerato mutasa y piruvato quinasa (PyK) (documento EPO-A-0 329 203). El gen PHOS de levadura, que codifica la fosfatasa ácida, también proporciona secuencias promotoras útiles [Myanohara y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1].
Además, promotores sintéticos que no aparecen en la naturaleza también funcionan como promotores de levaduras. Por ejemplo, pueden unirse secuencias UAS de un promotor de levadura con la región de activación de la transcripción de otro promotor de levadura, generando un promotor híbrido sintético. Los ejemplos de dichos promotores híbridos incluyen la secuencia reguladora de la ADH unida a la región de activación de la transcripción de GAP (Patentes de Estados Unidos Nº 4.876.197 y 4.880.734). Otros ejemplos de promotores híbridos incluyen promotores constituidos por las secuencias reguladoras de los genes ADH2, GAL4, GAL10 o PH05, combinados con la región de activación de la transcripción de un gen de enzima glicolítica tal como GAP o PyK (documento EP-A-0 164 556). Además, un promotor de levadura puede incluir promotores de origen natural de origen no de levadura que tengan la capacidad de unirse a una ARN polimerasa de levadura e iniciar la transcripción. Los ejemplos de dichos promotores incluyen, entre otros, [Cohen y col. (1980) Proc. Natl. Acad Sci. USA 77: 1078; Henikoff y col. (1981) Nature 283: 835; Hollenberg y col. (1981) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96: 119; Hollenberg y col. (1979) "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae", en: Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (eds. K. N. Timmis y A. Puhler); Mercerau-Puigalon y col. (1980) Gene 11: 163; Panthier y col. (1980) Curr. Genet. 2: 109].
Una molécula de ADN puede expresarse intracelularmente en levaduras. Una secuencia promotora puede unirse directamente con la molécula de ADN, en cuyo caso el primer aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína recombinante siempre será una metionina, que está codificada por el codón de inicio ATG. Si se desea, puede escindirse de la proteína la metionina en el extremo N-terminal por incubación in vitro con bromuro de cianógeno.
Las proteínas de fusión proporcionan una alternativa para sistemas de expresión en levaduras así como en sistemas de expresión de mamíferos, baculovirus y bacterianos. Habitualmente, una secuencia de ADN que codifica la porción N-terminal de una proteína de levadura endógena u otra proteína estable se fusiona al extremo 5' de las secuencias codificantes heterólogas. Tras la expresión, esta construcción proporcionará una fusión de las dos secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, el gen de la superóxido dismutasa (SOD) de levadura o humana puede unirse al extremo 5' terminal de un gen extraño y expresarse en levaduras. La secuencia de ADN en la unión de las dos secuencias de aminoácidos puede o no codificar un sitio escindible. Véase, por ejemplo, el documento EP-A-0 196 056. Otro ejemplo, es una proteína de fusión con ubiquitina. Dicha proteína de fusión está compuesta por la región de ubiquitina que preferiblemente conserva un sitio para una enzima de procesamiento (por ejemplo, una proteasa de procesamiento específica de ubiquitina) para escindir la ubiquitina de la proteína extraña. Mediante este procedimiento, por lo tanto, puede aislarse una proteína extraña nativa (por ejemplo, el documento WO88/024066).
Como alternativa, también pueden secretarse proteínas extrañas desde la célula hacia el medio de cultivo por generación de moléculas de ADN quiméricas que codifican una proteína de fusión compuesta por un fragmento de secuencia líder que proporciona la secreción en levaduras de la proteína extraña. Preferiblemente, existen sitios de procesamiento codificados entre el fragmento líder y el gen extraño que pueden escindirse in vivo o in vitro. El fragmento de secuencia líder codifica habitualmente un péptido señal compuesto por aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína desde la célula.
Puede obtenerse ADN que codifique secuencias señal adecuadas a partir de genes para proteínas de levadura secretadas, tales como el gen de la invertasa de levadura (documento EP-A-0 012 873; documento JPO. 62.096.086) y el gen del factor A (Patente de Estados Unidos 4.588.684). Como alternativa, existen líderes de origen no de levadura tales como un líder de interferón que también proporcionan la secreción en levaduras (documento EP-A-0 060 057).
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Una clase preferida de líderes de secreción son los que emplean un fragmento del gen del factor alfa de levaduras que contiene tanto una "pre"-secuencia señal como una "pro"-región. Los tipos de fragmentos de factor alfa que pueden emplearse incluyen el pre-pro-líder de factor alfa de longitud completa (de aproximadamente 83 restos aminoacídicos) así como líderes de factor alfa truncados (habitualmente de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 restos aminoacídicos) (Patentes de Estados Unidos 4.546.083 y 4.870.008; documento EP-A-0 324 274). Los líderes adicionales que emplean un fragmento del líder de factor alfa que proporciona la secreción incluyen líderes de factor alfa híbrido compuestos por una presecuencia de una primera levadura pero una pro-región de un segundo factor alfa de levadura (por ejemplo, véase el documento WO 89/02463).
Habitualmente, las secuencias de terminación de la transcripción reconocidas por levaduras son regiones reguladoras localizadas 3' al codón de terminación de la traducción y, por lo tanto, junto con el promotor flanquean la secuencia codificante. Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm que puede traducirse en el polipéptido codificado por el ADN. Los ejemplos de secuencia de terminación de la transcripción y otras secuencias de terminación reconocidas por levaduras tales como los que codifican enzimas glicolíticas.
Habitualmente, los componentes desvelados anteriormente, que comprenden un promotor, un líder (si se desea), una secuencia codificante de interés y una secuencia de terminación de la transcripción se ponen juntos en construcciones de expresión. Las construcciones de expresión se mantienen con frecuencia en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaz de un mantenimiento estable en un huésped, tal como levaduras o bacterias. El replicón puede tener dos sistemas de replicación, permitiendo de este modo que se mantenga, por ejemplo, en levaduras para su expresión y en un huésped procariota para la clonación y amplificación. Los ejemplos de dichos vectores lanzadera de levaduras-bacterias incluyen YEp24 [Botstein y col. (1979) Gene 8: 17-24], pCl/l [Brake y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci USA 81: 4642-4646] e YRp17 [Stinchcomb y col. (1982) J. Mol. Biol. 158: 157]. Además, un replicón puede ser un plásmido de alto o bajo número de copias. Un plásmido de alto número de copias tendrá generalmente un número de copias que varía de aproximadamente 5 a aproximadamente 200 y habitualmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 150. Un huésped que contiene un plásmido alto número de copias tendrá preferiblemente al menos aproximadamente 10 y más preferiblemente al menos aproximadamente 20. Puede seleccionarse un vector de alto o bajo número de copias dependiendo del efecto del vector y de la proteína extraña sobre el huésped. Véase, por ejemplo, Brake y col. anteriormente.
Como alternativa, las construcciones de expresión pueden integrarse en el genoma de levadura con un vector de integración. Los vectores de integración contienen habitualmente al menos una secuencia homóloga con un cromosoma de levadura que permite que el vector se integre y, preferiblemente, contienen dos secuencias homólogas que flanquean la construcción de expresión. Las integraciones parecen ser el resultado de recombinaciones entre el ADN homólogo en el vector y el cromosoma de levadura [Orr-Weaver y col. (1983) Methods in Enzymol. 101: 228-245]. Un vector de integración puede dirigirse a un locus específico en levadura por selección de la secuencia homóloga apropiada para su inclusión en el vector. Véase Orr-Weaver y col. anteriormente. Pueden integrarse una o más construcciones de expresión, afectando posiblemente a los niveles de proteína recombinante producida [Rine y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6750]. Las secuencias cromosómicas incluidas en el vector pueden aparecer como un solo segmento en el vector, que da como resultado la integración del vector completo, o dos segmentos homólogos a segmentos adyacentes en el cromosoma y que flanquean la construcción de expresión en el vector, que puede dar como resultado una integración estable de sólo la construcción de expresión. Habitualmente, las construcciones de expresión extracromosómicas y de integración pueden contener marcadores de selección para permitir la selección de cepas de levadura que se hayan transformado. Los marcadores de selección pueden incluir genes biosintéticos que pueden expresarse en el huésped de levadura, tales como ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 y ALG7 y el gen de resistencia a G418, que confieren resistencia en células de levadura a tunicamicina y G418, respectivamente. Además, un marcador de selección adecuado también puede proporcionar a la levadura la capacidad de crecer en presencia de compuestos tóxicos, tales como metal. Por ejemplo, la presencia de CUP1 permite a la levadura crecer en presencia de iones cobre [Butt y col. (1987) Microbiol, Rev. 51: 351].
Como alternativa, algunos de los componentes desvelados anteriormente pueden ponerse juntos en vectores de transformación. Los vectores de transformación están compuestos habitualmente por un marcador de selección que se mantiene en un replicón o se desarrolla en un vector de integración, como se ha desvelado anteriormente.
Se han desarrollado vectores de expresión y transformación, ya sean replicones extracromosómicos o vectores de integración, para la transformación en muchas levaduras. Por ejemplo, se han desarrollado vectores de expresión para, entre otras, las siguientes levaduras: Candida albicans [Kurtz, y col. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 142], Candida maltosa [Kunze, y col. (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141], Hansenula polymorpha [Gleeson, y col. (1986) J. Gen. Microbiol. 132: 3459; Roggenkamp y col. (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 302], Kluyveromyces fragilis [Das, y col. (1984) J. Bacteriol. 158: 1165], Kluyveromyces lactis [De Louvencourt y col. (1983) J. Bacteriol. 154: 737; Van den Berg y col. (1990) Bio/Technology 8: 135], Pichia guillerimondii [Kunze y col. (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141], Pichia pastoris [Cregg, y col. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376; Patentes de Estados Unidos 4.837.148 y 4.929.555], Saccharomyces cerevisiae [Hinnen y col. (1978) Proc. Natl. Acad Sci. USA 75: 1929; Ito y col. (1983) J. Bacteriol. 153: 163], Schizosaccharomyces pombe [Beach y Nurse (1981) Nature 300: 706], y Yarrowia lipolytica [Davidow, y col. (1985) Curr. Genet. 10: 380471 Gaillardin, y col. (1985) Curr. Genet. 10: 49].
Se conocen bien en la técnica procedimientos de introducción de ADN exógeno en huéspedes de levadura y habitualmente incluyen la transformación de esferoplastos o de células de levadura intactas tratadas con cationes alcalinos. Los procedimientos de transformación varían habitualmente con la especie de levadura que se va a transformar. Véase, por ejemplo, [Kurtz y col. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 142; Kunze y col. (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141; Candida]; [Gleeson y col. (1986) J. Gen. Microbiol. 132: 3459; Roggenkamp y col. (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 302; Hansenula]; [Das y col. (1984) J. Bacteriol. 158: 1165; De Louvencourt y col. (1983) J. Bacteriol. 154: 1165; Van den Berg y col. (1990) Bio/Technology 8: 135; Kluyveromyces]; [Cregg y col. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376; Kunze y col. (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141; Patentes de Estados Unidos Nº 4.837.148 y 4.929.555; Pichia]; [Hinnen y col. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75; 1929; Ito y col. (1983) J. Bacteriol. 153: 163 Saccharomyces]; [Beach y Nurse (1981) Nature 300: 706; Schizosaccharomyces]; [Davidow y col. (1985) Curr. Genet. 10: 39; Gaillardin y col. (1985) Curr. Genet. 10: 49; Yarrowia].
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Anticuerpos
Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido o grupo de polipéptidos compuestos por al menos un sitio de combinación de anticuerpo. Un "sitio de combinación de anticuerpo" es el espacio de unión tridimensional con una forma de superficie interna y una distribución de carga complementaria a las características de un epítope de un antígeno, que permite una unión del anticuerpo con el antígeno. El término "anticuerpo" incluye, por ejemplo, anticuerpos de vertebrados, anticuerpos híbridos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos modificados, anticuerpos univalentes, proteínas de Fab y anticuerpos de dominio único.
Los anticuerpos contra las proteínas de la invención son útiles para cromatografía de afinidad, inmunoensayos y distinguir/identificar proteínas de estreptococos.
Pueden prepararse anticuerpos contra las proteínas de la invención, tanto policlonales como monoclonales, por procedimientos convencionales. En general, la proteína se usa primero para inmunizar un animal adecuado, preferentemente un ratón, rata, conejo o cabra. Se prefieren conejos y cabras para la preparación de sueros policlonales debido al volumen de suero que puede obtenerse y a la disponibilidad de anticuerpos anti-conejo y anti-cabra marcados. La inmunización se realiza generalmente por mezcla o emulsión de la proteína en solución salina, preferiblemente en un adyuvante tal como adyuvante completo de Freund, e inyección de la mezcla o emulsión por vía parenteral (generalmente, por vía subcutánea o intramuscular). Típicamente es suficiente una dosis de 50-200 \mug/inyección. La inmunización se refuerza generalmente 2-6 semanas después con una o más inyecciones de la proteína en solución salina, preferiblemente usando adyuvante incompleto de Freund. Como alternativa, se pueden generar anticuerpos por inmunización in vitro usando procedimientos conocidos en la técnica, que para los fines de esta invención se consideran equivalentes a una inmunización in vivo. Se obtienen antisueros policlonales por extracción de sangre del animal inmunizado en un recipiente de vidrio o plástico, incubación de la sangre a 25ºC durante una hora, seguido de incubación a 4ºC durante 2-18 horas. El suero se recupera por centrifugación (por ejemplo, 1.000 g durante 10 minutos). Pueden obtenerse aproximadamente 20-50 ml por extracción de sangre de conejos.
Se preparan anticuerpos monoclonales usando el procedimiento convencional de Kohler y Miltein [Nature (1975) 256: 495-96], o una modificación del mismo. Típicamente, un ratón o rata se inmuniza como se ha desvelado anteriormente. Sin embargo, más que extraer sangre del animal para extraer suero, se extirpa el bazo (y opcionalmente varios ganglios linfáticos de gran tamaño) y se disocia en células individuales. Si se desea, las células de bazo pueden explorarse (después de la eliminación de células inespecíficamente adherentes) por aplicación de una suspensión celular en una placa o pocillo recubierto con el antígeno proteico. Las células B que expresan inmunoglobulina unida a membrana específica para el antígeno se unen a la placa y no se eliminan por aclarado con el resto de la suspensión. Las células B resultantes, o todas las células de bazo disociadas, se inducen después para fusionarse con células de mieloma para formar hibridomas y se cultivan en un medio selectivo (por ejemplo, medio de hipoxantina, aminopterina, timidina, "HAT"). Los hibridomas resultantes se siembran en placas por dilución limitante y se ensayan para determinar la producción de anticuerpos que se unen específicamente al antígeno inmunizante (y que no se unen a antígenos no relacionados). Después, los hibridomas que secretan MAb seleccionados se cultivan in vitro (por ejemplo, en frascos de cultivo de tejido o reactores de fibras huecas) o in vivo (como ascitis en ratones).
Si se desea, los anticuerpos (ya sean policlonales o monoclonales) pueden marcarse usando técnicas convencionales. Los marcadores adecuados incluyen fluoróforos, cromóforos, átomos radiactivos (particularmente ^{32}P y ^{125}I), reactivos electrodensos, enzimas y ligandos que tienen compañeros de unión específicos. Típicamente las enzimas se detectan por su actividad. Por ejemplo, habitualmente se detecta la peroxidasa de rábano picante por su capacidad para convertir la 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) en un pigmento azul cuantificable con un espectrofotómetro. La expresión "compañero de unión específica" se refiere a una proteína capaz de unirse a una molécula de ligando con alta especificidad, como por ejemplo en el caso de un antígeno y un anticuerpo monoclonal específico para el mismo. Otros compañeros de unión específica incluyen biotina y avidina o estreptavidina, IgG y proteína A y las numerosas parejas de recetor-ligando conocidas en la técnica. Debería entenderse que la descripción anterior no pretende categorizar los diversos marcadores en distintas clases, puesto que el mismo marcador puede servir de varios modos diferentes. Por ejemplo, el ^{125}I puede servir como un marcador radiactivo o como un reactivo electrodenso. La HRP puede servir como enzima o como antígeno para un MAb. Además, se pueden combinar diversos marcadores para el efecto deseado. Por ejemplo, los MAb y la avidina también requieren marcadores en la práctica de esta invención: por lo tanto, se puede marcar un MAb con biotina y detectar su presencia con avidina marcada con ^{125}I o con un MAb anti-biotina marcado con HRP. Otras combinaciones y posibilidades serán fácilmente evidentes para los especialistas en la técnica y se consideran equivalentes dentro del alcance de la presente invención.
Composiciones Farmacéuticas
Las composiciones farmacéuticas pueden comprender polipéptidos, anticuerpos o ácidos nucleicos de la invención. Las composiciones farmacéuticas comprenderán una cantidad terapéuticamente eficaz de polipéptidos, anticuerpos o polinucleótidos de la invención que se reivindica.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en este documento, se refiere a una cantidad de un agente terapéutico para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afección deseada o para presentar un efecto terapéutico o preventivo detectable. El efecto puede detectarse, por ejemplo, mediante marcadores químicos o niveles de antígeno. Los efectos terapéuticos también incluyen la reducción de los síntomas físicos, tal como una temperatura corporal disminuida. La cantidad eficaz exacta para un sujeto dependerá del tamaño y de la salud del sujeto, de la naturaleza y el grado de la afección y del compuesto terapéutico o combinación de compuestos terapéuticos seleccionados para su administración. Por lo tanto, no es útil especificar una cantidad eficaz exacta por adelantado. Sin embargo, la cantidad eficaz para una situación dada puede determinarse mediante una experimentación de rutina y es a juicio del médico.
Para fines de la presente invención, una dosis eficaz será de aproximadamente 0,01 mg/kg a 50 mg/kg o de 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de la molécula de la invención en el individuo al que se administra.
Una composición farmacéutica también puede contener un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo para la administración de un agente terapéutico, tal como anticuerpos o un polipéptido, genes y otros agentes terapéuticos. El término se refiere a cualquier vehículo farmacéutico que por sí mismo no induce la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición y que puede administrarse sin una toxicidad indebida. Los vehículos adecuados pueden ser macromoléculas de gran tamaño lentamente metabolizadas tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivas. Dichos vehículos se conocen bien por los especialistas en la técnica.
Pueden usarse sales farmacéuticamente aceptables en el mismo, por ejemplo, sales de ácidos minerales tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Está disponible una discusión minuciosa de excipientes farmacéuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N. J. 1991).
Los vehículos farmacéuticamente aceptables en composiciones terapéuticas pueden contener líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Además, pueden estar presentes en dichos excipientes sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes de pH y similares. Típicamente, las composiciones terapéuticas se preparan como inyectables, como soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución en o suspensión en excipientes líquidos antes de la inyección. Se incluyen los liposomas dentro de la definición de un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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Procedimientos de Suministro
Una vez formuladas, las composiciones de la invención pueden administrarse directamente al sujeto. Los sujetos a tratar pueden ser animales; en particular, pueden tratarse sujetos humanos.
El suministro directo de las composiciones se logrará generalmente por inyección, por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular o suministro al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también pueden administrarse en una lesión. Otros modos de administración incluyen la administración oral y pulmonar, supositorios y aplicaciones transdérmicas o transcutáneas (por ejemplo, véase el documento WO98/20734), agujas y pistolas génicas o pulverizaciones hipodérmicas (hyposprays). El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa multidosis.
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Vacunas
Las vacunas de acuerdo con la invención pueden ser profilácticas (es decir, para prevenir una infección) o terapéuticas (es decir, para tratar una enfermedad después de una infección).
Dichas vacunas comprenden un antígeno o antígenos, inmunógeno o inmunógenos, polipéptido o polipéptidos, proteína o proteínas o ácido nucleico inmunizante, habitualmente en combinación con "vehículos farmacéuticamente aceptables", que incluyen cualquier vehículo que por sí mismo no induce la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición. Los vehículos adecuados son típicamente macromoléculas de gran tamaño lentamente metabolizadas tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados lipídicos (tales como gotas de aceite o liposomas), y partículas de virus inactivas. Dichos vehículos son bien conocidos para los especialistas en la técnica. Además, estos vehículos pueden funcionar como agentes inmunoestimulantes ("adyuvantes"). Además, el antígeno o inmunógeno puede
conjugarse con un toxoide bacteriano, tal como un toxoide de patógenos de difteria, tétanos, cólera, H. pylori, etc.
Los adyuvantes preferidos para aumentar la eficacia de la composición incluyen, pero sin limitación: (1) formulaciones de emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos tales como péptidos de muramilo (véase a continuación) o componentes de pared celular bacteriana), tales como por ejemplo (a) MF59^{TM} (documento WO90/14837; Capítulo 10 en Vaccine Design - the subunit and adjuvant approach (1995) ed. Powell y Newman), que contiene escualeno al 5%, Tween 80 al 0,5% y Span 85 al 0,5% (que contiene opcionalmente MTP-PE) formulado en partículas submicrométricas usando un fluidizador, (b) SAF, que contiene escualeno al 10%, Tween 80 al 0,4%, polímero L121 bloqueado con plurónico al 5% y thr-MDP microfluidizado en una emulsión submicrométrica o agitado vorticialmente para generar una emulsión de mayor tamaño de partícula y (c) sistema adyuvante Ribi^{TM} (RAS), (RibiImmunochem, Hamilton, MT) que contiene escualeno al 2%, Tween 80 al 0,2% y uno o más componentes de pared celular bacteriana del grupo constituido por monofosforil lípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS), preferiblemente MPL + CWS (Detox^{TM}); (2) pueden usarse adyuvantes de saponina, tales como QS21 o Stimulon^{TM} (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) o partículas generadas a partir de los mismos tales ISCOM (complejos inmunoestimulantes), pudiendo estar los ISCOM desprovistos de detergente adicional, por ejemplo, documento WO00/07621; (3) Adyuvante Completo de Freund (CFA) y Adyuvante Incompleto de Freund (IFA); (4) citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (documento WO99/44636), etc.), interferones (por ejemplo, interferón gamma), factor estimulante de colonias de macrofágos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), etc.; (5) monofosforil lípido A (MPL) o MPL 3-O-desacilado (3dMPL) por ejemplo, documentos GB-2220221, EP-A-0689454; (6) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua, por ejemplo, documentos EP-A-0835318, EP-A-0735898, EP-A-0761231; (7) oligonucleótidos que comprenden motivos CpG [Krieg Vaccine 2000, 19, 618-622; Krieg Curr opin Mol Ther 2001 3: 15-24; Roman y col., Nat. Med., 1997, 3, 849-854; Weiner y col., PNAS USA, 1997, 94, 10833-10837; Davis y col., J. Immunol., 1998, 160, 870-876; Chu y col., J. Exp. Med., 1997, 186, 1623-1631; Lipford y col., Eur. J. Immunol., 1997, 27, 2340-2344; Moldoveanu y col., Vaccine, 1988, 16, 1216-1224, Krieg y col., Nature, 1995, 374, 546-549; Klinman y col., PNAS USA, 1996,93,2879-2883; Ballas y col., J. Immunol., 1996, 157,1840-1845; Cowdery y col., J. Immunol., 1996, 156, 4570-4575; Halpern y col., Cell. Immunol., 1996, 167, 72-78; Yamamoto y col., Jpn. J. Cancer Res., 1988, 79, 866-873; Stacey y col., J. Immunol., 1996, 157, 2116-2122; Messina y col., J. Immunol., 1991, 147, 1759-1764; Yi y col., J. Immunol., 1996, 157, 4918-4925; Yi y col., J. Immunol., 1996, 157, 5394-5402; Yi y col., J. Immunol., 1998, 160, 4755-4761; y Yi y col., J. Immunol., 1998, 160, 5898-5906; solicitudes de patente internacional WO96/02555, WO98/16247, W098/188 10, WO98/40100, WO98/55495, WO98/37919 y WO98/52581] es decir, que contienen al menos un dinucleótido CG, usándose opcionalmente 5-metilcitosina en lugar de citosina; (8) un éter de polioxietileno o un éster de polioxietileno, por ejemplo, documento WO99/52549; (9) un tensioactivo de éster de polioxietilensorbitán en combinación con un octoxinol (por ejemplo, documento WO01/21207) o un tensioactivo de éter o éster de alquilo de polioxietileno en combinación con al menos un tensioactivo no iónico adicional tal como octoxinol (por ejemplo, documento WO01/21152); (10) un oligonucleótido inmunoestimulador (por ejemplo, un oligonucleótido de CpG) y una saponina, por ejemplo, documento WO00/62800; (11) un inmunoestimulante y una partícula de sal de metal, por ejemplo, documento WO00/23105; (12) una saponina y una emulsión de aceite en agua, por ejemplo, documento WO99/11241; (13) una saponina, (por ejemplo, QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + un esterol), por ejemplo, documento WO98/57659; (14) sales de aluminio, preferiblemente hidróxido o fosfato, pero también puede usarse cualquier otra sal adecuada (por ejemplo, hidroxifosfato, oxihidróxido, ortofosfato, sulfato, etc. [por ejemplo, véanse los capítulos 8 y 9 de Powell y Newman]). También pueden usarse mezclas de sales de aluminio diferentes. La sal puede adoptar cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.); (15) otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes para aumentar la eficacia de la composición. Se prefieren sales de aluminio y/o MF59^{TM}.
Como se ha mencionado anteriormente, los péptidos de muramilo incluyen, pero sin limitación, N-acetil-muramil-L-treonil-D-iso-glutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1',2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.
Las composiciones inmunógenas (por ejemplo, el antígeno/inmunógeno/polipéptido/proteína/ácido nucleico inmunizante, el vehículo farmacéuticamente aceptable y el adyuvante) contendrán típicamente diluyentes, tales como agua, solución salina, glicerol, etanol, etc. Además, pueden estar presentes en dichos excipientes sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes del pH y similares.
Típicamente, las composiciones inmunógenas se preparan como inyectables, como soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse o encapsularse en liposomas para un efecto adyuvante potenciado, como se ha analizado anteriormente en vehículos farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones inmunógenas usadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de los polipéptidos antigénicos o inmunógenos, así como cualquier otro de los componentes mencionados anteriormente según sea necesario. Por "cantidad inmunológicamente eficaz" se entiende que la administración de esa cantidad a un individuo, en una sola dosis o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o la prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y del estado físico del individuo a tratar, del grupo taxonómico del individuo al tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), de la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, del grado de protección deseado, de la formulación de la vacuna, de la evaluación de la situación médica del médico que lo trate y otros factores pertinentes. Se espera que la cantidad estará en un intervalo relativamente amplio que puede terminarse mediante ensayos de rutina.
Las composiciones inmunógenas se administran convenientemente por vía parenteral, por ejemplo, por inyección, por vía subcutánea, intramuscular o transdérmica/transcutánea (por ejemplo, documento WO98/20734). Las formulaciones adicionales adecuadas para otros modos de administración incluyen formulaciones orales y pulmonares, supositorios y aplicaciones transdérmicas. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa multidosis. La vacuna puede administrarse junto con otros agentes inmunorreguladores.
Como alternativa a vacunas basadas en proteínas, puede usarse vacunación con ADN [por ejemplo, Robinson y Torres (1997) Seminars in Immunol. 9: 271-283; Donnelly y col. (1997) Annu Rev Immunol 15: 617-648; posteriormente en este documento].
Vehículos de Suministro de Genes
Pueden administrarse por vía local o sistémica vehículos de terapia génica para suministro de construcciones que incluyen una secuencia codificante de un compuesto terapéutico de la invención, que se va a suministrar al mamífero para la expresión en el mamífero. Estas construcciones pueden utilizar estrategias de vectores virales o no virales en una modalidad in vivo o ex vivo. La expresión de dicha secuencia codificante puede inducirse usando promotores de mamífero endógenos o heterólogos. La expresión de la secuencia codificante in vivo puede ser constitutiva o regulada.
La invención incluye vehículos de suministro de genes capaces de expresar las secuencias de ácido nucleico que se contemplan. El vehículo de suministro de genes es preferiblemente un vector viral y, más preferiblemente, un vector retroviral, adenoviral, de virus adenoasociado (AAV), herpesvirus o alfavirus. El vector viral también puede ser un astrovirus, coronavirus, ortomixovirus, papovavirus, paramixovirus, parvovirus, picornavirus, poxvirus o togavirus. Véase, en general, Jolly (1994) Cancer Gene Therapy 1: 51-64; Kimura (1994) Human Gene Therapy 5: 845-852; Connelly (1995) Human Gene Therapy 6: 185-193; y Kaplitt (1994) Nature Genetics 6: 148-153.
Se conocen bien en la técnica vectores retrovirales y se contempla que puede emplearse en la invención cualquier vector de terapia génica retroviral, incluyendo retrovirus tipos B, C y D, retrovirus xenotrópicos (por ejemplo, NZB-X1, NZB-X2 y NZB9-1 (véase O'Neill (1985) J Virol. 53: 160), retrovirus politrópicos, por ejemplo MCF y MCF-MLV (véase Kelly (1983) J. Virol. 45: 291), espumavirus y lentivirus. Véase RNA Tumor Viruses, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory 1985.
Pueden obtenerse porciones del vector de terapia génica retroviral de diferentes retrovirus. Por ejemplo, pueden obtenerse LTR de retrovector de un Virus de Sarcoma Murino, un sitio de unión a ARNt de un Virus de Sarcoma de Rous, una señal de empaquetamiento de un Virus de Leucemia Murina y un origen de síntesis de segunda cadena a partir de un Virus de Leucosis Aviar.
Éstos vectores retrovirales recombinantes pueden usarse para generar partículas de vectores retrovirales competentes para la traducción por introducción de los mismos en líneas celulares de empaquetamiento apropiadas (véase la Patente de Estados Unidos Nº 5.591.624). Pueden construirse vectores retrovirales para integración específica de sitio en ADN de célula huésped por incorporación de una enzima integrasa quimérica en la partícula retroviral (véase el documento WO96/37626). Es preferible que el vector viral recombinante sea un virus recombinante de replicación defectuosa.
Se conocen bien en la técnica líneas celulares de empaquetamiento adecuadas para el uso con los vectores retrovirales desvelados anteriormente, se preparan fácilmente (véanse los documentos WO95/30763 y WO92/05266) y pueden usarse para generar líneas celulares productoras (también denominadas líneas celulares de vector o "VCL") para la producción de partículas de vector recombinantes. Preferiblemente, las líneas de células de empaquetamiento se preparan a partir de células parentales humanas (por ejemplo, células HT1080) o líneas de células parentales de visón, que descarta la inactivación en suero humano.
Los retrovirus preferidos para la construcción de vectores de terapia génica retrovirales incluyen Virus de la Leucosis Aviar, Virus de la Leucemia Bovina, Virus de la Leucemia Murina, Virus Inductor de Focos en Células de Visón, Virus de Sarcoma Murino, Virus de la Reticuloendoteliosis y Virus del Sarcoma de Rous. Los Virus de Leucemia Murina particularmente preferidos incluyen 4070A y 1504A (Hartley y Rowe (1976) J Virol 19: 19-25), Abelson (ATCC Nº VR-999), Friend (ATCC Nº VR-245), Graffi, Gross (ATCC Nº VR-590), Kirsten, Virus del Sarcoma de Harvey y Rauscher (ATCC Nº VR-998) y Virus de la Leucemia Murina de Moloney (ATCC Nº VR-190). Dichos retrovirus pueden obtenerse a partir de depósitos o colecciones tales como la Colección Americana de Cultivos Tipo ("ATCC") en Rockville, Maryland o aislarse de fuentes conocidas usando técnicas comúnmente disponibles.
Los vectores de terapia génica retrovirales conocidos ejemplares que pueden emplearse en esta invención incluyen los desvelados en las solicitudes de patente GB2200651, EP0415731, EP0345242, EP0334301, WO89/02468; WO89/05349 WO89/09271, WO90/02806, WO90/07936, WO94/03622, WO93/25698, WO93/25234, WO93/11230, WO93/10218, WO91/02805, WO91/02825, WO95/07994, US 5.219.740, US 4.405.712, US 4.861.719, US 4.980.289, US 4.777.127, US 5.591.624. Véase también Vile (1993) Cancer Res 53: 3860-3864; Vile (1993) Cancer Res 53: 962-967; Ram (1993) Cancer Res 53 (1993) 83-88; Takamiya (1992) J Neurosci Res 33: 493-503; Baba (1993) J Neurosurg 79: 729-735; Mann (1983) Cell 33: 153; Cane (1984) Proc Natl Acad Sci 81: 6349; y Miller (1990) Human Gene Therapy 1.
También se conocen en la técnica y pueden emplearse en esta invención vectores de terapia génica adenovirales humanos. Véase, por ejemplo, Berkner (1988) Biotechniques 6: 616 y Rosenfeld (1991) Science 252: 431 y documentos WO93/07283, WO93/06223 y WO93/07282. Los vectores de terapia génica adenovirales conocidos ejemplares que pueden emplearse en esta invención incluyen los desvelados en los documentos a los que se ha hecho referencia anteriormente y en los documentos WO94/12649, WO93/03769, WO93/19191, WO94/28938, WO95/11984, WO95/00655 WO95/27071, WO95/29993, WO95/34671, WO96/05320, WO94/08026, WO94/11506 WO93/06223, WO94/24299, WO95/14102, WO95/24297, WO95/02697, WO94/28152, WO94/24299, WO95/09241, WO95/25807, WO95/05835, WO94/18922 y WO95/09654. Como alternativa, puede emplearse la administración de ADN unido a un adenovirus destruido como se describe en Curiel (1992) Hum. Gene Ther. 3: 147-154. Los vehículos de suministro de genes de la invención también incluyen vectores de virus asociados a adenovirus (AAV). Los ejemplos principales y preferidos de dichos vectores para el uso en esta invención son los vectores basados en AAV-2 desvelados en Srivastava, documento WO93/09239. Los vectores de AAV más preferidos comprenden las dos repeticiones terminales invertidas de AAV en las que las secuencias D nativas se modifican por sustitución de nucleótidos, de modo que se conservan al menos 5 nucleótidos nativos y hasta 18 nucleótidos nativos, preferiblemente al menos 10 nucleótidos nativos hasta 18 nucleótidos nativos, más preferiblemente 10 nucleótidos nativos y los nucleótidos restantes de la secuencia D se delecionan o sustituyen con nucléotidos no nativos. Las secuencias D nativas de las repeticiones terminales invertidas de AAV son secuencias de 20 nucleótidos consecutivos en cada repetición terminal invertida de AAV (es decir, existe una secuencia en cada extremo) que no están implicadas en la formación de HP. El nucleótido de sustitución no nativo puede ser cualquier nucleótido distinto del nucleótido que se encuentra en la secuencia D nativa en la misma posición. Otros vectores de AAV ejemplares que pueden emplearse son pWP-19, pWN-1, describiéndose ambos en Nahreini (1993) Gene 124: 257-262. Otro ejemplo de dicho vector de AAV es psub201 (véase Samulski (1987) J. Virol. 61: 3096). Otro vector de AAV ejemplar es el vector Double-D ITR. La construcción del vector Double-D ITR se describe en la Patente de Estados Unidos 5.478.745. Otros vectores más son los desvelados en la Patente de Estados Unidos 4.797.368 de Carter y la Patente de Estados Unidos 5.139.941 de Muzyczka, Patente de Estados Unidos 5.474.935 de Chartejee y documento WO94/288157 de Kotin. Un ejemplo adicional más de un vector de AAV que puede emplearse en esta invención es SSV9AFABTKneo, que contiene el potenciador de AFP y el promotor de albúmina y dirige la expresión predominantemente en el hígado. Su estructura y construcción se describen en Su (1996) Human Gene Therapy 7: 463-470. Se describen vectores de terapia génica de AAV adicionales en los documentos US 5.354.678, US 5.173.414, US 5.139.941 y US 5.252.479.
Los vectores de terapia génica de la invención también incluyen vectores de herpesvirus. Son ejemplos principales y preferidos vectores de virus herpes simple que contienen una secuencia que codifica un polipéptido de timidina quinasa tales como los desvelados en los documentos US 5.288.641 y EP0176170 (Roizman). Los vectores de virus herpes simple ejemplares adicionales incluyen HFEM/ICP6-LacZ desvelado en el documento WO95/04139 (Wistar Institute), pHSVIac desvelado en Geller (1988) Science 241: 1667-1669 y en los documentos WO90/09441 y WO92/07945, HSV Us3::pgC-lacZ desvelado en Fink (1992) Human Gene Therapy 3: 11-19 y HSV 7134, 2 RH 105 y GAL4 desvelados en el documento EP 0453242 (Breakefield), y los depositados en la ATTC con los números de acceso VR-977 y VR-260.
También se contemplan vectores de terapia génica de alfavirus que pueden emplearse en esta invención. Los vectores de alfavirus preferidos son vectores de virus Sindbis. Togavirus, virus del Bosque de Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), virus de Middleberg (ATCC VR-370), virus del Río Ross (ATCC VR-373; ATCC VR-1246), virus de la encefalitis equina venezolana (ATCC VR923; ATCC VR-1250; ATCC VR-1249; ATCC VR-532), y los desvelados en las Patentes de Estados Unidos 5.091.309, 5.217.879, y el documento WO92/10578. Más particularmente pueden emplearse los vectores de alfavirus desvelados en el documento US de Nº de Serie 08/405.627, presentado el 15 de marzo de 1995, y los documentos WO94/21792, WO92/10578, WO95/07994, US 5.091.309 y US 5.217.879. Dichos alfavirus pueden obtenerse de depósitos o colecciones tales como la ATCC en Rockville, Maryland o aislarse de fuentes conocidas usando técnicas comúnmente disponibles. Preferiblemente, se usan vectores de alfavirus con una citotoxicidad reducida (véase el documento USSN 08/679640).
También son útiles sistemas de vectores de ADN tales como sistemas de expresión en capas eucariotas para expresar los ácidos nucleicos de la invención. Véase el documento WO95/07994 para una descripción detallada de sistemas de expresión en capas eucariotas. Preferiblemente, los sistemas de expresión en capas eucariotas de la invención proceden de vectores de alfavirus y más preferiblemente de vectores virales Sindbis.
Otros vectores virales adecuados para el uso en la presente invención incluyen los derivados de poliovirus, por ejemplo, ATCC VR-58 y los desvelados en Evans, Nature 339 (1989) 385 y Sabin (1973) J Biol. Standardization 1: 115; rinovirus, por ejemplo ATCC VR-1110 y los desvelados en Arnold (1990) J Cell Biochem L401; poxvirus tales como el virus de la viruela del canario o virus vaccinia, por ejemplo ATCC VR-111 y ATCC VR-2010 y los desvelados en Fisher-Hoch (1989) Proc Natl Acad Sci 86: 317; Flexner (1989) Ann NY Acad Sci 569: 86, Flexner (1990) Vaccine 8: 17; en los documentos US 4.603.112 y US 4.769.330 y WO89/01973; virus SV40, por ejemplo ATCC VR-305 y los desvelados en Mulligan (1979) Nature 277: 108 y Madzak (1992) J Gen Virol 73: 1533; virus influenza, por ejemplo ATCC VR-797 y virus influenza recombinantes generados empleando técnicas de genética inversa como se describen en el documento US 5.166.057 y en Enami (1990) Proc Natl Acad Sci 87: 3802-3805; Enami y Palese (1991) J Virol 65: 2711-2713 y Luytjes (1989) Cell 59: 110, (véase también McMichael (1983) NEJ Med 309: 13; y Yap (1978) Nature 273: 238 y Nature (1979)277:108); virus de la inmunodeficiencia humana, como se describe en el documento EP-0386882 y en Buchschacher (1992) J. Virol. 66: 2731; virus del sarampión, por ejemplo ATCC VR-67 y VR-1247 y los desvelados en el documento EP-0440219; virus Aura, por ejemplo ATCC VR-368; virus Bebaru, por ejemplo ATCC VR-600 y ATCC VR-1240; virus Cabassou, por ejemplo ATCC VR-922; virus Chikungunya, por ejemplo ATCC VR-64 y ATCC VR-1241; virus Fort Morgan, por ejemplo ATCC VR-924; virus Getah, por ejemplo ATCC VR-369 y ATCC VR-1243; virus Kyzylagach, por ejemplo ATCC VR-927; virus Mayaro, por ejemplo ATCC VR-66; virus Mucambo, por ejemplo ATCC VR-580 y ATCC VR-1244; virus Ndumu, por ejemplo ATCC VR-371; virus Pixuna, por ejemplo ATCC VR-372 y ATCC VR-1245; virus Tonate, por ejemplo ATCC VR-925; virus Triniti, por ejemplo ATCC VR-469; virus Una, por ejemplo ATCC VR-374; virus Whataroa, por ejemplo ATCC VR-926; virus Y-62-33, por ejemplo ATCC VR-375; virus O'Nyong, virus de la encefalitis oriental, por ejemplo ATCC VR-65 y ATCC VR-1242; virus de la encefalitis occidental, por ejemplo ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622 y ATCC VR-1252; y coronavirus, por ejemplo ATCC VR-740 y los desvelados en Hamre (1966) Proc Soc Exp Biol Med 121: 190.
El suministro de las composiciones de esta invención en el interior de células no se limita a los vectores virales mencionados anteriormente. Pueden emplearse otros procedimientos y medios de suministro tales como, por ejemplo, vectores de expresión de ácidos nucleicos, ADN condensado policatiónico unido o no unido a un adenovirus destruido en solitario, por ejemplo, véase el documento US de Nº de Serie 08/366.787, presentado el 30 de diciembre de 1994 y Curiel (1992) Hum Gene Ther 3: 147-157, ADN ligado a ligando, por ejemplo véase Wu (1989) J Biol Chem 264: 16985-16987, células de vehículo de suministro de células eucariotas, por ejemplo, véase el documento US de Nº de Serie 08/240.030, presentado el 9 de mayo de 1994, y el documento US de Nº Serie 08/404.796, deposición de materiales de hidrogel fotopolimerizado, pistola de partículas de transferencia génica portátil, como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.149.655, radiación ionizante como se describe en los documentos US 5.206.152 y WO92/11033, neutralización de carga de ácido nucleico o fusión con membranas celulares. Se describen estrategias adicionales en Philip (1994) Mol Cell Biol 14: 2411-2418 y en Woffendin (1994) Proc Natl Acad Sci 91:
1581-1585.
Puede emplearse transferencia génica mediada por partículas, por ejemplo, véase el documento US de Nº de Serie 60/023.867. En resumen, la secuencia puede insertarse en vectores convencionales que contengan secuencias de control convencionales para una expresión de alto nivel y después incubarse con moléculas de transferencia génica sintéticas tales como cationes de unión a ADN poliméricos como polilisina, protamina y albúmina, unidos a ligandos de dirección celular tales como asialoorosomucoide, como se describe en Wu y Wu (1987) J Biol. Chem. 262: 4429-4432, insulina, como se describe en Hucked (1990) Biochem Pharmacol 40: 253-263, galactosa como se describe en Plank (1992) Bioconjugate Chem 3: 533-539, lactosa o transferrina.
También puede emplearse ADN desnudo. Se describen procedimientos de introducción de ADN desnudo ejemplares en los documentos WO 90/11092 y US 5.580.859. Puede mejorarse la eficacia de captación usando perlas de látex biodegradable. Las perlas de látex recubiertas con ADN se transportan eficazmente al interior de células después del inicio de endocitosis por las perlas. El procedimiento puede mejorarse adicionalmente por tratamiento de las perlas para aumentar la hidrofobicidad y por lo tanto facilitar la alteración del endosoma y la liberación del ADN hacia el citoplasma.
Se describen liposomas que pueden actuar como vehículos de suministro de genes en los documentos en US 5.422.120, WO95/13796, WO94/23697, WO91/14445 y EP-524.968. Como se describe en el documento USSN. 60/023.867, en el suministro no viral, las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido pueden insertarse en vectores convencionales que contengan secuencias de control convencionales para un alto nivel de expresión, y después incubarse con moléculas de transferencia génica sintéticas tales como cationes de unión a ADN poliméricos como polilisina, protamina y albúmina, unidos a ligandos de dirección celular tales como asialoorosomucoide, insulina, galactosa, lactosa o transferrina. Otros sistemas de suministro incluyen el uso de liposomas para encapsular ADN que comprende el gen bajo el control de una diversidad de promotores específicos de tejido o ubicuamente activos. Un suministro no viral adicional adecuado para usar incluye sistemas de suministro mecánico tales como la estrategia desvelada en Woffendin y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (24): 11581-11585. Además, la secuencia codificante y el producto de expresión de la misma pueden suministrarse por deposición de materiales de hidrogel fotopolimerizado. Otros procedimientos convencionales para suministro de genes que pueden usarse para el suministro de la secuencia codificante incluyen, por ejemplo, uso de pistola de partículas de transferencia génica portátil, como se describe en el documento US 5.149.655; uso de radiación ionizante para activar el gen transferido, como se describe en los documentos US 5.206.152 y WO92/11033.
Son liposomas y vehículos de suministro de genes policatiónicos ejemplares los desvelados en los documentos US 5.422.120 y 4.762.915; en los documentos WO 95/13796; WO94/23697; y WO91/14445; en el documento EP-0524968; y en Stryer, Biochemistry, páginas 236-240 (1975) W. H. Freeman, San Francisco; Szoka (1980) Biochem Biophys Acta 600: 1, Bayer (1979) Biochem Biophys Acta 550: 464; Rivnay (1987) Meth Enzymol 149: 119; Wang (1987) Proc Natl Acad Sci 84: 7851; Plant (1989) Anal Biochem 176:420.
Una composición polinucleotídica puede comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de un vehículo de terapia génica, según se ha definido el término anteriormente. Para los fines de la presente invención, una dosis eficaz será de aproximadamente 0,01 mg/kg a 50 mg/kg o de 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de las construcciones de ADN en el individuo al que se administra.
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Procedimientos de Suministro
Una vez formuladas, las composiciones de polinucleótidos de la invención pueden administrarse (1) directamente al sujeto; (2) suministrarse ex vivo, a células obtenidas del sujeto; o (3) in vitro para la expresión de proteínas recombinantes. Los sujetos a tratar pueden ser mamíferos o aves. Además, pueden tratarse sujetos humanos.
El suministro directo de las composiciones se logrará generalmente por inyección, ya sea por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular o suministro en el espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también pueden administrarse en una lesión. Otros modos de administración incluyen administración oral y pulmonar, supositorios y aplicaciones transdérmica o transcutánea (por ejemplo, véase el documento WO98/20734), agujas y pistolas de genes o pulverizaciones hipodérmicas. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa multidosis.
Se conocen en la técnica procedimientos para el suministro ex vivo y la reimplantación de células transformadas en un sujeto y se describen, por ejemplo, en el documento WO 93/14778. Los ejemplos de células útiles en aplicaciones ex vivo incluyen, por ejemplo, células madre, particularmente células hematopoyéticas, células linfáticas, macrófagos, células dendríticas o células tumorales.
Generalmente, el suministro de ácidos nucleicos para aplicaciones tanto ex vivo como in vitro puede conseguirse mediante los siguientes procedimientos, por ejemplo, transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del polinucleótido o polinucleótidos en liposomas y microinyección directa del ADN en núcleos, todos bien conocidos en la técnica.
Composiciones farmacéuticas de polinucleótidos y polipéptidos
Además de los vehículos farmacéuticamente aceptables y sales desveladas anteriormente, pueden usarse los siguientes agentes adicionales con composiciones de polinucleótidos y/o polipéptidos.
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A. Polipéptidos
Un ejemplo son polipéptidos que incluyen, sin limitación: asioloorosomucoide (ASOR); transferrina; asialoglicoproteínas; anticuerpos; fragmentos de anticuerpo; ferritina; interleucinas; interferones, granulocitos, factor estimulante de colonias de macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de células madre y eritropoyetina. También pueden usarse antígenos virales tales como proteínas de la envuelta. Además, proteínas de otros organismos invasivos, tales como el péptido de 17 aminoácidos de la proteína del circunsporozoíto de Plasmodium falciparum conocida como RII.
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B. Hormonas, Vitaminas, etc.
Otros grupos que pueden incluirse son, por ejemplo: hormonas, esteroides, andrógenos, estrógenos, hormona tiroidea o vitaminas, ácido fólico.
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C. Polialquilenos, Polisacáridos, etc.
Además, puede incluirse polialquilenglicol con los polinucleótidos/polipéptidos deseados. En una realización preferida, el polialquilenglicol es polietilenglicol. Además, pueden incluirse mono-, di- o polisacáridos. En una realización preferida de este aspecto, el polisacárido es dextrano o DEAE-dextrano. También, quitosana y poli(lactida-co-glicolida).
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D. Lípidos y Liposomas
El polinucleótido/polipéptido deseado también puede encapsularse en lípidos o empaquetarse en liposomas antes del suministro al sujeto o a células procedentes del mismo.
La encapsulación lipídica se realiza generalmente usando liposomas que son capaces de unir de forma estable o inmovilizar y retener ácido nucleico. La proporción de polinucleótido condensado respecto a preparación de lípidos puede variar pero generalmente será de aproximadamente 1:1 (mg de ADN:micromoles de lípido), o más de lípido. Para una revisión del uso de liposomas como vehículos para suministro de ácidos nucleicos, véase, Hug y Sleight. (1991) Biochim. Biophys. Acta. 1097: 1-17; Straubinger(1983) Meth. Enzymol. 101: 512-527.
Las preparaciones liposomales para usar en la presente invención incluyen preparaciones catiónicas (cargadas positivamente), aniónicas (cargadas negativamente) y neutras. Se ha demostrado que los liposomas catiónicos median el suministro intracelular de ADN plasmídico (Feigner (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7416); ARNm (Malone (1989) Proc. Natl. Acad Sci. USA 86: 6077-6081); y factores de transcripción purificados (Debs (1990) J. Biol. Chem. 265: 10189-10192), en forma funcional.
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Están fácilmente disponibles liposomas catiónicos. Por ejemplo, están disponibles liposomas de N[(1,2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trietilamonio (DOTMA) bajo la marca comercial Lipofectin, en GIBCO BRL, Grand Island, NY. (Véase, también, Felgner anteriormente). Otros liposomas disponibles en el mercado incluyen transfectace (DDAB/
DOPE) y DOTAP/DOPE (Boerhinger). Pueden prepararse otros liposomas catiónicos a partir de materiales fácilmente disponibles usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo Szoka (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 4194-4198; documento WO90/11092 para una descripción de la síntesis de liposomas de DOTAP (1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonio)propano).
De forma similar, están fácilmente disponibles liposomas aniónicos y neutros, tal como en Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL) o pueden prepararse fácilmente usando materiales fácilmente disponibles. Dichos materiales incluyen fosfatidilcolina, colesterol, fosfatidiletanolamina, dioleilfosfatidilcolina (DOPC), dioleoilfofatidilglicerol (DOPG), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), entre otros. Estos materiales también pueden mezclarse con los materiales de partida DOTMA y DOTAP en proporciones apropiadas. Se conocen bien en la técnica procedimientos para preparar liposomas usando estos materiales.
Los liposomas pueden comprender vesículas multilaminares (MLV), vesículas unilaminares pequeñas (SUV) o vesículas unilaminares grandes (LUV). Los diversos complejos de liposoma-ácido nucleico se preparan usando procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Straubinger (1983) Meth. Immunol. 101: 512-527; Szoka (1978) Proc. Natl. Acad Sci. USA 75: 4194-4198; Papahadjopoulos (1975) Biochim. Biophys. Acta 394: 483; Wilson (1979) Cell 17: 77); Deamer y Bangham (1976) Biochim. Biophys. Acta 443: 629; Ostro (1977) Biochem. Biophys. Res. Commun. 76: 836; Fraley (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 3348); Enoch y Strittmatter (1979) Proc. Natl. Acad Sci. USA 76: 145; Fraley (1980) J. Biol. Chem. (1980) 255:1 0431; Szoka y Papahadjopoulos (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 145; y Schaefer-Ridder (1982) Science 215: 166.
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E. Lipoproteínas
Además, pueden incluirse lipoproteínas con el polinucleótido/polipéptido a suministrar. Los ejemplos de lipoproteínas que se utilizarán incluyen: quilomicrones, HDL, IDL, LDL y VLDL. También pueden usarse mutantes, fragmentos o fusiones de estas proteínas. Además, pueden usarse modificaciones de lipoproteínas de origen natural tales como LDL acetilada. Estas lipoproteínas pueden dirigir el suministro de polinucleótidos a células que expresan receptores de lipoproteínas. Preferiblemente, si se incluyen lipoproteínas con el polinucleótido a suministrar, no se incluye ningún otro ligando de dirección en la composición.
Las lipoproteínas de origen natural comprenden un lípido y una porción proteica. La porción proteica se denomina apoproteína. Hasta el momento, se han aislado e identificado las apoproteínas A, B, C, D y E. Al menos dos de éstas contienen varias proteínas, designadas mediante números romanos AI, AII, AIV; CI, CII, CIII.
Una lipoproteína puede comprender más de una apoproteína. Por ejemplo, los quilomicrones de origen natural comprenden A, B, C y E, con el tiempo estas lipoproteínas pierden A y adquieren C y E. La VLDL comprende las apoproteínas A, B, C y E, la LDL comprende la apoproteína B; y la HDL comprende las apoproteínas A, C y E.
Los aminoácidos de estas apoproteínas se conocen y se describen en, por ejemplo, Breslow (1985) Annu Rev. Biochem 54: 699; Law (1986) Adv. Exp Med. Biol. 151: 162; Chen (1986) J Biol Chem 261: 12918; Kane (1980) Proc Natl Acad Sci USA 77: 2465; y Utermann (1984) Hum Genet 65: 232.
Las lipoproteínas contienen una diversidad de lípidos incluyendo triglicéridos, colesterol (libre y ésteres) y fosfolípidos. La composición de los lípidos varía en lipoproteínas de origen natural. Por ejemplo, los quilomicrones comprenden principalmente triglicéridos. Puede encontrarse una descripción más detallada del contenido lipídico de lipoproteínas de origen natural, por ejemplo, en Meth Enzymol. 128 (1986). La composición de los lípidos se selecciona para contribuir a la conformación de la apoproteína para su actividad de unión a receptor. La composición de lípidos también puede seleccionarse para facilitar la interacción hidrófoba y la asociación con la molecula de unión a polinucleótido.
Pueden aislarse lipoproteínas de origen natural a partir de suero por ultracentrifugación, por ejemplo. Dichos procedimientos se describen en Meth. Enzymol. (anteriormente); Pitas (1980) J. Biochem. 255: 5454-5460 y Mahey (1979) J Clin. Invest 64: 743-750. También pueden producirse lipoproteínas mediante procedimientos in vitro o recombinantes por expresión de los genes de apoproteínas en una célula huésped deseada. Véase, por ejemplo, Atkinson (1986) Annu Rev Biophys Chem 15: 403 y Radding (1958) Biochim Biophys Acta 30: 443. También pueden adquirirse lipoproteínas a partir de proveedores comerciales tales como Biomedical Technologies, Inc., Stoughton, MA, Estados Unidos. Puede encontrarse una descripción adicional de lipoproteínas en el documento WO98/06437.
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F. Agentes Policatiónicos
Pueden incluirse agentes policatiónicos, con o sin lipoproteína, en una composición con el polinucleótido/polipép-
tido deseado a suministrar.
Los agentes policatiónicos, presentan típicamente una carga neta positiva a un pH pertinente fisiológico y son capaces de neutralizar la carga eléctrica de ácidos nucleicos para facilitar el suministro en una localización deseada. Estos agentes tienen aplicaciones tanto in vitro, como ex vivo como in vivo. Pueden usarse agentes policatiónicos para suministrar ácidos nucleicos a un sujeto vivo por vía intramuscular, subcutánea, etc.
Los siguientes son ejemplos de polipéptidos útiles como agentes policatiónicos: polilisina, poliarginina, poliornitina y protamina. Otros ejemplos incluyen histonas, protaminas, albúmina sérica humana, proteínas de unión a ADN, proteínas cromosómicas distintas de histonas, proteínas de cubierta de virus de ADN, tales como (X174, factores de transcripción también contienen dominios que se unen a ADN y por lo tanto pueden ser útiles como agentes de condensación de ácidos nucleicos. En resumen, los factores de transcripción tales como C/CEBP, c-jun, c-fos, AP-1, AP-2, AP-3, CPF, Prot-1, Sp-1, Oct-1, Oct-2, CREP y TFIID contienen dominios básicos que se unen a secuencias de ADN.
Los agentes policatiónicos orgánicos incluyen: espermina, espermidina y putrescina.
Las dimensiones y las propiedades físicas de un agente policatiónico pueden extrapolarse a partir de la lista anterior para construir otros agentes policatiónicos polipeptídicos o para producir agentes policatiónicos sintéticos.
Los agentes policatiónicos sintéticos que son útiles incluyen, por ejemplo, DEAE-dextrano, polibreno, Lipofectin^{TM} y lipofectAMINE^{TM} son monómeros que forman complejos policatiónicos cuando se combinan con polinucleótidos/polipéptidos.
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Ensayos de Inmunodiagnóstico
Pueden usarse antígenos de estreptococos de la invención en inmunoensayos para detectar niveles de anticuerpos (o, por el contrario, pueden usarse anticuerpos anti-estreptococos para detectar niveles de antígeno). Pueden desarrollarse inmunoensayos basados en antígenos recombinantes bien definidos para sustituir procedimientos de diagnóstico invasivos. Pueden detectarse anticuerpos contra proteínas de estreptococos en el interior de muestras biológicas, incluyendo, por ejemplo, muestras de sangre o suero. El diseño de los inmunoensayos está sujeto a una gran cantidad de variación y una diversidad de éstos se conocen en la técnica. Los protocolos para el inmunoensayo pueden basarse, por ejemplo, en ensayos de competición, o de reacción directa, o de tipo sándwich. Los protocolos también pueden usar, por ejemplo, soportes sólidos o pueden ser por inmunoprecipitación. La mayoría de los ensayos implican el uso de un anticuerpo o polipéptido marcado; los marcadores pueden ser, por ejemplo, moléculas fluorescentes, quimioluminiscentes, radiactivas o colorantes. También se conocen ensayos que amplifican las señales de la sonda; siendo ejemplos de los mismos ensayos que utilizan biotina y adivina e inmunoensayos marcados con y mediados por enzimas, tales como ensayos de ELISA.
Se construyen kits adecuados para inmunodiagnóstico y que contienen los reactivos marcados apropiados por envasado de los materiales apropiados, incluyendo las composiciones de la invención, en recipientes adecuados junto con los reactivos y materiales restantes (por ejemplo, tampones adecuados, soluciones salinas, etc.) necesarios para la realización del ensayo, así como un conjunto adecuado de instrucciones de ensayo.
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Hibridación de Ácido Nucleico
El término "hibridación" se refiere a la asociación de dos secuencias de ácido nucleico entre sí por formación de enlaces de hidrógeno. Típicamente, una secuencia estará fija a un soporte sólido y la otra estará libre en solución. Después, las dos secuencias se ponen en contacto entre sí en condiciones que favorezcan la formación de enlaces de hidrógeno. Los factores que afectan a esta formación de enlaces incluyen: el tipo y el volumen de disolvente; la temperatura de reacción; el tiempo de hibridación; la agitación; agentes para bloquear la unión inespecífica de la secuencia en fase líquida al soporte sólido (reactivo de Denhardt o BLOTTO); la concentración de las secuencias; el uso de compuestos para aumentar la velocidad de asociación de las secuencias (sulfato de dextrano o polietilenglicol); y la rigurosidad de las condiciones de lavado después de la hibridación. Véase Sambrook y col. [anteriormente] Volumen 2, capítulo 9, páginas 9.47 a 9.57.
La "rigurosidad" se refiere a condiciones en una reacción de hibridación que favorezcan la asociación de secuencias muy similares sobre secuencias que sean diferentes. Por ejemplo, debería seleccionarse la combinación de temperatura y concentración de sal que sea de aproximadamente 120 a 200ºC por debajo de la Tm calculada del híbrido bajo estudio. Las condiciones de temperatura y sal pueden determinarse con frecuencia empíricamente en experimentos preliminares en los que muestras de ADN genómico inmovilizadas sobre filtros se hibridan con la secuencia de interés y después se lavan en condiciones de diferentes rigurosidades. Véase Sambrook y col. en la página 9.50.
Son variables a considerar cuando se realiza, por ejemplo, una transferencia de Southern (1) la complejidad del ADN que se transfiere y (2) la homología entre la sonda y las secuencias que se están detectando. La cantidad total del fragmento o fragmentos a estudiar puede variar una magnitud de 10, de 0,1 a 1 \mug, para un producto de digestión plasmídico o de fago, a 10^{-9} a 10^{-8} g para un gen de copia única en un genoma eucariota altamente complejo. Para polinucleótidos de menor complejidad, pueden usarse tiempos de transferencia, hibridación y exposición sustancialmente más cortos, una menor cantidad de polinucleótidos de partida y una menor actividad específica de sondas. Por ejemplo, un gen de copia única de levadura puede detectarse con un tiempo de exposición de sólo 1 hora partiendo con 1 \mug de ADN de levadura, una transferencia durante dos horas y una hibridación durante 4-8 horas con una sonda de 10^{8} cpm/\mug. Para un gen de copia única de mamífero, una estrategia conservativa comenzaría con 10 \mug de ADN, transferencia durante una noche e hibridación durante una noche en presencia de sulfato de dextrano al 10% usando una sonda de más de 10^{8} cpm/\mug, dando como resultado un tiempo de exposición de \sim24 horas.
Varios factores pueden afectar a la temperatura de fusión (Tm) de un híbrido de ADN-ADN entre la sonda y el fragmento de interés y, por consiguiente, a las condiciones apropiadas para la hibridación y lavado. En muchos casos la sonda no es homóloga al 100% con el fragmento. Otras variables que se encuentran comúnmente incluyen la longitud y el contenido total de G+C de las secuencias que hibridan y la fuerza iónica y el contenido de formamida del tampón de hibridación. Los efectos de todos estos factores pueden aproximarse mediante una sola ecuación:
Tm = 81 + 16,6(log_{10}Ci) + 0,4[%(G + C)] - 0,6(%formamida) - 600/n -1,5(%emparejamiento erróneo)
en la que Ci es la concentración de sal (iones monovalentes) y n es la longitud del híbrido en pares de bases (ligeramente modificado a partir de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138: 267-284).
En el diseño de un experimento de hibridación, pueden modificarse convenientemente algunos factores que afecten a la hibridación del ácido nucleico. La temperatura de la hibridación y los lavados y la concentración de sal durante los lavados son los más sencillos de ajustar. A medida que aumenta la temperatura de la hibridación (es decir, rigurosidad), se hace menos probable que se produzca hibridación entre cadenas que no sean homólogas y, como resultado, disminuye el fondo. Si la sonda radiomarcada no es completamente homóloga con el fragmento inmovilizado (como frecuentemente es el caso en experimentos de hibridación de familias de genes e interespecie), la temperatura de hibridación debe reducirse y aumentará el fondo. La temperatura de los lavados afecta a la intensidad de la banda de hibridación y al grado de fondo de una forma similar. La rigurosidad de los lavados también se aumenta con concentraciones de sal decrecientes.
En general, las temperaturas de hibridación convenientes en presencia de formamida al 50% son de 42ºC para una sonda con una homología del 95% al 100% con el fragmento diana, de 37ºC para una homología del 90% al 95% y de 32ºC para una homología del 85% al 90%. Para homologías inferiores, el contenido de formamida debería disminuirse y por consiguiente debería ajustarse la temperatura usando la ecuación anterior. Si la homología entre la sonda y el fragmento diana no se conoce, la estrategia más sencilla es comenzar con condiciones tanto de hibridación como de lavado que no sean rigurosas. Si se observan bandas inespecíficas o un fondo elevado después de la autorradiografía, el filtro puede lavarse a una rigurosidad elevada y volver a exponerse. Si el tiempo necesario para la exposición hace poco factible esta estrategia, deberían ensayarse varias rigurosidades de hibridación y/o lavado en paralelo.
Ensayos de Sondas de Ácidos Nucleicos
Procedimientos tales como PCR, ensayos de sondas de ADN ramificadas o técnicas de transferencia que utilizan sondas de ácido nucleico de acuerdo con la invención pueden determinar la presencia de ADNc o ARNm. Se dice que una sonda "hibrida" con una secuencia de la invención si puede formar un dúplex o complejo bicatenario que sea lo bastante estable para detectarse.
Las sondas de ácido nucleico hibridarán con las secuencias de nucleótidos de estreptococos de la invención (incluyendo cadenas tanto sentido como antisentido). Aunque muchas secuencias de nucleótidos diferentes codificarán la secuencia de aminoácidos, se prefiere la secuencia de estreptococos nativa porque es la secuencia real presente en las células. El ARNm representa una secuencia codificante y por lo tanto una sonda debería ser complementaria a la secuencia codificante; el ADNc monocatenario es complementario al ARNm y, por lo tanto, una sonda de ADNc debería ser complementaria a la secuencia no codificante.
La secuencia de sonda no tiene que ser idéntica a la secuencia del estreptococo (o su complementaria), alguna variación en la secuencia y longitud pueden conducir a una sensibilidad de ensayo aumentada si la sonda de ácido nucleico puede formar un dúplex con nucleótidos diana que pueden detectarse. Además, la sonda de ácido nucleico puede incluir nucleótidos adicionales para estabilizar el dúplex formado. También puede ser útil una secuencia adicional de estreptococos como un marcador para detectar el dúplex formado. Por ejemplo, puede unirse una secuencia de nucleótidos no complementaria al extremo 5' de la sonda, siendo el resto de la secuencia de sonda complementaria a una secuencia de estreptococo. Como alternativa, pueden intercalarse en la sonda bases o secuencias más largas no complementarias con tal de que la secuencia de sonda tenga una complementariedad suficiente con la secuencia de estreptococo para hibridar con la misma y, por lo tanto, formar un dúplex que pueda detectarse.
La longitud exacta y la secuencia de la sonda dependerán de las condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, condición de sal, etc.). Por ejemplo, para aplicaciones de diagnóstico, dependiendo de la complejidad de la secuencia de analito, la sonda de ácido nucleico contiene típicamente al menos 10-20 nucleótidos, preferiblemente 15-25, y más preferiblemente al menos 30 nucleótidos, aunque puede ser más corta que esto. Los cebadores cortos requieren generalmente temperaturas más frías para formar complejos híbridos suficientemente estables con el molde.
Pueden producirse sondas por procedimientos sintéticos, tales como el procedimiento del triéster de Matteucci y col. [J. Am. Chem. Soc. (1981) 103: 3185], o de acuerdo con Urdea y col. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 7461] o usando sintetizadores de oligonucleótidos automáticos disponibles en el mercado.
La naturaleza química de la sonda puede seleccionarse de acuerdo con la preferencia. Para ciertas aplicaciones, son apropiados ADN o ARN. Para otras aplicaciones, pueden incorporarse modificaciones, por ejemplo, modificaciones de la cadena principal, tales como fosforotioatos o metilfosfonatos, pueden usarse para aumentar la semivida in vivo, alterar la afinidad del ARN, aumentar la resistencia a nucleasas, etc. [por ejemplo, véase Agrawal e Iyer (1995) Curr Opin Biotechnol 6: 12-19; Agrawal (1996) TIBTECH 14: 376-387]; también pueden usarse análogos tales como ácidos péptidonucleicos [por ejemplo, véase Corey (1997) TIBTECH 15: 224-229; Buchardt y col. (1993) TIBTECH 11: 384-386].
Como alternativa, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es otro medio bien conocido para detectar pequeñas cantidades de ácido nucleico diana. El ensayo se describe en Mullis y col. [Meth. Enzymol. (1987) 155: 335-350] y Patentes de Estados Unidos Nº 4.683.195 y 4.683.202. Dos nucleótidos "cebadores" hibridan con los ácidos nucleicos diana y se usan para cebar la reacción. Los cebadores pueden comprender una secuencia que no hibrida con la secuencia de la diana de amplificación (o su complementaria) para contribuir con estabilidad del dúplex o, por ejemplo, para incorporar un sitio de restricción conveniente. Típicamente, dicha secuencia flanqueará la secuencia de estreptococos deseada.
Una polimerasa termoestable genera copias de ácidos nucleicos diana a partir de los cebadores usando los ácidos nucleicos diana originales como molde. Después de que se genere una cantidad umbral de ácidos nucleicos diana por la polimerasa, pueden detectarse mediante procedimientos más tradicionales, tales como transferencias de Southern. Cuando se usa el procedimiento de transferencia de Southern, la sonda marcada hibridará con la secuencia de estreptococos (o su complementaria).
Además, puede detectarse ARNm o ADNc mediante técnicas de transferencia tradicionales desveladas en Sambrook y col. [anteriormente]. El ARNm, o ADNc generado a partir de ARNm usando una enzima polimerasa, puede purificarse y separarse usando electroforesis en gel. Los ácidos nucleicos en el gel se transfieren después sobre un soporte sólido, tal como nitrocelulosa. El soporte sólido se expone a una sonda marcada y después se lava para eliminar cualquier sonda sin hibridar. A continuación, se detectan los dúplex que contienen la sonda marcada. Típicamente, la sonda se marca con un resto radiactivo.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra el análisis de SDS-PAGE de extractos celulares totales de cultivos de E. coli recombinantes que expresan proteínas de GBS de la invención. El carril I contiene marcadores de pesos moleculares. Estos son de 94, 67, 43, 30, 20,1 y 14,4 kDa.
La Figura 2 muestra datos de caracterización de proteínas para proteínas de la invención.
La Figura 3 muestra el análisis de SDS-PAGE de proteínas de GBS purificadas de la invención. El carril a la izquierda contiene marcadores de pesos moleculares. Estos son de 94, 67, 43, 30, 20,1 y 14,4 kDa.
Modos de realizar la invención
El siguiente ejemplo describe secuencias de ácidos nucleicos que se han identificado en Streptococcus, junto con sus productos de traducción deducidos. El ejemplo es generalmente en el siguiente formato:
\bullet
una secuencia de nucleótidos que se ha identificado en Streptococcus;
\bullet
el producto de traducción deducido de esta secuencia;
\bullet
un análisis informático (por ejemplo, resultado PSORT) del producto de traducción, indicando la antigenicidad.
El ejemplo describe secuencias de nucleótidos de S. agalactiae. La cepa específica que se secuenció era del serotipo V, y es una cepa clínica aislada en Italia que expresa el antígeno de R (colección del ISS/Roma/Italia, cepa 2603 V/R).
El ejemplo describe secuencias de nucleótidos de GBS para las que no se ha identificado homólogo en GAS. Esta ausencia de homología proporciona moléculas que son útiles para distinguir GBS de GAS y para preparar productos específicos de GBS.
El ejemplo incluye detalles de homología con secuencias en las bases de datos públicas.
Pueden usarse diversos ensayos para evaluar la inmunogenicidad in vivo de las proteínas identificadas en el ejemplo. Por ejemplo, las proteínas pueden expresarse de forma recombinante y usarse para explorar sueros de pacientes por inmunotransferencia. Una reacción positiva entre la proteína y el suero del paciente indica que el paciente ha montado previamente una respuesta inmune contra la proteína en cuestión, es decir, la proteína es un inmunógeno. Este procedimiento también puede usarse para identificar proteínas inmunodominantes. También puede usarse el modelo de ratón usado en el ejemplo.
La proteína recombinante también puede usarse convenientemente para preparar anticuerpos, por ejemplo, en un ratón. Estos pueden usarse para la confirmación directa de que una proteína se localiza en la superficie celular. Puede incubarse anticuerpo marcado (por ejemplo, marcaje fluorescente para FACS) con bacterias intactas y la presencia de marcador en la superficie bacteriana confirma la localización de la proteína.
Para las proteínas de GBS, se proporcionan los siguientes datos:
- Análisis de SDS-PAGE de extractos celulares de E. coli recombinantes totales para expresión de proteína de GBS.
- Análisis de SDS-PAGE después de la purificación de proteína.
- Análisis de transferencia de Western de extracto celular total de GBS usando antisueros generados contra proteínas recombinantes
- Análisis de FACS contra GBS usando antisueros generados contra proteínas recombinantes.
- Resultados del ensayo de protección pasiva in vivo.
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Se presentan a continuación detalles de las técnicas experimentales usadas:
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Análisis de secuencia
Se predijeron los marcos de lectura abiertas (ORF) en el interior de secuencias de nucleótidos usando el programa GLIMMER [Salzberg y col. (1998) Nucleic Acids Res 26: 544-8]. Cuando era necesario, se modificaron los codones de inicio y se corrigieron manualmente en base a la presencia de sitios de unión al ribosoma y regiones promotoras en la secuencia de ADN cadena arriba.
Después se exploraron las ORF contra las bases de datos de proteínas no redundantes usando los programas BLASTp [Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410] y PRAZE, una modificación del algoritmo de Smith-Waterman [Smith y Waterman (1981) J Mol Biol 147: 195-7; véase Fleischmann y col. (1995) Science 269: 496-512].
Los péptidos líder dentro de las ORF se localizaron usando tres estrategias diferentes: (i) PSORT [Nakai (1991) Bull. Inst. Chem. Res., Kyoto Univ. 69: 269-291; Horton y Nakai (1996) Intellig. Syst. Mol. Biol. 4: 109-115; Horton y Nakai (1997) Intellig. Syst. Mol. Biol. 5: 147-152]; (ii) SignalP [Nielsen y Krogh (1998) en Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB 6), AAA1 Press, Menlo Park, California, págs. 122-130; Nielsen y col. (1999) Protein Engineering 12: 3-9; Nielsen y col. (1997). Int. J. Neural Sys. 8: 581-599]; y (iii) inspección visual de las secuencias de las ORF. Cuando a una secuencia señal se le da valor de "sitio posible", el valor representa el resto C-terminal del péptido señal, por ejemplo, un "sitio posible" de 26 significa que la secuencia señal está constituida por los aminoácidos 1-26.
Se localizaron péptidos señal específicos de lipoproteína usando tres estrategias diferentes: (i) PSORT [véase anteriormente]; (ii) el motivo PROSITE de "sitio de unión de lípidos de lipoproteína de membrana procariota" [Hofmann y col. (1999) Nucleic Acids Res. 27: 215-219; Bucher y Bairoch (1994) en Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB-94), AAA1 Press, páginas 53-61]; y (iii) el programa FINDPATTERNS disponible en el Paquete GCG Wisconsin, usando el patrón (M, L, V)x{9, 35} LxxCx.
Se localizaron dominios transmembrana usando dos estrategias: (i) PSORT [véase anteriormente]; (ii) TopPred [von Heijne (1992) J. Mol. Biol. 225: 487-494].
Se localizaron motivos LPXTG característicos de proteínas unidas a pared celular en bacterias Gram-positivas [Fischetti y col. (1990) Mol Microbiol 4: 1603-5] con FINDPATTERNS usando el patrón (L,l,V,M,Y,F)Px(T,A,S,G) (G,N,S,T,A,L).
Se localizaron motivos RGD característicos de moléculas de adhesión celular [D'Souza y col. (1991) Trends Biochem Sci 16: 246-50] usando FINDPATTERNS.
También se seleccionaron enzimas pertenecientes a la ruta glicolítica como antígenos, debido a que se han encontrado experimentalmente expresadas en la superficie de estreptococos [por ejemplo, Pancholi y Fischetti (1992) J Exp Med 176: 415-26; Pancholi y Fischetti (1998) J Biol Chem 273: 14503-15].
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Clonación, expresión y purificación de proteínas
Se clonaron genes de GBS para facilitar la expresión en E. coli como proteínas de fusión que tenían un marcador hexa-histidina en el extremo amino-terminal (His-gbs).
Se realizó la clonación usando la tecnología de Gateway^{TM} (Life Technologies), que se basa en las reacciones de recombinación específicas de de sitio que median la integración y escisión de fago lambda en y del genoma de E. coli. Un solo experimento de clonación incluía las siguientes etapas:
1.- Amplificación de ADN cromosómico de GBS para obtener un producto de PCR que codifica una sola ORF flanqueada por sitios de recombinación attB.
2.- Inserción del producto de PCR en un vector pDONR (que contiene sitios attP) mediante una reacción BP (sitios attB x attP). Esta reacción proporciona una denomina vector "pEntry" que ahora contiene sitios attL flanqueando el inserto.
3.- Inserción del gen de GBS en vectores de expresión de E. coli (vectores pDestination, que contienen sitios attR) mediante una reacción LR entre plásmidos pEntry y pDestination (sitios attL x attR).
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A) Preparación de ADN Cromosómico
Para la preparación de ADN cromosómico, se cultivó cepa 2603 V/R de GBS (Istituto Superiore Sanità, Roma) hasta una fase exponencial en 2 litros de Caldo TH (Difco) a 37ºC, se recogió por centrifugación y se disolvió en 40 ml de TES (Tris 50 mM pH 8, EDTA 5 mM pH 8, sacarosa al 20%). Después de la adición de 2,5 ml de solución de lisozima (25 mg/ml en TES) y 0,5 ml de mutanolisina (Sigma M-9901, 25000 U/ml en H_{2}O) la suspensión se incubó a 37ºC durante 1 hora. Se añadió 1 ml de ARNasa (20 mg/ml) y 0,1 ml de proteinasa K (20 mg/ml) y se continuó con la incubación durante 30 min a 37ºC.
Se obtuvo la lisis celular por adición de 5 ml de solución de sarcosil (N-laurilsarcosina al 10% en EDTA 250 mM pH 8,0) e incubación 1 hora a 37ºC con inversión frecuente. Después de la extracción secuencial con fenol, fenol-cloroformo y cloroformo, se precipitó el ADN con acetato sódico 0,3 M a pH 5,2 y 2 volúmenes de etanol absoluto. El sedimento de ADN se aclaró con etanol al 70% y se disolvió en tampón TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8). Se evaluó la concentración de ADN por DO_{260}.
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B) Diseño de oligonucleótidos
Se diseñaron cebadores oligonucleotídicos sintéticos en base a la secuencia codificante de la ORF.
Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de GBS expresadas se definen definitivamente por las secuencias de los cebadores oligonucleotídicos proporcionadas en la Tabla 11 y las SEC ID 5 y 6.
Las colas 5' de los cebadores directos y las colas 3' de los cebadores inversos incluían sitios attB1 y attB2, respectivamente:
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Cebadores directos
5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCT-ORF en fase de lectura-3'.
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Cebadores inversos
5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTT-complementaria inversa de la ORF-3'.
El número de nucleótidos que hibridaban con la secuencia a amplificar dependía de la temperatura de fusión de los cebadores, que se determinó como se describe por Breslauer y col. [PNAS USA (1986) 83: 3746-50]. La temperatura de fusión media de los oligonucleótidos seleccionados era de 50-55ºC para la región de hibridación y 80-85ºC para los oligonucleótidos completos.
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C) Amplificación
El protocolo de PCR convencional era el siguiente: se usaron 50 ng de ADN genómico como molde en presencia de 0,5 \muM de cada cebador, 200 \muM de cada dNTP, MgCl_{2} t,5 mM, tampón 1x sin Mg^{++} (Gibco-BRL) y 2 unidades de ADN polimerasa Taq (Platinum Taq, Gibco-BRL) en un volumen final de 100 \mul. Cada muestra se sometió a una doble
etapa de amplificación: 5 ciclos realizados usando como temperatura de hibridación 50ºC, seguidos de 25 ciclos a 68ºC.
Los ciclos convencionales eran los siguientes:
\vocalinvisible
\textoinvisible
\quad
Desnaturalización: 94ºC, 2 min
5 ciclos:
Desnaturalización: 94ºC, 30 segundos
\quad
Hibridación: 50ºC, 50 segundos
\quad
Elongación: 72ºC, 1 min o 2 min y 40 s
25 ciclos:
Desnaturalización: 94ºC, 30 segundos
\quad
Hibridación: 68ºC, 50 segundos
\quad
Elongación: 72ºC, 1 min o 2 min y 40 s
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El tiempo de elongación era de 1 minuto para las ORF más cortas que 2000 pb y de 2:40 minutos para ORF más largas que 2000 pb. Se realizaron amplificaciones usando un sistema de PCR Gene Amp 9600 (Perkin Elmer).
Para comprobar los resultados de amplificación, se cargaron 2 \mul de cada producto de PCR en un gel de agarosa a 1-1,5 y se comparó el tamaño de los fragmentos amplificados con patrones de pesos moleculares de ADN (marcador de ADN IX Roche, patrón en escalera de ADN de 1 kb de Biolabs).
Se purificaron productos de PCR de una sola banda por precipitación con PEG: se añadieron 300 \mul de tampón TE y 200 l de PEG 8000 al 30%/MgCl_{2} 30 mM a 100 \mul de reacción de PCR. Después de agitar vorticialmente, el ADN se centrifugó durante 20 min a 10000 g, se lavó con 1 vol. de etanol al 70% y el sedimento se disolvió en 30 \mul de TE. Los productos de PCR de menor tamaño que 350 pb se purificaron usando un kit de purificación de PCR (Qiagen) y se eluyeron con 30 \mul del tampón de elución proporcionado.
Para evaluar el rendimiento, se sometieron 2 \mul del ADN purificado a electroforesis en gel de agarosa y se compararon con patrones de pesos moleculares titulados.
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D) Clonación de productos de PCR en vectores de expresión
Se realizó la clonación siguiendo el "protocolo de un tubo" de la tecnología Gateway^{TM} que consiste en una reacción de dos etapas (BP y LR) para la inserción directa de productos de PCR en vectores de expresión.
Reacción BP (sitios attB x attP): La reacción permitió la inserción del producto de PCR en un vector pDONR. El vector pDONR^{TM} 201 que se usó contiene el gen de toxina asesina ccdB entre los sitios attP1 y attP2 para minimizar las colonias de fondo que carecen del inserto de PCR y un gen marcador de selección para resistencia a kanamicina. La reacción daba como resultado el vector denominado pEntry, en el que el gen de GBS se localizaba entre los sitios attL1 y attL2.
Se incubaron 60 fmol de producto de PCR y 100 ng de vector pDONR^{TM} 201 con 2,5 \mul de BP clonase^{TM} en un volumen final de 12,5 \mul durante 4 horas a 25ºC.
Reacción LR (sitios attL x attR): La reacción permitió la inserción del gen de GBS, ahora presente en el vector pEntry, en vectores de expresión de E. coli (vectores pDestination, que contienen sitios attR). Se usaron dos vectores pDestination (pDEST15 para fusiones con GST N-terminales - Figura 86; y pDEST17-1 para fusiones marcadas con His N-terminal - Figura 87). Ambas permiten la transcripción de la fusión de ORF que codifica ARNm bajo el promotor de la ARN polimerasa de T7 [Studier y col. (1990) Meth. Enzymol. 185: 60ff].
A 5 \mul de reacción BP se añadieron 0,25 \mul de NaCl 0,75 M, 100 ng de vector Destination y 1,5 \mul de LR clonase^{TM}. La reacción se incubó a 25ºC durante 2 horas y se interrumpió con 1 \mul de solución de proteinasa K 1 mg/ml a 37ºC durante 15 min.
Se usó 1 \mul de la reacción terminada para transformar 50 \mul de células BL21-SI^{TM} electrocompetentes (0,1 cm, 200 ohms, 25 \muF). Las células BL21-SL contienen un gen de ARN polimerasa de T7 integrado bajo el control del promotor prU inducible por sal [Gowrishankar (1985) J. Bacteriol. 164: 434ff]. Después de la electroporación las células se diluyeron en 1 ml de medio SOC (bactotriptona a 20 g/l, extracto de levadura 5 g/l, NaCl 0,58 g/l, KCl 0,186 g/l, glucosa 20 mM, MgCl_{2} 10 mM) y se incubaron a 37ºC durante 1 hora. Se sembraron 200 \mul de células en placas LBON (medio de caldo de Luria sin NaCl) que contenían ampicilina 100 \mug/ml. Después las placas se incubaron durante 16 horas a 37ºC.
Clones Entry: Para permitir la futura preparación de plásmidos pEntry compatibles con Gateway que contienen genes que puedan acabar siendo de interés después de ensayos inmunológicos, se incubaron 2,5 \mul de reacción BP durante 15 min en presencia de 3 \mul de solución de proteinasa K 0,15 mg/ml y después se mantuvieron a -20ºC. La reacción estaba de este modo disponible para transformar células competentes de E. coli para producir clones Entry para la introducción futura de los genes en otros vectores Destination.
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E) Expresión de Proteína
Se inocularon colonias individuales obtenidas de la transformación de reacciones LR como cultivos a pequeña escala en 3 ml de LBON ampicilina 100 \mug/ml durante un cultivo de una noche a 25ºC. Se inocularon 50-200 \mul del cultivo en 3 ml de LBON/Amp a una DO600 inicial de 0,1. Los cultivos se cultivaron a 37ºC hasta una DO600 de 0,4-0,6 y se indujo la expresión de proteína recombinante por adición de NaCl a una concentración final de 0,3 M. Después de una incubación de 2 horas se comprobó la DO final y los cultivos se enfriaron en hielo. Se recogieron 0,5 DO_{600} de células por centrifugación. El sedimento celular se suspendió en 50 \mul de Tampón de Muestras de Carga de proteínas (TRIS-HCl 50 mM pH 6,8, SDS al 0,5% p/v, glicerina al 2,5% v/v, Azul de Bromofenol al 0,5% p/v, DTT 100 mM) y se incubó a 100ºC durante 5 min. Se analizaron 10 \mul de muestra mediante SDS-PAGE y tinción con Azul de Coomassie para verificar la presencia de banda de proteína inducida.
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F) Purificación de las proteínas recombinantes
Se inocularon colonias individuales en 25 ml de LBON ampicilina 100 \mug/ml y se cultivaron a 25ºC durante una noche. El cultivo de una noche se inoculó en 500 ml de LBON/amp y se cultivó en agitación a 25ºC hasta valores de DO_{600} de 0,4-0,6. Después se indujo la expresión de proteína por adición de NaCl a una concentración final de 0,3 M. Después de una incubación de 3 horas a 25ºC se comprobó la DO_{600} final y los cultivos se enfriaron en hielo. Después de la centrifugación a 6000 rpm (rotor JA10, Beckman) durante 20 min, el sedimento celular se procesó para purificación o se congeló a -20ºC.
Las proteínas se purificaron de 1 de 3 formas dependiendo del compañero de fusión y de la solubilidad de la proteína:
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Purificación de proteínas marcadas con His solubles a partir de E. coli
1. Transferir los sedimentos de -20ºC a un baño de hielo y reconstituir cada sedimento con 10 ml de solución B-PER^{TM} (Reactivo de Extracción de Proteína Bacteriana, cat. Pierce 78266), 10 \mul de una solución de MgCl_{2} 100 mM, 50 \mul de ADNasa 1 (Sigma D-4263, 100 K unidades en PBS) y 100 \mul de lisozima 100 mg/ml en PBS (Sigma L-7651, concentración final 1 mg/ml).
2. Transferir sedimentos resuspendidos en tubos de centrífuga de 50 ml y dejar a temperatura ambiente durante 30-40 minutos, agitando vorticialmente 3-4 veces.
3. Centrifugar 15-20 minutos a aproximadamente 30-40000 x g.
4. Preparar columnas Poly-Prep (Bio-Rad) que contienen un 1 ml de Sepharose quelante activada con Ni de flujo rápido (Pharmacia). Equilibrar con tampón fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, pH 8,0.
5. Almacenar el sedimento a -20ºC y cargar el sobrenadante en las columnas.
6. Desechar el flujo a través.
7. Lavar con 10 ml de tampón de imidazol 20 mM, fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, pH 8,0.
8. Eluir las proteínas unidas a las columnas con 4,5 ml (1,5 ml + 1,5 ml + 1,5 ml) de tampón imidazol 250 mM, fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, pH 8,0 y recoger tres fracciones de \sim1,5 ml cada una. Añadir a cada tubo 15 \mul de DTT 200 mM (concentración final 2 mM).
9. Medir la concentración de proteína de las fracciones recogidas con el procedimiento Bradford y analizar las proteínas mediante SDS-PAGE.
10. Almacenar las fracciones recogidas a +4ºC mientras se esperan los resultados del análisis de SDS-PAGE.
11. Para la inmunización preparar 4-5 alícuotas de 20-100 \mug cada una en 0,5 ml de glicerol al 40%. El tampón de dilución es el tampón de elución anterior, más DTT 2 mM. Almacenar las alícuotas a -20ºC hasta la inmuniza-
ción.
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Purificación de proteínas marcadas con His a partir de cuerpos de inclusión
1. Se recogen bacterias de cultivos de 500 ml por centrifugación. Si es necesario se almacenan los sedimentos bacterianos a -20ºC. Transferir los sedimentos de -20ºC a temperatura ambiente y reconstituir cada sedimento con 10 ml de solución B-PER^{TM}, 10 \mul de una solución de MgCl_{2} 100 mM (1 mM final), 50 \mul de ADNasa I equivalente a 100 K unidades en PBS y 100 \mul de una solución de lisozima 100 mg/ml (Sigma L-7651) en PBS (equivalente a 10 mg, concentración final 1 mg/ml).
2. Transferir los sedimentos resuspendidos en tubos de centrífuga de 50 ml y dejar a temperatura ambiente durante 30-40 minutos, agitando vorticialmente 3-4 veces.
3. Centrifugar 15 minutos a 30-4000 x g y recoger los sedimentos.
4. Disolver los sedimentos con TRIS-HCl 50 mM, TCEP {clorhidrato de tris(2-carboxietil)-fosfina, Pierce} 1 mM, clorhidrato de guanidina 6 M, pH 8,5. Agitar durante \sim10 min con una barra magnética.
5. Centrifugar como se ha desvelado anteriormente y recoger el sobrenadante.
6. Preparar columnas Poly-Prep (Bio-Rad) que contienen 1 ml de Sepharose quelante activada con Ni de flujo rápido (Pharmacia). Lavar las columnas dos veces con 5 ml de H_{2}O y equilibrar con TRIS-HCl 50 mM, TCEP 1 mM, clorhidrato de guanidina 6 M, pH 8,5.
7. Cargar los sobrenadantes de la etapa 5 sobre las columnas y lavar con 5 ml de tampón TRIS-HCl 50 mM, TCEP 1 mM, urea 6 M, pH 8,5.
8. Lavar las columnas con 10 ml de imidazol 20 mM, TRIS-HCl 50 mM, urea 6 M, TCEP 1 mM, pH 8,5. Recoger y apartar los primeros 5 ml para posibles controles adicionales.
9. Eluir proteínas unidas a columnas con 4,5 ml de tampón que contiene imidazol 250 ml, TRIS-HCl 50 mM, urea 6 M, TCEP 1 mM, pH 8,5. Añadir el tampón de elución en tres alícuotas de 1,5 ml y recoger las tres fracciones correspondientes. Añadir a cada fracción 15 \mul de DTT (concentración final 2 mM).
10. Medir la concentración de proteína eluida con el procedimiento Bradford y analizar las proteínas mediante SDS-PAGE.
11. Dializar durante una noche la fracción seleccionada contra tampón fosfato sódico 50 mM, pH 8,8, que contiene glicerol al 10%, arginina 0,5 M, glutatión reducido 5 mM, glutatión oxidado 0,5 mM, urea 2 M.
12. Dializar contra tampón fosfato sódico 50 mM, pH 8,8, que contiene glicerol al 10%, arginina 0,5 M, glutatión reducido 5 mM, glutatión oxidado 0,5 mM.
13. Aclarar la preparación de proteína dializada por centrifugación y desechar el material no soluble y medir la concentración de proteína con el procedimiento Bradford.
14. Para cada proteína destinada a la inmunización preparar 4-5 alícuotas de 20-100 \mug cada una en 0,5 ml después de haber ajustado el contenido de glicerol hasta el 40%. Almacenar las alícuotas preparadas a 20ºC hasta la inmunización.
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Inmunizaciones con proteínas de GBS
Las proteínas purificadas se usaron para inmunizar grupos de cuatro ratones CD-1 por vía intraperitoneal. Se inyectaron 20 \mug de cada proteína purificada en adyuvante de Freund los días 1, 21 y 35. Se controlaron las respuestas inmunes mediante el uso de muestras tomadas los días 0 y 49. Se analizaron los sueros como combinaciones de sueros de cada grupo de ratones.
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Procedimiento de Ensayo de Unión de bacterias FACScan
Se sembró la cepa 2603 V/R de serotipo V de GBS sobre placas de agar sangre TSA y se incubaron durante una noche a 37ºC. Se recogieron las colonias bacterianas a partir de las placas usando un hisopo de dracon estéril y se inocularon en 100 ml de Caldo de Todd Hewitt. Se controló el crecimiento bacteriano cada 30 minutos siguiendo la DO_{600}. Se cultivaron las bacterias hasta una DO_{600} = 0,7-0,8. El cultivo se centrifugó durante 20 minutos a 5000 rpm. El sobrenadante se desechó y se lavaron las bacterias una vez con PBS, se resuspendieron en ½ volumen de cultivo de PBS que contenía paraformaldehído al 0,05% y se incubaron durante 1 hora a 37ºC y después durante una noche a 4ºC.
\newpage
Se lavaron 50 \mul de células bacterianas (DO_{600} 0,1) una vez con PBS y se resuspendieron en 20 \mul de suero de bloqueo (Suero de Ternero Recién Nacido, Sigma) y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después las células se incubaron con 100 \mul de suero diluido (1:200) en tampón de dilución (Suero de Ternero Recién Nacido al 20%, BSA 0,1% en PBS) durante 1 hora a 4ºC. Las células se centrifugaron a 5000 rpm, el sobrenadante se aspiró y las células se lavaron por adición de 200 \mul de tampón de lavado (BSA al 0,1% en PBS). Se añadieron 50 \mul de F(ab)_{2} de cabra anti-ratón conjugado con R-Ficoeritrina, diluido 1:100 en tampón de dilución, a cada muestra y se incubó durante 1 hora a 4ºC. Las células se precipitaron por centrifugación a 5000 rpm y se lavaron por adición de 200 \mul de tampón de lavado. El sobrenadante se aspiró y las células se resuspendieron en 200 \mul de PBS. Se transfirieron muestras a tubos FACScan y se leyeron. La condición para ajuste del FACScan era: FL2 conectado; umbral FSC-H: 54; Voltaje FSC PMT: E 02, SSC PMT: 516; Aumentos Amp. 2,63; FL-2 PMT: 728. Valores de compensación: 0.
Las muestras se consideraron positivas si tenían un valor medio \Delta >50 valores de canal.
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Preparación de Extractos Completos
Se cultivaron durante una noche células de cepa COHI de serotipo III y de cepa 2603 V/R de serotipo V de GBS en Caldo Todd Hewitt. Se inoculó 1 ml del cultivo en 100 ml de Caldo Todd Hewitt. Se controló el crecimiento bacteriano cada 30 minutos siguiendo la DO_{600}. Las bacterias se cultivaron hasta que la DO alcanzó 0,7-0,8. El cultivo se centrifugó durante 20 minutos a 5000 rpm. El sobrenadante se desechó y se lavaron las bacterias una vez con PBS, se resuspendieron en 2 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 6,8 añadiendo 400 unidades de Mutanolisina (Sigma-Aldrich) y se incubaron 3 horas a 37ºC. Después de 3 ciclos de congelación/descongelación, se eliminaron los residuos celulares por centrifugación a 14000 g durante 15 minutos y la concentración de proteína de sobrenadante se midió mediante el ensayo de proteína de Bio-Rad, usando BSA como patrón.
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Transferencia de Western
Se cargaron proteínas purificadas (50 ng) y extractos celulares totales (25 \mug) derivados de cepa COHI de serotipo III y cepa 2603 V/R de serotipo V de GBS en SDS-PAGE al 12% o 15% y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La transferencia se realizó durante 1 hora a 100 V a 4ºC en tampón de transferencia (Tris base 25 mM, glicina 192 mM, metanol al 20%). La membrana se saturó por incubación durante una noche a 4ºC en tampón de saturación (leche desnatada al 5%, Tween 20 al 0,1% en PBS). La membrana se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con sueros de ratón diluidos 1:1000 en tampón de saturación. La membrana se lavó dos veces con tampón de lavado (leche desnatada al 3%, Tween 20 al 0,1% en PBS) y se incubó durante 1 hora con una dilución 1:5000 de anti-Ig de ratón marcado con peroxidasa de rábano picante (Bio-Rad). La membrana se lavó dos veces con Tween 20 al 0,1% en PBS y se reveló con el Kit de sustrato Opti-4CN (Bio-Rad). La reacción se interrumpió por adición de
agua.
A menos que se indique otra cosa, los carriles 1, 2 y 3 de las transferencias de los dibujos son: (1) la proteína purificada; (2) extractos de GBS-III; y (3) extractos de GBS-V. También se muestran marcadores de pesos moleculares.
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Ensayo de protección pasiva in vivo en modelo de ratón de septicemia neonatal
Los sueros inmunes recogidos a partir de los ratones CD1 inmunizados se ensayaron en un modelo de septicemia neonatal de ratón para verificar su eficacia protectora en ratones expuestos con serotipo III de GBS. Se dividieron aleatoriamente hermanos de camada Balb/C recién nacidos en dos grupos en 24 horas desde el nacimiento y se les inyectó por vía subcutánea 25 \mul de sueros diluidos (1:15) de ratones adultos CD1 inmunizados. Un grupo recibió sueros preinmunes, el otro recibió sueros inmunes. Cuatro horas después todas las crías se expusieron a una dosis letal al 75% de la cepa COH1 de serotipo III de GBS. La dosis de exposición obtenida diluyendo un cultivo en fase semilogarítmica se administró por vía subcutánea en 25 \mul de solución salina. El número de crías que sobrevivían a la infección por GBS se evaluó cada 12 horas durante 4 días. Los resultados están en la Tabla III.
\newpage
Ejemplo
Se identificó una secuencia de ADN (GBSx1351) en S. agalactiae <SEC ID 1> que codifica la secuencia de aminoácidos <SEC ID 2>. El análisis de esta secuencia de proteína revela lo siguiente:
1 
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También se identificó una secuencia de ácido nucleico de GBS relacionada <SEC ID 3> que codifica la secuencia de aminoácidos <SEC ID 4>. El análisis de esta secuencia proteica revela lo siguiente:
2 
\newpage
La proteína tiene homología con las siguientes secuencias en la base de datos GENPEPT
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3
4 
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No se identificó una secuencia de ADN correspondiente en S. pyogenes.
La SEC ID 8780 (GBS80) se expresó en E. coli como un producto de fusión con His. El análisis de SDS-PAGE de extracto celular total se muestra en la Figura 1 (carril 6; PM 56,8 kDa).
El producto de fusión de GBS80-His se purificó (Figura 2A: véase también la Figura 3, carril 5) y se usó para inmunizar ratones (producto de carril 1+2; 20 \mug/ratón). El antisuero resultante se usó para transferencia de Western (Figura 2B), FACS (Figura 2C) y en el ensayo de protección pasiva in vivo (Tabla III). Estos ensayos confirman que la proteína está accesible para el sistema inmune en GBS y que es un inmunógeno protector eficaz.
Basándose en este análisis, se predijo que esta proteína y sus epítopes podían ser antígenos útiles para vacunas o agentes de diagnóstico.
Se entenderá que la invención se ha desvelado a modo de ejemplo solamente y que pueden realizarse modificaciones.
TABLA I Pesos moleculares teóricas para proteínas de GBS80
5 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA II Cebadores usados para amplificar proteínas de GBS80
6 
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TABLA III Resultados para exposición a GBS in vivo
7 
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TABLA IV Funciones predichas para ciertas SEC ID
8 
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SEC ID 1
9 
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SEC ID 2
10 
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SEC ID 3
11 
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SEC ID 4
12 
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SEC ID 5
13 
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SEC ID 6
14

Claims (27)

1. Una proteína que induce una inmunidad protectora contra Streptococcus agalactiae que comprende:
(a)
una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID 2 y 4;
(b)
una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 80% o superior con la SEC ID 2 ó 4; o
(c)
un fragmento de n o más aminoácidos consecutivos a partir de la secuencia de aminoácidos SEC ID 2 o SEC ID 4 donde n es 10,
con la condición de que la proteína de (b) o (c) no sea: (i) los 246 aminoácidos C-terminales de la SEC ID 2; o (ii) un 245-mero que son los aminoácidos 336 a 580 de la SEC ID 2.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Una proteína de acuerdo con la parte (b) de la reivindicación 1 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 90% o superior con la SEC ID 2 ó 4.
3. Una proteína de acuerdo con la parte (b) de la reivindicación 1 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 95% o superior con la SEC ID 2 ó 4.
4. Un anticuerpo que se une a una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, con la condición de que el anticuerpo no se una a: (i) los 246 aminoácidos C-terminales de la SEC ID 2; (ii) un 245-mero que son los aminoácidos 336 a 580 de la SEC ID 2.
5. El anticuerpo de la reivindicación 4, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo totalmente humano.
6. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
7. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6, que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID 1 y 3.
8. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que induce una inmunidad protectora contra Streptococcus agalactiae que comprende una secuencia de nucléotidos seleccionada de:
(a)
una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia del 80% o superior con la SEC ID 1 o SEC ID 3;
(b)
un fragmento de m o más nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos SEC ID 1 o SEC ID 2 donde m es 30, o
(c)
una secuencia de nucleótidos complementaria a (a) o (b)
con la condición de que la molécula de ácido nucleico no sea: (i) un 741-mero constituido por los 738 nucleótidos 3' de la SEC ID 1 con un codón de terminación TAA en su extremo 3'; o (ii) un 737-mero que son los nucleótidos 1006 a 1742 de la SEC ID 1.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Una composición inmunógena, una composición de vacuna o una composición de diagnóstico que comprende una proteína, una molécula de ácido nucleico o un anticuerpo de acuerdo con cualquier reivindicación anterior.
10. Una composición que comprende una proteína, una molécula de ácido nucleico o un anticuerpo en combinación con un adyuvante seleccionado del grupo constituido por (i) los oligonucleótidos que comprenden motivos CpG; (ii) citocinas, tales como interleucinas, interferonas, factor estimulante de colonias de macrófagos, factor de necrosis tumoral, (iii) un oligonucleótido inmunoestimulador (por ejemplo, un oligonucleótido CpG) y una saponina (iv) un inmunoestimulante y una partícula de sal de metal (v), fosfato de aluminio (vi), hidroxifosfato de aluminio y (vii) mezclas de diferentes sales de aluminio
en la que la proteína induce a inmunidad protectora contra Streptococcus agalactiae que comprende:
(a)
una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por las SEC ID 2 y 4;
(b)
una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 80% o superior con la SEC ID 2 ó 4; o
(c)
un fragmento de n o más aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos SEC ID 2 o SEC ID 4 donde n es 10,
y en la que el ácido nucleico codifica una proteína que induce una inmunidad protectora contra Streptococcus agalactiae y comprende:
(d)
una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por la SEC ID 1 o SEC ID 3;
(e)
una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia del 80% o superior con la SEC ID 1 o SEC ID 3;
(f)
un fragmento de m o más nucleótidos consecutivos de la secuencia de nucleótidos SEC ID 1 o SEC ID 3 donde m es 30; o
(g)
una secuencia de nucleótidos complementaria a (a) o (b):
y en la que el anticuerpo se une a la proteína de (a), (b) o (c) anteriores.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Una composición de acuerdo con la reivindicación 10, en la que la proteína de la parte (b) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 90% o superior con la SEC ID 2 ó 4.
12. Una composición de acuerdo con la reivindicación 10, en la que la proteína de la parte (b) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 95% o superior con la SEC ID 2 ó 4.
13. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, siendo una composición inmunógena, una composición de vacuna o una composición de diagnóstico.
14. Una proteína, una molécula de ácido nucleico, un anticuerpo o una composición de acuerdo con cualquier reivindicación anterior para su uso como un producto farmacéutico.
15. Una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una composición que comprende una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en la que n es 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ó 100.
16. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 8 o una composición que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10, en la que m es 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 ó 200.
17. El uso de una proteína, una molécula de ácido nucleico o un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o el uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-12 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una infección o enfermedad causada por bacterias estreptocócicas, particularmente S. agalactiae.
18. Una proteína, una molécula de ácido nucleico o un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-12 para el tratamiento o la prevención de una infección o enfermedad causada por bacterias estreptocócicas, particularmente S. agalactiae.
19. Una proteína híbrida representada por la fórmula NH2-A-[-X-L-]_{n}-B-COOH, en la que X es una secuencia de aminoácidos como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, L es una secuencia de aminoácidos enlazadora opcional, A es una secuencia de aminoácidos N-terminal opcional, B es una secuencia de aminoácidos C-terminal opcional y n es un número entero mayor de 1.
20. Un kit que comprende cebadores para amplificar una secuencia de molde contenida en el interior de la SEC ID 1 o SEC ID 3, comprendiendo el kit un primer cebador y un segundo cebador, en el que el primer cebador es complementario a dicha secuencia de molde y el segundo cebador es complementario a una complementaria de dicha secuencia de molde, en el que las partes de dichos cebadores que tienen complementariedad definen los extremos terminales de la secuencia de molde que se va a amplificar.
21. Un kit que comprende un primer y un segundo oligonucleótido monocatenario que permite la amplificación de una secuencia de molde contenida en el interior de la SEC ID 1 o SEC ID 3 contenida en un ácido nucleico monocatenario o bicatenario (o mezcla del mismo), en el que: (a) el primer oligonucleótido comprende una primera secuencia que es complementaria a dicha secuencia de ácido nucleico de molde; (b) el segundo oligonucleótido comprende una secuencia de cebador que es complementaria a la complementaria de dicha secuencia de ácido nucleico de molde; (c) el primer oligonucleótido y/o el segundo oligonucleótido comprenden la secuencia que no es complementaria a dicho ácido nucleico de molde; y (d) dichas secuencias de cebadores definen los extremos terminales de la secuencia de molde que se va amplificar.
22. El kit de la reivindicación 21, en la que la secuencia o secuencias no complementarias de (c) comprenden un sitio de restricción y/o una secuencia promotora.
23. Un procedimiento para detectar Streptococcus en una muestra biológica que comprende la etapa de poner en contacto un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 con la muestra biológica en condiciones de hibridación.
24. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que el procedimiento implica amplificación de ácido nucleico.
25. Un procedimiento para determinar si un compuesto se une a una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende la etapa de poner en contacto un compuesto de ensayo con una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y determinar si el compuesto de ensayo se une a dicha proteína.
26. Una composición inmunógena o una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 9 que comprende una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y uno o más de los siguientes antígenos:
- un antígeno proteico de Helicobacter pylori;
- un antígeno proteico de N. meningitidis serogrupo B;
- una preparación de vesículas de membrana externa (OMV) de N. meningitidis serogrupo B;
- un antígeno de sacárido de de N. meningitidis serogrupo A, C, W135 y/o Y;
- un antígeno de sacárido de Streptococcus pneumoniae;
- un antígeno del virus de la hepatitis A;
- un antígeno del virus de la hepatitis B;
- un antígeno del virus de la hepatitis C;
- un antígeno de Bordetella pertussis;
- un antígeno de difteria;
- un antígeno de tétanos;
- un antígeno de sacárido de Haemophilus influenzae B;
- un antígeno de N. gonorrhoeae;
- un antígeno de Chlamydia pneumoniae;
- un antígeno de Chlamydia trachomatis;
- un antígeno de Porphyromonas gingivalis;
- un antígeno o antígenos de polio;
- un antígeno o antígenos de rabia;
- antígenos de sarampión, paperas y/o rubéola;
- un antígeno o antígenos de influenza;
- un antígeno de Moraxella catarrhalis y/o
- un antígeno de Staphylococcus aureus.
27. Una composición inmunógena, una composición de vacuna o una composición de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 9 que comprende dos o más proteínas, en la que cada proteína es una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
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